JPH03504495A

JPH03504495A - 反応溶媒として超臨界二酸化炭素を用いての有機合成

Info

Publication number: JPH03504495A
Application number: JP1503883A
Authority: JP
Inventors: バーストウ，レオン，イー．; ワード，グレン，ディー．; ビアー，ミラン
Original assignee: プロテイン　テクノロジイズ，インコーポレイティド
Priority date: 1988-03-11
Filing date: 1989-03-13
Publication date: 1991-10-03
Also published as: EP0408634A4; EP0408634A1; WO1989008659A1; US5001224A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】反応溶媒として超臨界二酸化炭素を用いての有機合成本発明は、多くの場合、これまで可能な形よりも純粋な形で反応生成物を生成できる化学反応を低費用で行なうための新規方法に関する。それは、特に、エステル及びアミドを形成するために炭素及び窒素での反応により合成ポリペプチド及びアミノ酸誘導体を形成するための方法への適用性を有する。

発明の背景実際の速度で生じる多くの化学反応に関しては、反応体のうち少なくとも１種が不活性溶媒に溶解されるべきであることは良く知られている。多くの有機反応に関しては、これらの溶媒は液体炭化水素又はハロゲン化炭化水素、たとえばクロロホルム、塩化メチレン及びクロロメタンである。

多くの場合、そのような溶媒の使用は、生成物の満足する生成を付与するが、しかし溶媒の価格、操作、回収及び廃棄の点で問題及び出費を提供する。生化学にとって重要なある反応、たとえばそのような溶媒がある問題を提供するポリペプチド合成が存在する。ポリペプチドは、時々、固体支持体、たとえばポリスチレン又は多孔性ガラス支持体に結合される成長ペプチド鎖への保護されたアミノ酸の連続的付加により調製される。現在実施されているように、これらの反応は、１００％完結に達しない。

たとえば、固体支持体を用いる従来の技法は、時々、樹脂への溶媒の浸入不能により不完全な反応を伴う。結果として、最終生成物は、しばしば、精製するのに難かしいポリペプチドの複雑な混合物である。その合成は、また除去されるべき有機反応溶媒の存在によりさらに複雑にされる。さらに、そのような溶媒は、相当に費用がかかり、そしである生成物を製造するための費用を実質的に高める。

反応生成物から容易に除去され、試薬を容易に溶解することができ、そして高い侵入力を有し、そして従って多孔性固体反応支持体又は固体反応体を容易に透過することができる低価格の溶媒を有することが高く所望される。

発明の記載本発明は、超臨界二酸化炭素が、有機反応のためにひじように経済的且つひじょうに柔軟な反応溶媒である発見に基づかれている。

良く知られているように、すべての気体は、臨界温度及び圧力を有し、すなわち臨界温度は気体は圧力を高めることによって液化され得ない温度以上であり、そして臨界圧力は臨界温度で気体を液化するのに必要な圧力である。二酸化炭素に関しては、臨界温度は８８″Ｆ　（３１，１℃）であり、そして臨界圧力は１０７３ｐｓ　ｉである。本発明で使用される用語“超臨界二酸化炭素”とは、８８ ″Ｆ以上の温度及び１０７３ｐｓ　ｉ以上の圧力での二酸化炭素を意味する。

その超臨界状態における二酸化炭素は、それをひじように所望される反応溶媒にする多くの性質を有する。それは、広範囲の種類の有機反応条件下で不活性である。それは高い拡散性を有し、モして固相支持体を容易に透過することができる。それは安価で且つ非毒性であるので、それは廃棄のために大気中に開放され得る。無水条件が維持される場合、それは容易に使用される。それは反応生成物の回収における問題を最少にする。なぜならば、その溶媒は、圧力を臨界以下に減じることによって単純に除去され、それによって使用づみ試薬、副生成物及び他の反応溶媒を除去するために反復洗浄の必要性を回避するからである。

超臨界二酸化炭素は、化学反応生成物が、不活性反応溶媒の存在下で複数の反応化学成分を接触し、超臨界二酸化炭素を維持するのに必要とされる条件下で、反応生成物を形成するために前記成分の混合を引き起こすことによって得られるいづれかの化学反応において使用され得る。成分は同じでも又は異なっていても良い。成分はそれぞれ単一の反応部位を有することができ、又はそれらは１以上の部位を有することもできる。反応は低分子量化学物質、たとえばエステル、エーテル、アミド、等を形成するための従来の反応であることができ、又はそれは二量重合、三量重合、オリゴ重合又は重合であることもできる。

