CN1350544A - 可溶性膜蛋白受体结构域的化学合成及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及膜蛋白受体的膜外受体结构域的化学合成以及使用所述膜蛋白受体的膜外受体结构域的组合物和方法。所述膜外受体结构域包括膜蛋白受体的可溶性配体结合胞外结构域和胞质结构域。通过在化学选择性化学连接条件下使膜蛋白受体的膜外受体结构域的第一种肽和第二种肽连接,产生本发明的膜外受体结构域,其中所述肽具有能够在它们之间形成共价健的未保护化学选择性反应性基团。使所述连接产物暴露于近似细胞膜的水－脂质界面的含有一种离液剂和一种有机溶剂的折叠缓冲液中。暴露于折叠缓冲液后,将与膜蛋白受体的配体结合的连接产物从缓冲液中分离。通过这种方法产生的连接产物的配体结合部分代表折叠膜外受体结构域。本发明例举了胰高血糖素样肽1受体的N末端结构域的全化学合成,证明了它与肽配体结合的能力,并且鉴定了它的二硫化物图谱。

Description

可溶性膜蛋白受体结构域的化学合成及应用

                        前言

                      技术领域

本发明涉及膜蛋白受体的可溶性膜外结构域的化学合成及应用。

                        背景

神经递质、肽类激素、生长因子和其它分子是调节细胞内和细胞间信号转导的细胞受体以及胞外基质的配体。大多数受体是具有胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域的膜蛋白。在接受和转导基于配体的胞外信号的情况下，这些结构域的一般简述功能如下。基于配体存在与否，胞外结构域提供接受来自细胞外信息的配体结合部位。跨膜结构域锚定质膜内的受体蛋白，使由胞外结构域接受的信息转导至胞质结构域。某些受体的跨膜结构域也可以用作配体结合部位。胞质结构域进而将在细胞外接受的信号信息转导至细胞内。从细胞内通过胞质结构域和/或跨膜结构域接受的基于配体的信息还可有助于受体介导的信号转导级联反应。

存在许多类型的细胞受体。有些受体位于调节细胞事件(例如应答激素和生长因子的新陈代谢或基因表达)变化的信号途径的中心，而另一些受体影响细胞粘附和细胞骨架的组构。影响细胞粘附和细胞骨架组构的受体家族的一个实例是整联蛋白受体家族。整联蛋白受体是负责使细胞粘附到胞外基质的主要受体。迄今已鉴定的大多数整联蛋白受体具有一个与胞外基质相互作用的胞外结构域、一个α-螺旋跨膜结构域和一个缺乏任何内在酶活性的短的胞质结构域。

调节细胞事件(例如新陈代谢或基因表达)变化的膜蛋白受体包括酶联受体。酶联受体直接偶联到胞内酶上，并且包括鸟苷酸环化酶受体、酪氨酸激酶受体、酪氨酸激酶连接的酪氨酸磷酸酶受体和丝氨酸/苏氨酸激酶受体。酶联受体的最大家族是受体蛋白-酪氨酸激酶。该家族包括表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素和许多其它生长因子的受体。大多数酶联受体具有一个N末端胞外配体结合结构域、一个跨膜α-螺旋结构域和一个具有酪氨酸激酶活性的胞质C末端结构域。配体例如生长因子与胞外结构域的结合激活胞质激酶结构域，而胞质激酶结构域进而传播胞内信号。配体与大多数酶联受体的结合诱导受体单体(例如EGF)的二聚化，而其它受体则作为二聚体存在(例如胰岛素、PDGF和NGF受体)。例如，配体与具有单体状态的受体结合使所述单体交联并且诱导二聚化。

细胞因子受体和非受体蛋白激酶代表酶联膜蛋白受体的另一个家族。该家族包括细胞因子例如白细胞介素-2和促红细胞生成素的受体以及某些多肽激素例如生长激素的受体。这些受体都具有一个N末端胞外配体结合结构域、一个跨膜α-螺旋结构域和一个胞质C末端结构域。它们与蛋白酪氨酸激酶受体不同，因为所述C末端结构域本身不具有激酶活性。而是，这些受体都通过与C末端胞质结构域连接的胞内蛋白激酶来传递配体结合信息。

细胞表面受体的最大家族通过鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(称为G蛋白)的中间作用使信号转递至胞内靶。迄今已鉴定出一千种以上的这种G蛋白偶联受体(GPCR)。GPCR的特征在于终止于胞外N末端结构域和胞内或胞质C末端结构域的七跨膜结构域。因此，GPCR还被称为“7TM”受体。可以将GPCR分为与视紫红质(A型)、降钙素(B型)和代谢受体(C型)有关的3个主要的亚家族。

膜蛋白受体的另一个家族是离子通道受体。所述离子通道受体包括配体门控离子通道和电压门控离子通道。配体门控离子通道是同源亚基的五聚体。乙酰胆碱受体是配体门控离子通道的一个实例。电压门控离子通道是具有6个跨膜螺旋的亚基的同源四聚体。钾离子通道和钠离子通道是电压门控离子通道的实例。结合配体的胞外结构域和/或胞内结构域在调节许多离子通道方面可能是重要的。

细胞膜蛋白受体代表极其重要的药物靶。例如，离子通道是许多主要人类疾病例如心脏心律失常、中风、高血压、心力衰竭、哮喘、糖尿病、胰囊性纤维化、癫痫、偏头痛和抑郁症的治疗靶。酶联受体与包括糖尿病、癌症以及血液和神经系统疾病在内的多种疾病有关。细胞因子受体是免疫系统疾病例如AID和关节炎的治疗靶。GPCR被认为是市售药物定向的最大类别的受体。例如，GPCR B型受体是介导代谢紊乱、神经系统病症、癌症和其它疾病的重要的药物靶。家族成员包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽、VIP(血管活性肠多肽)、GIP(胃肠肽)、GHRH(生长激素释放激素)、肠促胰液素、PACAP(垂体腺苷酸环化酶激活多肽)、PTH(甲状旁腺激素)、降钙素和CRF(促肾上腺皮质激素释放因子)的受体。另外，B型GPCR家族包括不同的亚型以及数种孤儿受体。

药物靶通常包括与配体结合有关的那些受体，因为可以应用调节天然配体与其受体相互作用的药物。如上所述，受体的大多数配体结合部位位于受体的膜外部分，例如胞外结构域和胞质结构域。不幸的是，关于大多数膜蛋白受体的结构活性关系和定量结构活性关系(SAR/QSAR)，包括它们的膜外结构域了解得非常少。这种信息的缺乏阻碍了新药物的开发以及对这些分子的全面了解。作为实例，虽然已经制备了GPCR的重组形式，包括分离的结构域，但是这些受体的膜外结构域的详细结构/功能信息仍不清楚。例如，看来B型GPCR的N末端膜外结构域是被六个高度保守的半胱氨酸残基形成的二硫桥高度交联。六个半胱氨酸残基中任一个的取代、用β-巯基乙醇还原受体以及N末端结构域的缺失，强烈地降低数个家族成员中相应的激素配体的结合亲和性(Wilmen等，FEBS Letters(1996)398：43-47；DeAlmeida等，Molecular Endocrinology(1998)12：750-765)。此外，在VIP受体上的定点诱变实验除鉴定出半胱氨酸以外的、在所述家族某些成员中看来对于受体活性关键的数个保守残基(Asp67、Trp72、Pro86、Gly108和Trp110)(Couvineau等，Biochem.Biophys.Res.Comm.(1995)206：246-252和Wilmen等，Peptides(1997)18：301-305)。虽然已经运用了理论模型以及体外和体内测定，但是B型GPCR的关键二硫键的二硫化物配对模式还仍然有待建立。这可能主要归因于难以生产和纯化足够量的这类研究所需材料以及所述材料的真正均质的制剂(Willshaw等，Biochemical Society Transactions(1998)26：S288和Chow等，Recept.Signal Transduct.(1997)7：143-150)。

迄今为止，膜蛋白受体的胞外结构域和胞质结构域的产生几乎限于连接至少一个跨膜锚着区的结构域的重组表达(参见，例如，Hsuesh等，WO 97/39131)。否则几乎没有产物可以产生，更不用说以可用量分离产物了。然而，不可能将受体的重组产生的结构域纯化至代表真正均质材料或不含细胞污染物的程度，无论纯化条件有多么严格和多么繁多，对于所有重组表达系统来说这都是一个难题。重组产生的受体的另一障碍是，从实用的观点来看，它们不能在所述分子内任一位置上定点标记，尤其是在与跨膜结构域分离的受体的胞质部分和胞外部分内标记。标记例如限于：将标记缀合于全长受体中仅几个氨基酸上，然后表达(参见，例如，Gether等，J.Biol.Chem.(1995)270：28268-28275和Kim等，Biochemistry(1998)37(13)：4680-4686)；在整个所述受体上加上放射性标记物或自旋标记物；或者利用非洲爪蟾属(Xenopus)卵母细胞中全长受体的体外抑制诱变(参见，例如，Turcatti等，J.Bio.Chem.(1996)271：19991-19998)。重组表达本身不能提供获得超纯以及大量超均质的功能性膜外受体结构域材料的途径。本发明解决了这些问题以及其它问题。

                    相关文献

Wilken等(Curr.Opin.Biotech.(1998)9(4)：412-426)综述了蛋白质化学合成。Turcatti等(J.Bio.Chem.(1996)271：19991-19998)公开了在体外抑制诱变非洲爪蟾属卵母细胞以将荧光标记的氨基酸引入七跨膜神经激肽-2受体中及其在卵母细胞膜中的掺入和活性。Gether等(J.Biol.Chem.(1995)270：28268-28275)公开了荧光标记β-2-促成雄性性状受体的跨膜结构域中的半胱氨酸残基。Hsuesh等(WO 97/39131)公开了通过蛋白酶切割位点偶联到G蛋白偶联受体N-末端部分的跨膜锚钩的重组表达。多种参考文献公开了GPCR N末端结构域的重组表达(Willshaw等，Biochemical Society Transactions(1998)26：S288，Wilmen等，FEBS Letters(1996)398：43-47；Chow等(Receptor SignalTransduction(1997)7：143-150；和Cao等，Biochem Biophys Res.Commun.(1995)212(2)：673-680公开了肠促胰液素/VIP N末端结构域的重组表达)。Bozon等(J.Mol.Endo.(1995)14：227)和Bobovnikova等(Endocrinology(1995)138：588)分别报道了促黄体生成激素(LH)和促甲状腺激素(TSH)受体结构域的重组表达。美国专利第5,726,290和5,837,486号公开了整联蛋白的可溶性类似物及测定。美国专利第5,783,402和5,462,856号公开了配体的基于细胞的GPCR联测定。

