CN107406881B - 用于指导癌症治疗的内容相关的诊断测试 - Google Patents

Abstract

本发明公开提供了与多种癌症相关的诊断方法，其包括对BH3谱诊断方法的改善。

Description

用于指导癌症治疗的内容相关的诊断测试

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年1月12日提交的美国临时申请No.62/102,499的优先权，就所有目的而言，该申请的内容以引用方式并入本文。本申请以引用方式将以下参考文献的内容全部并入本文：2013年5月10日提交的PCT/US13/40585，该申请要求2012年5月10日提交的美国临时申请No.61/645,253和2013年3月13日提交的美国临时申请No.61/780,252的优先权。

以电子形式提交的文本文件的描述

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技术领域

本发明公开涉及用于评价人类样品中的肿瘤的方法。

背景技术

与靶向癌症疗法配合的预测及预后生物标志物的使用可以是药品研发时间、改善药品效力及指导临床决策的关键。尽管在癌症的治疗中有所进展，但是化疗很大程度上仍是低效率的及无效的。化疗普遍表现不佳的一个原因在于所选择的治疗通常并非与单个患者的基本密切地匹配。将精确诊断与治疗学偶联的个性化医学方法可以减轻所述的问题。在2014年7月，FDA发行了“Guidance for Industry:In Vitro Companion DiagnosticDevices”以帮助企业在更早的药品研发阶段识别伴随诊断的需要。

到目前为止，仅少数的生物标志物对临床肿瘤实践具有价值。一部分是由于感知的标志物通常是相关的，但是不是药品机制的原因。即使当“生物标志物”生物学与伴随疗法的药理学一致时，在预测药品在各个患者中如何发挥作用中仍具有显著的挑战。此外，临床研发的途径需要看到所述测试的价值并认为其能够带给他们的患者益处的科研医生的参与。

抗凋亡BCL-2家族的蛋白质是癌细胞对化疗产生应答的关键因素。已经证明这些蛋白质在调控线粒体凋亡中功能性的测量，提供了用于癌症患者对治疗的应答的预测性生物标志物。许多化疗依赖于有效的凋亡，并且在一些情况下，特异性抗凋亡蛋白质对凋亡的调控与对特定疗法的应答有关。然后，特定蛋白质的测量提供用于药品应答的生物标志物。因此，此后继续寻找测定对治疗试剂产生的预期应答的生物标志物。

发明概述

因此，在一个方面中，本发明提供了选择用于患者的癌症治疗的方法，该方法包括测量试剂的应答，其中所述的试剂的功能利用患者的癌细胞的BH3谱来干扰MCL1和BFL1蛋白质，从而隔离促凋亡蛋白质；以及将患者的一个或多个临床特征包含在预测算法中，从而将各个患者对干扰MCL1功能的一种或多种癌症治疗所产生的临床应答的可能性进行分类。

在一些实施方案中，并且如本文所示，患者的癌症样本由骨髓抽吸物纯化的癌细胞组成。癌细胞暴露于多种试剂，这些试剂选择性地干扰与促凋亡蛋白质BIM,Bid,Bax或Bak结合的MCL1或MCL1和BFL1，如使用仅含BH3的蛋白质NOXA或者BH3模拟物的肽所测定的那样，所述的仅含BH3的蛋白质NOXA或者BH3模拟物对MCL1或MCL1和BFL1具有选择性。

在一些方面中，在测试中使用的NOXA肽为AELPPEFAAQLRKIGDKVYC(SEQ ID NO:l)。在其他的方面中，NOXA肽可以包含SEQ ID NO:1。在一些方面中，SEQ ID NO:1用作核心NOXA肽，并且NOXA肽可以包含得自内源NOXA蛋白质的侧翼序列。例如在一些方面中，NOXA肽可以为MPGKKARKNAQPSPARAP[AELPPEFAAQLRKIGDKVYC]FRQKLLNLISKLFCSGT(SEQ ID NO:2)。在其他的方面中，侧翼序列可以包含核心，以及至多10个氨基酸、至多20个氨基酸、至多30个氨基酸或者至多40个氨基酸，这些氨基酸得自由与所述的核心具有一致性的区域延伸的NOXA肽(即，AEL...KLN)，如通过针对NP 066950的BLAST(使用缺省参数)测量的那样。可以将氨基酸加入N-末端和/或C-末端。可以根据Genbank登陆NP066950提供的序列将氨基酸编号，或者氨基酸可以选自这些序列。在其他的方面中，使用的核心肽为与SEQ ID NO:l肽(即，AEL...KLN)具有一致性的野生型序列。

除了基于长度或同源性(与NOXA序列的同源性)变化的肽以外，还可以对肽进行修饰从而可以通过总体流动或网格蛋白介导的内吞作用(例如通过NOXA序列与TAT序列融合)(例如在Lin et al.,"Therapeutic applications of the TAT-mediated proteintransduction system for complex I deficiency and other mitochondrialdiseases,"Annals of the New York Academy of Sciences 1350,17-28中公开)而达到增加的细胞渗透，通过诱变和选择(用于改善的亲和性)而对肽进行优化以用于与MCL-1的结合(Dutta et al."Determinants of BH3binding specificity for Mcl-1versus Bcl-xL.Journal of molecular biology"398,747-762(2010))，以及通过加入化学部分而对肽进行改性从而具有改善的α-螺旋的稳定性(参见structural and functionalinformation in Stewart et al.,"The MCL-1BH3helix is an exclusive MCL-1inhibitor and apoptosis sensitizer,"Nature chemical biology 6,595-601,(2010))。此外，通过大规模功能结合筛选而鉴定的NOXA模拟化合物(例如在PCT/US2013/046826中定义的那些(在作为美国申请公开No.2015-0150869而公开))可以替代NOXA肽在NOXA动员测试(priming assay)中用作MCL-1依赖性的其他的或取代的标志物。此外，用于评估BH3动员(用于其他的BH3蛋白质)的合适的肽在PCT/US2013/046826(还在美国申请公开No.2015-0150869中公开)的表1中公开，对于所有这些肽，所述的文献以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，并且如本文所示，将由患者癌症样本得到的BH3测试读值与由外周血得到的BH3谱读值比较，其中所述的样本由骨髓抽吸物纯化的癌细胞组成。不同的读值预测了对不同治疗选择的应答。此外，已经显示在取自患者骨髓的AML细胞上实施的BH3谱，以预测FLAM治疗，而由外周血得到的AML细胞上的BH3谱不能预测FLAM治疗，但是可以预测7+3治疗。

在一些实施方案中，并且如本文所示，多种临床因素，甚至与凋亡不相关的或者未知与凋亡相关的那些，可以用于增加BID谱的预测能力，从而将所述的测试转化成预测、而不仅是预后的测试。

在一些实施方案中，本文所述的方法提供了诊断测试，其预测了白血病患者对CDK-9抑制化合物的应答。在一些方面中，CDK-9抑制剂为Flavopiridol(alvocidib)。在其他的方面中，CDK-9抑制剂可以与作为治疗方案的一部分与一种或多种其他的化合物共同给予。例如方案可以是alvocidib与ara-C和米托蒽醌(FLAM)结合。其他可变因素可以被认为用于增加测试可变因素的敏感性。例如患者的细胞发生谱或状态和/或年龄可以计入预测算法中。在一些实施方案中，诊断测试包括测量MCL1的功能，包括测量响应于BID肽NOXA或MCLl/Bfl-1选择性BID模拟化合物EU5346的、线粒体膜电位的变化(D.Richard etal.Molecular Cancer Therapeutics,2013中的化合物9)。

在另一个方面中，本发明提供了用于测定患者的癌症治疗的方法，其包括将一种或多种BID结构域肽传递至渗透化的患者癌细胞中，从而测定动员的程度；通过免疫组织化学和/或荧光原位杂交(FISH)测定患者癌细胞的一种或多种临床因素的存在或缺乏；以及针对对一种或多种癌症治疗的临床应答的可能性将患者分类。

在另一个方面中，本发明提供了测定AML患者对alvocidib或FLAM治疗的应答的方法，其包括针对由骨髓收集得到的患者AML癌细胞样本测定BH3谱；测定患者的一种或多种临床因素，并且其中一种或多种临床因素选自年龄谱和/或细胞发生状态；以及针对对一种或多种癌症治疗的临床应答的可能性将患者分类。

在另一个方面中，本发明提供了AML患者对alvocidib或FLAM治疗、或者单独的阿糖胞苷基治疗的应答的方法，其包括测定由骨髓收集得到的患者AML癌细胞样本的BH3谱；测定一种或多种患者的临床因素，并且其中一种或多种临床因素选自年龄谱和/或细胞发生状态；以及针对对一种或多种癌症治疗的临床应答的可能性将患者分类。然后，将该读值与得自外周血样本的BH3谱读值比较。具体而言，已经证明在0.1μΜ下BUM BH3肽的BH3谱读值对于ara-C治疗具有预测性，但对alvocidib不具有与测性。

在另一个方面中，本发明提供了用于测定AML患者对(白细胞介素-6)IL-6拮抗治疗试剂或MCL1选择性BH3模拟物的应答的方法，其包括测定由骨髓收集得到的患者AML癌细胞样本的BH3谱；测定患者的一种或多种临床因素，并且其中一种或多种临床因素选自年龄谱和/或细胞发生状态；以及针对对一种或多种癌症治疗的临床应答的可能性将患者分类。然后，将该读值与得自外周血样本的BH3谱读值比较。

本发明的细节在以下所附的说明书中列出。尽管类似于或等同于本文所述的那些的方法和材料可以在本发明的实践或测试中使用，但是现在描述示意性的方法和材料。本发明的其他特征、目的和益处将通过说明书和权利要求书而变得显而易见。在说明书和所附的权利要求书中，单数形式还包括复数，除非内容中另外作出相反的说明。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域任一技术人员通常理解的含义。

此外，癌细胞的体内情况会影响在癌症发作和持续中所涉及的MCL1蛋白质和靶向MCL1的治疗的效力的程度。具体而言，处于骨髓基质中的骨髓性白血病和骨髓瘤细胞更取决于MCL1的存活，而非在外周血中循环的那些。此外，已经建立得自外周血样品的BIM BID肽将AML患者对ara-C以及蒽环类抗生素,7+3的应答相关联。但是，该读值以及得自外周血中白血病细胞的任何BID谱读值均不能预测AML患者对FLAM或对其他MCL1抑制治疗的应答。

尽管已知BID谱本身能够提供对治疗的化学敏感性或化学反应性想一般指示。但是在本文中，鉴定机制(集中于MCL1蛋白质)的特异性相关性提供了用于预测患者对MCL1的应答的特别敏感的方法，从而影响治疗。然而，当癌细胞由骨髓的基质分离时，所述的情况仅对于某些靶向MCL1的治疗是真实的。

附图简述

图1A-E示出由骨髓样品得到的代表性BH3谱数据，其中所述的骨髓样品得自使用FLAM方案治疗的患者。所述的附图显示由AML患者得到的高动员的与低动员的母细胞模式的差异。通过用于骨髓中NOXA动员的ROC分析鉴定的临界值(具有最高的敏感性和特异性的结合)为大约10.7％，并且在40％的临界值下得到100％的阳性预测值(PPV)和70.5％的阴性预测值(NPV)。改变该阈值(用于患者作为应答者或非应答者的分类)将产物不同的敏感性和特异性的水平，并且该阈值的选择取决于研究的本性。例如如果目的是为了鉴定对试剂产生应答的每一位患者，则在以产生假阳性结果的代价下选择较低的阈值，或者如果目的是鉴定具有最高精确性的阳性(PPV)，则选择较高的阈值用于给定的研究。因此，基于NOXA动员的分类不是绝对的，并且可以经过调解而适应于所需的医学应用。面板A-C示出各个细胞发生风险分类内容的实例(Fav-有利的，adv-不利的，以及int-中等)，其示出发生CR的具有高NOXA动员的患者。面板D-E示出治疗失败的具有低NOXA动员的中间风险和不利风险的患者。

