CN1451013A - 对亲核试剂稳定的硫酯生成化合物,及其生产和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含原硫代酸酯或硫醇羧基酯的对亲核试剂稳定的硫酯生成化合物以及它们的生产和使用方法。这些化合物和方法在有机合成中有广泛应用，包括肽－、多肽－和其它聚合物－硫酯的生成。本发明特别适用于由使用强亲核试剂条件下制备的前体来生成活化硫酯，前体如用Fmoc SPPS制备的肽或多肽，以及通过多步连接或结合方法制备的肽或多肽，这需要(或从其使用中受益)相容的选择性方法指导相关的特异性连接或结合反应。
Description
技术领域
本发明涉及对亲核试剂稳定的硫酯生成化合物及其生产和使用方法。
背景技术
硫酯代表一类重要的、易于与亲核试剂反应的分子。硫酯特别适用于共轭及化学选择性连接反应。化学连接涉及第一化学成分与第二化学成分的化学选择性共价键合。存在于第一和第二化学成分中的独特的、相互反应的官能团可用于进行化学选择性连接反应。例如，硫酯通常用于进行肽和多肽的化学选择性化学连接。几种不同的硫酯介导的化学反应已用于此目的，如天然化学连接(Dawson等，Science(1994)266：776-779；Kent等，WO 96/34878；Kent等，WO 98/28434)。
遗憾的是制备肽和其它硫酯(Hojo等，Pept.Chem.(1992)，VolumDate 1991，29th pp，115-20；Canne等，Tetrahed.Letters(1995)36：1217-20；Hackeng等，Proc Natl Acad Sci USA.(1999)96：10068-73)和某些情况下使用的传统条件限于非亲核合成策略。例如，当试图使用Nα-9-芴基甲氧羰基(“Fmoc”)-基肽合成法制备有硫酯活性的肽时，问题产生了，就是肽合成过程中，强亲核试剂如哌啶或哌啶生成的氢氧根离子导致硫酯部分的破坏，这是不希望有的。这是一个重要问题，因为用于在每个Fmoc-基有机合成循环中除去Nα-Fmoc基团的优选试剂含有哌啶。哌啶如同其它强碱性或亲核化合物(以下称为“亲核试剂”)一样，破坏肽的硫酯成分，使它在以后的硫酯介导反应中失去作用。
已有多种尝试用于解决这一问题。Clippingdale等(J.PeptideSci.(2000)6：225-234)用非亲核性碱来除去由Fmoc-基固相肽合成法(“SPPS”)制备的肽的Nα-Fmoc基团。此方法有几个问题，包括产生不希望的缺失、副产物并需要主链保护策略。其它研究小组，包括，Bertozzi等(J.Amer.Chem.Soc.(1999)121：11684-11689)和Pessi等(Journal of the American Chemical Society；1999；121：11369-11374.)已经报导在Fmoc SPPS中结合‘Kenner’保险栓连接子，在溶液中生成完全保护的肽-硫酯，‘Kenner’保险栓连接子对亲核试剂是稳定的直至连接子烷基化。此方法的一个缺点是受保护的肽在溶液中的溶解性能太差。此方法的其它缺点，包括此方法固有的副反应，如当连接子烷基化而不稳定时生成多余的烷基化副产物，因此在许多应用情况下此方法是不实际的。相似的失败已发生在除了肽之外的分子的亲核性合成方案中，如有机小分子。
因此，所需要的就是通用并可靠的系统，它适用于产生对亲核试剂稳定的硫酯生成化合物和组合物，它与用于多种有机合成策略、采用硫酯介导反应的结合和化学选择性连接反应的有机或水性反应条件相容。本发明陈述了这点以及其它需要。
发明概述
本发明涉及与对亲核试剂稳定的硫酯生成化合物有关的方法和组合物。在一个实施方案中，本发明涉及对亲核试剂稳定的原硫代酸酯，分子式X-C(OR’)2-S-R，其中X是相关的靶分子，任选地含有一个或多个对亲核试剂不稳定的保护基，R是与原硫代部分-C(OR’)2-S-相容的任何基团，R’是对亲核试剂稳定的保护基，在非亲核性条件下可除去。在另一实施方案中，本发明涉及对亲核试剂稳定的烷基硫醇羧基酯，分子式X-C(O)-O-CH(R”)-(CH2)n-S-R，其中X是相关的靶分子，包含一个或多个对亲核试剂不稳定的保护基，R”是对非亲核试剂稳定的基团，n是1或2，R是连接在树脂上的氢、保护基或对酸或还原剂不稳定的连接子，或在非亲核性条件下可除去的保护基。本发明还涉及对亲核试剂稳定的，包含原硫代酸酯或硫醇羧基酯的硫酯生成树脂。对亲核试剂稳定的硫酯生成树脂具有分子式X-C(OR’)2-S-R-连接子-树脂、X-C((OR1’-连接子-树脂)(OR2’))-S-R、X-C(O)-O-CH(R”)-(CH2)n-S-连接子-树脂，或X-C(O)-O-CH(R”-连接子-树脂)-(CH2)n-S-R。还提供了本发明中对亲核试剂稳定的硫酯生成化合物的生产方法，中间体组合物及使用方法。
在会聚或相容的选择性连接方案中，且更通常在存在或生成氢氧根离子或其它强亲核试剂的条件下，本发明化合物对于亲核试剂介导的有机合成方案，如Fmoc-基SPPS中使用的亲核试剂是稳定的，并因而得到大范围使用。例如，对亲核试剂稳定的含原硫代酸酯或硫醇羧基酯的成分可在氢氧根离子或其它强亲核试剂存在时制备，且在适宜时即转变为活性硫酯形式。为活化对亲核试剂稳定的原硫代酸酯，使用非亲核性试剂如强酸，将氧保护基从原硫代酸酯上简单地除去。得到的硫酯活化成分用于众多硫酯介导连接反应中的任一反应。通过混合硫醇催化剂活化本发明中对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯。添加硫醇催化剂促进了分子内的硫酯形成，如此有利于与带有亲核基团的有关成分的硫酯介导连接反应。
因而，本发明的对亲核试剂稳定的硫酯生成化合物及方法极大地扩大了亲核性合成方案，尤其是固相或溶液相Fmoc-基小分子和肽合成方案的应用。使这些方案的产物能够用于大范围的硫酯介导连接反应，用来生产有机小分子、肽和多肽、其它聚合物等。
附图简述
图1描述了对亲核试剂稳定的Fmoc-原硫代酸酯硫酯生成树脂，以及各种对亲核试剂稳定的中间体和活性硫酯靶X-C(O)SR的生成反应图解。本图揭示了通过使用这些试剂，化学合成中容许的相容选择性保护方法所具有的充分灵活性。本发明允许人们选择酸不稳定性相同或不同的绑缚连接子和残基保护基。同样地，酸的添加(用于切除连接子和/或形成硫酯)可在碱添加(用于除去Fmoc部分)之前或之后完成。这样，通过选择合适的酸不稳定保护基如苄基、Trt等，本发明允许人们合成能在仍结合在树脂上时去保护(即所选残基保护基比连接子对酸更不稳定)的产物。另外，人们可以合成能从树脂上释放然后去保护的产物(即所选残基保护基的酸不稳定性比连接子小一些)。这样就提供了改动的Myriad合成。
例如，如(A)和(B)所示，在存在亲核试剂或碱(例如哌啶)时，合成材料可保持在足以切除Fmoc基团的条件下，然后保持在足以使原硫代酸酯-C(OR’)2S-转化为硫酯-C(O)S-的酸性条件下。如(A)所示，任选择用于将多肽绑缚在树脂上的连接子使之在足够形成硫酯的条件下，抗酸(HF，TFA等)的切除。因此，在此实施方案中，Fmoc保护的氨基基团将去保护，形成硫酯，但多肽将保留在固态支持物上。如(B)所示，任选择用于将多肽绑缚在树脂上的连接子使之在形成硫酯的条件下被切除。因此，在此实施方案中，Fmoc保护的氨基基团将去保护，形成硫酯，且多肽将从固态支持物上释放。
