ES2296544B1 - Procedimiento para la obtencion de peptidos biciclicos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención de péptidos bicíclicos. Procedimiento de obtención de los productos de la fórmula adjunta, en la cual AA1, AA2, AA3, AA4, AA1', AA2', AA3'y AA4' son independientemente alfa-aminoácidos de configuración L o D, si aplica, proteinogénicos o no proteinogénicos, y donde por lo menos dos son cisteínas o N-alquil cisteínas, que comprende la formación del dímero intermolecular por puente disulfuro en fase sólida a partir de precursores lineales, donde el puente disulfuro es escindido del soporte sólido y biciclado en solución. Los productos obtenidos tienen actividad biológica y utilidad en terapia, p.ej. como antitumorales.
Description
Procedimiento para la obtención de péptidos
bicíclicos.
La presente invención trata de síntesis orgánica
en fase sólida, particularmente de síntesis de péptidos
bicíclicos.
Los péptidos bicíclicos, tanto los aislados de
fuentes naturales como los obtenidos sintéticamente, son compuestos
que presentan interesantes actividades biológicas. La naturaleza
del puente que forma el biciclo es diversa y puede incluir un
puente disulfuro, un tioéter o una lactama.
Un ejemplo de péptidos bicíclicos es la familia
de péptidos antibióticos antitumorales aislados de organismos
marinos, que incluye la tiocoralina (cf. Romero, F.; Espliego, F.;
Perez Baz, J.; García de Quesada, T.; Grávalos, D.; De la Calle,
F.; Fernández-Puentes, J. L. J. Antibiotics
1997, 50, 734-737), el
BE-22179, el triostin A y el equinomicin. Este grupo
de péptidos presenta una estructura compleja que contiene: a) un
eje C_{2}; b) una estructura bicíclica formada por dos cadenas
peptídicas antiparalelas; c) un enlace éster o tioéster en la parte
terminal de la cadena peptídica; d) un puente disulfuro o un puente
análogo en la mitad de las cadenas peptídicas; e) un cromóforo
intercalador en la parte N-terminal; f) la presencia de
varios N-metil aminoácidos; y g) aminoácidos no naturales de
configuración D. Las estructuras de estos péptidos son:
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Por tanto, la estructura general de esta familia
de compuestos es:
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Un ejemplo de grupo heterocíclico es el ácido
3-hidroxiquinolino-2-carboxílico
(Hqa) y sus derivados (fórmula siguiente), los cuales forman la
parte heterocíclica de la tiocoralina y de otros depsipéptidos
naturales con interesantes actividades biológicas, como el
SW-163C, SW-163E, y el sandramicin.
Además, este cromóforo heterocíclico juega un papel muy importante
en las propiedades enlazantes del DNA con estos compuestos. La
síntesis de este heterociclo ha estado optimizada (cf. Riego. E.,
Bayó, N., Cuevas, C., Albericio, F., M. Alvarez, Tetrahedron 61,
1407-1411, 2005).
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donde R_{1} es H o un grupo
orgánico seleccionado de un grupo formado por un grupo alquilo, un
grupo arilo y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo;
donde R_{2} es H o un grupo funcional carbonilo enlazado a una
cadena alquílica formando un éster, con un grupo tiol, hidroxilo o
amino al final de la
cadena.
Aunque los procedimientos estándar para síntesis
en fase sólida se pueden aplicar con éxito para acceder a un gran
numero de péptidos; la síntesis de péptidos bicíclicos es todavía
muy difícil y muy dependiente de la secuencia. Esto es debido a la
presencia de reacciones secundarias asociadas con la elongación de
la cadena peptídico; en particular, a circunstancias como:
- formación de dicetopiperazina de los dos
residuos consecutivos posteriores al grupo functional éster o
tioéster;
- dificultad en completar la formación del
enlace éster; y
- alta labilidad de los enlaces éster o tioéster
a las condiciones básicas.
Estas limitaciones son especialmente dramáticas
por ejemplo en el caso de la tiocoralina y oxatiocoralina debido a
la rápida formación de dicetopiperazinas de las dos consecutivas
NMe-cisteínas. En este contexto se han establecido
nuevas vías para minimizar la formación de dicetopiperazinas.
Los péptidos bicíclicos como los representados
arriba presentan una interesante actividad biológica, por lo que es
interesante proporcionar nuevas rutas sintéticas para acceder a
ellos.
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La presente invención proporciona un
procedimiento para la obtención de un dímero intermolecular por
puente disulfuro en fase sólida a partir de precursores lineales.
En una realización particular el puente disulfuro es escindido del
soporte sólido y biciclado en solución para obtener compuestos con
la estructura de la fórmula adjunta, donde AA1, AA2, AA3, AA4, AA1',
AA2', AA3', y AA4' son independientemente
\alpha-aminoácidos de configuración L o D, si
aplica, proteinogénicos o no proteinogénicos, y donde por lo menos
dos son cisteínas o N-alquil cisternas, formando un puente
disulfuro; donde R_{1}, R_{2}, y R_{3} son cada uno
independientemente H o un grupo orgánico seleccionado de un grupo
que consiste de un grupo alquilo, un grupo arilo, un grupo
aralquilo, y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo, un
grupo mercapto, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo
halógeno; donde R_{4} es independientemente H o un grupo alquilo;
donde arilo (Aryl) es independientemente un grupo aromático/arilo,
un grupo alquilo o un grupo heterocíclico: el término grupo
aromático o grupo arilo significando un grupo aromático mono- o
policíclico hidrocarbonado, un mono- , bi- o policiclo adecuado; y
el término grupo heterocíclico significando un anillo cerrado
hidrocarbonado en el cual uno o mas átomos del anillo es un elemento
que no es carbono, un mono-, bi- o policiclo adecuado.
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En una realización preferida, el soporte sólido
es una resina ácido-lábil como la resina
p-alcoxibenzilo Wang o la resina cloruro de
2-clorotritilo. Aún más preferida es la realización
en la que para formar el precursor lineal se usan los siguientes
grupos protectores: Fmoc (fluorenilmethiloxicarbonil), Alloc (al
iloxicarbonil), Tritilo (trifenilmetilo), pNZ
(4-nitrobenziloxicarbonilo), Boc
(t-butiloxicarbonilo), TBDMS (t-butildimetilsililo) o
Troc (2,2,2-tricloroetoxicarbonilo). En todos los
casos el grupo arilo puede ser introducido en fase sólida o en
solución.
En particular, la invención supone la
preparación de un dímero intermolecular por puente disulfuro de
tetrapéptidos a partir de un tetrapéptido lineal, que permite
restringir la flexibilidad de la cadena minimizando la formación de
dicetopiperazinas.
La invención está especialmente dirigida a la
preparación de péptidos bicíclicos. Con este fin la invención
implica la preparación de un tetrapéptido lineal por síntesis en
fase sólida, que puede contener un grupo éster o tioéster, y la
subsiguiente formación de un dímero por puente disulfuro
intermolecular en fase sólida. En este aspecto de la invención, las
partes heterocíclicas pueden estar ya formando parte del dímero o
reemplazadas temporalmente por un grupo protector adecuado. El
proceso involucra la escisión del dímero del soporte sólido y la
simultánea doble ciclación para formar el biciclo. El heterociclo
también se puede introducir en este punto, en el caso que no
estuviera formando parte del dímero.