图2A-F示出在所有FLAM治疗的患者样本中通过受试者工作特征曲线(ROC)分析，BH3肽与对FLAM的响应的相关性。面板A、C和E示出BAD,BIM100和PUMA的受试者工作特征曲线(ROC)分析，并结合细胞发生风险因素和MDS(骨髓增生异常综合征)历史临床可变因素。面板B、D和F示出相应的点图，其示出与未达到CR的那些人相比，在达到CR的患者中由结合的度量得到的各个患者的数据点。

图3A-C示出在骨髓衍生的FLAM治疗的患者的样本中通过dot blot相关性分析，NOXA BH3肽与对FLAM的响应的相关性。单独的NOXA动员示出在骨髓基质内容的样品中的预测值。面板A-C示出代表在所有样品(A)、以及由骨髓(B)或外周血(C)取得的那些样品中测量的NOXA动员的dot plot。得自骨髓的样品示出与CR的显著相关性，其在由外周血基质内容中取得的样品中未见。

图4A-D示出在骨髓衍生的内容FLAM治疗的患者样本中通过受试者工作特征曲线(ROC)分析，NOXA BH3肽与应答的相关性。图A和B示出在所有样品中NOXA肽动员的受试者工作特征曲线(ROC)分析，并组合细胞发生风险因素和MDS历史临床可变因素。图C和D示出由骨髓抽出的样品的相同点，但是其不同于得自外周血的样品。加入细胞发生风险因素和MDS历史改善了测试的预测能力，并且在具有细胞发生风险因素和MDS历史的BM NOXA动员中，AUC值为0.92。

图5A至5C示出用于预测对治疗的应答的动员的实例。图5A示出BIM0.1(左侧面板)和NOXA(右侧面板)谱的实例。图5B示出对于某些单一的BH3肽而言，在混合的外周血和骨髓血液样品中测试读值之间缺乏相关性。图5C示出在AML患者的外周血样品中测试读值之间缺乏相关性。

图6示出在处治AML患者中用于鉴定癌症治疗之间选择算法的方法。通过比较相关的BIM 0.1和NOXA谱，患者可以分配为FLAM治疗、7+3治疗，或者鉴定为不适用于这两种治疗。

图7示出由CTRP v2.0药品筛选下载细胞系对药物试剂的应答。使用dinaciclib(CDK1,2,5和9的抑制剂)和alvocidib(CDK9抑制剂)测试总计437个细胞系。通过数值积分使用8个浓度点来计算曲线下面积的值。使用Pearson方法计算应答与这些试剂之间的相关性，并且发现其为大约0.95％。这些数据表明由于2种试剂之间的相似性，所以NOXA生物标志物可以用于预测对dinaciclib以及alvocidib的应答。

图8示出由AML样品得到的NOXA读值，其中所述的样品代表了60岁或更大的患者群体。NOXA信号的传播表明跨越这些代表性群体的信号的广泛代表性。数据显示在通过NOXA动物测定的细胞中，较高的MCL-1依赖性表明对低甲基化试剂(HMA)的敏感性。使用thePraediCare Dx^TM测试，使用NOXA肽，针对MCL-1依赖性绘制癌症细胞系谱(n＝33)。在这些细胞系中对阿扎胞苷和地西他滨的应答得自癌症应答治疗门路(Broad Institute CTD2公共数据库)，并且基于使用地西他滨的40％分位数和阿扎胞苷的12％分位数作为应答的阈值而得到的AUC值(曲线下面积)，将细胞分类为相应于低甲基化试剂(HMA)。计算2组之间Rank-sum测试p值，并显示于印迹上。综上，这表明可以需要通过NOXA生物标志物的MCL-1依赖性用于对HMA的应答。

图9示出通过NOXA动员而现实的细胞系对MCL-1选择性BH3模拟化合物EU5346(Richard et al 2013)也具有产生应答，其中所述的化合物EU5346根据the PraediCareDx^TMformat直接施加于渗透化的细胞。在3种悬浮的癌细胞系中线粒体对化合物的应答(用动员值表示)表明，EU5346在the PraediCare Dx^TM测试中可以用作配体用于检测NOXA动员。

图10A和10B示出在FLAM方案上在AML患者中NOXA动员之间的关系。图10A示出在AML和MDS患者样品中代表的NOXA动员，其中所述的患者代表了60岁或更大的患者群体。NOXA动员是使用the Praedicare Dx测试评估的。图10B示出在使用FLAM治疗的AML患者中相对时间绘制的NOXA动员指数，生存函数S(x)。生存曲线使用40％NOXA动员作为临界值。其中在该组中具有7位完全缓解(CR)，17位非应答者(NR)。低NOXA组的中值生存为303天，该中值生存未达到高NOXA组。对于低NOXA，我们的95％的较低的置信带为142天以下至为测定的上限，对于高NOXA，我们的95％的较低的置信带为959天以下至为测定的上限。高NOXA组和低NOXA组之间的生存差异时序检验得到p值为0.023。

图11A和11B示出通过FLT3突变状态分类的以及通过对地西他滨的应答分类的64位AML患者样品的线粒体谱相关性。预治疗的样品动员与作为单一试剂的地西他滨的应答具有相关性(图11A)。对地西他滨治疗产生应答的FLT3突变阴性患者与未应答的那些患者相比，对BID模拟物的线粒体应答明显更高，BIM 0.1(p＝0.04)。具有FLT3突变的患者通常具有明显更高BIM 0.1的动员(p＝0.02)(图11B)。

图12A-12D示出FLT3突变状态、动员和对地西他滨的应答之间的相关性方面。图12示出在FLT3阴性患者中BIM 0.1和HRK的动员(分别如图12A和12B所示)，其中我们看见较高的动员与对地西他滨的应答的相关性。使用时序检验和t检验来验证该相关性，并且其结果示于各图中。底部面板示出在患者的FLT3状态下，BIM 0.1(图12C)和HRK(图12D)的动员的相关性，其中在FLT3ITD阳性患者中，FLT3动员显示较高。使用线性回归分析检验该相关性，并且以动员作为应答，以FLT3状态作为预报器。总体模型p值(通过f统计)和FLT3ITD系数p值(通过t统计)示于下文附图的各图中。这表明FLT3阳性状态与FLT3阴性患者相比，与较高的动员具有相关性。

图1示出FLAM患者研究。总体患者概况示于表1中，并且各内容中阳性患者的数量超过各值可利用数据的总数。

图2示出FLAM治疗的患者概况分析。表格列出了所获得的所有样品。在3个不同的方案中登记患者(J0669,J0856和J01101)，并且是最新诊断的AML患者。样品得自外周血或骨髓抽吸物。在诊断室计算老化情况。使用CALGB指导原则测定细胞发生风险因素。细胞发生情况、FLT-3、NPM1突变状态、MDS历史、化疗史、骨髓原始细胞百分率、白细胞(WBC)计数、治疗和应答均获得。灰色阴影的样品是未成功测定BH3动员的，并且由所有随后的分析中排除(MRD-轻微后遗症、TF-治疗失败、RT-部分应答、CR-完全缓解)。完全应答(CR)表征为以下的一种或多种、通常为全部：低于5％成髓细胞，并且所有细胞系均自然成熟；ANC≥1000/μl并且血小板计数≥100,000/uL；外周血中缺乏原始细胞；骨髓中缺乏白血病细胞；与疾病有关的细胞发生被清除；并且早先的髓外病被清除。

表3示出临床特征与FLAM应答的相关性。相对于应答进行临床可变因素的统计学分析。通过时序Mann-Whitney测试和Logistic Regression分析测试每个所示的度量的显著性。AUC(曲线下面积)得自ROC曲线分析。

表4示出由FLAM患者研究得到的BH3谱数据。在表2中列出的所有患者样品上形成BH3谱。灰色阴影的几行为在处理过程中不满足BH3谱的接受标准的样品。包含破折号(-)的所有细胞均不具有对所示的细胞实施各种BH3肽测试的足够的细胞。信噪比为在CCCP JC-1读值MFI上的DMSO JC-1红色平均荧光强度(MFI)。通过使用台盼蓝拒染法的人工细胞计数来测定细胞计数和百分生活力。百分原始细胞为渗透化的活力细胞的CD45-dim,CD3/CD20阴性,和SSC-低的百分率。所有BH3谱都是在这些门控的原始细胞上实施的。

表5示出单个BH3肽谱与CR的相关性。相对于应答进行BH肽的统计学分析，并将CR样品与所有的部分应答的、轻微后遗症和治疗失败(NR-非应答者)比较。通过时序Mann-Whitney测试和Logistic Regression分析测试每个所示的度量的显著性。AUC(曲线下面积)得自ROC曲线分析。

表6示出在FLAM研究中具有其他临床可变因素的BH3肽谱的多变量分析。相对于应答进行BH3肽的统计学分析，并将CR样品与NR样品比较。使用逻辑回归测试可变因素的组合，从而测定在逻辑回归模型下的系数和常数，然后通过时序Mann-Whitney测试和ROC曲线分析来测试这些系数和常数。

表7示出在骨髓样品中单个BH3肽谱与CR的相关性。仅在得自骨髓的那些样品中实施BH3肽的统计学分析，如表5中所示。通过时序Mann-Whitney测试和Logistic Regression分析测试每个所示的度量的显著性。AUC(曲线下面积)得自ROC曲线分析。该分析表明NOXA动员在在对治疗产生应答的患者中明显高于非应答者。

表8示出在得自骨髓基质内容的样品中BH3肽的统计学分析。使用动员值测定Mann-Whitney p值或者由逻辑回归计算对数似然比。通过最终模型与空模型的ANOVA分析来计算逻辑回归的p值。该分析显示，BAD,BIM100和PUMA的组合也与单独的骨髓样品中的应答有关。NOXA和3个肽的读值被加入细胞发生风险分类和MDS历史中，并且得到更高的显著性和AUC值。

发明详述

本下发现：BH3谱测试的医学应用可以实现用于通过测量得自患者骨髓基质的癌细胞中的应答来预测对单独的CDK抑制剂(例如CDK-9抑制剂，例如alvocidib)或者在共同治疗方案(例如FLAM)中的应答。在由外周血或者外周血样品和骨髓样品的组合收集得到的血液中，BID谱测量的敏感性和/或特异性显著改善。可见NOXA生成的信号与应答的相关性急剧升高，如当仅使用得自骨髓基质内容的样品时，p值由0.445降低至0.0007所示(表6和7)。当临床可变因素、细胞发生和年龄内容被纳入分析时，测试的敏感性由0.805(AUC)改善至0.91(AUC)。本发明提供不同的算法来预测AML患者对FLAM治疗的应答。在一个方面中，单独使用NOXA动员来预测患者对FLAM方案的应答。在另一个方面中，可以组合使用BAD+BIM100+PUMA动员，从而预测患者对FLAM方案的应答。本发明所述的诊断方法提供了用于预测对MCL1干扰疗法的应答的新方法。

