CN101985470B - 胰高血糖素样多肽-1类似物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了胰高血糖素样多肽-1类似物及其制备方法与应用。本发明提供了第5位，第6位，第34位，第35位和/或在第37位进行修饰后的胰高血糖素样多肽-1类似物。本发明提供了该多肽的化学制备和分离方法和通过采用重组DNA技术制备与纯化该多肽方法。该多肽在临床上可用于治疗2型糖尿病和肥胖症。本发明还提供了该多肽用于制备治疗2型糖尿病的缓释药物的应用。

Description

胰高血糖素样多肽-1类似物及其制备方法与应用

本发明专利申请是申请号为“200510102363.7”的分案申请，原申请的申请日为“2005年12月16日”，申请号为“200510102363.7”，发明名称为“胰高血糖素样多肽-1类似物及其制备方法与应用”。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)类似物及其制备方法与应用。

背景技术

目前，2型糖尿病由于发病率提高而成为世界性的疾病。2型糖尿病的发病机理非常复杂，当前使用的治疗2型糖尿病药物有种种缺陷，最主要表现在长期使用引起患者的体重增加，而且由于药物引起的β-细胞功能作用的逐渐损失使得患病加重。大约百分之九十糖尿病患者为2型糖尿病，亦称为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。2型糖尿病患者一般仍然分泌胰岛素，但胰岛素无法由身体细胞有效地使用，因而无法降低血糖水平。

胰高血糖素样肽1是机体正常的分泌多肽，由于对2型糖尿病的疗效显著并且能克服现有药物的缺陷而成为倍受瞩目的治疗2型糖尿病的新型药物。

胰高血糖素样肽1(GLP-1)发现于1984年，被认为是一种重要的肠降糖素(incretin)。胰高血糖素样肽1是胰高血糖素原基因的产品.胰高血糖素样肽1是在摄食时由肠道的L-细胞释放，并促进胰腺β-细胞释放胰岛素。胰高血糖素样肽1的作用不仅在于刺激胰岛素的释放，还有众多的其它功能。目前普遍认为胰高血糖素样肽1不仅控制血液葡萄糖而且通过几个其它作用控制2型糖尿病疾病的行进。

在临床上，胰高血糖素样肽1被证明在降低血液葡萄糖是非常有效的，并且可用在糖尿病的任意阶段。非常重要的发现是很少观察到低血糖的风险。其原因在于胰高血糖素样肽1不同于磺酰脲降糖药(sulfonylureas)，只刺激葡萄糖诱导的胰岛素分泌。利用天然胰高血糖素样肽1进行六周皮肤注射试验表明患者的体重也下降了。唯一已知的药物学副作用是当在使用高剂量胰高血糖素样肽1时患者有恶心和呕吐。这些不必要的副作用可由被禁止空腹使用而克服。并且，大多数临床数据表明，恶心只是短暂的，高效率的葡萄糖控制能在没有这种副作用情况下实现。因而，从临床观点看，胰高血糖素样肽1可有效地降下血液葡萄糖，较少低血糖症风险和阻止疾病发展的潜力，为治疗型2糖尿病的理想药物。

目前有两类胰高血糖素样肽1化合物在进行临床开发。一类是天然胰高血糖素样肽1。另一类是exendin-4，是一种从蜥蜴Heloderma Suspectum的毒液中分离的多肽。这两类多肽结构同源性高达53％。

人类胰高血糖素样肽1是含有37氨基酸残基的多肽，来源于在回肠末端，由胰高血糖素样肽原衍生而来。在L-细胞中，胰高血糖素样肽原被加工成胰高血糖素样肽-1(7-36)-NH₂、胰高血糖素样肽-1(7-37)和胰高血糖素样肽-2。具有功能的天然人类胰高血糖素样肽1有两种形式：胰高血糖素样肽-1(7-36)-NH₂，胰高血糖素样肽-1(7-37)。

