ES2957487T3 - Método para la escisión del grupo Fmoc - Google Patents

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Alessandra Tolomelli
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Chiara Palladino
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Angelo Viola
Marco Macis
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Abstract

La presente invención proporciona un método para la escisión del grupo Fmoc caracterizado por el uso de una solución que comprende 3-(dietilamino)propilamina. En particular, proporciona un método para la preparación de péptidos en fase sólida en el que se utilizan aminoácidos protegidos con Fmoc y el grupo Fmoc se escinde mediante una solución que comprende 3-(dietilamino)propilamina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la escisión del grupo Fmoc
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la química de protección de la función amino. En particular, se refiere a un método para la escisión del grupo protector de amino Fmoc. Más en particular, se refiere a un método para escindir el grupo protector de amino Fmoc en la síntesis de péptidos, por ejemplo, en la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS).
Antecedentes de la técnica
El grupo Fmoc es uno de los grupos protectores de amino usados más habitualmente. El método usado más frecuentemente para retirar el grupo Fmoc es el tratamiento del compuesto químico protegido con una disolución de piperidina en 1,1-dimetilformamida (DMF). El grupo Fmoc es uno de los grupos protectores de alfa-amino usados más habitualmente en la síntesis de péptidos. Es particularmente habitual usar el grupo Fmoc como grupo protector de alfa-amino en el alargamiento de secuencias en la SPPS. El procedimiento convencional para retirar el grupo Fmoc después de cada ciclo de formación de enlaces amida de la síntesis de péptidos por etapas es el tratamiento del péptido en crecimiento con una disolución de piperidina al 20 % en DMF.
Sin embargo, la piperidina es una sustancia controlada ya que se emplea como precursor en la síntesis ilícita de drogas y sustancias psicotrópicas, como fentanilo y fenciclidina (PCP, también denominada “polvo de ángel”), bajo control internacional. Por este motivo, está incluida en la lista roja de la Junta Internacional de Fiscalización de Estupefacientes (INCB, véase la 17a ed., enero de 2020).
Además, la piperidina, que es necesario usar en un alto exceso para la escisión de Fmoc, es un compuesto muy tóxico. La toxicidad oral aguda es alta en muchas especies de animales de prueba. Los valores de DL<50>en ratones, conejos y ratas son de 30, 145 y 400 mg/kg, respectivamente.
Por tanto, existe la necesidad de nuevas rutas de síntesis que aborden los inconvenientes del uso de piperidina, que sean susceptibles de aplicación en la fabricación de productos químicos, en particular de péptidos, a escala industrial y sin ninguna restricción a su uso.
Sumario de la invención
El problema resuelve mediante la presente invención, proporcionando un método para escindir Fmoc de uno o más grupos amino protegidos con Fmoc, en el que el método comprende una etapa de poner en contacto los grupos amino protegidos con Fmoc con una disolución que comprende 3-(dietilamino)propilamina, también conocida como DEAPA.
La presente invención proporciona además un método para la escisión del grupo protector de amino Fmoc usando una disolución que comprende DEAPA en la síntesis de péptidos, en particular en síntesis de péptidos en fase sólida.
Además, la presente invención proporciona un método para la preparación de un péptido mediante la síntesis de péptidos en fase sólida basada en Fmoc, en el que el método comprende una etapa de poner en contacto los grupos amino protegidos con Fmoc con una disolución que comprende 3-(dietilamino)propilamina, escindiendo de ese modo el Fmoc de uno o más grupos amino protegidos con Fmoc.
Sorprendentemente, tales métodos proporcionan péptidos con una pureza total mejorada.
En una realización, la presente invención proporciona un método para la preparación de péptidos usando síntesis de péptidos en fase sólida, en el que el péptido comprende al menos un aminoácido ácido aspártico, caracterizándose el método por el uso de una disolución que comprende DEAPA para la escisión del grupo protector de amino Fmoc. Más particularmente, el método se caracteriza porque comprende una etapa de poner en contacto el grupo amino protegido con Fmoc con una disolución que comprende DEAPA.
En una realización adicional, la presente invención proporciona un método para la preparación de degarelix en la síntesis de péptidos en fase sólida, que se caracteriza por el uso de una disolución que comprende DEAPA para la escisión de uno o más grupos protectores de amino Fmoc.
En realizaciones preferidas, los métodos según la invención se caracterizan por el uso de una disolución de DEAPA al 10 % para la escisión del grupo protector de amino Fmoc. Incluso más preferiblemente la disolución es DEAPA al 10 % en DMF.
En particular, la presente invención proporciona un método para la preparación de un péptido en síntesis de péptidos en fase sólida, caracterizado por el uso de una disolución de DEAPA al 10 % en DMF para escindir grupos protectores de amino Fmoc.
Dibujos
Figura 1: 1H-RMN después de la desprotección con DEAPA al 20 % de resina de Fmoc-Gly-Trt-PS en DMF-d6 (ejemplo 1): el pico indicado con * corresponde a la señal de H1 de aducto de DBF-DEAPA; el pico indicado con # corresponde a las señales de H2de DBF; las señales a 7,5-8,0 ppm se refieren a una mezcla de protones aromáticos de DBF y DBF-DEAPA. La razón calculada de aducto de DBF/DBF-DEAPA es de 1/1,8.
