JPWO2009014177A1 - ジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法 - Google Patents

Abstract

Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物をアミンと反応させることにより脱保護して得られる、ジベンゾフルベン及び／又はジベンゾフルベンアミン付加体を含む反応混合物を、炭素数５以上の炭化水素溶媒および該炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒（但し、アミド系有機溶媒を除く。）中で攪拌、分層させ、炭化水素溶媒層を除去することにより、脱保護後に副成するジベンゾフルベン及び／又はジベンゾフルベンアミン付加体を効率的に淘汰することができる。

Description

本発明は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）基で保護されたアミノ酸化合物の脱保護の際に副成するジベンゾフルベン誘導体を効率的に淘汰する方法等に関する。

Ｆｍｏｃ基はアミノ基の保護基であり、保護された化合物に適度な脂溶性を付与し取り扱いが容易になる、ＵＶ吸収が付与されるため反応の追跡が容易になる、中性〜酸性域で安定である、アミンとの緩和な反応条件で容易に脱保護できるなど利点が多いため、広く使用されている。特に、ペプチド合成におけるアミノ酸やペプチドのアミノ基の重要な保護基である。

Ｆｍｏｃ基を脱保護する際には、ジベンゾフルベン及び／又はジベンゾフルベンと脱保護試薬であるアミンとの付加体（以下、本明細書において「ジベンゾフルベン誘導体」と総称する場合がある。）が副成するが、特にペプチド合成においては、該ジベンゾフルベン誘導体が残留したまま次工程に進めると、９−フルオレニルメチル化などの副反応を引き起こす恐れがあるため効率的に淘汰する必要がある。しかしながら、ジベンゾフルベン誘導体は脂溶性が高いため、反応混合物の水洗などでは淘汰することができない。

ペプチド合成においてＦｍｏｃ基は、固体支持体の洗浄によりジベンゾフルベン誘導体を容易に淘汰することができる固相合成法の保護基として主に利用されている。しかし、固相法は反応が固体支持体表面に限定されるためスケールアップや反応性に課題がある。

一方、ペプチドの液相合成法では、ジベンゾフルベン誘導体の淘汰が容易ではないため、脱保護の副成物を気体（イソブテン、二酸化炭素）として淘汰できるＢｏｃ基（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）が主に利用されている。しかし、システインやメチオニンなどの含硫アミノ酸を含むペプチドを合成する際には、Ｎ末端にＢｏｃ基を使用し、アミノ酸側鎖の官能基の保護やＣ末端の保護にＢｚｌ基を組み合わせて使用する、いわゆるＢｏｃ法は、含硫アミノ酸により触媒が被毒されて接触還元によりＢｚｌ基を脱保護することができないので採用することはできず、Ｎ末端保護基としてＦｍｏｃ基の使用が望まれる場合がある。
このような背景から、スケールアップが容易であり、ペプチド医薬品などの工業的生産に適した液相法において、保護基としてＦｍｏｃ基使用した場合に、ジベンゾフルベン誘導体を効率的に淘汰できる方法の開発が望まれている。

非特許文献１には、ペプチドの液相合成においてジベンゾフルベン誘導体を淘汰するために、反応抽出物を濃縮乾固した残渣にヘキサンなどの炭化水素溶媒を加えてトリチュレートすることによりジベンゾフルベン誘導体を溶媒に溶解させ、脱保護されたペプチドを結晶として単離する方法が記載されている。
しかし、この方法は操作性が悪く、大スケールでは再現性が得られない場合もあり、工業的生産には不向きである。また、目的の脱保護されたペプチドが油状物の場合にはこの方法は用いることができず、該ペプチドが結晶化することが必要である。さらに、ペプチド鎖が短い段階ではペプチド自体が炭化水素溶媒に溶解してしまい回収率が低下するなどの問題もある。

ＷＯ０３／０１８１８８ 実験化学講座第５版、（日本国）、丸善出版社、平成１７年３月３１日発行、第１６巻、２７２頁

本発明の目的は、Ｆｍｏｃ基を保護基として使用した場合において、脱保護後に副成するジベンゾフルベン誘導体の効率的な淘汰方法を提供し、特にペプチドの液相合成において工業的製造に適用可能な方法、さらにはワンポット合成を可能とする方法に繋げる操作法を提供することである。

本発明者は上記課題を解決するため、ジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法を鋭意検討した結果、炭素数５以上の炭化水素溶媒と該炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒の分層において、ジベンゾフルベン誘導体が炭化水素溶媒層に効率的に抽出され、かつ極性溶媒層に脱保護されたアミノ酸化合物が効率的に移行して、炭化水素溶媒にはほとんど抽出されないこと、すなわち、かかる有機溶媒−有機溶媒分層から炭化水素溶媒層を除去することにより、簡便にジベンゾフルベン誘導体が淘汰できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物をアミンと反応させることにより脱保護して得られる反応混合物からジベンゾフルベン及び／又はジベンゾフルベンアミン付加体を淘汰する方法であって、該反応混合物を、炭素数５以上の炭化水素溶媒および該炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒（但し、アミド系有機溶媒を除く。）中で攪拌、分層させ、ジベンゾフルベン及び／又はジベンゾフルベンアミン付加体が溶解した炭化水素溶媒層を除去する工程を含むことを特徴とする方法。
［２］アミンが、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ピペリジン、モリホリンおよび１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７−エン（ＤＢＵ）から選ばれる、上記［１］記載の方法。
［３］アミンが、ジエチルアミンおよびジメチルアミンから選ばれる、上記［２］記載の方法。
［４］炭素数５以上の炭化水素溶媒が、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタンおよびデカリンから選ばれる少なくとも一種である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒が、アセトニトリルおよびメタノールから選ばれる少なくとも一種を含む溶媒である上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒がさらに水を含む、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物が、Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸エステルまたはＦｍｏｃ基で保護されたペプチドである、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］上記［７］記載の方法を含む、液相合成法によるペプチドの製造方法。
［９］（１）Ｃ−保護ペプチドまたはＣ−保護アミノ酸を、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸と、縮合剤の存在下縮合させる工程、および／または
（２）Ｃ−保護ペプチドまたはＣ−保護アミノ酸を、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステルと縮合させる工程
を含む上記［８］記載の方法。
［１０］上記［９］の（１）記載の工程において、さらに活性化剤を存在させる、上記［９］記載の方法。
［１１］上記［１］記載の工程で得られた中間体ペプチドを固体として単離せずに上記［９］記載の工程に供することを含む、上記［９］または［１０］記載の方法。
［１２］ワンポット合成で行う、上記［８］〜［１１］のいずれかに記載の方法。

本発明により、Ｆｍｏｃ基を脱保護した際に副成するジベンゾフルベン誘導体を簡便に淘汰する方法が提供される。該方法は、結晶のトリチュレート、濾過、洗浄などの煩雑な操作を要せず、大スケール反応にも容易に適用可能である。したがって、Ｆｍｏｃ基の工業的生産への利用が容易になり、アミノ基の保護が必要である化合物の製造法の選択肢を格段に広げることができる。
特に、本発明の方法をペプチドの液相合成法に適用した場合、ジベンゾフルベン誘導体を洗浄のみで簡便に淘汰し、さらに必要に応じて水洗、塩基性水溶液洗浄、酸性水溶液洗浄などの洗浄操作を組み合わせることで、脱保護により得られるＮ末端無保護のペプチドを簡便に精製することができる。したがって、次工程のペプチド伸長反応へそのまま繋ぐことができるので、ペプチドのワンポット合成が可能となり、工業的生産に特に好適である。

