JP2017520000A - Ｂａｘ活性を調節するためのｂａｘのターゲティング二量体化 - Google Patents

Abstract

ＢＣＬ−２結合Ｘタンパク質（ＢＡＸ）を直接的に調節する薬剤を同定するための方法であって、ＢＡＸの二量体化を促進または崩壊させることによる方法が提供される。二量体化に影響を及ぼすことによってＢＡＸを直接的に調節する薬剤も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月３０日に出願され、その内容が参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第６２／００５，０１３号明細書の利益を主張するものである。

政府の権利に関する陳述
本発明は、米国立心肺血液研究所により授与された助成金番号第５Ｒ００ＨＬ０９５９２９号の下で政府による支援を受けて実施された。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

本出願を通して、様々な刊行物が括弧内に番号を付して言及されている。これらの参考文献の全引用は、本明細書の最後に見いだすことができる。本明細書で言及したこれらの刊行物ならびに全ての特許、特許出願刊行物および書籍の開示は、これにより本発明が属する分野をより詳細に説明するために全体として参照により本明細書に組み込まれる。

プログラム細胞死またはアポトーシスは、細胞の生と死との間の極めて重要な均衡を調節する基本過程である（１）。アポトーシスの異常調節は、例えば癌および神経変性などの疾患の原因となる正常恒常性の不均衡を生じさせる（２、３）。アポトーシスの異常調節は、癌、心血管疾患および神経変性疾患を含む死亡率の高い多数のヒト疾患にとって極めて重要である。タンパク質のＢＣＬ−２ファミリーは、ミトコンドリア経路でのアポトーシスに対する細胞の関与を調節する複雑な相互作用ネットワークを含む（４、５）。ＢＣＬ−２ファミリーは、プロアポトーシスタンパク質および抗アポトーシスタンパク質のいずれも含む。プロアポトーシスＢＣＬ−２タンパク質 ― ＢＣＬ−２結合Ｘタンパク質（ＢＡＸ）およびＢＣＬ−２相同アンタゴニストキラー（ＢＡＫ） ― は、ミトコンドリア外膜透過を誘導する、ミトコンドリアアポトーシスの重要なゲートキーパーおよびエフェクターを意味する。そこで、プロアポトーシスＢＡＸまたはＢＡＫの阻害は、細胞が心筋細胞およびニューロンを含む最終分化細胞において早期または望ましくない細胞死を開始する能力を妨害する。さらに、ＢＡＸまたはＢＡＫの活性化はアポトーシスを促進し、腫瘍細胞が細胞死を受ける抵抗性および障害を克服することができる。

プロアポトーシスＢＡＸは、非アポトーシス細胞の細胞質内で優勢である（６）ＢＣＬ−２ファミリーの極めて重要なエフェクターメンバーである（４、５）。活性化されると、ＢＡＸは細胞質からミトコンドリアへ転移してミトコンドリア外膜の透過ならびにミトコンドリア機能不全およびアポトーシスのための「復帰不能点」（９、１０）である細胞質内へのアポトーシス誘発化合物の遊離（７、８）を実行する。

プロアポトーシスＢＡＸは、その活性化を始動または阻害するプロアポトーシスおよび抗アポトーシスＢＣＬ−２タンパク質と相互作用する高度に調節されたタンパク質である。例えばＢＣＬ−２およびＢＣＬ−Ｘ_Ｌなどの抗アポトーシスＢＣＬ−２タンパク質は活性化ＢＡＸを直接的に阻害するが、例えばＢＩＭおよびＢＩＤなどのサブグループのプロアポトーシスＢＣＬ−２タンパク質は、それらのＢＨ３ドメインを使用してＢＡＸ活性化を直接的に始動させる。ＢＡＸの細胞質構造は、その構造のＮ末端表面に位置するＢＨ３トリガー部位を有する。Ｎ末端表面トリガー部位（ヘリックスα１／α６）を通したＢＡＸとステープルＢＩＭ ＢＨ３ヘリックスとの相互作用は、一連の構造変化を含むＢＡＸ活性化を生じさせる。これらの構造変化には、α１−α２ループの閉構造から開構造への転移、ならびにミトコンドリア透過をもたらすミトコンドリア転移およびオリゴマー化を可能にするための疎水性核からのα２（ＢＨ３ドメイン）およびα９ヘリックスの動員が含まれる。

ＢＡＸ活性化の理解において著しい進歩が遂げられたにもかかわらず、ＢＡＸの調節機構に関する現代の知識は限定されている。現在理解されているのは、活性化したＢＡＸがＢＡＸ ＢＨ３ドメインと抗アポトーシスＢＣＬ−２タンパク質のＢＨ３ ｇｒｏｏｖｅとの相互作用を通してどのように阻害されるかについてのみである。しかし、細胞質ＢＡＸを阻害する極めて多数のタンパク質は既に報告されており、ＢＡＸの細胞質形を安定化させる翻訳後修飾が研究されてきた。新たに得られたデータは、ＢＡＸがＢＡＸ活性化を必要とすることなく細胞質分画とミトコンドリア分画との間の高度に動的局在を有することを示唆している。しかし、細胞質ＢＡＸがどのように制御下に維持されるかについての構造的証拠または何らかの機構的理解は得られていない。現在の知識は、無傷ＢＡＸの構造に限定されており、そのＮＭＲ構造は、そのα９構造がタンパク質を非活性細胞質形に維持し、ミトコンドリア膜への転移を防止することを示唆した。

最近の研究は、全長ＢＡＸ構造のＮ末端表面にある活性化部位に加えて、短縮型構造にあることが解明され、ＢＡＸのミトコンドリア結合形を模倣する可能性が高いＣ末端ヘリックスα９が欠損している第２活性化部位について報告した（１１−１４）。ＢＡＸ活性化の初期のステップは確定されているが、ＢＡＸを細胞質内で制御下に維持し、その活性化およびミトコンドリア外膜への転移を調節する機構についての理解は依然として欠如している。さらに、ＢＡＸが細胞質内および活性化プロセスにおいて採用する構造は、ＢＡＸ媒介性アポトーシスおよびＢＡＸを薬理学的標的にできる方法について理解するために極めて重要である。このため、ＢＡＸおよび他のＢＣＬ−２ファミリーメンバーを含むＢＡＸ活性化を調節するタンパク質は、新規な療法を開発するための本調査研究および新薬発見キャンペーンの標的である（１５、１６）。

ＢＡＸを通しての細胞死調節は、多数の疾患における治療的有用性を有し得るであろう。早期または望ましくない細胞死に関連しており、かつＢＡＸの異常な活性化、発現または機能を特徴とする疾患には、心血管疾患および障害（例えば、動脈硬化症、心不全、心臓移植、動脈瘤、慢性肺疾患、虚血性心疾患、高血圧、血栓症、心筋症）、神経変性疾患および神経障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症、様々な形態の小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症）、免疫障害（例えば、臓器移植拒否反応、関節炎、狼瘡、炎症性腸疾患、クローン病、喘息、多発性硬化症、糖尿病）、虚血（例えば、脳卒中、心筋梗塞および再潅流障害）、不妊症（例えば、早発閉経症、卵巣障害または卵胞閉鎖）、血液疾患（例えば、ファンコニー貧血、再生不良性貧血、サラセミア、先天性好中球減少症、脊髄異形成）、腎低酸素症、肝炎、喘息およびＡＩＤＳが含まれる。しかし、現在のところ、ＢＡＸの活性の直接調節を通して細胞死を防止または活性化する小分子療法は存在しない。様々な細胞内での細胞死を防止するカスパーゼ阻害剤などのアポトーシス経路の阻害剤は存在する。しかし、カスパーゼ阻害剤には細胞内で利用できる様々なカスパーゼ間の特異性が欠如するため、それらの臨床適用に成功するための障害となる。ＢＡＸの直接活性化剤は、癌の治療に特に適用できる可能性があり、癌細胞の抗アポトーシス耐性を選択的に克服して正常細胞を傷付けないことができるであろう。同様に、ＢＡＸの直接活性化剤は、免疫細胞の無制限産生に関連する自己免疫疾患におけるアポトーシスを促進するために適用できる。ＢＡＸ阻害剤は、特に心疾患、ＣＮＳ障害性疾患ならびに細胞死が異常に過剰である肝臓および腎臓の疾患に適用できる可能性がある。

そこで本発明は、治療的処置のためのＢＡＸの阻害剤および活性化剤を同定する必要性に対処した。

本発明の開示は、ＢＡＸの二量体化を妨害もしくは促進し、および／または以前に同定されていなかったＢＡＸの二量体結合部位に結合する薬剤を同定するためのアッセイについて開示する。本発明はさらに、二量体化を促進または妨害する薬剤を提供する。

細胞死を促進または阻害するための候補薬剤として薬剤を同定するための方法であって、（ａ）その薬剤をＢＣＬ−２結合Ｘタンパク質（ＢＡＸ）単量体もしくはその部分および／またはＢＡＸ二量体と接触させる工程と、（ｂ）その薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害または促進するかどうかを測定する工程とを含み、その薬剤の非存在下に比較してその薬剤の存在下におけるＢＡＸ単量体の他のＢＡＸ単量体またはＢＡＸ単量体の部分への結合の減少は、その薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害することを示し、薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害する薬剤が細胞死を促進するための候補薬剤であり、その薬剤の非存在下に比較してその薬剤の存在下におけるＢＡＸ単量体またはその部分の他のＢＡＸ単量体またはその部分への結合の増加は、その薬剤がＢＡＸの二量体化を促進することを示し、薬剤がＢＡＸの二量体化を促進する薬剤が細胞死を阻害するための候補薬剤である、方法が提供される。

さらに、ＢＡＸの活性を調節する薬剤を同定するための方法であって、その薬剤の存在下およびその薬剤の非存在下でＢＡＸのα９ヘリックスペプチドをＢＡＸのＮ末端結合部位と接触させる工程と、ＢＡＸのα９ヘリックスペプチドとＢＡＸのＮ末端結合部位との間の結合を測定する工程とを含み、その薬剤の非存在下における結合に比較したその薬剤の存在下における結合の減少は、その薬剤がＢＡＸの活性のモジュレーターであることを示す、方法も提供される。