如(C)和(D)所示，另一个可能的选择是，存在亲核试剂或碱(例如哌啶)时，合成材料保持在足以切除Fmoc基团的条件下，而不将反应物保持在足以使原硫代酸酯-C(OR’)2S-转化为硫酯-C(O)S-的酸性条件下。这些实施方案允许人们不制备硫酯而除去Fmoc基团。因此，如(C)所示，人们可除去Fmoc基团，并在从固态支持物上切除多肽或蛋白质，或生成硫酯之前，将比连接子更易受酸切除影响的残基去保护。此外，如(D)所示，人们可除去Fmoc基团，并从固态支持物上切除多肽或蛋白质，并在生成硫酯之前将其它受保护的残基去保护。
本发明的方法允许人们使用各种这些方案的组合(例如在相同的合成中使用，去除某些比连接子对酸更不稳定的残基的保护基，以及去除另一些酸不稳定性比连接子小一些的残基的保护基等)。
图2显示了对亲核试剂稳定的Fmoc-烷基硫醇羧基酯硫酯生成树脂和，通过使用硫醇催化剂活化它们来产生多种对亲核试剂稳定的中间体和活化硫酯靶X-C(O)SR的方案。本图揭示了通过使用这些试剂而获得的化学合成的充分灵活性。例如，如(E)所示，选择连接子和残基保护基使得合成材料可在足够除去Fmoc保护基的条件下保持，然后在足够将保护基比连接子对酸更不稳定的残基去保护的条件下保持。在此实施方案中，Fmoc保护的残基和酸不稳定残基被去保护，而既不生成硫酯也不从树脂上释放合成材料。其后连接子在适当条件下的切除可用于将化合物烷基硫醇羧基酯释放到溶液中，在溶液中，通过加入催化性硫醇，可将它转化为硫醇酯。另一选择，如(F)所示，选择连接子和残基保护基使得合成材料可在足够除去Fmoc的一种或多种组合条件下保持，并从树脂中释放合成产物，而并不生成硫酯。在此实施方案中，合成材料从树脂中释放，且那些比连接子更不稳定的所选残基保护基被除去，而那些酸不稳定性比连接子小的所选残基保护基保留下来。在另一实施方案(G)中，添加硫醇催化剂使羧基硫醇硫酯转化为硫酯。这样的添加可在添加碱或酸之前或之后进行。因而，当合成产物已Fmoc-去保护之后，可以任意顺序从树脂上切除，或将它的受保护残基去保护。此外，本发明的方法允许人们使用这些策略的各种组合(例如在相同的合成中使用，去除某些比连接子对酸更不稳定的残基的保护基，以及去除另一些酸不稳定性比连接子小一些的残基的保护基等)。
图3显示了通过天然化学连接反应来合成靶分子的会聚方案，在本例中，假定的肽片断A、B、C和D，与对亲核试剂稳定的Fmoc生成原硫代酸酯片断来生成多肽连接产物A-cys-B-cys-C-cys-D，通过半胱氨酸连接部位的天然酰胺键连接。此图显示了本发明方法用于介导蛋白质、多肽和聚合物双向有机合成的能力。如图所示，本方法能连接多个片断(片断可以为衍生蛋白质、多肽、氨基酸、树脂、核酸、碳水化合物、聚合物等)。可以连接任意数目的这样的片断。依照本方法，“片断A”硫酯的硫酯部分与“片断B”硫酯的半胱氨酸残基反应。“片断B”硫酯还包含原硫代酸酯部分。氨基的氮和半胱氨酸残基上的硫原子攻击“片断A”硫酯的碳，导致了五元环的暂时形成。此环自发分解形成连接的“片断AB”产物，其中酰胺键连接前面硫酯的碳和氨基上的氮原子，且其中重新生成半胱氨酸残基。“片断A”和“片断B”间的反应不涉及或影响“片断B”的原硫代酸酯部分。使用本发明的方法，“片断B”的原硫代酸酯部分转化为硫酯，因而生成了像“片断A”那样能进一步延伸的化合物。“片断A”和“片断B”的反应展示了氨基-至-羧基方向的肽合成。在图3所示的第二个实施方案中，提供了羧基-至-氨基方向的肽合成。“片断C”(衍生蛋白质、多肽、聚合物、碳水化合物、核酸或含有受保护的(“PG”)半胱氨酸残基的氨基酸及硫酯)与“片断D”(半胱氨酸、或N-末端含半胱氨酸的蛋白质、多肽、聚合物)反应。如同片断A和B的情况，反应分解形成连接的“片断CD”产物，其中酰胺键连接前面硫酯的碳和前面片断D的N-末端半胱氨酸氨基上的氮原子，且其中重新生成半胱氨酸残基侧链硫醇。在除去PG保护基后，连接分子如“片断D”可进一步延伸。值得注意的是，在形成硫酯部分后，片断AB连接产物可与片断CD连接产物连接，因而包括生成片断ABCD连接产物的会聚合成方案。
图4显示了图3描述的靶分子天然化学连接的另一会聚方案，在本例中，假定的肽片断A、B、C和D，与对亲核试剂稳定的Fmoc生成原硫代酸酯片断来生成多肽连接产物A-cys-B-cys-C-cys-D，通过半胱氨酸连接部位的天然酰胺键连接。
本发明具体实施方案的描述
本发明涉及含有原硫代酸酯或硫醇羧基酯的对亲核试剂稳定的硫酯生成化合物，及其生产方法和用途。此类化合物和方法在有机合成中有广泛应用，包括肽-、多肽-和其它聚合物-硫酯的生成。本发明特别适用于由在使用强亲核试剂的条件下制备的前体来生成活性硫酯，前体如用Fmoc SPPS制备的肽或多肽，以及通过多步连接或结合方法制备的肽或多肽，这需要相容的选择性保护方法来进行相关的特异性连接或结合反应。
本发明中对亲核试剂稳定的原硫代酸酯具有分子式X-C(OR’)2-S-R，其中X是相关的靶分子，任选地包含一个或多个可被亲核试剂切除的保护基，R’是对亲核试剂稳定的保护基，在非亲核性切除条件下可除去，R是与原硫代酸酯-C(OR’)2-S-相容的任何基团。还提供了对亲核试剂稳定的原硫代酸酯硫酯生成树脂，具有分子式X-C(OR’)2-S-R-连接子-树脂或X-C((OR1’-连接子-树脂)(OR2’))-S-R，其中X、R’和R如上所述，并且其中连接子和树脂是任意对亲核试剂稳定的连接子和适用于固相有机合成的树脂，包括随后可转化为亲核试剂不稳定的连接子以进行切除的保险栓连接子。
靶分子X的实例包括，但并不局限于，任何含有一个或几个反应官能团的部分，如受亲核试剂不稳定的保护基保护的胺(即在亲核条件下可切除的保护基)，如受亲核试剂不稳定的Fmoc基团保护的氨基酸的Nα氨基。因而，X可包括含有反应官能团的化合物，该化合物自发或人为地包含氨基酸或氨基酸衍生物、肽、多肽、核酸、脂、碳水化合物、水溶性聚合物如聚氧化烯、聚酰胺、及其共聚物等，假如在其上至少一个反应官能团含有亲核试剂不稳定的保护基。已知许多这样的保护基适用于此目的(见，例如，
“Protecting Groups in Organic Synthesis”，3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，编辑.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochemCatalog 2000；“Synthetic Peptides，A Uset’s Guide，”G.A.Grant，编辑.，W.H.Freeman & Company，New York.NY，1992；“Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，”W.D..Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，编辑.，Advanced Chemtech，1998；“Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.，”M.Bodanszky，编辑.，Springer-Verlag，1993；“The Practice of Peptide Synthesis，2nded.，”M.Bodanszky和A.Bodanszky，编辑.，Springer-Verlag，1994；和“Protecting Groups，”P.J.Kocienski，编辑.，Georg Thierne Verlag，Stuttgart，Germany，1994).