胰高血糖素样-1(7-36)NH₂作为潜在治疗2型糖尿病药物拥有几个独特和有益的效果。但是，由于被二肽酶IV(DPP IV)迅速水解和被肾脏迅速清除，天然胰高血糖素样肽-1在体内作用的半衰期的极短，少于2分钟。有证据揭示其它水解酶，譬如中性肽链内切酶(NEP)也降解胰高血糖素样肽1。因而阻碍了利用胰高血糖素样肽-1治疗2型糖尿病研究发展。

比较而言，exendin-4对DPP-IV和NEP水解有较强抵抗性，在人体中的半衰期在DPP-IV控制后为26分钟。在Exendin-4类似物中，第八位的丙氨酸由Gly替代，尽管替换后的胰高血糖素样肽-1轻微地减弱了与受体的亲和力，但对DPP IV更稳定。根据exendin-4氨基酸序列，可以获得更多抗酶的多肽分子，但这些多肽分子也许引起免疫反应。

毋庸置疑，以胰高血糖素样肽1受体为目标的治疗的理想的方式是使用多肽化合物衍生物。因而，新药物发现将是开发一种具有半衰期长而稳定的化合物。实验结果表明，胰高血糖素样肽1肽的N-终端序列负责对胰高血糖素样肽1受体的核心部位的高亲合力结合，其C-端负责选择性与受体的N-端相结合；丙胺酸扫瞄实验显示天然胰高血糖素样肽1第7，10，12，13，15，28和29位的氨基酸对变异敏感。大量早期的研究在于瞄准设计抗蛋白酶的胰高血糖素样肽1，以利用作药物。但是，这些胰高血糖素样肽1类似物还是无法被用作为候选药物，因为它们被肾脏迅速地仍然清除。因而要求用其它形式提高多肽化合物的某种延时性。

就胰高血糖素样肽1而言，最大的挑战是这些肽类化合物必须注射。另一个更加具体的挑战是一种成功的胰高血糖素样肽1药物应尽可能地减少对食道的副作用。这种药物学副作用就是发生在药物浓度达到高峰时的恶心。根据与此相关联药物动力学的性质的研究，长半衰期可以最好地避免恶心，因为长半衰期可以保证血浆中的最小给药量。大量临床前和临床研究数据表明，胰高血糖样肽-1作为一种治疗非胰岛素依赖性糖尿病有巨大的前景，特别是当口服药剂失败时尤为显著。

此外，胰高血糖素样肽1的真正临床潜力在于降低葡萄糖，控制体重，并且控制病情。胰高血糖样肽-1可诱导许多生物效应，譬如刺激胰岛素分泌，抑止胰高血糖素分泌，抑止胃倒空，提高葡萄糖利用，并且导致减重。而且，目前的临床研究表明，胰高血糖样肽-1可能阻止糖尿病伴随的β-细胞功能损伤的恶化进程。胰高血糖样肽-1的最明显的特征是它能刺激胰岛素分泌但没有低血糖症风险，这种风险常见于胰岛素疗法或口服药物增加胰岛素表达的治疗过程。

发明内容

本发明的目的在于克服天然胰高血糖素样肽-1在体内作用的半衰期极短的问题，提供一种新的胰高血糖素样多肽-1类似物。新的衍生物比天然型具有更好的药物作用；比天然型在血液中对DPP-IV更强的抵抗力，具有更长的持久性；也更容易制备。

本发明的另一目的是提供上述胰高血糖素样肽-1类似物的制备方法。

本发明的进一步目的是提供上述胰高血糖素样多肽-1类似物在制备用于治疗2型糖尿病的缓释药物中的应用。

本发明的胰高血糖素样多肽-1类似物，具有如下氨基酸序列：

Xaa₅-Xaa₆-His-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa₃₄-Xaa₃₅-Arg-Xaa₃₇