ａ）ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡＳＬＴＩＷＫＫＭＧ（配列番号１１）、
ｂ）ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡＳＬＴ（配列番号１２）、
ｃ）ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡ（配列番号１３）、
ｄ）ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬ（配列番号１４）、
ｅ）配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧ（配列番号１５）（式中、任意の位置にあるＸは、独立して任意のアミノ酸または天然もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり得る）を含む、１１〜３０個のアミノ酸残基、
ｆ）配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧＶＸＴＡ（配列番号１６）（式中、任意の位置にあるＸは、独立して任意のアミノ酸または天然もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり得る）を含む、１５〜３０個のアミノ酸残基、または
ｇ）配列Ｙ１ＸＹ２Ｙ３ＸＸＹ４Ｙ５ＸＹ６Ｙ７（配列番号１７）（式中、Ｙ１は、トレオニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、Ｙ２は、グルタミンもしくは保存残基または非天然アミノ酸であり、Ｙ３は、トレオニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、Ｙ４は、イソロイシンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、Ｙ５は、フェニルアラニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、Ｙ６は、アラニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、Ｙ７は、グリシンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、任意の位置にあるＸは、独立して任意のアミノ酸または天然もしくは非天然型化学修飾アミノ酸である）を含む、１１〜３０個のアミノ酸残基からなるペプチドが提供される。

ＢＡＸを調節するための、および遮断(blockade)または望ましくない細胞死に関連しており、かつＢＡＸの異常な活性化、発現または機能を特徴とする疾患および障害を治療するための方法であって、ＢＡＸを本明細書に開示したペプチドのいずれかと接触させる工程を含む、方法が提供される。

（図１Ａ−１Ｄ）ＢＡＸは、非活性二量体構造を形成する。（Ａ）溶出された単量体（Ｍ）および二量体（Ｄ）が各々約１５．８ｍｌおよび約１４．２ｍｌでピークに達することを示している、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＨＲ １０／３０）ゲル濾過カラムによって解析した組換えＢＡＸの代表的なサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）トレースである。（Ｂ）組換えＢＡＸ（ｒｅｃ．ＢＡＸ）、ＷＴ ＭＥＦおよびＤＫＯ ＭＥＦの細胞質抽出物ならびに１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理したＷＴ ＭＥＦ由来の細胞質抽出物（ｃｙｔ．ＢＡＸ＋１％のＴｒｉｔｏｎ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＨＲ １０／３０）ゲル濾過によって解析した。指示した分子量および溶出体積に対応する分画を抗ＢＡＸイムノブロッティングによって解析した。（Ｃ）様々な用量での精製単量体組換えＢＡＸの二量体化をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（ＨＲ １０／３０）ゲル濾過カラムによって解析すると、溶出された単量体（Ｍ）および二量体（Ｄ）が各々約１１．８ｍｌおよび約１０．４ｍｌでピークに達することが証明された。（Ｄ）指示した濃度でステープルペプチドをベースとするＢＡＸ活性化因子ＢＩＭ ＳＡＨＢ_Ａ２を用いずに、および用いて、ＳＥＣ単離ＢＡＸ単量体および二量体の動的フォーマットでプロットしたリポソーム遊離アッセイである。３種の実験を表す（Ａ〜Ｃ）および（Ｄ）において示したデータは、４種の独立実験からの平均である。 （図２Ａ−２Ｂ）非活性ＢＡＸ二量体の結晶構造である。（Ａ）ＢＡＸ二量体結晶構造のリボン表示。二量体化相互作用インターフェースが各ＢＡＸプロモーターについて図示されている。ヘリックス（α）およびループ（Ｌ）は構造上に描出されている。ＢＣＬ−２相同ドメイン（ＢＨ）、膜貫通領域（ＴＭ）および二量体化相互作用インターフェースを示している二次構造表示のアニメーションである。Ｎ末端およびＣ末端二量化インターフェースを示している、垂直軸の周囲での９０度回転での表示（Ａ）に関連する視野内の各ＢＡＸプロモーターのリボン表示（Ｂ）。 （図３Ａ−３Ｅ）ＢＡＸ二量体化機構の構造的詳細である。（Ａ）相補的な疎水性、極性および荷電残基の位置を示している、二量体内の各ＢＡＸプロモーターのＣ末端およびＮ末端相互作用面の計算真空静電値である。（Ｂ）それらの二量体相互作用インターフェースにより標識されたプロモーターを示している、ＢＡＸ二量体のアニメーション表示。相互作用残基は棒で示され、二量体相互作用インターフェースの３つの異なる領域内で強調表示されている：（Ｃ）１つのプロモーターのα９残基Ｉ１７５およびＦ１７６ならびにα１からの残基Ｍ２０およびＡ２４、α６からのＭ１３７およびＬ１４１ならびにα１−α２ループからのＬ４７およびＶ５０を含む二量体化インターフェースの疎水性核、（Ｄ）異なるＢＡＸプロモーターの次の残基対：α６のＲ１４５とα９のＱ１７１との間、α１のＥ１７とα３のＭ７４およびＥ７５と間の水素結合ならびにα１のＫ２１とα３残基対のＥ７５との間の塩橋、および（Ｅ）異なるＢＡＸプロモーターの次の残基対：α１−α２ループのＡ４６とα８のＹ１６４との間、α１−α２ループのＥ４４とα５のＷ１０７との間、α１−α２ループのＤ４８とα５のＮ１０６との間の水素結合ならびにα１−α２ループのＤ４８とα４−α５ループのＲ１０９残基対との間の塩橋。 （図４Ａ−４Ｄ）ＢＡＸの自己阻害二量体はＢＡＸ活性化およびアポトーシスを調節する。（Ａ）精製単量体組換えＢＡＸ ＷＴおよび突然変異体の二量体化をＳＥＣによって解析し、観察された単量体および二量体ピーク下面積の積分によって定量した。（Ｂ）ＢＡＸ ＷＴおよび突然変異体を用いて再構成した未処理ＤＫＯ ＭＥＦのタンパク質溶解物をミトコンドリア由来の細胞質の分離にかけ、その後にＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＨＲ １０／３０）を使用するＳＥＣを実施した。（Ｃ）アネキシン−Ｖ結合によって測定したヒトＢＡＸ ＷＴおよび突然変異体を用いた一過性形質導入ＤＫＯ ＭＥＦの生存率アッセイである。ＢＡＸ ＷＴに比較した全突然変異体に対して、Ｐ値＜０．０５。（Ｄ）ＢＡＸ ＷＴおよびＢＡＸ Ｐ１６８Ｇ細胞を６時間にわたり１μΜのＳＴＳ処理により処理した。ＢＡＸ Ｅ７５ＫおよびＳ１８４Ｌ細胞は、より急速に細胞死が生じたために３時間にわたり処理した。細胞質分画およびミトコンドリア分画を単離し、ＳＥＣによって解析した。（Ｂ）および（Ｄ）に示したデータは３種の独立実験を表し、（Ａ）および（Ｃ）に示したデータは、３種の独立実験からの平均値±ＳＤである。 ＢＡＸと相互作用することが確定された抗アポトーシスＢＣＬ−２、ＢＣＬ−Ｘ_ＬおよびＭＣＬ−１タンパク質は、ＢＡＸと比較して細胞質内では極めて低濃度で、大部分はミトコンドリアに存在する。免疫検出法によって決定した、ＭＥＦの細胞質分画およびミトコンドリア分画内のＢＡＸ、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−Ｘ_ＬおよびＭＣＬ−１のタンパク質レベルである。ＭＥＦのミトコンドリア分画からの細胞質分画の分離をｂ−チューブリン抗体およびＶＤＡＣ抗体各々を用いて確証した。 （図６Ａ−６Ｂ）二量体構造内の細胞質ＢＡＸは、ＢＡＸの活性構造を特異的に認識する６Ａ７抗体を用いる免疫沈降アッセイによって決定されたように非活性である。（Ａ）二量体サイズにあるＢＡＸ ＷＴの溶出プロファイルを示している、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラムを使用したＭＥＦの細胞質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィ解析である。（Ｂ）ＢＡＸ ＷＴの分画６および８は６Ａ７陰性であり、６Ａ７抗体との共免疫沈降に失敗した。陽性コントロールとして、ＢＡＸを活性化してＢＡＸ上の６Ａ７エピトープを露出させる１％のオクチルグルコシド洗剤とともに分画をインキュベートした。 ＢＡＸ二量体化は、架橋結合アプローチを使用して検出される。指示したＢＡＸ濃度で１５分間にわたり２０Ｘ ＢＭＨ架橋剤を用いた処理後のポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）におけるＢＡＸのクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色である。 指示した種からのＢＡＸ配列のタンパク質配列アラインメントである。薄灰色で影を付けた同一残基；保存残基、類似残基および白色で影を付けた異なる残基を示しているＢＡＸ配列のタンパク質配列アラインメント。星印は、ＢＡＸ二量体構造のインターフェースでの相互作用に関係している各ＢＡＸプロモーター内の残基の位置を表している。ヘリックスおよびループの二次構造記号は、ＢＡＸ二量体の結晶構造に基づいている。配列の上から下へ、配列番号３（ホモサピエンス）〜配列番号１０（コンセンサス）である。 （図９Ａ−９Ｃ）突然変異ＢＡＸ Ｇ６７Ｒ二量体の結晶構造は、ＢＡＸ Ｐ１６８Ｇ二量体の構造内で決定されたＢＡＸの同一の二量体化機構を示している。（Ａ）ＢＡＸ Ｇ６７Ｒ二量体（薄灰色）およびＢＡＸ Ｐ１６８Ｇ二量体（濃灰色）の結晶構造の構造的アラインメント。（Ｂ）ヘリックスα５を中心に展開した図面におけるＢＡＸ Ｇ６７Ｒプロモーター（薄灰色）およびＢＡＸ Ｐ１６８Ｇプロモーター（濃灰色）の結晶構造の構造的アラインメント。（Ｃ）Ｎ末端トリガー部位を中心に展開した図面におけるＢＡＸ Ｇ６７Ｒプロモーター（薄灰色）およびＢＡＸ Ｐ１６８Ｇプロモーター（濃灰色）の結晶構造の構造的アラインメント。 （図１０Ａ−１０Ｃ）細胞質ＢＡＸ調節機構の構造的洞察である。Ａ）Ｎ末端トリガー部位に向かう方向に結合したα９ヘリックスおよびＢＩＭ ＢＨ３ヘリックスを示している、リボン表示でのＢＡＸプロモーター：α９複合体およびＢＡＸ単量体：ＢＩＭ ＢＨ３複合体の構造的アラインメント。ＢＡＸプロモーター：α９構造内で閉構造およびＢＡＸ単量体：ＢＩＭ ＢＨ３構造内で開構造にあるα１−α２ループである。棒状での重要な相互作用残基を強調表示している、Ｂ）ＢＡＸ単量体：ＢＩＭ ＢＨ３相互作用およびＣ）ＢＡＸプロモーター：ａ９相互作用のアニメーション表示。カラーコードが指示されている。詳細には、ＢＩＭ ＢＨ３結合構造内で、（Ｂ）α１のＡ２４、Ｌ２５、Ｌ２７およびα６のＬ１４１、Ｗ１３９、Ｇ１３８、Ｍ１３７の残基を含むＢＡＸ Ｎ末端表面トリガー部位の疎水性表面は、保存疎水性残基Ｆ１５９、Ｉ１５５、Ｌ１５２およびＢＩＭ ＢＨ３のＡ１４９との拡張された疎水性相互作用を形成する（同様に図１１Ｂ）。追加の安定化相互作用はＢＡＸのＱ２８およびＱ３２とＢＩＭ ＢＨ３のＮ１６０との間で発生し、相補的電荷相互作用はＢＡＸの残基Ｋ２１、Ｒ１３４およびＥ１３１とＢＩＭ ＢＨ３のＥ１５８Ｅ、Ｄ１５７およびＲ１５３との間で発生する（図１０Ｂおよび図１１Ｂ）。二量体ＢＡＸ構造（Ｃ）において、α１からの残基Ａ２４、Ｌ２５、Ｑ２８およびＱ３２は、その代わりに同一ＢＡＸ分子のα１−α２ループの残基Ｑ５２、Ｖ５０およびＤ４８と相互作用し、隣接ＢＡＸ分子のα９残基Ｉ１７５およびＦ１７６との相互作用を促進するα１およびα１−α２ループのポジショニングから形成される代替疎水性空洞を形成する（図１１Ａと同様）。α１−α２ループ閉構造も分子間相互作用を安定化させるためにループの極性および荷電残基をポジショニングする（Ｃ）。これらの構造的洞察は、細胞質ＢＡＸが、その活性化およびミトコンドリア転移のために必要とされる重要な相互作用を閉塞させる自己阻害二量体を形成するという強力な証拠を提供する。 （図１１Ａ−１１Ｂ）α９（ＢＡＸ Ｐ１６８Ｇ二量体構造から取られた）およびＢＩＭ ＢＨ３（ＰＤＢ ＩＤ：２ＫＷ７）ペプチドに結合したＢＡＸのＮ末端結合部位の構造的相違は、細胞質ＢＡＸ調節に関する構造的洞察を提供する。灰色で示したＢＡＸのＮ末端表面ならびにＢＡＸトリガー部位およびα１−α２ループの疎水性（薄灰色）、正荷電（Ｋ２１、Ｒ１３４およびＲ１４５）ならびに負荷電（Ｄ４８およびＥ１３１）残基が強調表示されている。（Ａ）ＢＡＸ α９とその疎水性残基との結合は、α１、α６およびα１−α２ループの疎水性残基との接触をもたらし、ＢＡＸの構造を非活性構造に、およびα１−α２ループを閉構造に維持する。（Ｂ）ＢＩＭ ＢＨ３結合およびその疎水性残基はα１およびα６の疎水性残基との接触をもたらし、α１−α２ループ内の開構造への構造変化と、α１およびα６残基の方向における変化とを起こす。さらに、ＢＩＭ ＢＨ３は、疎水性部位の周辺でα１およびα６の荷電残基との好ましい静電相互作用を有する。 非対称性ＢＡＸ二量体結晶構造の構造解析は、自己阻害二量体構造を形成する２つの新規なＢＡＸ相互作用表面を明らかにした。ＢＡＸ単量体のＣ末端ヘリックスα９はその溶媒が到達しにくい表面である正規ＢＨ３ポケット（右側のα９ヘリックス）およびその溶媒が到達できる表面である別のＢＡＸ分子のＢＨ３トリガー部位（左側のα９ヘリックス＊）と結合する。 選択ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質によって始動させられるＢＡＸ活性化経路を調節する非活性ＢＡＸ二量体化のモデルである。非活性および細胞質ＢＡＸの二量体化は、ＢＡＸ活性化へのオフ経路を提供する。ＢＡＸの直接活性化は、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質との直接相互作用およびＢＡＸ単量体のトリガー部位（指示したヘリックスα１およびα６）の係合によって開始される。ＢＡＸの構造変化、ミトコンドリア転移および自己活性化は、ＢＡＸ単量体がミトコンドリア外膜内で活性二量体を集合させ、ホモオリゴマー細孔が例えばシトクロムｃなどのアポトーシス原因子を遊離するのを促進および伝播させる。 （図１４Ａ−１４Ｂ）ＢＡＸの自己阻害二量体形は、高用量の活性化剤ＢＩＭ ＳＨＡＢによって活性化される前にＢＡＸ単量体に解離する。（Ａ）非活性ＢＡＸ ４ＭＡ二量体は、高用量のトリガー部位結合剤であるＢＩＭ ＳＨＡＢと競合し、ＢＩＭ ＳＨＡＢによって単量体に解離させられる。２０μΜのＤＴＴを使用して内部架橋ＢＡＸ ４ＭＡを還元すると、ＢＩＭ ＳＨＡＢは４ＭＡ単量体を活性化してＢＡＸオリゴマー化を誘導することができる。サンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（ＨＲ １０／３０）ゲル濾過クロマトグラフィによって解析し、観察された単量体ピーク下面積の積分によって定量した。示したデータは、３種の実験を表している。（Ｂ）用量を増加させながらＢＩＭ ＳＡＨＢ_Ａを使用した処理後の精製ＢＡＸ ＷＴ二量体およびＢＡＸ Ｐ１６８Ｇ二量体のリポソーム透過化アッセイである。ＢＡＸ Ｐ１６８Ｇ二量体は、ＢＡＸ ＷＴに比較してＢＩＭ ＳＨＡＢによる活性化に対してより抵抗性である。注目すべきことに、ＢＩＭ ＳＨＡＢ_ＡがＢＡＸ ＷＴ二量体を活性化するために必要とされる用量は、図１に示したＢＡＸ ＷＴ単量体を十分に活性化するために使用される用量より有意に高い。棒グラフは、９０分後に最高遊離が生じることを示している。データは、３回ずつおよび３回繰り返して実施された実験からの平均値＋ＳＤである。 ＢＡＸのＮ末端結合部位と相互作用する標識残基を備えるα９ヘリックスペプチドの構造。

