WO2008040833A1 - Procedimiento para la obtención de péptidos bicíclicos - Google Patents

Procedimiento para la obtención de péptidos bicíclicos Download PDF

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Judit Tulla Puche
Núria BAYÓ PUXAN
Fernando Albericio Palomera
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Universidad De Barcelona
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    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid

Definitions

  • the present invention relates to solid phase organic synthesis, particularly the synthesis of bicyclic peptides.
  • Bicyclic peptides are compounds that have interesting biological activities.
  • the nature of the bridge that forms the bike is diverse, and can include a disulfide bridge, a thioether, or a lactam.
  • bicyclic peptides is the family of antitumor antibiotic peptides isolated from marine organisms, which includes thiocoralin (cf. Romero, F .; Espliego, F .; Pérez Baz, J .; Garc ⁇ a de Quesada, T .; Grávalos, D .; De Ia Calle, F .; Fernandez-Puentes, JLJ Antibiotics 1997, 50, 734-737), BE-22179, triostin A, and equinomicin.
  • thiocoralin cf. Romero, F .; Espliego, F .; Pérez Baz, J .; Garc ⁇ a de Quesada, T .; Grávalos, D .; De Ia Calle, F .; Fernandez-Puentes, JLJ Antibiotics 1997, 50, 734-737
  • BE-22179 triostin A, and equinomicin.
  • This group of peptides has a complex structure that contains: a) a Ca axis; b) a bicyclic structure formed by two antiparallel peptide chains; c) an ester or thioester link in the terminal part of the peptide chain; d) a disulfide bridge or an analogous bridge in the middle of the peptide chains; e) an intercalator chromophore in the ⁇ / -terminal part; f) the presence of several ⁇ / -methyl amino acids; and g) unnatural amino acids of configuration D.
  • the structures of these peptides are:
  • heterocyclic group is 3-hydroxyquinoline-2-carboxylic acid (Hqa) and its derivatives (following formula), which form the heterocyclic part of thiocoraline and other natural depsypeptides with interesting biological activities, such as SW-163C , SW-163E, and the sandramicin.
  • this heterocyclic chromophore plays a very important role in the binding properties of DNA with these compounds.
  • the synthesis of this heterocycle has been optimized (cf. Irrigation. E., Bayo, N., Cuevas, C, Albericio, F., M. ⁇ lvarez, Tetrahedron 61, 1407-1411, 2005).
  • Ri is H or an organic group selected from a group consisting of an alkyl group, an aryl group and its derivatives substituted with a hydroxyl group; where R 2 is H or a carbonyl functional group linked to an alkyl chain forming an ester, with a thiol, hydroxyl or amino group at the end of the chain.
  • Bicyclic peptides such as those shown above have an interesting biological activity, so it is interesting to provide new synthetic routes to access them.
  • the present invention provides a process for obtaining a solid phase disulfide bridge intermolecular dimer from linear precursors.
  • the disulfide bridge is cleaved from the solid support and bicylated in solution to obtain compounds with the structure of the attached formula, where AA1, AA2, AA3, AA4, AA1 ', AA2', AA3 ', and AA4' are independently ⁇ -amino acids of L or D configuration, if applicable, proteinogenic or non-proteinogenic, and where at least two are cisterns or / V-alkyl cysteines, forming a disulfide bridge;
  • Ri, R 2 , and R 3 are each independently H or an organic group selected from a group consisting of an alkyl group, an aryl group, an aralkyl group, and its derivatives substituted with a hydroxyl group, a mercapto group, an amino group, a guanidino group, a halogen group;
  • the solid support is an acid-labile resin such as the p-alkoxybenzyl Wang resin or the 2-chlorotrityl chloride resin.
  • the following protecting groups are used: Fmoc (fluorenylmethiloxycarbonyl), Alloc (allyloxycarbonyl), Trityl (triphenylmethyl), pNZ (4-nitrobenzyloxycarbonyl), Boc (f-butyloxycarbonyl), TBDMS (f-butyldimethylsilyl) 2,2-trichloroethoxycarbonyl).
  • the aryl group can be introduced in solid phase or in solution.
  • the invention involves the preparation of a thermolecular dimer by disulfide bridge of tetrapeptides from a linear tetrapeptide, which allows restricting the flexibility of the chain by minimizing the formation of diketopiperazines.
  • the invention is especially directed to the preparation of bicyclic peptides.
  • the invention involves the preparation of a linear tetrapeptide by solid phase synthesis, which may contain an ester or thioester group, and the subsequent formation of a solid phase intermolecular disulfide bridge dimer.
  • the heterocyclic parts may already be part of the dimer, or temporarily replaced by a suitable protecting group.
  • the process involves the cleavage of the dimer of the solid support and the simultaneous double cyclization for form the bike
  • the heterocycle can also be introduced at this point, if it was not part of the dimer.
  • the compounds of this invention have biological activity, such as antitumor activity.
  • the process of this invention can be carried out from starting reagents in a fast and enantio- and stereocontrolled manner, taking advantage of the synthetic solid phase methodology, where a molecule under construction joins an insoluble support during all synthetic operations Therefore, excess reagents and soluble by-products can be eliminated by washing the resin-molecule with suitable solvents. Therefore, large excesses of soluble reagents can be used to complete the reaction in a short period of time, avoiding racemization (if applicable) and other side reactions.
  • the method also allows its automation.
  • the preferable procedure for the synthetic formation of bicyclic peptides is based on a solid phase approach, see for example, Lloyd-Williams, P., et al. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC Press, Boca Ratón (FL), 1997.
  • the procedure includes the following general characteristics:
  • a solid support e.g., polystyrene, polyethylene grafted onto polystyrene, and the like
  • a bifunctional spacer or acid-labile linker e.g., chlorotrityl, polyalkoxybenzyl, and the like
  • the preferred ones are Wahg resin and Barios resin [chlorotrityl chloride (CTC)], which minimizes the formation of diketopiperazines (DKP 1 S) and allows the cleavage of protected peptides under very mild acidic conditions;
  • scheme procedure comprises the sequential steps of:
  • HATU / HOAt / DIEA was used in DMF to perform the amide and DIPCDI bond ( ⁇ /, ⁇ / ' -diisopropylcarbodiimide) / DMAP [4- ⁇ N, N-dimethylamine) pinane] in the case of performing the ester or thioester (AA4) bond.
  • MSNT [1- (Mesitylene-2-sulfonyl) -3-nitro-1 H-1, 2,4-triazole] / NMI ( ⁇ / -methylmidazole) / DIEA can be used to form the ester bond.
  • some ⁇ / -methyl amino acids can be introduced by the solid phase amino acid / V-methylation method by the Fukuyama method (cf. Miller, S. C; Scanlan, TS, J. Am. Chem. Soc, 1998, 120, 2690-2691; Yang, L .; Chiu, K., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 7307-7310) using o-nitrosulfonyl as temporary protection of the ⁇ -amino functional group;
  • the synthesis of the peptide can be initiated at another point in the chain that is not AA2.
  • DIEA, DIPCDI, piperidine, TFA, ammonia, odomethane, allyl chloroformate, p-nitrobenzyl chloroformate, and quinadic acid were obtained from Aldrich (Milwaukee, Wl), and EDC ⁇ CI and HOAt were from Luxembourg Industries (TeI Aviv, Israel ).
  • DMF 1 CHaCI 2 , Acetonitrile (HPLC grade), methanol (HPLC grade), Dioxane, Et 2 O, TBME (f-butyl methyl ether) and EtOAc (ethyl acetate) were obtained from SDS (Peypin, France).
  • the solid phase syntheses were performed in polypropylene syringes (2.5 mL) provided with a porous polypropylene disc. Solvents and soluble reagents were removed by suction. The elimination of the Fmoc group was performed with piperidine-DMF (1: 4, v / v) (1 x 1 min, 2 x 5 min). Washings between deprotections, couplings, and final deprotections were performed with DMF (5 x 1 min) and CH 2 CI2 (5 x 1 min) using 5 mL solvent.g- 1 resin for each wash. The transformations of the synthesis of the peptides and the washes were performed at 25 ° C.
  • HPLC columns (Symmetry® C18 reverse phase column, 5.0 Dm x 4.6 mm x 150 mm) were obtained from Waters (Ireland).
  • the analytical HPLC was performed on a Waters instrument comprising a separation module (Waters 2695), automatic injector, array photodiode detector (Waters 996), and system controller (Millenium 32 login). UV detection was performed at 215 or 220 nm, and linear gradients of CH3CN (+ 0.036% TFA) in H2O (+ 0.045% TFA) were performed, at 1.0 mL-min "1 flow in 15 min.
  • MALDI-TOF and ES (+) - MS analyzes of peptide samples were performed on an Applied Biosystems VoyagerDE RP, using ACH matrix, and on a Waters Micromass ZQ spectrometer spectrometer and on an Agilent Ion Trap 1100 Series LC / MSDTrap.
  • 1 H NMR (400 MHz) and 13 C NMR (100 MHz) spectroscopy was performed on a Varian Mercury 400. Chemical shifts ( ⁇ ) are expressed in parts per million relative to tetramethylsilyl chloride. Coupling constants are expressed in Hertz.
  • Boc-NMe-Cys (Me) -OH was extracted with EtOAc (3 x 20 mL) and dried (MgSO 4 ).
  • the target product (3.6 g, 85% yield) was obtained as a colorless oil.
  • Boc-NMe-Cys (Me) -OH can be obtained from HCI-H-NMe-Cys-OH.
  • HCI-H-NMe-Cys-OH (4.1 g, 23.8 mmol), obtained from (R) (-) - thiazolidin-4-carboxylic acid according to Liu, JF .; Tang, XX .; Jiang, B. (cf. Synthesis 2002, 1499-1501), was dissolved in H 2 O-THF (1: 1) (170 mL) and the mixture was cooled to 4 ° C. Iodomethane (2.07 mL, 33.3 mmol) dissolved in THF (68 mL) and NaHCO 3 (5.3 g, 71.4 mmol) in H 2 O (68 mL) were added sequentially over the amino acid solution.
