ES2235336T3

ES2235336T3 - Ligacion quimica nativa en fase solida de peptidos desprotegidos o protegidos en la cisteina n-terminal en solucion acuosa.

Info

Publication number: ES2235336T3
Application number: ES98929035T
Authority: ES
Inventors: Lynne Canne; Stephen B. H. Kent; Reyna Simon
Original assignee: Gryphon Therapeutics Inc
Current assignee: Gryphon Therapeutics Inc
Priority date: 1997-06-13
Filing date: 1998-06-12
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2018-06-12
Also published as: AU8069598A; ES2282788T3; US20020132975A1; ATE285415T1; US7030217B2; CA2292724A1; US20020169282A1; US7094871B2; DE69837170D1; AU745094B2; EP1001968A1; DE69828287T2; JP2002505672A; EP1001968B1; ATE354584T1; DE69837170T2; US20050209440A1; DE69828287D1; US6326468B1; WO1998056807A1

Abstract

La presente invención proporciona procedimientos, dispositivos y kits para sintetizar péptidos ensamblados y proteínas sobre una fase sólida con ligamiento secuencial de tres o más segmentos peptídicos no protegidos utilizando productos químicos de ligamiento moderado y quimioselectivos en una disolución acuosa. Se proporciona también procedimientos para visualizar las reacciones de ligamiento secuencial en fase sólida utilizando una espectrometría de masas de tipo MALDI o de ionización por pulverización de electrones sobre los productos de reacción.

Description

Ligación química nativa en fase sólida de péptidos desprotegidos o protegidos en la cisteína N-terminal en solución acuosa.

Antecedentes

Los procedimientos existentes para la síntesis química de proteínas incluyen la síntesis paso a paso en fase sólida, y la condensación de fragmentos, bien en solución o en fase sólida. La síntesis paso a paso en fase sólida clásica de Merrifield implica la unión covalente de una aminoácido correspondiente al aminoácido carboxi-terminal de la cadena peptídica deseada a un soporte sólido, y la extensión de la cadena polipeptídica hacia el extremo amino mediante el acoplamiento paso a paso de derivados activados de aminoácidos que tienen grupos carboxilos activados. Después de la realización del ensamblaje de la cadena peptídica completamente protegida y unida a la fase sólida, se corta la unión covalente entre el péptido y la fase sólida mediante reacción química apropiada, y se retiran los grupos protectores para obtener el polipéptido producto.

Algunas desventajas del procedimiento de síntesis paso a paso en fase sólida incluyen: la reacción incompleta en los pasos de acoplamiento y desprotección en cada ciclo resultan en la formación de productos secundarios unidos a la fase sólida. De forma similar, las reacciones secundarias debidas a las imperfecciones en la reacción química, y/o las impurezas presentes en los aminoácidos reactivos/protegidos, todo conduce a una multiplicidad de productos unidos a la fase sólida en cada paso del ensamblaje de la cadena, y a la formación de mezclas de productos complejas en el producto final. Por tanto, cuanto más larga sea la cadena peptídica, más complejo es obtener productos bien definidos con elevada pureza. Debido a la producción de mezclas complejas, la estrategia de síntesis paso a paso en fase sólida tiene limitaciones de tamaño. En general, no se preparan rutinariamente polipéptidos bien definidos de 100 o más residuos aminoácidos mediante síntesis paso a paso en fase sólida. La síntesis de proteínas y polipéptidos largos mediante esta ruta es una tarea laboriosa que exige mucho tiempo.

La estrategia de condensación de fragmentos en fase sólida (también conocida como condensación de segmentos) se diseñó para superar las dificultades para obtener polipéptidos largos a través del procedimiento de síntesis paso a paso en fase sólida. El procedimiento de condensación de segmentos implica la preparación de varios segmentos de péptidos mediante el procedimiento paso a paso en fase sólida, seguidos por la separación de la fase sólida y la purificación de estos segmentos protegidos al máximo. Los segmentos protegidos se condensan uno a uno al primer segmento, el cual está unido a la fase sólida.

A menudo se encuentran dificultades técnicas en muchos de los pasos de la condensación de segmentos en fase sólida. Ver, E. Atherton, et al., "Solid Phase Fragment Condensation-The Problems," en Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis 11-25 (R. Epton, et al., 1990). Por ejemplo, el uso de grupos protectores en segmentos para bloquear las reacciones de ligación no deseados puede hacer frecuentemente que los segmentos protegidos sean pobremente solubles, interfiriendo en la activación eficiente del grupo carboxilo. La solubilidad limitada de los segmentos protegidos puede interferir también con la purificación de los segmentos protegidos. Ver K. Akaji et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 33:184-102 (1985). Los segmentos protegidos son difíciles de caracterizar con respecto a su pureza, estructura covalente, y no son apropiados para la ESMS (espectrometría de masas mediante electrospray) analítica de alta resolución (basada en la carga). La racemización del residuo C-terminal de cada segmento de péptido activado es también un problema, excepto si la ligación se realiza en residuos glicina. Además, la separación del polipéptido unido a la fase sólida y completamente ensamblado de la fase sólida, y la supresión de los grupos protectores frecuentemente pueden requerir procedimientos químicos agresivos y tiempos de reacción prolongados que resultan en la degradación del polipéptido completamente ensamblado.

La condensación de segmentos puede realizarse en solución en vez de en fase sólida. Ver, H. Muramatsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commn. 203(2):1131-1139 (1994). Sin embargo, la condensación de segmentos en solución requiere la purificación de los segmentos antes de la ligación, así como el uso de grupos protectores sobre un cierto rango de diferentes grupos funcionales en cadenas laterales para impedir múltiples reacciones secundarias no deseadas. Además, la ligación en solución no permite que los fáciles pasos de purificación y lavado permitidos por las ligaciones en fase sólida. Más aún, las limitaciones con respecto a la solubilidad de los segmentos peptídicos protegidos y los productos de reacción intermedios de los péptidos protegidos están exacerbadas.

Se ha explorado la ligación química de segmentos peptídicos mínimamente protegidos con objeto de superar los problemas de solubilidad hallados frecuentemente con los segmentos de péptidos protegidos al máximo. Ver Cheng, et al., Chemical Synthesis of Human \upsilon-endorphin(1-27) Analogs by Peptide Segment Coupling. Int. J. Pept. Protein Res. 38:70-78 (1991); J. Blake, Total Synthesis of S-Carbamoylmethyl Bovine Apocytochrome c by Segment Coupling, Int. J. Pept. Protein Res. 27:191-200 (1986); y H. Hojo et al., Protein Synthesis using S-Alkyl Thioester of Partially Protected Peptide Segments, Synthesis of DNA-Binding Protein of Bacillus stearothermophilus, Bull. Chem. Soc. Jpn. 65:3055-3063 (1992). Sin embargo, este procedimiento todavía requiere el uso de grupos protectores en todos los grupos amino de la cadena lateral de lisina, la protección selectiva N-\alpha de uno o más segmentos, y pasos de purificación laboriosos, que implican la purificación, reprotección y repurificación.

El uso de múltiples segmentos peptídicos protegidos es incompatible con el esquema general de diseñar proteínas usando péptidos producidos por medio de la expresión de ADN recombinante como fuente. Los procedimientos de segmentos peptídicos protegidos requieren mucho trabajo, y los segmentos peptídicos protegidos tienen propiedades de manipulación impredecibles, en parte debido a las dificultades de solubilidad y ligación de los segmentos peptídicos protegidos. A menudo, los segmentos peptídicos protegidos sin mínimamente solubles, incluso en los solventes apróticos polares más poderosos, tales como el dimetilsulfóxido (DMSO) y la dimetilformamida (DMF). El problema de la insolubilidad en segmentos peptídicos protegidos se ha tratado, con éxito limitado, de varias formas, incluyendo el uso de (1) la estrategia de protección de grupos parcial que enmascara todas las cadenas laterales excepto las de Ser, Thr y Try; (2) una estrategia de mínima protección de grupos laterales que sólo enmascara las cadenas laterales de tiol y amino; y (3) usar la protección reversible de un grupo amido del esqueleto para prevenir la agregación/insolubilidad. Los grupos protectores usados en la última aproximación alteran las conformaciones del péptido. El uso de grupos protectores del esqueleto no es todavía sencilla o predecible, y requiere una experimentación significativa para cada cadena polipeptídica diana.

Existe un cierto número de técnicas para la ligación de segmentos peptídicos no protegidos a través de uniones no naturales de esqueletos. Por contra, hay pocos procedimientos para conseguir una "ligación química natural". Una "ligación química natural" es la reacción quimioselectiva de segmentos peptídicos desprotegidos o protegidos en la cisteína N-terminal, con otros segmentos peptídicos desprotegidos, que resulta en la formación de un péptido ligado con un enlace amida en el sitio de ligación. El polipéptido diana completamente ensamblado de la invención comprende uno, dos, o más sitios de ligación química nativa.

En consecuencia, hay una necesidad en la técnica de procedimientos rápidos para sintetizar polipéptidos ensamblados a través de la ligación química de dos o más segmentos peptídicos desprotegidos usando un soporte sólido, con rendimientos mejorados y la manipulación facilitada de los productos intermedios.

La presente invención hace posible, entre otros, la síntesis rápida en fase sólida de polipéptidos grandes con un esqueleto peptídico natural, a través de la ligación química nativa de dos o más segmentos peptídicos desprotegidos, en donde ninguno de las funcionalidades reactivas en los segmentos peptídicos necesita ser enmascarada temporalmente mediante un grupo protector. La presente invención consigue por primera vez, la ligación química secuencial en fase sólida de segmentos peptídicos en una dirección N-terminal o C-terminal, siendo portador el primer segmento peptídico, desprotegido y unido a la fase sólida, de un \alpha-tioéster C-terminal que reacciona con otro segmento peptídico desprotegido que contiene una cisteína N-terminal y un tioácido C-terminal.

Otras realizaciones de la invención también permiten la ligación química nativa en fase sólida en la dirección C a N-terminal, con la protección temporal de los residuos cisteína N-terminales en un entrante (segundo) segmento peptídico. Aquéllos con formación ordinaria en la técnica apreciarán fácilmente que la invención también podría incluir el uso de la ligación química no nativa para ligar secuencialmente segmentos peptídicos a una fase sólida a través de enlaces no naturales. Alternativamente, la invención también podría incluir el uso de la ligación química nativa de segmentos peptídicos, en donde dichos segmentos peptídicos comprenden uno o más enlaces de esqueleto no naturales.

WO 96/34878 y Le Canne et al., J. Amer. Chem. Soc., 118(25):5891-5896 descubren la ligación de oligopéptidos preparados mediante síntesis en fase sólida. Uno podría tener un grupo tioéster C-terminal. Ambos oligopéptidos deben separarse del soporte antes de la ligación. Las siguientes referencias también podrían ser de interés: Matthys J. Janssen, "Thiolo, Thiono, and Dithio Acids and Esters," capítulo 15 de The Chemistry of Carboxylic Acids and Their Esters (1969).

: Schnolzer et al., Science 256:221-225 (1992)

: Rose et al., J. Am Chem. Soc. 116:30-34 (1994)

: Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6584-6588 (1994).

: Dawson et al. Science 266:77-779 (1994).

: Sakakibara S., Biopolymers (Peptide Science) 37:17-28 (1995).

: Tam et al., PNAS USA 92:12485-12489 (1995).

Resumen de la invención

La presente invención proporciona, entre otros, nuevos procedimientos para producir grandes polipéptidos mediante la ligación química nativa de segmentos peptídicos, en solución acuosa, a un péptido desprotegido unido a una fase sólida, sin necesidad de grupos protectores sobre los segmentos peptídicos, o, con la protección temporal de la cisteína N-terminal de los segmentos peptídicos entrantes. Entre las muchas ventajas de esta realización de la invención se hallan: la facilidad de purificación de los productos intermedios y finales; las reacciones de ligación más rápidas; las síntesis rápidas de grandes polipéptidos con un esqueleto peptídico natural; la facilidad de las reacciones de ligación debido a la ausencia de grupos protectores, y la solubilidad mejorada resultante de los segmentos peptídicos en soluciones acuosas o mixtas acuosas/orgánicas; la ligación quimioselectiva debido a la ausencia de reactividad del grupo tioéster con otros grupos funcionales presentes en ambos segmentos reactivos para formar coproductos estables, lo que resulta en un producto final más puro sin reacciones secundarias; la adaptabilidad para monitorizar sobre la fase sólida a través de la espectrometría de masas MALDI o la MS ESI (espectrometría de masas con ionización y electrospray); la racemización disminuida debido al uso de una activación suave usando un tioéster y la evitación de pH elevados; el polipéptido producto se obtiene directamente en forma desprotegida; y la adaptabilidad a la automatización y a las técnicas combinatorias.

