CN106661582A - Bax靶向二聚化以调节bax活性 - Google Patents

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Abstract

提供了鉴别试剂的方法，所述试剂通过促进或干扰BCL‑2相关x蛋白(BAX)的二聚化来直接调节BAX。还提供了通过影响二聚化来直接调节BAX的试剂。

Description

BAX靶向二聚化以调节BAX活性
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年5月30日提交的美国临时专利申请号62/005,013的权益，所述美国临时专利申请的内容以全文引用方式并入本文。
政府利益声明
本发明是在由国家心肺和血液研究所(National Heart,Lung,and BloodInstitute)颁发的基金号5R00HL095929下由政府支持进行的。政府在本发明中具有某些权利。
背景技术
发明背景
贯穿本申请，各种出版物由括号中的数字指代。这些参考文献的完整引用可在说明书的结尾处找到。本文提到的这些出版物以及所有专利、专利申请公布和书籍的公开特此以全文引用方式并入本申请，以更充分描述本发明从属的领域。
程序性细胞死亡或细胞凋亡是调控细胞生存和死亡之间关键平衡的基本过程(1)。细胞凋亡失调导致正常内稳态失衡，促成诸如癌症和神经变性的疾病(2,3)。细胞凋亡失调是包括癌症、心血管疾病和神经变性疾病的若干高死亡率人类疾病的关键。蛋白质的BCL-2家族包括调控细胞在线粒体途径处定型向凋亡的复杂相互作用网络(4,5)。BCL-2家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白二者。促凋亡BCL-2蛋白—BCL-2相关X蛋白(BAX)和BCL-2同源拮抗物杀伤物(BAK)—诱导线粒体外膜透化并且代表线粒体凋亡的关键守门因子(gatekeeper)和效应因子。因此，促凋亡BAX或BAK的抑制损害在包括心肌细胞和神经元的终末分化细胞中引发过早或不需要的细胞死亡的细胞能力。此外，BAX或BAK的激活促进凋亡并且可克服肿瘤细胞对经受细胞死亡的抗性和封闭性。
促凋亡BAX是在非凋亡细胞的细胞溶质中占主导的BCL-2家族(4,5)的关键效应因子成员(6)。在激活后，BAX从细胞溶质移位至线粒体以执行线粒体外膜的透化并且将凋亡因子(apoptogen)释放入细胞溶质(7,8)，这是线粒体功能障碍和凋亡的“不可返回点”(“point of no return”)(9,10)。
促凋亡BAX是高度受调控的蛋白，其与触发或抑制其激活的促凋亡和抗凋亡BCL-2蛋白相互作用。诸如BCL-2和BCL-XL的抗凋亡BCL-2蛋白直接抑制激活的BAX，而诸如BIM和BID的促凋亡BCL-2蛋白亚组使用它们的BH3结构域直接触发BAX激活。BAX的细胞溶质构象具有位于其结构的N末端表面的BH3触发位点。BAX与钉合(stapled)BIM BH3螺旋经过N末端触发位点(螺旋α1/α6)的相互作用导致涉及一系列构象变化的BAX激活。这些构象变化包括α1-α2环从封闭构象置换至开放构象以及α2(BH3结构域)和α9螺旋从疏水核心活动化以允许线粒体移位和寡聚化，从而导致线粒体透化。
尽管在理解BAX激活上已有显著进展，当前关于BAX调控机制的知识是有限的。仅理解了激活的BAX是如何通过BAX BH3结构域与抗凋亡BCL-2蛋白的BH3沟相互作用而抑制的。然而，已经报道了众多抑制细胞溶质BAX的蛋白，并且已研究了稳定BAX的细胞溶质形式的翻译后修饰。出现的数据表明在不需要BAX激活的情况下，BAX在细胞溶质与线粒体区室之间具有高度动态的定位。然而，不存在细胞溶质BAX如何保持在控制之下的结构证据或任何机制理解。当前的知识局限于完整BAX的结构，完整BAX的NMR结构表明其α9构象使蛋白保持无活性细胞溶质形式，从而防止蛋白移位至线粒体膜。
最近的研究报道了除全长BAX结构的N末端表面处的激活位点以外，在缺少C末端螺旋α9的截短结构中揭示的第二激活位点，所述截短结构可能模拟BAX的线粒体连接形式(11-14)。虽然BAX激活的早期步骤已确定，但仍缺乏使BAX在细胞溶质中保持在控制之下以及调控BAX激活和移位至线粒体外膜的机制的理解。此外，在细胞溶质中和激活过程中BAX采用的构象对于理解BAX介导性凋亡和BAX可如何被药物靶向是关键的。因此，BAX和调控BAX激活的蛋白，包括其它BCL-2家族成员，是针对开发新颖疗法的集中研究和药物发现活动的靶标(15,16)。
通过BAX调节细胞死亡可在若干疾病中具有治疗益处。与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、或表达或功能的疾病包括：心血管疾病和病症(例如，动脉硬化、心力衰竭、心脏移植、动脉瘤、慢性肺病、缺血性心脏病、高血压、血栓形成、心肌病)，神经变性疾病和神经障碍(例如，阿尔茨海默(Alzheimer)氏病、帕金森(Parkinson)氏病、亨廷顿(Huntington)氏病、色素性视网膜炎、脊髓性肌萎缩、各种形式的小脑变性、肌萎缩性侧索硬化症)，免疫病症(例如，器官移植排斥反应、关节炎、狼疮、炎性肠病、克劳恩(Crohn)氏病、哮喘、多发性硬化症、糖尿病)，缺血(例如，中风、心肌梗塞和再灌注损伤)，不育症(例如，过早绝经、卵巢衰竭或卵泡闭锁)，血液病症(例如，范可尼(Fanconi)贫血、再生障碍性贫血、地中海贫血、先天性中性白细胞减少症、脊髓发育不良)，肾缺氧，肝炎，哮喘和AIDS。然而，当前不存在通过直接调节BAX活性来阻止或激活细胞死亡的小分子疗法。存在凋亡途径的抑制剂，诸如在各种细胞中阻止细胞死亡的半胱天冬酶抑制剂。然而，半胱天冬酶抑制剂在细胞中可得到的不同半胱天冬酶间缺乏特异性，这是对于其成功临床应用的不利因素。BAX的直接激活剂可具体应用于癌症治疗中，并且可选择性地克服癌症细胞的抗凋亡抗性并使正常细胞免受伤害。同样地，可应用BAX的直接激活剂以在与免疫细胞不受控产生相关联的自身免疫疾病中促进凋亡。BAX抑制剂可具体应用于细胞死亡异常过度的心脏病、CNS障碍疾病以及肝和肾病。
本发明解决对鉴别用于治疗性处理的BAX抑制剂和激活剂的需要。
发明内容
本发明公开了用于鉴别干扰或促进BAX二聚化、和/或结合至先前未鉴别出的BAX二聚体结合位点的试剂的测定方法。本发明还提供促进或干扰二聚化的试剂。
提供了鉴别用作促进或抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法，所述方法包括：(a)使试剂与BCL-2相关X蛋白(BAX)单体或其部分、和/或与BAX二聚体接触，以及(b)测量试剂是否抑制或促进BAX二聚化；其中相比于试剂缺少时，在试剂存在时BAX单体与其它BAX单体或与BAX单体的部分的结合减少表明试剂抑制BAX二聚化，其中抑制BAX二聚化的试剂是用于促进细胞死亡的候选试剂；并且其中相比于试剂缺少时，在试剂存在时BAX单体或其部分与其它BAX单体或其部分的结合增加表明试剂促进BAX二聚化，其中促进BAX二聚化的试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。
还提供了用于鉴别调节BAX活性的试剂的方法，所述方法包括：在试剂存在和缺少时，使BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点接触；以及测量BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合，其中相比于试剂缺少时的结合，在试剂存在时减少的结合表明试剂是BAX活性的调节剂。
提供了由以下组成的肽：
a)TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQ ID NO:11)，
b)TWQTVTIFVAGVLTASLT(SEQ ID NO:12)，
c)TWQTVTIFVAGVLTA(SEQ ID NO:13)，
d)TWQTVTIFVAGVL(SEQ ID NO:14)，