  • Boc-NMe-Cys (Me) -OH (3.0 g, 12.0 mmol) was reacted for 1 h with TFACH 2 CI 2 (1: 1).
  • the mixture was evaporated to dryness and dioxane coevaporations were performed in order to remove excess TFA.
  • the solid was dissolved in a 30% aqueous solution of Na 2 CO 3 (50 mL).
  • a solution of allyl chloroformate (1.5 mL, 14.4 mmol) in dioxane (50 mL) was added dropwise, and the pH was maintained at 8-9 by adding 10% aqueous Na 2 CO 3 .
  • HCI-H-NMe-Cys-OH (4.1 g, 23.8 mmol), obtained from (R) (-) - thiazolidine-4-carboxylic acid according to Liu, JF .; Tang, XX .; Jiang, B. (Synthesis 2002, 14991501), was dissolved in H 2 O (12.3 mL) and the solution was purged with Ar, and then ⁇ / -hydroxmetmettamide (3.54 g, 39.7 mmol) was added to Ia solution and the mixture was cooled to 4 ° C under Ar. A solution of TFA in trifluoromethanesulfonic acid (95: 5) (41 mL) was added to the amino acid solution.
  • the mixture was stirred at 4 ° C for 2 h and at 25 ° C for 3 days, keeping the pH at 8.5-9.5
  • the dioxane was removed and the aqueous solution was washed with TBME (3 x 50 mL)
  • the aqueous phase was acidified with 4N HCI to pH 2 and the product was extracted with EtOAc (3 x 50 mL).
  • Example 4 Alloc-NMe-Cvs (Acm) -OH
  • Boc-NMe-Cys (Acm) -OH (0.74 g, 2.4 mmol) was reacted for 1 h with TF ⁇ CH2CI2 (1: 1).
  • the mixture was evaporated to dryness and dioxane coevaporations were performed in order to remove excess TFA.
  • the solid was dissolved in a 30% aqueous solution of Na 2 C0 3 (20 mL).
  • Boc-Cys (Me) -OH (0.56 g, 2.4 mmol) was reacted for 1 h with TF ⁇ CH 2 CI2 (1: 1). The mixture was evaporated to dryness and dioxane coevaporations were performed in order to remove excess TFA. The solid was dissolved in a 30% aqueous solution of Na 2 CO 3 (30 mL). Then, a solution of allyl chloroformate (0.3 mL, 2.9 mmol) in dioxane (30 mL) was added dropwise, and the pH was maintained at 8-9 by the addition of 10% aqueous Na 2 CO 3 .
  • Boc-Cys (Acm) -OH (1.0 g, 3.4 mmol) was reacted for 1 h with TFACH 2 CI 2 (1: 1). The mixture is evaporated to dryness and coevaporations were performed with dioxane in order to remove excess TFA. The solid was dissolved in a 30% aqueous solution of Na 2 C0 3 (30 ml_). Then, a solution of allyl chloroformate (0.43 mL, 4.1 mmol) in dioxane (30 mL_) was added dropwise, and the pH was maintained at 8-9 by the addition of 10% aqueous Na 2 CO 3 .
  • Boc-D-Ser-OH (1.0 g, 5.35 mmol) was dissolved in DMF (10 mL) and cooled to 0 ° C in an ice bath. Then TBDMSCI (1.04 g, 6.96 mmol) and imidazole (1.10 g, 16.0 mmol) were added, and the reaction was maintained at 0 ° C for 1 h and then brought to 25 ° C and stirred for a further 14 h. Then 1N HCI (25 mL) was added, and the product was extracted with Et 2 O (3 x 25 mL).
  • H-GIy-OH 1.0 g, 13.3 mmol
  • TFA-CH 2 CI 2 1: 1
  • the mixture was evaporated to dryness and dioxane coevaporations were performed in order to remove excess TFA.
  • the solid was dissolved in a 30% aqueous solution of Na 2 CO 3 (50 mL).
  • a solution of allyl chloroformate was added dropwise. (1.7 mL, 16.0 mmol) in dioxane (50 mL), and the pH is maintained at 8-9 by adding 10% aqueous Na 2 CO 3 .
  • Example 9 ⁇ fH ⁇ a-D-Ser (& 1 ) -Glv-Cvs (& 2 ) -Cvs (Me) & 3 ⁇ Hqa-D-Ser (& 3 VGIv- Cvs (& 2 ) -Cvs (Me ⁇ & 1 one)
  • the Fmoc-Gly-O-Wang resin was subjected to the following washes / treatments: filtration, CH 2 CI 2 (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidine-DMF (1: 4) (1 x 1 min, 2 x 5 min).
  • the functionalization (0.90 mmol / g) was calculated by measuring the absorbance at 290 nm of the Fmoc deprotection solution.
  • Fmoc-D-Ser (Trt) -OH (76.8 mg, 0.135 mmol) was introduced by HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) as a DMF coupling agent in the presence of DIEA (45.9 ⁇ L, 0.27 mmol).
  • the mixture was stirred for 1 h and after filtration, the Kaiser test indicated completion of the coupling reaction.
  • the peptidyl resin was then washed with DMF (3 x 1 min), CH 2 CI 2 (3 x 1 min), and treated with piperidine-DMF (1: 4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) to remove the Fmoc group.
  • the resin was treated with p-nitrobenzyl chloroformate (29.1 ⁇ L, 0.135 mmol) and DIEA (229 ⁇ L, 1.35 mmol) for 45 min.
  • the peptidyl resin was treated with Pd (PPh 3 ) 4 (5.2 mg, 4.5 ⁇ mol) and PhSiH 3 (55.4 mg, 0.45 mmol) dissolved in CH 2 Cb for 15 min under Ar, and then washed with CH 2 CI 2 (3 x 1 min). The process was repeated three times and then Boc-Cys (Acm) -OH (65.5 mg, 0.225 mmol) was introduced with HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), and DIEA (37.5 ⁇ l_, 0.22 mmol) as a coupling system. The coupling was repeated once.
  • the dimerized peptide was then cleaved from the resin by treatment with TFA-CH 2 CI 2 (1: 4) (2 x 30 min), and after the addition of H 2 O, the mixture was evaporated with N 2 , and lyophied. .
  • HPLC-ESMS m / z caled for C 44 H 52 N 10 Oi 6 S 4 1104.24; found, 1105.22 [M + H] + .
  • the lyophilized product was dissolved in CH 2 CI 2 and added to a solution of HOAt (49 mg, 0.36 mmol) in DMFCH 2 CI 2 (1: 9), and the mixture was stirred for 30 min.
  • the dimer can also be obtained before removing the protective group pNZ.
  • the cleavage of the resin dimer, evaporation, lyophilization, and cyclization under the conditions described above provides the protected cycle with the pNZ group.
  • Elimination of the protective group pNZ is carried out by treatment with SnCI 2 (1.5 equiv), HC1 1.6 mM in EtOAc-DMF (9: 1), and 3-hydroxyquinoline acid (3 equiv) was introduced by reaction with EDC-HCI (3 equiv), and HOSu (3 equiv), in CH 2 CI 2 at 25 ° C for 2 days.
  • Example 10 Qxathiocoraline: ⁇ [Hqa-D-Ser (& 1 ) -GIy- (Me) Cys (& 2 ) - (Me) Cvs (Me) & 3 ] [Hqa-D-Ser (& 3 ) -Glv - (Me) Cvs (& 2 ) - (Me) Cvs (Me) & 1 ] ⁇
  • the Fmoc-Gly-O-Wang resin was subjected to the following washes / treatments: filtration, CH 2 Cl 2 (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidine-DMF (1: 4) (1 x 1 min, 2 x 5 min).
  • Fmoc-D-Ser (Trt) -OH (76.8 mg, 0.135 mmol) was introduced by HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) as a DMF coupling agent in the presence of DIEA (45.9 ⁇ L, 0.27 mmol). The mixture was stirred for 1 h and after filtration, the Kaiser test indicated completion of the coupling reaction.
  • the peptidyl resin was then washed with DMF (3 x 1 min), CH 2 CI 2 (3 x 1 min), and treated with piperidine-DMF (1: 4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) to remove the Fmoc group.
  • the resin was treated with p-nitrobenzyl chloroformate (29.1 ⁇ L, 0.135 mmol) and DIEA (229 ⁇ L, 1.35 mmol) for 45 min.
  • Deprotection of the trityl group was carried out with washings with TFA-TIS-CH 2 CI 2 (2: 2.5: 95.5) until a colorless filtrate was achieved.
  • the peptidyl resin was then washed with CH 2 CI 2 (3 x 1 min) and Alloc-NMe-Cys (Me) -OH (104.8 mg, 0.45 mmol) was introduced by reaction with DIPCDI (69.7 ⁇ L, 0.45 mmol) and DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) in DMF-CH 2 CI 2 (1: 9) for 14 h at 25 ° C.
  • the peptidyl resin was treated with Pd (PPt ⁇ ) 4 (5.2 mg, 4.5 ⁇ mol) and PhSiH 3 (55.4 mg, 0.45 mmol) dissolved in CH 2 CI 2 for 15 min under Ar, and was then washed with CH 2 CI 2 (3 x 1 min).
  • the process was repeated three times and Boc-NMe-Cys (Acm) -OH (68.8 mg, 0.225 mmol) was introduced with HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), and DIEA (37.5 ⁇ L , 0.22 mmol) as a coupling system. The coupling was repeated once.
  • the dimerized peptide was then cleaved from the resin by treatment with TFA-CH 2 CI 2 (1: 4) (2 x 30 min), and after the addition of H 2 O, the mixture was evaporated with N 2 , and lyophilized .
  • HPLC-ESMS m / z caled for C 48 H 6O Ni 0 Oi 6 S 4 1160.31; found, 1161.84 [M + H] + .
