CN116789801A - 新型胰岛素衍生物及其用途 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种新型胰岛素衍生物及其用途。本发明所述新型胰岛素衍生物相对于人胰岛素，通过将位点B17、B25以及其他如A14位点、A19位点、B3位点、B4位点等进行氨基酸突变后，使其具有良好的对抗体内蛋白酶降解的性能；再通过酰化反应在B29位连接一个脂肪酸侧链，使其与白蛋白可逆性结合，进一步增加在体内存在的时间，进而实现长效化作用机制。本发明的新型胰岛素衍生物表现出明显的长周期胰岛素的作用特点，可以开发一周一次给药的人胰岛素类似物。
Description
技术领域
本发明涉及人胰岛素类似物的新衍生物领域，具体涉及新型胰岛素衍生物及其用途。
背景技术
胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，外源性胰岛素主要用来治疗糖尿病或与其关联的疾病。人胰岛素由51个氨基酸组成，分成A、B两条链，其中A链包含21个氨基酸，B链包含30个氨基酸。两条链间通过二对二硫键连接，而A链自身还含有一对二硫键。随着基因工程技术的不断发展和广泛应用，人们通过增加、减少或交换一个或多个氨基酸残基来制备各种用途的胰岛素类似物。
在大肠杆菌或酿酒酵母中表达胰岛素前体的方法已经在很多专利中公开，如美国专利第5,962,267号，WO95/16708、EP0055945、EP0163529、EP0347845、EP0741188。胰岛素类似物（如DesB30人胰岛素，或其A链或B链亦或其A链和B链上的一个或多个氨基酸被替换成其它氨基酸的类似物）的载体的构建、表达、分离和纯化可使用本领域技术人员公知的技术进行，如通过美国专利第6500645号中所公开的众所周知的技术，在合适的宿主细胞中表达编码目标胰岛素类似物的DNA序列来制备胰岛素类似物。
文献Glendorf T,Sorensen AR,Nishimura E,Pettersson I,&Kjeldsen T:Importance of the Solvent-Exposed Residues of the Insulin B Chainα-Helix forReceptor Binding;Biochemistry,2008,47:4743-4751中使用重叠延伸PCR将突变引入胰岛素编码载体。胰岛素类似物作为具有Arg-Arg小C肽的前胰岛素样融合蛋白在大肠杆菌中表达。使用lys-c酶、kex2酶、重组胰蛋白酶对表达的融合蛋白进行酶切，单链前体经酶促转化为双链DesB30人胰岛素类似物。
目前已经有多种不同的作用持续时间的胰岛素制剂上市，这样的制剂主要根据作用时间分为长效胰岛素制剂、中效胰岛素制剂和速效胰岛素制剂。目前上市的最长效的胰岛素制剂也需要每天注射一次，许多患者每天要接受2-4次注射，积年累月注射部位遍布针孔，局部皮肤更是有硬化风险。如果出现了皮肤变硬，可能会影响胰岛素吸收，引起血糖波动，低血糖事件等。频繁的注射也给患者带来了诸多的不便。如果可以有一种每周注射一次的基础胰岛素制剂，那将会大大提升广大患者的生活品质。
WO1995007931A1公开了已上市长效胰岛素地特胰岛素，其作用时间可以达到24小时，其分子结构是去B30人胰岛素的B29位赖氨酸残基上连接了一个C14脂肪酸链。WO2005012347A1公开了另一种已上市的长效胰岛素德谷胰岛素，虽然也是每天注射一次，但其药效曲线更加平缓作用时间更长，可以在注射1针后的最长42小时内注射第二针，其分子结构是通过一个谷氨酸连接子在去B30人胰岛素的B29位赖氨酸残基上连接了一个C16脂肪二酸。CN101573133B和WO2009/01042B公开了PEG化胰岛素，通过在胰岛素N端连接PEG延长胰岛素的作用时间。
目前的已经上市的基础胰岛素或其类似物中，半衰期最长的为德谷胰岛素，约为25小时，作用持续时间超过42小时，但其也只能实现每日给药一次。目前为止还未有一款注射周期超过两天的基础胰岛素类产品上市。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型胰岛素衍生物。本发明通过替换人胰岛素的A链或B链亦或同时替换A链和B链中的一个或多个氨基酸使其具有良好的对抗体内蛋白酶降解的性能；同时具有较好的水溶性，再通过酰化反应在B29位连接一个脂肪酸侧链，使其与白蛋白可逆性结合，进一步增加在体内存在的时间，进而实现长效化作用机制。本发明的胰岛素衍生物表现出明显的长周期胰岛素的作用特点，可以开发为一周一次给药的人胰岛素类似物。
本发明的技术方案如下：
一种胰岛素衍生物，所述胰岛素衍生物对人胰岛素的A链和/或B链中至少一个氨基酸进行替换；且所述胰岛素衍生物的B链第29位处的Lys（K）残基的ε氨基通过酰化反应增加脂肪酸侧链，第30位Thr（T）被删除。其中，人胰岛素的A链和B链的氨基酸序列分别如SEQID NO .1和SEQ ID NO .2所示。
进一步地，所述酰化反应的取代基团包括酰基与连接体基团；所述酰基包括C18-C22的脂肪酸；所述连接体基团包括γGlu与2-5个OEG氨基酸残基，其中γGlu代表谷氨酸，OEG代表乙二醇胺。
进一步地，所述胰岛素衍生物的B链位置17处的Leu（L）被替换为酸性、碱性或非极性氨基酸；所述酸性氨基酸包括Asp（D）和Glu（E）；所述碱性氨基酸包括His(H)和Arg(R)；所述非极性氨基酸包括Trp(W)。
进一步地，所述胰岛素衍生物还包括B链位置25处的Phe（F）被替换为酸性氨基酸或碱性氨基酸；所述碱性氨基酸包括His(H)；所述酸性氨基酸包括Glu(E)。
进一步地，所述胰岛素衍生物还包括一个或多个选自下组的氨基酸取代：
B链位置3处的Asn（N）被替换为Asp（D）、His（H）或Glu（E）；
B链位置4处的Gln（Q）被替换为His（H）；
B链位置14处的Ala（A）被替换为Gly（G）；
A链位置14处的Tyr（Y）被替换为Asp（D）或Glu（E）；
A链位置15处的Gln（Q）被替换为Glu（E）；
A链位置19处的Tyr（Y）被替换为Asp（D）或His（H）。
一种胰岛素衍生物，所述胰岛素衍生物的A链位于位置14处的Tyr（Y）被替换为Asp（D）或Glu（E）；所述B链的位置25处的Phe（F）被替换为His（H）或Glu（E）；和/或所述B链的位置16处的Tyr（Y）被替换为His（H）或Glu（E）；和/或所述B链的位置3处的Asn（N）被替换为Glu（E）或His（H）；且所述胰岛素衍生物的B链第29位处的Lys残基的ε氨基通过酰化反应增加脂肪酸侧链，第30位Thr（T）被删除。
进一步地，所述胰岛素衍生物选自下列化合物中的任一种：
化合物1：B17E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；（表示人胰岛素中B链17位的氨基酸L已经被突变为E，B链29位的氨基酸K已经通过其ε位残基的氮被酰化连上一个二十烷二酰基-gGlu-2xOEG，B链30位的氨基酸T已经被剔除）（A链和B链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。）。