在一个方面中，本发明提供了用于测定患者的癌症治疗的方法，其包括测定在得自骨髓的患者的肿瘤或癌细胞样本中MCL1依赖性的程度；测定患者的一个或多个临床因素；以及针对临床应答的可能性将患者分类至一种或多种癌症治疗；其中选择一种或多种临床因素来增加与临床应答相关的MCL1特异性BH3谱读值的特异性和/或敏感性。

在另一个方面中，本发明提供了用于测定患者的癌症治疗的方法，其包括将患者的渗透化的癌细胞暴露于NOXA BH3结构域肽，从而测定动员的程度；通过免疫组织化学和/或荧光原位杂交(FISH)测定患者的癌细胞的一个或多个临床因素的存在或缺乏；以及针对临床应答的可能性将患者分类至一种或多种癌症治疗。

在另一个方面中，本发明提供了用于测定AML患者对阿糖胞苷和/或FLAM的应答的方法，其包括针对由骨髓或外周血得到的患者的AML癌细胞样本测定BH3谱；将由这2种癌细胞来源得到的读值比较；以及使用该信息指导FLAM或阿糖胞苷基的治疗。

在多个实施方案中，临床内容为年龄、细胞发生状态、功能(performance)、组织学亚类、性别和疾病阶段中的一种或多种。在另一个实施方案中，所述的方法进一步包括选自成熟状态、单核苷酸多态性、稳定状态的蛋白质水平和动态蛋白质水平的其他生物标志物的量度，其可以将其他的特异性和/或敏感性加入测试中。在另一个实施方案中，所述的方法进一步包括预测患者中的临床应答。在另一个实施方案中，临床应答为至少大约1、大约2、大约3或者大约5年的无进展/无事件生存率。

在某些实施方案中，动员通过以下等式定义：

其中AUC包含曲线下面积或信号强度；DMSO包含基线阴性对照；而CCCP(羰基氰化物m-氯苯基腙)包含通过发挥质子梯度的解偶联试剂作用而成为蛋白质合成的效应器，其中所述的质子梯度是在线粒体的电子传递链中电子载体的正常活性包含基线阳性对照的过程中建立。在一些实施方案中，曲线下面积是通过均相时间分辨荧光(HTRF)建立的。在一些实施方案中，时间在大约0至大约300min、直至大约0至大约30min的窗口内发生的。在一些实施方案中，曲线下面积是通过中值荧光强度(MFI)统计的荧光激活细胞分选术(FACS)建立的。在一些实施方案中，荧光强度为在大约5min至大约300min内进行的单一时间点测量。对于单一的肽，动员可以按以下计算：

示例性临床决策

在一些实施方案中，本发明所述的方法用于患者的评价，例如评价诊断、预后和对治疗的应答。在多个方面中，本发明包含评价肿瘤或血液学癌症。在多个实施方案中，评价可以选自诊断、预后和对治疗的应答。

诊断是指试图测定或鉴定可能的疾病或紊乱(例如癌症)的过程。预后是指预测疾病或紊乱(例如癌症)的可能结果。完全预后通常包括预期的持续时间、功能和疾病过程的描述，例如下降型、间歇性危机或突发的不可预测的危机。对治疗的应答为当接受治疗时对患者医学结果的预测。对治疗的应答的非限定性实例可以为病理学完全应答、生存、无进展生存、进展之间和复发的可能性。

在多个实施方案中，本方法涉及关于患者是否接受特定治疗的临床决策。在一个实施方案中，本方法预测了对新辅助和/或辅助化疗的阳性应答，或者对新辅助和/或辅助化疗的非应答。在一个实施方案中，本方法预测了对促凋亡试剂或通过凋亡进行操作的试剂和/或并非通过凋亡进行操作的试剂的阳性应答，或对凋亡效应器试剂和/或并非通过凋亡进行操作的试剂的非应答。在多个实施方案中，本发明涉及癌症患者的治疗，例如包括应该给予或拒绝何种类型的治疗。

在一个实施方案中，本方法涉及关于在初级治疗、主要治疗或初始治疗后患者是否接受辅助疗法的临床决策。辅助疗法也称为辅助护理，是除了初级治疗、主要治疗或初始治疗以外给予的治疗。辅助疗法的非限定性实例可以是在手术后通常给予的额外的治疗，其中所有可检测的疾病已经除去，但是其中由于瘾发而保留了复发的统计学风险。

在一些实施方案中，本方法涉及患者的治疗，包括辅助疗法。例如经过评分对特定的治疗产生应答的患者可以接收此类治疗作为辅助疗法。此外，本方法可以涉及辅助疗法的特性，其非限定性治疗为以促凋亡的方式或者并非以促凋亡的方式进行诱导和/或操作的治疗。在一个实施方案中，本方法可以表明患者对特定的治疗未产生应答或具有较低的应答，因此，此类患者可以不必接受此类治疗作为辅助疗法。因此，在一些实施方案中，本方法提供了根据患者可能的应答提供或拒绝辅助疗法。按照这种方式，可以改善患者的生活品质和护理成本。

在一些实施方案中，本方法涉及关于患者是否接受特定类型的治疗的临床决策。因此，在一些实施方案中，本方法为用于患者治疗的指导测试。

在一些实施方案中，本方法提供了关于可能的应答的信息，其中所述的应答是患者对特定的治疗所具有的。在一些实施方案中，本方法提供了高可能性的应答，并且可以指导治疗，包括积极治疗。在一些实施方案中，本方法提供了低可能性的应答，并且可以指导治疗(包括积极治疗)的停止，和姑息护理的使用，从而为了更好的生活品质而避免无效化疗产生的不必要的毒性。

在示例性的实施方案中，本方法表明对特定治疗产生应答的可能性。例如在一些实施方案中，本方法表明对促凋亡试剂盒/或通过凋亡而进行操作的试剂盒/或通过直接蛋白质调控驱动的凋亡而进行操作的试剂产生应答的高可能性或低可能性。在多个实施方案中，示例性的促凋亡试剂盒/或通过凋亡进行操作的试剂和/或通过直接蛋白质调控驱动的凋亡进行操作的试剂包括ABT-263(Navitoclax),obatoclax,WEP,硼替佐米和卡菲偌米布。在一些实施方案中，本方法表明对并非通过凋亡进行操作的试剂和/或并非通过直接蛋白质调控驱动的凋亡进行操作的试剂的高可能性或低可能性。在多个实施方案中，并非通过凋亡进行操作的示例性试剂包括驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,砒霜(TRISENOX),MEK抑制剂,pomolidomide,阿扎胞苷,地西他滨,伏瑞斯特,恩替诺特,dinaciclib,吉姆单抗,BTK抑制剂(包括拉铁尼伯),PI3激酶δ抑制剂,lenolidimide,蒽环类抗生素,阿糖胞苷,马法兰,Akt抑制剂,mTOR抑制剂。

在示例性的实施方案中，本方法表明患者是否接受促凋亡试剂或通过凋亡进行操作的试剂用于癌症治疗。在另一个示例性的实施方案中，本方法表明患者是否接受并非通过凋亡进行操作的试剂。

在特定的实施方案中，本方法用于预测癌症患者对本文所述的任何治疗(包括试剂)的应答。在示例性的实施方案中，本发明预测AML患者对阿糖胞苷和阿扎胞苷产生应答的可能性，并且包括患者BH3谱、年龄谱和细胞发生因素的评价。

在多个实施方案中，基于本文所述的方法给予或拒绝癌症治疗。示例性的治疗包括收缩切除，放射疗法(包括本发明所述的化合物作为或者与射线增敏剂组合的用途)，化疗，药物疗法，靶向疗法，免疫疗法和支持性疗法(例如止痛药,利尿剂,抗利尿剂,抗病毒药,抗生素,营养补充剂,贫血治疗,血液凝固治疗,骨治疗,以及精神和心理治疗)。

示例性治疗

在示例性实施方案中，本发明计算了对特定治疗试剂的预计应答率。此类试剂的实例包括但不限于抗癌症药品、化疗、手术、辅助疗法和新辅助疗法的一种或多种。在一个实施方案中，癌症治疗为BH3模拟物,表观修饰剂,拓扑异构酶抑制剂,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂和驱动蛋白纺锤体蛋白稳定剂的一种或多种。在另一个实施方案中，癌症治疗为蛋白酶体抑制剂；和/或细胞周期调节的调控剂(其非限定性实例为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)；和/或细胞表观遗传机制的调控剂(其非限定性实例为蛋白脱乙酰基酶(HDAC)(例如伏瑞斯特或恩替诺特的一种或多种),阿扎胞苷,地西他滨的一种或多种)；和/或蒽环类抗生素或蒽二酮(其非限定性实例为表柔比星,亚德里亚霉素,米托蒽醌,道诺霉素,去甲氧基柔红霉素的一种或多种)；和/或铂基治疗剂(其非限定性实例为卡波铂,顺铂和奥沙利铂的一种或多种)；阿糖胞苷或阿糖胞苷基化疗；BH3模拟物(其非限定性实例为BCL2,BCLXL或MCL1的一种或多种)；以及MCL1的抑制剂。

在多个实施方案中，本发明属于癌症治疗，包括但不限于美国专利公开No.US2012-0225851和国际专利公开No.WO 2012/122370中所述的那些，这些文献的内容以引用方式全文并入本文。

在多个实施方案中，本发明属于癌症治疗，其包括但不限于以下的一种或多种：烷化剂，例如噻替派和CYTOXAN环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安,英丙舒凡和哌泊舒凡；环乙亚胺，例如苯佐替哌,卡波醌,meturedopa和uredopa；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺,替姆,三乙烯磷酰胺,三乙烯噻替派和羟甲蜜胺；多聚乙酰(例如泡番荔枝辛和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓虫素；卡利他汀类药物；CC-1065(包括其阿多来新,卡折来新和比折来新合成类似物)；cryptophycin(例如cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；duocarmycin(包括合成的类似物,KW-2189和CB 1-TMl)；软珊瑚醇；pancratistatin；a sarcodictyin；海绵抑制素；氮芥，例如苯丁酸氮芥,萘氮芥,cholophosphamide,雌氮芥,异环磷酰胺,二氯甲基二乙胺,盐酸氧氮芥,美法仑,新氮芥,苯芥胆甾醇,松龙苯芥,曲磷胺,尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡氯芥,氯乙链脲菌素,福莫司汀,环己亚硝脲,嘧啶亚硝脲和ranimnustine；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素,特别是卡奇霉素γ和卡奇霉素ω(例如参见Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；二碳磷酸盐化合物，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团),aclacinomysins,放射菌素,安曲霉素,重氮丝氨酸,博来霉素,C放射菌素,carabicin,caminomycin,嗜癌素,chromomycinis,D放射菌素,道诺霉素,地托比星,6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸,ADRIAMYCIN亚德里亚霉素(包括吗啉代-亚德里亚霉素,氰基吗啉代-亚德里亚霉素,2-吡咯啉代-亚德里亚霉素和脱氧亚德里亚霉素),表柔比星,依索比星,去甲氧基柔红霉素,麻西罗霉素,丝裂霉素(例如丝裂霉素C),菌酚酸,诺加霉素,橄榄霉素,培洛霉素,potfiromycin,嘌呤霉素,三铁阿霉素,罗多比星,链黑菌素,链佐星,杀结核菌素,乌苯美司,净司他丁,佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸,甲氨蝶呤,蝶罗呤,曲麦克特；嘌呤类似物，例如氟达拉滨,6-巯基嘌呤,硫咪嘌呤,硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如盐酸环胞苷,阿扎胞苷,6-氮尿苷,卡莫氟,阿糖胞苷,dideoxyuridine,去氧氟尿苷,依诺他滨,氟尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮,甲氧睾酮丙酸酯,环硫雄醇,美雄烷,睾内脂；肾上腺，例如minoglutethimide,密妥坦,曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；乙酰葡萄糖内酯；醒磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝塔布辛；比生群；依达曲沙；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；醋酸羟吡咔唑；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；lonidainine；美登醇，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙肼；甲基苄肼；PSK多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋锗；细格孢氮杂酸；三乙撑亚胺苯醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(例如T-2毒素,verracurin A,杆孢菌素A和蛇形菌素)；尿烷；去乙酰长春酰胺；氮烯唑胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌血生；ga胞核嘧啶；阿拉伯糖苷("Ara-C")；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如TAXOL特素(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.),ABRAXANECremophor-free,特素的白蛋白改造的纳米颗粒配制物(American PharmaceuticalPartners,Schaumberg,111.)和TAXOTERE多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；GEMZAR吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂,奥沙利铂和卡波铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINE.长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；依立替康(Camptosar,CPT-11)(包括依立替康与5-FU和亚叶酸的治疗方案)；局部异构酶抑制剂RFS 2000；二甲基亚砜(DMFO)；类维生素，例如视黄酸；卡培他滨；考布他汀；亚叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(Tykerb)；PKC-a,Raf,H-Ras,EGFR(例如埃罗替尼(Tarceva))和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞的增殖),地西他滨,硼替佐米以及上述任意一种的药物可接受的盐、酸或衍生物。