e)包含序列TXQTXXIFXAG(SEQ ID NO:15)的11-30个氨基酸残基，其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸、或天然或非天然化学修饰氨基酸，
f)包含序列TXQTXXIFXAGVXTA(SEQ ID NO:16)的15-30个氨基酸残基，其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸、或天然或非天然化学修饰氨基酸，或
g)包含序列Y1XY2Y3XXY4Y5XY6Y7(SEQ ID NO:17)的11-30个氨基酸残基，其中Y1为苏氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，Y2为谷氨酰胺或保守残基或非天然氨基酸，其中Y3为苏氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y4为异亮氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y5为苯丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y6为丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y7为甘氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸、或天然或非天然化学修饰氨基酸。
提供了调节BAX和治疗与封闭或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、表达或功能的疾病和病症的方法，所述方法包括使BAX与本文所公开的肽中的任何者接触。
附图说明
附图简要说明
图1A-1D、BAX形成无活性二聚体构象。(A)通过Superdex 200(HR 10/30)凝胶过滤柱分析的重组BAX的代表性尺寸排阻层析(SEC)迹线，显示出分别在约15.8mL和约14.2mL处的洗脱单体(M)和二聚体(D)峰。(B)通过Superdex200(HR 10/30)凝胶过滤分析重组BAX(rec.BAX)、WT MEF和DKO MEF的细胞溶质提取物、和来自用1％Triton X-100处理的来自WTMEF的细胞溶质提取物(cyt.BAX+1％Triton)。通过抗BAX免疫印迹分析对应于指示分子量的成分和洗脱体积。(C)通过Superdex 75(HR 10/30)凝胶过滤层析分析不同剂量下纯化单体重组BAX的二聚化，显示出分别在约11.8mL和约10.4mL处的洗脱单体(M)和二聚体(D)峰。(D)以不具有和具有指示浓度下基于钉合肽的BAX激活因子BIM SAHBA2的SEC分离的BAX单体和二聚体的动力学格式绘制的脂质体释放测定。(A-C)中所示的数据代表三个实验并且(D)中的数据是来自四个独立实验的平均值。
图2A-2B、无活性BAX二聚体的晶体结构。(A)BAX二聚体晶体结构的条带示意图。显示出对于每个BAX原聚体的二聚相互作用界面。在结构上描绘出螺旋(α)和环(L)。二级结构示意图草图显示出BCL-2同源结构域(BH)、跨膜区(TM)和二聚相互作用界面的位置。(B)与(A)中示意图相关的视图绕垂直轴90度旋转的每个BAX原聚体的条带示意图，显示出N末端和C末端二聚化界面。
图3A-3E、BAX二聚机制的结构细节。(A)二聚体中每个BAX原聚体的C末端和N末端相互作用表面的计算真空静电学(calculated vacuum electrostatics)，显示出互补的疏水、极性和带电残基的位置。(B)BAX二聚体的草图示意图，显示出由其二聚体相互作用界面标记的原聚体。相互作用残基以棍示出并且在二聚体相互作用界面的三个不同区域中突出：(C)二聚界面的疏水核心，涉及一个原聚体的α9残基I175和F176以及来自α1的残基M20和A24，来自α6的M137和L141以及来自α1-α2环的L47和V50，(D)不同BAX原聚体的以下残基对之间的氢键：α6的R145与α9的Q171，α1的E17与α3的M74和E75，以及α1的K21与α3的E75残基对之间的盐桥，以及(E)不同BAX原聚体的以下残基对之间的氢键：α1-α2环的A46与α8的Y164，α1-α2环的E44与α5的W107，α1-α2环的D48与α5的N106，以及α1-α2环的D48与α4-α5环的R109残基对之间的盐桥。
图4A-4D、BAX的自抑制二聚体调控BAX激活和凋亡。(A)纯化单体重组BAX WT和突变体的二聚化由SEC分析并且通过对观测的单体和二聚体峰下方的面积进行积分来量化。(B)与BAX WT和突变体重组的未处理DKO MEF的蛋白裂解物进行细胞溶质与线粒体的分离，接着是使用Superdex 200(HR 10/30)的SEC。(C)用人BAX WT和突变体瞬时转导的DKO MEF的生存力测定通过膜联蛋白-V结合来测量。相比于BAX WT，所有突变体P值<0.05。(D)BAXWT和BAX P168G细胞用1μΜSTS处理6h；BAX E75K和S184L细胞因更快的细胞死亡而处理3h。分离细胞溶质和线粒体成分并通过SEC来分析。(B)和(D)中所示的数据代表三个独立实验，并且(A)和(C)中的数据是来自三个独立实验的平均值±SD。
图5、相比于BAX，确定与BAX相互作用的抗凋亡BCL-2、BCL-XL和MCL-1蛋白在细胞溶质中处于非常低水平并且主要存在于线粒体。MEF的细胞溶质和线粒体成分中BAX、BCL-2、BCL-XL和MCL-1的蛋白水平通过免疫检测来测定。MEF的细胞溶质成分与线粒体成分的分离分别利用b-微管蛋白和VDAC抗体来证实。
图6A-6B、如利用特异性识别BAX活性构象的6A7抗体的免疫沉淀测定法所测定的，二聚体构象的细胞溶质BAX是无活性的。(A)使用Superdex 200 10/300GL凝胶过滤柱的MEF细胞溶质提取物的尺寸排阻层析分析，表明二聚体尺寸的BAX WT的洗脱图谱(B)BAX WT的成分6和8是6A7阴性的，并且不能与6A7抗体免疫共沉淀。作为阳性对照，用激活BAX并暴露BAX上6A7表位的1％辛基葡糖苷去污剂孵育成分。
图7、使用交联方法检测BAX二聚化。在指示的BAX浓度下用20×BMH交联剂处理15min之后，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中BAX的考马斯染色。
图8、来自指示物种的BAX序列的蛋白质序列比对。BAX序列的蛋白质序列比对显示出呈浅灰色阴影的相同残基；呈白色阴影的保守残基、类似残基和不同残基。星号表示每个BAX原聚体中涉及BAX二聚体结构界面处相互作用的残基的位置。螺旋和环的二级结构标记基于BAX二聚体的晶体结构。序列从顶部至底部：SEQ ID NO:3(人(Homo sapiens))至SEQID NO:10(共有序列)。
图9A-9C、突变体BAX G67R二聚体的晶体结构指示与在BAX P168G二聚体的结构中所测定的相同的BAX二聚化机构。(A)BAX G67R二聚体(浅灰色)和BAX P168G二聚体(更深的灰色)的晶体结构的结构比对。(B)BAX G67R原聚体(浅灰色)和BAX P168G原聚体(更深的灰色)晶体结构以绕螺旋α5为中心的视图的结构比对。(C)BAX G67R原聚体(浅灰色)和BAXP168G原聚体(更深的灰色)晶体结构以绕N末端触发位点为中心的视图的结构比对。
