CN115151556A - 人转铁蛋白受体结合肽 - Google Patents

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余田英士
桥本秀彦
藤山纱希
大内政辉
中村菜穂子
纳希鲁·加藤·巴西鲁汀
泽井直己
江原武
多久和正训
舛屋圭一
稻叶慎之介
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JCR Pharmaceuticals Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种通过与人转铁蛋白受体(hTfR)结合而可穿过血脑屏障(BBB)的肽等。本发明一种肽等，其具有:序列号1所记载的氨基酸序列(Ala‑Val‑Phe‑Val‑Trp‑Asn‑Tyr‑Tyr‑Ile‑Ile‑Ser‑Cys)；或在序列号1所记载的氨基酸序列中具有1以上且10以下的氨基酸残基的置换、缺失、加成和/或插入的氨基酸序列。

Description

人转铁蛋白受体结合肽
技术领域
本发明关于可与人转铁蛋白受体(hTfR)结合的肽。此发明关于可穿过血脑屏障(BBB)的肽、对于肌肉组织具有指向性的肽、具有细胞穿透性的肽。再者，本发明关于通过此等肽而将任意物质送达脑内的方法及将任意物质送达肌肉组织的方法等。
背景技术
除了包含脑室周围器官(松果体、脑下垂体、极后区等)的几个区域以外，对于脑的大部分组织供给血液的毛细血管与存在于肌肉等其他组织的毛细血管不同，形成其内皮的内皮细胞彼此通过稳固的细胞间接合而相互附着。因此，会阻碍从血液往脑被动运输物质，虽也有例外，但除了脂溶性高的物质或分子量小(200-500道尔顿以下)且在生理pH附近呈电中性的物质以外，难以从毛细血管移行至脑。此种经由脑内的毛细血管内皮而限制血液与脑的组织液之间的物质交换的机制，被称为血脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)。并且，血脑屏障不仅限制脑，也限制包含脑及脊髓的中枢神经系统的组织液与血液之间的物质交换。通过血脑屏障的存在，中枢神经系统的大部分细胞不会受到血中的激素、淋巴激素等物质的浓度变动的影响，能保持其生化学的恒常性。
作为穿过血脑屏障使高分子物质到达脑内的方法，已报导各种将该高分子物质进行修饰以使其与存在于脑内毛细血管的内皮细胞上的膜蛋白质亦即转铁蛋白受体具有亲和性的方法(专利文献1-3)。例如，在专利文献1中，记载一种血脑屏障穿梭体，其与转铁蛋白受体具有亲和性，且可与所述受体结合。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2015-528452号公报
专利文献2：日本特开H06-228199号公报
专利文献3：WO2016/208695
专利文献4：WO2019/151539
发明内容
发明所欲解决的课题
此说明书所记载的一发明的目的在于提供一种与人转铁蛋白受体(hTfR)结合的新颖的肽。
另一发明的目的在于进一步提供一种可穿过血脑屏障(BBB)的肽、对于肌肉组织具有指向性且可有效率地移行至肌肉组织的肽及具有细胞穿透性的肽。
另一发明的目的在于提供上述的新颖的肽的各种用途。
解决课题的技术手段
此说明书所记载的一发明关于与转铁蛋白受体结合的肽。
此肽具有:序列号1所记载的氨基酸序列(Ala-Val-Phe-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Ile-Ser-Cys)；或在序列号1所记载的氨基酸序列中具有1以上且10以下的氨基酸残基的置换、缺失、加成和/或插入的氨基酸序列。
发明功效
根据此说明书所记载的发明，如同由实施例所证实，可提供与人转铁蛋白受体(hTfR)结合的肽、可穿过血脑屏障(BBB)的肽、对于肌肉组织具有指向性的肽、具有细胞穿透性的肽等。
附图说明
图1是置换附图并表示各组织中的荧光强度测量结果的照片。
图1-2是置换附图并表示各组织中的荧光强度测量结果的照片。
图1-3是置换附图并表示各组织中的荧光强度测量结果的照片。
图2是置换附图并表示在已放大的脑中的荧光强度测量结果的照片。
图3是置换附图并表示小鼠脑内局部存在确认试验(单剂量)结果的照片。
图4是置换附图并表示小鼠脑内局部存在确认试验(多剂量)结果的照片。
图5是置换附图并表示往人乳癌细胞移行的荧光显微镜照片。
具体实施方式
为了以下，使用附图说明用于实施本发明的方式。本发明并不受限于以下所说明的方式，也包含在本领域的技术人员可理解的范围内从以下方式进行适当修正者。
此说明书所记载的一发明是关于与转铁蛋白受体结合且能穿过血脑屏障的肽。
转铁蛋白受体
所谓转铁蛋白受体，表示一种受体，其被包含在血浆中，且与和铁离子结合的蛋白质亦即转铁蛋白结合，并具有被摄入细胞内的功能。转铁蛋白受体会在网织红细胞、胎盘的滋养层细胞、淋巴球等各种细胞上表现，尤其被暗示会在肿瘤细胞表现。并且，转铁蛋白受体因具有通过血浆中的铁离子的结合刺激而触发细胞的内吞作用的性质，故正进行将结合至转铁蛋白受体的抗体等使用作为DDS而使物质通过BBB的研究。在本案说明书中，只要没有特别标记，则将人型的转铁蛋白受体标记为人TfR、hTfR或仅TfR。
与转铁蛋白受体结合的肽
所谓与转铁蛋白受体结合(也称具有结合活性、具有亲和性)，意指对于转铁蛋白受体进行特异性结合。
亲和性虽通过针对转铁蛋白受体与结合肽的解离的平衡常数(KD)表示，但其是表示转铁蛋白受体与结合肽上的抗原结合部位之间的结合强度的尺度，随着KD的值变小，转铁蛋白受体与结合肽之间的结合强度变强(作为置换，亲和性也能以1/KD亦即亲和性常数(KA)表示)。如本领域的技术人员所能理解(例如，基于本说明书中的进一步开示)，亲和性能因应目标的特定抗原而确定其本身众所周知的样式。结合活性是转铁蛋白受体与结合肽之间的结合强度的尺度。结合活性是关于转铁蛋白受体与其在结合肽上的结合部位之间的亲和性，以及存在于结合分子上的相关结合部位的数量这两者。
转铁蛋白受体与结合肽的特异性结合例如能以包含本说明书所记载的表面等离子共振(SPR)分析、斯卡查德分析以和/或放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及三明治竞争分析等竞争结合分析，以及在所属技术领域中其本身众所周知的其不同的变异体的其本身众所周知的任意适当样式而定。优选为，本发明的肽与转铁蛋白受体的亲和性为小于100nM，优选为小于50nM的KD。
能穿过血脑屏障(BBB)
所谓能通过BBB，意指例如可使物质穿过BBB至脑内，在脑内的任意部位中在投予后的某时间能检测该物质或其代谢物，或者能获得可类推该物质在脑内造成影响的见解。
脑相关疾病
所谓脑相关疾病，表示由脑中发生的某种异常所导致的疾病，例如中枢神经(CNS)疾病。作为脑相关疾病的例子，未被限定，但可为阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒病、亨廷顿病、溶酶体贮积病、中枢神经系统疾病、包含脑肿瘤在内的中枢神经系统的肿瘤、脑缺血、伴随脑损伤的疾病、外伤性的中枢神经系统疾病、病毒性及细菌性的中枢神经系统疾病、精神分裂症、抑郁症等造成精神性影响的疾病等。
对于肌肉组织具有指向性
所谓肌肉组织，可为心肌、骨骼肌及平滑肌的任一种。特别优选的肌肉组织为心肌或骨骼肌。所谓对于肌肉组织具有指向性，意指具有特异性、有效率地移行至肌肉组织的性质。
神经肌肉疾病
所谓神经肌肉疾病，表示由脑、脊髓、末梢神经等神经或肌肉的病变所导致的肌力的降低等运动障碍的疾病。神经肌肉疾病的例子，未被限定，但可为脊髓小脑变性症、肌萎缩侧索硬化症、重症肌无力症、肌营养不良症、多发性肌炎、遗传性肌病、神经肌肉疾病、肌肉萎缩症、药源性肌病、急性心力衰竭、慢性心力衰竭、心肌梗塞、慢性疲劳综合症、线粒体疾病、线粒体呼吸链复合体异常症及格林巴利综合症。
具有细胞穿透性的肽
具有细胞穿透性的肽，例如如同日本特许第6478632号公报及日本特许第6708770号(具有细胞通透性的肽)所记载，为众所周知。而且，如同实施例所示，本发明的肽是与转铁蛋白受体结合，并被摄入细胞内。因此，若使用本发明的肽或其复合体，则能将目标的有效成分递送至细胞内，例如，能将核酸医药送至细胞内。
肽
是指连续多个氨基酸的结构，其意义中也包含多肽、蛋白质。此外，在本案中，所谓氨基酸，不仅包含在细胞内转译mRNA并被并入肽链的天然存在的氨基酸(天然氨基酸)，也包含可通过肽结合而构成肽链的一部分的非天然存在的氨基酸(非天然氨基酸)。氨基酸可为人工合成者，也可为存在于自然界者。
并且，在本案中，本发明的肽、肽与物质的复合体也包含通过合成后环状化而形成环状部的肽(也称为环状肽)、将该肽进行进一步化学修饰而得的肽、肽与结合至肽的物质的复合体、肽与物质通过连接子而结合的复合体。
在本说明书中，所谓环状肽，是指在肽中，其氨基酸序列中间隔1个以上的氨基酸残基而分离的2个氨基酸彼此互相结合，因此其全部或一部分成为环状者。此外，在此，该2个氨基酸彼此的结合形式未被特别限定，但环状肽也包含以下者:通过其中一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间的酰胺键、其中一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的硫醇基之间的硫醚键、其中一个氨基酸的硫醇基与另一个氨基酸的硫醇基之间的硫醇键、内酰胺环形成或巨环化反应而形成环状结构者；或具有套索肽状结构者等。但是，该2个氨基酸彼此通过酰胺键而结合的情形，该酰胺键不限于通过其中一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基结合而形成者，只要合成反应的结果是通过酰胺键进行结合即可。针对其他结合形式也同样。
亦即，在本案中，环状肽只要其一部分为形成环状结构者即可，也可具有直链部。
此外，在本说明书中，为了肽的环状化而有改变氨基酸的一部分的情形。也包含此种已被改变一部分的氨基酸。可列举例如，像是在位于N端的氨基酸加成氯乙酰基且与肽中的半胱氨酸残基结合而进行环状化的情形，本案的氨基酸也包含已加成氯乙酰基的各种(天然/非天然)氨基酸。
所谓非天然氨基酸，是指天然氨基酸以外的，具有氨基酸的特性的化合物。例如，虽不限在此，但可列举β-氨基酸、γ-氨基酸、L-氨基酸；D-氨基酸(也称为D型氨基酸)；氨基酸变异体、氨基酸衍生物等经化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等在活体内无法成为蛋白质的构成材料的氨基酸等。可列举N-甲基氨基酸、N-乙基氨基酸、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸、在侧链具有多余的亚甲基、芳香环等结构的氨基酸及具有侧链中的羧酸官能基氨基酸被磺酸基置换的结构的氨基酸衍生物等。
以下揭示非天然氨基酸的例子与本说明书中的简称。括弧内表示CAS参考编号或购入来源公司名，针对新合成者则是表示合成例编号。此外，针对CAS编号，是该非天然氨基酸单体或保护基结合者，但特殊氨基酸不受限在此等，例如，此等分子中的氢原子的1个或多个被置换成烷基的结构者也为特殊氨基酸。氢原子被置换成烷基的情形，烷基优选为甲基、乙基，更优选为甲基。此外，在本说明书中，在氨基酸名的前方记载有Me或N-Me-的氨基酸，只要没有特别记载则表示N-甲基氨基酸。例如，丙氨酸(Ala或A)的N-甲基化氨基酸表示为MeAla、N-MeAla、MeA或N-MeA。并且，针对为单字母标记的氨基酸标记且其前方记载有d的氨基酸，表示为D-氨基酸。例如，针对丙氨酸(Ala或A)的D-氨基酸，表示为da。未记载CAS编号、购入来源者，可作为一般的试剂而购入。此外，关于以下的氨基酸，在肽合成中，能通过以既知的方法将阿尔法氨基进行Fmoc保护而使用。
Yph (S)-2-氨基-3-(4-苯氧基苯基)丙酸(CAS编号:180414-93-1)
W7OMe (S)-2-氨基-3-(7-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙酸(CAS编号:2416720-26-6)
W7N (S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-β]吡啶-3-基)丙酸(CAS编号:737007-45-3)
W7F (S)-2-氨基-3-(7-氟-1H-吲哚-3-基)丙酸(CAS编号:1956434-65-3)
W6N (S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)丙酸(KISHIDA CHEMICAL股份有限公司)
W6F (S)-2-氨基-3-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙酸(CAS编号:908847-01-8)
W5OMe 5-甲氧基-L-色氨酸(CAS编号:460751-69-3)
W5F (S)-2-氨基-3-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙酸(CAS编号:908846-88-8)
W4OMe 4-甲氧基-L-色氨酸(CAS编号:1205553-56-5)
W4N (S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[3,2-β]吡啶-3-基)丙酸(CAS编号:149818-23-5)
W4F (S)-2-((((9H-芴-9-基)-甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(tert-丁氧基羰基)-4-氟-1H-吲哚-3-基)丙酸(CAS编号:2244532-65-6)
W4C (S)-2-氨基-3-(4-氯-1H-吲哚-3-基)丙酸(CAS编号:2244532-68-9)
W2N (S)-2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(CAS编号:2305185-20-8)
W1iPr 1-异丙基-L-色氨酸(CAS编号:1496563-42-8)
W1Et7Cl (S)-2-氨基-3-(7-氯-1-乙基-1H-吲哚-3-基)丙酸(合成例2-1)
W1Et 1-乙基-L-色氨酸(CAS编号:168471-23-6)
Tbg (S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酸(CAS编号:33105-81-6)
pHPeG N-(4-羟基苯乙基)甘氨酸(CAS编号:258332-56-8)
PeG N-(2-苯基乙基)-甘氨酸(CAS编号:540483-58-7)
Nva L-正缬氨酸(CAS编号:6600-40-4)
Nle N-α-氯乙酰基-L-正亮氨酸(CAS编号:688-12-0)
Nal2 β-(2-萘基)L-丙氨酸(CAS编号:58438-03-2)
Nal1 β-(1-萘基)L-丙氨酸(CAS编号:2353616-32-5)
MeoBph N-α-甲基-2-苯基-L-苯丙氨酸
MeNal2 N-α-甲基-β-(2-萘基)-L-丙氨酸(CAS编号:179385-30-9)
MeNal1 N-α-甲基-β-(1-萘基)-L-丙氨酸(CAS编号:1380327-68-3)
MemBph N-α-甲基-3-苯基-L-苯丙氨酸
Hph L-高苯丙氨酸(CAS编号:943-73-7)
Hly (S)-2,7-二氨基庚酸(CAS编号:498-56-6)
F4OMe (S)-2-氨基-3-(4-甲氧基苯基)丙酸(CAS编号:7635-29-2)
F4G (4-胍基)-L-苯丙氨酸(CAS编号:59574-11-7)
F4F 4-氟-L-苯丙氨酸(CAS编号:1132-68-9)
F4C N-α-氯乙酰基-4-氯-L-苯丙氨酸(CAS编号:14173-39-8)
F3OMe (S)-2-氨基-3-(3-甲氧基苯基)丙酸(CAS编号:98813-19-5)
F3F 3-氟-L-苯丙氨酸(CAS编号:19883-77-3)
F3C N-α-氯乙酰基-3-氯-L-苯丙氨酸(CAS编号:80126-51-8)
F2OMe (S)-2-氨基-3-(2-甲氧基苯基)丙酸(CAS编号:206060-41-5)
F2C (S)-2-氨基-3-(2-氯苯基)丙酸(CAS编号:198560-41-7)
MeF4OMe (s)-3-(4-甲氧基苯基)-2-(甲基氨基)丙酸(CAS编号:1260595-45-6)
MeF4F N-α-甲基-4-氟-L-苯丙氨酸(CAS编号:1979176-87-8)
MeF3F N-α-甲基-3-氟-L-苯丙氨酸(CAS编号:1820567-10-9)
MeF3C N-α-甲基-3-氯氟-L-苯丙氨酸(CAS编号:1446478-28-9)
MeBph N-α-甲基-4-苯基-L-苯丙氨酸
Me4Py N-α-甲基-4-吡啶基-L-丙氨酸
Me3Py N-α-甲基-3-吡啶基-L-丙氨酸
dr D-精氨酸
dp D-脯氨酸
dc D-半胱氨酸
dk D-赖氨酸
Dap L-α,β-二氨基丙酸(CAS编号:515-94-6)
Dab (S)-4-氨基-2-(2-氯乙酰胺)丁酸(CAS编号:25691-37-6)
Cit 2-氨基-5-脲基戊酸(CAS编号:627-77-0)
Cha β-环己基-L-丙氨酸(CAS编号:4441-50-3)
CeG N-(2-羧基乙基)-甘氨酸(CAS编号:174799-89-4)
Cbg (S)-2-氨基-2-环丁基乙酸(CAS编号:1391630-31-1)
Cba 环丁基丙氨酸(CAS编号:478183-62-9)
aMeY α-甲基-L-酪氨酸(CAS编号:658-48-0)
aMeW α-甲基-色氨酸(CAS编号:153-91-3)
aMeK α-甲基-赖氨酸(CAS编号:111717-28-3)
aMeC α-甲基-L-半胱氨酸(CAS编号:441317-73-3)
Aib α-甲基丙氨酸(CAS编号:62-57-7)
Ahp/Alahp (S)-2-氨基庚酸(CAS编号:1115-90-8)
Abu L-α-氨基丁酸(CAS编号:1492-24-6)
A4paa (S)-2-氨基-3-(1-(羧甲基)哌嗪-4-基)丙酸(KISHIDA CHEMICAL股份有限公司)
5Ind (S)-2-氨基-3-(1H-吲哚-5-基)丙酸(CAS编号:1655518-66-3)
4Py2NH2 (S)-2-氨基-3-(2-氨基吡啶-4-基)丙酸(KISHIDA CHEMICAL股份有限公司)
4Py 4-吡啶基-L-丙氨酸(CAS编号:1956-21-4)
3Py6NH2 2-氨基-3-(6-氨基吡啶-3-基)丙酸(合成例2-3)
3Py 3-吡啶基-L-丙氨酸(CAS编号:17470-24-5)
W1aa 1-(羧甲基)-L-色氨酸(CAS编号:773823-50-0)
KCOpipzMe N6-(4-甲基哌嗪-1-羰基)-L-赖氨酸(KISHIDA CHEMICAL股份有限公司)
W1mCON 1-(2-氨基-2-氧代乙基)-L-色氨酸(合成例2-5)
W1EtOH 1-(2-羟乙基)-L-色氨酸(合成例2-9)
3Py6OMe (S)-2-氨基-3-(6-甲氧基吡啶-3-基)丙酸(CAS编号:1270317-99-1)
Epyrl2RCOO 2-((5-((R)-2-((烯丙氧基)羰基)吡咯啶-1-基)-5-氧代戊酸
Dpyrl2RCOO 2-((4-((R)-2-((烯丙氧基)羰基)吡咯啶-1-基)-4-氧代丁酸(实施例9-16)
MeF3COO 3-羧基-N-甲基-苯丙氨酸(CAS编号:1499826-56-0)
3Imp 2-氨基-3-(咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)丙酸(CAS编号:2276942-95-9)
KaAc N6-甘氨酰基-L-赖氨酸(合成例2-8)
A1Me4pip 4-氨基-1-甲基哌嗪-4-羧酸(CAS编号:15580-66-2)
Har N6-甲脒基-L-赖氨酸(CAS编号:156-86-5)
Acpr (S)-2-氨基-3-环丙基丙酸(CAS编号:1492156-90-7)
Atb (S)-2-氨基-4,4-二甲基戊酸(CAS编号:1934633-35-8)
MeF35dC (S)-3-(3,5-二氯苯基)-2-(甲基氨基)丙酸(CAS编号:1542508-65-5)
Adod 12-氨基十二酸
Hly L-高赖氨酸
W5C 5-氯-L-色氨酸
F3COO L-3-羧基苯丙氨酸
F3CON L-3-氨甲酰苯丙氨酸
Hgl L-2-氨基己二酸
Ndm N,N-二甲基-L-天冬酰胺
KN3或者LysN3 6-叠氮基-L-正亮氨酸
KAc N6-乙酰基-L-赖氨酸
dorn D-鸟氨酸
Nle L-正亮氨酸
F3H 3-羟基-L-苯丙氨酸
Yae O-(2-氨基甲基)-L-酪氨酸
F4aao O-(2-羧甲基)-L-酪氨酸
F4OEt O-乙基-L-酪氨酸
F34dOMe 3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸
alT L-别苏氨酸
alI L-别异亮氨酸
MeK N-甲基-L-赖氨酸
Tbg (S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酸
Nva L-正缬氨酸
Abu (S)-(+)-2-氨基丁酸
da D-丙氨酸
Bph 4-苯基-L-苯丙氨酸
de D-谷氨酸
MeA N-甲基-L-丙氨酸
PEG4c或者PEG3 1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-羧酸
MeR N-甲基-L-精氨酸
MeW N-甲基-L-色氨酸
PEG8c 1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-羧酸
PEG12c或者PEG11或者PEG12 1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-羧酸
此外，新颖合成氨基酸因在制造各种肽衍生物时有可在各种肽加成新功能的可能性，故为有用。
本发明的肽具有:序列号1所记载的氨基酸序列(Ala-Val-Phe-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Ile-Ser-Cys)；或在序列号1所记载的氨基酸序列中具有1以上且10以下的氨基酸残基的置换、缺失、加成和/或插入的氨基酸序列。
针对肽序列
氨基酸的被置换、缺失、加成和/或插入的氨基酸的数只要为1个以上且10个以下即可，其下限为1个。其上限为10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个，最少1个。此氨基酸的置换，优选为保存性氨基酸置换。
保存性氨基酸置换
所谓“保存性氨基酸置换(conservative amino acid substitution)”，意指与功能性等价或类似的氨基酸的置换。肽中的保存性氨基酸置换是对于该肽的氨基酸序列造成静态变化。例如，具有同样极性的一个或二个以上的氨基酸是功能性等价地进行作用，对在此肽的氨基酸序列造成静态变化。一般而言，某一群组内的置换可被认为对于结构及功能为保存性。然而，如本领域的技术人员可理解的，特定的氨基酸残基所发挥的作用，能由包含该氨基酸的分子在三维结构中的意义而决定。例如，半胱氨酸残基可为氧化型的(二硫化物)形式，其相较于还原型的(硫醇)形式极性更低。精氨酸侧链的长的脂肪族的部分能构成结构性及功能性重要的特征。并且，包含芳香环的侧链(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)能有助于离子-芳香族相互作用或阳离子-pi相互作用。在此情形中，即使将具有此等侧链的氨基酸置换成属于酸性或非极性群组的氨基酸，结构性及功能性仍能为保存性。脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸(二硫化物形式)等的残基有对于主链的立体结构带来直接效果的可能性，无法屡次无结构上变形地进行置换。
保存性氨基酸置换是如同以下所示，包含基于侧链的类似性的特异性置换(Lehninger，生化学，改订第2版，1975年刊登，73至75页:L.Lehninger,Biochemistry,2ndedition,pp73-75,Worth Publisher,New York(1975))及典型性置换。
此肽的优选例，包含具有选自以下群组的1个以上的置换的氨基酸序列:
序列号1的第1个丙氨酸残基被脂肪族氨基酸或甲基化脂肪族氨基酸置换；
序列号1的第2个缬氨酸残基被碱性氨基酸残基或甲基化碱性氨基酸残基置换；
序列号1的第3个苯丙氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
序列号1的第4个缬氨酸残基被甲基化缬氨酸残基置换；
序列号1的第5个色氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基色氨酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
序列号1的第6个天冬酰胺残基被中性氨基酸或甲基化中性氨基酸置换；
序列号1的第7个及第8个酪氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
序列号1的第9个异亮氨酸残基被脂肪族氨基酸残基、甲基化脂肪族氨基酸残基或具有支链结构的氨基酸残基置换；
序列号1的第10个异亮氨酸残基被任意氨基酸置换；及
序列号1的第11个丝氨酸残基被中性氨基酸残基置换。
(1)非极性氨基酸群组:丙氨酸(以下，标记为“Ala”或仅标记为“A”)、缬氨酸(以下，标记为“Val”或仅标记为“V”)、亮氨酸(以下，标记为“Leu”或仅标记为“L”)、异亮氨酸(以下，标记为“Ile”或仅标记为“I”)、脯氨酸(以下，标记为“Pro”或仅标记为“P”)、苯丙氨酸(标记为“Phe”或仅标记为“F”)、色氨酸(以下，标记为“Trp”或仅标记为“W”)、甲硫氨酸(以下，标记为“Met”或仅标记为“M”)。
(2)非荷电极性氨基酸群组:甘氨酸(以下，标记为“Gly”或仅标记为“G”)、丝氨酸(以下，标记为“Ser”或仅标记为“S”)、苏氨酸(以下，标记为“Thr”或仅标记为“T”)、半胱氨酸(以下，标记为“Cys”或仅标记为“C”)、酪氨酸(以下，标记为“Tyr”或仅标记为“Y”)、天冬酰胺(以下，标记为“Asn”或仅标记为“N”)、谷氨酰胺(以下，标记为“Gln”或仅标记为“Q”)。
(3)酸性氨基酸群组:天冬氨酸(以下，标记为“Asp”或仅标记为“D”)、谷氨酸(以下，标记为“Glu”或仅标记为“E”)。
(4)碱性氨基酸群组:赖氨酸(以下，标记为“Lys”或仅标记为“K”)、精氨酸(以下，标记为“Arg”或仅标记为“R”)、组氨酸(以下，标记为“His”或仅标记为“H”)。
并且，存在于自然界的氨基酸，可基于其共通的侧链的性质而分成如以下般的群组。
(1)疏水性氨基酸群组:正亮氨酸(Norleucine)、Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2)中性亲水性氨基酸群组:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性氨基酸群组:Asp、Glu
(4)碱性氨基酸群组:His、Lys、Arg
(5)对主链的方向造成影响的氨基酸的群组:Gly、Pro
(6)芳香族氨基酸群组:Trp、Tyr、Phe
此外，在各群组中，也包含被N-甲基化的氨基酸等非天然氨基酸。
此肽的优选例是具有序列号2(Ala-Val-Phe-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Ile-Arg-Arg-Tyr-MeTyr-Cys)所记载的氨基酸序列的肽。
此肽的优选例，包含在序列号2所记载的氨基酸序列中具有选自以下群组的1个以上的置换的氨基酸序列:
序列号2的第1个丙氨酸残基被脂肪族氨基酸或甲基化脂肪族氨基酸置换；
序列号2的第2个缬氨酸残基被碱性氨基酸残基或甲基化碱性氨基酸残基置换；
序列号2的第3个苯丙氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
序列号2的第4个缬氨酸残基被甲基化缬氨酸残基置换；
序列号2的第5个色氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
序列号2的第6个天冬酰胺残基被中性氨基酸或甲基化中性氨基酸置换；
序列号2的第7个及第8个酪氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
序列号2的第9个异亮氨酸残基被脂肪族氨基酸残基、甲基化脂肪族氨基酸残基或具有支链结构的氨基酸残基置换；
序列号2的第10个异亮氨酸残基被任意氨基酸置换；
序列号2的第11个及第12个精氨酸残基被碱性氨基酸残基置换；
序列号2的第13个酪氨酸残基被亲水性氨基酸残基置换；
序列号2的第14个甲基酪氨酸残基被酪氨酸残基、芳香族氨基酸残基或甲基化芳香族氨基酸残基置换；及
序列号2的第15个半胱氨酸残基被甲基化半胱氨酸残基置换。
此肽优选的另一例为，若将肽A设为包含序列号18(Ala-Val-Phe-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Ile-Ser-Cys)的第1个-第10个所记载的氨基酸序列并且肽长度为10以上且17以下，则所述肽为以下的肽:
肽A；或
在肽A中，具有含1以上且6以下的氨基酸残基的置换、缺失和/或插入的氨基酸序列的肽。
此说明书中的优选的肽的例子，与上述的肽同样为可结合至人转铁蛋白受体(hTfR)的肽。并且，优选例是可穿过血脑屏障(BBB)的肽、对于肌肉组织具有指向性的肽或具有细胞穿透性的肽。
也可为以下的肽:在肽A中，具有序列号18的第2、3、5、8及10个中的任一个氨基酸残基被置换的氨基酸序列。
所谓“氨基酸残基被置换”，意指特定的氨基酸残基被置换成其他可被修饰的氨基酸残基。
也可为以下的肽:在肽A中，
序列号18的第2个氨基酸残基为可被修饰的缬氨酸(Val)或可被修饰的谷氨酸(Glu)，
序列号18的第3个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)，
序列号18的第5个氨基酸残基为可被修饰的色氨酸(Trp)，
序列号18的第8个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)，
序列号18的第10个氨基酸残基为可被修饰的异亮氨酸(Ile)或可被修饰的缬氨酸(Val)。
所谓“可被修饰的”，意指可进行众所周知的氨基酸修饰或改变。修饰的例子为N-甲基化、后述具有简称的氨基酸修饰、往D型的修饰(转换)、往众所周知的该氨基酸的衍生物的转换。
此肽优选为肽长度为11以上且13以下。
此肽进一步更优选为具有以下的氨基酸序列的肽。
可为序列号18的第2个氨基酸残基为Val或Glu，
序列号18的第3个氨基酸残基为Phe或MeF3C，
序列号18的第5个氨基酸残基为Trp或MeTrp，
序列号18的第8个氨基酸残基为Tyr或F4OMe，