示例性检测方法

在多个实施方案中，本方法包括评价蛋白质和/或核酸的存在、缺乏或水平。在多个实施方案中，本方法包括评价蛋白质和/或核酸的存在、缺乏或水平，其中所述的蛋白质和/或核酸能够增强BH谱的特异性和/或敏感性。在一些实施方案中，评价涉及用于患者应答的标志物。在一些实施方案中，本方法包括使用一种或多种免疫组织化学染色、Western印迹、细胞内Western、免疫荧光染色、ELISA、萤光激活细胞分选术(FACS)或者本发明所述的或本领域已知的任何其他的方法的测量。本方法可以包括将抗体与肿瘤样本(例如活组织检查、组织或体液)接触，从而鉴定对组织或体液具有特异性的并且表明癌症状态的抗原表位。

通常具有2种策略用于检测体液或组织中抗原表位或抗原—直接方法和间接方法。直接方法包括一步染色，并且可以涉及由体液或组织样品中的抗原直接反应的标记的抗体(例如FITC缀合的抗血清)。间接方法包括与体液或组织抗原反应的未标记的一级抗体，以及与一级抗体反应的标记的二级抗体。标记可以包括放射性标记、荧光标记、半抗原标记(例如生物素)或酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。实施这些测试的方法是本领域公知的。例如参见Harlow et al.(Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1988),Harlow et al.(Using Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,NY,1999),Virella(Medical Immunology,6th edition,InformaHealthCare,New York,2007)和Diamandis et al.(Immunoassays,Academic Press,Inc.,New York,1996)。用于实施这些测试的试剂盒是市售可得的，例如ClontechLaboratories,LLC.(Mountain View,CA)。

在多个实施方案中，抗体包括整个抗体和/或任何抗原结合片段(例如抗原结合部分)和/或它们的单链(例如包含至少2条重链(H)和2条轻链(L)的抗体，这些重链和轻链通过二硫键内部链接；Fab片段；单价片段，其由V_L,V_H,C_L和CH1结构域组成；F(ab)₂片段；二价片段，其包括在铰链区通过二硫键连接的2条Fab片段；Fd片段，其由V_H和CH1结构域组成；Fv片段，其由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成等)。在多个实施方案中，多克隆和单克隆抗体可以作为分离的人类或人源化抗体、或者它们的功能片段使用。

标准的测试是本领域已知的，所述的测试用于评价抗体对多种物种的靶物的结合能力，例如包括ELISA、Western印迹和RIA。还可以通过本领域已知的标准测试来评估抗体的结合动力学(例如结合亲和性)，例如通过Biacore分析。

在另一个实施方案中，测量包括评价核酸的存在、缺乏或水平。本领域的技术人员将理解的是多种方法可以用于检测或定量合适的标志物的DNA/RNA的水平。

可以使用例如低-至-中-复合技术(low-to-mid-plex technique)测量基因表达，包括但不限于报告基因的测试、Northern印迹、荧光原位杂交(FISH)、和逆转录PCR(RT-PCR)。例如还可以使用例如更高的复合技术来测量基因表达，包括但不限于基因表达的系列分析(SAGE)、DNA微阵列、Tiling阵列、RNA-Seq/全转录鸟枪法测序(WTSS)、高通量测序、多重PCR、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、结扎法测序和Luminex/XMAP。本领域的技术人员将理解的是多种方法可以用于检测或定量样品中生物标志物的水平或RNA产物，包括阵列，例如微阵列、RT-PCR(包括定量PCR)、核酸酶保护测试和Northern印迹分析。

示例性癌症和患者

在一些实施方案中，本发明提供了用于测定癌症治疗的方法，和/或包含患者的肿瘤或癌细胞样本。癌症或肿瘤被称为细胞不受控制的生长和/或异常增加的细胞生存和/或凋亡的抑制，其干扰了肌体器官和系统的正常功能。患有癌症或肿瘤的受试对象为受试对象的肌体中具有客观的可测量的癌细胞的受试对象。良性和恶性癌症、以及休眠的肿瘤或微小转移都包含在本发明中。由其原始位置迁移或接种重要器官的癌症可以逐渐通过受影响器官的功能恶化而导致受试对象死亡。

在多个实施方案中，本发明适用于转移前癌症或转移性癌症。转移是指癌症由肌体中的原发位点散布至其他的位置。癌细胞可以由原发性肿瘤离开，渗透至淋巴和血管中，通过血流循环，并在肌体中别处的正常组织中的远端位点生长(转移)。转移可以是局部的或远端的。转移是连续的过程，视离开原发性肿瘤的肿瘤细胞而定，其穿越血流并在远点位点停止。在新的位点处，细胞建立供血并可以生长而形成威胁生命的团块。肿瘤细胞内的刺激和抑制分子途径调节上述行为，并且远端位点处肿瘤细胞与宿主细胞之间的相互作用也是明显的。除了监测特定的症状，通常通过单独的或结合使用磁共振成像(MSI)扫描、计算机断层(CT)扫描、血液和血小板计数、肺功能研究、胸透和骨扫描来检测转移。

本发明所述的方法定向于癌症的预后、癌症的诊断、癌症的治疗和/或诊断、预后、治疗、预防或减轻与增加的细胞生存或凋亡抑制有关的恶性和增殖紊乱的生长、进展和/或转移。在一些实施方案中，癌症为血液学癌症，包括但不限于急性骨髓性白血病(AML),多发性骨髓瘤,滤泡性淋巴瘤,急性淋巴细胞白血病(ALL),慢性淋巴细胞白血病和非Hodgkin淋巴瘤(包括但不限于外套细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)。在一些实施方案中，癌症为实体肿瘤，包括但不限于非小细胞肺癌、卵巢癌和黑素瘤。

在一些实施方案中，本发明涉及以下癌症的一种或多种：急性淋巴细胞白血病(ALL),急性髓细胞样白血病(AML),肾上腺皮质癌,AIDS相关癌症,肛门癌,阑尾癌,星形细胞瘤(例如儿童小脑或大脑),基底细胞癌,胆管癌,膀胱癌,骨肿瘤(例如骨肉瘤,恶性纤维组织细胞瘤),脑干胶质瘤,脑癌,脑肿瘤(例如小脑星形细胞瘤,脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤,脑室膜瘤,成神经管细胞瘤,幕上原始神经外胚层肿瘤,视通路和下丘脑胶质瘤),乳癌,支气管腺瘤/良性肿瘤,Burkitt淋巴瘤,良性肿瘤,中枢神经系统淋巴瘤,小脑星形细胞瘤,子宫颈癌,慢性淋巴细胞白血病(CLL),慢性髓细胞性白血病(CML),慢性增殖紊乱性疾病,结肠癌,皮肤T细胞淋巴瘤,促结缔组织增生性小圆细胞瘤,子宫内膜癌,脑室膜瘤,食管癌,尤文肉瘤,颅外生殖细胞肿瘤,性腺外生殖细胞瘤,肝外胆管癌,眼癌,胆囊癌,胃部(胃)癌,胃肠道间质瘤(GIST),胚组织瘤(例如颅外,性腺外,卵巢),妊娠性滋养层细胞瘤,神经胶质瘤(例如脑干,脑星形细胞瘤,视通路和下丘脑),胃部良性肿瘤,头颈部癌,心脏肿瘤,肝细胞(肝)癌,下咽癌,下丘脑和视通路神经胶质瘤,眼内黑素瘤,胰岛细胞癌(内分泌胰腺),肾癌(肾细胞癌),喉癌,白血病(例如急性淋巴细胞性白血病,急性骨髓性白血病,慢性淋巴细胞白血病,慢性髓细胞样白血病,多毛细胞),唇与口腔癌,脂肪肉瘤,肝癌,肺癌(例如非小细胞,小细胞),淋巴瘤(例如AIDS相关的,Burkitt,皮肤T细胞Hodgkin,非Hodgkin,中枢神经系统),成神经管细胞瘤,黑素瘤,Merkel细胞癌,间皮瘤,转移性鳞状颈癌,口腔癌,多发性内分泌肿瘤综合征,多发性骨髓瘤,蕈样肉芽肿,骨髓增生异常综合征,脊髓发育不良/骨髓增生性疾病,髓细胞性白血病,粒细胞性白血病,粒细胞性白血病,骨髓增生性疾病,慢性鼻腔和鼻窦癌,鼻咽癌,成神经细胞瘤,非Hodgkin淋巴瘤,非小细胞肺癌,口腔癌,口咽癌,骨肉瘤,卵巢癌,胰腺癌,胰腺癌,鼻窦癌和鼻腔癌,甲状旁腺癌,阴茎癌,咽癌,嗜铬细胞瘤,松果体瘤和/或生殖细胞瘤,成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤,垂体腺瘤,浆细胞瘤/多发性骨髓瘤,胸膜肺母细胞瘤,中枢神经系统淋巴瘤,前列腺癌,直肠癌,肾细胞癌(肾癌),肾盂和输尿管,眼癌,横纹肌肉瘤,唾腺癌,肉瘤(例如Ewing家族,Kaposi,软组织,子宫),Sezary综合征,皮肤癌(例如非黑素瘤,黑素瘤,Merkel细胞),小细胞肺癌,小肠癌,软组织肉瘤,鳞状细胞癌,鳞状宫颈癌,胃癌,幕上原始神经外胚层肿瘤,t细胞淋巴瘤,睾丸癌,喉癌,胸腺瘤与胸腺癌,甲状腺癌,滋养叶瘤,肾盂输尿管癌,尿道癌,子宫癌,子宫肉瘤,阴道癌,视通路和下丘脑胶质瘤,外阴癌,Waldenstrom巨球蛋白血和Wilms肿瘤。