或药物学可接受的盐；

其中：

Xaa₅是Pro，Gly，Ac，NH₂或者缺失；

Xaa₆是Pro，Ala，Ser或者缺失；

Xaa₈是Ala，βAla，Gly，Cys，-NH-CH(CH₃)-CH₂-，-NH-CH₂-CH₂-，Cys(Acm)或者Cys(SO₃)；

Xaa₃₄是Lys或者Pro或者缺失；

Xaa₃₅是Gly或者Pro或者缺失；

Xaa₃₇是βAla，Met，homoserine，Gly，Asp，NH₂或者缺失；

但是，所述的胰高血糖素样多肽-1类似物不包括以下序列：

GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)NH₂，Gly⁸-GLP-1(7-37)OH，

Gly⁸-GLP-1(7-36)NH₂。

本发明的胰高血糖素样多肽-1类似物具有同胰高血糖素样多肽-1(GLP-1(7-37)OH)类似的氨基酸序列。GLP-1(7-37)OH的氨基酸序列见表1中的SEQ ID NO：2。胰高血糖样肽-1类似物在修改一个或更多位置的氨基酸，如第8位和第37位氨基酸后，展示有比天然胰高血糖样肽-1(7-37)OH有更强的活力。本发明所述的胰高血糖素样多肽-1类似物与GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH₂有充分的同源性，胰高血糖素样多肽-1类似物具备促胰岛素活性。所述的胰高血糖素样多肽-1类似物包含有GLP-1(7-37)OH氨基酸序列或修改GLP-1(7-37)OH相对应的位置氨基酸，以便类似物有一，二，三，四或五个氨基酸不同于GLP-1(7-37)OH。胰高血糖素样多肽-1类似物的命名将替代的氨基酸和它的位置列在母本结构之前，如表2至表6所示。例如，Cys⁸-GLP-1(7-37)OH为GLP-1(7-37)OH中在第8位的丙氨酸被替换为半胱氨酸的一种胰高血糖素样多肽-1类似物。如表2所示，本发明所述的胰高血糖素样多肽-1类似物是在位置8为非丙氨酸的一系列类似物，即位置8类似物。

本发明所述的胰高血糖素样多肽-1类似物为含有大约三十或三十二个天然或非天然氨基酸的多肽，并和胰高血糖素样多肽-1(7-37)OH有充分的同源性，而且具有胰岛素促泌活性。“胰岛素促泌活性”指刺激胰岛素分泌能力可以回应升高的葡萄糖水平，使升高的葡萄糖被细胞吸收利用，致使血浆中葡萄糖减少到正常水平。胰岛素促泌活性可由已知方法分析，包括使用体内实验和体外分析测量胰高血糖素样多肽-1受体结合亲和力或受体的活化作用。结果分析见表7。

与本发明相符合的胰高血糖素样肽-1类似物可为通过连接Xaa₃₇和Xaa₅形成的环状肽。该环状肽比线状肽具有更好的药物动力学和药物代谢性能(如表7所示)，而且环状肽具有可口服的优点。

与本发明相符合的胰高血糖素样肽-1类似物可为通过Cys⁵或Cys⁸二硫键形成的二聚体肽。该二聚体肽比线状肽有更好的药物动力学和药物代谢性能(如表7所示)。

一个更具体化的胰高血糖素样多肽-1类似物是将GLP-1(7-37)OH在位置7和位置37氨基酸连接形成一种环状肽。更好地情况是除代替在位置8氨基酸之外，位置6为脯氨酸或甘氨酸，位置34和35氨基酸由脯氨酸替代，并且位置37氨基酸由天冬氨酸或甘氨酸替代。如表4所示。

通过上述位置氨基酸替代获得比GLP-1(7-37)OH更稳定的化合物。如表7所示，本发明所述的胰高血糖素样多肽-1类似物的半衰期明显比GLP-1(7-37)OH要长，胰高血糖素样多肽-1类似物比GLP-1(7-37)OH更有活力。图2说明mAla8-GLP-1(7-37)-OH与GLP-1(7-37)OH比较有更高的活力。

本发明所述的胰高血糖素样多肽-1类似物，还包括药物学上可接受的胰高血糖素样多肽-1类似物的盐类化合物。胰高血糖素样多肽-1类似物拥有充足的酸性功能基团或碱性功能基团，或同时拥有酸碱功能基团，这些功能基团可与一定数量的无机碱，无机酸和有机酸等形成盐。

