CN102796192A - 人胰高血糖素相关肽-1类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，公开两种人胰高血糖素相关肽-1的类似物的工程菌构建、表达、目的肽的制备方法。通过双酶切后插入目的序列，并在融合蛋白前端加入His标签，通过获得融合蛋白，用酸切割融合蛋白获得目的肽，等电点沉淀后再次通过Ni琼脂糖凝胶亲和层析获得目的肽。冻干后目的肽溶于PBS缓冲液中，对正常雄性ICR小鼠进行口服耐血糖实验及测定血清胰岛素浓度。这两种类似物是人胰高血糖素相关肽-1的改构多肽，实验证明两种多肽均具有降低血糖作用，可用于治疗2型糖尿病。另外本发明还提供了制备上述多肽的方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，公开两种人胰高血糖素相关肽-1类似物pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D肽和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽工程菌的构建、多肽的制备方法和降糖活性检测。用本实验室构建的新的长度30-70aa的活性多肽的融合表达制备技术平台，构建在大肠杆菌细胞内高效融合表达人胰高血糖素相关肽-1类似物。
pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D的基因工程菌，人胰高血糖素相关肽-1类似物的N端的丙氨酸(Ala)残基被Gly取代，C末端接加D氨基酸残基。pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD的基因工程菌，人胰高血糖素相关肽-1类似物的N端的丙氨酸(Ala)残基被Gly取代，22位Gly被Glu取代，同时N端接加2个脯氨酸残基，C末端接加PPSRD氨基酸残基。
在pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D肽和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽的N端设计一个酸敏感位点(Asp-Pro)，用酸切割融合蛋白His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD，获得目的肽pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D肽和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽。pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽在体内被DPPIV及PPCE酶切割生成高活性的h[Gly8]GLP-1(7-36)D和h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD。重组菌经裂解→洗涤→再溶解→Ni琼脂糖凝胶层析分离→分离出融合蛋白→50mM HCl水解融合蛋白→Ni琼脂糖凝胶层析分离，测得pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D相对分子质量为3593.95Da，pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽相对分子质量为3947.33Da。
pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D肽和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽无需复性，冻干后溶于PBS中，对正常小鼠进行口服耐血糖实验，并测定小鼠胰岛素分泌情况。
技术背景
人胰高血糖素相关肽-1(或人胰高血糖素样肽-1，human Glucagon-like peptide-1，hGLP-1)GLP-1作为一种肠肽激素，其生理功能主要包括这样几个方面：(1)GLP-1能血糖依赖性的刺激胰岛素分泌，故不会出现低血糖现象；(2)GLP-1能刺激β细胞的胰岛素合成与增殖；(3)GLP-1能抑制胰高血糖素的分泌；(4)对肠道具有调节作用；(5)可作用于中枢神经系统，抑制食欲，产生饱腹感；(6)减少甘油三酯的吸收等。GLP-1的这些生理功能决定了它能对糖尿病起到综合治疗的作用血糖依赖性促胰岛素分泌等多种生理功能，因此，在2型糖尿病的临床治疗中具有较好的应用前景。尽管天然GLP-1在治疗糖尿病上有诸多优点，但有用体内的DPP-IV的快速降解和肾脏代谢作用，导致GLP-1的半衰期很短，使其临床应用受到了很大的限制。针对GLP-1的这一弱点，人们主要从两个方面来探索以GLP-1为基础的治疗糖尿病的药物，一方面是DPP-IV抑制剂的研究，另一方面是GLP-1类似物的研究，通过对GLP-1的结构改造开发更稳定的GLP-1类似物，延长其体内有效时间成为近年来一个热门课题。目前，对于GLP-1类似物的研究虽然取得了一定的进展，但围绕天然GLP-1分子进行改造来设计长效GLP-1类似物仍是该研究领域的焦点。
国外有文献报道：改变GLP-1的氨基酸组成，能改变GLP-1的降糖活性，如用Gly来取代得到的(Gly8)GLP-1对受体的亲和力增强，同时还可以抵抗二肽酶降解。在动物实验只能够发现该突变肽的促胰岛素活性比天然肽好，而且半衰期可达几小时。GLP-1中Gly22为柔性结构，而Exendin-4相应的氨基酸为Glu， 具有增加α螺旋程度作用，提高与GLP-1受体的亲和能力，所以将Gly22替换为Glu可使GLP-1更加稳定；同时Exendin-4的C端部分序列是促胰岛素活性所必需，将Ex4(35-39)接加到GLP-1C端可增加促胰岛分泌活性。
哺乳动物细胞中的二肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV，DPPIV)能从肽类氨基酸末端水解释放二肽。其水解专一底物为NH2-X-Pro-(肽或蛋白链N端第2个氨基酸残基为Pro)；PPCE为水解-Pro-X-的内肽酶，pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽和pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D肽应归为DPPIV和PPCE酶的推测底物，pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽和pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D肽可能在体内被DPPIV和PPCE酶切生成高活性的h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽和h[Gly8]GLP-1(7-36)D肽而发挥作用。
