ES2282293T3 - Ciclopeptidos, su procedimiento de preparacion y su utilizacion como inhibidores o activadores de la angiogenesis. - Google Patents
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Abstract
Ciclopéptido, escogido entre los compuestos siguientes: P11: ciclo(DPhe-Pro-Gln-lle-Met-Arg-lle-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-lle-Gly-Glu) SEQ ID NO: 5 P16: ciclo(Arg-lle-Lys-Pro-His-Gln-Gly) SEQ ID NO: 8 P17: ciclo(Pro-Arg-lle-Lys-Pro-His-Gln-Gly) SEQ ID NO: 9 P19: ciclo(Gln-lle-Met-Arg-lle-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-lle-Gly-Glu) SEQ ID NO: 10 P20: ciclo(DPhe-Pro-Gln-lle-Met-Arg-lle-Lys-Pro-His-Gln-Gly-Gln-His-lle-Gly) SEQ ID NO: 11 P23: ciclo(DTyr-Pro-Arg-lle-Lys-Pro-His-Gln) SEQ ID NO: 13 P24: ciclo(Gly-Arg-lle-Lys-Pro-His) SEQ ID NO: 25
Description
Ciclopéptidos, su procedimiento de preparación y
su utilización como inhibidores o activadores de la
angiogénesis.
La presente invención tiene por objeto nuevos
ciclopéptidos y sistemas que los comprenden, que permiten regular
la angiogénesis.
La angiogénesis es un mecanismo de
neovascularización que surge a partir de una red capilar previamente
existente. Es particularmente importante e indispensable en el
transcurso de numerosos procedimientos fisiológicos como el
desarrollo embrionario, implantación de la placenta, pero también en
diferentes patologías, en particular el crecimiento de tumores,
desarrollo de metástasis, isquemia, enfermedades vasculares,
oculares y enfermedades inflamatorias crónicas (véase, Ferrara
et al, Nature Medicine, vol. 5, nº 12, diciembre de 1999,
páginas 1361-1364 [1] y Hagedorn et Bikfalvi [2]).
La angiogénesis es también esencial en la regeneración de tejidos y
la colonización duradera de biomateriales implantados como
sustitutos óseos.
La angigénesis es un procedimiento multifásico
que supone en premier lugar el desplazamiento unión y adhesión de
las células endoteliales, seguidamente su proliferación y su
organización en tubos con fin de formar la red vascular necesaria
para el desarrollo de tejidos.
Entre los factores reguladores de la
angiogénesis, el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)
aparece como uno de los más importantes.
El VEGF existe en cuatro isoformas, A, B, C y D;
y entre ellas, la isoforma A que compre 165 aminoácidos, es un
potente regulador de la angiogénesis tumoral y parece que está
implicado en otras patologías como la retinopatía diabética o las
enfermedades inflamatorias crónicas.
El VEGF-A es producido por
células normales por trasformadas. Su expresión puede ser inducida
por la hipoxia, la activación oncogénica o la activación por
factores de crecimiento, como el factor de crecimiento de
fibroblastos FGF-2.
El VEGF-A se fija sobre
diferentes receptores, particularmente el receptor del dominio de
quinasa KDR (VRGFR 2), que parece que es un efector muy importante
en la angiogénesis patológica. También, la inhibición de la
angiogenésis a través del receptor KDR podría constituir una
aproximación terapéutica interesante.
La estructura del VEGF-A que
comprende 165 aminoácidos, ha sido descrita a finales de 1997, y
está accesible desde finales de junio de 1998, se describe en el
documento (Véase Muller Y. A. en Structure, 1997, 5, páginas
1325-1338 [3]).
Se ha desarrollado un cierto número de
estrategias con el objetivo de interferir con la función del
receptor KDR de VEGF. Éstas incluyen la inhibición del VEGF.
- por anticuerpos humanizados como se describe
por Presta et al. en la publicación Cáncer Research, 57 1997,
páginas 4593-4599 [4],
- por anticuerpos antiidiotipos, como se
describe por Ortega et al. en la publicación Am. J. Pathol.
Nov., 1997, 151 (5), páginas 1215-1224 [5],
- por inhibidores del dominio de tirosina
quinasa del receptor KDR como se describe por Piosek et al.
en la publicación de Journal of Biological Chemistry, vol. 274, nº
9, 1999, páginas 5612-5619 [6], y
- por péptidos inhibidores aislados por
diferenciación de fagos, como se describe por Fairbrother et
al en la publicación Biochemistry 37, 1998, páginas
17754-17764 [7].
Otras moléculas activas con respecto a la
angiogénesis han sido caracterizadas y algunas han entrado en fase
clínica en oncológica, como se describe por Hagedorn y Bikfalvi en
la publicación Critical Reviews in Oncology/Hematology, 34, 2000,
páginas 89-110 [2].
El documento
US-A-5.939.383 [8] expone la
utilización de diversos ciclopéptidos injertados o acoplados a un
soporte sólido u otro, para aplicaciones biotecnológicas. Entre
diversas posibilidades, se propone el ciclopéptido siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
para el receptor KDR de
VEGF.
No obstante, no proporciona ningún resultado
sobre la inhibición posible del receptor KDR por este ciclopéptido
y, como se verá más adelante, esto no conduce a la inhibición de la
unión de VRGF a su receptor.
La presente invención tiene precisamente por
objeto nuevos ciclopéptidos que tienen una afinidad de enlace por
el receptor KDR más elevada que la suministrada por los productos
mencionados con anterioridad, lo que permite su utilización en
sistemas actividadores o inhibidores de la angiogénesis.
La presencia de tres aminoácidos Arg, Lys y His
es esencial para obtener una interacción deseada con el receptor
KDR de VEGF.
En la invención, los residuos Arg y Gly del
ciclopéptido son retenidos por una cadena que puede comprender una
o varias moléculas orgánicas escogidas entre aminoácidos naturales y
sintéticos, o bien compuestos que comprenden un grupo COOH o un
grupo NH_{2} eventualmente sustituido. Los aminoácidos pueden
estar en forma L o en forma de D.
Los aminoácidos sintéticos pueden ser por
ejemplo, compuestos aromáticos y/o heterociclícos que comprenden un
grupo COOH y un grupo NH_{2} sobre una estructura que permite
proporcionar una conformación espacial próxima a la del VEGF en la
secuencia peptídica interesante (SEQ ID NO: 1).
Las partes aromáticas pueden ser derivados de
benceno, naftaleno o dibenzofurano.
Los heteroátomos pueden ser átomos de oxígeno,
nitrógeno, silicio, germanio, estaño o fósforo.
Como ejemplo de este aminoácido se pude citar el
ácido
4-(2’-aminoetil)-6-dibenzofuranopropanoico
de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de este ácido a sido descrita por
Bekele et al, J. Org. Chem. 62, 1997, páginas
2259-2262 [9].
Como ejemplo de compuestos orgánicos que pueden
ser utilizados, se pueden citar silaxantenos, ácido
4-(2-aminoetil)-6-dibenzofuranopropanoico
y ácido
5-(2’-aminoetil)-9,9-dimetilsila-xanteno-4-propanoico.
Cuando el compuesto comprende un grupo NH_{2}
sustituido, este puede ser de tipo NHR en el que R representa un
grupo hidrocarbonado, que comprende eventualmente grupos funcionales
de tipo carboxi, éster, éter, hidroxi y siloxi.
Preferentemente, la cadena que une las
extremidades desde la secuencia peptídica comprende un amino ácido
en forma D, preferentemente D-Phe o
D-Tyr.