                      发明概述

本发明涉及膜蛋白受体的膜外受体结构域的化学合成以及使用所述膜蛋白受体的膜外受体结构域的组合物和方法。所述膜外受体结构域包括膜蛋白受体的可溶性配体结合胞外结构域和胞质结构域。通过在化学选择性化学连接条件下使膜蛋白受体的膜外受体结构域的第一种肽和第二种肽连接，产生本发明的膜外受体结构域，其中所述肽具有能够在它们之间形成共价健的未保护的化学选择性反应性基团。使连接产物暴露于近似细胞膜的水-脂质界面的含有一种离液剂和一种有机溶剂的折叠缓冲液。在暴露于折叠缓冲液之后，从缓冲液中分离与膜蛋白受体的配体结合的连接产物。通过这种方法产生的连接产物的配体结合部分代表折叠膜外受体结构域。

还提供一种包含具有化学合成区段的膜蛋白受体的合成膜外受体结构域的组合物，而所述化学合成区段在预选定残基位置上包括一个非天然氨基酸，其中所述膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域并且能够与所述膜蛋白受体的配体结合。还提供无细胞污染物的具有全合成超均一的膜蛋白受体的膜外受体结构域的组合物。

本发明还包括检测配体与膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域结合的方法。本发明的这方面涉及使膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域的单体与所述膜蛋白受体的配体接触，其中所述可溶性膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域，并且在预选定残基位置上包括一个非天然氨基酸。接触后测定所述可溶性膜外受体结构域的配体诱导的结构域单体缔合，例如二聚化。

本发明还包括测定可溶性膜外受体结构域单体的配体诱导的结构域单体缔合的方法。这种方法包括使膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域与所述膜蛋白的配体接触，其中所述可溶性膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域，并且在预选定残基位置包括一个非天然氨基酸。接触后测定所述可溶性膜外受体结构域的配体诱导的结构域单体缔合。

还提供检测配体与膜蛋白受体的膜外受体结构域结合的方法。这种方法涉及使膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域与所述膜蛋白受体的配体接触，其中所述可溶性膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域，并且包含一个具有一种可检测部分的非天然氨基酸。然后通过测定可检测部分的特性(例如当所述可检测标记是荧光团时的荧光)方面的变化进行配体结合的测定。

本发明的方法和组合物提供了前所未有地获得非限制量的超纯和超均质的膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域的方法，其中所述可溶性膜外受体结构域包括在预选位置上具有一个或更多个非天然氨基酸和/或非天然活性官能团的胞外结构域和胞质结构域。这首次促进了无杂质、跨膜区和仅通过重组合成制备的结构域其它特征的可溶性膜受体结构域的产生和真正的定点标记。本发明还提供了合成利用先前通过其它方法不能得到的结构/功能信息的方法，以及关于用于药物发现、疾病治疗和诊断方面的受体膜外结构域的新信息的发现。本发明的方法和组合物尤其可用来高通过量筛选对应于所述膜外受体结构域的受体的配体的化合物。

                         定义

氨基酸：包括在自然界发现的20种基因编码的氨基酸、稀有氨基酸或罕用氨基酸以及任何非天然存在的氨基酸和修饰氨基酸。在肽、多肽或蛋白的环境中有时称为氨基酸残基。

化学选择性化学连接：涉及(1)第一未保护氨基酸、肽或多肽与(2)第二氨基酸、肽或多肽的共价连接的化学选择性反应。可以用于连接未保护肽区段的任何化学选择性反应化学。

膜外受体结构域：位于细胞脂膜双分子层外部的膜蛋白受体的结构域。包括膜蛋白受体的胞外结构域和胞质结构域、或者能够与所述膜蛋白受体的配体结合的这些结构域的可溶性部分，例如N末端膜外结构域和C末端膜外结构域。不包括将完整膜蛋白受体锚定至所述细胞脂膜双分子层的跨越膜的跨膜结构域。可以包括跨膜结构域的一个或更多个氨基酸残基，前提是所述残基不跨越所述膜或不形成不能够与配体结合的不溶性复合体。

配体：与其细胞的靶膜蛋白受体相互作用的化学实体。

膜蛋白受体：具有至少一种能够包埋在细胞膜脂双层中并且将受体锚定在细胞膜脂膜双层的肽区段的细胞受体。作为说明但非限制性的实例包括：酶联受体，包括受体蛋白-酪氨酸激酶，例如EGF、NGF、PDGF、胰岛素和许多其它生长因子的受体；和细胞因子受体和非受体蛋白激酶，例如细胞因子诸如白细胞介素-2和促红细胞生成素的受体以及某些多肽类激素诸如生长激素的受体；G蛋白偶联受体，包括与视紫红质(A型)、降钙素(B型)和代谢受体(C型)有关的那些受体，更具体地说，包括B型受体诸如胰高血糖素、胰高血糖素样肽、VIP、GIP、GHRH、肠促胰液素、PACAP、PTH和CRF的受体；和离子通道受体，包括配体门控离子通道例如乙酰胆碱受体和电压门控离子通道例如钾离子通道和钠离子通道。

肽：具有至少两个单体的多聚体，其中所述单体是氨基酸，有时称为氨基酸残基，它们通过酰胺键连接在一起。可以具有或者完全天然的酰胺主链或者非天然的主链或其混合物。可以通过已知的合成方法进行制备，所述已知合成方法包括溶液合成、分步固相合成、链段缩合(segment condensation)和汇集缩合(convergent condensation)。可以在细胞内或在无细胞系统中进行核糖体合成，或者通过蛋白酶解较大的多肽区段而产生。可以通过化学法和核糖体法的联合进行合成。

多肽：包含三个或三个以上单体的多聚体，其中所述单体是氨基酸，有时称为氨基酸残基，它们通过酰胺键连接在一起。也称为肽或蛋白。可以包含天然酰胺键或任一已知的非天然肽主链或其混合物。大小范围为3-1000个氨基酸残基，优选3-100个氨基酸残基，更优选10-60个氨基酸残基，最优选20-50个氨基酸残基。可以通过已知合成方法制备多肽的区段或全部，所述已知合成方法包括溶液合成、分步固相合成、链段缩合和汇集缩合。也可以在细胞内或在无细胞翻译系统中通过核糖体制备多肽的区段或全部，或者通过蛋白酶解较大的多肽区段而产生多肽的区段或全部。可以通过化学法和核糖体法的联合进行合成。

蛋白质结构域：与所述分子的功能特性有关的蛋白序列内的一段连续的氨基酸残基。

可溶性膜蛋白受体结构域：在含水生理条件下是可溶的膜蛋白受体的结构域。实例包括分别位于细胞脂膜双分子层外部或内部的含水环境中的受体的胞外结构域和胞内结构域。

                     附图简述

图1为一示意图，显示在完整膜蛋白受体的环境中，G偶联蛋白受体的膜外受体结构域。

图2为一示意图，显示在完整膜蛋白受体的环境中，掺入不同非天然氨基酸的G偶联蛋白受体的膜外受体结构域。“X”代表一种标记，“Y”代表一种非天然主链，而“Z”代表一种化学手柄(handle)。

图3为一示意图，显示B型G偶联蛋白受体的N末端胞外受体结构域。

图4为一示意图，显示运用区段1(SEQ ID NO：1)、区段2(SEQ IDNO：2)和区段3(SEQ ID NO：3)的B型胰高血糖素样肽1G偶联蛋白受体(GLP-1R)的N末端胞外受体结构域的化学连接设计。

图5显示运用质谱法和高效液相层析(HPLC)监测的化学合成的GLP-1R N末端结构域的折叠。

图6A和图6B显示化学合成的GLP-1R N末端结构域的胰凝乳蛋白酶消化及二硫键的作图。

图7显示化学合成的GLP-1R N末端结构域(SEQ ID NO：4)的二硫键图谱。

图8A和图8B显示罗丹明标记的GLP配体与GLP-1RN末端结构域的结合以及所述结合事件的荧光各向异性测量。

                 具体实施方案的描述

本发明涉及膜蛋白受体的胞外受体结构域的化学合成、以及使用所述膜蛋白受体的胞外受体结构域的组合物和方法。所述膜外受体结构域包括膜蛋白受体的可溶性配体结合胞外结构域和胞内结构域。通过首先选择用于合成的目标结构域，产生本发明的膜外受体结构域。然后利用所述结构域的氨基酸序列信息设计用于化学连接的肽区段或多肽区段。然后构建所选定的膜外受体结构域的肽区段，以便具有在适合于所选定化学连接方法的条件下接触时在所述肽区段之间能够形成共价键的未保护的化学选择性反应性基团。然后通过化学选择性化学连接，使所述肽区段共价连接。然后将通过化学连接肽区段形成的连接产物暴露于折叠缓冲液中，以产生折叠连接产物。所述折叠缓冲液含有模拟细胞膜的水-脂质界面环境的至少一种离液剂和一种有机溶剂。在暴露于折叠缓冲液后，从缓冲液中分离所述膜蛋白受体的配体(例如所述受体的天然配体)结合的连接产物。通过这种方法产生的连接产物的配体结合部分代表折叠膜外受体结构域。