本明細書において使用される記号、略号の意味を以下に示す。
（１）Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
（２）Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
（３）Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
（４）Ｂｓｍｏｃ：１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルメトキシカルボニル
（５）Ａｌｌｏｃ：アリルオキシカルボニル
（６）Ａｃ：アセチル
（７）Ｍｅ：メチル
（８）Ｅｔ：エチル
（９）ｉＰｒ：イソプロピル
（１０）ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
（１１）Ｂｚｌ：ベンジル
（１２）Ｆｍ：９−フルオレニルメチル
（１３）Ｔｒｔ：トリチル
（１４）ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（１５）ＨＯＣｔ：６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（１６）ＨＯＡｔ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
（１７）ＨＯＯＢｔ：３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１．２．３−ベンゾトリアジン
（１８）ＨＯＳｕ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（１９）ＨＯＰｈｔ：Ｎ−ヒドロキシフタルイミド
（２０）ＨＯＮｂ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
（２１）Ｂｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール−１−イル
（２２）Ｃｔ：１−ヒドロキシ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル
（２３）Ａｔ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル
（２４）ＯＢｔ：３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１．２．３−ベンゾトリアジン−３−イル
（２５）Ｓｕ：スクシンイミドイル
（２６）Ｐｈｔ：フタルイミドイル
（２７）Ｎｂ：５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドイル
（２８）ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
（２９）ＥＤＣ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド
（３０）ＥＤＣ．ＨＣｌ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩
（３１）ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
（３２）ＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス(ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３３）ＰｙＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３４）ＰｙＢｒｏＰ：ブロモトリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３５）ＨＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３６）ＴＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート
（３７）ＨＣＴＵ：Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３８）ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３９）ＣＤＩ：カルボニルジイミダゾール
（４０）ＤＭＴ−ＭＭ：４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホニウム クロリド
（４１）ＡＡ_ｎ：アミノ酸残基（下付のｎは１以上の任意の整数であり、ペプチドＣ末端からの順番を示す。）
（４２）ＰＧ_０：ペプチドのＣ末端カルボキシル基の保護基
（４３）ＰＧ_ｎ：アミノ基の保護基（下付のｎは１以上の任意の整数であり、ＡＡ_ｎのアミノ基の保護基であることを示す。）
（４４）ＨＯＥ：活性化剤
（４５）Ｅ：活性エステル基
（４６）Ｇｌｙ：グリシン
（４７）Ａｌａ：アラニン
（４８）Ｖａｌ：バリン
（４９）Ｌｅｕ：ロイシン
（５０）Ｉｌｅ：イソロイシン
（５１）Ｍｅｔ：メチオニン
（５２）Ｐｈｅ：フェニルアラニン
（５３）Ｔｙｒ：チロシン
（５４）Ｔｒｐ：トリプトファン
（５５）Ｈｉｓ：ヒスチジン
（５６）Ｌｙｓ：リジン
（５７）Ａｒｇ：アルギニン
（５８）Ｓｅｒ：セリン
（５９）Ｔｈｒ：トレオニン
（６０）Ａｓｐ：アスパラギン酸
（６１）Ｇｌｕ：グルタミン酸
（６２）Ａｓｎ：アスパラギン
（６３）Ｇｌｎ：グルタミン
（６４）Ｃｙｓ：システイン
（６５）Ｐｒｏ：プロリン
（６６）Ｏｒｎ：オルニチン
（６７）Ｓａｒ：サルコシン
（６８）β−Ａｌａ：β−アラニン
（６９）ＧＡＢＡ：γ−アミノ酪酸
（７０）Ｄａｐ：２，３−ジアミノプロピオン酸

ＰＧ_０で示されるＣ末端カルボキシル基の保護基としては、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉＰｒ、ｔＢｕなどのアルキル基、Ｂｚｌ、Ｆｍ、Ｔｒｔ、ジフェニルメチル、1−１−ジメチルベンジル、ジメチルフェニル等が挙げられる。
ＰＧ_ｎで示されるアミノ基の保護基としては、Ｂｏｃ、Ｚ、Ｆｍｏｃ、Ｂｓｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、Ａｃ等が挙げられる。
Ｅで示される活性エステル基とは、アミノ基による求核攻撃を受けて「ＥＯ⁻」として容易に脱離し、アミド結合を生成させうる基を意味し、Ｂｔ、Ｃｔ，Ａｔ、ＯＢｔ、Ｓｕ、Ｐｈｔ、Ｎｂ、ペンタフルオロフェニル等が挙げられる。

１．ジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法
本発明のジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法は、Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物をアミンと反応させることにより脱保護して得られる反応混合物を、炭素数５以上の炭化水素溶媒および該炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒（但し、アミド系有機溶媒を除く。）中で攪拌、分層させ、ジベンゾフルベン及び／又はジベンゾフルベンアミン付加体が溶解した炭化水素溶媒層を除去する工程を含むことを特徴とする。
かかる操作により、意外なことに脱保護されたアミノ酸化合物が極性有機溶媒層に優先的に移行し、炭化水素溶媒層にはほとんど抽出されず、かつ、ジベンゾフルベン誘導体は炭化水素溶媒層に効率的に抽出されるので、抽出操作という大規模反応に適した簡便な操作のみでジベンゾフルベン誘導体を淘汰することができる。したがって、結晶化やクロマトグラフィーなどの操作によることなく、所望のアミノ酸化合物を簡便に精製または単離することができる。

なお、ＷＯ ０３／０１８１８８（特許文献１）の実施例９には、ペプチドの液相合成に際し、シクロヘキサンとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を分層させて、シクロヘキサン層からアミノ酸エステルまたはペプチドを回収する方法が記載されているが、アミノ酸エステルまたはペプチドを極性溶媒中から回収する本発明の方法とは構成が異なる。またこの方法は、アミノ酸エステルまたはペプチドを炭化水素溶媒であるシクロヘキサン層に移行させるため、脂溶性が極めて高い可溶性担体である（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オールをペプチドのＣ末端にエステル結合させている。炭化水素溶媒層にジベンゾフルベン誘導体を淘汰し、アミノ酸エステル又はペプチドを極性有機溶媒に移行させる本発明とは発想も全く異なっている。

「Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物」の「アミノ酸化合物」とは、分子内に、１級アミノ基および／または２級アミノ基、並びにカルボキシル基および／またはエステル化、チオエステル化またはアミド化されたカルボキシル基を有する化合物であって、本発明の炭化水素溶媒−極性有機溶媒の分層において極性有機溶媒層に効率的に移行するものであれば、特に限定されない。かかるアミノ酸化合物の好適な例としては、ペプチド、アミノ酸エステルが挙げられる。
ここで、ペプチド、アミノ酸エステルは、Ｎ末端としての１級アミノ基または２級アミノ基の他に、アミン性の側鎖官能基（アミノ基、インドール、グアニジン等）を有していてもよく、これらアミン性の側鎖官能基は保護基で保護されていても良い。またペプチドのＣ末端のカルボキシル基も保護されていても、保護されていなくてもよい。またペプチド、アミノ酸エステルがカルボキシル基及びアミノ基以外の側鎖官能基を有する場合、該側鎖官能基保護されていても、保護されていなくてもよい。なお、カルボキシル基が保護されている場合、（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メチルのようなペプチドの保護基としては通常使用しない極めて脂溶性が高い基でカルボキシル基等を保護すると、アミノ酸エステル又はペプチドが炭化水素溶媒層にも移行しやすくなるので適切ではない。好ましいカルボキシル基の保護基としてはメチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル等の炭素数１〜６のアルキル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ジフェニルメチル、アリルが挙げられる。

「Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物」は、アミノ酸化合物が有する第１級アミノ基および／または第２級アミノ基並びにアミン性側鎖官能基の少なくとも一つがＦｍｏｃ基で保護されていればよい。Ｆｍｏｃ基で保護されていない第１級アミノ基および／または第２級アミノ基並びにアミン性側鎖官能基は、無保護であっても、Ｆｍｏｃ基以外のアミノ基の保護基（アミン保護基）（例えば、Ｂｏｃ、Ｚ、Ｂｓｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、Ａｃ等）で保護されていてもよい。
「Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物」は、Ｎ末端アミノ基がＦｍｏｃ基で保護されており、アミン性の側鎖官能基がある場合、該アミン性の側鎖官能基はＦｍｏｃ基以外のアミン保護基で保護されている態様が好ましい。

「アミン」としては、Ｆｍｏｃ基を脱保護させる程度の求核性を有するものであれば特に限定されず、例えば、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７−エン（ＤＢＵ）等が挙げられる。
該アミンは、減圧濃縮で淘汰できる低沸点（沸点：０〜１２０℃程度）のものが好ましく、例えば、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンが好ましい。

ジベンゾフルベンとは、Ｆｍｏｃ基が脱保護する際に生成する副生成物である。ジベンゾフルベンアミン付加体とは、脱保護に用いたアミンが第２級アミンの場合に、ジベンゾフルベンに付加した化合物を意味する。これらをまとめて「ジベンゾフルベン誘導体」と総称するのは、前記で述べたとおりである。

「ジベンゾフルベン誘導体の淘汰」とは、脱保護によって得られるアミノ酸化合物とジベンゾフルベン誘導体を含む反応混合物から、洗浄、結晶化その他精製操作によってジベンゾフルベン誘導体を除くことを意味する。

「炭素数５以上の炭化水素溶媒」としては、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、デカリン、ナフタレンまたはこれらの混合溶媒が挙げられ、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタンが好ましい。混合溶媒とする場合は、任意の割合で混合することができる。炭素数が４以下の炭化水素溶媒は極性溶媒と混和しやすい。炭素数の上限は特に限定はないが、溶媒の留去等の取り扱いやすさ、溶媒としての存在性を考慮すると、炭素数２０以下のものが好ましい。

「炭素数５以上の炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒」は、当該性質を有するものから制限なく選択することができるが、但し、当該極性有機溶媒にアミド系有機溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ））などは含まれない。アミド系有機溶媒を用いた場合でも、炭化水素溶媒と分層させることができるが、ジベンゾフルベン誘導体が炭化水素溶媒層に効率的に分配されにくいので、アミド系有機溶媒層を炭化水素溶媒で数多く洗浄する必要があり効率が悪い（後掲比較例５、６参照）。また、アミド系有機溶媒は比較的高沸点であるために高温で留去しなければならず、効率が悪く、脱保護されたアミノ酸化合物が分解する恐れもある。さらには、水洗でアミド系有機溶媒を除く場合でも、酢酸エチル、ジエチルエーテルなどを用いた抽出操作を行わなければならず、煩雑である。
かかる極性有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、アセトン等またはそれらの混合溶媒が挙げられ、アセトニトリルまたはメタノールが好ましい。混合溶媒とする場合は、任意の割合で混合することができる。

本発明のジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法は、具体的には、まず、
（１）Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物とアミンを、有機溶媒中で混合し、アミノ酸化合物とジベンゾフルベン誘導体を含む反応混合物を得、次いで
（２）該反応混合物を炭化水素溶媒および極性有機溶媒中で攪拌後、静置して分層させ、炭化水素溶媒を除去することにより行うことができる。

アミンの使用量は、Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物に対して、通常２〜１００当量、好ましくは５〜２０当量である。この範囲より少ないと、未反応のＦｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物が残りやすく、多いとアミンが淘汰困難になりやすい。

脱保護反応の溶媒としては、脱保護反応を阻害しない溶媒であればいずれでもよく、脱保護の対象となるＦｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物にもよるが、例えば、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、クロロホルムなどまたはそれらの混合溶媒が挙げられる。混合溶媒とする場合は、任意の割合で混合することができる。溶媒の使用量は、Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物に対して、通常３〜１００倍重量であり、好ましくは５〜２０倍重量である。

反応温度は、脱保護の対象となるＦｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物にもよるが、通常０〜４０℃、好ましくは５〜３０℃の範囲内である。反応時間は、上記温度範囲内で、通常１〜２０時間である。

反応終了後、反応液を濃縮することにより、アミノ酸化合物とジベンゾフルベン誘導体を含む混合物を得ることができる。低沸点のアミンを用いた場合には、当該濃縮操作によってアミンを淘汰することができる。
このようにして得られた該混合物に極性有機溶媒と炭化水素溶媒を加え、攪拌後、静置して、極性有機溶媒と炭化水素溶媒を分層させることができる。
あるいは、脱保護反応に本発明の極性有機溶媒および／または炭化水素溶媒を使用した場合は、濃縮することなく、必要に応じて極性有機溶媒および／または炭化水素溶媒を追加して、攪拌後、静置して、極性有機溶媒と炭化水素溶媒を分層させることができる。
この際に、加熱により極性有機溶媒と炭化水素溶媒を均一系にした後に冷却して分層させてもよいが、操作が煩雑であり、攪拌、静置のみで本発明の効果を十分奏することができるので、加熱と冷却を伴う操作は不要である。

極性有機溶媒は、炭化水素溶媒との分層性を向上させたり、ジベンゾフルベン誘導体除去率、目的物の極性有機溶媒層への抽出率を向上させるためにさらに水を添加しても良い。水の含有量は、極性有機溶媒に対して１〜５０％（ｖ／ｖ）が好ましい。水の含有量がこの範囲より多い場合はＦｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物の抽出効率が低下する場合がある。
極性有機溶媒の使用量は、本発明の効果を損なわないかぎり特に限定はないが、Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物の濃度が極性有機溶媒に対して０．５〜３０％（ｗ／ｖ）となる範囲から適宜選択すればよい。

炭化水素溶媒の使用量は、本発明の効果を損なわないかぎり特に限定はないが、ジベンゾフルベン誘導体の濃度が炭水化物溶媒に対して０．２〜３％（ｗ／ｖ）となる範囲から適宜選択すればよい。

（極性有機溶媒）／（炭化水素溶媒）比（ｖ／ｖ）は、本発明の効果を損なわないかぎり特に限定はないが、好ましくは１／１０〜１／０．２であり、より好ましくは１／３〜１／０．５である。

攪拌、静置後、炭化水素溶媒層を除去することにより、ジベンゾフルベン誘導体を淘汰することができる。極性有機溶媒層にさらに炭化水素溶媒を加え、攪拌、静置後および炭化水素溶媒層除去の操作を複数回繰り返すことによって、極性有機溶媒層に残留したジベンゾフルベン誘導体をさらに淘汰することができる。
極性有機溶媒層を濃縮することにより、ジベンゾフルベン誘導体が淘汰されたアミノ酸化合物を含有する粗製物を得ることができる。この段階でアミノ酸化合物が単離できる場合もあるが、ジベンゾフルベン誘導体以外の不純物（例えば、脱保護に使用したアミンなど）が含まれる場合には、自体公知の単離精製操作（水洗、塩基性または酸性水溶液洗浄など）を組み合わせることにより、所望のアミノ酸化合物を単離することができる。