Los compuestos de esta invención tienen
actividad biológica, como por ejemplo actividad antitumoral.
El procedimiento de esta invención se puede
llevar a cabo a partir de reactivos de partida de una manera rápida
y enantio- y estereocontrolada, aprovechando las ventajas de la
metodología sintética de fase sólida, donde una molécula en
construcción se une a un soporte insoluble durante todas las
operaciones sintéticas. Por lo tanto, los excesos de reactivos y los
productos secundarios solubles pueden ser eliminados lavando la
resina-molécula con disolventes adecuados. Por lo
tanto, se pueden utilizar grandes excesos de reactivos solubles
para completar la reacción en un periodo corto de tiempo, evitando
racemización (si aplica) y otras reacciones secundarias. El método
también permite su automatización.
Los aspectos preferibles del procedimiento
sintético de la presente invención están representados mejor en el
esquema adjunto, el cual esta dirigido a la formación de los
compuestos objetivo.
Como se muestra en el esquema, el procedimiento
preferible para la formación sintética de péptidos bicíclicos está
basado en un enfoque de fase sólida, véase por ejemplo
Lloyd-Williams, P., et al. Chemical Approaches to
the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC Press, Boca Raton
(FL), 1997. El procedimiento comprende las siguientes
características generales:
(a) anclaje del primer aminoácido protegido en
un soporte sólido (p. ej., poliestireno, polietileno injertado
sobre poliestireno y similares) conteniendo un espaciador
bifuncional o enlazador ácido-lábil (p. ej.,
clorotritilo, polialcoxibenzilo y similares); los preferidos son la
resina Wang y la resina Barlos [cloruro de clorotritilo (CTC)], la
cual reduce al mínimo la formación de dicetopiperazinas (DKP'S) y
permite la escisión de péptidos protegidos en condiciones ácidas
muy suaves;
(b) esquema de protección basado en una
combinación de varios grupos protectores: fluorenilmetoxicarbonilo
(Fmoc)/aliloxicarbonilo (Alloc)/p-nitrobenziloxicarbonilo
(pNZ), tert-butiloxicarbonilo (Boc),
t-butildimetilsililo (TBDMS) y
2,2,2-tricloroetoxicarbonilo (Troc).
(c) el uso del grupo acetamidometilo (Acm), que
es un grupo protector ortogonal a los grupos protectores de los
grupos aminos descritos anteriormente, para enmascarar el grupo
tiol de la Cys durante la elongación de péptido y facilitar la
formación directa del puente disulfuro;
(d) la formación del puente disulfuro en fase
sólida, lo cual facilita la eliminación del exceso de I_{2}
únicamente por filtración y lavados, formando el dímero
abierto;
(e) el empleo de un arsenal de agentes
acoplantes desde los mas reactivos, aquellos basados en HOAT
(1-hidroxi-7-azabenzotriazol)
a los más suaves basados en HOSU (N-hidroxisuccinimida) para
mejorar los rendimientos de acoplamiento, evitar reacciones
secundarias así como sobreacilaciones.
Además, el procedimiento del esquema comprende
los pasos secuenciales de:
(a) la incorporación del primer aminoácido (AA2)
sobre la resina Wang o la resina Barlos formando un enlace éster,
teniendo el grupo funcional amino temporalmente protegido con el
grupo Fmoc;
(b) la introducción del aminoácido siguiente
(AA1) utilizando una estrategia Fmoc y HATU (hexafluorofosfato de
N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-1-ilmetilen]-N-metilmetanaminio)/HOAt
(1-hidroxi-7-azabenzotriazol)/DIEA
(N,N-diisopropiletilamina) para asegurar un acoplamiento
completo, el teniendo la funcionalidad amino temporalmente
protegido con el grupo Fmoc; y el grupo funcional de la cadena
lateral temporalmente protegido con el grupo TBDMS
(tert-butildimetilsililo) o Trt (tritilo) cuando se utilizan
Cys o Ser, o con un grupo Alloc cuando se utiliza Dap
(diaminopropiónico);
(c) el cambio del grupo protector del grupo
funcional \alpha-amino de Fmoc a pNZ.
(d) elongación de la cadena peptídica a través
de la cadena lateral de la Serina, Cisteína o Diaminopropiónico
(Dap) utilizando ácido trifluoroacético en presencia de TIS
(triisopropilsilano)
[TFA-TIS-CH_{2}Cl_{2} (2:5:93)]
para eliminar el grupo tritilo (Serina o Cisteína) y
Pd(PPh_{3})_{4}/PhSiH_{3} para eliminar el grupo
Alloc (Dap). Se utilizó HATU/HOAt/DIEA en DMF para realizar el
enlace amida y DIPCDI (N,N'-diisopropilcarbodiimida)/DMAP
[4-(N,N-dimetilamino)piridina] en el caso de realizar
el enlace éster o tioéster (AA4). Alternativamente, también se
puede utilizar MSNT
[1-(Mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1H-1,2,4-triazol]/NMI
(N-metilmidazol)/DIEA para formar el enlace éster.
(e) introducción del aminoácido siguiente (AA3)
usando HATU/HOAt/DIEA como sistema de acoplamiento para asegurar un
acoplamiento completo.
alternativamente algunos N-metil
aminoácidos se pueden introducir mediante el método de
N-metilación de aminoácidos en fase sólida por el método
Fukuyama (cf. Miller, S. C.; Scanlan, T. S., J. Am. Chem.
Soc., 1998, 120, 2690-2691; Yang,
L.; Chiu, K., Tetrahedron Left., 1997, 38,
7307-7310) utilizando o-nitrosulfonilo como
protección temporal del grupo funcional
\alpha-amino;
(f) eliminación del grupo pNZ e introducción del
ácido 3-hidroxiquináldico usando PyBOP
(hexafluorofosfato de
(benzotriazol-1-iloxi)-tris-(pirrolidino)fosfonio)/HOAt/DIEA
como sistema de acoplamiento;
(g) formación del dímero por puente disulfuro
intermolecular mediante tratamiento con I_{2} y eliminación del
reactivo por filtración y lavados;
(h) tratamiento con ácido trifluoroacético
[(TFA-CH_{2}Cl_{2} (1:4) con resina Wang y
TFA-CH_{2}Cl_{2} (1:99) con la resina Barlos]
para obtener el péptido dimerizado;
(i) la formación del biciclo usando PyAOP
[hexafluorofosfato de
(7-azabenzotriazol-1-iloxi)-tris(pirrolidino)
fosfonio]/DIEA ó PyBOP/HOAt/DIEA para asegurar una ciclación
completa y evitar la guanidilación que puede ocurrir cuando se
utilizan HATU u otros reactivos basados en aminio/uronio;
(j) alternativamente, la introducción del
heterociclo se puede realizar también después de la formación del
biciclo, mediante tratamiento con DIPCDI y HOSU en DCM.
Alternativamente, la síntesis del péptido se
puede iniciar en otro punto de la cadena que no sea AA2.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no se
pretende que sean limitativos de la presente invención.