在一个实施方案中，癌症为AML。AML为第二常见的白血病，在US每年大约13000新诊断的病例，并且9000人死亡。尽管存在经批准的疗法，但是许多白血病患者的预后较差，并且成功治疗的可能性低。目前用于AML的护理标准为引入胞核嘧啶阿拉伯糖苷(ara-C)，并结合蒽环类抗生素试剂(例如柔红霉素,去甲氧基柔红霉素或米托蒽醌)。这种治疗方案后通常给予高剂量的阿糖胞苷和/或干细胞移植。这些治疗改善了年轻患者的结果。在急性早幼粒细胞白血病的治疗中也取得了进展，其中使用全反式视黄酸(ATRA)或砒霜的靶向疗法得到了优异的生存率。然而，超过60岁的患者，其代表了绝大多数的AML病例，保持治疗之谜。尽管65-85％的患者初始时对现有的治疗产生应答，但是65％的这种应答者发生复发，并且许多患者死于该疾病。至少因为这个原因，并且由于上述提及的治疗具有不利的副作用，所以本发明的预测性测试可以指导减少这些诉讼的治疗的使用。在一些实施方案中，本发明通过将正确的患者与正确的治疗相匹配而改善了成功治疗的可能性。此外，目前不存在预测AML患者对治疗的应答的测试。

如本文所用，除非另外定义，术语受试对象为哺乳动物，例如人类、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、狗、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪或非人类灵长动物，例如猴、黑猩猩或狒狒。术语“受试对象”和“患者”可以交换使用。

示例性样本

在某些实施方案中，样本为人类肿瘤衍生的细胞系。在某些实施方案中，样本为癌症干细胞。在其他的实施方案中，样本衍生自实体肿瘤的活组织检查，例如结肠直肠、乳腺、前列腺、肺、胰腺、肾或卵巢原发性肿瘤的活组织检查。

在某些实施方案中，样本衍生自非实体肿瘤的活组织检查，例如本文所述的癌症的任意一种。在特定的实施方案中，样本衍生自患有多发性骨髓瘤,急性骨髓性白血病,急性淋巴细胞性白血病,慢性淋巴白血病,外套细胞淋巴瘤,弥漫性大B细胞淋巴瘤和非Hodgkin淋巴瘤的患者的活组织检查。在特定的实施方案中，样本为使用与固体基质或珠结合的抗CD138抗体通过选择由活组织检查样品富集的多发性骨髓瘤细胞。在特定的实施方案中，样本为通过与CD45定向抗体结合而富集的急性骨髓性白血病细胞。在特定的实施方案中，样本为通过非B细胞耗竭而富集的慢性淋巴白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤。

在一些实施方案中，样本衍生自循环肿瘤细胞。

BH3谱

在多个实施方案中，本发明包括BH3谱。在多个实施方案中，本发明包括BH3谱，其中一次性评价至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种BID肽。在一些实施方案中，本发明包括多肽分析，与单一BH3肽的评价相反。在一些实施方案中，在单一的患者样本上筛选一组BH3肽。

用于所述方法的BH3谱和试剂在美国专利No.7,868,133；8,221,966；和8,168,755和美国专利公开No.2011/0130309中有所描述，这些文献的内容以引用方式全文并入本文。

简言之，不希望被理论所束缚，异常表现型的结果是，癌细胞以凋亡途径发展功能框。这些功能框使得癌细胞对一些疗法具有抗性，令人惊奇的是，使得一些癌细胞对其他的疗法敏感。“癌基因成瘾”的概念描述了癌细胞为了生存而获得性地依赖于特定蛋白质或对特定蛋白质成瘾的显现。BH3谱测定这种依赖于调节蛋白质的某些凋亡是否在给定癌细胞中发生，并鉴定依赖的蛋白质。癌细胞可以为但不总是预先设定地发生凋亡，并且这是这些依赖于任何或所有抗凋亡BCL-2家族蛋白质的细胞的功能(为了它们另外的意想不到的生存)。这可以洞察癌细胞对治疗的应答的可能性。

不希望被理论所束缚，癌细胞展现出异常，例如DNA破坏、遗传不稳定、遗传生长因子信号传递以及遗传或错过基质相互作用，这些任意一种异常通常都应该通过固有的(线粒体)凋亡途径诱导凋亡。然而，癌细胞生存，而非对这些凋亡信号产生应答。通常，在发生这种情况时，这些细胞高度地依赖于所选的对慢性凋亡信号的功能框。这种适应提供了癌细胞的生存机制，但是，这些适应还可以使癌细胞对诱导特定凋亡的疗法敏感。通过固有的凋亡使得细胞死亡的重要事件是线粒体外模(MOMP)的渗透，以及激活效应器级联的分子的释放。在许多情况下，MOMP为固有凋亡途径中无再现的点。BCL-2家族蛋白质是MOMP的重要调节剂，并其它们的活性与淋巴和多种实体肿瘤癌症的发作有关，而且据信在许多癌症中，是抗化疗的重要的调控剂。

BCL-2蛋白质受到促生存(抗凋亡)成员与促凋亡成员之间的不同的蛋白质-蛋白质相互作用的调节。这种相互作用主要通过BH3(BCL-2同源结构域-3)介导的结合而发生。凋亡引发的信号传递最主要地在线粒体的上游发生，并且导致短的仅含BH3的蛋白质(BCL-2家族成员)易位至线粒体，其中它们激活或致敏MOMP。激活剂仅含BH3的蛋白质BIM和Bid与效应器促凋亡蛋白质Bax和Bak结合，并且直接将它们激活，而且还结合并抑制抗凋亡BCL-2家族蛋白质BCL-2,MCL1,Bfl-1,BCL-w和BCL-xL。致敏剂BH3蛋白质Bad,Bik,NOXA,Hrk,Bmf和Puma仅结合抗凋亡BCL-2家族蛋白质BCL-2,MCL1,Bfl-1,BCL-w和BCL-xL，由此阻断它们的抗凋亡功能。不希望被理论所束缚，各种致敏剂蛋白质均具有特度的特异性谱。例如NOXA(A和B)以高亲和性与MCL1结合，Bad结合BCL-xL和BCL-2，但仅微弱地结合MCL1，Puma良好地结合所有3种靶物。这些蛋白质的抗凋亡功能是捕获激活剂BH3蛋白质BIM和Bid。这些激活剂被致敏剂肽替代使得Bax/Bak-介导的凋亡提呈。这些相互作用可以具有多种结果，包括但不限于动态平衡、细胞死亡、对凋亡敏感以及凋亡的阻断。

其中凋亡信号传递被阻断的癌细胞的定义特征是仅BID激活剂蛋白质在线粒体的表面上累积，这是这些蛋白质被抗凋亡的蛋白质捕获的结果。这种累积以及与它们的效应器靶物蛋白质的接近造成对“BH3动员”状态下BCL-2家族蛋白质的拮抗的敏感性增加。

在一些实施方案中，对NOXA(A或B)产生高凋亡应答的细胞是MCL1动员的，而对肽Bad的高应答表明BCL-xL或BCL-2提供凋亡框。在一些实施方案中，Puma反应了pan-BCL-2家族动员。按照这种方式，依赖于MCL1或BCL-xL、依赖于这两种蛋白质或者依赖于多个BCL-2家族成员的细胞是容易区分的，这样可以相应地调整合适的治疗。对这些肽的线粒体应答的差异指导了疗法的使用，其中已知所述的疗法是通过进入MCL1或BCL-xL影响的固有信号传递的途径而起作用的。已知BCL-2或抑制MCL1的化合物的用途可以在此类情况中表明。在一些实施方案中，本方法还表明或不适用于靶向MCL1或BCL-xL上游的实体的疗法。

BH3谱测试确认了癌细胞处于动员状态下的时间，以及发生动员时为何种构造，并且这具有预测价值。

示例性临床因素以及其他的生物标志物

在一些实施方案中，本发明包括临床因素的评价。在一些实施方案中，本发明包括BH3谱和/或临床因素的评价，从而评估患者的应答。在一些实施方案中，提供患者应答信息并组合BH3谱研究的临床因素可能与凋亡无关。在一些实施方案中，临床因素是非凋亡影响的。在一个实施方案中，临床因素为年龄、细胞发生状态、功能、组织学亚类、性别和疾病阶段的一种或多种。在一个实施方案中，临床因素示于表3中。

在一个实施方案中，临床因素为年龄。在一个实施方案中，患者的年龄谱分成超过大约10岁、或者超过大约20岁、或者超过大约30岁、超过大约40岁、或者超过大约50岁、或者超过大约60岁、或者超过大约70岁、或者超过大约80岁。

在一个实施方案中，临床因素为细胞发生状态。在一些癌症中，例如Wilms肿瘤和眼癌，基因删除或失活会起始癌症的进展，这是因为与肿瘤抑制剂有关的染色体区域通常被删除或突变。例如在神经胶质瘤、非小细胞肺癌、白血病和黑素瘤中，在染色体区域9p21中通常检测到删除、倒位和易位。不希望被理论所束缚，这些染色体的改变可以使肿瘤抑制剂细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A失活。在特定基因的这些删除中，大部分的染色体还可以丢失。例如在实体肿瘤细胞中，染色体1p和16q通常丢失。基因复制以及基因拷贝数的增加还可以有助于癌症，并且可以使用转录分析或拷贝数变化阵列来检测。例如染色体区域12ql3-ql4在许多肉瘤中扩增。该染色体区域编码被称为MDM2的结合蛋白质，已知该蛋白质与被称为p53的肿瘤抑制剂结合。当MDM2扩增时，其阻止p53调节细胞生长，其可以导致肿瘤信息。此外，某些乳癌与过表达有关，并且增加ERBB2基因的拷贝数，所述的ERBB2基因编码人类表皮生长因子受体2。此外，染色体(例如染色体1q和3q)数的增加还与增加的癌症风险有关。

细胞发生状态可以以本领域已知的多种方式测量。例如可以使用FISH、传统的染色体核型分析、和病毒核型分析(例如比较基因组杂交阵列、CGH和单核苷酸多态性阵列)。例如FISH可以用于评估特定基因座处的染色体重排，并且这些现象与疾病风险状态有关。在一些实施方案中，细胞发生状态是有利的，中间的或不利的，其可以通过分类系统测定，包括但不限于the Southwest Oncology Group(SWOG),the Medical Research Council(MRC),和the Cancer and Leukemia Group B(CALGB)。

在一个实施方案中，临床因素为功能。可以使用本领域已知的用于评分患者功能状态的任何系统和方法来定量功能状态。该量度通常用于测定患者是否可以接收化疗，剂量调节以及测定姑息护理的强度。具有多种评分系统，包括the Karnofsky得分和theZubrod得分。平行评分系统包括the Global Assessment of Functioning(GAF)得分，其作为精神病学的诊断和统计手册(DSM)的第五轴引入。较高的功能状态(使用the Karnofsky评分系统，为至少80％或者至少70％)可以表明治疗能够防止疾病状态的进展，并增强患者接受化疗和/或放射治疗的能力。例如在这些实施方案中，患者是走动的，并且能够自理。在其他的实施方案中，评价表明具有较低功能状态的患者(使用the Karnofsky评分系统，为低于50％、低于30％或者低于20％)，这样可以使用传统的放疗和/或化疗被耐受。在这些实施方案中，患者很大程度上局限于床或椅子，并且甚至不能自理。

The Karnofsky得分由100运行至0，其中100为“极好的”健康，而0为死亡。得分可以以10分的间隔使用，其中100％为正常，无抱怨，无疾病迹象；90％能够正常活动，较少的症状或疾病迹象；80％为正常活动，但具有一些困难，一些症状或迹象；70％为关注自我，不能正常活动或工作；60％需要一些帮助，能够应付大部分的个人需要；50％通常需要帮助，需要频繁的医学护理；40％为残疾的，需要特殊护理和帮助；30％是严重残疾的，入院指示，但是无死亡风险；20％为病得很重，迫切需要入院，需要支持措施或治疗；以及10％是垂死的，快速进展的致命疾病过程。