R的实例包括，但并不局限于，芳基、苯甲基和烷基。优选的实施方案包括3-羧基-4-硝基苯基硫酯、苯甲基硫酯、巯基乙酸硫酯和巯基丙酸亮氨酸酯(见，例如，
Dawson等.，Science(1994)266：776-779；Canne等Tetrahedron Lett.(1995)36：1217-1220；Kent，等.，WO 96/34878；Kent，等.，WO 98/28434；Ingenito等.，JACS(1999)121(49)：11369-11374；和Hackeng等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)96：10068-10073).
R’的实例包括，但并不局限于，对亲核试剂稳定的(即，对亲核试剂稳定的保护基)但是在酸性条件下不稳定(即，对非亲核试剂不稳定的保护基)的保护基，如有催化剂的产氢物质(“H2/Cat.”或其它还原剂)，或强酸如三氟乙酸(“TFA”)或氢氟酸(“HF”)。这包括任意可与Fmoc SPPS相容的保护基，假如保护基R’是对亲核试剂稳定的和对非亲核试剂不稳定的。已知许多这样的保护基适用于此目的(见，例如，
“Protecting Groups in OrganicSynthesis”，3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，编辑.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；”Synthetic Peptides，A User’s Guide，”G.A.Grant，编辑.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“AdvancedChemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，”W.D..Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，编辑.，Advanced Chemtech，1998；“Principles of Peptide Synthesis，2nded.，”M.Bodanszky，编辑.，Springer-Verlag，1993；“The Practice of PeptideSynthesis，2nd ed.，”M.Bodanszky和A.Bodanszky，编辑.，Springer-Verlag，1994；and“Protecting Groups，”P.J.Kocienski，编辑.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994).
R’基团可为与原硫代酸酯-C[(OR1’)(OR2’)]中的独立氧基团连接的独立保护基，当特别提到时称之为“非环状原硫代酸酯保护基”。以外，R’基团可形成连接并保护两个氧基团-C(O-R’-O)的双氧环状结构，当特别提到时称之为“环状原硫代酸酯保护基”。这些化合物显示如下，其中左边的化合物含有环状原硫代酸酯，右边的化合物含有非环状原硫代酸酯。
环状原硫代酸酯 非环状原硫代酸酯
在环状原硫代酸酯中：(n)＝1-7个碳；R3可存在或不存在且可单独存在，或作为双氧环主链上的两个或更多相同或混合的取代基，且它是调节R’对非亲核试剂不稳定性的部分。R3优选地包含吸电子或给电子基团，以增加对除去非亲核保护基R’的稳定性。环状原硫代酸酯中(n)＝1到5，更优选(n)＝1到3，最优选(n)＝1-2，且R3优选为烷基、苯甲基或芳基。R3烷基、苯甲基或芳基可以是或包含线性、支链、取代或非取代的环状芳香性或非芳香性、杂芳环或非杂芳环结构，根据所给环状原硫代酸酯的预计最终用途来选择它们。通常，R3烷基、苯甲基和芳基是用于SPPS的基团，并与酸性或还原性切除相容。合适的吸电子基团包括但不局限于不同氧化状态的杂原子(不包括O-)、羰基、腈、硫氧基、砜、硫酸根和卤素基团。合适的给电子基团包括但不局限于脂肪族烷基、支链脂肪族烷基、苯甲基、取代苯甲基。优选的吸电子基团包括酮、酯、酰胺、I、Br、Cl、F、腈、硫氧基、砜和被一个或多个吸电子基团取代的苯甲基。优选的给电子基团包括-CH3、-CH2-CH3、-CH2(CH3)2、-CH2-CH2(CH3)2和被一个或几个给电子基团取代的苯甲基。在优选的实施方案中，R3包含对亲核切除条件稳定的吸电子基团(即对亲核试剂稳定)。在此适用如上所述的各种给电子和吸电子基团，公开在“Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanism，and Structure，”第四版，J.March编辑，JohnWiley & Sons，New York，NY，1992。将意识到R3可包括间隔基团，典型的是-CH2-基团，它可被选择以调节R’保护基对非亲核切除的稳定性或使特殊靶分子的合成容易或提高，且可以还原或非还原形式提供。
至于非环状原硫代酸酯，其中R’是独立的氧保护基R1’和R2’，R1’和R2’基团可相同或不同，且从烷基、苯甲基或芳基中选出。优选的R1’和R2’烷基、苯甲基或芳基包含吸电子或给电子基团，且优选它们相同。R1’和R2’基团可含有线性、支链、取代或非取代环状芳香性或非芳香性、杂芳环或非杂芳环结构，根据所给非环状原硫代酸酯的预计最终用途来选择它们。通常，R1’和R2’基团是用于SPPS的基团，并与酸性或还原性切除相容。在优选的实施方案中，R1’和R2’包含对亲核切除条件稳定的吸电子基团(即对亲核试剂稳定)。合适的吸电子基团包括但不局限于不同氧化状态的杂原子(不包括O-)、羰基、腈、硫氧基、砜、硫酸根和卤素基团。合适的给电子基团包括但不局限于脂肪族烷基、支链脂肪族烷基、苯甲基、取代苯甲基。优选的吸电子基团包括酮、酯、酰胺、I、Br、Cl、F、腈、硫氧基、砜和被一个或多个吸电子基团取代的苯甲基。优选的给电子基团包括-CH3、-CH2-CH3、-CH2(CH3)2、-CH2-CH2(CH3)2和被一个或几个给电子基团取代的苯甲基。在此适用如上所述的各种给电子和吸电子基团，公开在“Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanism，andStructure，”第四版，J.March编辑，John Wiley & Sons，New York，NY，1992。将意识到R3可包括间隔基团，典型的是-CH2-基团，它可被选择以调节R’保护基对非亲核切除的稳定性或使特殊靶分子的合成容易或提高，且可以还原或非还原形式提供。
本发明中对亲核试剂稳定的原硫代酸酯可在溶液中，通过聚合物载体合成法，或如在此描述的和依照已知工艺中的标准有机化学技术的组合来合成。见，例如，
“Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms，and Structure，”4th Edition，J.March(编辑)，John Wiley & Sons，NewYork，NY，1992；“Comprehensive Organic Transformations，A Guide to FunctionalGroup Preparations，”R.Larock(编辑)，VCH Publishers，New York，NY，1989；“Protecting Groups in Organic Synthesis”，3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，编辑.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；Feugeas等.，C.R.Acad.Sci.，Paris，Ser.C(1968)266(20)：1506-1507；和Honma和.，Chem.Pharm.Bull.(1976)24(4)：818-820).本发明中溶液和固相方法合成原硫代酸酯硫酯生成树脂在下面方案I-III中有Fmoc-氨基酸范例。在方案I-III中，Rs是相关的氨基酸侧链，它可以是遗传编码或非编码氨基酸侧链或它们的衍生物且可以是保护的或非保护的，Z是可有可无的保护基团可以是取决于所给合成方案的各种基团，如Fmoc、苄氧基羰基(Z-或Cbz-)或叔丁氧基羰基(“Boc”)。用于合成的试剂可以从许多商品来源获得，或重新合成。还有，将了解到起始成分和各种中间体，如具有第一氨基酸的原硫代酸酯硫酯生成化合物或用于相关的有机合成方案中下一步加工的其它化合物X可储存起来供以后使用，或者可成套供给等。