化合物2：B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；（A链和B链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6所示。）
化合物3：B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；（A链和B链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示。）
化合物4：B17E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-3xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物5：B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-3xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物6：B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-3xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物7：B17E，B29K（Nε二十二烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物8：B17E，B25H，B29K（Nε二十二烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物9：B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十二烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物10：B17H，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素； （A链和B链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO .9和SEQ ID NO .10所示。）
化合物11：B17D，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物12：B3H，B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；（A链和B链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO .11和SEQ ID NO .12所示。）
化合物13：B4H，B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物14：B17E，B25H，A14E，A19H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素； （A链和B链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO .13和SEQ ID NO .14所示。）
化合物15：B3E，B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物16：B3D，B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物17：A14E，B14G，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物18：A14E，B17R，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物19：B14G，B17E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物20：A15E，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物21：A14E，B17W，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物22：A14E，B16H，B25E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物23：A14E，B16E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物24：A14E，B3E，B16E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物25：A14D，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物26：A14D，B3E，B16H，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素。
胰岛素的A链和B链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示
SEQ ID NO .1
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO .2
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK
化合物1：B17E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；（SEQ IDNO .3和SEQ ID NO .4）
SEQ ID NO .3
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO .4
FVNQHLCGSHLVEALYEVCGERGFFYTPK
化合物2：B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；（SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6）
SEQ ID NO .5
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO .6
FVNQHLCGSHLVEALYEVCGERGFHYTPK
化合物3：B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；（SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8）
SEQ ID NO .7
GIVEQCCTSICSLEQLENYCN
SEQ ID NO .8
FVNQHLCGSHLVEALYEVCGERGFHYTPK
