PT1680443E

PT1680443E - Péptidos alfa-helicoidais estabilizados e suas utilizações

Info

Publication number: PT1680443E
Application number: PT48111983T
Authority: PT
Inventors: Loren D Walensky; Stanley J Korsmeyer; Gregory Verdine
Original assignee: Harvard College; Dana Farber Cancer Inst Inc
Priority date: 2003-11-05
Filing date: 2004-11-05
Publication date: 2013-12-11
Also published as: US8198405B2; CA2830063C; CN1906209A; IL175152A0; EP1997828A3; EP1680443A2; EP2332967A1; US20120082636A1; US20170008930A1; EP2332967B1; EP1680443A4; JP2015163608A; ES2586387T3; US9464115B2; US20090176964A1; JP2012116836A; US7723469B2; DK1680443T5; CY1114944T1; ES2437567T3

Description

ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Péptidos alfa-helicoidais estabilizados e suas utilizações"

ANTERIORIDADE A apoptose, ou morte celular programada, desempenha um papel crítico no desenvolvimento e manutenção da homeostasia em todos os organismos pluricelulares. A susceptibilidade para a apoptose varia marcadamente entre as células e é influenciada tanto por eventos celulares externos como internos. Foram definidas proteínas reguladoras positivas e negativas que medeiam o destino das células, e a desregulação destas redes de proteínas de sinalização foi documentada na patogénese de um largo espectro de doenças humanas, incluindo uma variedade de cancros. A BCL-2 é o membro fundador desta família de proteínas apoptóticas e foi pela primeira vez identificada no ponto de quebra cromossómico de linfomas t (14;18) (q32;q21) (Bakhashi et al. 1985 Cell 41:899; Cleary et al. 1985 Proc. Nat '1. Acad. Sei. USA 82:7439). O rearranjo de genes coloca o BCL-2 sob o controlo transcricional do locus da cadeia pesada de imunoglobulinas, gerando níveis inapropriadamente elevados de BCL-2 e resultando na sobrevivência patológica de células. Estas aberrações na apoptose foram identificadas em leucemias linfocíticas e mielógenas e numa pluralidade de outras malignidades, e foram ligadas a progressão tumoral e resistência adquirida a apoptose induzida por quimioterapia. A família de proteínas da BCL-2 expandiu-se significativamente e inclui tanto moléculas pró- como anti-apoptóticas que proporcionam as verificações e os equilíbrios que governam a susceptibilidade à morte celular (FIG. 1). Não surpreendentemente, as proteínas apoptóticas tornaram-se alvos-chave para o desenvolvimento de terapêuticas tanto para prevenir a morte celular precipitada em doenças de perda celular como para activar as vias de morte celular na malignidade. A família BCL-2 é definida pela presença de até quatro domínios de "homologia BCL-2" (BH) conservados designados BH1, 2 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ ΒΗ2, ΒΗ3 e ΒΗ4, todos incluindo segmentos α-helicoidais (Chittenden et ai. 1995 EMBO 14:5589; Wang et al. 1996 Genes Dev. 10:2859). As proteínas anti-apoptóticas, tais como a BCL-2 e a BCL-Xl, apresentam conservação de sequência em todos os dominios BH. As proteínas pró-apoptóticas dividem-se em membros "multidomínios" (e.g. BAK, BAX), que possuem homologia nos domínios BH1, BH2 e BH3, e nos membros "apenas domínio BH3" (em inglês, "BH3-domain only") (e.g. BID, BAD, BIM, BIK, NOXA, PUMA), que contêm homologia de sequência exclusivamente no segmento α-helicoidal anfipático BH3. Os membros da família BCL-2 possuem a capacidade de formar homo- e heterodímeros, sugerindo que a ligação competitiva e a razão entre os níveis de proteínas pró- e anti-apoptóticas ditam a susceptibilidade a estímulos de morte. As proteínas anti-apoptóticas funcionam para proteger as células contra o excesso pró-apoptótico, i.e., morte celular programada excessiva. As medidas de "segurança" adicionais incluem a regulação da transcrição de proteínas pró-apoptóticas e a sua manutenção como confórmeros inactivos, requerendo activação proteolítica, desfosforilação ou alteração conformacional induzida por ligandos para activar funções pró-morte. Em certos tipos de células, os sinais de morte recebidos na membrana plasmática desencadeiam a apoptose por uma via mitocondrial (FIG. 2). As mitocôndrias podem servir como um "porteiro" de morte celular sequestrando o citocromo c, um componente crítico de um complexo citosólico que activa a caspase 9, que conduz a eventos proteolíticos fatais a jusante. As proteínas multidomínios tais como BCL-2/BCL-Xl e BAK/BAX desempenham papéis de contenda de guardiões e executores na membrana mitocondrial, com as suas actividades adicionalmente reguladas por membros apenas BH3 da família BCL-2 a montante. Por exemplo, a BID é um membro do subconjunto "apenas domínio BH3" de proteínas pró-apoptóticas, e transmite sinais de morte recebidos na membrana plasmática a proteínas pró-apoptóticas efectoras na membrana mitocondrial. A BID tem a capacidade única de interagir tanto com proteínas pró- como anti-apoptóticas, e após activação por caspase 8, desencadeia a libertação de citocromo C e a apoptose mitocondrial. Estudos de deleção e mutagénese determinaram que o segmento α-helicoidal anfipático BH3 de membros da família pró-apoptótica funciona como um domínio de morte e representa assim um motivo estrutural crítico para interacção com proteínas apoptóticas multidomínios. Estudos estruturais 3 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ demonstraram que a hélice BH3 interactua com proteínas anti-apoptóticas por inserção num sulco hidrófobo formado pela interface dos domínios BH1, 2 e 3. A BID activada pode ser ligada e sequestrada por proteínas anti-apoptóticas (e.g., BCL-2 e BCL-Xl) e pode desencadear a activação das proteínas pró-apoptóticas BAX e BAK, conduzindo à libertação de citocromo c e a um programa de apoptose mitocondrial. A BAD é também um membro da família pró-apoptótica "apenas domínio BH3" cuja expressão do mesmo modo desencadeia a activação de BAX/BAK. Ao contrário da BID, contudo, a BAD apresenta ligação preferencial a membros anti-apoptóticos, BCL-2 e BCL-Xl. Embora o domínio BH3 da BAD exiba ligação de elevada afinidade a BCL-2, o péptido BH3 da BAD é incapaz de activar a libertação de citocromo c pela mitocôndria in vitro, sugerindo que a BAD não é um activador directo de BAX/BAK. As mitocôndrias que sobre-expressam BCL-2 são resistentes à libertação de citocromo c induzida por BID, mas o co-tratamento com BAD pode restabelecer a sensibilidade à BID. A indução de apoptose mitocondrial pela BAD parece resultar de: (1) deslocamento de activadores de BAX/BAK, tais como BID e proteínas semelhantes a BID, da bolsa de ligação BCL-2/BCL-Xl, ou (2) ocupação selectiva da bolsa de ligação BCL-2/BCL-Xl por BAD para impedir o sequestro de proteínas semelhantes a BID pelas proteínas anti-apoptóticas. Assim, emergiram duas classes de proteínas "apenas domínio BH3", as proteínas semelhantes a BID que activam directamente a apoptose mitocondrial, e proteínas semelhantes a BAD, que têm a capacidade de sensibilizar as mitocôndrias a pró-apoptóticos semelhantes a BID por ocupação das bolsas de ligação de proteínas anti-apoptóticas multidomínios. O objectivo de identificar ou gerar de moléculas pequenas para sondar funções apoptóticas de proteínas in vitro e especificamente manipular as vias apoptóticas in vivo tem sido desafiador. Um rastreio de alto rendimento identificou várias moléculas que inibem a interacção do domínio BH3 de BAK com BCL-Xl com afinidades micromolares. Em adição à potencial desvantagem de identificar compostos de baixa afinidade, a técnica está limitada na sua capacidade para gerar painéis de compostos talhados para as subtis especificidades de ligação de membros individuais de famílias de proteínas. Abordagens 4 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ alternativas à manipulação das vias de apoptose derivaram da manipulação de péptidos, uma técnica que utiliza a sequência de péptidos não específicos para gerar compostos com estruturas tridimensionais desejadas. Uma aplicação desta técnica envolveu a geração de hélices cx "pró-apoptóticas" constituídas por uma sequência peptídica não específica utilizadas para induzir morte celular por ruptura de membranas mitocondriais. A hélice alfa é um dos principais componentes estruturais das proteínas e é frequentemente encontrada na interface de contactos das proteínas, participando numa ampla variedade de eventos de reconhecimento biológicos intermoleculares. Teoricamente, os péptidos helicoidais, tais como a hélice BH3, podem ser utilizados para interferir selectivamente com, ou estabilizar, interacções proteína-proteína, e desse modo manipular processos fisiológicos. Contudo, os motivos helicoidais biologicamente activos no interior de proteínas tipicamente têm pouca estrutura quando retirados do contexto da proteína de comprimento completo e colocados em solução. Assim, a eficácia de fragmentos peptídicos de proteínas como reagentes in vivo tem sido comprometida pela perda da estrutura secundária helicoidal, pela susceptibilidade à degradação proteolítica e pela incapacidade de penetrar células intactas. Embora tenham sido reportadas várias abordagens à estabilização covalente de hélices, a maioria das metodologias envolve reticulações polares e/ou lábeis (Phelan et al. 1997 J. Am. Chem. Soc. 119:455; Leuc et al. 2003 Proc. Nat '1. Acad Sei. USA 100:11273; Bracken et al., 1994 J. Am. Chem. Soc. 116:6432; Yan et al. 2004 Bioorg. Med. Chem. 14:1403). Subsequentemente, Verdine e colaboradores desenvolveram uma abordagem alternativa baseada na metátese, que empregava aminoácidos não naturais a, a-dissubstituídos contendo "grampos" de alquilo (Schafmeister et al., 2000 J. Am. Chem. Soc. 122:5891; Blackwell et al. 1994 Angew Chem. Int. Ed. 37:3281).

SUMÁRIO A presente invenção baseia-se, em parte, na verificação de que a reticulação estável de um polipéptido possuindo pelo menos dois aminoácidos modificados (um processo denominado 5 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ "grampeamento por hidrocarboneto", em inglês ”hydrocarbon stapling") pode ajudar a conferir a conformação da estrutura secundária nativa desse polipéptido. Por exemplo, a reticulação de um polipéptido predisposto a ter uma estrutura secundária em hélice alfa pode constranger o polipéptido na sua conformação alfa-helicoidal nativa. A estrutura secundária constrangida pode aumentar a resistência do polipéptido à clivagem proteolítica e também aumentar a hidrofobicidade. Surpreendentemente, em alguns casos, os polipéptidos podem penetrar na membrana celular (e.g., através de um mecanismo de transporte dependente de energia, e.g., pinocitose). Desse modo, os polipéptidos reticulados aqui descritos podem ter uma actividade biológica melhorada relativamente a um polipéptido não reticulado correspondente. Por exemplo, o polipéptido reticulado pode incluir um domínio alfa-helicoidal de um polipéptido membro da família BCL-2 (e.g., domínio BID-BH3), que pode ligar-se a BAK/BAX e/ou BCL-2/BCL-Xl para promover a apoptose num indivíduo. Em alguns casos, o polipéptido reticulado pode ser utilizado para inibir a apoptose. Os polipéptidos reticulados aqui descritos podem ser utilizados terapeuticamente, e.g., para tratar o cancro num indivíduo. São aqui descritos polipéptidos de fórmula (I),

fórmula (I) em que; cada um de Ri e R2 são independentemente H ou um alquilo, alcenilo, alcinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo ou heterociclilalquilo de Ci a Ci0; R3 é alquilo, alcenilo, alcinilo; [R4-K-R4]n; cada uir substituído com 0-6 R5; R4 é alquilo, alcenilo ou alcinilo; R5 é halogéneo, alquilo, 0R6, N(Rg)2r SR6, SOR6, SO2R6Í CO2R6Í Rg, uma porção fluorescente ou um radioisótopo; q K é O, S, SO, S02 CO, C02 CONRg ou . 6 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ R.6 é Η, alquilo, ou um agente terapêutico; n é um número inteiro de 1-4; x é um número inteiro de 2-10; cada y é independentemente um número inteiro de 0-100; z é um número inteiro de 1-10 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); e cada Xaa é independentemente um aminoácido.

Em alguns casos, o polipéptido liga-se a uma proteína da família BCL-2. O polipéptido pode ligar-se a uma proteína anti-apoptótica. O polipéptido pode ligar-se a uma proteína pró-apoptótica. O polipéptido pode ligar-se e activar BAX ou BAK. Em alguns casos, o polipéptido liga-se a um domínio BH1, BH2 e/ou BH3.

Em alguns casos, o polipéptido activa a morte celular, por exemplo o polipéptido pode desencadear a libertação de citocromo c e activar a morte celular mitocondrial.

Em outros casos, o polipéptido pode inibir a morte celular.

Em alguns casos, o polipéptido inclui um domínio BH3.

Em alguns casos, x é 2, 3 ou Em alguns casos, cada y é inteiro entre 3 e 15. Em alguns casos cada y é inteiro entre 1 e 15. Em alguns casos, Ri e r2 são H ou alquilo Ci~Ce. 6. independentemente um número independentemente um número cada um independentemente,

Em alguns casos, Ri e R2 são, cada um independentemente, alquilo C1-C3.

Em alguns casos, pelo menos um de Rx e R2 é metilo. Por exemplo Rx e R2 são ambos metilo. 7 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Em alguns casos R3 é alquilo (e.g., alquilo Cs ) e x é 3. Em alguns casos, R3 é alquilo Cu e x é 6.

Em alguns casos, R3 é alcenilo (e.g., alcenilo Cs) e x é 3.

Em alguns casos x é 6 e R3 é alcenilo Cu.

Em alguns casos, R3 é uma cadeia linear de alquilo, alcenilo ou alcinilo.

Em alguns casos R3 é -CH2-CH2-CH2-CH=CH-CH2-CH2-CH2-.

Em certos casos os dois estereocentros alfa, alfa-dissubstituidos estão ambos na configuração R ou na configuração S (e.g., reticulação i, i+4), ou um estereocentro é R e o outro é S (e.g., reticulação i, i+7). Assim, quando a fórmula I é representada por

os estereocentros dissubstituidos C' e C" podem ambos estar na configuração R ou podem ambos estar na configuração S, por exemplo quando X é 3. Quando x é 6, o estereocentro dissubstituido C' está na configuração R e o estereocentro dissubstituido C" está na configuração S. A ligação dupla de R3 pode estar na configuração estereoquimica E ou Z.

Em alguns casos R3 é [R4-K-R4]n; e R4 é uma cadeia linear de alquilo, alcenilo ou alcinilo.

Em alguns casos, o polipéptido inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60% (70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98%) idêntica à sequência de aminoácidos de EDIIRNI*RHL*QVGDSNLDRSIW (SEQ ID NO: 112), em que * é um 8 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ aminoácido "grampeado" (em inglês "tethered"). Por exemplo, pode haver 1, 2, 3, 4, 5 ou mais alterações de aminoácidos, e.g., alterações conservativas. O "grampo" (em inglês "tether") pode incluir uma porção alquilo, alcenilo ou alcinilo (e.g., alquilo C5, Cs ou Cu ou um alcenilo C5, Cs ou Cu ou alcinilo C5, Cs ou Cu) . O aminoácido "grampeado" pode ser alfa-dissubstituido (e.g., Ci-C3 ou metilo). Em alguns casos, o polipéptido pode incluir uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60% (70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98%) idêntica à sequência de aminoácidos de EDIIRNIARHLA*VGD*NlDRSIW (SEQ ID NO: 110), em que * é um aminoácido "grampeado". Por exemplo, podem haver 1, 2, 3, 4, 5 ou mais alterações de aminoácidos, e.g., alterações conservativas. Em alguns casos, o polipéptido é transportado através da membrana celular (e.g., através de um transporte activo ou de um mecanismo endocitótico ou por transporte passivo). Em certos casos o polipéptido não inclui uma Cys nem uma Met.

Em alguns casos o polipéptido compreende pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 50, ou mais aminoácidos contíguos de um dominio de BCL-2 ou semelhante a BCL-2, e.g., um dominio BH3 ou um dominio semelhante a BH3, e.g., um polipéptido representado em qualquer das FIG. 5a, 5b e 28a-28h. Cada [Xaa]y é um péptido que pode compreender independentemente pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou mais aminoácidos contíguos de um dominio de BCL-2 ou semelhante a BCL-2, e.g., um dominio BH3 ou um dominio semelhante a BH3, e.g., um polipéptido representado em qualquer das FIG. 5a, 5b e 28a-28h. [Xaa]x é um péptido que pode compreender 3 ou 6 aminoácidos contíguos de um dominio de BCL-2 ou semelhante a BCL-2, e.g., um dominio BH3 ou um dominio semelhante a BH3, e.g., um polipéptido representado em qualquer das FIG. 5a, 5b e 28a-28h. O polipéptido pode compreender 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 aminoácidos contíguos de ácidos de um dominio de BCL-2 ou semelhante a BCL-2, e.g., um dominio BH3 ou um dominio semelhante a BH3, 9 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ e.g., um polipéptido representado em qualquer das FIG. 5a, 5b e 28a-28h (SEQ ID Nos: ) em que dois aminoácidos que estão separados por três aminoácidos (ou seis aminoácidos) estão substituídos por aminoácidos substitutos que estão ligados através de R3. Assim, pelo menos dois aminoácidos podem estar substituídos por aminoácidos "grampeados" ou substitutos de aminoácidos "grampeados". Assim, quando a fórmula I é representada por

z [Xaa]y- e [Xaa]y« podem, cada um, compreender sequências polipeptídicas contíguas dos mesmos, ou diferentes, domínios de BCL-2 ou semelhantes a BCL-2. São aqui descritos polipéptidos reticulados compreendendo 10 (11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais) aminoácidos contíguos de um domínio de BCL-2 ou semelhante a BCL-2, e.g., um domínio BH3 ou um domínio semelhante a BH3, e.g., um polipéptido representado em qualquer das FIG. 5a, 5b (SEQ ID Nos :84-114), e 28a-28h (SEQ ID Nos :1-83) em que os carbonos alfa de dois aminoácidos que estão separados por três aminoácidos (ou seis aminoácidos) estão ligados através de R3, um dos dois carbonos alfa está substituído com Ri e o outro está substituído com R2 e cada um está ligado através de ligações peptídicas a outros aminoácidos.

Em alguns casos o polipéptido possui actividade apoptótica.

Em alguns casos, o polipéptido também inclui uma porção fluorescente ou um radioisótopo.

Em alguns casos, o polipéptido inclui 23 aminoácidos; Ri e R2 são metilo; R3 é alquilo Cs, alquilo Cu, alcenilo Cs, alcenilo Cu, alcinilo Cs ou alcinilo Cu; e x é 2, 3 ou 6. 10 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Em alguns casos, o polipéptido inclui um marcador de afinidade, uma porção de direccionamento e/ou uma porção biotina.

Em alguns casos, o polipéptido é um polipéptido seleccionado do grupo que consiste nos polipéptidos representados nas FIG. 28a-h (SEQ ID NOS: 1-83) e 5a-b (SEQ ID NOS: 84-114). Noutro aspecto, a invenção concretiza-se num método de preparação de um polipéptido de fórmula (III), incluindo proporcionar um polipéptido de fórmula (II); e

fórmula (II) para modo tratar o composto de fórmula (II) com um catalisador promover uma metátese de fecho de anel, desse proporcionando um composto de fórmula (III)

[Xaa]y

Z em que cada um de Ri e R2 são independentemente H, alquilo, alcenilo, alcinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo; heteroarilalquilo; ou heterociclilalquilo; cada n é independentemente um número inteiro de 1-15; x é 2, 3 ou 6 cada y é independentemente um número inteiro de 0-100; z é um número inteiro de 1-10 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); e cada Xaa é independentemente um aminoácido;

Em alguns casos, o polipéptido liga-se a uma proteína membro da família BCL-2. 11 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Em alguns casos, o catalisador é um catalisador de ruténio.

Em alguns casos, o método também inclui proporcionar um agente redutor ou oxidante subsequentemente à metátese de fecho do anel.

Em alguns casos, o agente redutor é H2 ou o agente oxidante é tetróxido de ósmio.

Em alguns casos, a invenção concretiza-se num método de tratamento de um individuo incluindo a administração ao indivíduo de qualquer dos compostos aqui descritos. Em alguns casos, o método também inclui a administração de um agente terapêutico adicional.

Em alguns casos, a invenção concretiza-se num método de tratamento do cancro num indivíduo incluindo a administração ao indivíduo de qualquer dos compostos aqui descritos. Em alguns casos, o método também inclui a administração de um agente terapêutico adicional.

De acordo com a presente invenção é proporcionado um polipéptido contendo uma hélice cx pró-apoptótica para utilização no tratamento do cancro ou de condições neoplásicas, em que o referido polipéptido tem a fórmula (III) :

Fórmula (III) em que; cada um de Ri e R2 são independentemente H, alquilo C1-C20/ alcenilo C2-C20/ alcinilo C2-C20/ arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo ou heterociclilalquilo; cada n é independentemente um número inteiro de 1-15; x é 2, 3 ou 6; cada y é independentemente um número inteiro de 0-100; 12 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ ζ é um número inteiro de 1-10; e cada Xaa é independentemente um alfa-aminoácido e é o mesmo aminoácido que num polipéptido pró-apoptótico contendo uma hélice a. É descrita uma biblioteca dos compostos aqui descritos. É descrito um método de identificação de um composto candidato para a promoção de apoptose, incluindo; proporcionar mitocôndrias; fazer contactar as mitocôndrias com qualquer dos compostos aqui descritos; medir a libertação de citocromo c; e comparar a libertação de citocromo c na presença do composto com a libertação de citocromo c na ausência do composto, em que um aumento na libertação de citocromo c na presença do composto de fórmula 1 identifica o composto como um composto candidato para a promoção de apoptose. É descrito um polipéptido com a fórmula (IV),

em que; cada um de Ri e R2 são independentemente H, alquilo, alcenilo, alcinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo ou heterociclilalquilo; R3 é alquilo, alcenilo, alcinilo; [R4-K-R4]n ou uma cadeia lateral de um aminoácido de ocorrência natural; cada um substituído com 0-6 R5; R4 é alquilo, alcenilo ou alcinilo; R5 é halogéneo, alquilo, OR6, N(R6)2, SR6, SOR6, SO2R6, CO2R6/ R6, uma porção fluorescente ou um radioisótopo; aAa K é O, S, SO, S02, co, C02 CONRg ou 13 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Rg é Η, alquilo, ou um agente terapêutico; R7 é alquilo, alcenilo, alcinilo; [R4-K-R4]n ou uma cadeia lateral de um aminoácido de ocorrência natural; cada um substituído com 0-6 R5; n é um número inteiro de 1-4; x é um número inteiro de 2-10; cada y é independentemente um número inteiro de 0-100; z é um número inteiro de 1-10 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); e cada Xaa é independentemente um aminoácido; É descrito um polipéptido de fórmula (I)

fórmula (I) em que; cada um de Ri e R2 são independentemente H, alquilo, alcenilo, alcinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo ou heterociclilalquilo; R3 é alquilo, alcenilo, alcinilo; [R4-K-R4]n; cada um substituído com 0-6 R5; R4 é alquilo, alcinilo ou alcinilo; R5 é halogéneo, alquilo, ORg, N(R6)2, SRg, SORg, S02R6, C02Rg, Rg, uma porção fluorescente ou um radioisótopo;

K é O, S, SO, S02 CO, C02 CONRg ou R6 é H, alquilo, ou um agente terapêutico; n é um número inteiro de 1-4; x é um número inteiro de 2-10; cada y é independentemente um número inteiro de 0-100; z é um número inteiro de 1-10 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); e cada Xaa é independentemente um aminoácido; 14 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ em que ο polipéptido possui pelo menos 5% de helicidade alfa em solução aquosa como determinado por dicroismo circular.

Em alguns casos, o polipéptido possui pelo menos 15%, pelo menos 35%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90% de helicidade alfa como determinado por dicroismo circular. É descrito um polipéptido de fórmula (I),

Z fórmula (I) em que; cada um de Ri e R2 são independentemente H, alquilo, alcenilo, alcinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo ou heterociclilalquilo; R3 é alquilo, alcenilo, alcinilo; [R4-K-R4]n; cada um substituído com 0-6 R5; R4 é alquilo, alcinilo ou alcinilo; R5 é halo, alquilo, OR6, N(R6)2, SRê, SOR6, S02R6, C02R6, Rô, uma porção fluorescente ou um radioisótopo; K é O, S, SO, S02 CO, C02 CONR6 ou ySy R6 é H, alquilo ou um agente terapêutico; n é um número inteiro de 1-4; x é um número inteiro de 2-10; cada y é independentemente um número inteiro de 0-100; z é um número inteiro de 1-10 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); e cada Xaa é independentemente um aminoácido; em que o polipéptido possui pelo menos um aumento de 1,25 vezes na helicidade alfa como determinado por dicroismo circular comparativamente com o polipéptido da fórmula (IV) 15 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Ri Η Η R2 J χ fórmula (IV) em que Ri, R2, Xaa, x, y e z são todos como definido para a fórmula (I) anterior.

Em alguns casos, o polipéptido possui um aumento de pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,75 vezes, pelo menos 2,0 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 4 vezes na helicidade alfa, como determinado por dicroismo circular, comparativamente com o polipéptido da fórmula (IV). É descrito um método de identificação de um composto candidato para a inibição da apoptose, incluindo; proporcionar mitocôndrias; fazer contactar as mitocôndrias com um composto aqui descrito; medir a libertação de citocromo c; e comparar a libertação de citocromo c na presença do composto aqui descrito com a libertação de citocromo c na ausência do composto aqui descrito, em que uma diminuição na libertação de citocromo c na presença do composto aqui descrito identifica o composto aqui descrito como um composto candidato para a inibição da apoptose.

As combinações de substituintes e variáveis consideradas pela presente invenção são apenas aquelas que resultam na formulação de compostos estáveis. O termo "estável", como aqui se utiliza, refere-se a compostos que possuem estabilidade suficiente para permitir o fabrico e que mantêm a integridade do composto durante um período de tempo suficiente para serem úteis para os fins aqui detalhados (e.g., administração terapêutica a um indivíduo ou geração de reagentes para estudar ou revelar uma via biológica quer in vitro quer in vi vo.

Os compostos aqui descritos podem conter um ou mais centros assimétricos e desse modo ocorrer sob a forma de racematos e misturas racémicas, enantiómeros individuais, 16 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ diastereómeros individuais e misturas diastereoméricas. Todas estas formas isoméricas destes compostos estão explicitamente descritas. Os compostos aqui descritos podem também ser representados em múltiplas formas tautoméricas, casos em que estão explicitamente descritas todas as formas tautoméricas dos compostos aqui descritos (e.g., a alquilação de um sistema de anel pode resultar em alquilação em múltiplos locais, a invenção inclui explicitamente todos estes produtos reaccionais). Todas estas formas isoméricas destes compostos são aqui explicitamente descritas. Todas as formas cristalinas dos compostos aqui descritos são aqui explicitamente incluídas. O termo "aminoácido" refere-se a uma molécula contendo simultaneamente um grupo amino e um grupo carboxilo. Os aminoácidos adequados incluem, sem limitação, ambos os isómeros D e L dos 20 aminoácidos comuns de ocorrência natural encontrados em péptidos (e.g., A, R, N, C, D, !, E, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V (como são conhecidos pela abreviatura de uma letra)) assim como os aminoácidos que ocorrem na natureza e que não ocorrem na natureza preparados por sintese orgânica ou outras vias metabólicas.

Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado relativamente à sequência de tipo selvagem de um polipéptido (e.g., um domínio BH3) sem abolir ou alterar substancialmente a sua actividade. Um resíduo de aminoácido "essencial" é um resíduo que, quando alterado relativamente à sequência de tipo selvagem do polipéptido, resulta na abolição ou abolição substancial da actividade do polipéptido.

Uma "substituição conservativa de aminoácidos" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais similares foram definidas na especialidade. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (e.g., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (e.g., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (e.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (e.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, 17 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (e.g., treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (e.g., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial previsto num polipéptido BH3, por exemplo, é preferivelmente substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeias laterais. O símbolo «I, quando utilizado como parte de uma estrutura molecular, refere-se a uma ligação simples ou uma ligação dupla trans ou eis. A expressão "cadeia lateral de aminoácido" refere-se a uma porção ligada ao carbono α num aminoácido. Por exemplo, a cadeia lateral de aminoácido para a alanina é metilo, a cadeia lateral de aminoácido para a fenilalanina é fenilmetilo, a cadeia lateral de aminoácido para a cisterna é tiometilo, a cadeia lateral de aminoácido para o aspartato é carboximetilo, a cadeia lateral de aminoácido para a tirosina é 4-hidroxifenilmetilo, etc. Outras cadeias laterais de aminoácidos que não são de ocorrência natural estão também incluídas, por exemplo, as que ocorrem na natureza (e.g., um metabolito de um aminoácido) ou as que são preparadas sinteticamente (e.g., um aminoácido alfa-dissubstituído). 0 termo polipéptido abrange dois ou mais aminoácidos de ocorrência natural ou sintéticos ligados através de uma ligação covalente (e.g., uma ligação peptídica). Os polipéptidos, como aqui descrito, incluem proteínas de comprimento completo (e.g., proteínas totalmente processadas) assim como sequências de aminoácidos mais curtas (e.g., fragmentos de proteínas de ocorrência natural ou fragmentos polipeptídicos sintéticos).

O termo "halogéneo" refere-se a qualquer radical de flúor, cloro, bromo ou iodo. 0 termo "alquilo" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto que pode ser uma cadeia linear ou uma cadeia ramificada, contendo o número indicado de átomos de carbono. Por exemplo, Ci-Cio indica que o grupo pode possuir de 1 a 10 átomos de carbono (inclusive). Na ausência de qualquer designação numérica, "alquilo" é uma cadeia (linear ou ramificada) possuindo 1 a 20 átomos de carbono (inclusive). O 18 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ termo "alquileno" refere-se a um alquilo bivalente (i.e., -R-) · O termo "alcenilo" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto que pode ser uma cadeia linear ou uma cadeia ramificada possuindo uma ou mais ligações duplas carbono-carbono. A porção alcenilo contém o número indicado de átomos de carbono. Por exemplo, C2-C10 indica que o grupo pode possuir de 2 a 10 átomos de carbono (inclusive). A expressão "alcenilo inferior" refere-se a uma cadeia alcenilo C2-C8. Na ausência de qualquer designação numérica, "alcenilo" é uma cadeia (linear ou ramificada) possuindo 2 a 20 átomos de carbono (inclusive). O termo "alcinilo" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto que pode ser uma cadeia linear ou uma cadeia ramificada possuindo uma ou mais ligações triplas carbono-carbono. A porção alcinilo contém o número indicado de átomos de carbono. Por exemplo, C2-C10 indica que o grupo pode possuir de 2 a 10 átomos de carbono (inclusive). A designação "alcinilo inferior" refere-se a uma cadeia alcinilo C2-C8. Na ausência de qualquer designação numérica, "alcinilo" é uma cadeia (linear ou ramificada) possuindo 2 a 20 átomos de carbono (inclusive). O termo "arilo" refere-se a um sistema de anel aromático monociclico de 6 carbonos ou biciclico de 10 carbonos em que 0, 1, 2, 3 ou 4 átomos de cada anel podem estar substituídos com um substituinte. Os exemplos de grupos arilo incluem fenilo, naftilo e similares. O termo "arilalquilo" ou o termo "aralquilo" referem-se a um alquilo substituído com um arilo. O termo "arilalcoxi" refere-se a um alcoxi substituído com arilo. O termo "cicloalquilo", como aqui empregue, inclui grupos hidrocarbonetos cíclicos saturados e parcialmente insaturados possuindo 3 a 12 carbonos, preferivelmente 3 a 8 carbonos, e mais preferivelmente 3 a 6 carbonos, em que o grupo cicloalquilo adicionalmente pode estar opcionalmente substituído. Os grupos cicloalquilo preferidos incluem, sem limitação, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 19 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ ciclopentenilo, ciclo-hexilo, ciclo-hexenilo, ciclo-heptilo e ciclo-octilo. O termo "heteroarilo" refere-se a um sistema de anel aromático monociclico de 5-8 membros, biciclico de 8-12 membros, ou triciclico de 11-14 membros, possuindo 1-3 heteroátomos se monociclico, 1-6 heteroátomos se biciclico ou 1-9 heteroátomos se triciclico, sendo os referidos heteroátomos seleccionados entre O, N ou S (e.g., átomos de carbono e 1-3, 1-6 ou 1-9 heteroátomos de N, O ou S se monociclico, biciclico ou triciclico, respectivamente), em que 0, 1, 2, 3 ou 4 átomos de cada anel podem estar substituídos com um substituinte. Os exemplos de grupos heteroarilo incluem piridilo, furilo ou furanilo, imidazolilo, benzimidazolilo, pirimidinilo, tiofenilo ou tienilo, quinolinilo, indolilo, tiazolilo, e similares. O termo "heteroarilalquilo" do termo "heteroaralquilo" refere-se a um alquilo substituído com um heteroarilo. O termo "heteroarilalcoxi" refere-se a um alcoxi substituído com heteroarilo. O termo "heterociclilo" refere-se a um sistema de anel não aromático monociclico de 5-8 membros, biciclico de 8-12 membros ou triciclico de 11-14 membros possuindo 1-3 heteroátomos se monociclico, 1-6 heteroátomos se biciclico, ou 1-9 heteroátomos se triciclico, sendo os referidos heteroátomos seleccionados entre O, N ou S (e.g., átomos de carbono e 1-3, 1-6 ou 1-9 heteroátomos de N, O ou S se monociclico, biciclico ou triciclico, respectivamente), em que 0, 1, 2 ou 3 átomos de cada anel podem estar substituídos com um substituinte. Os exemplos de grupos heterociclilo incluem piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, morfolinilo, tetra-hidrofuranilo, e similares. O termo "substituintes" refere-se a um grupo "substituído" num grupo alquilo, cicloalquilo, arilo, heterociclilo ou heteroarilo em qualquer átomo nesse grupo. Os substituintes adequados incluem, sem limitação, halogéneo, grupos hidroxi, mercapto, oxo, nitro, haloalquilo, alquilo, alquilo, alcarilo, arilo, aralquilo, alcoxi, tioalcoxi, ariloxi, amino, alquiloxicarbonilo, amido, carboxi, alcanossulfonilo, alquilcarbonilo e ciano. 20 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Os detalhes de um ou mais aspectos da presente divulgação estão estabelecidos nos desenhos anexos e na descrição adiante. Outras características, objectos e vantagens da invenção serão evidentes da descrição e desenhos, e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 representa membros da família BCL-2 possuindo um ou mais domínios de homologia BCL-2 (BH) conservados. A FIG. 2 representa um modelo de apoptose mitocondrial mediada por BID. TNF-RI/Fas induz a clivagem de BID, que se transloca para a mitocôndria e desencadeia a apoptose. A FIG 3 representa uma estratégia de síntese para a geração de aminoácidos não naturais a,a-dissubstituídos quirais contendo cadeias laterais olefínicas. A FIG. 4a representa estruturas químicas de certos aminoácidos não naturais. A FIG. 4b representa a reticulação de aminoácidos sintéticos nas posições i e i + 4 e i e i + 7 por metátese olefínica. A FIG. 5a representa compostos SAHB3 gerados por substituição de aminoácidos não naturais e metátese olefínica (SEQ ID NO:84-108, respectivamente). A FIG. 5b representa certos péptidos reticulados utilizados nos estudos aqui descritos (SEQ ID NO:109-114, respectivamente). A FIG. 6 representa os resultados de um estudo que mostra o grau de α-helicidade de domínios BH3 de membros seleccionados da família BCL-2. A FIG. 7 representa os resultados de um estudo que mostra que a reticulação química melhora a helicidade alfa de compostos SAHB3Bid comparativamente com o péptido BID BH3 não modificado. 21 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ A FIG.8 representa os resultados de um estudo que mostra que um mutante gly -► glu do polipéptido SAHB3BidA exibe um contacto helicoidal similar ao correspondente polipéptido contendo gly. A FIG. 9 representa os resultados de um estudo que mostra que a truncagem do 23-mero SABH3BidB ("SAHB3b") num 16-mero resulta em perda de α-helicidade. A FIG. 10a representa os resultados de um estudo que mostra que a cinética da proteólise por tripsina in vitro é retardada 3,5 vezes pela reticulação de SABH3BidA. A FIG. 10b representa os resultados de um estudo de estabilidade sérica ex vivo de péptidos, demonstrando um aumento de 10 vezes na semivida do péptido reticulado comparativamente com o péptido não modificado. A FIG. 10c representa os resultados de um estudo in vivo que mostra que SAHB3BiDA é mantido em concentrações séricas mais elevadas ao longo do tempo comparativamente com o péptido BID BH3. A FIG. 11a representa os resultados de um estudo que mostra que péptidos SAHB3Bid exibem ligação de elevada afinidade a GST-BCL2 num ensaio de ligação competitiva com polarização de fluorescência. A FIG. 11b representa os resultados de um estudo que mostra que os mutantes pontuais Gly para Glu de controlo negativo de SAHB3BiDA e B são ligantes relativamente pobres. A FIG. 11c representa os resultados de um estudo que mostra que a truncagem de SAHB3BidB de um 23-mero para um 16-mero resulta numa queda de mais do que 6 vezes na Ki, coincidente com uma diminuição significativa na percentagem de helicidade do composto truncado. A FIG. lld representa os resultados de um ensaio de ligação directa a BCL-2 por polarização de fluorescência que demonstra um aumento de mais do que 6 vezes na afinidade de 22 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ ligação de SAHB3BiDA comparativamente com BID BH3 não modificado. A FIG. lie representa os resultados de um ensaio de ligação directa a BAX por polarização de fluorescência que demonstra que a incorporação de uma reticulação resulta em ligação mesurável de SAHB3BidA e SAHB3Bid<g->e)A a um membro da família BCL-2 pró-apoptótico multidomínios. O péptido BID BH3 não modificado não apresenta ligação. A FIG. llf representa espectros de HSQC que demonstram uma alteração conformacional de BCL-Xl marcado com 15N após ligação a SAHB3BiDA, que é similar à observada após ligação a BID BH3, confirmando que SAHB3BidA se liga a uma bolsa hidrófoba definida de BCL-Xl.

As FIG. 12a e 12b representam os resultados de estudos que mostram a percentagem de citocromo c libertado por compostos SAHB3Bid a partir de mitocôndrias de figado de ratinho purificadas.

As FIG. 13a e 13b representam os resultados de um estudo que mostra que a libertação de citocromo c induzida por SAHB3BiDA e por SAHB3BiDB é mais rápida e mais potente do que por péptido não modificado. A FIG. 14 representa os resultados de um estudo que mostra que a mutação Gly para Glu de SAHB3BidA elimina selectivamente a libertação de citocromo dependente de Bak sublinhando a especificidade de acção da libertação de citocromo c induzida por SAHB3BidA mostrada na FIG. 13. A FIG. 15 representa os resultados de um estudo que mostra que células Jurkat de leucemia de células T, após exposição a FITC-BID BH3 e FITC-BID hélice 6, não apresentam marcação fluorescente enquanto células Jurkat de leucemia de células T, após exposição a FITC-SAHB3BiD apresentam um sinal de FITC positivo, e que estes resultados não são significativamente alterados por tratamento das células com tripsina. 23 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ A FIG. 16a representa os resultados de um estudo que mostra que células T Jurkat expostas a péptidos FITC-SAHB3BidA e SAHB3Bid(g^e)A reticulados apresentaram marcação fluorescente, enquanto células T Jurkat expostas a péptidos com BH3 não modificado FITC-BID e FITC-BID(G^S) não apresentaram. A FIG. 16b representa os resultados de um estudo que mostra que a importação celular de FITC-SAHB3BidA é dependente do tempo a 37°C, como determinado por análise FACS.

As FIG. 17a e 17b representam os resultados de um estudo que mostra células T Jurkat tratadas com FITC-péptidos a 4°C e 37°C. A FIG. 17a mostra que FITC-BID ΒΗ3 não marcou as células a nenhuma das temperaturas, e que FITC-SAHB3BidA marcou as células a 37°C mas não a 4°C. A FIG. 17b mostra que FITC-BID hélice 6 marca mas também permeabiliza as células de uma maneira independente da temperatura. Contudo, pelo contrário, FITC-SAHB3BidA apenas marca as células a 37°C e fá-lo sem permeabilização celular, consistente com o transporte activo de SAHB3BidA por uma via endocitica. A FIG. 17c representa os resultados de um estudo que mostra que células T Jurkat, quando pré-incubadas com ou sem azida de sódio e 2-desoxiglucose seguida de tratamento com FITC-péptidos, não apresentaram marcação em nenhuma das condições com o polipéptido FITC-BID BH3. As células apresentaram marcação reduzida para FITC-SAHB3BiDA sob condições com azida de sódio e 2-desoxiglucose, e apresentaram marcação com FITC-BID hélice 6 sob ambas as condições. Estes resultados são consistentes com uma captação celular dependente de ATP (e.g., via da endocitose) para importação de SAHB3Bid. A FIG. 18 representa os resultados de um estudo que mostra que a captação de FITC-SAHB3BidA não é inibida por tratamento celular com o glicosaminoglicano heparina, indicando que existem distinções entre o mecanismo de ligação e captação de FITC-SAHB3BiDA comparativamente com outros péptidos que penetram as células (CPP, do inglês "Cell Penetrating Peptide") , tais como TAT de HIV e péptido de Antennapedia. 24 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ A FIG. 19 representa os resultados de um estudo que mostra que compostos FITC-SAHB3BidA exibem marcação citoplasmática com uma distribuição vesicular em células T Jurkat, enquanto não é evidente fluorescência da membrana plasmática. Por outro lado, o FITC-BID BH3 não exibe marcação celular de células e o FITC-BID hélice 6 marca as células difusamente e causa uma significativa destruição arquitectural. A FIG. 20 representa os resultados de um estudo que mostra que FITC-SAHB3BidA se co-localiza com um marcador da membrana mitocondrial em células T Jurkat. A FIG. 21a e a FIG. 21b representam os resultados de um estudo que mostra que FITC-SAHB3BidA se co-localiza em células T Jurkat vivas que sobre-expressam BCL-2 com endossomas marcados com dextrano mas não com endossomas marcados por transferência, indicando que FITC-SAHB3BidA é importado para as células por pinocitose de fase fluida. A FIG. 21c representa os resultados de um estudo que mostra que 24 horas após o tratamento, o FITC-SAHB3BiDA se co-localiza nas células vivas com mitocôndrias marcadas por

MitoTracker.

As FIG. 22a, 22b e 22c representam os resultados de um estudo que mostra que SAHB3BidA desencadeia paragem metabólica de uma maneira responsiva à dose nas linhas celulares de

leucemia testadas, enquanto o BID BH3 e o SAHB3BiD(g-.e)A essencialmente não têm efeito nesta gama de doses.

A FIG. 23 representa os resultados de um estudo que mostra que SABB3BiDA e SAHB3BiDB induziram apoptose em até 50% de células Jurkat intactas a 10 μΜ, um efeito especificamente inibido pela sobre-expressão de BCL-2 (barras a preto). O péptido BID ΒΗ3 não modificado e os mutantes gly para glu não tiveram efeito com base na comparação com o controlo sem tratamento. A FIG. 24 representa os resultados de um estudo que mostra a resposta à dose de células Jurkat que sobre-expressam BCL-2 tratadas com SAHB3BiDA, SAHB3BiD (g^e) e SAHB3BiD <g-s) a· 25 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Enquanto SAHB3BiDA e SAHB3Bid(g-s)A conseguem superar a inibição da apoptose por BCL-2 nesta gama de doses, o mutante pontual gly para glu não teve efeito. A FIG. 25 representa os resultados de um estudo que mostra que as linhas celulares de leucemia REH, MV4;11 e SEMK2 tratadas com SAHB3BidA, sofreram indução de apoptose específica, enquanto o mutante pontual gly para glu, SAHB3Bid(g-e)A, não teve efeito sobre as células.

As FIG. 26a e 26b representam os resultados de um estudo que mostra que tanto SAHB3BidA como SABB3BiD(g-s)A suprimiram o crescimento de leucemia SEMK2 em ratinhos NOD-SCID, SAHB3Bid(g-s)A demonstrando maior potência do que SAHB3BiDA. A FIG. 27a e a FIG. 27b representam os resultados de um estudo que mostra que SAHB3BiDA atenua a progressão de leucemia SEMK2 relativamente ao veículo em ratinhos NOD-SCID. É notado um efeito responsivo à dose na FIG 27a.

As FIG. 27c, 27d, 27e representam os resultados de um estudo com animais que mostra que SAHB3BiDA inibe o crescimento de leucemia RS4;11 relativamente ao veículo em ratinhos SCID bege, com um prolongamento estatisticamente significativo da sobrevivência em ratinhos tratados com SAHB3BiDA comparativamente com controlos de veículo. A FIG. 27f representa os resultados de um estudo com animais mostrando novamente que SAHB3BiDA causa regressão de leucemia RS4;11 em ratinhos SCID bege, em contraste com ratinhos tratados com SAHB3BiD <g^e> A e com veículo que apresentaram progressão da leucemia.

As FIG. 28a-28h representam exemplos de vários domínios alfa-helicoidais de proteínas membros da família BCL-2 (SEQ ID NO:1-83, respectivamente) susceptíveis de reticulação.

DESCRIÇÃO DETALHADA A invenção baseia-se, em parte, na verificação de que polipéptidos de domínio alfa-helicoidal reticulados de proteínas da família BCL-2 possuem propriedades farmacológicas 26 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ melhoradas relativamente às suas contrapartidas não reticuladas (e.g., hidrofobicidade, resistência a clivagem proteolítica, afinidade de ligação, actividade biológica in vitro e in vivo aumentadas). Adicionalmente, verificou-se surpreendentemente que os polipéptidos reticulados podem penetrar a membrana celular através de um mecanismo de transporte dependente da temperatura e de energia (e.g., endocitose, especificamente pinocitose de fase fluida). Os polipéptidos incluem um "grampo" (em inglês "tether") entre dois aminoácidos não naturais, "grampo" esse que melhora significativamente a estrutura secundária alfa-helicoidal do polipéptido. Geralmente, o "grampo" estende-se ao longo do comprimento de uma ou duas alças helicoidais (i.e., cerca de 3,4 ou cerca de 7 aminoácidos). Deste modo, os aminoácidos posicionados em i e i + 3; i e i + 4; ou i e i+7 são candidatos ideais para modificação quimica e reticulação. Assim, por exemplo, quando um péptido possui a sequência . . .Xaai, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaas, Xaag..., reticulações entre Xaai e Xaa4, ou entre Xaa4 e Xaa5, ou entre Xaai e Xaa8 são úteis, assim como reticulações entre Xaa2 e Xaas, ou entre Xaa2 e Xaa6, ou entre Xaa2 e Xaa9, etc. Em adição, preparou-se um polipéptido modelo incorporando dois conjuntos de reticulações com uma localizada entre Xaa4 e Xaa5 e a outra entre Xaag e Xaai3. A dupla reticulação foi conseguida através do cuidadoso controlo estereoquimico das reacções de metátese das ligações duplas. Assim, a invenção abrange a incorporação de mais do que uma reticulação na sequência polipeptídica para adicionalmente estabilizar a sequência ou para facilitar a estabilização de trechos polipeptidicos mais longos. Se os polipéptidos forem demasiado longos para serem prontamente sintetizados numa só parte, péptidos reticulados sintetizados independentemente podem ser unidos através de uma técnica denominada ligação quimica nativa (Bang, et al.; J. Am. Chem Soc. 126:1377).

Os novos polipéptidos reticulados são úteis, por exemplo, para imitar ou estudar proteínas ou polipéptidos possuindo um ou mais domínios alfa-helicoidais. Uma família de proteínas em que os membros da família possuem pelo menos um domínio alfa-helicoidal é a família BCL-2 de proteínas. Estas proteínas estão envolvidas em vias apoptóticas celulares. Alguns membros da família BCL-2 possuem uma função pró-apoptótica, outros 27 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ possuem uma função anti-apoptótica, e ainda outros mudam de função com uma alteração nas condições celulares. Deste modo, é desejável preparar polipéptidos estabilizados que possam imitar um ou mais motivos dos membros da familia BCL-2, desse modo modulando uma variedade de actividades relacionadas com BCL-2. Síntese Química de um Painel de Compostos SAHB3bid

Aminoácidos não naturais a,a-dissubstituídos contendo cadeias laterais olefinicas de vários comprimentos foram sintetizados de acordo com o esquema da FIG. 3 (Williams et al. 1991 J. Am. Chem. Soc. 113:9276; Schafmeister et al. 2000 J. Am. Chem Soc. 122:5891). Péptidos BID BH3 quimicamente reticulados foram desenhados substituindo dois ou quatro aminoácidos de ocorrência natural pelos correspondentes aminoácidos sintéticos (FIG. 4a). As substituições foram efectuadas em localizações discretas, nomeadamente as "posições i e i + 4" ou as "posições i e i + 7", que facilitam a quimica de reticulação colocando residuos reactivos na mesma face da hélice α (FIG. 4b). Aminoácidos altamente conservados entre as proteínas apoptóticas, em adição às sequências que se verificou serem importantes em interacções proteina-proteína com base em estudos de cristalografia de raios X e de RMN (Muchmore et al. 1996 Nature 381:335; Sattler et al. 1997 Science 275:983), foram especificamente não substituídos em certas circunstâncias, aminoácidos conservados podem ser substituídos por outros aminoácidos (e.g., aminoácidos sintéticos que não são de ocorrência natural) para melhorar a actividade (este efeito pode ser observado nos mutantes de SAHB3Bid aqui descritos) . Os compostos SAHB3Bid foram gerados por síntese peptídica em fase sólida seguida por reticulação baseada em metátese olefínica dos aminoácidos sintéticos através das suas cadeias laterais contendo olefinas. As variações de compostos SAHB3Bid geradas estão ilustradas na FIG. 5a. Variantes de SAHB3Bid (SAHBa) que incorporam mutações específicas que se sabe alterarem a função de BID (Wang et al. 1996 Genes Dev. 10:2859) foram também construídas para servir como controlos negativos em experiências biológicas (FIG. 5a). Os terminais amino de compostos seleccionados foram adicionalmente derivatizados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou lisina conjugada com biotina para gerar compostos 28 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ SAHB3Bid marcados para estudos de permeabilidade celular e ensaios bioquímicos, respectivamente (FIG. 5a). Em várias sinteses, foi adicionado um triptofano C-terminal à sequência para servir de marcador UV para fins de purificação e determinação da concentração; o ácido glutâmico N-terminal foi eliminado em vários péptidos para aumentar o pi global do composto para potencialmente facilitar a penetração celular (veja-se adiante). A abordagem da metátese foi prontamente aplicada à geração de SAHB3 alternativos, incluindo SAHB3bad e SAHB3Bid (FIG. 5a) .

Os aminoácidos não naturais (enantiómeros R e S do aminoácido olefinico de 5 carbonos e o enantiómero S do aminoácido olefinico de 8 carbonos) foram caracterizados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) (Varian Mercury 400) e espectrometria de massa (Micromass LCT) . A síntese peptídica foi realizada manualmente ou num sintetizador automático de péptidos (Applied Biosystems, modelo 433A), utilizando condições de fase sólida, resina Rink amide-AM (Novabiochem), e química do grupo protector Fmoc da cadeia principal. Para o acoplamento de aminoácidos naturais protegidos com Fmoc (Novabiochem), foram empregues 10 equivalentes de aminoácido e uma razão molar de 1:1:2 de reagentes de acoplamento HBTU/HOBt (Novabiochem)/DIEA. Os aminoácidos não naturais (4 equiv) foram acoplados com uma razão molar de 1:1:2 de HATU (Applied Biosystems)/HOBt/DIEA. A metátese olefínica foi realizada na fase sólida utilizando catalisador Grubbs 10 mM (Blackewell et al. 1994 supra) (Strem Chemicals) dissolvido em diclorometano desgaseifiçado e feito reagir durante 2 horas à temperatura ambiente. Os terminais amino de compostos seleccionados foram adicionalmente derivatizados com b-alanina e isotiocianato de fluoresceína (FITC [Sigma]/DMF/DIEA) para gerar compostos marcados com fluorescência. Foi incorporado um triptofano C-terminal para servir como marcador UV para fins de purificação e de determinação da concentração; foram também sintetizados compostos SAHBA sem o triptofano C-terminal e o ácido glutâmico N-terminal, esta última modificação realizada para aumentar o pi global das moléculas. O isolamento dos compostos metatesizados foi conseguido por desprotecção mediada por ácido trifluoroacético e clivagem, precipitação em éter para obter o produto bruto, e cromatografia líquida de alta 29 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ resolução (HPLC) (Varian ProStar) numa coluna C18 de fase inversa (Varian) para obter os compostos puros. A composição química dos produtos puros foi confirmada por espectrometria de massa LC/MS (sistema Micromass LCT em interface com HPLC Agilent 1100) e análise de aminoácidos (Applied Biosystems, modelo 420A). A FIG. 5b representa esquematicamente um subconjunto dos péptidos da FIG. 5a, incluindo a estereoquímica dos aminoácidos olefínicos (enantiómeros R e S do aminoácido olefínico de 5 carbonos e o enantiómero S do aminoácido olefínico de 8 carbonos).

Compostos SAHB3Bid Exibem a-Helicidade Melhorada

Examinámos a percentagem de helicidade de domínios BH3 pró-apoptóticos, e verificou-se que estes péptidos não modificados eram predominantemente serpentinas aleatórias em solução, com teores α-helicoidais todos abaixo de 25% (FIG. 6). Resumidamente, os compostos foram dissolvidos em solução aquosa de fosfato de potássio 50 mM, pH 7, em concentrações de 25-50 mM. Obtiveram-se espectros de CD num espectropolarímetro Jasco J-710 a 20°C utilizando os seguintes parâmetros padrão de medição: comprimento de onda, 190-260 nm; resolução do passo, 0,5 nm; velocidade, 20 nm/s; acumulações, 10; resposta, 1 s; largura de banda, 1 nm; comprimento do deslocamento, 0,1 cm. O teor a-helicoidal de cada péptido foi calculado dividindo a elipticidade média do resíduo [cp]222obs pela [cp]222obs reportada para um decapéptido helicoidal modelo (Yang et al. 1986 Methods Enzymol. 130:208)).