２．ペプチド液相合成法
アミノ酸化合物がペプチドまたはアミノ酸エステルである場合、本発明のジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法は、ペプチドの液相合成法に好適に適用できる。以下、本発明のジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法をペプチドの液相合成法に適用した一態様（以下、本明細書において、「本発明のペプチド液相合成法」という。）について説明するが、本発明がこれに限定されないことはいうまでもない。

２−１．用語の説明
本発明のペプチド液相合成法に使用される用語の意義について説明する。
本発明のペプチド液相合成法において「Ｆｍｏｃ基で保護されたペプチドまたはアミノ酸エステル」の脱保護は、ペプチドの液相合成法に含まれるＦｍｏｃ基の脱保護であれば、特に限定されない。例えば、後掲のＮ末端脱保護工程であってもよいし、最終脱保護における側鎖アミノ基の脱保護であってもよい。好ましくは、後掲のペプチド伸長反応において、次工程のカップリングの対象となるアミノ基を生成させる脱保護である。
本発明のペプチド液相合成法においてアミノ酸を「Ｈ−ＡＡ−ＯＨ」と表示した場合は、左側がアミノ基、右側がカルボキシル基であることを意味し、アミノ基およびカルボキシル基がそれぞれ保護されていないことを意味する。
この場合において、例えば、カルボキシル基が保護されている場合は、「Ｈ−ＡＡ−ＯＰＧ_０」と表示され、アミノ基が保護されている場合は、「ＰＧ_ｎ−ＡＡ−ＯＨ」と表示される。
アミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基が活性エステル化されている場合は、「ＰＧ_ｎ−ＡＡ−ＯＥ」と表示される。
ＰＧ_ｎ−ＡＡ−ＯＨの対称酸無水物は、「（ＰＧ_ｎ−ＡＡ）_２−Ｏ」と表示される。
アミノ酸が側鎖官能基を有する場合に、該官能基が保護されている場合は、「Ｈ−ＡＡ（ＰＧ）−ＯＨ」（ＰＧは側鎖官能基の保護基を示す）と表示される。

本発明のペプチド液相合成法においてペプチドを「Ｈ−ＡＡ_ｎ’−ＡＡ_ｎ’−１−・・・−ＡＡ_１−ＯＨ」（下付けのｎ’は２以上の任意の整数を示す。）と表示した場合は、左側がＮ末端、右側がＣ末端であり、Ｎ末端およびＣ末端がそれぞれ保護されていないアミノ酸残基をｎ’個有するペプチドであることを意味する。ここで、Ｎ末端とはアミノ酸残基のα位アミノ基に限定されず、ペプチド伸長が側鎖アミノ基（例えば、Ｌｙｓのεアミノ基）を介して行われる場合は、当該側鎖アミノ基もＮ末端に含まれる。以下、同様。
この場合において、例えば、Ｃ末端が保護されている場合は、「Ｈ−ＡＡ_ｎ’−ＡＡ_ｎ’−１−・・・−ＡＡ_１−ＯＰＧ_０」と表示し、さらにＮ末端が保護されている場合は、「ＰＧ_ｎ’−ＡＡ_ｎ’−ＡＡ_ｎ’−１−・・・−ＡＡ_１−ＯＰＧ_０」と表示するものとする。

本発明のペプチド液相合成法により合成されるペプチドの構成単位となるアミノ酸残基としては、天然アミノ酸または非天然アミノ酸が特に限定されることなく含まれ、また、それらのＬ体あるいはラセミ体も包含される。
天然アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｏｒｎ、Ｓａｒ、β−Ａｌａ、ＧＡＢＡ等が挙げられる。
非天然アミノ酸としては、Ｄａｐ等が挙げられる。
また、当該アミノ酸が側鎖に官能基を有する場合に、該官能基を保護基により保護したアミノ酸とすることもできる。かかる側鎖保護アミノ酸としては、例えば、Ｇｌｕのγ位又はＡｓｐのβ位のカルボキシル基をベンジル基で保護したγ-Ｂｚｌ−Ｇｌｕ又はβ−Ｂｚｌ−Ａｓｐ；、Ｇｌｕのγ位又はＡｓｐのβ位のカルボキシル基をｔｅｒｔ−ブチル基で保護したγ−ｔＢｕ−Ｇｌｕ又はβ−ｔＢｕ−Ａｓｐ；Ｌｙｓのεアミノ基を保護したε−Ｚ−Ｌｙｓ、ε−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ、ε−ｉＰｒ−ε−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ；ＣｙｓのＳＨ基をフェニルカルバモイル基で保護したＳ−フェニルカルバモイル−Ｃｙｓ；ＣｙｓのＳＨ基をトリチル基で保護したＳ−Ｔｒｔ−Ｃｙｓ；Ｔｙｒ及びＳｅｒの水酸基の酸素をＢｚｌで保護した誘導体等が挙げられる。

本発明のペプチド液相合成法において「Ｎ−保護アミノ酸」とは、アミノ基が保護されており、カルボキシル基が無保護のアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「ＰＧ_ｎ−ＡＡ−ＯＨ」と表示される。
本発明のペプチド液相合成法において「Ｎ−保護アミノ酸活性エステル」とは、アミノ基が保護され、カルボキシル基がＥにより活性エステル化されたアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「ＰＧ_ｎ−ＡＡ−ＯＥ」と表示される。
なお、Ｎ−保護アミノ酸活性エステルとして単離可能なものは、Ｅがペンタフルオロフェニル、ＳｕまたはＮｂであるものであり、その他のＮ−保護アミノ酸活性エステルは、Ｎ−保護アミノ酸を縮合剤（例えば、ＥＤＣ）および活性化剤（例えば、ＨＯＢｔ）と反応させることにより、反応系中で生成される。

本発明のペプチド液相合成法において「Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸」とは、アミノ基がＦｍｏｃで保護されており、カルボキシル基が無保護のアミノ酸残基を意味し、上記表記法によれば、「Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ」と表示される。
本発明のペプチド液相合成法において「Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステル」とは、アミノ基がＦｍｏｃで保護され、カルボキシル基がＥにより活性エステル化された任意のアミノ酸残基を意味し、上記表記法によれば、「Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＥ」と表示される。
Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステルとして単離可能なものは、Ｅがペンタフルオロフェニル、ＳｕまたはＮｂであるものであり、その他のＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステルは、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸を縮合剤（例えば、ＥＤＣ）および活性化剤（例えば、ＨＯＢｔ）と反応させることにより、反応系中で生成される。

本発明のペプチド液相合成法において「Ｃ−保護ペプチド」とは、Ｃ末端が保護されており、Ｎ末端が保護されていない任意の個数のアミノ酸残基を有するペプチドを意味し、上記表記法によれば、「Ｈ−ＡＡ_ｎ’−ＡＡ_ｎ’−１−・・・−ＡＡ_１−ＯＰＧ_０」（ｎ’は２以上の整数を示す）と表示される。
本発明のペプチド液相合成法において「Ｃ−保護アミノ酸」とは、カルボキシル基が保護されており、アミノ基が保護されていないアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「Ｈ−ＡＡ−ＯＰＧ_０」と表示される。
本発明のペプチド液相合成法において「Ｎ，Ｃ−ジ保護ペプチド」とは、Ｎ末端とＣ末端の両方が保護されている任意の個数のアミノ酸残基を有するペプチド意味し、上記表記法によれば、「ＰＧ_ｎ’−ＡＡ_ｎ’−ＡＡ_ｎ’−１−・・・−ＡＡ_１−ＯＰＧ_０」（ｎ’は２以上の整数を示す）と表示される。また、例えば、Ｎ末端がＦｍｏｃで保護されていて、Ｃ末端が保護されているＮ，Ｃ−ジ保護ペプチドは「Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護ペプチド」と表示するものとする。
本発明のペプチド液相合成法において「中間体ペプチド」とは、ペプチド液相合成における各工程で得られる合成中間体であるペプチドであって、最終的に目的とするペプチドよりアミノ酸残基数が少ないものを意味する。好ましい中間体ペプチドは、後掲のＮ末端脱保護後に得られるＣ−保護ペプチドである。