Una ventaja significativa de las ligaciones en fase sólida respecto las ligaciones en solución es que los procedimientos de ligación en fase sólida no requieren los arduos pasos de purificación mediante HPLC (cromatografía líquida de alta presión) y liofilización después de cada paso de ligación, mientras que las ligaciones en solución sí. Por tanto, las ligaciones en fase sólida eliminan muchos pasos de purificación que requieren mucho tiempo y que disminuyen la recuperación de producto final. En cambio, los procedimientos de ligación secuencial en fase sólida descritos aquí sólo requieren un única paso de purificación mediante HPLC y de liofilización después de que se haya ligado el segmento peptídico desprotegido final, y de que se haya separado el péptido ensamblado de la fase sólida. La eliminación de estos pasos de purificación que requieren mucho tiempo permite una síntesis más rápida del producto final, es decir, del péptido ensamblado, que la permitida por la ruta análoga en solución. La fácil purificación del producto deseado unido a la fase sólida de los coproductos solubles presenta un avance tremendo en términos de rendimiento del polipéptido ensamblado definitivo.

Otra ventaja de las ligaciones en fase sólida es que permiten concentraciones de reactivos más elevadas lo que conduce a velocidades de reacción más rápidas. Por ejemplo, usando un exceso a elevada concentración del segmento peptídico entrante en comparación con el péptido unido a la fase sólida, las reacciones pueden alcanzar su conclusión mucho más rápidamente. El exceso de segmento peptídico puede eliminarse fácilmente de la fase sólida después de completarse la reacción de ligación. Pueden conseguirse rendimientos incrementados de producto final incrementando las concentraciones de segmentos peptídicos. Por ejemplo, el polipéptido unido a la fase sólida puede secarse sobre la fase sólida y resolvatarse en solución de ligación. Alternativamente, el péptido unido a la fase sólida puede lavarse con una solución de segmentos peptídicos entrantes a concentración elevada.

Otras ventajas de la presente invención son que permite la síntesis de péptidos y proteínas mucho mayores que los actualmente realizables mediante procedimientos convencionales, puede automatizarse, y el uso de cargas de resina elevadas permite un fácil escalado. Más aún, la ligación en la dirección N- a C-terminal permite el uso de segmentos peptídicos crudos sin necesidad de purificación o liofilización, puesto que los productos de terminación formados durante la síntesis paso a paso en fase sólida de los segmentos peptídicos no reaccionarán con el péptido unido a la fase sólida.

En otra realización, la invención comprende un procedimiento para producir un péptido ensamblado que tiene un esqueleto peptídico nativo, mediante la ligación de segmentos peptídicos en la dirección N- a C-terminal, comprendiendo: (a) unir covalentemente un primer segmento peptídico desprotegido a una fase sólida a través de un conector que comprende un grupo que puede cortarse, en donde dicho grupo que puede cortarse es estable en las condiciones de ligación, y dicho primer segmento peptídico desprotegido está unido a dicho grupo que puede cortarse en su extremo N-terminal, y tiene un \alpha-tioéster en su extremo C-terminal; (b) introducir opcionalmente un segundo segmento peptídico desprotegido, en donde dicho segundo segmento comprende un residuo cisteína en su extremo N-terminal y un tioácido en su extremo C-terminal, en condiciones apropiadas para permitir la ligación entre dicho primer segmento peptídico desprotegido y dicho segundo segmentos peptídico desprotegido, para formar un péptido ligado nativamente unido a dicha fase sólida, en donde dicho péptido unido a la fase sólida comprende un tioácido en su extremo C-terminal, y convertir subsiguientemente dicho tioácido del péptido unido a la fase sólida a un tioéster; (c) repetir opcionalmente el paso (b) con segmentos peptídicos desprotegidos adicionales; (d) introducir un segmento peptídico desprotegido final, que comprende un residuo cisteína en su extremo N-terminal, en condiciones apropiadas para permitir la ligación entre dicho péptido unido a la fase sólida y dicho segmento peptídico desprotegido final. En una realización preferida, el grupo que puede cortarse se corta para liberar el péptido unido a la fase sólida en forma de péptido ensamblado. En otra realización preferida, el grupo que puede cortarse es un conector que puede cortarse capaz de ser cortado para los propósitos de monitorizar las reacciones de ligación secuenciales. En otra realización, el primer segmento peptídico desprotegido se añade como un tioácido péptido-\alphaCOSH y se convierte subsiguientemente a tioéster.

La ligación secuencial en la dirección de N- a C-terminal es un medio sorprendentemente efectivo y elegante para obtener la ligación quimioselectiva de segmentos de péptidos desprotegidos sin racemización. Antes de la presente invención, las ligaciones secuenciales no se realizaban en la dirección de N- a C-terminal debido a preocupaciones en relación a la racemización del \alpha-COX en el extremo C-terminal del péptido (péptido-\alpha-COX). Usando la presente invención, el \alpha-COSH en el extremo C-terminal del segmento peptídico se activa suavemente a tioéster y la reacción de ligación se lleva a cabo en ausencia de bases, en una solución acuosa tamponada, lo que resulta en condiciones suaves que no generan mezclas racémicas.

Los procedimientos de la invención pueden usarse para la ligación química nativa de segmentos peptídicos producidos mediante la síntesis paso a paso en fase sólida. El último segmento peptídico a añadirse al extremo C-terminal el péptido unido a la fase sólida en el esquema de reacción podría ser un péptido expresado de forma recombinante que tuviera un residuo cisteína N-terminal (Cys-péptido recombinante). El grupo tioácido, que se activa a un grupo tioéster, puede colocarse en cualquier lugar en donde se desea una ligación química nativa, incluyendo en una cadena lateral. Por tanto, las ligaciones secuenciales de la invención no están limitadas a péptidos ensamblados linealmente.

En otra realización, se usan piezas intermedias de segmentos peptídicos desprotegidos, que tienen cada una un residuo cisteína N-terminal que participa en la ligación química nativa.

En otra realización, la invención comprende un procedimiento para producir un péptido ensamblado, que tiene un esqueleto peptídico nativo, mediante la ligación de segmentos peptídicos en la dirección de C- a N-terminal, que comprende: (a) unir covalentemente un primer segmentos peptídico desprotegido a una fase sólida a través de un asa que puede cortarse, en donde dicho grupo que puede cortarse es estable en las condiciones de ligación, y en donde dicho primer segmento peptídico desprotegido está unido a dicho grupo que puede cortarse en su extremo C-terminal y tiene una cisteína en su extremo N-terminal; (b) introducir un segundo segmento peptídico, en donde dicho segundo segmento comprende un residuo cisteína en su extremo N-terminal y un alfa-tioéster en su extremo C-terminal, y en donde dicho segundo segmento peptídico tiene un grupo protector unido a su residuo cisteína N-terminal, en condiciones apropiadas para permitir la ligación entre dicho primer segmento peptídico y dicho segundo segmento peptídico protegido de forma N-terminal, para formar un péptido ligado nativamente unido a dicha fase sólida, en donde dicho péptido unido a la fase sólida comprende un grupo protector unido a una cisteína N-terminal; (c) retirar dicho grupo protector del péptido de la fase sólida; (d) opcionalmente repetir los pasos (b) y (c) con segmentos peptídicos adicionales comprendiendo una cisteína N-terminal y un alfa-tioéster C-terminal, en donde dichos segmentos peptídicos adicionales tienen un grupo protector unido a su residuo cisteína N-terminal, (e) introducir un segmento peptídico final, que comprende un alfa-tioéster en su extremo C-terminal, a condición de que, si dicho segmento peptídico final comprende una cisteína N-terminal, dicha cisteína N-terminal está protegida por un grupo protector, en donde dicha introducción ocurre en condiciones apropiadas para permitir la ligación entre dicho péptido unido a la fase sólida y dicho segmento peptídico final, y (f) opcionalmente retirar dicho grupo protector de la cisteína N-terminal de dicho péptido unido a la fase sólida.

En otra realización, la invención comprende un procedimiento para producir un péptido ensamblado, que tiene un esqueleto peptídico nativo, mediante la ligación de segmentos peptídicos en la dirección C- a N-terminal, que comprende: (a) unir covalentemente un primer segmentos peptídico desprotegido a una fase sólida a través de un asa que puede cortarse, en donde dicho grupo que puede cortarse es estable en las condiciones de ligación, y en donde dicho primer segmento peptídico desprotegido está unido a dicho grupo que puede cortarse en su extremo C-terminal y tiene una cisteína en su extremo N-terminal; (b) introducir opcionalmente un segundo segmento peptídico, en donde dicho segundo segmento comprende un residuo cisteína en su extremo N-terminal y un alfa-tioéster en su extremo C-terminal, y en donde dicho segundo segmento peptídico tiene un grupo protector unido a su residuo cisteína N-terminal, en condiciones apropiadas para permitir la ligación entre dicho primer segmento peptídico y dicho segundo segmento peptídico protegido de forma N-terminal, para formar un péptido ligado nativamente unido a dicha fase sólida, en donde dicho péptido unido a la fase sólida comprende un grupo protector unido a una cisteína N-terminal, y subsiguientemente retirar dicho grupo protector del péptido unido a la fase sólida; (c) repetir opcionalmente el paso (b) con segmentos peptídicos adicionales que comprenden una cisteína N-terminal y un alfa-tioéster C-terminal, en donde dichos segmentos peptídicos adicionales tienen un grupo protector unido a su residuo cisteína N-terminal; (d) introducir un segmento peptídico final, que comprende un alfa-tioéster en su extremo C-terminal, a condición de que, si dicho segmento peptídico final comprende una cisteína N-terminal, dicha cisteína N-terminal está protegida por un grupo protector, en donde dicha introducción ocurre en condiciones apropiadas para permitir la ligación entre dicho péptido unido a la fase sólida y dicho segmento peptídico final, y (e) opcionalmente retirar dicho grupo protector de la cisteína N-terminal de dicho péptido unido a la fase sólida.

En aún otra realización, hay la ligación secuencial en fase sólida de segmentos peptídicos en cualquiera de o en ambas direcciones, usando un conector que puede cortarse para monitorizar las reacciones de ligación a través de la espectrometría de masas y para purificar el péptido ensamblado de la fase sólida.

Otra realización es un procedimiento de ligación química nativa bidireccional en fase sólida, que comprende proporcionar un primer segmento peptídico unido a un soporte sólido a través de uno de sus residuos aminoácidos interno, en donde dicho primer segmento peptídico comprende una cisteína N-terminal y un tioéster C-terminal, y ligar un segundo segmento peptídico a cualquiera de los extremos.

En otra realización, se proporciona un equipo que comprende un segmento peptídico desprotegido, unido covalentemente, a través de un grupo funcional de una cadena lateral de aminoácido, a un conector que puede cortarse, en donde dicho conector que puede cortarse está unido a una fase sólida a través de un grupo funcional quimioselectivo complementario de un grupo funcional quimioselectivo sobre la fase sólida. Dicho equipo puede usarse para la ligación química en fase sólida de segmentos desprotegidos o protegidos en su cisteína N-terminal al péptido unido a la fase sólida. Un ejemplo preferido de tal conector que puede cortarse es un conector que puede cortarse funcionalizado, X-aminoetilsulfonetiloxicarbonilo (en donde X = CH_{3}-COCH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CONHCH_{2}-MSC- o X = AOA-NHCH_{2}-MSC-. (AOA = aminooxiacetal)

En otra realización, hay procedimientos para usar ácido bromoacético o ácido iodoacético para convertir un tioácido de segmento peptídico (péptido-\alphaCOSH) en un tioéster (péptido-\alphaCOSR), sobre una fase sólida.

En todavía otra realización, se proporciona un procedimiento para monitorizar el proceso de ligación secuencial sobre la fase sólida mediante espectrometría de masas MALDI o ESI, usando conectores que se pueden cortar. La monitorización vía MS ESI también puede conseguirse usando conectores que pueden cortarse con TFA o, cuando el procedimiento de espectrometría de masas usado es MALDI, podría emplearse preferiblemente un conector fotocortable.

En una realización adiciona, se proporcionan procedimientos novedosos para preparar bibliotecas modulares de grandes péptidos o proteínas usando combinaciones de los aspectos de la invención descritos en ésta. Son particularmente útiles los procedimientos de ligación secuencial en fase sólida de segmentos peptídicos para sintetizar rápidamente múltiples análogos de proteínas o polipéptidos conocidos.

También se proporcionan los equipos y aparatos para ensamblar polipéptidos y bibliotecas de polipéptidos mediante los procesos descritos en ésta.

Alguien con formación en la técnica apreciará fácilmente que cada una de las realizaciones de la invención puede combinarse con otras realizaciones para obtener un amplio rango de invenciones útiles.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama esquemático de un esquema de ligación química nativa en fase sólida, en la dirección N-a C-terminal. En una realización, el conector es un asa MSC, la cual se puede cortar aunque es estable en las condiciones de la ligación. En otra realización, el primer segmento peptídico desprotegido está covalentemente unido a una fase sólida (resina) a través de un enlace aminooxi-cetona.

La Figura 2A ilustra la estabilidad de un péptido-\alpha-COSH de 13 residuos con un residuo cisteína en el extremo N-terminal en las condiciones de ligación. El cromatograma de HPLC muestra que sólo un pequeño porcentaje del péptido se cicló o formó agregados, incluso después de su almacenamiento durante la noche en las condiciones de ligación.