Derivados de aminoácidos protegidos, PyBOP,
PyOAP, fueron obtenidos de Applied Biosystems (Framingham, MA),
Bachem (Bubendorf, Switzerland), Albatross (Montreal, Canada), y
NovaBiochem (Läufelfingen, Switzerland). La resina Barlos se obtuvo
de Rohm and Haas (Philadelphia, USA) o de Iris Biotech GmbH
(Marktredwitz, Germany). DIEA, DIPCDI, piperidina, TFA, amoníaco,
iodometano, cloroformiato de alilo, cloroformiato de
p-nitrobenzilo, y el ácido quináldico fueron obtenidos de
Aldrich (Milwaukee, WI), y EDC \cdot HCl y HOAt eran de
Luxembourg Industries (Tel Aviv, Israel). DMF, CH_{2}Cl_{2},
Acetonitrilo (grado HPLC), metanol (grado HPLC), Dioxano, Et_{2}O,
TBME (t-butil metil éter) y EtOAc (acetato de etilo) fueron
obtenidos de SDS (Peypin, France). El ácido
(R)(-)-thiazolidino-4-carboxílico,
trifluorometanosulfónico, N-hidroximetilacetamida y
N-hidroxisuccinimida fueron obtenidos de Fluka (Buchs,
Switzerland). Todos los reactivos comerciales y disolventes se
usaron tal como se recibieron con la excepción de la DMF y el
CH_{2}Cl_{2}, los cuales fueron desgasificados con nitrógeno
para eliminar contaminantes volátiles (DMF) y guardados sobre tamiz
molecular de 4\ring{A} (Merck, Darmstadt, Germany), y THF que fue
destilado de sodio/benzofenona.
Las reacciones en solución se realizaron en
balones con fondo redondo. Los extractos de disolventes orgánicos
fueron secados sobre MgSO_{4} anhidro y seguidamente se evaporó
el disolvente bajo presión reducida a temperaturas por debajo de
40ºC.
Las síntesis en fase sólida fueron realizadas en
jeringas de polipropileno (2,5 mL) provistas de un disco poroso de
polipropileno. Los disolventes y los reactivos solubles fueron
eliminados por succión. La eliminación del grupo Fmoc se realizó
con piperidina-DMF (1:4, v/v) (1 \times 1 min, 2
\times 5 min). Los lavados entre desprotecciones, acoplamientos y
desprotecciones finales se realizaron con DMF (5 \times 1 min) y
CH_{2}Cl_{2} (5 \times 1 min) usando 5 mL
disolvente.g-^{1} resina para cada lavado. Las
transformaciones de la síntesis de los péptidos y los lavados se
realizaron a 25ºC.
Las columnas de HPLC (columna de fase reversa
Symmetry® C18, 5.0 \mum \times 4.6 mm \times 150 mm) fueron
obtenidas de Waters (Ireland). El HPLC analítico se realizó en un
instrumento Waters que comprende un módulo de separación (Waters
2695), inyector automático, detector de fotodiodo array (Waters
996), y controlador del sistema (Millenium^{32} login). La
detección de UV se realizó a 215 ó 220 nm y se realizaron
gradientes lineales de CH_{3}CN (+0.036% TFA) en H_{2}O
(+0.045% TFA) a 1.0 mL\cdotmin^{-1} de flujo en 15 min.
Los análisis de MALDI-TOF y
ES(+)-MS de muestras de péptido fueron realizadas
en un Applied Biosystems VoyagerDE RP, utilizando matriz ACH y en
un espectrómetro Waters Micromass ZQ spectrometer y en un Agilent
Ion Trap 1100 Serie LC/MSDTrap. Espectroscopia ^{1}H NMR (400
MHz) y ^{13}C NMR (100 MHz) se realizó en un Varian Mercury 400.
Los desplazamientos químicos (\delta) son expresados en partes
por millón relativos al cloruro de tetrametilsililo. Las constantes
de acoplamiento son expresadas en Hertz.
En un balón de fondo redondo, NaH al 60% en
aceite mineral (2.01 g, 51 mmol) fue disuelto en THF anhidro (20
mL). A continuación se añadió
Boc-Cys(Me)-OH (4.0 g, 17
mmol) disuelto en THF (20 mL) y la reacción se enfrió a 0ºC en un
baño de hielo. Se añadió iodometano (2.1 mL, 34 mmol) gota a gota y
la reacción se dejó en agitación durante 14 h a 4ºC. Se añadió MeOH
lentamente para eliminar el exceso de hidruro y a continuación se
añadió H_{2}O y la mezcla se llevó a pH 8 mediante la adición de
NaOH y el THF residual fue eliminado por evaporación. La fase
acuosa fue extraída con TBME (3 \times 20 mL) y acidificada a pH
2 con HCl 4N.
Boc-NMe-Cys(Me)-OH
fue extraída con EtOAc (3 \times 20 mL) y secada (MgSO_{4}). El
producto objetivo (3.6 g, 85% rendimiento) fue obtenido como un
aceite incoloro.
Alternativamente,
Boc-NMe-Cys(Me)-OH
se puede obtener a partir de
HCl\cdotH-NMe-Cys-OH.
HCl\cdotH-NMe-Cys-OH
(4.1 g, 23.8 mmol), obtenido del ácido
(R)(-)-tiazolidin-4-carboxílico
de acuerdo con Liu, J-F.; Tang,
X-X.; Jiang, B. (cf. Synthesis 2002,
1499-1501), fue disuelto en
H_{2}O-THF (1:1) (170 mL) y la mezcla fue
enfriada a 4ºC. Se añadieron iodometano (2.07 mL, 33.3 mmol)
disuelto en THF (68 mL) y NaHCO_{3} (5.3 g, 71.4 mmol) en H_{2}O
(68 mL) secuencialmente sobre la solución de aminoácido. Después de
que la adición fuera completa, la mezcla se agitó a 25ºC durante 4
h, punto en el cual el test de Ellman fue negativo. La solución fue
acidificada hasta pH 5 y el disolvente se eliminó bajo presión
reducida. El residuo se disolvió en 2% Na_{2}CO_{3} acuoso
dioxano (1:1) (80 mL) y la solución se enfrió a 4ºC. Sobre la
solución de aminoácido se añadió (Boc)_{2}O (6.2 g, 35.7
mmol) disuelto en dioxano (8 mL) y el pH se ajustó a
8.5-9.5 añadiendo 10% Na_{2}CO_{3} acuoso. La
mezcla se agitó a 4ºC durante 2 h y a 25ºC durante 2 días,
manteniendo el pH a 8.5-9.5. El dioxano se eliminó
y la solución acuosa se lavó con TBME (3 \times 50 mL). La fase
acuosa se acidificó con HCl 4N hasta pH 2 y el producto se extrajo
con EtOAc (3 \times 50 mL) y fue purificado por HPLC preparativo
(gradiente lineal de 15 a 50% ACN en 30 min, 40 mL/min). Obtenido:
1.15 g, 19.4% rendimiento. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 7.18
(br s, 1H), 4.74 (dd, 1H), 3.05 (d, 1H), 2.88 (d, 1H), 2.84 (s,
3H), 2.13 (s, 3H), 1.46 (s, 9H). ^{13}C NMR \delta 175.2,
156.5, 80.7, 58.0, 33.2, 32.1, 28.6, 15.6. ESMS: m/z calcd
para C_{10}H_{19}NO_{4}S, 249.10; encontrada, 250.3 [M +
H]^{+}.