本発明のペプチド液相合成法において「縮合剤」としては、ＤＣＣ、ＥＤＣ（塩酸塩およびフリー体を含む。）、ＤＩＣ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒｏＰ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＣＤＩ、ＤＭＴ−ＭＭ等が挙げられる。
本発明のペプチド液相合成法において「活性化剤」とは、縮合剤との共存化でカルボキシル基を活性エステル、対称酸無水物などに導いてアミド結合を形成させやすくする試薬であり、「ＨＯＥ」で示される。具体的には、ＨＯＢｔ、ＨＯＣｔ、ＨＯＡｔ、ＨＯＯＢｔ、ＨＯＳｕ、ＨＯＰｈｔ、ＨＯＮＢ、ペンタフルオロフェノール等が挙げられる。

本発明のペプチド液相合成法において「ワンポット合成」とは、ペプチドの液相合成法において、各工程で得られる中間体ペプチドを反応容器から取り出さずに目的とするペプチドまで合成することを意味する。

２−２．ペプチド液相合成法
本発明のペプチド液相合成法により最終的に合成されるペプチドは特に限定されるものはないが、合成医薬ペプチド、化粧品、電子材料（有機ＥＬなど）、食品などの合成に好適に利用可能である。
該ペプチドの構成アミノ酸残基数は特に限定されないが、一般的な合成ペプチドにみられる２〜２０残基程度が好適である。
また、本発明のペプチド液相合成法は、アミノ酸側鎖官能基および／またはＣ末端保護基が酸で脱保護される保護基で保護されたＣ−保護ペプチド（例えば、ε−Ｂｏｃ−Ｌｙｓなどを含むペプチド）を使用したペプチド液相合成法などに適している。

「ペプチドの液相合成法」とは、固相法ではないことを意味し、全ての試薬が溶媒に溶解している場合の他、試薬の全部または一部が溶媒に溶解せず、懸濁などしているいわゆる不均一反応も本発明の方法に含まれる。

ペプチドの液相合成法は、ペプチド合成化学で常用される一般的な方法を特に制限なく採用することができる。
具体的には、下記スキームに示す方法、すなわち、
（１）Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ’）（ｎ’は、２以上の任意の整数を示し、アミノ酸残基がｎ’個のペプチドであることを意味する。以下、同様。）または一回目のペプチド伸長においてはＣ−保護アミノ酸（Ａ_１）（以下、本明細書において「Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等」（ｎは、１以上の任意の整数を示し、ｎが１の場合は、Ｃ−保護アミノ酸（Ａ_１）を意味する。以下、同様。）と総称する。）を、Ｎ−保護アミノ酸（ＰＡ_ｎ＋１）と、縮合剤（および好ましくは活性化剤）の存在下、縮合させるか、あるいは
（２）Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等を、Ｎ−保護アミノ酸活性エステル（ＰＡＥ_ｎ＋１）と縮合させて、
アミノ酸残基が一つ伸長したＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（ＰＰ_ｎ＋１）を得る工程（以下、本明細書においてそれぞれ「カップリング工程（１）」および「カップリング工程（２）」という。）、
得られたＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（ＰＰ_ｎ＋１）のアミノ保護基を脱保護してＣ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ＋１）を得る工程（以下、本明細書において「Ｎ末端脱保護工程」という。）を１サイクルとする反応（以下、本明細書において「ペプチド伸長反応」という。）の繰り返しからなる方法であり、
最終段階で、Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｍ）のカルボキシ保護基および側鎖官能基が保護されている場合は当該保護基を脱保護することにより（以下、本明細書において「最終脱保護工程」という。）、目的のペプチド（Ｐ）が得られる。
本発明のペプチド合成法において、ｎ番目のペプチド伸長反応を「ペプチド伸長反応（ｎ）」、ペプチド伸長反応（ｎ）を構成する各工程をそれぞれ「カップリング工程（１−ｎ）」、「カップリング工程（２−ｎ）」および「Ｎ末端脱保護工程（ｎ）」と表示するものとする。

（式中、ｍは目的とするペプチドのアミノ酸残基数を示し、他の記号は上記で定義した通りである。）
本発明は、一連のペプチド伸長反応の少なくとも一回で、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸を使用してカップリング工程（１）を行うか、またはＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステルを使用してカップリング工程（２）を行いＮ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護ペプチドを得、
続くＮ末端脱保護工程でＮ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護ペプチドをアミンと反応させることにより脱保護して、Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ＋１）とジベンゾフルベン誘導体を含む混合物を得、その後のワークアップにおいて、該混合物を極性有機溶媒と炭化水素溶媒中で分層させて、ジベンゾフルベン誘導体が溶解した炭化水素溶媒層を除去することを特徴とする（以下、「本発明のペプチド伸長反応」といい、ｎ回目のペプチド伸長反応を「本発明のペプチド伸長反応（ｎ）」と表示する。）。
本発明のペプチド液相合成法において、少なくとも１回、本発明のペプチド伸長反応が含まれていればよいが、全ての工程を本発明のペプチド伸長反応で行うことが好ましく、それにより目的のペプチドまでワンポットで合成することができる。
以下に、本発明のペプチド伸長反応（ｎ）のスキームを示す。

（式中、ＤＢＦはジベンゾフルベンを、ＤＢＦＡはジベンゾフルベンアミン付加体を示し、ＮＲ_２は、脱保護に使用したアミン（第２級アミンの場合）に相当し、その他の記号は前記と同義である。）

Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ＋１）とジベンゾフルベン誘導体を含む混合物を極性有機溶媒と炭化水素溶媒中で分層させることにより、意外なことにＣ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ＋１）は極性有機溶媒層に優先的に移行し、炭化水素溶媒層にはほとんど抽出されず、かつ、ジベンゾフルベン誘導体は炭化水素溶媒層に効率的に抽出されるので、抽出操作という大規模反応に適した簡便な操作のみでジベンゾフルベン誘導体を淘汰することができる。したがって、結晶化やクロマトグラフィーなどの単離精製操作をすることなく、得られたＣ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ＋１）を次のペプチド伸長反応（ｎ＋１）に供することができ、ワンポット合成に繋げることができる。

以下に、本発明のペプチド液相合成法について詳述する。
２−２−１．カップリング工程（１）
本発明のペプチド伸長反応のカップリング工程（１）においては、例えば、溶媒中において、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸（ＦＡ_ｎ＋１）、Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等および縮合剤を（好ましくは、活性化剤と共に）混合することによって一つアミノ酸残基が伸長したＮ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＦＰ_ｎ＋１）が得られる。添加順序は特に限定はないが、Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等が一つ前のペプチド伸長反応（ｎ−１）によって得られたものである場合は、反応容器中のＣ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等の溶液にＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸（ＦＡ_ｎ＋１）および縮合剤を添加すればよい。

Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸（ＦＡ_ｎ＋１）の使用量は、Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等に対して、通常０．９〜４．０当量、好ましくは１．０〜１．５当量である。この範囲より少ないと、未反応のＣ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等が残りやすく、多いと過剰のＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸（ＦＡ_ｎ＋１）を除去しにくくなる。

Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等を酸付加塩として使用した場合には中和するため、塩基が添加される。該塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリンなどが挙げられる。該塩基の使用量は、Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等に対して、通常０．５〜２．０当量、好ましくは１．０〜１．５当量である。塩基の使用量がこの範囲より少ないと中和が不十分となり反応が進行しにくくなる。

縮合剤は上記で例示したものを特に制限なく使用することができ、ＥＤＣ（フリー体または塩酸塩）、ＤＩＣ、ＤＣＣ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＤＭＴ−ＭＭが挙げられ、ＥＤＣが、残留した縮合剤や縮合剤の分解物を洗浄により淘汰することが容易であるため好ましい。縮合剤の使用量は、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸（ＦＡ_ｎ＋１）に対して通常０．８〜４．０当量、好ましくは１．０〜１．５当量である。

カップリング工程（１）において、反応を促進し、ラセミ化などの副反応を抑制するために、好ましくは、活性化剤が添加される。活性化剤を存在させた場合は、反応系中で一時的にＮ−保護アミノ酸の活性エステルなどが生成する。
活性化剤は上記で例示したものを制限無く使用することができ、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ、ＨＯＣｔ、ＨＯＡｔ、ＨＯＮｂ、ＨＯＳｕ等が好ましい。活性化剤の使用量は、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸（ＦＡ_ｎ＋１）に対して通常、０〜４．０当量、好ましくは０．１〜１．５当量である。

溶媒としては、本反応を阻害しない溶媒であればいずれでもよく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、酢酸エチル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、クロロホルム、塩化メチレンなどまたはそれらの混合溶媒が挙げられ、酢酸エチルまたはＤＭＦが好ましい。溶媒の使用量は、Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等に対して、通常３〜１００倍重量であり、好ましくは５〜２０倍重量である。

反応温度は、通常−２０〜４０℃、好ましくは０〜３０℃の範囲内である。反応時間は、上記温度範囲内で、通常０．５〜３０時間である。

カップリング工程（１）反応終了後のワークアップは、カップリング工程（２）と同様であるので、後掲の２−２−３においてまとめて説明する。

２−２−２．カップリング工程（２）
本発明のペプチド伸長反応のカップリング工程（２）においては、例えば、溶媒中において、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステル（ＦＡＥ_ｎ＋１）およびＣ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等を混合することによってＮ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＦＰ_ｎ＋１）が得られる。添加順序は特に限定はないが、Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等が一つ前のペプチド伸長反応（ｎ−１）によって得られたものである場合は、反応容器中のＣ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等の溶液にＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステル（ＦＡＥ_ｎ＋１）を添加すればよい。

Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステル（ＦＡＥ_ｎ＋１）の使用量はカップリング工程（１）におけるＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸（ＦＡ_ｎ＋１）と同様である。
また、塩基、溶媒およびその使用量、反応温度、反応時間等のその他の反応条件は、カップリング工程（１）と同様である。

２−２−３．カップリング工程（１）および（２）のワークアップ
カップリング工程（１）および（２）の反応終了後、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステル（ＦＡＥ_ｎ＋１）、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸のイソウレアエステル、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸の対称酸無水物などのアミン成分と縮合しうる反応混合物中の残留物や副生成物を淘汰するため、チオール基担持シリカゲル等の固相求核剤除去試薬（例えば、ＳＨシリカ、ＮＨシリカ（富士シリシア化学（株）製）など）を加え、攪拌後、濾去してもよい。また、洗浄工程にて、炭酸ナトリウムなど弱アルカリ性の水溶液で洗浄して、積極的に活性エステルを失活させてもよい。

カップリング工程（１）および（２）のワークアップでは、好ましくは、酸性水溶液洗浄および／または塩基性水溶液洗浄が行われる。酸性水溶液洗浄により、Ｃ−保護ペプチド、残留した縮合剤またはその分解物、塩基などを水層に淘汰することができる。塩基性水溶液洗浄により、活性化剤、残留したＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸などを水層に淘汰することができる。

酸性水溶液洗浄は、例えば、反応混合物を希塩酸水溶液（例えば、１Ｎ塩酸水溶液）、硫酸、ギ酸、クエン酸、リン酸などの水溶液と攪拌後、分液して水層を除去することにより行われる。

塩基性水溶液洗浄は、例えば、反応混合物を炭酸水素ナトリウム水溶液（例えば、５％炭酸水素ナトリウム水溶液）、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液などの水溶液と攪拌後、分液して水層を除去することにより行われる。

必要に応じてさらに水洗し、有機層を濃縮することにより、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＦＰ_ｎ＋１）を得ることができ、そのまま容器から取り出すことなく、Ｎ末端脱保護工程に供することができる。また、濃縮することなく、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＦＰ_ｎ＋１）の溶液としてＮ末端脱保護工程に用いてもよい。

本発明のペプチド液相合成法において、Ｆｍｏｃ以外のアミン保護基を使用するカップリング工程が含まれる場合も、上記と同様に行えばよい。

２−２−４．Ｎ末端脱保護工程
本発明のペプチド伸長反応におけるＮ末端脱保護工程においては、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＦＰ_ｎ＋１）を、溶媒中、アミンと反応させることによりＣ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ＋１）が得られる。具体的には、カップリング工程で得られたＮ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＦＰ_ｎ＋１）の溶液中にアミンを添加すればよい。
該脱保護反応によって得られる、Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ＋１）とジベンゾフルベン誘導体の混合物を炭素数５以上の炭化水素溶媒および該炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒（但し、アミド系有機溶媒を除く。）中で攪拌、分層させ、炭化水素溶媒層を除去することにより、ジベンゾフルベン誘導体を淘汰することができる。
伸長反応開始時はＣ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ）等がＣ−保護アミノ酸となる。該Ｃ−保護アミノ酸の調製は以下のようにして行うことができる。すなわちＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸のカルボキシル基を常法によりエステル化し、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護アミノ酸を得る。上記と同様、得られたＮ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護アミノ酸を、溶媒中、アミンと反応させることによりＣ−保護アミノ酸（アミノ酸エステル）が得られる。上記と同様に、該脱保護反応によって得られる、Ｃ−保護アミノ酸とジベンゾフルベン誘導体の混合物を炭素数５以上の炭化水素溶媒および該炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒（但し、アミド系有機溶媒を除く。）中で攪拌、分層させ、炭化水素溶媒層を除去することにより、ジベンゾフルベン誘導体を淘汰することができる。かかるＮ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護アミノ酸のＦｍｏｃ基の脱保護も、ここでいうＮ末端脱保護工程に含まれる。

本発明のペプチド液相合成法におけるＮ末端脱保護工程は、上記１の「ジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法」において、「Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物」を「Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＦＰ_ｎ＋１）」又は「Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｃ−保護アミノ酸」に、「アミノ酸化合物」を「Ｃ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ＋１）」又は「Ｃ−保護アミノ酸」にそれぞれ読み代えて、同様に行うことができる。
Ｎ末端脱保護工程により単離されたＣ−保護ペプチド（Ｐ_ｎ＋１）の溶液を濃縮するか、または濃縮することなく、次のペプチド伸長反応にそのまま用いることができる。