序列号18的第10个氨基酸残基为Ile或Val的肽。
再者，此肽为在肽A的N端具有以下的氨基酸序列的肽。
可为序列号18的第11个氨基酸残基为Ser或His，
序列号18的第12个氨基酸残基为Cys或Hgl的肽。
此肽优选的另一例为，若将肽B设为包含序列号15(Ala-Val-Phe-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Val-Pro-Arg-Asp-Cys)的第1个-第10个所记载的氨基酸序列并且肽长度为10以上且19以下，则所述肽为以下的肽:
肽B；或
在肽B中，具有含1以上且5以下的氨基酸残基的置换、缺失和/或插入的氨基酸序列的肽。
也可为以下的肽:在肽B中，具有序列号15的第2、3、5、8及10个中的任一个氨基酸残基被置换的氨基酸序列。
也可为以下的肽:在肽B中，
序列号15的第2个氨基酸残基为可被修饰的缬氨酸(Val)或可被修饰的谷氨酸(Glu)，
序列号15的第3个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)或色氨酸(Trp)，
序列号15的第5个氨基酸残基为可被修饰的色氨酸(Trp)，
序列号15的第8个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)，
序列号15的第10个氨基酸残基为可被修饰的异亮氨酸(Ile)或可被修饰的缬氨酸(Val)。
此等肽的肽长度可为13以上且15以下。
此肽进一步更优选为具有以下的氨基酸序列的肽。
可为序列号15的第2个氨基酸残基为Val或Glu，
序列号15的第3个氨基酸残基为Phe、Trp或MeF3C，
序列号15的第5个氨基酸残基为Trp或MeTrp，
序列号15的第8个氨基酸残基为Tyr、Phe或F4OMe，
序列号15的第10个氨基酸残基为Ile或Val的肽。
再者，此肽为在肽B的N端具有以下的氨基酸序列的肽。
可为序列号15的第11个氨基酸残基为Phe，
序列号15的第12个氨基酸残基为Arg，
序列号15的第13个氨基酸残基为Glu、Asn、Asp、His、Gln或MeTrp，
序列号15的第14个氨基酸残基为Cys的肽。
此肽优选的另一例为，若将肽C设为包含序列号214(MeA-Val-MeF3C-Val-MeW-Asn-Tyr-F4OMe-Ile-Ile-Arg-Arg-Phe-MeY-Cys)的第1个-第10个所记载的氨基酸序列并且肽长度为11以上且19以下，则所述肽为以下的肽:
肽C；或
在肽C中，具有含1以上且5以下的氨基酸残基的置换、缺失和/或插入的氨基酸序列的肽。
也可为以下的肽:在肽C中，具有序列号214的第1、3、5及8个中的任一个氨基酸残基被置换的氨基酸序列。
也可为以下的肽:在肽C中，
序列号214的第1个氨基酸残基为可被修饰的丙氨酸(Ala)或可被修饰的谷氨酸(Glu)，
序列号214的第3个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)，
序列号214的第5个氨基酸残基为可被修饰的色氨酸(Trp)，
序列号214的第8个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)。
此等肽优选为肽长度为15以上且18以下。
此肽进一步更优选为具有以下的氨基酸序列的肽。
可为序列号214的第1个氨基酸残基为Ala、Aib、Abu、Glu、Gly、Ser、Phe、Pro或MeA，特别优选为Ala或MeA，
序列号214的第3个氨基酸残基为Phe、F3C、F2C、F2OMe、F4C、Cha、MeF、MeF35dC、MeF4F、MeF4Ome、MeNal1、Me3Py、Me4Py、Me3OMe、MeF3COO、MeF3F、Glu、Epyrl2RCOO、Dpyrl2RCOO或MeF3C，特别优选为Phe、MeF或MeF3C，
序列号214的第5个氨基酸残基为Trp、MeW、aMeW、dp、F3C、F3F、F3OMe、F4C、F4F、Hph、MemBph、MeNal1、MeNal2、MeoBph、W4OMe、W1Et、W1Et7Cl、W1iPr、Yph、W1Pr、W5C、W5F、W1aa、W1EtOH、W4OMe、W1mCON或W6F，特别优选为Trp、MeW，
序列号214的第8个氨基酸残基为Phe、Tyr、Typ、Ahp、MeY、F4OMe、3Imp、4Py、3Py、3Py6OMe、F3C、F3CON、F4C、F4aao、F4F、F4OEt、MeF34dOMe、Yae、Lys、Orn或Nal1，特别优选为Tyr或F4OMe的肽。
再者，此肽为在肽C的N端具有以下的氨基酸序列的肽。
可为序列号214的第11个氨基酸残基为Arg、Ala、Asp、Gly、Glu、Lys、MeK、MeR、Dap、Dap、Abu、Aib、Hly、dorn、aMeK、A1Me4pip、KCOpipzMe、F4G、Nle、Nva或Orn，特别优选为Lys或Arg，
序列号214的第12个氨基酸残基为Lys、Arg、dr、Tyr、F4G、Orn、Hly、da、Cit、Dap或Dab，特别优选为Lys、Arg或dr，
序列号214的第13个氨基酸残基为Ala、Phe、Asn、Tyr或pHPeG，特别优选为Phe或Tyr，
序列号214的第14个氨基酸残基为MeTyr、Tyr、Phe、Ala、aMeY、Glu、Gly、Arg、Val、MeoBphMeBph、MeF、MemBph、MeNal1、MeNal2、MeoBph、MeW或pHPeG，特别优选为Phe或MeW，
序列号214的第15个氨基酸残基为Cys或Hgl的肽。
此肽优选的另一例为，若将肽D设为包含序列号219(Ala-Glu-Phe-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Ile-Arg-Arg-Tyr-MeY-Cys)的第1个-第10个所记载的氨基酸序列并且肽长度为11以上且19以下，则所述肽为以下的肽:
肽D；或
在肽D中，具有1以上且5以下的氨基酸残基的置换、缺失和/或插入的氨基酸序列的肽。
也可为以下的肽:在肽D中，具有序列号219的第2、3、5、8及10个中的任一个氨基酸残基被置换的氨基酸序列。
也可为以下的肽:在肽D中，
序列号219的第2个氨基酸残基为可被修饰的缬氨酸(Val)、可被修饰的谷氨酸(Glu)、可被修饰的精氨酸(Arg)、可被修饰的赖氨酸(Lys)、可被修饰的天冬氨酸(Asp)或可被修饰的苯丙氨酸(Phe)，
序列号219的第3个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)，
序列号219的第5个氨基酸残基为可被修饰的色氨酸(Trp)，
序列号219的第8个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)，
序列号219的第10个氨基酸残基为可被修饰的异亮氨酸(Ile)、可被修饰的谷氨酸(Glu)或可被修饰的赖氨酸(Lys)。
此等肽优选为肽长度为15以上且18以下。
此肽进一步更优选为具有以下的氨基酸序列的肽。
可为序列号219的第2个氨基酸残基为Val、Glu、Ala、Arg、Lys、Asp、Phe、Dap、Har、Abu、Nva、AcPr、AtbAhp或Hgl，特别优选为Gln或Val，
序列号219的第3个氨基酸残基为第3个氨基酸残基为Phe、F3C、F2C、F2OMe、F4C、Cha、MeF、MeF35dC、MeF4F、MeF4Ome、MeNal1、Me3Py、Me4Py、Me3OMe、MeF3COO、MeF3F、Glu、Epyrl2RCOO、Dpyrl2RCOO或MeF3C，特别优选为Phe、MeF或MeF3C，
序列号219的第5个氨基酸残基为Trp、MeW、aMeW、dp、F3C、F3F、F3OMe、F4C、F4F、Hph、MemBph、MeNal1、MeNal2、MeoBph、W4OMe、W1Et、W1Et7Cl、W1iPr、Yph、W1Pr、W5C、W5F、W1aa、W1EtOH、W4OMe、W1mCON或W6F，特别优选为Trp、MeW，
序列号219的第8个氨基酸残基为Phe、Tyr、Typ、Ahp、MeY、F4OMe、3Imp、4Py、3Py、3Py6OMe、F3C、F3CON、F4C、F4aao、F4F、F4OEt、MeF34dOMe、Yae、Lys、Orn或Nal1，特别优选为Tyr或F4OMe，
序列号219的第10个氨基酸残基为Ala、Abu、Acpr、Ahp、Aib、alI、alT、Atb、Dab、Dap、dorn、Gln、Hly、Ile、Lys、KCOpipzMe、Leu、Nle、Nva、Pro、Arg、Ser、Thr、Tbg、Val或Tyr，特别优选为Ile或alI的肽。
再者，此肽是在肽C的N端具有以下的氨基酸序列的肽。
可为序列号219的第11个氨基酸残基为Arg、Ala、Asp、Gly、Glu、Lys、MeK、MeR、Dap、Dap、Abu、Aib、Hly、dorn、aMeK、A1Me4pip、KCOpipzMe、F4G、Nle、Nva或Orn，特别优选为Lys或Arg，
序列号219的第12个氨基酸残基为Lys、Arg、dr、Tyr、F4G、Orn、Hly、da、Cit、Dap或Dab，特别优选为Lys、Arg或dr，
序列号219的第13个氨基酸残基为Ala、Phe、Asn、Tyr或pHPeG，特别优选为Phe或Tyr，
序列号219的第14个氨基酸残基为MeTyr、Tyr、Phe、Ala、aMeY、Glu、Gly、Arg、Val、MeoBphMeBph、MeF、MemBph、MeNal1、MeNal2、MeoBph、MeW或pHPeG，特别优选为Phe或MeW，
序列号219的第15个氨基酸残基为Cys或Hgl的肽。
此肽优选的另一例为，若将肽E设为包含序列号296(Ala-Val-MeF-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Ile-Arg-Arg-Tyr-MeY-Cys)的第1个-第15个所记载的氨基酸序列并且肽长度为15以上且18以下，则所述肽为以下的肽:
肽E；或
在肽E中，具有1以上且5以下的氨基酸残基的置换、缺失和/或插入的氨基酸序列的肽。
也可为以下的肽:在肽E中，具有序列号296的第3、5、7、8、11、12、13个中的任一个氨基酸残基被置换的氨基酸序列。
也可为以下的肽:在肽E中，
序列号296的第3个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)，
序列号296的第5个氨基酸残基为可被修饰的色氨酸(Trp)，
序列号296的第7个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)，
序列号296的第8个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)，
序列号296的第11个氨基酸残基为可被修饰的精氨酸(Arg)或可被修饰的丙氨酸(Ala)，
序列号296的第12个氨基酸残基为可被修饰的精氨酸(Arg)或可被修饰的赖氨酸(Lys)，
序列号296的第13个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)或可被修饰的苯丙氨酸(Phe)中的任一者。
并且，也可为以下的肽:在肽E中，
序列号296的第3个氨基酸残基为第3个氨基酸残基为Phe、F3C、F2C、F2OMe、F4C、Cha、MeF、MeF35dC、MeF4F、MeF4Ome、MeNal1、Me3Py、Me4Py、Me3OMe、MeF3COO、MeF3F、Glu、Epyrl2RCOO、Dpyrl2RCOO或MeF3C，特别优选为Phe、MeF或MeF3C，
序列号296的第5个氨基酸残基为Trp、MeW、aMeW、dp、F3C、F3F、F3OMe、F4C、F4F、Hph、MemBph、MeNal1、MeNal2、MeoBph、W4OMe、W1Et、W1Et7Cl、W1iPr、Yph、W1Pr、W5C、W5F、W1aa、W1EtOH、W4OMe、W1mCON或W6F，特别优选为Trp、MeW，
序列号296的第7个氨基酸残基为Tyr、3Py6OMe、Ala、Ahp、Phe、F3H、F4C、Nal1、Arg或Trp，特别优选为Tyr，
序列号296的第8个氨基酸残基为Phe、Tyr、Typ、Ahp、MeY、F4OMe、3Imp、4Py、3Py、3Py6OMe、F3C、F3CON、F4C、F4aao、F4F、F4OEt、MeF34dOMe、Yae、Lys、Orn或Nal1，特别优选为Tyr或F4OMe，
序列号296的第11个氨基酸残基为Arg、Ala、Asp、Gly、Glu、Lys、MeK、MeR、Dap、Dap、Abu、Aib、Hly、dorn、aMeK、A1Me4pip、KCOpipzMe、F4G、Nle、Nva或Orn，特别优选为Lys或Arg，
序列号296的第12个氨基酸残基为Lys、Arg、dr、Tyr、F4G、Orn、Hly、da、Cit、Dap或Dab，特别优选为Lys、Arg或dr，
序列号296的第13个氨基酸残基为Ala、Phe、Asn、Tyr或pHPeG，特别优选为Phe或Tyr。
再者，此肽为在肽C的N端具有以下的氨基酸序列的肽。
可为序列号296的第11个氨基酸残基为Arg、Ala、Asp、Gly、Glu、Lys、MeK、MeR、Dap、Dap、Abu、Aib、Hly、dorn、aMeK、A1Me4pip、KCOpipzMe、F4G、Nle、Nva或Orn，特别优选为Lys或Arg，
序列号296的第12个氨基酸残基为Lys、Arg、dr、Tyr、F4G、Orn、Hly、da、Cit、Dap或Dab，特别优选为Lys、Arg或dr，
序列号296的第13个氨基酸残基为Ala、Phe、Asn、Tyr或pHPeG，特别优选为Phe或Tyr，
序列号214的第14个氨基酸残基为MeTyr、Tyr、Phe、Ala、aMeY、Glu、Gly、Arg、Val、MeoBphMeBph、MeF、MemBph、MeNal1、MeNal2、MeoBph、MeW或pHPeG，特别优选为Phe或MeW，
序列号296的第15个氨基酸残基为Cys或Hgl的肽。
再者，也可为以下的肽:在肽E中，
序列号296的第3个氨基酸残基为苯丙氨酸(Phe)、甲基化苯丙氨酸(MeF)，或N-α-甲基-N-α-氯乙酰基-3-氯-L-苯丙氨酸(MeF3C)，
序列号296的第5个氨基酸残基为色氨酸(Trp)或甲基化色氨酸(MeW)，
序列号296的第7个氨基酸残基为酪氨酸(Tyr)，
序列号296的第8个氨基酸残基为酪氨酸(Tyr)或(S)-2-氨基-3-(4-甲氧基苯基)丙酸(F4OMe)，
序列号296的第11个氨基酸残基为精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)，
序列号296的第12个氨基酸残基为精氨酸(Arg)或D-精氨酸(dr)，
序列号296的第13个氨基酸残基为酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe)。
此肽的优选例为由序列号3-200中任一氨基酸序列所组成，或由在序列号3-200中任一氨基酸序列中N端为氯乙酰基-Ala的氨基酸序列所组成的肽。
此肽的优选例为上述任一种肽，且为环状肽。
此肽的优选例为包含序列号1-552中任一者所记载的氨基酸序列或氨基酸序列与连接子的复合体的第1个至第10个氨基酸序列，且氨基酸序列部位具有环状结构的肽。
此肽的特别优选例为由在序列号2、9、21-148、159-200、213-448、450-552中任一者所记载的氨基酸序列或氨基酸序列与连接子的复合体中的第1个至第15个氨基酸序列所组成，且氨基酸序列部位具有环状结构的肽。
关于环状肽
是指肽中的2个氨基酸结合，其全部或一部分成为环状者。此外，在本案中，也包含肽中的氨基酸形成交联结构者、通过形成内酰胺环或巨环化反应而形成环状结构者、具有套索肽状结构者等。亦即，在本案中，环状肽只要其一部分为形成环状结构者即可，也可具有直链部。
一般而言，肽在活体内的代谢稳定性差，且因尺寸大而有难以通过细胞膜的问题。对在此种课题，已有使肽进行环状化的方法。若将肽进行环状化，则蛋白酶耐性提升，代谢稳定性提升，且不会对构形改变造成限制，因此暗示刚性增加且膜通透性及与目标蛋白质的亲和性提升。
环化法
关于肽的环化，可依循众所周知的方法进行。
虽不限在此，但例如通过设计成在肽中包含2个以上的半胱氨酸残基，而在转译后，可通过双硫键而形成环状结构。并且，依循Goto等人的方法(Y.Goto、et al.AcssChem.Biol.3120-129(2008))，通过遗传密码的重编程技术，合成在N端具有氯乙酰基的肽，在肽中配置半胱氨酸残基，因此也可环状化。因此，在转译后巯基自动地对于氯乙酰基进行亲核攻击，肽通过硫醚键而环状化。也可通过遗传密码的重编程技术，将进行结合而形成环状的其他氨基酸的组合配置在肽内而进行环状化。并且，合成在N端具有环酰胺的肽，在肽中配置Hgl残基，因此也可进行环状化。如此，只要为众所周知的环状化方法，则可未被特别限制地进行。
此肽的优选例为上述中任一种肽，且为由15氨基酸残基所组成的肽。
肽长度
肽、肽部位的酰胺键的数量(氨基酸的数量、长度)未被特别限制，但优选为总氨基酸残基(结合至肽的物质或结合该物质与肽的连接子包含氨基酸的情形，不包含该等氨基酸)为20残基以内。优选为氨基酸为6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上，优选为氨基酸为19以下、18以下、17以下、16以下、15以下。
此说明书所记载的一发明是关于共轭物(复合体)。此复合体为包含上述中任一种肽、与此肽结合的连接子，以及结合至此连接子的物质的复合体。优选为至少物质能穿过血脑屏障的复合体。也可为复合体全体能穿过血脑屏障。复合体优选为对于肌肉组织具有指向性。复合体优选为至少可将物质搬运往肌肉组织者。复合体优选为具有细胞穿透性。此复合体优选为至少可将物质搬运往细胞者。
连接子的例子是连接子的氨基酸长度为1以上且15以下，而且连接子包含1个以上的甘氨酸(Gly)或丝氨酸(Ser)者。
此连接子的优选例是N端为可被修饰的半胱氨酸(Cys)或可被修饰的赖氨酸(Lys)。
连接子的另一例是氨基酸长度为1以上且5以下，而且包含D型的谷氨酸(de)及甲基化甘氨酸(MeG)中任一者或两者。
此连接子的优选例是N端为可被修饰的半胱氨酸(Cys)或可被修饰的赖氨酸(Lys)的复合体。
连接子的另一例是包含聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇的衍生物的PEG连接子。聚乙二醇的衍生物包含所有众所周知的PEG连接子。
优选为PEG连接子是进一步包含甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)者。
此连接子的优选例是N端为可被修饰的半胱氨酸(Cys)或可被修饰的赖氨酸(Lys)的复合体。
连接子的另一例是连接子为具有由序列号201、553-644中任一者所示的序列的连接子。
此复合体的优选例是连接子为:
聚乙二醇(PEG)；
由Gly或MeG所组成的肽连接子、亦即G连接子，由Gly或MeG与Ser所组成的肽连接子、亦即GS连接子；或
具有由序列号201、553-644中任一者所示的氨基酸序列的连接子。
在本说明书中，连接子(也称为交联剂)表示与转铁蛋白受体结合的肽与欲送达脑的物质的分子间连结，可为众所周知或本说明书所记载的任意的连接子。在特定的实施方式中，所述连接子例如为化学连接子、脂肪酸连接子、肽连接子(多肽连接子)。并且，例如可为化学连接子与肽连接子等的复合体。例如，可为序列号616或序列表627等所示的具有PEG及氨基酸残基或肽部分的连接子结构。
连接子例如可为通过环境、条件而分散、分离者，也可为保持稳定结构者。
化学连接子:在一些实施方式中，连接子可为化学连接子。作为化学连接子，虽不受限在此，但例如包含:置换或非置换亚烷基、置换或非置换亚杂烷基、置换或非置换亚环烷基、置换或非置换亚杂环烷基、置换或非置换丙炔和/或置换或非置换杂丙。并且，肽与连接子可通过硫氢基、氨基(氨)和/或者碳水化合物或任意的适当反应基而成为共轭物。同质二官能性及异质二官能性交联剂(共轭剂)能来自许多商业来源。交联剂可包含可挠性臂，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳原子。作为交联剂的例子，可列举BSS3([双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯]、NHSS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺与N-乙基-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺、磺酸基-EMCSS([N-e-马来酰亚胺己酸]酰肼、酰肼以及SSATA(N-琥珀酰亚胺基-SS-乙酰硫代乙酸)等。
化学连接子的优选例为PEG(Polyethyleneglycol，聚乙二醇)连接子。例如，PEG连接子可为由1-24个乙二醇单元所组成的PEG连接子。
脂肪酸连接子:连接子可为由脂肪酸所诱导的包含二价化学部分的脂肪酸连接子。例如，脂肪酸连接子可为具有12-氨基十二酸的连接子。
肽连接子:肽连接子包含至少1个氨基酸(例如，至少2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40或50个氨基酸的肽)。在特定的实施方式中，连接子为1个氨基酸(例如，Cys等任意的天然氨基酸)。在其他实施方式中，使用如美国专利第7,271,149号所记载般的具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(式中，n为1、2、3、4、5或6)的肽等富含甘氨酸的肽。在另一实施方式中，使用如美国专利第5,525,491号所记载般的富含丝氨酸的肽连接子。作为富含丝氨酸的肽连接子，可列举式[X-X-X-X-Gly]y(式中，X之中最多2个为Thr，其他X为Ser，y为1-5)者(例如，Ser-Ser-Ser-Ser-Gly(式中，y为2以上))。在一些事例中，连接子为1个氨基酸(例如，Gly或Ala等任意的氨基酸)。
此说明书所记载的一发明是关于脑相关疾病的预防或治疗剂。此脑相关疾病的预防或治疗剂包含上述的复合体，且上述的物质为有效成分。
物质为送达脑的物质。物质只要为希望送达脑的物质，则可为本领域的技术人员所希望的任何物质。但是，BBB的通过是由与转铁蛋白受体结合进行内吞作用、胞吞转送等的机制所导致，因此无法在该等机制中进行搬运的过大的物质较为不佳。作为该物质的例子，虽未被限制，但可列举以下:
化合物:不仅低分子化合物、中分子化合物，只要为能通过细胞的细胞摄入机制导入的化合物即可。可列举例如众所周知的低分子药剂。
肽:可为与体内的目标结合而表现某种效果的肽，例如可为环状肽。
RI:经放射性同位素标帜的低分子、中分子化合物或抗体等，只要为可被放射性同位素标帜的化合物即可。可列举例如PET检查用的化合物。
蛋白质:只要为抗体、酶等在体内表现有用功能的蛋白质即可。可列举例如用于酶补充疗法的酶。
核酸:只要为DNA、RNA等包含碱基序列者即可。可列举例如核酸医药品。
DDS:可为脂质体或微胞等DDS分子。在该DDS分子中，内部可进一步包含医药品等化合物。
以及，可为上述所列举的该等的复合体。
此说明书所记载的一发明是关于脑相关疾病的预防或治疗剂的制造方法。此方法是包含获得上述的复合体的步骤的脑相关疾病的预防或治疗剂的制造方法。
此方法的优选例是连接子为:
聚乙二醇(PEG)；
G连接子、GS连接子；或
具有由序列号201、553-644中任一者所示的氨基酸序列的连接子。
此说明书所记载的一发明是关于包含上述的复合体的脑相关疾病的诊断药。
此说明书所记载的一发明是包含上述的复合体的神经肌肉疾病的预防或治疗剂。此情形，物质为神经肌肉疾病的预防或治疗剂中的有效成分。此说明书所记载的一发明包含上述的复合体。此说明书所记载的一发明是关于包含上述的复合体的神经肌肉疾病的诊断药。
本发明的肽可通过液相法、固相法、组合液相法与固相法的杂合法等化学合成法，基因重组法等众所周知的肽的制造方法而进行制造。
固相法例如使具有羟基的树脂的羟基与α-氨基被保护基保护的第一氨基酸(通常是作为目标的肽的C端氨基酸)的羧基进行酯化反应。酯化触媒，可使用1-均三甲苯磺酰基-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)等众所周知的脱水缩合剂。
接着，使第一氨基酸的α-氨基的保护基脱离，且添加主链的羧基以外的所有官能基被保护的第二氨基酸，使该羧基活化，而使第一及第二氨基酸结合。再者，将第二氨基酸的α-氨基进行去保护，添加主链的羧基以外的所有官能基被保护的第三氨基酸，使该羧基活化，而使第二及第三氨基酸结合。重复此操作，当合成目标长度的肽，则将所有官能基进行去保护。
作为固相合成的树脂，可列举Merrifield resin、MBHA resin、Cl-Trt resin、SASRIN resin、Wang resin、Rink amide resin、HMFS resin、Amino-PEGA resin(默克公司)、HMPA-PEGA resin(默克公司)等。此等树脂可在利用溶剂(二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、氯甲烷等)清洗后使用。
作为α-氨基的保护基，可列举苯甲氧羰基(Cbz或Z)、tert-丁氧羰基(Boc)、芴甲氧羰基(Fmoc)、苯甲基、烯丙基、烯丙氧基羰基(Alloc)等。
Cbz基可通过氢氟酸、氢化等而去保护，Boc基可通过三氟乙酸(TFA)进行去保护，Fmoc基可利用由哌啶所进行的处理而去保护。
α-羧基的保护可使用甲酯、乙酯、苄酯、tert-丁酯、环己酯等。
作为氨基酸的其他官能基，丝氨酸或苏氨酸的羟基可被苯甲基或tert-丁基保护，酪氨酸的羟基可被2-溴苯甲氧羰基或tert-丁基保护。赖氨酸侧链的氨基、谷氨酸或天冬氨酸的羧基可与α-氨基、α-羧基同样地保护。
羧基的活化可使用缩合剂进行。作为缩合剂，可列举例如二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC或者WSC)、(1H-苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)、1-[双(二甲基氨基)甲基]-1H-苯并三唑鎓盐-3-氧化物六氟磷酸盐(HBTU)等。
来自树脂的肽链的剪切可通过以TFA、氟化氢(HF)等酸进行处理而进行。
由基因重组法(转译合成系统)所进行的肽的制造，可使用编码本发明的肽的核酸而进行。编码本发明的肽的核酸可为DNA，也可为RNA。
编码本发明的肽的核酸，可利用众所周知的方法或遵循其的方法而制备。例如，可通过自动合成装置而进行合成。为了将所得的DNA插入载体，可添加限制酶识别部位，或组入编码用于以酶等剪切所得的肽链的氨基酸序列的碱基序列。
如同上述，在使本发明的肽与膜通透性肽等进行融合的情形，上述核酸也包含编码膜通透性肽的核酸。
为了抑制由源自宿主的蛋白酶所进行的分解，也可使用以与其他肽的嵌合体肽的形式表现目标肽的嵌合体蛋白质表现法。此情形，作为上述核酸，能使用编码作为目标的肽及结合至此的肽的核酸。
接下来，使用编码本发明的肽的核酸制备表现载体。核酸可直接、或以限制酶进行消化、或加成连接子等，而插入表现载体的启动子的下游。作为载体，可列举源自大肠杆菌的质体(pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等)、源自枯草芽孢杆菌的质体(pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等)、源自酵母的质体(pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等)、噬菌体(e噬菌体、M13噬菌体等)、病毒(逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、杆状病毒等)、黏粒等。
启动子可因应宿主的种类而适当选择。在宿主为动物细胞的情形，例如可使用源自SV40(simian virus 40，猿猴病毒40)的启动子、源自CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)的启动子。在宿主为大肠杆菌的情形，可使用trp启动子、T7启动子、lac启动子等。
在表现载体中，也可组入编码DNA复制起始点(ori)、选择标记(抗生素抗性、营养要求性等)、增强子、剪接信号、聚A加成信号、标签(FLAG、HA、GST、GFP等)的核酸等。
接着，利用上述表现载体将适当的宿主细胞进行转形。宿主可依据与载体的关系而适当选择，例如能使用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌属菌、酵母、昆虫或昆虫细胞、动物细胞等。作为动物细胞，例如可使用HEK293T细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、HeLa细胞、Vero细胞。转形可因应宿主的种类，遵循脂质转染法、磷酸钙法、电穿孔法、显微注射法、粒子枪法等众所周知的方法而进行。通过遵循常规方法培养转形体，而使作为目标的肽表现。
来自转形体的培养物的肽的精制是通过以下方式获得粗萃取液:回收培养细胞，将其悬浮于适当缓冲液后，通过超音波处理、冷冻融解等方法而破坏细胞，并进行离心分离及过滤。在培养液中分泌肽的情形中，回收上清液。
来自粗萃取液或培养上清液的精制也可通过众所周知的方法或遵循其的方法(例如、盐析、透析法、超过滤法、凝胶过滤法、SDS-PAGE法、离子交换层析法、亲和力层析法、反相高效液相色谱等)而进行。
所得的肽也可利用众所周知的方法或遵循其的方法而从游离体转换成盐或从盐转换成游离体。
转译合成系统可设为无细胞转译系统。无细胞转译系统例如包含核糖体蛋白质、氨基酰基tRNA合成酶(ARS)、核糖体RNA、氨基酸、rRNA、GTP、ATP、转译起始因子(IF)伸长因子(EF)、释放因子(RF)及核糖体再循环因子(RRF)，以及转译所需要的其他因子。为了提高表现效率，也可添加大肠杆菌萃取液或小麦胚芽萃取液。另外，也可添加兔红血球萃取液或昆虫细胞萃取液。
在包含此等的系统中，通过使用透析连续地供给能量，而可生产数100μg至数mg/mL的蛋白质。为了一并进行来自基因DNA的转录，也可设为包含RNA聚合酶的系统。作为市售的无细胞转译系统，作为源自大肠杆菌的系统可使用Roche Diagnostics公司的RTS-100(注册商标)GeneFrontier公司的PURESYSTEM、NEW ENGLAND Biolabs公司的PURExpress InVitro Protein Synthesis Kit等，作为使用小麦胚芽萃取液的系统可使用ZOEGENE公司、CellFree Sciences公司的产品等。
若根据无细胞转译系统，能以不需精制的高纯度形式获得表现产物。
在无细胞转译系统中，也可使用将所期望的氨基酸或羟基酸与tRNA连结(酰基化)而成的人工的氨基酰基tRNA，以置换天然的氨基酰基tRNA合成酶所合成的氨基酰基tRNA。此氨基酰基tRNA可使用人工的核糖核酸酶进行合成。