通过对待合成的受体或结构域的鉴定并且搜索氨基酸序列信息(例如从私人或公共数据库)，可以完成膜外受体结构域的选择。可用于此目的的公共可利用的数据库的实例包括例如GenBank(Benson等，Nucleic Acids Res.(1998)26(1)：1-7)：USA National Center forBiotechnology Information.National Library of Medicine(NationalInstitutes of Health.Bethesda，MD.USA)；TIGR数据库(The Institute forGenomic Research，Rockville，MD.USA)；蛋白质数据库(Protein DataBank)(Brookhaven National Laboratory，USA)；和ExPASy和Swiss蛋白质数据库(Swiss Institute of Bioinformatics，Geneva，Switzerland)。或者，采用标准生物化学和/或分子生物学技术，例如根据本领域众所周知的方法进行克隆和测序，可以重新获得所述氨基酸序列信息。当一种选定受体序列的一个或多个靶膜外结构域还没有被确定时，则可以用本领域已知的各种经验法则、筛选和/或建模技术鉴定推定的结构域。实例包括序列同源性比较和适用于此目的的本领域已知的算法和蛋白质建模工具的应用。可以将例如诱变技术、热力学技术、计算技术、建模技术和/或任一揭示有关目的靶多肽功能信息和/或结构信息的技术应用于本过程中。这些技术包括免疫分析和层析分析、荧光共振能量转移(FRET)、圆二色性(CD)、核磁共振(NRM)、电子和x-射线晶体学、电子显微镜术、激光拉曼光谱学等等，所述技术通常用来设计和表征膜多肽系统。(参见，例如，Newman，R.，Methods Mol.Biol.(1996)56：365-387；Muller等，J.Struct.Biol.(1997)119(2)：149-157；Fleming等，J.Mol.Biol.(1997)272：266-27；Haltia等，Biochemistry(1994)33(32)：9731-9740.5；Swords等，Biochem.J.(1993)289(1)：215-219；Wallin等，Protein Sci.(1997)6(4)：808-815；Goormaghtigh等，SubcellBiochem.(1994)23：405-450)。Muller等，Biophys.J.(1996)70(4)：1796-1802；Sami等，Biochim Biophys Acta.(1992)1105(1)：148-154。Wang等，J.Mol.Biol.(1994)237(1)：1-4；Watts等，Mol.Membr.Biol.(1995)12(3)：233-246；Bloom，M.，Biophys.J.(1995)69(5)：1631-1632和Gutierrez-Merino等，Biochem Soc.Trans.(1994)22(3)：784-788)。

由于大多数受体通常根据其特征性跨膜结构域进行鉴定，所以这些区可以用作鉴定可能存在于细胞膜外部的非跨膜区段的参比对照。具体地说，采用标准技术可以获得结构和功能的信息，所述标准技术包括与其它具有相似氨基酸序列和结构域的膜蛋白受体、最好是其它已知至少某些结构和功能信息的受体进行同源性比较。关于具有已知三维结构的膜蛋白受体的范例表，参见Preusch等，Nature Struct.Biol.(1998)5：12-14。

也可以使用建模程序鉴定推定的跨膜区段，并由此鉴定推定的膜外结构域。例如，根据统计分析SwissProt数据库中现有的跨膜蛋白数据库，可以用程序“TmPred”和“TopPredII”作跨越膜的区域及其方向的预测。(von Heijne，J.Mol.Biol.(1992)225：487-494；Hoppe-Seyler，Biol.Chem.(1993)347：166和Claros等，Comput.Appl. Biosci.(1994)10(6)：685-686)。可以使用其它程序，包括：“DAS”(Cserzo等，Prot.Eng.(1997)10(6)：673-676)；“PHDhtm”(Rost等，Protein Science(1995)4：521-533)；和“SOSUI”(Mitaku Laboratory，Department of Biotechnology，Tokyo University of Agriculture and Technology)。

也可以对靶受体进行三维建模，以鉴定其中推定的膜外受体结构域。首先，确立待建模的多肽和已知结构的多肽之间的序列对比。其次，根据这种序列对比，产生主链结构。这通常是最具同源性结构的主链，但是也可以使用杂种主链。第三，然后将侧链置于所述模型中。可以使用各种技术如Monte Carlo方法、树搜索算法(tree searchingalgorithms)等，进行具有多种可能构象的旋转构象(rotomer)侧链的建模。如果待建模的多肽相对于所述已知结构具有插入或缺失片段，则将环再建模或从头建模。通常用所述结构中具有相似锚定点的环的数据库搜索来构建这些环，但是也可以使用基于能量的从头建模技术。然后通常用能量最低化、有时联合分子动力学来优化最终结构。然后评估所述模型的质量，包括目测检查，以确定所述模型的结构方面与已知的所述分子的功能方面不矛盾。

最好是运用适于膜多肽建模的计算机程序产生所述三维模型。(Vriend，“GPCR的分子建模(Molecular Modeling of GPCRs)”，7TM(1995)第5卷)。适用于此目的的计算机程序的实例包括：“WhatIf”(Vriend，J.Mol.Graph.(1990)8：52-56；可得自EMBL，Meyerhofstrasse1.69117 Heidelberg，Germany)和“Swiss-Model”(Peitsch等，(1996)“G蛋白偶联受体的分子建模(Molecular modeling of G-protein coupledreceptors)”，G Protein-coupled Receptors.New opportunities forcommercial development，6：6.29-6.37，N Mulford和LM Savage编著，IBCBiomedical Library Series；Peitsch等，Receptors and Channels(1996)4：161-164；Peitsch等，“大规模蛋白质比较建模(Large-scale comparativeprotein modeling)”，Proteome research：new frontiers in functionalgenomics”，第177-186页，Wilkins MR，Williams KL，Appel RO，Hochstrasser DF编著，Springer，1997)。

然后使用选定的膜外结构域的氨基酸序列信息，设计用于化学连接的肽或多肽区段，其中化学合成-即通过无核糖体合成至少一种用于连接的肽。在开发连接策略方面，设计肽区段以提供选择性反应以在连接位点(也称为化学选择性连接位点)产生共价键的未保护的反应性基团。因此，按照选定的连接化学或一种以上的单个连接化学设计所述肽，前提是在任何给出的合成步骤中用于连接的目标区段提供匹配的化学选择性连接组分配对，以在化学选择性化学连接时形成所需的共价键，这避免了不想要的副反应。

具体地说，根据选择用来将肽或多肽区段以其所需方向共价连接在一起的连接化学，设计所述肽或多肽区段及其化学选择性反应性基团。按照本发明的方法，可以使用任何数目的连接化学。这些化学包括但不限于天然化学连接(Dawson等，Science(1994)266：776-779；Kent等，WO 96/34878)、推广的普通化学连接(Kent等，WO 98/28434)、形成肟的化学连接(Rose等，J.Amer.Chem.Soc.(1994)116：30-33)、形成硫酯的连接(Schnlzer等，Science(1992)256：221-225)、形成硫醚的连接(Englebretsen等，Tet.Letts.(1995)36(48)：8871-8874)、形成腙的连接(Gaertner等，Bioconj.Chem.(1994)5(4)：333-338)、形成噻唑烷的连接和形成噁唑烷的连接(Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)：9184-9189；Tam等，WO 95/00846)。

作为实例，对于天然化学连接，用于连接的连接组分区段包含匹配的天然化学连接组分配对，其中所述组分之一提供一个具有未保护氨基的半胱氨酸，而另一组分提供一个具有未保护α-硫酯基的氨基酸。这些基团能够进行化学反应，以在连接位点产生一个天然的肽键。对于形成肟的化学连接，肽区段包含匹配的形成肟的化学连接组分配对，其中所述组分之一提供一个具有醛或酮部分的未保护氨基酸，而另一组分提供一个具有氨基-氧基部分的未保护氨基酸。这些基团能够进行化学反应，以产生在连接位点具有肟部分的连接产物。对于形成硫酯的化学连接，连接区段包含匹配的形成硫酯的化学连接组分配对，其中所述组分之一提供一个具有卤乙酰基部分的未保护氨基酸，而另一组分提供一个具有α-硫代羧酸酯部分的未保护氨基酸。这些基团能够进行化学反应，以产生在连接位点具有硫酯部分的连接产物。对于形成硫醚的化学连接，连接组分包含匹配的形成硫醚的化学连接组分配对，其中所述组分之一提供一个具有卤乙酰基部分的未保护氨基酸，而另一组分提供一个具有烷基硫醇部分的未保护氨基酸。这些基团能够进行化学反应，以产生在连接位点具有硫醚部分的连接产物。关于形成腙的化学连接，连接组分包含匹配的形成腙的化学连接组分配对，其中所述组分之一提供一个具有醛或酮部分的未保护氨基酸，而另一组分提供一个具有肼部分的未保护氨基酸。这些基团能够进行化学反应，以产生在连接位点具有腙部分的连接产物。对于形成噻唑烷的化学连接，连接组分包含匹配的形成噻唑烷的化学连接组分配对，其中所述组分之一提供一个具有1-氨基、2-硫醇部分的未保护氨基酸，而另一组分提供一个具有醛或酮部分的未保护氨基酸。这些基团能够进行化学反应，以产生在连接位点具有噻唑烷部分的连接产物。对于形成噁唑烷的化学连接，连接组分包含匹配的形成噁唑烷的化学连接组分配对，其中所述组分之一提供一个具有1-氨基、2-羟基部分的未保护氨基酸，而另一组分提供一个具有醛或酮部分的未保护氨基酸。这些基团能够进行化学反应，以产生在连接位点具有噁唑烷部分的连接产物。

其它设计的考虑包括连接位点的唯一性、连接组分的溶解性以及连接反应的特异性和完全性。具体地说，最好设计连接组分配对，以使连接反应的选择性最大化。这包括设计可以用于产生化学选择性反应性基团或用于有助于连接组分的溶解性的接头或加帽序列。通过二维或三维建模，可以选择连接组分及其互补配对组分，以模拟所连接的产物和/或预连接反应组分。可以将如上所述的建模程序用于此目的。

当设计一种更小的膜外受体结构域时，可以化学合成所有的肽，并将其用于全化学合成和连接。这包括例如大小范围至多约200-250个氨基酸的结构域。也可以将这些全合成结构域连接在一起，形成甚至更大的全合成结构域。由于使用化学合成，所以化学合成的肽或多肽可以是线性、环状或分支的，并且通常由20种基因编码的L-氨基酸组成，但不限于由20种基因编码的L-氨基酸组成。化学合成方法也允许加入新的或罕用的化学部分，包括D-氨基酸、其它非天然氨基酸；取代正常的酰胺键的肟、腙、醚、噻唑烷、噁唑烷、酯或烷基主链键以；N-烷基取代基或C-烷基取代基、侧链修饰物和限制因素例如二硫桥和侧链酰胺键或酯键。参见，例如，Wilken等(Curr.Opin.Biotech.(1998)9(4)：412-426)综述了各种用于化学合成肽和多肽的化学法。

