JP2002505672A

JP2002505672A - 水溶液中における保護されていないか又はｎ−末端システインで保護されたペプチドの固相での自然化学連結

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Publication number: JP2002505672A
Application number: JP50326799A
Authority: JP
Inventors: キャン，ライン; ビー．エイチ．ケント，スティーブン; サイモン，レイナ
Original assignee: グライフォンサイエンシズ
Priority date: 1997-06-13
Filing date: 1998-06-12
Publication date: 2002-02-19
Also published as: US7094871B2; US20020169282A1; AU8069598A; US20050209440A1; DE69837170T2; US7030217B2; EP1001968B1; US20020132975A1; US6326468B1; AU745094B2; EP1001968A1; ES2235336T3; CA2292724A1; ES2282788T3; DE69828287D1; ATE354584T1; ATE285415T1; DE69828287T2; WO1998056807A1; DE69837170D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、固相上で集合したペプチド及び蛋白質を合成するための方法、装置及びキットを提供するものであり、該合成は、水溶液中で温和な連結化学物質を用い、３つ又はそれ以上の保護されていないペプチドセグメントを連続的に連結することである。また、ＭＡＬＤＩ又は電子スプレーイオン化質量分光分析を用いて、固相連続連結反応をモニターする方法も提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】水溶液中における保護されていないか又はＮ−末端システインで保護されたペプチドの固相での自然化学連結序論背景蛋白質を化学合成する既存の方法は、段階的な固相合成、及び溶液中あるいは固相での断片縮合を含む。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの古典的な段階的固相合成は、好ましいペプチド鎖のカルボキシ末端アミノ酸に対応するアミノ酸を共有結合で固体支持体に結合させて、活性カルボキシ基を持つ活性アミノ酸誘導体の段階的カップリングによりポリペプチド鎖をアミノ末端の方へ延ばすものである。十分に保護された固相結合ペプチド鎖の集合が完了した後、ペプチド−固相の共有結合は、適当な試薬によって切断され、保護基が取り除かれて目的のポリペプチドが生成する。段階的固相合成方法のいくつかの欠点は、カップリングでの反応が不完全であること及び各サイクルにおける脱保護基により生成物による固相結合が形成されることである。同様に、化学試薬が不完全であることによる副反応、及び／又は、試薬／保護されたアミノ酸中に存在する不純物による副反応はいずれも、鎖集合体の各段階で多様な固相結合生成物を生じ、また最終生成物において複雑な混合物を形成することとなる。かように、ペプチド鎖が長くなるほど、高純度で良好に特定された生成物を取得するための課題が増大する。複雑な混合物が生成することにより、段階的固相合成へのアプローチは規模が限定されている。一般的には、１００あるいはそれ以上のアミノ酸残基の良好に特定されたポリペプチドは、段階的固相合成で定常的に合成される。この方法で、蛋白質および大きなポリペプチドを合成することは、長時間を要する骨の折れる仕事である。固相で断片縮合を行うことへのアプローチ（またセグメント縮合としても知られている）は、段階的固相合成方法による長鎖のポリペプチドを取得する場合の困難性を克服するために設計されたものである。セグメント縮合方法は、段階的固相合成方法によりいくつかのペプチドセグメントを作り、次いで、固相から切断して最大限に保護されたセグメントを精製する。保護されたセグメントは、固相に結合した第１セグメントまで一つづつ縮合される。固相でのセグメント縮合の多くの段階で、しばしば技術的困難に遭遇する。Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ，ｅｔａｌ．，「固相断片縮合−その問題」・固相合成における革新と展望・１１−２５（Ｒ．Ｅｐｔｏｎ，ｅｔａｌ．，１９９０）を参照のこと。例えば、望ましくない連結反応をブロックするために保護基をセグメントに使用すると、しばしば保護されたセグメントの溶解性が低下し、カルボキシ基の効果的な活性化が妨げられる。また、保護されたセグメントの溶解性が制限されるため、その精製に支障を来す。Ｋ．Ａｋａｊｉｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）３３：１８４−１０２（１９８５）を参照のこと。保護されたセグメントは、純度、共有結合構造について特定することが困難であり、高分解分析ＥＳＭＳ（電子スプレー量分光分析）に従って分析することができない（荷電に基づいて）。連結がグリシン残基で行われる場合以外は、各活性化されたペプチドセグメントのＣ−末端残基のラセミ化もまた問題である。さらに、十分に集合し固相に結合したポリペプチドを固相から切断して保護基を切り離すことは、しばしば苛酷な化学操作と長時間の反応を必要とするので、十分に集合したポリペプチドの分解をきたす。セグメント縮合は、固相よりもむしろ溶液中で行われる。Ｈ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｎ．２０３（２）：１１３１−１１３９（１９９４）を参照のこと。しかし、溶液中でのセグメント縮合は、複数の望ましくない副反応を防ぐため、異なった側鎖の官能基にわたって保護基を用いることはもちろん、連結に先立ってセグメントを精製することが必要である。さらに、溶液中での連結は、固相連結では容易にできる精製および洗浄工程が容易でない。さらにまた、保護されたペプチドセグメントおよび保護されたペプチドの中間反応生成物の溶解性が悪くなる。最大限に保護されたペプチドセグメントの場合にしばしば起こる溶解性の問題を克服するために、最小限に保護されたペプチドセグメントの化学連結が探究されてきた。Cheng,et al.,Chemical Synthesis of 38:70-78(1991);J.Blake,Total Synthesis of S-Carbamoylmethyl Bovine Apocy tochrome c by Segment Coupling,Int-J.Pept.Protein Res.27:191-200(1986);a nd H.Hojo et al.,Protein Synthesis using S-Alkyl Thioester of Partially Protected Peptide Segmcnts,Synthesis of DNA-Binding Protein of Bacillus stearothermophilus,Bull.Chem.Soc.Jpn.65:3055-3063（1992）を参照のこと。しかし、この方法はなお、全てのリジン側鎖のアミノ基に保護基を用いることが必要であり、１又はそれ以上の選択的なＮ−α保護、および精製、再保護、再精製というような骨の折れる精製工程が必要である。保護されたペプチドセグメントを繁雑に用いることは、資源として組み換え型ＤＮＡの発現という手段により生成されるペプチドを用いる蛋白質工学の全体計画とは両立しえない。保護されたペプチドセグメントを用いる方法は労働集約的であり、保護されたペプチドセグメントは、いくらかは、溶解性や連結の困難性のため、取り扱う際に予想のできない物性を有している。しばしば、大きな保護されたペプチドセグメントは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やジメチルスルホアミド（ＤＭＦ）のような最も強力な極性非プロトン性溶媒にさえ微量に溶解するだけである。保護されたペプチドセグメントが溶解しにくいという問題は、いくつかの方法で、限定的ではあるが成功に向かっている。その方法は、（１）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，及びＴｙｒ以外の全側鎖を遮蔽するという部分保護基戦略、（２）チオールとアミノ側鎖のみを遮蔽するという最小保護基戦略、及び（３）凝集／不溶を防止するため主鎖のアミド部分を可逆的に保護すること、等である。後者のアプローチで用いられる保護基はペプチドの立体配座を変える。主鎖の保護基を用いることは、まだ簡単ではなく予測し難いものであり、それぞれ目的とするポリペプチド鎖に対する重要な実験が必要である。保護されていないペプチドセグメントを非自然的主鎖結合により連結する技術はいくつかある。それに対し、「自然化学連結」を達成する方法はほとんどない。「自然化学連結」は、保護されていないペプチドセグメントか、又は他の保護されていないペプチドセグメントでＮ−末端システインが保護されたペプチドセグメントの化学選択的反応であり、連結部位においてアミド結合で連結されたペプチドを生成する。本発明の十分に集合した目的ポリペプチドは、一つ、二つ、又はそれ以上の自然な化学連結部位を有する。したがって、固体支持体を用いて、二つ又はそれ以上の保護されていないペプチドセグメントを化学連結により集合したポリペプチドを、改善された収率でかつ中間生成物の取扱が容易に、合成する迅速な方法に関する技術が必要とされている。特に、本発明は、二つ又はそれ以上の保護されていないペプチドセグメントの自然化学連結により自然的ペプチド主鎖を有する大きなポリペプチドを迅速に固相合成することを可能にするもので、しかも、該化学連結では、保護基で一時的に遮蔽するためにペプチドセグメントに何ら反応的官能性が必要とされない。本発明は、Ｎ−末端システイン及びＣ−末端チオ酸を含むもう一つの保護されていないペプチドセグメントと反応するＣ−末端α−チオエステルを有している第１の保護されていない固相結合ペプチドセグメントに関して、Ｎ−末端でのＣ−末端の方向へのペプチドセグメントの固相連続化学連結を初めて達成するものである。また、本発明の他の態様は、後から投入される（第２の）ペプチドセグメントでのＮ−末端システイン残基を一時的に保護し、Ｃ−末端でのＮ−末端方向への固相自然化学連結を可能にするものである。また、本発明が、固相での非自然的結合によりペプチドセグメントを連続的に連結する非自然的化学連結の使用をも包含することは、当業者は容易に理解できるであろう。あるいは、本発明は、一つ又はそれ以上の非自然的主鎖結合を有するペプチドセグメントの自然化学連結の使用をも包含することは、当業者は容易に理解できるであろう。発明の要旨本発明は、特に、保護されていない固相結合ペプチドに、水溶液中でペプチドセグメントの自然化学連結を行うことにより、大きなポリペプチドを生成する新規な方法を提供するもので、ペプチドセグメントに保護基を必要とせず、あるいは、後から投入されるペプチドセグメントのＮ−末端システインを一時的に保護して行うものである。この本発明の態様につき多くの利点の中から挙げると、次の通りである。中間体及び最終生成物の精製が容易であること。連結反応が早いこと。自然的ペプチド主鎖を有する大きなポリペプチドを迅速に合成することができること。保護基を必要としないため連結反応が容易であり、その結果、水溶液又は混合水溶液／有機溶媒溶液中でのペプチドセグメントの溶解性が高いこと。反応性の両ペプチドセグメント中に存在して安定な副生物となるような他の官能基を持ったチオエステル部位がないことによる化学選択的連結であり、その結果、副反応がなく一層純粋な最終生成物が得られること。ＭＡＬＤＩ質量分光分析計またはＥＳＩＭＳ（電子スプレーイオン化質量分光分析計）による固相のモニターが適応可能であること。チオエステルを用いた温和な活性化反応を用い、かつ、高ｐＨを避けているためラセミ化が少ないこと。ポリペプチド生成物が保護されていない形で直接得られること。自動化及び組み合わせ技術が適応可能であること、等である。溶液連結に対する固相連結法の重要な利点は、固相連結法は、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフ）による難しい精製及び各連結反応後の凍結乾燥工程を必要としないが、溶液連結法では必要とする。このように、固相連結は、最終生成物の回収を減少させるような長時間を要する精製工程が不要である。その代わり、ここで説明する固相連続連結法のみは、最終の保護されていないペプチドセグメントが連結されて、集合したペプチドが固相から切り離された後、シングルのＨＰＬＣ精製及び凍結乾燥工程を必要とする。長時間を要する精製工程が不要であるため、最終生成物、即ち、集合したペプチドを、溶液連結法の類似の工程よりも迅速に合成できる。溶解性の副生物から固相に結合した目的生成物を手早く精製することは、究極の集合したポリペプチドの収量の点で極めて大きな利点となる。固相連続連結のもう一つの利点は、反応物質が高濃度であるため反応速度が早くなるということである。例えば、固相に結合したペプチドに比し、後から来るペプチドセグメントを高濃度で過剰に用いることにより、反応は遥かに早く完了する。過剰のペプチドセグメントは、連結反応が完了した後、固相から速やかに洗浄除去される。ペプチドセグメントの濃度を増すことにより、最終生成物の収量の増大が達成される。例えば、固相に結合したポリペプチドは、固相で乾燥され、連結溶液に再溶解される。あるいは、固相に結合したポリペプチドは、高濃度の後から来るペプチドセグメントの溶液で洗浄される。本発明の他の利点は、従来法により現在達成可能なものよりも遙かに大きなペプチド及び蛋白質を合成できることであり、自動化しやすく、高樹脂充填にすることでスケールアップが容易である。さらに、Ｎ−末端でＣ−末端方向へ連結することにより、粗ペプチドセグメントを精製又は凍結乾燥することなく使用することが出来るが、それは、ペプチドセグメントの段階的固相合成で形成される最終生成物が、固相に結合したポリペプチドと反応しないからである。