目前国内外获取GLP-1类似物的方法主要有化学合成法和基因工程法。然而化学合成法步骤较多、得率较低、成本很高；基因工程法生产同样存在很多困难，如长度在20～80氨基酸之间的肽类mRNA和表达的蛋白质在宿主细胞内不稳定，导致表达效率很低；用融合方式能获得高效表达。由于化学合成法成本较高，价格昂贵，我们尝试以基因工程的方法来制备GLP-1类似物，以提高产量，降低成本。本专利通过构建GLP-1类似物的高效表达载体，分离纯化出目的肽。
发明内容
本发明的目的是提供人胰高血糖素相关肽-1类似物1pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D肽和人胰高血糖素相关肽-1类似物2pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽和及它们的制备方法，该方法可制备人胰高血糖素相关肽-1类似物pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D肽和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽。
本发明的另一个目的是提供相应的编码序列，载体与宿主细胞。
本发明的另一个目的是pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D肽和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽有显著的降血糖生物学活性。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明第一方面，提供了两种人胰高血糖素相关肽-1类似物，人胰高血糖素相关肽-1类似物1pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D肽包括有在人胰高血糖素相关肽-1类似物前的DPPIV及PPEC酶切位点，以及在N端Ala被Gly取代，同时N端接加2个脯氨酸残基，C端接加D残基。人胰高血糖素相关肽-1类似物2pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽，它包括有在人胰高血糖素相关肽-1类似物前的DPPIV及PPEC酶切位点，以及在N端Ala被Gly取代，Gly22被Glu取代，同时N端接加2个脯氨酸残基，C端接加PPSRD残基。
本发明第二方面，提供了一种人胰高血糖素样肽-1类似物的制备方法，其
特征在于，该方法包含步骤：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的质粒载体及其转化菌。
(b)从培养物中分离出权利要求2所示氨基酸序列的人胰高血糖素相关肽-1类似物1的融合蛋白His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和人胰高血糖素相关肽-1类似物2的融合蛋白His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD。
(c)纯化出pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD
(d)利用体内DPPIV酶切pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽形成h[Gly8]GLP-1(7-36)D和h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽。
在一优选例中，在本发明的方法中，所述的步骤(b)包括通过溶解，洗涤，亲和层析等方法分离出His-Ans-B-C-pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和 His-Ans-B-C-pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD；用酸水解方法从所述融合蛋白中切下融合伙伴，形成pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽；
在另一优选例中，所述的步骤(c)包括通过等电点沉淀分离出pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽。
在另一优选例中，所述的步骤(c)还包括Ni琼脂糖凝胶层析分离，透析和冻干。
本发明第三方面，pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD肽对正常小鼠皮下给药，口服耐血糖实验，并测定胰岛素浓度变化。
附图说明
图1重组质粒构建原理示意图
图2重叠PCR获得目的基因产物凝胶电泳检测结果
图2A：Lane1：Marker；Lane2：pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD
图2B：Lane1：Marker；Lane2：pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D
图3基因序列测序结果
图3A：pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D基因序列测序结果
图3B：pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD的基因序列测序结果
图4融合蛋白示意图
图5重组菌乳糖诱导表达情况
图5A：Lane1：Marker；Lane2、Lane3：pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D融合蛋白表达情况
图5B：Lane1：未加乳糖诱导；Lane2、Lane3：pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1 (7-35)PPSRD融合蛋白表达情况
图6Ni琼脂糖凝胶层析纯化得人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白示意图
图6A：pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D融合蛋白的亲和层析柱纯化
Lane1：蛋白Marker；Lane2：包涵体溶解上清；Lane3：binding buffer洗脱液；Lane4：washing buffer洗脱液；Lane5：eluting buffer洗脱液
图6B：pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD融合蛋白的亲和层析
Lane1：包涵体溶解上清；Lane2：样品上柱流出液；Lane3：Binding Buffer洗脱液；Lane4：Washing Buffer洗脱液；Lane5：Eluting Buffer洗脱液.