例如，具有天然肽主链结构的多肽的天然化学连接和合成公开于Kent等WO 96/34878。也参见Dawson等(Science(1994)266：77-779)和Tam等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：12485-12489)。也可以用已知方法制备非天然的肽主链(参见，例如，Schnolzer等，Science(1992)256：221-225；Rose等，J.Am Chem.Soc.(1994)116：30-34；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91：6584-6588；Englebretsen等，Tet.Letts.(1995)36(48)：8871-8874；Gaertner等，Bioconj.Chem.(1994)5(4)：333-338；Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)：9184-9189和Tam等，WO 95/00846)。也可以如Kent等，WO 98/28434中公开的推广的普通化学连接法和合成法。

另外，Canne等WO 98/56807描述了采用固相载体通过三个或三个以上未保护肽区段的化学连接快速合成装配的多肽的方法，其中在所述肽区段上的活性官能团都不需要由保护基团暂时保护，这提高了产量并且有助于中间产物的处理。简而言之，这种方法涉及将肽区段以N末端至C末端方向进行固相顺序化学连接，带有C末端α-硫酯的第一固相结合的未保护肽区段与另一含有N末端半胱氨酸和C末端硫羰酸的未保护肽区段反应。所述技术也允许以C末端至N末端方向进行固相天然化学连接。通过在固相载体上在水溶液中化学连接肽区段，也可以合成大的多肽，而无需在肽区段上用保护基团。各种各样的肽合成仪是市售的，用于不连续流动操作和连续流动操作以及用于同一轮内的多种肽的合成，并且是容易自动化的。

对于较大的膜外受体结构域，可能需要化学合成一种或更多种较小的肽或多肽区段，所述较小的肽或多肽区段在一个所选末端加入具有一个选定反应性基团(R1)的非天然氨基酸或修饰氨基酸，并且使用一种或更多种包括具有一个选定反应性基团(R2)的末端氨基酸的重组产生的多肽区段，其中R1和R2代表匹配的化学选择性反应基团。一个实例是天然化学连接的应用，其中提供具有末端半胱氨酸残基(R2)的重组区段，所述末端半胱氨酸能够化学选择性连接到由化学合成的肽区段的选定反应性基团(R1)提供的硫酯上。

某些用于膜蛋白受体多肽的克隆、表达和回收的常用宿主细胞系统包括大肠杆菌、非洲爪蟾属卵母细胞、杆状病毒、痘苗病毒和酵母以及许多高等真核生物，包括培养物中和完整动物和植物中的转基因细胞。(参见，例如，G.W.Gould，“Membrane Protein Expression Systems：A User’s Guide，”Portlad Press，1994，Rocky S.Tuan编著和“Recombinant Gene Expression Protocols，”Humana Press，1996)。例如，酵母表达系统是众所周知的并且可以根据标准方法用于表达和回收目的靶膜蛋白受体多肽。(参见，例如，Nekrasova等，Eur.J.Biochem.(1996)238：28-37；Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185(1991)；Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts CRC Press，Inc.(1992)；Herescovics等，FASEB(1993)7：540-550；Larriba，G.Yeast(1993)9：441-463；Buckholz，R.G.，Curr.Opinion Biotech.(1993)4：538-542；Asenjo等，“An Expert System for Selection and Synthesis of ProteinPurification Processes Frontiers in Bioprocessing II”第358-379页，American Chemical Society，(1992)；Mackett，M，“Expression ofMembrane Preteins in Yeast Membrane Protein Expression Systems：AUsers Guide”第177-218页，Portland Press(1995))。

也可以将切割位点适当地放置在用于连接的区段中，使得切割产生用于连接的所需末端基团。某些经常遇到的蛋白酶切割位点是凝血酶(KeyValProArg/GlySer)；因子Xa蛋白酶(IleGluGlyArg)；肠激酶(AspAspAspAspLys)；rTEV(GluAsnLeuTyrPheGln/Gly)，它是来自于烟草蚀刻病毒的重组内肽酶；以及3C人鼻病毒蛋白酶(LeuGluValLeuPheGln/GlyPro)(Pharmacia Biotech)。

多种化学切割位点也是已知的并且包括但不限于intein蛋白剪接元件(Dalgaard等，Nucleic Acids Res.(1997)25(6)：4626-4638)和溴化氰切割位点。可以构建Intein，它在任一剪接点不能剪接肽键，而是切割肽键(Xu等，EMBO J.(1996)15(19)：5146-5153和Chong等，J.Biol.Chem.(1996)271：22159-22168)。例如，可以修饰衍生自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)VMA1基因的intein序列，使得在低温下在硫醇(例如1，4-二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇或半胱氨酸)存在下，它在其N末端进行自切割反应(Chong等，Gene(1997)192：271-281)。

溴化氰(CnBr)在多肽序列的内部甲硫氨酸(Met)残基处切割。用CnBr切割产生两个或两个以上片段，所述片段含有具有活化α-羧基官能团的原始多肽序列内部的C末端残基，例如在内部Met残基上的溴化氰切割，得到具有C末端高丝氨酸内酯的片段。对于某些多肽，所述片段将在折叠条件下再缔合，产生促进所述区段间反应的折叠多肽样结构，得到合理得率(通常40-60％)的全长多肽链(现在已含有高丝氨酸残基，其中Met残基已经过溴化氰切割)(Woods等，J.Biol.Chem.，(1996)，271：32008-32015)。

一般而言，通常选择适合于所需化学连接化学的用于产生连接位点的切割位点是唯一的，即它在靶多肽中只出现一次。然而，当在由同一切割试剂识别和切割的靶多肽中存在一个以上的切割位点时，必要时，在合成过程中，可以将一个或更多个这样的位点永久封闭或暂时封闭以防所述切割试剂触及和/或将所述位点去除。通过取代、插入或缺失切割试剂识别序列的一个或更多个残基和/或掺入达到相同结果的一个或更多个非天然氨基酸，可以在给定的肽区段的合成过程中去除多个切割位点(参见图1和图2)。也可以用与所述肽结合的因子(包括结合所述肽的配体和去除全部或部分切割位点的可及性的配体)，将切割位点封闭。然而，封闭或去除切割位点，本领域技术人员会认识到，选择所述方法，使得在切割时肽或多肽能够化学选择性地化学连接至目的靶连接组分。

也可以选择含有有利于和/或易于纯化和/或检测的连接组分。例如，与亲和基质结合的纯化手柄或标志可以用于此目的(参见图1和图2)。许多这样的部分是已知的并且可以通过合成后化学修饰和/或在合程过程中引入(参见，例如，Protein Purification Protocols，(1996)，Doonan编著，Humana Press Inc.；Schriemer等，Anal Chem.(1998)70(8)：1569-1575；Evangelista等，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.(1997)699(1-2)：383-401；Kaufmann，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.(1997)699(1-2)：347-369；Nilsson等，Protein Expr.Purif.(1997)11(1)：1-16；Lanfermeijer等，Protein Expr.Purif.(1998)12(1)：29-37)。例如，可以在合成过程中掺入一个或更多个具有可以产生可用于纯化的特定特性的化学部分的非天然氨基酸。也可以通过重组DNA技术掺入纯化序列。在某些情况下，根据所述标志和最终用途，可能需要包括去除所述标志的化学切割位点或蛋白酶切割位点。为了易于检测，还可以使用非天然氨基酸或化学修饰氨基酸，例如掺入可通过荧光光谱法、免疫测定和/或MALDI质谱法检测的生色团、半抗原或生物素酰化部分。

因此，用于连接的一个或更多个肽或多肽可以是(1)全合成的，即完全通过无核糖体的化学合成产生的；(2)半合成的，即至少部分使用核糖体合成产生的，例如通过重组DNA技术；或(3)天然的，即完全通过核糖体合成产生的。因此，本发明的膜外受体结构域可以是全合成的或半合成的，并且可以包括在预选定残基位置上掺入的一个或更多个非天然氨基酸，如图1和图2中所示。

一旦设计出膜外受体结构域并且制备出连接组分，就可以在对应于由所述设计赋予的所选连接化学的合适化学连接条件下连接所述区段。正如人们可以认识到的，选择用于给定连接化学的反应条件，以保持连接组分的所需相互作用。例如，可以改变pH和温度、和加溶试剂以使连接最优化。添加或去除在不同程度上溶解连接组分的试剂还可以用来控制所需连接反应的特异性和速度。通过与一个或更多个内对照和/或外对照比较，测定所需化学选择性反应产物，可以容易地确定出反应条件。

通过任何数目的方法，包括免疫测定、荧光光谱法、凝胶电泳、采用或者反相或者离子交换柱的HPLC、氨基酸分析、质谱法、晶体学、NMR等等，可以证实所需连接产物的结构均一性和结构同一性。通过用或者化学法(Edman化学法)或者串联质谱法测序，可以鉴定氨基酸修饰、插入和/或缺失(如果存在的话)的位置。