一つの態様において、本発明は、ペプチドセグメントをＮ−末端でＣ−末端方向へ連結することにより自然的ペプチド主鎖を有する集合したペプチドを製造する方法からなり、ａ）切断可能な部位を有するリンカーにより、保護されていない第１のペプチドセグメントを固相に共有結合させることであって、該切断可能な部位は連結条件下で安定であり、該保護されていない第１のペプチドセグメントは、そのＮ−末端で該切断可能な部位と結合しており、また、そのＣ−末端に α−チオエステルを有している。ｂ）必要により、第２の保護されていないペプチドセグメントを導入することもでき、該第２のセグメントは、システイン残基をＮ−末端に、チオ酸をＣ−末端に有し、適切な条件下で、該第１の保護されていないペプチドセグメントと該第２の保護されていないペプチドセグメントの間に連結を行わせて、該固相と自然に連結されたペプチドを形成させ、そこで該固相結合ペプチドはＣ−末端にチオ酸を有しているが、続いて該固相結合ペプチドのチオ酸はチオエステルに変換される。（ｃ）必要により、追加的な保護されていないペプチドセグメントにつき工程（ｂ）を繰り返して行う。（ｄ）システイン残基をＮ−末端に有する最後の保護されていないペプチドセグメントを導入し、適切な条件下で、該固相結合ペプチドと該最後の保護されていないペプチドセグメントの間に連結を行わせる。好ましい態様においては、切断可能な部位は切断されて、集合したペプチドの形で固相結合ペプチドを遊離する。もう一つの好ましい態様においては、切断可能な部位が、連続的な連結反応をモニターする目的で切断されうるような切断可能なリンカーである。もう一つの態様においては、第１の保護されていないペプチドセグメントが、ペプチド−αＣＯＳＨチオ酸として加えられ、続いてチオエステルに変換される。Ｎ−末端でＣ−末端方向へ連続的に連結することは、保護されていないペプチドセグメントの化学選択的な連結をラセミ化がなく行うことができるという驚くほど有効で洗練された方法である。本発明の以前には、ペプチド（ペプチド−α ＣＯＸ）のＣ−末端におけるαＣＯＸでのラセミ化の関係から、Ｎ−末端でＣ− 末端方向へ連続的に連結することは行われなかった。本発明を用いることで、ペプチドセグメントのＣ−末端におけるαＣＯＳＨは温和に活性化されてチオエステルになり、塩基の存在なしに、緩衝水溶液中で、結果としてラセミ体混合物を生成しないような温和な条件下で、連結反応が進行する。本発明の方法は、段階的な固相合成により製造されるペプチドセグメントの自然化学連結のために用いることができる。反応系において最後の固相結合ペプチドのＣ−末端に加えられる最後のペプチドセグメントは、Ｎ−末端システイン残基（Ｃｙｓ−組み換えペプチド）を有する所謂組み換えペプチドである。チオ酸部位は、活性化されてチオエステル部位になり、側鎖を含め自然化学連結が行われる所望のいかなる場所にも配置される。このように、本発明の連続的連結は、線状の集合ペプチドの場合に限定されるものではない。もう一つの態様においては、自然化学連結に与かるＮ−末端システイン残基を有する保護されていないペプチドセグメントの中位の部分片を用いる場合がある。もう一つの態様においては、本発明は、ペプチドセグメントをＣ−末端でＮ− 末端方向へ連結することにより自然的ペプチド主鎖を有する集合したペプチドを製造する方法からなり、ａ）切断可能な部位を有する切断可能ハンドルにより、保護されていない第１のペプチドセグメントを固相に共有結合させることで、該切断可能な部位は連結条件下で安定であり、該保護されていない第１のペプチドセグメントは、そのＣ−末端で該切断可能な部位と結合しており、また、そのＮ −末端にシステインを有している。ｂ）第２のペプチドセグメントを導入することもでき、該第２のセグメントは、システイン残基をＮ−末端に、αチオエステルをＣ−末端に有し、また該第２のペプチドセグメントは、Ｎ−末端システイン残基に結合した保護基を有し、適切な条件下で、該第１のペプチドセグメントと該第２のＮ−末端で保護されているペプチドセグメントの間に連結を行わせて、該固相に結合した自然連結ペプチドを形成させ、そこで該固相結合ペプチドはＮ −末端システインに結合した保護基を有する。ｃ）該保護基を固徂結合ペプチドから取り除く。（ｄ）必要により、Ｎ−末端システインとＣ−末端アルファチオエステルを有する追加的なペプチドセグメントにつき工程ｂ）とｃ）を繰り返して行う。（ｅ）Ｃ−末端にアルファチオエステルを有する最後のペプチドセグメントを導入し、もし該最後のペプチドセグメントがＮ−末端システインを有する場合は、該Ｎ−末端システインは保護基により保護されており、そして該導入は適切な条件下で、該固相結合ペプチドと該最後のペプチドセグメントの間に連結を行わせる。及び（ｅ）必要により、該保護基を固相結合ペプチドのＮ−末端システインから取り除く。もう一つの態様においては、本発明は、ペプチドセグメントをＣ−端でＮ−末端方向へ連結することにより自然的ペプチド主鎖を有する集合したペプチドを製造する方法からなり、ａ）切断可能な部位を有する切断可能ハンドルにより、保護されていない第１のペプチドセグメントを固相に共有結合させることで、該切断可能な部位は連結条件下で安定であり、該保護されていない第１のペプチドセグメントは、そのＣ−末端で該切断可能な部位と結合しており、また、そのＮ− 末端にシステインを有している。ｂ）必要により、第２のペプチドセグメントを導入することもでき、該第２のセグメントは、システイン残基をＮ−末端に、α チオエステルをＣ−末端に有し、また該第２のペプチドセグメントは、Ｎ−末端システイン残基に結合した保護基を有し、適切な条件下で、該第１のペプチドセグメントと該第２のＮ−末端で保護されているペプチドセグメントの間に連結を行わせて、該固相に結合した自然連結ペプチドを形成させ、そこで該固相結合ペプチドはＮ−末端システインに結合した保護基を有し、続いて固相結合ペプチドから該保護基を取り除く。（ｃ）必要により、Ｎ−末端システインとＣ−末端アルファチオエステルを有する追加的なペプチドセグメントにつき工程（ｂ）を繰り返して行い、該追加的なペプチドセグメントは、Ｎ−末端システイン残基に結合した保護基を有する。（ｄ）Ｃ−末端にアルファチオエステルを有する最後のペプチドセグメントを導入し、もし該最後のペプチドセグメントがＮ−末端システインを有する場合は、該Ｎ−末端システインは保護基により保護されており、そして該導人は適切な条件下で、該固相結合ペプチドと該最後のペプチドセグメントの間に連結を行わせる。及び（ｅ）必要により、該保護基を固相結合ペプチドのＮ−末端システインから取り除く。しかしもう一つの態様においては、ペプチドセグメントの固相における連続的連結が、いずれかの方向又は両方向に行われ、質量分光分析計で連結反応をモニターするため、及び、集合したペプチドを固相から精製するために切断可能なリンカーを用いている。もう一つの態様は、二方向の固相による自然化学連結方法であり、内部のアミノ酸残基によって固体支持体に結合した第１のペプチドセグメントを有し、該第１のペプチドセグメントはＮ−末端システインとＣ−末端チオエステルを有しており、いずれかの末端で第２のペプチドセグメントを連結する。もう一つの態様においては、保護されていないペプチドセグメントを有するキットを提供するもので、該セグメントは内部のアミノ酸側鎖官能基により切断可能ハンドルに共有結合しており、該切断可能ハンドルは、固相の化学選択的官能基を補足する化学選択的官能基によって固相に結合している。該キットは、固相に結合したペプチドに対し、保護されていないか又はＮ−末端システインで保護されたペプチドセグメントを固相化学連結のために用いることである。そのような切断可能ハンドルの好ましい例は、官能性の切断可能ハンドルであり、Ｘ−アミノエチルスルホニルエチルオキシカルボニル（ここで、Ｘ＝ＣＨ３ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２−ＭＳＣ −又はＸ＝ＡＯＡ−ＮＨＣＨ２−ＭＳＣ−である。（ＡＯＡ＝アミノオキシアセタール）。もう一つの態様においては、ペプチドセグメントチオ酸（ペプチド−ＣＯＳＨ）を固相でチオエステル（ペプチド−ＣＯＳＲ）に変換するために臭化酢酸またはヨウ化酢酸を用いる方法である。また、もう一つの態様においては、切断可能なリンカーを用いて、ＭＡＬＤＩ又はＥＳＩ質量分光分析計により、固相での固相連続連結プロセスをモニターする方法を提供する。ＥＳＩＭＳによりモニターすることは、また、ＴＦＡ−切断可能リンカーを用いることを達成するもので、ＭＡＬＤＩが質量分光分析法に用いられる場合は、光切断可能リンカーが好ましく用いられる。さらなる態様においては、ここで述べる本発明の数々の特徴を組み合わせて、大きなペプチドモジュール又は蛋白質ライブラリーを作り上げる新規な方法を提供する。公知の蛋白質又はポリペプチドの多様な類似物を迅速に合成するために、ペプチドセグメントを固相で連続的に連結する方法は、特に有用である。ここで述べられているプロセスにより、集合したポリペプチド及びポリペプチドライブラリーのためのキット及び装置もまた提供される。本発明の各態様は、他の態様と組み合わされて広範囲の有用な発明が得られるということは、当業者であればすぐに分かることであろう。図面の簡単な説明図１は、Ｎ−末端において、Ｃ−末端方向への、固相での自然化学連結工程の概要図である。一態様においては、リンカーはＭＳＣハンドルであり、切断可能ではあるが連結条件下では安定である。他の態様において、保護されていない第１のペプチドセグメントは、アミノオキシ−ケトン結合により固相（樹脂）に共有結合している。図２Ａは、Ｎ−末端にシステイン残基を持つ１３−残基ペプチド−αＣＯＳＨの連結条件下での安定性を示すものである。ＨＰＬＣクロマトグラムは、ペプチドの環化あるいは大きな集合化が、連結条件で一晩放置した場合でも、ほんの少しの割合にすぎないことを示している。図２Ｂは、分子量１２３０．２のチオエステルペプチドの存在下における、同じ１３−残基ペプチド−ＣＯＳＨの安定性を示す。ＨＰＬＣクロマトグラムは、Ｃｙｓ−α−ＣＯＳＨペプチドが、連結に用いたとき、それ自身と重大な反応をすることなく十分に安定であることを示している。さらに、それ自身と１３−残基ペプチド−αＣＯＳＨ（Ｎ−末端システインを有する）との反応により少量生成するような副生物は、樹脂に結合したペプチドのα−ＣＯＳＲとは反応せず、簡単な濾過及び洗浄で速かに除去される。図３Ａ，３Ｂ及び３Ｃは、Ｎ−末端にシステイン残基を有するペプチドからＭＳＣハンドルを除去する際のヒドラジンの効果についてのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。１７０８．２の質量に関するピークは、ＭＳＣハンドルを除去された望ましいペプチドの存在を示す。１８１４．５の質量に対応するピークは、切断により生成する反応性の副生物を示すもので、これは、ＭＳＣハンドルなしに所望のペプチドと反応しうる。図３Ａは、１８１４．５ｍｗでのかなり大きなピークを示すもので、分取されたペプチドが、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．５の液中に入れられ、１ＮＮａＯＨに２分間希釈され、１ＮＨＣｌで冷却されたときのピークである。図３Ｂは、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ溶液中で５０ｍＭヒドラジン含有状態で、図３Ａの条件を繰返したときの生成物のＨＰＣＬクロマトグラムである。図３Ｃは、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ溶液中で２００ｍＭヒドラジン含有状態で、図３Ａの条件を繰返したときの生成物のＨＰＣＬクロマトグラムである。ヒドラジンは副生物を除去して、純粋な生成物になる。図４は、Ｎ−末端システイン残基を持たないペプチドから切断可能なＭＳＣハンドルを除去したときのＨＰＬＣクロマトグラムであり、該ペプチドは、Ｎ−末端ロイシン残基と、そのほゞ中心にシステイン残基を有している。ＭＳＣハンドルを有するペプチドの分子量は４０２２．４であり、ＭＳＣハンドルを有しないものの分子量は３７４５．１である。６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＡｃ，ｐＨ４．６液中での分取されたペプチドは、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＡｃ，ｐＨ１４中で２分間希釈され、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＡｃ，ｐＨ２．０で冷却される。ＨＰＣＬは、副生物との内部反応が起り、３９７９．７の分子量（ＬＥＶ−ＮＨＣＨ₂ −ハンドルに対応する）を有するピークの形成を示しているが、反応の程度は、Ｎ−末端システインを持ったペプチドに起る反応よりも少い。図５Ａは、Ｎ−末端でのＣ−末端への連続連結に、固体支持体として用いられるＰＥＧＡ樹脂の存在を示す反応系統図である。工程Ａ及びＢ１は、樹脂サンプルのＭＡＬＤＩ分析で用いる光に不安定なリンカーを生成する工程で、必要な場合に行う工程である。図５Ｂは、本発明の固相連続連結で用いる固相（樹脂）を調製するための一般的な系統を示した図である。構造体１は切断可能なリンカーで、質量分光分析計でカップリング及び連結反応の進行をモニターするために有用である。例えば、光に不安定なリンカーは、ＭＡＬＤＩＭＳにより樹脂上でモニターするために用いられるが、ＴＦＡ切断可能リンカーは、電子スプレーＭＳによるモニターのために用いられる。構造体１が樹脂に結合すると、直ちに保護基（ＰＧ）は除去され、第１のペプチドセグメントと化学選択的に反応しうる官能部位（構造体３）が樹脂に加えられる。構造体３が樹脂に結合すると、直ちに保護基が除去されて構造体４を生じ、それは、構造体５と化学選択的に反応するために準備される。該構造体５とは、切断可能な手段及び修飾された樹脂（４）と反応しうる官能基で修飾されたペプチドである。続いて起る連結が全て完了すると、「切断可能ハンドル」は切断されて、固相から完全な長さのペプチド（集合したペプチド）が遊離する。図６は、ペプチドセグメント１（Ｎ−末端ペプチドセグメント）の誘導を示す反応系統図である。図７Ａ及び７Ｂは、第１の保護されていないペプチドセグメント（１）が固体支持体、例えば、ＡＯＡ−官能基を有する樹脂、に結合するＨＰＬＣクロマトグラムである。図７Ａは、樹脂に加えられたペプチド溶液のＨＰＬＣである。図７Ｂは、過剰モルの樹脂と共に一晩ペプチドを反応させた後の上澄液のＨＰＬＣである。相当量のペプチドが上澄液から分離され、一晩の反応後、樹脂に結合したことを示している。