图7人胰高血糖素样肽-1类似物的酸水解纯化单体的电泳图
图7A：Lane1：pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D融合蛋白酸水解；Lane2：酸水解产物等电点沉淀；Lane3：pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D多肽亲和层析纯化；Lane4：胰岛素对照品(分子量5734Da)
图7B：Lane1：胰岛素对照品；Lane2：pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD融合蛋白酸水解；Lane3：酸水解产物等电点沉淀
图7C：Lane1：胰岛素对照品；Lane2：pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD多肽亲和层析纯化
图8人胰高血糖素样肽-1类似物的质谱图
图8A：pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D质谱图
图8B：pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD质谱图
图9不同剂量降血糖作用效果图
图9A：pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)降血糖图
图9B：pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD降血糖图
图10不同剂量促胰岛素分泌效果图
图10A：pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)胰岛素分泌图*：P＜0.05；**：P＜0.001
图10B：pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD胰岛素分泌图*：P＜0.05；**：P＜0.001
具体实施方式
以下通过附图及实施例对本发明作进一步说明。
本说明书中所提到的材料中
(1)宿主菌与质粒
宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究相关的实验室一般都有保存。质粒pED为本实验室构建并保存。
(2)酶和试剂
分子克隆工具酶为Fermentas和Takara两家公司；质粒抽提试剂盒为南京天为生物科有限公司；PCR胶回收试剂盒为Takara公司的产品。
(3)培养基
LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。
玉米浆培养基含有：玉米浆25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
(4)Ni琼脂糖凝胶亲和层析介质为美国GE公司产品。
本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
重组蛋白表达量测定：参见Sambrook J，Fristsh EF，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.
实施例1pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D多肽和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD多肽基因的设计、合成和克隆 按照大肠杆菌的偏爱密码子及设计要求将N端位置8的丙氨酸(8Ala)残基被Gly取代，同时N端接加2个脯氨酸(Pro)残基，C端加上D的人胰高血糖素相关肽-1的33个氨基酸序列转化成核苷酸序列，其序列框架见SEQ ID NO：1。在其5‘端增设BamH I酶切位点，3‘端增设终止密码子TAA和HindIII酶切位点，在计算机辅助分析后，确定基因全长108bp，分别为56、51、47碱基的三个寡核苷酸片段，同时，为用PCR方法初筛阳性克隆，设计了下游引物M4。合成四条序列如下：
M1：5’-ATATGGATCCGCCGCACGGTGAAGGCACCTTTACCTCTGACGTG TCTTCT TACCTG-3’，含BamH I酶切位点
M2：5’-GACGTGTCTTCTTACCTGGAAGGCCAGGCTGCTAAAGAATTTATTGCTTGG-3’
M3：5’-GGCCAAGCTTAATCACGACCTTTCACCAGCCAAGCAATAAATTCTTT-3’，含HindIII酶切位点
M4：5’-GGCCAAGCTTAATCACGACCTTTCACCAG-3’
由上海金斯瑞生物技术有限公司合成。PCR反应在伯日PCR扩增仪上进行。其中M1、M2、M3按10∶1∶10浓度比例混合，于94℃，30s；54℃，60s；72℃，90s；共30个循环。1.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，将目的片段用凝胶回收试剂盒回收后保存于-20℃。
经凝胶回收的PCR目的片段和载体质粒pED分别经BamH I和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，用T4DNA连接酶反应体系中16度连接过夜，转化E.coli BL21感受态细胞。将细胞涂布到含100μg/ml卡那霉素的LB平板上37℃培养过夜。挑取单菌落，抽提纯化。各取与pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D的基因上、下游核苷酸序列分别互补的两条特异引物M1、M4，各100pmol/L，以 纯化的重组质粒分别做模板在10μl体系中进行PCR，初筛阳性克隆，再将阳性克隆送至上海金斯瑞生物技术有限公司进行测序。