对于折叠，在适合于上述连接产物的pH下，将连接产物溶于含有加溶量离液剂的水溶液中。适合于此目的离液剂包括例如脲和氯化鈲。为了最佳溶解连接产物，可以调节离液剂的浓度和溶液的pH，但是是在不损伤蛋白质的范围内进行。当半胱氨酸存在于连接产物中时，可以使用二硫化物还原剂例如二硫苏糖醇。然后通过与折叠缓冲液混合，稀释含有溶解的连接产物的溶液。所述折叠缓冲液包括一种缓冲剂、一种离液剂和一种有机溶剂，它们以模拟细胞膜的水-脂质界面的量进行混合。缓冲剂是众所周知的并且包括盐，例如Tris和Mops。选择用于折叠缓冲液的有机溶剂，以具有与水形成氢键的一个化学部分和提拱一个脂族部分的另一个化学基团。优选的有机溶剂是水溶性的。水溶性有机溶剂的实例包括一元醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇和烯丙醇。也可以使用二元醇和三元醇，例如乙二醇、丙二醇、三甲基二醇和丙三醇。优选的用于本发明方法中的水溶性有机溶剂是甲醇和丙三醇，而最优选的是甲醇。人们将认识到，使蛋白质变性的有机溶剂和其它折叠缓冲液组分应避免使用，或者是以非变性量存在。人们还将认识到，为了折叠可以使用一种或更多种离液剂、有机溶剂等。可以包括其它添加剂，例如去污剂、脂质等。这包括陪伴蛋白。而且，可以使用所述折叠缓冲液以在灌注器中折叠所述连接产物，例如按照Altamirano等(Nature Biotechnology(1999)17：187-191)描述的氧化重折叠层析法，所述方法采用一种固定化陪伴蛋白系统。所述连接缓冲液也可以包括添加剂，例如还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽，例如，当形成二硫键的半胱氨酸存在时。人们还会认识到，对于特定连接产物，可以确定用于本发明方法的折叠缓冲液中的实际组分及其比例，然后按需进行调节。将连接产物在折叠缓冲液中暴露足以发生折叠的时间，可以通过任何数目的上述的和本领域已知的许多标准技术进行监测。一种优选的监测方法是液相层析，例如HPLC，也可以在监测的同时进行折叠产物的分离。通过任何数目的非变性层析技术分离折叠产物，然后测定衍生所述膜外受体结构域的膜蛋白的配体的结合。本领域已知的测定和/或本文中描述的测定可以用于此目的。然后，将与配体结合的折叠产物分类为折叠膜外受体结构域。然后可以将所述折叠连接产物立即使用或以未折叠形式或折叠形式贮藏以备以后使用。

在本发明的另一个实施方案中，提供按照本发明的方法产生的组合物。本发明的一种组合物包括具有化学合成区段的膜蛋白受体的合成膜外受体结构域，所述化学合成区段在预选定残基位置上包括一个非天然氨基酸，其中所述膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域并且能够与所述膜蛋白受体的配体结合。本发明的组合物还包括无细胞污染物的膜蛋白受体的全合成和超均一的膜外受体结构域。本发明组合物的膜外受体结构域可以包含一个或更多个合成区段，所述合成区段包括基因编码的L-氨基酸、线性氨基酸、环状氨基酸或分支氨基酸、D-氨基酸、其它非天然氨基酸、以及取代正常的酰胺键的肟、腙、醚、噻唑烷、噁唑烷、酯或烷基主链键、N-烷基取代基或C-烷基取代基、侧链修饰以及限制因素例如二硫桥和侧链酰胺键或酯键。

优选的非天然氨基酸是具有可检测标记的氨基酸。在这一实施方案中，使用化学合成在预连接组分中掺入至少一种可检测标记。这样可以设计所产生的连接产物，以在预选定的特定位置上含有一种或更多种可检测标记。特别关注可用NMR检测的同位素标记。还尤其感兴趣的是在目的靶连接组分中的一个或更多个特定位点上掺入一个或更多个包含一种可检测标记的非天然氨基酸。所谓非天然氨基酸是指任何非基因编码的L-氨基酸和D-氨基酸，对其进行修饰以含有一种可检测标记，例如光活化基团以及包括荧光团和其它染料的生色团或者半抗原例如生物素。包含生色团的非天然氨基酸以及用来将所述非天然氨基酸掺入到肽或多肽序列中的化学合成技术是众所周知的，并且可以用于此目的。例如，可以方便地将荧光团与结合树脂的肽缀合，然后去除其它保护基团并从所述树脂释放标记的肽。荧光素、伊红、Oregon绿、罗丹明绿、Rhodol绿、四甲基罗丹明、罗丹明红、德克萨斯红、香豆素和NBD荧光团、dabcyl生色团和生物素对氟化氢(HF)以及对于大多数其它酸都是相当稳定的，因此适于通过固相合成进行掺入(Peled等，Biochemistry(1994)33：7211；Ben-Efraim等，Biochemistry(1994)33：6966)。运用FMOC化学(Strahilevitz等，Biochemistry(1994)33：10951)，除香豆素外，这些荧光团对用来去保护所合成肽的试剂也是稳定的。ε-dabcyl-L-赖氨酸的t-BOC和α-FMOC衍生物也可用于在多肽序列中的选定位点上掺入dabcyl生色团。dabcyl生色团具有广谱的可见光吸收并且可用作猝灭基团。通过使用dabcyl琥珀酰亚胺酯，在N末端也可以掺入dabcyl基团(Maggiora等，J.Med.Chem.(1992)35：3727)。在FRET实验中，EDANS是一种用于与dabcyl猝灭剂配对的常用荧光团。在自动合成肽过程中，通过使用5-((2-(t-BOC)-γ-谷氨酰基氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸，该荧光团被方便地引入(Maggiora等，参见上文)。在化学合成过程中，α-(t-BOC)-ε-丹磺酰-L-赖氨酸可以用来将丹磺酰荧光团掺入到多肽中(Gauthier等，Arch Biochem Biophys(1993)306：304)。如同EDANS一样，这种荧光团的荧光重叠dabcyl的吸收。采用生物胞素的t-BOC-保护衍生物(Geahlen等，Anal.Biochem.(1992)202：68)，或者其它众所周知生物素酰化衍生物例如HNS-生物素等，可以达到肽的定点生物素酰化。在t-BOC或FMOC保护后，也可以将外消旋二苯甲酮苯丙氨酸类似物掺入到肽中(Jiang等，Intl.J.Peptide Prot.Res.(1995)45：106)。可以在HPLC纯化所述产物期间，完成非对映体的拆分；未保护的二苯甲酮也可通过本领域的标准技术进行拆分。用于肟偶联的带有酮的氨基酸、氮杂/羟基色氨酸、biotyl-赖氨酸和D-氨基酸是其中可以使用的非天然氨基酸的实例。人们将认识到，根据本领域的标准技术，通过委托合成可以制备用于自动肽合成的其它保护氨基酸。

人们将认识到，可以将其它可检测标记掺入到化学连接后的连接组分中，尽管是不大优选的。这可以采用与靶分子的反应性基团结合后立即形成共价键的反应性物质通过化学修饰来进行。例如，肽或多肽连接组分可以包括适于通过化学修饰偶联可检测标记的数个反应性基团或经修饰以具有反应性的基团，例如硫羟基、醛基、氨基(Lundblad等，载于“Chemical Reagents for Protein Modification”，CRC Press，BocaRaton，FL，(1984))。定点诱变和/或化学合成也可以用于引入这样的基团和/或从所需位置缺失这样的基团。包括生物素-抗生物素或链霉抗生物素蛋白系统的生物素酰化探针、抗体、抗体片段、糖结合结构域、包括荧光团和其它染料的生色团、凝集素、核酸杂交探针、药物、毒素等的任何数目的可检测标记，都可以以这种方式进行偶联。例如，通过运用半抗原化和生物素酰化试剂，可以将低分子量的半抗原、这样一种荧光团、洋地黄素苷、二硝基苯基(DNP)或生物素化学连接到膜多肽或连接标记组分上。然后采用荧光光谱法、质谱法等，可以直接检测半抗原化多肽，或者采用与作为第二检测试剂的半抗原选择性结合的标记试剂，间接检测半抗原化多肽。常用的第二检测试剂包括用荧光染料或其它可检测标记标记的抗体、抗体片段、抗生物素和链霉抗生物素蛋白。

根据反应性基团，化学修饰可以是可逆的或不可逆的。肽和多肽中作为靶的一种常用反应性基团是硫羟基，它可以用卤乙酰基和马来酰亚胺标记试剂进行化学修饰，产生不可逆修饰，并因此产生更稳定的产物。例如，在生理pH范围(pH 6.5-8.0)内巯基与α-卤代酮、酰胺和酸的反应是众所周知的，并且允许在肽和多肽中特异性地修饰半胱氨酸(Hermason等，载于“Bioconjugate Techniques”，Academic Press，SanDiego，CA，第98-100页，(1996))。通过条件的改变，例如，通过合适波长的光照明产生的光亲和性标记的变化，也可以触发可检测标记的共价连接。对于光亲和性标记，通常是荧光标记或放射性标记的所述标记，含有一种照射(通常用紫外光)时就变成化学活性的基团，并且与待标记分子上的合适基团形成共价键。适合于此目的一类重要的光敏基团是芳基叠氮化物，当照射时它形成短寿命但高度反应性的氮宾。可光活化的氨基酸或“笼形”氨基酸的快速光解也可以用来标记直至用UV光光解时才有生物活性的肽。不同的笼闭试剂(cagingreagent)可以用来修饰所述氨基酸，例如(such)邻硝基苄基化合物的衍生物，并且可以根据本领域标准技术进行检测(Kao等，“OpticalMicroscopy：Emerging Methods and Applications，”B.Herman，J.J.Lemasters编著，第27-85页(1993))。通过醚、硫醚、酯(包括磷酸酯)、酰胺或与杂原子(通常是O、S或N)的类似键合，可以将硝基苄基合成地掺入到生物活性分子中。笼形荧光团可以用于荧光光活化(PM)实验，它们类似于荧光漂白恢复(FRAP)。对于在所述序列中笼形氨基酸的特异性掺入，可以使用在赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚、谷氨酸的γ-羧酸或半胱氨酸的硫醇上被笼闭的那些氨基酸。也可使用在α-酰胺上被笼闭的丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸，制备在N末端上笼闭的肽或可以选择性光解以或者在多聚体中或在溶液中产生活性氨基酸的笼形中间体(Patchornik等，J.Am.Chem.Soc.(1970)92：6333)。也可以使用引入具有不成对的电子而作为电子自旋共振(ESR)报道物质的基团的自旋标记技术，所述报道物质例如硝基氧化合物(-N-O)，其中所述氮形成空间位阻环的一部分(Oh等，参见上文)。