図８Ａ及び８Ｂは、図７Ａ及び７Ｂで表わされたのと同じ実験のＨＰＬＣクロマトグラムであるが、固相としてＩｓｃｏ樹脂ビーズは用いていない。図９Ａ，９Ｂ及び９Ｃは、この図の工程１の後の生成物の分析結果であり、第１の保護されていないペプチドセグメントが固相に結合したものである。図９Ａは、樹脂−結合ペプチドの（ヒドラジン添加塩基）切断の分析結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。図９Ｂは、樹脂のＭＡＬＤＩ質量スペクトルで、（１）に対応するピーク、即ち、樹脂結合ペプチドを示している。図９Ｃは、リンカーを塩基で切断した後のＭＡＬＤＩ質量スペクトルであり、（１）に対応するピークがないことを示し、また、ペプチドが固相（樹脂）に付着していないことを示している。図１０Ａ，１０Ｂ及び１０Ｃは、この図の工程３の後の生成物の分析で、第２の保護されていないペプチドセグメント（２）を樹脂−結合ペプチド（１）に連結したものである。図１０Ａは、生成物、即ち、樹脂−結合ペプチドの中間体の分析ＨＰＬＣであり、質量（１）＋（２）の大きなピークを示している。図１０Ｂは、リンカーを切断する前の樹脂のＭＡＬＤＩ質量スペクトルであり、図１０Ｃは、リンカーを塩基で切断した後の樹脂の質量スペクトルである。図１１は、脱塩され、凍結乾燥されたペプチド生成物（表１の１＋２＋３）のＨＰＬＣクロマトグラムであり、固相（Ｉｓｃｏ樹脂）上でＮ−末端におけるＣ −末端方向への２連続連結を行った後の生成物である。最も高いピークは、凍結乾燥した粗生成物に対応するもので、ほゞ３６％の収量を示している。図１２Ａ及び１２Ｂは、集合したペプチド（表１の１＋２＋３）に対応する主ピークのＥＳＩＭＳ（電子スプレーイオン化質量スペクトル）である。図１２Ｂは、図１２Ａの質量スペクトルを再構成したもので、連結されたペプチド生成物の質量を示している。図１３は、脱塩され凍結乾燥されたペプチド（１＋２＋３）のＨＰＬＣクロマトグラムで、固相（ＰＥＧＡ樹脂）から集合したペプチドを遊離させるためリンカーを塩基で切断した後のものである。図１４Ａ及び１４Ｂは、７４３４質量ピークの電子スプレーイオン化質量スペクトルであり、図１４Ｂは、図１４Ａの質量スペクトルを再構成したものである。図１５Ａ，１５Ｂ及び１５Ｃは、精製と連結の双方のために、固体支持体技術が用いられたことを示す３つのＨＰＬＣクロマトグラムである。図１５Ａと１５Ｂはそれぞれ、ＤＮＰ基を除去する前後の粗ペプチドの溶液プロセスを示す。両ＨＰＬＣとも粗ペプチド混合物を示す。図１５Ｃは、図１５Ａに示すものと同じペプチド溶液のＨＰＬＣクロマトグラムであり、固体支持体に結合後、ＤＮＰ基を除去し、固相から塩基で切断し、相当に純粋な集合ペプチド生成物としたものである。図１６Ａ及び１６Ｂは、Ｎ−末端におけるＣ−末端方向への固相連続自然連結によるＭＩＦ（１−１１５）の合成反応系統を示す。図１７Ａは、Ｎ−末端ペプチドセグメントを修飾するための反応系統である。図１７Ｂは、第１の保護されていないペプチドセグメントを結合するために用いられる水親和性の固相を修飾することを示す図である。図１８Ａは、Ｎ−末端が修飾されたＭＩＦ（１−５９）を固相に結合させるための反応系統である。図１８Ｂは、塩基で切断後の遊離したペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムで、６２７１Ｄａに予期された質量を有する。図１８Ｃ及び１８Ｄは、切断可能ハンドルを切断した後、遊離したペプチドの主成分の電子スプレー質量スペクトルである。図１８Ｄは、図１８Ｃを再構成したものである。図１９Ａは、樹脂−結合ＭＩＦ（１−８０）を形成する連結工程の図である。図１９Ｂは、切断可能ハンドルを切断後の生成物のＨＰＬＣクロマトグラムである。図１９Ｃ及び１９Ｄは、塩基で切断した後に遊離したペプチドの主成分の質量スペクトルで、８５０２Ｄａの予期した質量を有する。図１９Ｄは図１９Ｃの質量スペクトルを再構成したものである。図２０Ａは、樹脂−結合ＭＩＦ（１−１１５）を形成するための連結工程の図である。図２０Ｂは、切断可能ハンドルを切断後の生成物のＨＰＬＣクロマトグラムである。図２０Ｃ及び２０Ｄは、塩基で切断した後に遊離した生成物の質量スペクトルで、１２４５０Ｄａの予期した質量を有する。図２１は、Ｃ−末端におけるＮ−末端方向への固相連結の系統図である。「樹脂」は固相を示す。三角印とその側方のＭ−形の相手は、化学選択的に共有結合を形成する補完的な官能基である。「ハンドル」は、固相から集合したペプチドを遊離するために切断されうる切断可能ハンドルである。波線は、ペプチドセグメントのアミノ酸残基である。「ＰＧ」は、保護基を表し、Ｎ−端システインの側鎖チオール又はα−アミノ基のいずれかに置かれている。工程２及び３は、４でマークされた矢印で示されるように、追加のペプチドセグメントのために繰返される。また、カップリングと連結反応をモニターする目的で切断可能なリンカーが、「ハンドル」と「樹脂」の間に加えられる。図２２は、Ｃ−末端におけるＮ−末端方向へのＰＬＡ２Ｇ５の固相連続連結の反応系統である。図２３は、Ｃ−末端におけるＮ−末端方向への固相連続連結によるＣａｍエステル誘導体を合成する反応系統である。図２４は、Ｃ−末端におけるＮ−末端方向への固相連続連結によるＣ−末端ペプチドセグメントを合成する反応系統である。図２５Ａ，Ｂ及びＣは、２又はそれ以上のペプチドセグメントの双方向固相連続連結により、集合したペプチドを合成する系統図である。図２６Ａ及びＢは、Ｎ−末端におけるＣ−末端方向への３つのペプチドセグメントを固相固相自然化学連結された後のＨＰＬＣクロマトグラフで、集合したペプチドであるＣ５ａ１−７４が生成しでいる。図２７は、ここで述べる固相自然化学連結で用いるためのＣ−末端ペプチドセグメントを合成する反応系統であり、合成されたペプチドセグメントを固相から遊離されるために、ＣＡＭエステル切断可能ハンドルを用いている。図２８Ａ及びＢは、３つのペプチドセグメントの固相連続連結から生成する集合したペプチドのＨＰＬＣクロマトグラフ及び再構成されたＥＳＩＭＳである。Ｆｍｏｃ保護基を用い、Ｃ末端でのＮ−末端方向への固相における、ペプチドセグメント１(ＳＥＱＩＤＮＯ：２)(ＣＡＤＲＫＮＩＬＡ)、ペプチドセグメント２(ＳＥＱＩＤＮＯ：３)(ＣＹＧＲＬＥＥＫＧ)及びペプチドセグメント３(ＳＥＱＩＤＮＯ：４)(ＡＬＴＫＹＧＦＹＧ) である。図２９Ａ及びＢは、最終の連結生成物、即ち、第３のペプチドセグメント（ＡＬＴＫＹＧＦＹＧ）に連結した第１の連結生成物のＨＰＬＣクロマトグラフ及びＥＳＩＭＳであり、保護基としてＡＣＭを用い、Ｃ−末端にてＮ−末端方向への３つのペプチドセグメントの固相連続連結により得られたものである。図３０Ａ−Ｈは、ホスホリパーゼＡ２グループ５、１１８残基蛋白質の合成工程でのＨＰＬＣクロマトグラフ及びＥＳＩＭＳであり、Ｃ−末端にてＮ−末端方向への４つのペプチドセグメントにつき、固相連続自然化学連結を用いたものである。第１のペプチドセグメントはＰＬＡ２Ｇ５８８−１１８、第２はＰＬＡ２Ｇ５５９−８７、第３はＰＬＡ２Ｇ５２６−５８、第４はＰＬＡ２Ｇ５１−２５である。図３２Ａ及びＢは、それぞれ、第１のペプチドセグメントのＨＰＬＣクロマトグラフ及び再構成されたＥＳＩＭＳである。図３２Ｃ及びＤは、それぞれ、第１と第２のペプチドセグメント（ＰＬＡ２Ｇ５５９−１１８）の連結生成物のＨＰＬＣクロマトグラフ及び再構成されたＥＳＩＭＳである。図３２Ｅ及びＦは、それぞれ、ＰＬＡ２Ｇ５２６−１１８，ＰＬＡ２Ｇ５５９−１１８及びＰＬＡ２Ｇ５２６−５８（第３のペプチドセグメント）のＨＰＬＣクロマトグラフ及び再構成されたＥＳＩＭＳである。図３２Ｇ及びＨは、それぞれ、ＰＬＡ２Ｇ５１−１１８、集合したポリペプチドのＨＰＬＣクロマトグラフ及び再構成されたＥＳＩＭＳである。発明の実施の形態術語アミノ酸：２０の遺伝暗号を付されたアミノ酸を含むアミノ酸、自然界で見つけることが稀か又は一般的でないアミノ酸、及び、自然には起りえないか又は修飾されえないようなあらゆるアミノ酸。水溶液：水を含む溶液、水中に８Ｍまで尿素を含有するもの、水中に６Ｍまでのグアニジン・ＨＣｌを含有するもの、水中に６０％までのアセトニトリルを含有するもの。集合したポリペプチド：固相連続又は双方向連結で、切断可能ハンドルの切断後に得られた最終生成物。集合したペプチドは、固相で連続的に連結された分離ペプチドセグメントを少くとも二つ有する。集合したペプチドは、生物学的活性を有していても、有していなくてもよい。切断可能なハンドル：集合したポリペプチドを固相から遊離させるために選択的に切断されうる切断可能部位。切断可能なハンドルは、カップリング、活性化、脱保護基、連結、洗浄、及び集合したペプチドの形成に含まれる他の工程にとって好ましい条件下では切断しないように抵抗することが出来るものでなければならない。また、切断可能なハンドルは、固相に結合することができる第１のペプチドセグメントを製造するための条件、例えば、段階的固相ペプチド合成に用いられる条件で安定でなければならない。好ましくは、切断可能ハンドルは、第１のペプチドセグメントに直接隣接して位置し、切断可能ハンドルの切断で、所望の集合したペプチドが固相から遊離する。切断可能ハンドルは、当該分野で用いられる切断可能ハンドルであれば、どのような変形のものでも選択してよい。例えば、次のようなものを参照のこと。L.Canne et al.,Tetrahedron Letters,3 8(19):3361-3364(1997);Ball et al.,J.Pept.Sci,1;288-294(1995);Funakoshi e t al,PNAS USA,88:6981-6985(1991);Funakoshi et al.,J.Chromatog.638:21-27(1995);Garc ia-Echeverria et al.,J.Chem.Soc.,Chem．Commun.,779-780(1995)．好ましい切断可能ハンドルはＢｏｃ−ＨＮ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ −ＣＯ−ＯＮｐ（Ｂｏｃ−ＨＮＣＨ２−ＭＳＣ−）又は官能性を有する切断可能ハンドル、Ｘ−アミノエチルスルホニルエチルオキシカルボニル（ここで、Ｘ＝ＣＨ３ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２−ＭＳＣ−又はＸ＝ＡＯＡ−ＮＨＣＨ２−ＭＳＣ−）である。（ＡＯＡ＝アミノオキシアセタール）。他の好ましい切断可能ハンドルは、ＣＡＭエステルである。Ｃｅｃｃａｔｏ，Ｍ．Ｌ．ｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３１：６１８９−６１９２（１９９０）を参照のこと。切断可能なリンカー：連結工程のいかなる時点、即ち、第２のペプチドセグメントの連結後、第３のペプチドセグメントの連結後、及びその先のようないかなる時点においても、反応混合物の少量のサンプルの質量スペクトル分析を用いて固相連続連結をモニターするために、選択的に切断されうる切断可能部位。切断可能リンカーは、カップリング、連結条件、脱保護基条件（もし必要なら）、及び洗浄条件で安定でなければならない。好ましい切断可能リンカーは、光に不安定なリンカー及びＴＦＡ−不安定リンカーを包含する。カップリング：第１のペプチドセグメントを固相に共有結合することを包含する化学選択的反応。連結：ペプチドセグメントを共有結合で、固相結合ペプチドにすることを包含する化学選択的反応。リンカー：共有結合鎖が連結している種々の部位。例えば、リンカーは第１のペプチトセグメントと固体支持体を連結しうるもので、そのようなリンカーは、必要により、切断可能ハンドル、切断可能リンカー、共有結合（即ち、オキシムを形成するアミノ−オキシ及びケトン）を化学選択的に形成しうる補完的な官能基などあらゆる数の部位を有するものである。ペプチド：少くとも二つのモノマーからなるポリマーで、モノマーとしては、アミノ酸、及びしばしばアミノ酸残基とみなされているものも含み、それらはアミド結合によって一体化されている。本発明の目的のためには、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「蛋白質」という語は、これら３つがここで述べられている方法により作られるときは、互に置換可能である。ペプチドは、ポリペプチドの代りにも用いられる。アミノ酸は、カイラルアミノ酸のＬ及びＤ異性体を包含する。ペプチドセグメント：ペプチド又はポリペプチドで、完全な自然的アミド主鎖又は非自然的アミド主鎖又はそれらの混合を有し、２〜１０００の範囲、最も好ましくは２〜９９、さらに好ましくは１０〜６０、最も好ましくは２０〜４０の範囲のアミノ酸残基を有する。各ペプチドセグメントは、自然的アミド結合又は公知の非自然的ペプチド主鎖のいかなるもの又はそれらの混合を有する。各ペプチドセグメントは、公知のいずれの合成法によっても得られ、溶液合成法、段階的固相合成法、セグメント縮合法、収束縮合法などがある。集合したペプチド生成物を形成するために加えられる最後のペプチドセグメントは、組換え的に発現される。保護基：他の官能基と反応しないように官能基を保護しうる化学部位で、アミノ酸又はペプチドを形成するのに支障なく脱離可能である。連続連結：３つ又はそれ以上のペプチドセグメントを、Ｃ−末端からＮ−末端へ又はＮ−末端からＣ−末端へ、所定の方向で連結し、集合したペプチド生成物を得ること。連続連結の方向性は、常に、固相−結合の第１のペプチドセグメントから、集合したペプチド生成物を形成するために加えられる最後のペプチドセグメントの方向へ向かって開始する。固相：表面を有する物質で、カップリング、脱保護基、及び切断反応に用いられる有機又は水溶液にさらされたとき、実質的に不溶性である。固相物質の例は、ガラス、ポリマー及び樹脂を含み、ポリアクリルアミド、ＰＥＧ、ポリスチレンＰＥＧ−Ａ，ＰＥＧ−ポリスチレン、多孔体、ＰＯＲＯＳ^TM、セルロース、再生セルロース（例えばペルローザ）、ニトロセルロース、ナイロン膜、調整された多孔ガラスビーズ、アクリルアミドゲル、ポリスチレン、活性化デキストラン、アガロース、ポリエチレン、官能性プラスチック、ガラス、シリコン、アルミニウム、鉄、鋼、銅、ニッケル及び金を包含する。そのような物質は、板、シート、ペトリ皿、ビーズ、ペレット、円板又はその他の都合のよい形状である。セルロースのシートは、本発明における固相として用いられ、立体的な方向への部分的な連結を可能にする。