Como ejemplo de ciclopéptidos según la
invención, se pueden citar los ciclopéptidos siguientes:
Los ciclopéptidos de la invención pueden ser
utilizados para regular la angiogénesis y tratar diversas patologías
asociadas a la angiogénesis. Para estas aplicaciones, pueden ser
utilizados en forma de solución o en sistema o biomateriales.
En el caso en que los ciclopéptidos sean
utilizados en forma de solución, se trata generalmente de
soluciones acuosas administrables por vía oral o inyectables. El
ciclopéptido puede ser utilizado para asegurar la inhibición de la
angiogénesis por fijación del ciclopéptido sobre un receptor de VEGF
o bien para asegurar la activación de la angiogénesis acoplando dos
ciclopéptidos sobre un compuesto orgánico apropiado para
proporcionarle una configuración espacial eficaz, permitiendo la
dimerización de los receptores de VEGF.
En los dos casos, los ciclopéptidos pueden ser
acoplados si es necesario a agentes bioactivos.
También, la invención tiene igualmente por
objeto una composición que comprende un ciclopéptido escogido entre
los ciclopéptidos:
La invención tiene todavía por objeto una
composición farmacéutica para activar la angiogénesis que comprende
dos cilcopéptidos iguales o diferentes, acoplados con un compuesto
orgánico farmacéuticamente aceptables, en que los ciclopéptidos son
escogidos entre los ciclopéptidos:
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto orgánico farmacéuticamente
aceptable puede comprender secuencias alternadas
hidrófilas-hidrófobas y funciones reactivas con las
funciones de las cadenas laterales de los aminoácidos del
ciclopéptido.
Cuando los ciclopéptidos son utilizados en el
forma de sistemas o biomateriales, estos pueden ser realizados de
forma que se asegure la inhibición o bien la activación de la
angiogénesis.
Según un primer modo de realización de estos
sistemas, estos comprenden 1 o varios ciclopéptidos, unido(s)
cada uno de forma covalente a un brazo separador orgánico que puede
estar a su vez unido de forma covalente a un soporte.
Con el primer modo de realización, cuando el
sistema está en contacto con receptores de VEGF, un solo
ciclopéptido se fija sobre un receptor de VEGF y evita la
dimerización del receptor y la activación de la angiogénesis.
Según un segundo modo de realización de estos
sistemas, más particularmente destinado a asegurar la activación de
la angiogénesis, estos comprenden dos ciclopéptidos unidos de forma
covalente a un compuesto orgánico, para disponer los dos
ciclopéptidos en una configuración espacial eficaz para activar la
angiogénesis.
Los compuestos orgánicos son compuestos
farmacéuticamente aceptables. Pueden estar formados por secuencias
alternadas hidrófilas-hidrófobas, por ejemplo, de
tipo polietilenglicol/alcano o fluoroalcano, y comprender funciones
reactivas con las funciones amino, hidroxi, ácido carboxílico u
otras de las cadenas laterales del ciclopéptido, para asegurar su
fijación sobre el compuesto, y pueden comprender también funciones
de tipo acrílico.
Como ejemplo de compuesto de este tipo, se puede
citar el compuesto de fórmula:
HOOCH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{5}(CH_{2})_{3}-NH-(CH_{2}CH_{2}O)5CH_{2}-CH_{2}-COOH
que comprende dos funciones
carboxílicas susceptibles de reaccionar con las funciones hidroxi o
amino de las cadenas laterales de los amino ácidos del
ciclopéptido.
Los compuestos orgánicos susceptibles de ser
utilizados pueden comprender también partes aromáticas y/o
heteroátomos de forma que mantengan, por una parte, los dos
ciclopéptidos en una configuración eficaz y permitir, por otra
parte la fijación de estos dos ciclopéptidos, en esta configuración,
sobre diversos soportes.
Las partes aromáticas pueden derivar de benceno,
naftaleno o dibenzofurano.
Los heteroátomos pueden ser átomos de oxígeno,
nitrógeno, silicio, germanio, estaño o fósforo.
Para asegurar la activación de la angiogénesis,
la distancia entre los dos cilopéptidos fijados sobre el compuesto
orgánico es tal que, cuando el sistemas es puesto en contacto con
células que expresan los receptores del factor de crecimiento del
endotelio vascular VEGF, permite la dimerización de estos
receptores.
En este segundo modo de realización, el
compuesto orgánico que soporta los dos ciclopéptidos está
generalmente unido a un soporte por medio de un brazo separador
orgánico.
En los dos modos de realización de los sistemas
de la invención, el brazo separador comprende, por ejemplo, una
cadena hidrocarbonada, fluorocarbonada, poliéter, polietilenglicol,
poliamina, poliamida, poliéster, polisiloxano o una combinación de
estas, que está funcionarizada en cada extremidad para formar un
enlace covalente por una parte, por el ciclopéptido y, por otra
parte, con el soporte.
Preferentemente, el brazo separador orgánico
comprende además un resto o una secuencia peptídica susceptible de
ser cortado por un sistema enzimático.
El corte del brazo separador permite liberar así
los ciclopéptidos activos en los lugares deseados. El sistema
enzimático puede estar constituido por metaloproteasa de la matriz
extracelular o por otras enzimas.
En este caso, el resto es una secuencia
peptídica que es un sustrato de estas metaloproteasas de la matriz
extracelular, por ejemplo, la secuencia peptídica siguiente:
HOOC-Ala-Gly-Leu-Leu-Gly-Gln-Pro-Gly-NH_{2}
Según una disposición ventajosa de la invención,
el brazo separador puede comprender además compuestos biactivo que
serán igualmente liberados en el lugar deseado el momento el corte
de este brazo separador.
Estos compuestos bioactivos pueden ser, por
ejemplo, agentes citotóxicos, agentes anticancerígenos o cualquier
otro principio activo que se desee manejar al nivel de los
receptores KDR.
Según la invención, el soporte, sobre el cual
son fijados el o los ciclopéptidos puede ser un sólido orgánico o
inorgánico. Se puede utilizar en particular, como soporte, un
polímero orgánico en forma sólida o en formal de gel.
El polímero utilizado es ventajosamente un
polímero biocompatible, biodegradable o no biocompatible ni
biodegradable.
Como ejemplo de polímeros susceptibles de ser
utilizados, se pueden citar el poli(tereftalato de etileno),
copolímeros de fluoruro de vinilideno y hexafluoro propileno,
poli(alcoholes vinílicos), poli(metacrilato de
hidroxietilo), polisacáridos y copolímeros obtenidos a partir de
monómeros que entran en la constitución de los coplímeros
anteriores.
Los ciclopéptidos de la invención pueden ser
preparados mediante procedimientos que aplican una etapa de síntesis
automática de un péptido lineal sobre una fase sólida mediante un
procedimiento clásico, seguida un acoplamiento de las extremidades
del péptido lineal, después de haber liberado el péptido de la fase
sólida o bien liberándolo a continuación de la fase sólida.
Por tanto, según un primer modo de realización,
el procedimiento consiste en
a) preparar un péptido lineal mediante síntesis
química sobre una fase sólida,
b) liberar el péptido lineal de la fase sólida,
y
c) acoplar las extremidades del péptido lineal
para formar el ciclopéptido.
Según un segundo modo de realización, el
procedimiento consiste en:
a) preparar un péptido lineal mediante síntesis
químicas sobre una fase sólida,
b) acoplar la extremidad libre del péptido
lineal con un función terminal de un residuo de aminoácido del
péptido lineal, y
c) liberar el ciclopéptido de la fase
sólida.
La invención tiene todavía por objeto un
procedimiento de preparación de un sistema que comprende un soporte
sobre el que se fija(n) el (los) ciclopéptido(s), que
consiste en someter un soporte de polímero orgánico a una
irradiación por medio de radiaciones ionizantes, plasmas o fotones,
sobre zonas definidas del soporte, e injertar seguidamente sobre
estas zonas del soporte un brazo separador orgánico sobre le cual es
o será fijado el ciclopéptido.