作为此核糖核酸酶，可列举弹性酶(flexizyme)(H.Murakami,H.Saito,andH.Suga,(2003),Chemistry&Biology,Vol.10,655-662；H.Murakami,D.Kourouklis,andH.Suga,(2003),Chemistry&Biology,Vol.10,1077-1084；H.Murakami,A.Ohta,H.Ashigai,H.Suga(2006)Nature Methods 3,357-359＂The flexizyme system:a highly flexibletRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides＂；N.Niwa,Y.Yamagishi,H.Murakami,H.Suga(2009)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 19,3892-3894＂A flexizyme that selectively charges amino acids activated by awater-friendly leaving group＂；及WO2007/066627等)。弹性酶也被称为原型的弹性酶(Fx)及由此改变的二硝基苄基弹性酶(dFx)、增强弹性酶(eFx)、氨基弹性酶(aFx)等。
通过使用由弹性酶所生成的连结所期望的氨基酸或羟基酸的tRNA，而可使所期望的密码子与所期望的氨基酸或羟基酸相关联并进行转译。作为所期望的氨基酸，也可使用特殊氨基酸。例如，上述的环状化所需要的非天然氨基酸也可通过此方法而导入结合肽。
本发明的大环状肽与其类似物的化学合成，可使用包含阶段性固相合成、经过构形性所支援的再连接的肽片段的半合成、化学连接的在各种的该技术领域中所泛用的方法进行合成。本说明书所记载的肽与其类似物的合成，例如为使用K.J.Jensen,P.T.Shelton,S.L.Pedersen,Peptide Synthesis and Applications,2nd Edition,Springer,2013等所记载般的各种固相技术的化学合成。作为优选的策略，是根据暂时地保护α-氨基及能通过碱基而选择性去除的Fmoc基、与暂时地保护侧链官能基且在去Fmoc条件下稳定的保护基的组合。此种一般的肽侧链的选择，已知所述的Peptide Synthesis and Applications,2ndedition,G.B.Fields,R.L.Noble,Solid pHase Peptide Synthesis Utilizing 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Acids,Int.J.Peptide Protein Res.35,1990,161-214等，但作为优选的肽侧链保护基，有对于以赖氨酸为首的氨基的Boc基或Mtt基、对于谷氨酸或天冬氨酸的羧基的tert-butyl基，以及对于半胱氨酸的硫醇基的Trt及Mmt基。
本发明所记载的肽与其类似物，可在所述的固相树脂上且在阶段性方法中合成。所使用的C端氨基酸及合成所使用的所有氨基酸及肽，α―氨基保护基在合成过程中，必须选择性地被去除。优选为使用所述的固相树脂，通过适当的试剂将N端被Fmoc等适当保护的肽的C端羧基或被Fmoc保护的氨基酸的C端羧基做成活化酯后，通过加成至固相树脂上的氨基而开始。连续的肽链的伸长，能遵循作为目标的肽的氨基酸序列，通过依序重复N端保护基(Fmoc基)的去除、接着保护氨基酸衍生物的缩合而达成。此外，此等可在最终阶段使目标的肽游离。例如，作为使其游离的条件，可列举Teixeira,W.E.Benckhuijsen,P.E.deKoning,A.R.P.M.Valentijn,J.W.Drijfhout,Protein Pept.Lett.,2002,9,379-385等，在TFA中，作为捕捉剂，可利用包含水/氢化硅烷/硫醇的TFA溶液使其游离。作为典型的例子，可列举TFA/Water/TIS/DODT(体积比92.5:2.5:2.5:2.5)。
本说明书所记载的肽类似物的合成，可通过使用单或多通道肽合成仪，例如CEM公司的Liberty Blue合成仪或Biotage公司的Syro I合成仪而实施。
羧基的活化可使用缩合剂而进行。作为缩合剂，可列举例如二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC或者WSC)、(1H-苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)、1-[双(二甲基氨基)甲基]-1H-苯并三唑鎓盐-3-氧化物六氟磷酸盐(HBTU)等。
此说明所公开的另一实施方案是关于医药。此医药包含上述的肽、其药学上所容许的盐或溶剂合物(为了简化，以下也将此等仅标记为肽)。此医药优选为包含有效量的上述的肽作为有效成分。
在本说明书中，医药组成物的投予形态未被特别限定，可口服投予也可非口服投予。作为非口服投予，可列举例如、肌肉内注射、静脉内注射、皮下注射等注射投予、经皮投予、经粘膜投予(经鼻、经口腔、经眼、经肺、经阴道、经直肠)投予等。
上述医药组成物可鉴于多肽容易被代谢及排泄的性质而进行各种的修饰。例如，在多肽加成聚乙二醇(PEG)或糖链可增长血中滞留时间、使抗原性降低。并且，也可将聚乳酸-乙二醇(PLGA)等活体内分解性的高分子化合、多孔性羟基磷灰石、脂质体、表面修饰脂质体、不饱和脂肪酸所制备的乳化、纳米粒子、纳米球等使用作为缓释化基剂，并在此中包含多肽。在进行经皮投予的情形，也可将弱电流流经皮肤表面而使其穿透角质层(离子电渗法)。
上述医药组成物，可直接使用有效成分，也可添加药学上可容许的载体、赋形剂、添加剂等而进行制剂化。作为剂形，可列举例如液剂(例如注射剂)、分散剂、混悬剂、片剂、丸剂、粉末剂、栓剂、散剂、细颗粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、锭剂、吸入剂、软膏剂、眼药水、滴鼻剂、滴耳剂、膏药等。
制剂化可适当使用例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、溶解补助剂、着色剂、调味剂、稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂等并通过常规方法而进行。
作为能使用于制剂化的成分的例子，可列举纯化水、盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等药学可容许的有机溶剂、动植物油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、玉米淀粉、二氧化硅、硅酸铝镁、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚醣、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、黄蓍胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、高级醇、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白等，但不受限在此等。
有鉴于肽难以经粘膜吸收，上述医药组成物可包含改善难吸收性药物的吸收的吸收促进剂。作为此吸收促进剂，可使用聚氧乙烯月桂基醚类、月桂基硫酸钠、皂苷等表面活性剂；甘胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸等胆汁酸盐；EDTA、水杨酸类等螯合剂；己酸、癸酸、月桂酸酯酸、油酸、亚麻油酸、混合胶束等脂肪酸类；烯胺衍生物、N-酰基胶原蛋白肽、N-酰基氨基酸、环糊精类、壳聚糖类、一氧化氮供体等。
丸剂或片剂也可被覆糖衣、胃溶性、肠溶性物质。
注射剂可包含注射用蒸馏水、生理食盐水、丙二醇、聚乙二醇、植物油、醇类等。再者，可添加湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、增溶剂、溶解补助剂、防腐剂等。
将本发明的医药组成物投予至哺乳类(例如，人类、小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、狗、马、猴、猪等)，尤其人类的情形的投予量，是依据症状、患者的年龄、性别、体重、感受性差异、投予方法、投予间隔、有效成分的种类、制剂的种类而异，虽未被特别限定，但例如可将30μg-100g、100μg-500mg、100μg-100mg以1次或分成数次进行投予。注射投予的情形，可依据患者的体重，将1μg/kg-3000μg/kg、3μg/kg-1000μg/kg以1次或分成数次进行投予。
使用本发明的肽的脑相关疾病的预防或治疗方法，可参照上述医药组成物的记载而实施。
包含上述的复合体的神经肌肉疾病的预防或治疗剂只要使用上述医药组成物即可。
此说明书所公开的另一实施方案是关于脑相关疾病检测药。此脑相关疾病检测药包含上述的肽、其盐或其溶剂合物。
脑相关疾病检测药及检测用试剂盒
本发明也包含含有本发明的肽的脑相关疾病检测药。使用作为检测药的情形，本发明的肽也可标识成能检测。肽的标识例如能使用通过过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶、125I、131I、35S、3H等放射性物质、异硫氰酸荧光素、罗丹明、丹磺酰氯、藻红蛋白、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、近红外荧光材料等荧光物质、荧光素酶、荧光素、水母发光蛋白等发光物质所标识的抗体。其他，也可检测以金胶体、量子点等纳米粒子所标识的抗体。例如，通过与脑相关疾病相关的特定标的进行结合的抗体与本发明的肽制作复合体，制作已标识该抗体或本发明的肽的复合体，将其进行投予、检测，因此可检测脑相关疾病。
并且，在免疫分析中，也可将本发明的肽以生物素进行标识，使其与以酶等标识的抗生物素蛋白或卵白素进行结合而进行检测。
在免疫分析中，使用酶标识的ELISA法也因可简便且迅速地测量抗原而较优选。例如，将抗体固定于固相载体，添加样本使其反应后，添加已标识的本发明的肽并使其反应。清洗后，与酶基质进行反应，使其发色，测量吸光度，因此可检测脑相关疾病。可在使固定于固相载体的抗体与试料进行反应后，添加未标识的本发明的肽，将针对本发明的肽的抗体进行酶标识并进一步添加。
酶基质在酶为过氧化酶的情形可使用3,3’-diaminobenzidine(DAB)、3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine(TMB)、o-phenylenediamine(OPD)等，在酶为碱性磷酸酶的情形可使用p-nitropheny phosphate(NPP)等。
在本说明书中，“固相载体”只要为可固定抗体的载体则未被特别限定，可列举玻璃制、金属性、树脂制等的微孔板、基板、珠粒、硝基纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜等，标的物质可遵循众所周知的方法而固定在此等固相载体。
本发明的检查用试剂盒包含上述检测所需要的试剂及器具(包含本发明的肽、抗体、固相载体、缓冲液、酶反应停止液、酶标仪等，但不限定在此等)。
此说明书所公开的另一实施方案也能被考虑使用作为包含上述的脑相关疾病检测药的脑相关疾病检测用试剂盒、用于发现脑相关疾病及伴随其的各种细胞功能或生命现象的工具。
此说明书也提供用于制造脑相关疾病的预防或治疗用的医药的肽的使用。在此情形中的肽只要为上述的任一者即可。
并且，此说明书也提供用于制造神经肌肉疾病的预防或治疗用的医药的肽的使用。在此情形中的肽只要为上述的任一者即可。
本说明书也提供一种脑相关疾病的预防或治疗方法，其包含对于人类、非人类哺乳动物或鸟类亦即对象投予有效量的肽、其药学上可容许的盐、或其溶剂合物、或复合体的步骤。肽可适当使用上述的肽。非人类哺乳动物的例子为人类以外的灵长类、猪、牛、狗、猫、马、绵羊、大鼠及小鼠。
此说明书也提供一种脑相关疾病的预防或治疗方法，其包含对于人类、非人类哺乳动物或鸟类亦即对象投予有效量的肽、其药学上可容许的盐、或其溶剂合物、或复合体的步骤。
本说明书中，尤其下述代表性实施例所使用的缩写对于本领域的技术人员而言为周知。所使用的一些缩写是如同下述:
Fmoc为9-芴甲氧羰基；
HOAt为1-羟基苯并三唑；
HATU为O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐；
MeCN为乙腈；
DBU为1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯；
DIPEA为N,N-二异丙基乙基氨；
DODT为3,6-二恶烷-1,8-辛烷-二硫醇；
DMSO为二甲亚砜；
DMF为N,N-二甲基甲酰胺；
Mtt为单甲基三苯甲基；
Mmt为单甲氧基三苯甲基；
Ns为2-硝基苯磺酸；
TFA为三氟乙酸；
TIS为三异丙基硅烷；
Trt为三苯甲基；
mL为毫升(单位)；
M为摩尔浓度(单位)；
v/v为volume/volume(体积/体积)；
Adod为12-氨基十二酸。
实施例1
化学合成
以下的实施例中的在化学合成中所使用的全部原料、结构单元、试剂、酸、碱、固相树脂、溶媒是直接使用市售品，或者为本领域的技术人员使用有机化学的手法可合成者。此外，包含保护基的氨基酸只要未被特别注明则是直接使用市售品。
固相树脂中的肽链的伸长是将各实施例所记载的树脂作为起始原料，利用通常所使用的肽偶合反应条件与Fmoc去除反应条件而进行。反应是使用肽自动合成仪亦即CEM公司Liberty Blue并遵循制造商的手册而进行。下述列举能使用的一般的氨基酸，侧链保护基表示于括号内。
Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-N-Me-Gly-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-N-Me-Phe-OH；Fmoc-Ala-OH；Fmoc-N-Me-Ala-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH；Fmoc-HydPro(tBu)-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Lys(Mtt)-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-N-Me-Ser(tBu)-OH。
氯乙酰基的导入是通过下述方式而进行:对于已保持前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将氯乙酸(3等量)添加3等量的N,N’-二异丙基碳二亚胺的DMF溶液(0.5M)、3等量的HOAt的DMF溶液(0.5M)，在室温振荡40分钟。
侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF与氯甲烷分别各清洗5次，并在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡150分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液进行再度振荡后，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，3min)，并倾析溶液。将所得的个体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，将所得的固体使用于后续的环化反应。
肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加6等量的三乙胺，在室温搅拌约16小时搅拌而进行。将所得的反应溶液以乙酸调制成酸性，使用Biotage(注册商标)V-10(Biotage Japan公司)进行减压浓缩。
作为所得的粗精制肽的精制方法，利用Waters公司AutoPurification System-SQD2 single quadruple mass spectrometer，使用反相制备型HPLC，一边监视源自目标物的m/z离子一边将其溶出。确认在包含由ESI-positive的扫描模式所得的质谱与由目标物的分子式所计算的多价离子的质谱在所使用的质量分析器的误差范围中为一致。此外，包含所使用的管柱的精制条件是显示于各实施例。
本发明中，化学合成的肽的纯度是利用以下任一分析方法而决定。
(分析条件)
分析条件A
管柱:CORTECS(注册商标)UPLC(注册商标)C18 column(Nihon Waters公司)、
Figure BDA0003807566610000241
1.6μm、2.1x100mm
流动相:0.025％TFA in MeCN/0.025％TFA in H2O
温度:40℃
梯度:5-95％MeCN/0.025％TFA in H2O in 5.56min；线性梯度
流量:0.4mL/min
检测法:UV 220nm
分析条件B
管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm、2.1IDx150mm、
Figure BDA0003807566610000242
(Phenomenex公司)
管柱温度:60℃
流动相A:0.025％TFA in H2O
流动相B:0.025％TFA in CH3CN
梯度:各实施例所记载
流速:0.25mL/min
检测:PDA(225nm)
化学合成的肽的结构决定，是将考虑遵循目标序列所使用的氨基酸与因应需要所使用的结构单元所计算的分子量，通过质谱分析法中的ESI-MS(+)进行确认。此外，所谓“ESI-MS(+)”，表示在正离子模式所实施的电喷雾电离质谱分析法。所检测的质量是以“m/z”单位标记表示。此外，分子量约大于1000的化合物是作为二价离子或三价离子而以高频率检测。
与hTfR结合的特殊环状肽的化学合成
利用国际公开WO2014/119600号、国际公开WO2012/033154号或国际公开WO2007/066627号所记载的筛选方法，识别hTfR结合肽。以确认该肽是否实际具有对于hTfR的结合活性为目的，进行化学合成。将所合成的肽的序列表示于表1。
[表1]
Figure BDA0003807566610000261
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.6mmol/g，0.33g)，遵循所述的一般方法，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。缩合反应是将在75℃反应10分钟作为基本条件。去Fmoc化是将在20％piperidine in DMF中，在75℃反应3分钟作为基本条件。氯乙酰基的导入是通过以下方式进行:对于已保持前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述方法去除α-氨基的Fmoc基后，添加5等量的氯乙酸的DMF溶液(0.2M)、5等量的HATU的DMF溶液(0.5M)、10等量的DIPEA的DMF溶液(1M)，在室温振荡30分钟。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次，并以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(10000rpm，1min)，并倾析溶液。将所得的个体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，将所得的固体进行干燥，使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加6等量的三乙胺，在室温搅拌约16小时。将所得的反应溶液使用Savant Explorer SpeedVaC进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C185μmμm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟5-30％，之后耗费8分钟30-35％，之后耗费1分钟35-60％；流量:120mL/min)。
所得的目标物是以所述的分析条件A或分析条件B进行分析，通过质谱分析法中的ESI-MS(+)确认结构。将所得的ESI-MS(+)观测值、与将在该情形中的质子加成数(M+XH)显示为X+时的X的值表示于表1。
实施例2
由表面等离子共振(SPR)所进行的转铁蛋白受体(hTfR)与肽的分子间相互作用评 价试验
针对所合成的各种肽，将对于转铁蛋白受体(hTfR)的肽的表面等离子共振(SPR)所导致的分子间相互作用，通过以下所示的方法实施试验。将具体的试验方法显示于以下。
[SPR测量]
将NTA感测晶片(Global Life Science Technologies Japan股份有限公司)插入BiacoreT200(Global Life Science Technologies Japan股份有限公司)，以电泳缓冲液:10mM HEPES pH8.0(nacalai tesque股份有限公司)、150mM NaCl(nacalai tesque股份有限公司)、0.05％Tween 20(nacalai tesque股份有限公司)、0.1％BSA(SIGMA-ALDRICH)、1.0％DMSO(富士胶片和光纯药股份有限公司)实施3次初始操作，以流速30μL/min进行平衡化。使350mM EDTA溶液以流速10μL/min反应60秒钟，并使0.5mM NiCl2溶液(KISHIDACHEMICAL)以流速10μL/min反应60秒钟后，将3mM EDTA溶液(nacalai tesque股份有限公司)以流速10μL/min清洗NTA感测晶片60秒钟。使60mM EDC溶液(Global Life ScienceTechnologies Japan股份有限公司)、650mM NHS溶液(Global Life ScienceTechnologies Japan股份有限公司)各混合50μL后，以流速10μL/min使其反应420秒钟。以电泳缓冲液进行稀释，制备3.2μM hTfR溶液150μL，以流速10μL/min使其反应600秒钟，将hTfR固定化在NTA感测晶片。固定化后，使1.0M乙醇氨水溶液(Global Life ScienceTechnologies Japan股份有限公司)以流速10μL/min反应420秒钟，进行加帽。将在DMSO溶液中制备成10mM的肽溶解液，以最终浓度成为10μM的肽溶解液的方式，以电泳缓冲液进行稀释后，制作100nM、50nM、25nM、10nM、5nM的肽溶液。使用上述的样本，通过SPR测量而取得对于hTfR的肽的动力学。动力学评价模型设为Single Cycle，使用KineticsBiacore T200Evaluation Software Version 3.0(Global Life Science Technologies Japan股份有限公司)而进行曲线拟合。对于所得的传感图，实施由最小平方法所进行的曲线拟合，通过求取其KD值而评价肽对于hTfR的结合。针对如此所求得的KD值，KD值小于1nM的情形标记为A，1nM以上且小于100nM的情形标记为B，100nM以上且小于1μM的情形标记为C，1μM以上的情形标记为D，并表示于表1。其结果，针对hTfRNo.894及具有与其类似的氨基酸序列的环状肽，显示与hTfR具有显著的结合能力。hTfRNo.894的化学结构是如同以下。
[化1]
Figure BDA0003807566610000281
实施例3
hTfR结合肽-PEG11-Vivotag750共轭物(hTfRNo.894-vivotag750)的合成
针对hTfRNo.894，合成使作为有效载荷的近红外荧光标识物质亦即Vivotag750(VivoTag-S(商标)750，PerkinElmer公司)通过PEG11连接子而结合的化合物(表示为hTfRNo.894-vivotag750或hTfR＿000894＿PEG11＿(VivoTag))(序列号146)。hTfR结合肽-PEG11的化学结构是如同以下，通过使该化合物与Vivo-tag750结合而合成标记化合物。详细内容于以下记载。
[化2]
Figure BDA0003807566610000291
hTfRNo.894-PEG11-vivotag750的合成
化学合成是如同以下般进行:
使用Fmoc-NH-SAL-PEG-resin 1500-2000Da(渡边化学，0.38mmol/g)，依循一般的方法，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue作为固相合成仪，依循制造商的手册进行。缩合反应的基本条件设为在缩合剂中使用HATU并以75℃使其在10分钟反应1次。但是，第11个残基、第12个残基是在25℃下，于20分钟进行2次重复反应。第13个残基、第14个残基是在75℃下，于10分钟进行2次重复反应。第15个残基是在25℃下，于20分钟进行1次反应。第16个残基是在25℃下，于60分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件为与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，关于第13个残基、第15个残基，Fmoc去除是通过在25℃下使其反应5分钟后，使其反应10分钟而进行。氯乙酰基的导入是通过对于前步骤所得的树脂，将5等量的氯乙酸的DMF溶液(0.2M)、5等量的HATU的DMF溶液(0.5M)、10等量的DIPEA的DMF溶液(1M)添加至固相树脂，在室温振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚与己烷的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(10000rpm，1min)，倾析上清液。将所得的固体以已冰冷的乙醚清洗后，使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加6等量的三乙胺，在室温进行整夜振荡后，以Savant ExplorerSpeedVac进行减压浓缩后、以逆相HPLC进行精制。将所得的肽(26.1mg，9.30umol)溶解于DMSO/H2O(9/1)，添加0.91等量的VivoTag-NHS、4.5等量的DIEA，搅拌45分搅拌。在反应溶液中添加AcOH并骤冷。
所得的反应液是使用以下的条件进行精制(管柱:XSelect CSH C18 5um10x150mm(Lot No.147i362781)；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度:40℃；梯度(％B):耗费3分钟7-32％，之后耗费8分钟32-37％，之后耗费1分钟37-60％；流量:5mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为97.1％。
分析条件B:保持时间＝13.20分钟；梯度(％B conc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1226.4(M+3H)3+。
并且，针对所合成的所述共轭物，遵循实施例2，确认由SPR所进行的与hTfR的结合能力后，KD＝1.09nM。
实施例4
成为控制组的肽共轭物:hTfRNo.894FLIP-vivotag750的合成
作为hTfRNo.894-vivotag750的控制组，合成使No.894的序列反转的具有以下的氨基酸序列的环状肽与vivotag750通过PEG11连接子而结合的下述共轭物(表示为hTfRNo.894FLIP-vivotag750或FLIP＿000894＿PEG11＿K＿FITC)。
FLIP序列:ClAc-Ala-MeTyr-Tyr-Arg-Arg-Ile-Ile-Tyr-Tyr-Asn-Trp-Val-Phe-Val-Cys(序列号202)。
hTfRNo.894FLIP-PEG11-vivotag750的合成
肽共轭物的合成及精制，除了将Sieber amide resin(渡边化学，0.6mmol/g，0.33g)使用作为起始树脂以外，与实施例3同样地进行。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为95.5％。
分析条件B:保持时间＝13.5分钟；梯度(％B conc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1226.4(M+3H)3+。
将如同上述所得的化合物的N端，遵循Vivotag750(VivoTag-S(商标)750、PerkinElmer公司)的程序进行标识，获得标题的化合物。
并且，针对所合成的所述共轭物，遵循实施例2，确认由SPR所进行的与hTfR的结合能力后，未确认到与hTfR的结合。
实施例5
hTfRNo.894-vivotag750的使用hTfR-KI小鼠的脑移行性评价试验
〔试液的制备〕
将羟丙基-β-环糊精(和光纯药工业公司)以成为20w/v％的浓度的方式溶解于水中，将此作为20％羟丙基-β-环糊精溶液。
〔投予液的制备〕
hTfRNo.894-vivotag750 conjugate投予液(No.894投予液):在6mL的由实施例2所合成的hTfRNo.894-vivotag750 conjugate的5mM溶液中，添加4.8μL的二甲亚砜(DMSO、Sigma-Aldrich公司)，再添加66μL的20％羟丙基-β-环糊精溶液，并仔细混合。在此中，进一步添加48μL的聚乙二醇400，将已混合者作为No.894-投予液。No.894投予液中的hTfRNo.894-FITC conjugate浓度成为250μM。
hTfRNo.894FLIP-vivotag750 conjugate投予液(No.894NC投予液):在6μL的所述的hTfRNo.894FLIP-vivotag750 conjugate的5mM溶液中，添加66Μl的20％羟丙基-β-环糊精溶液并仔细混合。在此中，进一步添加48μL的聚乙二醇400，将已混合者作为No.894NC投予液。No.894FLIP投予液中的hTfRNo.894FLIP-vivotag750conjugate浓度成为250μM。
〔TfR-KI小鼠的制作〕
遵循国际公开WO2016-208695的记载，制作标靶载体，其具有编码细胞内区域为小鼠hTfR的氨基酸序列且细胞外区域为人类hTfR的氨基酸序列的嵌合体hTfR的cDNA的3’侧，具有配置被loxP序列夹住的新霉素耐性基因的碱基序列的DNA片段、5’臂序列、3’臂序列。将所制作的标靶载体，通过电穿孔法导入小鼠ES细胞。将基因导入后的小鼠ES细胞，在新霉素存在下进行选择培养，选择标靶载体通过同质重组被并入染色体的小鼠ES细胞。将所得的基因重组小鼠ES细胞注入ICR小鼠的8细胞期胚(宿主胚)，移植至通过与已进行输精管结扎的小鼠交配而得的假孕小鼠(受胚小鼠)。针对所得的胎鼠(嵌合体小鼠)进行毛色判定，筛选ES细胞有助于高效率地形成活体的个体，亦即白色毛占全体毛的比例高的个体。将此嵌合体小鼠个体与C57BL6/J小鼠交配而获得F1小鼠。筛选白色的F1小鼠，分析由尾组织所萃取的DNA，将染色体上小鼠转铁蛋白受体基因被异质置换成嵌合体hTfR的小鼠作为TfR-KI小鼠。