Figura 2: 1H-RMN después de la desprotección con piperidina al 20 % de resina de Fmoc-Gly-Trt-PS en DMF-d6 (ejemplo 1): el pico indicado con * corresponde a una señal de H1 de aducto de DBF-piperidina; el pico indicado con # corresponde a las señales de H2de DBF; las señales a 7,5-8,0 ppm se refieren a una mezcla de protones aromáticos de DBF y DBF-piperidina. La razón calculada de aducto de DBF/DBF-piperidina es de 1/7,7.
Figura 3: Perfiles de HPLC superpuestos de degarelix a t0, t1, t2 y t3 (prueba 1, ejemplo 7).
la figura 4: Perfiles de HPLC superpuestos de degarelix a t0, t2 y t3 (prueba 2, ejemplo 7).
Descripción detallada de la invención
Fmoc, es decir, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo, en el presente documento también denominado grupo Fmoc, se emplea como grupo protector para funciones amino. Durante décadas el agente convencional para la escisión de Fmoc es la piperidina, y a pesar de su toxicidad y su estatus como sustancia de dispensación controlada (sustancia controlada) siempre se han considerado desventajosas, ninguna de las bases que se han propuesto para la escisión de Fmoc hasta ahora se han convertido en un nuevo agente convencional.
Los términos “función amino” y “grupo amino” se refieren a cualquier amina primaria o secundaria, incluyendo aminas alifáticas (acíclicas y cíclicas) y aromáticas, que pueden protegerse mediante el grupo Fmoc. Preferiblemente, una función amino de este tipo es una amina alifática primaria, más preferiblemente el grupo alfaamino de un aminoácido o de un péptido.
En particular, el grupo Fmoc se emplea como protección para el grupo alfa-amino de los aminoácidos usados como componentes básicos en la síntesis de péptidos, tanto en la síntesis de péptidos en fase líquida (LPPS) como en la SPPS. Las condiciones químicas requeridas para su escisión son generalmente ortogonales a las condiciones requeridas para la escisión de los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos. Estos últimos suelen retirarse una vez concluidas todas las etapas de alargamiento de la cadena peptídica. Esto se produce generalmente con la escisión simultánea de la cadena peptídica del soporte sólido cuando el péptido se sintetiza en la SPPS.
Tal preparación de péptidos en fase sólida puede llevarse a cabo como una SPPS por etapas o completamente basada en Fmoc, en la que los aminoácidos se acoplan uno por uno a la secuencia peptídica en crecimiento unida a un soporte sólido, o como una SPPS convergente basada en Fmoc. SPPS (CSPPS), en la que al menos dos fragmentos peptídicos, preparados independientemente, se acoplan entre sí para formar enlaces amida y fragmentos peptídicos más largos, hasta que finalmente se obtiene la secuencia final, en la que uno de los dos fragmentos implicados en una reacción de acoplamiento se une a un soporte sólido.
Los términos “SPPS basada en Fmoc” o “síntesis de péptidos basada en Fmoc” se refieren a una síntesis de péptidos en la que se emplean aminoácidos, en la que el grupo alfa-amino está protegido por el grupo Fmoc.
El grupo Fmoc también se usa como protección para funciones amino en cadenas laterales en una SPPS basada en Boc, es decir, cuando se emplean aminoácidos cuyo grupo alfa-amino está protegido por el grupo Boc. En este caso, como la escisión de Boc requiere condiciones ácidas, la protección de las cadenas laterales con Fmoc proporciona la ortogonalidad requerida para la desprotección de los grupos alfa-amino sin eliminar las protecciones de las cadenas laterales. También en este escenario puede usarse DEAPA para desproteger la función amino de la cadena lateral.
Los términos “fragmento peptídico” y “fragmento”, tal como se usan en el presente documento, describen una secuencia parcial de aminoácidos, con una longitud mínima de 2 aminoácidos, en relación con la secuencia del péptido diana. Un fragmento peptídico generalmente está protegido en la cadena lateral, así como en el grupo alfaamino N-terminal que no está implicado en una reacción de acoplamiento. El grupo alfa-amino N-terminal está preferiblemente protegido por el grupo Fmoc.
Los términos “agente desprotector de aminas” y “agente de escisión de Fmoc” se usan en el presente documento como sinónimos y se refieren a los reactivos usados en la presente divulgación para la escisión de grupos protectores de amino Fmoc.
Los términos “escisión” y “retirada”, así como los verbos “escindir” y “retirar” se usan en el presente documento como sinónimos y se refieren a la ruptura de los enlaces químicos que se produce durante la desprotección de los grupos amino protegidos con Fmoc.
Por tanto, la presente invención proporciona un método para la preparación de un péptido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, mediante el uso de síntesis de péptidos en fase sólida caracterizada por el uso de una disolución que comprende DEAPA para escindir grupos protectores de amino Fmoc de grupos alfaamino protegidos con Fmoc.