Generalmente, se realiza la irradiación a través
de una máscara para definir las zonas del soporte que van hacer
modificadas. Las radiaciones ionizantes utilizadas pueden ser haces
de electrones o de iones pesados rápidos.
En este procedimiento, los ciclopéptidos pueden
ser fijados sobre los brazos separadores orgánicos antes del
injertado. Se puede realizar también su fijación después del
injertado y, en este caso, el procedimiento comprende además una
etapa de fijación de los ciclopéptidos sobre los brazos separadores
orgánicos, después del injertado de éstos.
Otras características y ventajas de la invención
aparecerán mejor mediante la lectura de la descripción que sigue,
los ejemplos de realización que deben entenderse que son
proporcionados con carácter ilustrativo y no limitativo, en
referencia a las figuras anejas.
La figura 1 representa el primer modo de
síntesis de un ciclopéptido según la invención.
La figura 2 representa el segundo modo de
síntesis de un ciclopéptido según la invención.
La figura 3 representa la unión de un
ciclopéptido según la invención sobre un soporte por medio de un
brazo separador orgánico.
La figura 4 ilustra la fijación de un compuesto
orgánico que porta dos ciclopéptidos sobre un soporte por medio de
un brazo separador.
Se describe a continuación la síntesis química
de los péptidos P1 a P22 descritos en la tabla 1, que comprenden
las secuencias correspondientes a los segmentos
\beta5-\beta6 del factor de crecimiento del
endotelio bascular (VEGF-A).
Los péptidos P1 a P6, P10, P14 y P15 son
péptidos lineales y los péptidos P7 a P9, P11, P12, P13 y P16 a P24
y son ciclopéptidos.
Los ciclopéptidos P7 a P9, P11, P12, P13, P16 a
P18 y P23 son preparados utilizando el método de síntesis A, es
decir, el primer modo de realización del procedimiento de síntesis
de los ciclopéptidos de la invención.
Los ciclopéptidos P12, P13 y P19 a P 22 son
preparados utilizando el método de síntesis B, es decir, el segundo
modo de realización del procedimiento de síntesis de los
ciclopéptidos de la invención.
En la descripción que sigue, de estas síntesis,
se utilizaron las abreviaturas siguientes:
- Fmoc:
9-fluorenilmetoxi-carbonilo,
- tBu:
t-butoxicarbonilo,
- Trt: trililo,
-
2-Cl-Trt:
2-clorotrililo,
- HMPB: ácido
4-hidroximetil-3-metoxifenoxi-butílico,
- BHA: benzohidrolamina,
- HOBt:
N-hidrobenzotriazol,
- DCC: N,N’-dicicloexilcarbodiimida,
- DCM: diclorometano,
- TFA: ácido trifluoroacético,
- DIEA:
N,N-diisopropil-etilamina,
- NMM:
N-metilmorfolina,
- PyBop: hexafluorofosfato de
triazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio,
- NMP:
N-metilpirrolidona,
- DIPCDI:
N,N-diisopropilcarbodiimida,
- DMAP:
4-dimetilaminopiridina,
- FCS: suero de ternera fetal,
- PBS: solución salina tamponada con
fosfato,
- DIMEM: medio esencial mínimo modificado
según Delbecco,
- HEPES: ácido
[N-2(hidroxietil)piperazino-N’-(2-etanosulfónico)].
El método de síntesis A está representado en la
figura 1 que ilustra la síntesis del ciclopéptido P7.
Según este método, se sintetiza en primer lugar
el péptido lineal sobre una fase sólida T mediante síntesis por
tandas utilizando la técnica de protección de Fmoc/tBu, y un
sintetizador automático Applied Biosystems 430A. Para la
preparación de los fragmentos péptidos protegidos, se utilizan
resinas previamente cargadas de 2-clorotritilo
lábiles a los ácidos, por ejemplo, resinas de
H-His(Trt)-2-ClTrt
y H-Ile-2-ClTrt o
resinas de HMPB-BHA basadas en
BHA-poliestireno funcionarizadas con un conector que
es el ácido
4-hidroximetil-3-metoxi-fenoxibutanoico
de Rinker, por ejemplo, la resina de
Fmoc-Gly-HMPB-BHA.
Los aminoácidos protegidos por el grupo
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) son acoplados
utilizando un exceso correspondiente a cuatro veces la cantidad de
aminoácido activado en relación al éster de
N-hidroxibenzotriazol (HOBt) por medio de
N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC).
En la figura 1, la primera línea representa el
péptido lineal cuyas cadenas laterales son protegidas por grupos
tritilo (Trt) en el caso de los grupos amino de His y Gl, el grupo
Boc (t-butiloxicarbonilo) en el caso del grupo
amino y de Lys y grupo
2,2,5,7,8-petametil-cromano-6-sulfonilo
(Pmc) en el caso de Arg.
Se procede seguidamente a la separación del
péptido lineal de la fase sólida P mediante tratamiento con una
solución al 1% de ácido trifluoroacético (TFA) en diclorometano
(DCM).
Se obtiene así un fragmento peptídico protegido
con un elevado rendimiento y un elevado grado de pureza, y una
pérdida despreciable de los grupos que protegen las cadenas
laterales de los aminoácidos.
Un tratamiento repetido de la resina peptídica
con una solución resiente de TFA y tiempos de reacción mínimos
(diez veces durante dos minutos) proporciona los mejores resultados.
Seguidamente se lava la resina con DCM y metanol varias veces. La
consecución del corte es seguida por cromatografía sobre capa fina.
Los filtrados combinados son evaporados bajo presión reducida y se
añade agua con hielo al residuo para precipitar el material
peptídico. El material en bruto es asilado por filtración, lavado
con agua fría y secado en un desecador bajo vacío colocado sobre
NaOH. Los péptidos lineales protegidos con analizados por
cromatografía líquida de alta resolución HPLC sobre fase invertida
(columna Lichrosob RP-18 de Merck, 7 \mum, 0,4 x
25 cm) utilizando un gradiante lineal que va de 70 a 100% de B en
A, en que el disolvente A es una solución acuosa al 0,1% de TFA y el
disolvente B es una solución acuosa al 0,1% del TFA y 70% de
acetonitrilo.
El péptido lineal protegido correspondiente a P7
es ilustrado en la figura 1.
Se procede seguidamente a la ciclación del
péptido lineal protegido. Con este objetivo, se disuelve en DCM
para obtener una concentración final de 1 mg/ml. Se añaden a la
solución 6 equivalentes de N,N-diisopropiletilamina
(DIEA) o N-metilmorfolina (NMM), y se realiza la
ciclación por medio de hexafluorofosfato
(PyBOP)/N-hidroxibenzotrizol (HOBt) utilizado tres
equivalentes de cada reactivo de acoplamiento. Se mantiene el medio
de reacción a 25ºC bajo atmósfera de nitrógeno y agitación débil
durante 24 a 48 horas hasta que la ciclación se completa, lo que se
verifica mediante HPLC.
Se elimina el disolvente por evaporación bajo
presión reducida y se añade agua con hielo al residuo. Se separa el
precipitado en el bruto por filtración, se lava con agua fría y se
seca en un desecador bajo vacío colocado sobre NaOH, y se utiliza
para la desprotección total de las cadenas laterales sin
purificación complementaria.
El ciclopéptido protegido corresponde a P7 y es
ilustrado en figura 1.
