ES2114183T5 - Anticuerpo para el tratamiento de la diabetes dependiente de la insulina. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA LA PREVENCION DE LA DIABETES DEPENDIENTE DE LA INSULINA (DE TIPO I). EL METODO COMPRENDE LA ADMINISTRACION DE UN ANTICUERPO, POLIPEPTIDO U OTRA MOLECULA QUE RECONOZCA EL VLA4.

Description

Anticuerpo para el tratamiento de la diabetes dependiente de la insulina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un tratamiento de la diabetes dependiente de la insulina (tipo-I). Más particularmente, esta invención se refiere al uso de anticuerpos reconocedores de epítopos B1 o B2 de la subunidad \alpha4 de la integrina VLA4 (very late antigen 4, antígeno 4 muy retardado) en la prevención de la diabetes, según se reivindica.

Antecedentes de la invención

La diabetes dependiente de la insulina (también conocida como diabetes tipo-I y antiguamente como comienzo juvenil de la diabetes mellitus) ha sido clasificada durante las dos pasadas décadas como una enfermedad autoinmune crónica. En este trastorno, las células que producen insulina (células \beta) en los islotes pancreáticos son seleccionadas selectivamente y destruidas mediante un infiltrado celular en el páncreas. Este infiltrado inflamatorio que afecta a los islotes ha sido llamado insulitis. Las células que producen insulina comprenden la mayoría de las células de los islotes, pero menos del 2% de la masa pancreática total (Castano y Eisenbarth, 1990, [1]; Fujita y col., 1982 [2]; Foulis y col., 1986 [3]). El desarrollo de la diabetes de tipo I puede ser dividido conceptualmente en seis etapas, empezando con la susceptibilidad genética y finalizando con la completa destrucción de las células \beta (Eisenbarth, 1986 [4]). La Etapa I es susceptiblemente genética, lo cual es una condición necesaria pero insuficiente para el desarrollo de la enfermedad. Un suceso hipotéticamente disparador (Etapa II) conduce a la autoinmunidad activa frente a las células \beta (Etapa III). En la Etapa III, se ha hipotetizado que la masa celular \beta disminuye y se encuentran anormalidades inmunológicas tales como autoanticuerpos dirigidos contra la insulina y los islotes de los antígenos citoplásmicos. La secreción de insulina estimulada está todavía preservada en esta etapa. Sin embargo, durante un período de años, la progresiva pérdida de células \beta conduce a una secreción disminuida de insulina, de acuerdo con los análisis de tolerancia de glucosa intravenosa (IVGTT), mientras que el individuo es todavía normoglicémico (Etapa IV). La diabetes abierta (es decir, el inicio de la diabetes o la manifestación clínica de la enfermedad caracterizada por hiperglicemia) es la Etapa V, y puede desarrollarse años después cuando estén destruidas aproximadamente un 90% de las células \beta pancreáticas. En la Etapa V, cuando se reconoce por primera vez la diabetes abierta, queda alguna producción de insulina residual (tal como lo demuestra la presencia del péptido conector de proinsulina, el péptido C, en el suero) pero la individual, normalmente requiere insulina exógena de por vida. Finalmente, en la Etapa VI, incluso las restantes células \beta son destruidas y ya no puede detectarse péptido C en la circulación.

Mientras que el (los) factor(es) de iniciación y la secuencia específica de acontecimientos que conducen a la diabetes, incluyendo la importancia relativa de distintos tipos de células y citoquinas, se debate todavía ampliamente, se reconoce generalmente un papel clave a las células del reactivo T auto-antígeno (Miller y col., 1988 [5]; Harada y Makino, 1986 [6]; Koike y col., 1987 [7]; Makino y col., 1986 [8]). Además de los linfocitos T, la insulitis está caracterizada por macrófagos, células dendríticas (Voorbij y col., 1989 [9]) y células B, que pueden servir como células que presentan antígeno profesional (APC). Los macrófagos también pueden destruir las células \beta de los islotes, por sí mismos, mediante la liberación de citoquinas o radicales libres (Nomikos y col., 1986 [10]). Así, la diabetes autoinmune depende tanto de la migración celular como de la estimulación inmune de las nuevas células residentes.

El tráfico de células a los lugares inflamatorios está regulado por moléculas accesorias LFA-1, MAC-1 y VLA4 (Larson y Springer, 1990 [11]; Hemler y col., 1990 [12] sobre la superficie de los linfocitos (LFA-1, VLA4) y macrófagos (Mac-1, VLA4), y por sus contra-ligandos ICAM (para LFA-1 y MAC-1), y VCAM (para VLA4) que no son regulados por citoquinas en el endotelio vascular (Larson y Springer, 1990 [11]; Lobb, 1992 [13]; Osborn, 1990, [14]). Además, el VLA4 se enlaza a un componente de la matriz extracelular, el dominio CS-1 de fibronectina (FN) (Wayner y col., 1989 [15]). La relativa importancia de estas vías, por ejemplo, LFA-1 y VLA4 en linfocitos o MAC-1 y VLA4 en monocitos, en controlar la migración de células está todavía sujeta a investigación. Los datos in vitro sugieren que el uso diferencial de estas vías parece depender del estado de activación, tanto de los leucocitos como de las células endoteliales, (Shimizu y col., 1991 [16]). Su capacidad para controlar la migración de células a los lugares inflamatorios in vivo ha sido demostrada directamente con anticuerpos monoclonales (mAbs) al ICAM, MAC-1 o VLA4 inhibiendo varios modelos en animales de la enfermedad (Barton y col., 1989 [17], inflamación de pulmón de conejo inducido por éster de forbol; Issekutz e Issekutz, 1991 [18], hipersensibilidad de tipo retardado; Issekutz, 1991 [19], artritis inducida por adyuvante; Yednock y col., 1992 [20], transferencia de encefalomielitis alérgica experimental (EAE); Lobb, 1992 [21], asma).

El ICAM y VCAM se encuentran también en la superficie de los macrófagos y de las células dendríticas en los tejidos linfoideos (Dustin y col., 1986 [22]; Rice y col., 1990 [23]; Rice y col., 1991 [24]). Su distribución en este APC profesional es consistente con los datos funcionales que indican un papel para el LFA-1 y VLA4 en la activación celular T (Shimuzu y col., 1990 [25], Burkly y col., 1991 [26]). Sin embargo, otros numerosos pares de receptor-ligando, incluyendo CD4/MHC de clase II y CD8/MHC de clase I (Rudd y col., 1989 [27], CD2/LFA-3 (Moingeon y col., 1989 [287]), CD28/B7 (Harding y col., 1992 [29]) también pueden apoyar la adhesión o coestimular las células T durante las interacciones de células T/APC o T/objetivo. Las contribuciones específicas de estas numerosas vías al desarrollo de la diabetes están aún sin resolver. Se ha descrito una adhesión incrementada de monocitos de los pacientes de diabetes mellitus dependientes de la insulina a las células endoteliales en cultivos (Nouv. Rev. Fr. Hematol. (1992) 34 [Suppl]: 555 - 559), junto con un incremento de la expresión de las moléculas CD11b/Cd18 en la superficie de los monocitos diabéticos. Debido a que hay múltiples vías moleculares para la adhesión celular y la activación de células T, no es posible predecir si la intervención en una o más de estas vías puede afectar al inicio de la gravedad de la enfermedad de la diabetes, en particular, cuál de estas vías es crucial o relevante para el proceso de la enfermedad.

Los anticuerpos dirigidos a células T han sido utilizados en modelos de rata y en ratón para diabetes espontánea y transferencia adoptiva de diabetes para reducir las células T y así prevenir la enfermedad (ver, por ejemplo, Harada y Makino, 1986 [6], anti-Thy 1.2; Koike y col., 1987 [7], Miller y col., 1988 [5] y Shizuru y col., 1988 [30], anti-CD4; Barlow y Like, 1992 [31], anti-CD2; Like y col., 1986 [32], anti-CD5 y anti-CD8). Además, se ha utilizado un anticuerpo dirigido a la molécula del complemento del receptor tipo 3 (CR3) o a MAC-1 en los macrófagos para prevenir la infiltración de células T y macrófagos del tejido pancreático en un modelo de la enfermedad de transferencia adoptiva en ratones (Hutchings y col., 1990 [33]). Se desconoce si el VLA4 es relevante para la insulitis o para la actividad de las células específicas de los islotes después de la localización en el páncreas.

Los actuales protocolos de tratamiento sugeridos para la diabetes tipo I han incluido ciertos fármacos inmunomoduladores resumidos por Federlin y Becker [34] y las referencias por él citadas. Un largo período prediabético con anormalidades inmunológicas y una progresiva destrucción de las células \beta sugieren que puede ser posible detener la pérdida de células \beta con intervención inmune (Castano y Eisenbarth, 1990 [1]).

Los agentes/protocolos sugeridos han incluido ciertos agentes inmunomoduladores e inmunosupresores : levamisol, teofilina, hormonas tímicas, ciamexona, globulina anti-timocito, interferon, nicotinamida, infusión de gamma globulina, plasmaféresis o transfusión de glóbulos blancos. Agentes tales como la ciclosporina A y la azatioprina que perjudican la activación de las células T y el desarrollo de las células T, respectivamente, han sido utilizados en ensayos clínicos (Zielasek y col., 1989 [35]). Los resultados más prometedores se han conseguido con ciclosporina A (Castano y Eisenbarth, 1990 [1]). Federlin y Becker, 1990 [34] sugieren, sin embargo, que la ciclosporina A no puede recomendarse para uso general o prolongado debido a sus efectos secundarios tóxicos, al menos cuando se administra a dosis elevadas. Se han asociado elevadas dosis de ciclosporina o en combinación con otros fármacos inmunosupresores o ambos, con el desarrollo de linfoma y con daño irreversible en el riñón (Eisenbarth, 1986 [4]; Eisenbarth, 1987 [36]). Son necesarios estudios adicionales en otros agentes sugeridos para valorar la seguridad y eficacia. Incluso los estudios con ciclosporina A muestran que su eficacia en mantener la remisión de la diabetes es para un año de aproximadamente un 30-60% en nuevos inicios de diabetes. Sin embargo, en 3 años, las remisiones han desaparecido invariablemente (Castano y Eisenbarth, 1990 [1]). Los protocolos de tratamiento, después del inicio de la diabetes, son particularmente problemáticos ya que, por ejemplo, en el momento en que se diagnostica la diabetes en humanos, la insulitis ha progresado típicamente hasta una pérdida de más del 80% de las células \beta. Así, es posible que la ciclosporina A pueda prevenir una posterior destrucción de células \beta, pero tan pocas células \beta pueden estar presentes al inicio de la diabetes que éstas no pueden mantener un estado no diabético durante tiempo (Castano y Eisenbarth, 1990 [1]). La supresión de la insulitis y/o la prevención de la enfermedad puede tener más éxito si el tratamiento pudiera iniciarse en una fase anterior, es decir, antes del inicio de la enfermedad.

Existen dos requisitos previos necesarios para desarrollar cualquier tratamiento preventivo de la enfermedad de la diabetes: (1) la capacidad para identificar de un modo preciso al individuo prediabético y (2) el desarrollo de tratamientos preventivos específicos y efectivos, seguros. Se ha llevado a cabo un progreso significativo en la identificación de los individuos prediabéticos, aunque, sin embargo, queda mucho trabajo en el desarrollo de tratamientos preventivos, específicos, seguros, tal como han discutido y revisado Eisenbarth y colaboradores (ver, por ejemplo, Ziegler y Eisenbarth, 1990 [37]; Ziegler y col., 1990 [38]; Ziegler y col., 1990 [39]). Ha sido posible identificar ciertos factores de riesgo y grupos de riesgo para la diabetes tipo I y así predecir los individuos con mayor probabilidad de la enfermedad clínica y estimar la velocidad aproximada de inicio de la enfermedad en estos individuos. La capacidad para identificar individuos con susceptibilidad a la diabetes o para predecir la diabetes tipo I en la etapa preclínica por combinación de marcadores genéticos (determinación del tipo HLA), inmunológicos (autoanticuerpos de insulina e islotes) y metabólicos (primera fase de secreción de insulina de glucosa intravenosa precedente al desarrollo de hiperglicemia) posibilita la identificación y uso de fármacos inmunoterapéuticos profilácticos y de posibles protocolos durante la evolución del procedimiento de la enfermedad autoinmune cuando la destrucción de las células \beta es sólo parcial. Hasta la fecha, sin embargo, ha habido poco éxito en tratar la diabetes humana. Generalmente, debido a que el tratamiento humano se ha iniciado sólo después del comienzo de la enfermedad, el tratamiento ha sido seguido por una remisión parcial o completa, temporal, sólo en un cierto número de pacientes. Debido a que los mecanismos inmunosupresores pueden prevenir la insulitis y/o diabetes, hay una necesidad de componentes inmunosupresores para su utilización en la etapa prediabética. En particular, hay una necesidad para asegurar y mover, específicamente, los compuestos activos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, que inhiben la entrada de células efectivas, hacia el páncreas o la función de las células que pudieran haber entrado ya en los islotes de Langerhans.