化合物10，即A14E，B17H，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素。
SEQ ID NO .9
GIVEQCCTSICSLEQLENYCN
SEQ ID NO .10
FVNQHLCGSHLVEALYHVCGERGFHYTPK
化合物12，即A14E，B3H，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素。
SEQ ID NO .11
GIVEQCCTSICSLEQLENYCN
SEQ ID NO .12
FVHQHLCGSHLVEALYEVCGERGFHYTPK
化合物14，即A14E，A19H，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素。
SEQ ID NO .13
GIVEQCCTSICSLEQLENHCN
SEQ ID NO .14
FVNQHLCGSHLVEALYEVCGERGFHYTPK
化合物4-9、11、13、15-26的序列均可通过人胰岛素的序列通过上述替换得到。同时，本发明所述位置是从N端开始计数，比如所述“B链位置3处的Asn被替换为Asp、His或Glu”是指从N端开始计数，处于第3位的氨基酸Asn被替换为Asp、His或Glu。所述“B17E”表示B链从N段开始计数，第17位的氨基酸被替代为E。“DesB30”是指缺乏B30氨基酸的天然胰岛素B链或其类似物。所述B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素为人胰岛素的一种衍生物，其中A链中位置14处的氨基酸被置换为E，同时，B链中位置17处的氨基酸被置换为E，位置25处的氨基酸被替换为H，同时，B链中位置30处的氨基酸被删除。
本发明所述氨基酸采用三字母或单字母代码。其含义为本领域公知的含义。具体如下：丙氨酸 Ala/ A ；精氨酸 Arg/R；天冬氨酸 Asp/D ；半胱氨酸 Cys/C ；谷氨酰胺Gln/Q ；谷氨酸 Glu/E ；组氨酸 His/H ；甘氨酸 Gly/G ；天冬酰胺 Asn/N ；酪氨酸 Tyr /Y ；脯氨酸 Pro/P ；丝氨酸 Ser/S ；甲硫氨酸 Met/M ；赖氨酸 Lys/K ；缬氨酸 Val/V；异亮氨酸 Ile/I ；苯丙氨酸 Phe/F ；亮氨酸 Leu/L ；色氨酸 Trp/W ；苏氨酸 Thr/T。
本发明还保护上述胰岛素衍生物在制备用于治疗或预防糖尿病药物中的用途，其作用周期可以达到1周。
本发明有益的技术效果在于：
1，本发明的新型胰岛素衍生物相对于人胰岛素，通过将位点B17的氨基酸Leu(L)突变成Asp（D）、His（H）、Glu（E）、Arg（R）、Trp（W）等氨基酸；B25位Phe（F）突变成His（H）、Glu（E）等氨基酸，以及其他如A14位点、A19位点、B3位点、B4位点等进行氨基酸突变后，可大大改善体内降解酶的酶切，使化合物具有良好的对抗体内蛋白酶降解的性能，从而提高作用周期；通过酰化反应在B29位增加长链脂肪酸后，可以增加化合物和体内白蛋白的结合能力、竞争性，降低和肝细胞表面的受体结合能力，从而减少受体介导的肝细胞内吞和降解效应，提高在外周循环系统的作用周期。
2，本发明为一系列可以实现最长每周注射一次的基础胰岛素类似物的衍生物，具有较长的药代动力学特征，使用该产品的患者每周只需要注射一次，同样能达到满意的治疗效果，大大缩减了注射次数，提高了患者的生活品质，降低了皮肤硬化及硬化后并发症的风险。
附图说明
图1为本发明化合物3的结构示意图。
图2为本发明化合物3链接到B链第29位处的赖氨酸残基的ε氨基上的脂肪酸侧链结构示意图。
图3为本发明实施例3获得的化合物3和化合物3酰化前的化合物采用胰岛素类产品常用的V8酶进行消化鉴定后，消化的肽图，再进行肽图质谱进一步鉴定后的肽图。
图中：（A）、为酰化前的图；（B）、为酰化后的图。
图4为胰蛋白酶对德谷胰岛素、化合物1、化合物2和化合物3的消化时间曲线。
图5为胰蛋白酶对德谷胰岛素、化合物3、化合物10、化合物12和化合物14的消化时间曲线。
图6为德谷胰岛素、化合物1、化合物2、化合物3在大鼠体内降血糖的作用时间曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
化合物1，即B17E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素。
名称如下：N-{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-（19-羧基十九烷基氨基）丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluB17]，des-Thr B30-胰岛素（人）
结构如下：
其制备方法如下：
（1）B17E，DesB30人胰岛素的制备
采用本领域内众所周知的基因工程技术，通过编码所需要蛋白的DNA序列，利用基因工程菌大肠杆菌BL21表达目的蛋白B17E，DesB30胰岛素前体，采用的表达载体可以为PET系列载体，然后转化到感受态大肠杆菌中，筛选阳性克隆表达前体蛋白。然后在发酵罐中37℃培养大肠杆菌并表达前体蛋白，收集前体蛋白包涵体。
收集的前体蛋白通过蛋白变复性，获得成熟蛋白，蛋白采用重组胰蛋白酶或者赖氨酸肽链内切酶常温下酶切，并通过分离纯度获得纯度超过95%的B17E，DesB30人胰岛素。
（2）二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu的制备
二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu通过固相合成的方式使用相关领域人员广泛熟知的程序合成，该程序包括：将9-芴甲氧羰基保护的氨基酸连接至聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯树脂。所用方法可参见Organic Synthesis on Solid Phase，F.Z. Dorwald，Wiley-VCH,2000. ISBN 3-527-29950-5; Peptides: Chemisty and Biology N. Sewald&H.-D.Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3;和The Combinatorial CheemistryCatalog 1999, Novabiochem AG。在将9-芴甲氧羰基氨基酸连接至树脂后，使用例如仲胺哌啶或二乙胺将9-芴甲氧羰基团脱去（脱保护），接着再偶联下一个9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后再脱保护。合成序列通过偶联单叔丁基保护的脂肪二酸，即得到二十烷二酸单叔丁酯终止。使用0.5%~5%TFA/DCM(含三氟乙酸的二氯甲烷溶液)将化合物从树脂上解离下来。最后将C末端羧基活化，例如作为N-羟基琥珀酰亚胺脂（OSu）可直接或纯化后作为偶联试剂、或在脱保护后，用于连接于人胰岛素或胰岛素类似物，进而得到胰岛素类似物的衍生物。