細胞死を促進または阻害するための候補薬剤として薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）その薬剤をＢＣＬ−２結合Ｘタンパク質（ＢＡＸ）単量体もしくはその部分および／またはＢＡＸ二量体と接触させる工程と、
（ｂ）その薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害または促進するかどうかを測定する工程と
を含み、
その薬剤の非存在下に比較してその薬剤の存在下におけるＢＡＸ単量体の他のＢＡＸ単量体またはＢＡＸ単量体の部分への結合の減少は、その薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害することを示し、薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害する薬剤が細胞死を促進するための候補薬剤であり、
その薬剤の非存在下に比較してその薬剤の存在下におけるＢＡＸ単量体またはその部分の他のＢＡＸ単量体またはその部分への結合の増加は、その薬剤がＢＡＸの二量体化を促進することを示し、薬剤がＢＡＸの二量体化を促進する薬剤が細胞死を阻害するための候補薬剤である、方法が提供される。

その薬剤は、ＢＡＸのＮ末端結合部位および／またはＣ末端結合部位のアミノ酸残基に結合することができる。例えば、その薬剤は、ＢＡＸのＮ末端に結合部位残基Ｓ１６、Ｅ１７、Ｑ１８、Ｉ１９、Ｍ２０、Ｋ２１、Ｔ２２、Ｇ２３、Ａ２４、Ｌ２５、Ｌ２６、Ｉ２７、Ｑ２８、Ｇ２９、Ｆ３０、Ｉ３１、Ｑ３２、Ｄ３３、Ｒ３４、Ａ３５、Ｇ３６、Ｒ３７、Ｍ３８、Ｇ３９、Ｇ４０、Ｅ４１、Ａ４２、Ｐ４３、Ｅ４４、Ｌ４５、Ａ４６、Ｌ４７、Ｄ４８、Ｐ４９、Ｖ５０、Ｐ５１、Ｑ５２、Ｄ５３、Ａ５４、Ｖ１２９、Ｐ１３０、Ｅ１３１、Ｌ１３２、Ｉ１３３、Ｒ１３４、Ｔ１３５、Ｉ１３６、Ｍ１３７、Ｇ１３８、Ｗ１３９、Ｔ１４０、Ｌ１４１、Ｄ１４２、Ｆ１４３、Ｌ１４４、Ｒ１４５、Ｅ１４６およびＲ１４７のうちの１つ以上で結合することができる。または、もしくは追加して、その薬剤は、ＢＡＸのＣ末端に結合部位残基Ｎ７３、Ｍ７４、Ｅ７５、Ｌ７６、Ｄ９８、Ｍ９９、Ｆ１００、Ｓ１０１、Ｄ１０２、Ｇ１０３、Ｎ１０４、Ｆ１０５、Ｎ１０６、Ｗ１０７、Ｇ１０８、Ｒ１０９、Ｉ１５２、Ｑ１５３、Ｄ１５４、Ｑ１５５、Ｇ１５６、Ｇ１５７、Ｗ１５８、Ｄ１５９、Ｇ１６０、Ｌ１６１、Ｌ１６２、Ｓ１６３、Ｙ１６４、Ｆ１６５、Ｇ１６６、Ｔ１６７、Ｐ１６８、Ｔ１６９、Ｗ１７０、Ｑ１７１、Ｔ１７２、Ｖ１７３、Ｔ１７４、Ｉ１７５、Ｆ１７６、Ｖ１７７、Ａ１７８、Ｇ１７９、Ｖ１８０、Ｌ１８１、Ｔ１８２、Ａ１８３、Ｓ１８４、Ｌ１８５、Ｔ１８６、Ｉ１８７、Ｗ１８８、Ｋ１８９ Ｋ１９０、Ｍ１９１およびＧ１９２のうちの１つ以上で結合することができる。

本明細書に開示した方法のいずれにおいても、二量体または単量体としてのＢＡＸの測定は、蛍光偏光アッセイ、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、動的光散乱法、およびＢＡＸ二量体または単量体のいずれかに特異的に結合する抗体のうちの１つ以上を使用して実施される。