La Figura 2B ilustra la estabilidad del mismo péptido-\alphaCOSH de 13 residuos en presencia de un tioéster péptido que tiene un peso molecular de 1230,2. El cromatograma de HPLC muestra que el péptido Cys-\alpha-COSH es adecuadamente estable para su uso en la ligación sin una reacción significativa consigo mismo. Más aún, puesto que tales productos secundarios se forman en pequeña proporción mediante la reacción del péptido-\alphaCOSH de 13 residuos (que tiene una cisteína N-terminal) consigo mismo, no son reactivos con el péptido-\alphaCOSR unido a la resina, y se retiran fácilmente mediante simple filtración y lavado.

Las Figuras 3A, 3B y 3C muestran cromatogramas de HPLC del efecto de la hidrazina sobre la supresión del asa MSC de un péptido que tienen una cisteína N-terminal. El pico que se correlaciona con la masa de 1708,2 representa el péptido deseado con el asa MSC suprimida. El pico que corresponde a la masa 1814,5 representa un producto secundario reactivo formado a partir del corte, que puede reaccionar con el péptido deseado sin el asa MSC. La Figura 3A muestra un pico bastante grande al P.M. de 1814,5 cuando se colocó una alícuota del péptido en guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,5, a continuación se diluyó en NaOH 1 N durante 2 minutos, a continuación se apagó con HCl 1 N. La Figura 3B es un cromatograma de HPLC del producto resultante cuando se repiten las condiciones de la Figura 3A con la inclusión de hidrazina 50 mM en la solución de guanidina\cdotHCl 6 M. La Figura 3C es un cromatograma de HPLC del producto resultante cuando las condiciones de la Figura 3A se repiten con hidrazina 200 mM en la solución de guanidina\cdotHCl 6 M. La hidrazina secuestra el producto secundario, lo que resulta en un producto más puro.

La Figura 4 es un cromatograma de la supresión de un asa MSC que puede cortarse de un péptido que no tiene un residuo cisteína N-terminal, sino que tiene un residuo leucina N-terminal y un residuo cisteína en su centro aproximado. El peso molecular del péptido con el asa MSC es de 4022,4 y sin el asa MSC es de 3745,1. Se diluyó una alícuota del péptido en guanidina\cdotHCl 6 M, NaAc 0,1 M, pH 4,6, en guanidina\cdotHCl 6 M, NaAc 0,1 M, pH 14, durante 2 minutos, se apagó con guanidina\cdotHCl 6 M, NaAc 0,1 M, pH 2,0. La HPLC muestra que todavía ocurre una reacción interna con el producto secundario, para formar el pico que tiene un P.M. de 3979,7 (correspondiente a la modificación por parte de la LEV-NHCH_{2}-asa), pero que la extensión de la reacción es menor que la que ocurría con un péptido que tuviera una cisteína N-terminal.

La Figura 5A es un esquema de reacción que muestra la preparación de la resina PEGA usada como soporte sólido en las ligaciones secuenciales N- a C-terminales. Los pasos A y B1 son pasos opcionales para producir un conector fotolábil para su uso con el análisis MALDI de las muestras de resina.

La Figura 5B es un diagrama que ilustra un esquema generalizado para preparar una fase sólida (resina) para su uso en las ligaciones secuenciales en fase sólida de la invención. La Estructura 1 es un conector que puede cortarse útil para monitorizar el progreso de las reacciones de acoplamiento y ligación mediante espectrometría de masas. Por ejemplo, un conector fotocortable puede usarse para la monitorización sobre la resina mediante MS MALDI, mientras que un conector que puede cortarse con TFA puede usarse para monitorizar mediante MS de electrospray. Una vez la Estructura 1 está acoplada a la resina, se retira el grupo protector (PG) y se añade a la resina un grupo funcional (Estructura 3) capaz de reacción quimioselectiva con el primer segmento peptídico. Una vez 3 se ha acoplado a la resina, se retira el grupo protector para proporcionar la Estructura 4, la cual está a punto para su reacción quimioselectiva con la Estructura 5, un péptido modificado con un asa que puede cortarse y un grupo funcional capaz de reaccionar con la resina ahora modificada (4). Una vez se han completado todas las ligaciones subsiguientes, se corta el "asa que puede cortarse" para liberar el péptido de longitud completa (péptido ensamblado) de la fase sólida.

La Figura 6 es un esquema de reacción que ilustra la derivatización del Segmento Peptídico 1 (el segmento peptídico N-terminal).

Las Figuras 7A y 7B son cromatogramas de HPLC del acoplamiento del primer segmento peptídico desprotegido (1) al soporte sólido, en este ejemplo, una resina funcionalizada con AOA (PEGA). La Figura 7A es una HPLC de la solución de péptido tal como se añade a la resina. La Figura 7B es una HPLC del sobrenadante después de la reacción del péptido con un exceso molar de la resina durante la noche. Se ha retirado una cantidad significativa de péptido del sobrenadante, indicando que ha sido unido a la resina después de la reacción durante la noche.

Las Figuras 8A y 8B son cromatogramas de HPLC de los mismos experimentos reflejados en las Figuras 7A y 7B, excepto con cuentas de resina Isco como fase sólida.

Las Figuras 9A, 9B y 9C son análisis de los productos después del paso 1 de esta figura, la unión del primer segmento peptídico desprotegido a la fase sólida. La Figura 9A es un cromatograma de HPLC analítica del corte (base más hidrazina) del péptido unido a la resina. La Figura 9B es un espectro de masas MALDI de la resina, que muestra un pico correspondiente a (1), el péptido unido a la resina. La Figura 9C es un espectro de masas MALDI después de cortar el conector, mostrando la ausencia de un pico correspondiente a (1), y mostrando que ningún péptido está pegado a la fase sólida (resina).

Las Figuras 10A, 10B y 10C son análisis de los productos después del paso 3 de esta figura, es decir, la ligación del segundo segmento peptídico desprotegido (2) al péptido unido a la resina (1). La Figura 10A es una HPLC analítica del producto, el péptido intermedio unido a la resina, que muestra un gran pico con masa de (1)+(2). La Figura 10B es un espectro de masas MALDI de la resina antes de cortar el conector, y la Figura 10C es un espectro de masas MALDI de la resina después de cortar el conector.

La Figura 11 es un cromatograma de HPLC del producto del péptido, liofilizado, desalado (1+2+3 de la Tabla 1) después de 2 ligaciones secuenciales sobre un fase sólida (resina Isco) en la dirección N- a C-terminal. El pico más alto corresponde al producto crudo liofilizado, indicando aproximadamente un rendimiento del 36%.

Las Figuras 12A y 12B sin MS ESI (espectros de masas con ionización por electrospray) del pico principal correspondiente al péptido ensamblado (1+2+3 de la Tabla 1). La Figura 12B es un presentación reconstruida del espectro de masas de la Figura 12A que muestra la masa del péptido ligado producto.

La Figura 13 es un cromatograma de HPLC del péptido liofilizado, desalado (1+2+3) después de cortar con base el conector para retirar el péptido ensamblado de la fase sólida (resina PEGA).

Las Figuras 14A y 14B son espectros de masas con ionización por electrospray del pico con masa 7434, en donde la Figura 14B es una reconstrucción del espectro de masas de la Figura 14A.

Las Figuras 15A, 15B y 15C son 3 cromatogramas de HPLC que ilustran que la técnica del soporte sólido puede usarse para ambas, la purificación y la ligación. Las Figuras 15A y 15B muestran el procesamiento en solución de un péptido crudo respectivamente antes y después de la retirada de los grupos DNP. Ambas HPLC muestran una mezcla cruda de péptidos. La Figura 15C es un cromatograma de HPLC de la misma solución de péptido mostrado en la Figura 15A después del acoplamiento a un soporte sólido, la retirada de los grupos DNP, y el corte con base de la fase sólida, que resulta en un producto de péptido ensamblado significativamente más puro.

Las Figuras 16A y 16B ilustran el esquema de reacción para la síntesis de MIF(1-115) a través de ligaciones secuenciales nativas en fase sólida en la dirección N-terminal a C-terminal.

La Figura 17A es un esquema de reacción para la modificación del segmento peptídico N-terminal. La Figura 17B es un diagrama que ilustra la modificación de la fase sólida acuosa-compatible en la preparación para el acoplamiento del primer segmento peptídico desprotegido.

La Figura 18A es un esquema de reacción para el acoplamiento de MIF(1-59) modificado de forma N-terminal a una fase sólida. La Figura 18B es un cromatograma de HPLC del péptido liberado después del corte con base, que tiene una masa esperada de 6271 Da. Las Figuras 18C y 18D son espectros de masas con electrospray del componente principal del péptido liberado después del corte del asa que puede cortarse. La Figura 18D es una reconstrucción de la Figura 18C.

La Figura 19A es un diagrama del paso de ligación para formar MIF(1-80) unido a resina. La Figura 19B es un cromatograma de HPLC de los productos después del corte del asa que puede cortarse. Las Figuras 19C y 19D son espectros de masas de los componentes principales del péptido liberado después del corte con base, que tienen una masa esperada de 8502 Da. La Figura 19D es una presentación reconstruida del espectro de masas de la Figura 19C.

La Figura 20A es un diagrama del paso de ligación para formar MIF(-115) unido a resina. La Figura 20B es un cromatograma de HPLC de los productos después del corte del asa que puede cortarse. Las Figuras 20C y 20D son espectros de masas de los productos liberados después del corte con base, que tienen una masa esperada de 12450 Da.

La Figura 21 es un diagrama esquemático de las ligaciones en fase sólida en la dirección C- a N-terminal. La "resina" representa una fase sólida. El triángulo y su pareja con forma de M puesta de lado son grupos funcionales complementarios que forman quimioselectivamente un enlace covalente. El "asa" es un asa que puede cortarse para retirar el producto de péptido ensamblado de la fase sólida. Las líneas onduladas comprenden residuos aminoácidos de los segmentos peptídicos. La "PG" representa un grupo protector, el cual puede colocarse bien son un tiol de una cadena lateral o sobre el grupo \alpha-amino de la cisteína N-terminal. Los pasos 2 y 3 pueden repetirse, tal como se indica mediante la flecha marcada 4, para segmentos peptídicos adicionales. También puede añadirse un conector que puede cortarse para los propósitos de monitorizar las reacciones de acoplamiento y ligación entre el "asa" y la "resina".

La Figura 22 es un esquema de reacción para la ligación secuencial en fase sólida en la dirección C- a N-terminal del PLA2G5.

La Figura 23 es un esquema de reacción para sintetizar un derivado de éster de Cam para la ligación secuencial en fase sólida en la dirección C- a N-terminal.

La Figura 24 es un esquema de reacción para sintetizar el segmento peptídico C-terminal para la ligación secuencial en fase sólida en la dirección C- a N-terminal.

Las Figuras 25A, B y C es un diagrama de un esquema para sintetizar un polipéptido ensamblado a través de una ligación secuencial bidireccional en fase sólida de dos o más segmentos peptídicos.

La Figura 26 son cromatogramas de HPLC a continuación de la ligación química nativa en fase sólida de 3 segmentos peptídicos en la dirección N- a C-terminal, que resulta en el péptido ensamblado, C5a 1-74.

La Figura 27 es un esquema de reacción para la síntesis de un segmento peptídico C-terminal para su uso en las ligaciones químicas nativas en fase sólida descritas en ésta, usando un éster de CAM que puede cortarse para retirar el segmento peptídico sintetizado de la fase sólida.

Las Figura 28A y B son el cromatograma de HPLC y el MS ESI reconstruido del péptido ensamblado que resulta de la ligación secuencial en fase sólida de 3 segmentos peptídicos: el segmento peptídico 1 (SEC. Nº ID.: 2) (CA
DRKNILA), el segmento peptídico 2 (SEC. Nº ID.: 3) (CYGRLEEKG) y el segmento peptídico 3 (SEC. Nº ID.: 4) (ALTKYGFYG), sobre fase sólida, en la dirección C- a N-terminal, usando grupos protectores Fmoc.

Las Figura 29A y B son el cromatograma de HPLC y el MS ESI del producto de ligación final, es decir, el primer producto de ligación ligado al tercer segmento peptídico (ALTKYGFYG), que resulta de la ligación secuencial en fase sólida de 3 segmentos peptídicos en la dirección C- a N-terminal, usando el ACM como grupo protector.

Las Figuras 30A-H son cromatogramas de HPLC y MS ESI reconstruidos de los pasos para sintetizar la Fosfolipasa A2 Grupo 5, una proteína de 118 residuos, usando la ligación química nativa secuencial en fase sólida de cuatro segmentos peptídicos en la dirección C- a N-terminal. El primer segmento peptídico es el PLA2G5 88-118; el segundo es el PLA2G5 59-87, el tercero es el PLA2G5 26-58, y el cuarto es el PLA2G5 1-25. Las Figuras 30A y B son respectivamente el cromatograma de HPLC y el MS ESI reconstruido del primer segmento peptídico. Las Figuras 30C y D son respectivamente un cromatograma y un MS ESI reconstruido del producto de ligación del primer y segundo segmentos peptídicos (PLA2G5 59-118). Las Figuras 30E y F son respectivamente un cromatograma y un MS ESI reconstruido de PLA2G5 26-118, el producto de ligación de PLA2G5 59-118 y PLA2G5 26-58 (el tercer segmento peptídico). Las Figuras 30A y B son respectivamente el cromatograma de HPLC y el MS ESI de PLA2G5 1-118, el polipéptido ensamblado.