图10A-10C、细胞溶质BAX调控机制的结构见解。A)BAX原聚体:α9复合体和BAX单体:BIM BH3复合体以条带表示的结构比对，显示出α9螺旋和BIM BH3螺旋向N末端触发位点的结合取向。α1-α2环在BAX原聚体:α9结构中处于封闭构象，并且在BAX单体:BIM BH3结构中处于开放构象。B)BAX单体:BIM BH3相互作用和C)BAX原聚体:α9相互作用的草图示意图，以棍突出了关键相互作用残基。指示了色码。明确来说，在BIM BH3结合结构(B)中，包含α1的残基A24、L25、L27和α6的L141、W139、G138、M137的BAX N末端触发位点的疏水表面形成与BIM BH3的保守疏水残基F159、I155、L152和A149的持续疏水相互作用(还参见图11B)。另外的稳定相互作用在BAX的Q28和Q32与BIM BH3的N160之间发生，并且互补电荷相互作用在BAX的K21、R134和E131、BIM BH3的E158E、D157和R153残基之间发生(图10B和图11B)。在二聚体BAX结构(C)中，来自α1的残基A24、L25、Q28和Q32代替地与同一BAX分子的α1-α2环的残基Q52、V50和D48相互作用，产生形成自α1和α1-α2环定位的替代疏水空腔，这促进与相邻BAX分子的α9残基I175和F176的相互作用(还参见图11A)。封闭的α1-α2环构象还定位环的极性和带电残基以进行稳定的分子间相互作用(C)。这些结构见解提供了细胞溶质BAX形成自抑制二聚体的强力证据，所述自抑制二聚体堵塞BAX激活和线粒体移位所需的关键相互作用。
图11A-11B、结合至α9(取自BAX P168G二聚体结构)和BIM BH3(PDB ID：2KW7)肽的BAX的N末端结合位点的结构差异提供了细胞溶质BAX调控的结构见解。BAX的N末端表面以灰色显示，并且突出了BAX触发位点和α1-α2环的疏水(更浅的灰色)、带正电(K21、R134和R145)和带负电(D48和E131)残基。(A)BAXα9与其疏水残基的结合使与α1、α6和α1-α2环的疏水残基接触，从而维持BAX的结构处于无活性构象以及α1-α2环处于封闭构象。(B)BIM BH3结合和其疏水残基使与α1和α6的疏水残基接触，随后发生α1-α2环构象变化为开放构象以及α1和α6残基取向变化。此外，在疏水位点的外围处，BIM BH3具有与α1和α6的带电残基的有利静电相互作用。
图12、非对称BAX二聚体晶体结构的结构分析，揭示了两个新的BAX相互作用表面形成自抑制二聚体构象。BAX单体的C末端螺旋α9与其溶剂不可及的表面-规范的BH3口袋(右侧α9螺旋)结合，和与其溶剂可及的表面-另一个BAX分子的BH3触发位点(左侧α9螺旋*)结合。
图13、调控通过选择仅BH3的蛋白触发的BAX激活途径的无活性BAX二聚化的模型。无活性和细胞溶质BAX的二聚化提供了BAX激活的关闭途径。BAX的直接激活通过与仅BH3的蛋白直接相互作用和BAX单体的触发位点(指示的螺旋α1和α6)接合来引发。BAX的构象变化、线粒体移位和自激活继续进行并产生BAX单体以组装线粒体外膜内的活性二聚体，并且同寡聚孔释放诸如细胞色素c的关键致凋亡因子。
图14A-14B、在通过高剂量激活因子BIM SHAB激活之前，BAX的自抑制二聚形式解离成BAX单体。(A)通过高剂量的触发位点结合因子BIM SHAB，无活性BAX 4MA二聚体被竞争并解离成单体。在使用20μΜDTT来减少内部交联的BAX 4MA突变体后，BIM SHAB可激活4MA单体以诱导BAX寡聚化。样品通过Superdex 75(HR 10/30)凝胶过滤层析来分析并且通过对观测的单体峰下方面积进行积分来量化。所示数据代表三个独立实验(B)在用提高剂量的BIM SAHBA处理后，纯化的BAX WT二聚体和BAX P168G二聚体的脂质体透化测定。相比于BAXWT，BAX P168G二聚体对通过BIM SHAB的激活更有抗性。值得注意地，BIM SHABA激活BAX WT二聚体所需的剂量比用来完全激活图1中BAX WT单体的剂量显著更高。条形图表明90min时的最大释放。数据是来自三重进行和重复三次的实验的平均值+SD。
图15、α9螺旋肽的结构，具有与BAX的N末端结合位点相互作用的标记残基。
具体实施方式
发明详述
提供了鉴别用作促进或抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法，所述方法包括：
(a)使试剂与BCL-2相关X蛋白(BAX)单体或其部分、和/或与BAX二聚体接触，以及
(b)测量试剂是否抑制或促进BAX二聚化；
其中相比于试剂缺少时，在试剂存在时BAX单体与其它BAX单体或与BAX单体的部分的结合减少表明试剂抑制BAX二聚化，其中抑制BAX二聚化的试剂是用于促进细胞死亡的候选试剂；以及
其中相比于试剂缺少时，在试剂存在时BAX单体或其部分与其它BAX单体或其部分的结合增加表明试剂促进BAX二聚化，其中促进BAX二聚化的试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。
试剂可结合至BAX的N末端结合位点和/或C末端结合位点的氨基酸残基。例如，试剂可在结合位点残基S16、E17、Q18、I19、M20、K21、T22、G23、A24、L25、L26、I27、Q28、G29、F30、I31、Q32、D33、R34、A35、G36、R37、M38、G39、G40、E41、A42、P43、E44、L45、A46、L47、D48、P49、V50、P51、Q52、D53、A54、V129、P130、E131、L132、I133、R134、T135、I136、M137、G138、W139、T140、L141、D142、F143、L144、R145、E146和R147中一处或多处结合至BAX的N末端。替代地，或另外，试剂可在结合位点残基N73、M74、E75、L76、D98、M99、F100、S101、D102、G103、N104、F105、N106、W107、G108、R109、I152、Q153、D154、Q155、G156、G157、W158、D159、G160、L161、L162、S163、Y164、F165、G166、T167、P168、T169、W170、Q171、T172、V173、T174、I175、F176、V177、A178、G179、V180、L181、T182、A183、S184、L185、T186、I187、W188、K189K190、M191和G192中一处或多处结合至BAX的C末端。
在本文所公开方法中的任何者中，对作为二聚体或单体的BAX的测量是使用荧光偏振测定法、尺寸排阻层析(SEC)、聚丙烯酰胺凝胶电泳、动态光散射和特异性结合BAX二聚体或BAX单体的抗体中的一者或多者来进行的。
还提供了用于鉴别调节BAX活性的试剂的方法，所述方法包括：
在试剂存在和缺少时，使BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点接触；以及
测量BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合，其中相比于试剂缺少时的结合，在试剂存在时减少的结合表明试剂是BAX活性的调节剂。
在一个实施方案中，试剂是BAX的抑制剂。或者，试剂可为BAX的激活剂。
BAX的α9肽具有氨基酸序列TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQ ID NO:11)。BAX的α9螺旋肽例示于图15中。在不同的实施方案中，BAX的α9螺旋肽或BAX的N末端结合位点可固定在固体基质上。BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合可例如使用荧光测定法或表面等离激元共振测定法或免疫共沉淀测定法或NMR测定法来测量。
还公开了鉴别用作BCL-2相关X蛋白(BAX)的调节剂的试剂的方法，所述方法包括：使试剂与BAX接触，并且测量试剂是否抑制或促进BAX与另一个BAX或其部分的二聚化，其中相比于试剂缺少时，在试剂存在时结合减少表明试剂抑制BAX二聚化，并且相比于试剂缺少时，在试剂存在时BAX与另一个BAX分子的结合增加表明试剂促进BAX二聚化。
在本文所公开方法中的任何者中，BAX可为人BAX。
试剂可为例如，小分子、分离肽、合成肽、具有天然或非天然氨基酸或组合的肽基试剂、烃钉合肽(hydrocarbon stapled peptide)、限制性肽(constrained peptide)、大环(macrocycle)、类肽(peptoid)、模拟肽(peptidomimetic)、折叠体、适体、抗体、单抗体(monobody)、纳米抗体、或它们的组合。在实施方案中，试剂是BAX的α9螺旋的模拟肽。