在本发明中，其中的一个具体化是，本发明所述的胰高血糖素样肽-1类似物可以转换成C-端酰胺化多肽。

本发明所述的胰高血糖素样多肽-1类似物主要指天然氨基酸。

在本发明中，其中的一个具体化是，通过重组DNA方法制备胰高血糖素样肽-1类似物，而且所表达肽是前后重复排列的。重复肽片段通过甲硫氨酸或Asp-Gly或Asp-Pro连接，最大重复肽片段数六片段，即将胰高血糖素样多肽-1类似物以下述公式重复连接的形式插入蛋白质表达质粒pMFH中：

--{GLP-1类似物}n--       其中n＝1-6。

在本发明中，其中的一个具体化是，利用固相法强化重组胰高血糖素样多肽-1类似物的纯化。先将含胰高血糖素样多肽-1类似物的融合蛋白利用化学连接于固相载体表面，再用化学水解法释放多肽。

一种利用化学连接和化学水解法纯化本发明所述的重组胰高血糖素样多肽-1类似物的方法，包括以下步骤：

A)将氨基乙酸硫酯或氨基丙酸硫酯在无水环境下根据供应商提供的标准程序连接到固相小珠表面；

B)重组融合载体pMFH的N终端设计有半胱氨酸，将含有重组胰高血糖素样多肽-1类似物的融合蛋白通过化学连接法共价连接到固相小珠的表面；

C)表达的融合蛋白通过Ni-NTA亲合色谱柱纯化，在洗脱液中，加入4％benzymercaptan，和4％thiophenol或者2％MESNA以增加化学连接的效率；

D)用化学水解液充分地洗涤固相小珠：0.1摩尔浓度盐酸，6摩尔浓度盐酸胍；

E)以1∶200～400摩尔比加入溴化氰分解融合蛋白释放重组胰高血糖素样多肽-1类似物；收集合并含有多肽的洗出液，使用C18 Sep-Pak反相柱进行脱盐。

步骤A中，所述的固相小珠优选为化学修饰过的Affi-Gel10胶凝体。

本发明的胰高血糖素样多肽-1类似物可用于制备治疗2型糖尿病的缓释药物，其缓释药物的原型为：

蛋白载体-连结体-胰高血糖素样多肽-1类似物；

所述的蛋白载体为人白蛋白(Albumin)或者其他人血液蛋白；

所述的连结体具有如下氨基酸序列：

Yaa1-Yaa2-Yaa3-Yaa4-Yaa5-Yaa6-Yaa7

其中：

Yaa1：Cys或缺失；

Yaa2：Phe或Leu或缺失；

Yaa3：Asn或Val或缺失；

Yaa4：Pro或缺失；

Yaa5：Arg或缺失；

Yaa6：Gly或Pro或Ala或缺失；

Yaa7：Ser或Pro或Ala或缺失。

本发明利用蛋白载体在体内缓释胰高血糖素样多肽-1类似物。胰高血糖素样多肽-1类似物通过可水解的氨基酸序列连接于蛋白载体表面(如人白蛋白或者其他人血液蛋白)。可水解的氨基酸序列可选择人凝血酶识别序列。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过开发对DPP IV有强力抗性的新颖胰高血糖样肽-1类似物，解决了天然胰高血糖样肽-1半衰期极短和药物生物效率不高的问题。本发明还通过提高非注射疗法效率而克服胰高血糖样肽-1有限的药物生物效率。

附图说明

图1为基因重组合技术法制备胰高血糖素样多肽-1化合物的表达质粒；

图2为胰高血糖素样多肽-1类似物抗DPP IV肽酶抗性分析结果；

图3表示一种用固相法强化重组多肽纯化方法；

图4为一种重组胰高血糖素样多肽-1的质谱分析结果；

图5为缓释重组胰高血糖素样多肽-1衍生物缓释效果分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：固相Fmoc化学法制备胰高血糖素样多肽-1化合物

本发明所述的胰高血糖素样多肽-1类似物可用标准固相肽合成方法制备。多肽合成仪可从商业公司购买，如美国加州的Applied Biosystems公司。多肽合成单体也可从商业公司购买，如美国加州NovaBiochem公司。固相肽合成仪的使用根据制造商提供的说明操作进行保护干扰基团，偶和反应，去偶和反应，结合，分离，非反应的氨基酸保护反应。