Sorprendentemente, DEAPA ha demostrado ser adecuada para la escisión de grupos protectores de amino Fmoc. Se ha demostrado que es superior al uso de piperidina en la síntesis de péptidos, en la que puede usarse tanto en fase líquida como sólida, en particular en la SPPS. Es un producto químico menos tóxico y más respetuoso con el medioambiente y ha demostrado su eficacia como reactivo rápido, seguro y eficiente.
La estructura química de la 3-(dietilamino)propilamina (I) se representa a continuación:
Comparación de escisión de Fmoc con DEAPA/otras bases
Se comparó la velocidad de reacción de DEAPA y piperidina en la reacción de desprotección que retira Fmoc de un aminoácido modelo como Fmoc-Phe-OH en dos disolventes diferentes, DMF y NBP (es decir, N-butil-1-pirrolidona), y en dos concentraciones diferentes, el 10 % y el 20 %. También se sometieron a prueba otras aminas, concretamente 1,1,3,3-tetrametilguanidina (TMG) y terc-butilamina (TBA). Los resultados demostraron que DEAPA es tan adecuada para la escisión de Fmoc como las otras aminas sometidas a prueba.
El mecanismo de la escisión de Fmoc se representa a continuación:
El dibenzofulveno (DBF), que se forma en la primera etapa, es una especie reactiva y puede reaccionar adicionalmente con el agente desprotector de amina para formar un aducto de DBF-amina (DBF-A). Esto impide la posible reacción secundaria en la que el DBF reacciona con el grupo alfa-amino libre del péptido en preparación o con cualquier otra especie reactiva que pueda estar presente en la mezcla de reacción. Sorprendentemente se observó que piperidina y DEAPA eran capaces de formar el aducto de DBF-amina, mientras que TMG y TBA no formaban el aducto de DBF. Por tanto, DEAPA es capaz de actuar como agente eliminador del DBF y, por tanto, anula las reacciones secundarias provocadas por el DBF. Sorprendentemente, DEAPA reacciona de la misma manera que la piperidina, el agente de escisión convencional para Fmoc.
Se sometió a prueba adicionalmente la DEAPA para detectar cualquier impacto en la racemización en la SPPS basada en Fmoc. Se sabe en la técnica que la cisteína es extraordinariamente propensa a experimentar racemización durante la síntesis de péptidos. En primer lugar, se prepararon H-Phe-L-Cys-Gly-OH y H-Phe-D-Cys-Gly-OH como patrones, tal como se describe en el ejemplo 2. Luego, se realizó SPPS basada en Fmoc completa de H-Phe-L-Cys-Gly-OH en paralelo usando DEAPA o piperidina para retirar los grupos Fmoc (disolución de base al 30 %), tal como se describe en el ejemplo 3. No se observó ninguna diferencia sustancial en la razón de racemización entre DEAPA y piperidina, ya que, en ambos experimentos, la razón D/L en % (o % de razón de racemización) fue inferior a 0,1.
A continuación, se describe la preparación de SPPS basada en Fmoc completa de péptidos representativos usando DEAPA como agente de escisión de Fmoc.
Por ejemplo, se preparó octreotida lineal (II), es decir, H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (SEQ ID NO: 1), en tres experimentos paralelos diferentes, usando DEAPA al 10 % en DMF, piperidina al 20 % en DMF o piperidina al 20 % en NBP para la escisión de grupos Fmoc. El producto final obtenido usando DEAPA mostró una pureza aumentada, tal como se describe en detalle en el ejemplo 4.
Mediante un procedimiento análogo de SPPS, podrían prepararse otros péptidos, como por ejemplo glucagón, exenatida, etelcalcetida y similares, usando el método según la presente invención.
Una de las preocupaciones en la síntesis de péptidos es la formación de productos secundarios de aspartimida. Las condiciones básicas, que son obligatorias para la escisión del grupo Fmoc, también pueden favorecer la formación de derivados de aspartimida no deseados durante la SPPS basada en Fmoc y su aparición generalmente aumenta con el número de ciclos de escisión de Fmoc después de la introducción de un residuo de ácido aspártico (Asp) en la cadena peptídica. El anillo de aspartimida en el producto secundario puede entonces abrirse mediante ataque nucleófilo con formación de especies químicas no deseadas adicionales, tal como se muestra en el siguiente esquema:
Para analizar la idoneidad de DEAPA en tal escenario, se preparó un péptido modelo y luego se puso en contacto en condiciones básicas con piperidina u otra amina adecuada, o con DEA<p>A durante periodos prolongados.
Se preparó el hexapéptido modelo H-Ala-Lys-Asp-Gly-Tyr-Ile-OH (III, SEQ ID NO: 2, esquema 3) mediante SPPS basada en Fmoc completa usando piperidina al 20 % en DMF y se determinó la impureza de aspartimida (IV, esquema 3) en el compuesto final, que resultó ser del 2,6 % (HPLC, ejemplo 5).
Luego se realizó una prueba de estrés mediante la cual el péptido modelo se sometió a condiciones básicas para simular ciclos repetidos de desprotección de alfa-amino. El H-Ala-Lys-Asp-Gly-Tyr-Ile-OH unido a resina (que todavía portaba protecciones de cadena lateral) se trató en paralelo con disoluciones de piperidina al 20 %, DEAPA al 10 %, TMG al 5 % o TBA al 20 %, en DMF o NBP, durante 4 h a TA.