En un balón de fondo redondo de 500 mL,
Boc-NMe-Cys(Me)-OH
(3.0 g, 12.0 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con
TFACH_{2}Cl_{2} (1:1). La mezcla se evaporó a sequedad y se
realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el
exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30%
de Na_{2}CO_{3} (50 mL). A continuación se añadió gota a gota
una solución de cloroformiato de alilo (1.5 mL, 14.4 mmol) en
dioxano (50 mL), y el pH se mantuvo a 8-9 mediante
la adición de 10% Na_{2}CO_{3} acuoso. Se siguió el curso de la
reacción mediante TLC [EtOAcH_{2}OAcOH2-propanol
(2:1:1:1)]. Una vez completada la reacción, la fase acuosa se lavó
con TBME (3 \times 50 mL) y después se acidificó a pH 2 mediante
la adición de HCl 4N y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3
\times 50 mL) (2.5 g, 89.6% rendimiento). ^{1}H NMR
(CDCl_{3}) \delta 5.95 (m, 1 H), 5.34 (dd, 1H), 5.22 (dd, 1H),
4.81 (m, 1H), 4.62 (d, 2H), 3.10 (dd, 1H), 2.95 (s, 3H), 2.90 (dd,
1H), 2.13 (s, 3H). ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 174.8, 157.2,
136.8, 117.9, 67.1, 66.9, 58.8, 33.1, 32.0, 17.9. ESMS: m/z
calcd para C_{9}H_{15}NO_{4}S, 233.07; encontrada, 234.3 [M +
H]^{+}.
HCl\cdotH-NMe-Cys-OH
(4.1 g, 23.8 mmol), obtenido del ácido
(R)(-)-tiazolidin-4-carboxílico
de acuerdo con Liu, J-F.; Tang,
X-X.; Jiang, B. (Synthesis 2002,
14991501), se disolvió en H_{2}O (12.3 mL) y la solución se purgó
con Ar y entonces N-hidroximetilacetamida (3.54 g, 39.7
mmol) se añadió a la solución y la mezcla se enfrió a 4ºC bajo Ar.
Se añadió una solución de TFA en ácido trifluorometanosulfónico
(95:5) (41 mL) a la solución de aminoácido. La mezcla se agitó a
25ºC durante 16 h hasta que el test de Ellman dió negativo. El
producto se disolvió en 2% Na_{2}CO_{3} acuoso dioxano (1:1) (80
mL) y la solución se enfrió a 4ºC. Sobre la solución de aminoácido
se añadió (Boc)_{2}O (6.2 g, 35.7 mmol) disuelto en
dioxano (8 mL), y el pH se ajustó a 8.5-9.5
añadiendo 10% Na_{2}CO_{3} acuoso. La mezcla se agitó a 4ºC
durante 2 h y a 25ºC durante 3 días, manteniendo el pH a
8.5-9.5. El dioxano se eliminó y la solución acuosa
se lavó con TBME (3 \times 50 mL). La fase acuosa se acidificó
con HCl 4N hasta pH 2 y el producto se extrajo con EtOAc (3 \times
50 mL). El disolvente se eliminó bajo presión reducida para dar
1.23 g, 16.9% rendimiento global). ^{1}H NMR (CDCl_{3}):
\delta 6.72 (br s, 1H), 4.92 (m, 1 H), 4.56 (m, 1H), 4.21 (m, 1
H), 3.21 (m, 1 H), 2.89 & 2.82 (m, 4H), 2.05 (m, 3H), 1.50 (s,
9H). ^{13}C NMR (CDCl_{3}): \delta 172.6, 159.1, 153.5, 80.9,
59.3, 40.6, 32.3, 31.4, 28.3, 22.9. ESMS: m/z calcd para
C_{12}H_{22}N_{2}O_{5}S, 306.12; encontrada, 306.67 [M +
H]^{+}.
En un balón de fondo redondo de 250 mL,
Boc-NMe-Cys(Acm)-OH
(0.74 g, 2.4 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con
TFACH_{2}Cl_{2} (1:1). La mezcla se evaporó a sequedad y se
realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el
exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30%
de Na_{2}CO_{3} (20 mL). A continuación se añadió gota a gota
una solución de cloroformiato de alilo (0.3 mL, 2.9 mmol) en
dioxano (20 mL) y el pH se mantuvo a 8-9 mediante
la adición de 10% Na_{2}CO_{3} acuoso. Una vez completada la
reacción, la fase acuosa se lavó con TBME (3 \times 25 mL) y fue
entonces acidificada a pH 2 mediante la adición de HCl 4N, y el
producto objetivo se extrajo con EtOAc (3 \times 25 mL).
Obtenido: 0.61 g, 87% rendimiento. ^{1}H NMR (CDCl_{3})
\delta 10.25 (br s, 1H), 7.34 (br s, 1H), 5.92 (m, 1H), 5.34 (dm,
1H), 5.25 (dm, 1H), 4.94 & 4.84 (m, 1 H), 4.65 (m, 2H), 4.58
(dd, 1H), 4.24 (dd, 1H), 3.25 (dd, 1H, 2.92 (m, 4H), 2.11 (s, 3H).
^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 174.0, 159.8, 158.2, 132.1,
118.2, 67.5, 59.1, 42.1, 31.7, 30.9, 22.4. ES MS: m/z calcd
para C_{11}H_{18}N_{2}O_{5}S, 290.09; encontrada, 291.07 [M
+ H]^{+}.
En un balón de fondo redondo de 250 mL,
Boc-Cys(Me)-OH (0.56 g, 2.4
mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFACH_{2}Cl_{2} (1:1).
La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con
dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se
disolvió en una solución acuosa al 30% de Na_{2}CO_{3} (30 mL).
A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato
de alilo (0.3 mL, 2.9 mmol) en dioxano (30 mL) y el pH se mantuvo a
8-9 mediante la adición de 10% Na_{2}CO_{3}
acuoso. Una vez completada la reacción, la fase acuosa se lavó con
TBME (3 \times 30 mL) y fue entonces acidificada a pH 2 mediante
la adición de HCl 4N y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3
\times 30 mL). Obtenido: 0.51 g, 97% rendimiento. ^{1}H NMR
(CDCl_{3}) \delta 5.93 (m, 1H), 5.34 (dd, 1H), 5.26 (dd, 1H),
4.62 (d, 2H), 3.0 (m, 1H), 2.15 (s, 3H). ^{13}C NMR (CDCl_{3})
\delta 175.0. 156.2, 132.6, 118.8, 67.2, 53.2, 38.3, 18.2.ESMS:
m/z calcd para C_{8}H_{13}NO_{4}S, 219.06; encontrada,
219.75 [M + H]^{+}.
En un balón de fondo redondo de 250 mL,
Boc-Cys(Acm)-OH (1.0 g, 3.4
mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFACH_{2}Cl_{2} (1:1).
La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con
dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se
disolvió en una solución acuosa al 30% de Na_{2}CO_{3} (30 mL).