LC-MS(电喷雾)：m/z=859.02
（3）B17E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素的制备
将B17E，DesB30人胰岛素（3g，0.53 mmol）溶于100ml纯化水中，然后加入乙腈（100ml），用1M Na2CO3溶液调节pH至11.5~12.0。将二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu（0.75g，0.87mmol）溶于3.8ml的N-甲基吡咯烷酮中，然后缓慢的加入到B17E，DesB30人胰岛素溶液中，边加边搅拌，并且使用1M Na2CO3溶液维持反应pH在11.5~12.0。反应30分钟可以得到B17E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG）DesB30人胰岛素。
（4）B17E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素的纯化
使用sourceQ30填料在AKTA纯化仪器上纯化蛋白。
柱：160ml（2.6*30cm）
缓冲液A：20mM Tris 42%乙醇溶液pH7.0
缓冲液B：20mM Tris 500mM乙酸铵42%乙醇溶液pH7.0
梯度：0-80%B相，15CV
流速：25ml/min
通过本层析后可以获得95%左右纯度蛋白分子，经冻干可获得纯品蛋白用于各种检测。通过质谱进行分子量鉴定化合物正确。用于后续的体外和体内活性等研究。
实施例2
化合物2，即B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素。
名称如下：N-{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-（19-羧基十九烷基氨基）丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluB17，HisB25]，des-Thr B30-胰岛素（人）
结构如下：
其制备方法如下：
（1）B17E，B25H，DesB30人胰岛素的制备
采用本领域内众所周知的基因工程技术，通过编码所需要的蛋白的DNA序列，利用基因工程菌大肠杆菌表达目的蛋白即B17E，B25H，Des-B30胰岛素前体，采用表达载体可以为PET系列载体，然后转化到感受态大肠杆菌中，筛选阳性克隆表达前体蛋白。然后在发酵罐中37℃培养大肠杆菌并表达前体蛋白，收集前体蛋白包涵体。
收集的前体蛋白通过蛋白变复性，获得成熟蛋白，蛋白采用重组胰蛋白酶或者赖氨酸肽链内切酶常温下酶切，并通过分离纯度获得纯度超过95%的B17E，B25H，DesB30人胰岛素。
（2）二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu的制备
二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu可通过固相合成的方式使用相关领域人员广泛熟知的程序合成，该程序包括将9-芴甲氧羰基保护的氨基酸连接至聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯树脂。所用方法可参见Organic Synthesis on Solid Phase，F.Z. Dorwald，Wiley-VCH,2000. ISBN 3-527-29950-5; Peptides: Chemisty and Biology N. Sewald&H.-D.Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3;和The Combinatorial CheemistryCatalog 1999, Novabiochem AG；和其参考的文献。在将9-芴甲氧羰基氨基酸连接至树脂后，使用例如仲胺哌啶或二乙胺将9-芴甲氧羰基基团脱去（脱保护），接着再偶联下一个9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后再脱保护。合成序列通过偶联单叔丁基保护的脂肪二酸，即得到二十烷二酸单叔丁酯终止。使用0.5%~5%TFA/DCM(含三氟乙酸的二氯甲烷溶液)将化合物从树脂上解离下来。最后将C末端羧基活化，例如作为N-羟基琥珀酰亚胺脂（OSu）可直接或纯化后作为偶联试剂，或在脱保护后用于连接胰岛素或其它胰岛素类似物，进而得到胰岛素类似物的衍生物。
LC-MS(电喷雾)：m/z=859.02
（3）B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素的制备
将B17E，B25H，DesB30人胰岛素（3g，0.53 mmol）溶于100ml纯化水中，然后加入乙腈（100ml），用1M Na2CO3溶液调节pH至11.5~12.0。将二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu（0.75g，0.87mmol）溶于3.8ml的N-甲基吡咯烷酮中，然后缓慢的加入到B17E，B25H，DesB30人胰岛素溶液中，边加边搅拌，并且使用1M Na2CO3溶液维持反应pH在11.5~12.0，反应30分钟可以得到B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG）DesB30人胰岛素（化合物2）。
（4）B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素的纯化
使用sourceQ30填料在AKTA纯化仪器上纯化蛋白。
柱：160ml（2.6*30cm）
缓冲液A：20mM Tris 42%乙醇溶液pH7.0
缓冲液B：20mM Tris 500mM乙酸铵42%乙醇溶液pH7.0
梯度：0-80%B相，15CV
流速：25ml/min
通过本层析后可以获得95%左右纯度蛋白分子，经冻干可获得纯品蛋白用于各种检测。通过质谱进行分子量鉴定化合物正确。用于后续的体外和体内活性等研究。
实施例3
化合物3，即A14E，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素。
名称如下：N-{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-（19-羧基十九烷基氨基）丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14，GluB17，HisB25]，des-Thr B30-胰岛素（人）
结构如下：
其制备方法如下：
（1）A14E，B17E，B25H，DesB30人胰岛素的制备
采用本领域内众所周知的基因工程技术，通过编码所需要的蛋白的DNA序列，利用基因工程菌大肠杆菌表达目的蛋白即A14E，B17E，B25H，Des-B30胰岛素前体，采用表达载体可以为PET系列载体，然后转化到感受态大肠杆菌中，筛选阳性克隆表达前体蛋白。然后在发酵罐中37℃培养大肠杆菌并表达前体蛋白，收集前体蛋白包涵体。