超臨界二酸化炭素は、他にない溶媒であるが、しかし他の溶媒も存在し、そして超臨界二酸化炭素に帰する利益を今まで通りに達成することができる。従って、反応体が溶液の形で得られる場合、その溶液は、初めに反応体と溶媒とを分離しないで使用され得る。

反応は、反応体及び反応生成物の安定性、並びに二酸化炭素との所望する反応及び所望としない副反応の所望する速度を伴って、二酸化炭素の臨界温度以上のいづれかの温度及びその臨界圧力以上のいづれかの圧力で行なわれ得る。多くの反応は、約９０″Ｆ〜約１５０″Ｆの温度及び約１０７３ｐｓｉ〜４０００ｐｓ　ｉ又はそれ以上の圧力で容易に生じることが見出された。

超臨界二酸化炭素の使用は、ペプチド合成、たとえばアシル化、たとえば種々のアシル化剤、たとえばアシルイミダゾール、たとえばアセチルイミダゾール、アシルクロリド、たとえばアセチルクロリド又はアシル無水物、たとえば無水酢酸による第−及び第二アミンのアセチル化、及び試薬、たとえばアシルイミダゾール、アシル無水物及びアシルクロリドによるアルコールのエステル化に使用される反応を実施することにおいて特に重要なものである。

たとえば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法として知られている合成ペプチドの合成のための通常の固相方法は、アミノ基のカルボキシル基を通して、固体支持体、通常ポリスチレン樹脂に結合されたアミノ酸により開始される。さらに、そのアミノ基は、ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基により所望しない反応に対して保護される。従来のポリペプチド合成は、ジクロロメタン中、緩酸、たとえばトリフルオロ酢酸（ＴＰＡ）による処理によりＢＯＣ保護基を除去しく保護解除）、すべての微量ＴＦＡを除去するためにジクロロメタンにより洗浄し、ジクロロメタン中、トリエチルアミン（ＴＥＡ）により中和し、過剰のＴＥＡ及びその塩を除去するためにジクロロメタンにより洗浄し、カルボキシル活性化剤、たとえばジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下で、ジクロロメタンに溶解されたＢＯＣ−保護アミノ基と保護解除された樹脂−アミノ酸とを反応せしめ、溶解可能な試薬及び副生成物を除去するためにジクロロメタンにより洗浄し、ジクロロメタンに不溶性であるジシクロヘキシル尿素副生成物を除去するためにメタノールにより洗浄し、そしてメタノールを除去するためにジクロロメタンにより洗浄することによって進行する。その順序は次のようにして示される：ＯＲＯＲ ■）樹脂−ＤＣ−Ｃ１ｌ−ＮＨ−ＢＯＣＴ　Ｆ　Ａ　　　樹脂−ＱＣ−Ｃａｌ− ＮＨ３”２）洗浄ＯＲ０Ｒ３）樹脂−ＤＣ−ＣＨ−Ｎ）１３”　　　　Ｔ　Ｅ　Ａ　　　樹脂−ＱＣ−ＣＨ −ＮＬ４）洗浄ＯＲＯＲ’ ５）樹脂−ＯＣ−ＣＨ−Ｎ　Ｈ□＋）ＩＯＣ−Ｃ）Ｉ−ＮＨ−ＢＯＣＯＲＯＲ’ 　　　　　　　　　　　　ＤＣＣ樹脂−０Ｃ−ＣＨ−ＮＨ−Ｃ−ＣＨ−ＮＨ−ＢＯＣ＋ＤＣ口６）ジクロロメタンによる洗浄７）メタノールによる洗浄８）ジクロロメタンによる洗浄はとんどの洗浄段階はそれぞれ２又は３回行なわれるので、この方法はひじょうに時間がかかり、そしてペプチド鎖中に導入される個々のアミノ酸のためには、完全なサイクルは２時間を要する。この方法は、いくつかの欠点、たとえば塩素化された溶媒の広範な使用、時々の不完全な結合、反復性保護解除段階の間でのアミノ基のトリフルオロアセチル化による減じられた収率、アミノ酸の側鎖との反応及び支持体からペプチド鎖の早熟な切断を有する。結果として、最終生成物は不均質であり、そして所望するペプチドホルモンの活性に対立する活性を有するペプチドさえも含むかも知れない。