A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato
de alilo (0.43 mL, 4.1 mmol) en dioxano (30 mL) y el pH se mantuvo
a 8-9 mediante la adición de 10% Na_{2}CO_{3}
acuoso. Una vez completada la reacción, la fase acuosa se lavó con
TBME (3 \times 30 mL) y fue entonces acidificada a pH 2 mediante
la adición de HCl 4N, y el producto objetivo se extrajo con EtOAc
(3 \times 30 mL). Obtenido: 0.89 g, 95% rendimiento. ^{1}H NMR
(CDCl_{3}) \delta 5.89 (m, 1H), 5.18 (dd, 1H), 5.12 (dd, 1H),
4.62 (d, 2H), 4.42 (dd, 1H), 4.25 (dd, 1H), 3.10 (dd, 1H), 2.98 (dd,
1H), 2.05 (s, 3H). ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 173.1, 173.0.
156.9, 132.6, 118.3, 66.2, 54.1, 42.4, 34.4, 23.0. ESMS: m/z
calcd para C_{10}H_{16}N_{2}O_{5}S, 276.08; encontrada,
277.69 [M + H]^{+}.
Boc-D-Ser-OH
(1.0 g, 5.35 mmol) se disolvió en DMF (10 mL) y se enfrió a 0ºC en
un baño de hielo. A continuación se añadieron TBDMSCI (1.04 g, 6.96
mmol) e imidazol (1.10 g, 16.0 mmol) y la reacción se mantuvo a 0ºC
durante 1 h y después se llevó a 25ºC y se agitó durante 14 h más. A
continuación se añadió HCl 1N (25 mL) y el producto se extrajo con
Et_{2}O (3 \times 25 mL). Las fases orgánicas se combinaron y
secaron (MgSO4) y el producto se purificó por cromatografía en
columna [(CH_{2}Cl_{2}EtOAc (2:1)] para obtener 0.99 g (64%
rendimiento) del producto objetivo como un sólido blanco. ^{1}H
NMR (CDCl_{3}) \delta = 5.45 (br s, 1H), 4.11 (m, 1H), 3.85 (m,
1 H), 1.46 (s, 9H), 0.92 (s, 6H), 0.88 (s, 9H). ^{13}C NMR
(CDCl_{3}) \delta = 175.2, 156.4, 80.5, 63.6, 55.4, 28.5, 25.9,
18.4, -3.4, -5.6. ESMS: m/z calcd para
C_{15}H_{31}NO_{5}Si, 319.18; encontrada, 319.74 [M +
H]^{+}.
En un balón de fondo redondo de 250 mL,
H-Gly-OH (1.0 g, 13.3 mmol) se hizo
reaccionar durante 1 h con TFA-CH_{2}Cl_{2}
(1:1). La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron
coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el exceso de
TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30% de
Na_{2}CO_{3} (50 mL). A continuación se añadió gota a gota una
solución de cloroformiato de alilo. (1.7 mL, 16.0 mmol) en dioxano
(50 mL) y el pH se mantuvo a 8-9 mediante la adición
de 10% Na_{2}CO_{3} acuoso. Una vez completada la reacción, la
fase acuosa se lavó con TBME (3 \times 30 mL) y fue entonces
acidificada a pH 2 mediante la adición de HCl 4N y el producto
objetivo se extrajo con EtOAc (3 \times 50 mL) para dar 2.0 g (95%
rendimiento) de un aceite incoloro. ^{1}H NMR (CDCl_{3})
\delta 5.91 (m, 1H), 5.36 (dd, 1H), 5.24 (dd, 1H), 4.63 (d, 2H),
4.07 (s, 2H). ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 174.28, 156.57,
132.62, 118.27, 67.28, 66.25, 66.37, 43.29. ESMS: m/z calcd
para C_{6}H_{9}NO_{4}, 159.05; encontrada, 160.30 [M +
H]^{+}.
En una jeringa de polipropileno de 3 mL provista
de un disco poroso de polietileno se colocó resina Wang (50 mg,
0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 \times 1 min)
y CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min) y se añadió
Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol)
disuelto en CH_{2}Cl_{2}-DMF (9:1). A
continuación, DIPCDI (57.6 \muL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04
mmol) en DMF (0.2 mL) fueron secuencialmente añadidos y la mezcla
se dejó reaccionar durante 14 h. La resina
Fmoc-Gly-O-Wang fue
sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración,
CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min), DMF (3 \times 1 min),
piperidina-DMF (1:4) (1 \times 1 min, 2 \times
5 min). La funcionalización (0.90 mmol/g) se calculó midiendo la
absorbancia a 290 nm de la solución de desprotección del Fmoc. A
continuación se introdujo
Fmoc-D-Ser(Trt)-OH
(76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como
agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 \muL, 0.27
mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el
ensayo Kaiser indicó la finalización de la reacción de
acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3
\times 1 min), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min), y tratada con
piperidina-DMF (1:4) (1 \times 1 min, 2 \times 5
min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el grupo
pNZ, la resina fue tratada con cloroformiato de
p-nitrobenzilo (29.1 \muL, 0.135 mmol) y DIEA (229 \muL,
1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se
realizó con lavados de
TFA-TIS-CH_{2}Cl_{2}
(2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La
peptidil resina fue después lavada con CH_{2}Cl_{2} (3 \times
1 min) y se introdujo
Alloc-Cys(Me)-OH (98.5 mg,
0.45 mmol) por reacción con DIPCDI (69.7 \muL, 0.45 mmol) y DMAP
(5.5 mg, 0.045 mmol) en DMF-CH_{2}Cl_{2} (1:9)
durante 14 h a 25ºC. A continuación, para eliminar el grupo Alloc,
la peptidil resina fue tratada con
Pd(PPh_{3})_{4} (5.2 mg, 4.5 \mumol) y
PhSiH_{3} (55.4 mg, 0.45 mmol) disuelto en CH_{2}Cl_{2}
durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada con CH_{2}Cl_{2}
(3 \times 1 min). El proceso se repitió tres veces y después se
introdujo Boc-Cys(Acm)-OH
(65.5 mg, 0.225 mmol) con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7
mg, 0.225 mmol) y DIEA (37.5 \muL, 0.22 mmol) como sistema de
acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una alícuota de
la resina se clivó y se analizó por HPLC-ESMS:
m/z calcd para C_{23}H_{32}N_{6}O_{11}S_{2},
632.16; encontrada, 632.16 [M + H]^{+}. Después de lavar la
resina con DMF (3 \times 1 min) y CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1
min), el grupo pNZ se eliminó por tratamiento con SnCl_{2} 4.6 M,
HCl 1.6 mM en DMF (2 \times 30 min) y el ácido
3-hidroxiquináldico (12.7 mg, 0.067 mmol) se
introdujo por reacción con PyBOP (34.9 mg, 0.067 mmol), HOAt (9.1
mg, 0.067 mmol) y DIEA (34.4 \muL, 0.20 mmol) en DMF. Una
alícuota de la resina fue clivada y analizada por
HPLC-ESMS: m/z calcd para
C_{25}H_{32}N_{6}O_{9}S_{2} 624.17; encontrada, 624.58 [M
+ H]^{+}.
La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I_{2} (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 \times 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min), DMF (10 \times 1 min), y CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min). El péptido dimerizado fue entonces escindido de la resina mediante tratamiento con TFA-CH_{2}Cl_{2} (1:4) (2 \times 30 min) y después de la adición de H_{2}O, la mezcla fue evaporada con N_{2} y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{44}H_{52}N_{10}O_{16}S_{4} 1104.24; encontrada, 1105.22 [M + H]^{+}. El producto liofilizado se disolvió en CH_{2}Cl_{2} y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DM\tilde{F}CH_{2}Cl_{2} (1:9) y la mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 \muL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de la ciclación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{44}H_{48}N_{10}O_{14}S_{4} 1068.22; encontrada, 1069.86 [M + H]^{+}. MALDI-TOF: m/z calcd para C_{44}H_{48}N_{10}O_{14}S_{4} 1068.22; encontrada, 1069.30 [M + H]^{+}.