通常，原硫代酸酯通过将前体原酯在硫醇交换反应中转化为原硫代酸酯来制备。更特别地，按照标准方法原酯X-C(OR’)3作为含有所需相关的对亲核试剂稳定的保护基的前体来制备(见，例如，
“Protecting Groups in Organic Synthesis”，3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，编辑.，John Wiley & Sons，Inc.，pp.437 ff，1999；McElvin等.，J.Amer.Chem.Soc.(1942)64：1825；R.H.Dewolf，Synthesis(1974)153；Feugeas等.，C.R.Acad.Sci.，Paris，Ser.C(1968)266(20)：1506-1507；和Honma等.，Chem.Pharm.Bull.(1976)24(4)：818-820).在优选的实施方案中，原酯前体通过最终的路易斯酸催化原酯转化反应由腈构建，这展示在下面方案I中。在此方案中，靶分子X的腈形式与强酸如HCl或HBr及过量的引发醇如甲醇或乙醇或保护基R’的醇形式即R’OH混合。然后伯醇修饰的腈在合适的路易斯酸，如AlCl3，BF3·Et2O或SnCl4存在下，通过与相关保护基的醇形式R’OH反应转化为所需原酯前体X-C(OR’)3。另一选择，腈和一种醇R’OH可转化为亚氨酯，接着在路易斯酸催化剂存在下加入另一种醇R’OH转化为所需前体原酯X-C(OR’)3；在大多数情况下第一和第二种醇R’OH是相同的，但如果需要混合的原酯，也可以是不同的；例如，如果需要混合结构，第一醇可以是引发醇。为生成环状原硫代酸酯前体，相关保护基的二醇形式，即OH-R’-OH与伯醇修饰的原酯或衍生自亚氨酯的原酯混合，并用路易斯酸作为催化剂。为生成非环状模式则使用单醇。原酯前体也可以从酸制备，但此路线不优选。在某些情况下非路易斯酸1，1，1-三卤化物可作为催化剂，但也是不优选的。
方案1
一旦生成原酯前体X-C(OR’)3，它可储存备用或立即在路易斯酸，如AlCl3存在下按标准方法通过与相关的烷基、苯甲基或芳基硫醇的交换反应转化为所需原硫代酸酯X-C(OR’)2-S-(Feugeas等，C.R.Acad.Sci.，Paris，Ser.C(1968)266(20)：1506-1507；及Honma等，Chem.Pharm.Bul1.(1976)24(4)：818-820)。在下面的方案II和III中展示了Fmoc-氨基酸原硫代酸酯。
图解II
图解III
如图1和2所示，在靶分子X的Fmoc-相容合成中原硫代酸酯可结合在树脂上。连接子和树脂系统根据所给最终需要选择；熟知许多这样的系统并适用于此目的(见，例如，
The Combinatorial Index，B.A.Bunin，Acedemic Press，1998；NovaBiochem Catalog 2000；“Synthetic Peptides，A User’s Guide，”G.A.Grant，编辑.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid PhaseOrganic Chemistry，”W.D..Bennet，J.W.Christensen.L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，编辑.，Advanced Chemtech，1998；“Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.，”M.Bodanszky，编辑.，Springer-Verlag，1993；和“The Practice of Peptide Synthesis，2nd ed.，”M.Bodanszky和A.Bodanszky，编辑.，Springer-Verlag，1994).
结合连接子和树脂系统选择保护基R’提供了额外的灵活性。例如，根据保护基R’，和将原硫代酸酯连接于树脂的连接子，可开发许多相容的选择性或非选择性树脂上合成、切除和硫酯活化方案。相容的选择性保护方案涉及被不同化学机理除去的两种或多种基团，因而可以任何顺序并在任何其它基团存在时除去。相容的选择性保护方案提供了实质上更温和的全部反应条件，因为选择性可在不同化学反应而不是反应速率的基础上获得。例如，当使用Fmoc化学反应进行肽合成时，即，其中X是Fmoc保护的氨基酸或肽，虽然在每轮氨基酸添加中都使用了哌啶，原硫代酸酯还是稳定的。一旦完成最后相关的偶联循环，Fmoc基可通过使用哌啶混合试剂除去，通常之后用强酸如TFA处理肽树脂以除去所存在的任何其它对TFA不稳定的侧链保护基。当在原硫代酸酯中使用对TFA不稳定的邻氧保护基R’时，TFA处理生成了亲核不稳定的肽-硫酯。因而，当使用含有对TFA不稳定的连接子，如Rink连接子的合成树脂时，生成肽-硫酯并同时从树脂上切除，活性肽-硫酯释放到溶液中。此切除产物此时适用于接下来相关的硫酯介导反应。另一选择，当使用对HF不稳定的邻氧保护基系统，且使用含有对TFA不稳定的连接子的合成树脂时，TFA处理在溶液中生成了对亲核试剂稳定的肽原硫代酸酯。这尤其适用于生产带有N-端反应基如半胱氨酸的肽，同时结合C-端对亲核试剂稳定的原硫代酸酯(见，例如，图3)。如果使用对酸稳定的连接子，那么硫酯肽仍与树脂键合；这可以是使用酶或保险栓切除性连接子的情况。相容的选择性保护也可用于加工过的靶分子X，它可用于某些构造的合成也可用于在会聚结合或连接方案中使用的中间体的制备(见，例如，图3和4)。非选择性方法对某些靶有利并可减少一些化学步骤，此方法中原硫代酸酯或硫醇羧基酯、连接子和加工后的靶分子X上对非亲核性试剂不稳定的保护基在同样的条件组合下不稳定并被同时切除。显而易见，用于肽的与上述同样的基本设计方法可用于其它相关的靶分子，如其它聚合物和小分子，且可用于在树脂上或溶液中生成部分保护或全部无保护的靶分子X。
本发明中对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯具有分子式X-C(O)-O-CH(R”)-(CH2)n-S-R，其中X是相关的靶分子，含有一个或几个亲核试剂不稳定的保护基，R”是对非亲核试剂稳定的基团，n是1或2，优选n＝1，R是氢、保护基或连接于树脂上对酸或还原剂不稳定的连接子或保险栓连接子或在非亲核性条件下可除去的保护基。还提供了对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯硫酯生成树脂，它具有分子式X-C(O)-O-CH-(R”)-CH2n-S-连接子-树脂或X-C(O)-O-CH(R”-连接子-树脂)-CH2n-S-R，其中X、R”、n和R如上所述，且连接子和树脂是任何对亲核试剂稳定的连接子和适用于固相有机合成的树脂。
靶分子X的实例包括，但并不局限于，任何含有一个或几个反应官能团的部分，如受亲核试剂不稳定的保护基保护的胺(即在亲核条件下可切除的保护基)，如受亲核试剂不稳定的Fmoc基团保护的氨基酸的Nα氨基。因而，X可包括含有反应官能团的化合物，该化合物自发或人为地包含氨基酸或氨基酸衍生物、肽、多肽、核酸、脂、碳水化合物、水溶性聚合物如聚氧化烯、聚酰胺、及其共聚物等，假如在其上至少一个反应官能团含有亲核试剂不稳定的保护基。已知许多这样的保护基适用于此目的(见，例如，
“Protecting Groups in Organic Synthesis”.3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，编辑.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochemCatalog 2000；“Synthetic Peptides，A User’s Guide，”G.A.Grant，编辑.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，”W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；“Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.，”M.Bodanszky，编辑.，Springer-Verlag，1993；“The Practice of Peptide Synthesis，2nded.，”M.Bodanszky和A.Bodanszky，编辑.，Springer-Verlag，1994；和“Protecting Groups，”P.J.Kocienski，编辑.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994).