  • the lyophilized product was dissolved in CH 2 CI 2 and added to a solution of HOAt (49 mg, 0.36 mmol) in DMF-CH 2 CI 2 (1: 9), and the mixture was stirred for 30 min.
  • the dimer can also be obtained before removing the protective group pNZ.
  • the cleavage of the resin dimer, evaporation, lyophilization, and cyclization under the conditions described above provides the protected cycle with the pNZ- group.
  • the elimination of the protective group pNZ is carried out by treatment with SnCI 2 (1.5 equiv), HC1 1.6 mM in EtOAc-DMF (9: 1), and 3-hydroxyquinoline acid (3 equiv) was introduced by reaction with EDC- HCI (3 equiv), and HOSu (3 equiv), in CH 2 CI 2 at 25 ° C for 2 days.
  • Example 11 frQac-D-Ser (& 1 ) -Glv-Cvs (& 2 ) -Cys (Me) & 3 1 [Qac-D-Ser (& 3 ) -Glv- Cvs (& 2 ) -Cvs (Me ) & 1 p
  • the Fmoc-G Iy-O-Wa ng resin was subjected to the following washes / treatments: filtration, CH 2 CI 2 (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidine-DMF (1: 4) (1 x 1 min, 2 x 5 min).
  • Fmoc-D-Ser (Trt) -OH (76.8 mg, 0.135 mmol) was introduced by HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) as a DMF coupling agent in the presence of DIEA (45.9 ⁇ L, 0.27 mmol). The mixture was stirred for 1 h and after filtration, the Kaiser test indicated completion of the coupling reaction.
  • the peptidyl resin was then washed with DMF (3 x 1 min), CH 2 CI 2 (3 x 1 min), and treated with piperidine-DMF (1: 4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) to remove the Fmoc group.
  • the resin was treated with p-nitrobenzyl chloroformate (29.1 ⁇ L, 0.135 mmol) and DIEA (229 ⁇ L, 1.35 mmol) for 45 min.
  • Deprotection of the trityl group was carried out with washings with TFA-TIS-CH 2 CI 2 (2: 2.5: 95.5) until a colorless filtrate was achieved.
  • the peptidyl resin was then washed with CH 2 CI 2 (3 x 1 min) and Alloc-Cys (Me) -OH (98.5 mg, 0.45 mmol) was introduced by reaction with DIPCDI (69.7 ⁇ L, 0.45 mmol) and DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) in DMFCH 2 CI 2 (1: 9) for 14 h at 25 ° C. Then, to eliminate the Alloc group, the peptidyl resin was treated with Pd (PPh 3 ) 4 (5.2 mg, 4.5 ⁇ mol) and PhSiH 3 (55.4 mg, 0.45 mmol) dissolved in CH 2 CI 2 for 15 min under Ar, and was then washed with CH 2 Cb (3 x 1 min).
  • Boc-Cys (Acm) -OH (65.5 mg, 0.225 mmol) was introduced with HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), and DIEA (37.5 ⁇ L, 0.22 mmol) as a coupling system. The coupling was repeated once. An aliquot of the resin was cloned and analyzed by HPLC-ESMS: m / z caled for C 23 H 32 N 6 OnS 2 , 632.16; found, 632.16 [M + H] + .
  • the intermolecular disulfide bridge formation was obtained by treatment with I 2 (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) in DMF (2 x 10 min).
  • the resin was repeatedly washed with CH 2 CI 2 (10 x 1 min), DMF (10 x 1 min), and CH 2 CI 2 (10 x 1 min).
  • the dimerized peptide was then cleaved from the resin by treatment with TFA-CH 2 CI 2 (1: 4) (2 x 30 min), and after the addition of H 2 O, the mixture was evaporated with N 2 , and lyophilized .
  • HPLC-ESMS m / z caled for C 44 H 52 N 10 Oi 4 S 4 , 1072.25; found, 1073.52 [M + H] + .
  • He Lyophilized product was dissolved in CH 2 CI 2 and added to a solution of HOAt (49 mg, 0.36 mmol) in DMFCH 2 CI 2 (1: 9), and the mixture was stirred for 30 min. Addition of PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) and DIEA (90 ⁇ L) to adjust to pH 8.0 allowed the beginning of the cyclization, which was stirred for 4 h. The solvent was evaporated and the bicyclic peptide was then purified by semi-preparative HPLC. HPLC-ESMS: m / z caled for C 44 H 48 N 10 O 12 S 4 , 1036.23; found, 1037.64 [M + H] + . MALDI-TOF: m / z caled for C 44 H 48 Ni 0 Oi 2 S 4 , 1036.23; found, 1038.06 [M + H] + .
  • the dimer can also be obtained before removing the protective group pNZ.
  • the cleavage of the resin dimer, evaporation, lyophilization, and cyclization under the conditions described above provides the protected cycle with the pNZ group.
  • Removal of the pNZ protecting group is carried out by treatment with SnCI 2 (1.5 equiv), 1.6 mM HC1 in EtOAc-DMF (9: 1), and 3-hydroxyquinoline acid (3 equiv) was introduced by reaction with EDC HCI (3 equiv), and HOSu (3 equiv), in CH 2 CI 2 at 25 ° C for 2 days.
  • Example 12 (rQac-D-Ser (& 1 ) -Glv- (Me) Cvs (& 2 ) - (Me) Cvs (Me) & 3 irQac-D- Ser (& 3 ) -Glv- (Me) Cvs (& 2 HMe) Cvs (Me) & 1 1 ⁇
  • the Fmoc-Gly-O-Wang resin was subjected to the following washes / treatments: filtration, CH 2 CI 2 (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidine-DMF (1: 4) (1 x 1 min, 2 x 5 min).
  • Fmoc-D-Ser (Trt) -OH (76.8 mg, 0.135 mmol) was introduced by HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) as a DMF coupling agent in the presence of DIEA (45.9 ⁇ L, 0.27 mmol). The mixture was stirred for 1 h and after filtration, the Kaiser test indicated completion of the coupling reaction.
  • the peptidyl resin was then washed with DMF (3 x 1 min), CH 2 CI 2 (3 x 1 min), and treated with piperidine-DMF (1: 4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) to remove the Fmoc group.
  • the resin was treated with p-nitrobenzyl chloroformate (29.1 ⁇ L, 0.135 mmol) and DIEA (229 ⁇ L, 1.35 mmol) for 45 min.
  • Deprotection of the trityl group was carried out with washings with TFA-TIS-CH 2 CI 2 (2: 2.5: 95.5) until a colorless filtrate was achieved.
  • the peptidyl resin was then washed with CH 2 CI 2 (3 x 1 min) and Alloc-NMe-Cys (Me) -OH (104.8 mg, 0.45 mmol) was introduced by reaction with DIPCDI (69.7 ⁇ L, 0.45 mmol) and DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) in DMF-CH 2 CI 2 (1: 9) for 14 h at 25 ° C.
  • the peptidyl resin was treated with Pd (PPh 3 ) 4 (5.2 mg, 4.5 ⁇ mol) and PhSiH 3 (55.4 ⁇ L, 0.45 mmol) dissolved in CH 2 CI 2 for 15 min under Ar, and was then washed with CH 2 CI 2 (3 x 1 min).
  • Boc-NMe-Cys (Acm) - OH (68.8 mg, 0.225 mmol) was introduced with HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), and DIEA (37.5 ⁇ L, 0.22 mmol) as a system of coupling The coupling was repeated once.
  • the dimerized peptide was then cleaved from the resin by treatment with TFACH 2 CI 2 (1: 4) (2 x 30 min), and after the addition of H 2 O, the mixture was evaporated with N 2 , and lyophilized.
  • HPLC-ESMS m / z caled for C 48 H 60 Ni 0 O 14 S 4 , 1128.32; found, 1129.86 [M + H] + .
  • the lyophilized product was dissolved in CH 2 CI 2 and added to a solution of HOAt (49 mg, 0.36 mmol) in DMFCH 2 CI 2 (1: 9), and the mixture was stirred for 30 min.
  • the dimer can also be obtained before removing the protective group pNZ.
  • the cleavage of the resin dimer, evaporation, lyophilization, and cyclization under the conditions described above. provides the protected cycle with the pNZ- group.
  • the elimination of the protective group pNZ is carried out by treatment with SnCI 2 (1.5 equiv), HC1 1.6 mM in EtOAc-DMF (9: 1), and 3-hydroxyquinoline acid (3 equiv) was introduced by reaction with EDC- HCI (3 equiv), and HOSu (3 equiv), in CH 2 CI 2 at 25 ° C for 2 days.

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Abstract

Procedimiento de obtención de los productos de la fórmula adjunta, en la cual AA1, AA2, AA3, AA4, AA1', AA2', AA3', y AA4' son independientemente -aminoácidos de configuración L o D, si aplica, proteinogénicos o no proteinogénicos, y donde por lo menos dos son cisteinas o N-alquil cisteinas, que comprende la formación del dímero intermolecular por puente disulfuro en fase sólida a partir de precursores lineales, donde el puente disulfuro es escindido del soporte sólido y biciclado en solución. Los productos obtenidos tienen actividad biológica y utilidad en terapia, p.ej. como antitumorales.

Description

Procedimiento para Ia obtención de péptidos bicíclicos
La presente invención trata de síntesis orgánica en fase sólida, particularmente de síntesis de péptidos bicíclicos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los péptidos bicíclicos, tanto los aislados de fuentes naturales como los obtenidos sintéticamente, son compuestos que presentan interesantes actividades biológicas. La naturaleza del puente que forma el biciclo es diversa, y puede incluir un puente disulfuro, un tioéter, o una lactama.