他の固相合成は、アミノ基上の塩基不安定性フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）保護基を使用する。この基をピペリジン（Ｐｉｐ）、又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解され他の有機塩基により除去し、樹脂を過剰で且つ使用されたＦＭＯＣ試薬、ピペリジン及びその塩を除去するためにＤＭＦにより洗浄し、保護解除された樹脂と活性化されたＦＭＯＣ−保護アミノ酸、たとえばその酸のペンタフルオロフェニルエステルとを反応せしめ、そしてその樹脂を副生成物及び過剰のエステルを除去するためにＤＭＦにより洗浄する。この順序は次の通りに示される：ＯＲ０Ｒ１）樹脂−ＱＣ−Ｃ）ｌ−ＮＨ−ＰＭＯＣＰ　ｉ　ｐ　　　樹脂−ＤＣ−ＣＨ− ＮＨ２２）洗浄ＯＲＯＲ’ ３）樹脂−ＤＣ−ＣＨ−Ｎ１１．＋　Ｆ　　　　　　　　　　ＱＣ−［：Ｈ−ＮＨ−ＦＭＯＣＯＲＯＲ’ 樹脂−ＤＣ−Ｃ８−ＮＨ−Ｃ−ＣＨ−ＮＨ−ＦＭＯＣ４）洗浄このスケムは、ＢＯＣスケムよりも少ない段階を有するが、それはまた数回の洗浄段階を有し、そして収率及び不均質生成物の形成に関していくらかの問題を有する。

固相技法の進歩の前、ペプチドは、次のようにアミノ酸と反応性アミノ酸誘導体、たとえばＮ−カルボキシル無水物（ＮＣＡ）とを反応せしめ、続いて二酸化炭素を除去することによって溶液中で合成されて来た：この方法は、アミノ酸ＮＣＡが活性化しないで遊離アミノ基と直接反応し、そして生成物が保護基として作用するペプチドカルバメートであるので、ひじょうに単純であるが、それは低収率のために広く使用されず、そしてそれは通常、不純生成物を付与する。カルバメート基は１１以下のｐＨの溶液中において不安定であり、そして脱カルボキシル化は重合又は過剰反応を引き起こす脱離性遊離基を生ぜしめる。ｐＨが１１以上に高められる場合、他の競争反応が、加水分解又はヒダントイン酸の形成の結果として生じる。結果として、結合効率が通常９０〜９５％を越えず、そしてこの技法の実際の値は、小さなペプチドの大規模製造に制限される。

超臨界二酸化炭素は、反復アミノ酸単位を有するペプチドホモポリマー又はコポリマーを形成するために、Ｎ−カルボキシル無水物又はその誘導体を重合するための方法で反応溶媒として使用され得る。

ＲＯＲＯＲＯＮＨ２Ｃｌ−ＣＮＨ−Ｃ１ｌ−ＣＮＨＣＩＩ−Ｃ−ＤＨＲＯＲＯＲＯＮＨ，ＣＨ−ＣＮｉ１−Ｃ）ｌ−ＣＮＨＣＨ−Ｃ−０１（２番目の反応において、“Ｒ”側鎖は、Ｒ１又はＲ２及びコモノマーの相対的割合に依存して異なるであろう。ターポリマー及びそれ以上のポリマーが、３又はそれ以上の出発無水物モノマーの使用により得られる。

上記反応スケムにおいて、Ｒ及びＲ’は水素又はアミノ酸側鎖、たとえばアミノ酸、たとえばアラニン、）くリン、ロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンの炭化水素側鎖、及びアミノ酸、たとえばチロシン、トレオニン、セリン、トリプトファン、チロキシン、メチオニン、システィン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸の置換された炭化水素側鎖を表わす。さらに、側鎖が、複素環式環、たとえばプロリン及びヒドロキシプロリンを形成するためにアミノ基と組合されているアミノ酸が使用され得る。もちろん、この発明は、天然に存在するアミノ酸又はここに特定された特異的合成に制限されない。これに反して、それは、ペプチドオリゴマー又はポリマーを産生ずるためのいでれかの方法において都合良く使用され得る。