La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I_{2} (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 \times 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min), DMF (10 \times 1 min), y CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min). El péptido dimerizado fue entonces escindido de la resina mediante tratamiento con TFA-CH_{2}Cl_{2} (1:4) (2 \times 30 min) y después de la adición de H_{2}O, la mezcla fue evaporada con N_{2} y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{44}H_{52}N_{10}O_{16}S_{4} 1104.24; encontrada, 1105.22 [M + H]^{+}. El producto liofilizado se disolvió en CH_{2}Cl_{2} y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DM\tilde{F}CH_{2}Cl_{2} (1:9) y la mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 \muL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de la ciclación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{44}H_{48}N_{10}O_{14}S_{4} 1068.22; encontrada, 1069.86 [M + H]^{+}. MALDI-TOF: m/z calcd para C_{44}H_{48}N_{10}O_{14}S_{4} 1068.22; encontrada, 1069.30 [M + H]^{+}.
Alternativamente, el dímero se puede también
obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del
dímero de la resina, evaporación, liofilización y ciclación bajo
las condiciones descritas anteriormente proporciona el biciclo
protegido con el grupo pNZ. Eliminación del grupo protector pNZ se
lleva a cabo por tratamiento con SnCl_{2} (1.5 equiv), HCl 1.6 mM
en EtOAc-DMF (9:1), y el ácido
3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante
reacción con EDC\cdotHCl (3 equiv) y HOSu (3 equiv) en
CH_{2}Cl_{2} a 25ºC durante 2 días.
En una jeringa de polipropileno de 3 mL provista
de un disco poroso de polietileno se colocó resina Wang (50 mg,
0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 \times 1 min)
y CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min) y se añadió
Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol)
disuelto en CH_{2}Cl_{2}DMF (9:1). A continuación, DIPCDI (57.6
\muL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04 mmol) en DMF (0.2 mL) fueron
secuencialmente añadidos y la mezcla se dejó reaccionar durante 14
h. La resina
Fmoc-Gly-O-Wang fue
sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración,
CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min), DMF (3 \times 1 min),
piperidina-DMF (1:4) (1 \times 1 min, 2 \times
5 min). A continuación se introdujo
Fmoc-D-Ser(Trt)-OH
(76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como
agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 \muL, 0.27
mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el
ensayo Kaiser indicó la finalización de la reacción de
acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3
\times 1 min), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min), y tratada con
piperidina-DMF (1:4) (1 \times 1 min, 2 \times
5 min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el
grupo pNZ, la resina fue tratada con cloroformiato de
p-nitrobenzilo (29.1 \muL, 0.135 mmol) y DIEA (229 \muL,
1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se
realizó con lavados de con
TFA-TIS-CH_{2}Cl_{2}
(2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La
peptidil resina fue después lavada con CH_{2}Cl_{2} (3 \times
1 min) y se introdujo
Alloc-NMe-Cys(Me)-OH
(104.8 mg, 0.45 mmol) mediante reacción con DIPCDI (69.7 \muL,
0.45 mmol) y DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) en
DMF-CH_{2}Cl_{2} (1:9) durante 14 h a 25ºC. A
continuación, para eliminar el grupo Alloc, la peptidil resina fue
tratada con Pd(PPh_{3})_{4} (5.2 mg, 4.5
\mumol) y PhSiH_{3} (55.4 mg, 0.45 mmol) disuelto en
CH_{2}Cl_{2} durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada con
CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min). El proceso se repitió tres
veces y
Boc-NMe-Cys(Acm)-OH
(68.8 mg, 0.225 mmol) se introdujo con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol),
HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol) y DIEA (37.5 \muL, 0.22 mmol) como
sistema de acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una
alícuota de la resina se clivó y se analizó por
HPLC-ESMS: m/z calcd para
C_{25}H_{36}N_{6}O_{11}S_{2} 660.19; encontrada, 662.02 [M
+ H]^{+}. Después de lavar la resina con DMF (3 \times 1
min) y CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min), el grupo pNZ se eliminó
por tratamiento con SnCl_{2} 4.6 M, HCl 1.6 mM en DMF (2 \times
30 min) y el ácido 3-hidroxiquináldico (12.7 mg,
0.067 mmol) se introdujo por reacción con PyBOP (34.9 mg, 0.067
mmol), HOAt (9.1 mg, 0.067 mmol) y DIEA (34.4 \muL, 0.20 mmol) en
DMF. Una alicuota de la resina fue clivada y analizada por
HPLC-ESMS: m/z calcd para
C_{27}H_{36}N_{6}O_{9}S_{2} 652.20; encontrada, 653.62 [M
+ H]^{+}.
La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I_{2} (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 \times 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min), DMF (10 \times 1 min) y CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min). El péptido dimerizado fue entonces escindido de la resina mediante tratamiento con TFA-CH_{2}Cl_{2} (1:4) (2 \times 30 min), y después de la adición de H_{2}O, la mezcla fue evaporada con N_{2} y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{48}H_{60}N_{10}O_{16}S_{4} 1160.31; encontrada, 1161.84 [M + H]^{+}. El producto liofilizado se disolvió en CH_{2}Cl_{2} y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMF-CH_{2}Cl_{2} (1:9), y la mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 \muL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de la ciclación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{48}H_{56}N_{10}O_{14}S_{4} 1124.29; encontrada, 1125.35 [M + H]^{+}. MALDI-TOF: m/z calcd para C_{48}H_{56}N_{10}O_{14}S_{4} 1124.29; encontrada, 1125.9957 [M + H]^{+}.
La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I_{2} (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 \times 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min), DMF (10 \times 1 min) y CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min). El péptido dimerizado fue entonces escindido de la resina mediante tratamiento con TFA-CH_{2}Cl_{2} (1:4) (2 \times 30 min), y después de la adición de H_{2}O, la mezcla fue evaporada con N_{2} y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{48}H_{60}N_{10}O_{16}S_{4} 1160.31; encontrada, 1161.84 [M + H]^{+}. El producto liofilizado se disolvió en CH_{2}Cl_{2} y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMF-CH_{2}Cl_{2} (1:9), y la mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 \muL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de la ciclación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{48}H_{56}N_{10}O_{14}S_{4} 1124.29; encontrada, 1125.35 [M + H]^{+}. MALDI-TOF: m/z calcd para C_{48}H_{56}N_{10}O_{14}S_{4} 1124.29; encontrada, 1125.9957 [M + H]^{+}.
Alternativamente el dímero se puede también
obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del
dímero de la resina, evaporación, liofilización y ciclación bajo
las condiciones descritas anteriormente proporciona el biciclo
protegido con el grupo pNZ-. La eliminación del grupo protector pNZ
se lleva a cabo por tratamiento con SnCl_{2} (1.5 equiv), HCl 1.6
mM en EtOAc-DMF (9:1), y el ácido
3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante
reacción con EDC\cdotHCl (3 equiv), y HOSu (3 equiv), en
CH_{2}Cl_{2} a 25ºC durante 2 días.