Un ejemplo de péptidos bicíclicos es Ia familia de péptidos antibióticos antitumorales aislados de organismos marinos, que incluye Ia tiocoralina (cf. Romero, F.; Espliego, F.; Pérez Baz, J.; García de Quesada, T.; Grávalos, D.; De Ia Calle, F.; Fernandez-Puentes, J. L. J. Antibiotics 1997, 50, 734-737), el BE-22179, el triostin A, y el equinomicin. Este grupo de péptidos presenta una estructura compleja que contiene: a) un eje Ca; b) una estructura bicíclica formada por dos cadenas peptídicas antiparaleias; c) un enlace éster o tioéster en Ia parte terminal de Ia cadena peptídica; d) un puente disulfuro o un puente análogo en Ia mitad de las cadenas peptídicas; e) un cromóforo intercalador en Ia parte Λ/-terminal; f) Ia presencia de varios Λ/-metil aminoácidos; y g) aminoácidos no naturales de configuración D. Las estructuras de estos péptidos son:
Figure imgf000003_0001
Triostin A Equinomicin Por tanto, Ia estructura general de esta familia de compuestos es:
Figure imgf000004_0001
Un ejemplo de grupo heterocíclico es el ácido 3-hidroxiquinolino-2-carboxílico (Hqa) y sus derivados (fórmula siguiente), los cuales forman Ia parte heterocíclica de Ia tiocoralina y de otros depsipéptidos naturales con interesantes actividades biológicas, como el SW-163C, SW-163E, y el sandramicin. Además, este cromóforo heterocíclico juega un papel muy importante en las propiedades enlazantes del DNA con estos compuestos. La síntesis de este heterociclo ha estado optimizada (cf. Riego. E., Bayo, N., Cuevas, C, Albericio, F., M. Álvarez, Tetrahedron 61 , 1407-1411, 2005).
Figure imgf000004_0002
donde Ri es H o un grupo orgánico seleccionado de un grupo formado por un grupo alquilo, un grupo arilo y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo; donde R2 es H o un grupo funcional carbonilo enlazado a una cadena alquílica formando un éster, con un grupo tiol, hidroxilo o amino al final de Ia cadena.
Aunque los procedimientos estándar para síntesis en fase sólida se pueden aplicar con éxito para acceder a un gran numero de péptidos, Ia síntesis de péptidos bicíclicos es todavía muy difícil y muy dependiente de Ia secuencia. Esto es debido a Ia presencia de reacciones secundarias asociadas con Ia elongación de Ia cadena peptídico; en particular, a circunstancias como: - formación de dicetopiperazina de los dos residuos consecutivos posteriores al grupo functional éster o tioéster;
- dificultad en completar Ia formación del enlace éster; y
- alta labilidad de los enlaces éster o tioéster a las condiciones básicas.
Estas limitaciones son especialmente dramáticas por ejemplo en el caso de Ia tiocoralina y oxatiocoralina debido a Ia rápida formación de dicetopiperazinas de las dos consecutivas NMe-cisteinas. En este contexto, se han establecido nuevas vías para minimizar Ia formación de dicetopiperazinas.
Los péptidos bicíclicos como los representados arriba presentan una interesante actividad biológica, por lo que es interesante proporcionar nuevas rutas sintéticas para acceder a ellos.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un procedimiento para Ia obtención de un dímero intermolecular por puente disulfuro en fase sólida a partir de precursores lineales. En una realización particular, el puente disulfuro es escindido del soporte sólido y biciclado en solución para obtener compuestos con Ia estructura de Ia fórmula adjunta, donde AA1 , AA2, AA3, AA4, AA1', AA2', AA3', y AA4' son independientemente α-aminoácidos de configuración L o D, si aplica, proteinogénicos o no proteinogénicos, y donde por Io menos dos son cisternas o /V-alquil cisteinas, formando un puente disulfuro; donde Ri, R2, y R3 son cada uno independientemente H o un grupo orgánico seleccionado de un grupo que consiste de un grupo alquilo, un grupo arilo, un grupo aralquilo, y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo, un grupo mercapto, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo halógeno; donde R4 es independientemente H o un grupo alquilo; donde arilo (Aryl) es independientemente un grupo aromático/arilo, un grupo alquilo, o un grupo heterocíclico: el término grupo aromático o grupo arilo significando un grupo aromático mono- o policíclico hidrocarbonado, un mono- , bi-, or policiclo adecuado; y el término grupo heterocíclico significando un anillo cerrado hidrocarbonado en el cual uno o mas átomos del anillo es un elemento que no es carbono, un mono-, bi- o policiclo adecuado.
Figure imgf000006_0001
AA11 AA21 AA3' AA41
En una realización preferida, el soporte sólido es una resina ácido-lábil como Ia resina p-alcoxibenzilo Wang o Ia resina cloruro de 2-clorotritilo. Aún más preferida es Ia realización en Ia que para formar el. precursor lineal, se usan los siguientes grupos protectores: Fmoc (fluorenilmethiloxicarbonil), Alloc (alliloxicarbonil), Tritilo (trifenilmetilo), pNZ (4-nitrobenziloxicarbonilo), Boc (f-butiloxicarbonilo), TBDMS (f-butildimetilsililo) o Trac (2,2,2- tricloroetoxicarbonilo). En todos los casos, el grupo arilo puede ser introducido en fase sólida o en solución.
En particular, Ia invención supone Ia preparación de un dímero ¡ntermolecular por puente disulfuro de tetrapéptidos a partir de un tetrapéptido lineal, que permite restringir Ia flexibilidad de Ia cadena minimizando Ia formación de dicetopiperazinas.
La invención está especialmente dirigida a Ia preparación de péptidos bicíclicos. Con este fin, Ia invención implica Ia preparación de un tetrapéptido lineal por síntesis en fase sólida, que puede contener un grupo éster o tioéster, y Ia subsiguiente formación de un dímero por puente disulfuro intermolecular en fase sólida. En este aspecto de Ia invención, las partes heterocíclicas pueden estar ya formando parte del dímero, o reemplazadas temporalmente por un grupo protector adecuado. El proceso involucra Ia escisión del dímero del soporte sólido y Ia simultánea doble ciclación para formar el biciclo. El heterociclo también se puede introducir en este punto, en el caso que no estuviera formando parte del dímero.
Los compuestos de esta invención tienen actividad biológica, como por ejemplo actividad antitumoral.
El procedimiento de esta invención se puede llevar a cabo a partir de reactivos de partida de una manera rápida y enantio- y estereocontrolada, aprovechando las ventajas de Ia metodología sintética de fase sólida, donde una molécula en construcción se une a un soporte insoluble durante todas las operaciones sintéticas. Por Io tanto, los excesos de reactivos y los productos secundarios solubles pueden ser eliminados lavando Ia resina-molécula con disolventes adecuados. Por Io tanto, se pueden utilizar grandes excesos de reactivos solubles para completar Ia reacción en un periodo corto de tiempo, evitando racemización (si aplica) y otras reacciones secundarias. El método también permite su automatización.
Los aspectos preferibles del procedimiento sintético de Ia presente invención están representados mejor en el esquema adjunto, el cual esta dirigido a Ia formación de los compuestos objetivo
Como se muestra en el esquema, el procedimiento preferible para Ia formación sintética de péptidos bicíclicos está basado en un enfoque de fase sólida, véase por ejemplo, Lloyd-Williams, P., et al. Chemical Approaches to the Synthesis ofPeptides and Proteins. CRC Press, Boca Ratón (FL), 1997. El procedimiento comprende las siguientes características generales:
(a) anclaje del primer aminoácido protegido en un soporte sólido (p. ej., poliestireno, polietileno injertado sobre poliestireno, y similares) conteniendo un espaciador bifuncional o enlazador ácido-lábil (p. ej., clorotritilo, polialcoxibenzilo, y similares); los preferidos son Ia resina Wahg y Ia resina Barios [cloruro de clorotritilo (CTC)], Ia cual reduce al mínimo Ia formación de dicetopiperazinas (DKP1S) y permite Ia escisión de péptidos protegidos en condiciones acidas muy suaves;
Figure imgf000008_0001
(b) esquema de protección basado en una combinación de varios grupos protectores: fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc)/aliloxicarbonilo (Alloc) / p-nitrobenziloxicarbonilo (pNZ), tert-butiloxicarbonilo (Boc), f-butildimetilsililo (TBDMS), y 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo (Trac).
(c) el uso del grupo acetamidometilo (Acm), que es un grupo protector ortogonal a los grupos protectores de los grupos aminos descritos anteriormente, para enmascarar el grupo tiol de Ia Cys durante Ia elongación de péptido y facilitar Ia formación directa del puente disulfuro;
(d) Ia formación del puente disulfuro en fase sólida, Io cual facilita Ia eliminación del exceso de l2 únicamente por filtración y lavados, formando el dímero abierto;
(e) el empleo de un arsenal de agentes acoplantes desde los mas reactivos, aquellos basados en HOAT (1-hidroxi-7-azabenzotriazol) a los más suaves basados en HOSU (Λ/-hidroxisucc¡nimida) para mejorar los rendimientos de acoplamiento, evitar reacciones secundarias, así como sobreacilaciones.