溶媒としての超臨界二酸化炭素の使用は、ペプチドの調製において計り知れない価値のものである。それは固相合成に使用され、そして支持体が調節された多孔性ガラス（ＣＰＧ）ベッドである場合、特に価値あるものである。超臨界二酸化炭素の高い拡散性は支持体の孔の透過を確保する。さらに、揮発性試薬は、圧縮された流体をベントし、乾燥粉末を生成することによって簡単に除去され、それによって有機溶媒の廃棄又は再循環の必要性を回避することができる。倹約された時間及び費用は、たとえば２０〜４０回のアミノ酸を有するポリペプチド、たとえばカルシトニンを合成する場合、ばく大である。無水条件が、１００％の結合収率を付与するためにいくつかの反応に必要とされ、そしてそのような反応は超臨界二酸化炭素により容易に行なわれ得る。二酸化炭素の使用はまた、それが溶媒として通常使用される塩素化された炭化水素よりも相当に安いのでその方法の費用を削減し、そしてそれは非毒性であるので、大気中に放出され得る。さらに、多量の液体溶媒の必要性を回避するこきによって、超臨界二酸化炭素の使用は、実験室での大きさの装置よりも単にわずかに大きい、ポリペプチドの製造のための低費用の商業用規模生産装置の構成を可能にすることができる。

反応溶媒としての超臨界二酸化炭素の使用はまた、試薬としてアミノカルボキシル無水物（ＮＣＡ）を用いる液相合成のためにも好都合であり、ここでそれは、カーボネート保護基を安定化し、そして次の化学反応の前、溶媒と反応生成物との分離を促進することができる。

超臨界二酸化炭素はまた、タンパク質からのアミノ酸の分析において反応溶媒としても有用である。従来のアミノ酸分析においては、タンパク質はその個々のアミノ酸成分に加水分解され、そしてアミノ酸が分離され、同定され、そして定量化される。アミノ酸の検出は、紫外線吸収、色又は螢光により測定され得る誘導体の生成に依存する。１９５１年にＭｏｏｒｅ及び５ｔｅｉｎにより紹介されたアミノ酸分析のための第１の自動化された方法は、アミノ酸を分離するためにイオン交換カラムを使用する。着色された誘導体は、アミノ酸のα−アミノ基とニンヒドリンとの反応により個々のアミノ酸から製造される。次に、これらの着色された化合物が比色計を用いて検出され、そして対照の濃度及び保持時間を比較する場合、定性及び定量分析の両者を付与する。Ｍｏｏｒｅ及び５ｔｅｉｎの技法は、アミノ酸分析のための後−力ラム誘導体化方法の第１の例である。

最近、いくつかの前−カラム方法が開発されており、ここでアミノ酸の誘導体が加水分解された粗混合物に調製される。

次に、その得られたアミノ酸混合物が逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより分離され、そしてアミノ酸が、保持時間により定性同定され、そして対照との色吸収度の比較により定量同定される。前−カラム方法における誘導体を調製するために使用されて来たいくつかの試薬、たとえばフェニルインチオシアネート、オルトフタルアルデヒド及びダンシルクロリドが存在する。

これらの反応のための溶媒としての超臨界二酸化炭素の使用は、生物学的対象の多くのタンパク質は通常、ひじょうに少量見出されるので、ひじょうに重要なものである。従って、ひじょうに感度の高い定量分析方法を有することが重要である。

超臨界二酸化炭素はまた、タンパク質の一次構造を決定するためのタンパク質配列決定技法において価値あるものであるａ　　　Ｅｄｍａｎ　　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　　［Ｂｄｍａｎ、　　Ｐ、、　　Ａｃｔａ、Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、ＩＶ。

２８３　（１９５０）を参照のこと］として知られている基本的な配列決定技法においては、フェニルインチオシアネートがＮ−末端α−アミノ酸の誘導体を製造するために使用される。この誘導体は、無水有機酸、たとえばトリフルオロ酢酸により処理される場合、Ｎ−末端アミノ酸を除去し、そしてアニリノチアゾロンアミノ酸誘導体を生成するために環化する。次に、このいく分不安定な誘導体は、強酸による処理に基づいてフェニルチオヒダントインに乾燥される。この反応の順序は次の通りである：ＮＣＳ　＋　Ｈ，Ｎ−ＣＨＲ−ＣＤ−Ｎｌ（−ＸＮＨ−ＣＮＩ−ＣＨＲ−ＣＯ□ Ｈフェニルチオヒダントインアミノ酸（ＰＴＣアミノ酸）は、クロマトグラフィーにより同定され、そしてその螢光吸収度と対照とを比較することによって定量化される。Ｂｄｍａｎ技法は、手動で行なわれ得るが、しかしそれは高い熟練を必要とする退屈な仕事である。