Tal como se muestra en el esquema 2 anterior, la formación del subproducto de aspartimida puede ir seguida de un ataque nucleófilo al anillo de aspartimida con la formación de subproductos adicionales, como aductos de amina (apertura de anillo mediada por aminas) y péptidos alfa y beta (apertura de anillo mediada por agua).
Se analizaron las muestras de hexapéptido obtenidas después de tales tratamientos con las disoluciones de escisión de Fmoc mediante HPLC y los resultados se muestran en la tabla 1 (para conocer el procedimiento experimental detallado, véase el ejemplo 6).
Table 1. Pureza de HPLC (% de A) de H-Ala-Lys-Asp-Gly-Tyr-Ile-OH (III, SEQ ID NO: 2)
Entrada Base Disolvente<III (%>Aspartimida (IV) Piperididas (V) A Asp
de A)(% de A) (% de A) (% de
A)
Punto de partida (después de la síntesis en
DMF con pip. al 20 %)<97,4 2,6 ->1 piperidina al 20 % DMF 86,5 7,2 6,3 10,9 2 DEAPA al 10 % DMF 89,9 10,1 - 7,5 3 TMG al 5 % DMF 14,5a 85,5 - 82,9 4 TBA al 20 % DMF 70,7 29,3 - 26,7 5 piperidina al 20 % NBP 90,0 7,1 2,9 7,4 6 DEAPA al 10 % NBP 95,8 4,2 - 1,6 7 TMG al 5 % NBP 27,1a 72,9 - 70,3
8 TBA NBP 80,0 20,0 - 17,4
a suma de péptido alfa y beta
Cuando se usó piperidina, se observó la formación de piperididas (V).
El uso de DEAPA dio como resultado la formación de los subproductos correspondientes en trazas solamente, y no se enumeran en la tabla 1.
La escisión con TMG dio como resultado la formación del péptido beta, coeluyendo con el péptido alfa, correspondiente al péptido diana (III).
En la tabla 1, A Asp indica la cantidad de impurezas totales adicionales de aspartimida (que comprenden subproductos de piperididas) resultantes de la prueba de estrés en relación con la cantidad inicial de aspartimida (2,6 %). Este valor resultó ser menor cuando se usó DEAPA, en comparación con las otras aminas sometidas a prueba, en el disolvente respectivo.
Como consecuencia, la pureza del péptido diana (III) es mayor en las muestras tratadas con la disolución DEAPA. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para la escisión de grupos protectores de amino Fmoc caracterizado por el uso de una disolución que comprende 3-(dietilamino)propilamina.
La presente invención también proporciona un método para la preparación de un péptido caracterizado por el uso de una disolución que comprende 3-(dietilamino)propilamina para escindir grupos protectores de amino Fmoc.
Además, la presente invención proporciona un método para la preparación de un péptido mediante síntesis de péptidos en fase sólida caracterizado por el uso de una disolución que comprende 3-(dietilamino)propilamina para escindir grupos protectores de amino Fmoc.
Preferiblemente, la concentración de DEAPA oscila entre el 5 y el 30 %, más preferiblemente entre el 10 y el 20 %, lo más preferiblemente es del 10 %. Preferiblemente, el disolvente es un disolvente aprótico polar, más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en DMF, NBP, NMP (es decir 1-metil-2-pirrolidona) o disolventes similares, o mezclas de los mismos. En la realización más preferida, la disolución es una concentración al 10 % de DEAPA en DMF.
Donde en toda la presente divulgación los valores concentración se proporcionan en %, estos se refieren a % en volumen.
En una realización especialmente preferida, la presente invención proporciona un método para la escisión de grupos protectores de amino Fmoc caracterizado por el uso de una disolución de DEAPA al 10 % en DMF.
El uso de DEAPA también resultó ventajoso en la síntesis de degarelix (VI). Degarelix se identifica por la secuencia:
1 5 10
Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2
en la que los números indican las posiciones del aminoácido (aa) posiciones, comenzando en el aa N-terminal (D-Nal) al aa C-terminal (D-Ala).
Uno de los principales problemas en la preparación de degarelix es la alta sensibilidad del resto ácido (L)dihidroorótico (indicado como Hor) del residuo Aph(Hor) en la posición 5 de la secuencia en presencia de una disolución básica acuosa. En estas condiciones, se produce una rápida reordenación del anillo Hor de 6 miembros, con formación de un anillo de hidantoína de 5 miembros.
Se sometió a prueba la estabilidad de degarelix (VI) frente al reordenamiento de hidantoína en una disolución de DEAPA para monitorizar cualquier formación de su impureza de hidantoína (VII).
Se mantuvo degarelix en una disolución de DEAPA al 10 % en DMF durante 24 h para simular las condiciones correspondientes a las usadas para la retirada del grupo Fmoc durante la SPPS completa. Se analizaron las muestras mediante HPLC en cuatro puntos de control hasta 24 h y los cuatro perfiles de HPLC obtenidos se compararon tal como se muestra en las figuras 3 y 4 (para conocer el procedimiento experimental detallado, véase el ejemplo 7).
No se observó ninguna degradación significativa de degarelix. En particular, no se detectó ningún aumento de la impureza de hidantoína (VI).
Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para la preparación de degarelix mediante síntesis de péptidos en fase sólida caracterizado por el uso de una disolución que comprende DEAPA para escindir grupos protectores de amino Fmoc, en el que la síntesis en fase sólida es o bien una s PpS completa o una CSPPS.
Preferiblemente, en la preparación de degarelix la concentración de DEAPA oscila entre el 5 y el 30 %, más preferiblemente entre el 10 y el 20 %, lo más preferiblemente es del 10 %. Preferiblemente, el disolvente es un disolvente aprótico polar, más preferiblemente DMF, NBP, NMP (es decir 1-metil-2-pirrolidona) o similares, o mezclas de los mismos.
En una realización especialmente preferida, la presente invención proporciona un método para la síntesis de degarelix caracterizado por el uso de una disolución de DEAPA al 10 % en DMF para la escisión de grupos protectores de amino Fmoc.
En una realización preferida, la síntesis de degarelix según la presente invención se realiza usando al menos uno de los compuestos seleccionados del grupo que consiste en Fmoc-Aph(Hor)-OH, Fmoc-Aph(PG)-OH, Fmoc-Phe(NO<2>)-OH, Fmoc-D-Phe(NO<2>)-OH y un fragmento peptídico que comprende uno o más de Aph(Hor), Phe(NO<2>) y D-Phe(NO<2>). PG es un grupo protector de amino seleccionado del grupo que consiste en terc-butiloxicarbonilo, formilo, aliloxicarbonilo y benciloxicarbonilo. En particular, la presente invención proporciona un método para la preparación de degarelix mediante SPPS basada en Fmoc completa siguiendo el enfoque descrito en el documento WO2017103275, ejemplo 2, página 34, caracterizado por el uso de una disolución que comprende DEAPA para escindir grupos protectores de amino Fmoc en lugar de piperidina.
En otra realización, la presente invención proporciona el uso de 3-(dietilamino)propilamina para escindir el grupo protector de amino Fmoc. En particular, proporciona el uso de 3-(dietilamino)propilamina para escindir el grupo protector de amino Fmoc en síntesis de péptidos, preferiblemente en la síntesis de péptidos en fase sólida.
En comparación con la piperidina que ha sido el agente de escisión convencional para Fmoc durante décadas, DEAPA tiene una toxicidad menor (DL<50>en ratas = 830 mg/kg). Ha mostrado comparabilidad mecanística con la piperidina, lo que permite ampliar la aplicabilidad de este método a la escisión de Fmoc en general. En ejemplos específicos, DEAPA ha demostrado superioridad con respecto a las reacciones secundarias, lo que da como resultado productos con mayor pureza. La DEAPA no está en la lista de sustancias controladas e incluso su precio es menor al precio de la piperidina.
Abreviaturas
Aph p-amino-fenilalanina
h hora
min minutos
GnRH Hormona liberadora de gonadotropina
SPPS Síntesis de péptidos en fase sólida
Fmoc-Aph(Hor)-OH 9-Fluorenilmetiloxicarbonil-N(4)-(L-hidroorotil)- 4-aminofenilalanina
Fmoc-Phe-OH 9-Fluorenilmetiloxicarbonil-L-fenilalanina
Aph(Hor) N(4)-(L-hidroorotil)-4-aminofenilalanina
Hor Resto dihidroorotilo
Hor-OH Ácido (L)dihidroorótico
Fmoc 9-Fluorenilmetiloxicarbonilo
Boc t-Butiloxicarbonilo
HPLC Cromatografía de líquidos de alta resolución
DIPEA/DIEA Diisopropiletilamina
DEAPA 3-(Dietilamino)propilamina
TFA Ácido trifluoroacético
DMF N,N-dimetilformamida
DMA N,N-dimetilacetamida
NMP 1 -metil-2-pirrolidona
NBP 1 -butil-2-pirrolidona
ACN Acetonitrilo
DCM Diclorometano
DBF Dibenzofulveno
DIC Diisopropilcarbodiimida
TIS Tri-isopropilsilano
OxymaPure 2-Ciano-2-hidroxiimino-acetato de etilo
RRT Tiempo de retención relativo
TA Temperatura ambiente
TM Molécula diana
Resina de Trt-PS Resina de tritilo poliestirénico
Ejemplos
Los siguientes ejemplos proporcionan condiciones experimentales detalladas para el método de la presente invención y pretenden ser ilustrativos y no limitativos de todas las realizaciones posibles de la misma.
A menos que se indique lo contrario, todos los materiales, disolventes y reactivos se obtuvieron de proveedores comerciales, de la mejor calidad, y se usaron sin purificación adicional. La síntesis en fase sólida de los péptidos se llevó a cabo manualmente o usando sintetizadores de péptidos comunes, tales como el instrumento Syrowave de Biotage (síntesis automatizadas) y MultiSynTech de Biotage (síntesis semiautomáticas).