R”基团可以是各种具有如下性质的不同吸电子基团或给电子基团中的一个：i)使酯对酸性或还原切除条件稳定(即，对非亲核试剂稳定)；及ii)允许催化剂硫醇存在下进行硫酯化交换反应。合适的R”基团任选自脂肪烃基、支链脂肪烃基、杂原子、羰基、苯甲基、腈、硫氧基、砜、硫酸根和卤素基团。优选的实施方案包括-CH3、-CH2-CH3、-CH2(CH3)2、-CH2-CH2(CH3)2、甲氧基、酮、酯、酰胺、Br、Cl、F、腈、硫氧基、砜和被一个或几个吸电子基团或给电子基团取代的苯甲基。硫醇催化剂可以是非结合硫醇或结合硫醇。优选的催化剂硫醇包括苯甲基硫醇、苯硫酚、1-硫代-2-硝基苯酚，2-硫代-苯甲酸，2-硫代-吡啶、4-硫代-2-吡啶羧酸，和4-硫代-2-硝基苯酚，苯硫酚是最优选的。
许多方法可用于制造本发明的对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯，例如在此描述的方案VII-IX中，并依照本领域已知的标准有机化学技术。见例如，
“Advanced OrganicChemistry，Reactions，Mechanisms，and Structure，”4th Edition，J.March(编辑)，John Wiley & Sons，New York，NY.1992；“Comprehensive OrganicTransformations，A Guide to Functional Group Preparations，”R.Larock(Ed.)，VCH Publishers，New York，NY，1989；和“Protecting Groups in OrganicSynthesis”，3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，编辑.，John Wiley & Sons，Inc.，1999).优选的方法使用具有分子式PG-S-CH2n-CH(R”)OH的硫醇前体或具有分子式PG-S-CH2n-CO(R”)的硫酮，其中PG是对亲核试剂稳定的保护基。使用硫醇和碱-催化羧基酯化(例如，碱催化剂如二甲基氨基吡啶“DMAP”)的固相合成在下面方案IV-VI中有举例，展示了Fmoc-氨基酸硫醇羧基酯的生成。在方案IV中，显示了通过硫醇与连接子的偶联，其中R是游离的。方案V展示了通过R”的偶联。相同的基本合成方案可用于非氨基酸。还有，对于硫酮前体，酮转化为硫醇形式然后羧基酯化。所用连接子优选对酸不稳定的，如可被TFA切除的连接子-树脂系统，如Wang树脂。
图解IV
图解V
图解VI
本发明中对亲核试剂稳定的硫酯生成原硫代酸酯和硫醇羧基酯在用于结合和连接反应的硫酯合成中得到了特别应用。例如，它们可用于肽和多肽的硫酯介导的化学选择性连接，如天然化学连接(Dawson等，Science(1994)266：776-779；Kent等，WO 96/34878；Kent等，WO 98/28434)。含有C-端或侧链硫酯的肽可在连接反应中用本发明的原硫代酸酯和硫醇羧基酯组合物通过Fmoc合成制备。含有N-端Cys残基的肽或多肽可用Fmoc或Boc化学合成，或通过生物学方法如重组DNA表达，或它们的组合，这取决于预期的最终用途。
因而本发明的方法和组合物的优点是，除了对亲核试剂不敏感(如Boc保护)的策略以外，允许使用对亲核试剂敏感(例如，Fmoc等)的保护策略。这些化学方法允许对酸不稳定的基团如甾类、荧光素和叶酸与合成蛋白质或多肽连接。此外，本发明允许在化学连接反应中使用传统Fmoc试剂以及改性Fmoc试剂。特别地，本发明允许形成任意期望的合成肽或多肽的Fmoc MAP(多抗原性肽)衍生物。Fmoc MAP试剂典型地具有多个(例如，4或8)从赖氨酸核心基质伸出的肽臂。它们的作用被认为是提高肽的抗原性。用于实验性疫苗设计的MAP-肽已诱发高滴度的识别天然蛋白的抗肽抗体
Tam，J.P.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，5409-5413；Posnett，D.N.等(1988)J.Biol.Chem.263，1719-1725；Auriault，C.等(1991)Peptide Res.4，6-11.据报道，与其它疫苗相比，抗V3环的AIDs疫苗刺激更高水平的抗体，并诱导更持久的免疫应答responses(Wang，C.Y.等(1991)Science，254，285-288).此外，固相免疫测定中抗体-抗原的相互作用的可靠性和灵敏度增加已经由MAP-肽观察到，这是因为盖覆容量和亲和力强度的增强(Tam，J.P及Zavala，F.(1989)J Immunol.Meth.124，53-61)。MAP法免去了将肽与可改变抗原决定簇的载体蛋白质连接的需要。
本发明的方法有利于反应基团的相容性选择性保护，因而允许进行构建多个(肽)片断连接的会聚合成方案，从而提高产物的理论最大产率。
本发明可以使相容选择性保护的能力增强，因而允许在单个容器中进行多重反应，或使用比其它方式需要的容器少一些的反应容器。
此外，采用Fmoc化学方法合成肽和多肽的能力有利于用肽反转技术来反转合成肽，因而允许在肽C-端引入修饰(见，例如，M.Davies等(1998)J.Org.Chem.8696-8703；M.Davies等，(1997)Angew.Chem.109：1135-1138)：
本专利说明书中所有提及的出版物和专利申请都在此引作参考，就好像每个单独的出版物或专利申请是特别地且独立地指出引作参考。
既然已经一般地描述了本发明，同样的内容将通过参考下面的实施例而更易于理解，实施例通过例证的方式提供，并不意味着限制本发明，除非特别说明。
实施例
给出下面的制备方法和实施例以使本领域技术人员更清楚地理解并实施本发明。它们不应看作限制了本发明的范围，而应仅仅看作本发明的例证和代表。实施例1：氯-Wang树脂(p-苄氧基苄基氯树脂)的制备
氯-Wang树脂(p-苄氧基苄基氯树脂)通过将N-氯琥珀酰亚胺(5mmol，667mg)溶解在10mL THF中来制备。三苯基膦(5mmol，1.31g)溶解在10mL THF中并加入N-氯琥珀酰亚胺溶液。沉淀出白色固体，向其中加入10mL THF。5分钟后在混合物中加入1g Wang树脂(0.7mmol/g)，让反应过夜进行。然后用DMF和DCM洗涤氯-Wang树脂几次，并真空干燥。实施例2：p-苄氧基苯甲基硫代乙醇树脂的制备
用于偶联Fmoc-保护氨基酸的p-苄氧基苯甲基硫代乙醇树脂用如下方法制备。将1.5mL 2-巯基乙醇、3mL DIEA和8mL DMF的混合物加入实施例1中制备的350mg氯-Wang树脂中。使用2.5mL流动洗涤且让反应过夜进行。然后用DMF和DCM洗涤树脂几次，并真空干燥。实施例3：p-苄氧基苄硫基-2-丙醇树脂的制备
用于偶联Fmoc-保护氨基酸的p-苄氧基苄硫基-2-丙醇树脂用如下方法制备。将1.5mL 1-巯基-2-丙醇、3mL DIEA和8mL DMF的混合物加入实施例1中制备的350mg氯-Wang树脂中。使用2.5mL流动洗涤且反应过夜进行。然后用DMF和DCM洗涤树脂几次，并真空干燥。实施例4：Fmoc-氨基乙酸与p-苄氧基苄硫基-2-丙醇树脂的偶联
p-苄氧基苄硫基-2-丙基-Fmoc氨基乙酸酯树脂用如下方法制备。将83 mg(2.8mmol)Fmoc-氨基乙酸、0.22mL(1.4mmol)DIC、17.2mg(0.14mmol)DMAP和溶于3mLDMF中的22mg(0.16mmol)HOBT的混合物预活化30分钟，然后加入p-苄氧基苄硫基-2-丙醇树脂。让反应过夜进行。实施例5：p-苄氧基苄硫基-2-丙基-Fmoc氨基乙酸酯树脂上的肽的Fmoc SPPS