多くのグループが、自動化されたＥｄｍａｎ技法、たとえばアメリカ特許第３．７２５．０１０号に開示されている液相スピニングカップ配列決定機、Ｌａｕｒｓｅｎ、　Ｒ，Ａ、、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０（１９７１）により開発された固相／液体配列決定機及びアメリカ特許第４、０６５．４１２号に開示されるガス相配列決定機を開発して来た。

ガス相配列決定機は、それがひじょうに少量のタンパク質の配列決定を可能にするので、有意に商業的に成功している。

Ｂｄｍａｎ方法の上記変法のいづれかに包含される有機溶媒のための置換物としての超臨界二酸化炭素の使用は、化学的収率を改良するのみならず、また液体溶媒による洗浄による機械的な損失を有意に減じる。改良された化学の他に、得られた誘導体の分析は、より有効である。なぜならば、二酸化炭素溶媒は、ＨＰＬ（’注入バルブを通して、アミノ酸誘導体を含む超臨界二酸化炭素を送ることによって除去され得、そしてその二酸化炭素は、圧力を臨界以下に減じることによって簡単に除去されるからである。次に、誘導体の分析を、標準のＨＰＬｃ逆相システムにより行なう。より高い感度の分析が、圧力を半一界に減じることによって質量分析器の入口部分に誘導体全付着せしめることによって得られる。改良された化学、減じられた機械的収率及び分析システムへの改良された送出しの組合せは、ひじょうに有意な感度を高め、そしてピコモル以下の量でのタンパク質の二次構造の決定を可能にする。

上記フェニルインチオシアネート反応は、中ぐらいのｐＨ（たとえば７〜９）で、タンパク質のアミノ基により生じるが、しかし高いｐＨで、その反応はまた、リシン、オルナリン及びオルガニンのようなアミノ酸の塩基性側鎖上でも生じる。

反応溶媒としての超臨界二酸化炭素の使用はまた、個々のアミノ酸、たとえばタンパク質又はポリペプチドの加水分解により得られたアミノ酸の混合物の分析においても有益である。そのような分析においては、誘導体化剤がアミノ酸又はアミノ酸の混合物に添加され、そして誘導体を形成するために反応する。適切な誘導体化剤は、フェニルインチオシアネート、ダンシルクロリド、オルトフタルアルデヒド、ニンヒドリン、ジニトロベンゼン及びフルオレサミンを包含する。

これらのタンパク質誘導体は、化学反応の収率を改良し、副反応の量を減じ、そして分析システムへの送出しを改良することにより分析の感度を高めるために超臨界二酸化炭素中において製造され得る。

アミノ酸は、それらが標準の分析分光計により少量、検出され得る前、それらを色素原又は螢光原にするために誘導体化されるべきである。上記タンパク質分析について記載される同じ誘導体は、アミノ酸分析のためにも有用であり、そして超臨界二酸化炭素中において製造され得る。このアプローチは、現在の溶液法よりも一層改良された感度を付与することができる。

次の例は例示的である。すべての反応は、圧縮ＣＯ２のための底部入口及び容器をベントするための上部出口を備えられた、５０００ｐｓ　ｉに定められた５５ｍ１の圧力容器を反応容器として使用して、Ｍｉｌｔｏｎ　Ｒａｇ、　　Ｉｖｙｌａｎｄ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａにより製造された超臨界流体システム中において行なわれた。一般的な規則として、液体反応体はフィルター支持体上に吸着され、そして固体反応体は、折られたフィルター紙の包みに置かれた。超臨界ＣＤ□にひじように溶解する反応体は、ＣＯ□入口近くのチャンバーに置かれ、その結果、それは、それよりも低い溶解性の反応体を接触せしめる前、Ｃ０２蒸気により抽出されるべきであった。

例Ｉ液体ｎ−ブタノール１ｍｊ！を含むフィルター支持体を、Ｃ０２人口近くの容器に置き、そして固体アセチルイミダゾール５５０■を前記フィルター支持体上に置いた。次に、そのシステムを９６″Ｆ及び３０００ｐｓ　ｉで二酸化炭素により充填し、そして１時間、反応せしめた。そのシステムを臨界条件以下に減じ、そして大気中に排気した。液体反応生成物をその反応容器から排出し、そしてガスクロマトグラフィー及び質量分光分析法により、５７％の収率での酢酸ブチルであることが見出された。