Además, el procedimiento del esquema comprende los pasos secuenciales de:
(a) Ia incorporación del primer aminoácido (AA2) sobre Ia resina Wang o Ia resina Barios formando un enlace éster, teniendo el grupo funcional Damino temporalmente protegido con el grupo Fmoc;
(b) Ia introducción del aminoácido siguiente (AA1) utilizando una estrategia Fmoc y HATU (hexafluorofosfato de Λ/-[(dimetilamino)-1H-1 ,2,3-triazolo[4,5- b]piridin-1 -ilmetilen]-Λ/-metilmetanaminio)/HOAt (1 -hidroxi-7- azabenzotriazol)/DIEA (/V,Λ/-diisopropiletilamina) para asegurar un acoplamiento completo, el teniendo Ia funcionalidad Damino temporalmente protegido con el grupo Fmoc; y el grupo funcional de Ia cadena lateral temporalmente protegido con el grupo TBDMS (íerí-butildimetilsililo) o Trt (tritilo) cuando se utilizan Cys o Ser, o con un grupo Alloc cuando se utiliza Dap (diaminopropiónico);
(c) el cambio del grupo protector del grupo funcional α-amino de Fmoc a pNZ. (d) elongación de Ia cadena peptídica a través de Ia cadena lateral de Ia Serina, Cisteina o Diaminopropiónico (Dap) utilizando ácido trifluoroacético en presencia de TIS (triisopropilsilano) [TFA-TIS-CH2CI2 (2:5:93)] para eliminar el grupo tritilo (Serina o Cisteina) y Pd(PPh3VPhSiH3 para eliminar el grupo Alloc (Dap). Se utilizó HATU/HOAt/DIEA en DMF para realizar el enlace amida y DIPCDI (Λ/,Λ/'-diisopropilcarbodiimida)/DMAP [4-{N,N- dimetilam¡no)p¡rid¡na] en el caso de realizar el enlace éster o tioéster (AA4). Alternativamente, también se puede utilizar MSNT [1-(Mesitileno-2-sulfonil)-3- nitro-1 H-1 ,2,4-triazol] /NMI (Λ/-metilmidazol)/DIEA para formar el enlace éster.
(e) introducción del aminoácido siguiente (AA3) usando HATU/HOAt/DIEA como sistema de acoplamiento para asegurar un acoplamiento completo.
alternativamente algunos Λ/-metil aminoácidos se pueden introducir mediante el método de /V-metilación de aminoácidos en fase sólida por el método Fukuyama (cf. Miller, S. C; Scanlan, T. S., J. Am. Chem. Soc, 1998, 120, 2690-2691 ; Yang, L.; Chiu, K., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 7307-7310) utilizando o-nitrosulfonilo como protección temporal del grupo funcional α-amino;
(f) eliminación del grupo pNZ e introducción del ácido 3-hidroxiquináldico usando PyBOP (hexafluorofosfato de (benzotriazol-i-iloxi)-tris- (pirrolidino)fosfonio)/ HOAt/DIEA como sistema de acoplamiento;
(g) formación del dímero por puente disulfuro intermolecular mediante tratamiento con b y eliminación del reactivo por filtración y lavados;
(h) tratamiento con ácido trifluoroacético [(TFA-CH2CI2 (1 :4) con resina Wang y TFA-CH2Cb (1 :99) con Ia resina Barios] para obtener el péptido dimerizado;
(i) Ia formación del biciclo usando PyAOP [hexafluorofosfato de (7- azabenzotriazol-i-iloxi)-tris(pirrolidino) fosfonio]/DIEA o PyBOP/HOAt/DIEA para asegurar una delación completa y evitar Ia guanidilación que puede ocurrir cuando se utilizan HATU u otros reactivos basados en aminio/uronio; (j) alternativamente, Ia introducción del heterociclo se puede realizar también después de Ia formación del biciclo, mediante tratamiento con DIPCDI y HOSU, en DCM.
Alternativamente, Ia síntesis del péptido se puede iniciar en otro punto de Ia cadena que no sea AA2.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
EJEMPLOS
Métodos generales:
Derivados de aminoácidos protegidos, PyBOP1 PyOAP1 fueron obtenidos de Applied Biosystems (Framingham, MA), Bachem (Bubendorf, Switzerland), Albatross (Montreal, Canadá), y NovaBiochem (Láufelfingen, Switzerland). La resina Barios se obtuvo de Rohm and Haas (Philadelphia, USA) o de Iris Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany). DIEA, DIPCDI, piperidina, TFA, amoníaco, ¡odometano, cloroformiato de alilo, cloroformiato de p-nitrobenzilo, y el acido quináldico fueron obtenidos de Aldrich (Milwaukee, Wl), y EDCΗCI y HOAt eran de Luxembourg Industries (TeI Aviv, Israel). DMF1 CHaCI2, Acetonitrilo (grado HPLC), metanol (grado HPLC), Dioxano, Et2O, TBME (f-butil metil éter) y EtOAc (acetato de etilo) fueron obtenidos de SDS (Peypin, France). El ácido (R)(-)-thiazolidino-4-carboxílico, trifluorometanosulfónico, N- hidroximetilacetamida y /V-hidroxisuccinimida fueron obtenidos de Fluka (Buchs, Switzerland). Todos los reactivos comerciales y disolventes se usaron tal como se recibieron con Ia excepción de Ia DMF y el CH2CI2, los cuales fueron desgasificados con nitrógeno para eliminar contaminantes volátiles (DMF) y guardados sobre tamiz molecular de 4Á (Merck, Darmstadt, Germany), y THF que fue destilado de sodio/benzofenona. Las reacciones en solución se realizaron en balones con fondo redondo. Los extractos de disolventes orgánicos fueron secados sobre MgSO4 anhidro, y seguidamente se evaporó el disolvente bajo presión reducida a temperaturas por debajo de 40 °C.
Las síntesis en fase sólida fueron realizadas en jeringas de polipropileno (2, 5 mL) provistas de un disco poroso de polipropileno. Los disolventes y los reactivos solubles fueron eliminados por succión. La eliminación del grupo Fmoc se realizó con piperidina-DMF (1 :4, v/v) (1 x 1 min, 2 x 5 min). Los lavados entre desprotecciones, acoplamientos, y desprotecciones finales se realizaron con DMF (5 x 1 min) y CH2CI2 (5 x 1 min) usando 5 mL disolvente.g-1 resina para cada lavado. Las transformaciones de Ia síntesis de los péptidos y los lavados se realizaron a 25 °C.
Las columnas de HPLC (columna de fase reversa Symmetry® C18, 5.0 Dm x 4.6 mm x 150 mm) fueron obtenidas de Waters (Ireland). El HPLC analítico se realizó en un instrumento Waters que comprende un módulo de separación (Waters 2695), inyector automático, detector de fotodiodo array (Waters 996), y controlador del sistema (Millenium32 login). La detección de UV se realizó a 215 o 220 nm, y se realizaron gradientes lineales de CH3CN (+0.036% TFA) en H2O (+0.045% TFA), a 1.0 mL-min"1 de flujo en 15 min.
Los análisis de MALDI-TOF y ES(+)-MS de muestras de péptido fueron realizadas en un Applied Biosystems VoyagerDE RP, utilizando matriz ACH, y en un espectrómetro Waters Micromass ZQ spectrometer y en un Agilent Ion Trap 1100 Serie LC/MSDTrap. Espectroscopia 1H NMR (400 MHz) y 13C NMR (100 MHz) se realizó en un Varían Mercury 400. Los desplazamientos químicos (δ) son expresados en partes por millón relativos al cloruro de tetrametilsililo. Las constantes de acoplamiento son expresadas en Hertz.
Ejemplo 1 : Boc-NMe-Cvs(Me)-OH
En un balón de fondo redondo, NaH al 60% en aceite mineral (2.01 g, 51 mmol) fue disuelto en THF anhidro (20 mL). A continuación, se añadió Boc- Cys(Me)-OH (4.0 g, 17 mmol) disuelto en THF (20 mL) y Ia reacción se enfrió a 0 °C en un baño de hielo. Se añadió ¡odometano (2.1 mL, 34 mmol) gota a gota y Ia reacción se dejó en agitación durante 14 h a 4 °C. Se añadió MeOH lentamente para eliminar el exceso de hidruro y a continuación se añadió H2O, y Ia mezcla se llevo a pH 8 mediante Ia adición de NaOH, y el THF residual fue eliminado por evaporación. La fase acuosa fue extraída con TBME (3 x 20 ml_) y acidificada a pH 2 con HCI 4N. Boc-NMe-Cys(Me)-OH fue extraída con EtOAc (3 x 20 mL) y secada (MgSO4). El producto objetivo (3.6 g, 85% rendimiento) fue obtenido como un aceite incoloro. Alternativamente, Boc-NMe-Cys(Me)-OH se puede obtener a partir de HCI-H-NMe-Cys-OH. HCI-H-NMe-Cys-OH (4.1 g, 23.8 mmol), obtenido del acido (R)(-)-tiazolidin-4-carboxylico de acuerdo con Liu, J-F.; Tang, X-X.; Jiang, B. (cf. Synthesis 2002, 1499-1501), fue disuelto en H2O-THF (1 :1) (170 mL) y Ia mezcla fue enfriada a 4 °C. Se añadieron iodometano (2.07 mL, 33.3 mmol) disuelto en THF (68 mL) y NaHCO3 (5.3 g, 71.4 mmol) en H2O (68 mL) secuencialmente sobre Ia solución de aminoácido. Después de que Ia adición fuera completa, Ia mezcla se agitó a 25 °C durante 4 h, punto en el cual el test de Ellman fue negativo. La solución fue acidificada hasta pH 5 y el disolvente se eliminó bajo presión reducida. El residuo se disolvió en 2% Na2CO3 acuoso dioxano (1 :1) (80 mL) y Ia solución se enfrió a 4 °C. Sobre Ia solución de aminoácido se anadió (Boc)2O (6.2 g, 35.7 mmol) disuelto en dioxano (8 mL), y el pH se ajustó a 8.5-9.5 añadiendo 10% Na2CO3 acuoso. La mezcla se agitó a 4 °C durante 2 h y a 25 °C durante 2 días, manteniendo el pH a 8.5- 9.5. El dioxano se eliminó y Ia solución acuosa se lavó con TBME (3 x 50 mL). La fase acuosa se acidificó con HCI 4N hasta pH 2 y el producto se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL) y fue purificado por HPLC preparativo (gradiente lineal de 15 a 50% ACN en 30 min, 40 mL/min). Obtenido: 1.15 g, 19.4% rendimiento. 1H NMR (CDCI3) δ 7.18 (br s, 1H), 4.74 (dd, 1H), 3.05 (d, 1 H), 2.88 (d, 1 H), 2.84 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 1.46 (s, 9H). 13C NMR δ 175.2, 156.5, 80.7, 58.0, 33.2, 32.1 , 28.6, 15.6. ESMS: m/z caled para C10H19NO4S, 249.10; encontrada, 250.3 [M + H]+.