Em cada caso, a(s) reticulação(ões) química(s) aumentaram a percentagem de α-helicidade do domínio BH3 de BID, com SAHB3BidA e B atingindo um aumento superior a 5 vezes (FIG. 7) . O SAHB3bid (g-e) A, um mutante pontual Gly para Glu de controlo negativo de SAHB3BidA, exibe um teor helicoidal similar ao SAHB3BidA (FIG. 8). Assim, a reticulação de todos os hidrocarbonetos pode transformar um péptido apoptótico que é essencialmente uma serpentina aleatória em solução aquosa num que é predominantemente de estrutura α-helicoidal. É interessante que a importância da quarta alça helicoidal na estabilização de péptidos BID BH3 é sublinhada pela diminuição 30 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ na helicidade observada quando o SAHB3BidB 23-mero é truncado no 16-mero, SABB3BiD(tr)B (FIG. 9) . A Reticulação de Todos os Hidrocarbonetos Aumenta a Resistência a Proteases de Compostos SAHB3Bid A ligação peptídica do esqueleto peptídico é susceptível a hidrólise por proteases, desse modo tornando os compostos peptídicos vulneráveis a uma degradação rápida in vivo. A formação de hélices peptídicas, contudo, enterra o esqueleto de amidas e portanto escuda-o contra a clivagem proteolitica. O SAHB3BidA foi submetido a proteólise por tripsina in vitro para determinar qualquer alteração na velocidade de degradação comparativamente com o péptido BID BH3 não modificado. O SAHB3BidA e o péptido não modificado foram incubados com agarose de tripsina e as reacções foram extintas em vários pontos temporais por centrifugação e subsequente injecção em HPLC para quantificar o substrato residual por absorção ultravioleta a 280 nm. Resumidamente, compostos BID BH3 e SAHB3BidA (5 mcg) foram incubados com agarose de tripsina (Pierce) (S/E-125) durante 0, 10, 20, 90 e 180 minutos. As reacções foram extintas por centrifugação em centrífuga de bancada a alta velocidade; o substrato remanescente no sobrenadante isolado foi quantificado por detecção de picos baseada em HPLC a 220 nm. A reacção proteolitica exibiu uma cinética de primeira ordem e a constante de velocidade, k, foi determinada a partir de um gráfico de ln[S] versus tempo (k = -1 x declive) (FIG. 10a). A experiência, realizada em triplicado, demonstrou um aumento de 3,5 vezes na resistência de SAHB3BidA a tripsina comparativamente com o péptido não modificado. Assim, a protecção melhorada de ligações peptídicas sensíveis a tripsina enterrando-as no núcleo da hélice oí produz um composto peptídico mais estável, e pode portanto tornar estes compostos particularmente estáveis no soro.

Para estudos de estabilidade no soro ex vivo, péptidos BID BH3 e SAHB3BidA conjugados com FITC (2,5 mcg) foram incubados com soro fresco de ratinho (20 mL) a 37°C durante 0, 1, 2, 4, 8 e 24 horas. O nível de FITC-composto intacto foi determinado por congelação flash de espécimes de soro em azoto líquido, liofilização, extracção em acetonitrilo/água 50:50 31 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ contendo 0,1% de ácido trifluoroacético, seguida por quantificação baseada em HPLC utilizando detecção de fluorescência aos valores de excitação/emissão de 495/530 nm. Os resultados desta análise estão apresentados na FIG. 10b.

Para investigar a estabilidade in vivo de SAHB3BiDA, injectaram-se 10 mg/kg de péptido BID BH3 e SAHB3BidA conjugados com FITC em ratinhos NOD-SCID e recolheram-se espécimes de sangue a 0, 1, 4 e 22 horas após a injecção.

Foram então medidos os niveis de FITC-composto intacto em 25 yL de soro fresco. Os resultados desta análise, representados na FIG. 10c, mostram que o SAHB3BiDA era prontamente detectável ao longo de um período de 22 horas, com 13% do inicial ainda mensurável às 22 horas. Pelo contrário, apenas 12% de BID BH3 eram detectáveis uma hora após a inj ecção.

Compostos SAHB3Bid Retêm Ligação de Anti-Apoptótica de Alta Afinidade

As reticulações de todos os hidrocarbonetos foram selectivamente colocadas na face carregada da hélice anfipática de BID BH3 de modo a evitar a interferência com interacções críticas entre a bolsa de ligação de proteínas apoptóticas multidomínios e os resíduos hidrófobos da hélice de BID BH3. Realizaram-se experiências de ligação competitiva por polarização de fluorescência para avaliar a eficácia de compostos SAHB3Bid na competição com péptido BID BH3 não modificado marcado com FITC pela ligação a GST-BCL-2. Todos os compostos SAHB3Bid demonstraram ligação de elevada afinidade a GST-BCL2, com SAHB3BiDA e B, os dois compostos com a maior percentagem de helicidade, apresentando do mesmo modo a afinidade mais elevada (Fig. 11a) . Note-se que a mutação Gly para Glu de SAHB3BiDA e B elimina a ligação de elevada afinidade, como seria de prever a partir de estudos prévios (FIG. 11b). Determinámos adicionalmente que a mutação Gly para Ser de SAHB3BidA elimina a ligação a BCL-2 neste ensaio (dados não mostrados). A truncagem do SAHB3BiDB 23-mero num 16-mero resulta na perda de afinidade de ligação para com BCL-2, coincidente com a diminuição na α-helicidade acima descrita (FIG. 11c). 32 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ Ο péptido BID ΒΗ3 marcado com FITC liga-se a BCL-2 com uma KD de 220 nM, e uma vez ligado, ocorre o deslocamento desta interacção pelo BID BH3 não marcado a uma IC50 de 838 nM. Isto suporta um modelo segundo o qual a ligação de BH3 a BCL-2 desencadeia uma alteração conformacional global que favorece a interacção, resultando a necessidade de maiores quantidades de péptido não marcado para deslocar o BID BH3 marcado com FITC pré-ligado. Mostrámos ainda que o dominio BH3 de BAD possui uma KD aumentada de 41 nM para a ligação a BCL-2, e que pode deslocar FITC-BID BH3 pré-ligado com uma IC50 de 173 nM. Numa experiência similar, verificou-se que SAHB3BidA desloca FITC-BID BH3 de BCL-2 com uma IC50 de 62 nM, reflectindo um aumento superior a 13 vezes na potência de deslocamento comparativamente com o péptido BID BH3 não modificado. Estes dados confirmam que SAHB3BidA se liga com afinidade melhorada a BCL-2 comparativamente com péptidos com BH3 não modificado, e sugerem que a pré-organização da estrutura α-helicoidal por reticulação química proporciona uma vantagem cinética para a ligação ao alvo.

Ensaios de ligação directa por polarização de fluorescência demonstraram que a incorporação da reticulação no péptido BID BH3 resultou em afinidade de ligação melhorada de SAHB3BidA para com BCL-2, uma proteína anti-apoptótica multidomínios, e BAX, uma proteína pró-apoptótica multidomínios, comparativamente com péptido BID BH3 não modificado (FIG. lld e lie) . Um ensaio de ligação directa a BCL-2 por polarização de fluorescência demonstrou um aumento de 6 vezes na afinidade de ligação a BCL-2 de SAHB3BidA (Kd, 38,8 nm) comparativamente com péptido BID BH3 não modificado (KD, 269 nM) (FIG. lld). Uma mutação Gly para Glu, SAHBA(g^e) (KD, 483 nM) , elimina a ligação de elevada afinidade e serve como um controlo útil (FIG. lld). Resumidamente, Escherichia coli BL21 (DE3) contendo o plasmídeo que codifica o GST-BCL-2 com o terminal C eliminado, foram cultivadas em Caldo de Luria contendo ampicilina e induzidas com IPTG 0,1 mM. As peletes bacterianas foram ressuspensas em tampão de lise (lisozima a 1 mg/ml, 1% de Triton X-100, 0,1 mg/ml de PMSF, 2 pg/ml de aprotinina, 2 pg/ml de leupeptina, 1 yg/ml de pepstatina A em PBS) e tratadas com ultra-sons. Após centrifugação a 20 000 x g durante 20 min., aplicou-se o sobrenadante numa coluna de contas de glutationa-agarose (Sigma). As contas foram lavadas 33 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ com PBS e tratadas com glutationa a 50 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) para eluir a proteína, que foi então dialisada contra tampão de ensaio de ligação (NaCl 140 mM, Tris-HCl 50 mM [pH 7,4]). Os compostos tratados com fluoresceína (25 nM) foram incubados com GST-BCL2 (25 nM-1000nM) em tampão de ligação à temperatura ambiente. A actividade de ligação foi medida por polarização de fluorescência num espectrofotómetro de luminescência Perkin-Elmer LS50B. Os valores de KD foram determinados por análise de regressão não linear utilizando software Prism (Graphpad). A proteína BAX de comprimento completo foi preparada como anteriormente descrito (Suzuki et al., Cell, 103:645) e o ensaio de polarização de fluorescência foi realizado como descrito acima. SAHB3BidA Liga-se a BCL-Xl

Para determinar se SAHB3BidA interactua especificamente com o sulco de ligação definido de uma proteína anti-apoptótica multidomínios, foi registado um espectro bidimensional de correlação heteronuclear 15N/1H a uma ligação (HSQC) de BCL-Xl marcado com 15N antes e após a adição de SAHB3BidA e foi comparado com o correspondente espectro de BID BH3/15N-BCL-Xl . Resumidamente, Escherichia coli BL21 (DE3) contendo o plasmídeo que codifica BCL-Xl com o C-terminal eliminado, foram cultivadas em meio mínimo M9 contendo 15NH4C1 (Cambridge Isotope Laboratories) para gerar proteína uniformemente marcada com 15N. As proteínas recombinantes foram isoladas de bactérias. Péptidos não marcados SAHB3BidA e BID ΒΗ3 foram gerados e purificados como descrito acima. Prepararam-se os seguintes complexos 1:1 a 0,1 mM em fosfato de potássio 50 mM (pH 7), cloreto de sódio 50 mM, DMSO a 5% em D20 ou H20/D20 (95:5): 15N-BCL-Xl/BID BH3 não marcado, 15N-BCL-

Xl/SAHB3BidA não marcado. Os espectros bidimensionais heteronucleares 15N/1H a uma ligação foram registados para os dois complexos e foram analisados quanto a alterações na ressonância após ligação do ligando. A similaridade global dos espectros de HSQC indica que as alterações estruturais que ocorrem em BCL-Xl após adição de SAHB3BiDA são praticamente idênticas às observadas com o péptido BID BH3 (FIG. llf). 34 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Compostos SAHB3Bid Desencadeiam a Libertação Rápida e Específica de Citocromo C Mitocondrial

Para determinar a actividade biológica de compostos SAHB3Bid in vitro, foram realizados ensaios de libertação de citocromo c utilizando mitocôndrias de figado de ratinho purificadas. As mitocôndrias (0,5 mg/mL) foram incubadas durante 40 minutos com 1 μΜ e 100 nM de compostos SABB3Bid e depois os sobrenadantes e as fracções mitocondriais foram isolados e submetidos ao ensaio ELISA para citocromo c. A libertação de fundo de citocromo c (10-15%) foi subtraída da libertação total para cada amostra, e foi determinada a percentagem de libertação real de citocromo c (FIG. 12). Foi realizada simultaneamente a experiência idêntica com mitocôndrias de fígado de ratinho isoladas de ratinhos Bak-/-, que não libertam citocromo c mitocondrial em resposta a activação por BID-BH3; os resultados das mitocôndrias BAK-/-servem portanto como controlo negativo para a libertação de citocromo c mediada por BAK em resposta a tratamentos com SAHB3Bid- Em cada caso, excepto para o SAHB3BidE duplamente reticulado (a que podem faltar aminoácidos críticos para a actividade biológica ou, neste caso, pode estar excessivamente constrangido pelas reticulações duplas), há aproximadamente uma duplicação da libertação de citocromo c em resposta a compostos SAHB3Bid 1 yM comparativamente com o péptido não modificado (FIG. 12a) . É observada libertação de citocromo c independente de BAK para esta dose com SAHB3BidA, B, e, em particular, D. Embora esta libertação de citocromo c possa representar um efeito não específico de perturbação da membrana das hélices α, o papel de um componente induzido por SAHB3Bid, independente de BAK, da libertação de citocromo c merece exploração adicional. É interessante que o composto SAHB3Bid que induz o nível mais significativo de libertação de citocromo c independente de BAK, o SAHB3BidD, é também o mais hidrófobo dos compostos SAHB3Bid; o SAHB3BidD elui da coluna C18 de fase inversa com 95% de acetonitrilo/5% de água, comparativamente com os outros compostos SAHB3Bid que eluem com 50-75% de acetonitrilo. Os mutantes de BID com domínios BH3 defeituosos podem promover a mobilização de citocromo c independente de BAK (Scorrano et al., Dev Cell, 2:55), e o BID hélice 6 altamente hidrófobo foi implicado nesta actividade (L. Scorrano, S.J. Korsmeyer, resultados não publicados). É 35 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ plausível que SAHB3BidD exiba libertação de citocromo c tanto dependente como independente de BAK, imitando características de hélices 3 e 6 de BID. Numa dose dez vezes inferior os SAHB3BidA e B retêm a actividade selectiva de libertação de citocromo c dependente de BAK (FIG. 12b). A potência de SAHB3BidB, em particular, compara-se favoravelmente com proteína BID miristolada, activada ao máximo, que liberta aproximadamente 65% de citocromo c sob estas condições em doses de 30 nM.

Os compostos SAHB3BiD mais activos, A e B, foram submetidos a outros estudos cinéticos para determinar se a pré-organização helicoidal pode desencadear uma mais rápida libertação de citocromo c comparativamente com o péptido não modificado. De modo similar à experiência anterior,

mitocôndrias de fígado de ratinho de ratinhos do tipo selvagem e Bak-/- foram expostas aos compostos em várias concentrações e ensaiadas quanto a libertação de citocromo c a intervalos de 10 e 40 minutos. Enquanto aos 10 minutos o péptido não modificado causa menos do que 10% de libertação na dose máxima testada (1 μΜ) , o SAHB3Bidb possui uma EC50 para a libertação neste ponto temporal de pouco menos que 400 nM, com libertação de citocromo quase máxima a 1 μΜ (Fig. 13a) . Do mesmo modo, o SAHB3BidA desencadeia uma libertação significativa de citocromo c no intervalo de tempo de 10 minutos. A EC50 para a libertação de citocromo c aos 40 minutos é de 2,9 μΜ para o péptido não modificado e de 310 e 110 nM para SAHB3Bid A e B, respectivamente (Fig. 13b). Assim, o SAHB3BidA e o B exibem um aumento de 10-25 vezes na actividade de libertação de citocromo c no ponto temporal de 40 minutos. Enquanto a libertação de citocromo c dependente de BAK aumenta ao longo do tempo, a libertação independente de BAK não se altera entre os pontos temporais de 10 e 40 minutos, sugerindo que esta libertação distinta ocorre precocemente e é maximamente atingida em 10 minutos. É de notar que o mutante pontual Gly para Glu de controlo negativo de SAHB3BibA, SAHB3BiD(g-.e)A, gera apenas libertação de citocromo c independente de Bak, confirmando que o SAHB3BiDA funciona através da via de apoptose de mitocondrial dependente de Bak (Fig. 14). Tomados em conjunto, estes dados sobre a libertação de citocromo c indicam que os SAHB3BiDA e B são capazes de induzir especificamente a libertação de citocromo c dependente de BAK 36 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ com potência e cinética marcadamente melhoradas comparativamente com o péptido não modificado.

Compostos SAHB3Bid Penetram Células Intactas

Compostos SAHB3Bid, péptidos BID BH3 e um péptido BID hélice 6, derivatizados com fluoresceina, foram incubados com células Jurkat de leucemia de células T em cultura durante 4-24 horas e que subsequentemente foram seleccionadas por FACS para determinar a percentagem de marcação de células de leucemia. Para evitar resultados confusos devido a compostos ligados à superfície celular, as células Jurkat foram lavadas extensamente e submetidas a sobre-digestão com tripsina, de acordo com relatórios recentes. Para nenhum dos compostos testados houve alteração significativa no perfil do sinal de FITC após a digestão com tripsina, sugerindo que no caso destes péptidos, pouco ou nenhum composto marcado com FITC está ligado na superfície (FIG. 15). Enquanto as células tratadas com BID BH3 foram negativas para FITC, tanto as células tratadas com FITC-SAHB3BidA como com FITC-SAHB3Bid(g-.e)A foram positivas para FITC, como indicado pelo desvio para a direita do sinal de FITC (FIG. 16a). O perfil similar de FITC-SAHB3BiDA e FITC-SAHB3Bid(g-.e)A nestes estudos de permeabilidade celular é particularmente importante, tendo em conta a utilização do composto mutante pontual como controlo negativo em experiências biológicas: BID hélice 6, um péptido que permeia as células e perturba a membrana, foi utilizado como controlo positivo para a marcação com FITC nesta experiência.

Surpreendentemente, verificou-se que o FITC-SAHB3BiDA parece entrar na célula através de endocitose, uma via de transporte dependente da temperatura e de energia. A importação celular de FITC-SAHB3BidA ocorreu de uma maneira dependente do tempo (FIG. 16b). Quando a endocitose celular foi inibida realizando a experiência a 4°C (FIG. 17a, 17b) ou por tratamento com os venenos de energia azida de sódio e 2-desoxiglucose (FIG. 17c), a marcação celular foi inibida ou marcadamente diminuída, respectivamente. É de notar que as células Jurkat marcadas com FITC-SAHB3BiDA a 37°C são negativas para iodeto de propídio (PI), confirmando que o péptido reticulado não funciona meramente como um agente permeabilizante (Fig. 17b); em contraste, o FITC-BID hélice 6 37 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ penetra prontamente a ambas as temperaturas, permeabilizando eficazmente as células, como evidenciado pelo grau de positividade para PI (FIG. 17b) . Estes dados suportam um mecanismo endocitico de entrada para os compostos SAHB3Bid, consistente com relatórios recentes que mencionam aderência na superficie celular seguida por endocitose como o mecanismo de entrada para outros péptidos que penetram as células (CPP), tais como o transactivador de transcrição (TAT) de HIV. Embora se acredite que CPP altamente básicos, tais como TAT e

Antennapedia, se concentram na superficie celular por aderência a glicosaminoglicanos carregados negativamente, a importação de SAHB3BidA não foi inibida de uma maneira responsiva à dose pela heparina (FIG. 18) . As propriedades biofisicas da hélice cx anfipática de SAHB3Bid podem facilitar contactos celulares distintos através de interacções electrostáticas e/ou da membrana lipidica.

Foram empregues experiências de microscopia confocal para determinar a localização intracelular de SAHB3BiDA. Células Jurkat de leucemia de células T foram incubadas com compostos marcados com FITC como descrito acima ou com substituição de soro às 4 horas seguida por mais 16 horas de incubação a 37°C, e após duas lavagens com PBS, foram cito-centrifugadas a 600 RPM durante 5 minutos em lâminas de vidro Superfrost Plus (Fisher). As células foram então fixadas em paraformaldeido a 4%, lavadas com PBS, incubadas com iodeto de TO-PRO-3 (100 nM) (Molecular Probes) para contraste dos núcleos, tratadas com meio de montagem Vectashield (Vector), e depois obteve-se a imagem por microscopia confocal (BioRad 1024). Para as experiências de dupla marcação, as células fixadas foram adicionalmente incubadas com anticorpo primário contra TOM20, e anticorpo secundário conjugado com rodamina antes do contraste de TO-PRO-3. Para a microscopia confocal viva, a marcação dupla de células Jurkat foi realizada com FITC-SAHBA (10 μΜ) e MitoTracker (100 nM, Molecular Probes), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC)-Dextrano 4,4 kD ou 70 kD (25 mcg/mL, Molecular Probes), ou Alexa Flúor 594-transferrina (25 mcg/mL, Molecular Probes) durante 4 horas (dextrano e transferrina) ou 24 horas (MitoTracker) . Devido a limitações de fotobranqueamento, utilizaram-se células Jurkat que sobre-expressam BCL-2 para a microscopia confocal viva para optimizar a obtenção de imagens por FITC. A marcação com 38 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ FITC-SAHBa de mitocôndrias foi mais luminosa em células Jurkat que sobre-expressam BCL-2 (consistente com o mecanismo para a actividade de SAHB), e portanto a captura da imagem era facilitada utilizando estas células. As células Jurkat tratadas foram lavadas duas vezes e depois ressuspensas em PBS e analisaram-se preparações montadas em húmido com um microscópio confocal de varrimento a laser BioRad 1024 (Beth Israel/Deaconess Center for Advanced Microscopy) ou Zeiss LSM510 (Children's Hospital Boston Imaging Core).

Em secções fixadas, os compostos SAHB3BidA localizaram-se na orla citoplasmática das células leucémicas, sem fluorescência evidente na membrana plasmática nem na superfície; o padrão vesicular de fluorescência sugeriu uma localização especifica nos organelos (FIG. 19a e 19b) . Consistentemente com os dados de FACS, as células Jurkat tratadas com FITC-BID BH3 não apresentaram marcação fluorescente (FIG. 19c). Enquanto as células tratadas com FITC-SAHB3BidA exibem fluorescência intracelular selectiva e mantêm a sua arquitectura celular (FIG. 19a), as células tratadas com FITC-BID hélice 6 são difusamente marcadas e apresentam uma morfologia celular corrompida (FIG. 19d). Estudos de co-localização utilizando FITC-SAHB3BidA e um anticorpo contra a proteina da membrana mitocondrial Tom20, demonstraram uma sobreposição extensa da fluorescência de SAHB3BidA com mitocôndrias, o local esperado dos alvos moleculares de SAHB3Bid (FIG. 20) . A obtenção de imagens de células vivas realizada 4 h após tratamento com SAHB demonstrou uma co-localização inicial de FITC-SAHBa com endossomas marcados com dextrano (4,4 kD ou 70 kD) (Fig. 21a), mas não com endossomas marcados com transferrina (Fig. 21b), consistente com a captação celular por pinocitose de fase fluida (manuscrito com ref. 27), a via endocitica determinada para péptidos TAT e Antp (manuscrito com ref. 28). Num ponto temporal de 24 h, o FITC-SAHBa intracelular apresentou uma co-localização aumentada com mitocôndrias marcadas com MitoTracker em células vivas (Fig. 21c), consistente com a co-localização mitocondrial observada em células fixadas utilizando um anticorpo contra Tom20, uma proteina da membrana mitocondrial externa (Fig. 20). Tomados em conjunto, os dados de FACS e da 39 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ imagiologia confocal demonstram que a reticulação de todos os hidrocarbonetos permite que os compostos SAHB3BiDA sejam importados por células intactas (e.g., através de um mecanismo endocitótico).

Compostos SAHB3Bid Desencadeiam Apoptose de Células de Leucemia de Linhagem B, Te Linhagem Mista (MLL)

Para determinar se os compostos SAHB3Bid podiam parar o crescimento de células de leucemia proliferantes em cultura, realizaram-se ensaios MTT com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, utilizando diluições em série de SAHB3BidA, em células T (Jurkat) , células B (REH) e células de Leucemia de Linhagem Mista (MLL) (MV4;11, SEMK2, RS4;11) em cultura. O SAHB3BiDA inibiu as células leucémicas com IC5o de 2,2 (Jurkat), 10,2 (REH), 4,7 (MV4;11), 1,6 (SEMK2) e 2,7 (RS4;11) μΜ (FIG. 22a) . Nem o péptido BID BH3 nem o mutante pontual SAHBa(g^e) tiveram efeito nesta gama de doses (FIG. 22b, 22c) .

Para determinar se esta paragem metabólica representava indução de apoptose, trataram-se células Jurkat de leucemia com 10 μΜ de SAHB3BidA e Β, SAHB3Bid(g-.e) A e Β, e péptido BID ΒΗ3 não modificado, em meios isentos de soro, durante 4 horas, seguidas de uma incubação de 16 horas em meios contendo soro (i.e. concentrações finais de péptido de 5 μΜ) , e depois ensaiaram-se quanto a apoptose por detecção por citometria de fluxo de células tratadas com anexina V. Os SAHB3BidA e Β demonstraram entre 40-60% de positividade de anexina V a 20 horas após o tratamento, enquanto o péptido não modificado e os mutantes pontuais de SAHB3Bid não tiveram efeito (FIG. 23a e 23b). Estudos comparáveis que utilizam péptidos com ΒΗ3 não modificado com reagentes transportadores ou hélices manipuladas com efeitos de perturbação mitocondrial não especifica, necessitaram de doses de 200-300 μΜ para activar a apoptose. Foi subsequentemente realizada uma experiência de controlo adicional utilizando células Jurkat manipuladas para sobre-expressar BCL-2 para determinar se a apoptose induzida por SAHB3Bid podia ser diminuída por um excesso de BCL-2, o que sugeriria que os compostos funcionam especificamente no interior das células através da via da apoptose mitocondrial. De facto, o efeito pró-apoptótico de SAHB3BidA e Β 10 uM sobre 40 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ células Jurkat "do tipo selvagem" foi eliminado nas células que sobre-expressam BCL-2. Este efeito protector, contudo, pode ser ultrapassado por um escalamento da dose de SAHB3BiDA mas não de SABB3Bid<g-e>A (FIG. 24) ; em adição, um mutante pontual gly para ser de SAHB3BidA (SABB3Bid<c^s) A) , que não exibe afinidade de ligação para com BCL-2 (veja-se acima), é igualmente eficaz como pró-apoptótico em células Jurkat "do tipo selvagem" que sobre-expressam BCL-2 (FIG. 24). Foram adicionalmente realizados ensaios de indução da apoptose utilizando SAHB3BidA e SAHB3Bid(g-.e) A nas linhas celulares REH, MV4;11 e SEMK2 com resultados similares (FIG. 25). Tomados em conjunto, estes dados indicam que os compostos SAHB3BiD podem penetrar e matar células de leucemia proliferantes. Os efeitos pró-apoptóticos observados são selectivamente eliminados pela mutação gly para glu de SAHB3BidA e pela sobre-expressão celular de BCL-2, verificações que sublinham que os compostos SAHB3Bid funcionam através da via da apoptose de mitocondrial definida. SAHB3bidA e SAHB3Bidg~sA demonstram supressão leucémica in vivo

Ratinhos NOD-SCID foram submetidos a uma irradiação de corpo completo de 300 cGy seguida de injecção intravenosa de 4xl06 células de leucemia SEMK2-M1 que exibem expressão estável de luciferase. Os ratinhos foram monitorizados semanalmente quanto ao enxerto de leucemia utilizando o sistema de imagiologia In Vivo Imaging System (IVIS, Xenogen), que quantifica a luminescência de corpo completo após injecção intraperitoneal de D-luciferina. No dia 0, obteve-se a imagem dos ratinhos leucémicos que depois se trataram intravenosamente com 10 mg/kg de SAHB3BiDA, SAHB3Bidg-sA, ou sem injecção nos dias 1, 2, 3, 5, 6. A luminescência de corpo completo foi medida nos dias 4 e 7. Relativamente à FIG. 26a, a análise da carga tumoral entre os grupos demonstra supressão leucémica por SAHB3BidA e SAHB3BiD <g^s) A comparativamente com ratinhos de controlo não tratados. Relativamente à FIG. 26b, as imagens de luminescência de corpo completo apresentam leucemia mais avançada no grupo não tratado no dia 7 (é observada densidade de vermelho, representando leucemia de nivel elevado, em todo o sistema esquelético) comparativamente com os ratinhos tratados com SAHB3BiDA, que apresentam doença com nível menor e mais localizada. É interessante que o 41 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ mutante G->S, que não pode ser sequestrado por BCL-2, parece ser mais potente do que o composto progenitor, SAHB3BiDA, na supressão do crescimento leucémico.