Métodos de HPLC
Ejemplos 1-6: Se realizaron análisis de HPLC-EM en un sistema 1260 Infinity II de Agilent acoplado a un espectrómetro de masa de ionización por electrospray (modo ion positivo, m/z = 100-1500, Fragmentor 30 V), usando columnas Agilent Zorbax-SB-C18 5 μm, 250 * 4,6 mm o Fenomenex Luna C18 5 μm, 250 * 4,6 mm; temperatura: 25 °C; volumen de inyección: 10 μl, UV: 220 nm, fases móviles: H<2>O+TFA al 0,08 % (A) y CH<3>CN+TFA al 0,08 % (B), flujo: 0,5 ml/min o 1,0 ml/min.
Ejemplo 7: Se realizaron análisis de HPLC en un sistema 1260 Infinity II de Agilent usando columnas Waters Cortecs C182,7 μm, 4,6 * 150 mm; temperatura: 30 °C; volumen de inyección: 10 μl, UV: 245 nm; tampón fosfato a pH 5,5: fosfato de potasio 25 mM a pH 5,5; tampón fosfato a pH 3,5: fosfato de potasio 25 mM a pH 3,5; fases móviles: 75 % de tampón a pH 5,5: 25 % de CH<3>CN (A); 65 % de tampón a pH 3,5: 35 % de CH<3>CN (B); flujo: 1,0 ml/min, concentración de muestra 0,5 mg/ml; gradiente: 0-5 min 0 % de B, 5-45 min f0-100 % de B, 45-46 min 100-0 % de B, 46-60 min 0 % de B.
Ejemplo 1: Monitorización formación de aducto de DBF-amina
Se hincharon 50 mg de resina seca de Fmoc-Gly-Trt-PS en 2 ml de DMF durante 30 minutos. Se filtró la resina y se añadieron a la resina 0,75 ml de disolución base al 20 % (DEAPA, piperidina, TBA o TMG) en DMF-d6 y se agitaron durante 30 min. Se filtró la resina y se analizó directamente el filtrado mediante espectroscopia de<1>H-RMN para revelar la presencia de DBF solo o la formación del aducto de DBF-amina (esquema 1).
Los espectros de<1>H-RMN demostraron la formación de aducto de DBF-DEAPA (figura 3) en una razón de DBHDBF-DEAPA de 1/1,8 y la formación de aducto de DBF-piperidina (figura 4) en una razón de DBHDBF-piperidina de 1/7,7. después de 30 minutos.
No se observó ningún aducto de base-DBF con TBA o TMG.
Ejemplo 2: SPPS basada en Fmoc completa de H-Phe-L-Cys-Gly-OH y H-Phe-D-Cys-Gly-OH en DMF como compuestos de referencia para pruebas de racemización de Cys
Se llevó a cabo la síntesis usando resina de Fmoc-Gly-Trt-PS (200 mg, carga 1,1 mmol/g). Después de hinchar la resina en 2 ml de DMF, se retiró el grupo protector Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (2 x 2 ml, 15 min cada uno) y se lavó la resina con DMF (4 x 2 ml). Fmoc-L-Cys(Trt)-OH (o Fmoc-D-Cys(Trt)-OH) y Fmoc-Phe-OH (tres veces en exceso con respecto a la carga de la resina) se preactivaron mediante DIC y OxymaPure (exceso de tres veces de los reactivos respecto a la carga de la resina) durante 3 min y se acopló a la resina en 60 min. Después de cada etapa de acoplamiento, se retiró el grupo protector Fmoc tratando la resina peptídica con piperidina al 20 % en DMF (2 x 2 ml, 15 min cada uno) y se lavó la resina con DMF (4 x 2 ml). Después de la escisión con Fmoc del grupo alfaamino N-terminal, se lavó la resina peptídica con DMF (3 x 2 ml) y DCM (3 x 2 ml). Se suspendió resina peptídica seca en 5 ml de la mezcla TFA/TIS/H<2>O/1-dodecanotiol (92,5/2,5/2,5/2,5 vlvlvlv) y se agitó durante 2 h. Se separó por filtración la resina y se añadió a la disolución diisopropil éter (20 ml) enfriado a 4 °C. Se filtró el péptido y se secó a vacío para obtener H-Phe-L-Cys-Gly-OH o H-Phe-D-Cys-Gly-OH en bruto como compuestos de referencia para pruebas de racemización.
Gradiente de análisis de HPLC-EM: 0-30 min 0-60 % de B; flujo: 0,5 ml/min.
Ejemplo 3: Pruebas de racemización de Cys durante la SPPS basada en Fmoc completa de H-Phe-L-Cys-Gly-OH en DMF con DEAPA y piperidina como agentes de desprotección
Se realizaron dos SPPS de H-Phe-L-Cys-Gly-OH tal como se indicó anteriormente en el ejemplo 2, pero usando las siguientes condiciones para la escisión del grupo Fmoc en paralelo: DEAPA o piperidina al 30 % en DMF durante 60 minutos.
Gradiente de análisis de HPLC-EM: 0-30 min 0-60 % de B; flujo: 0,5 ml/min.
Se determinó la razón de racemización (% de D/L) en la preparación de H-Phe-Cys-Gly-OH mediante las áreas en % del HPLC (% de A) de los dos diaestereómeros, y se calcularon como (H-Phe-D-Cys-Gly-OH A %)/(H-Phe-L-Cys-Gly-OH A %) x 100. El % de D/L era <0,1 en ambos experimentos.