用于功能状态的The Zubrod评分系统包括：0，完全活跃的，能够进行所有疾病前的功能而没有限制；1，身体的剧烈活动受到限制，但是是走动的并且能够进行轻松的或久坐性质的工作，例如轻松家庭工作、办公室工作；2，走动的，并且能够全部自理，但是不能进行任何工作活动达到和大约超过50％的清醒时间；3，能够仅有有限的自理，局限于床或椅子超过50％的清醒时间；4，完全残疾的，不能进行任何自理，完全局限于床或椅子；5，死亡。

在一个实施方案中，临床因素为组织学亚类。在一些实施方案中，根据Elston&Ellis,Histopathology,1991,19:403-10将肿瘤的组织学样品分级，所述文献的内容以引用方式全文并入本文。

在一个实施方案中，临床因素为性别。在一个实施方案中，性别为男性。在另一个实施方案中，性别为女性。

在一个实施方案中，临床因素为疾病阶段。非限定性实例，使用整体阶段分组，I期癌症局限于肌体的一个部分；II期癌症是局部晚期的，如同III期癌症。癌症指定为II期或III期，可以取决于癌症的特定类型。在一个非限定性实例中，Hodgkin病，II期表明仅在横膈膜的一侧具有受影响的淋巴结，而III期表明在横膈膜之上和之下具有受影响的淋巴结。因此，II期和III期的具体标准根据诊断而不同。IV期癌症通常转移，或者散布于其他器官或整个肌体。

在一些实施方案中，临床因素为用于血液学疾病的French-American-British(FAB)分类系统(例如表明dysmyelopoiesis的存在，以及成髓细胞和成红血细胞的定量)。在一个实施方案中，急性淋巴细胞白血病的FAB为L1-L3，或者急性髓细胞样白血病的FAB为M0-M7。

在另一个实施方案中，所述的方法进一步包括测量选自突变状态、单核苷酸多态性、稳定状态的蛋白质水平和动态蛋白质水平的其他生物标志物。在另一个实施方案中，所述的方法进一步包括预测患者的临床应答。在另一个实施方案中，临床应答为大约1、大约2、大约3或者大约5年的无进展/无事件生存。

已经鉴定多种临床因素，例如年龄谱和功能状态。还使用了大量的诊断的静态测量，例如细胞发生和分子事件，包括但不限于基因MLL,AML/ETO,Flt3-ITD,NPM1(NPMc+),CEBPa,IDH1,IDH2,RUNX1,RAS和WT1的突变，和表观遗传性修饰基因TET2和ASXL的突变，以及细胞信号传递蛋白质谱的改变。

在一些实施方案中，本方法包括根据本文所述的方法的指导向可能遭受癌症折磨的患者给予治疗。在一些实施方案中，如果受试对象表征为以下的一种或多种：癌症的高风险、癌症的遗传倾向性(例如遗传风险因素)、早先的癌症发作期(例如新的癌症和/或复发)、癌症家族史、暴露于诱导癌症的试剂(例如环境试剂)、以及药物基因组学信息(基因型对治疗剂的药代动力学、药效学或疗效谱的影响)，则该受试对象可能能够受到癌症的折磨。

在一些实施方案中，如果受试对象表征为癌症的高风险，则该受试对象可能受到癌症的折磨。在一些实施方案中，如果受试对象表征为癌症的遗传倾向性，则该受试对象可能受到癌症的折磨。在一些实施方案中，癌症的遗传倾向性为遗传临床因素，如本领域已知的那样。至少对于结肠、子宫、小肠、胃、尿道癌而言，这种临床因素可以包括例如HNPCC,MLH1,MSH2,MSH6,PMS1,PMS2。在一些实施方案中，如果受试对象表征为早先的癌症发作期，则该受试对象可能受到癌症的折磨。在一些实施方案中，受试对象受到1、或者2、或者3、或者4、或者5、或者6段早先的癌症发作期的折磨。在一些实施方案中，如果受试对象表征为癌症的家族史，则该受试对象可能受到癌症的折磨。在一些实施方案中，亲代和/或祖父母和/或兄弟姐妹和/或阿姨/叔叔和/或伯叔祖母/伯叔祖父和/或表兄弟姐妹已经或者受到癌症的折磨。在一些实施方案中，如果受试对象表征为暴露于诱导癌症的试剂(例如环境试剂)，则该受试对象可能受到癌症的折磨。例如皮肤暴露于强日光为皮肤癌的临床因素。例如吸烟是肺、口腔、喉、膀胱、肾和多个其他的器官的临床因素。

此外，在一些实施方案中，以下临床因素的任意一项可以用于本文所述的方法中：性别；遗传的风险因素；家族史；个人经历；种族和民族；某些组织的特征；多种良性状况(例如非增殖性损伤)；早先的胸部放疗；暴露于致癌物等。

而且，在一些实施方案中，以下临床因素的任意一项可以用于本文所述的方法中：细胞表面标志物CD33,细胞表面标志物CD34,FLT3突变状态,p53突变状态,MEK-1激酶的磷酸化状态,以及在BCL-2的位置70处丝氨酸的磷酸化中的一种或多种。

在一些实施方案中，临床因素为细胞因子的表达水平，包括但不限于白细胞介素-6。在一些实施方案中，白细胞介素-6的水平与MM患者中的应答的可能性相关，包括较差的患者预后或良好的患者预后。

在某些实施方案中，通过评估百分动员率来测定应答的可能性。在某些实施方案中，通过以下等式定义动员率：

其中AUC包含曲线下面积或信号强度；DMSO包含基线阴性对照；而CCCP(羰基氰化物m-氯苯基腙)包含通过发挥质子梯度的解偶联试剂作用而成为蛋白质合成的效应器，其中所述的质子梯度是在线粒体的电子传递链中电子载体的正常活性包含基线阳性对照的过程中建立。在一些实施方案中，曲线下面积是通过均相时间分辨荧光(HTRF)建立的。在一些实施方案中，时间在大约0至大约300min、直至大约0至大约30min的窗口内发生的。在一些实施方案中，曲线下面积是通过中值荧光强度(MFI)统计的荧光激活细胞分选术(FACS)建立的。在一些实施方案中，信号强度为在大约5min至大约300min内进行的单一时间点测量。

在另一个实施方案中，所述的方法包括测量BH3谱测试，以及细胞表面标志物CD33,细胞表面标志物CD34,FLT3突变状态,p53突变状态,MEK-1激酶的磷酸化状态,以及在BCL-2的位置70处丝氨酸的磷酸化中的一种或多种；以及与使用阿糖胞苷或阿糖胞苷基化疗和/或阿扎胞苷治疗AML患者中的效力相关联。

在另一个实施方案中，所述的方法包括测量BH3谱测试，以及细胞表面标志物CD33,细胞表面标志物CD34,FLT3突变状态,p53突变状态,MEK-1激酶的磷酸化状态,以及在BCL-2的位置70处丝氨酸的磷酸化中的一种或多种；以及与使用化疗治疗MM患者中的效力相关联。

在另一个实施方案中，癌症为AML和/或MM，和临床因素为年龄谱和/或细胞发生状态；或者癌症为AML和/或MM，和癌症治疗为阿糖胞苷或阿糖胞苷基化疗和/或阿扎胞苷；或者癌症治疗为阿糖胞苷或阿糖胞苷基化疗和/或阿扎胞苷，和临床因素为年龄谱和/或细胞发生状态；或者癌症治疗为阿糖胞苷或阿糖胞苷基化疗和/或阿扎胞苷；癌症为AML和/或MM；和临床因素为年龄谱和/或细胞发生状态。

本发明还提供了能够简化肿瘤或癌细胞样本的评价的试剂盒。本发明的典型的试剂盒包含多种试剂，例如包括一种或多种用于检测BH3肽的试剂。试剂盒还可以包含用于检测的一种或多种试剂，包括用于多种检测方法中的那些，例如抗体。该试剂盒可以进一步包含评价所需的材料，包括多孔板、注射器等。试剂盒可以进一步包含指导所述试剂的使用的标签或印刷说明书。试剂盒可以进一步包含待测试的治疗剂。

当术语“大约”与所参照的数字指示联合使用时，其是指参照数字指示加上或减去该参照数字指示的至多10％。例如语言“大约50”涵盖45至55的范围。

如本文所用，词语“包括”及其变体是指非限定性的，使得列表中所述的项目不排除其他类似的项目，这些类似的项目也可以用于该技术的材料、组合物、装置和方法中。类似地，术语“能够”和“可以”以及它们的变体是指非限定性的，使得一个实施方案能够或可以包含某些元素或特征的描述不排除该技术的不包含这些元素或特征的其他实施方案。尽管开放式的术语“包含”作为此类术语的同义词，例如包括、含有或具有，其在本发明中用于描述本发明并要求本发明的权利，备选地可以使用更限定性的术语来描述本发明的技术或其实施方案，例如“由所述的组分组成”或者“基本上由所述的组分组成”。

除非另外定义，否则本文中所有的技术和科学术语均具有本发明所属技术领域任一普通技术人员通常理解的含义。尽管类似于或等价于本发明所述那些的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是优选的方法和材料如本文所述。就所有目的而言，所引用的所有公开、专利和专利公开均以引用方式全文并入本文。

通过以下非限定性实例进一步说明本发明。

实施例

实施例1：使用AML患者基的队列的研究

我们获得了由在方案NCT00795002(J0856),NCT00407966(J0669)或NCT01349972(J1101)上招募的新诊断为AML或MDS的患者得到的、总计63份外周血和骨髓样品。使用FLAM:alvocidib(Flavopiridol),Ara-C和米托蒽醌(n＝54)或7+3(Ara C和道诺霉素,n＝9)治疗患者。完全应答表征为低于5％成髓细胞，并且所有细胞系均自然成熟；ANC≥1000/μl并且血小板计数≥100,000/uL；外周血中缺乏原始细胞；骨髓中缺乏白血病细胞；与疾病有关的细胞发生被清除；并且早先的髓外病被清除。在BH3谱完成并概括于表1中之后，通过盲态外部评审来提供总体患者的特征，包括患者年龄、细胞发生的风险、FLT-3突变、NPM1突变、MDS/骨髓紊乱病史、既往化疗史、BM成髓细胞％、诊断时WBC计数、以及对疗法的应答。单一的患者特征列于表2中。

线粒体谱

简言之，将冷冻的提取的白细胞样品快速解冻，并通过台盼蓝拒染法测定细胞生活力。将细胞在FACS缓冲剂(lx PBS，具有2％FBS)中洗涤，并使用荧光标记的CD45,CD3和CD20单克隆抗体测定细胞的免疫表现型。然后将细胞再次悬浮于Newmeyer缓冲剂(10mM海藻糖,10mM HEPES,80mM KC1,20μΜEGTA,20μΜEDTA,5mM琥珀酸盐,pH 7.4)以用于干扰步骤。将BH3肽在Newmeyer缓冲剂中稀释，以制备工作液，从而得到最终浓度BIM(100μΜ),BIM(0.1μΜ),NOXA(100μΜ),Puma(10μΜ),HRK(100μΜ),BAD(100μΜ),和BID(1.0μΜ)。DMSO和CCCP用作阴性和阳性肽对照。将毛地黄皂苷和寡霉素加入单一的FACS管中，然后加入BH3肽。接着，将细胞加入FACS管中并在室温下温育2小时15分钟，以便用于细胞渗透、肽或化合物的传递、以及线粒体去极化的发生。在温育后，在Newmeyer缓冲剂中制备JC-1染料，并将其直接加入处理的细胞中。将未使用肽或化合物处理的另外一管细胞用碘化丙锭(PI)染色，从而确保细胞高效地被毛地黄皂苷渗透。在与JC-1温育45分钟后，在三激光BDFACSCantoΠ上分析细胞。基于4个参数门控AML成髓细胞：1)渗透(通过PI染色测定)；2)基于SSC的单线态分辨；3)CD45dim和CD3/CD20阴性；以及4)SSC较低。然后使用门控成髓细胞群体的中值JC-1红色荧光，与DMSO(阴性)和CCCP(阳性)相比，来计算％去极化。