在本文所述方法的实施方案中，试剂是2000道尔顿或更小的小分子。在本文所述方法的实施方案中，试剂是1500道尔顿或更小的小分子。在本文所述方法的实施方案中，试剂是1000道尔顿或更小的小分子。在本文所述方法的实施方案中，试剂是800道尔顿或更小的小分子。在本文所述方法的实施方案中，试剂是2000、1500、1000、800、700、600、500或400道尔顿或更小的小分子。在本文所述方法的实施方案中，试剂是有机小分子。
本文所公开的方法可进一步包括向受试者施用鉴别为促进BAX二聚化或抑制BAX的试剂，所述受试者患有与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、表达或功能的疾病或病症；以及测试试剂在治疗疾病上的功效。所述方法可进一步包括向患有癌症的受试者施用鉴别为抑制BAX二聚化或激活BAX的试剂，以及测试试剂在治疗癌症上的功效。
还提供了与BAX的N末端结合位点相互作用的以下肽：
1.TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQ ID NO:11)(对应于BAX的α9)
2.TWQTVTIFVAGVLTASLT(SEQ ID NO:12)
3.TWQTVTIFVAGVLTA(SEQ ID NO:13)
4.TWQTVTIFVAGVL(SEQ ID NO:14)。
突出显示的氨基酸残基与BAX的N末端结合位点相互作用。不与BAX的N末端结合位点相互作用的其它残基可突变至任何残基，但肽序列可仍具有结合和抑制功能。因此，本发明提供具有11-30个氨基酸残基的肽，所述肽包含序列：TXQTXXIFXAG(SEQ ID NO:15)，其中任何位置处的“X”可独立地为任何氨基酸或非天然氨基酸。在一个实施方案中，具有11-30个氨基酸残基、包含序列TXQTXXIFXAG(SEQ ID NO:15)的肽不包括SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的任何者。本发明还提供具有15-30个氨基酸残基的肽，所述肽包含序列：TXQTXXIFXAGVXTA(SEQ ID NO:16)，其中任何位置处的“X”可独立地为任何氨基酸或非天然氨基酸。在一个实施方案中，具有15-30个氨基酸残基、包含序列TXQTXXIFXAGVXTA(SEQ ID NO:16)的肽不包括SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的任何者。本发明还提供具有11-30个氨基酸残基的肽，所述肽包含序列Y1XY2Y3XXY4Y5XY6Y7(SEQ ID NO:17)，其中Y1为苏氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，Y2为谷氨酰胺或保守残基或非天然氨基酸，其中Y3为苏氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y4为异亮氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y5为苯丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y6为丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y7为甘氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中任何位置处的X可独立地为天然或非天然化学修饰氨基酸的任何氨基酸。优选每个序列中至少一个X或一个Y为非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸。例如11-30个氨基酸，其意指11-30之间任何数量的氨基酸，即，11、12、13、14、......29或30个氨基酸残基。在一个实施方案中，肽由序列TXQTXXIFXAG(SEQ ID NO:15)或序列TXQTXXIFXAGVXTA(SEQ ID NO:16)组成。在不同的实施方案中，相互作用残基还可突变至将维持与BAX相互作用的保守或类似残基。在不同的实施方案中，肽可用诸如荧光标记或放射性标记的标记来标记。在一个实施方案中，本文要求保护的肽为化学合成肽或由重组DNA或cDNA产生的肽。例如，肽可通过液相合成或通过固相合成来制得。肽可例如使用重组DNA或cDNA来合成。在一个实施方案中，肽并不直接得自较大的天然存在BAX蛋白，例如通过消化蛋白质。在一个实施方案中，肽是分离和纯化的肽。
提供了抑制BAX的方法，所述方法包括使BAX与本文所公开肽中的任何者接触。BAX可处于活细胞中，其中优选地，BAX的抑制抑制细胞死亡。BAX可处于受试者中，诸如哺乳动物、诸如人，并且将试剂施用于受试者。受试者可患有与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、表达或功能的疾病或病症。
与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、表达或功能的疾病和病症包括：例如，心血管疾病和病症(例如，动脉硬化、心力衰竭、心脏移植、动脉瘤、慢性肺病、缺血性心脏病、高血压、血栓形成、心肌病)，神经变性和神经疾病和障碍(例如，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、色素性视网膜炎、脊髓性肌萎缩、各种形式的小脑变性、肌萎缩性侧索硬化症)，肝疾病和病症，肾疾病和病症，免疫病症(例如，器官移植排斥反应、关节炎、狼疮、IBD、克劳恩氏病、哮喘、多发性硬化症、糖尿病)，缺血(例如，中风、心肌梗塞和再灌注损伤)，不育症(例如，过早绝经、卵巢衰竭或卵泡闭锁)，血液病症(例如，范可尼贫血、再生障碍性贫血、地中海贫血、先天性中性白细胞减少症、脊髓发育不良)，肾缺氧，肝炎，哮喘和AIDS。与细胞死亡的抑制相关联并且特征为BAX的异常抑制、表达或功能的疾病包括例如，癌症和自身免疫疾病。
还提供了鉴别用作抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法，所述方法包括：
在试剂存在和缺少时，使BCL-2相关X蛋白(BAX)与本文所公开肽的任何者中的一者或多者接触，以及
测量一种或多种肽与BAX的结合，
其中相比于试剂缺少时一种或多种肽与BAX的结合，在试剂存在时一种或多种肽与BAX减少的结合表明试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。在一个实施方案中，例如用异硫氰酸荧光素(FITC)来荧光标记肽。
如本文所使用，“BAX”是BCL-2相关X蛋白。在实施方案中，BAX是哺乳动物型。在优选实施方案中，BAX是人BAX。在实施方案中，BAX包含具有以下序列的连续氨基酸残基：
MDGSGEQPRGGGPTSSEQIMKTGALLLQGFIQDRAGRMGGEAPELALDPVPQDASTKKLSECLKRIGDELDSNMELQRMIAAVDTDSPREVFFRVAADMFSDGNFNWGRVVALFYFASKLVLKALCTKVPELIRTIMGWTLDFLRERLLGWIQDQGGWDGLLSYFGTPTWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQ ID NO:l)。
在本文所述方法的实施方案中，方法可用于鉴别治疗性细胞死亡抑制剂。在本文所述方法的实施方案中，方法可用于鉴别治疗性细胞死亡激活剂。
除非本文中有另外指示或在上下文中另外明显地发生矛盾，否则本文所述各种要素的所有组合都在本发明的范围内。
本发明将从下文的实验细节来更好地理解。然而，本领域技术人员将容易理解，所论述的特定方法和结果仅例示本发明，本发明如其后所接的权利要求书中更充分描述。
实验细节
材料和方法
试剂—对应于BIM的BH3结构域的烃钉合肽、BIM SAHBA2：N-乙酰化145EIWIAQELRS5IGDS5FNAYYA164-CONH2(SEQ ID NO:2)，其中S5代表插入的用于烯烃复分解的非天然氨基酸，如先前由CPC Scientific描述的进行合成、纯化和鉴定(11)。