La solicitud de patente PCT/WO 93/08823 publicada en 13 de Mayo de 1993 (citada bajo el artículo 54(3)CPE) describe compuestos guanidinílicos y compuestos relacionados de modulación de la adhesión celular que están dirigidos contra los receptores reconocedores del ácido arginina-glicina-aspártico (RGD). La diabetes Tipo I es mencionada entre las muchas enfermedades y condiciones que pueden ser dirigidas con dichos compuestos de modulación de la adhesión celular.

La solicitud de patente PCT/WO 94/16094 publicada el 21 de Julio de 1994 (citada bajo el artículo 54(3)CPE) describe moléculas de anticuerpos de anti-VLA4 recombinantes, útiles en el tratamiento de inflamación específica y no específica, incluyendo asma y enfermedad de inflamación intestinal.

Ahora ha sido sorprendente descubrir que la administración de un anticuerpo de anti-VLA4 que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de VLA4 reduce de forma significativa la incidencia de la diabetes, en un modelo de enfermedad de diabetes en roedor. El modelo de diabetes en ratón NOD es un modelo bien establecido, directamente comparable a la diabetes de tipo I en humanos. Utilizando un protocolo experimental de enfermedad transferida de forma adoptiva, se administró a ratas NOD, no-diabéticas, irradiadas, esplenocitos obtenidos de ratas NOD espontáneamente diabéticas para una transferencia aguda de la enfermedad. Estos esplenocitos se trataron con un anticuerpo del anti-VLA4 que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de VLA4 antes de la administración y los receptores también se trataron durante varios períodos de tiempo, después de la transferencia con tal anticuerpo de anti-VLA4.

Resumen de la invención

Por consiguiente, la presente invención proporciona nuevos usos para la fabricación de medicamentos para su uso en la prevención de la dependencia de insulina en individuos prediabéticos (tipo I), según se reivindica.

Así, la presente invención proporciona un uso de un anticuerpo anti-VLA4 que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 para la fabricación de un medicamento para su uso como el único medicamento en la prevención de la dependencia de insulina en individuos prediabéticos (tipo I).

En particular, el anticuerpo está seleccionado entre el anticuerpo HP1/2 o un anticuerpo de anti-VLA4 humanizado, que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 derivado de HP1/2. También se contempla el uso de anticuerpos análogos o fragmentos de anticuerpos que mimetizan la acción de los deseados anticuerpos de anti-VLA4 en el tratamiento de la diabetes.

Además, la presente invención proporciona un uso de un anticuerpo, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico o fragmentos de dichos anticuerpos capaces de enlazarse al epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 o combinaciones de cualquiera de los anteriores para la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de la diabetes, según se reivindica. También es contemplada una proteína de fusión de VCAM 2D - IgG que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4. Este agente actuará por competencia entre la proteína de enlace a la superficie de la célula y el VLA4.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico en que se muestra el efecto del anticuerpo de anti-VLA4 (R1-2) y de los controles en la prevención de la diabetes después de la transferencia adoptiva de células del bazo; se muestra la frecuencia de receptores que devienen diabéticos y el día del inicio de la enfermedad para la transferencia de 2 x 10^{7} esplenocitos a partir de donadores NOD diabéticos (D) sin tratamiento (círculos cerrados), con un tratamiento IgG2b en ratas no específicas (triángulos cerrados), y con un tratamiento con anti-VLA4 R1-2 (diamantes cerrados), así como para la transferencia de esplenocitos a partir de donantes NOD no diabéticos (Y) (cuadrados abiertos); los esplenocitos se transfirieron con R1-2 o IgG2b de rata o sin mAb, y a continuación se inyectó R1-2 o IgG2b de rata en días alternos hasta el día 12 después de la transferencia (n = 8-10 para todos los grupos).

La Figura 2 es un gráfico que representa el efecto del anticuerpo anti-VLA4 (R1-2) y de los controles en la prevención de la diabetes después de transferencia adoptiva de células de bazo; se muestran la frecuencia de los receptores que devienen diabéticos y el día del inicio de la enfermedad para la transferencia de 3 x 10^{7} esplenocitos a partir de donantes NOD diabéticos (D) sin tratamiento (círculos cerrados), con un tratamiento IgG2b en ratas no específicas (triángulos cerrados) y con tratamiento con anti-VLA4 R1-2 (diamantes cerrados), así como para la transferencia de esplenocitos a partir de donantes NOD no diabéticos (Y) (cuadrados abiertos); los esplenocitos se transfirieron con R1-2 o IgG2b de rata o sin Mab y a continuación el R1-2 o el IgG2b de rata se inyectó cada 3,5 días hasta el día 25 después de la transferencia (n = 4-5 para todos los grupos).

La Figura 3 es un gráfico que representa el efecto del anticuerpo anti-VLA4 (R1-2) y de los controles en la prevención de la diabetes después de la transferencia adoptiva de células de bazo; se muestra la frecuencia de los receptores que devienen diabéticos y el día del comienzo de la enfermedad para la transferencia de 2-3 x 10^{7} esplenocitos para donantes NOD diabéticos (D) sin tratamiento (círculos cerrados), con un tratamiento con IgG2b en ratas no específicas (triángulos cerrados) y con tratamiento con anti-VLA4 R1-2 (diamantes cerrados), así como para la transferencia de esplenocitos a partir de donantes NOD no diabéticos (Y) (cuadrados abiertos) o para PBS sólo (círculos abiertos); los esplenocitos se transfirieron con R1-2 o IgG2b de rata o sin Mab y a continuación el R1-2 o el IgG2b de rata se inyectó cada 3,5 días hasta el día 25 después de la transferencia (n = 5 para todos los grupos).

La Figura 4 es un diagrama de barras que muestra el efecto del anticuerpo anti-VLA4 (R1-2) y de los controles en el grado de insulitis después de la transferencia adoptiva de células de bazo; se cuantificó y representó la frecuencia de los islotes no infiltrados (infiltrado de Grado 0-I, barra punteada) y de los islotes infiltrados (insulitis de Grado II-IV, barras negras) después de la transferencia de células tratadas con R1-2, IgG2b de rata o sin Mab y a continuación el R1-2 o el IgG2b de rata se inyectó cada 3,5 días hasta el día 25 con ratas sacrificadas cuando se mostraron diabéticas o en el día 26 después de la transferencia. Se valoraron las secciones pancreáticas de n = 4-5 ratas para cada grupo experimental, es decir, Y \rightarrow Y (células de donantes no diabéticos) o D \rightarrow Y (células de donantes diabéticos) en receptores (Y) no diabéticos con ningún tratamiento Mab, ni tratamiento con IgG2b de rata, ni tratamiento con R1-2.

La Figura 5 es un diagrama de barras que muestra el efecto del anticuerpo anti-VLA4 (R1-2) y los controles en el grado de insulitis después de transferencia adoptiva de células de bazo; se cuantificó y mostró la frecuencia de los islotes no infiltrados (infiltrado de Grado O-I, barras punteadas) y de los islotes infiltrados (insulitis de Grado II-IV, barra negra) después de la transferencia de células tratadas con R1-2, IgG2b de rata o sin Mab y, a continuación, se inyectó R1-2 o IgG2b de rata cada día alterno hasta el día 12 después de la transferencia, manteniéndose a continuación sin ninguna inyección posterior de Mab hasta que se sacrificaron cuando se mostraron diabéticas o en el día 29 después de la transferencia. Se valoraron las secciones pancreáticas para n = 4-5 ratas para cada grupo experimental, es decir, Y \rightarrow Y (células de donantes no diabéticos) o D \rightarrow Y (células de donantes diabéticos) en receptores (Y) no diabéticos con ningún tratamiento con Mab, ni tratamiento con IgG2b de rata, ni tratamiento con R1-2.

La Figura 6 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo anti-VLA4 (R1-2) y de los controles en la prevención de la diabetes en un modelo de enfermedad espontánea de diabetes; la frecuencia de los receptores que devienen diabéticos y el día del inicio de la enfermedad se muestran para ratas NOD sin tratamiento (cuadrados cerrados), con un tratamiento con IgG2b de rata no específico (círculos cerrados), y con tratamiento con anti-VLA4 R1-2 (triángulos cerrados); se inyectó R1-2 o IgG2b de rata durante 8 semanas en ratas NOD dos veces por semana desde la edad de cuatro semanas hasta las doce.

La Figura 7 es un gráfico que muestra el efecto de la proteína de fusión VCAM 2D-IgG que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 y de los controles en la prevención de la diabetes después de la transferencia adoptiva de células de bazo; la frecuencia de los receptores que devinieron diabéticos y el día del inicio de la enfermedad se muestran para la transferencia de 2 x 10^{7} esplenocitos para donantes NOD (D) diabéticos con un tratamiento de proteína de fusión LFA-3Ig de rata irrelevante (cuadrados cerrados) y con tratamiento con VCAM 2D-IgG que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 (círculos abiertos) o de receptores que recibieron PBS sólo, sin células transferidas, (triángulos cerrados); los esplenocitos se transfirieron con VCAM 2D-IgG que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 o LFA-3Ig de rata y, a continuación, se inyectó VCAM 2D-IgG que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 o LFA-3Ig de rata cada día alterno desde el día 17 después de la transferencia (n = 5 para todos los grupos).

La Figura 8 es una representación esquemática de la estructura de la proteína de fusión VCAM 2DIgG que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 de VLA4 descrita en el Ejemplo 5. El VCAM 2D-IgG que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 es una forma soluble del ligando para VLA4 (VCAM1) y consiste en los dos dominios N-terminales de VCAM1 fusionados a las secuencias de la región constante de la cadena pesada de IgG1 humano (Hinges, C_{H}2 y C_{H}3).

Descripción detallada de la invención

La invención concierne a un tratamiento que incluye la prevención de la diabetes insulino dependiente (tipo I). Más particularmente, la invención concierne al uso de anticuerpos al epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 en el tratamiento de la diabetes en un individuo prediabético. El término "prediabético" se da en el sentido de un individuo con riesgo de desarrollar la enfermedad de la diabetes (por ejemplo, predispuesto genéticamente) en cualquier estadio del proceso de la enfermedad previo a la diabetes manifiesta o al ataque de diabetes. El término "diabético" se da en el sentido de un individuo con hiperglicemia manifiesta (es decir, con niveles de glucosa en sangre en ayunas \geq 250 mg/dL). El término "diabetes manifiesta" o "ataque de diabetes" se da en el sentido de un estado de enfermedad en el que las células de islote pancreáticas se han destruido, y que se manifiesta clínicamente por una hiperglicemia manifiesta (es decir, con niveles de glucosa en sangre en ayunas \geq 250 mg/dL).

En el primer aspecto, la invención concierne a un tratamiento de la diabetes que comprende la etapa de administrar una composición la cual incluye un anticuerpo que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 o una proteína de fusión de VCAM 2D - IgG que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 capaz de ligarse, incluyendo inmovilizar o recubrir, el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 sobre la superficie de las células VLA4-positivas, comprendiendo los linfocitos y los macrófagos. A efectos de la invención, el término "ligarse el epítopo" B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 se da en el sentido de provocar una reacción con el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 de los antígenos VLA4 sobre las células y con ello interferir con interacciones entre los antígenos VLA4 y VCAM-1, o entre los antígenos VLA4 y la fibronectina, sobre la superficie de las células, o con ello inducir un cambio en la función de las células VLA4-positivas. Tal como aquí se demuestra, tal ligado, que incluye la inmovilización o el recubrimiento del epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 da como resultado la prevención de, o la protección contra la incidencia de la diabetes. Esta exposición utiliza un anticuerpo monoclonal contra el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 de VLA4 como agente ligante/coordinador, el cual inmoviliza o bloquea efectivamente el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4.