收集的前体蛋白通过蛋白变复性，获得成熟蛋白，蛋白采用重组胰蛋白酶或者赖氨酸肽链内切酶常温下酶切，并通过分离纯度获得纯度超过95%的A14E，B17E，B25H，DesB30人胰岛素。
（2）二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu的制备
二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu可通过固相合成的方式使用相关领域人员广泛熟知的程序合成，该程序包括将9-芴甲氧羰基保护的氨基酸连接至聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯树脂。所用方法可参见Organic Synthesis on Solid Phase，F.Z. Dorwald，Wiley-VCH,2000. ISBN 3-527-29950-5; Peptides: Chemisty and Biology N. Sewald&H.-D.Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3;和The Combinatorial CheemistryCatalog 1999, Novabiochem AG；和其参考的文献。在将9-芴甲氧羰基氨基酸连接至树脂后，使用例如仲胺哌啶或二乙胺将9-芴甲氧羰基基团脱去（脱保护），接着再偶联下一个9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后再脱保护。合成序列通过偶联单叔丁基保护的脂肪二酸，即得到二十烷二酸单叔丁酯终止。使用0.5%~5%TFA/DCM(含三氟乙酸的二氯甲烷溶液)将化合物从树脂上解离下来。最后将C末端羧基活化，例如作为N-羟基琥珀酰亚胺脂（OSu）可直接或纯化后作为偶联试剂，或在脱保护后用于连接胰岛素或其它胰岛素类似物，进而得到胰岛素类似物的衍生物。
LC-MS(电喷雾)：m/z=859.02
（3）A14E，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素的制备
将A14E，B17E，B25H，DesB30人胰岛素（3g，0.53 mmol）溶于100ml纯化水中，然后加入乙腈（100ml），用1M Na2CO3溶液调节pH至11.5~12.0。将二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu（0.75g，0.87mmol）溶于3.8ml的N-甲基吡咯烷酮中，然后缓慢的加入到A14E，B17E，B25H，DesB30人胰岛素溶液中，边加边搅拌，并且使用1M Na2CO3溶液维持反应pH在11.5~12.0，反应30分钟可以得到A14E，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG）DesB30人胰岛素（化合物3）。
（4）A14E，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素的纯化
使用sourceQ30填料在AKTA纯化仪器上纯化蛋白。
柱：160ml（2.6*30cm）
缓冲液A：20mM Tris 42%乙醇溶液pH7.0
缓冲液B：20mM Tris 500mM乙酸铵42%乙醇溶液pH7.0
梯度：0-80%B相，15CV
流速：25ml/min
通过本层析后可以获得95%左右纯度蛋白分子，经冻干可获得纯品蛋白用于各种检测。通过质谱进行分子量鉴定化合物正确。用于后续的体外和体内活性等研究。
实施例4
化合物10，即A14E，B17H，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素。
名称如下：N-{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-（19-羧基十九烷基氨基）丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14，HisB17，HisB25]，des-Thr B30-胰岛素（人）
结构如下：
其制备方法如下：
（1）A14E，B17H，B25H，DesB30人胰岛素的制备
采用本领域内众所周知的基因工程技术，通过编码所需要的蛋白的DNA序列，利用基因工程菌大肠杆菌表达目的蛋白即A14E，B17H，B25H，Des-B30胰岛素前体，采用表达载体可以为PET系列载体，然后转化到感受态大肠杆菌中，筛选阳性克隆表达前体蛋白。然后在发酵罐中37℃培养大肠杆菌并表达前体蛋白，收集前体蛋白包涵体。
收集的前体蛋白通过蛋白变复性，获得成熟蛋白，蛋白采用重组胰蛋白酶或者赖氨酸肽链内切酶常温下酶切，并通过分离纯度获得纯度超过95%的A14E，B17H，B25H，DesB30人胰岛素。
（2）二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu的制备
二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu可通过固相合成的方式使用相关领域人员广泛熟知的程序合成，该程序包括将9-芴甲氧羰基保护的氨基酸连接至聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯树脂。所用方法可参见Organic Synthesis on Solid Phase，F.Z. Dorwald，Wiley-VCH,2000. ISBN 3-527-29950-5; Peptides: Chemisty and Biology N. Sewald&H.-D.Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3;和The Combinatorial CheemistryCatalog 1999, Novabiochem AG；和其参考的文献。在将9-芴甲氧羰基氨基酸连接至树脂后，使用例如仲胺哌啶或二乙胺将9-芴甲氧羰基基团脱去（脱保护），接着再偶联下一个9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后再脱保护。合成序列通过偶联单叔丁基保护的脂肪二酸，即得到二十烷二酸单叔丁酯终止。使用0.5%~5%TFA/DCM(含三氟乙酸的二氯甲烷溶液)将化合物从树脂上解离下来。最后将C末端羧基活化，例如作为N-羟基琥珀酰亚胺脂（OSu）可直接或纯化后作为偶联试剂，或在脱保护后用于连接胰岛素或其它胰岛素类似物，进而得到胰岛素类似物的衍生物。
LC-MS(电喷雾)：m/z=859.02
（3）A14E，B17H，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素的制备