Ejemplo 2: Alloc-NMe-Cvs(Me)-OH
En un balón de fondo redondo de 500 mL, Boc-NMe-Cys(Me)-OH (3.0 g, 12.0 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFACH2CI2 (1 :1 ). La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30% de Na2CO3 (50 mL). A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo (1.5 mL, 14.4 mmol) en dioxano (50 mL), y el pH se mantuvo a 8-9 mediante Ia adición de 10% Na2CO3 acuoso. Se siguió el curso de Ia reacción mediante TLC [EtOAcH2ÓAcOH2-propanol (2:1 :1 :1)]. Una vez completada Ia reacción, Ia fase acuosa se lavó con TBME (3 x 50 ml_) y después se acidificó a pH 2 mediante Ia adición de HCI 4N, y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml_), (2.5 g, 89.6% rendimiento). 1H NMR (CDCI3) δ 5.95 (m, 1 H), 5.34 (dd, 1 H), 5.22 (dd, 1 H), 4.81 (m, 1 H), 4.62 (d, 2H), 3.10 (dd, 1 H), 2.95 (s, 3H)1 2.90 (dd, 1 H), 2.13 (s, 3H). 13C NMR (CDCI3) δ 174.8, 157.2, 136.8, 117.9, 67.1 , 66.9, 58.8, 33.1 , 32.0, 17.9. ESMS: m/z caled para C9H15NO4S, 233.07; encontrada, 234.3 [M + H]+.
Ejemplo 3: Boc-NMe-Cvs(Acm)-OH
HCI-H-NMe-Cys-OH (4.1 g, 23.8 mmol), obtenido del ácido (R)(-)-tiazolidin-4- carboxílico de acuerdo con Liu, J-F.; Tang, X-X.; Jiang, B. (Synthesis 2002, 14991501 ), se disolvió en H2O (12.3 mL) y Ia solución se purgó con Ar, y entonces Λ/-hidrox¡met¡lacetamida (3.54 g, 39.7 mmol) se añadió a Ia solución y Ia mezcla se enfrió a 4 °C bajo Ar. Se añadió una solución de TFA en acido trifluorometanosulfónico (95:5) (41 mL) a Ia solución de aminoácido. La mezcla se agitó a 25 °C durante 16 h hasta que el test de Ellman dio negativo. El producto se disolvió en 2% Na2CO3 acuoso" dioxano (1 :1 ) (80 mL) y Ia solución se enfrió a 4 °C. Sobre Ia solución de aminoácido se anadió (Boc)2O (6.2 g, 35.7 mmol) disuelto en dioxano (8 mL), y el pH se ajustó a 8.5-9.5 añadiendo 10% Na2CO3 acuoso. La mezcla se agitó a 4 °C durante 2 h y a 25 °C durante 3 días, manteniendo el pH a 8.5-9.5. El dioxano se eliminó y Ia solución acuosa se lavó con TBME (3 x 50 mL). La fase acuosa se acidificó con HCI 4N hasta pH 2 y el producto se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL). El disolvente se eliminó bajo presión reducida para dar 1.23 g, 16.9% rendimiento global). 1H NMR (CDCI3): δ 6.72 (br s, 1 H), 4.92 (m, 1 H), 4.56 (m, 1 H), 4.21 (m, 1 H), 3.21 (m, 1 H), 2.89 & 2.82 (m, 4H), 2.05 (m, 3H), 1.50 (s, 9H). 13C NMR (CDCI3): δ 172.6, 159.1 , 153.5, 80.9, 59.3, 40.6, 32.3, 31.4, 28.3, 22.9. ESMS: m/z caled para C12H22N2O5S, 306.12; encontrada, 306.67 [M + H]+.
Ejemplo 4: Alloc-NMe-Cvs(Acm)-OH En un balón de fondo redondo de 250 ml_, Boc-NMe-Cys(Acm)-OH (0.74 g, 2.4 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFÁCH2CI2 (1:1). La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30% de Na2C03 (20 mL). A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo (0.3 mL, 2.9 mmol) en dioxano (20 mL), y el pH se mantuvo a 8-9 mediante Ia adición de 10% Na2Cθ3 acuoso. Una vez completada Ia reacción, Ia fase acuosa se lavó con TBME (3 x 25 mL) y fue entonces acidificada a pH 2 mediante Ia adición de HCI 4N, y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3 x 25 mL). Obtenido: 0.61 g, 87% rendimiento. 1H NMR (CDCI3) δ 10.25 (br s, 1H), 7.34 (br s, 1H), 5.92 (m, 1H), 5.34 (dm, 1 H), 5.25 (dm, 1 H), 4.94 & 4.84 (m, 1 H), 4.65 (m, 2H), 4.58 (dd, 1 H), 4.24 (dd, 1 H), 3.25 (dd, 1 H1 2.92 (m, 4H), 2.11 (s, 3H). 13C NMR (CDCI3) δ 174.0, 159.8, 158.2, 132.1 , 118.2, 67.5, 59.1 , 42.1 , 31.7, 30.9, 22.4. ESMS: m/z caled para C11Hi8N2O5S, 290.09; encontrada, 291.07 [M + H]+.
Ejemplo 5: Alloc-Cvs(Me)-OH
En un balón de fondo redondo de 250 mL, Boc-Cys(Me)-OH (0.56 g, 2.4 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFÁCH2CI2 (1 :1 ). La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30% de Na2CO3 (30 mL). A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo (0.3 mL, 2.9 mmol) en dioxano (30 mL), y el pH se mantuvo a 8-9 mediante Ia adición de 10% Na2CO3 acuoso. Una vez completada Ia reacción, Ia fase acuosa se lavó con TBME (3 x 30 mL) y fue entonces acidificada a pH 2 mediante Ia adición de HCI 4N, y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3 x 30 mL). Obtenido: 0.51 g, 97% rendimiento. 1H NMR (CDCI3) δ 5.93 (m, 1 H), 5.34 (dd, 1 H), 5.26 (dd, 1 H), 4.62 (d, 2H), 3.0 (m, 1 H), 2.15 (s, 3H). 13C NMR (CDCI3) δ 175.0. 156.2, 132.6, 118.8, 67.2, 53.2, 38.3, 18.2.ESMS: m/z caled para C8H13NO4S, 219.06; encontrada, 219.75 [M + H]+.
Ejemplo 6: Alloc-Cvs(Acm)-QH
En un balón de fondo redondo de 250 mL, Boc-Cys(Acm)-OH (1.0 g, 3.4 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFACH2CI2 (1 :1). La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30% de Na2C03 (30 ml_). A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo (0.43 mL, 4.1 mmol) en dioxano (30 ml_), y el pH se mantuvo a 8-9 mediante Ia adición de 10% Na2CO3 acuoso. Una vez completada Ia reacción, Ia fase acuosa se lavó con TBME (3 x 30 mL) y fue entonces acidificada a pH 2 mediante Ia adición de HCI 4N, y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3 x 30 mL). Obtenido: 0.89 g, 95% rendimiento. 1H NMR (CDCI3) δ 5.89 (m, 1 H), 5.18 (dd, 1 H), 5.12 (dd, 1 H), 4.62 (d, 2H), 4.42 (dd, 1 H), 4.25 (dd, 1 H), 3.10 (dd, 1 H), 2.98 (dd, 1H), 2.05 (s, 3H). 13C NMR (CDCI3) δ 173.1 , 173.0. 156.9, 132.6, 118.3, 66.2, 54.1 ,
42.4, 34.4, 23.0. ESMS: m/z caled para Ci0H16N2O5S, 276.08; encontrada, 277.69 [M + H]+.
Ejemplo 7: Boc-D-Ser(TBDMS)-OH
Boc-D-Ser-OH (1.0 g, 5.35 mmol) se disolvió en DMF (10 mL) y se enfrió a 0 °C en un baño de hielo. A continuación se añadieron TBDMSCI (1.04 g, 6.96 mmol) y imidazol (1.10 g, 16.0 mmol), y Ia reacción se mantuvo a 0 °C durante 1 h y después se llevó a 25 °C y se agitó durante 14 h más. A continuación se añadió HCI 1N (25 mL), y el producto se extrajo con Et2O (3 x 25 mL). Las fases orgánicas se combinaron y secaron (MgSO4), y el producto se purificó por cromatografía en columna [(CH2CI2EtOAc (2:1 )] para obtener 0.99 g (64% rendimiento) del producto objetivo como un sólido blanco. 1H NMR (CDCI3) δ = 5.45 (br s, 1 H), 4.11 (m, 1 H), 3.85 (m, 1 H), 1.46 (s, 9H),
0.92 (s, 6H), 0.88 (s, 9H). 13C NMR (CDCi3) δ = 175.2, 156.4, 80.5, 63.6, 55.4,
28.5, 25.9, 18.4, -3.4, -5.6. ESMS: m/z caled para Ci5H31NO5Si, 319.18; encontrada, 319.74 [M + H]+.
Ejemplo 8: Alloc-GIv-OH
En un balón de fondo redondo de 250 mL, H-GIy-OH (1.0 g, 13.3 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFA-CH2CI2 (1 :1). La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30% de Na2CO3 (50 mL). A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo. (1.7 mL, 16.0 mmol) en dioxano (50 mL), y el pH se mantuvo a 8-9 mediante Ia adición de 10% Na2CO3 acuoso. Una vez completada Ia reacción, Ia fase acuosa se lavó con TBME (3 x 30 ml_) y fue entonces acidificada a pH 2 mediante Ia adición de HCI 4N, y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL) para dar 2.0 g (95% rendimiento) de un aceite incoloro. 1H NMR (CDCI3) δ 5.91 (m, 1 H), 5.36 (dd, 1 H), 5.24 (dd, 1 H), 4.63 (d, 2H), 4.07 (s, 2H). 13C NMR (CDCI3) δ 174.28, 156.57, 132.62, 118.27, 67.28, 66.25, 66.37, 43.29. ESMS: m/z caled para C6H9NO4, 159.05; encontrada, 160.30 [M + H]+.