表1至6中所列有的肽类化合物使用PerSeptive肽自动合成仪采用F-moc化学固相法合成。固相载体为聚乙烯甘醇多苯乙烯树脂，使用哌啶二甲基甲酰胺为去保护剂和2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate和1-hydroxyben-zotriazole为连结剂。起始C-终端酰氨物使用50 umole Rink AM树脂。多肽链宿合完毕后，使用90％TFA，5％ thioanisole，3％ anisol和2％ ethanedithiol进行去树脂裂解和去保护反应。粗肽使用C18-HPLC反相疏水层析纯化，流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度纯化的样品由质谱进行鉴定。纯化肽的纯度大于95％。

原料Fmoc-AlaΨCH(OH)-CH2-Glu(OtBu)和Fmoc-GlyΨCH(OH)-CH2-Glu(OtBu)根据Makowiec等的文献{Makowiec，S.，&Wisniewska，K.，&Lankiewicz，L.(2004).Peptide bond modification.I.simple and efficient method ofBoc-Gly[CH(OH)CH2]Gly-OH syntesis.Polish J.Chem.78，315-318.}所述常规方法进行制备，其它Fmoc氨基酸及其它化学制品和溶剂，均购买于商业来源。

实施例2：基因重组合技术法制备胰高血糖素样多肽-1化合物

本发明所述的胰高血糖素样多肽-1类似物可用重组DNA方法制备。例如，胰高血糖素样多肽-1基因可克隆到多肽表达载体pMFH中(见Su等人；Staphylococcal nuclease fusion proteins for the production of recombinant peptides。US Patent 7390639)。融合蛋白质中的胰高血糖素样多肽-1通过化学方法裂解后，进一步用HPLC纯化。

表1中只含L-型天然氨基酸的胰高血糖素样多肽-1及突变体也可以按Osborne等文献(Osborne，M.J.，Su，Z.，Sridaran，V.，&Ni，F.(2003).Efficientexpression of isotopically labeled peptides for high resolution NMR studies：application to the Cdc42/Rac binding domains of virulent kinases in Candida albicans.J.Biomol.NMR 26，317-326.)和Su等专利(Staphylococcal nuclease fusionproteins for the production of recombinant peptides。US Patent 7390639)描述的常规基因重组合技术来制备。胰高血糖素样多肽-1及突变体基因片段可单一或同时以多达六个重复片段形式插入蛋白质表达质粒pCMFH中，如图1所示。片段之间通过甲硫氨酸或Asp-Gly连结。

如上述Osborne等文献和Su等专利所述，质粒pSGLP中使用的载体蛋白质是staphylococcal核酸酶的N-端无甲硫氨酸的突变体片段，并连结有六个连续组氨酸标记。

融合蛋白质用大肠杆菌BL21(DE3)表达。然后按标准程序使用Ni-NTA琼脂糖树脂进行纯化了。融合蛋白质溶解于70％甲酸中，利用酸或溴化氰水解释放目标肽。晶体溴化氰使用量为融合蛋白质摩尔数100倍。让反应混和物在黑暗状态下反应24小时。反应混和物在中性化以后进行脱盐处理，脱盐处理后的样品经Ni NTA层析柱除去MFH融合载体和未水解的融合蛋白质。洗脱液流经脱盐后冻干备用。