可检测标记系统的选择一般取决于所述分析及其计划用途。具体地说，在本发明的筛选测定或检测分析中，可以使用本发明的化学连接方法和组合物。这些包括诊断测定、筛选用于药物开发的新化合物和其它应用配体与由本发明方法产生的膜外受体结构域结合的结构和功能分析。所述配体可以衍生自天然存在的配体或衍生自合成来源，例如组合文库。尤其感兴趣的筛选方法和检测方法包括通过荧光光谱法检测配体结合。

在一个实施方案中，利用由本发明方法产生的膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域，检测配体与其的结合。本发明的这方面涉及使膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域的单体与所述膜蛋白受体的配体结合。用于这种方法的可溶性膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域，并且在预选定残基位置上包括一个非天然氨基酸，例如包含一种可检测标记的非天然氨基酸。接触后测定所述可溶性膜外受体结构域的配体诱导的结构域单体缔合。例如，可以通过监测所述可检测标记的特性方面的变化，检测结构域单体的缔合，例如二聚化。

在另一个实施方案中，提供一种测定可溶性膜外受体结构域单体的配体诱导的结构域单体缔合的方法。这种方法包括使膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域与所述膜蛋白受体的配体接触。在这种方法中，与以上的方法一样，所述可溶性膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域，并且在预选定残基位置上包括一个非天然氨基酸。接触后测定所述可溶性膜外受体结构域的配体诱导的结构域单体缔合。

在再一个实施方案中，提供一种检测配体与膜蛋白受体的膜外受体结构域结合的方法。这种方法涉及使膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域与所述膜蛋白受体的配体接触，其中所述可溶性膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域，并且包含具有一种可检测部分的一个非天然氨基酸。然后通过测定所述可检测部分特性方面(例如当所述可检测标记是荧光团时的荧光)的变化，进行配体结合的检测。

尤其感兴趣的是使用GPCR(例如在所述实施例中例举的B型GPCR)的全合成N末端膜外结构域的方法和组合物。例如，关于B型GPCR的结构几乎不了解，几乎不存在均一的真正高通过量测定。以下给出了一系列可能的合成N末端受体结构域在药物发现方面的应用。用FRET操针的N末端受体结构域的配体顶替法测定(ligantdisplacement assay)

在这种测定形式中，N末端受体结构域及其配体分别用荧光供体和荧光受体标记。配体与受体的结合将导致所述配体和所述受体之间的能量传递。破坏这种相互作用的小分子可以由于它们干扰能量传递而被鉴定。时间分辨荧光探针，例如镧系螯合剂配合物对于此目的是理想的，因为它们使由于光散射产生的背景信号受抑制(reject)并且适合于目前均一的高通过量筛选设备。根据结合化学计量法，可以设想其它FRET测定形式。感兴趣的可能性是激素与受体的结合导致受体二聚化(或寡聚化)。这意味着人们可以设计通过诱导受体的二聚化(或寡聚化)发挥作用的受体激动剂。二聚化(或寡聚化)测定

对于使用GPCR的N末端结构域的二聚化(或寡聚化)测定，在这种测定形式中，人们用荧光受体标记所述受体结构域的一部分，而另一半用荧光供体标记。在没有配体诱导二聚化(或寡聚化)时，没有观察到FRET。然而，FRET信号的上升指示出这种配体的存在。时间分辨荧光探针，例如镧系螯合剂配合物对于此目的是理想的，因为它们使由于光散射产生的背景信号受抑制并且适合于目前统一的高通过量筛选设备。供体-供体二聚化(或寡聚化)对不导致受体发射。使用合适的时间延迟可以门控去掉受体-受体对。这只留下了明确的供体-受体对的作用。用同位素NMR探针标记受体结构域

根据核磁共振的结构/活性关系(根据NMR的SAR)是药物筛选的一种新方法，所述方法需要同位素标记药物靶蛋白，以鉴定小分子药物前体与药物靶的相互作用。这种方法检测由于潜在激动剂或拮抗剂的结合诱导的位于药物靶结合部位中的氨基酸的化学位移的变化。目前根据NMR的SAR方法需要在均一同位素标记的蛋白质上应用二维NMR技术，严重限制了适于筛选的分子的处理量。蛋白质的化学合成只允许将同位素标记定点掺入到大量的蛋白质中，因此根据NMR的SAR可能仅需要一维NMR技术。这将达到每种样品明显省时，将根据NMR的SAR推进到真正高通过量筛选的范围中。用于噬菌体展示筛选的N末端受体结合结构域

噬菌体展示是一种非常灵敏的技术，允许用于与固定化药物靶结合的肽的扩增和鉴定。化学合成技术是唯一适于产生大量的具有定点附着位点(例如通过生物素标记)的离子通道的技术。然后可以利用这种标记结构域在固相载体上的粘附，选择展示表现出与N末端受体结构域具有结合亲和性的肽的噬菌体。这将使得能够快速鉴定与特定N末端受体结构域结合、并且可以用作药物发现的前导化合物的肽。这种方法也可以用于鉴定孤儿受体的配体。在载体基质上的N末端受体结构域

如对于噬菌体展示附着的描述，具有一个化学手柄例如一种生物素标记的N末端受体结构域可以用于将蛋白附着于载体基质，例如芯片或聚合物上。这样的装置可以用于鉴定与N末端受体结构域结合的小肽。在这种方法中，人们合成一种小肽的文库。将这些肽的溶液和所述基质一起温育。然后洗去未结合的肽。则可以容易地通过MALDI法分析与受体结构域结合的肽。同样的方法可以用于鉴定孤儿受体的配体。用于基于结构的药物设计的结构信息

此外，可以用化学合成的受体结构域，获得对基于结构的药物设计重要的结构信息。这种信息包括在游离状态和结合配体的状态下的NMR和晶体学数据以及与新激动剂或新拮抗剂复合的受体结构域的结构数据。具有重同位素标记(例如硒代甲硫氨酸和碘化酪氨酸)的N末端受体结构域的合成将有助于晶体学研究。治疗用途

本发明的受体结构域也可用作治疗药物，包括用作相应的天然存在的受体配体的激动剂或拮抗剂以及用作疫苗。

作为实例，本发明的GPCR B型受体结构域可以用于与GPCR B型受体相关的代谢疾病、神经系统疾病、癌症和其它疾病的适应证的调解(mediation)。实际上，有意义的是可溶形式的受体结构域代表一类用于治疗人类疾病的新的重要的蛋白质治疗药物(参见，例如，Heaney等，J.Leukocyte Biology(1998)64(2)：135-46)。某些具体实例包括含有可溶性IL-6(白细胞介素6)受体结构域的重组表达的可溶性蛋白，它已经显示出作为IL-6的激动剂起作用并且显示出正常IL-6受体活性(Mackiewicz等，FEBS(1992)30：257)。因此，设想可以将按照本发明方法产生的合成IL-6受体结构域用作IL-6受体信号的激动剂。作为另一个实例，促炎细胞因子-肿瘤坏死因子α(TNFα)参与介导急性炎症和慢性炎症，包含TNFα受体结合结构域的重组抗体样蛋白已经用作TNFα的配体捕获物(Edwards CK3rd，Annals of the Rheumatic Diseases，1999年11月，58增刊1：I73-81；Solorzano等，J.Appl.Phys.(1998)84(4)：1119-1130)。因此，按照本发明方法产生的合成TNFα受体结构域可以用作治疗与TNFα炎症途径相关的慢性炎性疾病的拮抗剂。此外，可以将本发明的合成受体结构域用于临床应用，以产生用于封闭涉及疾病的膜受体蛋白的中和抗体或产生用作疫苗的中和抗体。例如，通过中和抗体抑制IL-受体，产生具有免疫治疗价值的效果(Rosenberg，S.A，Immunology Today(1988)9：58-59)。此外，次要的病毒编码的M2蛋白的胞外结构域在所有的甲型流感毒株中几乎是不变异的。给予M2结构域与乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白的融合蛋白，给小鼠提供抵抗在其它情况下致死的病毒感染的90-100％保护(Neirynck等，Nature Medicine(1999)5(10)：1157-1163)。因此，人们可以使用本发明的方法和合成的受体结构域作为广谱(wideband)流感疫苗构建体，所述构建体由通过接头以多价方式或以模板辅助的合成蛋白(TASP)构建体设计连接的甲型流感M2蛋白的胞外结构域以及乙型和丙型流感的同源蛋白结构域构成。

已知在构建按照本发明的超纯和均质受体结构域化合物中化学合成的绝对精确和效率，因此这些化合物可应用于仅使用重组DNA技术不能解决的临床应用。

以下实施例用来说明本发明的各个方面，而不是用来限制本发明的范围。

                        实施例

                       实施例1

                        肽合成

使用委托改进的Applied Biosystems 430A肽合成仪，按照已建立的方案(Schhlzer等，Int.J.Peptide Protein Res.(1992)40：180-193)，合成用于GLP-1受体N末端结构域(GLP-1R NTD)的化学合成的以下肽区段(参见图3)。