La desprotección de las cadenas laterales del
ciclopéptido se efectúa por medio de una solución de TFA al 95% en
presencia de los reactivos (fenol, tioanisol, triisopropilsilano y
agua) durante dos a tres horas. Se efectúa seguidamente una
evaporación de la mayor parte del TFA para obtener una buena
precipitación del ciclopéptido en bruto desprotegido y se añade 10
veces el volumen de éter enfriado con hielo. Después de una
filtración y un lavado con éter de nueva aportación, se seca el
precipitado sobre NaOH y se liofiliza. Se efectúan seguidamente
purificaciones semipreparativas sobre una columna HPLC de Applied
Biosystems utilizando la fase de la columna invertida Lichrosorb
C18 (250 x 10). Se utilizan los tampones A y B descritos con
anterioridad. Se utilizaron gradientes lineales de 10 a 50% de B en
A durante un período de 30 minutos, a un caudal de 4 ml/min. Se
reúnen las fracciones homogéneas obtenidas por HPLC y se liofilizan
para obtener los ciclopéptidos deseados con un grado de pureza
satisfactorio, superior a 95% por HPLC analítica.
La figura 1 ilustra el ciclopéptido protegido,
que conduce al ciclopéptido P7 de la tabla 1.
Se sigue el mismo modo operatorio para preparar
los ciclopéptidos P8, P9, P11, P12, P13, P16 a P18 y P23,
utilizando para la síntesis los aminoácidos L o D protegidos por el
grupo Fmoc, la resina
Fmoc-L-Gly-HMPB/BHA
(0,53 mmol/g), la resina,
H-His(Trt)-2-ClTrt
(0,42 mmol/g), la resina
H-Ile-2-ClTrt (0,53
mmol/g), y la resina NovaSyn TGA (90 \mum), y PyBOP procedentes
de la empresa Societe Novabiochem.
Se utilizan también los reactivos HOBt, DCC,
TFA, DIEA, NMM y piperidina procedente de la empresa Aldrich.
Debe precisarse que las HPLC se efectúan sobre
una columna Lichrosorb RP-18
(7-\mum, 0,4 x 25 cm) de la empresa Merck, y
sobre una columna Lichrosorb C-18
(5-\mum, 0,4 x 25 cm) de la empresa Interchim,
realizando la elución con un gradiente lineal B en el disolvente A.
El disolvente A comprende 0,1% de TFA en H_{2}O. El disolvente B
comprende 0,1% de TFA, 70% de acetonitrilo y 30% de agua. Se
utiliza un caudal de 1 ml/min durante un período de 30 minutos. La
detección UV se efectúa a 214 nanómetros y 280 nanómetros. Los
péptidos purificados son caracterizados por análisis de
aminoácidos, realizando la hidrólisis en HCl 6M y fenol al 2% y
110ºC, durante 20 a 24 horas, y por espectrometría de masas
FAB-MS.
Se describe seguidamente el método de síntesis
B, es decir, el segundo modo de realización del procedimiento de
síntesis de ciclopéptidos de la invención.
El modo de síntesis B es ilustrado en la figura
2 en el caso del péptido P19.
Para esta síntesis se utilizan los mismos
reactivos que para la síntesis A, añadiendo la resina de
Fmoc-L-Glu
(PEG-PS)-O-Alilo
(0,18 mmol/g) de la empresa Perkin Elmer.
Se sintetiza en primer lugar el péptido lineal
P10 mediante síntesis en fase sólida, utilizando el sintetizador
automático Applied Biosystems 430 A, como en el método de síntesis
A.
Como se representa en la figura 2 el primer
aminoácido C-terminal
Fmoc-Glu-O-Alilo es
fijado sobre la resina NovaSyn TGA de 90 \mum (fase sólida P) por
su cadena lateral, utilizando un método de anhídrido simétrico. Se
expande la resina en N-metilpirrolidona (NMP)
durante 30 minutos. Se añade una solución de 5 equivalentes de
N,N-diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) a una solución
de 10 equivalentes del aminoácido en DCM seco a 0ºC. Después de
agitar durante 30 minutos, se elimina el disolvente bajo presión
reducida y se disuelve en residuo en NMP y se trasfiere sobre la
resina preinpregnada. La fijación del ácido carboxílico es concebida
ante esterificación catalizada por medio de
4-dimetilaminopiridina (DMAP) a razón de 0,1
equivalente durante 2 horas, para proporcionar una sustitución
final de 0,25 mmol/g. La carga de la resina es estimada por
cuantificación UV del producto de adición de
piperidina-Fmoc a 290 nm. Se utilizó también la
resina comercial de Fmoc-L-Glu
(PEG-PS)-O-alilo
(0,18 mmol/g) procedente de la empresa Perkin Elmer.
Se acoplan los aminoácidos siguientes,
protegidos por el grupo Fmoc, utilizando un exceso correspondiente
a 4 veces la cantidad de aminoácido activando con respecto al éster
HOBt por medio de DCC.
Se obtiene así el péptido lineal de cadenas
laterales protegidas, representado en la primera línea de la figura
2.
Se efectúa seguidamente una desprotección
alílica del aminoácido terminal Glu fijado sobre la fase sólida,
tratando la resina con el péptido protegido con 3 equivalentes de
[Pd(PPh_{3})_{4}] en una mezcla de DCM:AcOH:NMM
(37:2:1) bajo una corriente de argón a 25ºC durante 2,5 horas bajo
agitación suave ocasional. Se elimina el catalizador lavando la
resina con 0,5% de DIEA en NMP, durante 2 minutos 3 veces en NMP y
seguidamente en dietilditiocarbamato de sodio al 0,5% p/p en NMP, 3
veces durante 15 minutos, y finalmente en NMP y DCM durante 2
minutos repitiendo 3 veces.
Se efectúa seguidamente la ciclación del péptido
sobre la fase sólida de la forma siguiente. Se trata la resina con
20% de piperidina en NMP para liberar el grupo amino
N-terminal de péptido y se lava con HOBt 1 N en NMP,
y seguidamente con NMP y DCM. Se efectúa la ciclación en fase
sólida utilizando 6 equivalentes de PyBOP, 6 equivalentes de HOBt
y 12 equivalentes de DIEA en NMP, durante 4 a 6 horas. Se verifica
la consecución de la ciclación mediante el ensayo de ninhidrina. Se
lava la resina varias veces con NMP y DCM y se seca bajo vacío
aplicado durante una noche. El ciclopéptido protegido está
representado la figura 2.
\newpage
Se procede seguidamente a la separación del
ciclopéptido de la fase sólida y a la desprotección de las cadenas
laterales de los aminoácidos. Esto se efectúa por medio de TFA a 95%
y el producto de la acidolisis es purificado mediante HPLC
semipreparativa como se describió con anterioridad.
Se reúnen las facciones homogéneas obtenidas por
HPLC y se liofilizan para obtener los ciclopéptidos deseados con un
grado de pureza satisfactorio (superior a 95% mediante HPLC
analítica).
Se obtiene así el ciclopéptido P19 representado
en la figura 2.
Se sigue el mismo operatorio para preparar los
ciclopéptidos de P20 a P22 de la tabla 1.
Los péptidos lineales P1 a P6, P10, P14 y P15 de
tabla 1 son preparados mediante síntesis peptídica clásica.
La tabla 2 ilustra la estructura y el peso
molecular de los péptidos P1 a P22 en referencia a la secuencia
peptídica de VEGF-A que comprende 165
aminoácidos.
Se ensayan los péptidos P1 a P24, en lo que se
refiere a su propiedad de inhibición de la unión de VEGF sobre su
receptor KDR.
Para estos ensayos, se utilizan células de
ovarios de hamster chinos deficiente en sulfato de heparano tras
fectados con un vector de expresión que contiene VRGFR2cDNAs
(Células CHOm VEGFR2). Se ha demostrado que el KDR recombinante de
las células de CHO presenta las mismas características que el KDR de
células endoteliales (véase Binetruy-Tournaire
et al, RMBO Journal, 19, (7), 2000 páginas
1525-1533 [10]).