Em outras experiências com animais, obtiveram-se imagens de ratinhos leucémicos (gerados como acima) no dia 0 e depois trataram—se intravenosamente com SAHB3bid A a 10 mg/kg, SAHB3BidA a 5 mg/kg, ou controlo de veiculo (5% de DMSO em D5W) nos dias 1, 2, 3, 6 e 7. A luminescência de corpo completo foi medida nos dias 4 e 8. Relativamente à FIG. 27a, a análise da carga tumoral entre os grupos demonstra supressão leucémica por SAHB3BidA de uma maneira dependente da dose comparativamente com ratinhos de controlo não tratados. Relativamente à FIG. 27b, as imagens de luminescência de corpo completo apresentam uma leucemia mais avançada no grupo não tratado no dia 8 (densidade de vermelho representa leucemia de nivel elevado) comparativamente com os ratinhos tratados com SAHB3BiDA, cuja progressão leucémica é notavelmente atenuada.

Em experiências adicionais com animais que empregaram, desta vez, ratinhos SCID bege e células de leucemia RS4;11, o tratamento com SAHB3BidA suprimiu consistentemente o crescimento da leucemia in vivo. Para as imagens da leucemia in vivo, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano inalado (Abbott Laboratories) e tratados simultaneamente com injecção intraperitoneal de D-luciferina (60 mg/kg) (Promega). Obteve-se a imagem da emissão fotónica (2 min de exposição) utilizando o sistema de imagiologia In Vivo Imaging System (Xenogen) e quantificou-se a bioluminescência de corpo completo por integração do fluxo fotónico (fotões/s) (Living Image Software, Xenogen). Começando no dia 1 da experiência, os ratinhos receberam uma injecção diária na veia da cauda de SAHB3biDA (10 mg/kg) ou veiculo (5% de DMSO em D5W) durante sete dias. Obteve-se a imagem dos ratinhos nos dias 1, 3 e 5 e monitorizou-se a sobrevivência diariamente durante toda a experiência. As distribuições da sobrevivência de ratinhos tratados com SABB3BiDA e com veiculo foram determinadas utilizando o método de Kaplan-Meier e comparadas utilizando o teste Log-rank. Utilizou-se o teste Exacto de Fisher para comparar a proporção de ratinhos com tratamento falhado entre os dias 3 e 5, onde a falha do tratamento foi definida como progressão ou morte, e o sucesso como doença estável ou 42 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ regressão. Os ratinhos que expiraram foram submetidos a necropsia (Rodent Histopathology Core, DF/HCC).

Os ratinhos de controlo apresentaram aceleração progressiva do crescimento leucémico como quantificado por um fluxo aumentado de bioluminescência nos dias 1-5 (FIG. 27c). O tratamento com SAHB3BiDA suprimiu a expansão leucémica após o dia 3, com regressão do tumor observada no dia 5. As imagens representativas dos ratinhos demonstram a infiltração leucémica progressiva no baço e no figado em ratinhos, mas regressão da doença nestes locais anatómicos em ratinhos tratados com SAHBa no dia 5 do tratamento (FIG 27d). A mediana do tempo até à morte neste coorte foi de 5 dias para animais de controlo, enquanto nenhum dos animais tratados com SAHBA morreu durante os sete dias do período de tratamento, e em vez disso sobreviveram durante um tempo mediano de 11 dias (FIG 27e) . Os exames histológicos de ratinhos tratados com SAHBa não mostraram uma toxicidade óbvia do composto no tecido normal. Num estudo adicional que compara ratinhos tratados com SAHB3BidA e com SAHB3Bid(g-e) A, os animais que receberam o mutante pontual de SAHB não exibiram regressão do tumor (FIG. 27f), realçando a especificidade in vivo da actividade antileucémica do SAHB3bidA.

Polipéptidos

Em alguns casos, os "grampos" de hidrocarbonetos (i.e., reticulações) aqui descritos podem ser adicionalmente manipulados. Num caso, uma ligação dupla de um "grampo" de hidrocarboneto alcenilo, (e.g., sintetizado utilizando uma metátese de fecho de anel catalisada por ruténio (RCM)) pode ser oxidada (e.g., via epoxidação ou di-hidroxilação) para proporcionar um dos compostos abaixo.

Quer a porção epóxido quer uma das porções hidroxilo livre podem ser adicionalmente funcionalizadas. Por exemplo, o epóxido pode ser tratado com um nucleófilo, que proporciona 43 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ uma funcionalidade adicional que pode ser utilizada, por exemplo, para ligar um marcador (e.g., um radioisótopo ou um marcador fluorescente). 0 marcador pode ser utilizado para auxiliar a dirigir o composto para uma localização desejada no corpo (e.g., direccionando o composto para a tiróide quando utilizando um marcador de iodo) ou rastrear a localização do composto no corpo. Alternativamente, um agente terapêutico adicional pode ser quimicamente ligado ao "grampo" funcionalizado (e.g., um agente anticanceroso tal como rapamicina, vinblastina, taxol, etc.). Esta derivatização pode ser alternativamente conseguida por manipulação sintética do terminal amino ou carboxi do polipéptido ou através da cadeia lateral de aminoácidos.

Embora tenham sido descritos "grampos" de hidrocarboneto, estão também contemplados outros "grampos". Por exemplo, o "grampo" pode incluir uma ou mais de entre uma porção éter, tioéter, éster, amina ou amida. Em alguns casos, uma cadeia lateral de um aminoácido de ocorrência natural pode ser incorporada no "grampo". Por exemplo, um "grampo" pode ser acoplado a um grupo funcional tal como o hidroxilo na serina, o tiol na cisterna, a amina primária na lisina, o ácido no aspartato ou no glutamato, ou a amida na asparagina ou na glutamina. Deste modo, é possível criar um "grampo" utilizando aminoácidos de ocorrência natural em vez de utilizar um "grampo" que é feito por acoplamento de dois aminoácidos que não são de ocorrência natural. É também possível utilizar um único aminoácido que não é de ocorrência natural juntamente com um aminoácido de ocorrência natural. É ainda contemplado que o comprimento do "grampo" possa variar. Por exemplo, pode ser utilizado um menor comprimento de "grampo" quando é desejável proporcionar um grau relativamente elevado de constrangimento na estrutura secundária alfa-helicoidal, enquanto, em alguns casos, é desejável proporcionar menos constrangimento na estrutura secundária alfa-helicoidal, e assim pode ser desejável um "grampo" mais longo.

Adicionalmente, embora tenham sido descritos exemplos de "grampos" que se estendem dos aminoácidos i a i+3, i a i+4; e i a i+7 para proporcionar um "grampo" que está principalmente 44 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ numa única face da hélice alfa, os "grampos" podem ser sintetizados para se estenderem em quaisquer combinações de números de aminoácidos.

Em alguns casos, são utilizados aminoácidos alfa-dissubstituídos no polipéptido para melhorar a estabilidade da estrutura secundária alfa-helicoidal. Contudo, não são necessários aminoácidos alfa-dissubstituídos, e estão também contemplados casos em que se utilizam mono-alfa-substituintes (e.g., nos aminoácidos "grampeados").

Como pode notar um especialista, os métodos de sintese dos compostos aqui descritos serão evidentes para as pessoas competentes na matéria. Adicionalmente, os vários passos de sintese podem ser realizados numa sequência ou ordem alternativas para originar os compostos desejados. As transformações químicas sintéticas e as metodologias de grupos de protecção (protecção e desprotecção) úteis na síntese dos compostos aqui descritos são conhecidas na especialidade e incluem, por exemplo, as descritas em R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene e P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser e M. Fieser, Fieser, Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); e L. Paquette, ed., Enciclopédia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), e suas edições subsequentes.

Os péptidos da presente invenção podem ser preparados por métodos de síntese química, que são bem conhecidos das pessoas competentes na matéria. Veja-se, por exemplo, Fields et al., Capítulo 3 em Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77. Portanto, os péptidos podem ser sintetizados utilizando as técnicas de Merrifield automáticas de síntese em fase sólida com a a-NH2 protegida por química de t-Boc ou F-moc utilizando aminoácidos com cadeia lateral protegida em, por exemplo, Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A ou 431.

Uma maneira de preparar os péptidos aqui descritos é utilizando a síntese peptídica em fase sólida (SPPS). 0 aminoácido C-terminal é ligado a uma resina de poliestireno 45 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ reticulado através de uma ligação lábil aos ácidos com uma molécula ligante. Esta resina é insolúvel nos solventes utilizados para a síntese, tornando relativamente simples e rápido lavar o excesso de reagentes e subprodutos. O terminal N é protegido com o grupo Fmoc, que é estável aos ácidos, mas é removível com bases. Quaisquer grupos funcionais de cadeias laterais são protegidos com grupos estáveis às bases e lábeis aos ácidos. Péptidos mais longos podem ser preparados unindo péptidos sintéticos individuais utilizando a ligação química nativa. Alternativamente, os péptidos sintéticos mais longos podem ser sintetizados por técnicas de ADN recombinante bem conhecidas. Estas técnicas são proporcionadas em manuais convencionais bem conhecidos com protocolos detalhados. Para construir um gene que codifica um péptido da presente invenção, a sequência de aminoácidos é traduzida inversamente para obter uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos, preferivelmente com codões que são óptimos para o organismo em que o gene vai ser expresso. Em seguida, é preparado um gene sintético, tipicamente sintetizando oligonucleótidos que codificam o péptido e quaisquer elementos reguladores, se necessário. O gene sintético é inserido num vector de clonagem adequado e transfectado numa célula hospedeira. O péptido é então expresso sob condições adequadas, apropriadas para o sistema de expressão e o hospedeiro seleccionados. O péptido é purificado e caracterizado por métodos padrão.

Os péptidos podem ser preparados de uma maneira combinatória, de alto rendimento, e.g., utilizando um sintetizador combinatório de múltiplos canais de elevado rendimento disponível de Advanced Chemtec.

As Figuras 28a-28f representam vários péptidos que incluem domínios que são úteis para a criação de péptidos reticulados. Métodos de Tratamento São aqui descritos métodos de tratamento profilácticos e terapêuticos de um indivíduo em risco de (ou susceptível a) uma desordem, ou possuindo uma desordem, associada a expressão 46 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ ou actividade aberrantes (e.g., insuficiente ou excessiva) de membros da família BCL-2 (e.g., anomalias da via apoptótica extrínseca ou intrínseca) . Como aqui se utiliza, o termo "tratamento" é definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico a um paciente, ou a aplicação ou administração de um agente terapêutico a um tecido ou linha celular isolados de um paciente, que tem uma doença, um sintoma de doença ou uma predisposição para uma doença, com o propósito de curar, sarar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, melhorar ou afectar a doença, os sintomas de doença ou a predisposição para a doença. Um agente terapêutico inclui, mas não se lhes limita, moléculas pequenas, péptidos, anticorpos, ribozimas e oligonucleótidos anti-sentido. É possível que algumas desordens do tipo BCL-2 possam ser causadas, pelo menos em parte, por um nível anormal de um ou mais membros da família BCL-2 (e.g., sobre- ou sub-expressão), ou pela presença de um ou mais membros da família BCL-2 exibindo actividade anormal. Como tal, a redução no nível e/ou na actividade do membro da família BCL-2 do melhoramento do nível e/ou da actividade do membro da família BCL-2, que originaria a melhoria dos sintomas da desordem.

Os polipéptidos aqui descritos podem ser utilizados para tratar, prevenir e/ou diagnosticar cancros e condições neoplásicas. Como aqui se utilizam, os termos "cancro", "hiperproliferativo" e "neoplásico" referem-se a células possuindo a capacidade de crescimento autónomo, i.e., um estado ou condição anormais caracterizados por crescimento celular de proliferação rápida. Os estados de doença hiperproliferativa e neoplásica podem ser categorizados como patológicos, i.e., caracterizando ou constituindo um local de doença, ou podem ser categorizados como não patológicos, i.e., um desvio ao normal mas não associado a um estado de doença. No termo pretende-se incluir todos os tipos de crescimentos cancerosos ou processos oncogénicos, tecidos metastáticos ou células, tecidos ou órgãos transformados malignamente, independentemente do tipo ou estádio histopatológico de invasividade. Células "hiperproliferativas patológicas" ocorrem em estados de doença caracterizados por crescimento tumoral maligno. Os exemplos de células hiperproliferativas 47 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ não patológicas incluem a proliferação de células associada a reparação de feridas.

Os exemplos de desordens celulares proliferativas e/ou diferenciativas incluem o cancro, e.g., carcinoma, sarcoma, ou desordens metastáticas. Os compostos (i.e., polipéptidos) podem actuar como novos agentes terapêuticos para o controlo do cancro da mama, cancro ovariano, cancro do cólon, cancro do pulmão, metástases destes cancros e similares. Um tumor metastático pode surgir de uma pluralidade de tipos de tumores primários, incluindo, mas não se lhes limitando, os de origem na mama, pulmão, figado, cólon e ovariana.

Os exemplos de cancros ou condições neoplásicas incluem, mas não se lhes limitando, um fibrossarcoma, miossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, cancro gástrico, cancro esofágico, cancro rectal, cancro pancreático, cancro ovariano, cancro da próstata, cancro uterino, cancro da cabeça e pescoço, cancro da pele, cancro do cérebro, carcinoma de células escamosas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do dueto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, cancro cervical, cancro testicular, carcinoma pulmonar de células pequenas, carcinoma pulmonar de células não pequenas, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma ou sarcoma de Kaposi.

Os exemplos de desordens proliferativas incluem desordens neoplásicas hematopoiéticas. Como aqui se utiliza, a expressão "desordens neoplásicas hematopoiéticas" inclui doenças que envolvem células hiperplásicas/neoplásicas de origem hematopoiética, e.g., que surgem de linhagens mielóides, linfóides ou eritróides, ou células suas precursoras. Preferivelmente, as doenças surgem de leucemias agudas 48 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ pobremente diferenciadas, e.g., leucemia eritroblástica e leucemia megacarioblástica aguda. Exemplos adicionais de desordens mielóides incluem, mas não se lhes limitando, leucemia promielóide aguda (APML), leucemia mielógena aguda (AML) e leucemia mielógena crónica (CML) (revisto em Vaickus, L. (1991) Crit Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97); as malignidades linfóides incluem, mas não se lhes limitando, leucemia linfoblástica aguda (ALL) que inclui ALL de linhagem B e ALL de linhagem T, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia prolinfocitica (PLL), leucemia de células pilosas (HLL) e macroglobulinemia de Waldenstrom (WM) . Formas adicionais de linfomas malignos incluem, mas não se lhes limitando, linfoma não hodgkiniano e suas variantes, linfomas de células T periféricas, leucemia/linfoma de células T adultas (ATL), linfoma de células T cutâneas (CTCL), leucemia linfocítica granular grande (LGF), doença de Hodgkin e doença de Reed-Sternberg.

Os exemplos de desordens celulares proliferativas e/ou diferenciativas da mama incluem, mas não se lhes limitando, doença proliferativa da mama incluindo, e.g., hiperplasia epitelial, adenose esclerosante e papilomas ductais pequenos; tumores, e.g., tumores estromais tais como fibroadenoma, tumor filóide e sarcomas, e tumores epiteliais tais como papilomas de ductais grandes; carcinoma da mama incluindo carcinoma in situ (não invasivo) que inclui carcinoma ductal in situ (incluindo doença de Paget) e carcinoma lobular in situ, e carcinoma invasivo (infiltrante) incluindo, mas não se lhes limitando, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma medular, carcinoma colóide (mucinoso), carcinoma tubular e carcinoma papilar invasivo, e neoplasmas malignos vários. As desordens na mama masculina incluem, mas não se lhes limitando, ginecomastia e carcinoma.

Os exemplos de desordens celulares proliferativas e/ou diferenciativas do pulmão incluem, mas não se lhes limitando, carcinoma broncogénico, incluindo síndromes paraneoplásicas, carcinoma bronquioloalveolar, tumores neuroendócrinos, tais como tumores carcinóides bronquiais, vários, e tumores metastáticos; patologias da pleura, incluindo efusões pleurais inflamatórias, efusões pleurais não inflamatórias, pneumotórax 49 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ e tumores pleurais, incluindo tumores fibrosos solitários (fibroma pleural) e mesotelioma maligno.

Os exemplos de desordens celulares proliferativas e/ou diferenciativas do cólon incluem, mas não se lhes limitando, pólipos não neoplásicos, adenomas, sindromes familiares, carcinogénese colorrectal, carcinoma colorrectal e tumores carcinóides.

Os exemplos de desordens celulares proliferativas e/ou diferenciativas do figado incluem, mas não se lhes limitando, hiperplasias nodulares, adenomas e tumores malignos, incluindo carcinoma primário do figado e tumores metastáticos.

Os exemplos de desordens celulares proliferativas e/ou diferenciativas do ovário incluem, mas não se lhes limitando, tumores ovarianos tais como, tumores do epitélio celómico, tumores serosos, tumores mucinosos, tumores endometrióides, adenocarcinoma celular claro, cistadenofibroma, tumor de

Brenner, tumores epiteliais de superfície; tumores de células germinais tais como teratomas maduros (benignos), teratomas monodérmicos, teratomas malignos imaturos, disgerminoma, tumor do seio endodérmico, coriocarcinoma; tumores estromais dos cordões sexuais tais como, tumores de células da granulosa-teca, tecoma-fibromas, androblastomas, tumores de células doentes e gonadoblastoma; e tumores metastáticos tais como tumores de Krukenberg.

Os polipéptidos aqui descritos podem também ser utilizados para tratar, prevenir ou diagnosticar condições caracterizadas por morte celular sobre-reactiva ou morte celular devida a insulto fisiológico, etc. Alguns exemplos de condições caracterizadas por morte celular prematura ou indesejada são, ou alternativamente proliferação celular indesejada ou excessiva incluem, mas não se lhes limitando, condições hipocelulares/hipoplásicas, acelulares/aplásicas ou hipercelulares/hiperplásicas. Alguns exemplos incluem desordens hematológicas incluindo, mas não se lhes limitando, anemia de Fanconi, anemia aplásica, talassemia, neutropenia congénita, mielodisplasia. 50 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Os polipéptidos aqui descritos que actuam para diminuir a apoptose podem ser utilizados para tratar desordens associadas a um nivel indesejável de morte celular. Assim, os péptidos anti-apoptóticos aqui descritos podem ser utilizados para tratar desordens tais como as que conduzem a morte celular associada a infecção virai, e.g., infecção associada a infecção com virus da imunodeficiência humana (HIV). Uma vasta variedade de doenças neurológicas são caracterizadas pela perda gradual de conjuntos específicos de neurónios, e os péptidos anti-apoptóticos da invenção podem ser utilizados no tratamento destas desordens. Estas desordens incluem doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ALS) retinite pigmentosa, atrofia muscular espinal, e várias formas de degeneração cerebelar. A perda de células nestas doenças não induz uma parece ser o mecanismo doenças hematológicas diminuída de células anemia associada a neutropenia crónica, Desordens de produção resposta inflamatória, e a apoptose

Em adição, várias a uma produção desordens incluem anemia aplásica, mielodisplásicas. de morte celular, estão associadas sanguíneas. Estas doença crónica, e as síndromes de células sanguíneas, tais como a síndrome mielodisplásica e algumas formas de anemia aplásica, estão associadas a morte celular apoptótica aumentada dentro da medula óssea. Estas desordens podem resultar da activação de genes que promovem a apoptose, deficiências adquiridas em células estromais ou factores de sobrevivência hematopoiética, ou dos efeitos directos de toxinas e mediadores de respostas imunitárias. Duas desordens comuns associadas a morte celular são os enfartes do miocárdio e o icto. Em ambas estas desordens, as células na área central de isquemia, que é produzida no evento de perda aguda de fluxo sanguíneo, parecem morrer rapidamente em resultado de necrose. Contudo, fora da zona isquémica central, as células morrem ao longo de um período de tempo mais prolongado e morfologicamente parecem morrer por apoptose. Os péptidos anti-apoptóticos da invenção podem ser utilizados para tratar todas estas desordens associadas a morte celular indesejável.

Alguns exemplos de desordens imunológicas que podem ser tratadas com os polipéptidos aqui descritos incluem, mas não se lhes limitando, rejeição de transplantes de órgãos, 51 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ artrite, lúpus, IBD, doença de Crone, asma, esclerose múltipla, diabetes, etc.

Alguns exemplos de desordens neurológicas que podem ser tratadas com os polipéptidos aqui descritos incluem, mas não se lhes limitando, Doença de Alzheimer, Sindrome de Down, Hemorragia Cerebral Hereditária com Amiloidose do Tipo Holandês, Amiloidose Reactiva, Nefropatia Amilóilde Familiar com Urticária e Surdez, Sindrome de Muckle-Wells, Mieloma Idiopático; Mieloma a Associado a Macroglobulinemia, Polineuropatia Amilóide Familiar, Cardiomiopatia Amilóide Familiar, Amilóide Cardiaca Isolada, Amiloidose Senil Sistémica, Diabetes com Inicio no Adulto, Insulinoma, Amilóide Atrial Isolada, Carcinoma Medular da Tiróide, Amiloidose Familiar, Hemorragia Cerebral Hereditária Com Amiloidose, Polineuropatia Amilóide Familiar, paraplexia enzoótica ("scrapie"), Doença Creutzfeldt-Jacob, Sindrome Gerstmann Straussler-Scheinker, Encefalite Espongiforme Bovina, uma doença mediada por Priões e Doença de Huntington.

Alguns exemplos de desordens endocrinológicas que podem ser tratadas com os polipéptidos aqui descritos incluem, mas não se lhes limitando, diabetes, hipotiroidismo, hipopituitarismo, hipoparatiroidismo, hipogonadismo, etc.

Os exemplos de desordens cardiovasculares (e.g., desordens inflamatórias) "que podem ser tratadas ou prevenidas com os compostos e métodos da invenção incluem, mas não se lhes limitando, aterosclerose, enfarte do miocárdio, icto, trombose, aneurisma, insuficiência cardiaca, doença isquémica cardiaca, angina de peito, morte súbita cardiaca, doença cardiaca hipertensiva; doença de vasos não coronários, tal como arterioloscelerose, doença dos pequenos vasos, nefropatia, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, xantomatose, asma, hipertensão, enfisema e doença pulmonar crónica; ou uma condição cardiovascular associada a procedimentos intervencionais ("traumatismo vascular procedimental"), tais como restenose após angioplastia, colocação de shunt, stent, enxertos de excisão sintéticos ou naturais, cateter residente, válvula ou outros dispositivos implantáveis. As desordens cardiovasculares 52 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ preferidas incluem aterosclerose, enfarte do miocárdio, aneurisma e icto.

Composições Farmacêuticas e Vias de Administração

Os compostos aqui descritos, incluindo os compostos com as fórmulas aqui descritas, são definidos para incluir derivados farmaceuticamente aceitáveis de seus pró-fármacos. Um "derivado ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitáveis" significam qualquer sal, éster, sal de um éster, ou outro derivado, farmaceuticamente aceitáveis, de um composto da presente invenção, que, após administração a um beneficiário, é capaz de proporcionar (directa ou indirectamente) um composto da presente invenção. Os derivados e pró-fármacos particularmente favorecidos são aqueles que aumentam a biodisponibilidade dos compostos da presente invenção quando esses compostos são administrados a um mamífero (e.g., permitindo que um composto administrado oralmente seja mais prontamente absorvido no sangue) ou que melhoram a entrega do composto progenitor num compartimento biológico (e.g., no cérebro ou no o sistema linfático) relativamente à espécie progenitora. Os pró-fármacos preferidos incluem derivados em que um grupo que melhora a solubilidade aquosa ou o transporte activo através da membrana intestinal está apenso à estrutura com as fórmulas aqui descritas.

Os compostos aqui descritos podem ser modificados ligando as funcionalidades apropriadas para melhorar propriedades biológicas selectivas. Estas modificações são conhecidas na especialidade e incluem as que aumentam a penetração biológica num determinado compartimento biológico (e.g., sangue, sistema linfático, sistema nervoso central), aumentam a disponibilidade oral, aumentam a solubilidade para permitir a administração por injecção, alteram o metabolismo e alteram a taxa de excreção.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presente invenção incluem os que são derivados de ácidos e bases inorgânicos e orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Os exemplos de sais de ácidos adequados incluem acetato, adipato, benzoato, benzenossulfonato, butirato, citrato, digluconato, dodecilsulfato, formato, fumarato, glicolato, hemissulfato, 53 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ heptanoato, hexanoato, cloridrato, bromidrato, iodidrato, lactato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, palmoato, fosfato, picrato, pivalato, proprionato, salicilato, succinato, sulfato, tartarato, tosilato e undecanoato. Os sais derivados de bases apropriadas incluem sais de metais alcalinos (e.g. sódio), metais alcalino-terrosos (e.g. magnésio), amónio e N-(alquilo) 4+. A presente invenção também prevê a quaternização de quaisquer grupos contendo azoto básico dos compostos aqui divulgados. Produtos solúveis ou dispersáveis em água ou em óleo podem ser obtidos através desta quaternização.

Os compostos com as fórmulas aqui descritas podem, por exemplo, ser administrados por injecção, intravenosa, intra-arterial, subdérmica, intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea; ou por via oral, bucal, nasal, transmucosa, tópica, numa preparação oftálmica, ou por inalação, com uma gama de dosagem de cerca de 0,001 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal ou de acordo com as necessidades do fármaco particular. Os métodos contemplam aqui a administração de uma quantidade eficaz de composto ou composição de compostos para atingir o efeito desejado ou pretendido. Tipicamente, as composições farmacêuticas da presente invenção serão administradas de cerca de 1 a cerca de 6 vezes por dia ou alternativamente, sob a forma de uma infusão continua. Esta administração pode ser utilizada sob a forma de terapia crónica ou aguda. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com os materiais transportadores para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração particular. Uma preparação típica conterá de cerca de 5% a cerca de 95% de composto activo (p/p). Alternativamente, estas preparações contêm de cerca de 20% a cerca de 80% de composto activo.