En una realización preferida el anticuerpo deseado que es utilizado en el uso de la invención para ligarse, incluyendo inmovilizar o recubrir con el deseado VLA4 de la superficie de la célula es un anticuerpo monoclonal o un productor de anticuerpos. Entre los deseados productores de anticuerpos preferidos para el tratamiento, en particular para el tratamiento humano, se incluyen anticuerpos recombinantes humanizados, anticuerpos recombinantes quiméricos, fragmentos de anticuerpo Fab, Fab', F(ab')_{2}, y F(v), y monómeros o dímeros de cadenas, pesadas o ligeras, de anticuerpo, o entremezclas de los mismos, que sea capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4. De ese modo, en el método de acuerdo con la invención, los anticuerpos monoclonales contra el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 son los agentes ligantes preferidos.

La tecnología para producir anticuerpos monoclonales es bien conocida. Brevemente, una línea de células inmortales (típicamente células de mieloma) se fusiona con linfocitos (típicamente esplenocitos) procedentes de un mamífero inmunizado con células enteras con manifestación de un antígeno dado, por ejemplo, VLA4, y los supranadantes del cultivo de las células de hibridoma resultantes se exploran en busca de anticuerpos contra el antígeno. (Ver, de manera general, Kohler y otros, 1975 [40]).

La inmunización se puede lograr utilizando procedimientos estándar. La dosis unitaria y el régimen de inmunización depende de la especie del mamífero inmunizado, su inmuno-estado, el peso del cuerpo del mamífero, etc. Típicamente, los mamíferos inmunizados se sangran y el suero de cada muestra de sangre se analiza en busca de anticuerpos particulares utilizando análisis de exploración apropiados. Por ejemplo, los anticuerpos del VLA4 pueden ser identificados por inmuno-precipitación de lisatas de células ^{125}I-marcadas procedentes de células con manifestación de VLA4. (Ver, Sanchez-Madrid y otros, 1986 [41] y Helmer y otros, 1987 [42]). Los anticuerpos anti-VLA4 también pueden ser identificados por citometría de flujo, por ejemplo, mediante la medición del teñido fluorescente de células de Ramos incubadas con un anticuerpo que potencialmente puede reconocer el VLA4 (ver Elices y otro, (1990) [43]). Típicamente, los limfocitos utilizados en la producción de células de hibridoma se aislan de mamíferos inmunizados cuyo suero tiene ya prueba positiva de la presencia de anticuerpos anti-VLA4 utilizando tal análisis de
exploración.

Típicamente, la línea de células inmortales (por ejemplo, una línea de células de mieloma) se obtiene de la misma especie de mamífero que los limfocitos. Las líneas de células inmortales preferidas son las líneas de célula de mieloma de ratón que responden a un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT").

Típicamente, las células de mieloma de ratón HAT-sensibles se fusionan a esplenocitos de ratón utilizando glicol de polietileno de peso molecular 1500 ("PEG 1500"). Luego, las células de Hibridoma resultantes de la fusión se seleccionan utilizando un medio HAT, el cual mata las células de mieloma no fusionadas e inproductivas (a menudo los esplenocitos mueren al cabo de varios días a causa de que no se han transformado). Explorando los supranadantes del cultivo de hibridoma se detectan los hibridomas que producen un anticuerpo deseado. Por ejemplo, se pueden explorar hibridomas preparados para producir los deseados anticuerpos anti-VLA4 examinando el supranadante del cultivo de hibridoma en busca de anticuerpos secretados con la capacidad de ligarse al epítopo B1 o B2 de una línea de células con manifestación de \alpha_{4}-subunidad-recombinante, tal como las células K-562 transfectadas (ver Elices y otros [43]).

Para producir los deseados anticuerpos anti-VLA4, las células de hibridoma que han dado positivo en tales análisis exploratorios, se cultivaron en un medio nutriente bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que las células de hibridoma secreten los anticuerpos monoclonales en el medio de cultivo. Son bien conocidas las técnicas de cultivo de tejidos y los medios de cultivo indicados para las células de hibridoma. El supranadante del cultivo del hibridoma condicionado puede ser recogido y, opcionalmente, los deseados anticuerpos anti-VLA4 pueden ser ulteriormente purificados mediante métodos bien conocidos.

Alternativamente, el anticuerpo deseado se puede producir inyectando las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón no inmunizado. Las células de hibridoma proliferan en la cavidad peritoneal secretando el anticuerpo, el cual se acumula como fluido de ascitis. El anticuerpo deseado puede ser recolectado retirando el fluido de ascitis de la cavidad peritoneal con una jeringa.

Varios anticuerpos monoclonales anti-VLA4 de ratón ya han sido descritos previamente (ver, por ejemplo, Sanchez-Madrid y otros, 1988 [41]; Helmer y otros, 1987 [42]; Pulido y otros, 1991 [44]). Estos anticuerpos monoclonales anti-VLA4 tales como el HP1/2 y otros anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, mAb HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9) capaces de reconocer el epítopo B1 o B2 de la cadena \alpha del VLA4 serán útiles en los métodos de tratamiento de acuerdo con la presente invención. Se prefieren los anticuerpos anti-VLA4 que pueden reconocer los epitopos B1 o B2 de la cadena VLA-\alpha_{4} involucrados en el ligado con el VCAM-1 y los grupos coordinadores de fibronectina (es decir, anticuerpos que pueden ligarse al epítopo B1 o B2 de VLA4 en un sitio involucrado en el reconocimiento de grupos coordinadores, e inmovilizar el ligado con el VCAM-1 y la fibronectina). Tales anticuerpos han sido definidos como anticuerpos B epitopo-específicos (B1 o B2) (ver Pulido y otros (1991) [36]). El anticuerpo R1-2 utilizado tal como aquí se describe es un anticuerpo del tipo B epitopo.

Otro agente ligante preferido son los anticuerpos monoclonales humanos contra el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4, los cuales pueden inmovilizar o recubrir el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 de los antígenos VLA4 según el método de la invención. Éstos pueden ser preparados utilizando esplenocitos humanos preparados in vitro, tal como describe Boerner y otros, 1991 [45]. Alternativamente, pueden ser preparados mediante clonación de repertorio, tal como describe Persson y otros, 1991 [46], o Huang y Stollar, 1991 [47]. Otro agente ligante que puede inmovilizar o recubrir el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 de los antígenos VLA4 según el método de la invención es un anticuerpo quimérico recombinante con especificidad de epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 anti-VLA4 y una región constante de anticuerpo humano. Todavía otro agente ligante preferido que puede inmovilizar o recubrir el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 de los antígenos VLA4 según el método de la invención es un anticuerpo recombinante humanizado con especificidad de epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 anti-VLA4. Los anticuerpos humanizados se prepararán tal como se ejemplifica en Jones y otros, 1986 [48], Riechmann y otros, 1988 [49], Queen y otros, 1989 [50], y Orlandi y otros, 1989 [51]. Los agentes ligantes preferidos, que incluyen los anticuerpos recombinante quimérico y recombinante humanizado con especificidad B epitopo, han sido preparados y se describen en la solicitud de patente internacional de propiedad compartida WO 9416094, publicada el 21 de Julio de 1994 [52]. El material de partida para la preparación de los deseados anticuerpos anti-VLA4 quimérico (ratón V - Humano C) y de los deseados anticuerpos anti-VLA4 humanizados puede ser un anticuerpo de epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 anti-VLA4 monoclonal murino tal como se ha descrito previamente, un anticuerpo de epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 anti-VLA4 monoclonal asequible comercialmente (por ejemplo, HP2/1, Amac International Inc. Westbrook, Maine), o un anticuerpo de epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 anti-VLA4 monoclonal preparado de acuerdo con las explicaciones de esta memoria. Por ejemplo, las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo anti-VLA4 HP1/2 han sido clonadas, secuenciadas y manifestadas en combinación con regiones constantes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina humana. Tal deseado anticuerpo quimérico HP1/2 es similar en cuanto a especificidad y potencia al anticuerpo murino HP1/2, y puede ser útil en métodos de tratamiento de acuerdo con la presente invención. La secuencia de DNA HP1/2 V_{H} y sus secuencias de aminoácido transferidas se han dispuesto en las SEC ID Nº: 1 (secuencia de identificación nº 1) y SEC ID Nº: 2, respectivamente. La secuencia de DNA HP1/2 V_{K} y sus secuencias de aminoácido trasladadas se han dispuesto en las SEC ID Nº: 3 y SEC ID Nº: 4, respectivamente. De manera similar, los anticuerpos de epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 anti-VLA4 recombinantes humanizados serán útiles en estos métodos. Uno de los anticuerpos anti-VLA4 recombinantes humanizados preferido es un anticuerpo AS/SVMDY, por ejemplo, el anticuerpo AS/SVMDY producido por la línea de células depositada ante la ATCC el 3 de noviembre de 1992, y a la que se le dio el nº de acceso CRL 11175. El anticuerpo AS/SVMDY humanizado es al menos equipotente con, o tal vez más potente que el anticuerpo murino HP1/2. La secuencia de DNA AS V_{H} y sus secuencias de aminoácido trasladadas se han dispuesto en las SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 6, respectivamente. La secuencia de DNA SVMDY V_{K} y sus secuencias de aminoácido trasladadas se han dispuesto en las SEC ID Nº: 7 y SEC ID Nº: 8,
respectivamente.

Alternativamente, los agentes ligantes usados en el uso relacionado con la invención pueden no ser anticuerpos o derivados de anticuerpos, sino que en su lugar puede ser una proteína de fusión de VCAM 2D - IgG que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4. Estos agentes ligantes van a actuar compitiendo con la proteína de la superficie de la célula ligante del VLA4.

En este uso relacionado con el primer aspecto de la invención, los deseados agentes ligantes del VLA4 son administrados, de manera preferida, parenteralmente. Los deseados agentes ligantes del VLA4 se administran preferiblemente como una composición farmacéutica estéril que contiene un portador farmacéuticamente aceptable, que puede ser cualquier de los numerosos portadores bien conocidos, tales como agua, solución salina, solución salina tamponada de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, o combinaciones de los mismos. Preferiblemente, si el deseado agente ligante del VLA4 es un anticuerpo o un derivado de anticuerpo, éste debe ser administrado a una dosis dentro del intervalo de entre aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal/día y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal/día, preferiblemente dentro del intervalo de entre aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal/día y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, y a intervalos de cada 1-14 días. Para VCAM 2D - IgG el intervalo de la dosis debe estar preferiblemente entre unas cantidades de equivalentes molares y estas cantidades de anticuerpo. Preferiblemente, una composición de anticuerpo se administra en una cantidad efectiva para proporcionar un nivel de anticuerpo en plasma de al menos 1 \mug/ml. La optimización de las dosificaciones se puede determinar mediante la administración de los agentes ligantes seguida por la evaluación del revestimiento de las células VLA4-positivas por parte del agente al cabo de un tiempo después de haber sido administrado in vivo a una dosis determinada. En las células mononucleares de sangre periférica, contenidas en una muestra de la sangre periférica del individuo, se puede tratar de encontrar la presencia del agente in vitro (o ex vivo) utilizando un segundo reactivo para detectar el agente administrado. Por ejemplo, éste puede ser un anticuerpo marcado con fluorocromo específico para el deseado anticuerpo o la deseada proteína de fusión de VCAM 2D - IgG administrada, el cual se mide luego mediante análisis de FACS (fluorescent activated cell sorter) (distribuidor de célula activada por fluorescencia). Alternativamente, la presencia del deseado anticuerpo o la deseada proteína de fusión de VCAM 2D - IgG administrada se puede detectar in vitro (o ex vivo) mediante la incapacidad, o la capacidad disminuida, de las células del individuo para ligar el mismo agente que se ha marcado a sí mismo (por ejemplo, mediante un fluorocromo). La dosificación preferida debe producir un recubrimiento detectable en una amplia mayoría de células VLA4-positivas. Preferiblemente, el recubrimiento se sostiene, en el caso de un deseado anticuerpo monoclonal o un derivado de anticuerpo monoclonal deseado, durante un período de
1-14 días.