重组BAX的产生—人BAX野生型和突变体在pTYB1载体(New England Biolabs)中使用标准的基于PCR的克隆策略和基于PCR的定点诱变来产生，并且通过测序来证实构建物。重组蛋白以BL21(DE3)密码子+大肠杆菌菌株来表达并且如先前描述的纯化(16)。
尺寸排阻层析—Superdex 75 10/300GL和200 10/300GL(GE Healthcare)柱用于重组蛋白和细胞提取物的尺寸排阻层析。将重组蛋白注入用含有20mM HEPES pH 7.2、150mM KCl、1mM DTT的缓冲液平衡的柱中。将1mg细胞溶质或膜提取物施加于在含有10mMTris、pH 7.5、1mM EGTA、200mM蔗糖和完全蛋白酶抑制剂的缓冲液中平衡的Superdex 20010/300GL。收集500μL成分，并且每个成分中的30μl通过SDS-PAGE和免疫印迹来分析。所有操作在4℃下进行。还使凝胶过滤分子量标记物(GE Healthcare)经过柱以获得用于估计蛋白质分子量的标准曲线。
动态光散射—各种样品的动态光散射使用来自Wyatt Technology的DynaPro801仪器和用于数据收集和分析的DYNAMICS v.5.25.44软件来测量。在从尺寸排阻层析洗脱之后，将蛋白质样品以13,000rpm离心10min并装至塑料比色皿。通常，对每个100μl样品获得五秒的一百个扫描。归一化的强度对流体动力半径(nm)在20mM HEPES pH 7.2、150mM KCl、1mM DTT缓冲液中测量。
结晶—在20mM HEPES pH 7.2、150mM KCl、1mM DTT缓冲液中的均质BAX蛋白使用过滤单元(Milipore)来浓缩至10mg/ml。针对BAX野生型和突变体的结晶条件的初始筛选通过在293K下使用96孔Intelli板(Hampton Research)的坐滴式蒸气扩散方法(sitting-drop vapor-diffusion)来进行。BAX蛋白在20mM HEPES pH 7.2、150mM KCl、1mM DTT中浓缩至10mg/ml，并且在结晶建立(setup)之前离心。衍射质量杆状晶体在0.1M Bis-Tris pH6.5、1.5M硫酸铵中使用24孔VDX板(Hampton Research)经由悬滴式蒸气扩散方法来产生。将1μl蛋白质溶液和储备溶液混合并且对1ml储备溶液平衡。晶体通过在含有0.1M Bis-Tris pH 6.5、1.5M硫酸铵和25％(v/v)甘油的20μl防冷冻剂溶液中浸泡5s来防冷冻，并且在液氮中快速冷冻。
数据收集和结构测定—X射线衍射数据收集于国家同步加速器光源(NationalSynchrotron Light Source)和先进光子源(Advanced Photon Source)中的光束线。所有数据利用HKL2000来整合和缩放(19)，并且利用CCP4软件套件来进行进一步处理(20)。BAX的晶体结构通过将BAX的单体NMR结构(PDB ID：IF16)用作搜索模型的分子置换方法来测定。模型突变至多Ala。使用COOT的多周期模型手动编辑和调整(21)，接着为通过模拟的退火、能量最小化来细化，和利用REFMAC的个别各向同性B因子细化(22)。螺旋α1与α2之间环的断链因建模阶段的较差衍射数据而实现。利用PROCHECK(23)、PISA(24)来验证最终模型，并且使用PYMOL来给出分子模型(25)。数据收集和统计概述于表2中。
NMR样品和谱—蛋白质样品于5％D2O中、pH 6.0的25mM磷酸钠、50mM NaCl溶液中制备。针对BAX P168G单体的骨架1H、13C、15N分配的相关性1H-15N HSQC、1H-15N TROSY谱和三线共振谱：HNCO、HNCA、HNCOCA、HNCACB、HNCOCACB和N15NNH-NOESY在25℃下于配备有低温探针的Inova 600MHz NMR谱仪上获得，使用Topsin处理，并且利用CCPNMR来分析(26)。BAX野生型交叉峰分配如先前报道的来应用(11,16)。在指示的摩尔比率下的加权平均化学位移差异Δ计算为以p.p.m计的√(ΔδH1)2+(ΔδN15/5)2。误差条的缺少表明无化学位移差异，或者存在脯氨酸或者重叠和未用于分析中的残基。根据标准方法，基于在所有残基间的平均化学位移加标准差来计算骨架酰胺化学位移变化的显著性阈。
BAX二聚化测定—BAX野生型和突变体在BAX缓冲液(10mM HEPES pH 7、150mMKCl、1mM DTT)中浓缩至约0.5mM并且在20℃下孵育1-3天，之后稀释至250μl的总体积并且装填至Superdex 75HR 10/30尺寸排阻柱(GE Healthcare)上。这些条件允许与因BAX激活所致的聚集相比受控的二聚化过程。在4℃下使用0.5ml/min的流速实现单体和二聚BAX的分离。层析谱迹线显示出分别在约11.8ml和约10.4ml处的单体峰和二聚峰。使用蛋白质标准品(GE Healthcare)来校准凝胶过滤峰的分子质量。层析谱迹线代表数个新近SEC纯化的单体BAX的独立制备物。
BAX交联—使用通过在冰上用20×BMH孵育指示剂量的BAX 15min接着用1mM DTT淬灭的交联方法来检测二聚化。样品在90度下变性并且利用SDS-PAGE来分析。
脂质体透化测定—脂质体由以下摩尔百分率的脂质(Avanti Polar Lipids)组成：磷脂酰胆碱48％；磷脂酰乙醇胺28％；磷脂酰肌醇10％；二油酰基磷脂酰丝氨酸10％；和四油酰基心磷脂4％，并且在挤压时用ANTS/DPX(Molecular Probe)装载。BAX(400nM)与指示浓度的BIM SAHBA2以96孔格式(Corning)组合，并随后在测定缓冲液(10mM HEPES、pH 7、200mM KCl、5mM MgCl2和0.2mM EDTA)中添加脂质体(来自50mM总脂质原液的10μl)至100μl的最终体积。在从脂质体释放至上清液中时，基于当ANTS荧光团与DPX猝灭剂分离时发生的荧光强度升高来量化ANTS/DPX释放。在30℃下使用Tecan Infinite M1000读板机随时间测量荧光(λ激发＝355nm和λ发射＝520nm)。90min时ANTS/DPX的释放百分率计算为释放百分率＝((F-F0)/(F100-F0))×100，其中F0和F100分别为基线荧光和最大荧光。使用1％Triton处理来测定每次测定的脂质体释放最大量，并且此值设定为100％值。
细胞培养、细胞转染和凋亡测定—野生型MEF和SV40转化的Bax-/-Bak-/-(DKO)MEF维持在补充有10％FBS、100U ml-1青霉素/链霉素、2mM l-谷氨酰胺、0.1mM MEM非必需氨基酸和50μΜβ-巯基乙醇的DMEM高葡萄糖(Invitrogen)中。通过BAX-IRES-GFP或BAX(P168G)-IRES-GFP质粒的逆转录病毒转导来实现将BAX和BAX突变体重建入DKO细胞中，接着对GFP阳性细胞进行MoFlo分拣。逆转录病毒的产生如先前描述的进行(17)。BAX WT和突变体蛋白的可比较的表达通过Western印迹分析证实。对于十字孢碱处理而言，MEF(每个孔5×104)在含血清培养基中接种于六孔透明底板16-18小时，并随后用1μΜ十字孢碱处理。对于BAX或BAX突变体的瞬时逆转录病毒转导而言，用表达BAX或BAX突变体的逆转录病毒侵染DKO MEF30-36小时。细胞死亡通过膜联蛋白-V(BioVision)染色来量化。流式细胞术使用LSRFortessa(BD Biosciences)来进行，并且使用FACSDiva(BD Biosciences)来分析数据。BAX或BAX突变体的表达量通过抗BAXWestern印迹来评估。统计分析的P值使用学生(Student)t检验来获得。