Las células CHOm VEGFR2 son obtenidas mediante
trasfección de células de ovarios de hamster chinos deficientes en
sulfato de heparano con VEGFR2 cDNA en un vector
psV-7d como ha sido descrito por Jonca et al.
en la publicación J. Biol. Chem., 1997, 272, páginas 24203 [11].
Las células CHOm VEGFR2 son cultivadas rutinariamente en medio
Eagle modificado mediante un medio de Dulbecco, complementado con
10% (v/v) de suero de ternera fetal (FCS), 50 U/ml de penecilina,
50 \mug/ml de estreptomicina, 1 mg/ml de glucosa y
L-glutamina 2 mM, a 37ºC, en una atmósfera con 5%
de CO_{2}.
Para estos ensayos, se utiliza VEGF marcado
radioactivamente con I^{125}-Na utilizando perlas
de yodo (yodógeno).
La actividad específica de
I^{125}-VEGF es de 150.000 a 200.000 cpm/g. Las
células son sembradas en cajas de 3,5 cm de diámetro revestidas
previamente con 0,15% de gelatina, a una densidad de 200.000 células
por caja y son cultivadas en un medio durante 2 días. Las cajas
subconfluentes son trasferidas a 4ºC. Las células son lavadas dos
veces con un tampón de solución salina en fosfato enfriada con hielo
(PBS) y son encubadas con diferentes concentraciones de péptidos y
5 ng/ml de I^{125}-VEGF, en presencia o ausencia
de 50 ng/ml de heprina, en un tampón de enlace (DMEM que contiene
20 mmol/L de HEPES, pH 7,4, 0,15% de gelatina), durante 2 horas a
4ºC. Al final del período de incubación, las células son lavadas 3
veces con PBS enfriados con hielo y son solubilizadas en 1 ml de
tampón con 2% de Triton X 100, 10% de glicerol, 1 mg/ml de albumina
de suero bovino BSA. EL grado de radioactividad asociada a las
células en contado en un contador gamma Kontron
MR-250. La unión no específica es determinada
mediante incubación de las células con
I^{125}-VEGF y un exceso de 200 veces de VEGF nmo
marcado. La unión específica es calculada sustrayendo la unión no
específica de la unión total.
Se efectúa este ensayo en presencia de
concentraciones fijadas de péptidos P1 a P22, de 20 \muM, 200
\muM y 400 \muM. Todos los péptidos lineales y algunos péptidos
cíclicos no muestran ningún efecto inhibidor sobre la unión de
VEGF a KDR a estas concentraciones. Se continúan los ensayos con los
ciclopéptidos interesantes y dos péptidos lineales como testigos
para un análisis de la inhibición en función de la dosis.
Los resultados obtenidos representados por
IC_{50}, es decir, la concentración en \muM necesaria para
inhibir un 50% de la unión del VEGF al receptor KDR son igualmente
proporcionados en la tabla 2.
Todos los ensayos son repetidos tres veces y
proporcionan resultados similares.
Se aprecia así que los ciclopéptidos P11, P16,
P17, P19, P20, P23 y P24 son muy eficaces para inhibir la unión de
VEGF al receptor KDR.
Por el contrario, el ciclopéptido P22 que
corresponde al cilcopéptido descrito en el documento
US-A-5.939.383 [8] no es más eficaz
que los péptidos lineales P1 a P6, P10, P14 y P15 para inhibir está
unión.
Los péptidos que inhiben la unión de
I^{125}-VEGF al receptor de VEGFR2 son
seguidamente ensayados en experimentos de angiogénesis in
Vitro, ex vivo y in vivo y sobre su efecto sobre
la señalización celular. Se proporcionan en la presente memoria
descriptiva resultados que se refieren al efecto de los péptidos
activos sobre la proliferación celular, el desplazamiento celular y
sobre la activación de las quinasas p42 y p44 (quinasas activadas
por mitogenes).
La proliferación celular es medida mediante
recuento celular. Son colocadas 7.000 células endoteliales en
pocillos de placas de 24 (Costar) en medio de DMEM que contiene
suero bovino de recién nacido. Después que las células se han
adherido, las células son lavadas en DMEM sin suero y son incubadas
con medio de DMEM que contiene 1% de suero bovino de recién nacido,
10 ng/ml de VEGF en presencia o ausencia de diferentes
concentraciones de péptidos. Dos días después las células son una
vez más estimuladas mediante VEGF en presencia o ausencia de
diferentes concentraciones de péptidos. En el quinto día, las
células son tripsinizadas y contadas con un contador Coulter. Como
ejemplo, el péptido P11 (circular) muestra una fuerte inhibición de
la proliferación celular. Por el contrario, el péptido lineal es
inactivo (tabla 3).
El desplazamiento celular es medido según el
método descrito Sato y Rifkin (J. cell Biol., septiembre de 1988,
(107 (3): 1199-205) [17] con modificaciones. Se
colocan 100.000 células endoteliales en cajas de cultivo de 35 mm
en medio de DMEM que contiene 10% de suero bovino neonatal. A la
confluencia, el medio es sustituido con medio DMEM sin suero y las
células se dejan incubar durante una noche. Al día siguiente, se
efectúa artificialmente una denudación en la monocapa con una
punta de pipeta esterilizada. Se toma una serie de fotos digitales
y el borde la denudación es trazado mediante una línea utilizando el
programa BiocomVisionL@b2000. Las cajas son seguidamente aclaradas
e incubadas con 10 ng/ml de VEGF en presencia o ausencia de
péptido. Después de 18 horas de incubación, se toma una nueva serie
de fotos y las imágenes antes y después la estimulación son
superpuestas. Las células que se encuentran más allá del borde
denudación son contadas. Por ejemplo, el péptido P11 (cíclico) en
este grupo de experimento
inhibe fuertemente el desplazamiento celular. Por el contrario, el péptido lineal no tiene ningún efecto (tabla 3).
inhibe fuertemente el desplazamiento celular. Por el contrario, el péptido lineal no tiene ningún efecto (tabla 3).
La fosforilación de ERK1 (p44) y de ERK1 (p42)
es medida mediante ensayo de trasferencia Western utilizando
anticuerpos anti p42/p44 (New England Biolabs). Las células
endoteliales capilares son cultivadas en DMEM que contiene 10% de
suero bovino de recién nacido. Los cultivos subconfluentes son
seguidamente desprovistos de suero durante 24 horas. Los péptidos
son añadidos a concentraciones específicas durante 5 minutos a las
células en presencia o ausencia de 10 ng/ml de VEGF. Las células son
seguidamente retiradas de las cajas de cultivo y son lisadas
durante 20 minutos sobre hielo en tampón de lisis que contiene Hepes
50 mM, pH 7,4, NaCl 75 mM, EDTA 1 mM, 1% Nonidet
P-40 y 0,001% de SDS. El material insoluble se
retira por centrifugación y se separan 50 \mug/ml de extracto
proteico mediante electroforesis sobre gel poliacrilamida que
contiene dodecil-sulfato de sodio (SDS) en
condiciones desnaturalizantes. Las proteínas son seguidamente
transferidas desde el gel sobre una membrana de nitrocelulosa
(Amersham Pharmacia Biotech, Orsay) con un aparato de transferencia
(Transfert semiseco, Bio-Rad,
Ivry-sur-Seine, Francia). La
membrana es seguidamente incubada con los anticuerpos primarios
contra p42/p44 y seguidamente los secundarios acoplados a la
peroxidasa. La visualización se efectúa utilizando el sistema
ECLplus (Amersham Pharmacia Biotech, Orsay). Los resultados son
cuantificados utilizando el programa Image Quant (Molecular
Dinamics).