〔使用TfR-KI小鼠的脑移行性评价试验〕
接着，实施使用TfR-KI小鼠的脑移行性评价试验。对于表现hTfR的TfR-KI小鼠(雌、12周龄)，将No.894投予液或No.894NC投予液各100μL地急速投予至尾静脉内。在投予起1小时后，以异氟醚麻醉小鼠，由左心室灌流4-5分钟生理食盐水，进行放血处理。之后，采取测量荧光强度的组织(脑、心、肺、肝、脾、肾、股四头肌、胸腺、胸椎、股骨)，以不使其干燥的方式保管在生理食盐水中。使用In vivo发光-荧光成像系统IVIS LuminaIII(PerkinElmer公司)及荧光色素VivoTag750用的过滤器组，遵照操作说明书，测量荧光强度。
〔使用hTfR-KI小鼠的脑移行性评价的结果〕
将各组织中的荧光强度测量结果表示于图1、图1-2、图1-3及图2。
图中的“#894”标记表示hTfRNo.894-vivotag750 conjugate的投予组，“#894FLIP”标记表示hTfRNo.894FLIP-vivotag750 conjugate投予组。此外，各照片的右侧的柱表示平均放射效率(Average Radiant Efficiency，[p/sec/cm2/sr]/[μW/cm2])。
图1-1的(1)Brain表示脑的照片，(2)Liver(Left lateral lobe)表示肝的外侧左叶区域的照片，(3)Kidney表示肾脏的照片，(4)Lung表示肺的照片，(5)Thoracicvertebrae表示胸椎的照片。色标针对(1)是表示最低值为5.00×107且最大值为1.3×108，针对(2)及(3)是表示最低值为6.00×108且最大值为2.4×1010，针对(3)及(4)是表示最低值为4.5×108且最大值为5.4×109。图1-2的(1)Heart表示心的照片，(2)Spleen表示脾的照片，(3)Thymus表示胸腺的照片。此外，色标表示最低值为4.83×107且最大值为4.8×109。
图1-3的(1)Quadriceps表示股四头肌的照片，(2)Femur表示股骨的照片。此外，色标表示最低值为1.5×108且最大值为1.5×109。图2为图1-1(1)脑的放大照片。
由图1-1、1-2、1-3及图2可知，在hTfRNo.894-vivotag750 conjugate投予组检测到比hTfRNo.894FLIP-vivotag750 conjugate投予组更强的荧光的组织为肾、胸椎、心、股骨、股四头肌及脑。在hTfRNo.894FLIP-vivotag750 conjugate投予组检测到比hTfRNo.894-vivotag750 conjugate投予组更强的荧光的组织为肝与脾。
由两投予组皆在肾脏检测到最强的荧光且肝的荧光为次强可知，两试验物质主要是通过肾、肝而被代谢、排泄。并且，在No.894投予组中可见胸椎、心、股骨、股四头肌及脑的荧光比No.894NC投予组强。此等组织因TfR表现量较多，故两者的组织分布差异被认为是起因于有无hTfR结合能力。
通过本试验，可确认到hTfR结合性特殊环状肽No.894在hTfR-KI小鼠中通过与TfR结合而通过BBB并移行至脑内，以及移行至以肌肉组织为中心的各组织。
实施例6
使用hTfR结合性特殊环状肽-荧光标识探针共轭物的小鼠脑内局部存在确认试验
[hTfR结合性特殊环状肽No.894与荧光物质FITC的共轭物的制作]
针对hTfR结合性特殊环状肽No.894与荧光物质FITC的共轭物，使用由实施例3所合成的hTfRNo.894-PEG11，遵循FITC标识试剂盒(同仁化学公司)的程序进行合成。并且，针对所合成的所述共轭物，遵循实施例2，确认由SPR所进行的与hTfR的结合能力后，KD＝0.28nM。
[单剂量实验]
与实施例5同样地，将hTfR结合性特殊环状肽No.894与荧光物质FITC的共轭物投予至hTfR-KI小鼠。投予量成为3.7mg/kg。
在投予起1小时后，以异氟醚麻醉小鼠，由左心室灌流4-5分钟生理食盐水，进行放血处理。之后，采取测量荧光强度的脑，以不使其干燥的方式保管在生理食盐水中。使用此脑组织，使用抗FITC抗体(MLB Bioscience公司)进行免疫组织化学染色。脑组织中的抗FITC抗体的免疫组织化学染色是通过众所周知的方法进行，并通过荧光显微镜进行观察。将结果表示于图3。此外，图中的红箭号指向脑毛细血管，箭头指向浦肯野细胞。(1)表示#894-FITC投予组的照片，(2)表示作为控制组而未投予#894-FITC的组别的照片。
[多剂量实验]
每10分钟投予3.7mg/kg的投予量，共计6次，除此之外，与所述单剂量同样地将hTfR结合性特殊环状肽No.894与荧光物质FITC的共轭物投予至hTfR-KI小鼠，通过免疫组织化学染色确认脑组织中的所述共轭物的局部存在。将结果表示于图4。此外，图中的红箭号指向脑毛细血管，箭头指向浦肯野细胞，黄箭号指向树突。(1)表示#894-FITC投予组的照片，(2)表示作为控制组而未投予#894-FITC的组别的照片。
通过本试验，在任一剂量试验中，皆确认到hTfR结合性特殊环状肽No.894与荧光物质FITC的共轭物通过BBB而被导入小脑内部。并且，在多剂量试验结果中，可得知该共轭物到达如浦肯野细胞般的神经元。
实施例7
由SPR所进行的转铁蛋白受体(hTfR)与hTfRNo.894的变异体肽、连接子加成肽及 有效载荷共轭物的分子间相互作用评价试验
[hTfRNo.894的变异体、连接子加成肽的合成]
合成具有在hTfRNo.894的氨基酸序列中数个氨基酸被插入、缺失、置换的序列的肽(也称为变异体)及各种连接子所结合的肽，同样地确认由SPR所进行的与hTfR的结合能力。变异体肽只要实施例9或10中未记载则是遵循实施例1进行合成。连接子加成肽在连接子为PEG的情形中，使用Fmoc-NH-SAL-PEG resin(渡边化学)作为肽合成的树脂，除此之外，遵循实施例1进行合成。针对肽、脂肪酸、PEG与其等的复合体的连接子所加成的肽，也只要实施例9或10中未记载则是遵循实施例1进行合成。针对由其等的SPR测量所求得的KD值，KD值小于1nM的情形标记为A，1nM以上且小于100nM的情形标记为B，100nM以上且小于1μM的情形标记为C，1μM以上的情形标记为D，将结果表示于表2-表4。
表2:肽或连接子加成肽
[表2-1]
Figure BDA0003807566610000341
[表2-2]
Figure BDA0003807566610000351
[表2-3]
Figure BDA0003807566610000361
[表2-4]
Figure BDA0003807566610000371
[表3-1]
Figure BDA0003807566610000381
Figure BDA0003807566610000391
[表3-2]
Figure BDA0003807566610000401
Figure BDA0003807566610000411
[表4-1]
Figure BDA0003807566610000421
Figure BDA0003807566610000431
[表4-2]
Figure BDA0003807566610000441
Figure BDA0003807566610000451
[表4-3]
Figure BDA0003807566610000461
Figure BDA0003807566610000471
[表4-4]
Figure BDA0003807566610000481
Figure BDA0003807566610000491
[表4-5]
Figure BDA0003807566610000501
Figure BDA0003807566610000511
[表4-6]
Figure BDA0003807566610000521
Figure BDA0003807566610000531
[表4-7]
Figure BDA0003807566610000541
Figure BDA0003807566610000551
[表4-8]
Figure BDA0003807566610000561
Figure BDA0003807566610000571
[表4-9]
Figure BDA0003807566610000581
Figure BDA0003807566610000591
[表4-10]
Figure BDA0003807566610000601
Figure BDA0003807566610000611
[表4-11]
Figure BDA0003807566610000621
Figure BDA0003807566610000631
由结果可知，针对hTfRNo.894及在其氨基酸序列中数个氨基酸被插入、缺失、置换的序列及各种连接子所结合的肽，显示具有与hTfR的结合能力。
实施例8
〔细胞培养〕
在人乳癌细胞BT-549(COSMO BIO公司)的培养中，使用包含10％FBS及2mmol/L L-Glutamine的RPMI-1640培养基(Thermo Fisher Scientific)。培养是在370℃、5％CO2条件下进行。
〔细胞的播种〕
利用20mmol/L乙酸，将Collagen Type I(康宁公司)以成为50μg/mL的方式进行稀释。在24孔板的各孔中各放置1片已灭菌的盖玻片，添加已稀释的Collagen Type I溶液后，在37℃保温1小时。去除Collagen Type I溶液，以PBS清洗3次。每1孔播种1×105个人乳癌细胞BT-549，在37℃、5％CO2条件下培养一晩。
〔各种肽共轭物的合成〕
hTfR＿894＿3m＿PEG4dk5FAM(序列号446)、hTfR＿894＿variant03＿PEG4dk5FAM(序列号448)、hTfR＿894＿variant61＿PEG4dk5FAM(序列号447)及作为负控制组而将Flip894＿variant61＿PEG4dk5FA(序列号449)M使用作为试料。
hTfR＿894＿3m＿PEG4dk5FAM的合成
[化3]
Figure BDA0003807566610000641
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.53g)，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为自动合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，以下述作为基本条件:对于树脂1eq，使用Fmoc-AA/DIC/Oxymapure＝4.2eq/4eq/8eq，在75℃下使其反应10分钟。但是，第2个残基是在75℃下，于30分钟进行2次反应。第11个残基、第12个残基是在25℃下，于20分钟进行2次反应。第13个残基是在75℃下，于10分钟进行2次反应。第15个残基是在25℃下，进行20分钟反应。去Fmoc化是以下述作为基本条件:与20％piperidine的DMF溶液在75℃下，使其反应3分钟。但是第2个残基、第13个残基的Fmoc基的去除是通过在25℃下进行5分钟反应后，使其反应10分钟而进行。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将10eq的氯乙酸、10eq的DIPCI、10eq的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液，添加固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，在氯乙酰基导入步骤后，将所得的树脂以DMF清洗5次、以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，2min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加5等量的三乙胺，在室温振荡约14小时。将由1.1eq的5-FAM(Funakoshi)、1.2eq的EDC、1.2eq的HOSu调整后的F-FAM-NHS添加至反应溶液，在室温搅拌3小时。使用Savant Explorer SpeedVaC将所得的反应溶液进行减压浓缩。
所得的粗中间体肽是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C185μmμm OBD(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA inMeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟9-34％，之后耗费8分钟34-39％，之后耗费1分钟39-60％；流量:120mL/min)。冷冻干燥后，使用以下的条件进行再度精制(管柱；COSMOSIL PBr10x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟21-46％，之后耗费8分钟46-51％，之后耗费1分钟51-60％；流量:5mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为95.3％。
分析条件B:保持时间＝4.47分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μmμm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000651
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝944.42(M+3H)3+。
hTfR＿894＿variant03＿PEG4dk5FAM、hTfR＿894＿variant61＿PEG4dk5FAM及作 为负控制组的Flip894＿variant61＿PEG4dk5FAM的合成
对于与hTfR＿894＿3m＿PEG4dk5FAM同样地合成、环化的hTfR＿894＿3m＿PEG4、hTfR＿894＿variant03＿PEG4、hTfR＿894＿variant61＿PEG4及Flip894＿variant61＿PEG4，同样地添加由5-FAM所调整的F-FAM-NHS，获得所述的共轭物。
此外，针对所合成的各种共轭物，与实施例2同样地利用SPR确认与hTfR的结合。仅Flip894＿variant91＿PEG4未确认到与hTfR的结合。
〔试料溶液的制备及往细胞的添加〕
在试料的稀释中，使用稀释用培养基(包含0.5％牛血清白蛋白及20μg/mL人转铁蛋白全型的RPMI 1640培养基)。以稀释用培养基将试料稀释成100nmol/L。
确认在24孔板中已一晩培养的细胞BT-549与盖玻片接着后，以RPMI 1640培养基清洗2次。以500μL/well添加包含0.5％牛血清白蛋白的RPMI 1640培养基，在冰上静置15分钟后，以500μL/well添加已稀释的试料溶液，在37℃、5％CO2条件下静置3小时。
〔细胞的固定、核染色、封片〕
从24孔板去除试料溶液，以PBS将细胞BT-549清洗3次。以500μL/well添加4％多聚甲醛磷酸缓冲液(富士胶片和光纯药公司)，在室温静置15分钟后，以PBS清洗3次。再者，以500μL/well添加已以PBS稀释成2μg/mL的赫斯特33342(Hoechst 33342)(Thermo FisherScientific)，在室温、遮光下静置10分钟后，以PBS清洗3次。从24孔板取出盖玻片，使用Fluorescent Mounting Medium(Agilent公司)，在载玻片上进行封片，在室温、遮光下静置一晩。观察是使用倒立型荧光显微镜DMI6000B(Leica Microsystems公司)，以FITC及DAPI检测用的波长进行观察。将结果表示于图5。此外，图中的线状比例尺表示50μm。
如由图5可确认般，hTfR＿894＿3m＿PEG4dk5FAM、hTfR＿894＿variant03＿PEG4dk5FAM、hTfR＿894＿variant61＿PEG4dk5FAM虽确认到往细胞内的移行，但具有无与hTfR的结合能力的肽的Flip894＿variant91＿PEG4不会往细胞内移行。由此结果可知，hTfR＿894及具有与hTfR的结合能力的变异体，显示会通过与hTfR的结合而移行至细胞内。
实施例9
合成以下的肽或连接子加成肽。
[实施例9-1]
894＿v01＿PEG12(序列号102)的合成
[化4]
Figure BDA0003807566610000661
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.52mmol/g，0.19g)，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，使用Biotage公司的SyroI作为自动合成仪，遵循制造商的手册进行合成。缩合反应的基本条件为在75℃下，于20分钟进行2次重复反应。但是，在导入第15、16个残基时，在室温进行60分钟、15分钟反应。又，在导入PEG时，进行1次缩合反应，在导入第11个残基氨基酸时进行3次缩合反应。去Fmoc化的基本条件为在哌嗪(5％)与Oxima pure(0.2M)的DMF溶液中，在50℃使其反应5分钟后，使其再度反应15分钟。但是，第15及16个残基的Fmoc基的去除是通过在25℃进行5分钟后，再度进行15分钟反应而进行。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，添加5等量的ClAcOSu的DMF溶液，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次，并以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(10000rpm，1min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加10等量的三乙胺，在室温振荡约1小时。将所得的反应溶液使用Savant ExplorerSpeedVaC进行减压浓缩。
接下来，使用所得的固相树脂，遵循所述的一般方法，进行侧链的去保护及从固相树脂的剪切及环化反应。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μmμm OBD(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA inMeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟8-33％，之后耗费8分钟33-38％，之后耗费1分钟38-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为91.5％。
分析条件A:保持时间＝3.57分钟:ESI-MS(+)观测值m/z＝理论值(M+3H)3+。
分析条件B:保持时间＝12.8分钟；梯度(％B conc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝899.6(M+3H)3+。
[实施例9-2]
894＿v05＿PEG8Me(序列号43)的合成
[化5]
Figure BDA0003807566610000671
将Cl-Trt(2-Cl)resin(1g，1.6mmoL，渡边化学工业，1.6mmol/g)以DCM(脱水，10mL，nacalai tesque)膨润10分钟，以过滤后DCM(脱水、10mL)清洗2次。对于已膨润的树脂，依序添加Fmoc-CyS(CH2COOH)-PEG8Me(767mg，1mmol)的DCM(脱水、10mL)溶液、DIEA(836uL，4.8mmoL，渡边化学工业)，在室温振荡35分钟。再者，添加MeOH(1mL，KISHIDACHEMICAL)，振荡10分钟后，将树脂以DMF(10mL，KISHIDA CHEMICAL)清洗3次，以DCM(10mL，KISHIDA CHEMICAL)清洗3次，以乙醚(10mL，KISHIDA CHEMICAL)清洗3次清洗后，进行减压干燥，获得Fmoc-CyS[CH2COO-Trt(2-Cl)-resin]-PEG8Me(1.686g，94％)。使用所得的树脂，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，将Biotage公司的SyroI使用作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，对于树脂1eq，使用Fmoc-AA-OH/HATU/DIEA(3.2eq/3eq/6.3eq)，在DMF中，在室温下，于30分钟进行2次重复反应。但是，第1个残基、导入第2个残基、第4个残基时是在室温下，于60分钟进行3次反应。导入第3个残基时是在25℃下，于60分钟进行2次重复反应。导入第9个残基时是在室温下，于30分钟进行3次反应。并且，Fmoc去除是通过在与20％piperidine的DMF溶液在室温下进行5分钟反应后，使其再度反应15分钟而进行。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将3等量的氯乙酸的DMF溶液(0.45M)、3等量的HCTU的DMF溶液(0.43M)、3等量的DIPEA的DMF溶液(1.57M)添加至固相树脂，在室温振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-HFIP/DCM(1/4)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，重复3次与所述滤液进行混合的操作。将此滤液使用GenevaC EZ-2Elite进行减压浓缩后，若添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，5min)，并倾析上清液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为2.5mM的方式溶解于DMF后，添加1.1等量的HATU的DMF溶液(0.43M)、1.5等量的DIPEA，在室温振荡约1小时。在所得的反应溶液中以室温添加3等量的乙酸后，使用GenevaC EZ-2进行减压浓缩。在所得的残渣中添加已冰冷的二异丙醚，产生白色沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，10分钟)，并倾析上清液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的乙醚清洗，并进行减压干燥。在所得的固体中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡60分钟。添加已冰冷的过剩的二异丙醚，产生沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，5min)，并倾析上清液。将所得的固体再度以已冰冷的乙醚清洗后，使其减压干燥。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)30x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟8-33％，之后耗费8分钟33-38％，之后耗费1分钟38-60％；流量:45mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为97.4％。
分析条件B:保持时间＝11.93分钟；梯度(％B conc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1211.6(M+2H)2+。
[实施例9-3]
hTfR＿894＿E1＿PEG12＿(Hydrazide)(序列号218)的合成
[化6]
Figure BDA0003807566610000691
使用NH2NH-Trt(2-Cl)-resin(渡边化学，0.78mmol/g，0.13g)，遵循所述的一般方法，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，基本条件为对于树脂1eq使用Fmoc-AA-OH/HATU/DIEA(5.3eq/5eq/10eq)，缩合反应是在75℃下反应10分钟。在导入第11个、第12个残基氨基酸时，分别在25℃下，于30分钟进行2次缩合反应。第13个残基、第14个残基是在75℃下，于10分钟进行2次。第15个残基是在25℃下，于30分钟进行1次。第16个残基是使用Fmoc-AA-OH/HATU/DIEA(3eq/3eq/6eq)并在25℃下，于120分钟进行1次。去Fmoc化的基本条件为在20％piperidine in DMF中，在75℃下使其反应3分钟。但是第13、15个残基的Fmoc基的去除是通过在25℃下进行5分钟后，使其反应10分钟而进行。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将10eq的氯乙酸、10eq的DIPCI、10eq的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的NMP，制备ClAcOSu的DCM/NMP溶液(0.2M)，添加固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次，以氯甲烷清洗3次，并在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡60分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，2min)，并倾析溶液。将所得的个体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，将所得的固体进行干燥，使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加5等量的三乙胺，在室温搅拌约14小时。以乙酸进行骤冷，将反应溶液使用Biotage V-10进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)30x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟5-29％，之后耗费8分钟29-34％，之后耗费1分钟34-60％；流量:45mL/min。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为77.0％。
分析条件B:保持时间＝10.57分钟；管柱Kinetex EVO C18 2.6μm、2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000702
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％Bconc)耗费20分钟20–60％，之后耗费1分钟60–95％，之后耗费5分钟95-95％；流量:0.25mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1378.48(M+2H)2+。
[实施例9-4]
894＿3m＿G＿Azi(序列号297)的合成
[化7]
Figure BDA0003807566610000701
对于另外合成的894＿3m＿G(3.3g，1.39mmol)，使用以众所周知的方法所合成的1.1eq的H-KN3-NH2(316mg，1.52mmol)、1.2eq的HATU(632mg，1.66mmol)、5eq的DIEA(1.21mL，6.93mmol)，在室温下搅拌30分钟。
所得的混合物是使用以下的条件所精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费2分钟7-7％，之后耗费1分钟7-32％，之后耗费8分钟32-37％，之后耗费1分钟37-60％；流量:耗费1分钟20-20mL/min，之后耗费1分钟20-120mL/min，之后120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为97.1％。
分析条件B:保持时间＝4.29分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000712
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1154.72(M+2H)2+。
[实施例9-5]
894＿variant＿39(序列号327)的合成
[化8]
Figure BDA0003807566610000711
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.21g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，对于树脂1eq，使用Fmoc-AA-OH/DIPCI/Oxima pure(5.3eq/10eq/5eq)，在DMF中，在90℃下，于3分钟进行1次重复反应。但是，导入第2个残基、第4个残基时是在75℃下，于30分钟进行2次反应。第9个残基是在90℃下，于10分钟进行2次反应。第11个残基、第12个残基是在50℃下，于15分钟进行2次反应。第13个残基是在90℃下，于3分钟进行2次反应。第15个残基是在50℃下，于15分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件为与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，第2个残基、第4个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃下于5分钟进行2次重复反应。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将5eq的氯乙酸in DMF、5eq的HATU in DMF、10eq的DIEA inDMF添加至固相树脂，在室温振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡60分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，1.5min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加10等量的三乙胺，以室温振荡约24小时。将所得的反应溶液使用SavantExplorer SpeedVaC进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟11-36％，之后耗费8分钟36-41％，之后耗费1分钟41-60％；流量:120mL/min。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为93.1％。