亚细胞分级—MEF维持在补充有10％FBS、100U ml-1青霉素/链霉素、2mM l-谷氨酰胺、0.1mM MEM非必需氨基酸和50μΜβ-巯基乙醇的DMEM(Invitrogen)中。MEF(每个孔20×106)接种于150mm皿12小时。为了分离细胞溶质和线粒体成分，通过Dounce匀浆器在含有10mM Tris、pH 7.5、1mM EGTA、200mM蔗糖和完全蛋白酶抑制剂(Complete ProteaseInhibitors)的裂解缓冲液LB中裂解细胞。细胞裂解物以700×g离心10min来去除未裂解的细胞和细胞核。上清液在4℃下以12000×g离心10min，并且所得沉淀物收集为线粒体成分。膜沉淀物被再悬浮于LB+1％CHAPS中。
Western印迹—20μg全细胞蛋白在4-12％NuPage(Invitrogen)凝胶上电泳分离，转移至Immobilon-FL PVDF膜(Millipore)并进行免疫印迹。对于利用Odyssey红外成像系统(LI-COR Biosciences)的蛋白质可视化而言，膜在含有2.5％乳粉的PBS中封闭。一级BAX抗体(Cell Signaling 2772S)在4℃下以1:1,000稀释孵育过夜。在漂洗之后，用1:5,000稀释的缀合IRdye800的山羊抗家兔IgG二级抗体(LI-COR Biosciences)孵育膜。利用Odyssey红外成像系统检测蛋白。
BAX构象变化测定—细胞溶质成分经受免疫沉淀，接着是针对总BAX的免疫印迹。简单地说，100-300μg总蛋白被收集并用预平衡的蛋白质GSepharose微珠(Santa CruzBiotechnology公司)孵育1小时。然后，预清洗的样品在4℃下用6A7抗体(6μg/ml)(1:1,000，sc-23959，Santa Cruz Biotechnology)孵育四小时，接着添加预平衡的蛋白质GSepharose微珠1小时。微珠被沉淀、在4℃下用裂解缓冲液漂洗3次，并且通过在90℃下在LDS/DTT上样缓冲液中加热微珠10分钟来洗脱蛋白质。免疫沉淀物经受电泳和使用抗BAX抗体(1:1,000)(Cell Signaling 2772S)的Western印迹分析。
结果
本发明利用了以下发现：细胞溶质BAX形成二聚自抑制形式，所述二聚自抑制形式通过一个原聚体的N末端触发位点和包括第二个原聚体的α9的新相互作用C末端表面来介导。这些BAX的相互作用蛋白表面提供了理解BAX抑制的结构基础和设计用于药理调节BAX的药物的重要见解。发现了单体野生型BAX(BAX WT)在缺少BH3激活结构域时，如通过尺寸排阻层析(SEC)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测量的，随着时间推移可逆地形成二聚体。诸如BAX的α8-α9环中P168G的单点突变控制螺旋α9活动化，产生SEC的相同二聚峰。BAX P168G形成在室温下存留数天的更稳定二聚体。
研究了来自小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的重组BAX和细胞溶质BAX的构象。使用几丁质亲和层析接着是尺寸排阻层析(SEC)，从大肠杆菌提取物中纯化了重组全长BAX(17)。重组BAX从SEC洗脱，主要在对应于单体形式的峰(11,17)并且另外在对应于二聚形式的第二相异峰(图1A,1B)。培养的MEF在缓冲液中不利用去污剂来裂解，并且接着细胞溶质和线粒体成分利用SEC的分级来分离。令人惊奇地，使用相同的针对重组BAX的SEC条件，在对应于BAX二聚体的成分中洗脱出内源性BAX(图1B)。接下来，用BAX-/-和BAK-/-双缺失(DKO MEF)和在内源性水平上稳定表达人BAX的MEF重复SEC，并且再次地，细胞溶质BAX显现为二聚体(图1B)。为了排除细胞溶质BAX是与细胞溶质中抗凋亡BCL-2蛋白的异二聚体的可能性，细胞溶质和线粒体成分经受了Western印迹分析，证实细胞溶质中抗凋亡蛋白相比于BAX而言水平非常低并且主要存在于线粒体(图5)。此外，如通过使用仅识别活性BAX构象的6A7抗体的免疫沉淀分析证明的，细胞溶质BAX二聚体呈无活性构象(图6)(18)。然而，当用促进BAX激活的去污剂处理细胞溶质BAX时，BAX以高分子量显著呈现，据推测形成BAX寡聚体。另外，较少部分洗脱为BAX单体，表明BAX激活需要BAX二聚体构象的破坏(图1B)。合起来看，这些结果证实细胞溶质BAX主要采用二聚和无活性构象。
为了阐明细胞溶质BAX二聚体构象的生理作用，研究了BAX二聚化的分子基础。首先，通过如SEC所显示的高浓度BAX单体孵育或用BMH交联剂处理接着是聚丙烯酰胺凝胶电泳(图1C，7)，建立了用来可再现地产生足够量BAX二聚体的方法。SEC的单体和二聚峰通过分别对应于BAX单体(约21KD)和二聚体(约42KD)的均相群体的动态光散射来证实(表1)。在脂质体测定中，尽管BAX单体不能够单独透化膜，但它在通过烃钉合的BIM BH3螺旋、BIMSAHBA2激活时激活和诱导膜透化(图1D)(11,12)。相比之下，单独的SEC分离的BAX二聚体在脂质体透化测定中不显示诱导膜透化的能力，并且在添加BIM SAHBA2时它几乎无活性(图1D)。因此，BAX二聚体构象无活性并且相比于单体BAX而言对激活有抗性，表明BAX二聚体可形成自抑制构象。
进行了X射线结晶学研究以获得对无活性BAX二聚体的更深见解。利用野生型BAX和突变体来监测SEC二聚体峰的稳定性以预测成功的结晶。用于衍射的晶体质量在与野生型BAX相比产生更稳定二聚体的突变体情况下更好。不改变BAX结构但降低α8-α9环动力学的BAX P168G突变体成功产生晶体，并且获得了分辨率的天然X射线数据集。通过将全长BAX的NMR结构用作搜索模型的分子置换方法，解析和细化了晶体结构(表2)。非对称单元含有具有极佳电子密度图的两个BAX分子，其中除了N末端非结构化区的残基(残基1-13)和螺旋α1和α2之间非结构化环的四个残基(残基37-40)外，所有BAX残基可追踪(图2)。二聚化界面由保守残基形成，并且是大范围的，掩埋了几乎表面面积(图2A和8)。值得注意地，BAX二聚体结构揭示了包括对BAX激活关键的两个结构表面的相互作用的二聚化界面；来自一个BAX原聚体的N末端触发位点和来自包括C末端α9螺旋的第二个BAX原聚体的新C末端表面(图2B,14)。应注意的，此二聚体结构和二聚化界面无关于BAX P168G突变体，因为对螺旋1引入新氢键的BH3残基突变体G67R产生了如通过X射线晶体学测定的分辨率的相同非对称二聚体构象(图9，表2)。
在非对称BAX二聚体结构内的BAX原聚体与通过溶液NMR测定的无活性单体BAX结构相似，然而，它们在螺旋取向和环构象上具有显而易见的差异(骨架r.m.s.d.)(17)。最明显的差异对应于位于包括螺旋α1、α6、α2和α1-α2环的N末端触发位点表面的残基。此外，与结合至BIM BH3螺旋的全长BAX结构(骨架r.m.s.d.)(11)的比较表明，在非对称二聚体中，α1-α2环呈封闭构象，与螺旋α1和α6形成特异性分子内接触，而结合BIMBH3的BAX结构具有呈开放和活性构象的α1-α2环(11,12)。因此，结构分析表明非对称二聚体结构含有呈相异但无活性构象的两个BAX分子，与细胞溶质无活性BAX二聚体的证据一致(图1)。
非对称BAX二聚体构象突出了BAX的两个新相互作用表面(图3)。一个BAX原聚体的相互作用表面主要包括先前鉴别的结合BIM SAHBA2的BAX触发位点残基与其外围处的若干额外相互作用(11)。此外，C末端表面处的相互作用位点是包括C末端螺旋α9的新的和未预见的BAX结合表面。C末端结合表面具有来自溶剂暴露的α9疏水残基的疏水中心，所述疏水残基由α8、α7、α3、α4-α5环和α8-α9环的极性和带电荷残基环绕(图3A)。N末端结合表面具有来自溶剂暴露的由带电荷残基环绕的α1、α6和α1-α2环的疏水残基形成的疏水中心，其补充C末端结合表面的带电荷残基(图3A)。二聚化界面的核心是疏水的(图3B,C)。数个残基形成补充螺旋α9与N末端BH3结合位点的结合的疏水相互作用网络(图3C)。然而，若干氢键和盐桥促成二聚体形成和稳定性(图3B,D,E)。因此，疏水的、极性相互作用和盐桥涉及大范围和高度互补的二聚化界面。