例■ 類似する方法を用いて、固体アセチルイミダゾール６６０■を、液体５−アミノ −１−ペンタノール５１６■と反応せしめた。そのシステムを、３０００ｐｓ　ｉ及び１５４″Ｆで二酸化炭素により充填し、そして４時間反応せしめた。そのシステムをベントし、そして分解し、そしてフィルター支持体を約５分間、クロロホルム５ｒｎｌ中で浸ψりし、反応生成物を抽出した。クロロホルム溶液をガスクロマトグラフィー及び質量分光分析法により分析し、そして２種の出発材料の他に、Ｎ、Ｏ−ジアセチル−５−アミノ−ペンタノール、Ｎ−アセチル−５− アミノ−１−ペンタノール及びＯ−アセチル−５−アミノ−１−ペンタノールを含むことが見出された。

例■ 例■に記載される方法に類似する方法を用いて、液体無水酢酸１ｒｒ１１と、Ｃｏｅｎｅｎ、など、、　Ｇｅｒｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。

７、３３５（１９８４）の方法によるブトキシカルボニル保護基の除去により保護解除されたＢＯＣ−Ｖａｌｉｎｅ　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂１５０■と反応せしめた。容器を３０００ｐｓ　ｉ及び９４″Ｆで二酸化炭素により充填し、そして２０分間反応せしめた。そのシステムを臨界以下の条件に減じ、そして大気中に排気した。保護解除されたバリン樹脂のアセチル化は、ＭｃＨｕｇｈ、など、、　５ｕｐｏｒｃｒｉｔｉｃａｌＦｌｕｉｄ　Ｂｘｔｒａｃｔｉｏｎ、　Ｂｕｔｌｅｗｏｒｔｈ　＆　ｃｏ、、　Ｌｔｄ、　（１９８６）に記載されるＫａｉｓｅｒ方法を用いてのニンヒドリン分析により９９．４％以上の完結度であった。

例■ 例■に記載される方法に類似する方法を用いて、市販の長鎖アルキルアミン調節多孔性ガラス（Ｌ（：ＡＡ−ＣＰＧ）樹脂１００■と、固体アセチルイミダゾール２００■とを反応せしめた。両反応体をフィルター紙の包みに置き、ここで、アセチルイミダゾールを含む包みを、ＬＣＡＡ−ＣＰＧを含む包みの下の容器に配置した。そのシステムを３０００ｐｓ　ｉ及び９５′Ｆで二酸化炭素により充填し、そしてその反応を１時間進行せしめた。次に、容器を臨界以下の条件に減じ、そして大気中にベントした。

Ｋａｉｓｅｒニンヒドリン試薬による少量の樹脂サンプルの分析は、ＬＣＡＡ− ＣＰＧ樹脂のアセチル化が完結であったことを示した。

例Ｖ例Ｉ、ＩＩ及び■に記載される方法に類似する方法を用いて、ＢＯＣ−Ｖａｌｉｎｅ　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂２００■を保護解除し、そしてその保護解除された樹脂を、１００’Ｆ及び３０００ｐｓｉで二酸化炭素の存在下で２時間、固体アセチルイミダゾール２２０■と反応せしめた。Ｋａｉｓｅｒニンヒドリン試薬による少量の樹脂サンプルの分析は、アシル化が７４％以下の完結度であったことを示した。例■〜■の結果に基づけば、ＬＣＡＡ−ＣＰＧ樹脂は、固体アセチル化剤が使用される場合、良好な支持体であり、そしてＬＣＡＡ−ＣＰＧ樹脂及びポリスチレン基材のＭｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ樹脂の両者は、液体アシル化剤が使用される場合に使用され得るように例■に記載される方法に類似する方法を用いて、Ｌ［：ＡＡ−ＣＰＧ樹脂１００■と、ＢＯＣ−グリシンの固体Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル２７２■とを、３０００ｐｓ　ｉ及び９６″Ｆで二酸化炭素中で５時間反応せしめた。ＢＯＣ−グリシンエステル２４０■が包みに残存することが見出され、これは、たった３２■が二酸化炭素に溶解したことを示した。Ｋａｉｓｅｒニンヒドリンによる少量の樹脂サンプルの分析は、保護されたグリシンとＬＣＡＡ−ＣＰＧ樹脂との反応が約９４％の完結度であったことを水側■に記載される方法に類似する方法を用いて、ＢＯＣ−グリシンの１．０　ｍＭの対称無水物を含む溶液と、ＬＣＡＡ−ＣＰＧ　１００■とを３５００ｐｓ　ｉ及び１００″Ｆで二酸化炭素中において１０５分間反応せしめた。Ｋａｉｓｅｒニンヒドリン試薬による少量の樹脂サンプルの分析は、ＬＣＡＡ−ＣＰＧとＢＯＣ−グリシンとの結合が完全であったことを示した。