Podem ser necessárias doses inferiores ou superiores às acima citadas. Os regimes de dosagem e de tratamento específicos para qualquer paciente particular irão depender de uma variedade de factores, incluindo a actividade do composto específico empregue, da idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos, da gravidade e decurso da doença, da 54 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ condição ou dos sintomas, da disposição do paciente relativamente à doença, condição ou sintomas, e da opinião do médico assistente.

Após melhoria da condição do paciente, pode ser administrada uma dose de manutenção de um composto, composição ou combinação da presente invenção, se necessário. Subsequentemente, a dosagem ou a frequência de administração, ou ambas, podem ser reduzidas, em função dos sintomas, para um nivel em que seja retida condição melhorada. Os pacientes podem, contudo, necessitar de tratamento intermitente numa base de longo prazo após qualquer recorrência dos sintomas de doença.

As composições farmacêuticas aqui descritas compreendem um composto com as fórmulas aqui descritas ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis; um agente adicional incluindo por exemplo, morfina ou codeina; e qualquer transportador, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente aceitáveis. Composições alternativas da presente invenção compreendem um composto com as fórmulas aqui descritas ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um transportador, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente aceitáveis. As composições aqui delineadas incluem os compostos com as fórmulas aqui delineadas, assim como agentes terapêuticos adicionais, se presentes, em quantidades eficazes para conseguir uma modulação da doença ou dos sintomas da doença, incluindo desordens mediadas por membros da família BCL-2 ou seus sintomas. A expressão "transportador ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a um transportador ou um adjuvante que podem ser administrados a um paciente, juntamente com um composto aqui descrito, e que não destroem a sua actividade farmacológica e não são tóxicos quando administrados em doses suficientes para entregar uma quantidade terapêutica do composto.

Os transportadores, adjuvantes e veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas não se lhes limitando, permutadores iónicos, alumina, estearato de alumínio, lecitina, sistemas de entrega de 55 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ fármacos auto-emulsionantes (SEDDS) tais como succinato de d-a-tocoferol-polietilenoglicol 1000, tensioactivos utilizados em formas de dosagem farmacêutica tais como Tweens ou outras matrizes poliméricas de entrega similares, proteinas séricas, tais como albumina sérica humana, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicéricos parciais de ácidos gordos saturados vegetais, água, sais ou electrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, silica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose, polietilenoglicol, carboximetilcelulose sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de blocos de polietileno-polioxipropileno, polietilenoglicol e lanolina. Ciclodextrinas tais como α-, β- e γ-ciclodextrina, podem também ser utilizadas com vantagem para melhorar a entrega de compostos com as fórmulas aqui descritas.

As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas por via oral, parentérica, pulverização para inalação, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, ou por via de um reservatório implantado, preferivelmente por administração oral ou administração por injecção. As composições farmacêuticas da presente invenção podem conter quaisquer transportadores, adjuvantes ou veículos convencionais, não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis. Em alguns casos, o pH da formulação pode ser ajustado com ácidos, bases ou tampões farmaceuticamente aceitáveis para melhorar a estabilidade do composto formulado ou da sua forma para entrega. O termo "parentérico", como aqui se utiliza, inclui injecção subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-arterial, intra-sinovial, intra-esterno, intratecal, intralesional e intracraniana ou técnicas de infusão.

As composições farmacêuticas podem estar na forma de uma preparação estéril injectável, por exemplo, sob a forma de uma suspensão estéril injectável aquosa ou oleaginosa. Esta suspensão pode ser formulada de acordo com técnicas conhecidas na especialidade utilizando agentes de dispersão ou molhantes adequados (tais como, por exemplo, Tween 80) e agentes de suspensão. A preparação estéril injectável pode também ser uma 56 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ solução ou suspensão estéreis injectáveis num diluente ou solvente não tóxicos parentericamente aceitáveis, por exemplo, sob a forma de uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veiculos e solventes aceitáveis que podem ser empregues estão o manitol, água, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. Em adição, são empregues convencionalmente óleos fixados estéreis como solvente ou meio de suspensão. Para este fim, pode ser empregue qualquer óleo fixado brando incluindo mono- ou diglicéridos sintéticos. Ácidos gordos, tais como ácido oleico e seus derivados glicéridos, são úteis na preparação de injectáveis, assim como óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como azeite ou óleo de ricino, especialmente nas suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões em óleo podem também conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, ou agentes dispersantes de carboximetilcelulose ou similares, que são vulgarmente utilizados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis tais como emulsões e ou suspensões. Outros tensioactivos vulgarmente utilizados tais como Tweens ou Spans e/ou outros agentes emulsionantes similares ou potenciadores de biodisponibilidade que são vulgarmente utilizados no fabrico de formas dosagem sólidas, liquidas, ou outras, farmaceuticamente aceitáveis, podem também ser utilizados para fins de formulação.

As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas oralmente em qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo, mas não se lhes limitando, cápsulas, comprimidos, emulsões e suspensões, dispersões e soluções aquosas. No caso de comprimidos para uso oral, os transportadores que são vulgarmente utilizados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, são também tipicamente adicionados. Para administração oral na forma de uma cápsula, os diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando são administradas oralmente suspensões e/ou emulsões aquosas, o ingrediente activo pode ser suspenso ou dissolvido numa fase oleosa e é combinado com agentes emulsionantes e/ou de suspensão. Se desejado, podem ser adicionados certos agentes edulcorantes e/ou aromatizantes e/ou corantes. 57 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

As composições farmacêuticas aqui descritas podem também ser administradas na forma de supositórios para administração rectal. Estas composições podem ser preparadas por mistura de um composto da presente invenção com um excipiente não irritante adequado que é sólido à temperatura ambiente mas liquido à temperatura rectal e portanto irá derreter no recto para libertar os compostos activos. Estes materiais incluem, mas não se lhes limitando, manteiqa de cacau, cera de abelha e polietilenoglicóis.

As composições farmacêuticas aqui descritas podem também ser administradas por aerossol ou inalação nasal. Estas composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas na especialidade da formulação farmacêutica e podem ser preparadas na forma de soluções em solução salina, empregando álcool benzilico ou outros conservantes adequados, promotores da absorção para melhorar a biodisponibilidade, fluorocarbonetos, e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes conhecidos na especialidade.

Quando as composições aqui descritas compreendem uma combinação de um composto com as fórmulas aqui descritas e um ou mais agentes terapêuticos ou profilácticos adicionais, tanto o composto como o agente adicional deverão estar presentes em niveis de dosagem entre cerca de 1 a 100%, e mais preferivelmente entre cerca de 5 a 95% da dosagem normalmente administrada num regime de monoterapia. Os agentes adicionais podem ser administrados, como parte de um regime de doses múltiplas, separadamente dos compostos da presente invenção. Alternativamente, estes agentes podem fazer parte de uma única forma de dosagem, misturados em conjunto com os compostos da presente invenção numa única composição.

Ensaios de Rastreio São aqui descritos métodos (também referidos aqui como "ensaios de rastreio") para a identificação de polipéptidos que modulam a actividade de uma ou mais proteínas da família BCL-2 ou que se ligam a uma ou mais proteínas da família BCL-2 (e.g., um polipéptido possuindo pelo menos um domínio de homologia BH). 58 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ A afinidade de ligação dos polipéptidos aqui descritos pode ser determinada utilizando, por exemplo, um ensaio de titulação da ligação. Um polipéptido da família BCL-2 compreendendo um domínio BH (e.g., BID, BAK, BAX, etc.) pode ser exposto a várias concentrações de um composto candidato (i.e., polipéptido) (e.g., 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ, 1 mM e 10 mM) na presença de um substrato tal como um polipéptido contendo BH3 marcado por fluorescência ou um seu fragmento (e.g., BID, BAD, BAK, BAX, etc.). O efeito de cada concentração de composto candidato é então analisada para determinar o efeito do composto candidato sobre a actividade de ligação à família BCL-2 a várias concentrações, que pode ser utilizado para calcular o Ki do composto candidato. O composto candidato pode modular a actividade do tipo BCL-2 de uma maneira competitiva ou não competitiva. Ensaios de ligação directa podem também ser realizados entre proteínas da família BCL-2 e compostos candidatos marcados por fluorescência para determinar o Kd para a interacção de ligação. Os compostos candidatos podem também ser rastreados quanto a actividade biológica in vitro, por exemplo, medindo a sua eficácia responsiva à dose para desencadear a libertação de citocromo c por mitocôndrias purificadas. Estão também previstos ensaios de rastreio da permeabilidade celular, em que compostos candidatos marcados por fluorescência são aplicados a células intactas, que são então ensaiadas quanto à fluorescência celular por microscopia de detecção de fluorescência celular de elevado rendimento.

Os ensaios aqui descritos podem ser realizados com compostos candidatos individuais ou podem ser realizados com uma pluralidade de compostos candidatos. Quando os ensaios são realizados com uma pluralidade de compostos candidatos, os ensaios podem ser realizados utilizando misturas de compostos candidatos ou podem ser realizados em reacções paralelas em que cada reacção possui um único composto candidato. Os compostos de teste ou agentes podem ser obtidos utilizando qualquer das numerosas abordagens em métodos de bibliotecas combinatórias conhecidos na especialidade.

Num caso, um ensaio é um ensaio à base de células em que uma célula que expressa uma proteína da família BCL-2 ou uma sua porção biologicamente activa é colocada em contacto com um 59 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ polipéptido candidato, e a capacidade do composto de teste para modular a actividade do tipo BCL-2 é determinada (e.g., em alguns casos aumento na apoptose e em outros casos diminuição da apoptose, através de vias de morte celular intrínsecas ou extrínsecas). A determinação da capacidade do composto do teste modular a actividade do tipo BCL-2 em células pode ser realizada monitorizando, por exemplo, a libertação de citocromo c por mitocôndrias ou outro resultado fisiológico relevante (e.g., coloração de anexina V, ensaio MTT, ensaio da actividade de caspase, ensaio TUNEL).

Num caso, um ensaio é um ensaio bioquímico, através do qual polipéptidos reticulados se podem ligar a resina de afinidade para purificar ou identificar parceiros interactivos novos ou conhecidos na via apoptótica.

Outras aplicações

As aplicações biologicamente relevantes para os péptidos aqui descritos são numerosas e prontamente evidentes, como indicado pelos seguintes exemplos baseados nos compartimentos celulares: (1) Superfície celular - Mostrou-se que péptidos naturais que representam regiões helicoidais chave da proteína gp41 de HIV-1 (e.g., péptido C, péptido T-20) previnem a fusão virai, e portanto, a infecciosidade do HIV. Os péptidos helicoidais participam em mecanismos de fusão essenciais para muitos paradigmas de infecção vírus-célula hospedeira (e.g., Dengue, Hepatite C, Influenza), e portanto, análogos "grampeados" por hidrocarbonetos destas regiões helicoidais críticas podem funcionar como antibióticos eficazes por inibição da fusão virai. Em geral, ligandos que interactuam com receptores da superfície celular utilizando interfaces helicoidais para activar ou inibir vias de sinalização, representam aplicações adicionais para os polipéptidos aqui descritos. e (2) Intramembranar - A dimerização e a oligomerização de receptores são características fundamentais de activação e sinalização de receptores induzidas por ligandos. Os domínios helicoidais transmembranares participam amplamente nestas reacções essenciais de oligomerização (e.g., família dos Receptores do Factor de Crescimento Epidérmico [EGFR]), 60 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ foram identificadas sequências peptídicas especificas que facilitam estes fortes associados helicoidais intramembranares. A activação aberrante destes receptores através de oligomerização está implicada na patogénese de doenças (eg. erbB e cancro). Portanto, no cenário apropriado, a activação ou a inibição de interacções inter-helicoidais transmembranares terá beneficio terapêutico. (3) Citosólico - Os alvos citosólicos incluem proteínas-alvo solúveis e as associadas a organelos intracitosólicos específicos, incluindo a mitocôndria, o reticulo endoplasmático, o aparelho de Golgi, lisossomas e peroxissomas. No campo da apoptose, existem múltiplos alvos de proteínas apoptóticas citosólicas e mitocondriais para os domínios da família BCL-2 "grampeados" por hidrocarbonetos. No subgrupo apenas BH3 de proteínas pró-apoptóticas, foram identificados dois subconjuntos principais de domínios BH3: (1) BH3 do tipo BID (e.g., BIM) que são "activadores" de apoptose que induzem oligomerização de BAK e libertação de citocromo c na mitocôndria e (2) BH3 do tipo BAD que são "sensibilizadores de apoptose" que têm como alvos selectivos proteínas anti-apoptóticas multidomínios, permitindo que níveis subliminares de domínios activadores sejam maximamente eficazes. Em adição à distinta ligação de proteínas apenas BH3 a membros da família multidomínios pró- vs. anti-apoptóticos, os domínios BH3 desempenham ligação diferencial entre proteínas anti-apoptóticas. Por exemplo, pode ser demonstrado que a BAD se liga preferencialmente a BCL-2 anti-apoptótica, enquanto a BIM tem como alvo a MCL-1 anti-apoptótica. A identificação e a exploração destas interacções selectivas são criticamente importantes porque diferentes membros da família BCL-2 estão implicados em diferentes tipos de cancro. Por exemplo, a sobre-expressão de BCL-2 é responsável pelo desenvolvimento de linfoma folicular e resistência a quimioterapia em geral, enquanto se crê que a MCL-1 desempenha um papel importante na patogénese de mieloma múltiplo. A capacidade para transformar os muitos domínios BH3 em reagentes estruturalmente estáveis e permeáveis das células proporcionaria uma importante oportunidade para explorar e manipular diferencialmente vias apoptóticas em células cancerosas. Está previsto ter como alvo outras interacções dependentes das hélices no citosol ou em organelos citosólicos. 61 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ (4) Nuclear - Factores de transcrição nucleares e as suas proteínas moduladoras conduzem uma série de processos fisiológicos baseados em interacções de péptidos helicoidais com proteínas e ácidos nucleicos nucleares. A exequibilidade de geração de péptidos "grampeados" por hidrocarbonetos para se envolverem em interacções nucleares foi recentemente demonstrada pela nossa síntese de um painel de péptidos de p53 "grampeados" por hidrocarbonetos, que interactuam com MDM2 com afinidades picomolares. Em adição à modulação de interacções proteína-proteína no interior do núcleo, as interacções proteína-ácido nucleico são também alvos evidentes. Múltiplas famílias de factores de transcrição, tais como homeodomínio, hélice-alça-hélice básico, receptor nuclear e proteínas contendo dedo de zinco, directamente interactuam com ADN através das suas hélices peptídicas para activar ou inibir a transcrição génica. Como exemplo, as proteínas de homeodomínio são uma família de factores de transcrição essenciais que regulam programas genéticos de crescimento e diferenciação em todos os organismos pluricelulares. Estas proteínas partilham um motivo de ligação ao ADN conservado, denominado o homeodomínio, que contém um péptido de 60 aminoácidos de comprimento que forma três hélices a, a terceira delas entrando em contacto directo com o sulco principal de ADN. Tal como o domínio BH3 das proteínas apoptóticas, o homeodomínio é um motivo efector crítico com variação suficiente entre homólogos para facilitar especificidades de ligação e actividades fisiológicas diferenciais. As interacções proteína-ADN podem ser complexas e extensivas, e desse modo apresentar um desafio ao desenvolvimento de moléculas pequenas com o propósito de estudar e selectivamente modular eventos de transcrição. Em organismos superiores, as proteínas de homeodomínio são altamente expressas durante o desenvolvimento, especificando o plano do corpo e ditando a diferenciação dos tecidos. A sobre-expressão de homeoproteínas específicas (e.g. CDX4) pode activar programas de diferenciação específicos de tecidos que resultam, por exemplo, na formação de sangue a partir de células estaminais embrionárias de ratinho. A desregulação da expressão de genes homeóticos, tal como a supra-regulação aberrante de proteínas de homeodomínio expressas tipicamente em células indiferenciadas ou a infra-regulação inapropriada destas proteínas normalmente expressas em células diferenciadas, pode 62 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ contribuir para ο desenvolvimento e manutenção do cancro. Por exemplo, no rabdomiossarcoma alveolar pediátrico, a fusão do dominio de ligação a ADN, PAX3 ou PAX7, ao dominio de transactivação em "cabeça de garfo" ("forkhead") foi implicada na transformação celular; translocações envolvendo os dominios de ligação ao ADN de vários genes HOX foram ligadas à patogénese da leucemia. Assim, a capacidade para estabilizar quimicamente as hélices dos factores de transcrição, tais como os péptidos de homeodomínio, para entrega celular tem o potencial de originar uma caixa de ferramentas química para a investigação e modulação de diversos programas de transcrição responsáveis por uma pluralidade de processos biológicos na saúde e na doença. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> DANA-FARBER CÂNCER INSTITUTE, INC.

<120> PÉPTIDOS ALFA-HELICOIDAIS ESTABILIZADOS E SUAS UTILIZAÇÕES <130> 116-038 <140> EP 04 811 198.3 <141> 2004-11-05 <150> PCT/US2004/038403 <151> 2004-11-05 <150> US 60/517,848 <151> 2003-11-05 <150> US 60/591,548 <151> 2004-07-27 <160> 117 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens 63 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ < 4 0 0 > 1

Met Ala Arg Ala Arg Gin Glu Gly Ser Ser Pro Glu Pro Val Glu Gly 1 5 io 15 Leu Ala Arg Asp Gly Pro Arg Pro Phe Pro Leu Gly Arg Leu Val Pro 20 25 30 Ser Ala Vai Ser Cys Gly Leu Cys Glu Pro Gly Leu Ala Ala Ala Pro 35 40 45 Ala Ala Pro Thr Leu Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Cys Ala Pro Thr Ala 50 55 60 Pro Pro Ala Vai Thr Ala Ala Leu Gly Gly Ser Arg Trp Pro Gly Gly 65 70 75 80 Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gly Pro Arg Pro Asp Gly Pro Gin Pro Ser 85 90 95 Leu Ser Leu Ala Glu Gin His Leu Glu Ser Pro val Pro Ser Ala Pro 100 105 110 Gly Ala Leu Ala- Gly Gly Pro Thr Gin Ala Ala pro Gly Val Arq Gly 115 120 125 Glu Glu Glu Gin Trp Ala Arg Glu Ile Gly Ala Gin Leu Arg Arg Met 130 135 14 0 Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gin Tyr Glu Arg Arg Arg Gin Glu Glu Gin 14 5 150 155 160 Gin Arg HiS Arg Pro Ser Pro Trp Arg Val Leu Tyr Asn Leu Ile Met 165 170 175 Gly Leu Leu Pro Leu Pro Arg Gly His Arg Ala Pro Glu Met Glu Pro 180 185 190 Asn <210> 2 <211> 193 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ala Arg Ala Arg Gin Glu Gly Ser Ser Pro Glu Pro Val Glu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Arg Asp Ser Pro Arg Pro Phe Pro Leu Gly Arg Leu Met Pro 20 25 30 Ser Ala Vai Ser Cys Ser Leu Cys Glu Pro Gly Leu Pro Ala Ala Pro 35 40 45 Ala Ala Pro Ala Leu Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Cys Ala Pro Thr Ala 50 55 60 Pro Pro Ala Vai Thr Ala Ala Leu Gly Gly Pro Arg Trp Pro Gly Gly 65 70 75 80 His Arg Ser Arg Pro Arg Gly Pro Arg Pro Asp Gly Pro Gin Pro Ser 85 90 95 Leu Ser Pro Ala Gin Gin His Leu Glu Ser Pro Val Pro Ser Ala Pro 100 105 110 Glu Ala Leu Ala Gly Gly Pro Thr Gin Ala Ala Pro Gly Val Arg Val 115 120 125 Glu Glu Glu Glu Trp Ala Arg Glu Ile Gly Ala Gin Leu Arg Arg Met 130 135 140 Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gin Tyr Glu Arg Arg Arg Gin Glu Glu Gin 145 150 155 160 His Arg His Arg Pro Ser Pro Trp Arg Val Met Tyr Asn Leu Phe Met 165 170 175 Gly Leu Leu Pro Leu Pro Arg Gin Pro Gly Ala Pro Glu Met Glu Pro 180 185 190 Asn <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural 64 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ < 4 0 0 > 3_

Trp Ala Arg Glu Ile Gly Ala Gin Leu Arg Arg Met Ala Asp Asp Leu 1 S io is

Asn Ala Gin Tyr _20_

<210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 4

Ile Gly Tyr Glu Ile Gly Ser Lys Leu Ala Ala Met Cys Asp Asp Phe 1 5 io 15

Asp Ala Gin Met . 20

<210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 5

Ala Ala Gin Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Phe 15 10 15

Vai Asp Ser Phe 20

<210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 6_

Pro Glu Ile Trp Ile Ala Gin Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe 15 10 15

Asn Ala Tyr Tyr _20_

<210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 7_

Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gin Vai Gly Asp Ser Met 1 5 10' 15

Asp Arg Ser Ile 20 65 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

<210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 8

Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu MeC 1 S 10 15

Asp Vai Ser Leu _20__

<210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 9_

Ala Ala Gin Leu Thr Ala Ala Arg Leu Lys Ala Leu Gly Asp Glu Leu 1 5 10 15

His Gin Arg Thr 20

<210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 10

Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Vai Ser 1 5 10 15

Leu Arg

<210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 11_

Trp Ile Ala Gin Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn Ala Tyr 15 10 15

Tyr Ala__

<210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural 66 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 12_

Glu Cys Ala Thr Gin Leu Arg Arg Phe Gly Asp Lys Leu Asn Phe Arg 1 S 10 15

Gin Lya

<210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 13

Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gin Vai Gly Asp Ser Met Asp Arg Ser 15 10 15

Ile Pro

<210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 14

Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Phe Vai Asp Ser 1 5 10 15

Phe Lys

<210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 15

Glu Ile Gly Ser Lys Leu Ala Ala Met Cys Asp Asp Phe Asp Ala Gin 1 5 10 15

Met Met

<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16_

Leu Asp Ala Leu Gly His Glu Leu Pro 1 5

<210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17

Leu Glu Vai Leu Gly Arg Glu Leu Pro 1_5_ 67 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Leu Ala Gin Vai Gly Asp Ser Met Asp 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Leu Ala Gin Ile Gly Asp Glu Met Asp 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Leu Lys ; Ala Leu Gly Asp Glu Leu His 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Phe Vai 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Leu Ala Xle He Gly Asp Asp Ile Asn

1 S 68 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp 1 5

<210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26

Leu Leu Arg Leu Gly Asp Glu Leu Glu 1 5__ <210> 27 <211> 351 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27

Met Thr Leu Arg Leu Leu Glu Asp Trp Cys Arg Gly Met Asp Met Asn 1 5 10 15 Pro Arg Lys Ala Leu Leu Ile Alã Gly Ile Ser Gin Ser Cys Ser Val 20 25 30 Ala Glu Ile Glu Glu Ala Leu Gin Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Glu 35 40 45 Tyr Arg Leu Leu Gly Arg Met Phe Arg Arg Asp Glu Asn Arg Lys Val 50 55 60 Ala Leu Vai Gly Leu Thr Ala Glu Thr Ser HÍS Ala Leu val Pro Lys 65 70 75 80 Glu Ile Pro Gly Lys Gly Gly Ile Trp Arg Vai iie Phe Lys Pro Pro 85 90 95 Asp Pro Asp Asn Thr Phe Leu Ser Arg Leu Asn Glu Phe Leu Ala Gly 100 105 110 Glu Gly Met Thr Vai Gly Glu Leu Ser Arg Ala Leu Gly His Glu Asn 115 120 125 Gly Ser Leu Asp Pro Glu Gin Gly Met Ile Pro Glu Met Trp Ala Pro 130 135 14 0 Met Leu Ala Gin Ala Leu Glu Ala Leu Gin Pro Ala Leu Gin Cys Leu 145 150 155 160 Lys Tyr Lys Lys Leu Arg Vai Phe Ser Gly Arg Glu Ser Pro Glu Pro 165 17 0 175 Gly Glu Glu Glu Phe Gly Arg Trp Met Phe His Thr Thr Gin Met Ile 180 185 190 Lys Ala Trp Gin Vai Pro Asp Vai Glu Lys Arg Arg Arg Leu Leu Glu 195 200 205 Ser Leu Arg Gly Pro Ala Leu Asp Vai Ile Arg Vai Leu Lys Ile Asn 210 215 220 Asn Pro Leu Ile Thr Vai Asp Glu Cys Leu Gin Ala Leu Glu Glu val 225 230 235 240 Phe Gly Vai Thr Asp Asn Pro Arg Glu Leu Gin vai Lys Tyr Leu Thr 245 250 255 Thr Tyr His Lys Asp Glu Glu Lys Leu Ser Ala Tyr Vai Leu Arg Leu 260 265 270 Glu Pro Leu Leu Gin Lys Leu Vai Gin Arg Gly Ala Ile Glu Arg Asp 275 280 285 Ala Vai Asn Gin Ala Arg Leu Asp Gin Vai Ile Ala Gly Ala Val His 290 295 300 Lys Thr ile Arg Arg Glu Leu Asn Leu Pro Glu Asp Gly Pro Ala Pro 305 310 315 320 Gly Phe Leu Gin Leu Leu Vai Leu Ile Lys Asp Tyr Glu Ala Ala Glu 325 330 335 Glu Glu Glu Ala Leu Leu Gin Ala ile Leu Glu Gly Asn Phe Thr 340 345 350 69 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <2ΐο> : 28 <2ΐι> : 352 <212> : PRT <213> Mus musculus <400> 28 Met Thr Leu Arg Leu Leu Glu Asp Trp Cys Arg Gly Met Asp Met Asn 1 5 10 15 Pro Arg Lys Ala Leu Leu Val Ala Gly Ile Pro Pro Thr Cys Gly Val 20 25 30 Ala Asp Ile Glu Glu Ala Leu Gin Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Glu 35 40 45 Hls Arg Leu Leu Gly Arg Met Phe Arg Arg Asp GlU Asn Lys Asn Val 50 55 60 Ala Leu Ile Gly Leu Thr Val Glu Thr Gly Ser Ala Leu Val Pro Lys 55 70 75 80 Glu Ile Pro Ala Lys Gly Gly Val Trp Arq val Ile Phe Lys Pro Pro 85 90 95 Asp Thr Asp Ser Asp Phe Leu Cys Arg Leu Asn Glu Phe Leu Lys Gly 100 105 110 Glu Gly Met Thr Met Gly Glu Leu Thr Arg Val Leu Gly Asn Arg Asn 115 120 125 Asp Pro Leu Gly Leu Asp Pro Gly Ile Met Ile Pro Glu Ile Arg Ala 130 135 140 Pro Met Leu Ala Gin Ala Leu Asn Glu Ala Leu Lys Pro Thr Leu Gin 145 * 150 155 160 Tyr Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Ser val Phe Ser Gly Arg Asp Pro Pro 165 170 175 Gly Pro Gly Glu Glu Glu Phe Glu Ser Trp Met Phe His Thr Ser Gin 180 185 190 Vai Met Lys Thr Trp Gin Val Ser Asp Val Glu Lys Arg Arg Arg Leu 195 200 205 Ile Glu Ser Leu Arg Gly Pro Ala Phe Glu Ile Ile Arg Val Leu Lys 210 215 220 Ile Asn Asn Pro Phe Ile Thr Val Ala Glu Cys Leu Lys Thr Leu Glu 225 230 235 24 0 Thr Ile Phe Gly ile Ile Asp Asn Pro Arg Ala Leu Gin Val Lys Tyr 245 250 255 Leu Thr Thr Tyr Gin Lys Thr Asp Glu Lys Leu Ser Ala Tyr Val Leu 260 265 270 Arg Leu Glu Pro Leu Leu Gin Lys Leu val Gin Lys Gly Ala Ile Glu 275 280 285 Lys Glu val Val Asn Gin Ala Arg Leu Asp Gin Val Ile Ala Gly Ala 290 295 300 Val His Lys Ser Val Arg Arg Glu Leu Gly Leu Pro Glu Gly Ser Pro 305 310 315 320 Ala Pro Gly Leu Leu Gin Leu Leu Thr Leu Ile Lys Asp Lys Glu Ala 325 330 335 Glu Glu Glu Glu Val Leu Leu Gin Ala Glu Leu Glu Gly Tyr Cys Thr 340 345 350