さらに、ＢＡＸの活性を調節する薬剤を同定するための方法であって、
その薬剤の存在下およびその薬剤の非存在下でＢＡＸのα９ヘリックスペプチドをＢＡＸのＮ末端結合部位と接触させる工程と、
ＢＡＸのα９ヘリックスペプチドとＢＡＸのＮ末端結合部位との間の結合を測定する工程と
を含み、その薬剤の非存在下における結合に比較したその薬剤の存在下における結合の減少は、その薬剤がＢＡＸの活性のモジュレーターであることを示す、方法も提供される。

１つの実施形態では、その薬剤は、ＢＡＸの阻害剤である。または、その薬剤は、ＢＡＸの活性化剤であってよい。

ＢＡＸのα９ペプチドは、アミノ酸配列ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡＳＬＴＩＷＫＫＭＧ（配列番号１１）を有する。ＢＡＸのα９ヘリックスペプチドは、図１５に例示されている。異なる実施形態では、ＢＡＸのα９ヘリックスペプチドまたはＢＡＸのＮ末端結合部位は、固体基質上に固定することができる。ＢＡＸのα９ヘリックスペプチドとＢＡＸのＮ末端結合部位との間の結合は、例えば蛍光アッセイまたは表面プラズモン共鳴アッセイまたは共免疫沈降アッセイまたはＮＭＲアッセイを使用して測定できる。

ＢＣＬ−２結合Ｘタンパク質（ＢＡＸ）のモジュレーターとしての薬剤を同定するための方法であって、その薬剤をＢＡＸと接触させる工程と、その薬剤が別のＢＡＸまたはその部分を用いたＢＡＸの二量体化を阻害または促進するかどうかを測定する工程とを含み、その薬剤の非存在下に比較してその薬剤の存在下における結合の減少は、その薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害することを示し、その薬剤の非存在下に比較してその薬剤の存在下におけるＢＡＸの他のＢＡＸ分子への結合の増加は、その薬剤がＢＡＸの二量体化を促進することを示す、方法も開示される。

本明細書に開示した方法のいずれにおいても、ＢＡＸは、ヒトＢＡＸであってよい。

その薬剤は、例えば、小分子、単離ペプチド、合成ペプチド、天然もしくは非天然アミノ酸もしくは組み合わせを備えるペプチドをベースとする薬剤、炭化水素ステープルペプチド、拘束ペプチド、大員環、ペプトイド、ペプチドミメティック、フォルダマー、アプタマー、抗体、モノボディ、ナノボディ、またはそれらの組み合わせであってよい。１つの実施形態では、薬剤は、ＢＡＸのα９ヘリックスのペプチドミメティックである。

本明細書に記載した方法の１つの実施形態では、その薬剤は、２，０００ダルトン以下の小分子である。本明細書に記載した方法の１つの実施形態では、その薬剤は、１，５００ダルトン以下の小分子である。本明細書に記載した方法の１つの実施形態では、その薬剤は、１，０００ダルトン以下の小分子である。本明細書に記載した方法の１つの実施形態では、その薬剤は、８００ダルトン以下の小分子である。本明細書に記載した方法の１つの実施形態では、その薬剤は、２，０００、１，５００、１，０００、８００、７００、６００、５００または４００ダルトン以下いずれかの小分子である。本明細書に記載した方法の１つの実施形態では、その薬剤は、小有機分子である。

本明細書に開示した方法は、ＢＡＸの二量体化を促進するか、またはＢＡＸを阻害すると同定された薬剤を、早期または望ましくない細胞死と関連しており、かつＢＡＸの異常な活性化、発現または機能を特徴とする疾患または障害を有する対象に投与する工程と、その疾患を治療する際のその薬剤の有効性を試験する工程とをさらに含むことができる。本方法は、ＢＡＸの二量体化を阻害するか、またはＢＡＸを活性化すると同定された薬剤を、癌を有する対象に投与する工程と、癌を治療する際にその薬剤の有効性を試験する工程とをさらに含むことができる。

さらに、ＢＡＸのＮ末端結合部位と相互作用する以下のペプチド：
１．ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡＳＬＴＩＷＫＫＭＧ（配列番号１１）（ＢＡＸのα９に対応する）
２．ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡＳＬＴ（配列番号１２）
３．ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡ（配列番号１３）
４．ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬ（配列番号１４）
も提供される。強調表示したアミノ酸残基は、ＢＡＸのＮ末端結合部位と相互作用する。ＢＡＸのＮ末端結合部位と相互作用しない他の残基は、任意の残基に突然変異する可能性があるが、ペプチド配列は依然として結合および阻害機能を有することができる。したがって、本発明は、配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧ（配列番号１５）（式中、任意の位置にある「Ｘ」は、独立して任意のアミノ酸または非天然アミノ酸であり得る）を含む、１１〜３０個のアミノ酸残基のペプチドを提供する。１つの実施形態では、配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧ（配列番号１５）を含む１１〜３０個のアミノ酸残基のペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４のいずれも含まない。本発明は、配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧＶＸＴＡ（配列番号１６）（式中、任意の位置にある「Ｘ」は、独立して任意のアミノ酸または非天然アミノ酸であり得る）を含む、１５〜３０個のアミノ酸残基のペプチドをさらに提供する。１つの実施形態では、配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧＶＸＴＡ（配列番号１６）を含む１５〜３０個のアミノ酸残基のペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４のいずれも含まない。本発明は、配列Ｙ１ＸＹ２Ｙ３ＸＸＹ４Ｙ５ＸＹ６Ｙ７（配列番号１７）（式中、Ｙ１は、トレオニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、Ｙ２は、グルタミンもしくは保存残基または非天然アミノ酸であり、Ｙ３は、トレオニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、Ｙ４は、イソロイシンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、Ｙ５は、フェニルアラニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、Ｙ６は、アラニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、Ｙ７は、グリシンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸であり、任意の位置にあるＸは、独立して任意のアミノ酸または天然もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり得る）を含む、１１〜３０個のアミノ酸残基のペプチドもさらに提供する。好ましくは、各配列内の少なくとも１つのＸまたは１つのＹは、非天然アミノ酸もしくは非天然型化学修飾アミノ酸である。例えば１１〜３０個のアミノ酸は、１１〜３０の任意のアミノ酸数、すなわち、１１、１２、１３、１４、．．．２９または３０アミノ酸残基を意味する。１つの実施形態では、ペプチドは、配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧ（配列番号１５）または配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧＶＸＴＡ（配列番号１６）からなる。異なる実施形態では、相互作用性残基は、ＢＡＸとの相互作用を維持する保存または類似の残基にさらに突然変異することができるであろう。異なる実施形態では、ペプチドは、例えば蛍光標識または放射性標識などの標識で標識することができる。１つの実施形態では、本明細書で要求したペプチドは、化学合成ペプチドまたは組換えＤＮＡもしくはｃＤＮＡによって生成されるペプチドである。例えば、ペプチドは、液相合成または固相合成によって作成することができる。ペプチドは、例えば、組換えＤＮＡまたはｃＤＮＡを使用して合成することができる。１つの実施形態では、ペプチドは、より大きい天然型ＢＡＸタンパク質から、例えばそのタンパク質の消化によって直接的には入手されない。１つの実施形態では、ペプチドは、単離および精製ペプチドである。

ＢＡＸを阻害するための方法であって、ＢＡＸを本明細書に開示したペプチドのいずれかと接触させる工程を含む方法が提供される。ＢＡＸは、好ましくはＢＡＸの阻害が細胞死を阻害する生細胞内にあってよい。ＢＡＸは、例えばヒトなどの哺乳動物などの対象内にある可能性があり、その薬剤はその対象に投与される。その対象は、早期または望ましくない細胞死に関連しており、かつＢＡＸの異常な活性化、発現または機能を特徴とする疾患または障害を有する可能性がある。

早期または望ましくない細胞死に関連しており、かつＢＡＸの異常な活性化、発現または機能を特徴とする疾患および障害には、心血管疾患および障害（例えば、動脈硬化症、心不全、心臓移植、動脈瘤、慢性肺疾患、虚血性心疾患、高血圧、血栓症、心筋症）、神経変性性および神経系疾患および障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症、様々な形態の小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症）、肝臓疾患および障害、腎臓疾患および障害、免疫障害（例えば、臓器移植拒否反応、関節炎、狼瘡、ＩＢＤ、クローン病、喘息、多発性硬化症、糖尿病）、虚血（例えば、脳卒中、心筋梗塞および再潅流障害）、不妊症（例えば、早発閉経症、卵巣障害または卵胞閉鎖）、血液疾患（例えば、ファンコニー貧血、再生不良性貧血、サラセミア、先天性好中球減少症、脊髄異形成）、腎低酸素症、肝炎、喘息およびＡＩＤＳが含まれる。細胞死の阻害に関連しており、かつＢＡＸの異常な阻害、発現または機能を特徴とする疾患には、例えば、癌および自己免疫疾患が含まれる。

細胞死を阻害するための候補薬剤として薬剤を同定するための方法であって、
ＢＣＬ−２結合Ｘタンパク質（ＢＡＸ）を、その薬剤の存在下およびその薬剤の非存在下において本明細書に開示したペプチドのいずれかのうちの１つ以上と接触させる工程と、
その１つ以上のペプチドのＢＡＸへの結合を測定する工程と
を含み、
その薬剤の非存在下におけるＢＡＸへのその１つ以上のペプチドの結合に比較してその薬剤の存在下でのその１つ以上のペプチドのＢＡＸへの結合の減少は、その薬剤が細胞死を阻害するための候補薬剤であることを示す、方法も提供される。１つの実施形態では、そのペプチドは、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いて蛍光標識される。

本明細書で使用する「ＢＡＸ」は、ＢＣＬ−２結合Ｘタンパク質である。１つの実施形態では、ＢＡＸは、哺乳動物のＢＡＸである。１つの好ましい実施形態では、ＢＡＸは、ヒトＢＡＸである。１つの実施形態では、ＢＡＸは、以下の配列：
ＭＤＧＳＧＥＱＰＲＧＧＧＰＴＳＳＥＱＩＭＫＴＧＡＬＬＬＱＧＦＩＱＤＲＡＧＲＭＧＧＥＡＰＥＬＡＬＤＰＶＰＱＤＡＳＴＫＫＬＳＥＣＬＫＲＩＧＤＥＬＤＳＮＭＥＬＱＲＭＩＡＡＶＤＴＤＳＰＲＥＶＦＦＲＶＡＡＤＭＦＳＤＧＮＦＮＷＧＲＶＶＡＬＦＹＦＡＳＫＬＶＬＫＡＬＣＴＫＶＰＥＬＩＲＴＩＭＧＷＴＬＤＦＬＲＥＲＬＬＧＷＩＱＤＱＧＧＷＤＧＬＬＳＹＦＧＴＰＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡＳＬＴＩＷＫＫＭＧ（配列番号１）を有する連続アミノ酸残基を含む。