冻干粉使用C18 HPLC反相层析柱，以水和乙腈混和物(含0.1％三氟乙酸)为梯度进行洗脱。纯净肽由质谱核实，如图4所示。

实施例3：利用固相法强化重组多肽的纯化方法

图3描述一种用固相法强化重组多肽的纯化方法。固相小珠1，为修饰过的Affi-Gel10胶凝体(Bio-Rad，美国)。尽管可使用其它固相小珠，但Affi-Gel 10胶凝体对尿素，盐酸胍，热，溶剂，酸碱(酸碱度2-12)等有良好的抗性，并且具有高容量。首先，将氨基乙酸硫酯或氨基丙酸硫酯在无水环境下根据供应商提供的标准程序连接到Affi-Gel10胶凝体表面。融合蛋白2通过修饰过的肽表达质粒pMFH，在大肠杆菌制备(见Su等人；Staphylococcal nucleasefusion proteins for the production of recombinant peptides。US Patent 7390639)。重组融合载体MFH的N终端设计有半胱氨酸以便可将融合蛋白通过化学连接法共价连接到固相小珠1的表面。在本发明中，三个化学水解位点，即Met-Xaa(Xaa为任意氨基酸)，Asp-Pro和Asp-Gly，单独地插入在融合载体和胰高血糖素样多肽-1之间。表达的融合蛋白通过Ni-NTA亲合色谱柱纯化。简单地，细胞破碎上清液被装载入用细胞破碎缓冲液平衡过的Ni-NTA亲合色谱柱：50毫摩尔浓度磷酸盐，100毫摩尔浓度氯化钠，6摩尔浓度盐酸胍，酸碱度8.0，10摩尔浓度TECP。然后使用含50毫摩尔浓度imidozale前述缓冲液充分洗涤亲合色谱柱。融合蛋白用含200毫摩尔浓度的imidozale前述缓冲液洗脱收集。洗脱液无需进一步纯化而直接用于化学连接。在洗脱液中，加入4％benzymercaptan，和4％thiophenol或者2％MESNA以增加化学连接的效率。在本发明中，未观察到benzymercaptan和thiophenol组合和MESNA之间的区别，但发明人更喜欢MESNA，因为它无气味。化学连接反应在6个小时完全联结。然后使用化学水解液充分地洗涤小珠：0.1摩尔浓度盐酸，6摩尔浓度盐酸胍。以1∶200～400摩尔比加入溴化氰分解融合蛋白释放多肽。当需要用酸水解时，使用50％甲酸代替上述水解液。所有水解反应以柔和地震动方式25℃在黑暗中进行，水解反应过程用HPLC监测。水解反应效率在24到36小时以后达到95％。先使用重力洗脱水解液，然后以五倍床体积的水解缓冲液洗脱固相小珠。收集合并含有多肽的洗出液，使用C18 Sep-Pak反相柱进行脱盐。多肽的特性由MALDI-TOF质谱仪鉴定，如图4所示。三种水解法的多肽产率总结于表8。

实施例4：本发明所述的胰高血糖素样多肽-1类似物的酰氨化

肽C终端酰氨基团由酶法转酰氨反应制备，再用光解法去保护基团。根本上，用羧肽酶(carboxypeptidase)对多肽底物与亲核试剂进行酰氨化。转酰氨反应一般在含水缓冲溶液(包括50mM HEPES和5mM EDTA，酸碱度7.5或50mM CHES和5mM EDTA，酸碱度9.5)进行。转酰氨反应过程由HPLC监控。其后，将反应混合物的酸碱度降低到酸碱度为1到3以终止反应。转酰氨反应产物利用反相谱色谱法HPLC进行分离。

此外，转酰氨反应也可在有机溶液中进行。合适的有机溶液可用dimethylsulfoxide(DMSO)，N，N′-dimethylacetamide，dimethylformamdie和其它相似的溶剂。Henriksen等描述了常规有机溶液中转酰氨反应的方法学(Henriksen，D.B.，Breddam，K.，&Buchardt，O.(1993).Peptide amidation by enzymatic transacylationand photolysis.Int.J.Pept.Protein Res.41，169-180.)。

例如以水溶液进行转酰氨反应，将多肽底物mAla8 GLP 1(7-36)-丙氨酸溶于5％的乙酸溶液。亲核试剂(如白氨酸氨化物)溶于在50mM HEPES，5mMEDTA缓冲溶液(最终浓度为500mM)。25ul，40mM的mAla8 GLP 1(7-36)-丙氨酸与950ul的亲核试剂混合(酸碱度是7.5，20℃)。加入终浓度为每毫升0.002到0.07毫克的羧肽酶。转酰氨反应过程由HPLC监控。当产物不再形成后，加入一体积的三氟乙酸终止反应。