Descripción de realizaciones específicas Terminología

Aminoácidos: los aminoácidos incluyen los 20 aminoácidos codificados genéticamente, los aminoácidos raros o inusuales que se hallan en la naturaleza, y cualquiera de los aminoácidos modificados y que no ocurren de forma natural.

Solución acuosa: soluciones que contienen agua, incluyendo hasta urea 8 M en agua, hasta guanidina\cdotHCl 8 M en agua, hasta el 60% de acetonitrilo en agua.

Péptido ensamblado: el producto final de una ligación secuencial o bidireccional en fase sólida, después de cortar el asa que puede cortarse. El péptido ensamblado comprende al menos dos segmentos peptídicos separados ligados secuencialmente sobre una fase sólida. El péptido ensamblado podría tener o podría no tener actividad biológica.

Asa que puede cortarse: un grupo que es susceptible de ser cortado selectivamente para liberar el péptido ensamblado de la fase sólida. El asa que puede cortarse deber se capaz de resistir el corte en las condiciones apropiadas para el acoplamiento, la activación, la desprotección, la ligación, el lavado, y otros pasos implicados en la formación de un péptido ensamblado. El asa que puede cortarse debe ser estable también en las condiciones usadas para producir el primer segmento peptídico que es capaz de unirse a una fase sólida, incluyendo, por ejemplo, la síntesis de péptidos paso a paso en fase sólida. El asa que puede cortarse preferiblemente está localizada directamente adyacente al primer segmento peptídico, de tal forma que, a partir del corte del asa que puede cortarse, se libera el péptido ensamblado deseado de la fase sólida. El asa que puede cortarse podría seleccionarse de entre cualquiera de la variedad de asas que pueden cortarse usadas por aquéllos en el campo. Ver, por ejemplo, L. Canne et al., Tetrahedron Letters, 38(19):3361-3364 (1997); Ball et al., J. Pept. Sci., 1:288-294 (1995); Funakoshi et al., PNAS USA, 88:6981-6985 (1991); Funakoshi et al., J. Chromatog. 638:21-27 (1995); Garcia-Echeverria et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 779-780 (1995). Un asa que puede cortarse preferida es Boc-HN- -CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-O- -CO- -ONp (Boc-HNCH2-MSC-), o un asa que puede cortarse funcionalizada, X-aminoetilsulfoniletiloxicarbonil (en donde X = CH3COCH2CH2CH2CONHCH2-MSC- o X = AOA-NHCH2-MSC-). (AOA = aminooxiacetal). Otro asa que puede cortarse preferida es un éster de CAM. Ver Ceccato, M. L. et al., Tetrahedron Lett. 31:6189-6192
(1990).

Asa que puede cortarse: un grupo que es capaz de ser cortado selectivamente para monitorizar la ligación secuencial en fase sólida usando la espectrometría de masas de muestras pequeñas de la mezcla de reacción en cualquier momento durante el procedimiento de ligación, es decir, después de ligar el segundo segmento peptídico después de ligar el tercer segmento peptídico, y así sucesivamente. El conector que puede cortarse debe ser estable en las condiciones de acoplamiento y ligación, en las condiciones de desprotección (si es necesaria), y en las condiciones de lavado. Los conectores que pueden cortarse preferidos incluyen conectores fotolábiles y conectores lábiles al TFA.

Acoplamiento: reacciones quimioselectivas que implican la unión covalente de un primer segmento peptídico a una fase sólida.

Ligación: reacciones quimioselectivas que implican la unión covalente de un segmento peptídico a un péptido unido a una fase sólida.

Conector: un enlace covalente que une varias moléculas. Por ejemplo, un conector podría unir un primer segmento peptídico y un soporte sólido, y un conector tal podría comprender opcionalmente cualquier número de grupos, incluyendo un asa que puede cortarse, un conector que puede cortarse, grupos funcionales complementarios capaces de formar quimioselectivamente un enlace covalente (por ejemplo, un amino-oxi y una cetona para formar un oxima).

Péptido: un polímero de al menos dos monómeros, en donde los monómeros son aminoácidos, a veces denominados como residuos aminoácidos, los cuales se unen juntos a través de un enlace amida. Para los propósitos de esta invención, los términos "péptido", "polipéptido", y "proteína" son mayoritariamente intercambiables, puesto que los tres tipos pueden prepararse mediante los procedimientos descritos en ésta. Los péptidos se denominan alternativamente como polipéptidos. Los aminoácidos incluyen las isoformas L y D de los aminoácidos quirales.

Segmento peptídico: un péptido o polipéptido que tiene, bien un esqueleto amida completamente nativo, o un esqueleto no natural, o una mezcla de los mismos, que oscila en tamaño desde 2 a 1000 residuos aminoácidos, preferiblemente desde 2-99 residuos aminoácidos, más preferiblemente desde 10-60 residuos aminoácidos, y lo más preferiblemente desde 20-40 residuos aminoácidos. Cada segmento peptídico puede comprender enlaces amida nativos, o cualquiera de los esqueletos peptídicos no naturales conocidos, o una mezcla de los mismos. Cada segmento peptídico puede prepararse mediante cualesquier procedimientos sintéticos, incluyendo la síntesis en solución, la síntesis paso a paso en fase sólida, la condensación de segmentos, y la condensación convergente. El segmento peptídico final a añadir para formar el producto de péptido ensamblado puede expresarse recombinantemente.

Grupo protector: grupo químico capaz de proteger un grupo funcional de la reacción con otro grupo funcional, y que puede retirarse sin dañar el aminoácido o péptido formado.

Ligación secuencial: ligar tres o más segmentos peptídicos juntos con objeto desde el extremo C-terminal al extremo N-terminal, o desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, dependiendo de la direccionalidad escogida, para obtener un producto peptídico ensamblado. La direccionalidad de las ligaciones secuenciales siempre comienza desde el primer segmento peptídico unido a la fase sólida hasta el último segmento peptídico a añadir para formar el producto peptídico ensamblado.

Fase sólida: material que tiene una superficie y el cual es sustancialmente insoluble cuando se expone a las soluciones orgánicas o acuosas usadas en las reacciones de acoplamiento, desprotección y corte. Los ejemplos de materiales de fase sólida incluyen el vidrio, los polímeros y las resinas, incluyendo la poliacrilamida, el PEG, el poliestireno PEG-A, el PEG-poliestireno, macroporosos, POROS^{TM}, la celulosa, la celulosa reconstituida (por ejemplo, Perloza), la nitrocelulosa, las membranas de nilón, las cuentas de vidrio de poro controlado, el poliestireno, el dextrano activado, la agarosa, el polietileno, los plásticos funcionalizados, el vidrio, la silicona, el aluminio, el acero, el hierro, el cobre, el níquel y el oro. Tales materiales podrían estar en forma de una bandeja, lámina, placa de petri, cuentas, apelotonados, discos, u otras formas convenientes. Pueden usarse hojas de celulosa como fase sólida en la presente invención, para conseguir la ligación en punto en una matriz espacialmente direccionable. Muchos de los ejemplos y realizaciones descritas en ésta se refieren a resinas, las cuales son un tipo de fase sólida, y alguien con formación ordinaria en la técnica entenderá que tales ejemplos no se pretende que se limiten a resinas, sino a fases sólidas en general. Los términos fase sólida y soporte sólido se usan en ésta de forma intercambiable.

Péptido unido a la fase sólida: un péptido unido a la fase sólida comprende al menos un segmento peptídico unido a una fase sólida a través cualquier variedad de conectores, asa o grupos que pueden cortarse. Un péptido unido a la fase sólida puede incluir cualquiera de los productos peptídicos intermedios de las reacciones de ligación secuencial, incluyendo el péptido final unido a fase sólida producido después de que el segmento peptídico final se ligue al penúltimo péptido unido a la fase sólida.

Tioácido: un grupo tioácido ionizable, representado bien por -COSH o -COS^{-}, que a menudo se refiere a un tioácido de péptido, representado por "péptido \alpha-COSH" o "péptido \alpha-COS^{-}".

Tioéster: un grupo representado por -COSR, a menudo conectado a un péptido. Por ejemplo, un péptido tioéster podría representarse como "péptido \alpha-COSR". El grupo R podría ser cualquier número de grupos, incluyendo alquilos funcionalizados de 1-15 C, lineales o ramificados, estructuras aromáticas de 1-15 C, aminoácidos 1-4 o derivados de los mismos, preferiblemente en donde el grupo R se selecciona de tal forma que el péptido-alfa-COSR es un tioéster activado. En una realización preferida, R = -CH3-\varnothing, -\varnothing. Comúnmente se usa el término "tioéster", pero el término IUPAC correcto es "tioloéster". Ver Matthys J. Janssen, más arriba.

I. Ligación nativa secuencial en fase sólida de segmentos de péptidos desprotegidos en la dirección N- a C-terminal

Ha habido pocos informes sobre proteínas sintetizadas mediante múltiples ligaciones secuenciales de tres o más segmentos peptídicos desprotegidos. Tales ligaciones secuenciales de segmentos peptídicos en solución requieren una purificación a continuación una purificación (por ejemplo, HPLC) después de cada ligación, y típicamente requieren la protección temporal de uno de las funcionalidades de los segmentos intermedios.

Un aspecto de la presente invención es una técnica de ligación secuencial en fase sólida que evita la necesidad de múltiples purificaciones y la necesidad de proteger temporalmente los segmentos peptídicos intermedios. Esta estrategia emplear (1) la modificación del segmento peptídico N-terminal con un asa que puede cortarse funcionalizada con un grupo capaz de reaccionar quimioselectivamente con el soporte sólido, y (2) las ligaciones químicas nativas secuenciales de segmentos peptídicos desprotegidos en una dirección N- a C-terminal. La ligación química nativa implica la reacción de un segmento peptídico desprotegido portador de un \alpha-tioéster C-terminal, con un segundo segmento peptídico desprotegido que contiene un residuo cisteína N-terminal. El intercambio del tiol rinde un intermediario unido mediante tioéster que espontáneamente se dispone de nuevo en un enlace amida en el sitio de ligación. Hemos determinado que un segmento peptídico portador de una cisteína N-terminal y un tioácido C-terminal es suficientemente estable en las condiciones de ligación nativa que no requiere la protección temporal de la funcionalidad tioácido C-terminal. En consecuencia, estos segmentos peptídicos pueden usarse como segmentos intermedios en un esquema de ligación temporal que implica tres o más segmentos peptídicos, tal como se muestra en la Figura 1. Una vez se ha ligado un segmento intermedio como éste al péptido que contiene un tioéster unido a la fase sólida para generar un tioácido de péptido unido a la fase sólida, el tioácido se convierte fácilmente en un tioéster y puede hacerse reaccionar con la cisteína N-terminal del siguiente segmento peptídico a ligarse. Alternativamente, el segmento peptídico entrante podría tener un aminoácido interno con una cadena lateral no natural portadora de grupos amino y tiol sobre átomos de carbono adyacentes, es decir, en una relación 1,2 entre ellos, y un residuo aminoácido que no es cisteína desprotegido en su extremo N-terminal, lo cual conduciría a un péptido ensamblado no lineal. Se contemplan las ligaciones múltiples de distintos segmentos peptídicos para formar un péptido ensamblado unido a la fase sólida. Una vez se han completado todas las ligaciones, se corta el conector que une el péptido unido a la fase sólida con la fase sólida, liberándose el péptido ensamblado, es decir, el péptido de longitud completa. Esta técnica se aplica a la síntesis química total de un péptido aleatorio de secuencia artificial (Tabla 1 en la Sección de Ejemplos), y un Factor Inhibidor de la Migración de Macrófagos (MIF) humano, una citoquina de 115 aminoácidos implicada en la función del sistema inmune. Ver Figuras 16-20.

A. Síntesis de péptidos

Los segmentos peptídicos se sintetizaron de forma paso a paso mediante procedimientos en fase sólida establecidos, con la ayuda de instrumentos, sobre resinas de poliestireno, usando los protocolos de neutralización in situ/activación con HBTU de la química del Boc (L. Canne et al., Tetrahedron Lett. 38:3361-3364 (1997)) sobre resinas Boc-aminoacil-OCH_{2}-PAM, resinas generadoras de tioésteres (Hojo, et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 64:111-117 (1991)), o resinas generadoras de tioácidos. Una vez completado el ensamblaje de la cadena, se desprotegieron los péptidos y simultáneamente se separaron de la resina mediante tratamiento con HF anhidro conteniendo un 5% de p-cresol, se liofilizaron, y se purificaron mediante HPLC preparativa. El segmento peptídico N-terminal se modificó antes del corte con HF tal como se esboza en la Figura 17A.