本明細書に記載した方法の１つの実施形態では、本方法は、治療用細胞死阻害剤を同定するために有用である。本明細書に記載した方法の１つの実施形態では、本方法は、治療用細胞死活性化剤を同定するために有用である。

本明細書に記載した様々な要素のあらゆる組み合わせは、本明細書で他に特に記載しない限り、または状況によって明白に否定されない限り、本発明の範囲内に含まれる。

本発明は、以下に記載する実験の詳細からより明白に理解されるであろう。しかし、当業者であれば、特定の方法および考察された結果は、以下に続く特許請求の範囲においてより十分に記載する本発明の単に具体例であることを容易に理解するであろう。

実験の詳細
材料および方法
試薬 − ＢＩＭのＢＨ３ドメインであるＢＩＭ ＳＡＨＢ_Ａ２：Ｎ−アセチル化^１４５ＥＩＷＩＡＱＥＬＲＳ５ＩＧＤＳ５ＦＮＡＹＹＡ^１６４−ＣＯＮＨ_２（配列番号２）（式中、Ｓ５は、オレフィンメタセシスのために挿入された非天然アミノ酸を表す）に対応する炭化水素ステープルペプチドは、以前にＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社によって記載されたように合成、精製および特性解析した（１１）。

組換えＢＡＸの生成 − ヒトＢＡＸ野生型および突然変異体は、標準ＰＣＲに基づくクローニング戦略およびｐＴＹＢ１ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）内でのＰＣＲに基づく特定部位突然変異誘発を使用して生成し、構築物をシーケンシングによって確証した。組み換えタンパク質は、ＢＬ２１（ＤＥ３）コドン＋大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株中で発現させ、以前に記載されたように精製した（１６）。

サイズ排除クロマトグラフィ − Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬおよび２００ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを組み換えタンパク質および細胞抽出物のサイズ排除クロマトグラフィのために使用した。組換えタンパク質は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴを含有するバッファーを用いて平衡化させたカラム内に注入した。１ｍｇの細胞質抽出物もしくは膜抽出物は、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＧＴＡ、２００ｍＭのスクロースおよび完全プロテアーゼ阻害剤を含有するバッファー中で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬに適用した。５００μｌの分画を収集し、３０μｌの各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによって解析した。全操作は、４℃でランした。タンパク質の分子量を推定するための標準曲線を得るために、ゲル濾過分子量マーカー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）もカラムにかけた。

動的光散乱法 − 様々なサンプルの動的光散乱は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＤｙｎａＰｒｏ８０１機器ならびにデータ収集および解析用のＤＹＮＡＭＩＣＳ ｖ．５．２５．４４ソフトウエアを使用して測定した。サイズ排除クロマトグラフィからの溶出後のタンパク質サンプルを１０分間にわたり１３，０００ｒｐｍで遠心し、プラスチック製キュベットに装填した。典型的には、各１００μｌサンプルに対して５秒間の１００回のスキャンを取得した。正規化強度対液体力学半径（ｎｍ）は２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴバッファー中で測定した。

結晶化 − ２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴバッファー中の同種ＢＡＸタンパク質は、濾過装置（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を使用して１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＢＡＸ野生型および突然変異体についての結晶化条件の初期スクリーニングは、２９３Ｋで９６ウェルＩｎｔｅｌｌｉ−Ｐｌａｔｅｓ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用するシッティングドロップ蒸気拡散法によって実施した。ＢＡＸタンパク質は２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中で１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、遠心した後に結晶化セットアップにかけた。回折品質の棒状結晶は、０．１ＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）、１．５Ｍの硫酸アンモニウム中で２４ウェルＶＤＸプレート（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用する懸滴蒸気拡散法によって生成した。１μｌのタンパク質溶液とリザーバー溶液とを混合し、１ｍｌのリザーバー溶液に対して平衡化させた。結晶は５秒間にわたり０．１ＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）、１．５Ｍの硫酸アンモニウムおよび２５％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含有する２０μｌの凍結防止剤溶液中に浸漬することにより凍結防止し、液体窒素中で急速冷凍した。

データ収集および構造決定 − Ｘ線回折データは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ ＳｏｕｒｃｅおよびＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅにおいてビームラインで収集した。全てのデータを統合してＨＫＬ２０００を用いてスケーリングし（１９）、その後のプロセッシングはＣＣＰ４ソフトウエア一式（２０）を用いて実施した。ＢＡＸの結晶構造は、検索モデルとしてのＢＡＸ（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｆ１６）の単量体ＮＭＲ構造を使用する分子置換法によって決定した。モデルはポリＡｌａに突然変異させた。ＣＯＯＴ（２１）を使用するモデルの複数サイクルの手動エディティングおよび調整の後に、模擬アニーリング、エネルギー最小化およびＲＥＦＭＡＣ（２２）を用いた個別等方性Ｂ因子リファインメントを続けた。ヘリックスα１およびα２の間のループの破損鎖は、モデル構築段階での不良な解説データのために実現した。最終モデルはＰＲＯＣＨＥＣＫ（２３）を用いて妥当性確認し、ＰＩＳＡ（２４）および分子モデルはＰＹＭＯＬ（２５）を使用して提供された。データ収集および統計データは、表２に要約した。

ＮＭＲサンプルおよび分光法 − タンパク質サンプルは、５％のＤ_２Ｏ中の２５ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌナトリウム溶液（ｐＨ６．０）中で調製した。ＢＡＸ Ｐ１６８Ｇ単量体：ＨＮＣＯ、ＨＮＣＡ、ＨＮＣＯＣＡ、ＨＮＣＡＣＢ、ＨＮＣＯＣＡＣＢおよびＮ^１５ ＮＮＨ−ＮＯＥＳＹのバックボーン^１Ｈ、^１３Ｃ、^１５Ｎ配置に対する^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣ、^１Ｈ−^１５Ｎ ＴＲＯＳＹスペクトルと三重共鳴スペクトルとの相関は、２５℃で極低温プローブを装備したＩｎｏｖａ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計上で取得し、Ｔｏｐｓｉｎを使用してプロセッシングし、ＣＣＰＮＭＲ（２６）を用いて解析した。ＢＡＸ野生型クロスピーク配置は、以前に報告されたように適用した（１１、１６）。指示したモル比での加重平均化学シフト差Δは、ｐｐｍ単位で√（ΔδＨ^１）^２＋（ΔδＮ^１５／５）^２として計算した。棒(bar)の非存在は、化学シフト差がないこと、または重複していて解析に使用しなかったプロリンもしくは残基の存在を示す。バックボーンのアミド化学シフト変化についての有意性閾値は、標準方法にしたがって、全残基にわたる平均化学シフト＋標準偏差に基づいて計算した。

ＢＡＸ二量体化アッセイ − ＢＡＸ野生型および突然変異体は、ＢＡＸバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、１５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）中で約０．５ｍＭに濃縮し、２０℃で１〜３時間インキュベートし、その後に総容量２５０μｌに希釈し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填した。これらの条件は、ＢＡＸ活性化に起因して凝集よりもむしろ制御二量体化プロセスを可能にする。単量体および二量体ＢＡＸの分離は、４℃で０．５ｍｌ／分の流量を使用して達成した。クロマトグラムのトレースは、各々約１１．８および約１０．４ｍｌで単量体および二量体ピークを示している。タンパク質標準物質（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してゲル濾過ピークの分子量を校正した。クロマトグラムトレースは、新鮮ＳＥＣ精製単量体ＢＡＸの数種の独立調製物を表している。

ＢＡＸ架橋結合 − 二量体化は、架橋結合アプローチを使用して指示量にあるＢＡＸを２０×のＢＭＨとともに氷上で１５分間インキュベートした後に１ｍＭのＤＴＴを用いてクエンチすることによって検出した。サンプルは９０℃で変性させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析した。

リポソーム透過化アッセイ − リポソームは、以下のモル百分率の脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）：ホスファチジルコリン、４８％；ホスファチジルエタノールアミン、２８％；ホスファチジルイノシトール、１０％；ジオレオイルホスファチジルセリン、１０％；およびテトラオレオイルカルジオリピン、４％から構成し、抽出後にＡＮＴＳ／ＤＰＸ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）とともに装填した。ＢＡＸ（４００ｎＭ）は、９６ウェルフォーマット（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で指示濃度でＢＩＭ ＳＡＨＢ_Ａ２と組み合わせ、次にリポソーム（５０ｍＭの総脂質ストックからの１０μｌ）をアッセイバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、２００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２および０．２ｍＭのＥＤＴＡ）中に最終容量１００μｌとなるまで加えた。ＡＮＴＳ／ＤＰＸ遊離は、リポソームから上清中に遊離されるとＤＰＸクエンチャーからＡＮＴＳ蛍光体が分離された場合に発生する蛍光強度の増加に基づいて定量した。蛍光（λ_ｅｘ＝３５５ｎｍおよびλ_ｅｍ＝５２０ｎｍ）は３０℃で経時的にＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００プレートリーダーを使用して測定した。９０分間でのＡＮＴＳ／ＤＰＸの遊離率は、遊離率＝（（Ｆ−Ｆ_０）／（Ｆ_１００−Ｆ_０））×１００（式中、Ｆ_０およびＦ_１００は、各々ベースライン蛍光および最高蛍光である）として計算した。アッセイ毎のリポソーム遊離の最高量を決定するために１％のトリトン処理を使用したが、この数値は１００％値を設定する。