分析条件B:保持时间＝12.76分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000721
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％；流量:0.25mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1196.12(M+2H)2+。
[实施例9-6]
894＿variant＿120(序列号353)的合成
[化9]
Figure BDA0003807566610000731
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.43g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，对于树脂1eq，使用Fmoc-AA-OH/HATU/DIEA(5eq/5eq/10eq)，在DMF中，在75℃下，于10分钟进行1次反应。但是，第1个残基、第3个残基是在75℃下，于20分钟进行1次反应。第2个残基、第4个残基是在75℃下，于30分钟进行1次反应。第9个残基、第10个残基、第11个残基是在75℃下，于20分钟进行2次反应。第12个残基是在25℃下，于30分钟进行2次反应。第13个残基是在75℃下，于10分钟进行2次反应。第15个残基是在25℃下，于30分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，第2个残基、第4个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃下，于5分钟进行2次重复反应。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将5eq的ClAcOH in DMF、5eq的HATU in DMF、10eq的DIEA in DMF添加至固相树脂，在25℃振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡60分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，2min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加10等量的三乙胺，在室温振荡约16小时。将所得的反应溶液使用Savant Explorer SpeedVaC进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟16-41％，之后耗费8分钟41-46％，之后耗费1分钟46-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为97.5％。
分析条件B:保持时间＝6.07分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000742
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1036.90(M+2H)2+。
[实施例9-7]
894＿variant＿61(序列号354)的合成
[化10]
Figure BDA0003807566610000741
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.21g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，对于树脂1eq，使用Fmoc-AA-OH/DIPCI/Oxima pure(5.3eq/10eq/5eq)，在DMF中，在90℃下，于3分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第4个残基是在75℃下，于30分钟进行2次反应。第10个残基、第11个残基是在90℃下，于10分钟进行2次反应。第12个残基是在50℃下，于15分钟进行2次反应。第13个残基是在90℃下，于3分钟进行2次反应。第15个残基是在50℃下，于15分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件为与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，第2个残基、第4个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃下，于5分钟进行2次重复反应。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将10eq的氯乙酸、5eq的DIPCI、5eq的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.2M)，添加至固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，2min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加5eq的三乙胺，在室温振荡约14小时。将所得的反应溶液使用Savant Explorer SpeedVaC进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟15-40％，之后耗费8分钟40-45％，之后耗费1分钟45-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为87.5％。
分析条件B:保持时间＝16.50分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000751
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％；流量:0.25mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1160.58(M+2H)2+。
[实施例9-8]
894＿variant＿14(序列号387)的合成
[化11]
Figure BDA0003807566610000761
使用Fmoc-D-Glu(OtBu)-wang resin(渡边化学，0.68mmol/g，184mg)，依循一般的方法，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，依循制造商的手册进行。缩合反应的基本条件为在缩合剂中使用HATU，并在75℃下，使其于10分钟反应2次。但是，第2个残基是在75℃下，于30分钟进行2次反应。第4个残基是在75℃下，于30分钟进行2次反应。第6个残基是在75℃下，于10分钟进行1次反应。第7个残基是在75℃下，于10分钟进行1次反应。第8个残基是在75℃下，于10分钟进行1次反应。第10个残基是在75℃下，于10分钟进行1次反应。第11个残基是在30℃下，于30分钟进行2次反应。第12个残基是在30℃下，于30分钟进行1次反应。第15个残基是在30℃下，于30分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件为与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，关于第2个残基、第4个残基、第13个残基，Fmoc去除是在室温下，使其于5分钟反应2次。氯乙酰基的导入是通过将氯乙酸(5等量)、DIPCI(5等量)、HOSu(5等量)在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液，添加至由前步骤所得的固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(3/1)，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9500rpm，1min)，倾析上清液后，利用已冷却至0℃的乙醚进行清洗，将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为4mM的方式溶解于DMSO后，添加10等量的三乙胺，在室温振荡约16小时。将所得的反应溶液使用GenevaC EZ-2Elite进行减压浓缩。
所得的反应液是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C185μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟11-36％，之后耗费8分钟36-41％，之后耗费1分钟41-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为88.60％。
分析条件B:保持时间＝13.03分钟；梯度(％B conc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1137.23(M+2H)2+。
[实施例9-9]
894＿variant84(序列号390)的合成
[化12]
Figure BDA0003807566610000771
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.21g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，对于树脂1eq，使用Fmoc-AA/DIPCI/Oxyma pure＝5.3eq/10eq/5eq，在DMF中，在90℃下，于3分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第4个残基是在75℃下，于45分钟进行2次反应。第11个残基、第12个残基是在50℃下，于15分钟进行2次重复反应。导入第13个残基时是在90℃下，于3分钟进行2次反应。并且，Fmoc去除的基本条件为与20％piperidine的DMF溶液在75℃下，使其于3分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第4个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃于5分钟进行2次重复反应。在连第1个残基都伸长后，将树脂悬浮于DCM中，添加Pd(PpH3)4/pHSiH3(0.2eq/10eq)，在室温振荡1小时。氯乙酰基的导入是通过将已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂以DMF清洗3次、以DCM清洗3次后，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，添加5eq的氯乙酸in DMF、5eq的HATU in DMF、10eq的DIEA in DMF，在室温振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(10000rpm，1min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加10等量的三乙胺，在室温进行整夜振荡。使用Savant Explorer SpeedVaC将反应溶液进行减压浓缩。将所得的混合物溶解于DMSO(4mL)，添加HOSu(10eq)、EDC HCl(10eq)，在室温搅拌2小时。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)30x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟11-36％，之后耗费8分钟36-41％，之后耗费1分钟41-60％；流量:45mL/min)。
将所得的环状肽-NHS酯(25mg，11.3μmol)溶解于DMF(225μL)，添加Fmoc-MeK-OH盐酸盐(5mg，11.9μmol)及DIEA(5.9μL，33.9μmol)并进行搅拌。1小时后，在反应液中添加Et2NH(5.9μL，56.5μmol)并进行搅拌。1小时后，以乙酸进行骤冷。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)19x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％B):耗费3分钟8-33％，之后耗费8分钟33-38％，之后耗费1分钟38-60％；流量:17mL/min。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为97.9％。
分析条件B:保持时间＝12.33分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000781
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1134.34(M+2H)2+。
[实施例9-10]
894＿variant89(序列号391)的合成
[化13]
Figure BDA0003807566610000791
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.21g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，对于树脂1eq，使用Fmoc-AA/DIPCI/Oxyma pure/DIEA(5.3eq/10eq/5eq)，在DMF中且90℃下，于3分钟进行1次反应。但是，导入第2个残基、第4个残基时是在75℃下，于45分钟进行2次反应。导入第11个残基、第12个残基时是在50℃下，于15分钟进行2次重复反应。导入第13个残基时是在90℃下，于3分钟进行2次反应。并且，Fmoc去除的基本条件为与20％piperidine的DMF溶液在75℃下，使其于3分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第4个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃下，于5分钟进行2次重复反应。在连第1个残基都伸长后，将树脂悬浮于DCM中，添加Pd(PpH3)4/pHSiH3(0.2eq/10eq)，在室温振荡1小时。将固相树脂以DMF清洗3次，且以DCM清洗3次后，使其减压干燥。将树脂(60μmol)悬浮于DMF中，添加H-D-Glu(OtBu)-OtBu盐酸盐(71mg，0.24mmol)、0.5M Oxyma pure in DMF(0.48mL，0.24mmol)、DIPCI(37μL，0.24mmol)及DIEA(42μL，0.24mmol)，在微波照射下，使其在75℃于30分钟反应2次。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，添加5eq的氯乙酸in DMF、5eq的HATU in DMF、10eq的DIEA in DMF，在室温振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(10000rpm，1min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加10eq的三乙胺，在室温进行整夜振荡。使用Savant Explorer SpeedVaC将反应溶液进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟8-33％，之后耗费8分钟33-38％，之后耗费1分钟38-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为94.9％。
分析条件B:保持时间＝11.81分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000802
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％Bconc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％；流量:0.25mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1127.76(M+2H)2+。
[实施例9-11]
894＿variant＿03(序列号397)的合成
[化14]
Figure BDA0003807566610000801
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.21g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，对于树脂1eq，使用Fmoc-AA/DIPCI/Oxima pure(4.2eq/4eq/8eq)，在DMF中且75℃下，于10分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第4个残基是在75℃下，于30分钟进行2次反应。第11个残基、第12个残基是在90℃下，于10分钟进行2次反应。第13个残基是在75℃下，于10分钟进行2次反应。第15个残基是在25℃下，于20分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下，使其反应3分钟。但是，第2个残基、第4个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃下于5分钟进行反应后，在25℃下于10分钟进行反应。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将氯乙酸(10等量)、10等量的DIPCI、10等量的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.2M)，添加至固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，2min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于50％MeCN水溶液后，添加5等量的三乙胺，在室温振荡约14小时。将所得的反应溶液使用Savant Explorer SpeedVaC进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟10-35％，之后耗费8分钟35-40％，之后耗费1分钟40-60％；流量:120mL/min。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为98.2％。
分析条件B:保持时间＝13.18分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000811
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％Bconc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95-95％；流量:0.25mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1072.49(M+2H)2+。
[实施例9-12]
894＿variant＿31(序列号400)的合成
[化15]
Figure BDA0003807566610000821
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.21g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，对于树脂1eq，使用Fmoc-AA/DIPCI/Oxima pure(4.2eq/4eq/8eq)，在DMF中，在90℃下，于3分钟进行2次重复反应。但是，导入第2个残基、第4个残基时是在75℃下，于45分钟进行2次反应。第3个残基是在75℃下，于30分钟进行2次反应。第7个残基、第8个残基是在90℃下，于3分钟进行1次反应。导入第11个残基、第12个残基时是在50℃下，于15分钟进行2次反应。第15个残基、第16个残基是在50℃下，于15分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，第2个残基、第4个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃于5分钟进行2次重复反应。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将氯乙酸(5等量)、5等量的DIPCI、5等量的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.2M)，添加至固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9500rpm，1min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为4mM的方式溶解于DMSO后，添加7等量的三乙胺，在室温振荡约12小时。将所得的反应溶液使用GenevaC EZ-2Elite进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟15-40％，之后耗费8分钟40-45％，之后耗费1分钟45-60％；流量:120mL/min。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为95.4％。
分析条件B:保持时间＝12.64分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000832
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％；流量:0.25mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1195.87(M+2H)2+。
[实施例9-13]
894＿variant＿03＿G4S2C(序列号401)的合成
[化16]
Figure BDA0003807566610000831
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.73mmol/g，1.37g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，对于树脂1eq，使用Fmoc-AA/HATU/DIEA(4.2eq/4eq/8eq)，在DMF中，在75℃下，于10分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第4个残基是在75℃下，于30分钟进行1次反应。第11个残基、第12个残基是在25℃下，于20分钟进行2次重复反应。第13个残基是在75℃下，于10分钟进行2次反应。第15个残基、第22个残基是在25℃下，于30分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件为与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，第2个残基、第4个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃下进行5分钟反应后，在室温下使其反应10分钟。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将10eq的氯乙酸、10eq的DIPCI、10eq的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.2M)，添加至固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比90:2.5:2.5:5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9500rpm，1min)，将溶液进行倾析并使其在减压下进行干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加10eq的三乙胺，在室温振荡约15小时。将所得的反应溶液使用GenevaC HT-12进行减压浓缩。将所得的混合物溶解于DMSO，添加3eq的乙酸银，振荡3小时。添加2M DTT水溶液(11eq)后，进行离心分离，回收上清液后，在减压下进行浓缩而获得粗生成物。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟11-11％，之后耗费3分钟11-36％，之后耗费8分钟36-41％，之后耗费1分钟41-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为94.8％。
分析条件B:保持时间＝4.31分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000841
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1324.94(M+2H)2+。
[实施例9-14]
894＿A＿hgl＿CyCloamide(序列号408)的合成
[化17]
Figure BDA0003807566610000851
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g)，依循一般的方法，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，依循制造商的手册进行。缩合反应的基本条件是在缩合剂中使用DIPCI、Oxyma pure，在90℃下，于3分钟使其进行1次反应。但是，第11个残基、第12个残基是在50℃下，于15分钟进行2次重复反应。第13个残基是在90℃下，于3分钟进行2次重复反应。并且，Fmoc去除的基本条件为与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，关于第13个残基，Fmoc去除是通过在25℃下，于5分钟使其进行2次反应而进行。将所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚与己烷的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，2min)，并倾析上清液。将所得的固体以已冰冷的乙醚清洗后，使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMF后，添加1.5等量的HATU、3等量的三乙胺，在室温振荡约1小时。将所得的反应溶液使用Savant Explorer SpeedVaC进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)30x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟6-31％，之后耗费8分钟31-36％，之后耗费1分钟36-60％；流量:45mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为96.8％。
分析条件B:保持时间＝10.03分钟；梯度(％B conc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1033.0(M+2H)2+。
[实施例9-15]
894＿BiCyCle＿001(序列号409)的合成
[化18]
Figure BDA0003807566610000861
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.53mg)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1等量，使用Fmoc-AA/HATU/DIEA(4.2等量/4等量/8等量)，在DMF中，在75℃下，于10分钟进行2次反应。但是，第1个残基、第6个残基、第10个残基是在75℃下，于10分钟进行1次反应。第2个残基、第3个残基是在75℃下，于20分钟进行2次反应。第4个残基是在75℃下，于30分钟进行2次反应。第11个残基、第14个残基是在75℃下，于20分钟进行1次反应。第12个残基、第15个残基是在30℃下，于30分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件为与20％piperidine的DMF溶液在75℃下，使其于3分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第4个残基、第13个残基的Fmoc去除是在25℃下，于5分钟进行2次重复反应。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将5等量的氯乙酸、5等量的DIPCI、5等量的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.2M)，添加至固相树脂，在室温振荡75分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9500rpm，1min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为4mM的方式溶解于5％含水DMSO后，添加10等量的三乙胺，在室温振荡约12小时。将所得的反应溶液使用GenevaC EZ-2Elite进行减压浓缩。对于所得的混合物，以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为25mM的方式溶解于DMF，添加1等量的HATU、3等量的DIEA，在室温振荡约30分钟。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟11-36％，之后耗费8分钟36-41％，之后耗费1分钟41-60％；流量:120mL/min。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为94.8％。
分析条件B:保持时间＝13.78分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000872