按照大肠杆菌的偏爱密码子及设计要求将N端位置8的丙氨酸(8Ala)残基被Gly取代，22位Gly残基的位置取代为Glu，同时N端接加2个脯氨酸(Pro)残基，C端加上PPSRD的人胰高血糖素相关肽-1的36个氨基酸序列转化成核苷酸序列，其序列框架见SEQ ID NO：2。在其5‘端增设BamH I酶切位点，3‘端增设终止密码子TAA和HindIII酶切位点，在计算机辅助分析后，确定基因全长124bp，分别为53、54、53碱基的三个寡核苷酸片段，同时，为用PCR方法初筛阳性克隆，设计了下游引物N4。合成四条序列如下：
N1：5’-ATATGGATCCGCCGCACGGT TTTGGCACCTTTACCTCTGACGTGTCTTCTTACCTG-3’，含BamH I酶切位点
N2：5’-GACGTGTCTTCTTACCTGGAAGAACAGGCTGCTAAAGAATTTCTGGCTTGG-3’
N3：5’-GGCCAAGCTTAATCACGAGACGGCGGACCTTTCACCAGCCAAGCCAGAAATTCTTT-3’，含HindIII酶切位点
N4：5’-GGCCAAGCTTAATCACGAGACGGCGGACC-3’，含HindIII酶切位点
由上海金斯瑞生物技术有限公司合成。PCR反应在伯日PCR扩增仪上进行。其中N1、N2、N3按10∶1∶10浓度比例混合，于94℃，30s；54℃，60s；72℃，90s；共30个循环。1.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，将目的片段用凝胶回收试剂盒回收后保存于-20℃。
经凝胶回收的PCR目的片段和载体质粒pED分别经BamH I和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，用T4DNA连接酶反应体系中16度连接过夜， 转化E.coli BL21感受态细胞。将细胞涂布到含100μg/ml卡那霉素的LB平板上37℃培养过夜。挑取单菌落，抽提纯化。各取与pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD的基因上、下游核苷酸序列分别互补的两条特异引物N1、N4，各100pmol/L，以纯化的重组质粒分别做模板在10μl体系中进行PCR，初筛阳性克隆，再将阳性克隆送至上海金斯瑞生物技术有限公司进行测序。
实施例2pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D多肽和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD多肽基因在大肠杆菌中的表达
重组表达菌在液体LB培养基中37度震荡过夜，以3％接种量转接于玉米浆发酵培养基中，37度培养4h，加终浓度5mmol/L乳糖诱导表达，6-8h后收集发酵菌体。留样进行15％SDS-PAGE分析。在分子量约17700Da处出现明显的蛋白条带。融合蛋白在诱导后6h达到稳定的最大表达量，BandScan分析显示融合蛋白占细菌总蛋白的40％以上，并在胞内形成了包涵体。
实施例3融合蛋白插入His标签
按照大肠杆菌的偏爱密码子及设计要求在融合蛋白上游插入6个组氨酸，形成组氨酸标签，通过PCR的方法将His-tag插入，设计上下游引物：
Nco I His Up：5’-TATACCATGGATCATCATCATCATCATCATACGCCATTCG-3’，含Nco I酶切位点
HindIII down1：5’-GGCCAAGCTTAATCACGACCTTTCACCAG-3’，含HindIII酶切位点
以质粒pED-PP-h[Gly8]GLP-1(7-36)D为模板，Nco I His Up和HindIII down1为上下游引物，PCR扩增，反应条件同实施例1。将PCR产物进行Nco I和BamH I双酶切，质粒pED-PP-h[Gly8]GLP-1(7-36)D进行Nco I和HindIII双酶切去除AnsB-C-PP-h[Gly8]GLP-1(7-36)D基因片段，将两者的酶切产物连接构建重组质 粒pET-His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D。
按照大肠杆菌的偏爱密码子及设计要求在融合蛋白上游插入6个组氨酸，形成组氨酸标签，通过PCR的方法将His-tag插入，设计上下游引物：
Nco I His Up：5’-TATACCATGGATCATCATCATCATCATCATACGCCATTCG-3’，含Nco I酶切位点
HindIII down2：5’-GGCCAAGCTTAATCACGAGACGGCGGACC-3’，含HindIII酶切位点以质粒pED-PP-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD为模板，Nco I HisUp和HindIII down2为上下游引物，PCR扩增，反应条件同实施例1。将PCR产物进行Nco I和BamH I双酶切，质粒pED-PP-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD进行Nco I和HindIII双酶切去除AnsB-C-PP-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD基因片段，将两者的酶切产物连接构建重组质粒pET-His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD。
实施例4融合蛋白分离纯化