細胞培養、細胞トランスフェクションおよびアポトーシスアッセイ − 野生型ＭＥＦおよびＳＶ４０形質転換Ｂａｘ^−／−Ｂａｋ^−／−（ＤＫＯ）ＭＥＦは、１０％のＦＢＳ、１００Ｕｍｌ^−１のペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸および５０μＭのβ−メルカプトエタノールを補給したＤＭＥＭ高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。ＢＡＸおよびＢＡＸ突然変異体のＤＫＯ細胞内への再構成は、ＢＡＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはＢＡＸ（Ｐ１６８Ｇ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドのレトロウイルス形質導入によって達成し、その後にＧＦＰ陽性細胞に対するＭｏＦｌｏソーティングを実施した。レトロウイルスの生成は、以前に記載されたように実施した（１７）。ＢＡＸ ＷＴおよび突然変異体タンパク質の匹敵する発現はウェスタン解析によって確証した。スタウロスポリン処理のために、ＭＥＦ（５×１０^４／ウェル）を６ウェルクリアボトムプレート内の血清含有培地中で１６〜１８時間播種し、次に１μＭのスタウロスポリンで処理した。ＢＡＸまたはＢＡＸ突然変異体の一過性レトロウイルス形質導入のために、ＤＫＯ ＭＥＦは３０〜３６時間にわたりＢＡＸまたはＢＡＸ突然変異体を発現するレトロウイルスを用いて感染させた。細胞死は、アネキシン−Ｖ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）染色によって定量した。フローサイトメトリーは、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施し、データはＦＡＣＳＤｉｖａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して解析した。ＢＡＸまたはＢＡＸ突然変異体の発現は、抗ＢＡＸウエスタンブロットによって評価した。統計分析のためのＰ値は、スチューデントのｔ検定を使用して入手した。

細胞亜分画 − ＭＥＦは、１０％のＦＢＳ、１００Ｕｍｌ^−１のペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸および５０μＭのβ−メルカプトエタノールを補給したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。ＭＥＦ（２０×１０^６／ウェル）は１２時間にわたり１５０ｍｍディッシュ中に播種した。細胞質およびミトコンドリア分画を単離するために、細胞は１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＧＴＡ、２００ｍＭのスクロースおよび完全プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解バッファー中でＤｏｕｎｃｅ型ホモジナイザーによって溶解させた。細胞溶解物は、未溶解細胞および核を除去するために１０分間にわたり７００×ｇで遠心した。上清を１２，０００×ｇで１０分間にわたり４℃で遠心し、生じたペレットはミトコンドリア分画として収集した。膜ペレットはＬＢ＋１％のＣＨＡＰＳ中に再懸濁させた。

ウエスタンブロッティング − ２０μｇの全細胞タンパク質を４〜１２％のＮｕＰａｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲル上で電気泳動法により分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、イムノブロッティングにかけた。Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたタンパク質の可視化のために、膜は２．５％粉乳を含有するＰＢＳ中でブロッキングした。一次ＢＡＸ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ２７７２Ｓ）を１：１，０００の希釈率において４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、膜を１：５，０００の希釈率にあるＩＲｄｙｅ８００コンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにインキュベートした。タンパク質はＯｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステムを用いて検出した。

ＢＡＸ構造変化アッセイ − 細胞質分画を免疫沈降法にかけ、その後に全ＢＡＸに対するイムノブロッティングを実施した。手短には、１００〜３００μｇの総タンパク質を収集し、前平衡プロテインＧセファロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）とともに１時間インキュベートした。事前に証明されたサンプルを次に６Ａ７抗体（６μｇ／ｍｌ）（１：１，０００、ｓｃ−２３９５９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で４時間インキュベートし、その後に１時間にわたり前平衡プロテインＧセファロースビーズを添加した。これらのビーズをペレット化し、溶解バッファーを用いて４℃で３回洗浄し、ＬＤＳ／ＤＴＴ装填用バッファー中で１０分間にわたり９０℃でビーズを加熱することによりタンパク質を溶出した。免疫沈降物をＢＡＸ抗体（１：１，０００）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ２７７２Ｓ）を使用して電気泳動法およびウエスタンブロッティング解析にかけた。

結果
本発明は、細胞質ＢＡＸが１つのプロモーターのＮ末端トリガー部位により媒介される二量体自己阻害形を形成し、および第２プロモーターのα９を含む新規な相互作用性Ｃ末端表面を形成するという発見を利用している。ＢＡＸのこれらの相互作用性タンパク質表面は、ＢＡＸ阻害の構造的基礎を理解するため、およびＢＡＸを薬理学的に調節するための薬物を設計するための重要な洞察を提供する。単量体野生型ＢＡＸ（ＢＡＸ ＷＴ）は、ＢＨ３活性化ドメインの非存在下で、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）およびポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）により測定されたように経時的に可逆的に二量体を形成する。ＢＡＸのα８−α９ループ内の、ヘリックスα９動員を制御する例えばＰ１６８Ｇなどの単一点突然変異は、ＳＥＣによる同一の二量体ピークを生成する。ＢＡＸ Ｐ１６８Ｇは、室温で数日間持続するより安定性の二量体を形成する。

マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）由来の組換えＢＡＸおよび細胞質ＢＡＸの構造を研究した。組換え全長ＢＡＸは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物からキチンアフィニティークロマトグラフィ、その後にサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）（１７）を使用して精製した。組換えＢＡＸは、主としてその単量体形（１１、１７）に対応するピークに、および追加して二量体形に対応する第２の明確なピークにＳＥＣから溶出する（図１Ａ、１Ｂ）。培養したＭＥＦは、洗剤を含まないバッファー中に溶解させ、細胞質分画およびミトコンドリア分画を分離して、その後にＳＥＣによる分別にかけた。驚くべきことに、内因性ＢＡＸは、組換えＢＡＸのための同一ＳＥＣ条件を使用するとＢＡＸ二量体に対応する分画中に溶出した（図１Ｂ）。次に、ＳＥＣをＢＡＸ^−／−およびＢＡＫ^−／−（ＤＫＯ ＭＥＦ）が二重に欠損していて内因性レベルでヒトＢＡＸを安定的に発現するＭＥＦを用いて繰り返すと、再び細胞質ＢＡＸが二量体として出現した（図１Ｂ）。細胞質ＢＡＸが細胞質内に抗アポトーシス性ＢＣＬ−２タンパク質を備えるヘテロ二量体である可能性を排除するために、細胞質およびミトコンドリア分画をウエスタンブロット解析にかけ、抗アポトーシスタンパク質がＢＡＸに比較して細胞質内で極めて低レベルにあり、主としてミトコンドリアに存在することが確証された（図５）。さらに、細胞質ＢＡＸ二量体は、活性ＢＡＸ構造のみを認識する６Ａ７抗体を使用する免疫沈降法解析によって実証されたように非活性構造にある（図６）（１８）。しかし、細胞質ＢＡＸがその活性化を促進する洗剤を用いて処理された場合、ＢＡＸは、おそらくＢＡＸオリゴマーを形成する主として高分子量で出現した。さらに、わずかな部分はＢＡＸ単量体として溶出したが、これはＢＡＸ活性化がＢＡＸ二量体構造の崩壊を必要とすることを示唆している（図１Ｂ）。これらをまとめると、これらの結果は、細胞質ＢＡＸが主として二量体および非活性構造を採用することを証明している。

細胞質ＢＡＸ二量体構造が果たす生理学的役割を解明するために、ＢＡＸ二量体化の分子的根拠を研究した。第一に、十分量のＢＡＸ二量体を再現性よく生成するための方法は、ＳＥＣまたはＢＭＨ架橋剤を用いた処理の後にポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって証明されたように、高濃度にあるＢＡＸ単量体のインキュベーションによって確証された（図１Ｃ、７）。ＳＥＣの単量体ピークおよび二量体ピークは、ＢＡＸ単量体（約２１ＫＤ）および二量体（約４２ＫＤ）各々の同種集団に対応することが動的光散乱法によって確証された（表１）。リポソームアッセイでは、ＢＡＸ単量体は単独では膜を透過することはできないが、炭化水素ステープルＢＩＭ ＢＨ３ヘリックスであるＢＩＭ ＳＡＨＢ_Ａ２によって活性化されると活性化されて膜透過化が誘導された（図１Ｄ）（１１、１２）。これとは対照的に、ＳＥＣ単離ＢＡＸ二量体単独はリポソーム透過化アッセイにおいて膜透過化を誘導する能力を示さず、ＢＩＭ ＳＡＨＢ_Ａ２の添加後には、ほぼ非活性であった（図１Ｄ）。このため、ＢＡＸ二量体構造は非活性であり、単量体ＢＡＸに比較して活性化に対して抵抗性であり、これはＢＡＸ二量体が自己阻害構造を形成できることを示唆している。

非活性ＢＡＸ二量体に関するより詳細な洞察を得るために、Ｘ線結晶学的研究を実施した。上首尾の結晶化を予測するために野生型ＢＡＸおよび突然変異体を用いて、ＳＥＣ二量体ピークの安定性をモニタリングした。回折用の結晶の品質は、野生型ＢＡＸよりも安定性の二量体を生成する突然変異体を用いた方が優れていた。ＢＡＸの構造を変化させないがα８−α９ループの動力学を低下させるＢＡＸ Ｐ１６８Ｇ突然変異体は、結晶を生成することに成功し、１．９Åの分解能で天然Ｘ線データセットが得られた。結晶構造は、検索モデルとしての全長ＢＡＸのＮＭＲ構造を使用する分子置換アプローチによって解明およびリファインメントした（表２）。非対称性単位は、その中では全ＢＡＸ残基をＮ末端非構造化領域の残基（残基１〜１３）ならびにヘリックス素α１およびα２間の非構造化領域（残基３７〜４０）からを除いてトレースすることができるであろう極めて優れた電子密度マップを備える２つのＢＡＸ分子を含有していた（図２）。二量体化インターフェースは、保存残基によって形成され、広範囲に、ほぼ１，９００Å^２の表面積を覆い隠している（図２Ａおよび８）。極めて顕著なことに、ＢＡＸ二量体構造は、ＢＡＸの活性化のために重要な構造表面の相互作用を誘導する二量体化インターフェース；１つのＢＡＸプロモーターからのＮ末端トリガー部位およびＣ末端α９ヘリックスを含む第２ＢＡＸプロモーターからの新規なＣ末端表面を明らかにしている。（図２Ｂ、１４）。注目すべきことに、この二量体構造および二量体化インターフェースは、ヘリックス１との新規な水素結合を導入するＢＨ３残基突然変異体としてのＢＡＸ Ｐ１６８Ｇ突然変異体とは無関係であり、３．３Åの分解能でのＸ線結晶学検査により決定されるように同一非対称二量体構造を生じさせる（図９、表２）。