转酰氨反应的产物，mAla8-GLP-1(7-36)-ONPGA由光解去保护。12.5ml溶于甲醇mAla8-GLP-1(7-36)-ONPGA加入12.5ml，80mM NaHSO3，用5NNaOH调整酸碱度到9.5。然后用N2将反应混合物通气15分钟，随后用紫外光在氮气保护下进行光解作用。光解样品在0，30，60和120分钟定时提取分析。利用HPLC对每个样品进行分析，结果与标准样品相比较。

实施例5：本发明所述的胰高血糖素样多肽-1类似物对胰高血糖素样多肽-1受体的活化作用：

当前发明使用由Montrose-Rafizadeh等人描述的常规方法(Montrose-Rafizadeh，C.，Yang，H.，Rodgers，B.D.，Beday，A.，Pritchette，L.A.，&Eng，J.(1997).High potency antagonists of the pancreatic glucagon-like peptide-lreceptor.J.Biol.Chem.272，21201-21206.)，测定胰高血糖素样多肽-1和类似物置换CHO/GLP-1R细胞的胰高血糖素样多肽-1受体结合的[¹²⁵I]GLP-1的竞争能力。在实验之前，CHO/GLP-1R细胞培养至密度为70％后用serum-freeHAM’S F-12培养基洗涤2h。用0.5ml缓冲液进行二次洗涤后，细胞置于0.5ml缓冲液(含2％BSA，50mM DPP-IV抑制剂，10mM葡萄糖，1-1,000nM GLP-1或类似物和30,000cpm ¹²⁵I-胰高血糖素样多肽-1和类似物)在4℃培养过夜。在培养结束，去除上清液，用冰冷PBS洗涤细胞三次。在室温加0.5ml 0.5NNaOH和0.1％SDS，并培养10分钟。细胞水解物的放射线剂量在被了在Apec系列λ-计数器测量。专一性结合力定为总结合力减去用过量非标记的胰高血糖素样多肽-1(1μM)测定的放射线剂量。其IC50值列于表7。

实施例6：细胞内cAMP浓度的测定

当CHO/GLP-1R细胞培养至密度为60-70％时，以磷酸盐缓冲液洗涤了三次。加1ML含有0.1％BSA的磷酸盐缓冲液，置湿润空气孵化器中于37℃培养2h。然后加1ML含有0.1％BSA和IBMX(1mM)的磷酸盐缓冲液后继续培养，并加入胰高血糖素样多肽-1和类似物。空白样以磷酸盐缓冲液代替。30分钟后，以冰冷磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次停止反应。用1ML冰冷高氯酸溶液(0.6M)处理5分钟，提取细胞中的cAMP。用碳酸钾(5M，84U1)调整样品的酸碱度至7，短暂振荡样品管，并且离心去沉淀物(5分钟，2000x g，4℃)。上清液经真空干燥后溶于0.05M含4MM EDTA的Tris盐缓冲液(酸碱度7.5)。加入碳酸钠(0.15μM)和硫酸锌(0.15μM)于样品，然后放置于冰上15分钟。离心去盐沉淀物(5分钟，2000x g，4℃)。使用[³H]cAMP竞争约束分析用试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)测定样品。EC₅₀值列表7。

实施例7：本发明所述的胰高血糖素样多肽-1类似物抗DPP IV肽酶抗性分析

胰高血糖素样多肽-1或类似物(最终浓度为2uM)与DPP IV(1.25mU)或人血浆(7.5ul)混合，在37℃，50mM Tris-Cl缓冲液，酸碱度7.8的条件下，分别反应0，2，4，6和12h。在初步实验中确定DPP IV和人的血浆的浓度，使大约50％的多肽在4-6h之内水解，以便在12h内定时观察多肽的水解过程。加入TFA溶液(15ul，10％(v/v))终止反应了。反应液经离心澄清后(12，000转/每分钟，10分钟)，使用Vydac C18分析层析柱定量测定水解的较大的肽片段(即GLP-1(9-36)amide)。分析层析柱预先使用TFA/H₂O(0.12％)(v/v)平衡，流速为1.0ml/min。使用乙腈进行浓度梯度洗脱(从10％到40％，30分钟)。样品吸收峰使用278纳米波长监测，收集后使用ESI质谱仪鉴定。