El tratamiento con los deseados agentes ligantes del VLA4 se continúa preferiblemente durante tanto tiempo como el sujeto prediabético mantenga un nivel de plasma normoglicémico estable y un estado prediabético estable reflejado por un determinado número de marcadores conocidos, tal como se ha descrito anteriormente. En los ejemplos siguientes, se ha encontrado que la administración de un anti-VLA4 mAb capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4, por ejemplo, R1-2 mAb, ha prevenido el ataque de diabetes durante el tratamiento y que los resultados beneficiosos residuales del tratamiento se extendieron hasta transcurridos dos meses después de haber cesado el tratamiento con R1-2. Sin embargo, para mantener el pleno efecto protector del deseado agente ligante del VLA4 frente al ataque de diabetes se prefiere un tratamiento continuado con los agentes ligantes.

El uso al que está relacionada la presente invención comprende la administración a un individuo prediabético de una composición que comprende un anticuerpo anti-VLA4 capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4. Los ejemplos siguientes disponen sucesivamente los resultados observados en un modelo de enfermedad de roedor. Estos resultados exponen un efecto protector del deseado anticuerpo anti-VLA4 en el ataque de la enfermedad en el modelo de transferencia agudo de la enfermedad. El ratón diabético no obeso (NOD) se ha convertido en un importante modelo diabetes mellitus tipo I o insulino-dependiente desde que fue introducido por Makino y otros en 1980 [7] y ha sido documentado como un modelo particularmente relevante para la diabetes humana (ver, por ejemplo, Castano y Eisenbarth [1], Miller y otros, 1988 [5], Hutchings y otros, 1990 [33] y las referencias citadas en los mismos). Que los síndromes diabéticos mostrados en los ratones NOD y en los humanos son similares es bien conocido a través de varios caminos de evidencia. Por ejemplo, tanto en los ratones NOD como en los humanos [1], existe una fuerte asociación genética de la diabetes con posiciones del principal compuesto de histo-compatibilidad. Además, por ejemplo, en ambas especies, se ha evidenciado una patogénesis de autoinmunidad mediante (i) la presencia de una inflamación linfocítica en los islotes pancreáticos (es decir, insulitis) que aparece por medio de la destrucción selectiva de las células \beta, (ii) la presencia de anticuerpos de células anti islotes, y (iii) los efectos moduladores de la ciclosporina A. Una evidencia adicional de la presencia de una etiología autoinmune en la enfermedad de la diabetes en los ratones MOD es (i) la capacidad para transferir la diabetes con las células del bazo (incluyendo células T esplénicas purificadas) procedentes de donantes diabéticos, (ii) la prevención de la diabetes mediante tratamiento in vivo con anticuerpos específicos para las células T, y (iii) el fallo de los ratones desnudos tímicos con antecedentes genéticos de NOD para desarrollar diabetes (ver, por ejemplo, Miller y otros, 1988 [5], Hutchings y otros, 1990 [33] y las referencias citadas en los mismos).

A pesar de que los acontecimientos precisos que se producen en la diabetes permanecen poco claros, en el ratón NOD una respuesta inflamatoria progresiva en el páncreas parece ser la lesión histológica inicial, la cual empieza como una célula mononuclear periductal/perivascular infiltrada a la edad de 3-4 semanas. A las, aproximadamente, 4-6 semanas de edad, se puede observar la insulitis, y empezando alrededor de las aproximadamente 12 semanas de edad la diabetes manifiesta (es decir, valores consistentes de 1+, o más altos, utilizando un análisis Testape (Eli Lilly, Indianapolis, IN) en busca de glicosurina, o mayor de 250 mg/dL si la glucosa en plasma está controlada). Para impedir variaciones en el inmuno estado de los animales, los ratones NOD se obtienen a partir de colonias libres de patologías específicas y que exhiben una alta incidencia, estable, de diabetes en aproximadamente el 80% de las hembras y aproximadamente el 20% de los machos, que típicamente adquieren la diabetes, aproximadamente, a las 20 semanas de edad. La fuente/origen preferida de los ratones NOD utilizados en los experimentos descritos en esta memoria es Taconic Farms (Germantown, NY). Un amplio cuerpo de datos, particularmente procedentes de estudios de la rata BB y del ratón NOD, indica que la diabetes tipo I puede ser una enfermedad en la que intervienen células T. La evidencia de los datos sugiere que las dos principales subpoblaciones de células T (CD4/L3T4 y CD8/Ly2) juegan un importante papel en el desarrollo de la diabetes en el hombre y en el ratón NOD. Los datos que sostienen el papel esencial de las células T en la diabetes no excluyen la posibilidad de que los T limfocitos puedan reclutar otras células ( por ejemplo, macrófagos) como ejecutores finales de la destrucción de las células \beta. Los macrófagos han sido implicados en el proceso de la enfermedad en base a su presencia en los islotes infiltrados y en la capacidad del tratamiento crónico a base de sílice para prevenir la enfermedad (ver, por ejemplo, Hutchings y otros, 1990 [33] y las referencias citadas en el mismo).

Utilizando la cepa NOD de ratones, los investigadores han desarrollado un modelo de transferencia aguda de la enfermedad que presenta como paralelismo con el modelo de enfermedad espontánea que las células de transferencia producidas por ratones NOD diabetogénicos intervienen en el proceso, el cual se caracteriza por unas células reactivas inmunes que intervienen en la insulitis y en la destrucción específica de las células \beta de los islotes. Además, en este modelo, se ha mostrado que ciertos anticuerpos monoclonales contra células T (ver, por ejemplo, Miller y otros, 1988 [5]) y contra macrófagos (ver, por ejemplo, Hutchings y otros, 1990 [33]) anulan el ataque de la enfermedad. Tales anticuerpos monoclonales se han utilizado en el tratamiento de la enfermedad espontánea y en la enfermedad transferida adoptivamente, por ejemplo, los anticuerpos anti-CD4 se ha mostrado que anulan la enfermedad en ambos modelos (Miller y otros, 1988 [5] y Shizuru y otros, 1988 [30]). Los resultados del tratamiento con un agente en el modelo de transferencia adoptiva o en el modelo de la enfermedad espontánea son indicativos de la capacidad del agente para modular el proceso humano de la enfermedad.

Ejemplo 1 Efecto del tratamiento del anticuerpo anti-VLA4 en diabetes de transferencia adoptiva

Para los experimentos de diabetes de transferencia adoptiva se obtuvieron ratones NOD de Taconic Farms (Germantown, NY) o de Joslin Diabetes Center (Boston, MA). Se utilizaron hembras espontáneamente diabéticas (D) de ataque reciente (13-20 semanas de edad) como donantes de células de bazo, y hembras no diabéticas (Y), de 8 semanas de edad, sirvieron de receptoras. Como control negativo se utilizaron células del bazo de donantes hembras no diabéticas (Y), de 4 semanas de edad, que fallaron en la transmisión de la enfermedad.

Los ratones receptores se colocaron en agua acidulada (una disolución del 1:8400 de concentración de Hcl en agua) una semana antes de la irradiación subletal (775 rad) realizada en dosis repartidas (300 rad, 300 rad y 175 rad) en cada uno de los tres días (día -2, -1 y el día de la transferencia), con el fin de minimizar cualquier incidencia de infección intestinal como consecuencia de las altas dosis de radiación (fuente Gamma Cell Cesium^{137}, Nordion International, Inc., Ontario, Canada). Se recolectaron los bazos procedentes de los donantes diabéticos o de los controles no diabéticos, se hicieron suspensiones de células y lisis de células rojas con solución Hemilytic Geys. Las células del bazo se inyectaron intravenosamente (2-3 x 10^{7} en 0,2 ml PBS) pretratadas tanto con 75 \mug de anticuerpo monoclonal R1-2 (mAb) como con 75 \mug de IgG2b de rata, o no tratadas. Para el tratamiento con el anticuerpo, las células se suspendieron simplemente al 1-1,5 x 10^{8} células/ml con mAb al 375 \mug/ml y mantenidas sobre hielo hasta el momento de la inyección. El momento de la inyección fue tres horas después de la última irradiación. Algunos receptores recibieron PBS sólo. El anti-VLA4 mAb R1-2 y el isotipo emparejado IgG2b de rata fueron adquiridos de Pharmingen (La jolla, CA). El R1-2 (anti-ratón de rata) anti-VLA4 mAb fue descrito originariamente por Holzmann y otros, 1989 [53]. El R1-2 anti-VLA4 mAb inmoviliza el VLA4 ligándolo a sus grupos coordinadores (Hession y otros, 1992 [54]) y por lo tanto pertenece por definición al grupo B (Pulido y otros, 1991 [44], es decir, es equivalente a los mAbs del VLA4 anti-humano del grupo B (por ejemplo, el Hp1/2 o Hp2/1).

El R1-2 mAb o IgG2b de rata fue administrado intra-peritonealmente a una dosis de \mug/0,2 ml cada 2-3 días, un régimen de dosificación que se determinó para mantener un máximo recubrimiento de las células VLA4-positivas en la sangre periférica, órganos linfoides y médula del hueso, detectadas por el teñido de suspensiones de células de sangre periférica y de célula única, preparadas a partir de estos órganos, con un mAb marcado con fluorocromo específico para el mAb R1-2 y por el análisis FACS para medir las células con fluorocromo positivo (tal como se ha descrito anteriormente). Las inyecciones se mantuvieron hasta el día 12 o día 14 post transferencia. Los ratones fueron controlados en cuanto a la diabetes mediante pruebas de glicosuria con TesTape (EliLilly, Indianapolis, IN) y mediante los niveles de glucosa en plasma (Glucometer, 3 Blood Glucose Meter, Miles, Inc., Elkhart, IN), y se consideraron diabéticos después de dos pruebas de orina positivas consecutivas [valores de Testape de [+1] o superiores] o niveles de glucosa en plasma > 250 mg/dL.

Se demostró un efecto inhibidor del mAb anti-VLA4 sobre el ataque de diabetes cuando las células de bazo aisladas de donantes diabéticos NOD se trataron con una cantidad saturante de mAb anti-VLA4 R1-2, seguida por la transferencia a huéspedes irradiados no diabéticos, tal como se ha descrito anteriormente, y luego el mAb R1-2 se administró cada uno de los otros días, durante 12 días, con el fin de mantener el máximo recubrimiento de todas las células VLA4-positivas en la sangre periférica y órganos linfoides durante dos semanas. La Figura 1 muestra la frecuencia de los receptores que adquirieron la diabetes y el día del ataque de la enfermedad por transferencia de 2 x 10^{7} esplenocitos procedentes de donantes NOD (D \rightarrow Y) (i) sin tratamiento (círculos cerrados); (ii) con tratamiento de IgG2b de rata (triángulos cerrados), y (iii) con tratamiento anti-VLA4 R1-2 (diamantes cerrados) así como también por transferencia de esplenocitos procedentes de donantes no diabéticos NOD (Y \rightarrow Y) (cuadrados abiertos). La inyección del PBS sólo dio un 0% de incidencias. Bajo estas condiciones, solo 1 de cada 8 individuos receptores tratados con mAb R1-2 adquirieron la diabetes, con el ataque en el día 29 post transferencia. Por contraste, 6/10 y 5/9 individuos adquirieron la diabetes después de recibir esplenocitos de donantes diabéticos tratados sin mAb, o con IgG2b de rata no específico, respectivamente. Tal como se muestra en la Figura 1, el ataque de diabetes se produjo tan pronto como el día 14 post transferencia, a pesar de que la administración del irrelevante IgG2b de rata retardó en cierta medida el ataque.

Estos datos demuestran un efecto protector del mAb R1-2 dependiendo de su especificidad para el epítopo aB1 de la subunidad \alpha4 del VLA4. Los receptores de esplenocitos procedentes de ratones no diabéticos, o de PBS sólo, no adquirieron la diabetes. Así, el tratamiento con los deseados anticuerpos anti-VLA4 redujo la frecuencia de la diabetes durante 30 días post transferencia.