Como ejemplo, el péptido P11 (cíclico) inhibe
fuertemente la fosforilación de p42/p44. El péptido lineal no tiene
ningún efecto (Tabla 3).
La tabla 3 indica el efecto del péptido P11
sobre la proliferación y el desplazamiento celular y sobre la
fosforilación de las quinasas MAP (p42 y p44). Los experimentos se
efectuaron como se indica. La inhibición de la proliferación y el
desplazamiento está indicada en valores de inhibición del 50% del
efecto biológico (IC 50). Se utilizaron péptidos 50 \muM para los
experimentos de fosforilación. El grado de fosforilación es
estimado después de la cuantificación de las señales obtenidas a
partir de las películas de autorradiografía y los resultados se
expresan en porcentaje de inhibición con respecto a la señal
obtenida con 10 ng/ml de VEGF solo.
Los ciclopéptidos de la invención pueden ser
utilizados para la realización de sistemas inhibidores o activadores
de la angiogénesis, en forma soluble, o bien acoplándolos a
soportes apropiados.
En la figura 3 se ha representado el primer modo
de realización de un sistema inhibidor según la invención.
En está figura, se observa que el ciclopéptido
está acoplado a un soporte apropiado 1 por medio de un brazo
separador orgánico 3, que puede comprender un resto 4 susceptible de
ser cortado por un sistema enzimático.
El brazo separador orgánico puede estar
constituido por una cadena hidrocarbonada, fluorocarbonada de
poliéter, polietilenglicol, poliamina, poliamida, poliéster,
polisiloxano o una combinación de estas, que está funcionarizada en
cada extremidad para formar un enlace covalente, por una parte, con
el ciclopéptido, por otra parte con el soporte 1.
El resto 4 susceptible de ser cortado por un
sistema enzimático presente en el brazo separador 3 puede ser en
particular una secuencia peptídica que es un sustrato de enzimas
como las metaloproteasas de la matriz extracelular.
La presencia de este resto permite por tanto
liberar el ciclopéptido en el lugar deseado cuando esta en contacto
con las enzimas apropiadas, permitiendo así que el ciclopéptido
desempeñe su función de inhibición de la unión del VEGF al receptor
KDF y regular la angiogénesis.
En la figura 3, se ha representado un solo
ciclopéptido unido al soporte. Naturalmente, se pueden utilizar
soportes que comprendan un gran número de ciclopéptidos unidos cada
uno al soporte mediante un brazo separador orgánico que comprenda o
no comprenda un resto como 4.
En la figura 4, se ha representado otro modo de
realización de sistemas de la invención, en el que se utilizan dos
ciclopéptidos para obtener un efecto activador de los receptores
KDR.
En este caso, dos ciclopéptidos son fijados
sobre un compuesto 6 que está unido a su vez al soporte 1 mediante
un brazo orgánico separador 3; y este brazo puede comprender
igualmente un resto 4 susceptible de ser cortado por un sistema
enzimático.
La elección del compuesto orgánico sobre el que
son fijados los dos ciclopéptidos permite disponer estos en una
configuración satisfactoria para permitir la dimerización de los
receptores del factor de crecimiento del endotelio vascular.
Por tanto, la distancia entre los dos
ciclopéptidos fijados es tal que cuando el sistema es puesto en
contacto con las células que expresan los receptores de VEGF,
permite la dimerización de estos receptores.
El brazo orgánico separador 3 puede ser del
mismo tipo que el de la figura 3 y comprender un resto 4 del mismo
tipo que el de la figura 3.
El compuesto orgánico 6 puede estar formado por
secuencias alternadas hidrófilas-hidrófobas, de
tipo polietilenglicol/alcano o fluoroalcano, para permitir una
disposición apropiada de los dos ciclopéptidos. La fijación de cada
ciclopéptido sobre este compuesto utiliza funciones de aminas o
ácidos carboxílicos de las cadenas laterales del ciclopéptido o
funciones de tipo acrílico.
El soporte 1 utilizado en los diferentes modos
de realización de los sistemas de la invención puede estar en forma
sólida o en forma de gel. Se puede tratar de un sólido orgánico o
inorgánico.
Preferentemente, el soporte es un polímero
orgánico biocompatible, biodegradable o no biodegradable. En este
caso la fijación del brazo separador orgánico sobre este polímero
puede ser efectuada por vía química o radioquímica. En este ultimo
caso, se somete el soporte de polímero orgánico a una irradiación
por medio de radiaciones ionizantes, plasmas o fotones sobre las
zonas definidas del soporte que deberán recibir el bazo separador,
y se injerta seguidamente sobre estas zonas el brazo separador
orgánico directamente o bien por medio de un monómero polimerizable
por vía radicalaria (radioinjertado) que comprende, por ejemplo,
funciones de amina o ácido carboxílico.
El acoplamiento al polímero radioinjertado o no
radioinjertado se hace, por ejemplo, mediante la creación de
enlaces de amidas, entre la funciones de ácidos carboxílicos y las
funciones de aminas introducidas en la extremidad de los brazos
separadores, o bien entre las funciones aminas del soporte y las
funciones de ácidos carboxílicos introducidas en la extremidad de
los brazos separadores.
Los ejemplos siguientes ilustran la realización
de estos sistemas.
Se parte de un compuesto orgánico que comprende
tres grupos funcionales de los que uno está protegido.
El compuesto orgánico responde a la fórmula:
HOOC
CH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{5}(CH_{2})_{3}NH(CH_{2}CH_{2}O)_{5}CH_{2}CH_{2}COOH
(Compuesto
1)
El brazo separador es fijado sobre el grupo NH
de este compuesto y responde a la fórmula:
CH_{2}=CH-CO-NH-(CH_{2})_{5}-CO-P-CO-
(Compuesto
2)
en la que P representa el péptiodo
que es un sustrato de metalopeoteasa de la matriz
extracelular.
Se prepara el compuesto orgánico 1 efectuando
las etapas siguientes.
Etapa nº
1
Para esta etapa, se sigue el mismo modo
operatorio descrito por O. setos, H. Kunz, J. Org. Chem., 62, 813
(1997) [12]:
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de tres bocas, se añade THF anhidro
con hexaetilenglicol, estando el conjunto bajo nitrógeno y
agitación. Se añade seguidamente Na que se deja disolver. Se añade
acrilato de terc-butilo. Se deja volver durante 20
horas a temperatura ambiente. Se añade HCl 1 N para neutralizar la
solución. Se evapora el THF bajo presión reducida, y seguidamente
se dispone la solución en solución salina saturada. La solución se
extrae seguidamente tres veces con acetato de etilo. El conjunto de
fases orgánicas es nuevamente dispuesto en solución salina
saturada. Se recupera la fase orgánica y se evapora el acetato de
etilo. Se recupera el producto puro (el compuesto 3) con un
rendimiento de 96%.
Etapa nº
2
a) Tosilación según el modo operatorio descrito
por D.S. Wlibur et al, Bioconjugate Chem., 9 813 (1998)
[13]:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de dos bocas se coloca piridina y
el compuesto 3 de partida. El conjunto se lleva a 0ºC bajo N_{2}.