B. Preparación de la fase sólida

La fase sólida se prepara tal como se ilustra en las Figuras 5A y 5B. La Figura 5A es un esquema para preparar una resina PEGA como soporte sólido. La Figura 5B es un diagrama generalizado para la preparación de cualquier fase sólida. Se derivatizó una resina de afinidad amino-Spherilose^{TM}. (Isco) con ácido Boc-aminooxiacético tal como se muestra en la Figura 17B.

Otras resinas a usarse como la fase sólida incluyen la EAH-Sepharose (Pharmacia), la Amino-PEGA (Novabiochem), la resina CLEAR-Base (Peptides International), el vidrio con poro controlado con cadenas de alquilaminas largas (Sigma), el poliestireno HCl.PEG (PerSeptive Biosystems), la resina Lysine-Hyper-D(Biosepra), la resina ArgoGel-Base (Argonaut Technologies). Estas resinas están disponibles en forma amino-derivatizada y se convierten fácilmente a la forma amino-derivatizada.

C. Acoplamiento del segmento peptídico N-terminal modificado a la fase sólida

El péptido modificado, que contiene un grupo cetona, tal como se ilustra en la Figura 17A, se disuelve en guani-
dina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, metionina 0,15 M, pH 4,6 (1,6 mM), y se añade al soporte sólido funcionalizado con aminoxi, el cual se había lavado previamente a conciencia con el mismo tampón, y se deja reaccionar a temperatura ambiente durante la noche (Figura 16A, Paso #1).

II. Ligación en la dirección N- a C-terminal A. Reacciones de ligación

Se disolvió el segmento peptídico, que iba a ligarse al tioéster de péptido unido a la resina, en guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, metionina 0,15 M, 0,15% de tiofenol, pH 7,5 (3,7-4,0 mM), y se añadió al tioéster de péptido unido a la resina, el cual se había lavado a conciencia con el mismo tampón, y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante la noche (Figuras 16A y 16B, Pasos #2 y #4). Preferiblemente, la concentración del primer segmentos peptídico puede oscilar desde 1 hasta 150 mM; más preferiblemente desde 10-50 mM, dependiendo del segmento peptídico concreto.

Alguien con formación en la técnica entenderá que las concentraciones del primer segmento peptídico y del segundo y otros segmentos peptídicos entrantes pueden optimizarse usando experimentación rutinaria. Las concentraciones del segundo y adicionales segmentos peptídicos pueden oscilar desde 1-200 mM, más preferiblemente desde 5-100 mM, y lo más preferiblemente desde 10-59 mM, dependiendo del segmento peptídico concreto.

El exceso de primer segmento peptídico y/o el exceso de los segmentos peptídicos entrantes se pueden retirar fácilmente del péptido unido a la fase sólida mediante filtración y lavado.

B. Conversión del tioácido a tioéster usando ácido bromoacético o ácido iodoacético

El uso de ácido bromoacético o ácido iodoacético es un procedimiento mejorado para generar tioésteres péptido-\alphaCOSR a partir de tioácido péptido-\alphaCOSH. Con objeto de garantizar la solubilidad de los péptidos largos desprotegidos, se usa guanidina-HCl 6 M a cerca de pH 4. Las reacciones se llevan a cabo a cerca de pH 4. En tales condiciones, el único grupo reactivo con el ácido bromoacético o el ácido iodoacético es el tioácido. El bromuro de bencilo, un compuesto hidrofóbico, no se disuelve completamente en solución, lo que resulta en reacciones lentas y heterogéneas. Las ventajas de usar el ácido bromoacético o el ácido iodoacético son que ambos se disuelven fácilmente en guanidina-HCl 6 M (una solución acuosa) a cerca de pH 4, ambos resultan en la consecución rápida de la reacción deseada, ambos se eluyen en el volumen vacío de la típica HPLC en fase inversa, y permiten el procesamiento de grandes cantidades de segmentos peptídicos.

El tioácido del péptido unido a la resina se lava a conciencia con guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, metionina 0,15 M, pH 4,6, y se trata con una solución 50 mM de ácido bromoacético en el mismo tampón durante 15 minutos, seguidos por el lavado a conciencia con el tampón a pH 4,6 (Figura 16B, Paso #3).

C. Corte de la fase sólida

Las asas que pueden cortarse útiles en las ligaciones en la dirección N- a C-terminal deben ser capaces de ser estables respecto las condiciones de ligación, estables respecto las reacciones químicas paso a paso en fase sólida, capaces de unirse covalentemente en forma desprotegida a la fase sólida, y de ser cortadas sin dañar el polipéptido ensamblado. Cualesquiera asas que puedan cortarse que satisfagan estos requisitos pueden usarse, incluyendo, pero no limitándose a: el asa MSC, los conectores fotolábiles, los ésteres CAM (-OCHCONH-), (-O-CH2-\varnothing-SO-CH2-CO-),
(-O-CRH-CO-\varnothing-O-CH2-CO-). Por ejemplo, podría usarse (-O-CH2-\varnothing-SO-CH2-CO-) como un asa que puede cortarse en cualesquiera de las condiciones siguientes: (1) HF, DMS; (2) SciCl4, TFA; o corte con rojo de sulfóxido y TFA; (3) NaOH, agua; o (4) rojo de sulfóxido y TBAF en DMF. Ver Samamen, J. M., J. Org. Chem. 53:561 (1988). Como otro ejemplo, el (-O-CRH-CO-\varnothing-O-CH2-CO-) podría usarse como asa que puede cortarse en cualesquiera de las siguientes condiciones: (1) NaOH, agua (conector CAM); (2) ZnCH3COOH/agua; (3) fotolisis. Ver Tjoeng et al., Synthesis 897 (1981); Sheehan et al., J. Org. Chem. 38:3771 (1973); Serebryakov et al., Tetrahedron 34:345 (1978); Hendrickson et al., Tetrahedron Lett. 343 (1970); Ceccato, M.L. et al., Tetrahedron Lett. 31:6189-6192 (1990); J. Martinez et al., Tetrahedron Lett. 41:739 (1985). Alguien con formación en la técnica apreciará fácilmente la idoneidad de las asas que pueden cortarse conocidas para los propósitos descritos en ésta.

Las condiciones siguientes pueden usarse en el corte del conector para liberar el polipéptido ensamblado de la fase sólida, particularmente cuando se usa un asa MSC. Se tratan alícuotas de péptido unido a resina con guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, metionina 0,15 M, conteniendo hidrazina 200 mM, a pH aproximado de 14, durante 2 minutos, seguido por el lavado con una cantidad igual de guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, metionina 0,15 M, a pH 4,6. Los eluyentes combinados del péptido libre se analizan mediante HPLC analítica y espectrometría de masas con electrospray (Fig. 16B, Paso #5).

III. Ligaciones en fase sólida en la dirección C- a N-terminal

La discusión anterior sobre las ligaciones N- a C-terminales se aplica igual de bien a las ligaciones C- a N-terminales excepto, tal como se muestra en la Figura 23, que (1) el primer segmento peptídico se une a la fase sólida a través de su extremo C-terminal, es decir, el segmento peptídico C-terminal del polipéptido ensamblado resultante es el que se modifica con una asa que puede cortarse, y (2) los segmentos peptídicos entrantes (es decir, el segundo, tercero y adicionales) requieren de la protección temporal de su cisteína N-terminal (ver pasos 2-4). Opcionalmente, todos los residuos cisteína de los segmentos peptídicos entrantes o intermedios pueden protegerse temporalmente junto con la cisteína N-terminal.

Tal como se esbozó en el esquema (Figura 23), el segmento peptídico C-terminal portador de un asa que puede cortarse se acopla al soporte sólido mediante reacción con un grupo funcional correspondiente sobre el soporte sólido (por ejemplo, la resina), por ejemplo, a través de un enlace oxima (grupo aminooxiacetil sobre la resina y una cetona (a través del ácido levulínico) en el péptido), o a la inversa (grupo aminooxiacetil en el péptido y una cetona sobre la fase sólida.

Una vez se ha unido el primer segmento peptídico a la fase sólida, tal como se muestra en el paso 1 de la Figura 21, el segmento peptídico entrante (segundo), que comprende una Cys N-terminal protegida (PG-Cys) y un tioéster C-terminal, reacciona con la Cys N-terminal desprotegida del primer segmento peptídico unido a la resina a través de la reacción de ligación química nativa. Una vez se ha completado la ligación, se retira el grupo protector de la Cys N-terminal (paso 3 de la Figura 21), y se añade el siguiente segmento peptídico (paso 4/2 de la Figura 21). Una vez se han completado todas las ligaciones (paso 5 de la Figura 21), se corta el asa que une el péptido ligado secuencialmente a la resina, liberándose el péptido de longitud completa. Esta técnica C- a N-terminal se aplica a la síntesis química total de un péptido aleatorio con secuencia artificial, y a la fosfolipasa A2 secretora humana, grupo 5 ("PLA2G5"), un enzima de 118 aminoácidos, tal como se describe más abajo.

A. Síntesis del péptido

La síntesis del péptido para la ligación química nativa secuencial en fase sólida en la dirección C- a N-terminal es esencialmente la misma que la descrita más arriba para la ligación química nativa secuencial en fase sólida en la dirección N- a C-terminal.

Ver el Ejemplo 7 más abajo para detalles en referencia a la síntesis peptídica en fase sólida paso a paso de los segmentos peptídicos.

B. Preparación de la fase sólida

La preparación de la fase sólida para la dirección C- a N-terminal es idéntica a la descrita para la dirección N- a C-terminal.

C. Acoplamiento del segmento peptídico modificado en C-terminal a la fase sólida

Las condiciones para acoplar el segmento peptídico modificado de forma C-terminal al soporte sólido pueden ser idénticas a las esbozada para el acoplamiento del péptido modificado de forma N-terminal en las ligaciones N- a C-terminales descritas más arriba.

D. Ligación en la dirección C- a N-terminal

Las condiciones para las reacciones de ligación química nativa en la dirección de C- a N-terminal pueden ser idénticas a las esbozadas para las ligaciones de N- a C-terminal, tal como se describen más arriba, excepto que el segmento peptídico que contiene la cisteína N-terminal está unido a la fase sólida, y el segmento peptídico entrante que contiene el tioéster está en solución.

E. Grupos protectores de la cisteína y su retirada

Puede usarse cualquiera de los grupos protectores conocidos apropiados para proteger la Cys N-terminal de un segmento peptídico, a condición de que, si se usa, sea estable en las condiciones de ligación, estable en las condiciones para añadir el conector, y que puede retirarse del segmento peptídico en condiciones que no son perjudiciales para el péptido unido a la fase sólida, el conector, la resina, o el asa que puede cortarse. Los grupos protectores también deben ser estables respecto las condiciones de síntesis del péptido en fase sólida paso a paso. Un ejemplo de grupo protector es el ACM (acetamidometil), el cual proporciona protección de la cadena lateral de cisteínas (-SCH2NHCOCH3), y puede cortarse con mercurio(II)acetato u otros reactivos apropiados. El Fmoc (9Fluorenilmetilcarbamato) proporciona protección del alfa amino, puede cortarse en piperidina al 20% en DMF, y funciona bien con péptidos hidrofílicos. El DNPE (2-(2,4-dinitrifenil)etil) proporciona protección a la cadena lateral de la cisteína y se corta en piperidina al 50% en DMF. El para-nitrobencensulfonilo proporciona protección del alfa-amino y se corta en DBU 1 M/beta-mercaptoetanol 1 M en DMF. Los grupos protectores adicionales de la cisteína incluyen, pero no se limitan a, el Sulfmoc, NSC, Dde, Boc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Cys-(Mob)-OH, Boc-Cys(Fm)-OH, y Boc-Cys(DNPE)-OH, en donde Acm = acetamidometil, Mob = metoxibencil, Dnpe = 2-(2,4-dinitrofenil)etil, Fm = 9-fluorenilmetil. Ver Protective Groups in Organic Synthesis, Eds. Green, T.W. y Wuts, P.G.M., (2ª edición, 1991), particularmente las pp. 293-294, 318-319; R. Merrifield, J. Org. Chem. 43:4808-4816 (1978); V.V. Samukov et al., Tetrahedron Lett. 35:7821-7824 (1994); B.W. Bycroft et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm. 776-777 (1993); M. Royo et al., Tetrahedron Lett. 33:2391-2394 (1992); S.C. Miller, J. Am. Chem. Soc. 119:2301-2302 (1997). Ciertos grupos protectores pueden hacer insoluble los segmentos peptídicos. Por ejemplo, ciertos segmentos peptídicos hidrofóbicos pueden devenir insolubles a partir de la adición de un grupo protector. Alguien con formación ordinaria en la técnica puede discernir fácilmente la idoneidad de cualquier grupo protector para un segmento peptídico.