例■ 例■に記載される方法に類似する方法を用いて、標準技法により例■の生成物を保護解除することにより製造されたＧＩｙ−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ　８７■と、ＢＯＣ−ロイシンｐ−ニトロフェニルエステル５５２■とを、３１００ｐｓｉ及び１０１″Ｆで二酸化炭素中において約１６時間（−晩）反応せしめた。Ｋａｉｓｅｒニンヒドリン試薬による樹脂生成物の少量サンプルの分析は、ＢＯＣ−ロイシンとの結合がＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ樹脂を形成するために完全であったことを示した。

例■ 例■に記載される方法に類似する方法を用いて、例■の生成物を保護解除し、そしてＢＯＣ−グリシンの０．５　ｍＭの対称無水物と、３０００ｐｓ　ｉ及び１０５″Ｆで二酸化炭素中において９０分間反応せしめた。樹脂の少量サンプルの分析は、ＢＯＣ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｙ−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ樹脂を生成するためのＢＯＣ−グリシンの結合が完全であったことを示した。

例Ｘ例■に記載される方法に類似する方法を用いて、例■の生成物を保護解除し、そしてその保護解除された生成物と、ＢＯＣ−アラニンの０．５ｍＭの対称無水物とを、３０００ｐｓ　ｉ及び１０５″Ｆで二酸化炭素中において９０分間反応せしめた。樹脂の少量サンプルの分析は、ＢＯＣ−Ａ　１　ａ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ −ＬＣＡＡ−ＣＰＧ樹脂を生成するためのＢＯＣ−アラニンの結合が完全であったことを示した。

このようにして生成された樹脂を、濃塩酸／プロピオン酸（１：　１　、　ｖ／ｖ）　０．５ｍ１．により１１０℃で一晩加水分解した。

得られた混合物を蒸発乾燥せしめ、そして固体樹脂を水１ｒｎｌと共に混合した。得られた水溶液を０．２２−のフィルターを固定された注射器中にドレンし、水を蒸発し、そしてその管を、Ｂｅｃｋｍａｎ　８９０アミノ酸分析機に基づく標準方法によるアミノ酸分析のために密封した。グリシン、アラニン及びロイシンのみが、２：１：１のモル比で存在することが見出された。

例ＸＩ例■に記載される方法に類似する方法を用いて、４−ヒドロキシメチル安息香酸が標準の対称結合技法を用いて塩基不安定結合体として結合されているＬＣＡＡ −ＣＰＧ樹脂２５０■と、ＢＯＣ−バリンの０．２５ｍＭの対称無水物とを、２８００ｐｓ　ｉ及び１０３’Ｆで二酸化炭素中において１時間反応せしめた。Ｋａｉｓｅｒ−ニヒドリン試薬による樹脂の少量サンプルの分析は、ＢＯ［’−Ｖａ　Ｉ！−ＨＭＢＡ−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ樹脂を形成するための結合反応が完結したことを示した。

例ｘ■ 例■に記載される方法に類似する方法を用いて、例ＸＩの生成物のすべてを保護解除し、モしてＢＯＣ−グリシンの０、２５ｍＭの対称無水物と、２８００ｐｓ　ｉ及び１０３″Ｆで二酸化炭素中において１時間、反応せしめた。Ｋａｉｓｅｒニンヒドリン試薬による樹脂の少量部分の分析は、ＢＯＣ−Ｇｌｙ−Ｖａ　ｌ　−）ＩＭＢＡ−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ樹脂を形成するための結合反応が完結したことを示した。