En una jeringa de polipropileno de 3 mL provista
de un disco poroso de polietileno se colocó resina Wang (50 mg,
0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 \times 1 min)
y CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min), y se añadió
Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol)
disuelto en CH_{2}Cl_{2}-DMF (9:1). A
continuación, DIPCDI (57.6 \muL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04
mmol) en DMF (0.2 mL) fueron secuencialmente añadidos y la mezcla
se dejó reaccionar durante 14 h. La resina
Fmoc-Gly-O-Wang fue
sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración,
CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min), DMF (3 \times 1 min),
piperidina-DMF (1:4) (1 \times 1 min, 2 \times
5 min). A continuación, se introdujo
Fmoc-D-Ser(Trt)-OH
(76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como
agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 \muL, 0.27
mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el
ensayo Kaiser indicó la finalización de la reacción de
acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3
\times 1 min), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min), y tratada con
piperidina-DMF (1:4) (1 \times 1 min, 2 \times
5 min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el
grupo pNZ, la resina fue tratada con cloroformiato de
p-nitrobenzilo (29.1 \muL, 0.135 mmol) y DIEA (229 \muL,
1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se
realizó con lavados de con
TFA-TIS-CH_{2}Cl_{2}
(2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La
peptidil resina fue después lavada con CH_{2}Cl_{2} (3 \times
1 min) y se introdujo
Alloc-Cys(Me)-OH (98.5 mg,
0.45 mmol) por reacción con DIPCDI (69.7 \muL, 0.45 mmol) y DMAP
(5.5 mg, 0.045 mmol) en DM\tilde{F}CH_{2}Cl_{2} (1:9) durante
14 h a 25ºC. A continuación, para eliminar el grupo Alloc, la
peptidil resina fue tratada con Pd(PPh_{3})_{4}
(5.2 mg, 4.5 \mumol) y PhSiH_{3} (55.4 mg, 0.45 mmol) disuelto
en CH_{2}Cl_{2} durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada
con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min). El proceso se repitió tres
veces y después se introdujo
Boc-Cys(Acm)-OH (65.5 mg,
0.225 mmol) con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225
mmol), y DIEA (37.5 \muL, 0.22 mmol) como sistema de
acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una alícuota de
la resina se clivó y se analizó por HPLC-ESMS:
m/z calcd para C_{23}H_{32}N_{6}O_{11}S_{2},
632.16; encontrada, 632.16 [M + H]^{+}. después de lavar
la resina con DMF (3 \times 1 min) y CH_{2}Cl_{2} (3 \times
1 min), el grupo pNZ se eliminó por tratamiento con SnCl_{2} 4.6
M, HCl 1.6 mM en DMF (2 \times 30 min) y el ácido quináldico
(11.6 mg, 0.067 mmol) se introdujo por reacción con PyBOP (34.9 mg,
0.067 mmol), HOAt (9.1 mg, 0.067 mmol), y DIEA (34.4 \muL, 0.20
mmol) en DMF. Una alícuota de la resina fue clivada y analizada por
HPLC-ESMS: m/z calcd para
C_{25}H_{32}N_{6}O_{8}S_{2}, 608.17; encontrada, 608.94 [M
+ H]^{+}.
La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I_{2} (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 \times 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min), DMF (10 \times 1 min), y CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min). El péptido dimerizado fue entonces escindido de la resina mediante tratamiento con TFA-CH_{2}Cl_{2} (1:4) (2 \times 30 min), y después de la adición de H_{2}O, la mezcla fue evaporada con N2 y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{44}H_{52}N_{10}O_{14}S_{4}, 1072.25; encontrada, 1073.52 [M + H]^{+}. El producto liofilizado se disolvió en CH_{2}Cl_{2} y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMFCH_{2}Cl_{2} (1:9) y la mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 \muL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de la ciclación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{44}H_{48}N_{10}O_{12}S_{4}, 1036.23; encontrada, 1037.64 [M + H]^{+}. MALDI-TOF: m/z calcd para C_{44}H_{48}N_{10}O_{12}S_{4}, 1036.23; encontrada, 1038.06 [M + H]^{+}.
La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I_{2} (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 \times 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min), DMF (10 \times 1 min), y CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1 min). El péptido dimerizado fue entonces escindido de la resina mediante tratamiento con TFA-CH_{2}Cl_{2} (1:4) (2 \times 30 min), y después de la adición de H_{2}O, la mezcla fue evaporada con N2 y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{44}H_{52}N_{10}O_{14}S_{4}, 1072.25; encontrada, 1073.52 [M + H]^{+}. El producto liofilizado se disolvió en CH_{2}Cl_{2} y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMFCH_{2}Cl_{2} (1:9) y la mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 \muL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de la ciclación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z calcd para C_{44}H_{48}N_{10}O_{12}S_{4}, 1036.23; encontrada, 1037.64 [M + H]^{+}. MALDI-TOF: m/z calcd para C_{44}H_{48}N_{10}O_{12}S_{4}, 1036.23; encontrada, 1038.06 [M + H]^{+}.
Alternativamente, el dímero se puede también
obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del
dímero de la resina, evaporación, liofilización y ciclación bajo
las condiciones descritas anteriormente proporciona el biciclo
protegido con el grupo pNZ. La eliminación del grupo protector pNZ
se lleva a cabo por tratamiento con SnCl_{2} (1.5 equiv), HCl 1.6
mM en EtOAc-DMF (9:1), y el ácido
3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante
reacción con EDC\cdotHCl (3 equiv), y HOSu (3 equiv), en
CH_{2}Cl_{2} a 25ºC durante 2 días.
En una jeringa de polipropileno de 3 mL provista
de un disco poroso de polietileno, se colocó resina Wang (50 mg,
0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 \times 1 min)
y CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min) y se añadió
Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol)
disuelto en CH_{2}Cl_{2}DMF (9:1). A continuación, DIPCDI (57.6
\muL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04 mmol) en DMF (0.2 mL) fueron
secuencialmente añadidos y la mezcla se dejó reaccionar durante 14
h. La resina
Fmoc-Gly-O-Wang fue
sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración,
CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min), DMF (3 \times 1 min),
piperidina-DMF (1:4) (1 \times 1 min, 2 \times
5 min). A continuación se introdujo
Fmoc-D-Ser(Trt)-OH
(76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como
agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 \muL, 0.27
mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el
ensayo Kaiser indicó la finalización de la reacción de
acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3
\times 1 min), CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min), y tratada con
piperidina-DMF (1:4) (1 \times 1 min, 2 \times
5 min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el
grupo pNZ, la resina fue tratada con cloroformiato de
p-nitrobenzilo (29.1 \muL, 0.135 mmol) y DIEA (229 \muL,
1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se
realizó con lavados de con
TFA-TIS-CH_{2}Cl_{2}
(2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La
peptidil resina fue después lavada con CH_{2}Cl_{2} (3 \times
1 min) y se introdujo
Alloc-NMe-Cys(Me)-OH
(104.8 mg, 0.45 mmol) mediante reacción con DIPCDI (69.7 \muL,
0.45 mmol) y DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) en
DMF-CH_{2}Cl_{2} (1:9) durante 14 h a 25ºC. A
continuación, para eliminar el grupo Alloc, la peptidil resina fue
tratada con Pd(PPh_{3})_{4} (5.2 mg, 4.5
\mumol) y PhSiH_{3} (55.4 \muL, 0.45 mmol) disuelto en
CH_{2}Cl_{2} durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada con
CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min).