区段1(SEQ ID NO：1)：

AGPRPQGATVSLWETVQKWREYRRQCQRSLTEDPPPATDLF

区段2(SEQ ID NO：2)：

CNRTFDEYACWPDGEPGSFVNVSCPWYLPWASSVPQGHVYRF

区段3(SEQ ID NO：3)：

CTAEGLWLQKDNSSLPWRDLSECEESKRGERSSPEEQLLFL

由20种氨基酸残基组成的推定的信号结构域(Gke等，FEBSLetters(1996)398：43-47)方便地在合成设计中被排除掉。在具有214nmUV检测的Rainin双泵高压混合系统中，使用Vydac C-4制备柱或半制备柱(粒子大小10mm，分别为2.2cm×25cm和1cm×25cm)，通过制备型梯度反相HPLC纯化肽区段，然后在Vydac C-18分析柱(粒子大小5mm，0.46cm×15cm)上，使用具有214nm和280nm UV检测的Hewlett Packard 1100型四级泵高压混合系统，进行分析型反相HPLC。使用PE-Sciex API-1四极离子喷雾质谱仪，获得所述肽产物的电喷射质谱(ESMS)。从所有观察的质子化状态计算肽质量，然后运用MACSPEC软件(PE-Sciex，Thornhill，ON，Canada)重建肽质谱。运用MACPROMASS软件(Terri Lee，City of Hope)计算出理论质量。使用已制定的侧链保护策略，用于Boc(叔-丁氧羰基)化学分步SPPS的通过原位中和方案(Schnlzer等，参见上文)，在产生硫酯的树脂上，合成GLP-1R NTD区段1(SEQ ID NO：1)和区段2(SEQ ID NO：2)(分别为氨基酸残基21-61和62-103)。为了防止环化，用ACM(乙酰氨基甲基)基团保护区段2的N末端半胱氨酸。在-OCH₂-PAM树脂(Schnlzer等，参见上文)上，类似地合成GLP-1R NTD区段3(SEQ ID NO：3)(氨基酸残基104-144)。按照标准Boc-化学方法(Schnlzer等，参见上文)，使用HF/对甲酚，将所述肽去保护，同时将其从树脂载体中切下。用25-45％缓冲液B(含0.1％TFA的100％乙腈)与0.1％TFA水溶液的线性梯度，所有三种GLP-1R NTD区段都通过制备型反相HPLC在45分钟内纯化。用ESMS鉴定含纯肽的流分，将其合并，冻干，用于随后的连接。通过电喷射MS表征所述纯化的肽：区段1硫酯肽(SEQ IDNO：1)分子量观测值：4962+1D，分子量计算值：4,961.3D(平均同位素组成)；区段2硫酯肽，具有2个保护基团(1His(DNP)和1Cys(ACM)基团)(SEQ ID NO：2)：分子量观测值5,294+1kD，分子量计算值5,294.4D(平均同位素组成)；区段3羧酸酯肽(SEQ ID NO：3)分子量观测值：4769+1D，分子量计算值：4,749.3D(平均同位素组成)。

                      实施例2

                   蛋白质化学合成

将等摩尔量的纯化未保护GLP-1R NTD肽(氨基酸残基104-144，区段3，SEQ ID NO：3)加入到纯化未保护硫酯肽GLP-1R NTD(氨基酸残基62-103)α-COSR(区段2，SEQ ID NO：2)(2mM)的0.1M磷酸钠/6M氯化鈲，pH7.5和1％苯硫酚的溶液中。将连接混合物在室温下搅拌过夜，并且所述反应通过反相HPLC和ESMS进行监测。随后反应混合物用等体积的40％β-巯基乙醇的6M氯化鈲、100mM磷酸盐pH7.5的溶液处理20分钟，以去除任何残余的His(DNP)保护基团。用25-45％缓冲液B与0.1％TFA水溶液的线性梯度，反应物和产物通过制备型反相HPLC在45分钟内分离。含GLP-1R NTD(氨基酸残基62-144，区段2和区段3，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)的流分通过ESMS鉴定(分子量观测值9,690+1kD，分子量计算值9,690.7D(平均同位素组成))，将其合并，冻干。随后，将纯化的GLP-1R NTD(62-144)溶于含2M尿素和1.5倍摩尔浓度过量(相对于总半胱氨酸浓度而言)的乙酸汞的0.5M乙酸中。30分钟后，将溶液在20％的β-巯基乙醇中制成20％的溶液，以清除汞离子。随后，用10-45％缓冲液B与0.1％TFA水溶液的分级梯度，通过制备型反相HPLC使所述溶液脱盐，得到冻干的GLP-1R NTD(氨基酸残基62-144，区段2和区段3，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)。

将等摩尔量的纯化未保护GLP-1R NTD(氨基酸残基62-144，区段2和区段3，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)加入到纯化未保护硫酯肽GLP-1R NTD(21-61)α-COSR(区段1，SEQ ID NO：1)(2mM)的0.1M磷酸钠/6M氯化鈲pH7.5和1％苯硫酚的溶液中。如上所述进行连接和处理，产生以下的连接产物：

合成的GLP-1R N末端结构域(氨基酸残基21-144，SEQ IDNO：4)：

AGPRPQGATVSLWETVQKWREYRRQCQRSLTEDPPPATDLF

CNRTFDEYACWPDGEPGSFVNVSCPWYLPWASSVPQGHVYR

FCTAEGLWLQKDNSSLPWRDLSECEESKRGERSSPEEQLLFL

用25-45％缓冲液B与0.1％TFA水溶液的线性梯度，将反应剂和产物通过制备型反相HPLC在45分钟内分离。含全长GLP-1R NTD(氨基酸残基21-144，SEQ ID NO：4)的流分通过ESMS鉴定(分子量观测值14,375+1kD，分子量计算值14,375.0D(平均同位素组成))，将其合并并且冻干。

                    实施例3

                   蛋白质折叠

将纯化全长GLP-1R NTD(氨基酸残基21-144，SEQ ID NO：4)以4mg/ml在氩气氛围下溶于新鲜脱气的6M盐酸鈲pH4(100mM乙酸钠)中。加入1摩尔当量的DTT(二硫苏糖醇)，然后将溶液搅拌30分钟。随后，用含20％甲醇的新鲜脱气的2M盐酸鈲、pH8.6(200mM Tris)，将溶液稀释至肽浓度为0.2mg/ml，然后加入8摩尔当量的还原谷胱甘肽和1摩尔当量的氧化谷胱甘肽(相当于所述肽中的半胱氨酸浓度)(Wetlaufer等，Biochemistry(1970)9(25)：5015)。将溶液在氩气下搅拌过夜。用25-45％缓冲液B与0.1％TFA水溶液的线性梯度，将折叠进程通过分析型反相HPLC监测30分钟，直到检测HPLC-图录的形状方面无变化为止，大多数蛋白峰已经衰弱在1个主峰下，表明均一折叠。通过ESMS鉴定出折叠过程中的3个二硫桥的形成。

用25-45％缓冲液B与0.1％TFA水溶液的线性梯度，将折叠全长GLP-1R NTD(氨基酸残基21-144，SEQ ID NO：4)通过制备型反相HPLC在45分钟内纯化。含有折叠全长GLP-1R NTD(氨基酸残基21-144，SEQ ID NO：4)的流分通过ESMS鉴定(分子量观测值14,369+1kD，分子量计算值14,369.0D(平均同位素组成))，将其合并并且冻干。

                    实施例4

                 折叠产物的分析

图7显示了GLP-1R NTD(SEQ ID NO：4)的序列。B型GPCR中的严格保守残基用粗体表示，并且连接位点和所有半胱氨酸，包括在Cys62和Cys104上的连接位点也用粗体表示。在这些位点上的3个区段的连接达到有效获得多毫克量的全长GLP-1R NTD(21-144)肽。图5显示监测GLP-1R NTD折叠反应的分析型反相HPLC图录。上部图录显示溶于6M氯化鈲(pH4)的全长GLP-1R NTD(21-144)肽的HPLC-图录。在21.1分钟的尖峰表示高纯度的合成的未折叠物质。1小时后，HPLC-图录中的多个峰显示宽范围的折叠中间体(数据未显示)。折叠过夜后，这些折叠中间体的大多数已消失，而相应的HPLC-峰已衰弱至在18.9分钟的主峰中。在较早保留时间的较宽的峰是由于谷胱甘肽加合物的形成引起的。通过观察相对于未折叠蛋白的6D质量损失，证实所述折叠蛋白中3个二硫桥的形成(参见插图；未折叠全长GLP-1RNTD(氨基酸残基21-144，SEQ ID NO：4)分子量观测值14,375+1D，分子量计算值14,175.0D(平均同位素组成))，折叠全长GLP-1R NTD(氨基酸残基21-144，SEQ ID NO：4)分子量观测值14,369+1D，分子量计算值14,369D(平均同位素组成))。通过反相HPLC将折叠蛋白与未折叠蛋白分开。再溶解冻干的折叠蛋白得到显示GLP结合活性的溶液。

                      实施例5

       折叠产物的蛋白酶解消化和二硫化物作图

对于蛋白酶解消化，将50μg折叠GLP-1R NTD(21-144)溶于含2M尿素和10mM CaCl₂的100μl 125mM Tris-HCl、pH7.5中，加入4.5μg CLCK处理过的胰凝乳蛋白酶(49u/g，Worthington Biochemicals)。将溶液在氩气下搅拌1小时，然后用100μl 200mM乙酸水溶液酸化。用5-45％缓冲液B线性梯度，通过分析型反相HPLC分离肽混合物。单个肽片段通过电喷射质谱法进行鉴定。运用PE-Sciex API-1四极离子喷射质谱仪获得消化肽产物的电喷射质谱(ESMS)。从所有观测的质子化状态计算出肽质量，然后运用MACSPEC软件(PE-Sciex，Thornhill，ON，Canada)重建肽质谱。

图6A和图6B显示在用TCEP(三羧乙基膦)处理消化混合物之前和之后的胰凝乳蛋白酶消化已消化的折叠蛋白的结果，以及所述层析谱之间的示差谱。在所述示差层析谱中，人们清楚地观察到在Cys94和Cys126(SEQ ID NO：4的氨基酸残基70-80和SEQ ID NO：4的氨基酸残基81-87)之间、以及在Cys71和Cys85(SEQ ID NO：4的氨基酸残基104-110和SEQ ID NO：4的氨基酸残基121-142)之间含有二硫桥的二硫键连接μ肽片段的阳性峰。在还原时，这些阳性峰消失了，而每峰出现了2个阴性带，对应于先前构成所述二硫键连接的肽的还原区段。将该结果与在折叠时的3个二硫键的形成结合起来，人们可以得出结论：第3个二硫桥在Cys46和Cys62之间形成。将5M尿素中的折叠蛋白部分胰蛋白酶消化1小时，产生含有Cys46和Cys62的片段(SEQ ID NO：4的氨基酸残基45-48，SEQ ID NO：4的氨基酸残基49-64)。还原产生对应于氨基酸残基49-64的肽片段。胰蛋白酶的较长消化时间导致二硫化物混乱。图7显示全合成GLP-1R NTD的二硫键图谱。