按标准Fmoc SPPS程序于p-苄氧基苄硫基-2-丙基-Fmoc氨基乙酸酯树脂上合成FKLAG序列的肽。特别的，Fmoc去保护使用溶于DMF的20％哌啶来完成(每添加一轮氨基酸2次，每次3分钟)。链组装使用标准HBTU/DIEA活化来完成。通过此方法构建p-苄氧基苄硫基-2-丙基-肽酯树脂。实施例6：p-苄氧基苄硫基-2-丙基-肽酯树脂的酸性切除
肽-硫醇羧基酯通过实施例5树脂连接的肽的酸性切除来生成。实施例5中的p-苄氧基苄硫基-2-丙基-肽酯树脂(350mg)用5mL TFA、0.2mL水和0.25mL硫代苯甲醚处理2小时。含有FKLAG-硫醇羧基酯、1-巯基，2-丙基肽酯的切除产物，用高效液相色谱纯化并用质谱分析。纯化后的切除产物显示了609.7道尔顿的预期质量。实施例7：1-巯基，2-丙基肽羧基酯与N-端半胱氨酸肽的硫酯介导的连接
肽-硫醇羧基酯在硫醇催化剂存在下转化为活性硫酯肽的能力通过测试肽与含N-端半胱氨酸的肽的连接能力来检测。大约0.3mg实施例6的1-巯基，2-丙基肽酯(异丙基硫醇FKLAG-羧基酯)和0.6mgN-端半胱氨酸肽(CARHTVHQRHLFG)，MW 1562，与0.25mL 6mol胍盐缓冲液pH7和0.02mL苯硫酚在室温混合。再加入0.02mL苯硫酚并让反应继续进行。4天后HPLC显示的主峰通过质谱分析，相对于预期连接产物(预期值是2079Da)，质谱分析得到2078Da的质量。实施例8：Fmoc-氨基乙酸原三甲基酯的制备
氨基乙腈HCL盐(1mmol(92.53mg))溶于2mL DMF和2mmol 0.35mL的DIEA中。然后加入Fmoc-琥珀酰亚胺碳酸氢盐1.1mmol(350mg)并让反应过夜进行。加入水和稀盐酸使pH值达2。产物用乙酸乙酯抽提三次并在Na2SO4上干燥以生成Fmoc-NH-CH2-CN。1mmol Fmoc-NH-CH2-CN(278mg)溶于2mL无水甲醇中并通HCL气体。反应在0℃保持40小时(Voss和Gerlach Helv.Chim.Acta(1983)66：2294)以生成想要的Fmoc-氨基乙酸原三甲基酯(Fmoc-NH-CH2-C(OCH3)3)。实施例9：Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯树脂的树脂上制备
Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯硫酯生成树脂的树脂上制备如下述进行。3，3’-二硫代二丙酸二(N-羟基琥珀酰亚胺基酯)(10mmol(4.04g))与NH2-{Rink连接子}-树脂(1mmol)在5mL DMF中偶联。偶联用水合茚三酮试验来监控。树脂用DMF洗涤，且在树脂中加入溶于DMF的10％哌啶和10％β-巯基乙醇混合物，并用1mL流动洗涤和5mL批处理30分钟。树脂用DMF洗涤并在1mmol AlCl3(133mg)存在下与溶于12mL DCM的实施例8中的10mmol Fmoc-NH-CH2-C(OCH3)3(3.56g)反应以完成硫醇交换(Feugeas等，Lab.Syn.Org.B.，Fac.Sci.Marseilles，Fr.C.R.Adca.Sci.，Paris Ser.C.(1968)266(20)：1506-1507)而获得Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯-树脂。实施例10：Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯酸的溶液相制备
Bzl-保护的Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯在溶液中如下述制备。在AlCl3 1mmol(133mg)存在下Fmoc-NH-CH2-C(OCH3)3(1mmol(356mg))与HS-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl酯1mmol 196mg在2mL DCM中反应以完成硫醇交换(Feugeas等，Lab.Syn.Org.B.，Fac.Sci.Marseilles，Fr.C.R.Adca.Sci.，Paris Ser.C.(1968)266(20)：1506-1507)，这在溶液中产生了Bzl保护的Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯(Fmoc-NH-CH2-C(OCH3)2-S-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl)。
为除去苯甲基保护基，使用H2/Pt的还原性切除
(“Protecting Groups in Organic Synthesis，”3rd Edition，T.W.Green和P.GM.Wuts，编辑.，John Wiley & Sons，New Tork，NY，1992，pp 250-252；和“Protecting Groups，”P.J.Kocienski，编辑.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994，pg.137).1mmol Bzl保护的Fmoc-NH-CH2-C(OCH3)2-S-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl溶于10mL无水甲醇中并用100mg Pt催化剂和H2在室温下处理3小时以产生产物Fmoc-NH-CH2-C(OCH3)2-S-CH2-CH2-CH2-COOH。Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯酸可用于溶液相偶联，或用标准HBTU/DIEA偶联方案连接于HN2-Rink树脂以获得Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯树脂。实施例11：Fmoc-氨基乙酸环状原乙酸酯的制备
Fmoc-NH-CH2-CN(1mmol(278mg))与HCl气体及1当量的乙醇(46mg)在THF中反应以获得亚氨基酯中间体。亚氨基酯在同样的混合物中与1mmol乙二醇[HO-CH2-CH2-OH](62mg)反应以获得环状原乙酸酯Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OEt。另-选择，实施例8中制备的1mmol Fmoc-NH-CH2-C(OCH3)3(356mg)与1mmol乙二醇[HO-CH2-CH2-OH](62mg)在0.1mmol对甲苯磺酸(19mg)存在时于无水THF中反应以获得环状原乙酸酯Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OCH3。实施例12：Fmoc-氨基乙酸环状原乙基硫代酸酯树脂的树脂上合成