诱导表达后的工程菌经离心回收菌体，将菌体用50mmol/L Tris-Hcl缓冲液洗涤两次，向收集的菌体中加入配制好的菌体裂解液(4ml/g菌体)，放置于37℃摇床恒温剧烈振荡过夜，以充分裂解菌体。裂解至溶液不粘滞时，离心收集沉淀。每克裂解后的菌体沉淀加入10ml包涵体洗涤液1(0.2％TritonX-100，50mmol/L Tris·HCl)，将包涵体悬浮于洗涤液中剧烈振荡2小时后，离心收集沉淀。将沉淀加入适量蒸馏水中重悬洗涤，洗涤后离心收集沉淀。再用包涵体洗涤液2(2mol/L Urea，10％TritonX-100)洗涤沉淀2次，收集洗涤后的包涵体。每克包涵体加入8ml包涵体溶解液(8mol/LUrea，50mmol/L Tris·HCl)，混匀，室温下连续振荡至包涵体溶解，12000r/min离心20分钟，收集上清液。3倍体积Binding Buffer(5mmol/L Imidazole，500mm ol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)平衡Ni琼脂糖凝胶亲和层析柱，将His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D的粗品溶液上清上样过柱，用10倍体积Binding Buffer洗脱杂蛋白，以10倍柱体积的Wash Buffer(40mmol/L imidazole，500mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)洗脱杂蛋白，最后以Elute Buffer(100mmol/L imidazole，500mmol/L NaCl，20mmol/LTris-HCl，pH7.9)收集目的蛋白，得pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D的融合蛋白His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D。pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD的融合蛋白His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD的获取方法与pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D的融合蛋白相同。
实施例5融合蛋白的酸切割
将含有人胰高血糖素样肽-1类似物1的融合蛋白His-AnsB-C-pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D的Elute Buffer透析，冻干，每克冻干产物加入10ml 50mmol/L HCl溶解，置于48℃水浴48h，进行酸水解。酸水解后，用NaOH调节pH值至5.5，有大量沉淀生成，12000rpm离心20min，去除上清，得pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D多肽粗品，冻干。人胰高血糖素样肽-1类似物2pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD多肽的获取方法与pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D多肽相同。
实施例6目的多肽的分离纯化
沉淀冻干后溶解于少量Binding Buffer中，上样于Ni琼脂糖凝胶亲和层析柱，收集流出液，透析除盐，冻干收集目的肽。pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD多肽的获取方法与pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D相同。SDS-PAGE电泳检测，结果见附图7。
实施例7两种目的多肽的质谱分析
由中国药科大学完成。
方法为：电喷雾质谱。
测得重组制备的pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D的相对分子质量为3594.5Da；pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD的相对分子质量为3947.7Da(图8)，与理论推算值一致。
实施例8目的多肽的小鼠口服耐血糖实验
ICR小鼠，雄性，5-7周，体重22～28g，按体重随机分7组，分别为空白对照组，pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D多肽高中低剂量给药组，pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD多肽高中低剂量给药组，每组7只，实验前适应实验室环境1-2周，实验前1天晚禁食，仅给予饮水。
冻干样品用前以pH 7.0磷酸盐缓冲溶液(NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，加800mL H2O溶解，以HCl调pH至7.0，再加H2O至1000ml，灭菌)稀释至所需浓度；血糖仪与血糖试纸(购自北京怡成生物电子技术有限公司)，小鼠胰岛素检测试剂盒。
pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D多肽给药组皮下注射分别给予20μg/kg、80μg/kg、140μg/kg样品；pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD多肽给药组皮下注射分别给予20μg/kg、80μg/kg、140μg/kg样品；空白对照组小鼠腹腔给予等量磷酸盐缓冲液；各组小鼠分别于给药后灌胃2.0g/kg葡萄糖，并于葡萄糖负荷后0min、10min、20min、40min、60min、80min、100min、120min对小鼠进行尾静脉取血；测定血糖浓度。
pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD高中低剂量给药组降糖测定结果如图9A和9B所示，说明pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD呈现剂量依赖性，两者与空白组比较P＜0.001，具有极显著的 降糖效果。
实施例9目的多肽的促胰岛素分泌作用
ICR小鼠，雄性，5-7周，体重22～28g，实验前1天晚禁食，仅给予饮水。pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D多肽给药组皮下注射分别给予20μg/kg、80μg/kg、140μg/kg样品；pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD多肽给药组皮下注射分别给予20μg/kg、80μg/kg、140μg/kg样品；空白对照组小鼠腹腔给予等量磷酸盐缓冲液；各组小鼠分别于给药后灌胃2.0g/kg葡萄糖，20min后小鼠尾静脉取血100μL，快速吹入离心管中(预加20μl 0.1M EDTA)，4℃，4000rmp离心3min，取上清，存于-20℃，试剂盒测定胰岛素浓度。