胰高血糖素样多肽-1由DPP IV降解半衰期(t1/2)为40min，在12hrs后，78-82％多肽已经被水解，主要吸收峰经ESI质谱仪鉴定为GLP-1(9-36)短肽。相反，含有非肽键的胰高血糖素样多肽-1类似物，即mAla⁸-GLP-1(7-36)-NH2，mAla⁸ GLP 1(7-37)OH，mGly⁸-GLP-1(7-36)-NH2，mGly⁸ GLP 1(7-37)OH，在与DPP IV反应后不产生第二个吸收峰，表明对DPP IV水解具有完全的抵抗性(图2和表7)。

如图2所示，如果延长胰高血糖素样多肽-1〖GLP-1(7-36)〗的N-端氨基酸序列，也可以改善胰高血糖素样多肽-1对DPP IV水解的抵抗性。添加Gly-Pro序列(此序列可视为Asp-Gly-Pro的酸水解产物)可将胰高血糖素样多肽-1对DPP IV水解的抵抗性提高3.7倍。添加Phe-Asn-Pro-Arg序列可将胰高血糖素样多肽-1对DPP IV水解的抵抗性延长超过24小时。与GLP-1(7-37)相比，本发明中其他的胰高血糖素样多肽-1类似物也不同程度地提高了对DPPIV水解的抵抗性。详细的结果列于表7。

实施例8：胰高血糖素样多肽-1类似物的缓释分析

缓释分析采用如下方式进行。目标胰高血糖素样多肽-1类似物按常规方法与人白蛋白共价交联。交联蛋白溶于50毫摩尔浓度磷酸缓冲液(终浓度为1毫摩尔浓度)。将1毫升交联蛋白溶液移入FloatA Lyzer^TM透析袋(1毫升，MWCO：10KD)。再将透析袋置入装有3毫升同样浓度的磷酸缓冲液试管中，透析袋应完全浸入缓冲液中，并用磁力搅拌器匀速搅拌。隔时抽取试管中溶液测定透析袋释放胰高血糖素样多肽-1类似物的剂量。在对比试验中分别添加小剂量人凝血酶(thrombin)和二肽酶IV(DPP IV)，以测定胰高血糖素样多肽-1类似物缓释效果。空白试验中含有1毫摩尔浓度的胰高血糖素样多肽-1类似。实验结果表明：交联蛋白人-胰高血糖素样多肽-1类似物在凝血酶或DPP IV作用下有明显的缓释效果，如图5所示。

表1、胰高血糖素样多肽-1氨基酸序列

表2、第八位氨基酸变异的胰高血糖素样多肽-1氨基酸序列

表3、可用基因重组技术制备的胰高血糖素样多肽-1氨基酸序列

表4、环状胰高血糖素样多肽-1氨基酸序列

表5、用于同白蛋白交联的胰高血糖素样多肽-1氨基酸序列

表6、二聚体胰高血糖素样多肽-1氨基酸序列

表7、胰高血糖素样多肽-1及衍生物在CHO/GLP-1R中的受体结合力和cAMP分析以及抗DPP IV分析

表8、三种水解法制备胰高血糖素样多肽-1的比较

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于：所述胰高血糖素样多肽-1类似物的氨基酸序列如下所示：

Xaa₅-Xaa₆-His-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa₃₄-Xaa₃₅-Arg-Xaa₃₇

或药物学可接受的盐；

其中：

Xaa₅是缺失；

Xaa₆是缺失；

Xaa₈是-NH-CH(CH₃)-CH₂-；

Xaa₃₄是Lys；

Xaa₃₅是Gly；

Xaa₃₇是Gly-OH或者NH₂。

2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于：所述类似物为C-端酰胺化胰高血糖素样多肽-1类似物。

3.根据权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于：所述胰高血糖素样多肽-1类似物是由天然氨基酸合成。

4.权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物在制备用于治疗2型糖尿病的缓释药物中的应用。

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