Ejemplo 9: {fHαa-D-Ser(&1)-Glv-Cvs(&2)-Cvs(Me)&3πHqa-D-Ser(&3VGIv- Cvs(&2)-Cvs(Me^&11)
En una jeringa de polipropileno de 3 mL provista de un disco poroso de polietileno, se colocó resina Wang (50 mg, 0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 x 1 min) y CH2CI2 (3 x 1 min), y se añadió Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol) disuelto en CH2CI2-DMF (9:1). A continuación, DIPCDI (57.6 μL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04 mmol) en DMF (0.2 mL) fueron secuencialmente añadidos y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 14 h. La resina Fmoc-Gly-O-Wang fue sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración, CH2CI2 (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidina-DMF (1:4) (1 x 1 min, 2 x 5 min). La funcionalización (0.90 mmol/g) se calculó midiendo Ia absorbancia a 290 nm de Ia solución de desprotección del Fmoc. A continuación, se introdujo Fmoc-D-Ser(Trt)-OH (76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 μL, 0.27 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el ensayo Kaiser indicó Ia finalización de Ia reacción de acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3 x 1 min), CH2CI2 (3 x 1 min), y tratada con piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el grupo pNZ, Ia resina fue tratada con cloroformiato de p-nitrobenzilo (29.1 μL, 0.135 mmol) y DIEA (229 μL, 1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se realizó con lavados de TFA-TIS-CH2CI2 (2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La peptidil resina fue después lavada con CH2CI2 (3 x 1 min) y se introdujo Alloc-Cys(Me)-OH (98.5 mg, 0.45 mmol) por reacción con DIPCDI (69.7 μL, 0.45 mmol) y DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) en DMF-CH2CI2 (1 :9) durante 14 h a 25 °C. A continuación, para eliminar el grupo Alloc, Ia peptidil resina fue tratada con Pd(PPh3)4 (5.2 mg, 4.5 μmol) y PhSiH3 (55.4 mg, 0.45 mmol) disuelto en CH2Cb durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada con CH2CI2 (3 x 1 min). El proceso se repitió tres veces y después se introdujo Boc-Cys(Acm)-OH (65.5 mg, 0.225 mmol) con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), y DIEA (37.5 μl_, 0.22 mmol) como sistema de acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una alícuota de Ia resina se clivó y se analizó por HPLC-ESMS: m/z caled para C23H32N6OnS2, 632.16; encontrada, 632.16 [M + H]+. Después de lavar Ia resina con DMF (3 x 1 min) y CH2CI2 (3 x 1 min), el grupo pNZ se eliminó por tratamiento con SnCI24.6 M, HCI 1.6 mM en DMF (2 x 30 min) y el ácido 3-hidroxiquináldico (12.7 mg, 0.067 mmol) se introdujo por reacción con
PyBOP (34.9 mg, 0.067 mmol), HOAt (9.1 mg, 0.067 mmol), y DIEA (34.4 μl_, 0.20 mmol) en DMF. Una alícuota de Ia resina fue olivada y analizada por HPLC-ESMS: m/z caled para C25H32N6O9S2 624.17; encontrada, 624.58 [M + H]+. La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I2 (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 x 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH2CI2 (10 x 1 min), DMF (10 x 1 min), y CH2CI2 (10 x 1 min). El péptido dimerizado fue entonces escindido de Ia resina mediante tratamiento con TFA-CH2CI2 (1 :4) (2 x 30 min), y después de Ia adición de H2O, Ia mezcla fue evaporada con N2, y liofiiizada. HPLC-ESMS: m/z caled para C44H52N10Oi6S4 1104.24; encontrada, 1105.22 [M + H]+. El producto liofilizado se disolvió en CH2CI2 y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMFCH2CI2 (1 :9), y Ia mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 μL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de Ia ciclación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z caled para C44H48N10Oi4S4 1068.22; encontrada, 1069.86 [M + H]+. MALDI-TOF: m/z caled para C44H48Ni0Oi4S4 1068.22; encontrada, 1069.30 [M + H]+.
Alternativamente, el dímero se puede también obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del dímero de Ia resina, evaporación, liofilización, y ciclación bajo las condiciones descritas anteriormente proporciona el biciclo protegido con el grupo pNZ. Eliminación del grupo protector pNZ se lleva a cabo por tratamiento con SnCI2 (1.5 equiv), HC1 1.6 mM en EtOAc-DMF (9:1), y el ácido 3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante reacción con EDC-HCI (3 equiv), y HOSu (3 equiv), en CH2CI2 a 25 °C durante 2 días. Ejemplo 10: Qxathiocoraline: {[Hqa-D-Ser(&1)-GIy-(Me)Cys(&2)- (Me)Cvs(Me)&3][Hqa-D-Ser(&3)-Glv-(Me)Cvs(&2)-(Me)Cvs(Me)&1]}
En una jeringa de polipropileno de 3 ml_ provista de un disco poroso de polietileno, se colocó resina Wang (50 mg, 0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 x 1 min) y CH2CI2 (3 x 1 min), y se añadió Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol) disuelto en CH2CI2DMF (9:1 ). A continuación, DIPCDI (57.6 μL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04 mmol) en DMF (0.2 ml_) fueron secuencialmente añadidos y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 14 h. La resina Fmoc-Gly-O-Wang fue sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración, CH2Cl2 (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min). A continuación, se introdujo Fmoc-D-Ser(Trt)-OH (76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 μL, 0.27 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el ensayo Kaiser indicó Ia finalización de Ia reacción de acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3 x 1 min), CH2CI2 (3 x 1 min), y tratada con piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el grupo pNZ, Ia resina fue tratada con cloroformiato de p-nitrobenzilo (29.1 μL, 0.135 mmol) y DIEA (229 μL, 1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se realizó con lavados de con TFA-TIS-CH2CI2 (2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La peptidil resina fue después lavada con CH2CI2 (3 x 1 min) y se introdujo Alloc-NMe-Cys(Me)-OH (104.8 mg, 0.45 mmol) mediante reacción con DIPCDI (69.7 μL, 0.45 mmol) y DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) en DMF-CH2CI2 (1 :9) durante 14 h a 25 °C. A continuación, para eliminar el grupo Alloc, Ia peptidil resina fue tratada con Pd(PPt^)4 (5.2 mg, 4.5 μmol) y PhSiH3 (55.4 mg, 0.45 mmol) disuelto en CH2CI2 durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada con CH2CI2 (3 x 1 min). El proceso se repitió tres veces y Boc-NMe-Cys(Acm)-OH (68.8 mg, 0.225 mmol) se introdujo con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), y DIEA (37.5 μL, 0.22 mmol) como sistema de acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una alícuota de Ia resina se clivó y se analizó por HPLC-ESMS: m/z caled para C25H36N6O1 1S2 660.19; encontrada, 662.02 [M + H]+. Después de lavar Ia resina con DMF (3 x 1 min) y CH2CI2 (3 x 1 min), el grupo pNZ se eliminó por tratamiento con SnCI24.6 M, HC1 1.6 mM en DMF (2 x 30 min) y el ácido 3-hidroxiquináldico (12.7 mg, 0.067 mmol) se introdujo por reacción con PyBOP (34.9 mg, 0.067 mmol), HOAt (9.1 mg, 0.067 mmol), y DIEA (34.4 μl_, 0.20 mmol) en DMF. Una alícuota de Ia resina fue olivada y analizada por HPLC-ESMS: m/z caled para C27H36N6O9S2 652.20; encontrada, 653.62 [M + H]+. La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I2 (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 x 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH2CI2 (10 x 1 min), DMF (10 x 1 min), y CH2CI2 (10 x 1 min). El peptido dimerizado fue entonces escindido de Ia resina mediante tratamiento con TFA-CH2CI2 (1 :4) (2 x 30 min), y después de Ia adición de H2O, Ia mezcla fue evaporada con N2, y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z caled para C48H6ONi0Oi6S4 1160.31 ; encontrada, 1161.84 [M + H]+. El producto liofilizado se disolvió en CH2CI2 y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMF-CH2CI2 (1 :9), y Ia mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 μL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de Ia delación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z caled para C48H56N10Oi4S4 1124.29; encontrada, 1125.35 [M + H]+. MALDI-TOF: m/z caled para C48H56Ni0Oi4S4 1124.29; encontrada, 1125.9957 [M + H]+.
Alternativamente, el dímero se puede también obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del dímero de Ia resina, evaporación, liofilización, y ciclación bajo las condiciones descritas anteriormente proporciona el biciclo protegido con el grupo pNZ-. La eliminación del grupo protector pNZ se lleva a cabo por tratamiento con SnCI2 (1.5 equiv), HC1 1.6 mM en EtOAc-DMF (9:1), y el ácido 3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante reacción con EDC-HCI (3 equiv), y HOSu (3 equiv), en CH2CI2 a 25 °C durante 2 días.