Retirada del Fmoc como grupo protector de Cys. Una realización implica la retirada de un grupo protector Fmoc de la Cys N-terminal de un péptido unido a fase sólida. Después de la ligación con un péptido con una Fmoc-Cys N-terminal, se lava el péptido unido a la resina con guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, metionina 0,15 M, pH 7, seguida por agua, seguida por DMF. A continuación se trata la resina con dos alícuotas de piperidina al 20% en DMF, 5 minutos cada una. Entonces se lava la resina a conciencia con DMF, seguida por agua, seguida por guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, metionina 0,15 M, pH 7.

Retirada del ACM como grupo protector de Cys. Después de la ligación con un péptido con una Cys(ACM) N-terminal, se lava el péptido unido a la resina con guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, metionina 0,15 M, pH 7, seguida por ácido acético acuoso al 3%. A continuación se trata la resina con una solución de mercurio(II)acetato en ácido acético acuoso al 3% (15 mg/ml) durante 30 minutos, seguida por lavado con ácido acético acuoso al 3%. Entonces se lava la resina con guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, metionina 0,15 M, pH 7, seguido por tratamiento con beta-mercaptoetanol al 20% en guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, metionina 0,15 M, pH 7 durante 30 minutos. La resina se lava a continuación con guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, metionina 0,15 M, pH 7.

F. Corte de la fase sólida

Se usan asas que pueden cortarse para cortar el péptido unido a la fase sólida de la fase sólida en las ligaciones en la dirección N- a C-terminal, en la dirección C- a N-terminal, y en la estrategia bidireccional (ambas, ligación N- a C-terminal y ligación C- a N-terminal). Para las ligaciones químicas nativas secuenciales en fase sólida en la dirección C- a N-terminal (y para las ligaciones bidireccionales que usan la ligación C- a N-terminal), los requisitos del asa que puede cortarse son los mismos que para aquéllas útiles en la dirección N- a C-terminal, con el requisito adicional de que el asa que puede cortarse debe ser estable en las condiciones usadas para la retirada del grupo protector de la cisteína N-terminal del péptido unido a la fase sólida.

Corte de un enlace péptido-éster CAM de la fase sólida. Se lavaron alícuotas de péptido unido a la resina con urea 8 M, NaPi 0,1 M, pH 7, seguido por el tratamiento durante 2 minutos con NaOH 0,25 N en el mismo tampón de urea 8 M (lo que resulta en un pH aproximado de 14). A continuación se lava la resina con una cantidad igual de HCl 0,25 N en el mismo tampón de urea 8 M (lo que resulta en un pH aproximado de 2), seguida por un lavado a conciencia con el tampón de urea 8 M. Los eluyentes combinados del péptido libre se analizan mediante HPLC y espectrometría de masas con electrospray.

IV. Ligación química nativa secuencial bidireccional en fase sólida

Aún otra realización de la invención se refiere a la síntesis de proteína bidireccional en fase sólida que incorpora aspecto de ambas, la síntesis de proteína en fase sólida de N- a C-terminal y de C- a N-terminal. En la estrategia bidireccional, se une un segmento peptídico, que tiene uno de los dos o ambos de una cisteína N-terminal y/o un tioéster C-terminal, a una fase sólida a través de una cadena lateral de uno de sus residuos aminoácidos. Ver las Figuras 25A, B, C. El segmento peptídico puede a continuación ligarse en cualquiera de sus extremos a un segundo segmento peptídico, seguido por la ligación en el otro extremo a un tercer segmento peptídico. En esta estrategia bidireccional, si el segmento unido a la fase sólida tiene ambos, una cisteína N-terminal protegido y un tioéster C-terminal, el segundo y tercer segmentos peptídicos pueden añadirse a ambos extremos en ligaciones subsiguientes. A continuación pueden añadirse segmentos peptídicos adicionales a cualquier extremo del péptido ligado y unido a la fase sólida. Las ligaciones en cualquier dirección se realizan usando los procedimientos descritos en ésta para las ligaciones bien en la dirección C- a N-terminal o en la dirección N- a C-terminal.

Alternativamente, el primer segmento peptídico, unido a través de sus residuos aminoácidos internos a la fase sólida, puede usarse sólo para ligaciones unidireccionales. Por ejemplo, el segmento peptídico unido a la fase sólida puede ligarse a un segundo segmento peptídico en un extremo, seguido por una o más ligaciones a péptidos adicionales. En esta realización, el segmento peptídico unido a la fase sólida puede usarse bien para las ligaciones químicas nativas secuenciales en fase sólida en la dirección C- a N-terminal, o para las ligaciones químicas nativas secuenciales en fase sólida en la dirección N- a C-terminal. En esta realización, el segmento peptídico unido a la fase sólida puede ser bidireccionalmente capaz (es decir, que tiene ambos, una cisteína N-terminal y un tioéster C-terminal) mientras que se usa para ligaciones secuenciales unidireccionales (es decir, que tiene una cisteína N-terminal protegido o un tioéster C-terminal).

El primer segmento peptídico se une a la fase sólida a través de una cadena lateral de uno de sus residuos aminoácidos, el cual se une a un asa que puede cortarse, la cual se une a la fase sólida a través de un grupo químico funcional que es capaz de formar quimioselectivamente un enlace covalente con un grupo químico funcional complementario sobre la fase sólida, tal como se ilustra en la Figura 25.

Por ejemplo, el primer segmento peptídico puede unirse a la fase sólida a través de las cadenas laterales de un una lisina, un ácido aspártico o un ácido glutámico, en cuyo caso podría usarse un asa que puede cortarse basada en funcionalidades tales como el aliloxicarbonilo (alloc) o Fmoc, es decir, que puede cortarse en condiciones ortogonales, para conectar el segmento peptídico a la fase sólida a través de la cadena lateral de su lisina, ácido aspártico o ácido glutámico. Como otro ejemplo, podría formarse un enlace oxima mediante el primer segmento peptídico y la fase sólida, en donde el primer segmento peptídico comprende bien un grupo amino-oxi o cetona funcional y quimioselectivo, y la fase sólida comprende un grupo funcional quimioselectivo complementario, tal como una cetona o amino-oxi, respectivamente.

V. Uso de conectores que pueden cortarse y espectrometría de masas para monitorizar las reacciones de ligación

Pueden usarse varios conectores que pueden cortarse para monitorizar las ligaciones secuenciales en fase sólida. Estos conectores que pueden cortarse se colocan entre la fase sólida y el primer segmento peptídico, el cual está unido covalentemente al asa que puede cortarse, por ejemplo, fase sólida-conector que puede cortarse-asa que puede cortarse-segmento peptídico. Los conectores que pueden cortarse son capaces de ser fácilmente cortados para permitir el análisis mediante espectrometría de masas de una pequeña porción de fase sólida-péptido unido para monitorizar las reacciones de acoplamiento y ligación.

Por ejemplo, cuando la fase sólida consiste en cuentas de resina, se pueden tomar unas pocas cuentas de resina de la mezcla de reacción, después de la reacción de acoplamiento o después de cada reacción de ligación, para determinar el alcance de la reacción. Los conectores que pueden cortarse particularmente preferidos incluyen los conectores que pueden cortarse fotolábiles para la espectrometría de masas MALDI, incluyendo el 3-nitro-4(metilamino)benzoil-. Ver la Figura 5A. Se retira una pequeña alícuota de la mezcla de reacción para análisis mediante MS MALDI y se seca sobre un portaobjetos en mezcla con una solución de matriz. El láser del espectrómetro de masas MALDI corta el conector fotolábil sobre la plataforma del espectrómetro de masas, permitiendo el análisis de masas de los péptidos liberados.

Otro conector que puede cortarse preferido es uno que puede cortarse mediante TFA (ácido trifluoroacético), el cual es útil para la espectrometría de masas con ionización por electrospray. Con los conectores que puede cortarse con TFA, los péptidos de cortan de la fase sólida antes de la MS ESI.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de la fase sólida para las ligaciones N- a C-terminales

La preparación de la fase sólida se ilustra esquemáticamente en la Figura 5. La fase sólida es un resina, por ejemplo, Amino PEGA (0,2-0,4 mmol/g empapada en metanol) o una resina de afinidad amino-Spherilose (15-20 Tmol/ml, 0,6-0,9 mmol/g resina seca), disponibles de Pharmacia, NovaSyn o Isco. La resina (PEGA o Isco) se lava con DMF (dimetilformamida), a continuación se lava brevemente con DIEA al 10% (diisopropil etilamina). Se usan dos lavados de 30 segundos con flujo de DMF. Se activa un conector fotocortable (PLC) (Ver la Figura 5A) con un equivalente de HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio hexafluorofosfato) y DIEA en DMF durante 5-10 minutos). El conector fotocortable activado se añade a continuación a la resina, y se deja reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas (la ninhidrina puede usarse con la Isco). Se usan dos lavados con flujo de 30 segundos de DMF, seguidos por TFA (1 minutos \times 2) y dos lavados más con flujo de 30 segundos de DMF. El resto de los pasos se indican en forma abreviada:

\bullet 10% DIEA (1 minuto \times 2)

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet adición de ácido Boc-aminooxiacético activado (activado con un equivalente de DIOC y N-hidroxisuccinimida en DMF durante 30-60 minutos)

\bullet dejar reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora (la ninhidrina puede usarse con la Isco)

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2) [la resina puede almacenarse en esta etapa]

\bullet TFA (1 minuto \times 30)

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet 10% DIEA (1 pulgada \times 2)

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet lavado a conciencia con tampón acuoso (GuHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6) (1 ml \times 5)

Ejemplo 2 Preparación del primer segmento peptídico desprotegido para las ligaciones N- a C-terminales

Los procedimientos siguientes se usan para preparar el primer segmento peptídico (N-terminal), el cual se esquematiza en las Figuras 6A, 7A y 7B.

La resina-péptido se empapa en DMF

\bullet TFA (1 minuto \times 2)

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet 10% DIEA (1 minuto \times 2)

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet adición del asa MSC en DMF

\bullet dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 hora

\bullet añadir DIEA y dejar reposar durante otra hora

\bullet usar el ensayo con ninhidrina para verificar el acoplamiento adecuado

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet TFA (1 minuto \times 2)

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet 10% DIEA (1 minuto \times 2)

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet adición de ácido levulínico activado (activado como el anhídrido simétrico con 0,5 equivalentes de DIC en DCM durante 5-10 minutos)

\bullet dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos

\bullet ensayo con ninhidrina para verificar la ligación adecuada

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet lavado a conciencia con DCM

\bullet secar en un liofilizador

\bullet corte con HF a 0ºC durante 1 hora usando p-cresol como limpiador

\bullet triturado y lavado con acetato de etilo frío

\bullet disolver en B al 50% y liofilizar

\bullet purificar mediante HPLC preparativa

TABLA 1

1

Ejemplo 3 Ligación química nativa en fase sólida de segmentos peptídicos aleatorios en solución acuosa en la dirección N- a C-terminal

Los procedimientos siguientes se usan para las ligaciones en fase sólida en la dirección de N- a C-terminal, tal como se esquematiza en la Tabla 1. Los principios generales de la ligación química nativa se describe en WO 96/34878, PCT/US95/05668, incorporadas en ésta por referencia.

Se lavó la resina con guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6 (1 ml \times 5) y se secó. El segmento peptídico modificado de forma N-terminal se disolvió en guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6, y se añadió a la resina y se dejó reposar a temperatura ambiente durante la noche. (La concentración del primer segmento peptídico es de al menos 5 mM). La mañana siguiente, se lavó la resina con guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6 (1 ml \times 5) y se secó. Se retiró una muestra de resina para su análisis mediante MS MALDI y se lavó con B al 50%, MeOH, DCM y se secó. Se retiró una muestra de resina para su corte con base y se trató con 200 \mul de guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, hidrazina 200 mM, pH aproximado de 14, durante 2 minutos y se secó, la resina se lavó con 200 \mul de guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, hidrazina 200 mM, pH aproximado de 2, y con 200 \mul de guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6, y los eluyentes combinados se trataron con TCEP antes de su inyección en HPLC.

En preparación para la adición del siguiente segmento peptídico, se lavó la resina con guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,5 (1 ml \times 5) y se secó. El segundo segmento peptídico (Cys-COOH) se disolvió en guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,5, 0,5% de tiofenol, y se añadió a la resina. Esta mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante la noche. La mañana siguiente, se lavó la resina guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6 (1 ml \times 5) y se secó. Se retiraron muestras de resina para Maldi y corte con base y se trataron como más arriba.

El péptido unido a la fase sólida se convirtió a continuación de COSH a COSaC tratando la resina con BrAcOH 50 mM en guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6, durante 15 minutos.

Se lavó la resina con guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6 (1 ml \times 5) y se secó.

En preparación para la adición del siguiente segmento peptídico, se lavó la resina con guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,5 (1 ml \times 5) y se secó. El segmento peptídico final se disolvió en guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,5, 0,5% de tiofenol, y se añadió a la resina. Esta mezcla de reacción se dejó reposar a temperatura ambiente durante la noche. La mañana siguiente, se lavó la resina guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6 (1 ml \times 5) y se secó. Se retiró una muestra de resina para monitorización mediante análisis de MS MALDI.