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度℃:60℃；梯度(％Bconc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95-95:流量0.25％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1072.26(M+2H)2+。
[实施例9-16]
894＿BiCyCle＿006(序列号414)的合成
[化19]
Figure BDA0003807566610000871
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.32g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1等量，使用Fmoc-AA/DIPCI/Oxyma pure/DIEA(5.3等量/10等量/5等量)，在DMF中，在90℃下，于3分钟进行1次反应。但是，导入第2个残基、第4个残基、第11个残基、第13个残基时是在90℃下，于3分钟进行2次反应。导入第12个残基时是在50℃下，于15分钟进行2次反应。导入第15个残基时是在50℃下，于15分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其于3分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第4个残基、第13个残基的Fmoc去除是在25℃下，于5分钟进行2次重复反应。将固相树脂以DMF、DCM进行依序清洗并减压干燥后，以DCM使其膨润，添加10等量的pHSiH3、0.2等量的Pd(PpH3)4，在室温振荡1小时。将固相树脂以DCM清洗5次、以DMF清洗5次、以乙醚清洗3次并使其干燥。将固相树脂以NMP进行膨润，添加5等量的HATU、5等量的DIEA，在室温振荡30分钟。将树脂清洗后，再度添加5等量的HATU、5等量的DIEA，在室温振荡30分钟。将固相树脂以DCM清洗5次、以DMF清洗5次、以乙醚清洗3次。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将5等量的氯乙酸、5等量的DIPCI、5等量的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.2M)，添加至固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9500rpm，1min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为3.3mM的方式溶解于5％含水DMSO后，添加7等量的三乙胺，在室温振荡约12小时。将所得的反应溶液使用GenevaC EZ-2 Elite进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度℃:40℃；梯度(％B):耗费3分钟7-32％，之后耗费8分钟32-37％，之后耗费1分钟37-60％；流量:120mL/min)精制后，进行冷冻干燥，利用以下的条件进行再度精制。(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA inMeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟11-36％，之后耗费8分钟36-41％，之后耗费1分钟41-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为89.0％。
分析条件B:保持时间＝3.67分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000881
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1055.13(M+2H)2+。
[实施例9-17]
894＿BiCyCle＿012(序列号419)的合成
[化20]
Figure BDA0003807566610000891
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，213mg)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。使用Fmoc-W1aa(Allyl)-OH、Fmoc-Hgl(tBu)-OH、Fmoc-Hly(Boc)-OH作为氨基酸原料，除此之外，参考Bicycle＿01及Bicycle＿06的合成，以同样的方法获得粗生成物。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)19x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％B):耗费3分钟11-36％，之后耗费8分钟36-41％，之后耗费1分钟41-60％；流量:17mL/min。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为94.8％。
分析条件B:保持时间＝4.76分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000892
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1093.23(M+2H)2+。
[实施例9-18]
894＿3m＿G(序列号421)的合成
[化21]
Figure BDA0003807566610000901
使用Fmoc-Gly-wang resin(渡边化学，0.78mmol/g，1.31g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1等量，使用Fmoc-AA/HATU/DIEA(4.2等量/4等量/8等量)，在DMF中，在60℃下，于15分钟进行2次重复反应。但是，导入第15个残基时是在25℃下，于30分钟进行1次反应。导入第11个残基、第12个残基时是在25℃下，于20分钟进行2次重复反应。导入第10个残基时是在60℃下，于15分钟进行1次反应。导入第7个残基时是在60℃下，于15分钟进行1次反应。导入第5个残基时是在60℃下，于15分钟进行1次反应。导入第3个残基时是在60℃下，于45分钟进行2次反应。并且，Fmoc去除的基本条件为与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，第2个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃于5分钟进行2次重复反应。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将氯乙酸(5等量)、5等量的DIPCI、5等量的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.2M)，添加至固相树脂，以室温振荡240分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9500rpm，1min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为4mM的方式溶解于DMSO后，添加10等量的三乙胺，以室温振荡约12小时。将所得的反应溶液使用GenevaC EZ-2进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x250mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％B):耗费5分钟0-0％，之后耗费2分钟0-4.2％，之后耗费3分钟4.2-28.6％，之后耗费15.5分钟28.6-33.7％，之后耗费1.5分钟33.7-60％；流量:5分钟18mL/min之后，耗费2分钟18mL/min-118mL/min，之后为118mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为92.2％。
分析条件B:保持时间＝11.52分钟；梯度(％B conc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1078.24(M+2H)2+。
[实施例9-19]
894＿3m＿G4S2C(ACNMe)(序列号443)的合成
[化22]
Figure BDA0003807566610000911
将另外合成的894＿3m＿G4S2C(20mg，7.07μmol)溶解于DMF(0.1mL)，添加4等量的TEA(3.94μL，28.3μmol)in DMF(39μL)、1.1等量的2-Iodo-N-MethylaCetamide(39.1mg，0.25mmol)in DMF(15μL)，在室温搅拌1小时。
所得的混合物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C185μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％B):耗费3分钟6-31，之后耗费8分钟31-36％，之后耗费1分钟36-60％；流量:17mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为97.3％。
分析条件B:保持时间＝3.53分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000922
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1337.32(M+2H)2+。
[实施例9-20]
894＿0263(序列号487)的合成
[化23]
Figure BDA0003807566610000921
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.48mmol/g，0.26g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1等量，使用Fmoc-AA/DIPCI/Oxyma pure/DIEA(4.2等量/8等量/4等量)进行反应。并且，Fmoc去除是通过与20％piperidine的DMF溶液进行反应而进行。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，添加5等量的氯乙酸in DMF、5等量的HATU in DMF、10等量的DIEA in DMF，在25℃下，振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡60分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，2min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加10等量的三乙胺，在室温进行整夜振荡。使用Savant Explorer SpeedVaC将反应溶液进行减压浓缩。将所得的固体以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加MePEG4c(1.2等量)、HATU(1.1等量)、DIEA(3等量)，在室温振荡1小时。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟13-38％，之后耗费8分钟38-43％，之后耗费1分钟43-60％；流量:120mL/min。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为92.3％。
分析条件B:保持时间＝5.28分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000931
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1136.17(M+2H)2+。
合成以下的肽、连接子及有效载荷的复合体。
[实施例10-1]
JCR＿hTfR＿000894＿PEG11＿K＿FITC(序列号147)的合成
[化24]
Figure BDA0003807566610000941
使用Fmoc-NH-SAL-PEG-resin 1500-2000Da(渡边化学，0.38mmol/g)，依循一般的方法，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成仪，依循制造商的手册进行。缩合反应的基本条件是在缩合剂中使用HATU，在75℃下，使其于10分钟进行1次反应。但是，第11个残基、第12个残基是在25℃下，于20分钟进行2次重复反应。第13个残基、第14个残基是在75℃下，于10分钟进行2次重复反应。第15个残基是在25℃下，于20分钟进行1次反应。第16个残基是在25℃下，于60分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件为与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，关于第13个残基、第15个残基，Fmoc去除是通过在25℃下，使其反应5分钟后，使其反应10分钟而进行。氯乙酰基的导入是通过对于由前步骤所得的树脂，将5等量的氯乙酸的DMF溶液(0.2M)、5等量的HATU的DMF溶液(0.5M)、10等量的DIPEA的DMF溶液(1M)添加至固相树脂，在室温振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚与己烷的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(10000rpm，1min)，并倾析上清液。将所得的固体以已冰冷的乙醚清洗后，使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加6等量的三乙胺，在室温进行整夜振荡。在所得的反应溶液中添加1.1等量的FAM-OSu的DMSO溶液(0.71M)，搅拌30分钟。在反应溶液中添加AcOH进行骤冷，在减压下浓缩溶媒。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:XSeleCt C18 30x150mm(LotNo.151i3629811308)；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟6-31％，之后耗费8分钟31-36％，之后耗费1分钟36-60％；流量:45mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为97.1％。
分析条件B:保持时间＝13.20分钟；梯度(％B conc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝793.2理论值792.6(M+4H)4+。
[实施例10-2]
894＿v01＿PEG12＿C＿Mal(FITC)(序列号166)的合成
[化25]
Figure BDA0003807566610000951
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.6mmol/g，0.19g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1等量，使用Fmoc-AA/HATU/DIEA(5.3等量/5等量/10等量)，在DMF中，在75℃下，于10分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第13个残基是在75℃下，于10分钟进行2次反应。第11个残基、第12个残基是在25℃下，于20分钟进行2次重复反应。第15个残基、第17个残基是在25℃下，于30分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下，于3分钟使其反应。但是，第2个残基、第13个残基、第15个残基、第17个残基的Fmoc去除是在25℃下，于5分钟进行反应后，在25℃下反应10分钟。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将5等量的氯乙酸inDMF、5等量的HATU in DMF、10等量的DIEA in DMF添加至固相树脂，在室温振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(10000rpm，1min)，将溶液进行倾析，将固体以已冷却至0℃的乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加6等量的三乙胺，在室温进行整夜振荡。将所得的反应溶液使用Savant Explorer SpeedVaC.进行减压浓缩。将所得的混合物溶解于DMSO，添加3等量的乙酸银，振荡3小时。添加10等量的DTT后，进行离心分离，回收上清液。
所得的粗中间体肽是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C185μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟9-34％，之后耗费8分钟34-39％，之后耗费1分钟39-60％；流量:120mL/min)。
将已精制的中间体肽(29.8mg，10.6μmol)溶解于DMSO(424μL)，添加1.1等量的荧光素-5-顺丁烯二酰亚胺、5等量的DIEA，搅拌1小时后，以乙酸进行骤冷。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:COSMOSIL PBr 10x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟23-48％，之后耗费8分钟48-53％，之后耗费1分钟53-60％；流量:5mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为82.8％。
分析条件B:保持时间＝13.93分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000961
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％Bconc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％；流量:0.25mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1076.51理论值(M+2H)2+。
[合成例10-3]
894＿variant＿61＿G4S2C(序列号358)的合成
[化26]
Figure BDA0003807566610000971
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.73mmol/g，1.37g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1等量，使用Fmoc-AA/HATU/DIEA(4.2等量/4等量/8等量)，在DMF中，在75℃下，于10分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第4个残基是在75℃下，于30分钟进行1次反应。第12个残基是在25℃下，于20分钟进行2次重复反应。第13个残基是在75℃下，于10分钟进行2次反应。第15个残基、第22个残基是在25℃下，于30分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下反应3分钟。但是第4个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃下进行5分钟反应后，在室温反应10分钟。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将10等量的氯乙酸、10等量的DIPCI、10等量的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.2M)，添加至固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比90:2.5:2.5:5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9500rpm，1min)，将溶液进行倾析，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加10等量的三乙胺，在室温振荡约15小时。将反应液以乙酸进行骤冷，使用GenevaC HT-12进行减压浓缩。将所得的混合物溶解于DMSO(20mL)，添加3等量的乙酸银，振荡3小时。添加2M DTT水溶液(11等量)后，进行离心分离，回收上清液后，在减压下进行浓缩，获得粗生成物。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x250mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％B):耗费5分钟6.7-6.7％，之后耗费2分钟6.7-10.3％，之后耗费3分钟10.3-35.8％，之后耗费15.5分钟35.8-40.8％，之后耗费1.5分钟40.8-60％；流量:耗费5分钟18mL/min-18mL/min，之后耗费2分钟18mL/min-118mL/min，之后118mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为94.8％。
分析条件B:保持时间＝5.45分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610000981
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1289.65(M+2H)2+。
如同以下，合成肽或连接子加成肽。此外，所合成的肽、连接子加成肽表示于表5，连接子表示于表6。
[表5]
Figure BDA0003807566610000991
[表6-1]
Figure BDA0003807566610001001
[表6-2]
Figure BDA0003807566610001011
[表6-3]
Figure BDA0003807566610001021
[合成例1-1]
894＿3142(序列号547)的合成
[化27]
Figure BDA0003807566610001031
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.48mmol/g，0.52g)，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为自动合成仪，遵循制造商的手册进行合成。合成是与实施例1同样地进行。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度:40℃；梯度(％B):耗费3分钟7-32％，之后耗费8分钟32-37％，之后耗费1分钟37-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比所算出，且为94.20％。
分析条件B:保持时间＝4.12分；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm、2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001032
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％B conc):耗费7.15分钟20–60％，之后耗费0.3分钟60–95％，之后耗费1.55分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1147.70(M+2H)2+。
[实施例1-2]
894＿3143(序列号548)的合成
[化28]
Figure BDA0003807566610001041
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.48mmol/g，0.52g)，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue HT使用作为自动合成仪，遵循制造商的手册进行合成。合成是与实施例1同样地进行。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度:40℃；梯度(％B):耗费2分钟6-6％，之后耗费1分钟6-31％，之后耗费8分钟31-36％，之后耗费1分钟36-60％；流量:耗费1分钟20-20mL/min，之后耗费1分钟20-120mL/min，之后120mL/min)。
目的物的纯度是由以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比所算出，且为97.61％。
分析条件:保持时间＝3.75分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm、2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001042
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc)耗费7.15分钟20–60％，之后耗费0.3分钟60–95％，之后耗费1.55分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1133.66(M+2H)2+。
[实施例1-3]
894＿3144(序列号549)的合成
[化29]
Figure BDA0003807566610001051
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.48mmol/g，0.52g)，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为自动合成仪，遵循制造商的手册进行合成。合成是与实施例1同样地进行。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度:40℃；梯度(％B):耗费2分钟8-8％，之后耗费1分钟8-33％，之后耗费8分钟33-38％，之后耗费1分钟38-60％；流量:耗费1分钟20-20mL/min，之后耗费1分钟20-120mL/min，之后120mL/min)。
目的物的纯度是由以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比所算出，且为97.52％。
分析条件B:保持时间＝3.97分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm、2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001052
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc)耗费7.15分钟20–60％，之后耗费0.3分钟60–95％，之后耗费1.55分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1108.62(M+2H)2+。
[实施例1-4]
894＿3145(序列号550)的合成
[化30]
Figure BDA0003807566610001061
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.48mmol/g，0.52g)，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为自动合成仪，遵循制造商的手册进行合成。合成是与实施例1同样地进行。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度:40℃；梯度(％B):耗费3分钟13-38％，之后耗费8分钟38-43％，之后耗费1分钟43-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比所算出，且为98.02％。
分析条件:保持时间＝4.91分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm、2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001062
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc)耗费7.15分钟20–60％，之后耗费0.3分钟60–95％，之后耗费1.55分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1177.95(M+2H)2+。
[实施例1-5]
894＿3147(序列号551)的合成
[化31]
Figure BDA0003807566610001071
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.48mmol/g，0.52g)，Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为自动合成仪，遵循制造商的手册进行合成。合成是与实施例1同样地进行。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度:40℃；梯度(％B):耗费3分钟21-46％，之后耗费8分钟46-51％，之后耗费1分钟51-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比所算出，且为96.34％。
分析条件:保持时间＝6.24分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm、2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001072
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc)耗费7.15分钟20–60％，之后耗费0.3分钟60–95％，之后耗费1.55分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1198.29(M+2H)2+。
[实施例1-6]
894＿3148(序列号552)的合成
[化32]