Fmoc-氨基乙酸环状原乙基硫代酸酯树脂的树脂上合成如下述进行。实施例11中制备的10mmol Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OCH3(3.54g)与12mL DCM中的1mmol AlCl3(133mg)混合并与实施例9制备的1mmol硫醇树脂反应以进行硫醇交换(Feugeas等，Lab.Syn.Org.B.，Fac.Sci.Marseilles，Fr.C.R.Adca.Sci.，Paris Ser.C.(1968)266(20)：1506-1507)并生成Fmoc-氨基乙酸环状原乙基硫代酸酯硫酯生成树脂。另一选择，10mmol Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OCH3(3.54g)与12mL二氯乙烷中的1mmol SnCl4(260mg)混合并与实施例9制备的1mmol硫醇树脂反应以完成硫醇交换(Honma等，Chem.Pharm.Bull.(1976)24(4)：818-820)并生成Fmoc-氨基乙酸环状原乙基硫代酸酯硫酯生成树脂。实施例13：Fmoc-氨基乙酸环状原乙基硫代酸酯酸的溶液相制备
Bzl-保护的Fmoc-氨基乙酸环状原乙基硫代酸酯在溶液中如下述制备。Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OCH3(1mmol(354mg))在AlCl3(1mmol，133mg)和2mL DCM存在下与HS-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl酯(1mmol196mg)反应以完成硫醇交换(Feugeas等，Lab.Syn.Org.B.，Fac.Sci.Marseilles，Fr.C.R.Adca.Sci.，Paris Ser.C.(1968)266(20)：1506-1507)，这在溶液中产生了Bzl保护的Fmoc-氨基乙酸环状原乙基硫代酸酯(Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-S-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl)。同样的化合物还通过Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OCH3(1mmol354mg)在SnCl4(0.1mmol 26mg)和2mL二氯乙烷存在下与HS-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl酯(1mmol 196mg)反应以完成硫醇交换(Honma等，Chem.Pharm.Bull.(1976)24(4)：818-820)并生成化合物Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-S-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl。
为除去苯甲基保护基，使用H2/Pt的还原性切除
(“Protecting Groups in Organic Synthesis，”3rd Edition，T.W.Green和P.G.M.Wuts，编辑.，John Wiley & Sons，New Tork，NY，1992，pp 250-252；和“Protecting Groups，”P.J.Kocienski，编辑.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994，pg.137).1mmol Bzl保护的Fmoc-NH-CH2-C(O-(CH2)2-O)-S-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl化合物溶于10mL无水甲醇中并用100mg Pt催化剂和H2在室温下处理3小时以产生产物Fmoc-NH-CH2-C(O-(CH2)2-O)-S-CH2-CH2-CH2-COOH。Fmoc-氨基乙酸环状原乙基硫代酸酯酸可用于溶液相偶联，或用标准HBTU/DIEA偶联方法连接到HN2-Rink树脂以获得Fmoc-氨基乙酸环状原乙基硫代酸酯硫酯生成树脂。实施例14：Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯硫酯生成树脂上肽的FmocSPPS
实施例9中制备的Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯硫酯生成树脂用于按标准Fmoc SPPS程序合成FKLAG序列的肽。Fmoc去保护使用溶于DMF的20％哌啶来完成(每个循环2次，每次3分钟)。链组装使用标准HBTU/DIEA活化来完成，此活化使用2.1mmol Fmoc氨基酸、3.8mL 0.5M HBTU的DMF溶液和1mL DIEA，且每个偶联循环进行1分钟预活化，反应时间为30分钟。肽-树脂在去保护和偶联反应步骤后用DMF洗涤。实施例15：FKLAG肽从原二甲基硫代酸酯硫酯生成树脂上的酸性切除
FKLAG-硫酯肽通过实施例14的树脂连接肽的酸性切除生成。350mg树脂用5mL TFA、0.2mL水和0.25mL硫代苯甲醚处理两小时。真空蒸发TFA并用乙醚沉淀想要的肽-硫酯。含有FKLAG硫酯的切除产物用HPLC纯化并用电喷雾质谱分析，计算所得的质量在实验误差范围内。实施例16：原二甲基硫代酸酯生成的FKLAG硫酯肽与N-端半胱氨酸-肽的硫酯介导连接
实施例15中制备的FKLAG-硫酯肽与含N-端半胱氨酸的肽CARHTVHQRHLFG连接。大约0.3mg FKLAG-硫酯肽和0.6mg N-端半胱氨酸肽CARHTVHQRHLFG，与0.25mL 6M胍盐缓冲液pH7和0.02mL苯硫酚在室温下混合，并让反应过夜进行。反应通过HPLC分析且连接产物通过电喷雾质谱表征，并发现在实验误差范围内具有预期的质量。实施例17：Fmoc-氨基乙酸环状原乙基硫代酸酯硫酯生成树脂上肽的Fmoc SPPS
用实施例12制备的Fmoc-氨基乙酸环状原乙基硫代酸酯硫酯生成树脂按标准Fmoc SPPS过程合成FKLAG序列的肽。Fmoc去保护使用溶于DMF的20％哌啶来完成(每个循环2次，每次3分钟)。链组装使用标准HBTU/DIEA活化来完成，此活化是用2.1mmol Fmoc氨基酸、3.8mL 0.5M HBTU的DMF溶液和1mL DIEA，且每个偶联循环进行1分钟预活化，反应时间为30分钟。肽-树脂的中间体洗涤使用DMF完成。实施例18：FKLAG肽从环状原乙基硫代酸酯硫酯生成树脂上的酸性切除
FKLAG-硫酯肽通过实施例17的树脂连接肽的酸性切除生成。350mg树脂用5mL TFA、0.2mL水和0.25mL硫代苯甲醚室温处理2小时。真空蒸发TFA并用乙醚沉淀想要的肽-硫酯。含有FKLAG硫酯的切除产物用HPLC纯化并用电喷雾质谱分析，发现在实验误差范围内具有预期的质量。实施例19：环状原乙基硫代酸酯生成的FKLAG硫酯肽与N-端半胱氨酸肽的硫酯介导连接
实施例18中制备的FKLAG-硫酯肽与含N-端半胱氨酸的肽CARHTVHQRHLFG如下述连接。大约0.3mg FKLAG-硫酯肽和0.6mg N-端半胱氨酸肽CARHTVHQRHLFG，与0.25mL 6M胍盐缓冲液pH7和0.02mL苯硫酚在室温下混合，并让反应过夜进行。反应通过HPLC分析且连接产物通过电喷雾质谱表征。
本发明已经联系了它的具体实施方案作了描述，可以了解它能进一步修改且此申请意指涵盖通常遵循本发明的法则的任何变化、使用或改进，并包括一些对本公开的偏差，偏差在本发明所属领域的已知或惯例范围内，且偏差可能应用于上文指出的基本特征。
Claims (40)
1.一种对亲核试剂稳定的原硫代酸酯，分子式为X-C(OR’)2-S-R，其中X是相关靶分子，任选地包含一个或多个对亲核试剂不稳定的在亲核切除条件下可除去的保护基，R’是对亲核试剂稳定的保护基，在非亲核切除条件下可除去，且R是与原硫代部分-C(OR’)2-S-相容的任何基团。