将A14E，B17H，B25H，DesB30人胰岛素（3g，0.53 mmol）溶于100ml纯化水中，然后加入乙腈（100ml），用1M Na2CO3溶液调节pH至11.5~12.0。将二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu（0.75g，0.87mmol）溶于3.8ml的N-甲基吡咯烷酮中，然后缓慢的加入到A14E，B17E，B25H，DesB30人胰岛素溶液中，边加边搅拌，并且使用1M Na2CO3溶液维持反应pH在11.5~12.0，反应30分钟可以得到A14E，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG）DesB30人胰岛素（化合物10）。
（4）A14E，B17H，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG）DesB30人胰岛素的纯化
使用sourceQ30填料在AKTA纯化仪器上纯化蛋白。
柱：160ml（2.6*30cm）
缓冲液A：20mM Tris 42%乙醇溶液pH7.0
缓冲液B：20mM Tris 500mM乙酸铵42%乙醇溶液pH7.0
梯度：0-80%B相，15CV
流速：25ml/min
通过本层析后可以获得95%左右纯度蛋白分子，经冻干可获得纯品蛋白用于各种检测。通过质谱进行分子量鉴定化合物正确。用于后续的体外和体内活性等研究。
实施例5
化合物12，即A14E，B3H，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素。
名称如下：N-{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-（19-羧基十九烷基氨基）丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14，HisB3，GluB17，HisB25]，des-Thr B30-胰岛素（人）
结构如下：
其制备方法如下：
（1）A14E，B3H，B17E，B25H，DesB30人胰岛素的制备
采用本领域内众所周知的基因工程技术，通过编码所需要的蛋白的DNA序列，利用基因工程菌大肠杆菌表达目的蛋白即A14E，B3H，B17E，B25H，Des-B30胰岛素前体，采用表达载体可以为PET系列载体，然后转化到感受态大肠杆菌中，筛选阳性克隆表达前体蛋白。然后在发酵罐中37℃培养大肠杆菌并表达前体蛋白，收集前体蛋白包涵体。
收集的前体蛋白通过蛋白变复性，获得成熟蛋白，蛋白采用重组胰蛋白酶或者赖氨酸肽链内切酶常温下酶切，并通过分离纯度获得纯度超过95%的A14E，B3H，B17E，B25H，DesB30人胰岛素。
（2）二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu的制备
二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu可通过固相合成的方式使用相关领域人员广泛熟知的程序合成，该程序包括将9-芴甲氧羰基保护的氨基酸连接至聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯树脂。所用方法可参见Organic Synthesis on Solid Phase，F.Z. Dorwald，Wiley-VCH,2000. ISBN 3-527-29950-5; Peptides: Chemisty and Biology N. Sewald&H.-D.Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3;和The Combinatorial CheemistryCatalog 1999, Novabiochem AG；和其参考的文献。在将9-芴甲氧羰基氨基酸连接至树脂后，使用例如仲胺哌啶或二乙胺将9-芴甲氧羰基基团脱去（脱保护），接着再偶联下一个9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后再脱保护。合成序列通过偶联单叔丁基保护的脂肪二酸，即得到二十烷二酸单叔丁酯终止。使用0.5%~5%TFA/DCM(含三氟乙酸的二氯甲烷溶液)将化合物从树脂上解离下来。最后将C末端羧基活化，例如作为N-羟基琥珀酰亚胺脂（OSu）可直接或纯化后作为偶联试剂，或在脱保护后用于连接胰岛素或其它胰岛素类似物，进而得到胰岛素类似物的衍生物。
LC-MS(电喷雾)：m/z=859.02
（3）A14E，B3H，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素的制备
将A14E，B3H，B17E，B25H，DesB30人胰岛素（3g，0.53 mmol）溶于100ml纯化水中，然后加入乙腈（100ml），用1M Na2CO3溶液调节pH至11.5~12.0。将二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu（0.75g，0.87mmol）溶于3.8ml的N-甲基吡咯烷酮中，然后缓慢的加入到A14E，B17E，B25H，DesB30人胰岛素溶液中，边加边搅拌，并且使用1M Na2CO3溶液维持反应pH在11.5~12.0，反应30分钟可以得到A14E，B3H，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素（化合物12）。
（4）A14E，B3H，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素的纯化
使用sourceQ30填料在AKTA纯化仪器上纯化蛋白。
柱：160ml（2.6*30cm）
缓冲液A：20mM Tris 42%乙醇溶液pH7.0
缓冲液B：20mM Tris 500mM乙酸铵42%乙醇溶液pH7.0
梯度：0-80%B相，15CV
流速：25ml/min
通过本层析后可以获得95%左右纯度蛋白分子，经冻干可获得纯品蛋白用于各种检测。通过质谱进行分子量鉴定化合物正确。用于后续的体外和体内活性等研究。
实施例6
化合物14，即A14E，A19H，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素。
名称如下：N-{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-（19-羧基十九烷基氨基）丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14，HisA19，GluB17，HisB25]，des-Thr B30-胰岛素（人）
结构如下：
其制备方法如下：
（1）A14E，A19H，B17E，B25H，DesB30人胰岛素的制备
采用本领域内众所周知的基因工程技术，通过编码所需要的蛋白的DNA序列，利用基因工程菌大肠杆菌表达目的蛋白即A14E，A19H，B17E，B25H， Des-B30胰岛素前体，采用表达载体可以为PET系列载体，然后转化到感受态大肠杆菌中，筛选阳性克隆表达前体蛋白。然后在发酵罐中37℃培养大肠杆菌并表达前体蛋白，收集前体蛋白包涵体。