<210> 29 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1)...(329) <223> Xaa = Qualquer Axninoácido 70 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 29

Met Ala Met Thr Leu Leu Glu Asp Trp Cys Arg Gly Met Asp Val Asn 1 5 10 15 Ser Gin Arg Xaa Leu Leu Val Trp Gly ile Pro Val Asn Cys Asp Glu 20 25 30 Ala Glu Ile Glu Glu Thr Leu Gin Ala Ala Met Pro Gin val Ser Tyr 35 40 45 Arg Met Leu Gly Arg Met Phe Trp Arg Glu Glu Asn Ala Lys Ala Ala 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Thr Gly Ala Val Asp Tyr Ala Ala Ile Pro Arg Glu 65 70 75 80 Met Pro Gly Lys Gly Gly Val Trp Lys Val Leu Phe Lys Pro Pro Thr 85 90 95 Ser Asp Ala Glu Phe Leu Glu Arg Leu HiS Leu Phe Leu Ala Arg Glu 100 105 110 Gly Trp Thr Val Gin Asp Val Ala Arg Val Leu Gly Phe Gin Asn Pro 115 120 125 Thr Pro Thr Pro Gly Pro Glu Met Pro Ala Glu Met Leu Asn Tyr Ile 13 0 135 140 Leu Asp Asn val Ile Gin Pro Leu Val Glu Ser Ile Trp Tyr Lys Arg 145 150 155 160 Leu Thr Leu Phe Ser Gly Arg Asp Ile Pro Gly Pro Gly Glu Glu Thr 165 170 175 Phe Asp Pro Trp Leu Glu His Thr Asn Glu Val Leu Glu Glu Trp Gin 180 185 190 vai Ser Asp Val Glu Lys Arg Arg Arg Leu Met Glu Ser Leu Arg Gly 195 200 205 Pro Ala Ala Asp Val Ile Arg Ile Leu Lys Ser Asn Asn Pro Ala Ile 210 215 220 Thr Thr Ala Glu Cys Leu Lys Ala Leu Glu Gin Val Phe Gly Ser Val 225 230 235 240 GlU Ser Ser Arg Asp Ala Gin Ile Lys Phe Leu Asn Thr Tyr Gin Asn 245 250 255 Pro Gly Glu Lys Leu Ser Ala Tyr Val Ile Arg Leu Glu Pro Leu Leu 260 265 270 Gin Lys val Val Glu Lys Gly Ala Ile Asp Lys Asp Asn Val Asn Gin 275 280 285 Ala Arg Leu Glu Gin Val Ile Ala Gly Ala Asn His Ser Gly Ala Ile 290 295 300 Arg Arg Gin Leu Trp Leu Thr Gly Ala Gly Glu Gly Pro Gly Pro Lys 305 310 315 320 Pro Leu Ser Val Ala Gly Ala Asp Pro 325

<210> 30 <211> 364 <212> PRT <213> Homo sapiens 71 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 30

Met Ala Leu Ala Leu Leu Glu Asp Trp Cys Arg Ile Met Ser Val Asp 1 5 10 15 Glu Gin Lys Ser Leu Met Vai Thr Gly Ile Pro Ala Asp Phe Glu Glu 20 25 30 Ala Glu Ile Gin Glu Vai Leu Gin Glu Thr Leu Lys Ser Leu Gly Arg 35 40 45 Tyr Arg Leu Leu Gly Lys Ile Phe Arg Lys Gin Glu Asn Ala Asn Ala 50 55 60 Vai Leu Leu Glu Leu Leu Glu Asp Thr Asp Vai Ser Ala Ile Pro Ser 65 70 75 80 Glu Vai Gin Gly Lys Gly Gly Vai Trp Lys Vai Ile Phe Lys Thr Pro 85 90 95 Asn Gin Asp Thr Glu Phe Leu Glu Arg Leu Asn Leu Phe Leu Glu Lys 100 105 110 Glu Gly Gin Thr Vai Ser Gly Met Phe Arg Ala Leu Gly Gin Glu Gly 115 120 125 Vai Ser Pro Ala Thr Vai Pro Cys Ile Ser Pro Glu Leu Leu Ala His 130 135 140 Leu Leu Gly Gin Ala Met Ala His Ala Pro Gin Pro Leu Leu Pro Met 145 150 155 160 Arg Tyr Arg Lys Leu Arg Vai Phe Ser Gly Ser Ala Val Pro Ala Pro 165 170 175 Glu Glu Glu Ser Phe Glu Vai Trp Leu Glu Gin Ala Thr Glu Ile Val 180 185 190 Lys Glu Trp Pro Vai Thr Glu Ala Glu Lys Lys Arg Trp Leu Ala Glu 195 200 205 Ser Leu Arg Gly Pro Ala Leu Asp Leu Met His Ile Val Gin Ala Asp 210 215 220 Asn Pro Ser Ile Ser Vai Glu Glu Cys Leu Glu Ala Phe Lys Gin Val 225 230 235 240 Phe Gly Ser Leu Glu Ser Arg Arg Thr Ala Gin Vai Arg Tyr Leu Lys 245 250 255 Thr Tyr Gin Glu Glu Gly Glu Lys Vai Ser Ala Tyr Val Leu Arg Leu 260 265 270 Glu Thr Leu Leu Arg Arg Ala Vai Glu Lys Arg Ala Ile Pro Arg Arg 275 280 285 Ile Ala Asp Gin Vai Arg Leu Glu Gin Vai Met Ala Gly Ala Thr Leu 290 295 300 Asn Gin Met Leu Trp Cys Arg Leu Arg Glu Leu Lys Asp Gin Gly Pro 305 310 315 320 Pro Pro Ser Phe Leu Glu Leu Met Lys Vai Ile Arg Glu Glu Glu Glu 325 330 335 Glu Glu Ala Ser Phe Glu Asn Glu Ser Ile Glu Glu Pro Glu Glu Arg 340 345 350 Asp Gly Tyr Gly Arg Trp Asn His Glu Gly Asp Asp 355 360 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Leu Ser Arg Ala Leu Gly His Glu 1 s <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Leu Thr Arg Val Leu Gly Asn Arg 1 s 72 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Leu Asp Ala Leu Gly His Glu 1 - 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Leu Gll· Vai Leu Gly Arg Glu 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Leu Lys Ala Leu Gly Asp Glu 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Leu Ala Gin Vai Gly Asp Ser 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39

Leu Ala Gin Ile Gly Asp Glu 1 5 73 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210> 40 <211> 213 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 40

Met Glu Val Leu Arg Arg Ser Ser Val Phe Ala Ala Glu Ile Met Asp 1 5 10 15 Ala Phe Asp Arg Ser Pro Thr Asp Lys Glu Leu Val Ala Gin Ala Lys 20 25 30 Ala Leu Gly Arg Glu Tyr Val His Ala Arg Leu Leu Arg Ala Gly Leu 35 40 45 Ser Trp Ser Ala Pro Glu Arg Ala Ser Pro Ala Pro Gly Gly Arg Leu 50 55 60 Ala Glu Val Cys Thr Val Leu Leu Arg Leu Gly Asp Glu Leu Glu Gin 65 70 75 80 Ile Arg Pro Ser Val Tyr Arg Asn Val Ala Arg Gin Leu His Ile Pro 85 90 95 Leu Gin Ser Glu Pro Val Val Thr Asp Ala Phe Leu Ala Val Ala Gly 100 105 110 Hls Ile Phe Ser Ala Gly Ile Thr Trp Gly Lys Val Val Ser Leu Tyr 115 120 125 Ser Vai Ala Ala Gly Leu Ala Val Asp Cys Val Arg Gin Ala Gin Pro 130 135 14 0 Ala Met Val HiS Ala Leu Val Asp Cys Leu Gly Glu Phe Val Arg Lys 145 150 155 160 Thr Leu Ala Thr Trp Leu Arg Arg Àrg Gly Gly Trp Thr ASp val Leu 165 170 175 Lys Cys val val Ser Thr Asp Pro Gly Phe Arg Ser His Trp Leu val 180 185 190 Ala Thr Leu Cys Ser Phe Gly Arg Phe Leu Lys Ala Ala Phe Phe Leu 195 200 205 Leu Leu Pro Glu Arg 210 <210> 41 <211> 211 <212> PRT <213> Home sapiens <400> 41 Met Ala Ser Gly Gin Gly Pro Gly Pro Pro Arg Gin Glu Cys Gly Glu 1 5 10 15 Pro Ala Leu Pro ser Ala Ser Glu Glu Gin Val Ala Gin Asp Thr Glu 20 25 30 Glu Vai Phe Arg Ser Tyr Val Phe Tyr Arg His Gin Gin Glu Gin Glu 35 40 45 Ala Glu Gly Val Ala Ala Pro Ala Asp Pro Glu Met Val Thr Leu Pro 50 55 60 Leu Gin Pro Ser ser Thr Met Gly Gin Val Gly Arg Gin Leu Ala Ile 65 70 75 80 Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg Tyr Asp Ser Glu Phe Gin Thr Met 85 90 95 Leu Gin His Leu Gin Pro Thr Ala Glu Asn Ala Tyr Glu Tyr Phe Thr 100 105 110 Lys Ile Ala Thr Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ile Asn Trp Gly Arg Val 115 120 125 Vai Ala Leu Leu Gly Phe Gly Tyr Arg Leu Ala Leu His Val Tyr Gin 130 135 140 His Gly Leu Thr Gly Phe Leu Gly Gin Val Thr Arg Phe Val Val Asp 145 150 155 160 Phe Met Leu His His Cys lie Ala Arg Trp ile Ala Gin Arg Gly Gly 165 170 175 Trp Val Ala Ala Leu Asn Leu Gly Asn Gly Pro Ile Leu Asn Val Leu 180 185 190 Vai Vai Leu Gly Val Val Leu Leu Gly Gin Phe Val Val Arg Arg Phe 195 200 205 Phe Lys Ser 210 74 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210> 42 <211> 192 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 42

Met Asp Gly Ser Gly Glu Gin Pro Arg Gly Gly Gly Pro Thr Ser Ser 1 5 10 15 Glu Gin Ile Met Lys Thr Gly Ala Leu Leu Leu Gin Gly Phe Ile Gin 20 25 30 Asp Arg Ala Gly Arg Met Gly Gly Glu Ala Pro Glu Leu Ala Leu Asp 35 40 45 Pro Val Pro Gin Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys 50 55 60 Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn Met Glu Leu Gin Arg Met Ile 65 70 75 80 Ala Ala Val Asp Thr Asp Ser Pro Arg Glu Val Phe Phe Arg Val Ala 85 90 95 Ala Asp Met Phe Ser Asp Gly Asn Phe Asn Trp Gly Arg Val Val Ala 100 105 110 Leu Phe Tyr Phe Ala Ser Lys Leu Val Leu Lys Ala Leu CyS Thr Lys 115 12 0 125 Vai pro Glu Leu Ile Arg Thr Ile Met Gly Trp Thr Leu Asp Phe Leu 130 135 140 Arg Glu Arg Leu Leu Gly Trp Ile Gin Asp Gin Gly Gly Trp Asp Gly 145 150 155 160 Leu Leu Ser Tyr Phe Gly Thr Pro Thr Trp Gin Thr Val Thr Ile Phe 165 170 175 Vai Ala Gly Val Leu Thr Ala Ser Leu Thr Ile Trp Lys Lys Met Gly 180 185 190 <210> 43 <211> 192 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 43 Met Ala Thr Pro Ala Ser Pro Asp Thr Arg Ala Leu val Ala Asp Phe 1 5 10 15 Vai Gly Tyr Lys Leu Arg Gin Lys Gly Tyr Val Cys Gly Ala Gly Pro 20 25 30 Gly Glu Gly Pro Ala Ala Asp Pro Leu His Gin Ala Met Arg Ala Ala 35 40 45 Gly Asp Glu Phe Glu Thr Arg Phe Arg Arg Thr Phe Ser Asp Leu Ala 50 55 60 Ala Gin Leu His Val Thr Pro Gly Ser Ala Gin Gin Arg Phe Thr Gin 65 70 75 80 Val Ser Asp Glu Leu Phe Gin Gly Gly Pro Asn Trp Gly Arg Leu Val 85 90 95 Ala Phe Phe Val Phe Gly Ala Ala Leu Cys Ala Glu Ser Val Asn Lys 100 105 110 Glu Met Glu Pro Leu val Gly Gin Val Gin Glu Trp Met Val Ala Tyr 115 120 125 Leu Glu Thr Arg Leu Ala Asp Trp Ile His Ser Ser Gly Gly Trp Ala 130 135 140 Glu Phe Thr Ala Leu Tyr Gly Asp Gly Ala Leu Glu Glu Ala Arg Arg 145 150 155 160 Leu Arg Glu Gly Asn Trp Ala Ser Val Arg Thr Val Leu Thr Gly Ala 165 170 175 Val Ala Leu Gly Ala Leu Val Thr Val Gly Ala Phe Phe Ala Ser Lys 180 185 190

<210> 44 <211> 194 <212> PRT <213> Homo sapiens 75 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 44

Met Ser Gin Ser Asn Arg Glu Leu val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gin Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gin Phe Ser Asp val Glu Glu 20 25 30 As η Arg Thr Glu Ala Pro Arg Glu Val Ile Pro Met Ala Ala Val Lys 35 40 45 Gin Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg 50 55 60 Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gin Leu His Ile Thr Pro Gly Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Gin Ser Phe Glu Gin val Val Asn Glu Leu Phe Arg Asp Gly val 85 90 95 Asn Trp Gly Arg He Val Ala Phe Phe Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys 100 105 110 Vai Glu Ser Vai ASp Lys Glu Met Gin Val Leu Val Ser Arg Ile Ala 115 120 125 Ala Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile Gin 130 135 140 Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe val Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala 145 150 155 160 Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gin Glu Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu 165 170 175 Thr Gly Met Thr val Ala Gly Val Val Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser 190 185 190 Arg Lys

<210> 45 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45

Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gin Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Pro Ala Leu Ser 35 40 45 Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Ala Leu Arg Gin Ala Gly Asp Asp 50 55 60 Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Gly Asp Phe Ala Glu Met Ser Ser Gin Leu 65 70 75 80 His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly Arg Phe Ala Thr val Val Glu 85 90 95 Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe 100 105 110 Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu Ser Val Asn Arg Glu Met Ser 115 120 125 Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg 130 135 140 His Leu His Thr Trp Ile Gin Asp Asn Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu 165 170 175 Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr 180 185 190 Leu Gly Ala Tyr Leu Ser His Lys 195 200

<210> 46 <211> 231 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans 76 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 46

Ser Pro Ser Arg Gin Ala Ser Thr Arg Arg Met Ser Ile Gly Glu Ser 1 5 10 15 Ile Asp Gly Lys Ile Asn Asp Trp Glu Glu Pro Arg Leu Asp Ile Glu 20 25 30 Gly Phe Vai vai Asp Tyr Phe Thr His Arg Ile Arg Gin Asn Gly Met 35 40 45 Glu Trp Phe Gly Ala Pro Gly Leu Pro Cys Gly val Gin Pro Glu His 50 55 60 Glu Met Met Arg Vai Met Gly Thr Ile Phe Glu Lys Lys His Ala Glu 65 70 75 80 Asn Phe Glu Thr Phe Cys Glu Gin Leu Leu Ala Val Pro Arg Ile Ser 85 90 95 Phe Ser Leu Tyr Gin Asp Vai Val Arg Thr Val Gly Asn Ala Gin Thr 100 105 110 Asp Gin Cys Pro Met Ser Tyr Gly Arg Leu Ile Gly Leu Ile Ser Phe 115 120 125 Gly Gly Phe Vai Ala Ala Lys Met Met Glu Ser Val Glu Leu Gin Gly 130 135 140 Gin Vai Arg Asn Leu Phe val Tyr Thr Ser Leu Phe Ile Lys Thr Arg 145 150 155 160 lie Arg Asn Asn Trp Lys Glu His Asn Arg Ser Trp Asp Asp Phe Met 165 170 175 Thr Leu Gly Lys Gin Met Lys Glu Asp Tyr Glu Arg Ala Glu Ala Glu 180 18 5 190 Lys Vai Gly Arg Arg Lys Gin Asn Arg Arg Trp Ser Met Ile Gly Ala 195 200 205 Gly Vai Thr Ala Gly Ala Ile Gly Ile val Gly Val Val Val Cys Gly 210 215 220 Arg Met Met Phe Ser Leu Lys 225 230

<210> 47 <211> 270 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Sequência de consenso <221> VARIANTE <222> 77, 114, 123, 168, 221 <223> Xaa = qualquer aminoácido <400> 47

Met 1 Ala Ala Pro Gin 5 Asp Val His Val Arg 10 Ile Cys Asn Gin Glx 15 Ile val Lys Phe Asp 20 Leu Glu Val Lys Ala 25 Leu Ile Gin Asp Ile 30 Arg Asp Cys Ser Gly 35 Pro Leu Ser Ala Leu 40 Thr Glu Leu Asn Thr 45 Lys Val Lys Glu Lys 50 Phe Gin Gin Leu Arg 55 His Arg Ile Gin Pro 60 Val Leu Tyr Gin Arg 65 Ala Thr Ile Asn Glx 70 Ala Ser Thr lie Thr 75 Thr Xaa Leu Tyr Tyr 80 Glu Leu Thr Asp Phe 85 Ser Ser Thr Gin Asn 90 Asp Phe Asn Ser Pro 95 Thr Tyr Phe Val Thr 100 Phe Ser Asp Leu Glx 105 Gin Leu Ala Lys Glx 110 Gin Asp Lys Xaa Ser 115 Glu Lys Gin Leu Leu 120 Leu Gin Xaa Val Glu 125 Asn Arg Lys Lys Gin 130 Asn Leu Lys Asn Gin 135 Ala Ser Trp Arg Lys 140 Ala Asn Leu Thr Cys 145 Lys Leu Ala Ile Asp 150 Asn Ile Arg Lys Ala 155 Asn Leu Leu Gin Gin 160 Gin Asp Leu Leu Ala 165 Gin Arg Xaa Thr Tyr 170 Lys Lys Ser Leu Ala 175 Gin 77 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Tyr Ser Ser Thr Ile Thr Lys Ser Leu Asn Gly Ile Ser Arg Gin Lys 1ΘΟ 185 190

Ala Gin Gin Vai Gin Gin Ser Glu Glu Ala Asn Gin Ser Leu Vai Thr 195 200 205

Ser Ser Arg Thr Ile Leu Asp Ala Lys Glu Glu Thr Xaa Ser Asn Ser 210 215 220

Gin Thr Ile Gin Leu Gin Arg Lys Leu Ile Thr Lys Tyr Met Arg Arg 225 230 235 240

Glx Leu Thr Asp Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Leu Arg Leu Thr Leu 245 250 255

Ala Thr Vai Leu Tyr Ile Vai Lys Lys Arg Leu Phe Pro Phe _260_265_270_ <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 48 Lys Ala Glu Leu Leu Gin Gly Gly Asp Lys Lys Arg Gin Arg 1 s 10 <210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 49 Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Vai Ser 1 5 10 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 50 Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Leu Cys 1 5 10 <210> 51 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 51 Ala Arg His Leu Ala Gin Vai Gly Asp Ser Met Asp Arg Ser 1 5 10 78 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

<210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <4 0 0> 52 Gly Arg Gin Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg 1 5 10 <210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 53 Ala Ala Arg Leu Lys Ala Leu Gly Asp Glu Leu His Gin Arg 1 5 10 <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 54 Ser Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn 1 5 iO <210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 55 Ala Gin Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn Ala Tyr 1 5 10 <210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 56 Cys Thr Vai Leu Leu Arg Leu Gly Asp Glu Leu Glu Gin Ile 1 5 10 79 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210> 57 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural < 4 0 0 > 57 Lys Gin Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu Leu Arg 1 5 10 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 58 His Leu Thr Leu Arg Gin Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg 1 5 10 <210> 59 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 59 Leu Glu Thr Leu Arg Arg Vai Gly Asp Gly Vai Gin Arg Asn 1 5 10 <210> 60 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60

Met Glu Pro Ser Gin Cys Vai Glu Glu Leu Glu Asp Asp Vai Phe Gin 1 5 10 15 Pro Glu Asp Gly Glu Pro Vai Thr Gin Pro Gly Ser Leu Leu Ser Ala 20 25 30 Asp Leu Phe Ala Gin Ser Leu Leu ASp Cys Pro Leu Ser Arg Leu Gin 35 40 45 Leu Phe Pro Leu Thr His Cys Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Thr Ser 50 55 60 Gin Glu Asp Lys Ala Thr Gin Thr Leu Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro 65 70 75 80 Gly Vai Met Leu Pro Cys Gly Vai Thr Glu Glu Pro Gin Arg Leu Phe 85 90 95 Tyr Gly Asn Ala Gly Tyr Arg Leu Pro Leu Pro Ala Ser Phe Pro Ala 100 105 110 Vai Leu Pro Ile Gly Glu Gin Pro Pro Glu Gly Gin Tyr Gin His Gin 115 120 125 Ala Glu Vai Gin lie Ala Arg Lys Leu Gin Cys Ile Ala Asp Gin Phe 130 135 14 0 His Arg Leu His Vai Gin Gin His Gin Gin Asn Gin Asn Pro Vai Trp 145 150 155 160 Asn Gin Ile Leu Leu Phe Leu His Asn Leu Ala Leu Asn Gly Glu Glu 165 170 175 Asn Pro Asn Gly Ala Gly Pro Arg 180 80 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

<210> 61 <211> 185 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61

Met Glu Pro Pro Gin Cys Vai Glu Glu Leu Glu Asp Asp Vai Phe Gin 1 .5 10 15 Ser Glu Asp Gly Glu Pro Gly Thr Gin Pro Gly Gly Leu Leu Ser Ala 20 25 30 Asp Leu Phe Ala Gin Ser Gin Leu Asp Cys Pro Leu Ser Arg Leu Gin 35 40 45 Leu Phe Pro Leu Thr His Cys Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Ile Ser 50 55 60 Gin Glu Asp Lys Ala Thr Gin Thr Leu Ser Pro Ala Ser Pro Ser Gin 65 70 75 80 Gly Vai Met Leu Pro Cys Gly Vai Thr Glu Glu Pro Gin Arg Leu Phe 85 90 95 Tyr Gly Asn Ala Gly Tyr Arg Leu Pro Leu Pro Ala Ser Phe Pro Ala 100 105 110 Gly Ser Pro Leu Gly Glu Gin Pro Pro Glu Gly Gin Phe Leu Gin His 115 120 125 Arg Ala Glu Vai Gin Ile Ala Pro Lys Leu Gin Cys Ile Ala Asp Gin 130 135 140 Phe His Arg Leu His Thr Gin Gin His Gin Gin Asn Arg Asp Arg Ala 145 150 155 160 Trp Asn Gin Vai Phe Leu Phe Leu Gin Asn Leu Ala Leu Asn Arg Gin 165 170 175 Glu Asn Pro Glu Gly Vai Gly Pro Trp 1B0 185

<210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 62

Ile Ala Arg Lys Leu Gin Cys Ile Ala Asp Gin Phe His Arg Leu 1 5 io 15

<210> 63 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 63___

Ile Ala Gin Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Phe Asn Ala Tyr 1 5 10

<210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural 81 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 64_

Ile Gly Ser Lys Leu Ala Ala Cys Asp Phe Asp Ala Gin 15 10

<210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 65

Gly Arg Gin Leu Ala Ile He Gly Asp Asn Arg Arg 15 10

<210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 66

Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Asp Ser Asn 15 10 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência <220> <223> Péptido de <400> 67 Ala Leu Leu Ala Cys 1 5 Artificial ocorrência natural Ile Gly Asp Asp Vai Ser 10 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 68 Thr Ala Ala Leu Lys Ala Gly Asp His Gin Arg 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 69 Gly Arg Glu Leu Arg Arg Ser Asp Phe Vai Asp 1 5 10 82 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

<210> 70 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 70

Ser Ser Ala Ala Glu Glu Leu Ala Ala Ala Leu Arg Arg Ile Gly Asp 15 10 15

Glu Leu Asp Arg Arg Tyr 20

<210> 71 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 71

Glu Gly Pro Ala Asp Pro Leu His Gin Ala Met Arg Ala Ala Gly Asp 1 5 10-15

Glu Phe Glu Thr Arg Phe _20__ _

<210> 72 <211> 24 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 72_

Leu Gin Pro Ser Ser Thr Met Gly Gin Vai Gly Arg Gin Leu Ala Ile 15 10 15

Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg 20

<210> 73 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 73

Gin Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly 15 10 15

Asp Glu Leu Asp Ser Asn 20

<210> 74 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural 83 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 74

Ala Leu Ser Pro Pro Vai Vai His Leu Ala Leu Arg Gin Ala Gly Asp .1 5 10 15

Asp Phe Ser Arg Arg Tyr _20 _

<210> 75 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 75

Asn Leu Trp Ala Ala Gin Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser 15 10 15

Asp Glu Phe Vai Asp Ser Phe Lys Lys 20 25

<210> 76 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 76

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gin Vai Gly Asp 15 10 15

Ser Met Asp Arg Ser Ile 20

<210> 77 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 77

Glu Vai Ile Pro Met Ala Ala Vai Lys Gin Ala Leu Arg Glu Ala Gly 1 5' 10 15

Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr _20_ _

<210> 78 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 78

Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met 15 10 15

Asp Vai Ser Leu 20 84 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210> 79 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 79 Met Arg Pro Glu Ile Trp Ile Ala Gin Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp 1 5 10 15

Glu Phe Asn Ala Tyr Tyr 20

<210> 80 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 80

Ser Ser Ala Ala Gin Leu Thr Ala Ala Arg Leu Lys Ala Leu Gly Asp 15 10 IS

Glu Leu His Gin Arg Thr _20____

<210> 81 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 81___

His Gin Ala Glu Vai Gin lie Ala Arg Lys Leu Gin Cys Ile Ala Asp l 5 10 15

Gin Phe His Arg Leu His 20

<210> 82 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 82

Ile Glu Arg Arg Lys Glu Vai Glu Ser Ile Leu Lys Lys Asn Ser Asp 15 10 15

Trp Ile Trp Asp Trp Ser 20

<210> 83 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural 85 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 83__

