MX2011008488A - Metodos y composiciones para identificar, clasificar y monitorear individuos que tienen tumores y canceres resistentes al inhibidor de la familia de bcl-2. - Google Patents

Metodos y composiciones para identificar, clasificar y monitorear individuos que tienen tumores y canceres resistentes al inhibidor de la familia de bcl-2.

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Abstract

La invención está dirigida a métodos y estuches que permiten la identificación, clasificación, y monitoreo de pacientes con cáncer para terapias con inhibidor de la familia de Bcl-2. Los métodos y composiciones de la invención están dirigidos a determinar la amplificación de BCI-XL y en células de cáncer o tumor, o la expresión elevada del polipéptido BCI-XL.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES PARA IDENTIFICAR. CLASIFICAR Y MONITOREAR INDIVIDUOS QUE TIENEN TUMORES Y CÁNCERES RESISTENTES AL INHIBIDOR DE LA FAMILIA DE BCL- 2 CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a pruebas de diagnóstico útiles para identificar, clasificar y monitorear pacientes con cáncer para terapia con inhibidor de la familia de Bcl-2, y en particular se refiere a la medición de ciertos marcadores que pueden identificar a pacientes cuyo cáncer probablemente sea resistente a la mayoría de los inhibidores de Bcl-2.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La heterogeneidad genética del cáncer es un factor que complica el desarrollo de fármacos contra cáncer eficaces. Los cánceres que se consideran son una entidad patológica individual de conformidad con la clasificación histopatológica clásica con frecuencia revelan múltiples subtipos genómicos cuando se someten a determinación de perfil molecular. En algunos casos, la clasificación molecular demuestra ser más exacta que la patología clásica. La eficacia de fármacos contra cáncer dirigidos se puede correlacionar con la presencia de un rasgo genómico, tal como una amplificación de gen (Cobleigh et al., 1999; Lynch et al., 2004). Para Her-2 en cáncer de mama, se ha demostrado que la detección de amplificación de gen provee información superior de prognosis y de selección de tratamiento en comparación con la detección mediante inmunohistoquímica (IHC) de la sobre-expresión de la proteína (Pauletti et al., 2000). Existe por lo tanto la necesidad de marcadores para clasificación genómica que puedan mejorar la tasa de respuesta de los pacientes hacia terapia contra cáncer dirigida.
Cáncer de pulmón es un área de investigación activa para nuevas terapias contra cáncer dirigidas. Los tumores malignos de pulmón son la causa principal de mortalidad por cáncer, aproximadamente 160,000 fallecimientos en los Estados Unidos de Norteamérica en 2006. El carcinoma de pulmón de célula pequeña (SCLC) es un subtipo histopatológico de cáncer de pulmón, el cual representa aproximadamente 20% de los casos de cáncer de pulmón. La tasa de supervivencia para este subtipo es baja (4-5% de supervivencia a largo plazo) y no ha mejorado en forma significativa en la última década, a pesar de la introducción de nuevos regímenes de quimioterapia. El resto de los casos de cáncer de pulmón son carcinomas de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), una categoría que está constituida por varios subtipos comunes. En los últimos años, ha habido un progreso sustancial en el desarrollo de terapias dirigidas para NSCLC, tales como erlotinib y gefitinib. Se han descubierto biomarcadores genómicos los cuales permiten la estratificación de los pacientes con NSCLC en respondedores y no respondedores potenciales. En particular, se demostró que las mutaciones y amplificaciones en el dominio de la EG FR cinasa se correlacionan con la respuesta a erlotinib y gefitinib. Por desgracia, no se ha logrado tal avance con SCLC , aún cuando se han reportado análisis genómicos de líneas celulares y tumores de SCLC (Ashman et al. , 2002; Coe et al. , 2006; Kim et al. , 2006).
Se ha reportado investigación sobre terapia contra cáncer dirigida contra miembros de la familia de la proteína Bcl-2, los cuales son los reguladores centrales de la muerte celular prog ramada. Los miembros de la familia de Bcl-2 que inhiben la apoptosis están sobre-expresados en los cánceres y contribuyen a la génesis de tumor. La expresión de Bcl-2 ha sido fuertemente correlacionada con resistencia a la terapia contra cáncer y supervivencia disminuida. Por ejemplo, la emergencia de independencia de andrógeno en cáncer de próstata está caracterizada por una incidencia elevada de expresión de Bcl-2 (> 40% de los cohortes examinados) (Chaudhary et al. , 1 999), lo cual también corresponde a una resistencia incrementada a la terapia . Asimismo, se ha demostrado que la sobre-expresión de Bcl-2 en líneas celulares tanto de NSCLC como de SCLC , induce resistencia a los agentes citotóxicos (Ohmori et al. , 1 993; Yasui ef al. , 2004). Yasui et al. (2004) describen la ganancia del número de copias en el locus Bcl-w (BCL2L2) y concluyen que la expresión de Bcl-w es por lo menos parcialmente responsable de la quimio-resistencia de SKOV3/VP. Yatsui et al. (2004) no describen la identificación del cambio de número de copias de la familia de Bcl-2 en ninguna otra línea de célula de cáncer.