Ejemplo 4: SPPS basada en Fmoc completa de H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (octreotida lineal, II, SEQ ID NO: 1) con DEAPA o piperidina como agente de escisión de Fmoc
Se llevó a cabo la síntesis usando resina de Fmoc-Thr(tBu)-ol-Trt-PS (200 mg, carga 1,1 mmol/g). Después de hinchar la resina en 2 ml de DMF o NBP, se retiró el grupo protector Fmoc con DEAPA al 10 % en DMF (o piperidina al 20 % en DMF o NBP) (2 x 2 ml, 15 min cada uno) y se lavó la resina con DMF o PNI (4x2 ml). Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-D-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Trt) -O<h>, Fmoc-D-Phe-OH (tres veces en exceso con respecto a la carga de la resina) se preactivaron por DIC y OxymaPure (tres veces en exceso de los reactivos con respecto a la carga de la resina) durante 3 min y se acoplaron a la resina en 60 min. En el caso del primer Fmoc-Cys(Trt)-OH insertado(Cys7 en la secuencia final) el acoplamiento se repitió una segunda vez. Después de cada etapa de acoplamiento, se retiró el grupo protector Fmoc tratando la resina peptídica con DEAPA al 10 % en DMF (2 x 2 ml, 15 min cada uno) o con piperidina al 20 % en DMF o NBP (2 x 2 ml, 15 min cada uno) y se lavó la resina con DMF o NBP (4 x 2 ml). Después de la escisión con Fmoc del grupo amino N-terminal, la se lavó resina peptídica con DMF o NBP (3 x 2 ml) y DCM (3 x 2 ml). Se suspendió resina peptídica seca en 5 ml de la mezcla TFA/TIS/1-dodecanotiol (90/5/5 v/v/v) y se agitó durante 4 h. Se separó por filtración la resina y se añadió a la disolución diisopropil éter (20 ml) enfriado hasta 4 °C. Se filtró el péptido y se secó a vacío para obtener octreotida lineal en bruto (II). Las purezas de HPLC calculadas como la suma de todos los aductos de las moléculas diana se informan en la tabla 3. Vale la pena señalar que todas las especies informadas en la tabla 3 no son impurezas sino precursoras de la octreotida final (TM = molécula diana).
Gradiente de análisis de HPLC-EM: 0-15 min 20-40 % de B; flujo: 0,5 ml/min.
Tabla 2. Pureza de HPLC de octreotida lineal (II) en DMF con DEAPA al 10 % en DMF o con piperidina al 20 % en DMF o NBP como agente de desprotección
Ejemplo 5: SPPS basada en Fmoc completa de H-Ala-Lvs-Asp-Glv-Tvr-IIe-OH (III, SEQ ID NO: 2) con escisión de Fmoc con piperidina/DMF para la detección de formación de aspartimida
Se llevó a cabo la síntesis usando resina de Fmoc-Ile-Trt-PS (800 mg, carga 1,1 mmol/g). Después de hinchar la resina en 2 ml de DMF, se retiró el grupo protector Fmoc con piperidina al 20 % en DMF (2 x 2 ml, 15 min cada uno) y se lavó la resina con DMF (4 x 2 ml). Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH (exceso tres veces respecto a la carga de la resina) se preactivaron por DIC y OxymaPure (exceso de tres veces de los reactivos con respecto a la carga de la resina) durante 3 min y se acoplaron a la resina durante 60 min. Después de cada etapa de acoplamiento, se retiró el grupo protector Fmoc tratando la resina peptídica con piperidina al 20 % en DMF (2 x 2 ml, 15 min cada uno) y se lavó la resina con DMF (4 x 2 ml). Después de la escisión de Fmoc del grupo amino N-terminal, se lavó la resina peptídica con DMF (3 x 2 ml) y DCM (3 x 2 ml). Se suspendieron 100 mg de resina peptídica seca en 3 ml de la mezcla TFA/TIS/H<2>O (90/5/5 vlvlv) y se agitó durante 2 h. Se separó la resina por filtración y se añadió a la disolución diisopropil éter (10 ml) enfriado hasta 4 °C. Se filtró el péptido y se secó a vacío para obtener H-Ala-Lys-Asp-Gly-Tyr-Ile-OH (II) en bruto con una pureza de HPLC del 97,4 % y una impureza de aspartimida (IV) del 2,6 %.
Gradiente de análisis de HPLC-EM: 0-30 min 10-40 % de B; flujo: 0,5 ml/min.
Ejemplo 6: Prueba de estabilidad de estrés de H-Ala-Lys-Asp-Gly-Tyr-Ile-OH (II, SEQ ID NO: 2) con piperidina, DEAPA, TMG y TBA en DMF o NBP
Se hincharon 100 mg de resina seca de H-Ala-Lys-Asp-Gly-Tyr-Ile-Trt-PS (preparada tal como se describe en el ejemplo 2) en 2 ml de DMF o NBP durante 30 minutos. Se filtró la resina y se añadió a la resina una disolución de 2 ml de<d>E<a>PA al 10 % (o piperidina al 20 %, TMG al 5 %, TBA al 20 %) en DMF o NBP y se agitó durante 4 horas a TA. Se filtró la resina, se lavó con DMF o NBP (3x2 ml) y con DCM (3x2 ml). Se suspendió resina peptídica seca en 3 ml de la mezcla TFA/TIS/H<2>O (90/5/5 v/v/v) y se agitó durante 2 h. Se separó por filtración la resina y se añadió a la disolución diisopropil éter (10 ml) enfriado hasta 4 °C. Se filtró el péptido y se secó a vacío para obtener H-Ala-Lys-Asp-Gly-Tyr-Ile-OH (II) en bruto e impureza de aspartimida (III) en diferentes razones según las condiciones usadas.