Gly Arg Leu Ala Glu Vai Cys Ala Vai Leu Leu Arg Leu Gly Asp Glu 1 5 10 .15

Leu Glu Met Ile Arg Pro _20_

<210> 84 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 84_

Leu Ala Glu Vai Cys Thr Vai Leu Leu Arg Leu Gly Asp Glu Leu Glu 1 5 10 15

Gin Ile Arg

<210> 85 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 85

Met Thr Vai Gly Glu Leu Ser Arg Ala Leu Gly His Glu Asn Gly Ser 1 5 10 15

Leu Asp Pro <210> 86 <211> 23 <212> PRT <213> Sequênc ia Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 86 Ala Thr Ser Arg Lys Leu Glu Thr Leu Arg Arg Vai Gly Asp Gly Vai 1 5 10 15

Gin Arg Asn His Glu Thr Ala 20 <210> 87 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência <400> 87

Ser Ser Ala Ala Gin Leu Thr Ala Ala Arg Leu Lys Ala Leu Gly Asp 1 5 10 15

Glu Leu His Gin Arg Thr _20_

<210> 88 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial 86 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <2 2 0 > <223> Péptido de ocorrência natural <400> 88_

Glu Gin Trp Ala Arg Glu Ile Gly Ala Gin Leu Arg Arg Met Ala Asp 15 10 15

Asp Leu Asn Ala Gin. Tyr 20

<210> 89 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 89

Ala Glu Leu Pro Pro Glu Phe Ala Ala Gin Leu Arg Lys Ile Gly Asp 15 10 15

Lys Vai Tyr Cys Thr Trp 20

<210> 90 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 90

Pro Ala Asp Leu Lys Asp Glu Cys Ala Gin Leu Arg Arg ile Gly Asp 15 10 15

Lys Val Asn Leu Arg Gin _20_

<210> 91 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 91_

Val Val Glu Gly Glu Lys Glu Val Glu Ala Leu Lys Lys Ser Ala Asp 1 5 10 15

Trp Val Ser Asp Trp Ser _20_

<210> 92 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 13, 17 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" 87 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparigina <221> VARIANTE <222> (1)...(23) <223> Xaa = Qualquer Aminoácido <400> 92

Glu Asp lie ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Gly Asp 15 10 15

Xaa Xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 93 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = L-asparagina <400> 93

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Gly Asp Xaa 15 10 15

Xaa Asp Arg Ser Ile 20

<210> 94 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 13, 17 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparagina <400> 94_

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Glu Asp 15 10 15

Xaa xaa Asp Arg Ser Ile Trp _20_

<210> 95 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial 88 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = L-asparagina <400> 95

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Glu Asp Xaa 1 5 10 15

Xaa Asp Arg Ser Ile 20

<210> 96 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = L-asparagina <400> 96

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Ser Asp Xaa 1 5 10 15

Xaa Asp Arg Ser Ile Trp _20_

<210> 97 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = L-asparagina <400> 97

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala' Arg His Leu Ala Xaa Vai Gly Asp Xaa 1 5 10 15

Xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20 89 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

<210> 98 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = L-asparagina <400> 98______

Asp Ile Ile Arg Asn ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Glu Asp Xaa 1 5 10 15

Xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 99 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural

<221> VARIANTE <222> 8, 12 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparagina <400> 99

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Gly Asp 15 10 15

Ser Xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 100 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 7, 11 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = L-asparagina 90 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ < 4 0 0 > 100_ ' Asp Ile Ile Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Gly Asp Ser 15 10 15

Xaa Asp Arg Ser Ile 20

<210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 4, 8 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 101

Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Gly Asp Ser Xaa Asp Arg 1 5 10 15

Trp

<210> 102 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural

<221> VARIANTE <222> 8, 12 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparagina <400> 102_

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Glu Asp 15 10 15

Ser Xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 103 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 7, 11 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = L-asparagina 91 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 103_

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Gly Asp Ser 15 10 15

Xaa Asp Arg Ser Ile Trp _20_

<210> 104 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 7, 11 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = L-asparagina <400> 104

Asp ile Ile Arg Asn ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Glu Asp Ser l 5 10 15

Xaa Asp Arg Ser Ile _20_

<210> 105 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 9, 13 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparagina <400> 105

Glu Asp Ile Ile Arg Asn He Ala Xaa His Leu Ala Xaa Vai Gly Asp 15 10 15

Ser Xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 106 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 10, 17 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" 92 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparagina <400> 106_

Glu Asp Ile Ile Arg Asn ile Ala Arg Xaa Leu Ala Gin Vai Gly Asp 1 5 10 15

Xaa Xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 107 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 5, 9, 13, 17 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparagina <400> 107

Glu Asp Ile Ile Xaa Asn Ile Ala Xaa His Leu Ala Xaa vai Gly Asp 1 5 10 15

Xaa Xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 108 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 14, 18 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 15 <223> Xaa = L-asparagina <400> 108

Asn Leu Trp Ala Ala Gin Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Xaa Xaa Ser 15 10 15

Asp Xaa Phe Vai Asp Ser Phe Lys Lys _20_25_

<210> 109 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <220> 93 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = L-asparagina <400> 109

Asp lie Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Ala Ala Xaa Vai Gly Ala Xaa 15 10 15

Xaa Asp Arg Ser Ile 20

<210> 110 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = L-asparagina <400> 110

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Ala Ala Xaa vai Glu Ala xaa 1 5 10 15

Xaa Asp Arg Ser ile 20

<210> 111 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 9, 13 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 111_

Ile Trp Ile Ala Gin Glu Leu Arg Xaa Ile Gly Asp Xaa Phe Asn Ala 1 5 10 15

Tyr Tyr Ala Arg Arg 20

<210> 112 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural 94 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = L-asparagina <400> 112____

Glu.Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gin Vai GÍy Asp 1 5 10 15

Ser Xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20 <210> 113 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 13, 17 <223> Xaa = enantiómeros S do aminoácido olefinico de 5 carbonos <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparagina <400> 113

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xáa Vai Gly Asp 15 10 15

Xaa Xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 114 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 13, 17 <223> Xaa = enantiómeros S do aminoácido olefinico de 5 carbonos <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparagina <400> 114

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Glu Asp 15 10 15 xaa xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 115 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural 95 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

<221> VARIANTE <222> 8, 12 <223> Xaa = enantiómeros S do aminoácido olefínico de 5 carbonos <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparagina <400> 115

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Glu Asp 1 5 10 15

Ser Xaa Asp Arg Ser ile Trp _20_ <210> 116 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 9, 13 <223> Xaa = enantiómeros S do aminoácido olefínico de 5 carbonos <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparagina <400> 116

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Xaa His Leu Ala xaa Vai Glu Asp 15 10 15

Ser Xaa Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 117 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 10 <223> Xaa = enantiómeros R do aminoácido olefínico de 5 carbonos <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = enantiómero S do aminoácido olefínico de 8 carbonos <221> VARIANTE <222> 18 <223> Xaa = L-asparagina <400> 117

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg Xaa Leu Ala Gin Vai Glu Asp 15 10 15

Xaa Xaa Asp Arg Ser Ile Trp _20__ 96 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> DANA-FARBER CÂNCER INSTITUTE, INC.

<210> 1 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met Ala 1 Arg Ala Arg 5 Gin Glu Gly Ser Ser 10 Pro Glu Pro Val Glu 15 Gly Leu Ala Arg Asp Gly 20 Pro Arg Pro Phe 25 Pro Leu Gly Arg Leu 30 Val Pro Ser Ala Vai 35 Ser Cys Gly Leu Cys 40 Glu Pro Gly Leu Ala 45 Ala Ala Pro Ala Ala SO Pro Thr Leu Leu Pro 55 Ala Ala Tyr Leu Cys 60 Ala Pro Thr Ala Pro Pro 65 Ala Vai Thr Ala 70 Ala Leu Gly Gly Ser 75 Arg Trp Pro Gly Gly 80 Pro Arg Ser Arg Pro 85 Arg Gly Pro Arg Pro 90 Asp Gly Pro Gin Pro 9S Ser Leu Ser Leu Ala Glu 100 Gin His Leu Glu 105 Ser Pro val Pro Ser 110 Ala Pro Gly Ala Leu 115 Ala. Gly Gly Pro Thr 120 Gin Ala Ala pro Gly 125 Val Arg Gly Glu Glu 130 Glu Gin Trp Ala Arg 135 Glu Ile Gly Ala Gin 14 0 Leu Arg Arg Met Ala Asp 14 5 Asp Leu Asn Ala 150 Gin Tyr Glu Arg Arg 155 Arg Gin Glu Glu Gin 160 Gin Arg HiS Arg Pro 165 Ser Pro Trp Arg Vai 170 Leu Tyr Asn Leu Ile 175 Met Gly Leu Asn Leu Pro Leu 180 Pro Arg Gly His 185 Arg Ala Pro Glu Met 190 Glu Pro

<210> 2 <211> 193 <212> PRT <213> Mus musculus 97 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 2

Met 1 Ala Arg Ala Arg 5 Gin Glu Gly Ser Ser 10 Pro Glu Pro Vai Glu Gly 15 Leu Ala Arg Asp 20 Ser Pro Arg Pro Phe 25 Pro Leu Gly Arg Leu 30 Met Pro Ser Ala Vai 35 Ser Cys Ser Leu Cys 40 Glu Pro Gly Leu Pro 45 Ala Ala Pro Ala Ala 50 Pro Ala Leu Leu Pro 55 Ala Ala Tyr Leu Cys 60 Ala Pro Thr Ala Pro 65 Pro Ala Vai Thr Ala 70 Ala Leu Gly Gly Pro 75 Arg Trp Pro Gly Gly 80 His Arg Ser Arg Pro 85 Arg Gly Pro Arg Pro Asp 90 Gly Pro Gin Pro Ser 95 Leu Ser Pro Ala 100 Gin Gin His Leu Glu 105 Ser Pro Vai Pro Ser 110 Ala Pro Glu Ala Leu 115 Ala Gly Gly Pro Thr 120 Gin Ala Ala Pro Gly 125 Vai Arg Vai Glu Glu 130 Glu Glu Trp Ala Arg 135 Glu Ile Gly Ala Gin 140 Leu Arg Arg Met Ala 145 Asp Asp Leu Asn Ala 150 Gin Tyr Glu Arg Arg 155 Arg Gin Glu Glu Gin 160 His Arg His Arg Pro 165 Ser Pro Trp Arg Vai 170 Met Tyr Asn Leu Phe Met 175 Gly Asn Leu Leu Pro 180 Leu Pro Arg Gin Pro 185 Gly Ala Pro Glu Met 190 Glu Pro

<210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 3

Trp Ala Arg Glu Ile Gly Ala Gin Leu Arg Arg Met Ala Asp Asp Leu 1 S 10 15

Asn Ala Gin Tyr _20_

<210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 4_

Ile Gly Tyr Glu Ile Gly ser Lys Leu Ala Ala Met Cys Asp Asp Phe l 5 10 15

Asp Ala Gin Met . 20

<210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural 98 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 5_

Ala Ala Gin Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Phe 1 S 10 15

Vai Asp Ser Phe _20_ _ _ <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência <400> 6

Pro Glu Ile Trp Ile Ala Gin Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe 15 10 15

Asn Ala Tyr Tyr 20 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 7 Ile lie Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gin Vai Gly Asp Ser Met 1 5 10' 15

Asp Arg Ser Ile 20

Gly Ser Asp Ala Leu Alá Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met 1 ‘ 5 10 15

Asp Vai Ser Leu 20

<210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 9

Ala Ala Gin Leu Thr Ala Ala Arg Leu Lys Ala Leu Gly Asp Glu Leu 1 5 10 15

His Gin Arg Thr 20 99 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 10 Ala Leu í Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val Ser 1 5 10 15 Leu Arg <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 11 Trp Ile Ala Gin Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn Ala Tyr 1 5 10 15

Tyr Ala

<210 > 12 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 12_

Glu Cys Ala Thr Gin Leu Arg Arg Phe Gly Asp Lys Leu Asn Phe Arg 1 5 10 15

Gin Lys

<210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 13_

Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gin Vai Gly Asp Ser Met Asp Arg ser 15 10 15

Ile Pro___

<210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 14_

Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Phe Vai Asp Ser 1 5 10 15

Phe Lys 100 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

<210 > 15 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 15

Glu Ile Gly Ser Lys Leu Ala Ala Met Cys Asp Asp Phe Asp Ala Gin 1 5 10 15

Met Met

<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Leu Asp Ala Leu Gly His Glu Leu Pro 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Leu Glu Vai Leu Gly Arg Glu Leu Pro 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Leu Ala Gin Vai Gly Asp Ser Met Asp 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Leu Ala Gin lie Gly Asp Glu Met Asp 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 101 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <4 0 0> 21 Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn 1 S <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 22 Leu Lys i Ala Leu Gly Asp Glu Leu His 1 5 <210 > 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 23 Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Phe Vai 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 24 Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn 1 5 <210 > 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 25 Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 26 Leu Leu Arg Leu Gly Asp Glu Leu Glu 1 5 <210 > 27 <211> 351 <212> PRT <213> Homo sapiens 102 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 27

Met Thr Leu Arg Leu Leu Glu Asp Trp Cys Arg Gly Met Asp Met Asn 1 5 10 15 Pro Arg Lys Ala Leu Leu Ile Ala Gly Ile Ser Gin Ser Cys Ser Val 20 25 30 Ala Glu Ile Glu Glu Ala Leu Gin Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Glu 35 40 45 Tyr Arg Leu Leu Gly Arg Met Phe Arg Arg Asp Glu Asn Arg Lys Val 50 55 60 Ala Leu Vai Gly Leu Thr Ala Glu Thr Ser His Ala Leu Val Pro Lys €5 70 75 80 Glu Ile Pro Gly Lys Gly Gly Ile Trp Arg Val iie Phe Lys Pro Pro 85 90 95 Asp Pro Asp Asn Thr Phe Leu Ser Arg Leu Asn Glu Phe Leu Ala Gly 100 105 110 Glu Gly Met Thr Vai Gly Glu Leu Ser Arg Ala Leu Gly His Glu Asn 115 120 125 Gly Ser Leu Asp Pro Glu Gin Gly Met Ile Pro Glu Met Trp Ala Pro 130 135 14 0 Met Leu Ala Gin Ala Leu Glu Ala Leu Gin Pro Ala Leu Gin Cys Leu 145 150 155 160 Lys Tyr Lys Lys Leu Arg Vai Phe Ser Gly Arg Glu Ser Pro Glu Pro 165 17 0 175 Gly Glu Glu Glu Phe Gly Arg Trp Met Phe His Thr Thr Gin Met Ile 1B0 185 190 Lys Ala Trp Gin Vai Pro Asp Vai Glu Lys Arg Arg Arg Leu Leu Glu 195 200 205 Ser Leu Arg Gly Pro Ala Leu Asp Vai Ile Arg Val Leu Lys Ile Asn 210 215 220 Asn Pro Leu Ile Thr Vai Asp Glu Cys Leu Gin Ala Leu Glu Glu Val 225 230 23S 240 Phe Gly Vai Thr Asp Asn Pro Arg Glu Leu Gin val Lys Tyr Leu Thr 245 250 255 Thr Tyr His Lys Asp Glu Glu Lys Leu Ser Ala Tyr Val Leu Arg Leu 260 265 270 Glu Pro Leu Leu Gin Lys Leu Vai Gin Arg Gly Ala Ile Glu Arg Asp 275 280 285 Ala Vai Asn Gin Ala Arg Leu Asp Gin Val ile Ala Gly Ala Val His 290 295 300 Lys Thr Ile Arg Arg Glu Leu Asn Leu Pro Glu Asp Gly Pro Ala Pro 305 310 315 320 Gly Phe Leu Gin Leu Leu Vai Leu Ile Lys Asp Tyr Glu Ala Ala Glu 325 330 335 Glu Glu Glu Ala Leu Leu Gin Ala Ile Leu Glu Gly Asn Phe Thr 340 345 350

<210> 28 <211> 352 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28

Met 1 Thr Leu Arg Leu 5 Leu Glu Asp Trp Cys 10 Arg Gly Met Asp Met 15 Asn Pro Arg Lys Ala 20 Leu Leu Val Ala Gly Ile 25 Pro Pro Thr Cys 30 Gly Val Ala Asp Ile 35 GlU Glu Ala Leu Gin 40 Ala Gly Leu Ala Pro 45 Leu Gly Glu His Arg 50 Leu Leu Gly Arg Met 55 Phe Arg Arg Asp Glu 60 Asn Lys Asn Val Ala 65 Leu Ile Gly Leu Thr 70 Val Glu Thr Gly Ser 75 Ala Leu Val Pro Lys 80 Glu Ile Pro Ala Lys 85 Gly Gly val Trp Arg 90 Val Ile Phe Lys Pro 95 Pro 103 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Asp Thr Asp Ser Asp Phe Leu Cys Arg Leu Asn Glu Phe Leu Lys Gly 100 105 110 Glu Gly Met Thr Met Gly Glu Leu Thr Arg Val Leu Gly Asn Arg Asn 115 120 125 Asp Pro Leu Gly Leu Asp Pro Gly Ile Met Ile Pro Glu Ile Arg Ala 130 135 140 Pro Met Leu Ala Gin Ala Leu Asn Glu Ala Leu Lys Pro Thr Leu Gin 14 5 150 155 160 Tyr Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Ser val Phe Ser Gly Arg Asp Pro Pro 165 170 175 Gly Pro Gly Glu Glu Glu Phe Glu Ser Trp Met Phe His Thr Ser Gin 180 18 5 190 Vai Met Lys Thr Trp Gin Val Ser Asp Val Glu Lys Arg Arg Arg Leu 195 200 205 Ile Glu Ser Leu Arg Gly Pro Ala Phe Glu Ile Ile Arg Val Leu Lys 210 215 220 Ile Asn Asn Pro Phe Ile Thr Val Ala Glu Cys Leu Lys Thr Leu Glu 225 230 235 240 Thr Ile Phe Gly Ile Ile Asp Asn Pro·Arg Ala Leu Gin Val Lys Tyr 245 250 255 Leu Thr Thr Tyr Gin Lys Thr Asp Glu Lys Leu Ser Ala Tyr Val Leu 260 265 270 Arg Leu Glu Pro Leu Leu Gin Lys Leu Val Gin Lys Gly Ala Ile Glu 275 280 285 Lys Glu Val Val Asn Gin Ala Arg Leu Asp Gin Val Ile Ala Gly Ala 290 295 300 Vai His Lys Ser Val Arg Arg Glu Leu Gly Leu Pro Glu Gly Ser Pro 305 310 315 320 Ala Pro Gly Leu Leu Gin Leu Leu Thr Leu Ile Lys Asp Lys Glu Ala 325 330 335 Glu Glu Glu Glu Val Leu Leu Gin Ala Glu Leu Glu Gly Tyr Cys Thr 340 345 350 <210> 29 <211> 329 <212> PRT <213> Home ) sapie: ns <400> 29 Met Ala Met Thr Leu Leu Glu Asp Trp Cys Arg Gly Met Asp Val Asn 1 5 10 15 Ser Gin Arg Xaa Leu Leu Val Trp Gly ile Pro Val Asn Cys Asp Glu 20 25 30 Ala Glu Ile Glu Glu Thr Leu Gin Ala Ala Met Pro Gin Val Ser Tyr 35 40 45 Arg Met Leu Gly Arg Met Phe Trp Arg Glu Glu Asn Ala Lys Ala Ala 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Thr Gly Ala Val Asp Tyr Ala Ala Ile Pro Arg Glu 65 70 75 80 Met Pro Gly Lys Gly Gly Val Trp Lys Val Leu Phe Lys Pro Pro Thr 85 90 95 Ser Asp Ala Glu Phe Leu Glu Arg Leu HÍS Leu Phe Leu Ala Arg Glu 100 105 110 Gly Trp Thr Val Gin Asp Val Ala Arg Val Leu Gly Phe Gin Asn Pro 115 120 125 Thr Pro Thr Pro Gly Pro Glu Met Pro Ala Glu Met Leu Asn Tyr Ile 130 135 140 Leu Asp Asn Val Ile Gin Pro Leu Val Glu Ser Ile Trp Tyr Lys Arg 145 150 155 160 Leu Thr Leu Phe Ser Gly Arg Asp Ile Pro Gly Pro Gly Glu Glu Thr 165 170 175 Phe Asp Pro Trp Leu Glu His Thr Asn Glu Val Leu Glu Glu Trp Gin 180 185 190 Val Ser Asp Val Glu Lys Arg Arg Arg Leu Met Glu Ser Leu Arg Gly 195 200 205 104 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Pro Ala Ala Asp Vai Ile Arg Ile Leu Lys Ser Asn Asn Pro Ala Ile 210 215 220 Thr Thr Ala Glu Cys Leu Lys Ala Leu Glu Gin Vai Phe Gly Ser Vai 225 230 235 240 Glu Ser Ser Arg Asp Ala Gin Ile Lys Phe Leu Asn Thr Tyr Gin Asn 245 250 255 Pro Gly Glu Lys Leu Ser Ala Tyr Vai Ile Arg Leu Glu Pro Leu Leu 260 265 270 Gin Lys Vai Vai Glu Lys Gly Ala Ile Asp Lys Asp Asn Vai Asn Gin 275 260 285 Ala Arg Leu Glu Gin Vai Ile Ala Gly Ala Asn His Ser Gly Ala Ile 290 295 300 Arg Arg Gin Leu Trp Leu Thr Gly Ala Gly Glu Gly Pro Gly Pro Lys 305 310 315 320 Pro Leu Ser Vai Ala Gly Ala Asp Pro 325

<210> 30 <211> 364 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30

Met Ala Leu Ala Leu Leu Glu Asp Trp Cys Arg Ile Met Ser Val Asp 1 5 10 15 Glu Gin Lys Ser Leu Met Vai Thr Gly Ile Pro Ala Asp Phe Glu Glu 20 25 30 Ala Glu Ile Gin Glu Vai Leu Gin Glu Thr Leu Lys Ser Leu Gly Arg 35 40 45 Tyr Arg Leu Leu Gly Lys Ile Phe Arg Lys Gin Glu Asn Ala Asn Ala 50 55 60 Vai Leu Leu Glu Leu Leu Glu Asp Thr Asp Val Ser Ala Zle Pro Ser 65 70 75 80 Glu Vai Gin Gly Lys Gly Gly Val Trp Lys Val Ile Phe Lys Thr Pro 85 90 95 Asn Gin Asp Thr Glu Phe Leu Glu Arg Leu Asn Leu Phe Leu Glu Lys 100 105 110 Glu Gly Gin Thr Vai Ser Gly Met Phe Arg Ala Leu Gly Gin Glu Gly 115 120 125 Vai Ser Pro Ala Thr Vai Pro Cys Ile Ser Pro Glu Leu Leu Ala His 130 135 140 Leu Leu Gly Gin Ala Met Ala His Ala Pro Gin Pro Leu Leu Pro Met 145 150 155 160 Arg Tyr Arg Lys Leu Arg Vai Phe Ser Gly Ser Ala Val Pro Ala Pro 165 170 175 Glu Glu Glu Ser Phe Glu Vai Trp Leu Glu Gin Ala Thr Glu Ile Val 180 185 190 Lys Glu Trp Pro Vai Thr Glu Ala Glu Lys Lys Arg Trp Leu Ala Glu 195 200 205 Ser Leu Arg Gly Pro Ala Leu Asp Leu Met His Ile Val Gin Ala Asp 210 215 220 Asn Pro Ser Ile Ser Vai Glu Glu Cys Leu Glu Ala Phe Lys Gin Val 225 230 235 240 Phe Gly Ser Leu Glu Ser Arg Arg Thr Ala Gin val Arg Tyr Leu Lys 245 250 255 Thr Tyr Gin Glu Glu Gly Glu Lys Val Ser Ala Tyr Val Leu Arg Leu 260 265 270 Glu Thr Leu Leu Arg Arg Ala Val Glu Lys Arg Ala Ile Pro Arg Arg 275 280 285 Ile Ala Asp Gin Vai Arg Leu Glu Gin Val Met Ala Gly Ala Thr Leu 290 295 300 Asn Gin Met Leu Trp Cys Arg Leu Arg Glu Leu Lys Asp Gin Gly Pro 305 310 315 320 Pro Pro Ser Phe Leu Glu Leu Met Lys Val Ile Arg Glu Glu Glu Glu 325 330 335 Glu Glu Ala Ser Phe Glu Asn Glu Ser Ile Glu Glu Pro Glu Glu Arg 340 345 350 Asp Gly Tyr Gly Arg Trp Asn His Glu Gly Asp Asp 355 360 105 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

<210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Leu Ser Arg Ala Leu Gly His Glu 1 5

<210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32

Leu Thr Arg Vai Leu Gly Asn Arg _1_5_

<210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33

Leu Asp Ala Leu Gly His Glu 1 5

<210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34

Leu Glu Vai Leu Gly Arg Glu 1 5

<210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35

Leu Lys Ala Leu Gly Asp Glu 1 5

<210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36

Leu Ala Gin Vai Gly Asp Ser 1 5

<210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37_

Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu 1 5 106 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Leu Ala Gin Ile Gly Asp Glu 1 5 <210> 40 <211> 213 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 40

Met Glu Val Leu Arg Arg Ser Ser Val Phe Ala Ala Glu Ile Met Asp 1 Ala Phe Asp Arg 5 Ser Pro Thr Asp 10 Lys Glu Leu Val Ala Gin 15 Ala Lys Ala Leu Gly 20 Arg Glu Tyr Val His 25 Ala Arg Leu Leu Arg 30 Ala Gly Leu Ser Trp 35 Ser Ala Pro Glu Arg 40 Ala Ser Pro 45 Ala Pro Gly Gly Arg Leu Ala 50 Glu Val Cys Thr Val 55 Leu Leu Arg Leu 60 Gly Asp Glu Leu Glu Gin 65 Ile Arg Pro Ser Val 70 Tyr Arg Asn Val Ala 75 Arg Gin Leu His Ile 80 Pro Leu Gin Ser Glu 85 Pro Val Val Thr 90 Asp Ala Phe Leu Ala Val 95 Ala Gly His Ile Phe 100 Ser Ala Gly Ile Thr 105 Trp Gly Lys Val Val 110 Ser Leu Tyr Ser Val 115 Ala Ala Gly Leu Ala 120 Val Asp Cys 125 Val Arg Gin Ala Gin Pro Ala 130 Met Val His Ala Leu 135 Val Asp Cys Leu 140 Gly Glu Phe Val Arg Lys 145 Thr Leu Ala Thr Trp 150 Leu Arg 155 Arg Àrg Gly Gly Trp Thr Asp Val 160 Leu Lys Cys Val Val 165 Ser Thr Asp Pro 170 Gly Phe Arg Ser His Trp 175 Leu Val Ala Thr Leu 180 Cys Ser Phe Gly Arg 185 Phe Leu Lys Ala Ala 190 Phe Phe Leu 195 200 205

Leu Leu Pro Glu Arg 210

<210> 41 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens 107 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 41