Figure BDA0003807566610001081
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.48mmol/g，0.52g)，Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为自动合成仪，遵循制造商的手册进行合成。合成是与实施例1同样地进行。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度:40℃；梯度(％B):耗费3分钟18-43％，之后耗费8分钟43-48％，之后耗费1分钟48-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由以下的分析条件的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比所算出，且为96.03％。
分析条件:保持时间＝6.15分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm、2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001082
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc)耗费7.15分钟20–60％，之后耗费0.3分钟60–95％，之后耗费1.55分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1142.36(M+2H)2+。
[合成例1-7]
894＿variant＿61＿G＿Azi(序列号543)的合成
[化33]
Figure BDA0003807566610001091
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.21g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1等量，使用Fmoc-AA/HATU/DIEA(5.3等量/5等量/10等量)，在DMF中，在75℃下，于10分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第4个残基是在75℃下，于30分钟进行1次反应。第10个残基、第11个残基、第13个残基是在75℃下，10分钟进行2次重复反应。第12个残基是在25℃下，于20分钟进行2次反应。第15个残基是在25℃下，于20分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，第2个残基、第4个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃下进行5分钟反应后，在25℃下反应10分钟。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将10等量的氯乙酸、10等量的DIPCI、10等量的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.2M)，添加至固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，2min)，将溶液进行倾析，使其在减压下进行干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加5等量的三乙胺，在室温振荡约14小时。将所得的反应溶液使用Savant ExplorerSpeedVaC进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟17-42％，之后耗费8分钟42-47％，之后耗费1分钟47-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为92.8％。
分析条件B:保持时间＝6.22分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001102
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1142.31(M+2H)2+。
[合成例1-8]
hTfR＿894＿3m＿G＿PEG4＿gAbu(NHS)(序列号635记载的连接子与序列号296的 肽的复合体)的合成
[化34]
Figure BDA0003807566610001101
使用遵循一般的固相合成而由Fmoc-Abu(4)-Alko resin(渡边化学，1.00mmol/g，0.1g)所制备的Fmoc-PEG4c-Abu-Alko resin，遵循所述的一般方法，从Fmoc的去除开始，合成C端羧酸肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将0.2M氯乙酸in DMF(5等量)、0.5M HATU in DMF(5等量)、1M DIEA in DMF(10等量)添加至固相树脂，在室温振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(10000rpm，1min)，并倾析溶液。将所得的个体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，将所得的固体进行干燥，使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加10等量的三乙胺，在室温搅拌约17小时。使用Savant ExplorerSpeedVaC将反应溶液进行减压浓缩。以将固相树脂的摩尔数作为基准而所得的C端羧酸肽的终浓度成为5mM的方式，将混合物溶解于DMSO/H2O(9/1，4mL)，添加HOSu(230mg，20等量)及EDC HCl(383.4mg，20等量)并进行搅拌。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)30x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟9-34％，之后耗费8分钟34-39％，之后耗费1分钟39-60％；流量:45mL/min。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为87.4％。
分析条件B:保持时间＝4.25分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001112
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1292.86(M+2H)2+。
[合成例1-9]
894＿C12NH2(脂肪酸连接子与序列号1的复合体)的合成
[化35]
Figure BDA0003807566610001111
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.53mmol/g，0.21g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，相对于树脂1等量，使用Fmoc-AA/HATU/DIEA(5.3等量/5等量/10等量)，在DMF中，在75℃下，进行10分钟反应。但是，第1个残基、第9个残基、第10个残基、第13个残基、第14个残基是在75℃下，于10分钟进行2次反应。第11个残基、第12个残基是在30℃下，于20分钟进行2次反应。导入第15个残基时是在30℃下，于20分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，第11个残基、第12个残基、第14个残基、第15个残基的Fmoc去除是在25℃下进行5分钟反应后，在25℃下进行10分钟反应。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将氯乙酸(5等量)、5等量的DIPCI、5等量的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.2M)，添加至固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡60分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(6000rpm，4min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO后，添加5等量的三乙胺，在室温振荡约2小时。将所得的反应溶液使用SavantExplorer SpeedVaC进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)30x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟11-36％，之后耗费3分钟36-41％，之后耗费1分钟41-60％；流量:45mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为96.3％。
分析条件B:保持时间＝12.61分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001122
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％；流量:0.25mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1140.56(M+2H)2+。
[合成例1-10]
894＿3m＿G4(序列号643记载的连接子与序列号296的肽的复合体)的合成
[化36]
Figure BDA0003807566610001121
使用Fmoc-Gly-wang resin(渡边化学，0.7mmol/g，1.43g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。缩合反应的基本条件是在缩合剂中使用HATU，在75℃下，于10分钟使其进行1次反应。但是，导入第15个残基时是在25℃下，于20分钟进行1次反应。导入第13个残基时是在75℃下，于10分钟进行2次重复反应。导入第2个残基时是在75℃下，于45分钟进行2次重复反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，第2个残基及第13个残基的Fmoc去除是通过在25℃下反应5分钟后，使其反应10分钟而进行。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，添加氯乙酸(4等量)的DMF溶液(0.2M)、4等量的DIPCI的DMF溶液(0.5M)、4等量的HOSu的DMF溶液(0.5M)，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚，则产生白浊沉淀。滤取此混合物，以乙醚清洗后，在减压下使其干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO/IPA/H2O(90/5/5)后，添加5等量的三乙胺，在室温搅拌约16小时。将所得的反应溶液使用GenevaC HT-12进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)30x250mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费0.1分钟50-7％，之后耗费1.9分钟7-7％，之后耗费3分钟7-32％，之后耗费11分钟32-37％，之后耗费1分钟37-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为90.6％。
分析条件B:保持时间＝11.34分钟；梯度(％B conc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1163.59(M+2H)2+。
[合成例1-11]
894＿3m＿G4S2＿K(Mal)(序列号561记载的连接子与序列号296的肽的复合体)的 合成
[化37]
Figure BDA0003807566610001141
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.52mmol/g，2.4g X 3)，依循一般的方法，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue使用作为固相合成仪，依循制造商的手册进行。缩合反应的基本条件是在缩合剂中使用DIPCI、Oxyma pure，在75℃下使其于10分钟进行1次反应。但是，第15个残基是在50℃下进行20分钟反应。第3个残基、第4个残基、第8个残基、第10个残基、第13个残基、第14个残基是在75℃下，于10分钟进行2次反应。第11个残基、第12个残基是在50℃下，于20分钟进行2次反应。第2个残基是在75℃下，于60分钟进行3次反应。第1个残基是在75℃下，于20分钟进行2次反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟反应。但是，关于第15个残基、第16个残基、第17个残基，Fmoc去除是通过在室温使其反应5分钟后，在75℃使其反应3分钟而进行。氯乙酰基的导入，首先，对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法，去除α-氨基的Fmoc基。之后，通过将氯乙酸(5等量)、DIPCI(5等量)、HOSu(5等量)在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.15M)，添加至固相树脂，在室温振荡180分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚，则产生白浊沉淀。滤取此混合物，以已冷却至0℃的乙醚清洗后，将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为4.9mM的方式溶解于DMSO后，添加7等量的三乙胺，在室温振荡约1小时。在所得的反应溶液中添加1.05等量的SMCC，在室温振荡1.5小时。将所得的反应溶液使用GenevaC EZ-2 Elite进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x250mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％B):耗费5.1分钟0-0％，之后耗费1.9分钟0-5％，之后耗费5分钟5-29％，之后耗费13.5分钟29-34％，之后耗费1.5分钟34-60％；流量:1mL/min至0-5.1分钟为止，从5.1分钟至7.0分钟为止为1-119mL/min，之后119mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为94.1％。
分析条件B:保持时间＝11.33分钟；梯度(％B conc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1424.0(M+2H)2+。
[合成例1-12]
894＿3m＿G4S2C(序列号644记载的连接子与序列号296的肽的复合体)的合成
[化38]
Figure BDA0003807566610001151
将另外合成的894＿3m＿G(500mg，0.21mmol)溶解于DMF(5mL)，使用以众所周知的方法所合成的1.2等量的H-Gly-Gly-Gly-Ser(OtBu)-Ser(OtBu)-CyS(Trt)-NH2(207mg，0.25mmol)、1.2等量的EDC(39.1mg，0.25mmol)、1.2等量的DIEA(35.8mg，0.25mmol)，在室温下搅拌2.5小时。添加0.24等量的H-Gly-Gly-Gly-Ser(OtBu)-Ser(OtBu)-CyS(Trt)-NH2(41.4mg，0.05mmol)、0.24等量的7.8mg，0.05mmol)、0.24等量的DIEA(7.2mg，0.05mmol)，在室温搅拌2小时。以Biotage公司V-10浓缩后，将所得的混合物在TFA/TIS/H2O/DODT(92.5/2.5/2.5/2.5)中，在室温下使其反应75分钟。若将反应液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，2min)，并倾析溶液。将所得的固体以已冷却至0℃的乙醚清洗，离心分离后(9000rpm，2min)，并倾析溶液。
所得的混合物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C185μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟5-30％，之后耗费8分钟30-35％，之后耗费1分钟35-60％；流量120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为96.1％。
分析条件B:保持时间＝3.52分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001152
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95-95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1301.89(M+2H)2+。
[合成例1-13]
894＿3m＿GGRGRS＿K(Mal)(序列号573记载的连接子与序列号296的肽的复合体) 的合成
[化39]
Figure BDA0003807566610001161
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，532mg)，依循一般的方法，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，依循制造商的手册进行。缩合反应的基本条件为在缩合剂中使用HATU，并在75℃下使其于10分钟反应2次。但是，第2个残基是在75℃下，于30分钟进行2次反应。第5个残基、第6个残基、第7个残基、第16个残基、第17个残基、第19个残基、第21个残基、第22个残基是在75℃下，于10分钟进行1次反应。第11个残基是在50℃下，于15分钟进行2次反应。第12个残基、第18个残基、第20个残基是在50℃下，于15分钟进行1次反应。第15个残基是在50℃下，于15分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，关于第2个残基、第13个残基，Fmoc去除是在室温下使其于5分钟反应2次。氯乙酰基的导入是通过将氯乙酸(5等量)、DIPCI(5等量)、HOSu(5等量)在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.15M)，添加至由前步骤所得的固相树脂，在室温振荡60分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡150分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚与己烷的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9500rpm，1min)，倾析上清液后，利用已冷却至0℃的乙醚进行清洗，将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于DMSO(5％含水)后，添加7等量的三乙胺，在室温振荡约3小时。在所得的反应溶液中，添加1.1等量的SMCC，在室温振荡3小时。将所得的反应溶液使用GenevaC EZ-2 Elite进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x250mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟5-29％，之后耗费8分钟29-34％，之后耗费1分钟34-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为95.4％。
分析条件B:保持时间＝9.53分钟；梯度(％B conc):耗费20分钟20-60％，之后耗费1分钟60-95％，之后耗费5分钟95％。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1005.7(M+3H)3+。
[合成例1-14]
894＿3m＿PEG12dk(Biotin)(序列号613记载的连接子与序列号296的肽的复合 体)的合成
[化40]
Figure BDA0003807566610001171
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.65mmol/g，0.54g)，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，将CEM公司的Liberty Blue HT使用作为自动合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，其基本条件是相对于树脂1等量，使用Fmoc-AA/DIC/Oxymapure＝5.3等量/10等量/5等量，在90℃下使其反应3分钟。但是，第2个残基是在75℃下，于30分钟进行2次反应。第11个残基、第12个残基是在50℃下，于15分钟进行2次反应。第13个残基是在90℃下，于3分钟进行2次反应。第15个残基是在50℃下，进行15分钟反应。去Fmoc化的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是第2个残基、第13个残基的Fmoc基的去除是通过在25℃下，于5分钟进行2次反应而进行。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，添加5等量的ClAcOH in DMF、5等量的HATU in DMF、10等量的DIEA in DMF，在室温振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次，并以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡90分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚/己烷(1/1)，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(10000rpm，1min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚清洗后，将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于5％含水DMSO后，添加10等量的三乙胺，在室温振荡约16小时。将所得的反应溶液使用Savant Explorer SpeedVaC进行减压浓缩。
所得的粗中间体肽是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C185μm OBD(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA inMeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟5-30％，之后耗费8分钟30-35％，之后耗费1分钟35-60％；流量:120mL/min)。
对于所得的中间体肽的DMSO溶液(22mM、160μL)，添加1.3等量的Biotin-NHS及5等量的DIEA，在室温进行搅拌。2.5小时后，将反应液以乙酸进行骤冷。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm OBD(注册商标)19x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％B):耗费3分钟10-35％，之后耗费8分钟35-40％，之后耗费1分钟40-60％；流量:17mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为98.7％。
分析条件B:保持时间＝4.30分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001182
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1017.76(M+3H)3+。
[合成例1-15]
894＿11K＿3Me＿PEG4C＿KTrzMal(序列号624记载的连接子与序列号293的肽的 复合体)的合成
[化41]
Figure BDA0003807566610001181
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.52mmol/g，0.19g)，从Fmoc的去除开始，合成目的的肽。此时，将Biotage公司的SyroI使用作为自动合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，其基本条件是相对于树脂1等量，使用Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure＝3.2等量/3等量/6.3等量，在75℃下，于20分钟使其进行2次反应。但是，第2个残基、第13个残基、第17个残基是在75℃下，于10分钟进行3次反应。第15个残基是在25℃下，于15分钟进行2次反应。第16个残基是在25℃下，于60分钟进行反应。去Fmoc化是通过与20％piperidine的DMF溶液在25℃下进行5分钟反应后，进行15分钟反应而进行。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将5等量的氯乙酸、5等量的DIPCI、5等量的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的NMP，制备ClAcOSu的DCM/NMP溶液(0.2M)，添加至固相树脂，在室温振荡90分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次，并以氯甲烷清洗3次，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡60分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的二异丙醚/己烷(1/1)，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(9000rpm，3min)，并倾析溶液。将所得的固体再度以已冷却至0℃的少量乙醚及己烷清洗后，将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于9％含水DMSO后，添加10等量的三乙胺，在室温振荡约1.5小时。将所得的反应溶液使用Savant Explorer SpeedVaC进行减压浓缩。
所得的粗中间体肽是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm OBD(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA inMeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟9-34％，之后耗费8分钟34-39％，之后耗费1分钟39-60％；流量:120mL/min)。
冷冻干燥后，对于所得的中间体肽的DMF溶液(15mM)，添加2等量的CuSO4·5H2O水溶液(100mM)及10等量的抗坏血酸水溶液(500mM)后，添加2等量的N-炔丙基顺丁烯二酰亚胺的DMF溶液(100mM)，在室温进行搅拌。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:COSMOSIL PBr 10x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟17-42％，之后耗费8分钟42-47％，之后耗费1分钟47-60％；流量:5mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为82.7％。
分析条件B:保持时间＝11.37分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001191
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95％；流量:0.25mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1303.33(M+3H)3+。
[合成例1-16]
894＿variant＿03＿GKN3(序列号554记载的连接子与序列号397的复合体)的合 成
[化42]
Figure BDA0003807566610001201
使用Sieber amide resin(渡边化学，0.47mmol/g，0.21g)，利用所述的一般方法，从Fmoc基的去除开始，合成目的的肽。此时，使用CEM公司的Liberty Blue HT作为固相合成仪，遵循制造商的手册进行合成。在各残基的导入中，对于树脂1eq，使用Fmoc-AA/HATU/DIEA(4.2eq/4eq/8eq)，在DMF中，在75℃下，于10分钟进行1次反应。但是，第2个残基、第4个残基是在75℃下，于30分钟进行1次反应。第11个残基、第12个残基是在25度下，于20分钟进行2次重复反应。第13个残基是在75℃下，于10分钟进行2次反应。第15个残基、第22个残基是在25℃下，于30分钟进行1次反应。并且，Fmoc去除的基本条件是与20％piperidine的DMF溶液在75℃下使其反应3分钟。但是，第2个残基、第4个残基及第13个残基的Fmoc去除是在25℃下，于5分钟进行反应后，在室温使其反应10分钟。氯乙酰基的导入是通过对于已保持由前步骤所得的被Fmoc保护的肽的固相树脂，利用所述的方法去除α-氨基的Fmoc基后，将5eq的氯乙酸、5eq的DIPCI、10eq的HOSu在DCM中进行搅拌，添加与DCM同量的DMF，制备ClAcOSu的DCM/DMF溶液(0.2M)，添加至固相树脂，在室温振荡30分钟而进行。侧链的去保护及从固相树脂的剪切，首先，将在氯乙酰基导入步骤后所得的树脂以DMF清洗5次并以氯甲烷清洗3次后，在减压下进行干燥。接着，在已装入固相树脂的反应容器中，添加反应剂混合液-A(TFA/H2O/TIS/DODT的体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合物)，在室温振荡20分钟。由玻璃料过滤回收反应液。残留于反应容器的固相树脂是与剪切用混合液再度进行振荡，由玻璃料回收溶液成分，并与所述的滤液混合。若将此滤液添加至已冷却至0℃的过剩的乙醚/己烷(1/1)的混合溶媒，则产生白浊沉淀。将此混合物进行离心分离(10000rpm，1min)，将溶液进行倾析，使其在减压下进行干燥。将所得的固体使用于后续的环化反应。肽的环化反应是以将固相树脂的摩尔数作为基准而肽的终浓度成为5mM的方式溶解于5％含水DMSO后，添加6等量的三乙胺，在室温振荡约16小时。将所得的反应溶液使用Savant ExplorerSpeedVaC进行减压浓缩。