Martinez-Climent ef al. (2003) describen la identificación de un cambio en el número de copias en 18q21, incluyendo el locus de Bcl-2, en la transformación de linfoma folicular hacia un linfoma de célula grande (Martinez-Climent ef al., 2003). Monni et al. (1996) reportan cambios en el número de copias múltiples en linfoma de célula B grande difusa (Monni et al., 1996). Galteland et al. (2005) reportan ganancias del locus del cromosoma de Bcl-2 en linfomas de tipo no Hodgkin de célula B (Galteland ef al., 2005). Nupponen, et al (1998) describen ganancia de bajo nivel del número de copias de Bcl-2 en cuatro de 17 muestras de cáncer de próstata recurrente (Nupponen et al., 1998). Olejniczak et al. han reportado una ganancia en 18q21 en SCLC que contiene al gen de Bcl-2 gene y fue asociada con sensibilidad hacia un inhibidor de Bcl-2, ABT-737, (Olejniczak ef al., 2007).
Un área clave de investigación oncológica hoy en día es el estudio de resistencia adquirida hacia terapias dirigidas. Las terapias dirigidas proveen beneficios innegables a los pacientes; sin embargo, en la mayoría de los casos, estos beneficios son temporales, debido a que los tumores ponen en marcha numerosas estrategias para escapar de los efectos de estas terapias. Estos mecanismos de resistencia son complejos y diversos. Una vez que se logre el entendimiento de estos mecanismos, se pueden desarrollar y desplegar nuevas terapias que elijan como blanco los mecanismos de resistencia.
Los imitadores de BH3 son compuestos altamente dirigidos diseñados para desencadenar apoptosis inhibiendo a miembros de la familia de Bcl-2 anti-apoptóticos específicos. La resistencia a los efectos de estos fármacos puede surgir durante el tratamiento.
Uno de dichos imitadores, ABT-737 (forma oral, ABT-263), es un inhibidor de tipo molécula pequeña de los miembros Bcl-2, BCI-XL, y Bcl-w de la familia de Bcl-2, y se ha demostrado que induce la regresión de tumores sólidos (Oltersdorf et al., 2005). ABT-737 se ha probado contra un panel diverso de líneas de célula de cáncer de humano y ha mostrado potencia selectiva contra líneas de célula de SCLC y de linfoma (Oltersdorf et al., 2005). La estructura química de ABT-737 es suministrada por Oltersdorf et al. (2005) en la página 679.
En muchos tumores, la capacidad de la familia de Bcl-2 para eliminar células dañadas es está socavada, ya sea porque un miembro de la familia pro-supervivencia es sobre-expresado (Cory et al., 2003), o porque las mutaciones en la ruta de p53 detienen la inducción de las proteínas de tipo "sólo para BH3" mediada por p53 que de otro modo podrían desencadenar la apoptosis (Jeffers et al., 2003; Shibue ef al., 2003; Villunger et al., 2003). Sin embargo, como un aspecto interesante, aún cuando es resistente a los efectos de la familia de inhibidor de Bcl-2, la maquinaria apoptótica en las células de tumor permanece intacta.
En un estudio de células que sobre-expresan a miembros de la familia de Bcl-2 pro-supervivencia, se encontró que las células son resistentes a ABT-737, el cual comúnmente desencadena la apoptosis mediada por Bax/Bak. Van Delft et al. (2006) descubrieron que las células son quimio-refractarias hacia ABT-737 debido a que otro familiar pro-supervivencia, Mcl-1 , fue sobre-expresado. Mediante regulación negativa de Mcl-1 , las células se vuelven sensibles a apoptosis mediada por ABT-737 (van Delft et al. , 2006). El papel de Mcl-1 en hacer que una célula de cáncer sea refractaria a los efectos de ABT-737 fue demostrado por Tahir et al. (2007) (Olejniczak et al. , 2007) . En dicho estudio, Tahir et al. (2007) observaron que a medida que una línea de cáncer de pulmón de célula pequeña se expone a dosis cada vez mayores de ABT-737, las células adquieren resistencia a ABT-737, lo cual está asociado con la regulación positiva de la expresión de Mcl-1 .