非対称ＢＡＸ二量体構造内のＢＡＸプロモーターは、溶液ＮＭＲによって決定される非活性単量体ＢＡＸ構造に似ているが、しかし、それらはヘリックスの方向およびループの構造においては顕著な差を有する（２．１Åのバックボーンｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）（１７）。最も顕著な差は、ヘリックスα１、α６、α２およびα１−α２ループを含むＮ末端トリガー部位表面内に位置する残基に対応する。さらに、ＢＩＭ ＢＨ３ヘリックスに結合した全長ＢＡＸ（３．０Åのバックボーンｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）の構造との比較（１１）は、非対称性二量体中では、α１−α２ループが閉構造にあり、ヘリックスα１およびα６と特異的分子内接触を形成しているが、他方では、ＢＩＭ ＢＨ３結合ＢＡＸ構造は開構造および活性構造にあるα１−α２ループを有することを示している（１１、１２）。このため、構造解析は、非対称性二量体構造が、細胞質非活性ＢＡＸ二量体の証拠と一致して別個であるが、非活性構造にある２つのＢＡＸ構造を含有することを示している（図１）。

非対称性ＢＡＸ二量体構造は、ＢＡＸの２つの新規な相互作用表面を強調している（図３）。１つのＢＡＸプロモーターの相互作用表面は、大部分がその周辺での多数の追加の相互作用を伴ってＢＩＭ ＳＡＨＢ_Ａ２へ結合することが以前に同定されたＢＡＸトリガー部位残基を含んでいる（１１）。さらに、Ｃ末端表面での相互作用部位は、Ｃ末端ヘリックスα９を含むＢＡＸの新規で予期せぬ結合表面である。Ｃ末端結合表面は、ヘリックスα８、α７、α３、α４−α５ループおよびα８−α９ループの極性および荷電残基によって取り囲まれているα９の溶媒露出疎水性残基からの疎水性中心を有する（図３Ａ）。Ｎ末端結合表面は、Ｃ末端結合表面の荷電残基を補完する荷電残基によって取り囲まれているα１、α６およびα１−α２ループの溶媒露出疎水性残基からの疎水性中心を有する（図３Ａ）。二量体化インターフェースの核は疎水性である（図３Ｂ、Ｃ）。数種の残基はＮ末端ＢＨ３結合部位へのヘリックスα９の結合を補完する疎水性相互作用のネットワークを形成する（図３Ｃ）。しかし、多数の水素結合および塩橋は、二量体形成および安定性に寄与する（図３Ｂ、Ｄ、Ｅ）。そこで、疎水性の極性相互作用および塩橋が広範囲に及ぶ高度に相補的な二量体化インターフェースに含まれる。

Ｎ末端トリガー部位にＢＨ３が結合すると、α１−α２ループは、６Ａ７エピトープ（残基１２〜２４）およびＢＡＸ活性化のために必須の構造変化である開構造に置換される（１１、１２、１７、１８）（図１０Ａ）。これとは対照的に、二量体ＢＡＸ構造では、α９はα１−α２ループの構造を閉鎖および非活性構造に維持する方向にあるＮ末端ＢＨ３結合部位に結合する（図１０Ａ）。詳細には、ＢＩＭ ＢＨ３結合は、ＢＩＭ ＢＨ３の保存疎水性残基とともに、α１およびα６の露出疎水性残基によって媒介される（図１０Ｂ、１１Ａ）。しかし、二量体ＢＡＸ構造では、これらのα１残基の多くが覆い隠され、その代わりに同一ＢＡＸプロモーターのα１−α２ループの残基と相互作用する。これはα９の疎水性残基との相互作用を促進するα１およびα１−α２ループのポジショニングから形成された代替疎水性空洞を生成する（図１０Ｃ）。このα１−α２ループ閉構造も分子間相互作用を安定化させるためにループの極性および荷電残基をポジショニングする（図１０Ｃ、１１Ｂ）。このため、α１／α６部位およびα１−α２ループ内のこれらの新規な相互作用は、ＢＡＸトリガー部位への接近を阻害し、およびその固有の疎水性空洞内の適所にヘリックスα９を維持しながら非活性ＢＡＸ構造を安定化させる（図１２）。これらの構造的洞察は、細胞質ＢＡＸが、その活性化およびミトコンドリア転移のために必要とされる重要な相互作用を閉塞させる自己阻害二量体を形成するという強力な証拠を提供する。

結晶構造内の二量体化インターフェースおよび溶液中で観察されたＢＡＸ二量体が短縮ＢＡＸ ΔＣ２１について以前に報告されたドメインスワップ二量体ではないこと（１３）を確証するために、以前に報告されたように（１３）活性化に抵抗性であり、ドメインスワップ二量体を形成することができない４ＭＡと称する内部架橋結合突然変異体（Ｃ６２Ｓ、Ｃ１２６Ｓ、Ｖ１２１Ｃ、Ｉ１３６Ｃ）を利用した。予期されたように、ＢＡＸ ４ＭＡは、これらの突然変異がＢＡＸ ＷＴ構造内と同様に非活性構造を維持するため、ＢＡＸ二量体を形成する能力を保持している（図４Ａ）。二量体結晶構造と一致して、α９とＢＨ３グルーブとの相互作用を不安定化させる二量体インターフェースであるＥ７５ＫおよびＴ１７２ＫまたはＳ１８４Ｌでの重要な相互作用を形成する残基中の突然変異は、二量体形成を崩壊させる（図４Ａ）。次に、Ｎ末端トリガー部位結合剤であるＢＩＭ ＳＨＡＢ_Ａが二量体と競合して解離できるかどうかを試験した。単離ＢＡＸ ４ＭＡ二量体は、量を増加させながらＢＩＭ ＳＨＡＢ_Ａとともに、または使用せずにインキュベートした。これらの結果は、高用量にあるＢＩＭ ＳＨＡＢ_Ａがその二量体と競合し、単量体に解離させられることを証明している（図１４Ａ）。さらに、内部架橋ＢＡＸ ４ＭＡ突然変異体を還元させる還元剤（ＤＴＴ）の存在下では、ＢＩＭ ＳＨＡＢ_Ａは、さらにＢＡＸオリゴマー化を誘導するためにＢＡＸ ４ＭＡ単量体を活性化することができる。これらの生化学的データは、さらにＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質による活性化を抑制する機構としての自己阻害二量体ＢＡＸの妥当性を確証している。

ＢＡＸ二量体化機構が果たす生理学的役割を研究するために、ＢＡＸ ＷＴおよび突然変異体が自己阻害二量体を形成してＢＡＸ活性化を調節する能力に関する研究を実施した。ＤＫＯ ＭＥＦはＢＡＸ ＷＴおよび突然変異体を用いて生理学的発現レベルで再構成された。Ｐ１６８Ｇ突然変異体はＢＡＸ ＷＴより安定性の自己阻害二量体を形成するが（図４Ａ、図１４Ｂ）、他方では、Ｅ７５ＫおよびＳ１８４Ｌ突然変異体はＢＡＸ二量体化を崩壊させる（図４Ａ）。これと一致して、ＢＡＸ ＷＴおよびＢＡＸ Ｐ１６８Ｇタンパク質はいずれも細胞質内で二量体のみを形成する。しかし、ＢＡＸ Ｅ７５ＫおよびＢＡＸ Ｓ１８４Ｌは細胞質内で単量体を形成する（図４Ｂ）。印象的にも、単量体ＢＡＸを用いたＢＡＸ突然変異体の構成的発現は、ＢＡＸ ＷＴと比較して細胞死誘導における有意に増加した活性を示した（図４Ｃ）。これとは対照的に、より安定性の細胞質二量体を備えるＢＡＸ Ｐ１６８Ｇ突然変異体細胞は、ＢＡＸ ＷＴと比較して損傷した活性を有している（図４Ｃ）。さらに、スタウロスポリン処理後、ＢＡＸ Ｐ１６８Ｇ二量体は、ＢＡＸ ＷＴに比較してミトコンドリア外膜内の転移およびオリゴマー化を受けることにより抵抗性であった（図４Ｄ）。しかし、スタウロスポリン処理後、単量体ＢＡＸ Ｅ７５ＫおよびＳ１８４Ｌは、対応するＢＡＸ ＷＴ二量体よりもミトコンドリア外膜でのより迅速な活性化およびオリゴマーへの形質転換を受ける（図４Ｄ）。これをまとめると、これらのデータは、細胞質ＢＡＸが構造を自己阻害二量体から単量体へ切り換えられること、ならびに単量体ＢＡＸは、二量体ＢＡＸがＢＡＸ活性化および最終的には細胞死活性を妨害しながらより迅速なＢＡＸ活性化およびより強力な細胞死活性に好都合であることを示している。

アポトーシスの開始中、細胞質ＢＡＸはミトコンドリアへ転移するために、活性化剤であるＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質とＮ末端トリガー部位との相互作用、その後にＮ末端構造変化およびα９のそのＣ末端疎水性グルーブからの置換を介して活性化される。さらに、その疎水性グルーブから置換されたα９を備えるミトコンドリア結合ＢＡＸは、活性化剤ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質によるさらなる活性化後にはＮ末端構造変化を受ける（１３）。ＢＡＸ活性化のステップとは無関係に、膜透過化をもたらす完全ＢＡＸ活性化にはＮ末端およびＣ末端表面での構造変化が必要とされる。本明細書に記載の研究は、細胞質ＢＡＸが各プロモーター内のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかの構造変化を防止し、制御下にあるＢＡＸ活性化を維持するために自己阻害二量体構造を形成することを示唆している（図１３）。細胞内でのアポトーシスの誘導には、それらの発現レベルまたは活性状態の確率的揺らぎを超えるプロアポトーシス性シグナル（例えばＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質）の深い関与を必要とするはずである。このため、ＢＡＸ自己阻害は、ＢＡＸ活性化を遮断するためおよび望ましくないアポトーシスを防止するための機構を提供する。最終的に、これらの構造的および機能的洞察は、過剰な細胞死または細胞生存を特徴とする疾患におけるアポトーシスを調節するために、Ｎ末端部位またはＣ末端部位のいずれかに係合する薬理学的モジュレーターの開発のために重要な意味を有する（２、３）。

参考文献
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２３．Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ８，４７７−４８６（１９９６）．
２４．Ｅ．Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ，Ｋ．Ｈｅｎｒｉｃｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２，７７４−７９７．（２００７）．
２５．Ｗ．Ｌ．ＤｅＬａｎｏ，ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ，ＵＳＡ（２００２）．
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細胞死を促進または阻害するための候補薬剤として薬剤を同定するための方法であって、（ａ）その薬剤をＢＣＬ−２結合Ｘタンパク質（ＢＡＸ）単量体もしくはその部分および／またはＢＡＸ二量体と接触させる工程と、（ｂ）その薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害または促進するかどうかを測定する工程とを含み、その薬剤の非存在下に比較してその薬剤の存在下におけるＢＡＸ単量体の他のＢＡＸ単量体またはＢＡＸ単量体の部分への結合の減少は、その薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害することを示し、ＢＡＸの二量体化を阻害する薬剤が細胞死を促進するための候補薬剤であり、その薬剤の非存在下に比較してその薬剤の存在下におけるＢＡＸ単量体またはその部分の他のＢＡＸ単量体またはその部分への結合の増加は、その薬剤がＢＡＸの二量体化を促進することを示し、ＢＡＸの二量体化を促進する薬剤が細胞死を阻害するための候補薬剤である、方法が提供される。