La tabla 1 en la descripción enumera los resultados. A Asp indica la diferencia entre la cantidad de aspartimida formada después de las pruebas de estrés (incluyendo las piperididas si están presentes) y la que surge de la síntesis de hexapéptido (2,6 %, véase el ejemplo 2).
Gradiente de análisis de HPLC-EM: 0-30 min 10-40 % de B; flujo: 0,5 ml/min.
Ejemplo 7: Estabilidad de deqarelix en presencia de DEAPA
Se disolvió una muestra de degarelix, como polvo liofilizado de aproximadamente el 99 % de pureza, en DMF con el 10 % de DEAPA a dos concentraciones diferentes: aproximadamente 170 g/l (prueba 1) y aproximadamente 17 g/l (prueba 2). Se siguió la estabilidad a TA durante 24 h en cuatro puntos de control, es decir, t0, 1h (t1), 4h (t2) y 24h (t3).
Los perfiles de HPLC superpuesto se muestran en la figura 3 (prueba 1) y la figura 4 (prueba 2).
Prueba 1: Perfil no cambiado después de 24 h. Sólo RRT de la impureza especificada 0,85 (X, desconocido), no presente en t0, aumentó a un valor del 0,06 % en t3 (cambio de pureza desde el 99,17 hasta el 99,10 %).
La impureza de hidantoína (VI) en RRT 1,03 no aumenta: el 0,10% tanto en t0 como en t3.
Prueba 2: Perfil no cambiado después de 24 h. Sólo RRT de la impureza especificada 0,85 (X, desconocido), no presente en t0, aumentó a un valor del 0,04 % en t3 (cambio de pureza desde el 99,18 % al 99,10 %).
La impureza de hidantoína (VI) en RRT 1,03 no aumenta: el 0,09 % tanto en t0 como en t3.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Método para escindir Fmoc de uno o más grupos amino protegidos con Fmoc, en el que el método comprende una etapa de poner en contacto los grupos amino protegidos con Fmoc con una disolución que comprende 3-(dietilamino)propilamina.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la concentración de 3-(dietilamino)propilamina en la disolución oscila entre el 5 y el 30 % en volumen o entre el 10 y el 20 % en volumen.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de 3-(dietilamino)propilamina en la disolución es del 10 % en volumen.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la disolución comprende además un disolvente seleccionado del grupo que consiste en N,N-dimetilformamida, N-metilpirrolidona, N-butilpirrolidona y mezclas de las mismas.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la disolución consiste en 3-(dietilamino)propilamina al 10 % en volumen en N,N-dimetilformamida.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la escisión del Fmoc se realiza en la síntesis de péptidos, preferiblemente en la síntesis de péptidos en fase sólida.
7. Método según la reivindicación 6, en el que el péptido comprende al menos un aminoácido ácido aspártico.
8. Método según la reivindicación 6, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en degarelix, octreotida, exenatida, etelcalcetida y glucagón.
9. Método según la reivindicación 8, en el que se prepara degarelix usando un aminoácido protegido seleccionado del grupo que consiste en Fmoc-Aph(Hor)-OH, Fmoc-Aph(PG)-OH, Fmoc-Phe(NO2)-OH y Fmoc-D-Phe(NO2)-OH, en los que PG es un grupo protector de amino seleccionado de tercbutiloxicarbonilo, formilo, aliloxicarbonilo y benciloxicarbonilo.
10. Método para la preparación de un péptido mediante síntesis de péptidos en fase sólida basada en Fmoc, en el que el método comprende una etapa de poner en contacto los grupos amino protegidos con Fmoc con una disolución que comprende 3-(dietilamino)propilamina, escindiendo de ese modo el Fmoc de uno o más grupos amino protegidos con Fmoc.
11. Método según la reivindicación 10, en el que la concentración de 3-(dietilamino)propilamina en la disolución está en el intervalo de desde el 5 hasta el 30 % en volumen o desde el 10 hasta el 20 % en volumen, o es del 10 % en volumen.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11, en el que la disolución comprende además un disolvente seleccionado del grupo que consiste en N,N-dimetilformamida, N-metilpirrolidona, N-butilpirrolidona y mezclas de las mismas.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el péptido comprende al menos un aminoácido ácido aspártico.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en degarelix, octreotida, exenatida, etelcalcetida y glucagón.
15. Uso de 3-(dietilamino)propilamina para escindir el grupo protector de amino Fmoc, en el que preferiblemente el grupo protector de amino Fmoc se emplea en la síntesis de péptidos, incluso más preferiblemente en la síntesis de péptidos en fase sólida.
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