细胞发生风险状态的测定

根据the Cancer and Leukemia Group B(CALGB)指导原则来测定单个患者细胞发生风险的分类(有利的、中间的和不利的)：有利的＝invl6,t(8:21),t(15；17)，中间＝二倍体，不利的＝-5,-7,+8,t(6；9),llq,PH1+,≥3不相关的细胞发生异常等。

统计学分析：对于各种肽，使用以下公式来计算百分动员率，其中所述的公式基于DMSO阴性对照作为完全未动员的、CCCP作为100％动员的参照来测定动员情况：

为了分析，将未分类为CR的所有患者均作为非应答者处理[轻微后遗症(MRD),部分缓解(PR),和TF(治疗失败)]。使用GraphPad Prism5.04版和MedCalc 14.8.1版计算BID肽(以及其他的肿瘤特征，例如细胞发生等)与应答之间的Student's t检验、Mann-Whitney时序非参数检验、多变量逻辑回归、和ROC曲线分析。

在FLAM方案上招募的AML患者样品的线粒体谱

接收总计63份患者样品并处理，而且这些样品概括于表1和2中。完整的谱得自43份样品，另外的9份(9)使用使用谱的亚组处理(由于进行完整测试的细胞数量不足)。剩余的11份(11)样品的品质不足以测定任何BED谱，这是由于较差的信噪比(细胞在测试前已经凋亡)或者不足的细胞数量。仅在成功用于任何BH3谱处理的那些样品上进行所有随后的分析(总计n＝52)。

将得自患者的临床可变因素与应答比较，从而测定这些因素的哪一项(如果存在)会影响患者是否对疗法产生应答(表3)。发现与CR具有显著相关性的唯一可变因素是细胞发生风险因素，其中具有不利分类的那些不太可能对疗法产生应答。WBC、MDS史以及随后采用何种方案均是意义重大的，并且较高的WBC值和MDS史与对疗法的应答有关。方案J0856比J1101(25名患者具有8名)具有更高的CR比(25名患者中具有13名CR)，并且方案J0669仅由成功形成BH3谱的2名患者代表。在该数据库中，年龄、BM成髓细胞百分率和NPM/FLT-3突变状态与应答不明显相关。

所有BH3单一患者的数据概括于表4中，并且详细描述了原始细胞中各种BH3肽诱导线粒体去极化的能力(即，“动员”)。查看所有应答，BIM100μΜ肽得到最高的中值去极化(99.2％动员)，并且NOXA具有最低的整体去极化(16.0％动员)。然后，将对治疗产生应答(CR)的患者中与表6中未应答(NR)的那些的单一肽BED谱比较。信号肽均不与应答显著相关；然而，BAD肽达到显著程度，p值为0.09，但是AUC值仅为0.65。这表明使用完整的一组患者，单一的BED肽均不足以鉴定对FLAM治疗产生应答的患者。

在多变量分析中，使用其他的BED肽谱并使用临床可变因素来测试BED肽(表8)。该分析表明BIM 100μΜ+BAD+PUMA之间的极其显著的相关性与应答有关，并且p值为0.009，ROC AUC为0.732(图1)。当这3种肽与细胞发生风险分类结合时，p值为0.0001，AUC为0.84。在分析中进一步加入MDS史创造了进一步的显著性，p值为0.0001，AUC为0.85。单独的细胞发生风险分类仅产生AUC值为0.60(细胞发生风险+MDS史得到AUC为0.72)。这表明在分析中加入BH3肽动员极大地增加了鉴定对FLAM产生应答的那些患者的能力。在理想的临界值(Youden指数——最高的特异性+敏感性)(使用BH3肽数据以及细胞发生风险分类和MDS史)下，所述的测试在鉴定本研究中对治疗产生应答的患者的敏感性为89.5％、特异性为76％。这表明使用得自这3种肽以及临床信息的BH3肽动员数据在用于使用FLAM方案进行治疗的预测值中具有价值。

在本研究的过程中，我们还检查了在BID动员中可以起作用的其他因素。由于白血病细胞来源(即，外周血或骨髓)可以潜在地分离不同的细胞群体，所以我们仅在得自患者骨髓的那些样品中进行分析。表8示出仅在骨髓样品中各种BH3肽与应答的相关性。在该样品亚组中，与未产生应答的那些相比，NOXA动员在对治疗产生应答的患者中显著较高(p＝0.006，分别为44.5％和5.2％)，并且AUC值为0.805(图2和图3)。其他单一的肽在单独的骨髓样品中均未显示与应答的显著相关性。在临界值高于10.78％NOXA动员的情况下，测试的敏感性为92％，特异性为67％。将细胞发生风险因素和MDS史加入算法中显示在预测对治疗的应答中，NOXA动员加入了这些可变因素，并且产生AUC值为0.92，并且在理想的临界值下，敏感性为92％，特异性为80％(表8和图3)。

本研究的结果建立了BH3谱用于鉴定对FLAM治疗可能产生应答的患者。观察完整的数据库，尽管单一的BH3肽与应答不相关，但是多种肽的组合(BIM,BAD和PUMA)确实显示与FLAM应答的强烈的相关性。这些多种肽显示在本研究中，在骨髓和外周血样品中与应答的相关性。此外，这些数据被加入至已知的患者风险因素中，从而使我们鉴定将细胞发生状态以及患者MDS史引入预测患者应答的单一度量的算法中。

本研究的另一个有趣的发现是在完整的数据库中未发现NOXA信号传递与FLAM应答显著相关。然而，单独检查骨髓样品显示与应答的极强的相关性。由于AML肿瘤细胞微环境(niche)为骨髓，所以与骨髓相比，在外周血中具有不同的BH3谱是不令人吃惊的，这是因为与骨髓相比，外周血中原始细胞的表现型标志物不同(1,2)。此外，之前已经显示骨髓基质通过直接细胞接触以及通过骨髓中存在的可溶性因子而赋予AML细胞对多种疗法的抗性(3)。由于骨髓抽吸潜在地收集了AML原始细胞、可溶性因子以及潜在的实质性的基质细胞，所以骨髓中BID动员测试可以代表在它们正常环境内容下白血病细胞的更直接的测试。使用FLT3激酶抑制剂单一疗法之前已经在AML中观察到功能差异，其中循环原始细胞通过所述的疗法由外周血中清除，同时骨髓原始细胞受到最小的影响(4)。NOXA读值可以检测相似的功能差异，其中使用NOXA动员使得MCL-1被替代，并且导致凋亡，从而鉴定可能对FLAM产生应答的那些癌症。

在本研究中鉴定的算法NOXA和[BAD+BIM 100+PUMA]动员可以鉴定MCL-1动员的癌细胞。对NOXA产生高凋亡应答的细胞据信是MCL-1动员的，而对肽Bad的高应答表明BCL-xL或BCL-2提供了凋亡框。由于PUMA可以反映pan-BCL-2家族的动员，并且在[BAD+BIM 100+PUMA]之后的算法实际上为PUMA-BAD-BIM 100，这样事实上，这些读值都可以有效地测量MCL-1的动员状态，并且最终，对FLAM方案产生应答的那些患者可以是MCL-1依赖性的。用于由本研究测定对FLAM的应答的可能性的一种算法是鉴定高于某一阈值的患者可能为应答者，然后使用该阈值来表征所述的测试的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。将临床可调节的可变因素包含在内说明患者或样品的特异性内容可以通过使用拟合训练数据库然后经证实的逻辑回归模型来进行。接着，使用该模型，可以使用sigmoid函数以及逻辑模型来计算可能性；这些可能性可以用于鉴定阈值，从而在特异性、敏感性、阳性预测值和阴性预测值方面在这些临界值下建立测试特征。还可以使用决策树，其考虑了患者或样品特征以及BH3谱结果的任意一项，从而建立应答的可能性。还可以使用其他的算法来研发预测算法，包括患者和样品的特征，包括但不限于随机森林、神经网络和出血。

实施例2：辨别FLAM方案与传统的7+3治疗策略的算法

在AML患者骨髓或外周血中BIM 0.1动员与对7+3方案(阿糖胞苷+蒽环类抗生素)的应答有关；参见Pierceall,et al."BH3 Profiling Discriminates Response toCytarabine-based Treatment of Acute Myelogenous Leukemia"Molecular CancerTherapeutics。如上文所讨论，NOXA骨髓动员与对FLAM方案(alvocidib,ara-C,米托蒽醌)的应答有关。我们研究何种算法能够区分FLAM或7+3应该用于治疗初治AML患者。

BIM 0.1预测了BM样品亚组中对7+3的应答，并且AUC值为0.80，敏感性和特异性分别为64.3％和100％—below left。然而，在这些相同的样品中，NOXA基本不具有预测能力，并且AUC值为0.54，敏感性和特异性分别为42.9％和100％。参见图5(当使用FLAM治疗时，AUC为0.81，并且92％/67％敏感性/特异性，与此相比)。这表明当在取自预治疗的AML患者的骨髓细胞中检测NOXA动员时，该NOXA动员与对FLAM的应答有关，但是与7+3的应答无关，并且在由治疗前测试的AML患者的外周血读取的BIM 0.1与对7+3的应答有关，但是与FLAM的应答无关。

与BIM 0.1动员相比，NOXA动员的进一步检查表明一个亚类的患者，其动员值表明它们不可能对一种试剂产生应答，但是可能对另一种试剂产生应答。图6表明NOXA动员与BUM 0.1动员，其得自由初始7+3研究得到的骨髓样品(n＝23)。图6中的数据提供了通过比较骨髓样品中NOXA动员与患者外周血(PB)样品中BIM 0.1动员来选择预治疗AML患者中癌症治疗策略的方法。如果BM NOXA>10.8％并且BMZPB BIM 0.1<35％，则患者为FLAM的候选人。如果BM NOXA<10.8％并且BMZPB BIM 0.1>15％，则患者为7+3疗法的候选人。患者还为7+3疗法的候选人，其中BM NOXA<10.8％并且BM/PB BIM 0.1>35％。最终，在BM NOXA<10.8％并且BM/PB BIM0.1<15％的情况下，该患者不是FLAM或者7+3疗法的候选人。

我们还证明单独的NOXA动员预测AML患者响应于FLAM治疗的生存。使用40％NOXA动员作为样品中的临界值，具有40％或以上NOXA动员的患者具有完全应答和生存的更高的可能性。该数据证明可以使用NOXA动员来预测AML患者对FLAM治疗的应答。