Claims (27)

1. 細胞死を促進または阻害するための候補薬剤として薬剤を同定する方法であって、
   （ａ）前記薬剤をＢＣＬ−２結合Ｘタンパク質（ＢＡＸ）単量体もしくはその部分および／またはＢＡＸ二量体と接触させる工程と、
   （ｂ）前記薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害または促進するかどうかを測定する工程と
   を含み、
   前記薬剤の非存在下に比較して前記薬剤の存在下におけるＢＡＸ単量体の他のＢＡＸ単量体またはＢＡＸ単量体の部分への結合の減少は、前記薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害することを示し、薬剤がＢＡＸの二量体化を阻害する薬剤が細胞死を促進するための候補薬剤であり、
   前記薬剤の非存在下に比較して前記薬剤の存在下におけるＢＡＸ単量体またはその部分の他のＢＡＸ単量体またはその部分への結合の増加は、前記薬剤がＢＡＸの二量体化を促進することを示し、薬剤がＢＡＸの二量体化を促進する薬剤が細胞死を阻害するための候補薬剤である、方法。
2. 前記薬剤は、ＢＡＸのＮ末端結合部位および／またはＣ末端結合部位のアミノ酸残基に結合する、請求項１に記載の方法。
3. 前記薬剤は、ＢＡＸのＮ末端に結合部位残基Ｓ１６、Ｅ１７、Ｑ１８、Ｉ１９、Ｍ２０、Ｋ２１、Ｔ２２、Ｇ２３、Ａ２４、Ｌ２５、Ｌ２６、Ｉ２７、Ｑ２８、Ｇ２９、Ｆ３０、Ｉ３１、Ｑ３２、Ｄ３３、Ｒ３４、Ａ３５、Ｇ３６、Ｒ３７、Ｍ３８、Ｇ３９、Ｇ４０、Ｅ４１、Ａ４２、Ｐ４３、Ｅ４４、Ｌ４５、Ａ４６、Ｌ４７、Ｄ４８、Ｐ４９、Ｖ５０、Ｐ５１、Ｑ５２、Ｄ５３、Ａ５４、Ｖ１２９、Ｐ１３０、Ｅ１３１、Ｌ１３２、Ｉ１３３、Ｒ１３４、Ｔ１３５、Ｉ１３６、Ｍ１３７、Ｇ１３８、Ｗ１３９、Ｔ１４０、Ｌ１４１、Ｄ１４２、Ｆ１４３、Ｌ１４４、Ｒ１４５、Ｅ１４６およびＲ１４７のうちの１つ以上で結合する、請求項１に記載の方法。
4. 前記薬剤は、ＢＡＸのＣ末端に結合部位残基Ｎ７３、Ｍ７４、Ｅ７５、Ｌ７６、Ｄ９８、Ｍ９９、Ｆ１００、Ｓ１０１、Ｄ１０２、Ｇ１０３、Ｎ１０４、Ｆ１０５、Ｎ１０６、Ｗ１０７、Ｇ１０８、Ｒ１０９、Ｉ１５２、Ｑ１５３、Ｄ１５４、Ｑ１５５、Ｇ１５６、Ｇ１５７、Ｗ１５８、Ｄ１５９、Ｇ１６０、Ｌ１６１、Ｌ１６２、Ｓ１６３、Ｙ１６４、Ｆ１６５、Ｇ１６６、Ｔ１６７、Ｐ１６８、Ｔ１６９、Ｗ１７０、Ｑ１７１、Ｔ１７２、Ｖ１７３、Ｔ１７４、Ｉ１７５、Ｆ１７６、Ｖ１７７、Ａ１７８、Ｇ１７９、Ｖ１８０、Ｌ１８１、Ｔ１８２、Ａ１８３、Ｓ１８４、Ｌ１８５、Ｔ１８６、Ｉ１８７、Ｗ１８８、Ｋ１８９ Ｋ１９０、Ｍ１９１およびＧ１９２のうちの１つ以上で結合する、請求項１に記載の方法。
5. 二量体または単量体としてのＢＡＸの測定は、蛍光偏光アッセイ、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、動的光散乱法、およびＢＡＸ二量体または単量体のいずれかに特異的に結合する抗体のうちの１つ以上を使用して実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ＢＡＸの活性を調節する薬剤を同定するための方法であって、
   前記薬剤の存在下および前記薬剤の非存在下でＢＡＸのα９ヘリックスペプチドをＢＡＸのＮ末端結合部位と接触させる工程と、
   ＢＡＸの前記α９ヘリックスペプチドとＢＡＸの前記Ｎ末端結合部位との間の結合を測定する工程と
   を含み、前記薬剤の非存在下における結合に比較した前記薬剤の存在下における結合の減少は、前記薬剤がＢＡＸの活性のモジュレーターであることを示す、方法。
7. 前記薬剤は、ＢＡＸの阻害剤である、請求項６に記載の方法。
8. ＢＡＸの前記α９ペプチドは、アミノ酸配列ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡＳＬＴＩＷＫＫＭＧ（配列番号１１）を有する、請求項６または７に記載の方法。
9. ＢＡＸの前記α９ヘリックスペプチドまたはＢＡＸの前記Ｎ末端結合部位は、固体基質上に固定される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. ＢＡＸの前記α９ヘリックスペプチドとＢＡＸの前記Ｎ末端結合部位との間の結合は、蛍光アッセイを使用して測定される、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ＢＡＸは、ヒトＢＡＸである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記薬剤は、小分子、単離ペプチド、合成ペプチド、天然もしくは非天然アミノ酸もしくは組み合わせを備えるペプチドをベースとする薬剤、炭化水素ステープルペプチド、拘束ペプチド、大員環、ペプトイド、ペプチドミメティック、フォルダマー、アプタマー、抗体、モノボディ、ナノボディ、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ＢＡＸの二量体化を促進するか、またはＢＡＸを阻害すると同定された薬剤を、早期または望ましくない細胞死と関連しており、かつＢＡＸの異常な活性化、発現または機能を特徴とする疾患または障害を有する対象に投与する工程と、前記疾患を治療する際の前記薬剤の有効性を試験する工程とをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. ＢＡＸの二量体化を阻害するか、またはＢＡＸを活性化すると同定された薬剤を、癌を有する対象に投与する工程と、癌を治療する際に前記薬剤の有効性を試験する工程とをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
15. ａ）ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡＳＬＴＩＷＫＫＭＧ（配列番号１１）、
    ｂ）ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡＳＬＴ（配列番号１２）、
    ｃ）ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬＴＡ（配列番号１３）、
    ｄ）ＴＷＱＴＶＴＩＦＶＡＧＶＬ（配列番号１４）、
    ｅ）配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧ（配列番号１５）（式中、任意の位置にあるＸは、独立して任意のアミノ酸または非天然アミノ酸もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり得る）を含む、１１〜３０個のアミノ酸残基、
    ｆ）配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧＶＸＴＡ（配列番号１６）（式中、任意の位置にあるＸは、独立して任意のアミノ酸または非天然アミノ酸もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり得る）を含む、１５〜３０個のアミノ酸残基、または
    ｇ）配列Ｙ１ＸＹ２Ｙ３ＸＸＹ４Ｙ５ＸＹ６Ｙ７（配列番号１７）（式中、Ｙ１は、トレオニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり、Ｙ２は、グルタミンもしくは保存残基または非天然アミノ酸もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり、Ｙ３は、トレオニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり、Ｙ４は、イソロイシンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり、Ｙ５は、フェニルアラニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり、Ｙ６は、アラニンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり、Ｙ７は、グリシンもしくは保存アミノ酸または非天然アミノ酸もしくは非天然型化学修飾アミノ酸であり、任意の位置にあるＸは、独立して任意のアミノ酸または天然もしくは非天然型化学修飾アミノ酸である）を含む、１１〜３０個のアミノ酸残基
    からなるペプチド。
16. 前記配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧ（配列番号１５）または前記配列ＴＸＱＴＸＸＩＦＸＡＧＶＸＴＡ（配列番号１６）からなる、請求項１５に記載のペプチド。
17. 請求項１５または１６に記載のペプチドのいずれかからなる化学合成ペプチド。
18. 請求項１５または１６に記載のペプチドのいずれかからなる組換えＤＮＡまたはｃＤＮＡによって生成されたペプチド。
19. 請求項１５または１６に記載のペプチドのいずれかからなる単離および精製ペプチド。
20. ＢＡＸを、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のペプチドと接触させる工程を含む、ＢＡＸを阻害する方法。
21. ＢＡＸは生細胞内にあり、およびＢＡＸの阻害は細胞死を阻害する、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ＢＡＸは対象内にあり、および前記薬剤は前記対象に投与される、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記対象は、ヒトである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記対象は、早期または望ましくない細胞死に関連しており、かつＢＡＸの異常な活性化、発現または機能を特徴とする疾患または障害を有する、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 前記疾患または障害は、心血管疾患もしくは障害、神経変性性もしくは神経系疾患もしくは障害、肝臓疾患もしくは障害、腎臓疾患もしくは障害、免疫障害、虚血、不妊症、血液疾患、腎低酸素症、肝炎、喘息またはＡＩＤＳである、請求項１３または２４に記載の方法。
26. 蛍光標識または放射性標識に結合されている、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のペプチドを含む標識ペプチド。
27. 細胞死を阻害するための候補薬剤として薬剤を同定する方法であって、
    ＢＣＬ−２結合Ｘタンパク質（ＢＡＸ）を、前記薬剤の存在下および前記薬剤の非存在下において請求項１５〜１９または２６のいずれか一項に記載の１つ以上のペプチドと接触させる工程と、
    前記１つ以上のペプチドのＢＡＸへの結合を測定する工程と
    を含み、
    前記薬剤の非存在下におけるＢＡＸへの前記１つ以上のペプチドの結合に比較して前記薬剤の存在下での前記１つ以上のペプチドのＢＡＸへの結合の減少は、前記薬剤が細胞死を阻害するための候補薬剤であることを示す、方法。

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