ここで述べた多くの例と態様は、固相のタイプである樹脂に関するものであるが、それらの例が樹脂のみを意味し、それに限定されるものではなく、一般的な固相に関するものであることは、当業者なら理解できるだろう。固相及び固体支持体の用語は、互換的に用いられる。固相−結合ペプチド：固相−結合ペプチドは、少くとも一つのペプチドセグメントが、種々の切断可能なリンカー、ハンドル又は部分により結合したものである。固相−結合ペプチドは、連続連結反応でのいかなるペプチド生成物中間体をも包含し、最後のペプチドセグメントが後から二番目の固相−結合ペプチドに連結した後に生成する第１の固相−結合ポリペプチドをも包含する。チオ酸：イオン化チオ酸部位で、−ＣＯＳＨ又は−ＣＯＳ^-で表され、しばしば「ペプチドα−ＣＯＳＨ」又は「ペプチドα−ＣＯＳ^-」で表されるペプチドチオ酸をも云う。チオエステル：−ＣＯＳＲで表される部位で、しばしばペプチドに結合したものもある。例えば、ペプチドチオエステルは、「ペプチドα−ＣＯＳＲ」と表される。Ｒ基は、１〜１５炭素数の官能性アルキルで直鎖又は分岐のもの、１〜１５炭素数の芳香族構造、１〜４アミノ酸又はその誘導体を表し、好ましくは、Ｒは、ペプチド−アルファ−ＣＯＳＲが活性化されたチオエステルであるものから選ばれる。好ましい具体例は、Ｒ＝−ＣＨ３−Ｏ，−Ｏである。「チオエステル」の語は、一般に用いられるもので、正しいＩＵＰＡＣの語では「チオロエステル」である。ＭａｔｔｙｓＪ．Ｊａｎｓｅｎの上掲の文献を参照のこと。Ｉ．Ｎ−末端でのＣ−末端方向への、保護されていないペプチドセグメントの固相連続自然化学連結３つ又はそれ以上の保護されていないペプチドセグメントの連続的、多面的連結により蛋白質を合成することに関する報文は少い。溶液中での遊離ペプチドセグメントの連続的連結は、結果として、連結後の精製（例えばＨＰＬＣによる）を必要とし、中間セグメントの官能性部分の一つを一時的に保護する必要がある。本発明の一つの局面は、複数の精製法を必要とせず、中間のペプチドセグメントを一時的に保護する必要のない、固相連続連結技術である。この戦略は、（１）固体支持体と化学選択的に反応しうる基で官能性化された切断可能ハンドルで、ペプチドセグメントのＮ−末端を修飾すること、及び（２）Ｎ−末端にてＣ− 末端の方向へ、保護されていないペプチドセグメントを連続的に自然化学連結すること、などの手段を用いる。自然化学連結は、Ｃ−末端にα−チオエステルを有する保護されていないペプチドセグメントを、Ｎ− 末端にシステイン残基を有する保護されていない第２のペプチドセグメントと反応させる。チオール交換は、チオエステル−結合中間体を生じ、それは自動的に再配列されて、連結部位で自然なアミド結合となる。我々は、Ｎ−末端システインとＣ−末端チオ酸を有するペプチドセグメントは、自然の連結条件では十分に安定であり、Ｃ−末端チオ酸の官能性を一時的に保護する必要がないことを見出した。したがって、これらのペプチドセグメントは、図１に示すような、３つ又はそれ以上のペプチドセグメントを含む連続連結工程において、中間的なセグメントとして用いることができる。そのような中間セグメントが、固相−結合チオエステル−含有ペプチドに連結して、固相−結合ペプチドチオ酸を生じると、チオ酸は容易にチオエステルに変換し、次のペプチドセグメントのＮ−末端システインと反応して連結される。引続いて導入されるペプチドセグメントは、炭素原子に隣接して、互に１，２の関係で、アミノ及びチオール部位を有する非自然的側鎖とＮ−末端に反応性がなく保護されていないシステインでないアミノ酸残基とを持った内部アミノ酸を有しており、非線状の集合したペプチドを生成する。固相に結合した集合ペプチドを形成するために、別個のペプチドセグメントを多様に連結することも期待される。全ての連結が完了すると、固相結合ペプチドを固相に結合しているリンカーは切断され、集合したペプチド、即ち完全な長鎖のペプチドが遊離される。この技術は、ランダムなペプチドの全体的化学合成の技術的順序（実施例における表１）に適用されるもので、ヒトのマクロファージマイグレーションインヒビトリー要因（ＭＩＦ）、免疫システムの機能に含まれる１１５アミノ酸サイトカインに適用される。図１６〜２０を参照のこと。Ａ．ペプチド合成ペプチドセグメントは、機械的補助手段による固相方法で段階的に合成され、その方法は、Ｂｏｃ化学(Ｌ．Ｃａｎｎｅ等、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３８：３３６１−３３６４(１９９7))のために中和／ＨＢＴＵ活性化プロトコールの場で用いられるポリスチレン樹脂上で、Ｂｏｃ−アミノアシル−ＯＣＨ₂ −ＰＡＭ樹脂、チオエステル発生樹脂(Ｈｏｊｏ等、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．６４：１１１−１１７(１９９１))、又はチオ酸発生樹脂の上などで行われる。連鎖の集合が完了した後、ペプチドは脱保護基され、同時に、５％ｐ−クレゾールを含有する無水ＨＦで処理することにより樹脂から切断され、凍結乾燥され、準備されているＨＰＬＣにより精製される。Ｎ−末端ペプチドセグメントは、図１７Ａに略図として描かれているように、ＨＦ切断に先立って修飾される。Ｂ．固相の調製固相は、図５Ａ及び５Ｂに図示されているようにして調製される。図５Ａは、固体支持体としてＰＥＧＡ樹脂を調製する系統図である。図５Ｂは、あらゆる固相を調製するための一般的な系統図である。アミノ−Ｓｐｈｅｒｉｌｏｓｅ^TM（Ｉｓｃｏ）親和性樹脂は、図１７Ｂに示されるようなＢｏｃ−アミノオキシ酢酸を用いて誘導される。固相として用いられる他の樹脂は、ＥＡＨセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、アミノＰＥＧＡ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＬＥＡＲ塩基樹脂（ＰｅｐｔｉｄｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、長鎖アルキルアミン調節された多孔ガラス（Ｓｉｇｍａ）、ＨＣｌ・ＰＥＧポリスチレン（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、リジンハイパーＤ樹脂（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）、ＡｒｇｏＧｅｌ塩基樹脂（ＡｒｇｏｎａｕｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などである。これらの樹脂は、アミノ誘体の形成に有用であり、又は、アミノ誘導体の形に速やかに変換される。Ｃ．修飾されたＮ−末端ペプチドセグメントの固相へのカップリング図１７Ａに図示されているように、ケトン部位を有する修飾されたペプチドは、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、０．１５ＭメチオニンにｐＨ４．６（１．６ｍＭ）で溶解され、前もって十分に同じ緩衝液で洗浄されたアミノオキシ活性化固体支持体に加えられ、室温で一晩反応させられる（図１６Ａ、工程＃１）。 II．Ｎ−末端でのＣ−末端方向への連結Ａ．連結反応。樹脂−結合ペプチドチオエステルに連結されるペプチドセグメントは、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、０．１５Ｍメチオニン、０．５％チオフェノール中にｐＨ７．５（３．７〜４．０ｍＭ）で溶解され、十分に同じ緩衝液で洗浄された樹脂結合ペプチドチオエステルに加えられ、室温で一晩反応させられる（図１６Ａ及び１６Ｂ、工程＃２及び４）。好ましくは、第１のペプチドセグメントの濃度は、１〜１５０ｍＭ、より好ましくは５〜１００ｍＭ、最も好ましくは１０〜５０ｍＭの範囲であり、特定のペプチドセグメントに従って選択される。第１のペプチドセグメント及び第２及び他の後から導入される追加的ペプチドセグメントの濃度は定型的な実験により最適化できることは、当業者には理解できよう。第２の又は追加的ペプチドセグメントの濃度は、１〜２００ｍＭ、より好ましくは５〜１００ｍＭ、最も好ましくは１０〜５９ｍＭであり、特定のペプチドセグメントに従って選択される。過剰な第１のペプチドセグメント及び／又は過剰の追加的ペプチドセグメントは、濾過又は洗浄により固相結合ペプチドから速かに除去される。Ｂ．臭化酢酸又はヨウ化酢酸を用いたチオ酸のチオエステルへの変換臭化酢酸又はヨウ化酢酸の使用は、ペプチド−αＣＯＳＨチオ酸からペプチド −αＣＯＳＲチオエステルを生じさせる改良された方法である。長鎖の保護されていないペプチドの溶解性を確認するために、６Ｍグアニジン・ＨＣｌがｐＨ４で用いられる。反応はほゞｐＨ４で進行する。この条件下で、臭化酢酸又はヨウ化酢酸と反応しうる基は、チオ酸のみである。ベンジルブロマイドは、疎水性の化合物であり、溶液中には完全には溶解せず、遅い、不均一な反応になる。臭化酢酸又はヨウ化酢酸を用いることの利点は、両者とも６Ｍグアニジン・ＨＣｌ（水溶液）にほゞｐＨ４で速かに溶解し、所望の反応が速かに完了し、典型的な逆相ＨＰＬＣの孔容積中に溶出し、多量のペプチドセグメントを生成するということである。樹脂結合ペプチドチオ酸は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、０．１５ＭメチオニンでｐＨ４．６にて十分に洗浄され、同じ緩衝液中の５０ｍＭの臭化酢酸溶液で１５分間処理され、ｐＨ４．６の緩衝液で十分に洗浄される（図１６Ｂ、工程＃３）。Ｃ．固相からの切断Ｎ−末端でのＣ−末端方向への連結に用いられる切断可能ハンドルは、連結の条件で安定で、段階的な固相での化学物質にも安定でなければならず、固相に保護されていない形で共有結合し、集合したポリペプチドを傷つけずに切断可能でなければならない。この要求を満す切断可能なハンドルはどれでも使用でき、次のようなものが含まれるが、これらに限定はされない。即ち、ＭＳＣハンドル、光不安定性リンカー、ＣＡＭエステル（−ＯＣＨＣＯＮＨ−）、（ −Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＳＯ−ＣＨ２−ＣＯ−）、（−Ｏ−ＣＲＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｏ− ＣＨ２−ＣＯ−）。例えば、（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＳＯ−ＣＨ２−ＣＯ−）は、次のようないずれの条件でも切断可能なハンドルとして用いられる。（１）ＨＦ，ＤＭＳ，（２）ＳｃｉＣ１４，ＴＦＡ、又はスルホキシドのレッド（ｒｅｄ）及びＴＦＡ切断、（３）ＮａＯＨ、水、（４）スルホキシドのレッド（ｒｅｄ）及びＤＭＦ中のＴＢＡＦ．Ｓａｍａｍｅｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３：５６１（１９８８）を参照のこと。もう一の例として、（−Ｏ−ＣＲＨ− ＣＯ−Ｏ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−）は、次のようないずれの条件でも切断可能ハンドルとして使用できる。（１）ＮａＯＨ、水（ＣＡＭリンカー）、（２）ＺｎＣＨ３ＣＯＯＨ／水、（３）光照射。Tjoeng et al.,Synthesis 897(1981);Sheeha n et al.，J．Org．Chem．38:3771(1973);Serebryakov et al.，Tetrahedron 34 :345(1978);Hendrickson et al.,Tetrahedron Lett．343(1970);Ceccato,M.L.et al.,Tetrahedron Lett.31:6189-6192(1990);J.Martinez et al.,Tetrahedron L ett.41:739(1985)などを参照のこと。ここで述べられている目的のために、公知の適切な切断可能ハンドルが用いうることは当業者には容易に理解できよう。固相から集合したポリペプチドを遊離させるために、リンカーを切断する条件としては、特に、ＭＳＣハンドルが用いられる場合には、次のような条件が用いられる。分取された樹脂−結合ポリペプチドは、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、０．１５Ｍメチオニンで、２００ｍＭヒドラジン含有状態でｐＨ〜１４で２分間処理され、等量の６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１Ｎａアセテート、０．１５Ｍメチオニン、ｐＨ〜２及び等量の６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、０．１５Ｍメチオニン、ｐＨ４．６を用いて洗浄する。遊離のペプチドの複合溶離液は、ＨＰＬＣ分析及び電子スプレー質量分光分析計で分析される（図１６Ｂ、工程＃５）。 II．Ｃ−末端でのＮ−末端方向への固相連結上述のＮ−末端でのＣ−末端への連結についての説明は、全く同様にＣ−末端でのＮ−末端への連結に適用できるが、図２３に示すように次の場合は除かれる。（１）第１のペプチドセグメントがＣ−末端により固相に結合しているとき、即ち、取得される集合したポリペプチドのＣ−末端ペプチドセグメントが切断可能なハンドルで修飾されたものであるとき、及び（２）後から投入される（即ち、第２、第３、さらに追加的の）ペプチドセグメントが、それらのＮ−末端システインを一時的に保護する必要があるとき、などである（工程２〜４を参照）。必要により、追加の又は中間のペプチドセグメントの全てのシステイン残基は、Ｎ−末端システインにて、一時的に保護される。系統図（図２３）に概要を示すように、切断可能ハンドルを有するＣ−末端ペプチドセグメントは、固体支持体（例えば、樹脂）上の対応する官能基と反応して固体支持体に結合される。該官能基とは、例えば、オキシム結合（樹脂上のアミノオキシエチル基及びペプチドのケトン〔レブリン酸による〕）、又はその逆のケース（ペプチド上のアミノアセチル基及び固体支持体上のケトン）などである。第１のペプチドセグメントが図２１の工程１に示すように固相に結合すると、Ｎ−末端保護のＣｙｓ（ＰＧ−Ｃｙｓ）及びＣ−末端チオエステルを有する追加の（第２の）ペプチドセグメントが、自然化学連結反応により、樹脂−結合の第１のペプチドセグメントの保護されていないＮ−末端Ｃｙｓと反応する。