El péptido ensamblado se retiró de la fase sólida mediante corte con base del asa que puede cortarse de la resina restante, tal como se ha esbozado más arriba sólo que a mayor escala seguida por purificación mediante HPLC, o desalado en columna PD-10 y liofilización.

Ejemplo 4 Ligación química nativa en fase sólida de C5a(1-74) (74 aa) en la dirección de N- a C-terminal

Este ejemplo describe la ligación química nativa secuencial en fase sólida en la dirección de N- a C-terminal del C5a, el Factor de Complemento 5A. La secuencia del C5a es:

100

Este péptido se preparó usando ligación química nativa secuencial en fase sólida de 3 segmentos peptídicos: C5a(1-20), C5a(21-46), y C5a(47-74). Los procedimientos usados para sintetizar el C5a mediante ligaciones en fase sólida son idénticos a los descritos en la ligación nativa secuencial en fase sólida del MIF (Ver el Ejemplo 5).

Ejemplo 5 Ligación química nativa en fase sólida de MIF(1-115) (115 aa) en la dirección de N-terminal a C-terminal

La secuencia del MIF(1-115) es:

101

Este péptido se preparó usando ligación nativa secuencial en fase sólida de 3 segmentos peptídicos: MIF(1-59), MIF(60-80) y MIF(81-115). Ver las Figuras 16-20.

Paso #1

El primer segmento peptídico desprotegido, MIF(1-59) es acopla a una fase sólida como se ilustra en la Figura 18. Las condiciones de acoplamiento son guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, metionina 0,15 M, pH 4,6, 24 horas.

El asa MSC usada es:

\vskip1.000000\baselineskip

3

Este asa que puede cortarse se basa en el grupo protector de aminas metilsulfoniletiloxicarbonil (MSC). Se añade fácilmente al amino terminal desprotegido del péptido-resina, sobrevive a la desprotección y corte de la resina con HF, es cortado rápida y limpiamente por una base acuosa, y está diseñado con una amina protegida que puede derivatizarse con una variedad de funcionalidades.

Paso #2

El segundo segmento peptídico desprotegido (Cys60-MIF(61-80)-COSH) se liga a continuación al primer segmento peptídico desprotegido unido a la fase sólida, bajo las condiciones de guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, 0,5% de tiofenol, metionina 0,15 M, pH 7,5, 24 horas.

Paso #3

El péptido unido a la fase sólida, MIF(1-80)-COSH, se activa entonces al tioéster en las condiciones siguientes: BrCH2COOH 50 mM, guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, metionina 0,15 M, pH 4,6, 15 minutos.

Paso #4

El tercer segmento peptídico desprotegido (Cys81-MIF82-115-COOH) se liga al péptido unido a la fase sólida con guanidina\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, 0,5% de tiofenol, metionina 0,15 M, pH 7,5, 24 horas.

Paso #5

El MIF(1-115) unido a la fase sólida se corta entonces del soporte sólida mediante corte con base del asa que puede cortarse en las condiciones de corte: guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, metionina 0,15 M, hidrazina 200 mM, a pH aproximado de 14, durante 2 minutos, seguidos por guanidina\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, metionina 0,15 M, hidrazina 200 mM, a pH aproximado de 2. La masa esperada del péptido MIF(1-115) ensamblado liberado a partir del corte con base es de 12450 Da. Las Figuras 20C y 20D son espectros de masas del péptido ensamblado que tienen una masa esperada de 12450. La Figura 20D es una reconstrucción del espectro de masas de la Figura 20C. La Figura 20B es un cromatograma de HPLC del péptido ensamblado.

Ejemplo 6 Ligación química nativa en fase sólida de la Fosfolipasa A2, grupo 5(1-118) (118 aa) en la dirección de C- a N-terminal

La secuencia de la Fosfolipasa A2, grupo 5 (PLA2G5) es:

102

Este péptido se preparó usando la ligación nativa secuencial en fase sólida de 4 segmentos peptídicos: PLA2G5 (1-25), PLA2G5 (26-58), PLA2G5(59-87) y PLA2G5 (88-118). Los procedimientos usados para sintetizar el PLA2G5 mediante ligaciones en fase sólida son idénticos a los usados para sintetizar la secuencia aleatoria, usando la protección con ACM de los residuos Cys N-terminales de los segmentos intermedios, tal como se describe en el Ejemplo 9. Ver la Figura 22 para el esquema de la reacción.

El derivado éster de CAM se sintetizó e incorporó en el segmento peptídico C-terminal de acuerdo con los diagramas de las Figuras 23, 24/Figura 27.

Ejemplo 7 Preparación del segmento peptídico modificado de forma C-terminal (sobre resina de síntesis con conector CAM) (Figura 27)

La resina comercial elegida (MBHA, cualquier resina Boc-AA-OCH2-Pam) se empapa en DMF.

\bullet TFA (1 minuto \times 2) (no es necesaria si se trabaja con la resina MBHA)

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet adición de Boc-Lys(Fmoc)-OH activado (activación con HBTU/DIEA), comprobar la conclusión de la reacción después de 10-15 minutos mediante el ensayo con ninhidrina

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet TFA (1 minuto \times 2)

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet 10% DIEA in DMF (1 minuto \times 2)

\bullet adición de ácido bromoacético activado (activado como el anhídrido simétrico con 0,5 equivalentes de DIC en DCM durante 5-10 minutos), comprobar la conclusión de la reacción después de 30 minutos mediante el ensayo con ninhidrina

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet adición del primer aminoácido protegido con Boc de la secuencia (Boc-AA-OH) 2 M en DIEA al 20% en DMF. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 3 horas

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet sintetizar el resto de la secuencia mediante protocolos estándares para la química del Boc

\bullet retirar el grupo Fmoc mediante tratamiento con piperidina al 20% en DMF (5 minutos \times 2)

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet adición del ácido levulínico activado (activado como el anhídrido simétrico con 0,5 equivalentes de DIC en DCM durante 5-10 minutos), comprobar la conclusión de la reacción después de 30 minutos mediante el ensayo con ninhidrina

\bullet lavado con flujo de DMF (30 segundos \times 2)

\bullet lavado a conciencia con DCM

\bullet secado a conciencia de la resina

\bullet corte con HF a 0ºC durante 1 hora usando p-cresol como limpiador

\bullet triturado y lavado con etiléter frío.

\bullet disolver en tampón de HPLC acuoso y liofilizar

\bullet purificar mediante HPLC preparativa

Ejemplo 8 Ligación química nativa en fase sólida de segmentos peptídicos aleatorios en la dirección de C- a N-terminal usando protección con Fmoc (Ver Figura 28)

Los siguientes procedimientos pueden usarse para las ligaciones en fase sólida en la dirección de C- a N-terminal, tal como se esquematiza en la Tabla 2. Por ejemplo, puede ligarse un péptido aleatorio de ALTKYGFYGC YGR
LEEKGCA DRKNILA en tres segmentos peptídicos (en dirección de C- N-terminal): segmento 1 = CADRKNILA (aminoácidos 19-27); segmento 2 = CYGRLEEKG (aminoácidos 10-18); y segmento 3 = ALTKYGFYG (aminoácidos 1-9).

Se lava la resina con Gu\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6 (1 ml \times 5) y se drena. El segmento peptídico modificado de forma C-terminal (el primer segmento peptídico) se disuelve en Gu\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6 (primer segmento peptídico 5 mM), y se añade a la resina, y se deja reposar a temperatura ambiente durante la noche. Se lava la resina con Gu\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6 (1 ml \times 5) y se drena. Se retira una muestra para corte con base, y se trata con urea 8 M, NaPi 0,1 M, pH 7, se trata durante 2 minutos con NaOH 0,25 N en el mismo tampón de urea 8 M (lo que resulta en un pH aproximado de 14), se lava con una cantidad igual de HCl 0,25 N en el mismo tampón urea 8 M (lo que resulta en un pH aproximado de 2), y los eluyentes combinados se tratan con TCEP antes de su inyección en HPLC.

Como preparación para la adición del segmentos siguiente, se lava la resina con Gu-HCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0 (1 ml \times 5) y se drena. El segundo segmento peptídico (Fmoc-Cys-péptido-COSR) se disuelve en Gu\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0, 0,5% de tiofenol (hasta al menos de 10 mM a 50 mM del segundo segmento peptídico) y se añade a la resina. Se deja reposar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se lava la resina con Gu\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0 (1 ml \times 5), agua (1 ml \times 5), DMF (1 ml \times 5), y se retira el grupo protector Fmco mediante tratamiento con dos alícuotas de piperidina al 20% en DMF (5 minutos cada una). A continuación se lava la resina con DMF (1 ml \times 5), agua (1 ml \times 5), y Gu\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0 (1 ml \times 5). Se retira una muestra de resina y se corta la base como más arriba.

El segmento peptídico final se disuelve en Gu\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0, 0,5% de tiofenol, y se añade a la resina. Esta mezcla se deja reposar a temperatura ambiente durante la noche. A continuación se lava la resina con Gu\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0, y se retira el péptido ensamblado de la fase sólida mediante corte con base del asa que puede cortarse de la resina restante, tal como se esbozó más arriba, sólo que a mayor escala, seguida por purificación mediante HPLC o desalado en columna PD-10 y liofilización.

Estos procedimientos pueden aplicarse a la construcción de péptidos que tengan residuos cisteína.

Ejemplo 8A Ligación química nativa en fase sólida de segmentos peptídicos aleatorios en la dirección de C- a N-terminal usando protección con DNPE

El DNPE (2-(2,4-dinitrofeniletil)) es otro grupo protector de la cadena lateral de la cisteína, el cual puede usarse para las ligaciones en la dirección C- a N-terminal. Se repitió el Ejemplo 8 usando el DNPE como grupo protector. Las condiciones para la ligación química en fase sólida de segmentos peptídicos aleatorios en la dirección de C- a N-terminal fueron idénticas a aquéllas usadas en el Ejemplo 8 más arriba, excepto que en la retirada del grupo protector DNPE se usó piperidina al 50%.

Ejemplo 9 Ligación química nativa en fase sólida de segmentos peptídicos aleatorios en la dirección de C- a N-terminal usando protección con ACM

Los procedimientos siguientes se usan para las ligaciones en fase sólida en la dirección de C- a N-terminal, tal como se esquematiza en la Tabla 3. Se ligó el mismo polipéptido aleatorio descrito en el ejemplo anterior.

Se lavó la resina con Gu\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 4,6 (1 ml \times 5) y se drenó. El segmento peptídico modificado de forma C-terminal se disuelve en Gu\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6, y se añade a la resina, y se deja reposar a temperatura ambiente durante la noche. Se lava la resina con Gu\cdotHCl 6 M, acetato sódico 0,1 M, pH 4,6 (1 ml \times 5) y se drena. Se retira una muestra para corte con base, y se trata con urea 8 M, NaPi 0,1 M, pH 7, se trata durante 2 minutos con NaOH 0,25 N en el mismo tampón de urea 8 M (pH resultante \sim14), se lava con una cantidad igual de HCl 0,25 N en el mismo tampón urea 8 M (pH resultante \sim2), y los eluyentes combinados se tratan con TCEP antes de su inyección en HPLC.

Como preparación para la adición del segmentos siguiente, se lava la resina con Gu-HCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0 (1 ml \times 5) y se drena. El segundo segmento peptídico (Fmoc-Cys-péptido-COSR) se disuelve en Gu\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0, 0,5% de tiofenol (hasta al menos 10 mM del segundo segmento peptídico) y se añade a la resina. Se deja reposar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se lava la resina con Gu\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0 (1 ml \times 5), ácido acético al 3% en agua (1 ml \times 5), y se retira el grupo protector ACM mediante tratamiento con mercurio(II)acetato en ácido acético al 3% en agua (15 mg/ml) durante 30 minutos. A continuación se lava la resina con ácido acético al 3% en agua (1 ml \times 5), Gu\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0 (1 ml \times 5), y se trata con beta-mercaptoetanol al 20% en Gu\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0 durante 30 minutos, seguidos por lavado con Gu\cdotHCl 6 M, NaPi 0,1 M, pH 7,0 (1 ml \times 5). Se extrae una muestra de resina y se corta la base como más arriba.

TABLA 2

4

TABLA 3

5

Ejemplo 10 Ligación química nativa secuencial bidireccional en fase sólida

Este ejemplo ilustra una de las realizaciones de la estrategia de ligación bidireccional de proteínas en fase sólida, a saber, empezando la situación con un primer segmento peptídico unido a la fase sólida, en donde el primer segmento peptídico es una "pieza de en medio" de la proteína diana deseada, es decir, el primer segmento peptídico, unid a la fase sólida, se usa para ligaciones en ambos, su cisteína N-terminal y su tioéster C-terminal.