收集的前体蛋白通过蛋白变复性，获得成熟蛋白，蛋白采用重组胰蛋白酶或者赖氨酸肽链内切酶常温下酶切，并通过分离纯度获得纯度超过95%的A14E，A19H，B17H，B25H，DesB30人胰岛素。
（2）二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu的制备
二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu可通过固相合成的方式使用相关领域人员广泛熟知的程序合成，该程序包括将9-芴甲氧羰基保护的氨基酸连接至聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯树脂。所用方法可参见Organic Synthesis on Solid Phase，F.Z. Dorwald，Wiley-VCH,2000. ISBN 3-527-29950-5; Peptides: Chemisty and Biology N. Sewald&H.-D.Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3;和The Combinatorial CheemistryCatalog 1999, Novabiochem AG；和其参考的文献。在将9-芴甲氧羰基氨基酸连接至树脂后，使用例如仲胺哌啶或二乙胺将9-芴甲氧羰基基团脱去（脱保护），接着再偶联下一个9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后再脱保护。合成序列通过偶联单叔丁基保护的脂肪二酸，即得到二十烷二酸单叔丁酯终止。使用0.5%~5%TFA/DCM(含三氟乙酸的二氯甲烷溶液)将化合物从树脂上解离下来。最后将C末端羧基活化，例如作为N-羟基琥珀酰亚胺脂（OSu）可直接或纯化后作为偶联试剂，或在脱保护后用于连接胰岛素或其它胰岛素类似物，进而得到胰岛素类似物的衍生物。
LC-MS(电喷雾)：m/z=859.02
（3）A14E，A19H，B17E，B25H， B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素的制备
将A14E，A19H，B17H，B25E， DesB30人胰岛素（3g，0.53 mmol）溶于100ml纯化水中，然后加入乙腈（100ml），用1M Na2CO3溶液调节pH至11.5~12.0。将二十烷二酰基-γGlu-2xOEG-OSu（0.75g，0.87mmol）溶于3.8ml的N-甲基吡咯烷酮中，然后缓慢的加入到A14E，A19H，B17E，B25H，DesB30人胰岛素溶液中，边加边搅拌，并且使用1M Na2CO3溶液维持反应pH在11.5~12.0，反应30分钟可以得到A14E，A19H，B17E，B25H， B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG）DesB30人胰岛素（化合物14）。
（4）A14E，A19H，B17E，B25H， B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG）DesB30人胰岛素的纯化
使用sourceQ30填料在AKTA纯化仪器上纯化蛋白。
柱：160ml（2.6*30cm）
缓冲液A：20mM Tris 42%乙醇溶液pH7.0
缓冲液B：20mM Tris 500mM乙酸铵42%乙醇溶液pH7.0
梯度：0-80%B相，15CV
流速：25ml/min
通过本层析后可以获得95%左右纯度蛋白分子，经冻干可获得纯品蛋白用于各种检测。通过质谱进行分子量鉴定化合物正确。用于后续的体外和体内活性等研究。
对比例1
采购德谷胰岛素(Novo Nordisk A/S批号：KP54898-1)作为对比例1。
测试例
（1）消化鉴定：
本发明实施例3获得的化合物3适应胰岛素类产品常用的V8酶进行消化鉴定：取本化合物适量，加入0.1%三氟醋酸溶液，制成每1ml中含10mg的溶液，取20μl，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH7.3）20μl、0.1%V8酶溶液20μl与水140μl，混匀，置37℃水浴中2小时后，加磷酸3μl，作为供试品溶液；另取化合物3酰化前的化合物适量，同法制备，作为对比溶液。照效价测定项下的方法，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（pH2.3）-乙腈（90:10）为流动相A，乙腈-水（50:50）为流动相B，按照表1进行梯度洗脱。
表1梯度洗脱程序
取对照品溶液和供试品溶液各25μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，消化的蛋白肽再进行肽图质谱进一步鉴定，得到的肽图数据如图3。
（2）酶消化对比研究：
对本申请不同化合物和对比例1使用胰蛋白酶、羧肽酶A(CPA)等体内蛋白消化酶进行酶切分析，对比例1和本申请不同化合物对体内蛋白酶抗消化的分析如图4、图5和表2所示。
表2胰蛋白酶对本申请不同化合物和对比例1消化90%时间
结果表明，B17位突变成Glu或其他酸性、碱性、非极性氨基酸后，对抗酶活性增加，增加其他位点突变成其他酸性、碱性、非极性氨基酸后，对抗酶降解活性也会在这个基础上再逐渐增加。
（3）小鼠降血糖试验：
对BALB/c小鼠进行降血糖测试，测试本申请不同化合物和对比例1降血糖的作用时间，对比例1给药1mg/Kg，本申请化合物3mg/Kg给药，其在小鼠中降血糖作用周期如表3所示。
表3本申请不同化合物和对比例1在小鼠体内降血糖的作用时间
结果表明，B17位突变成Glu或其他酸性、碱性、非极性氨基酸后，其小鼠体内作用周期远远优于对比例1；进一步增加其他位点突变成其他酸性、碱性、非极性氨基酸后，各个化合物在小鼠体内的作用周期进一步延长，在小鼠体内作用周期可以达到40小时以上。
（4）大鼠降血糖试验:
对SD大鼠进行降血糖测试，测试本申请不同化合物和对比例1降血糖的作用时间，对比例1给药0.75mg/Kg，本申请化合物3mg/Kg给药，部分结果如图6所示，其在大鼠中降血糖作用周期如表4所示。
表4本发明不同化合物和对比例1在大鼠体内降血糖的作用时间
结果表明，B17位突变成突变成Glu或其他酸性、碱性、非极性氨基酸后，其大鼠体内作用周期远远优于对比例1的德谷胰岛素；进一步增加其他位点突变成其他酸性、碱性、非极性氨基酸后，各个化合物在大鼠体内的作用周期进一步延长，在大鼠体内作用周期可以达到60小时以上。
以上试验结果表明，突变B17位点为Glu时，对于抵抗体内酶反应、延长动物体内的降糖作用周期有较大帮助，所以本品拟保护B17位点突变成Glu、His、Asp突变，进一步保护化合物3以及对应的化合物突变、化合物12以及对应的覆盖。这些化合物具有潜在开发成一周给药一次的人胰岛素类似物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种胰岛素衍生物，其特征在于，所述胰岛素衍生物对人胰岛素的A链和/或B链中至少一个氨基酸进行替换；且所述胰岛素衍生物的B链第29位处的Lys残基的ε氨基通过酰化反应增加脂肪酸侧链，第30位Thr被删除。