連結が完了した後、Ｎ−末端Ｃｙｓの保護基は除去され（図２１の工程３）、次のペプチドセグメントが追加される（図２１の工程４／２）。全ての連結が完了すると（図２１の工程５）、樹脂に連続的に連結したペプチドに結合しているハンドルは切断され、完全な長鎖のペプチドが遊離する。このＣ−末端からＮ−末端への技術は、ランダムなペプチドの全体的化学合成の技術的順序に適用されるもので、ヒトの分泌腺のホスホリパーゼＡ２、グループ５（「ＰＬＡ２Ｇ５」）、１１８アミノ酸エンザイムなどに適用できるが、これらについては以下に述べられる。Ａ．ペプチド合成Ｃ−末端でのＮ−末端方向への固相連続自然化学連結によるペプチド合成は、Ｎ−末端でのＣ−末端方向への固相連続自然化学連結について上記で述べたのと本質的に同じである。下記実施例７での、ペプチドセグメントの再段階的固相ペプチド合成の詳細を参照のこと。Ｂ．固相の調製Ｃ−末端でのＮ−末端方向へのための固相の調製は、Ｎ−末端でのＣ−末端方向について述べたのと同じである。Ｃ．固相への修飾されたＣ−末端ペプチドセグメントのカップリング固体支持体への修飾されたＣ−末端ペプチドセグメントのカップリング条件は、上述の、Ｎ−末端でのＣ−末端への連結において、修飾されたＮ−末端のカップリングについて概説したことと同様である。Ｄ．Ｃ−末端でのＮ−末端方向への連結Ｃ−末端でのＮ−末端方向への自然化学連結反応の条件は、上述の、Ｎ−末端でのＣ−末端方向への連結につき概説したことと同様であるが、ペプチドセグメントを有するＮ−末端システインが固相結合であり、ペプチドセグメントを有する追加のチオエステルが溶液中であることは除かれる。Ｅ．システイン保護基と脱離ペプチドセグメントのＮ−末端Ｃｙｓを保護するに適した公知の保護基はいずれも使用可能であるが、その条件として、連結条件で安定であること、リンカーを加える条件で安定であること、固相結合ペプチド、リンカー、樹脂、又は、切断可能ハンドルを用いる場合は、それらに有害でないような条件下でペプチドセグメントから脱離可能であることが必要である。保護基は、また、段階的固相ペプチド合成条件で安定でなければならない。保護基の一つの例はＡＣＭ（アセトアミドメチル）であり、これは、システイン側鎖保護（−ＳＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ３）を与え、水銀（II）アセテート、又は他の適切な試薬で切断可能である。Ｆｍｏｃ（９フルオレニルメチルカルバメート）は、アルファアミノ保護を与え、ＤＭＦ中で２０％ピペリジンで切断され、疎水性ペプチドについて良好に作用する。ＤＮＰＥ（２−（２，４−ジニトリフェニル）エチル）は、システイン側鎖保護を与え、ＤＭＦ中で５０％ピペリジンで切断が起る。パラ−ニトロベンジルスルホニルは、アルファアミノ保護を与え、ＤＭＦ中で１ＭＤＢＵ／ＩＭベーターメルカプトエタノールで切断される。追加的なシステイン保護基は、次のようなものを包含するが、それらに限定されない。即ち、Sulfmoc，NSC，Dde，Boc -Cys(Acm)-OH,Fmoc-Cys-(Mob)-OH,Boc-Cys(Fm)-OH,及びBoc-Cys(DNPE,-OH，ここでAcm=アセトアミドメチル，Mob=メトキシベンジル，Dnpe=2-(2,4-ジニトロフェニル)エチル，Fm=9-フルオレニルメチルなどである。Protective Groups in Org anic Synthesis,Green,T.W.及びWuts,P.G.M.eds,(2d Ed.1991)，特にp.293-294, 318-319,R.Merrifield,J.Org.Chem.43:48084816(1978);VV.Samukov et al.,Tetr ahedron Lett.35:7821-7824(1994);B.W.Bycroft et al.,J.Chem.Soc.Chem.Comm. 776-777(1993);M.Royo et al.,Tetrahedron Lett.,33:2391-2394 (1992);S.C.Miller,J.Am.Chem.Soc.119:2301-2302(1997)などを参照のこと。ある種の保護基は、ペプチドセグメントを溶解させない。例えば、ある種の疎水性ペプチドセグメントは、保護基の付加で不溶性になる。ペプチドセグメントに対する保護基として、特定のいかなるものでも、その適合性を確かめることは当業者であれば容易になしうる。Ｃｙｓ保護基としてのＦｍｏｃの脱離。一つの態様は、固相結合ペプチドのＮ −末端ＣｙｓからＦｍｏｃ保護基を脱離させることを含む。Ｎ−末端のＦｍｏｃ −Ｃｙｓでのペプチドの連結後、樹脂結合ペプチドは６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，０．１５ＭメチオニンでｐＨ７で洗浄され、次いで水、次いでＤＭＦで洗浄される。それから樹脂は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンでそれぞれ５分間２回分取され処理される。次いで樹脂は、ＤＭＦで十分に洗浄され、次いで水、次いで６Ｍ・グアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，０．１５Ｍメチオニンで５分間処理される。Ｃｙｓ保護基としてのＡＣＭの脱離。Ｎ−末端Ｃｙｓ（ＡＣＭ）でのペプチドの連結後、樹脂結合ペプチドは、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，０．１５ＭメチオニンでｐＨ７にて洗浄され、次いで３％酢酸水溶液で洗浄される。次いで、樹脂は、３％酢酸水溶液（１５ｍｇｓ／ｍｌ）中の水銀（II）アセテート溶液で３０分間処理され、次いで、３％酢酸水溶液で洗浄される。次に、樹脂は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，０．１５ＭメチオニンでｐＨ７にて洗浄され、次いで、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，０．１５Ｍメチオニン中の２０％ベーターメルカプトエタノールで処理される。次いで、樹脂は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，０．１５ＭメチオニンでｐＨ７にて洗浄される。Ｆ．固相からの切断切断可能ハンドルは、Ｎ−末端でのＣ−末端方向、Ｃ−末端でのＮ−末端方向及び両方向（即ち、Ｎ−末端にてＣ−末端方向及びＣ−末端にてＮ−末端方向の双方向）への連結で、固相から固相結合ペプチドを切断するために用いられる。Ｃ−末端でのＮ−末端方向の固相連続自然化学連結のため（及び、Ｃ−末端でのＮ−末端連結に用いる双方向連結のため）、切断可能ハンドルの必要性は、Ｎ− 末端でのＣ−末端方向の場合に有用であるのと同様であり、固相結合ペプチドのＮ−末端システインから保護基を脱離させるために用いられる条件で、切断可能ハンドルが安定であるという必要性が、さらに追加される。固相へのペプチド−ＣＡＭエステル連結の切断。分取された固相結合ペプチドは、８Ｍ尿素、０．１ＭＮａＰｉでｐＨ７にて洗浄され、次いで２分間、同じ８Ｍ尿素緩衝液中の０．２５ＮＮａＯＨで処理される（結果としてのｐＨ〜１４）。次いで樹脂は、同じ８Ｍ尿素緩衝液中の０．２５ＮＨＣｌの等量で洗浄され（結果としてのｐＨ〜２）、８Ｍ尿素緩衝液で十分に洗浄される。遊離ペプチドの混合した溶出液はＨＰＬＣ及び電子スプレー質量分光分析で分析される。 III．双方向固相連続自然化学連結さらに本発明のもう一つの態様は、双方向固相連続自然化学連結に関し、Ｎ− 末端でのＣ−末端方向及びＣ−末端でのＮ−末端方向の双方向の連続固相蛋白質合成へのアプローチの面も有している。双方向へのアプローチにおいて、Ｎ−末端システイン及び／又はＣ−末端チオエステルのいずれか又は両方を有するペプチドセグメントは、側鎖のアミノ酸残基の一つにより固相に結合している。図２５Ａ，Ｂ，Ｃを参照のこと。次いでペプチドセグメントは、いずれかの末端で第２のペプチドセグメントと連結し、次いで、他の末端で第３のペプチドセグメントと連結する。この双方向のアプローチにおいて、固相に結合したペプチドセグメントが、Ｎ−末端システイン及びＣ−末端チオエステルの両方が保護されている場合は、第２及び第３のペプチドセグメントは、両方の端で引続いて連結が行われる。追加のペプチドセグメントは、次に、連結された固相結合ペプチドのいずれかの末端に追加される。いずれかの方向への連結は、Ｃ−末端でのＮ−末端方向又はＮ−末端でのＣ−末端方向への連結につきここで述べられた方法を用いて完遂される。代りに、固相に対し、内部アミノ酸残基の一つによって結合している第１のペプチドセグメントは、一方向連結のためにのみ用いられる。例えば、固相結合ペプチドセグメントは、一つの末端で第２のペプチドセグメントと連結され、第２のペプチドセグメントの同じ末端で、追加のペプチドセグメントと一つ又はそれ以上の連結が行われる。この態様においては、固相結合ペプチドセグメントは、Ｃ−末端でのＮ−末端方向への又はＮ−末端でのＣ−末端方向への連続固相自然化学連結のいずれかのために用いられる。この態様では、固相結合ペプチドセグメントは、双方向に可能（即ち、保護されたＮ−末端システイン及びＣ−末端チオエステルの両方を有している）であり、一方、一方向の連続連結のためにも用いられる（即ち、保護されたＮ−末端システイン又はＣ−末端チオエステルのいすれかを有している）。第１のペプチドセグメントは、側鎖のアミノ酸残基の一つにより固相に結合し、切断可能ハンドルにも結合しており、また、固相上の補完的な化学官能部位と化学選択的に共有結合を形成しうる官能性の化学部位により固相に結合している。このことは図２５に示す通りである。例えば、第１のペプチドセグメントは、側鎖のリジン、アスパルティック酸、又はグルタミン酸により固相に結合しており、その場合、アリルオキシカルボニル（ａｌｌｃ）又はＦｍｏｃのような例えば直交条件下で切断可能な官能性に基く切断可能ハンドルが、側鎖のリジン、アスパルティック酸又はグルタミン酸により固相に、ペプチドセグメントを結合させるために用いられる。もう一つの例として、オキシム結合が、第１のペプチドセグメントと固相によって形成され、その場合は、第１のペプチドセグメントは、アミノオキシ又はケトンのような化学選択的基を有し、固相は、ケトン又はアミノオキシのような補完的な化学選択的基をそれぞれ有している。Ｖ．切断可能なリンカーの使用及び連結反応をモニターするための質量分光分析種々の公知の切断可能なリンカーが、固相連続連結をモニターするために用いられる。これらの切断可能なリンカーは、固相と切断可能ハンドルが結合した第１のペプチドセグメント、即ち、固相−切断可能リンカー−切断可能ハンドル− ペプチドセグメントの間に置かれる。切断可能リンカーは、容易に切断されうるもので、カップリング及び連結反応をモニターするために少量の固相結合ペプチドを質量分光分析で分析することができる。例えば、固相が樹脂ビーズからなるときは、カップリング反応又は各連結反応の後、反応の程度を決定するために、反応混合物から少量の樹脂ビーズを採取して行うことができる。特に好ましい切断可能リンカーは、ＭＡＬＤＩ質量分光分析のための光不安定性切断可能リンカーで、３−ニトロ−４（メチルアミノ）ベンゾイル−を包含する。図５Ａを参照のこと。反応混合物を少量分取することは、ＭＡＬＤＩＭＳ分析のために行われ、そして該混合物はマトリックス溶液との混合状態でスライド上で乾燥される。ＭＡＬＤＩ質量分光分析計のレーザーは、質量分光分析計のステージ上の光不安定リンカーを切断し、遊離したペプチドの質量分析が行われる。もう一つの好ましい切断可能リンカーは、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）により切断可能なものであり、電子スプレーイオン化質量分光分析のために有用である。ＴＦＡ−切断可能リンカーでは、ペプチドは、ＥＳＩＭＳの前に固相から切断される。実施例実施例１：Ｎ−末端でのＣ−末端方向への連結のための固相の調製固相の調製は、図５の系統図に示す。固相は樹脂であり、例えば、アミノＰＥＧＡ（０．２〜０．４ｍｍｏｌ／ｇメタノール中膨潤）又はアミノ−スフェリロース親和性樹脂（１５〜２０Ｔｍｏｌ／ｍｌ，０．６〜０．９ｍｍｏｌ／ｇ乾燥樹脂）であって、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＮｏｖａＳｙｎ又はＩｓｃｏから入手できる。樹脂（ＰＥＧＡ又はＩｓｃｏ）は、ＤＭＦ（ジメチルスルホアミド）で洗浄され、次いで、１０％ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミド）で簡単に洗浄される。ＤＭＦによる流動洗浄で３０秒間、２回行うのがよい。光切断可能リンカー(ＰＣＬ)(図５Ａ参照)は、１当量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）及びＤＭＦ中のＤＩＥＡで５〜１０分間）活性化される。こうして活性化された光切断可能リンカーは、次いで、樹脂に加えられ、室温で〜３時間放置される（ニンヒドリンが、Ｉｓｃｏの場合に用いられる）。３０秒間のＤＭＦ流動洗浄が２回行われ、次いで、ＴＦＡ（１分間×２）、２〜３０秒間のＤＭＦ流動洗浄が行われる。残りの工程は、省略した形で記す。 −１０％ＤＩＥＡ（１分間×２） −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −活性化されたＢｏｃ−アミノオキシ酢酸（１当量のＤＩＣ及びＮ−ヒドロキシサクシンイミドでＤＭＦ中３０〜６０分間で活性化したもの）の添加 −室温で〜１時間放置（ニンヒドリンが、Ｉｓｃｏの場合に用いられる） −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２）〔樹脂はこの段階で貯蔵〕 −ＴＦＡ（１分間×３０） −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒×２） −１０％ＤＩＥＡ（ｌｉｎ×２） −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −緩衝水溶液で十分に洗浄(６ＭＧｕＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、ｐＨ４．６)(１ｍｌ×５) 実施例２：Ｎ−末端でのＣ−末端への連結のための、第１の保護されていないペプチドセグメントの調製次の工程が、第１のペプチドセグメント（Ｎ−末端）を調製するために用いられ、図６，７Ａ及び７Ｂに図示する。