所得的粗生成物是使用以下的条件进行精制(管柱:WaterS Xbridge(注册商标)C18 5μm(注册商标)50x150mm；流动相:A＝0.1％TFA in H2O、B＝0.1％TFA in MeCN；温度40℃；梯度(％B):耗费3分钟11-36％，之后耗费8分钟36-41％，之后耗费1分钟41-60％；流量:120mL/min)。
目的物的纯度是由分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱图的面积比进行计算，且为95.5％。
分析条件B:保持时间＝4.84分钟；管柱:Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1x150mm、
Figure BDA0003807566610001212
流动相:A＝0.025％TFA in H2O、B＝0.025％TFA in MeCN；温度60℃；梯度(％Bconc):耗费7.2分钟20-60％，之后耗费0.3分钟60-95％，之后耗费1.6分钟95％；流量:0.5mL/min。
ESI-MS(+)观测值m/z＝1178.06(M+2H)2+。
如同以下，合成新的氨基酸。
[合成例2-1]
(S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-3-(7-氯-1-乙基-1H-吲哚-3-基)丙酸 (W1Et7Cl)的合成
[化43]
Figure BDA0003807566610001211
对于7-氯-3-碘-1H-吲哚(18g，64.9mmol)的DMF溶液(500mL)，在0℃下，分批添加NaH(60wt％，8.7g，361mmol)。接下来，在0℃下，分批添加碘乙烷(10.3mL，130.4mmol)后，将此在室温搅拌约16小时。以水将反应溶液稀释后，以乙酸乙酯(3x200mL)进行萃取。将合并的有机层以水(100mL)清洗三次，以无水硫酸钠进行干燥，并进行过滤。将有机层进行浓缩后，将残渣以硅胶柱层析法(乙酸乙酯:石油醚＝1:5)进行精制。
氮气环境下，在锌(8g，122mmol)的DMF悬浮液(50mL)中添加碘(1.6g，12.6mmol)，接着添加甲基(2R)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-3-碘丙酸酯(18.5g，41mmol)，在室温搅拌30分钟。在此反应液中，添加由所述所得的生成物的一部分(15g，49mmol)的DMF(300mL)溶液，接下来，添加SpHos(0.84g，2.0mmol)与Pd2(dba)3(1.1g，1.2mmol)，将混合物在50℃搅拌4小时。以水将反应停止，滤去固体，将滤液以乙酸乙酯(400mL)萃取四次。将合并的有机层以水(200mL)清洗四次。将有机层以无水硫酸钠进行干燥，过滤后进行浓缩。将所得的残渣以硅胶柱层析法(乙酸乙酯:石油醚＝2:8)进行精制。
在所得的生成物的一部分(18g，35.8mmol)与1,4-二恶烷(200mL)的混合物中，吹入氯化氢(60g，1.7mol)，在100℃搅拌4小时。将反应液进行浓缩后，将残渣以逆相硅胶柱层析法(水:乙腈＝100:0-0:100)进行精制，获得标题物质。
ESI-MS(+)观测值m/z＝489.10(M+H)+。
[合成例2-2]
(S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-3-(2-((叔丁基氧基羰基)氨基)吡啶- 4-基)丙酸(4Py6NH2)的合成
[化44]
Figure BDA0003807566610001221
在氮氣環境下，在鋅(5.8g，88.6mmol)的DMF(200mL)懸浮液中添加碘(4.5g，17.7mmol)後，在室溫滴下甲基(2R)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-3-碘丙酸酯(20g，44.32mmoL，1.0等量)的DMF溶液(50mL)。将混合物在室温搅拌1小时。接着，添加4-溴吡啶-2-氨(7.7g，44.3mmoL，1等量)、Pd2(dba)3(2.0g，2.2mmoL，0.05等量)、SpHos(1.8g，4.4mmoL，0.1等量)后，将此在50℃搅拌约16小时。添加水500mL使反应停止后，滤去固体。将滤液以乙酸乙酯(300mL)萃取三次。将合并的有机萃取物以饱和食盐水(300mL)清洗三次，以无水硫酸钠进行干燥，并进行过滤，将滤液进行浓缩。将所得的残渣以硅胶柱层析法(乙酸乙酯:石油醚＝25:75)进行精制。
将由上述所得的生成物的一部分(10g，24.0mmol)，在叔丁醇(110mL)中，添加Boc2O(6.3g，28.7mmol)、NaI(4.3g，28.7mmol)，在室温搅拌约16小时。将反应液进行浓缩后，将所得的残渣溶解于乙酸乙酯80mL后，以饱和食盐水(100mL)清洗三次。将有机层以无水硫酸钠进行干燥，且进行过滤，并进行浓缩。
在所得的生成物的一部分(3g，5.8mmol)的2-丙醇(30mL)溶液中，添加CaCl2(6.4g，58.0mmol)后，在0℃添加LiOH-H2O(0.28g，11.6mmol)的水溶液(5mL)。将混合液在室温搅拌约16小时后，以水60mL进行稀释，滤去固体。使用柠檬酸水溶液将滤液的pH调整成约为6，以乙酸乙酯(40mL)萃取三次。将合并的有机萃取物以饱和食盐水(50mL)清洗三次，以无水硫酸钠进行干燥后，进行过滤，并进行浓缩。将残渣以硅胶柱层析法(二氯甲烷:甲醇＝92:8)进行精制，获得标题物质。ESI-MS(+)观测值m/z＝504.15(M+H)+。
[合成例2-3]
(S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-3-(6-((叔丁基氧基羰基)氨基)吡啶- 3-基)丙酸(3Py6NH2)的合成
[化45]
Figure BDA0003807566610001222
标题物质是遵循合成例[1-x]，使用5-溴吡啶-2-氨以置换4-溴吡啶-2-氨，并以同样的方法获得。ESI-MS(+)观测值m/z＝504.15(M+H)+。
[合成例2-4]
N2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N6-(4-甲基哌嗪-1-羰基)-L-赖氨酸 (KCOpipzMe)的合成
[化46]
Figure BDA0003807566610001231
在已溶解于二氯甲烷(20mL)的1-甲基哌嗪(1.4mL，12.7mmol)中，在0℃添加DIPEA(2.3mL，13.0mmol)及三光气(1.23g，4.2mmol)。在同温下搅拌1小时后，进行浓缩。在所得的残渣中，在0℃下，添加[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸与DIPEA(2.8mL，16.3mmol)的二氯甲烷溶液(20mL)。将混合液在0℃下搅拌约16小时。以饱和碳酸氢钠水溶液停止反应后，以二氯甲烷进行稀释，以水清洗一次，以5％乙酸水溶液清洗二次，以饱和碳酸氢钠水溶液清洗一次，最后以饱和食盐水清洗一次。将有机层以无水硫酸钠进行干燥，并进行浓缩。将残渣以硅胶柱层析法(二氯甲烷:甲醇＝100:0-80:20)进行精制，获得标题化合物。ESI-MS(+)观测值m/z＝495.40(M+H)+。
[合成例2-5]
Nα-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-1-(2-氨基―2-氧代乙基)-L-色氨酸(W1mCON)的 合成
[化47]
Figure BDA0003807566610001232
在氮气环境下，在N-Boc-色氨酸(5g，16.4mmol)的DMF(30mL)与THF(30mL)的混合溶液中，在0℃下，分成数次添加叔丁醇钾(3.7g，32.9mmol)。在同温下搅拌0.5小时后，在0℃下，分成数次添加2-氯乙酰胺(1.5g，16.4mmol)后，将其混合物在室温下搅拌3小时。添加水(100mL)而使反应停止后，以乙酸乙酯(50mL)萃取三次。将合并的有机层以饱和食盐水(50mL)清洗三次后，以无水硫酸镁进行干燥，且进行过滤，并将滤液进行浓缩。将所得的残渣以硅胶柱层析法(乙酸乙酯:石油醚＝90:10)进行精制。
在所得的生成物的一部分(6g，16.6mmol)的乙酸乙酯溶液(30mL)中，添加氯化氢的乙酸乙酯溶液(2M，30mL)，在室温搅拌约16小时。滤取所生成的固体，将此以乙酸乙酯、乙醚进行清洗。将所得的固体溶解于1,4-二恶烷(50mL)与水(10mL)后，在0℃下添加2,5-二氧基吡咯啶-1-基―9H-芴-9-基―碳酸甲酯(5.9g，17.5mmol)及碳酸氢钠(5.9g，69.9mmol)。将混合物在室温搅拌3小时后，以水200mL进行稀释。添加柠檬酸将pH调整成5-6后，以乙酸乙酯(60mL)萃取三次。将合并的有机萃取物以饱和食盐水(100mL)清洗三次。将有机层以无水硫酸钠进行干燥，且进行过滤，并进行浓缩。将残渣以硅胶柱层析法(二氯甲烷/甲醇＝92/8)进行精制，获得标题化合物。ESI-MS(+)观测值m/z＝484.25(M+H)+。
[合成例2-6]
Fmoc-Glu(d-Pro-O-allyl)-OH(Epryl2RCOO)的合成
[化48]
Figure BDA0003807566610001241
在4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(2.5g，5.8mmol)的DMF溶液(10mL)中，添加HATU(2.7g，7.0mmol)、DIPEA(1.3mL，7.5mmol)、烯丙基-D-脯氨酸(0.9g，5.80mmol)，在0℃搅拌1小时。以水稀释反应溶液后，以乙酸乙酯、己烷的混合溶媒进行萃取。将有机层以水清洗4次后，以无水硫酸钠进行干燥，过滤后，进行减压浓缩。将残渣以硅胶柱层析法进行精制。
将由所述反应所得的生成物的一部分(2.6g，4.5mmol)与二氯甲烷/TFA(1:1、30mL)在室温下搅拌3小时。将反应溶液进行浓缩后，将残渣溶解于二氯甲烷，添加饱和碳酸氢钠水溶液，将pH调整成8以上。接着，添加盐酸，将pH调整成3-4，以乙酸乙酯进行萃取。将有机层以无水硫酸钠进行干燥，且进行过滤，并进行减压浓缩，获得标题化合物。ESI-MS(+)观测值m/z＝507.40(M+H)+。
[合成例2-7]
Fmoc-Asp(d-Pro-O-allyl)-OH(Dpryl2RCOO)的合成
[化49]
Figure BDA0003807566610001242
标题物质是遵循合成例[1-x]，使用3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(叔丁氧基)-4-氧代丁酸以置换4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸，并以同样的方法获得。ESI-MS(+)观测值m/z＝493.30(M+H)+。
[合成例2-8]
Fmoc-Lys(Gly-O-allyl)-OH(KaAC)的合成
[化50]
Figure BDA0003807566610001251
在叔丁基(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-赖氨酸甲基-盐酸盐(1.2g，2.6mmol)、((烯丙氧基)羰基)甘氨酸(0.46g，2.9mmol)、DIPEA(0.59mL，3.4mmol)的DMF溶液中，添加HATU(1.22g，3.1mmol)的DMF溶液(20mL)，在0℃下搅拌1小时。以乙酸乙酯、己烷的混合溶媒进行稀释，将有机层以水清洗4次。将有机层以无水硫酸钠进行干燥，并在进行浓缩后，将残渣以硅胶柱层析法(乙酸乙酯:己烷＝0:100-80:20)进行精制。
在由所述所合成的生成物的一部分(1.5g，2.6mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)中添加TFA(10mL)，在室温下搅拌约16小时。将反应溶液进行浓缩，使用甲苯进行3次共沸操作。将所得的残渣以二异丙醚进行清洗，在55℃下进行减压干燥，获得标题化合物。ESI-MS(+)观测值m/z＝510.40(M+H)+。
[合成例2-9]
Nα-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-1-(2-((叔丁基二甲基硅基)氧基)乙基)-L-色 氨酸(Fmoc-W1EtOH-OH)的合成
[化51]
Figure BDA0003807566610001252
在N-Boc-色氨酸(20g，64.9mmol)的THF(100mL)与DMF(100mL)混合液中，在0℃下添加叔丁醇钾(14.8g，69.0mmol)。在搅拌15分钟后，添加2-溴乙氧基(叔丁基)二甲基硅烷(16.5g，69.0mmol)，在室温搅拌约16小时。在0℃下，在反应溶液中添加柠檬酸水溶液，将pH调整成6，以200mL的水进行稀释。将反应溶液以乙酸乙酯(100mL)萃取三次，将合并的有机萃取物以饱和食盐水(100mL)清洗三次。将有机层以硫酸钠进行干燥，过滤后，进行浓缩。将残渣以硅胶柱层析法(乙酸乙酯:己烷＝1:5)进行精制。
在氮气环境下，在所得的生成物的一部分(16g，34.6mmol)的二氯甲烷(150mL)溶液中，添加2,6-二甲基吡啶(20mL，172.9mmol)，在0℃下添加TMSOTf(25mL，112mmol)。将混合液升温至室温，搅拌24小时。将反应溶液进行浓缩。在所得的混合物中添加二恶烷(300mL)、水(150mL)后，添加碳酸氢钠(9.3g，110.35mmoL，3.19等量)、9-芴基甲基―N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(14.0g，41.4mmol)，在室温搅拌约16小时。将固体进行过滤，在滤液中添加柠檬酸，将pH调整成7。以水200mL进行稀释，以乙酸乙酯(200mL)萃取三次萃取。将合并的有机萃取物以饱和食盐水(200mL)清洗三次。将有机层以硫酸钠进行干燥，过滤后，进行浓缩。将残渣以硅胶柱层析法(乙酸乙酯:己烷(1:15)进行精制，获得标题化合物。ESI-MS(+)观测值m/z＝585.15(M+H)+。
产业上的可利用性
此发明能被利用于医药产业。

Claims (40)

1.一种肽，其与转铁蛋白受体结合，其特征在于，具有:
序列号1所记载的氨基酸序列(Ala-Val-Phe-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Ile-Ser-Cys)；或
在序列号1所记载的氨基酸序列中具有1以上且10以下的氨基酸残基的置换、缺失、加成和/或插入的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，包含具有选自以下群组的1个以上的置换的氨基酸序列:
(I)序列号1的第1个丙氨酸残基被脂肪族氨基酸或甲基化脂肪族氨基酸置换；
(II)序列号1的第2个缬氨酸残基被碱性氨基酸残基或甲基化碱性氨基酸残基置换；
(III)序列号1的第3个苯丙氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
(IV)序列号1的第4个缬氨酸残基被甲基化缬氨酸残基置换；
(V)序列号1的第5个色氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基色氨酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
(VI)序列号1的第6个天冬酰胺残基被中性氨基酸或甲基化中性氨基酸置换；
(VII)序列号1的第7个及第8个酪氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
(VIII)序列号1的第9个异亮氨酸残基被脂肪族氨基酸残基、甲基化脂肪族氨基酸残基或具有支链结构的氨基酸残基置换；
(IX)序列号1的第10个异亮氨酸残基被任意氨基酸置换；及
(X)序列号1的第11个丝氨酸残基被中性氨基酸残基置换。
3.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，具有序列号2(Ala-Val-Phe-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Ile-Arg-Arg-Tyr-MeTyr-Cys)所记载的氨基酸序列，或包含在序列号2所记载的氨基酸序列中具有选自以下群组的1个以上的置换的氨基酸序列:
(I)序列号2的第1个丙氨酸残基被脂肪族氨基酸或甲基化脂肪族氨基酸置换；
(II)序列号2的第2个缬氨酸残基被碱性氨基酸残基或甲基化碱性氨基酸残基置换；
(III)序列号2的第3个苯丙氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
(IV)序列号2的第4个缬氨酸残基被甲基化缬氨酸残基置换；
(V)序列号2的第5个色氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
(VI)序列号2的第6个天冬酰胺残基被中性氨基酸或甲基化中性氨基酸置换；
(VII)序列号2的第7个及第8个酪氨酸残基被芳香族氨基酸残基、甲基化芳香族氨基酸残基、已加成芳香环的氨基酸残基或已加成稠环的氨基酸残基置换；
(VIII)序列号2的第9个异亮氨酸残基被脂肪族氨基酸残基、甲基化脂肪族氨基酸残基或具有支链结构的氨基酸残基置换；
(IX)序列号2的第10个异亮氨酸残基被任意氨基酸置换；
(XI)序列号2的第11个及第12个精氨酸残基被碱性氨基酸残基置换；
(XII)序列号2的第13个酪氨酸残基被亲水性氨基酸残基置换；
(XIII)序列号2的第14个甲基酪氨酸残基被酪氨酸残基、芳香族氨基酸残基或甲基化芳香族氨基酸残基置换；及
(XIV)序列号2的第15个半胱氨酸残基被甲基化半胱氨酸残基置换。
4.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，
若将肽A设为包含序列号18(Ala-Val-Phe-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Ile-Ser-Cys)的第1个-第10个所记载的氨基酸序列并且肽长度为10以上且17以下，则所述肽为以下任一种肽:
肽A；
在肽A中，具有含1以上且6以下的氨基酸残基的置换、缺失和/或插入的氨基酸序列的肽；
在肽A中，具有序列号18的第2、3、5、8及10个中的任一个氨基酸残基被置换的氨基酸序列的肽；及
在肽A中，
序列号18的第2个氨基酸残基为可被修饰的缬氨酸(Val)或可被修饰的谷氨酸(Glu)，
序列号18的第3个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)，
序列号18的第5个氨基酸残基为可被修饰的色氨酸(Trp)，
序列号18的第8个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)，
序列号18的第10个氨基酸残基为可被修饰的异亮氨酸(Ile)或可被修饰的缬氨酸(Val)的肽。
5.根据权利要求4所述的肽，其特征在于，是肽长度为11以上且13以下的肽。
6.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，
若将肽B设为包含序列号15(Ala-Val-Phe-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Val-Pro-Arg-Asp-Cys)的第1个-第10个所记载的氨基酸序列并且肽长度为10以上且19以下，则所述肽为以下任一种肽:
肽B；
在肽B中，具有含1以上且5以下的氨基酸残基的置换、缺失和/或插入的氨基酸序列的肽；
在肽B中，具有序列号15的第2、3、5、8及10个中的任一个氨基酸残基被置换的氨基酸序列的肽；及
在肽B中，
序列号15的第2个氨基酸残基为可被修饰的缬氨酸(Val)或可被修饰的谷氨酸(Glu)，
序列号15的第3个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)或色氨酸(Trp)，
序列号15的第5个氨基酸残基为可被修饰的色氨酸(Trp)，
序列号15的第8个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)，
序列号15的第10个氨基酸残基为可被修饰的异亮氨酸(Ile)或可被修饰的缬氨酸(Val)的肽。
7.根据权利要求6所述的肽，其特征在于，是肽长度为13以上且15以下的肽。
8.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，
若将肽C设为包含序列号214(MeA-Val-MeF3C-Val-MeW-Asn-Tyr-F4OMe-Ile-Ile-Arg-Arg-Phe-MeY-Cys)的第1个-第10个所记载的氨基酸序列并且肽长度为11以上且19以下，则所述肽为以下任一种肽:
肽C；
在肽C中，具有含1以上且5以下的氨基酸残基的置换、缺失和/或插入的氨基酸序列的肽；
在肽C中，具有序列号214的第1、3、5及8个中的任一个氨基酸残基被置换的氨基酸序列的肽；及
在肽C中，
序列号214的第1个氨基酸残基为可被修饰的丙氨酸(Ala)或可被修饰的谷氨酸(Glu)，
序列号214的第3个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)，
序列号214的第5个氨基酸残基为可被修饰的色氨酸(Trp)，
序列号214的第8个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)的肽。
9.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，
若将肽D设为包含序列号219(Ala-Glu-Phe-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Ile-Arg-Arg-Tyr-MeY-Cys)的第1个-第10个所记载的氨基酸序列并且肽长度为11以上且19以下，则所述肽为以下任一种肽:
肽D；
在肽D中，具有含1以上且5以下的氨基酸残基的置换、缺失和/或插入的氨基酸序列的肽；
在肽D中，具有序列号219的第2、3、5、8及10个中的任一个氨基酸残基被置换的氨基酸序列的肽；及
在肽D中，
序列号219的第2个氨基酸残基为可被修饰的缬氨酸(Val)、可被修饰的谷氨酸(Glu)、可被修饰的精氨酸(Arg)、可被修饰的赖氨酸(Lys)、可被修饰的天冬氨酸(Asp)或可被修饰的苯丙氨酸(Phe)，
序列号219的第3个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)，
序列号219的第5个氨基酸残基为可被修饰的色氨酸(Trp)，
序列号219的第8个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)，
序列号219的第10个氨基酸残基为可被修饰的异亮氨酸(Ile)、可被修饰的谷氨酸(Glu)或可被修饰的赖氨酸(Lys)的肽。
10.根据权利要求9或10所述的肽，其特征在于，是肽长度为15以上且18以下的肽。
11.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，
若将肽E设为包含序列号296(Ala-Val-MeF-Val-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Ile-Ile-Arg-Arg-Tyr-MeY-Cys--)的第1个-第15个所记载的氨基酸序列并且肽长度为15以上且18以下，则所述肽为:
肽E；或
在肽E中，具有含1以上且5以下的氨基酸残基的置换、缺失和/或插入的氨基酸序列的肽。
12.根据权利要求11所述的肽，其特征在于，是以下的肽:在肽E中，具有序列号296的第3、5、7、8、11、12、13个中的任一个氨基酸残基被置换的氨基酸序列。
13.根据权利要求11所述的肽，其特征在于，是以下的肽:
在肽E中，
序列号296的第3个氨基酸残基为可被修饰的苯丙氨酸(Phe)，
序列号296的第5个氨基酸残基为可被修饰的色氨酸(Trp)，
序列号296的第7个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)，
序列号296的第8个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)，
序列号296的第11个氨基酸残基为可被修饰的精氨酸(Arg)或可被修饰的赖氨酸(Lys)，
序列号296的第12个氨基酸残基为可被修饰的精氨酸(Arg)或可被修饰的赖氨酸(Lys)，
序列号296的第13个氨基酸残基为可被修饰的酪氨酸(Tyr)或可被修饰的苯丙氨酸(Phe)的任一者。
14.根据权利要求11所述的肽，其特征在于，是以下的肽:
在肽E中，
序列号296的第3个氨基酸残基为苯丙氨酸(Phe)、甲基化苯丙氨酸(MeF)或N-α-甲基-N-α-氯乙酰基-3-氯-L-苯丙氨酸(MeF3C)，
序列号296的第5个氨基酸残基为色氨酸(Trp)或甲基化色氨酸(MeW)，
序列号296的第8个氨基酸残基为酪氨酸(Tyr)或(S)-2-氨基-3-(4-甲氧基苯基)丙酸(F4OMe)，
序列号296的第11个氨基酸残基为精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)，
序列号296的第12个氨基酸残基为精氨酸(Arg)或D型精氨酸(dr)，
序列号296的第13个氨基酸残基为酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe)。
15.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，是由序列号3-200中的任一氨基酸序列所组成，或由在序列号3-200中的任一氨基酸序列中N端为氯乙酰基-Ala的氨基酸序列所组成。
16.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，包含序列号1-552中任一者所记载的氨基酸序列或氨基酸序列与连接子的复合体的第1个至第10个氨基酸序列，且氨基酸序列部位具有环状结构。
17.根据权利要求16所述的肽，其特征在于，是由序列号2、9、21-148、159-200、213-448、450-552中任一者所记载的氨基酸序列或氨基酸序列与连接子的复合体中的第1个至第15个氨基酸序列所组成，且氨基酸序列部位具有环状结构。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的肽，其特征在于，是环状肽。
19.根据权利要求16或17所述的肽，其特征在于，是由15氨基酸残基所组成。
20.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，能穿过血脑屏障。
21.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，对于肌肉组织具有指向性。
22.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，具有细胞穿透性。
23.一种复合体，其特征在于，包含:如权利要求1所述的肽、与所述肽结合的连接子，以及结合至所述连接子的物质。
24.根据权利要求23所述的复合体，其特征在于，所述物质能穿过血脑屏障。
25.根据权利要求23所述的复合体，其特征在于，所述连接子的氨基酸长度为1以上且15以下，而且所述连接子包含1个以上的甘氨酸(Gly)或丝氨酸(Ser)。
26.根据权利要求23所述的复合体，其特征在于，所述连接子的N端为可被修饰的半胱氨酸(Cys)或可被修饰的赖氨酸(Lys)。
27.根据权利要求23所述的复合体，其特征在于，所述连接子的氨基酸长度为1以上且5以下，而且包含D型的谷氨酸(de)及甲基化甘氨酸(MeG)中任一者或两者。
28.根据权利要求23所述的复合体，其特征在于，所述连接子的N端为可被修饰的Cys或可被修饰的赖氨酸(Lys)。
29.根据权利要求23所述的复合体，其特征在于，所述连接子为包含聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇的衍生物的PEG连接子。
30.根据权利要求29所述的复合体，其特征在于，所述PEG连接子进一步包含甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)。
31.根据权利要求29或30所述的复合体，其特征在于，所述连接子的N端为可被修饰的半胱氨酸(Cys)或可被修饰的赖氨酸(Lys)。
32.根据权利要求23所述的复合体，其特征在于，所述连接子具有由序列号201、553-642中任一者所示的序列。
33.根据权利要求22所述的复合体，其特征在于，所述连接子为:
聚乙二醇(PEG)；
G连接子、GS连接子；或
具有由序列号201、553-644中任一者所示的氨基酸序列的连接子。
34.一种预防或治疗剂，其特征在于，是包含如权利要求23所述的复合体的脑相关疾病的预防或治疗剂，其中，所述物质为有效成分。
35.一种脑相关疾病的预防或治疗剂的制造方法，其特征在于，包含获得如权利要求23所述的复合体的步骤。
36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述连接子为:
聚乙二醇(PEG)；
G连接子、GS连接子；或
具有由序列号201、553-644中任一者所示的氨基酸序列的连接子。
37.一种脑相关疾病的诊断药，其特征在于，包含如权利要求23所述的复合体。
38.根据权利要求23所述的复合体，其特征在于，对于肌肉组织具有指向性。
39.一种预防或治疗剂，其特征在于，是包含如权利要求23所述的复合体的神经肌肉疾病的预防或治疗剂，其中，所述物质为有效成分。
40.一种神经肌肉疾病的诊断药，其特征在于，包含如权利要求23所述的复合体。
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