Se añade seguidamente TsCl. Después de 15 horas de reacción, la
solución se limpia con hielo y se extrae tres veces con
CH_{2}Cl_{2}. La fase orgánica se lava con una solución de ácido
acético al 2% y seguidamente con agua. La fase orgánica
seguidamente se recupera, se seca sobre MgSO_{4} y se evapora bajo
presión reducida. El producto se purifica haciéndolo pasar sobre
una columna de sílice (70/230) con 100% de acetato de etilo como
eluyente. El producto (compuesto 4) se recupera con un rendimiento
de 65%.
b) Azidación según el modo operatorio descrito
por K.D. Reynolds, Bioconjugate Chem., 10, 1021-31
(1999) [14]:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de dos bocas, se coloca el
compuesto 4 con DMF bajo N_{2} y seguidamente se añade NaN_{3}.
Se agita el conjunto durante 20 horas y la solución se vuelve opaca.
La solución se hace pasar sobre un material sinterizado
seguidamente la DMF se evapora conjuntamente con tolueno.
Seguidamente se tiene un precipitado blanco que se diluye con éter.
La solución se hace pasar nuevamente sobre el producto sinterizado y
el éter se evapora.
Se obtiene así el compuesto 5 con un rendimiento
de 95%.
Etapa nº
3
La alilación se realiza mediante sustitución
nucleofílica de bromuro de alilo comercial por medio de la sal de
sodio de hexaetilenglicol. El derivado obtenido
\vskip1.000000\baselineskip
se aísla seguidamente por
cromatografía sobre columna se sílice con un rendimiento de
50%.
La síntesis se efectúa en THF.
Etapa nº
4
Se efectúa según el procedimiento descrito por
Carboni et al, J. Org. Chem., 1993, 58
3736-3741 [15] haciendo reaccionar el compuesto 5
con el compuesto 6 sobre el que se añade dicloborano. Se obtiene el
compuesto 7.
tBuOOCCH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{5}CH_{2}CH_{2}CH_{2}HN(CH_{2}CH_{2}O)_{5}CH_{2}CH_{2}-COOtBu
(compuesto
7)
Etapa nº
5
El compuesto 7 se trata seguidamente con
FmocOSu, según el procedimiento utilizado, por ejemplo, por
Chetyrkina et al., Tetrahedron Letters 2000, 41,
1923-1926 [16].
Se obtiene el compuesto 8
Etapa nº
6
En un matraz de dos bocas se coloca el
compuesto 8 al que se añade anisol y seguidamente TFA. Se deja
agitar la reacción durante 1 h 30 minutos a 25ºC y seguidamente se
evapora el TFA bajo presión reducida. El producto en bruto se hace
pasar seguidamente sobre una columna de sílice (70/230) como
eluyente 95/5 de CH_{2}Cl_{2}/MeOH y seguidamente 90/10
CH_{2}Cl_{2}/MeOH. Se recupera el compuesto 9 puro con un
rendimiento de 65%.
Se fijan los ciclopéptios P23 sobre los dos
grupos funcionales (COOH) del compuesto 9 operando de la manera
siguiente.
Se pone el compuesto 9 en solución en THF y se
activa por medio de
N,N-dimetilpropiletilcarbodiimida.
Se añade seguidamente una cantidad
correspondiente a 1 equivalente molar de cada ciclopéptido y se deja
el medio durante 12 horas a temperatura ambiente y seguidamente se
liofiliza. Se recoge el liofilizado por medio de cloroformo, se
elimina la urea que se forma mediante filtración y se evapora el
filtrado bajo presión reducida.
Se caracteriza el producto obtenido por
espectrometría infrarrojos con la transformada de Fourier, RMN
protónica y espectrometría de masas. Corresponde al producto
buscado.
Para asegurar la fijación de este producto sobre
un soporte, se fija en primer lugar sobre el grupo NH del compuesto
orgánico un brazo separador que comprende una función polimerizable.
Se procede de la manera siguiente.
Se realiza en primer lugar la desprotección del
grupo NH del compuesto 9 mediante tratamiento con piperidina.
Se prepara además el brazo separador efectuando
la reacción siguiente:
En un matraz de tres bocas se añade la sal y
agua y seguidamente el aminoácido
H_{2}N(CH_{2})_{5}-COOH; y el
conjunto se enfría a 0ºC. Bajo una agitación enérgica se añade
cloruro de ácido acrílico a una razón de aproximadamente 3 ml por
minuto.
Se deja agitar 10 minutos a temperatura
ambiente y seguidamente se hace pasar la solución sobre un material
sinterizado. El matraz se lleva nuevamente a 0ºC bajo una agitación
enérgica. Se añade seguidamente HCl concentrado para obtener un pH
= 2. Esto provoca una precipitación del producto. La mezcla se
filtra seguidamente y el producto secado (compuesto 10) es puro. El
rendimiento es del 75%.
Se condensa el compuesto 10 sobre el péptido P
que es un sustrato de metaloproteasa de la matriz extracelular,
durante la última etapa de su síntesis en fase sólida. Seguidamente
el conjunto es liberado de la resina sin protección de las cadenas
laterales.
La molécula obtenida es seguidamente condensada
gracias a la diciclohexil-carbodiimida sobre el
compuesto 9 desprotegido. Se desprotegen seguidamente las cadenas
laterales del péptido del brazo separador y seguidamente se fija el
brazo sobre un soporte de polímero por medio de las funciones
acrílicas del brazo.
Se utiliza como soporte una película industrial
de 25 \mum de grosor de poli(tereftalato de etileno) (PTE)
y se extrae previamente en el dispositivo Soxhlet por medio de
tolueno a reflujo, a una temperatura de 110ºC, durante 12 horas,
con el fin de eliminar cualquier residuo de monómero orgánico.
Se coloca seguidamente sobre la película de
polímero una rejilla metálica de níquel o cobre, con un grosor de
50 \mum, perforada por orificios circulares con un diámetro de 5 a
10 \mum repartidos regularmente sobre toda su superficie con un
paso de aproximadamente 100 \mum. La rejilla fue fabricada
mediante electroconformación para presentar una perfecta capacidad
de reproducción y una precisión muy elevada del orden de un
micrómetro.
Seguidamente la película de polímero es sometida
a una irradiación por medio de un haz de electrones para irradiar
únicamente las zonas correspondientes a los orificios de la rejilla.
El haz de electrones presenta las características siguientes:
- energía Ep =2,5 MeV,
- intensidad máxima Imax = 1 \muA,
- dosis máxima = 500 KGy
Se efectúa la irradiación bajo una atmósfera que
contiene oxígeno.
Después de la irradiación, se retira la rejilla
de la película de polímero y se pone la película de polímero
irradiada en contacto con el compuesto orgánico sobre el que están
fijados los dos ciclopéptidos para injertar este compuesto por
medio del brazo separador, sobre la película de polímero. Esta
fijación se efectúa poniendo en contacto la película con una
solución 10^{-2} M de compuesto orgánico obtenido anteriormente,
en acetonitrilo, actuando a 40ºC.
Se injerta así el compuesto orgánico por medio
de las funciones acrílicas del brazo separador sobre las zonas
irradiadas de la película de polímero.
Se caracteriza el producto final mediante
espectrometría FT-IR y XPS.
En este ejemplo, se sigue el mismo modo
operatorio que en el ejemplo anterior para acoplar dos ciclopéptidos
P23 sobre dos funciones del compuesto orgánico descrito, utilizado
con anterioridad.
Para realizar este acoplamiento, se coloca el
compuesto orgánico en solución en cloroformo y se activa por medio
de diciclohexilcabodiimida DCCI; y seguidamente se añade una
cantidad correspondiente a 1 equivalente molar de cada ciclo
péptido y se mantiene el medio de reacción durante 12 horas a 4ºC.
Se elimina el precipitado de diciclohexilurea por filtración y
seguidamente se evapora el filtrado bajo presión reducida.
Se caracteriza el producto obtenido por
espectrometría infrarrojos con la trasformada de Fourier, RMN
protónica y espectrometría de masas, como anteriormente.