例Ｘ■ 例■に記載される方法に類似する方法を用いて、例Ｘｆｆの生成物のすべてを保護解除し、そしてＢＯＣ−アラニンの０．２５ｍＭの対称無水物と、２８００ｐｓｉ及び１０３″Ｆで二酸化炭素中において１時間、反応せしめた。Ｋａ　ｉ　ｓｅｒニンヒドリン試薬による樹脂の少量部分の分析は、ＢＯＣ−Ａ　ｌ　ａ− Ｇｌｙ−Ｖａ　Ｉ！　−ＨＭＢＡ−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ樹脂を形成するための結合反応が完結したことを水側■に記載される方法に類似する方法を用いて、例ＸＨの生成物のすべてを保護解除し、そしてＢＯＣ−ロイシンの０、２５ｍＭの対称無水物と、２８００ｐｓ　ｉ及び１０３″Ｆで二酸化炭素中において１時間、反応せしめた。Ｋａｉｓｅｒニンヒドリン試薬による樹脂の少量部分の分析は、ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ａ　（ｌ　ａ−Ｇｌｙ−Ｖａ　ｊ２−）ＩＭＢＡ−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ樹脂を形成するための結合反応が完結したことを示した。

例ＸＶジクロロメタン中、４０％トリフルオロ酢酸溶液２〜３ｍｌを容器中に置き、そしてフィルター紙の包みに含まれる例■の生成物５０■を容器中に置いた。その容器を２８００ｐｓｉ及び１２０下で二酸化炭素により充填し、そしてその反応を１時間進行せしめた。そのシステムを臨界以下の条件に減じ、大気中に排気し、樹脂を取り出し、そして中和した後、Ｋａｉｓｅｒニンヒドリン試薬による生成物の少量サンプルの分析は、遊離アミノ基を残すために、ＢＯＣ保護基の９５％以上の除去率を例■に記載される方法に類似する方法を用いて、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄのペプチドを、保護されたバリン、保護されたグリシン、保護されたアラニン及び保護されたロイシンと長鎖脂肪族アニリン調節多孔性ガラスピーズとを、９５′Ｆ及び３０００ｐｓ　ｉで、反応溶媒として超臨界二酸化炭素を用いて反応せしめることによって調製した。

このサンプル１００■とヘキサン中、フェニルインチオシアネートの５％溶液１．０ｍｌとを、３３００ｐｓ　ｉ及び１００″Ｆで二酸化炭素中において反応せしめ、フェニルチオカルボニルを形成した。この生成物を、無水トリフルオロ酢酸２．０−により処理し、そしてその得られたトリフルオロ酢酸溶液を標準のＢｅｃｋｍａｎ　９９０　Ｓｐｉｎｎｉｎｇ　（ｕｐ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒに基づいて高圧液体クロマトグラフィーシステムで分析した。卓越したピークは、フェニルイソチオシアネートロイシンヒダントインであった。

本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｅｒｏｎａｕｔｉｃｓ　ａｎｄ　５ｐａｃｅ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＮＡＳＡ）により授与された５ＢｒＲＣｏｎｔｒａｃｔ　Ｎａ　ＮＡＳ　２−１２５６３で政府の支持により行なわれた。政府は本発明において一定の権利を有する。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．不活性反応溶媒の存在下で少なくとも２種の異なった反応成分を接触せしめることによって化学反応生成物を生成するための方法であって、主要反応溶媒として超臨界二酸化炭素を用いることを含んで成る方法。
２．有機エステルが、アルコールとアシル化剤とを反応せしめることによって形成される請求の範囲第１項記載の方法。
３．有機アミドが、アミンとアシル化剤とを反応せしめることによって形成される請求の範囲第１項記載の方法。
４．前記アミンが、アミノ酸、保護されたアミノ酸又は少なくとも１つのアミノ基を有するペプチド鎖である請求の範囲第３項記載の方法。
５．前記アシル化剤が、カルボン酸、カルボン酸エステル、Ｎ−カルボキシル無水物、アシルイミダゾール又は対称アシル無水物である請求の範囲第４項記載の方法。
６．１つの反応体がポリペプチドであり、そしてもう１つの反応体がフェニルイソチオシアネート、ダンシルクロリド、オルトフタルアルデヒド、ニンヒドリン及びジニトロフルオロベンゼンである請求の範囲第１項記載の方法。
７．１つの反応体がフェニルイソチオシアネートである請求の範囲第６項記載の方法。
８．ペプチドポリマーが、少なくとも１つのＮ−カルボキシル無水物を重合することによって形成される請求の範囲第１項記載の方法。
９．１つの反応体がアミノ酸であり、そしてもう１つの反応体がフェニルイソチオシアネート、ダンシルクロリド、オルトフタルアルデヒド、ニンヒドリン、ジニトロフルオロペンゼン又はフルオレサミンである請求の範囲第１項記載の方法。