ペプチド−樹脂はＤＭＦ中で膨潤させられる。 −ＴＦＡ（１分間×２） −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −１０％ＤＩＥＡ（１分間×２） −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −ＤＭＦ中にＭＳＣハンドルの添加 −室温で１時間放置 −ＤＩＥＡ添加及びさらに１時間放置 −十分なカップリングを確かめるためにニンヒドリン試験を行う −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −ＴＦＡ（１分間×２） −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −１０％ＤＩＥＡ（１分間×２） −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −活性化されたレブリン酸の添加（ＤＣＭ中０．５当量のＤＩＣで５〜１０分間、対称無水物として活性されたもの） −室温で３０分間放置 −十分な連結を確認するためニンヒドリン試験 −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −ＤＣＭで十分に洗浄 −凍結乾燥器で乾燥 −捕集剤としてｐ−クレゾールを用い、０℃１時間でＨＦ切断 −粉砕して冷エチルアセテートで洗浄 −５０％Ｂに溶解して凍結乾燥 −ＨＰＬＣで精製実施例３：水溶液中での、Ｎ−末端でのＣ−末端方向への、ランダムペプチドセグメントの固相自然化学連結次の工程は、Ｎ−末端でのＣ−末端方向への固相連結に用いられるもので、表１に図示する通りである。自然化学連結の一般的な原理は、この明細書の参考文献にあるＷＯ９６／３４８７８，ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５６６８に開示されている。樹脂は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、ｐＨ４．６（１ｍｌ×５）にて洗浄され、水切りされる。修飾されたＮ−末端ペプチドセグメントは、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテートにｐＨ４．６にて溶解され、樹脂に加えられ、室温で一晩放置される。（第１のセグメントの濃度は少くとも５ｍＭである）。次の朝、樹脂は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、ｐＨ４．６（１ｍｌ×５）にて洗浄され、水切りされる。樹脂のサンプルが、ＭＡＬＤＩＭＳ分析のため採取され、５０％Ｂ、メタノール、ＤＣＭで洗浄され、乾燥される。樹脂のサンプルが、塩基による切断のために採取され、２００φ１６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，２００ｍＭヒドラジンでｐＨ〜１４にて処理され、乾燥され、樹脂は、２００φ１６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、２００ｍＭヒドラジンでｐＨ〜２にて、次いで、２００φ１６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテートでｐＨ４．６にて洗浄され、溶出液混合物は、ＨＰＬＣに注入する前にＴＣＥＰで処理される。次のペプチドセグメントを追加する準備として、樹脂は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉでｐＨ７．５（１ｍｌ×５）にて洗浄され、水切りされる。第２のペプチドセグメント（Ｃｙｓ−ＣＯＳＨ）は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．５，０．５％チオフェノール、に溶解され、樹脂に添加される。この混合物は室温で一晩放置される。次の朝、樹脂は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、ｐＨ４．６〔１ｍｌ×５）にて洗浄され、水切りされる。樹脂のサンプルが、Ｍａｌｄｉ及び塩基での切断のために採取され、上記と同様に処理される。固相結合ペプチドは、次いで、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、ｐＨ４．６中で５０ｍＭＢｒＡｃＯＨにより樹脂を１５分間処理することにより、ＣＯＳＨからＣＯＳＡｃに変換される。樹脂は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、ｐＨ４．６（１ｍｌ×５）にて洗浄され、水切りされる。次のペプチドを追加するための準備として、樹脂は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉでｐＨ７．５（１ｍｌ×５）にて洗浄され、水切りされる。最後のペプチドセグメントは、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．５，０．５％チオフェノールに溶解され、樹脂に添加される。この反応混合物は、室温で一晩放置される。次の朝、樹脂は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、ｐＨ４．６（１ｍｌ×５）にて洗浄され、水切りされる。樹脂のサンプルは、ＭＡＬＤＩＭＳ分析によるモニタリングのため採取される。集合したペプチドは、残った樹脂から切断可能ハンドルを塩基で切断することにより固相から遊離されるが、上記に概説したように、大スケールの場合のみでは、次にＨＰＬＣによる精製又はＰD−１０カラムでの脱塩を行い、凍結乾燥を行う。実施例４：Ｎ−末端でのＣ−末端方向への、Ｃ５ａ(１−７４)(７４ａａ)の固相自然化学連結この例では、Ｃ５ａ、補完因子５ＡのＮ−末端でのＣ−末端方向への固相連続自然化学連結につき述べる。Ｃ５ａの連鎖は、（SEQ ID NO.?）TLQ KKIEEIAAKYKJSVVKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPKCIKAFTECCVV ASQLRANISHKDMQLGR . このペプチドは、３つのペプチドセグメント、即ち、Ｃ５ａ（１−２０），Ｃ５ａ（２１−４６）、及びＣ５ａ（４７−７４）の固相連続自然連結を用いて調製される。固相連結によるＣ５ａの合成に用いられる工程は、ＭＩＦの固相連続自然連結で述べたと同様である（実施例５参照）。実施例５：Ｎ−末端でのＣ−末端方向への、ＭＩＦ(１−１１５)(１１５ａａ)の固相連続自然化学連結ＭＩＦ（１−１１５）の連鎖は、(SEQ.ID.NO． ):MPMFIVNTNVPRASVPDGFL SELTQQLAQATGKPPQYIAVHVVPDQLMAFGGSSEPC ALCSLHSIGKIGGAQNRSYSKLLCGLLAERLRIS PDRVYINYYDMNAASVGWNNSTFAである。このペプチドは、３つのペプチドセグメント、即ち、ＭＩＦ（１−５９），ＭＩＦ（６０−８０）及びＭＩＦ（８１−１１５）の固相連続自然化学連結を用いて調製される。図１６−２０を参照のこと。工程＃１：第１の保護されていないペプチドセグメントＭＩＦ（１−５９）は、図１８に図示されているように固相に結合される。カップリング条件は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、０．１５ＭメチオニンでｐＨ４．６にて２４時間である。用いられるＭＳＣハンドルは、この切断可能ハンドルは、メチルスルホニルエチルオキシカルボニル（ＭＳＣ）アミン保護基に基いている。それは、ペプチド−樹脂の保護されていないアミノ末端に容易に付加し、ＨＦ脱保護と樹脂からの切断に対して耐えることができ、塩基水溶液により速かに、きれいに切断され、種々の官能性を持って誘導される保護されたアミンを有するよう設計されている。工程＃２：第２の保護されていないペプチドセグメント（Ｃｙｓ６０−ＭＩＦ（６１−８０）−ＣＯＳＨ）は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，０．５％チオフェノール、０．１５ＭメチオニンでｐＨ７．５にて２４時間という条件下で、固相に結合した第１の保護されいないペプチドセグメントに連結される。工程＃３：固相結合ペプチドＭＩＦ（１−８０）−ＣＯＳＨは、次いで、５０ＭＢｒＣＨ２ＣＯＯＨ，６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、０．１５ＭメチオニンでｐＨ４．６にて１５分間という条件下でチオエステルに活性化される。工程＃４：第３の保護されていないペプチドセグメント（Ｃｙｓ８１−ＭＩＦ８２−１１５−ＣＯＯＨ）は、６Ｍグアニジン・ＨＣ１，０．１ＭＮａＰｉ，０．５％チオフェノール、０．１５ＭメチオニンでｐＨ７．５にて２４時間の条件で、固相結合ペプチドに連結される。工程＃５：固相に結合したＭＩＦ（１−１１５）は、次に、切断条件下で、切断可能ハンドルの塩基による切断で、固体支持体から切断される。その条件は、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、０．１５Ｍメチオニン、２００ｍＭヒドラジンでＰＨ−１４にて２分間であり、続いて、６Ｍグアニジン・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、０．１５Ｍメチオニン、２００ｍＭヒドラジンでｐＨ−２にて行われる。塩基による切断で遊離される集合したペプチドＭＩＦ（１−１１５）の期待される質量は１２４５０Ｄａである。図２０Ｃ及び２０Ｄは、１２４５０の期待される質量を有する集合したペプチドの質量スペクトルである。図２０Ｄは、図２０Ｃの質量スペクトルを再構成したものである。図２０Ｂは、集合したペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムである。実施例６：Ｃ−末端でのＮ−末端方向への、ホスホリパーゼＡ２、グループ５( １−１１８)(１１８ａａ)の固相自然化学連結ホスホリパーゼＡ２、グループ５（ＰＬＡ２Ｇ５）の連鎖は、(SEQ ID NO:):G LLDLKSMIEKVTGKNALTNYGFYGCYCGWGGRGTPKDGTDWCCWAHDHCYGRL EEKGCNIRTQSYKYRFAW GVVTCEPGPFCHVNLCACDRKLVYCLKRNLRSYNPQYQ YFPNILCSである。このペプチドは、４つのペプチドセグメント、即ち、ＰＬＡ２Ｇ５（１−２５），ＰＬＡ２Ｇ５（２６−５８），ＰＬＡ２Ｇ５（５９−８７），ＰＬＡ２Ｇ５（８８−１８）の固相連続自然連結を用いて調製される。固相連結によりＰＬＡ２Ｇ５を合成するのに用いられる工程は、実施例９で述べるように、中間セグメントのＮ−末端Ｃｙｓ残基をＡＣＭで保護することによるランダム連続のものを合成するために用いられる方法と同様である。反応系統は、図２２を参照のこと。Ｃａｍエステル誘導体が合成され、図２３，２４／図２７の系統図に従ってＣ−末端ペプチドセグメントに合体される。実施例７：修飾されたＣ−末端ペプチドセグメント(樹脂上ＣＡＭリンカー合成) (図２７)の調製選択される市販の樹脂（ＭＢＨＡ，Ｂｏｃ−ＡＡ−ＯＣＨ２−Ｐａｍ樹脂はいずれも可）は、ＤＭＦ中で膨潤される。 −ＴＦＡ(１分間×２)(ＭＢＨＡ樹脂を用いて行うときは不要) −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒×２） −活性化されたＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性化）の添加、１０〜１５分後にニンヒドリン試験で反応の完了をチェックする。 −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −ＴＦＡ（１分間×２） −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −ＤＭＦ中の１０％ＤＩＥＡ（１分間×２） −活性化臭化酢酸（ＤＣＭ中で０．５当量のＤＩＣで５〜１０分間対称無水物として活性化されたもの）を添加し、３０分後に、ニンヒドリン試験で反応の完了をチェックする。 −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −ＤＭＦ中、２０％ＤＩＥＡ中におけるシーケンス（Ｂｏｃ−ＡＡ−ＯＨ）２Ｍの最初のＢｏｃ−保護アミノ酸を添加する。室温で３時間放置する。 −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −Ｂｏｃ化学物質に対する標準プロトコールによりシーケンスの残を合成する。 −ＤＭＦ中２０％ピペリジンで処理（５分間×２）ことにより、Ｆｍｏｃ基を脱離させる。 −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −活性化されたレブリン酸（ＤＣＭ中で０．５当量のＤＩＣで対称無水物として活性化されたもの）を添加し、３０分後に、ニンピドリン試験で、反応の完了をチェックする。 −ＤＭＦ流動洗浄（３０秒間×２） −ＤＣＭで十分洗浄 −十分に樹脂を乾燥 −捕集剤としてｐ−クレゾールを用い０℃、１時間でＨＦ切断する。 −粉砕して、冷エチルエーテルで洗浄 −ＨＰＬＣ緩衝水溶液に溶解し、凍結乾燥 −ＨＰＬＣで精製実施例８：Ｆｍｏｃ保護を用い、Ｃ−末端でのＮ−末端方向への、ランダムペプチドセグメントの固相自然化学連結以下の工程は、表２の系統図に示すように、Ｃ−末端でのＮ−末端方向への固相連結に用いられるものである。例えば、（ＳＥＱＩＤＮＯ：？）：ＡＬＴＫＹＧＦＹＧＣＹＧＲＬＥＥＫＧＣＡＤＲＫＮＩＬＡのランダムペプチドは、３つのペプチドセグメント、即ち、セグメント１＝ＣＡＤＲＫＮＩＬＡ、セグメント２＝ＣＹＧＲＬＥＥＫＧ、及びセグメント３＝ＡＬＴＫＹＧＦＹＧ、に連結される（Ｃ−末端からＮ−末端方向へ）。樹脂は、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、ｐＨ４．６（１ｍｌ×５）にて洗浄され、水切りされる。修飾されたＣ−末端ペプチドセグメント（第１のペプチドセグメント）は、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート中にｐＨ４．