Se fija seguidamente sobre el grupo NH del
compuesto orgánico un brazo separador como en el ejemplo 1.
Seguidamente se fija el conjunto sobre un
soporte constituido con una película industrial de 25 \mum de
grosor de poli(fluoruro de vinilideno/hexafluoropropileno)
PCDF-HFP. Se somete previamente la película a una
extracción en el dispositivo Soxhlet en diclorometano a reflujo, a
una temperatura de 40ºC, durante 12 horas, con el fin de eliminar
cualquier resto de monómero orgánico.
Se somete seguidamente la película a una
irradiación en aire por iones pesados rápidos. Los iones utilizados
son iones de oxígeno que tiene una energía primaria E_{p} de
aproximadamente 10 MeV/uma, a fluencias comprendidas entre
10^{7} y 10^{9} iones/cm^{2} y a intensidades de
aproximadamente 10^{2} a 5,10^{2} nA. Se escoge un régimen a
baja fluencia, de forma que no haya recuperación de residuos
latentes.
Este régimen está directamente determinado por
los parámetros de irradiación (número atómico del ion, energía
primaria o fluencia). En este caso, la distribución aleatoria de los
centros activos en la zona perturbada creada durante la irradiación
(surgimiento de residuos latentes) permite radioinjertar al menos
dos brazos separadores orgánicos que portan cada uno un
ciclopéptido, bloqueando la distancia entre los puntos de anclaje
de forma que la distancia d entre dos ciclopéptidos favorezca la
dimerización de los receptores de VEGF.
Las zonas irradiadas con útiles para injertar
gracias a los radicales libres creados a lo largo del residuo
latente del ion y el surgimiento de este en la superficie de la
película de polímero, brazos separadores orgánicos que portan los
ciclopéptidos obtenidos, como se describió con anterioridad,
mediante la reacción de su función de tipo acrílico, con el soporte
irradiado.
Este acoplamiento es efectuado por calentamiento
a 40ºC de la película irradiada puesta en presencia de una solución
10^{-3} M de los brazos orgánicos portadores de ciclopéptidos en
tetrahidrofurano.
Se caracteriza el compuesto final por
espectrometría FT-IR y XPS.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
<110> Commissariat à l'énergie
atomique
\hskip1cm Université Victor Segalen - Bordeaux
2
\hskip1cm Université Bordeaux 1
\hskip1cm BETZ Natacha
\hskip1cm BIKFALVI Andréas
\hskip1cm DELERIS Gérard
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<120> Ciclopéptidos, su procedimiento de
preparación y su utilización como inhibidor o activador de la
angiogénesis
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<130> B 13445.3 MDT
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<140>
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<141>
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<150> FR nº 0012654
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<151>
2000-10-04
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<160> 25
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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<223> péptido cíclico
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His}
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artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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Gly Gln His Ile Gly}
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<223> Descripción de la secuencia
artificial secuencia procedente de VEGF-A
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Gln His Ile Gly Glu}
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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Gln His Ile Gly Glu}
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artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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His Ile Gly Glu}
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artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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Gln His Ile}
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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\sa{Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln
His Ile Gly Glu}
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\sa{Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln
His Ile Gly}
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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<221> MOD_RES
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<222> (5)
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<223> (D)Pro
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\sa{Gly Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln
His}
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<210> 20
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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\sa{Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln
His Ile Gly Glu}
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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<400> 21
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\sa{Pro Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly
Gln His Ile Gly Glu}
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<210> 22
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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<400> 22
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\sa{Gly Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly
Gln His Ile Gly Glu}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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<220>
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<223> péptido cíclico
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (1)
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<223> (D)Phe
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\sa{Phe Arg Ile Lys Pro His Gln}
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<211> 10
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<213> secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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<223> péptido cíclico
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\sa{Glu Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
Gln}
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<213> secuencia artificial
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artificial: secuencia procedente de VEGF-A
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<223> péptido ciclico
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<400> 25
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\sa{Gly Arg Ile Lys Pro His}
Claims (23)
1. Ciclopéptido, escogido entre los compuestos
siguientes:
2. Composición farmacéutica para inhibir la
angiogénesis, que comprende un ciclopéptido escogido entre los
ciclopéptidos:
3. Composición farmacéutica para activar la
angiogénesis, que comprende dos ciclopéptidos iguales o diferentes,
acoplados con un compuesto orgánico farmacéuticamente aceptable, en
que los ciclopéptidos son escogidos entre los ciclopéptidos:
4. Sistema que comprende un ciclopéptido según
la reivindicación 1, unido de forma covalente a un brazo separador
orgánico.
5. Sistema según la reivindicación 4, en el que
el brazo separador orgánico está unido de forma covalente a un
soporte.
6. Sistema que comprende dos ciclopéptidos según
la reivindicación 1, unidos de forma covalente a un compuesto
orgánico.
7. Sistema que según la reivindicación 6, en el
que la distancia entre los dos ciclopéptidos es tal que cuando el
sistema es puesto en contacto con células que expresan receptores
del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), permite la
dimerización de estos receptores.
8. Sistema que según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 y 7, en el que el compuesto orgánico está unido
de forma covalente a un soporte por medio de un brazo separador
orgánico.
9. Sistema que comprende un soporte sólido sobre
el que son fijados por enlace covalente ciclopéptidos según la
reivindicación 1, en el que cada uno de los ciclopéptidos está unido
al soporte por un brazo separador orgánico.
10. Sistema que según una cualquiera de las
reivindicaciones 4, 5, 8 y 9, en el que el brazo separador comprende
una cadena hidrocarbonada, fluorocarbonada, de poliéter,
polietilenglicol, poliamina, poliamida, poliéster, polisiloxano o
una combinación de estos, que está funcionalizada en cada extremidad
para formar un enlace covalente, por una parte con el ciclopéptido
y, por otra parte, con el soporte.
11. Sistema según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 10, en el que el brazo separador orgánico
comprende además un resto susceptible de ser cortado por un sistema
enzimático.
12. Sistema que según la reivindicación 11, en
el que el brazo separador orgánico comprende además un compuesto
bioactivo.
13. Sistema que según una cualquiera de las
reivindicaciones 5, 8 y 9, en el que el soporte es un sólido
orgánico o inorgánico.
14. Sistema que según una cualquiera de las
reivindicaciones 5, 8 y 9, en el que el soporte es un polímero
orgánico en forma sólida o en forma de gel.
15. Sistema que según la reivindicación 14, en
el que el polímero orgánico es un polímero biocompatible,
biodegradable o no biocompatible ni biodegradable.
16. Sistema que según la reivindicación 15, en
el que el polímero orgánico es escogido entre
poli(teraftalato de etileno), copolímeros de fluoruro de
vinilideno y hexafluoropropileno, poli(alcoholes vinílicos),
poli(metacrilato de hidroxietilo), polisacáridos y sus
copolímeros.
17. Sistema que según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 y 5, para inhibir la angiogénesis.
18. Sistema que según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, para activar la angiogénesis.
19. Procedimiento de preparación de un sistema
que según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, que
consiste en someter un soporte de polímero orgánico a una
irradiación por medio de radiaciones ionizantes, plasmas o fotones,
sobre zonas definidas del soporte, e injertar seguidamente sobre
estas zonas del soporte un brazo separador orgánico.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que se realiza la irradiación a través de una máscara.
21. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que las irradiaciones ionizantes son un haz de electrones o
iones pesados rápidos.
22. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que los ciclopéptidos son fijados sobre los brazos separadores
orgánicos antes del injertado.
23. Procedimiento según la reivindicación 19,
que comprende además una etapa de fijación de los ciclopéptidos
sobre los brazos separadores orgánicos, después del injertado de
éstos.
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