本発明のペプチド合成において、Ｆｍｏｃ以外のＮ末端保護基を使用したＮ末端脱保護工程が含まれる場合は、ペプチド合成化学で常用されるアミノ基保護基の種類に応じた一般的なＮ−末端脱保護方法により行えばよい。
以上のように、本発明の方法により、Ｎ末端脱保護工程において、Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物をアミンと反応させることにより脱保護して得られる反応混合物からジベンゾフルベン及び／又はジベンゾフルベンアミン付加体を簡便に淘汰できるため、ペプチドの液相合成法において、次の縮合工程、すなわち次のペプチド伸長反応を、中間体ペプチドを反応容器から取り出すことなく行うことができる。すなわち、得られた中間体ペプチドを晶析等により固体として単離せずに次の縮合工程を行うことができる。このように、本発明の方法によれば、ペプチドの液相合成法により、目的とする最終ペプチドをワンポット合成することが可能である。

２−２−５．最終脱保護工程
本発明のペプチド合成で、目的のペプチドまで構築されたＣ−保護ペプチド（Ｐ_ｍ）のＰＧ_０や側鎖保護基を脱保護することにより、目的のペプチド（Ｐ）を得ることができる。
最終脱保護工程は、ＰＧ_０または側鎖保護基の種類に応じた自体公知の脱保護法を特に制限なく採用することができる。
例えば、Ｍｅ、Ｅｔなどの低級アルキル基の場合は、水又は水性有機溶媒などの溶媒中、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基と、−２０〜４０℃で、０．５〜１０時間反応させることができる。
ｔＢｕの場合は、クロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチル、ジオキサンなどの溶媒中、トリフルオロ酢酸、塩酸、メタンスルホン酸、トシル酸、ギ酸などの酸と、−２０〜４０℃で、０．５〜１０時間反応させることにより脱保護することができる。
Ｂｚｌの場合は、メタノール、ＤＭＦ、酢酸などの溶媒中、パラジウム炭素などの触媒を用いて、０〜４０℃で、０．５〜１００時間、水素化反応させるか、あるいはフッ化水素、トリフルオロメタンスルホン酸などの強酸と、−２０〜４０℃で、０．５〜１０時間反応させることにより脱保護することができる。
Ａｌｌｏｃ基の場合は、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム等の０価パラジウム均一系触媒と反応させる。０価パラジウム均一系触媒は、０．０１〜１．０当量、好ましくは、０．０５〜０．５当量使用される。
最終脱保護工程において、Ｆｍｏｃ基で保護された側鎖アミノ基を脱保護する場合も、Ｎ末端脱保護工程と同様にワークアップにおいて本発明のジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法が適用できる。

本発明の方法により、合成されたペプチド（Ｐ）は、ペプチド化学で常用される方法に従って単離精製することができる。例えば、Ｃ末端脱保護工程のワークアップにおいて、反応混合物を抽出洗浄、晶析、クロマトグラフィーなどによって、ペプチド（Ｐ）を単離精製することができる。

以下、本発明について、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
ＨＰＬＣ分析は以下の条件で行った。
カラム：ＹＭＣ-Ｐａｃｋ １５０ｍｍ ｘ４．６ｍｍ １２ｎｍ ５μｍ
移動相：０．１％ ＴＦＡａｑ．／ ０．１％ＴＦＡ−ＭｅＣＮ

参考例１
Ｈ−Ａｌａ−ＯｔＢｕ．ＨＣｌ （１．００ ｇ， ５．５０ ｍｍｏｌ）をＤＭＦ （１０ ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（０．８０ ｍｌ， ５．７８ ｍｍｏｌ）を加え、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ （２．２４ ｇ， ５．７８ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．１５ｇ， １．１ ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下でＥＤＣ．ＨＣｌ（１．２１ ｇ， ６．０６ ｍｍｏｌ）を添加して室温で３時間攪拌した。反応液を５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し有機層を濃縮し、残渣にヘキサンを加えて析出物を濾取して減圧乾燥して、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕ （２．８０ ｇ，５．４４ ｍｍｏｌ）を得た。

参考例２
Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯｔＢｕ．ＨＣｌ （６．１１ ｇ， １３．４０ ｍｍｏｌ）をＡｃＯＥｔ （６５ ｍｌ）と１０％炭酸ナトリウム水溶液（６５ ｍｌ）を加えて分層させ、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層に、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（５．５０ ｇ， １３．４０ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１．８１ｇ， １３．４０ ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下でＥＤＣ．ＨＣｌ（２．８３ ｇ， １４．７４ ｍｍｏｌ）を添加して室温で３時間攪拌した。反応液にＡｃＯＥｔ （６５ ｍｌ）を加え、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し、有機層を濃縮した。残渣にヘキサンを加えて析出物を濾取して減圧乾燥して、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯｔＢｕ （１０．３５ ｇ， １２．７５ ｍｍｏｌ）を得た。

実施例１
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕ （０．５０ ｇ， ０．９７ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ ｍｌ）に溶解し、ジエチルアミン（１．０２ ｍｌ， ９．７２ ｍｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。反応液を濃縮乾固し、９０％アセトニトリル水（８ ｍｌ）に溶解し、ヘプタン（８ ｍｌ）で３回洗浄した。ＨＰＬＣ分析したところ、ヘプタン層には目的物のＨ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕは検出されず、フルベン誘導体の反応液からヘプタン層への除去率は９３％であった。

実施例２
Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯｔＢｕ （０．７０ ｇ， ０．８６ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１２ ｍｌ）に溶解して、ジエチルアミン（０．６４ ｍｌ）を加え室温下にて２時間攪拌した。反応液を減圧濃縮して残査をアセトニトリル（１２ ｍｌ）を加えて溶解し、ヘプタン（７ ｍｌ）にて３回洗浄した。アセトニトリル層を濃縮し、残渣をＨＰＬＣ分析した。Ｈ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯｔＢｕ （０．５０ ｇ， ０．８５ ｍｍｏｌ）を得た。ＨＰＬＣ分析したところ、フルベン誘導体の反応液からヘプタン層への除去率は８１％であった。目的物はヘプタン層に検出されなかった。

実施例３
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕ （０．２５ ｇ， ０．４９ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ ｍｌ）に溶解して、ジエチルアミン（１．０２ ｍｌ）を加え室温下にて２時間攪拌した。反応液を減圧濃縮して残査を９０％アセトニトリル水（３ ｍｌ）で溶解して、ヘキサン（４ ｍｌ）にて３回洗浄した。ＨＰＬＣ分析したところ、ヘキサン層にはＨ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕは検出されず、フルベン誘導体の反応液からのヘキサン層への除去率は８５％であった。

実施例４
上記実施例３と同様の操作を行い、洗浄溶媒をヘキサンの代わりにオクタン（４ ｍｌ）のみ変えて実施した。ＨＰＬＣ分析したところ、オクタン層にはＨ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕは検出されず、フルベン誘導体の反応液からのオクタン層への除去率は９５％であった。

実施例５
上記実施例３と同様の操作を行い、洗浄溶媒をヘキサンの代わりにデカリン（４ ｍｌ）のみ変えて実施した。ＨＰＬＣ分析したところ、デカリン層にはＨ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕは検出されず、フルベン誘導体の反応液からのオクタン層への除去率は９３％であった。

実施例６
上記実施例３と同様の操作を行い、ヘキサン−９０％アセトニトリル水の代わりに、ヘプタン−メタノール(４ ｍｌ）のみ変えて実施した。ＨＰＬＣ分析したところ、ヘプタン層にはＨ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕは検出されず、フルベン誘導体の反応液からのオクタン層への除去率は８６％であった。