Por lo tanto, existe la necesidad de tener la capacidad de identificar células que sean resistentes a los antagonistas de los miembros de la familia de Bcl-2.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un primer aspecto, la invención está dirigida a métodos para clasificar a un paciente que tiene un cáncer que es resistente a un inhibidor de la familia de Bcl-2, que comprende: (a) proveer una muestra de tejido proveniente de un paciente; (b) determinar si está amplificado un gen de BCI-XL; y (c) clasificar al paciente como resistente al inhibidor de molécula pequeña de Bcl-2 si el gen de Bcl-xL está amplificado.
En un segundo aspecto, la invención está dirigida a métodos para identificar a un paciente con cáncer como elegible para recibir una terapia con inhibidor de la familia de Bcl-2 que comprende: (a) proveer una muestra de tejido proveniente de un paciente; (b) determinar si la expresión de un gen de Bcl-xL está amplificada; y (c) clasificar al paciente como elegible para recibir al inhibidor de la familia de Bcl-2 si el gen de Bcl-xL no está amplificado.
En el primero y segundo aspectos, el inhibidor de la familia de Bcl-2 puede ser ABT-263, y la amplificación del gen de BCI-XL se correlaciona con un incremento en la expresión del polipéptido Bcl-xL. El paso de determinar puede comprender hibridación ¡n situ, tal como con una sonda de ácido nucleico que esté marcada en forma detectable. De manera alternativa, la PCR se puede utilizar para determinar la amplificación del gen, utilizando iniciadores que se hibriden al gen de Bcl-xL. La amplificación también se puede determinar utilizando pruebas de micro-arreglo.
En un tercer aspecto, la invención está dirigida a métodos para monitorear a un paciente que está siendo tratado con un agente anti-familia de Bcl-2 que comprende: (a) proveer una muestra de prueba proveniente de un paciente con cáncer; (b) identificar en, o extraer de, la muestra de prueba células de tumor o de cáncer; (c) determinar en las células de tumor o de cáncer si un gen de Bcl-xL está amplificado; y (d) comparar el número de células de tumor o de cáncer que tienen un gen de Bcl-xL amplificado con el nivel de línea basal de dichas células de tumor o de cáncer determinadas antes de o al inicio de la terapia.
En un cuarto aspecto, la invención está dirigida a métodos para clasificar a un paciente que tiene un cáncer que es resistente a un inhibidor de la familia de Bcl-2, que comprende (a) proveer una muestra de prueba proveniente de un paciente; (b) determinar en la muestra de prueba: (i) si el gen de Bcl-xL está amplificado; y (ii) una cantidad de Bcl-xL en la muestra de prueba; (c) determinar si la cantidad de Bcl-xL en la muestra es más alta o más baja entonces la cantidad de Bcl-xL en un control; y (d) clasificar al paciente como que tiene un cáncer que es resistente al inhibidor de ia familia de Bcl-2 tomando como base: (i) la amplificación del gen de Bcl-xL; y (ii) la cantidad de Bcl-xL es más alta en la muestra de prueba que en el control.
En un quinto aspecto, la invención está dirigida a métodos para identificar a un paciente con cáncer como elegible para recibir una terapia con inhibidor de la familia de Bcl-2 que comprende: (a) proveer una muestra de prueba proveniente de un paciente; (b) determinar en la muestra de prueba: (i) si el gen de Bcl-xL está amplificado; y (ii) una cantidad de Bcl-xL en la muestra de prueba; (c) determinar si la cantidad de Bcl-xL en la muestra es más alta o más baja entonces la cantidad de Bcl-xL en un control; y (d) clasificar al paciente como elegible para recibir la terapia con inhibidor de la familia de Bcl-2 tomando como base: (i) la amplificación del gen de Bcl-xL; y (ii) la cantidad de Bcl-xL es más alta en la muestra de prueba que en el control.
En un sexto aspecto, la invención está dirigida a métodos para monitorear a un paciente que está siendo tratado con un agente anti-familia de Bcl-2 que comprende: (a) proveer una muestra de prueba proveniente de un paciente con cáncer; (b) identificar en, o extraer de, la muestra células de tumor o de cáncer; (c) determinar si el paciente debe continuar o no siendo tratado con el inhibidor de la familia de Bcl-2 tomando como base la presencia o ausencia de amplificación del gen de Bcl-xL.