在BH3结合至N末端触发位点时，α1-α2环置换成开放构象，该构象变化对暴露6A7表位(残基12-24)和BAX激活是必要的(11,12,17,18)(图10A)。相比之下，在二聚体BAX结构中，α9以保持α1-α2环构象呈封闭和无活性构象的取向结合N末端BH3结合位点(图10A)。具体来说，BIM BH3结合是通过α1和α6的暴露疏水残基与BIM BH3的保守疏水残基介导的(图10B,11A)。然而，在二聚体BAX结构中，许多这些α1残基被掩埋并且替代地与同一BAX原聚体的α1-α2环的残基相互作用。这产生了形成自α1和α1-α2环定位的替代疏水空腔，其促进与α9的疏水残基的相互作用(图10C)。此封闭α1-α2环构象还定位环的极性和带电荷残基，以产生稳定化的分子间氢键(图10C,11B)。因此，α1/α6位点和α1-α2环内的这些新相互作用稳定了无活性BAX构象，封闭进入BAX触发位点以及将螺旋α9维持在其自身疏水口袋内的位置(图12)。这些结构见解提供了细胞溶质BAX形成自抑制二聚体的强力证据，所述自抑制二聚体堵塞BAX激活和线粒体移位所需的关键相互作用。
为了确认晶体结构中的二聚化界面和溶液中观测的BAX二聚体不是先前针对截短BAXΔC21报道的域交换二聚体(13)，使用了称作4MA的内部交联突变体(C62S，C126S，V121C，I136C)，4MA对激活有抗性并且不能形成如先前报道的域交换二聚体(13)。正如预期的，BAX 4MA保留形成BAX二聚体的能力，因为这些突变保持如BAX WT结构中的无活性构象(图4A)。与二聚体晶体结构一致，在二聚化界面处形成关键相互作用的残基中的突变E75K和T172K或S184L使α9与BH3沟的相互作用不稳定，干扰二聚体形成(图4A)。接下来，测试N末端触发位点结合因子BIM SHABA是否可竞争并解离二聚体。分离的BAX 4MA二聚体用或不用增加量的BIM SHABA孵育。结果显示高剂量的BIM SHABA可竞争并解离二聚体成单体(图14A)。此外，在存在减少内部交联BAX 4MA突变体的还原剂(DTT)时，BIM SHABA还可激活BAX4MA单体以诱导BAX寡聚化。这些生化数据进一步验证了自抑制二聚BAX作为通过仅BH3蛋白抑制激活的机制。
为了研究BAX二聚化机制的生理作用，着手做了BAX WT和突变体形成自抑制二聚体和调控BAX激活的能力的研究。DKO MEF在生理表达水平上与BAX WT和突变体重组。P168G突变体形成比BAX WT更稳定的自抑制二聚体(图4A，图14B)，而E75K和S184L突变体干扰BAX二聚化(图4A)。与此一致，BAX WT和BAX P168G蛋白二者在细胞溶质中仅形成二聚体；然而，BAX E75K和BAX S184L在细胞溶质中形成单体(图4B)。醒目地，BAX突变体与单体BAX的组成型表达显示出相比于BAX WT在细胞死亡诱导上显著升高的活性(图4C)。相比之下，具有更稳定细胞溶质二聚体的BAX P168G突变体细胞具有相比于BAX WT受损的活性(图4C)。此外，在十字孢碱处理时，相比于BAX WT，BAX P168G二聚体对在线粒体外膜中经受移位和寡聚化更有抗性(图4D)。然而，在十字孢碱处理时，单体BAX E75K和S184L比对应BAX WT二聚体经受更快的激活和在线粒体外膜处变换至寡聚体(图4D)。合起来看，数据表明细胞溶质BAX可使其构象从自抑制二聚体转换至单体，以及单体BAX有利于更快BAX激活和更强效细胞死亡活性，而二聚BAX妨碍BAX激活和最终细胞死亡活性。
在凋亡起始期间，细胞溶质BAX通过激活因子仅BH3蛋白与N末端触发位点的相互作用激活，接着是N末端构象变化和α9从其C末端疏水沟的位移，以便移位至线粒体。此外，在由激活因子仅BH3蛋白(BH3-only protein)进一步激活时，具有从其疏水沟移位的α9的线粒体连接的BAX经受N末端构象变化(13)。不论BAX激活的步骤，N末端和C末端表面处的构象变化是导致膜透化的完全BAX激活所需的。本文的工作表明细胞溶质BAX形成自抑制二聚体构象来阻止每个原聚体中N末端或C末端的构象变化并且维持BAX激活在控制之下(图13)。细胞中凋亡的诱导应需要保证促凋亡信号(例如仅BH3蛋白)超过其表达水平或活性状态的随机波动；因此，BAX自抑制提供了封闭BAX激活和阻止不需要的凋亡的机制。最终，这些结构和功能见解对于药物调节剂的开发具有重要暗示，所述调节剂约束(engage)N末端位点或C末端位点来调节特征为过度细胞死亡或存活的疾病中的凋亡(2,3)。
表1.来自尺寸排阻层析洗脱峰的BAX单体和二聚体的代表性动态光散射数据。
表2.数据收集和细化的结构统计。
括号中的数值是针对最高分辨率壳层的。┼R对称＝Σ(I-<I>)/Σ<I>，其中I是对给定折射的强度测量并且<I>是对此折射的多个测量的平均强度。
参考文献
1.N.N.Danial,S.J.Korsmeyer,Cell 116,205(2004).
2.R.W.Johnstone,A.A.Ruefli,S.W.Lowe,Cell 108,153(2002).
3.D.E.Bredesen,R.V.Rao,P.Mehlen,Nature 443,796(2006).
4.R.J.Youle,A.Strasser,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.9,47-59(2008).
5.J.E.Chipuk，等人，Mol.Cell.37,299-310,(2010).
6.K.G.Wolter，等人，J.Cell Biol.139,1281-1292(1997).
7.1.S.Goping，等人，J.Cell Biol.143,207-215(1998).
8.A.Nechushtan,C.L.Smith,Y.T.Hsu,R.J.Youle,EMBO J.18 2330-2341(1999).
9.M.C.Wei等人，Science 292,727(2001).
10.S.W.Tait,D.R.Green,Cold Spring Harb.Perspect.Biol.5,(2013).
11.E.Gavathiotis等人，Nature 455,1076(2008).
12.E.Gavathiotis等人，Mol.Cell 40,481(2010).
13.P.E.Czabotar，等人，Cell 152,519-531(2013).
14.G.Lessene,P.E.Czabotar,P.M.Colman,Nat.Rev.Drug Disc.7,989(2008).
15.E.Gavathiotis等人，Nat.Chem.Bio.8,639(2012).
16.M.Suzuki,R.J.Youle,N.Tjandra,Cell 103,645(2000).
17.H.Kim et al.,Mol.Cell 36,487(2009).
18.Y.T.Hsu,R.J.Youle,J.Biol.Chem.272,13829(1997).
19.Z.Otwinowski,W.Minor,Methods Enzymol.276,307-326(1997).
20.Collaborative Computational Project,Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 50,760-3,(1994).
21.P.Emsley,K.Cowtan,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60,2126-2132,(2004).
22.M.D.Winn,G.N.Murshudov,M.Z.Papiz,Methods Enzymol.374,300-321,(2003).
23.Laskowski,R.A.，等人，Journal of Biomolecular NMR 8,477-486(1996).
24.E.Krissinel,K.Henrick,J.Mol.Biol.372,774-797.(2007).
25.W.L.DeLano,DeLano Scientific,San Carlos,CA,USA(2002).
26.Vranken,W.F.，等人，Proteins 59,687-696,(2005).