Boc-NMe-Cys(Acm)-OH
(68.8 mg, 0.225 mmol) se introdujo con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol),
HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol) y DIEA (37.5 \muL, 0.22 mmol) como
sistema de acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una
alícuota de la resina se clivó y se analizó por
HPLC-ESMS: m/z calcd para
C_{25}H_{36}N_{6}O_{11}S_{2}, 660.19; encontrada, 662.02
[M + H]^{+}. Después de lavar la resina con DMF (3 \times
1 min) y CH_{2}Cl_{2} (3 \times 1 min), el grupo pNZ se
eliminó por tratamiento con SnCl_{2} 4.6 M, HCl 1.6 mM en DMF (2
\times 30 min) y el ácido quináldico (11.6 mg, 0.067 mmol) se
introdujo por reacción con PyBOP (34.9 mg, 0.067 mmol), HOAt (9.1
mg, 0.067 mmol) y DIEA (34.4 \muL, 0.20 mmol) en DMF. Una alícuota
de la resina fue clivada y analizada por HPLC-ESMS:
m/z calcd para C_{27}H_{36}N_{6}O_{8}S_{2},
636.20; encontrado, 637.98 [M + H]^{+}. La formación del
puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con
I_{2} (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 \times 10 min). La
resina fue repetidamente lavada con CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1
min), DMF (10 \times 1 min), y CH_{2}Cl_{2} (10 \times 1
min). El péptido dimerizado fue entonces clivado de la resina
mediante tratamiento con TF\tilde{A}CH_{2}Cl_{2} (1:4) (2
\times 30 min), y después de la adición de H_{2}O, la mezcla fue
evaporada con N_{2}, y liofilizada. HPLC-ESMS:
m/z calcd para C_{48}H_{60}N_{10}O_{14}S_{4},
1128.32; encontrado, 1129.86 [M + H]^{+}. El producto
liofilizado se disolvió en CH_{2}Cl_{2} y se añadió a una
solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMFCH_{2}Cl_{2} (1:9), y
la mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36
mmol) y DIEA (90 \muL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo
de la ciclación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se
evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC
semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z calcd para
C_{48}H_{56}N_{10}O_{12}S_{4}, 1092.30; encontrado,
1093.16 [M + H]^{+}.
Alternativamente, el dímero se puede también
obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del
dímero de la resina, evaporación, liofilización y ciclación bajo
las condiciones descritas anteriormente proporciona el biciclo
protegido con el grupo pNZ-. La eliminación del grupo protector pNZ
se lleva a cabo por tratamiento con SnCl_{2} (1.5 equiv), HCl 1.6
mM en EtOAc-DMF (9:1), y el ácido
3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante
reacción con EDC\cdotHCl (3 equiv) y HOSu (3 equiv) en
CH_{2}Cl_{2} a 25ºC durante 2 días.
Claims (6)
1. Procedimiento para la obtención de un dímero
intermolecular por puente disulfuro en fase sólida a partir de
precursores lineales.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 donde
el puente disulfuro es escindido del soporte sólido y biciclado en
solución para obtener compuestos con la fórmula:
donde AA1, AA2, AA3, AA4, AA1',
AA2', AA3', y AA4' son independientemente
\alpha-aminoácidos de configuración L o D, si
aplica, proteinogénicos o no proteinogénicos, y donde por lo menos
dos son cisternas o N-alquil cisteínas, formando un puente
disulfuro; donde R_{1}, R_{2}, y R_{3} son cada uno
independientemente H o un grupo orgánico seleccionado de un grupo
que consiste de un grupo alquilo, un grupo arilo, un grupo aralquilo
y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo, un grupo
mercapto, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo halógeno;
donde R_{4} es independientemente H o un grupo alquilo; donde
Arilo (Aryl) es independientemente un grupo aromático/arilo, un
grupo alquilo o grupo heterocíclico: el término grupo aromático o
grupo arilo significando un grupo aromático mono- o policíclico
hidrocarbonado, un mono- , bi- o policiclo adecuado; y el término
grupo heterocíclico significando un anillo cerrado hidrocarbonado en
el cual uno o mas átomos del anillo es un elemento que no es
carbono, un mono-, bi- o policiclo
adecuado.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, donde el soporte sólido es una resina
ácido-lábil como la resina p-alcoxibenzilo
Wang o la resina cloruro de 2-clorotritilo.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 ó 3, donde, para formar el precursor lineal
se usan los siguientes grupos protectores: Fmoc
(fluorenilmethiloxicarbonil), Alloc (al iloxicarbonil), Tritilo
(trifenilmetilo), pNZ (4-nitrobenziloxicarbonilo),
Boc (t-butiloxicarbonilo), TBDMS
(t-butildimetilsililo) o Troc
(2,2,2-tricloroetoxicarbonilo).
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, donde el grupo arilo es introducido
en fase sólida.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, donde el grupo arilo es introducido
en solución.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200602584A ES2296544B1 (es) | 2006-10-05 | 2006-10-05 | Procedimiento para la obtencion de peptidos biciclicos. |
| PCT/ES2007/000565 WO2008040833A1 (es) | 2006-10-05 | 2007-10-05 | Procedimiento para la obtención de péptidos bicíclicos |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200602584A ES2296544B1 (es) | 2006-10-05 | 2006-10-05 | Procedimiento para la obtencion de peptidos biciclicos. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2296544A1 ES2296544A1 (es) | 2008-04-16 |
| ES2296544B1 true ES2296544B1 (es) | 2009-04-01 |
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ID=39247920
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|---|---|---|---|
| ES200602584A Active ES2296544B1 (es) | 2006-10-05 | 2006-10-05 | Procedimiento para la obtencion de peptidos biciclicos. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2296544B1 (es) |
| WO (1) | WO2008040833A1 (es) |
-
2006
- 2006-10-05 ES ES200602584A patent/ES2296544B1/es active Active
-
2007
- 2007-10-05 WO PCT/ES2007/000565 patent/WO2008040833A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BOGER, D.L. & LEE, J.K. "Development of a Solution-Phase Synthesis of Minor Groove Binding Bis-Intercalators Based on Triostin A Suitable for Combinatorial Synthesis". Journal of Organic Chemistry, 2000, Volumen 65, Número 19, páginas 5996-6000. Todo el documento. * |
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| DIETRICH, B. & DIEDERICHSEN, U. "Synthesis of Cyclopeptidic Analogues of Triostin A with Quinoxalines or Nucleobases as Chromophores". European Journal of Organic Chemistry, 2005, páginas 147-153. Ver página 148 y esquema 2. * |
| MALKINSON, J.P. et al. "Efficient Solid-Phase-Based Total Synthesis of the Bisintercalator TANDEM". Journal of Organic Chemistry, 2005, Volumen 70, Número 19, páginas 7654-7661. Ver especialmente esquema 1. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008040833A1 (es) | 2008-04-10 |
| ES2296544A1 (es) | 2008-04-16 |
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