A pesar de que los resultados mostrados en la Figura 1 demuestran que la diabetes clínica se produjo en solo 1 de cada 8 animales tratados con anti-VLA4, es posible que el anticuerpo anti-VLA4 causara solamente un retardo menor en el ataque de la enfermedad. Los niveles de glucosa en plasma se controlaron en paralelo con la glucosa en orina con el fin de cuantificar cualquier incremento en los niveles de azúcar en sangre, y con ello detectar la progresión de la enfermedad clínica. En el grupo tratado con el anticuerpo anti-VLA4 mostrado en la Figura 1, todos los ratones se mostraron todavía normoglicémicos en el día 29, con un valor de glucosa en plasma promedio de 100 \pm 7 mg/dL, n = 7, excepto para el único individuo que se registró como clínicamente diabético mediante la prueba de orina y glucosa en plasma >500 mg/dL. De esta forma, la progresión de la enfermedad no fue aparente en ninguna de los otros receptores tratados con el anticuerpo anti-VLA4 mostrados en la Figura 1 en el día 29 post transferencia, dos semanas enteras más allá de la última inyección del anticuerpo anti-VLA4. El análisis del suero procedente de estos ratones confirmó que el anti-VLA4 mAb descendieron en gran medida o presentaron niveles indetectables sobre el día 18-21 post transferencia.

Se realizaron transferencias adicionales de células con el fin de confirmar que el deseado mAb anti-VLA4 protegió contra la transferencia de la diabetes. En estos experimentos, el tratamiento con el anticuerpo anti-VLA4 se prolongó hasta 25 días post transferencia, pero administrado cada 3,5 días, para con ello mantener niveles sostenidos de R1-2 o IgG2b de rata hasta el día 26, en el que los ratones fueron sacrificados para extraerles tejido pancreático. Bajo estas condiciones, también se demostró un efecto inhibidor del mAb anti-VLA4 capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 sobre el ataque de diabetes en base a la transferencia de células del bazo y el tratamiento con R1-2. La Figura 2 muestra la frecuencia de los receptores (n = 4-5 para cada grupo) que adquirieron la diabetes y el día del ataque de la enfermedad por transferencia de 3 x 10^{7} esplenocitos procedentes de donantes NOD (D \rightarrow Y) (i) sin tratamiento (círculos cerrados), (ii) con tratamiento de IgG2b (triángulos cerrados) y con tratamiento de R1-2 anti-VLA4 (diamantes cerrados), así como por transferencia de esplenocitos procedentes de donantes no diabéticos NOD (Y \rightarrow Y; cuadrados abiertos). La inyección de PBS sólo tuvo un 0% de incidencia. La Figura 2 muestra que solo 1 de entre 5 ratones tratados con mAb R1-2 adquirió la diabetes en el día 22 post transferencia mientras que la diabetes se transfirió en 4/4 receptores sin mAb R1-2 y 5/5 tratados con IgG2b de rata. El ataque de la enfermedad se produjo tan pronto como el día 13 post transferencia. Estos experimentos demuestran, individual y colectivamente, que el mAb anti VLA4 capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 protege, de manera reproducible, contra el desarrollo de la diabetes en un modelo de transferencia aguda de la enfermedad.

Se llevaron a cabo experimentos ulteriores para determinar cuál de los deseados mAb anti-VLA-4 simplemente retrasaba el ataque de la enfermedad durante el período de tratamiento o si éste podía conseguir un efecto protector a más largo plazo. La Figura 3 muestra el ataque de diabetes en ratones, con el transcurso del tiempo después de la inyección de R1-2 (una cada 3,5 días hasta el día 25), con solo 2/5 ratones que adquirieron la diabetes en los días 35 y 38 post transferencia, 10-13 días después de la última inyección. Por contraste, la diabetes se produjo, en los grupos no tratados o tratados con IgG2b tan pronto como el día 11 post transferencia, con un 100% de incidencia en los días 18-21. Sorprendentemente, la incidencia de la enfermedad en el grupo tratado con R1-2 no aumentó, incluso en el transcurso de los 2 meses siguientes a la última inyección de R1-2. Los valores de glucosa en plasma controlados en paralelo durante este tiempo revelan que estos tres individuos eran consistentemente normoglicémicos. Después de este momento (es decir, aproximadamente 3 meses post transferencia), incluso los grupos de control negativos que recibieron PBS sólo o células no diabéticas comenzaron a desarrollar la enfermedad espontánea. En resumen, el mAb específico para el VLA-4 capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 reduce la incidencia de la transferencia de la diabetes. Además, su efecto protector contra le enfermedad se sostiene en ausencia de ulterior tratamiento con mAb.

Ejemplo 2 Efecto del mAb anti-VLA4 capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 en la insulitis pancreática

Para el análisis histológico, los ratones fueron sacrificados entre 2-4 semanas después de la transferencia, tal como se describe en este Ejemplo, y se recolectó la pancreata en una solución salina tamponada formalina al 10% en porciones embebidas en parafina que se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para la histología. El grado de insulitis se puntuó de la manera siguiente: Grado 0: sin insulitis [islote desprovisto de inflamación]; Grado I: peri-insulitis [células mononucleares inflamatorias localizadas en la periferia del islote]; Grado II: <25% infiltrado [<25% del interior del islote contiene células inflamatorias linfocíticas]; Grado III: 25-50% infiltrado [infiltración linfocítica]; Grado IV: >50% infiltrado. Luego el porcentaje de islotes en cada grado se calculó en relación al número total de islotes examinado. La secciones Histológicas se examinaron y puntuaron acerca del grado de insulitis siguiendo la transferencia adoptiva de esplenocitos NOD con o sin tratamiento con mAb anti-VLA4, y los resultados se tabularon. Específicamente, se cuantificaron las frecuencias de islotes no infiltrados (Grado 0-I de infiltración) y de islotes con Grado II-IV de insulitis (tal como se ha descrito anteriormente). Para cada grupo experimental, se puntuaron las secciones pancreáticas procedentes de n = 4-5 ratones.

El tejido pancreático se recuperó de receptores tratados con el deseado mAb anti-VLA4 durante varios períodos de tiempo con el fin de dirigir su efecto sobre el establecimiento de infiltraciones celulares específicas del islote. Los ratones se trataron con IgG2b de rata no específico o con mAb R1-2 cada 3,5 días hasta en día 14, en que se sacrificaron. De manera similar, los ratones fueron tratados hasta el día 25 y sacrificados después de que la diabetes se hubiera diagnosticado, o en el día 26 post transferencia. Los ratones tratados continuamente con el mAb R1-2 durante 14 días post transferencia mantuvieron una alta frecuencia de (76%) de islotes no infiltrados, de los que solo un 24% progresaron hasta el Grado II-IV de insulitis. Por contraste, aquellos que fueron tratados con IgG2b de rata no específico mostraron el esquema recíproco, con un 74% de insulitis severa. De manera similar, en los ratones tratados con R1-2 hasta el día 25 (un 20% de la pancreata diabética aislada de los ratones registrados en la Figura 2), se preservó una alta frecuencia (58%) de islotes no infiltrados, similar a la (55% de no infiltrados) que presentaban los receptores no diabéticos de esplenocitos NOD jóvenes, tal como se muestra en la Figura 4. Por contraste, tanto los ratones no tratados como los tratados con IgG2b tuvieron solo un 28% de islotes no infiltrados, y por contra han incrementado (72%) la insulitis. De este modo, el tratamiento con el deseado anticuerpo anti-VLA4 aparenta específicamente inhibir o alternativamente retardar el desarrollo de la insulitis a base de la transferencia adoptiva de células de bazo diabetogénicas.

Con el fin de distinguir entre estas alternativas, se determinó el esquema de la insulitis al cabo de 4 semanas post transferencia cuando los ratones se trataron con IgG2b de rata o con mAb R1-2 hasta el día 12, y se mantuvieron luego sin ulterior tratamiento. Los ratones fueron sacrificados al serles diagnosticada la diabetes o en el día 29 post transferencia. El análisis del suero de estos ratones confirmó que el mAb anti-VLA-4 circulante cayó a niveles indetectables por los días 18-21 post transferencia. Con este protocolo, es grado de insulitis en el grupo tratado con R1-2 (69% insulíticos, 25% diabéticos) fue similar al de los receptores no tratados (73% insulíticos, 60% diabéticos) a pesar de que bajaron aún más en los ratones tratados con IgG2b de rata 96% insulíticos, 75% diabéticos), tal como se muestra en la Fig. 5. Significativamente, la severidad de la insulinitis fue similar entre los grupos tratados con R1-2, no tratados y tratados con IgG2b de rata, con un promedio de 57%, 47% y 64%, respectivamente, de infiltrados en Grado III/IV. Incluso considerando solamente los individuos no diabéticos tratados con R1-2, éstos todavía exhibieron un 59% de insulitis con un 52% de infiltrados en Grado III/IV. Los receptores de esplenocitos NOD no diabetogénicos tuvieron solo un 7% de infiltraciones en Grado III/IV. Por contra, la Figura 5 muestra que la frecuencia de islotes no infiltrados disminuyó en los ratones tratados con R1-2 en comparación con los receptores de células de bazo en solución salina o no diabetogénicas. De ese modo, el grado de insulitis progresó en estos ratones tratados con R1-2 (ver Figura 5) en comparación con los ratones en los que el tratamiento con R1-2 fue mantenido (Figura 4) y se aproximó en los grupos de control no tratados o tratados con IgG2b de rata. Tomados en conjunto, estos datos indican que la administración del mAb anti VLA-4 capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 puede retardar la progresión de la insulitis en un modelo agudo de transferencia de la enfermedad.

Ejemplo 3 Comparación de diferentes tratamientos con el anticuerpo anti-VLA4 en la transferencia adoptiva de la diabetes

Este ejemplo proporciona resultados comparativos de la eficacia entre el PS/2, un anticuerpo anti-VLA4, capaz de enlazar el epítopo B de la subunidad \alpha4 del VLA4 y el R1-2 utilizando el modelo de transferencia adoptiva y el procedimiento descritos en el Ejemplo 1. Se trataron ratones NOD con (a) un anticuerpo de control irrelevante (D/IgG2b de rata, n = 19 ratones); (b) el anticuerpo R1-2 (D/mAb R1-2, n = 24 ratones); (c) PS/2 mAb (D/PS/2 mAb, n = 5 ratones); o (d) se dejaron sin tratamiento (SIN, n = 26 ratones). Las células de bazo fueron inyectadas intravenosamente (2-3 x 10^{7} en 0,2 ml PBS) y pretratadas tanto con 75 \mug de mAb R1-2, 75 \mug de mAb PS/2, 75 \mug de IgG2b de rata, como no tratadas. El aislamiento y purificación del mAb anti-VLA4 PS/2 fue descrito originalmente por Miyake y otros, 1991 [55].

Se administró el mAb R1-2, mAb PS/2 o IgG2b de rata a una dosis de 75 \mug/0,2 ml intraperitonealmente cada 2-3 días, régimen de dosificación que se determinó para mantener un máximo recubrimiento de las células VLA4-positivas en la sangre periférica, órganos linfoides y médula de huesos, detectado por el teñido de suspensiones de células de la sangre periférica y de célula única preparadas, a partir de estos órganos, con un mAb marcado con fluorocromo específico para el mAb R1-2 y mAb PS/2 y por el análisis FACS para medir las células con fluorocromo positivo (tal como se ha descrito anteriormente). Las inyecciones se mantuvieron hasta los días 22 a 25 post transferencia. Los ratones fueron controlados en cuanto a la diabetes mediante pruebas de glicosuria con TesTape (EliLilly, Indianapolis, IN) y mediante los niveles de glucosa en plasma (Glucometer, 3 Blood Glucose Meter, Miles, Inc., Elkhart, IN), y se consideraron diabéticos después de dos pruebas de orina positivas consecutivas [valores de Testape de [+1] o superiores] o niveles de glucosa en plasma > 250 mg/dL.