実施例７
Ｈ−Ａｌａ−ＯｔＢｕ．ＨＣｌ （０．５０ ｇ， ２．２５ ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（０．４０ ｍｌ， ２．８９ ｍｍｏｌ）を加え、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ （１．１２ ｇ， ２．８９ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．７５ ｇ， ０．５５ ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下でＥＤＣ．ＨＣｌ（０．６０ ｇ， ３．０３ ｍｍｏｌ）を添加して室温で３時間攪拌した。反応液にＳＨシリカ（０．７０ ｇ）加えて、３０分攪拌した後、濾過した。濾液に酢酸エチル（１０ ｍｌ）を加え、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し有機層を濃縮した。残渣にアセトニトリル（１０ ｍｌ）を加えて、ジエチルアミン（２ｍｌ）を加え室温下にて攪拌した。反応液をヘプタン（１５ ｍｌ）にて３回洗浄した。ＨＰＬＣ分析したところ、ヘプタン層にはＨ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕは検出されず、フルベン誘導体の反応液からの除去率は９３％であった。
得られたアセトニトリル層にＨＯＢｔ （０．０４ ｇ， ０．２７ ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ （１．１１ ｇ， ２．８９ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下でＨＣｌ．ＥＤＣ （０．６１ ｇ， ３．０３ ｍｍｏｌ）を添加して３時間攪拌した。反応液にＳＨシリカ（０．７０ ｇ）加えて、３０分攪拌した後、濾過して濾液に酢酸エチル（３０ｍｌ）を加え、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し、有機層を濃縮して、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕ（１．３２ ｇ， ２．００ ｍｍｏｌ）を得た。

実施例８
Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯｔＢｕ （１１．７８ ｇ，１．４５ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１２０ ｍｌ）に溶解して、ジエチルアミン（１５．１ ｍｌ）を加え室温下にて２時間攪拌した。反応液を減圧濃縮して、酢酸エチル（３０ ｍｌ）を加えて再度濃縮した。残査を９０％アセトニトリル（１８０ ｍｌ）を加えて溶解し、ヘプタン（１８０ ｍｌ）にて３回洗浄した。ＨＰＬＣ分析したところ、フルベン誘導体の反応液からヘプタン層への除去率は８６％であり、目的物のペプチドはヘプタン層に検出されなかった。得られたアセトニトリル層を濃縮して酢酸エチル（１８０ ｍｌ）を加え、１０％炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。
有機層にＨＯＢｔ（０．２０ ｇ， １．４１ｍｍｏｌ）及びＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（５．９７ ｇ， １．４５ ｍｍｏｌ）を溶解し、ＥＤＣ．ＨＣｌ（３．０６ ｇ， １．６０ ｍｍｏｌ）を氷冷下で添加して３時間攪拌した。反応液を５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し、有機層を濃縮してＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯｔＢｕ （１３．３ ｇ， １．３５ ｍｍｏｌ）を得た。

比較例１
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕ（３００ ｍｇ， ０．５８ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７ ｍｌ）に溶解し、ジエチルアミン（０．６１ ｍｌ， ５．８０ ｍｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。反応液を濃縮乾固し、残渣にヘキサンを加えたが、沈殿化することはなく、油状物となった。

比較例２
Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯｔＢｕ（１．５６ ｇ， １．９２ ｍｍｏｌ）をアセトニトリ（１６ ｍｌ）に溶解して、ジエチルアミン（１．９５ ｍｌ， １９．２ ｍｍｏｌ）を加え、室温下にて２時間攪拌した。反応液を減圧濃縮して、残査油状物をヘキサン（１５ ｍｌ）で２回デカントして、更にヘキサンを加えて攪拌し、析出物を濾過し、減圧乾燥させて、Ｈ−Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯｔＢｕを１．０２ ｇ（１．７３ ｍｍｏｌ）得た。 ＨＰＬＣ分析したところ、ジベンゾフルベン（ＤＢＦ）の反応液からヘキサン母液への除去率は８３％であった。

比較例３
実施例３と同様の操作を行い、抽出、洗浄溶媒を９０％アセトニトリル水−ヘキサンの代わりに、水（４ ｍｌ）とヘプタン（４ ｍｌ）にのみ変えて実施したところ、不溶性物質が浮遊して分層操作を著しく低下させた。ＨＰＬＣ分析したところ、水層へはフルベン誘導体、Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕは検出されず、抽出、及び、フルベン誘導体の除去はできなかった。

比較例４
実施例３と同様の操作を行い、抽出、洗浄溶媒を９０％アセトニトリル水−ヘキサンの代わりに、水（４ ｍｌ）と酢酸エチル（４ ｍｌ）のみ変えて実施した。ＨＰＬＣ分析したところ、水層へはフルベン誘導体は検出されず、フルベン誘導体の水層への除去率は１％以下であった。

比較例５
実施例３と同様の操作を行い、抽出、洗浄溶媒を９０％アセトニトリル水−ヘキサンの代わりに、ジメチルホルムアミド（４ ｍｌ）とヘプタン（４ ｍｌ）のみ変えて実施した。ＨＰＬＣ分析したところ、ヘプタン層にはＨ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕは検出されず、フルベン誘導体の反応液からのヘプタン層への除去率は４４％であった。

比較例６
実施例３と同様の操作を行い、抽出、洗浄溶媒を９０％アセトニトリル水−ヘキサンの代わりに、９０％ジメチルホルムアミド水（４ ｍｌ）とヘプタン（４ ｍｌ）のみ変えて実施した。ＨＰＬＣ分析したところ、ヘプタン層にはＨ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯｔＢｕは検出されず、フルベン誘導体の反応液からのヘプタン層への除去率は５１％であった。

本発明の方法は、ペプチド医薬品などの工業的製造に好適に利用できる。

本出願は、日本で出願された特願２００７−１９３１５３を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
本発明がその好ましい態様を参照して提示又は記載される一方、本明細書中において、添付の請求の範囲で包含される発明の範囲を逸脱することなく、形態や詳細の様々な変更をなし得ることは当業者に理解されるであろう。本明細書中に示され又は参照されたすべての特許、特許公報及びその他の刊行物は、参照によりその全体が取り込まれる。

Claims (12)

1. Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物をアミンと反応させることにより脱保護して得られる反応混合物からジベンゾフルベン及び／又はジベンゾフルベンアミン付加体を淘汰する方法であって、該反応混合物を、炭素数５以上の炭化水素溶媒および該炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒（但し、アミド系有機溶媒を除く。）中で攪拌、分層させ、ジベンゾフルベン及び／又はジベンゾフルベンアミン付加体が溶解した炭化水素溶媒層を除去する工程を含むことを特徴とする方法。
2. アミンが、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ピペリジン、モリホリンおよび１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７−エン（ＤＢＵ）から選ばれる、請求項１記載の方法。
3. アミンが、ジエチルアミンおよびジメチルアミンから選ばれる、請求項２記載の方法。
4. 炭素数５以上の炭化水素溶媒が、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタンおよびデカリンから選ばれる少なくとも一種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒が、アセトニトリルおよびメタノールから選ばれる少なくとも一種を含む溶媒である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒がさらに水を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸化合物が、Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸エステルまたはＦｍｏｃ基で保護されたペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 請求項７記載の方法を含む、液相合成法によるペプチドの製造方法。
9. （１）Ｃ−保護ペプチドまたはＣ−保護アミノ酸を、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸と、縮合剤の存在下縮合させる工程、および／または
   （２）Ｃ−保護ペプチドまたはＣ−保護アミノ酸を、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステルと縮合させる工程
   を含む請求項８記載の方法。
10. 請求項９の（１）記載の工程において、さらに活性化剤を存在させる、請求項９記載の方法。
11. 請求項１記載の工程で得られた中間体ペプチドを固体として単離せずに請求項９記載の工程に供することを含む、請求項９または１０記載の方法。
12. ワンポット合成で行う、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。