                      实施例6

                荧光各向异性结合测定

如下进行荧光各向异性结合测定。将在结合缓冲液(125mM Tris，pH7.3，150mM NaCl，1mM EDTA)中含在Lys33处用四甲基罗丹明标记的GLP-1(7-36)的300μl 0.7μM溶液放置到带有单激发和发射光谱仪的Fluorolog 3L-型分光荧光计(ISA-Spex-Jobin-Yvon，New Jersey)的恒温(T＝25℃)样品区室中。对于漫射光的额外抑制，将一个550nm长通滤光片(long-pass filter)加到所述发射光路中。制备含300μg折叠GLP-1R NTD的50μl结合缓冲液的储液，并以小等份将其加到配体溶液中。为了计算非特性结合，制备SDF-1α(高度二硫化物交联的趋化因子)的储液，并且将浓度调节到与氨基酸残基的总摩尔浓度相等。各种浓度通过吸收光谱法进行测定。每次添加后，让样品于25℃搅拌下平衡10分钟。较长的平衡时间不会导致各向异性的显著变化。在520nm激发后，从590nm至630nm进行荧光各向异性和魔角总发射扫描。用4nm步长和1秒延迟时间进行扫描。为了改进S/N比率，将从590nm至630nm的各向异性结合起来分析。

                    实施例7

                    结合测定

图8A和图8B显示了以半对数表示的GLP-1受体的各向异性配体结合测定的结果。显然，用大约Kd50的17μM观察到结合开始饱和。更有趣的是，以线性表示的S形配体结合曲线表明，所述激素的受体结构域的结合是协同结合。确定配体受体复合体的准确化学计量，协同性的程度和结合常数的进一步研究正在进行中。

以上实施例说明，可以用膜蛋白受体结构域的化学合成达到容易并且是史无前例地获得膜蛋白受体的膜外结构域。本发明创立了可溶性受体结构域的详细结构-功能研究的方法，并且创立了开发均一的真正高通过量药物筛选测定和诊断的方法。

在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都通过引用结合到本文中，其程度正如每种单个出版物或专利申请具体而单独地通过引用结合到本文中一样。

现在已经全面地描述了本发明，对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离所附权利要求书的精神或范围的情况下，可以对本文进行许多变化修改。

                序列表<110>Gryphon Sciences<120>可溶性膜蛋白受体结构域的化学合成及应用<130>GRFN-031/01WO<140>尚未获得<141>2000-03-11<150>US 60/124,272<151>1999-03-11<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>41<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的<400>1Ala Gly Pro Arg Pro Gln Gly Ala Thr Val Ser Leu Trp Glu Thr Val1                 5                  10                  15Gln Lys Trp Arg Glu Tyr Arg Arg Gln Cys Gln Arg Ser Leu Thr Glu

         20                  25                  30Asp Pro Pro Pro Ala Thr Asp Leu Phe

     35                  40<210>2<211>42<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的<400>2Cys Asn Arg Thr Phe Asp Glu Tyr Ala Cys Trp Pro Asp Gly Glu Pro1               5                  10                  15Gly Ser Phe Val Asn Val Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Ala Ser

         20                  25                  30Ser Val Pro Gln Gly His Val Tyr Arg Phe

     35                  40<210>3<211>41<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的<400>3Cys Thr Ala Glu Gly Leu Trp Leu Gln Lys Asp Asn Ser Ser Leu Pro1               5                  10                  15Trp Arg Asp Leu Ser Glu Cys Glu Glu Ser Lys Arg Gly Glu Arg Ser

         20                  25                  30Ser Pro Glu Glu Gln Leu Leu Phe Leu

     35                  40<210>4<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的<400>4Ala Gly Pro Arg Pro Gln Gly Ala Thr Val Ser Leu Trp Glu Thr Val1               5                  10                  15Gln Lys Trp Arg Glu Tyr Arg Arg Gln Cys Gln Arg Ser Leu Thr Glu

         20                  25                  30Asp Pro Pro Pro Ala Thr Asp Leu Phe Cys Ash Arg Thr Phe Asp Glu

     35                  40                  45Tyr Ala Cys Trp Pro Asp Gly Glu Pro Gly Ser Phe Val Asn Val Ser

 50                  55                  60Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Ala Ser Ser Val Pro Gln Gly His Val65                   70                 75                   80Tyr Arg Phe Cys Thr Ala Glu Gly Leu Trp Leu Gln Lys Asp Asn Ser

             85                  90                  95Ser Leu Pro Trp Arg Asp Leu Ser Glu Cys Glu Glu Ser Lys Arg Gly

        100                 105                 110Glu Arg Ser Ser Pro Glu Glu Gln Leu Leu Phe Leu

    115                 120

Claims (46)

1.一种产生膜蛋白受体的折叠膜外受体结构域的方法，所述方法包括：

通过在化学选择性化学连接条件下使选定膜蛋白受体的膜外受体结构域的第一种肽和第二种肽连接，形成一种包含所述膜外受体结构域的化学连接产物，其中所述肽具有能够在它们之间形成共价键的匹配的未保护的化学选择性反应性基团；

将所述化学连接产物暴露于模拟细胞膜的水-脂质界面环境的含有一种缓冲剂、一种离液剂和一种有机溶剂的折叠缓冲液；和

从所述折叠缓冲液中分离与所述膜蛋白受体的所述膜外受体结构域的配体结合的化学连接产物，从而产生膜蛋白受体的折叠膜外受体结构域。

2.权利要求1的方法，其中所述膜外受体结构域是一种胞外结构域。

3.权利要求2的方法，其中所述胞外结构域是一种氨基末端结构域。

4.权利要求2的方法，其中所述膜外受体结构域衍生自选自G蛋白偶联受体和酶联蛋白受体的受体。

5.权利要求4的方法，其中所述G蛋白偶联受体是一种B型G蛋白偶联受体。

6.权利要求5的方法，其中所述B型G蛋白偶联受体是胰高血糖素样肽1受体。

7.权利要求1的方法，其中所述化学连接选自天然化学连接、形成肟的连接、形成硫酯的连接、形成硫醚的连接、形成腙的连接、形成噻唑烷的连接和形成噁唑烷的连接。

8.权利要求1的方法，其中所述有机溶剂是一种水溶性有机溶剂。

9.权利要求8的方法，其中所述水溶性有机溶剂是甲醇。

10.权利要求1的方法，其中所述第一种肽包含一个非天然氨基酸。

11.权利要求10的方法，其中所述非天然氨基酸包含一个选自生色团和半抗原的化学部分。

12.权利要求11的方法，其中所述生色团是一种荧光团。

13.权利要求11的方法，其中所述半抗原包含一个生物素部分。

14.一种组合物，所述组合物包含一种按照权利要求1的方法产生的化学合成的膜外受体结构域。

15.一种试剂盒，所述试剂盒包含一种权利要求14的组合物。

16.一种组合物，所述组合物包含一种具有一个化学合成区段的膜蛋白受体的合成膜外受体结构域，所述化学合成区段在预选定残基位置上包括一个非天然氨基酸，其中所述膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域并且能够与所述膜蛋白受体的配体结合。

17.权利要求16的组合物，其中所述组合物完全不含细胞污染物。

18.权利要求16的组合物，其中所述非天然氨基酸包含一个选自生色团和半抗原的化学部分。

19.权利要求18的组合物，其中所述生色团是一种荧光团。

20.权利要求18的组合物，其中所述半抗原包含一个生物素部分。

21.权利要求16的组合物，其中将所述合成膜外受体结构域连接到一种载体基质上。

22.权利要求21的组合物，其中所述载体基质是一种MALDI载玻片。

23.权利要求21的组合物，其中所述载体基质是一种聚合物。

24.一种测定可溶性膜外受体结构域的配体诱导的二聚化的方法，所述方法包括：

使一种膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域与所述膜蛋白的配体接触，其中所述可溶性膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域；和

测定所述可溶性膜外受体结构域的配体诱导的二聚化。

25.权利要求24的方法，其中所述可溶性膜外受体结构域包含一个非天然氨基酸。

26.权利要求25的方法，其中所述非天然氨基酸包含一个选自生色团和半抗原的化学部分。

27.权利要求26的方法，其中所述生色团是一种荧光团。

28.权利要求26的方法，其中所述半抗原包含一个生物素部分。

29.权利要求24的方法，其中将所述膜外受体结构域连接到一种载体基质上。

30.权利要求25的方法，其中所述测定的特征在于检测所述非天然氨基酸的特性。

31.权利要求30的方法，其中所述非天然氨基酸包含一种生色团，而所述特性是荧光。

32.权利要求24的方法，其中所述配体包含一种可检测标记。

33.权利要求32的方法，其中所述可检测标记是一种生色团。

34.权利要求24的方法，其中所述测定的特征在于检测所述配体的特性。

35.权利要求34的方法，其中所述配体包含一种生色团，而所述特性是荧光。

36.一种检测配体与一种膜蛋白受体的膜外受体结构域结合的方法，所述方法包括：

使一种膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域与所述膜蛋白受体的配体接触，其中所述可溶性膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域，并且包含一个具有可检测部分的非天然氨基酸；和

测定所述可溶性膜外受体结构域的所述膜外受体结构域单体的配体诱导的二聚化。

37.权利要求36的方法，其中所述配体选自激动剂和拮抗剂。

38.权利要求37的方法，其中所述拮抗剂是一种部分拮抗剂。

39.权利要求37的方法，其中所述激动剂是一种部分激动剂。

40.权利要求36的方法，其中所述膜外受体结构域是一种胞外结构域。

41.一种检测配体与一种膜蛋白受体的膜外受体结构域结合的方法，所述方法包括：

使一种膜蛋白受体的可溶性膜外受体结构域与所述膜蛋白受体的配体接触，其中所述可溶性膜外受体结构域不含跨越膜的跨膜结构域，并包含一个具有可检测部分的非天然氨基酸；和

通过测定所述可检测部分的特性变化，检测所述配体与所述可溶性膜外受体结构域的结合。

42.权利要求41的方法，其中所述可检测部分是一种生色团，而所述特性是能量传递。

43.权利要求41的方法，其中所述配体选自激动剂和拮抗剂。

44.权利要求43的方法，其中所述拮抗剂是一种部分拮抗剂。

45.权利要求43的方法，其中所述激动剂是一种部分激动剂。

46.权利要求41的方法，其中所述可溶性膜外受体结构域是一种胞外结构域。

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