６（５ｍＭ第１のペプチドセグメント）にて溶解され、樹脂に加えられ、室温で一晩放置される。樹脂は、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテートでｐＨ４．６（１ｍｌ×５）にて洗浄され、水切りされる。サンプルは、塩基による切断のために採取され、８Ｍ尿素、０．１ＭＮａＰｉでｐＨ７にて処理され、同じ８Ｍ尿素緩衝液（結果のｐＨ〜１４）中で０．２５ＮＮａＯＨで２分間処理され、同じ８Ｍ尿素緩衝液（結集のｐＨ〜２）中で等量の０．２５ＮＨＣｌで洗浄され、溶出液混合物は、ＨＰＬＣに注入される前にＴＣＥＰで処理される。次のセグメントを追加するための準備として、樹脂は、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉでｐＨ７．０（１ｍｌ×５）にて洗浄され、水切りされる。第２のペプチドセグメント（Ｆｍｏｃ− Ｃｙｓ−ペプチド−ＣＯＳＲ）は、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．０，０．５％チオフェノールに溶解され（少くとも１０ｍＭから５０ｍＭまでのペプチドセグメント）、樹脂に加えられ、混合物は室温で一晩放置される。樹脂は、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．０（１ｍｌ× ５）、水（１ｍｌ×５）、ＤＭＦ（１ｍｌ×５）で洗浄され、ＤＭＦ中での２０％ピペリジンで２回（各５分間）処理することにより、Ｆｍｏｃ保護基が取り除かれる。次いで、樹脂は、ＤＭＦ（１ｍｌ×５）、水（１ｍｌ×５）及び６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７（１ｍｌ×５）で洗浄される。樹脂のサンプルは採取され、上記と同様にして塩基により切断される。最後のペプチドセグメントは、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．０，０．５％チオフェノールに溶解され、樹脂に加えられる。混合物は、室温で一晩放置される。次いで、樹脂は、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．０で洗浄され、残った樹脂から切断可能ハンドルを塩基で切断することにより固相から集合したペプチドを遊離させるが、上記に概説したように、大スケールの場合にのみは、続いて、ＨＰＬＣによる精製又はＰＤ−１０カラムでの脱塩を行う。これらの方法は、システイン残基を有するいかなるペプチドを作る場合にも適用可能である。実施例８Ａ：ＤＮＰＥ保護を用いた、Ｃ−末端でのＮ−末端方向への、ランダムペプチドセグメントの固相自然化学連結ＤＮＰＥ(２−(２，４−ジニトロフェニルエチル))は、Ｃ−末端でのＮ−末端方向への連結に用いられる、もう一つの、システイン側鎖保護基である。保護基としてＤＮＰＥを用い、実施例８を繰返した。Ｃ−末端でのＮ−末端方向へのランダムペプチドセグメントの固相化学連結のための条件は、上述の実施例８で用いられた条件と同様であるが、ＤＮＰＥ保護基の脱離に、５０％ピペリジンを用いる点が異る。実施例９：ＡＣＭ保護を用いた、Ｃ−末端でのＮ−末端方向へのランダムペプチドセグメントの固相自然化学連結次の工程は、表３に示すように、Ｃ−末端でのＮ−末端方向への固相連結のために用いられるものである。上記の実施例で述べた同じランダムポリペプチドが連結される。樹脂は、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、ｐＨ４．６（１ｍｌ×５）で洗浄され、水切りされる。修飾されたＣ−末端ペプチドセグメントは、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａアセテート、ｐＨ４．６に溶解され、樹脂に加えられ、室温で一晩放置される。サンプルは、塩基による切断のために採取され、８Ｍ尿素、０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７で処理され、同じ８Ｍ尿素緩衝液中（結果としてのｐＨ〜１４）、０．２５ＮＮａＯＨで２分間処理され、次いで、同じ８Ｍ尿素緩衝液中（結果としてのｐＨ〜２）、等量の０．２５ＮＨＣｌで洗浄され、溶出液混合物は、ＨＰＬＣに注入される前にＴＣＥＰで処理される。次のセグメントを追加するための準備として、樹脂は、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．０（１ｍｌ×５）で洗浄され、水切りされる。第２のペプチドセグメント（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ペプチド−ＣＯＳＲ）は、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．０，０．５％チオフェノール（少くとも１０ｍＭの第２のペプチドセグメントまで）に溶解され、水切りされる。混合物は室温で一晩放置される。樹脂は、水中の６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．０（１ｍｌ×５），３％酢酸で洗浄され、次いで、水中３％酢酸中の水銀（II）アセテートで処理することによりＡＣＭ保護基が脱離される。次いで、樹脂は、水中の３％酢酸（１ｍｌ×５），６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．０（１ｍｌ ×５）で洗浄され、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．０中の２０％ベーターメルカプトエタノールで３０分間処理され、次いで、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７（１ｍｌ×５）で洗浄される。樹脂のサンプルは、採取されて上記のように塩基で切断される。最後のペプチドセグメントは、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．０，０．５％チオフェノールに溶解され、樹脂に加えられる。混合物は室温で一晩放置される。次いで、樹脂は、６ＭＧｕ・ＨＣｌ，０．１ＭＮａＰｉ，ｐＨ７．０で洗浄され、残った樹脂から切断可能ハンドルを塩基で切断することにより固相から遊離されるが、上記に概説したように、大スケールの場合のみは、続いて、ＨＰＬＣによる精製又はＰＤ−１０カラムでの脱塩及び凍結乾燥を行う。実施例１０：双方向固相連続自然化学連結この例は、双方向固相蛋白質連結へのアプローチの一つの態様を表すもので、即ち、固相に結合した第１のペプチドセグメントで開始する状態であり、この場合、第１のペプチドセグメントは、所望の目的蛋白質の「中位の部分片」であり、即ち、固相に結合した第１のペプチドセグメントは、そのＮ−末端システイン及びＣ−末端チオエステルの両方で連結するために用いられる。目的蛋白質の中位の部分片の一つで開始すると、切断可能なリンカーが、中位の部分片の側鎖のアミノ酸残基の一つに付加される。保護可能な官能基を有するアミノ酸残基の側鎖は、いずれも使用可能であり、好ましくは、アスパルティック酸又はグルタミン酸が含まれる。最も好ましくは、リジンアミノ酸残基を用いることである。例えば、ＣＡＭ切断可能ハンドル又はいかなる他のカルボン酸保護基も、アスパルティック又はグルタミン酸の側鎖によって第１のペプチドセグメントを固相に結合させるために選択されうる。この工程を完遂するための必要な化学物質については、当業者は容易にわかるだろう。例えば、内部アミノ酸により固相に結合される第１のペプチドセグメントの合成は、図２５Ｃに図示されている。適切な固相（チオエステル又はチオ酸を生成する）で開始すると、第１のペプチドセグメントは、標準的なＢｏｃプロトコールを用いて合成され、選択されたリジン残基に到達する。Ｂｏｃ化学物質を用いると、Ｆｍｏｃ基で保護された側鎖のアミンを持つリジン（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ）は、固相段階的ペプチド合成の間に、適切な位置で挿入され、次いで、第１のペプチドセグメントの末端まで合成が継続する。Ｆｍｏｃ保護基は、段階的ペプチド合成の終りに脱離され、側鎖アミンに結合している脱離可能ハンドルも脱離される（図２５Ｃの工程Ｂ）。この方法は、図２４に概説した工程と大部分同じであるが、次の点で異っている。即ち、工程４のレブリン酸が、切断可能ハンドルに置きかわり、Ｆｍｏｃ基（また工程４の一部）を切断するために用いられる２０％ピペリジンが、１．８ −ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、即ち、ＤＭＦ中のＤＢＵの１−２等価物のような代りの塩基で、より低濃度のものに置かれる点である。その理由は、中間のペプチドセグメントが、樹脂からの切断時にチオ酸又はチオエステルを生成するか否かにかゝわらず、２０％ピペリジンの存在で切断されるチオエステルにより樹脂に結合されるからである。この特殊な戦略のためには、ＭＳＣハンドルが好ましく、他の切断可能ハンドルも用いることができる。リジン残基の側鎖アミンへの結合、及び、固相連結樹脂上の対応する基と反応しうる適切な官能基を持ったリンカーの修飾は、一般には図１７Ａに概要を示したようなものであるが、ＭＳＣハンドルのアミンが、Ｂｏｃ基の代りにＦｍｏｃ基で保護されるという点が異る。ペプチドセグメントへの結合が、内部アミノ酸残基によるものであるから、Ｎ−末端アミノ酸は、Ｂｏｃ保護となり、Ｎ−末端アミノ基、及びＭＳＣ切断可能ハンドルのアミノ基が、同じ基によって保護されることは不可能である。ＭＳＣ切断可能ハンドル上のＦｍｏｃ基の除去は、また、ピペリジンの代りにＤＢＵで行われることが必要である。図１７Ａに示すように、レブリン酸が、固体支持体上の対応するアミノオキシアセチル基と共にリンカーに結合するためには、好ましい。樹脂に結合する第１のペプチドセグメントについての形式を、２つ下記に述べる。第１の形式。第１のペプチドセグメントは、保護されていないＮ −末端システインとＣ−末端チオ酸を有する（図２５Ａ）。第２のペプチドセグメント（図２５Ａの工程２）は、第１のペプチドセグメントに連結されるもので、Ｃ−末端チオエステル及び必要により、保護されたＮ−末端システイン（もし、さらにＣ−末端からＮ−末端への連結を望む場合には）を有するペプチドであって、Ｃ−末端チオエステルは、第１のペプチドセグメント（例えば、Ｃ−末端でのＮ−末端方向へ）のＮ−末端Ｃｙｓと反応することができる。この工程は、所望なら、Ｃ−末端でのＮ−末端方向へ付加される追加のペプチドセグメントと共に、複数回繰返されるが、もし、内部に投入されるペプチドセグメントが、保護されたＮ−末端システインをそれぞれ有する場合には、標準的なＣ−末端からＮ−末端への固相自然化学連結工程に従って、該システインは脱保護されるのであり、これは図２１に概説されている（目的生成物のＮ−末端に付加される第１のペプチドセグメントは、Ｎ−末端システインを有している必要はない）。連結が完了した後、目的の固相結合ペプチド（例えば、第１又は第２のペプチドセグメントの連結生成物）のＣ−末端チオ酸は、次に、臭化酢酸でチオエステルに変換される（表１のＮ−末端でのＣ−末端連結で概説し、図２５Ａの工程３に系統図で示した）。次の工程（図２５Ａの工程４）は、Ｎ−末端Ｃｙｓを持った第３のペプチドセグメントへの固相結合ペプチドの連結を含む。この工程は、Ｎ−末端でのＣ−末端への追加で投入されるペプチドセグメントを追加するために、必要により繰返されるもので、所望ならば、内部に投入されるペプチドセグメントがそれぞれ、保護されていないＮ−末端システイン及びＣ−末端チオ酸を有している場合には、チオ酸のチオエステルへの変換に関して、連結が完了した後、次のペプチドセグメントの追加に先立って、上記の工程が繰返される。適切な保護基及び他の適切な化学物質が中位の部分片又は固相結合ペプチドに対して用いられるならば、多様な連結が、続いて双方向に起りうるということは、当業者には容易にわかるだろう。これらの追加的な工程は、個々の方向、即ち、Ｎ−末端からＣ−末端方向へのＮ−末端の保護されていないＣｙｓに加えてＣ −末端チオエステル、及びＣ−末端からＮ−末端方向へのＮ−末端Ｃｙｓ（ＡＣＭ）に加えてＣ−末端チオエステル、など個々の方向に用いられる戦略と同様である。ＭＳＣリンカーが用いられるならば、樹脂から、最終の鎖長の生成物を切断することは、表１の工程６で概説したように、塩基溶液（ｐＨ１２〜１４）中で行われる。しかし、好ましいアプローチは、一方向への必要な全ての連結工程を完了することであり、続いて、他の方向へ連結を行うことである。固相結合ペプチドが、保護されたＮ−末端システイン又はＣ−末端チオ酸のいずれかを有している限り、連結は、ここで述べる適切な戦略が行われるならば、いずれかの方向に進行する。もし、固相結合ペプチドが、保護されていないＮ−末端システイン及びＣ−末端チオエステルの両方を有しているならば、追加で投入されるペプチドセグメントへ連結しようという企ては、いずれも、固相結合ペプチドの環化という結果になるだろう。第２の形式。この系統の第２の形式は、Ｎ−末端でのＣ−末端方向への連結で開始し、続いて、反対方向方向での連結が起るが、このことは図２５Ｂに示す通りである。樹脂に結合する第１のペプチドセグメントは、一時的に保護されたＮ −末端ＣｙｓとＣ−末端チオエステルを有する。第１のペプチドセグメントに対する第２のペプチドセグメントの連結は、Ｎ−末端にてＣ−末端方向である。Ｃ −末端でのＮ−末端方向への続いて起る連結はいずれも、最初に、保護基の脱離を必要とする。固体支持体に対する第１のペプチドセグメントの結合を除けば、この戦略は、単に、Ｎ−末端でのＣ−末端方向及びＣ−末端でのＮ−末端方向への連結の工程を結合しただけのものである（上記を参照のこと）。この明細書で言及された全ての文献及び特許出願は、参考文献としてここに加えてあり、それは、個々の文献又は特許出願が参考文献として加えられるべきであると、特別にそして個別的に指摘されていた限りの範囲のものである。本発明については、以上に十分に説明したので、添付されたクレームの精神と範囲から離れない限り、多くの変形や改良がなされうることは当業者には明らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年７月２９日（１９９９．７．