Se demostró un efecto inhibidor del mAb anti-VLA4 sobre el ataque de diabetes cuando células del bazo aisladas de donantes diabéticos NOD se trataron con una cantidad saturante de mAb anti-VLA4 R1-2 o PS/2, seguida por la transferencia a huéspedes irradiados no diabéticos, tal como se ha descrito anteriormente, y luego el mAb R1-2 o PS/2 se administró cada uno de los otros días, durante 22-25 días, con el fin de mantener el máximo recubrimiento de todas las células VLA4-positivas en la sangre periférica y órganos linfoides durante aproximadamente dos semanas. La Tabla 1 muestra la frecuencia de los receptores que adquirieron la diabetes y el día del ataque de la enfermedad por transferencia de esplenocitos procedentes de donantes NOD (i) sin tratamiento (D); (ii) con tratamiento de IgG2b de rata (D/IgG2b de rata no específico), (iii) con tratamiento anti-VLA4 R1-2 (D/mAb R1-2); (iv) con tratamiento de PS/S (D/mAb PS/2), así como también por transferencia de esplenocitos procedentes de donantes no diabéticos NOD (no-D). Los ratones no diabéticos recibieron PBS y no se incluyeron esplenocitos (SIN) a modo de control. La inyección del PBS sólo dio un 4% de incidencias. Bajo estas condiciones, solo 1 de cada 24 individuos receptores tratados con mAb R1-2 adquirieron la diabetes, con el ataque en el día 22 post transferencia, mientras que ninguno de los cinco individuos receptores del tratamiento con mAb PS/2 adquirió la diabetes. Por contraste, 16/19 individuos adquirieron la diabetes después de recibir esplenocitos de donantes diabéticos tratados sin mAb, o con IgG2b de rata no específico. Tal como se muestra en la Tabla 1, el ataque de diabetes se produjo tan pronto como el día 14 post transferencia, a pesar de que la administración del irrelevante IgG2b de rata retardó en cierta medida un día el
ataque.

Estos datos demuestran un efecto protector del mAb R1-2 y PS/2 dependiendo de su especificidad para el VLA4. Los receptores de esplenocitos procedentes de ratones no diabéticos, o de PBS sólo, no adquirieron la diabetes. Así, el tratamiento con anticuerpos anti-VLA4 capaz de enlazar el epítopo B de la subunidad \alpha4 del VLA4 redujo la frecuencia de la diabetes durante 30 días post transferencia. El análisis del suero de estos ratones confirmó que los niveles de mAb anti-VLA4 R1-2 y PS/2 se hicieron indetectables entre los días 26 y 34 post-transferen-
cia.

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TABLA 1

Los mAbs Anti-VLA-4 Inhiben la Transferencia Adoptiva de la Diabetes en Ratones NOD
Células Transferidas/Tratamiento^{\text{*}}	Nº de Diabéticos/Total de Receptores^{+}	Día de Comienzo X \pm SEM
SIN	1/26	(4%)	34
No - D	1/15	(7%)	15
D	16/19	(84%)	14 \pm 0,2
D/IgG2b de rata no específico	16/19	(84%)	15 \pm 0,9

TABLA 1 (continuación)

Células Transferidas/Tratamiento^{\text{*}}	Nº de Diabéticos/Total de Receptores^{+}	Día de Comienzo X \pm SEM
D/mAb R1-2	1/24	(4%)	22
D/mAb PS/2	0/5	(0%)
^{\text{*}} \begin{minipage}[t]{155mm}Se transfirieron células del bazo procedentes de hembras NOD de 4 semanas de edad no diabéticas (NO-D) o de ataque reciente de diabetes (D), con células D suspendidas en mAb o IgG de rata dos veces a la semana durante 22-25 días. Los ratones se controlaron durante un mes post transferencia. Los datos están compilados a partir de 5 experimentos.\end{minipage}
^{+} \begin{minipage}[t]{155mm}Los grupos tratados con mAb D/R1-2 y D/PS/2 son significativamente diferentes de los grupos tratados con D y D/IgG2b de rata mediante la prueba cuadrada Chi con la corrección de Yates tal como sigue: R1-2 frente al grupo tratado con IgG2b D, p<0,0001; PS/2 frente al grupo tratado con IgG2b D, p<0,003.\end{minipage}

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Ejemplo 4 Efecto del tratamiento con anticuerpo anti-VLA4 en el modelo de diabetes espontánea

Este Ejemplo describió resultados eficaces utilizando mAb R1-2 en el modelo de diabetes espontánea, el cual emplea ratones NOD. Los ratones NOD se trataron durante 8 semanas con (a) un anticuerpo de control irrelevante (NOD/IgG2b de rata, n = 10 ratones); (b) anticuerpo R1-2 (NOD/R1-2, n = 20 ratones); o (c) sin tratamiento (NOD, n = 10 ratones), empezando en la semana cuatro y hasta la semana doce de edad. El mAb se administró a una dosis de 75 \mug por o,2 ml de PBS iv, dos veces por semana. Los ratones se controlaron en cuanto a sucesos de diabetes mediante TesTape por glicosuria, tal como se ha descrito anteriormente.

La Figura 6 demuestra un marcado retardo en el ataque de la diabetes (12-16 semanas de retardo) después de la administración del R1-2, en comparación con, los dos grupos de control. Los ratones NOD que recibieron el mAb IgG2b irrelevante, o que no recibieron tratamiento alguno, desarrollaron la diabetes tan pronto como a las 13 semanas. Estos resultados en modelo de enfermedad espontánea muestran un paralelismo con los resultados en la transferencia adoptiva con mAb R1-2 ilustrados en la Figura 1, y demuestran directamente que el deseado anticuerpo anti-VLA4 protege contra el ataque de diabetes.

Ejemplo 5 Efecto de una proteína de fusión VCAM-Ig en la transferencia adoptiva de la diabetes

Se preparó el experimento de transferencia adoptiva descrito en el Ejemplo 1 con una proteína de fusión VCAM-Ig (VCAM 2D-IgG) en vez de una mAb anti VLA4. La VCAM 2D-IgG es una forma soluble del grupo coordinador para el VLA4 (VCAM1), que consiste en dos dominios N-terminales de VCAM1 fusionados con las secuencias de región constante de cadena pesada IgG1 humana (Tramos de articulación, C_{H}2 y C_{H}3). La secuencia del DNA VCAM 2D-IgG y su secuencia de aminoácido convertida se muestran en SEC ID Nº 9. La Figura 8 ilustra la estructura de la proteína de fusión. La proteína de fusión se construyó mediante técnicas recombinantes tal como se describe a continuación.

Aislamiento del cDNA de la región de cadena pesada IgG1 humana y construcción del pSAB144 plásmide

Con el fin de aislar una copia de la región de cadena pesada IgG1 humana, se preparó el RNA a partir de células COS7 las cuales se transfectan transitoriamente mediante el plásmide VCAM1-IgG1 (también conocido como pSAB133). La construcción del plásmide VCAM1-IgG1 está descrito en la Solicitud de Patente PCT WO 90/13300. El RNA se transcribió a la inversa para generar el cDNA utilizando transcriptasa invertida y hexámeros aleatorios como iniciadores. Después de 30 min. a 42ºC se finalizó la reacción de la transcriptasa invertida por incubación de la reacción a 95ºC durante 5 min. Luego, el cDNA se amplificó mediante PCR (Reacción de Cadena de Polimerasa, ver, por ejemplo, Samrook y col., Molecular Cloning, Vol. 3, pp. 14.1-14.35. (Cold Spring Harbor; 1989)) utilizando las siguientes bases de partida cinasadas:

370-31 (SEC ID Nº: 10):

1

la cual contiene un sitio SalI, y

370-33 (SEC ID Nº: 11):

5'GTAAATGAGT GCGGCGGCCG CCAA,

la cual codifica la lisina del terminal carboxi de la región constante de cadena pesada, seguida de un sitio NotI.

El cDNA amplificado por PCR se purificó mediante electroforesis de gel de agarosa y elución con bola de vidrio para clonar el plásmide pNN03. El plásmide pNN03 se construyó eliminando la secuencia polivinculante sintética del plásmide pUC8 asequible comercialmente (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) mediante digestión de endonucleasa de restricción y reemplazando la secuencia polivinculante sintética por la siguiente nueva secuencia sintética

(SEC ID Nº: 12):

2

El fragmento de cDNA amplificado por PCR purificado se ligó al pNN03 que había sido adherida con EcoRV, defosforilatada, y purificada por electroforesis de gel de agarosa de baja temperatura. La reacción de ligamento se utilizó para transformar el E. coli JA221 y las colonias resultantes se exploraron para obtener un plásmido conteniendo un inserto de aproximadamente 700 bp. La identidad del inserto correcto se confirmó mediante el análisis de la secuencia de DNA, y el plásmide se designó pSAB144.

Construcción del plásmide pSAB142

El plásmide pSAB142 se construyó como sigue. Se sujetó el CDNA procedente de células COS transfectadas con pSAB133 (tal como se ha descrito en la sección previa) a una amplificación de PCR utilizando oligonucleótidos 370-01 y 370-29. Los oligonucleótidos 370-01 incluyen el sitio NOTI y los nucleótidos correspondientes a los aminoácidos del 1 al 7 de la secuencia de señal VCAM-1

(SEC ID Nº: 13)

3

El oligonucleótido 370-29 corresponde a los aminoácidos VCAM-1 214-219 e incluyen un sitio SalI

(SEC ID Nº:14):

5'AA GTC GAC TTG CAA TTC TTT TAC

El fragmento de DNA amplificado se ligó al fragmento vector de pNN03, adherido por EcoRV.

Construcción del pSAB132

pJOD-S (Barsoum, J., DNA and Cell Biol., 9, pp.239-300 (1990)) se modificó para insertar un único sitio NotI aguas abajo del promotor tardío principal del adenovirus de manera que los fragmentos NodI pueden ser insertados en el vector de expresión. El pJOD-S se linealizó con el NotI adhesivo del DNA plásmide. Los terminales 5' protuberantes se despuntaron utilizando nucleasa Mung Bean, y el fragmento de DNA linealizado se purificó mediante electroforesis de gel de agarosa de baja temperatura de fusión. El fragmento de DNA se religó usando ligasa de DNA T4. Luego las moléculas ligadas se transformaron en E. coli Ja221. Las colonias se exploraron para asegurar la ausencia de un sitio NotI. El vector resultante se designó pJOD-S delta Not1. El pJOD-8 delta Noti1 se linealizó utilizando SalI y los terminales 5' se defosforilataron utilizando fosfatasa alcalina de ternero. El fragmento de DNA linealizado se purificó mediante electroforesis de gel de agarosa de baja temperatura de fusión y ligado en presencia del oligonucleótido fosforilatado ACE 175, el cual tiene la secuencia siguiente

(SEC ID Nº: 15)

TCGACGCGGC CGCG

La mezcla ligante se transformó en E. coli JA221, y las colonias se exploraron en busca de la presencia de un plásmide con un sitio NotI. El plásmide deseado se llamó pMDR901.

Con el fin de borrar las dos repeticiones aumentadoras del SV40 en el promotor del SV40, las cuales controlan la transcripción del DHFR cDNA, pMDR901 Y pJOD\Deltae-tPA (Barsoum, DNA and Cell Biol., 9, pp 293-300 (1990)), ambas fueron adheridas con AatII y DraIII. El fragmento 2578 bp AatII-DraIII procedente del pMDR901 y el fragmento 5424 bp AatII-DraIII procedente del pJOD\Deltae-tPA se aislaron mediante electroforesis de gel de agarosa de baja temperatura de fusión y se ligaron entre sí. Después de la transformación en E. coli JA221, se aisló el plásmide resultante, pMDR902. Luego se formó el pSAB132 eliminando el fragmento EcoRI-NotI del pMDR902 que contiene el promotor tardío principal del adenovirus y reemplazándolo por un fragmento bp EcoRI-NotI del plásmide pCMV-B (Clontech, Palo Alto, California) que contiene el promotor y aumentador temprano inmediato del citomegalovirus.

Construcción del pSAB146

El pSAB 144 se adhirió con SalI y NotI, y se aisló el fragmento bp 693. El pSAB 142 se adhirió con NotI y SalI, y se aisló el fragmento bp 664. Los dos fragmentos se ligaron al pSAB132, el cual había sido adherido con NotI, y los terminales 5' se defosforilataron mediante fosfatasa alcalina de ternero. El plásmide resultante, pSAB146, que contiene la secuencia de DNA que codifica la secuencia de señal VCAM-1, los aminoácidos con amino terminal 219 de VCAM-1 maduro, diez aminoácidos de la región del tramo de articulación del IgG1 y los dominios constantes C_{H}2 y C_{H}3 del IgG1.

Producción del VCAM 2D-IgG procedente de una línea de células CHO transformadas de manera estable

Un vector de expresión VCAM 2D-IgG recombinante se construyó tal como se describe a continuación y transfectado en células CHO para producir una línea de células con secreción continuada de VCAM 2D-IgG.