Ejemplo 11 : frQac-D-Ser(&1)-Glv-Cvs(&2)-Cys(Me)&31[Qac-D-Ser(&3)-Glv- Cvs(&2)-Cvs(Me)&1p
En una jeringa de polipropileno de 3 mL provista de un disco poroso de polietileno, se colocó resina Wang (50 mg, 0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 x 1 min) y CH2CI2 (3 x 1 min), y se añadió Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol) disuelto en CH2CI2-DMF (9:1). A continuación, DIPCDI (57.6 μL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04 mmol) en DMF (0.2 mL) fueron secuencialmente añadidos y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 14 h. La resina Fmoc-G Iy-O-Wa ng fue sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración, CH2CI2 (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min). A continuación, se introdujo Fmoc-D-Ser(Trt)-OH (76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 μL, 0.27 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el ensayo Kaiser indicó Ia finalización de Ia reacción de acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3 x 1 min), CH2CI2 (3 x 1 min), y tratada con piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el grupo pNZ, Ia resina fue tratada con cloroformiato de p-nitrobenzilo (29.1 μL, 0.135 mmol) y DIEA (229 μL, 1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se realizó con lavados de con TFA-TIS-CH2CI2 (2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La peptidil resina fue después lavada con CH2CI2 (3 x 1 min) y se introdujo Alloc-Cys(Me)-OH (98.5 mg, 0.45 mmol) por reacción con DIPCDI (69.7 μL, 0.45 mmol) y DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) en DMFCH2CI2 (1 :9) durante 14 h a 25 °C. A continuación, para eliminar el grupo Alloc, Ia peptidil resina fue tratada con Pd(PPh3)4 (5.2 mg, 4.5 μmol) y PhSiH3 (55.4 mg, 0.45 mmol) disuelto en CH2CI2 durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada con CH2Cb (3 x 1 min). El proceso se repitió tres veces y después se introdujo Boc-Cys(Acm)-OH (65.5 mg, 0.225 mmol) con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), y DIEA (37.5 μL, 0.22 mmol) como sistema de acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una alícuota de Ia resina se clivó y se analizó por HPLC-ESMS: m/z caled para C23H32N6OnS2, 632.16; encontrada, 632.16 [M + H]+. después de lavar Ia resina con DMF (3 x 1 min) y CH2CI2 (3 x 1 min), el grupo pNZ se eliminó por tratamiento con SnCI24.6 M, HC1 1.6 mM en DMF (2 x 30 min) y el ácido quináldico (11.6 mg, 0.067 mmol) se introdujo por reacción con PyBOP (34.9 mg, 0.067 mmol), HOAt (9.1 mg, 0.067 mmol), y DIEA (34.4 μL, 0.20 mmol) en DMF. Una alícuota de Ia resina fue clivada y analizada por HPLC-ESMS: m/z caled para C25H32N6O8S2, 608.17; encontrada, 608.94 [M + H]+. La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I2 (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 x 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH2CI2 (10 x 1 min), DMF (10 x 1 min), y CH2CI2 (10 x 1 min). El péptido dimerizado fue entonces escindido de Ia resina mediante tratamiento con TFA-CH2CI2 (1:4) (2 x 30 min), y después de Ia adición de H2O, Ia mezcla fue evaporada con N2, y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z caled para C44H52N10Oi4S4, 1072.25; encontrada, 1073.52 [M + H]+. El producto liofilizado se disolvió en CH2CI2 y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMFCH2CI2 (1 :9), y Ia mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 μL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de Ia ciclación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z caled para C44H48N10O12S4, 1036.23; encontrada, 1037.64 [M + H]+. MALDI-TOF: m/z caled para C44H48Ni0Oi2S4, 1036.23; encontrada, 1038.06 [M + H]+.
Alternativamente, el dímero se puede también obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del dímero de Ia resina, evaporación, liofilización, y ciclación bajo las condiciones descritas anteriormente proporciona el biciclo protegido con el grupo pNZ. La eliminación del grupo protector pNZ se lleva a cabo por tratamiento con SnCI2 (1.5 equiv), HC1 1.6 mM en EtOAc-DMF (9:1 ), y el ácido 3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante reacción con EDC HCI (3 equiv), y HOSu (3 equiv), en CH2CI2 a 25 °C durante 2 días.
Ejemplo 12: (rQac-D-Ser(&1)-Glv-(Me)Cvs(&2)-(Me)Cvs(Me)&3irQac-D- Ser(&3)-Glv-(Me)Cvs(&2HMe)Cvs(Me)&11}
En una jeringa de polipropileno de 3 mL provista de un disco poroso de polietileno, se colocó resina Wang (50 mg, 0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 x 1 min) y CH2CI2 (3 x 1 min), y se añadió Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol) disuelto en CH2CI2DMF (9:1 ). A continuación, DIPCDI (57.6 μL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04 mmol) en DMF (0.2 mL) fueron secuencialmente añadidos y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 14 h. La resina Fmoc-Gly-O-Wang fue sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración, CH2CI2 (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min). A continuación, se introdujo Fmoc-D-Ser(Trt)-OH (76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 μL, 0.27 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el ensayo Kaiser indicó Ia finalización de Ia reacción de acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3 x 1 min), CH2CI2 (3 x 1 min), y tratada con piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el grupo pNZ, Ia resina fue tratada con cloroformiato de p-nitrobenzilo (29.1 μL, 0.135 mmol) y DIEA (229 μL, 1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se realizó con lavados de con TFA-TIS-CH2CI2 (2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La peptidil resina fue después lavada con CH2CI2 (3 x 1 min) y se introdujo Alloc-NMe-Cys(Me)-OH (104.8 mg, 0.45 mmol) mediante reacción con DIPCDI (69.7 μL, 0.45 mmol) y DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) en DMF-CH2CI2 (1 :9) durante 14 h a 25 °C. A continuación, para eliminar el grupo Alloc, Ia peptidil resina fue tratada con Pd(PPh3)4 (5.2 mg, 4.5 μmol) y PhSiH3 (55.4 μL, 0.45 mmol) disuelto en CH2CI2 durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada con CH2CI2 (3 x 1 min). Boc-NMe-Cys(Acm)- OH (68.8 mg, 0.225 mmol) se introdujo con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), y DIEA (37.5 μL, 0.22 mmol) como sistema de acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una alícuota de Ia resina se clivó y se analizó por HPLC-ESMS: m/z caled para C25H36N6OnS2, 660.19; encontrada, 662.02 [M + H]+. Después de lavar Ia resina con DMF (3 x 1 min) y CH2CI2 (3 x 1 min), el grupo pNZ se eliminó por tratamiento con SnCI24.6 M, HC1 1.6 mM en DMF (2 x 30 min) y el ácido quináldico (11.6 mg, 0.067 mmol) se introdujo por reacción con PyBOP (34.9 mg, 0.067 mmol), HOAt (9.1 mg, 0.067 mmol), y DIEA (34.4 μL, 0.20 mmol) en DMF. Una alícuota de Ia resina fue clivada y analizada por HPLC-ESMS: m/z caled para C27H36N6O8S2, 636.20; found, 637.98 [M + H]+. La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I2 (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 x 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH2CI2 (10 x 1 min), DMF (10 x 1 min), y CH2CI2 (10 x 1 min). El peptido dimerizado fue entonces clivado de Ia resina mediante tratamiento con TFACH2CI2 (1 :4) (2 x 30 min), y después de Ia adición de H2O, Ia mezcla fue evaporada con N2, y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z caled para C48H60Ni0O14S4, 1128.32; found, 1129.86 [M + H]+. El producto liofilizado se disolvió en CH2CI2 y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMFCH2CI2 (1 :9), y Ia mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 μL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de Ia delación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z caled para C48H56Ni0O12S4, 1092.30; found, 1093.16 [M + H]+.
Alternativamente, el dímero se puede también obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del dímero de Ia resina, evaporación, liofilización, y ciclación bajo las condiciones descritas anteriormente proporciona el biciclo protegido con el grupo pNZ-. La eliminación del grupo protector pNZ se lleva a cabo por tratamiento con SnCI2 (1.5 equiv), HC1 1.6 mM en EtOAc-DMF (9:1), y el ácido 3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante reacción con EDC-HCI (3 equiv), y HOSu (3 equiv), en CH2CI2 a 25 °C durante 2 días.

Claims

REINVINDICACIONES
1. Procedimiento para Ia obtención de un dímero ¡ntermolecular por puente disulfuro en fase sólida a partir de precursores lineales.
2. Procedimiento según Ia reivindicación 1 donde el puente disulfuro es escindido del soporte sólido y biciclado en solución para obtener compuestos con Ia fórmula:
AA4 AA3 AA2 AA1 N M
Figure imgf000025_0001
AA11 AA2' AA31 AA41
donde AA1 , AA2, AA3, AA4, AAV, AA2', AA3', y AA4' son independientemente α-aminoácidos de configuración L o D, si aplica, proteinogénicos o no proteinogénicos, y donde por Io menos dos son cisteinas o Λ/-alquil cisternas, formando un puente disulfuro; donde R1, R2, y R3 son cada uno independientemente H o un grupo orgánico seleccionado de un grupo que consiste de un grupo alquilo, un grupo arilo, un grupo aralquilo, y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo, un grupo mercapto, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo halógeno; donde R4 es independientemente H o un grupo alquilo; donde Arilo (Aryl) es independientemente un grupo aromático/arilo, un grupo alquilo, o grupo heterocíclico: el término grupo aromático o grupo arilo significando un grupo aromático mono- o policíclico hidrocarbonado, un mono- , bi-, or policiclo adecuado; y el término grupo heterocíclico significando un anillo cerrado hidrocarbonado en el cual uno o mas átomos del anillo es un elemento que no es carbono, un mono-, b¡- o policiclo adecuado.
3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde el soporte sólido es una resina ácido-lábil como Ia resina p-alcoxibenzilo Wang o Ia resina cloruro de 2-cIorotritilo.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 ó 3, donde, para formar el precursor lineal, se usan los siguientes grupos protectores: Fmoc (fluorenilmethiloxicarbonil), Alloc (alliloxicarbonil), Tritilo (trifenilmetilo), pNZ (4-nitrobenziIoxicarbonilo), Boc (f-butiloxicarbonilo), TBDMS (f- butildimetilsililo) o Trac (2,2,2-tricloroetoxicarbonilo).
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3 ó 4, donde el grupo arilo es introducido en fase sólida.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3 ó 4, donde el grupo arilo es introducido en solución.
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