２９）【補正内容】請求の範囲１．Ｎ−末端においてＣ−末端方向に集合したペプチドを製造する方法であって、該方法は、ａ）Ｎ−末端システインとＣ−末端チオ酸を有するペプチドセグメントをＣ− 末端チオエステルを有する固相結合ペプチドセグメントに連結して、Ｃ−末端チオ酸を有する固相結合ペプチドセグメントを形成すること、及び、ｂ）該固相結合ペプチドの該Ｃ−末端チオ酸をＣ−末端チオエステルに変換して、Ｃ−末端チオエステルを有する固相結合の集合したペプチドを形成すること、からなる工程を有する方法。２．固相結合ペプチドセグメントが、リンカーによって該ペプチドセグメントに結合した固相を有する請求項１記載の方法。３．リンカーが切断可能なリンカーである請求項２記載の方法。４．さらに、切断可能なリンカーを切断することにより、固相から集合したペプチドを分離することを有する請求項３記載の方法。５．さらに、Ｃ−末端チオエステルを有する固相結合の集合したペプチドを、Ｎ−末端システインとチオ酸以外のＣ−末端基を有するペプチドセグメントに連結して、チオ酸以外のＣ−末端基を有する固相結合の集合したペプチドを形成する請求項１記載の方法。６．固相結合の集合したペプチドセグメントがリンカーによって該ペプチドセグメントに結合した固相を有する請求項５記載の方法。７．リンカーが切断可能なリンカーである請求項６記載の方法。８．さらに、切断可能なリンカーを切断することにより、固相から集合したペプチドを分離することを有する請求項７記載の方法。９．Ｃ−末端においてＮ−末端方向に集合したペプチドを製造する方法であって、該方法は、ａ）第１のペプチドセグメントを第２のペプチドセグメントに連結し、該第１のペプチドセグメントは保護されていないＮ−末端システインと、該Ｃ−末端基に隣接するリンカーにより固相に結合したＣ−末端基を有しており、該第２のペプチドセグメントは保護されているＮ−末端システインと保護されていないＣ− 末端チオエステルを有すること、ｂ）第２のペプチドセグメントの保護されているＮ−末端システインの脱保護基を行うこと、及び、ｃ）保護されていないＣ−末端チオエステルを有する第３のペプチドセグメントを、第２のペプチドセグメントの保護されてないＮ−末端システインに連結して集合したペプチドを製造すること、からなる方法。１０．第３のペプチドが保護されているＮ−末端システインを有し、工程ｂ）及びｃ）が、脱保護基及び連結と一致して一つ又はそれ以上のペプチドセグメントの追加と共に、一回又はそれ以上繰り返される請求項９記載の方法。１１．リンカーが切断可能なリンカーである請求項９に記載の方法。１２．さらに、切断可能なリンカーを切断することにより、固相から集合したペプチドを分離することを有する請求項１１記載の方法。１３．リンカーが切断可能なリンカーである請求項１２記載の方法。１４．さらに、切断可能なリンカーを切断することにより、固相から集合したペプチドを分離することを有する請求項１３記載の方法。１５．集合したポリペプチドを製造するためのキットであって、ａ）第１の保護されていないペプチドセグメントが、Ｃ−末端とＮ−末端にチオエステルを有し、該第１の保護されていないペプチドセグメントが、切断可能な部位を有するリンカーにより固相に結合していること、ｂ）第２の保護されていないペプチドセグメントの対が、それぞれＣ−末端にチオ酸を、Ｎ−末端にシステインを有し、各該第２の保護されていないペプチドセグメントが同数のアミノ酸を有すること、及び、ｃ）異なる保護されていないペプチドセグメントの一対又はそれ以上が、それぞれＣ−末端にチオエステルを、Ｎ−末端にシステイン残基を有し、各対がそれぞれ同数のアミノ酸を有すること、を特徴とするキット。１６．第２の保護されていないペプチドセグメントの対が、同じ長さで、異なった数のアミノ酸連鎖を持つペプチドを有する請求項１５記載のキット。１７．第２の保護されていないペプチドセグメントの対が、実質的に同等のペプチドからなる請求項１５記載のキット。１８．異なる保護されていないペプチドの一対又はそれ以上が、同じ長さで、異なった数のアミノ酸連鎖を持つペプチドの少なくとも一対を有する請求項１５記載のキット。１９．集合したポリペプチドを製造するための装置であって、ａ）Ｃ−末端にチオエステルを、Ｎ−末端に切断可能なリンカー−を持った第１の保護されていないペプチドに結合している固体支持体を有しており、該保護されていないペプチドは、リンカーにより該固体支持体に結合していること、ｂ）第２の保護されていないペプチドの対は、それぞれＣ−末端にチオ酸を、Ｎ−末端にシステイン残基を有していること、ｃ）異なる保護されていないペプチドの一対又はそれ以上が、それぞれＣ−末端にチオ酸を、Ｎ−末端にシステイン残基を有していること、を特徴とする装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者サイモン，レイナアメリカ合衆国，カリフォルニア 95030, ロスガトス，ラスカンバーズロード 18439

Claims

【特許請求の範囲】１．水溶液中で、固相上に集合したペプチドを製造する方法であって、該方法は、ａ）保護されていない第１のペプチドセグメントをリンカーにより固相に結合することであり、該保護されていない第１のペプチドセグメントは、Ｎ−末端を有し、そのＣ−末端に−ＣＯＳＲの形のチオエステルを有し、該リンカーは切断可能部位を有し、該保護されていない第１のペプチドセグメントは、該Ｎ−末端で該リンカーに結合していること、ｂ）該固相に結合した該第１のペプチドセグメントに保護されていない第２のペプチドセグメントが連結しており、該第２のペプチドセグメントはそのＮ−末端にシステインを有し、そのＣ−末端にチオ酸を有し、そして、該第２のペプチドセグメントのＮ−末端システインは、該固相に結合した第１のペプチドセグメントのＣ−末端に化学選択的に連結して、そのＣ−末端にチオ酸を有する固相結合ペプチドを形成することができること、ｃ）該固相結合ペプチドの該Ｃ−末端チオ酸を、−ＣＯＳＲの形の活性化されたチオエステルに変換すること、ｄ）工程ｂ）及びｃ）を、保護されていない第３のペプチドセグメントについて繰り返すこと、ｅ）必要により、工程ｂ）及びｃ）を、保護されていない追加のペプチドセグメントについて繰り返すこと、からなる方法。２．さらに、工程ｅ）の後に、ｆ）リンカーを切断して、集合したペプチドを遊離すること、を有する請求項１に記載の方法。３．集合したポリペプチドが、２０以上、１０００以下の長さのアミノである請求項１に記載の方法。４．固体支持体が樹脂ビーズである請求項１に記載の方法。５．切断可能部位が切断可能ハンドルである請求項１に記載の方法。６．切断可能部位が切断可能リンカーである請求項１に記載の方法。７．ペプチドセグメントの範囲が、その大きさにおいて、５以上、９９以下のアミノ酸残基である請求項１に記載の方法。８．ペプチドセグメントが、全て、段階的固相合成により調製されたものである請求項１に記載の方法。９．固相結合ペプチドに連結される最後のペプチドセグメントが、組み換えＤＮＡ発現から誘導されたものである請求項１に記載の方法。１０．ペプチドセグメントの少なくとも一つが、非自然主鎖構造を有する請求項１に記載の方法。１１．変換工程が、臭化酢酸を用いて完遂される請求項１に記載の方法。１２．ｆ）質量分光分析法を用いて、連結反応をモニターすること、をさらに有する請求項１に記載の方法。１３．集合したペプチドを製造する方法であって、該方法は、ａ）保護されていない第１のペプチドセグメントをリンカーにより固相に結合することであり、該保護されていない第１のペプチドセグメントは、Ｎ−末端を有し、そのＣ−末端に−ＣＯＳＨの形のチオ酸を有し、該リンカーは切断可能部位を有し、該保護されていない第１のペプチドセグメントは、該Ｎ−末端で該リンカーに結合していること、ｂ）該第１のペプチドセグメントの該Ｃ−末端チオ酸を、−ＣＯＳＲの形のチオエステルに変換すること、ｃ）該固相に結合した該第１のペプチドセグメントに保護されていない第２のペプチドセグメントが連結しており、該第２のペプチドセグメントはそのＮ−末端にシステインを有し、そのＣ−末端にチオ酸を有し、そして、該第２のペプチドセグメントのＮ−末端システインは、該固相に結合した第１のペプチドセグメントのＣ−末端に化学選択的に連結して、そのＣ−末端にチオ酸を有する固相結合ペプチドを形成することができること、ｄ）該固相結合ペプチドの該Ｃ−末端チオ酸を、−ＣＯＳＲの形の活性化されたチオエステルに変換すること、ｅ）工程ｃ）及びｄ）を、保護されていない第３のペプチドセグメントについて繰り返すこと、ｆ）必要により、工程ｃ）及びｄ）を、保護されていない追加のペプチドセグメントについて繰り返すこと、からなる方法。１４．集合したペプチドを製造する方法であって、該方法は、ａ）第１のペプチドセグメントをリンカーにより固相に結合することであり、該第１のペプチドセグメントは、Ｎ−末端システイン及び該リンカーに結合しうるＣ−末端を有し、該リンカーは切断可能部位を有し、該第１のペプチドセグメントは、該Ｃ−末端で該リンカーに結合していること、ｂ）該固相に結合した該第１のペプチドセグメントに第２のペプチドセグメントが連結しており、該第２のペプチドセグメントはそのＮ−末端にシステインを有し、そのＣ−末端にチオエステルを有し、そして、該第２のペプチドセグメントのＮ−末端システインは保護基に結合することができ、該第２のペプチドセグメントのＣ− 末端チオエステルは、該第１のペプチドセグメントのＮ−末端システインに結合して、そのＮ−末端に保護されたシステインを有する固相結合ペプチドを形成すること、ｃ）該保護基を取り除くこと、ｄ）工程ｂ）及びｃ）を、もう一つのペプチドセグメントについて少なくとも一回繰り返すこと、ｅ）該固相結合ペプチドに最後のペプチドセグメントを連結することであり、該最後のペプチドセグメントは保護されておらず、Ｃ−末端チオエステルを有すること、ｆ）該切断可能部位を切断して、固相から集合したペプチドを遊離すること、からなる方法。１５．固相結合ペプチドを質量分光分析して、任意の段階で該連結反応をモニターそることを、さらに含む請求項１４記載の方法。１６．集合したペプチドを製造する方法であって、該方法は、ａ）第１のペプチドセグメントをリンカーにより固相に結合することであり、該第１のペプチドセグメントは、Ｎ−末端システイン及び該リンカーに結合しうるＣ−末端を有し、該リンカーは切断可能部位を有し、該第１のペプチドセグメントは、該Ｃ−末端で該リンカーに結合していること、ｂ）該固相に結合した該第１のペプチドセグメントに第２のペプチドセグメントが連結しており、該第２のペプチドセグメントは、Ｃ−末端チオエステルを持つペプチドを有し、該第２のペプチドセグメントの該Ｃ−末端チオエステルは、固相に結合した該第１のペプチドセグメントのＮ−末端システインに結合して、そのＮ−末端に保護されたシステインを有する固相結合ペプチドを形成すること、からなる方法。１７．集合したペプチドを製造する方法であって、該方法は、ａ）第１のペプチドセグメントをリンカーにより固相に結合して固相結合ペプチドを形成すること、ｂ）水溶液中で、該固相結合ペプチドに少なくとも第２のペプチドセグメントを連結すること、からなる方法。１８．該固相が水親和性である請求項１７記載の方法。１９．該水溶液が１−８Ｍ尿素を有する請求項１７記載の方法。２０．該水溶液が１−６Ｍグアニジン・ＨＣｌを有する請求項１７記載の方法。２１．該水溶液が、水中での１０−６０％アセトニトリルを有する請求項１７記載の方法。２２．該水溶液が、水／有機溶媒の混合物を有する請求項１７記載の方法。２３．集合したポリペプチドを製造するためのキットであって、該キットは、ａ）保護されていない第１のペプチドセグメントは、Ｃ−末端及びＮ−末端にチオエステルを有しており、該保護されていない第１のペプチドセグメントは、切断可能部位を有するリンカーにより固相に結合していること、ｂ）保護されていない第２のペプチドセグメントのセットは、それぞれ、Ｃ− 末端にチオ酸を、Ｎ−末端にシステインを有し、該保護されていない第２のペプチドセグメントは、それぞれ、同数のアミノ酸を有していること、ｃ）異なった保護されていないペプチドセグメントのセットの一つ又はそれ以上は、それぞれ、Ｃ−末端にチオエステルを、Ｎ−末端にシステイン残基を有し、各セットの各ペプチドセグメントは、同数のアミノ酸を有していること、からなるキット。２４．保護されていない第２のペプチドセグメントのセットが、同じ長さで、異なったアミノ酸シーケンスを持つペプチドを有する請求項１２記載のキット。２５．保護されていない第２のペプチドのセットが、実質的に同じペプチドからなる請求項１２記載のキット。２６．異なった保護されていないペプチドセグメントのセットの一つ又はそれ以上が、同じ長さで、異なったアミノ酸シーケンスを持つペプチドの少なくとも一セットを有する請求項１３記載のキット。２７．集合したポリペプチドを製造するための装置であって、該装置は、ａ）固体支持体が、Ｃ−末端にチオエステルを、Ｎ−末端に切断可能リンカーを有する保護されていない第１のペプチドに結合しでおり、該保護されていないペプチドは、リンカーにより該固体支持体に結合していること、ｂ）保護されていない第２のペプチドセグメントのセットは、それぞれ、Ｃ− 末端にチオ酸を、Ｎ−末端にシステイン残基を有していること。ｃ）異なった保護されていないペプチドのセットの一つ又はそれ以上は、それぞれ、Ｃ−末端にチオ酸を、Ｎ−末端にシステイン残基を有していること、からなる装置。２８．固相で連続的に連結された集合したペプチドのポリペプチドライブラリー製造する方法であって、該方法は、ａ）保護されていない第１のペプチドセグメントのセットを、リンカーにより固相に共有結合させることで、該リンカーは、連結条件下で安定な切断可能部位を有し、該保護されていない第１のペプチドセグメントは、それぞれ、Ｎ−末端で該リンカーに結合しており、Ｃ−末端にチオエステルを有していること、ｂ）保護されていない第２のペプチドセグメントのセットを導入することであって、該第２のセグメントは、それぞれ、Ｎ−末端にシステイン残基を、Ｃ−末端にチオ酸を有しており、該導入は、該保護されていない第１のペプチドセグメントと該保護されていない第２のペプチドセグメントとの間に連結を生じさせて、該固体支持体に結合した自然的連結ポリペプチドを形成せしめるために適切な条件下で行われ、該結合したポリペプチドはＣ−末端にチオ酸を有していること、ｃ）チオ酸をチオエステルに変換すること、ｄ）必要により、工程ｂ）及びｃ）を、保護されていないペプチドセグメントの追加的なセットについて繰り返すこと、からなる方法。