2.权利要求1的对亲核试剂稳定的原硫代酸酯，其中X含有受对亲核试剂不稳定的保护基保护的胺。
3.权利要求2的对亲核试剂稳定的原硫代酸酯，其中所述胺存在于选自氨基酸、肽和多肽的部分上。
4.权利要求2的对亲核试剂稳定的原硫代酸酯，其中所述对亲核试剂不稳定的保护基是Fmoc。
5.权利要求1的对亲核试剂稳定的原硫代酸酯，其中R’选自烷基、芳基和苯甲基。
6.权利要求1的对亲核试剂稳定的原硫代酸酯，其中R选自芳基、苯甲基和烷基。
7.权利要求1的对亲核试剂稳定的原硫代酸酯，其中R与对亲核试剂稳定的连接子共价连接。
8.权利要求1的对亲核试剂稳定的原硫代酸酯，其中所述连接子与对亲核试剂稳定的树脂共价连接。
9.一种含有原硫代酸酯的对亲核试剂稳定的硫酯生成树脂。
10.权利要求9的对亲核试剂稳定的硫酯生成树脂，具有分子式X-C(OR’)2-S-R-连接子-树脂，其中X是相关靶分子，包含一个或多个对亲核试剂不稳定的在亲核切除条件下可除去的保护基，R’是对亲核试剂稳定的保护基，在非亲核切除条件下可除去，R是与原硫代部分-C(OR’)2-S-相容的任何基团，且所述连接子和树脂是对亲核试剂稳定的。
11.一种对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯，具有分子式X-C(O)-O-CH(R”)-(CH2)n-S-R，其中X是相关靶分子，包含一个或多个对亲核试剂不稳定的保护基，R”是氢或对非亲核试剂稳定的基团，n是1或2，R是氢、保护基或连接于树脂上的对酸、还原剂或光不稳定的连接子或在非亲核性条件下可除去的保护基。
12.权利要求12的对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯，其中X含有受对亲核试剂不稳定的保护基保护的胺。
13.权利要求13的对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯，其中所述胺存在于选自氨基酸、肽和多肽的部分上。
14.权利要求12的对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯，其中所述可亲核切除的保护基是Fmoc。
15.权利要求11的对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯，其中R”选自：氢、甲基、脂肪烃基、支链脂肪烃基、杂原子、羰基、苯甲基、取代苯甲基、腈、硫氧基和砜。
16.权利要求11的对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯，其中R选自：氢、芳基、苯甲基和烷基。
17.权利要求11的对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯，其中R”或R与对亲核试剂稳定的连接子共价连接。
18.权利要求17的对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯，其中所述连接子与对亲核试剂稳定的树脂共价连接。
19.一种含有硫醇羧基酯的对亲核试剂稳定的硫酯生成树脂。
20.权利要求19的对亲核试剂稳定的硫酯生成树脂，具有分子式X-C(O)-O-CH-(R”)-CH2n-S-连接子-树脂或X-C(O)-O-CH(R”-连接子-树脂)-CH2n-S-R，其中X是相关靶分子，包含一个或多个对亲核试剂不稳定的保护基，R”是氢或对非亲核试剂稳定的基团，n是1或2，R是氢、保护基或连接于树脂上的对酸、还原剂或光不稳定的连接子或在非亲核性条件下可除去的保护基，且所述连接子和树脂对亲核试剂稳定。
21.一种聚合物，含有硫酯反应性亲核基团和选自非环状原硫代酸酯、环状原硫代酸酯、芳基硫醇羧基酯、苯甲基硫醇羧基酯和烷基硫醇羧基酯的对亲核试剂稳定的基团。
22.权利要求21的聚合物，其中所述聚合物选自肽和多肽。
23.权利要求22的聚合物，其中所述硫酯反应性亲核基团位于所述肽或多肽的氨基端。
24.权利要求22的聚合物，其中所述对亲核试剂稳定的基团位于所述肽或多肽的羧基端。
25.一种聚合物，含有受保护的硫酯反应性亲核基团和选自非环状原硫代酸酯、环状原硫代酸酯、芳基硫醇羧基酯、苯甲基硫醇羧基酯和烷基硫醇羧基酯的对亲核试剂稳定的基团。
26.权利要求25的聚合物，其中所述聚合物选自肽和多肽。
27.权利要求26的聚合物，其中所述受保护的硫酯反应性亲核基团位于所述肽或多肽的氨基端。
28.权利要求26的聚合物，其中所述对亲核试剂稳定的基团位于所述肽或多肽的羧基端。
29.一种聚合物的化学连接方法，所述方法包括步骤：
i)在连接条件下将第一和第二聚合物连接以生成连接产物，所述第一聚合物含有硫酯反应性亲核基团和选自非环状原硫代酸酯、环状原硫代酸酯、芳基硫醇羧基酯、苯甲基硫醇羧基酯和烷基硫醇羧基酯的对亲核试剂稳定的基团，所述第二聚合物含有活性硫酯基团。
30.权利要求29的方法，进一步包括步骤：
ii)将所述连接产物的对亲核试剂稳定的基团转化为活性硫酯，并将它与含有硫酯反应性亲核基团的第三聚合物连接。
31.一种合成对亲核试剂稳定的硫酯生成组合物的方法，此组合物含有相关的分子，所述方法包括步骤：
i)将相关的分子与对亲核试剂稳定的硫酯生成组合物共价偶联，所述对亲核试剂稳定的硫酯生成组合物含有对亲核试剂稳定的原硫代酸酯，此原硫代酸酯在非亲核条件下可转化为活性硫酯，所述相关的分子含有受对亲核试剂不稳定的保护基保护的胺基；和
ii)通过在亲核切除条件下的切除，从所述相关的分子中除去所述对亲核试剂不稳定的保护基以产生对亲核试剂稳定的硫酯生成组合物，此组合物含有与所述对亲核试剂稳定的原硫代酸酯共价连接的所述相关的分子。
32.权利要求31的方法，其中进一步包括：
iii)重复步骤i)和ii)一次或多次。
33.权利要求31的方法，其中所述原硫代酸酯通过连接子与树脂共价连接，且其中所述连接子在亲核切除条件下稳定。
33.权利要求31的方法，其中所述原硫代酸酯通过连接子与树脂共价连接，且其中所述连接子在非亲核切除条件下可以切除。
34.权利要求33的方法，它进一步含有将所述连接子在非亲核切除条件下切除。
35.一种合成对亲核试剂稳定的硫酯生成组合物的方法，此组合物含有相关的分子，所述方法包括步骤：
i)将相关的分子与对亲核试剂稳定的硫酯生成组合物共价偶联，所述对亲核试剂稳定的硫酯生成组合物含有对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯，此硫醇羧基酯在非亲核条件下可转化为活性硫酯，所述相关的分子含有受对亲核试剂不稳定的保护基保护的胺基；和
ii)通过在亲核切除条件下的切除，从所述相关的分子中除去所述对亲核试剂不稳定的保护基以产生对亲核试剂稳定的硫酯生成组合物，此组合物含有与所述对亲核试剂稳定的硫醇羧基酯共价连接的所述相关的分子。
37.权利要求36的方法，其中进一步包括：
iii)重复步骤i)和ii)一次或多次。
38.权利要求36的方法，其中所述硫醇羧基酯通过连接子与树脂共价连接，且其中所述连接子在亲核切除条件下稳定。
39.权利要求36的方法，其中所述硫醇羧基酯通过连接子与树脂共价连接，且其中所述连接子在非亲核切除条件下可以切除。
40.权利要求39的方法，它进一步含有将所述连接子在非亲核切除条件下切除。
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