Empezando con una de la piezas del medio de la proteína diana, se añade un conector que puede cortarse a la cadena lateral de uno de los residuos aminoácidos de la pieza del medio. Puede usarse la cadena lateral de cualquier residuo aminoácido que tenga un grupo funcional que puede protegerse, incluyendo, preferiblemente, el ácido aspártico o el ácido glutámico. Más preferiblemente, se usa un residuo aminoácido de lisina. Por ejemplo, un éster de CAM de asa que puede cortarse, o cualquier otro grupo protector de ácido carboxílico, podría adaptarse para unir el primer segmento peptídico a la fase sólida a través de la cadena lateral del ácido aspártico o glutámico. Alguien con formación en la técnica apreciará fácilmente las reacciones químicas necesarias para completar este paso.

Por ejemplo, en la Figura 25C se ilustra la síntesis de un primer segmento peptídico a ser unido a la fase sólida a través de un aminoácido interno. Empezando con una fase sólida apropiada (generadora de tioéster o tioácido), se sintetiza el primer segmento peptídico usando los protocolos del Boc estándares hasta que se alcanza el residuo lisina elegido. Usando la química del Boc, se inserta una lisina con la amina de su cadena lateral protegida con un grupo Fmoc (Boc-Lys(Fmoc)-OH) en la ubicación apropiada durante la síntesis del péptido en fase sólida paso a paso, seguida por la síntesis continuada hasta el final del primer segmento peptídico. El grupo protector Fmoc se retira al final de la síntesis del péptido paso a paso, y el asa que puede cortarse se acopla a la amina de la cadena lateral (paso B de la Figura 25C).

Este procedimiento es más o menos el procedimiento esbozado en la Figura 24, con las siguientes diferencias: el ácido levulínico en el paso 4 se remplaza con el asa que puede cortarse, y la piperidina al 20% usada para cortar el grupo Fmoc (también parte del paso 4) se remplaza con una concentración mucho menor de una base alternativa, tal como el 1,8-Diazabiciclo[5,4,0]undec-7-ene (DBU), por ejemplo, 1-2 equivalentes de DBU en DMF. La razón es que los segmentos peptídicos del medio, con independencia de si generan tioácidos o tioésteres a partir de su corte de la resina, están conectados a la resina mediante un tioéster, el cual se cortaría en presencia de piperidina al 20%.

Para esta estrategia particular, se prefiere el asa de MSC, aunque pueden usarse otras asas que pueden cortarse. La unión de la amino de la cadena lateral de un residuo de lisina, y la modificación adicional del conector con un grupo funcional apropiado capaz de reacción con un grupo correspondiente en la resina de ligación en fase sólida, generalmente sucederá como se esboza en la Figura 17A, con la excepción de que la amina del asa de MSC debería protegerse con un Fmoc en vez de con un grupo Boc. Puesto que la unión al segmento peptídico es a través de un residuo aminoácido interno, el aminoácido N-terminal se protegería con Boc, y no es posible que el grupo amino N-terminal y el grupo amino en la asa MSC que puede cortarse estén protegidos por el mismo grupo. La retirada del grupo Fmoc del asa que puede cortarse MSC también debería realizarse con DBU en vez de con piperidina. Como en la Figura 17A, se prefiere el ácido levulínico para acoplar el conector con el correspondiente grupo aminooxiacetil sobre el soporte sólido (Fig. 17B).

A continuación se describen dos versiones del primer segmento peptídico a acoplar a la resina.

Primera versión. El primer segmento peptídico tiene una cisteína N-terminal desprotegida y un tioácido C-terminal (Figura 25A). El segundo segmento peptídico (paso 2 en la Figura 25A), a ligar al primer segmento peptídico, es un péptido con un tioéster C-terminal y opcionalmente con una cisteína N-terminal protegida (si se desean ligaciones de C- a N-terminal adicionales), en donde el tioéster C-terminal es capaz de reaccionar con la Cys N-terminal del primer segmento peptídico (es decir, en la dirección de C- a N-terminal). Este paso puede repetirse múltiples veces con segmentos peptídicos adicionales añadidos en la dirección de C- a N-terminal, si se desea, a condición de que los segmentos peptídicos entrantes internos comprendan cada uno de ellos una cisteína N-terminal protegida, la cual debe desprotegerse de acuerdo con los pasos de la ligación química nativa en fase sólida de C- a N-terminal estándar, tal como se esbozan en la Figura 21 (el segmento peptídico final a ser añadido al extremo N-terminal del producto resultante no es necesario que tenga una cisteína N-terminal). Una vez se ha completado la ligación, el tioácido C-terminal del péptido unido a la fase sólida resultante (es decir, el producto de ligación de los segmentos peptídicos primero y segundo) se convierte a continuación a un tioéster con ácido bromoacético (tal como se esboza en las ligaciones de N- a C-terminal en la Tabla 1 y se esquematiza como paso de la Figura 25A). El paso siguiente (paso 4 de la Figura 25A) comprende la ligación del péptido unido a la fase sólida a un tercer segmento peptídico con una Cys N-terminal. Este paso puede repetirse opcionalmente, para añadir segmentos peptídicos entrantes adicionales en la dirección de N- a C-terminal, si se desea, a condición de que los segmentos peptídico entrantes internos comprendan cada uno una cisteína N-terminal desprotegida y un tioácido C-terminal, con conversión del tioácido a tioéster una vez se ha completado la ligación y antes de la adición del siguiente segmento peptídico. El segmento peptídico final a añadir al extremo C-terminal del producto resultante no es necesario que tenga un tioácido C-terminal.

Alguien con formación en la técnica apreciará que pueden realizarse subsiguientemente múltiples ligaciones en ambas direcciones si se usan los grupos protectores apropiados y otras reacciones químicas apropiadas con la pieza del medio o el péptido unido a la fase sólida. Estos pasos adicionales son idénticos a las estrategias usadas para las direcciones individuales, es decir, Cys desprotegido N-terminal más tioéster C-terminal para la dirección de N- a C-, y Cys(ACM) N-terminal más tioéster C-terminal para la dirección de C- a N-terminal. Asumiendo que se use el conector MSC, el corte del producto de longitud completa de la resina se realizaría en solución básica (pH 12-14), tal como se esboza en el paso 6 de la Tabla 1. Sin embargo, la estrategia preferida es completar todos los pasos de ligación necesarios en una dirección, seguidos por los pasos de ligación en la otra dirección. Mientras el péptido unido a la fase sólida tenga, bien una cisteína N-terminal protegida o un tioácido C-terminal, las ligaciones pueden proceder en cualquier dirección a condición de que se sigan las estrategias apropiadas, tal como se describen en ésta. Si el péptido unido a la fase sólida tiene ambos, una cisteína N-terminal desprotegida y un tioéster C-terminal, cualquier intento de ligación de un segmento peptídico entrante adicional resultará en la ciclización del péptido unido a la fase sólida.

Segunda versión. La segunda versión de este esquema implica comenzar con la ligación en la dirección de N- a C-terminal, seguida por la ligación en la dirección opuesta, tal como se muestra en la Figura 25B. El primer segmento peptídico a acoplar a la resina comprende una Cys N-terminal temporalmente protegida y un tioéster C-terminal. La ligación de un segundo segmento peptídico al primer segmento peptídico sucede a continuación en la dirección de N- a C-terminal. Cualesquiera ligaciones subsiguientes en la dirección de C- a N-terminal requerirían primero la retirada del grupo protector.

Excepto por la unión del primer segmento peptídico al soporte sólido, este estrategia meramente combina los procedimientos para las ligaciones de N- a C- y de C- a N-terminal (descritos más arriba).

Referencias

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Claims

1. Procedimiento para producir un péptido ensamblado en la dirección de N-terminal a C-terminal, comprendiendo dicho procedimiento los pasos de:

a): ligar un segmento peptídico que tiene una cisteína N-terminal y un tioácido C-terminal a un segmento peptídico unido a fase sólida, que tiene un tioéster C-terminal, para formar un segmento peptídico unido a fase sólida que tiene un tioácido C-terminal; y

b): convertir dicho tioácido C-terminal de dicho péptido unido a fase sólida a un tioéster C-terminal, para formar un péptido ensamblado unido a fase sólida que tiene un tioéster C-terminal.

2. Procedimiento de la Reivindicación 1, en donde dicho segmento peptídico unido a fase sólida comprende una fase sólida unida a dicho segmento peptídico a través de un conector.

3. Procedimiento de la Reivindicación 2, en donde dicho conector es un conector que puede cortarse.

4. Procedimiento de la Reivindicación 3, el cual además comprende liberar dicho péptido ensamblado de dicha fase sólida mediante el corte de dicho conector que puede cortarse.

5. Procedimiento de la Reivindicación 1, el cual además comprende ligar dicho péptido ensamblado unido a fase sólida, que tiene un tioéster C-terminal, a un segmento peptídico que tiene una cisteína N-terminal y un grupo C-terminal distinto de un tioácido, para formar un péptido ensamblado unido a fase sólida que tiene un grupo C-terminal distinto de un tioácido.

6. Procedimiento de la Reivindicación 5, en donde dicho segmento peptídico ensamblado unido a fase sólida comprende una fase sólida unida a dicho segmento peptídico a través de un conector.

7. Procedimiento de la Reivindicación 6, en donde dicho conector es un conector que puede cortarse.

8. Procedimiento de la Reivindicación 7, el cual además comprende liberar dicho péptido ensamblado de dicha fase sólida cortando dicho conector que puede cortarse.

9. Procedimiento para producir un péptido ensamblado en la dirección C-terminal a N-terminal, comprendiendo dicho procedimiento los pasos:

a): ligar un primer segmento peptídico a un segundo segmento peptídico, teniendo dicho primer segmento peptídico una cisteína N-terminal desprotegida y un grupo C-terminal unido a una fase sólida a través de un conector añadido a dicho grupo C-terminal, y teniendo dicho segundo segmento peptídico una cisteína N-terminal protegida y un tioéster C-terminal desprotegido,

b): desproteger dicha cisteína N-terminal protegida de dicho segundo segmento peptídico; y

c): ligar un tercer segmento peptídico que tiene un tioéster C-terminal desprotegido a dicha cisteína N-terminal desprotegido de dicho segundo segmento peptídico, para producir un péptido ensamblado.

10. Procedimiento de la Reivindicación 9, en donde dicho tercer péptido comprende una cisteína N-terminal protegida, y en donde los pasos b) y c) se repiten una o más veces con uno o más segmentos peptídicos adicionales, compatibles con dicha desprotección y dicha ligación, para producir dicho péptido ensamblado.

11. Procedimiento de la Reivindicación 9, en donde dicho conector es un conector que puede cortarse.

12. Procedimiento de la Reivindicación 11, el cual comprende además liberar dicho péptido ensamblado de dicha fase sólida cortando dicho conector que puede cortarse.

13. Procedimiento de la Reivindicación 12, en donde dicho conector es un conector que puede cortarse.

14. Procedimiento de la Reivindicación 13, el cual además comprende liberar dicho péptido ensamblado de dicha fase sólida cortando dicho conector que puede cortarse.

15. Equipo para preparar polipéptidos ensamblados, que comprende:

a): un primer segmento peptídico desprotegido, que comprende un tioéster en su extremo C-terminal, y un extremo N-terminal, en donde dicho primer segmento peptídico desprotegido está unido a una fase sólida a través de un conector que comprende un grupo que puede cortarse;

b): un conjunto de segundos segmentos peptídicos desprotegidos, comprendiendo cada uno de ellos un tioácido en su extremo C-terminal y una cisteína en su extremo N-terminal, en donde cada uno de dichos segundos segmentos peptídicos desprotegidos tiene el mismo número de aminoácidos; y

c): uno o más conjuntos de diferentes segmentos peptídicos desprotegidos, comprendiendo cada uno un tioéster en su extremo C-terminal y un residuo cisteína en su extremo N-terminal, en donde cada uno de los miembros de cada conjunto tiene el mismo número de aminoácidos.

16. Equipo de la Reivindicación 15, en donde dicho conjunto de segundos segmentos peptídicos desprotegidos está compuesto por péptidos que tienen la misma longitud, pero diferentes secuencias de aminoácidos.

17. Equipo de la Reivindicación 15, en donde dicho conjunto de segundos péptidos desprotegidos consiste esencialmente en péptidos idénticos.

18. Equipo de la Reivindicación 15, en donde dichos uno o más conjuntos de péptidos desprotegidos diferentes comprende al menos un conjunto de péptidos que tienen la misma longitud, pero diferentes secuencias de aminoácidos.

19. Aparato para producir polipéptidos ensamblados, que comprende:

a): un soporte sólido, que tiene unido sobre sí un primer péptido desprotegido, que tiene un tioéster en su extremo C-terminal y un conector que puede cortarse en su extremo N-terminal, en donde dicho péptido desprotegido está unido a dicho soporte sólido a través de un conector;

b): un conjunto de segundos péptidos desprotegidos, comprendiendo cada uno un tioácido en su extremo C-terminal y un residuo cisteína en su extremo N-terminal; y

c): uno o más conjuntos de diferentes péptidos desprotegidos, comprendiendo cada uno un tioácido en su extremo C-terminal y un residuo de cisteína en su extremo N-terminal.