Claims (27)

1.一种鉴别用作促进或抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法，所述方法包括：
(a)使试剂与BCL-2相关X蛋白(BAX)单体或其部分、和/或与BAX二聚体接触，以及
(b)测量试剂是否抑制或促进BAX的二聚化；
其中相比于试剂缺少时，在试剂存在时BAX单体与其它BAX单体或与BAX单体的部分的结合减少表明试剂抑制BAX的二聚化，其中抑制BAX的二聚化的试剂是用于促进细胞死亡的候选试剂；以及
其中相比于试剂缺少时，在试剂存在时BAX单体或其部分与其它BAX单体或其部分的结合增加表明试剂促进BAX的二聚化，其中促进BAX的二聚化的试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述试剂结合至BAX的N末端结合位点和/或C末端结合位点的氨基酸残基。
3.如权利要求1所述的方法，其中试剂在结合位点残基S16、E17、Q18、I19、M20、K21、T22、G23、A24、L25、L26、I27、Q28、G29、F30、I31、Q32、D33、R34、A35、G36、R37、M38、G39、G40、E41、A42、P43、E44、L45、A46、L47、D48、P49、V50、P51、Q52、D53、A54、V129、P130、E131、L132、I133、R134、T135、I136、M137、G138、W139、T140、L141、D142、F143、L144、R145、E146和R147中一处或多处结合至BAX的N末端。
4.如权利要求1所述的方法，其中试剂在结合位点残基N73、M74、E75、L76、D98、M99、F100、S101、D102、G103、N104、F105、N106、W107、G108、R109、I152、Q153、D154、Q155、G156、G157、W158、D159、G160、L161、L162、S163、Y164、F165、G166、T167、P168、T169、W170、Q171、T172、V173、T174、I175、F176、V177、A178、G179、V180、L181、T182、A183、S184、L185、T186、I187、W188、K189K190、M191和G192中一处或多处结合至BAX的C末端。
5.如权利要求1-4中任何项所述的方法，其中对二聚体或单体形式的BAX的测量是使用荧光偏振测定法、尺寸排阻层析(SEC)、聚丙烯酰胺凝胶电泳、动态光散射和特异性结合BAX二聚体或BAX单体的抗体中的一者或多者来进行的。
6.一种用于鉴别调节BAX的活性的试剂的方法，所述方法包括：
在试剂存在和缺少时，使BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点接触；以及
测量BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合，其中相比于试剂缺少时的结合，在试剂存在时减少的结合表明试剂是BAX活性的调节剂。
7.如权利要求6所述的方法，其中试剂是BAX的抑制剂。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中BAX的α9肽具有氨基酸序列TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQ ID NO:11)。
9.如权利要求6-8中任何项所述的方法，其中BAX的α9螺旋肽或BAX的N末端结合位点固定在固体基质上。
10.如权利要求6-9中任何项所述的方法，其中BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合使用荧光测定法来测量。
11.如权利要求1-10中任何项所述的方法，其中BAX是人BAX。
12.如权利要求1-11中任何项所述的方法，其中试剂是小分子、分离肽、合成肽、具有天然或非天然氨基酸或组合的肽基试剂、烃钉合肽、限制性肽、大环、类肽、模拟肽、折叠体、适体、抗体、单抗体、纳米抗体或它们的组合。
13.如权利要求1-12中任何项所述的方法，进一步包括向受试者施用鉴别为促进BAX的二聚化或抑制BAX的试剂，所述受试者患有与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、表达或功能的疾病或病症；以及测试所述试剂在治疗所述疾病上的功效。
14.如权利要求1-12中任何项所述的方法，进一步包括向患有癌症的受试者施用鉴别为抑制BAX的二聚化或激活BAX的试剂，以及测试所述试剂在治疗癌症上的功效。
15.一种由以下组成的肽：
a)TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQ ID NO:11)，
b)TWQTVTIFVAGVLTASLT(SEQ ID NO:12)，
c)TWQTVTIFVAGVLTA(SEQ ID NO:13)，
d)TWQTVTIFVAGVL(SEQ ID NO:14)，
e)包含序列TXQTXXIFXAG(SEQ ID NO:15)的11-30个氨基酸残基，其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸，
f)包含序列TXQTXXIFXAGVXTA(SEQ ID NO:16)的15-30个氨基酸残基，其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸，或
g)包含序列Y1XY2Y3XXY4Y5XY6Y7(SEQ ID NO:17)的11-30个氨基酸残基，其中Y1为苏氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸，Y2为谷氨酰胺或保守残基或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸，其中Y3为苏氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸，其中Y4为异亮氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸，其中Y5为苯丙氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸，其中Y6为丙氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸，其中Y7为甘氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸，其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸或天然或非天然存在的化学修饰氨基酸。
16.如权利要求15所述的肽，其由序列TXQTXXIFXAG(SEQ ID NO:15)或序列TXQTXXIFXAGVXTA(SEQ ID NO:16)组成。
17.一种化学合成肽，其由权利要求15或16所述肽中的任何者组成。
18.一种通过重组DNA或cDNA产生的肽，所述肽由权利要求15或16所述肽中的任何者组成。
19.一种分离和纯化的肽，其由权利要求15或16所述肽中的任何者组成。
20.一种抑制BAX的方法，所述方法包括使BAX与权利要求15-19中任何项所述的肽接触。
21.如权利要求20所述的方法，其中BAX处于活细胞中并且BAX的抑制抑制细胞死亡。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述BAX处于受试者中并且将试剂施用于受试者。
23.如权利要求22所述的方法，其中受试者是人。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中受试者患有与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、表达或功能的疾病或病症。
25.如权利要求13或24所述的方法，其中所述疾病或病症是心血管疾病或病症、神经变性或神经疾病或障碍、肝疾病或病症、肾疾病或病症、免疫病症、缺血、不育症、血液病症、肾缺氧、肝炎、哮喘或AIDS。
26.一种标记的肽，其包含连接至荧光标记或放射性标记的权利要求15-19中任何项所述的肽。
27.一种鉴别用作抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法，所述方法包括：
在试剂存在和缺少时，使BCL-2相关X蛋白(BAX)与权利要求15-19或26中任何项的一种或多种肽接触，以及
测量所述一种或多种肽与BAX的结合，
其中相比于试剂缺少时所述一种或多种肽与BAX的结合，在试剂存在时所述一种或多种肽与BAX减少的结合表明试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10294294B2 (en) 2015-09-10 2019-05-21 Albert Einstein College Of Medicine Synthetic antibodies to BAX and uses thereof
WO2018222473A1 (en) * 2017-06-01 2018-12-06 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Bax activators and uses thereof in cancer therapy

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5691179A (en) * 1993-08-26 1997-11-25 Washington University Cell death regulators
US6566330B1 (en) * 1996-10-22 2003-05-20 Medical University Of South Carolina Foundation Research Development Positively charged non-natural amino acids, methods of making and using thereof in peptides
US6245885B1 (en) 1998-10-05 2001-06-12 Mcgill University Bax-mediated apoptosis modulating reagents and methods
AU1130600A (en) 1998-10-22 2000-05-08 Washington University Neuroprotective truncated bax polypeptides
PT2332968T (pt) * 2003-11-05 2016-08-17 Harvard College Péptidos alfa-helicoidais adequados para a activação ou inibição da morte celular
AU2005265164A1 (en) * 2004-06-17 2006-01-26 Musc Foundation For Research Development Non-natural amino acids
WO2009042237A2 (en) 2007-09-26 2009-04-02 Dana Farber Cancer Institute Methods and compositions for modulating bcl-2 family polypeptides
EP2338056B1 (en) 2008-10-10 2018-01-03 Dana Farber Cancer Institute Chemical modulators of pro-apoptotic bax and bcl-2 polypeptides
WO2011103567A2 (en) 2010-02-22 2011-08-25 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Peptides and methods for inducing cell death
US20130189784A1 (en) * 2010-09-16 2013-07-25 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Anti-heparan sulfate peptides that block herpes simplex virus infection in vivo
EP2766355B1 (en) 2011-10-11 2020-12-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pyrazol-3-ones that activate pro-apoptotic bax
WO2014110476A2 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Small- molecule binding site on pro-apoptotic bax regulates inhibition of bax activity
WO2015120296A1 (en) * 2014-02-06 2015-08-13 Universtiy Of Utah Research Foundation Targeting p53 and its dna-binding domain
US10294294B2 (en) 2015-09-10 2019-05-21 Albert Einstein College Of Medicine Synthetic antibodies to BAX and uses thereof

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