空白对照组、pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D组和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD组促进胰岛素分泌的测定结果如图10A和10B所示，在低剂量情况下两者与空白组比较P＜0.05，胰岛素分泌具有显著性的差异；在中高剂量情况下两者与空白组比较P＜0.001，胰岛素分泌具有极显著差异。说明pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD具有很好的促胰岛素分泌作用。
除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的技术方案，均落于本发明要求的保护范围。
Claims (9)
1.两种人胰高血糖素相关肽-1(hGLP-1)类似物，人胰高血糖素相关肽-1类似物1pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和人胰高血糖素相关肽-1类似物2pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD，该人胰岛素样肽-1类似物氨基酸序列分别为：
Pro-Pro-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Asp(SEQ ID NO：3)Pro-Pro-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Pro-Pro-Ser-Arg-Asp(SEQ IDNO：4)
2.根据权利要求1所述的pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D，其特征在于：该类似物相对分子质量3593.95Da，其中GLP-1(7-36)部分的8位Ala残基的位置取代为Gly，同时N端接加2个脯氨酸(Pro)残基，N端包含DPPIV及PPCE酶切位点，C端加上D；pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD其特征在于：该类似物相对分子质量3947.33Da，其中GLP-1(7-35)部分的8位Ala残基的位置取代为Gly，22位Gly残基的位置取代为Glu，同时N端接加2个脯氨酸(Pro)残基，N端包含DPPIV及PPCE酶切位点，C端加上PPSRD。
3.权利要求1和2所述的pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD的生物活性，其特征在于：pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D的N端Ala被Gly取代，C端加上D同时N端接加2个脯氨酸残基；pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD的N端Ala被Gly取代，22位由Glu取代Gly，C端加上PPSRD，同时N端接加2个脯氨酸残基，所形成的两种人胰高血糖素相关肽-1依然能保持显著的生物活性，促进血糖降低。
4.两种设计合成的多核苷酸，其特征在于：包含两种核苷酸序列，其特征在于，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。该核苷酸序列分别编码权利要求2所示氨基酸的人胰高血糖素相关肽-1类似物。
5.一种载体，其特征在于：它包含权利要求4所述的核苷酸序列及重组方法：将由PCR方法生成的L-天冬氨酸酶N端加入His标签及在其C末端127个氨基酸的DNA片段分别与人工PCR方法合成的Asp-pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和Asp-pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD的基因序列融合，构成新的融合蛋白基因。将该基因插入到pED载体T7启动子下游。这个重组的融合表达质粒称pED-PPGLP-1D和pED-PPGLP-1PPSRD。pED-PPGLP-1D包括了一个融合伙伴和Asp-pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D的基因；pED-PPGLP-1PPSRD包括了一个融合伙伴和Asp-pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD的基因。
6.一种基因工程菌，其特征在于：它含有权利要求5所述的载体。
7.包括权利5所述的该类似物的重组方法，其特征在于：该融合蛋白使用L-天冬氨酸N端插入6个His与127个氨基酸残基构成融合蛋白，在融合伙伴基因与活性多肽之间以天冬-脯肽键连接，这种连接对酸敏感。
8.权利要求1和2所述的pro-pro-h[Gly8]GLP-1(7-36)D和pro-pro-h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD进入体内后，通过体内丰富的DPPIV及PPCE酶迅速酶切N末端的Pro-Pro-，形成h[Gly8]GLP-1(7-36)D和h[Gly8，Glu22]GLP-1(7-35)PPSRD。这对于研制抗DPPIV水解的长效激素是有益的。
9.根据权利要求1所述的两种人胰高血糖素相关肽-1类似物的活性，其特征在于：所述的两种人胰高血糖素相关肽-1类似物具有血糖依赖性的降低血糖和促胰岛素分泌的作用，且作用效果具有显著性，有望用于治疗2型糖尿病。
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