实施例3：在靶向药品种类中鉴定PraediCare Dx^TM读值用途的NOXA

我们示出特定的线粒体读值与细胞对特定的治疗产生的应答有关。为了进一步评估细胞内容在线粒体读值用途中对变量的影响，我们比较了培养物中生长的癌细胞上MCL-1干扰药品的活性，并且与我们理解的由患者收集的细胞中线粒体谱读值比较。我们查看了2种治疗化合物的癌细胞应答范围内的重叠，所述的化合物在靶物种类中与线粒体谱中相同的读值有关。在一种情况下，我们查看了2种CDK抑制化合物，其具有针对CDK9,alvocidib和dinaciclib的普遍的活性。图7表明在dinaciclib跨越图7所示的癌细胞系的情况下，NOXA读值显示能够预测对这些化合物的每一种的应答。这些细胞系中，对alvocidib和dinaciclib的应答得自癌症应答治疗门户(www.broadinstitute.org/ctrp/)，并且基于所获得的AUC(曲线下面积)，根据对这些化合物的应答将细胞分类。如图7所示，细胞系应答谱的重叠是引人注目的，并且相关系数为0.95％。

这些数据建立了NOXA动员测试用于多种CDK抑制化合物(其具有针对CDK9的普遍的活性)的用途。

实施例4：体外内容的NOXA化合物

使用得自癌细胞系的公共可用的治疗药品应答数据，可以鉴定对其而言NOXA生物标志物具有重要性的其他治疗药品类别。为了检查这种可能性，我们检查了NOXA动员读值用于评估癌细胞对低甲基化试剂(HMA)(例如)产生的应答中的用途。我们发现通过NOXA动员测定的细胞中的MCL-1依赖性表明对这些HMA的敏感性更高。使用FACS BH3 ProfilingAssay(PraediCare Dx^TM测试)，使用NOXA肽针对MCL-1依赖性制作癌细胞系谱(n＝33)。在这些细胞系中对阿扎胞苷和地西他滨的应答得自癌症应答治疗门户(www.broadinstitute.org/ctrp/)，并且通过AUC值(曲线下面积)，基于对试剂的应答，根据对HMA的应答将细胞分类，其中所述的AUC值是使用40％分位数(用于地西他滨)和12％分位数(用于阿扎胞苷)作为应答的阈值而获得的。计算2组之间的时序检验p值，并展示于图上。总之，这表明需要通过NOXA生物标志物的MCL-1依赖性用于对HMA的应答(图8)。

实施例5：突变状态影响动员状态以及AML患者对低甲基化试剂和其他药品的应答率

尽管在靶蛋白(其与药品活性完全一致并且可以指导靶向疗法的治疗)中具有突变，但是关于复发和毒性、以及最佳的结合选择的问题需要其他的测量，这仍保持未解答的。在研发过程中，选择靶向试剂用于on-target活性。通常还具有不可预计的活性，其不能通过突变谱或基因表达模式来直接说明。

在白血病领域中，已经鉴定多种预后基因生物标志物：FLT3,IDH,p53突变，用于急性髓细胞样白血病(AML)；以及IGHV,BCL-6,BTK和p53突变用于慢性淋巴细胞白血病(CLL)。这些生物标志物通常与对疗法较差的或有利的结果有关。除了CLL群体的小部分以外，这些测试的预测值需要额外的敏感性，其并非用于指导疗法的选择。许多普通药品的机制以及患者对这些试剂的应答通常取决于癌细胞对促凋亡信号传递的应答能力。即使在与药品应答有关的突变的内容中，患者对应答之间也存在可变性，因此测量癌症中凋亡倾向性的程度是重要的。

对使用低甲基化试剂(地西他滨)治疗的患者进行检查。这些患者之前表征为多个突变特征，包括FLT3异常。具有突变状态的这些谱的检查表明FLT3突变状态与测试读值结合是必须的，这是因为发现具有FLT3突变的AML患者通常对地西他滨是非应答的，不管它们的线粒体谱水平如何。然而，在具有未突变的FLT3的患者中，发现BIM(0.1)肽与应答有关(图11A)。此外，对地西他滨治疗产生应答的FLT3突变阴性患者显示与不产生应答的那些相比，对BH3模拟物产生更高的线粒体应答BIM 0.1(p＝0.04)。具有FLT3突变的患者通常具有显著较高的BIM 0.1动员(p＝0.02)。这表明突变状态与得自BH3谱的结果的组合能够预测哪位患者将以高的精确性对地西他滨产生良好的应答。

实施例6：用于评估MCL-1依赖性的备选方法

为了进一步探测MCL-1依赖性，我们研究了某些BH3模拟化合物用于提供NOXA读值的备选物的用途，以测定癌细胞中MCL-1的依赖性。我们的方法是直接利用膜可渗透的BH3模拟化合物，其选择性地靶向MCL1。如此操作可以增加直接观察治疗试剂的靶物活性的益处。图9显示由NOXA动员的细胞系也对MCL-1选择性BH3模拟化合物EU5346产生应答，所述的模拟化合物EU5346根据the PraediCare Dx^TMformat FACS BH3谱测试直接施加于渗透和的细胞上。

无非使用常规的试验，本领域的那些技术人员意识到或者能够弄明白本文具体描述的特定实施方案的多个等价物。这种等价物将涵盖在所附权利要求书的范围内。

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表

表1：患者概述

表3：临床特征与应答的相关性

表5：单一的BH3肽谱与CR的相关性

表6：BH3肽谱与其他临床变量的多变量分析

表7：骨髓样品中单一的BH3肽谱与CR的相关性

表8：仅在由骨髓得到的那些样品实施BH3肽的统计学分析

序列表

<110> 尤特罗皮克斯制药股份有限公司

Cardone, Michael H.

Dettman, Elisha J.

<120> 用于指导癌症治疗的内容相关的诊断测试

<130> EUTR-017/01WO

<150> US 62/102,499

<151> 2015-01-12

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Ala Glu Leu Pro Pro Glu Phe Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ile Gly Asp

1 5 10 15

Lys Val Tyr Cys

20

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Pro Gly Lys Lys Ala Arg Lys Asn Ala Gln Pro Ser Pro Ala Arg

1 5 10 15

Ala Pro Ala Glu Leu Pro Pro Glu Phe Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ile

20 25 30

Gly Asp Lys Val Tyr Cys Phe Arg Gln Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser

35 40 45

Lys Leu Phe Cys Ser Gly Thr

50 55

Claims (22)

1.试剂在制备用于确定患者的癌症治疗的方法的试剂盒中的用途，其中所述试剂包括用于提供由所述患者的骨髓抽吸物取得的患者肿瘤或癌细胞样本的BH3谱和一种或多种临床因素的试剂，所述方法包括：

提供由所述患者的骨髓抽吸物取得的患者肿瘤或癌细胞样本的所述BH3谱，其中所述BH3谱包括渗透化所述的患者的肿瘤或癌细胞并且测定在所述渗透化的细胞与NOXA肽接触时线粒体膜电位的变化，其中所述NOXA肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；

提供所述的患者的一种或多种临床因素，其中所述BH3谱和所述一种或多种临床因素用于针对对一种或多种癌症治疗的临床应答的可能性将所述的患者分类，其中所述癌症治疗包括alvocidib、胞核嘧啶阿拉伯糖苷(ara-C)和米托蒽醌(FLAM)；并且

其中选择所述的一种或多种临床因素，从而增加与临床应答有关的所述的BH3谱的特异性和/或敏感性。

2.权利要求1所述的用途，其中所述的癌症为血液学癌症。

3.权利要求2所述的用途，其中所述的血液学癌症选自急性骨髓性白血病(AML),多发性骨髓瘤,滤泡性淋巴瘤,急性成淋巴细胞白血病(ALL),慢性淋巴细胞白血病和非Hodgkin淋巴瘤。

4.权利要求3所述的用途，其中所述的非Hodgkin淋巴瘤选自外套细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤。

5.权利要求2所述的用途，其中所述的血液学癌症为骨髓增生异常综合征(MDS)。

6.权利要求2所述的用途，其中所述的血液学癌症为慢性淋巴细胞白血病(CLL)。

7.权利要求1所述的用途，其中将BH3谱分析与由外周血取得的患者样品的BH3谱分析比较，并将差异用于指导治疗。

8.权利要求1所述的用途，其中所述的BH3谱分析还包括将线粒体膜电位的损失与所述细胞对凋亡诱导化疗试剂的化学敏感性相关联。

9.权利要求1所述的用途，其中所述NOXA肽在0.1μΜ至200μΜ的浓度下使用。

10.权利要求1所述的用途，其中所述的临床因素为年龄、细胞发生状态、功能、组织学亚类、性别和疾病阶段中的一种或多种。

11.权利要求1所述的用途，其中所述试剂包括测量选自突变状态、稳定状态的蛋白质水平和动态蛋白质水平中的其他的生物标志物的试剂，并且所述方法进一步包括测量选自突变状态、稳定状态的蛋白质水平和动态蛋白质水平中的其他的生物标志物。

12.权利要求1所述的用途，其中所述的方法进一步包括预测所述的患者中的临床应答。

13.权利要求12所述的用途，其中所述的临床应答为至少1、2、3、或者5年的无进展/无事件生存。

14.权利要求1所述的用途，其中所述的临床应答的可能性是通过以下等式定义的：

其中：

所述的AUC包含曲线下面积或信号强度；

所述的DMSO包含基线阴性对照；以及

所述的CCCP(羰基氰化物间氯苯基腙)包含通过发挥质子梯度的解偶联试剂作用而成为的蛋白质合成的效应器，其中所述的质子梯度是在线粒体的电子传递链中电子载体的正常活性包含基线阳性对照的过程中建立。

15.权利要求14所述的用途，其中所述的曲线下面积是通过均相时间分辨荧光(HTRF)建立的。

16.权利要求15所述的用途，其中所述的时间在0至300min、直至0至30min的窗口内发生。

17.权利要求14所述的用途，其中所述的曲线下面积是通过荧光激活细胞分选术(FACS)建立的。

18.权利要求14所述的用途，其中所述的信号强度为在5min至300min内进行的单一时间点测量。

19.权利要求1所述的用途，其中所述试剂包括测定BH3谱，以及以下的一种或多种：细胞表面标志物CD33,细胞表面标志物CD34,FLT3突变状态,p53突变状态,MEK-1激酶的磷酸化状态,和BCL-2的位置70处丝氨酸的磷酸化的试剂，且所述方法包括测定BH3谱，以及以下的一种或多种：细胞表面标志物CD33,细胞表面标志物CD34,FLT3突变状态,p53突变状态,MEK-1激酶的磷酸化状态,和BCL-2的位置70处丝氨酸的磷酸化；以及将治疗AML患者的效力与阿糖胞苷或阿糖胞苷基化疗和/或阿扎胞苷相关联。

20.权利要求1所述的用途，其中所述试剂包括测定BH3谱，以及以下的一种或多种：细胞表面标志物CD33,细胞表面标志物CD34,FLT3突变状态,p53突变状态,MEK-1激酶的磷酸化状态,和BCL-2的位置70处丝氨酸的磷酸化的试剂，且所述方法包括测定BH3谱，以及以下的一种或多种：细胞表面标志物CD33,细胞表面标志物CD34,FLT3突变状态,p53突变状态,MEK-1激酶的磷酸化状态,和BCL-2的位置70处丝氨酸的磷酸化；以及将治疗MM患者的效力与化疗相关联。

21.权利要求1所述的用途，其中所述的癌症为AML和/或MM，并且所述的临床因素为年龄谱和/或细胞发生状态。

22.权利要求1的用途，其中所述试剂包括JC-1染色的试剂，且使用JC-1染色测量线粒体膜电位的变化。

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