Met Ala Ser Gly Gin Gly Pro Gly Pro Pro Arg Gin Glu Cys Gly Glu 1 5 10 15 Pro Ala Leu Pro ser Ala Ser Glu Glu Gin Val Ala Gin Asp Thr Glu 20 25 30 GlU val Phe Arg Ser Tyr Val Phe Tyr Arg His Gin Gin Glu Gin Glu 35 40 45 Ala Glu Gly Val Ala Ala Pro Ala Asp Pro Glu Met Val Thr Leu Pro 50 55 60 Leu Gin Pro Ser ser Thr Met Gly Gin Val Gly Arg Gin Leu Ala Ile 65 70 75 80 Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg Tyr Asp Ser Glu Phe Gin Thr Met 85 90 95 Leu Gin His Leu Gin Pro Thr Ala Glu Asn Ala Tyr Glu Tyr Phe Thr 100 105 110 Lys Ile Ala Thr Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ile Asn Trp Gly Arg Val 115 120 125 Val Ala Leu Leu Gly Phe Gly Tyr Arg Leu Ala Leu His Val Tyr Gin 130 135 140 HiS Gly Leu Thr Gly Phe Leu Gly Gin Val Thr Arg Phe Val Val Asp 145 150 155 160 Phe Met Leu His His Cys Ile Ala Arg Trp Ile Ala Gin Arg Gly Gly 165 170 175 Trp Val Ala Ala. Leu Asn Leu Gly Asn Gly Pro Ile Leu Asn Val Leu 180 185 190 val Val Leu Gly Val val Leu Leu Gly Gin Phe Val Val Arg Arg Phe 195 200 205 Phe Lys Ser 210 <210> 42 <211> 192 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 42 Met Asp Gly Ser Gly Glu Gin Pro Arg Gly Gly Gly Pro Thr Ser Ser 1 5 10 15 Glu Gin ile Met Lys Thr Gly Ala Leu Leu Leu Gin Gly Phe Ile Gin 20 25 30 Asp Arg Ala Gly Arg Met Gly Gly Glu Ala Pro Glu Leu Ala Leu Asp 35 40 45 Pro Val Pro Gin Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys 50 55 60 Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn Met Glu Leu Gin Arg Met Ile 65 70 75 80 Ala Ala Val Asp Thr Asp Ser Pro Arg Glu Val Phe Phe Arg Val Ala 85 90 95 Ala Asp Met Phe Ser Asp Gly Asn Phe Asn Trp Gly Arg Val Val Ala 100 105 110 Leu Phe Tyr Phe Ala Ser Lys Leu Val Leu Lys Ala Leu Cys Thr Lys 115 120 125 Val Pro Glu Leu Ile Arg Thr Ile Met Gly Trp Thr Leu Asp Phe Leu 130 135 14 0 Arg Glu Arg Leu Leu Gly Trp Ile Gin Asp Gin Gly Gly Trp Asp Gly 145 150 155 160 Leu Leu Ser Tyr Phe Gly Thr Pro Thr Trp Gin Thr Val Thr Ile Phe 165 170 175 Val Ala Gly Val Leu Thr Ala Ser Leu Thr Ile Trp Lys Lys Met Gly 180 185 190

<210> 43 <211> 192 <212> PRT <213> Rattus norvegicus 108 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 43

Met 1 Ala Thr Pro Ala 5 Ser Pro Asp Thr Arg 10 Ala Leu Vai Ala Asp 15 Phe Vai Gly Tyr Lys 20 Leu Arg Gin Lys Gly 25 Tyr Vai Cys Gly Ala 30 Gly Pro Gly Glu Gly 35 Pro Ala Ala Asp Pro 40 Leu His Gin Ala Met 45 Arg Ala Ala Gly Asp 50 Glu Phe Glu Thr Arg 55 Phe Arg Arg Thr Phe 60 Ser Asp Leu Ala Ala 65 Gin Leu HÍS Vai Thr 70 Pro Gly Ser Ala Gin 75 Gin Arg Phe Thr Gin 80 Vai Ser Asp Glu Leu 85 Phe Gin Gly Gly Pro 90 Asn Trp Gly Arg Leu 95 Vai Ala Phe Phe Vai 100 Phe Gly Ala Ala Leu 105 Cys Ala Glu Ser Vai 110 Asn Lys Glu Met Glu 115 Pro Leu Vai Gly Gin 120 Vai Gin Glu Trp Met 125 Vai Ala Tyr Leu Glu 130 Thr Arg Leu Ala Asp 135 Trp Ile His Ser Ser 140 Gly Gly Trp Ala Glu 145 Phe Thr Ala Leu Tyr 150 Gly Asp Gly Ala Leu 155 Glu Glu Ala Arg Arg 160 Leu Arg Glu Gly Asn 165 Trp Ala Ser Vai Arg 170 Thr Vai Leu Thr Gly 175 Ala Vai Ala Leu Gly 180 Ala Leu Vai Thr Vai 185 Gly Ala Phe Phe Ala 190 Ser Lys

<210> 44 <211> 194 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44

Met Ser Gin Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gin Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gin Phe Ser Asp val Glu Glu 20 2S 30 Asn Arg Thr Glu Ala Pro Arg Glu val ile Pro Met Ala Ala Val Lys 35 40 45 Gin Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg 50 55 60 Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gin Leu His Ile Thr Pro Gly Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Gin Ser Phe Glu Gin Vai Val Asn Glu Leu Phe Arg Asp Gly val 85 90 95 Asn Trp Gly Arg ile Vai Ala Phe phe Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys 100 105 110 Vai Glu Ser Vai Asp Lys Glu Met Gin Val Leu Val Ser Arg Ile Ala 115 120 125 Ala Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile Gin 130 135 140 Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe val Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala 145 150 155 160 Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gin Glu Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu 165 170 175 Thr Gly Met Thr Vai Ala Gly Val Val Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser 180 185 190 Arg Lys

<210> 45 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens 109 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 45

Mec Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu He Val Met 1 5 10 15 Lya Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gin Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Pro Ala Leu Ser 35 40 45 Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Ala Leu Arg Gin Ala Gly Asp Asp 50 55 60 Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Gly Asp Phe Ala Glu Met Ser Ser Gin Leu €5 70 75 80 Kls Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly Arg Phe Ala Thr val Val Glu 85 90 95 Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe 100 105 110 Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu Ser Val Asn Arg Glu Met Ser 115 120 125 Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg 130 135 140 His Leu His Thr Trp Ile Gin Asp Asn Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu 165 170 175 Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr 180 185 190 Leu Gly Ala Tyr Leu Ser His Lys 195 200

<210> 46 <211> 231 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 46

Ser Pro Ser Arg Gin Ala Ser Thr Arg Arg Met Ser Ile Gly Glu Ser 1 5 10 15 Ile Asp Gly Lys Ile Asn Asp Trp Glu Glu Pro Arg Leu Asp Ile Glu 20 25 30 Gly Phe Val val Asp Tyr Phe Thr His Arg Ile Arg Gin Asn Gly Met 35 40 45 Glu Trp Phe Gly Ala Pro Gly Leu Pro Cys Gly Val Gin Pro Glu His 50 55 60 Glu Met Met Arg Val Met Gly Thr Ile Phe Glu Lys Lys His Ala Glu 65 70 75 80 Asn Phe Glu Thr Phe Cys Glu Gin Leu Leu Ala val Pro Arg Ile Ser 85 90 95 Phe Ser Leu Tyr Gin Asp Val Val Arg Thr Val Gly Asn Ala Gin Thr 100 105 110 Asp Gin Cys Pro Met Ser Tyr Gly Arg Leu Ile Gly Leu Ile Ser Phe 115 120 125 Gly Gly Phe Val Ala Ala Lys Met Met Glu Ser Val Glu Leu Gin Gly 130 135 140 Gin Val Arg Asn Leu Phe val Tyr Thr Ser Leu Phe Ile Lys Thr Arg 145 150 155 160 Ile Arg Asn Asn Trp Lys Glu His Asn Arg Ser Trp Asp Asp Phe Met 165 170 175 Thr Leu Gly Lys Gin Met Lys Glu Asp Tyr Glu Arg Ala Glu Ala Glu 180 18 5 190 Lys Val Gly Arg Arg Lys Gin Asn Arg Arg Trp Ser Met Ile Gly Ala 195 200 205 Gly Val Thr Ala Gly Ala Ile Gly Ile Val Gly Val Val Val Cys Gly 210 215 220 Arg Met Met Phe Ser Leu Lys 225 230

<210> 47 <211> 270 <212> PRT <213> Sequência Artificial 110 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ < 2 2 0 >

Met Ala Ala Pro Gin Asp Vai His Val Arg Ile Cys Asn Gin Glx Ile 1 ' 5 10 15 Vai Lys Phe Asp Leu Glu Vai Lys Ala Leu Ile Gin Asp Ile Arg Asp 20 25 30 Cys Ser Gly Pro Leu Ser Ala Leu Thr Glu Leu Asn Thr Lys Val Lys 35 40 4S Glu Lys Phe Gin Gin Leu Arg His Arg Ile Gin Pro Val Leu Tyr Gin 50 55 60 Arg Ala Thr Ile Asn Glx Ala Ser Thr Ile Thr Thr xaa Leu Tyr Tyr 65 70 75 80 Glu Leu Thr Asp Phe Ser Ser Thr Gin Asn Asp Phe Asn Ser Pro Thr 85 90 95 Tyr Phe Vai Thr Phe Ser Asp Leu Glx Gin Leu Ala Lys Glx Gin Asp 100 105 110 Lys Gly Ser Glu Lys Gin Leu Leu Leu Gin Xaa Val Glu Asn Arg Lys 115 120 125 Lys Gin Asn Leu Lys Asn Gin Ala Ser Trp Arg Lys Ala Asn Leu Thr 130 135 140 Cys Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ile Arq Lys Ala Asn Leu Leu Gin Gin 145 150 155 160 Gin Asp Leu Leu Ala Gin Arg Xaa Thr Tyr Lys Lys Ser Leu Ala Gin 165 170 175 Tyr Ser Ser Thr Ile Thr Lys Ser Leu Asn Gly Ile Ser Arg Gin Lys 1Θ0 185 190 Ala Gin Gin Vai Gin Gin Ser Glu Glu Ala Asn Gin Ser Leu Val Thr 195 200 205 Ser Ser Arg Thr Ile Leu Asp Ala Lys Glu Glu Thr Xaa Ser Asn Ser 210 215 220 Gin Thr Ile Gin Leu Gin Arg Lys Leu Ile Thr Lys Tyr Met Arg Arg 225 230 235 240 Glx Leu Thr Asp Lys Leu Leu Ile Phe Leu Ala Leu Arg Leu Thr Leu 245 250 255 Ala Thr vai Leu Tyr Ile Val Lys Lys Arg Leu Phe Pro Phe 260 265 270

<210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 48

Lys Ala Glu Leu Leu Gin Gly Gly Asp Lys Lys Arg Gin Arg 15 10

<210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 49

Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Vai Ser 15 10 111 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 50 Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Leu Cys 1 5 10 <210> 51 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 51 Ala Arg His Leu Ala Gin Vai Gly Asp Ser Met Asp Arg Ser 1 5 10 <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 52 Gly Arg Gin Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg 1 5 10 <210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 53 Ala Ala Arg Leu Lys Ala Leu Gly Asp Glu Leu His Gin Arg 1 5 10

<210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 54

Ser Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn 15 10 112 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência <400> 55

Ala Gin Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn Ala Tyr 1 5 10 <210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 56 Cys Thr Vai Leu Leu Arg Leu Gly Asp Glu Leu Glu Gin Ile 1 5 10 <210> 57 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 57 Lys Gin Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu Leu Arg 1 5 10 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 58 His Leu Thr Leu Arg Gin Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg 1 5 10 <210> 59 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 59 Leu Glu Thr Leu Arg Arg Vai Gly Asp Gly Vai Gin Arg Asn 1 5 10 113 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

<210> 60 <211> 184 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60

Met Glu Pro Ser Gin Cys Vai Glu Glu Leu Glu Asp Asp Vai Phe Gin 1 5 10 15 Pro Glu Asp Gly Glu Pro Vai Thr Gin Pro Gly Ser Leu Leu Ser Ala 20 25 30 Asp Leu Phe Ala Gin Ser Leu Leu Asp Cys Pro Leu Ser Arg Leu Gin 35 40 45 Leu Phe Pro Leu Thr His Cys Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Thr Ser 50 55 60 Gin Glu Asp Lys Ala Thr Gin Thr Leu Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro ¢5 70 75 80 Gly Vai Met Leu Pro Cys Gly Vai Thr Glu Glu Pro Gin Arg Leu Phe 85 90 95 Tyr Gly Asn Ala Gly Tyr Arg Leu Pro Leu Pro Ala Ser Phe Pro Ala 100 105 110 Vai Leu Pro Ile Gly Glu Gin Pro Pro Glu Gly Gin Tyr Gin His Gin 115 120 125 i—1 < Glu Vai Gin Ile Ala Arg Lys Leu Gin Cys Ile Ala Asp Gin Phe 130 135 14 0 His Arg Leu His Vai Gin Gin His Gin Gin Asn Gin Asn Pro Vai Trp 145 150 155 160 Asn Gin Ile Leu Leu Phe Leu His Asn Leu Ala Leu Asn Gly Glu Glu 165 170 175 Asn Pro Asn Gly Ala Gly Pro Arg 180

<210> 61 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 61

Met Glu Pro Pro Gin Cys Vai Glu Glu Leu Glu Asp Asp Vai Phe Gin 1 .5 10 15 Ser Glu Asp Gly Glu Pro Gly Thr Gin Pro Gly Gly Leu Leu Ser Ala 20 25 30 Asp Leu Phe Ala Gin Ser Gin Leu Asp Cys Pro Leu Ser Arg Leu Gin 35 40 45 Leu Phe Pro Leu Thr His Cys Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro lie Ser 50 55 60 Gin Glu Asp Lys Ala Thr Gin Thr Leu Ser Pro Ala Ser Pro Ser Gin 65 70 75 80 Gly Vai Met Leu Pro Cys Gly Vai Thr Glu Glu Pro Gin Arg Leu Phe 85 90 95 Tyr Gly Asn Ala Gly Tyr Arg Leu Pro Leu Pro Ala Ser Phe Pro Ala 100 105 110 Gly Ser Pro Leu Gly Glu Gin Pro Pro Glu Gly Gin Phe Leu Gin HiS 115 120 125 Arg Ala Glu Vai Gin Ile Ala Pro Lys Leu Gin Cys Ile Ala Asp Gin 130 135 140 Phe His Arg Leu His Thr Gin Gin His Gin Gin Asn Arg Asp Arg Ala 145 150 155 160 Trp Asn Gin Vai Phe Leu Phe Leu Gin Asn Leu Ala Leu Asn Arg Gin 165 170 175 Glu Asn Pro Glu Gly Vai Gly Pro Trp 180 185

<210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial 114 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 62_

Ile Ala Arg Lys Leu Gin Cys Ile Ala Asp Gin Phe His Arg Leu 1 5 10 15

<210> 63 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 63

Ile Ala Gin Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Phe Asn Ala Tyr 15 10

<210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 64

Ile Gly Ser Lys Leu Ala Ala Cys Asp Phe Asp Ala Gin 15 10

Gly Arg Gin Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asn Arg Arg 15 10

Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Asp Ser Asn 15 10

<210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural 115 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 67 Ala Leu Leu Ala Cys Ile Gly Asp Asp Vai Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 68 Thr Ala Ala Leu Lys Ala Gly Asp His Gin Arg 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 69 Gly Arg Glu Leu Arg Arg Ser Asp Phe Vai Asp 1 S 10

Ser Ser Ala Ala Glu Glu Leu Ala Ala Ala Leu Arg Arg Ile Gly Asp 15 10 15

Glu Leu Asp Arg Arg Tyr 20

Glu Gly Pro Ala Asp Pro Leu His Gin Ala Met Arg Ala Ala Gly Asp 1 5 10 15

Glu Phe Glu Thr Arg Phe _20__

<210> 72 <211> 24 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural 116 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 72_

Leu Gin Pro Ser Ser Thr Met Gly Gin Vai Gly Arg Gin Leu Ala Ile 1 5 io 15

Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg _20_

Gin Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly 15 10 15

Asp Glu Leu Asp Ser Asn 20

<210> 74 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 74

Ala fcew Ser Fr® Vai vai lísu Ala Leu Ala. Lau .Arg «Jn Ala eiy Aags is is as

Asp t?hs ser Arg Arg tyr SS®

Asn Leu Trp Ala Ala Gin Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser 15 10 15

Asp Glu Phe Vai Asp Ser phe Lys Lys 20 25

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gin Vai Gly Asp 15 10 15

Ser Met Asp Arg Ser Ile _20 _ 117 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

Glu Vai Ile Pro Met Ala Ala Vai Lys Gin Ala Leu Arg Glu Ala Gly 1 5' 10-15

Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr 20

Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met 1 S 10 15

Asp Vai Ser Leu _20_

<210> 79 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 79_

Met Arg Pro Glu Ile Trp Ile Ala Gin Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp 1 5 10 15

Glu Phe Asn Ala Tyr Tyr 20 <210> 80 <211> 22 <212> PRT <213> Sequênc ia Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 80 Ser Ser * Ala Ala Gin Leu Thr Ala Ala Arg Leu Lys Ala Leu Gly Asp

15 10 IS

Glu Leu His Gin Arg Thr 20

<210> 81 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural 118 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ < 4 0 0 > 81___

His Gin Ala Glu Vai Gin Ile Ala Arg Lys Leu Gin Cys Ile Ala Asp 1 5 10 15

Gin Phe His Arg Leu His _20__

<210> 82 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 82_

Ile Glu Arg Arg Lys Glu Vai Glu Ser Ile Leu Lys Lys Asn Ser Asp 1 5 10 15

Trp Ile Trp Asp Trp Ser 20

<210> 83 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 83

Gly Arg Leu Ala Glu Vai Cys Ala Vai Leu Leu Arg Leu Gly Asp Glu 1 5 10 15

Leu Glu Met Ile Arg pro 20 <210> 84 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 84 Leu Ala Glu Vai Cys Thr Vai Leu Leu Arg Leu Gly Asp Glu Leu Glu 15 10 15

Gin Ile Arg

Met Thr Vai Gly Glu Leu Ser Arg Ala Leu Gly His Glu Asn Gly Ser 1 5 10 15

Leu Asp Pro

<210> 86 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial 119 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 86___

Ala Thr Ser Arg Lys Leu Glu Thr Leu Arg Arg Vai Gly AsP G1y Val 15 10 15

Gin Arg Asn His Glu Thr Ala 20 <210> 87 <211> 22 <212> PRT <213> Sequênc ia Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 87 Ser Ser Ala Ala Gin Leu Thr Ala Ala Arg Leu Lys Ala Leu Gly Asp 1 5 10 15

Glu Leu His Gin Arg Thr 20

<210> 88 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 88

Glu Gin Trp Ala Arg Glu Ile Gly Ala Gin Leu Arg Arg Met Ala Asp 15 10 15

Asp Leu Asn Ala Gin. Tyr _ 20_

<210> 89 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 89_

Ala Glu Leu Pro Pro Glu Phe Ala Ala Gin Leu Arg Lys Ile Gly Asp 15 10 15

Lys Vai Tyr Cys Thr Trp _20_

<210> 90 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 90_

Pro Ala Asp Leu Lys Asp Glu Cys Ala Gin Leu Arg Arg il'e Gly Asp 15 10 15

Lys Vai Asn Leu Arg Gin 20 120 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ

<210> 91 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ocorrência natural <400> 91

Val Val Glu Gly Glu Lys Glu Vai Glu Ala Leu Lys Lys Ser Ala Asp 1 5 10 IS .

Trp Val Ser Asp Trp Ser 20

<210> 92 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 13, 17 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 92_

Glu Asp lie Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Val Gly Asp

1 _ 5 10 IS

Xaa Asp Asp Arg Ser ile Trp 20

<210> 93 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 93

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Val Gly Asp Xaa 15 10 15

Asp Asp Arg Ser Ile 20

<210> 94 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 13, 17 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" 121 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <400> 94

Glu ASp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Glu Asp 1 Xaa _ 5 Asp Asp Arg Ser _20

Ile Trp 10 15

<210> 95 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 95

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Glu Asp Xaa 1 5 10 15

Asp Asp Arg Ser Ile 20

<210> 96 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 96

Arg His Leu Ala Xaa vai Ser Asp Xaa 10 15

Asp ile Ile Arg Asn Ile Ala 1 5

Asp

Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 97 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 97 A?p Ile Ile Arg Asn Ile Ala' Arg His Leu Ala Xaa Vai Gly Asp Xaa 1 Asp 15 10

Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 98 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial 122 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 98

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Glu Asp Xaa 1 5 10 IS

Asp

Asp Arg Ser Ile Trp 20

<221> VARIANTE <222> 8, 12 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 99

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin vai Gly Asp 15 io 15

Ser Asp Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 100 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 7, 11 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <4 00> 100 ' Asp Ile Ile Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Gly Asp Ser 15 10 15

Asp Asp Arg Ser Ile _ 20

<210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 4, 8 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" 123 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ < 4 0 0 > 101_

Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Gly Asp Ser Asp Asp Arg 1 5 10 15

Trp

<221> VARIANTE <222> 8, 12 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 102__

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin vai Glu Asp 1 _ 5 10 15

Ser Asp Asp Arg Ser Ile Trp _ 20

<210> 103 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 7, 11 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 103

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Gly Asp Ser 15 10 15

Asp

Asp Arg Ser Ile Trp _20

<210> 104 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 7, 11 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 104

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Glu Asp Ser 1 5 10 15

Asp

Asp Arg Ser Ile 20

<210> 105 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial 124 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 9, 13 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 105

Glu Asp Ile lie Arg Asn Ile Ala Xaa His Leu Ala xaa vai Gly Asp 1 _ 5 10 15

Ser Asp Asp Arg Ser Ile Trp _ 20

<210> 106 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 10, 17 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 106_

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg Xaa Leu Ala Gin Vai Gly Asp 1 5 10 15

Xaa Asp Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 107 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 5, 9, 13, 17 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 107_

Glu Asp Ile Ile Xaa Asn Ile Ala Xaa His Leu Ala Xaa Vai Gly Asp 1 _ 5 10 15

Xaa

Asp Asp Arg Ser Ile Trp 20

<210> 108 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 14, 18 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" 125 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ < 4 0 0 > 108 _

Asn Leu Trp Ala. Ala Gin Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Xaa Asp ser 15 io 15

Asp Xaa Phe Vai Asp Ser Phe Lys Lys _20_25

<210> 109 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 109

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Ala Ala Xaa Vai Gly Ala Xaa 15 io 15

Asp Asp Arg Ser Ile 20

<210> 110 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 12, 16 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 110

Arg His Ala Ala Xaa Vai Glu Ala Xaa 10 15

Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala 1 5

Asp

Asp Arg Ser Ile 20

<210> 111 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 9, 13 <223> Xaa = um aminoácido "grampeado" <400> 111

Ile Trp He Ala Gin Glu Leu Arg Xaa Ile Gly Asp Xaa Phe Asn Ala 1 5 10 15

Tyr Tyr Ala Arg Arg 20

<210> 112 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial 126 ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <400> 112

Glu.Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gin Vai Gly Asp 1 5 10 15

Ser Asp Asp Arg Ser Ile Trp 20 <210> 113 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 13, 17 <223> Xaa = enantiómeros S do aminoácido olefinico de 5 carbonos <400> 113

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Gly Asp 15 10 15

Xaa Asp Asp Arg Ser Ile Trp _20_ _

<210> 114 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 13, 17 <223> Xaa = enantiómeros S do aminoácido olefinico de 5 carbonos <400> 114

Glu Asp lie lie Arg Asn lie Ala Arg His Leu Ala Xaa Vai Glu Asp 1 - 5 10 15

Xaa Asp Asp Arg Ser Ile Trp 20 <210> 115 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 8, 12 <223> Xaa = enantiómeros S do aminoácido olefinico de 5 carbonos <400> 115

Glu Asp Ile Ile Arg Asn lie Xaa Arg His Leu Xaa Gin Vai Glu Asp 1 5 10 15

Ser Asp Asp Arg Ser ile Trp 20 127

ΕΡ 1 680 443/ΡΤ <210 > 116 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 9, 13 <223> Xaa = enantiómeros S do aminoácido olefinico de 5 carbonos <400> 116_

Glu Asp Ile lie Arg Asn Ile Ala Xaa His Leu Ala xaa Vai Glu Asp 1 _ 5 10 15

Ser Asp Asp Arg Ser Ile Trp _ _20_ _.

<210> 117 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado por substituição por aminoácido não natural <221> VARIANTE <222> 10 <223> Xaa = enantiómeros R do aminoácido olefinico de 5 carbonos <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = enantiómero S do aminoácido olefinico de 8 carbonos <400> 117

Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg Xaa Leu Ala Gin Vai Glu Asp 15 10 15

Xaa Asp Asp Arg Ser Ile Trp _ 20_

Lisboa, 2013-12-04

Claims

ΕΡ 1 680 443/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas, em que o referido polipéptido tem a fórmula (III) :

Z Fórmula (III) em que; cada um de Ri e R2 são independentemente H, alquilo Ci-C20, alcenilo C2-C20, alcinilo C2-C20, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo ou heterociclilalquilo; cada n é independentemente um número inteiro de 1-15; x é 2, 3 ou 6; cada y é independentemente um número inteiro de 0-100; z é um número inteiro de 1-10; e cada Xaa é independentemente um alfa-aminoácido e é o mesmo aminoácido que num polipéptido pró-apoptótico contendo uma hélice a.
2. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, em que -(CH2)n---- (CH2)n- é alquilo Cs ou alquilo Cu.
3. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, em que -(CH2)n---- (CH2)n- é alcenilo Cs ou alcenilo Cu.
4. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, em que Ri e R2 são H ou alquilo Ci_6. ΕΡ 1 680 443/ΡΤ 2/3
5. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, em que o polipéptido compreende um dominio BH3.
6. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, em que x é 3 ou 6 e z é 1.
7. Polipéptido contendo uma hélice a pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, em que cada y é independentemente um número inteiro entre 1 e 15.
8. Polipéptido contendo uma hélice a pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, em que Ri e R2 são, cada um independentemente, alquilo C1-C3.
9. Polipéptido contendo uma hélice a pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 8, em que pelo menos um de Ri e R2 é metilo.
10. Polipéptido contendo uma hélice a pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, em que x é 3 ou 6 e Ri e R2 são metilo.
11. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, o polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l, ou compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
12. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas ΕΡ 1 680 443/ΡΤ 3/3 como reivindicado na reivindicação 11, em que pelo menos um de Ri ou R2 é alquilo C1-6.
13. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, em que cada um de Ri e R2 é independentemente H ou alquilo C1-C3.
14. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, compreendendo adicionalmente uma porção fluorescente, um radioisótopo, um marcador de afinidade, uma porção de direccionamento ou uma porção biotina.
15. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado na reivindicação 1, em que o polipéptido é um polipéptido seleccionado do grupo que consiste nos polipéptidos representados na FIG. 5.
16. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 15 para utilização no tratamento de cancro.
17. Polipéptido contendo uma hélice α pró-apoptótica para utilização no tratamento de cancro ou de condições neoplásicas como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 15 para utilização no tratamento de doença neoplásica. Lisboa, 2013-12-04