El fragmento 1.357 kb NotI que contiene la secuencia codificante VCAM 2D-IgG del pSAB146 se purificó mediante electroforesis de gel de agarosa. Este fragmento se ligó al sitio de clonación NotI del vector de expresión pMDR901, el cual utiliza el promotor tardío principal del gene de expresión heterologus y el marcador de reductasa de dihidrofolato (dhfr) seleccionable, amplificable. El DNA ligado se utilizó para transformar el E. coli DH5. Las colonias que contenían el plásmide con el inserto deseado, correctamente orientado, fueron identificadas mediante la presencia de los fragmentos bp 5853 y 3734 en base a la digestión con HindIII; y los fragmentos bp 4301, 2555, 2293, y 438, sobre la base de la digestión con BglIII. El vector de expresión recombinante VCAM 2D-IgG resultante se designó pEAG100. La identidad del inserto correcto se confirmó por medio del análisis de la secuencia del
DNA.

El plásmide de expresión recombinante pEAG100 electroforatado en células CHO deficientes en dhfr de acuerdo con el protocolo publicado de J. Barsoum (DNA Cell Biol 9: 293-300, 1990), con los cambios siguientes: En el protocolo de electroforación se utilizaron 200 \mug plásmide de PvuI-linealizado pEAG100 y 200 \mug de DNA de esperma de salmón sonicatado. Además, las células se seleccionaron en un medio alfa-completo suplementado con 200 nM de metotrexato.

Para determinar niveles de expresión de VCAM 2D-IgG secretado, los clones se transfirieron a una placa de microvaloración de una cavidad 96 de fondo plano, crecido hacia la confluencia y ensayado por ELISA tal como se describe a continuación.

Dos placas de cavidades de Immulon (Dynatech, Chantilly, Virginia) se revistieron, cada una, con Mab 4B9 anti-VCAM (aislado y purificado en Protein A Sepharose tal como se describe en Carlos y col., 1990 [56]) con 100 \mul de Mab 4B9 anti-VCAM diluido a 10 \mug/ml en 0,05 M de tampón de carbonato/bicarbonato de sodio, de pH 9,6, se cubrieron con Parafilm, y se incubaron durante la noche a 4ºC. Al día siguiente, los contenidos de la placa se vaciaron e inmovilizaron con 200 \mul/cavidad de un tampón de bloqueo (5% de suero de feto de ternero en 1x PBS), el cual se filtró con un filtro de 2 \mu. El tampón se extrajo al cabo de una hora de incubación a temperatura ambiente y las placas se lavaron dos veces con una solución de 0,05% de Tween-20 en 1x PBS. Se añadió un medio acondicionado a varias disoluciones. Como control positivo también se incluyó un anti-ratón Ig. El tampón de bloqueo y el LFA-3TIP constituyeron los controles negativos. Las muestras y los controles se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas.

Luego se lavaron las placas dos veces con una solución de 0,05% de Tween-20 en 1x PBS. Cada cavidad, excepto la cavidad del control positivo, se llenó entonces con 50 \mul de una disolución al 1:2000 de IgG HRP-Donkey (HRP de burro) anti-humano (H+L) (Jackson Immune Research Laboratories, Inc.; West Grove, Pennsylvania) en tampón de bloqueo. La cavidad del control positivo se llenó con 50 \mul de una disolución al 1:2000 de IgG HRP-Goat (HRP de cabra) anti-ratón (H+L) (Jackson Immune Research Laboratories, Inc.; West Grove, Pennsylvania) en tampón de bloqueo. Luego las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente.

Las soluciones Ab con el HRP conjugado se extrajeron, y lavaron las placas dos veces con una solución de 0,05% de Tween-20 en 1x PBS. Luego se añadió a cada placa 100 \mul de tampón de substrato de HRP a temperatura ambiente. El tampón de substrato de HRP se preparó de la siguiente manera: se añadieron despacio 0,5 ml de 42 mM 3,3', 5,5'-tetramitilbenzidina (TMB), (ICN Immunobiologicals, Lisle, South Carolina, Catálogo nº 980501) en DMSO (Aldrich) a un tampón de substrato (0,1 M de acetato sódico/ácido cítrico, pH4,9); A continuación se añadieron 7,5 \mul de peróxido de hidrógeno al 30% (Sigma, Catálogo nº H.1009).

Se controló el desarrollo del color azul en cada cavidad a 650 nm en un lector de placa de microvalorador. Después de 7-10 minutos, se detuvo el desarrollo mediante la adición de 100 \mul de ácido sulfúrico 2N. El color amarillo resultante se leyó a 450 nm en un lector de placa de microvalorador. Un control negativo se utilizó para poner a cero la máquina.

Purificación del VCAM 2D-IgG

Las células de CHO con expresión de VCAM 2D-IgG crecieron en botellas rodantes sobre bolas de colágeno. se concentró un medio acondicionado (5 litros) hasta 500 ml utilizando un cartucho ultrafiltrante espiral Amicon S1Y10 (Amicon, Danvers, Ma). El concentrado se diluyó en un litro de tampón ligante de Proteína A de Pierce (Pierce, Rockford, IL), y cargado por gravedad dentro de una columna de Proteína A (Sepharose 4 Fast Flow, Pharmacia, Piscataway, NJ). La columna se lavó 9 veces con 10 ml de tampón ligante de Proteína A y luego 7 veces con 10 ml de PBS. El VCAM 2D-IgG se lavó en doce etapas de 5 ml conteniendo 25 mM H_{3}PO_{4} pH2,8, 100 mM NaCl. Las muestras lavadas se neutralizaron mediante la adición de 0,5 M Na_{2}HPO_{4} pH8,6 hasta 25 mM. Las fracciones se analizaron respecto a la absorbancia a 280 nm y mediante SDS-PAGE. Las tres fracciones de picos de más alta pureza se juntaron, filtraron, proporcionaron y almacenaron a -70ºC. Mediante SDS-PAGE, el producto presentaba una pureza mayor del 95%. El material presentaba menos de 1 unidad de endotoxina por mg de proteína. En algunos casos, se necesitó una ulterior purificación del producto eluato de la proteína A en Q-sefarosa FF (Pharmacia). El eluato de proteína A se diluyó con 3 volúmenes de 25 mM Tris Hcl pH8,0 y se cargó en una columna de Q-Sefarosa FF a 10 mg de VCAM 2D-IgG por mg de resina. El VCAM 2D-IgG se eluyó entonces a partir de la Q-Sefarosa con PBS.

Evaluación del VCAM 2D-IgG

Las suspensiones de células del bazo se prepararon a partir de donantes diabéticos o a partir de controles no diabéticos, tal como se ha descrito anteriormente. Las células del bazo se inyectaron intravenosamente (2-3 x 10^{7} en 0,2 ml de PBS) y se pretrataron o bien con 100 \mug de VCAM 2D-IgG o con 100 \mug de un irrelevante control de proteína de fusión LFA-3Ig. Otro grupo recibió PBS sólo, sin células transferidas. La proteína de fusión LFA-3Ig (LFA-3TIP) se aisló y purificó tal como se describe en el documento PCT US92/02050 y en Miller y col., 1993 [57]. Se administró la proteína de fusión VCAM 2D-IgG o la proteína irrelevante LFA-3Ig a una dosis de 100 \mug/0,2 ml intraperitonealmente dos veces por semana hasta el día 17. Esta concentración fue suficiente para proporcionar un nivel de suero o de proteína de fusión suficiente para saturar las células de VLA4-positivas, siendo los niveles de suero determinados mediante ELISA, tal como se ha descrito anteriormente. El ataque de diabetes se controló tal como se ha descrito anteriormente.

Los resultados de la evaluación se muestran en la Figura 7. Tal como se muestra en esta figura, la proteína de fusión VCAM 2D-IgG inhibe significativamente el ataque de diabetes en receptores de células procedentes de ratones donantes diabéticos (D/VCAM-IG, círculos abiertos) con un 60% de incidencia por el día 15 post transferencia, en comparación con los ratones que recibieron células de un donante diabético (datos no mostrados) e irrelevante proteína de fusión IG de control LFA-3Ig (D/LFA-3 Ig), los cuales habían alcanzado el 60% de incidencia por el día 25 post transferencia. Los ratones que no recibieron células (solo PBS) no desarrollaron la enfermedad. Hubo n = 5 ratones por cada grupo experimental.

En resumen, los deseados anticuerpos anti-VLA4 son protectores frente el ataque de la enfermedad de la diabetes (Ejemplos 1, 3 y 4) y son efectivos en el retardo de la progresión de la insulitis (Ejemplo 2), utilizando un modelo murino para la diabetes humana. Otros agentes ligantes del VLA4, tales como los derivados de VCAM soluble (VCAM 2d-IgG) fueron también útiles en la protección frente al ataque de la enfermedad de la diabetes (Ejemplo 5). Los Ejemplos anteriores deben ser entendidos como una ilustración del uso de la presente invención, y no se presentan como una limitación de la invención tal como está reivindicada de aquí en adelante. A partir de la anterior exposición, numerosas modificaciones y realizaciones adicionales de la invención resultarán aparentes para los expertos en la materia. Por ejemplo, la dosificación utilizada realmente, el tipo de anticuerpo o de fragmento de anticuerpo utilizado, el modo de administrarlo, la composición exacta, momento y manera de la administración del tratamiento, y otras muchas características, pueden ser todas ellas variadas sin apartarse de la anterior descripción. Todas estas modificaciones y realizaciones adicionales se encuentran dentro de lo contemplado por esta solicitud y dentro del campo de las reivindicaciones adjuntas.

Lista de referencias citadas

[1] Castano y Eisenbarth, 1990, Annu. Rev. Immunology 8: 647-79, "Type I Diabetes: A Chronic Autoimmune Disease of Human, Mouse, and Rat"

[2] Fujita y col., 1982, Biomed. Res. 3: 429-436, "Lymphocytic Insulitis in a Non-obese Diabetic (NOD) Strain of Mice: An Immunohistochemical and Electron Microscope Investigation"

[3] Foulis y col., 1986, Diabetologia 29: 267, "The histopathology of the pancreas in Type I (insulin-dependent) diabetes mellitus: a 25-year review of deaths in patients under 20 years of age in the United Kingdom"

[4] Eisenbarth, 1986, New Engl. J. Med. 314:1360-1368, "Type I Diabetes Mellitus - A Chronic Autoimmune Disease"

[5] Miller y col., 1988, J. Immunol. 140: 52-58, "Both the Lyt-2+ and L3T4+ T Cell subsets are required for the transfer of diabetes in Nonobese diabetic mice"

[6] Harada y Makino, 1986, Exp. Anim. 35: 501, "Suppression of overt diabetes in NOD mice by Anti-thymocyte serum or anti-Thy 1.2 antibody"

[7] Koike y col., 1987, Diabetes 36: 539, "Preventive effect of monoclonal anti-L3T4 antibody on development of diabetes in NOD mice"

[8] Makino y col., 1986, Exp. Anim. 35: 495, "Absence of insulitis and overt diabetes in athymic nude mice with NOD genetic background"

[9] Voorbij y col.,1989, Diabetes 35: 1623-1629, "Dendritic cells and scavenger macrophages in pancreatic islets of prediabetc BB rats"

[10] Nomikos y col., 1986, Diabetes 35: 11302-1304, "Combined treatment with nicotinamide and desferrioxamine prevents islet allograft destruction in NOD mice"

[11] Larson y Springer, 1990, Immunol. Rev. 114: 181-217, "Structure and Function of Leukocyte Integrins"

[12] Hemler y col., 1990, Immunol. Rev. 114: 45-66, "Structure of the Integrin VLA-4 and its Cell-Cell and Cell-matrix adhesion functions"

[13] Lobb, R.R., 1992, Adhesion: Its Role in Inflammatory Diseases. ed. J.M. Harlan y D.Y. Liu, New York: W. H. Freeman. 1-18.