2.根据权利要求1所述的胰岛素衍生物，其特征在于，所述酰化反应的取代基团包括酰基与连接体基团；所述酰基包括C18-C22的脂肪酸；所述连接体基团包括γGlu与2-5个OEG氨基酸残基，其中γGlu代表谷氨酸，OEG代表乙二醇胺。
3.根据权利要求1所述的胰岛素衍生物，其特征在于，所述胰岛素衍生物的B链位置17处的Leu被替换为酸性、碱性或非极性氨基酸；所述酸性氨基酸包括Asp和Glu；所述碱性氨基酸包括His和Arg；所述非极性氨基酸包括Trp。
4.根据权利要求3所述的胰岛素衍生物，其特征在于，所述胰岛素衍生物还包括B链位置25处的Phe被替换为酸性或碱性氨基酸；所述碱性氨基酸包括His；所述酸性氨基酸包括Glu。
5.根据权利要求4所述的胰岛素衍生物，其特征在于，所述胰岛素衍生物还包括一个或多个选自下组的氨基酸取代：
B链位置3处的Asn被替换为Asp、His或Glu；
B链位置4处的Gln被替换为His；
B链位置14处的Ala被替换为Gly；
A链位置14处的Tyr被替换为Asp或Glu；
A链位置15处的Gln被替换为Glu；
A链位置19处的Tyr被替换为Asp或His。
6.根据权利要求1所述的胰岛素衍生物，其特征在于，所述胰岛素衍生物的A链位于位置14处的Tyr被替换为Asp或Glu；同时，所述B链的位置25处的Phe被替换为His或Glu，和/或所述B链的位置16处的Tyr被替换为His或Glu，和/或所述B链的位置3处的Asn被替换为Glu或His。
7.根据权利要求1-6任一项所述的胰岛素衍生物，其特征在于，所述胰岛素衍生物选自下列化合物中的任一种：
化合物1：B17E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物2：B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物3：B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物4：B17E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-3xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物5：B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-3xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物6：B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-3xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物7：B17E，B29K（Nε二十二烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物8：B17E，B25H，B29K（Nε二十二烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物9：B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十二烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物10：B17H，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物11：B17D，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物12：B3H，B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物13：B4H，B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物14：B17E，B25H，A14E，A19H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物15：B3E，B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物16：B3D，B17E，B25H，A14E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物17：A14E，B14G，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物18：A14E，B17R，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物19：B14G，B17E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物20：A15E，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物21：A14E，B17W，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物22：A14E，B16H，B25E，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物23：A14E，B16E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物24：A14E，B3E，B16E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物25：A14D，B17E，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素；
化合物26：A14D，B3E，B16H，B25H，B29K（Nε二十烷二酰基-γGlu-2xOEG），DesB30人胰岛素。
8.一种权利要求1-7任一项所述胰岛素衍生物在制备用于治疗或预防糖尿病药物中的用途。
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|---|
| THOMAS B. KJELDSER: "Molecular Engineering of Insuin Icodec, the First Acylated Insulin Analog for Once-Weekly Administration in Human", J.MED.CHEM, vol. 64, no. 13, pages 8942 - 8950 * |
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