[14] Osborn, L., 1990, Cell 62: 3-6, "Leukocyte Adhesion to Endothelium in Inflammation"

[15] Wayner y col., 1989, J. Cell. Biol. 109: 1321-1330, "Identification and Characterization of the T Lymphocyte Adhesion Receptor for an Alternative Cell Attachment Domain (CS-1) in Plasma Fibronectin"

[16] Shimizu y col., 1991, J. Cell Biol. 113: 1203, "Four molecular pathways to T cell adhesion to endothelial cells: roles of LFA-1 VCAM-1 and ELAM-1 and changes in pathway hierarchy under different activation conditions"

[17] Barton y col., 1989, J. Immunol. 143: 1278, "The effect of anti-intercellular adhesion molecule-1 on phorbolester-induced rabbit lung inflammation"

[18] Issekutz, T.B. y Issekutz, A.C., 1991, Clinical Immunol. and Immunopathol. 138: 300-312, "T lymphocyte migration to arthritis joints and dermal inflammation in the rat: differing migration patterns and the involvement of VLA-4"

[19] Issekutz, T.G., 1991, J. Immunol 147: 4178-4184, "Inhibition of In Vivo Lymphocyte Migration to Inflammation and Homing to Lymphoid Tissues by the TA-2 Monoclonal Antibody - A Likely Role for VLA-4 In Vivo"

[20] Yednock, y col., 1992, Nature 356: 63-66, "Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against \alpha4\beta1 integrin"

[21] Lobb, Solicitud de Patente US nº de solicitud 07/821,768 presentada en 13 de Enero de 1992, "Treatment for Asthma"

[22] Dustin y col., 1986, J. Immunol. 137: 245-254 "Induction by IL-1 and Interferon-\gamma Tissue Distribution, Biochemistry, and Function of a Natural Adherence Molecule (ICAM-1)"

[23] Rice y col., 1990, J. Exp. Med. 171: 1369, "Inducible Cell Adhesion Molecule 110 (INCAM-110) Is An Endothelial Receptor for Lymphocytes - A CD11/CD18-lndependent Adhesion Mechanism"

[24] Rice y col., 1991, Am. J. Path. 138: 385393, "Vascular and Nonvascular Expression of INCAM-110"

[25] Shimuzu y col.,1990, Immunol. Rev. 114: 109-144, "Roles of Adhesion Molecules in T-cell recognition: Fundamental Similarities between four integrins on resting human T cells (LFA-1, VLA-4, VLA-5, VLA-6) in expression, binding and co-stimulation"

[26] Burkly y col., 1991, Eur. J. Immunol. 21: 2871 -2875, "Signaling by vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) through VLA4 promotes CD3-dependent T cell proliferation"

[27] Rudd y col., 1989, Immunol. Rev. 111: 225-266, "Molecular Interactions, T-Cell Subsets, and a Role of the CD4/CD8:p56^{1ck} Complex in Human T-Cell Activation"

[28] Moingeon y col., 1989, Immunol. Rev. 111: 111-144, "The Structural Bidogy of CD2"

[29] Harding y col., 1992, Nature 356: 607-609, "CD28-mediated signalling co-stimulates murine T cells and prevents inducdon of energy in T cell clones"

[30] Shizuru y col., 1988, Science 240: 659-662, "Immunotherapy of the Nonobese Diabetic Mouse: Treatment with an Antibody to T-Helper Lymphocytes"

[31] Barlow y Like, 1992, Amer. J. Pathol. 141: 1043-1051, "Anti-CD2 Monoclonal Antibodies Prevent Spontaneous and Adoptive Transfer of Diabetes in the BB/Wor Rat"

[32] Like y col., 1986, J. Exp. Med. 164: 1145-1159, "Prevention of Diabetes in Biobreeding/Worchester Rats with Monoclonal Andbodies that Recognize T Lymphocytes or Natural Killer Cells"

[33] Hutchings y col., 1990, Nature 348: 639-642, "Transfer of diabetes in mice prevented by blockade of adhesion-promoting receptor on macrophages"

[34] Federlin y Becker, 1990, Klin. Wochenschr. 68: Suppl. XXI 38-43, "Specific Therapeutic Attempts in Experimental and Clinical Type-I Diabetes"

[35] Zielasek y col., 1989, Clin. Immunol. Immunopathol. 52: 347-365, "The Potentially Simple Mathematics of Type I Diabetes"

[36] Eisenbarth, 1987, Hosp. Prac. 22:167-183, "Type I Diabetes: Clinical Implication of Autoimmunity"

[37] Ziegler y Eisenbarth, 1990, Horm. Res. 33: 144-150, "Multiple Target Antigens in Pre-Type I Diabetes: Implications for Prediction"

[38] Ziegler y col., 1990, Diabetes Care 13: 762-765, "Predicting Type I Diabetes"

[39] Ziegler y col., 1990, J. Autoimmun. 3 Suppl. 1: 69-74, "Type I Diabetes: polygenic inheritance, multiple autoantigens and "dual" parameter prediction"

[40] Kohler, G. y Milstein, 1975, C. Nature 265: 295-497, "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity"

[41] Sanchez-Madrid y col., 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349, "VLA-3: A novel polypeptide association within the VLA molecular complex: cell distribution and biochemical characterization"

[42] Hemler y col., 1987, J. Biol. Chem. 262: 11478-11485, "Characterization of the cell surface heterodimer VLA4 and related peptides"

[43] Elices y col., 1990, Cell 60: 577-584, "VCAM-1 on Activated Endothelium Interacts with the Leukocyte Integrin VLA4 at a Site Distinct from the VLA4/Fibronectin Binding Site"

[44] Pulido y col., 1991, J. Bid. Chem., 266(16): 10241-10245, "Functional Evidence for Three Distinct and Independently Inhibitable Adhesion Actvities Mediated by the Human Integrin VLA-4"

[45] Boerner y col., 1991, J. Immunol. 147:86-95, "Production of Antigen-specific Human Monoclonal Anhbodies from In Vitro-Primed Human Splenocytes"

[46] Persson y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2432-2436, "Generation of diverse high-affinity human monoclonal antibodies by repertoire cloning"

[47] Huang y Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141: 227-236, "Construction of representative immunoglobulin variable region cDNA libraries from human peripheral blood lymphocytes without in vitro stimulation"

[48] Jones y col., 1986, Nature 321: 522-525, "Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse"

[49] Rlechmann, 1988, Nature 332: 323-327, "Reshaping human antibodies for therapy"

[50] Queen y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029, "A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor"

[51] Orlandi y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833 "Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction"

[52] Solicitud de Patente Internacional nº WO 9416094, publicada en 21 de Julio de 1994, "Recombinant Anti-VLA4 Antibody Molecules"

[53] Holzmann y col, 1989, Cell 56: 37-46, "Identification of a Murine Peyer's Patch-Specific Lymphocyte Homing Receptor as an Integrin Molecule with \alpha Chain Homologous to Human VIA-4\alpha"

[54] Hession y col., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 183: 163-169, "Cloning of Murine and Rat Vascular Cell Adhesion Molecule-1"

[55] Miyake y col., 1991, J. Exp. Med. 173: 599-607.

[56] Carlos y col., 1990, Blood 17: 965, "Vascular Cell Adhesion molecule-1 (VCAM-1) mediates Lymphocyte Adherence to Cytokine-activated Cultured Human Endothelial Cells."

[57] Miller y col., 1993, J. Exp. Med. 178: 211.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Biogen, Inc,

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Fourteen Cambridge Center

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Cambridge

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Massachusetts

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL

\hskip2,9cm

(ZIP): 02142

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 617-252-9200

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: 617-252-9595

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Tratamiento para la Diabetes dependiente de la insulina.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADORA: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Versión #1.0, Versión #1.25 (OEP)

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FECHA ACTUAL DE SOLICITUD:

\hskip1,5cm

Nº de Solicitud: PCT/US94/01456

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 360 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica misc_

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES:/nota = "pBAG159 insertar: HP1/2 región variable de cadena pesada; el aminoácido 1 es Glu (E) pero Gln (Q) puede ser sustituido".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1-360

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC.ID. Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 120 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA:lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID Nº 2:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 318 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1-318

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES: /producto = "HPl/2 región variable de cadena ligera"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES: /nota = "pBAG172 insertar: HPl/2 región variable cadena ligera"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID Nº 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 106 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº 4

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC.ID Nº 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 429 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave: péptido sig_

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición 1-57

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave: péptido mat_

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición: 58-429

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN 1-429

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE característica misc_

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "pBAG195 insertar : AS región variable de cadena pesada"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº. 5:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº. 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA :

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 143 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID. Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID. Nº 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 386 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave: péptido sig_

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición 1-57

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave: péptido mat_

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición: 58-386

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN 1-386

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE característica misc_

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "pBAG198 insertar: VK2 (SVMDY) región variable de cadena ligera"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº. 7:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID. Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 128 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC. ID. Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID. Nº 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1348 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave: segmento genético VCAM-1

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición 1-219

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL: Esta porción de la secuencia corresponde, en parte, a Segmentos I, II y III de la secuencia de nucleótidos del gene VCAM-1 de Cybulsky y col. Proc. Nat'l Acad. Sci USA 88:7861 (1991).

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave: Región de articulación

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición: 220-229

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL: Esta porción de la secuencia corresponde, en parte, a la Fig. 12A de la patente PCT/US92/0250 y representa la región de articulación de la región constante de cadena pesada de IgG1 Humano.

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Región constante de cadena pesada 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN 230-338

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL: Esta porción de la secuencia corresponde, en parte, a la Fig. 12a de la patente PCT/US92/02050 y representa la región constante de cadena pesada 2 de la región constante de cadena pesada de IgG1 Humano

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE región constante de cadena pesada 3

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 339-446

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL: Esta porción de la secuencia corresponde, en parte, a la Fig. 12A de la patente PCT/US92/02050 y representa la región constante de cadena pesada 3 de la región constante de cadena pesada del IgG1 humano.

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID. Nº 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL: Corresponde al iniciador de Kinasa 370-31.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 10

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID. Nº 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL: Corresponde al iniciador de Kinasa 370--32.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAATGAGT GCGGCGGCCG CCAA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID Nº 12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 115 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 12

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID. Nº 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC. ID. Nº 13

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID. Nº 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

Nombre/clave:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC. ID. Nº 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AA GTC GAC TTG CAA TTC TTT TAC

\hfill

23

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID. Nº 15

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Posición:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN ADICIONAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC. ID. Nº 15

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGACGCGGC CGCG

\hfill

14

Claims (15)

1. Uso de un anticuerpo anti-VLA4 capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4 para la fabricación de un medicamento que consta esencialmente de dicho anticuerpo en un portador farmacéuticamente aceptable para su uso como el único medicamento en la prevención de la diabetes insulino dependiente (tipo I) en individuos prediabéticos.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-VLA4 está seleccionado a partir del grupo formado por HP1/2, HP2/1, HP2/4, L25 y P4C2.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-VLA4 es HP1/2, o un fragmento del mismo, capaz de ligarse al epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-VLA4 es un anticuerpo HP1/2 humanizado, o un fragmento del mismo, capaz de ligarse al epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento está administrado a una dosificación con el fin de proporcionar desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 mg/kg, sobre la base del peso del individuo prediabético.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento está administrado en una cantidad efectiva para recubrir las células VLA4-positivas en la sangre periférica durante un período de 1-14 días.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento está administrado en una cantidad efectiva para proporcionar un nivel en plasma del anticuerpo en el individuo prediabético de al menos 1 \mug/ml.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento está administrado previamente al desarrollo de una diabetes manifiesta, medida mediante un nivel de glucosa en suero de menos de aproximadamente 250 mg/dL.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el individuo prediabético es un humano.

10. Uso de un anticuerpo, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, fragmentos de dichos anticuerpos, o una proteína de fusión de VCAM 2D - IgG que es capaz de enlazar el epítopo B1 o B2 de la subunidad \alpha4 del VLA4, o combinaciones de cualesquiera de los anteriores para la fabricación de un medicamento, que consta esencialmente de dicho anticuerpo un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, fragmentos de dichos anticuerpos, o una proteína de fusión de VCAM 2D - IgG en un portador farmacéuticamente aceptable para su uso como el único medicamento en la prevención de la diabetes.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el anticuerpo está seleccionado a partir de anticuerpo monoclonal HP1/2; fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} o F(v) de tal anticuerpo.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medicamento comprende una pluralidad de anticuerpos monoclonales anti-VLA4 o fragmentos ligantes del VLA4 de los mismos.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medicamento está administrado a una dosificación con el fin de proporcionar desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 mg/kg de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, sobre la base del peso del mamífero susceptible.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medicamento está administrado en una cantidad efectiva para recubrir las células VLA4-positivas en la sangre periférica durante un período de 1-14 días.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medicamento está administrado en una cantidad efectiva para proporcionar un nivel en plasma de anticuerpo en el mamífero de al menos 1 \mug/ml durante un período de 1-14 días.