En un séptimo aspecto, la i nvención está dirigida a mon itorear a un paciente q ue está siendo tratado con un agente antifamilia de Bcl-2 que comprende: (a) proveer u na muestra de prueba proveniente de un paciente; (b) determinar en la muestra de prueba: (i) si el gen de Bcl-xL está amplificado ; y (ii) una cantidad de Bcl-xL en la muestra de prueba; (c) determinar si la cantidad de Bcl-xL en la muestra es más alta o más baja entonces la cantidad de Bcl-xL en un control ; y (d) determinar si el paciente debe continuar o no siendo tratado con el in hibidor de la familia de Bcl-2 tomando como base: (i) si el gen de Bcl-xL está amplificado ; (ii) si la ca ntidad de Bcl-xL es más alta en la muestra de prueba que en el control , la determinación en el paso (b) (ii) se efectúa mediante in muno-ensayo.
En estos primeros siete aspectos de la invención , el in hibidor de la familia de Bcl-2 puede ser ABT- 263 , y la amplificación del gen de Bcl-xL se correlaciona con u n incremento en la expresión de la proteína Bcl-xL, respectivamente. El paso de determinar puede comprender hibridación in situ, tal como con una sonda de ácido nucleico que esté marcada en forma detectable. De manera alternativa , la PCR se puede utilizar para determinar la amplificación del gen , utilizando iniciadores q ue se hibriden al gen de Bcl-xL. La amplificación también se puede determinar utilizando pruebas de micro-arreglo. En algunos aspectos, la expresión del gen de BCI-XL se determina midiendo los niveles de ARNm o polipéptido. Los niveles de polipéptido se pueden medir utilizando inmunoensayos, tales como inmunoensayos en emparedado, ELISAs, o incluso utilizando instrumentos para inmunoensayo automatizados. Los pacientes pueden padecer particularmente de SLCL y linfoma. Las células de tumor pueden ser células de tumor en circulación.
En un octavo aspecto, la invención está dirigida a estuches que comprenden: (a) reactivos para detectar un gen de Bcl-xL amplificado; y (b) instrucciones.
Los reactivos en el estuche pueden ser polinucleótidos marcados en forma detectable que se hibridan a por lo menos una porción del gen de Bcl-xL gene, o anticuerpos que se unen a polipéptidos de Bcl-xL.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee métodos y composiciones para monitorear células de tumor y de cáncer respecto a resistencia a terapias con inhibidor de la familia de Bcl-2. Los inventores descubrieron, de manera inesperada, que la amplificación de gen de la región que codifica para uno de los productos del gen elegido como blanco de antemano por un inhibidor de la familia de Bcl-2 da origen a resistencia al inhibidor de la familia de Bcl-2. Este descubrimiento no se podía anticipar totalmente en teoría, o a partir de la literatura.
Los inventores descubrieron la amplificación utilizando una técnica de hibridación genómica comparativa basada en micro-arreglo para detectar anormalidades en el número de copias del gen a escala de todo el genoma, brindando de esta manera una vista del genoma completo de las aberraciones cromosómicas acompañadas por un cambio en el número de copias del ADN. Este método se describe completamente en el documento titulado METHODS FOR ASSEMBLING PANELS OF CANCER CELL LINES FOR USE IN TESTING THE EFFICACY OF ONE OR MORE PHAR MACE UTI CAL COMPOSITIONS, presentado el 31 de octubre de 2008 y al que se le asignó el número de serie US 61/110,281, cuyos contenidos se incorporan en la presente solicitud en su totalidad.
La invención provee pruebas de diagnóstico para identificar, clasificar y monitorear a pacientes con cáncer que comprenden evaluar en una muestra de tejido del paciente la amplificación del gen de Bcl-xL y/o un incremento en la expresión del gen. Las pruebas de la invención incluyen métodos de prueba para identificar a pacientes elegibles para recibir terapia con antagonista de la familia de Bcl-2 y para monitorear la respuesta del paciente hacia dicha terapia. La invención comprende, por ejemplo, determi nar mediante hibridación in situ fluorescente la presencia o ausencia de la amplificación del gen de Bcl-xL. Los pacientes a q uienes se clasifica q ue tienen un Bcl-xL amplificado son ineleg ibles para recibir terapia anti-familia de Bcl-2 debido a q ue éstos tienen menos probabilidad de responder a esta terapia . Además , los pacientes que tienen esta amplificación pueden ser resistentes a otras terapias para cáncer. Por lo tanto, la determinación de la presencia de una amplificación de Bcl-xL en célu las de cáncer y de tumor es u n marcador de estratificación de terapia general.
En una modalidad , la invención comprende u n método para identificar o clasificar a un paciente que tiene u n cáncer que es resistente a un in hibidor de la familia de Bcl-2 , que comprende: (a) proveer u na muestra de tejido proven iente de u n paciente ; (b) determinar si está amplificado u n gen de BC I-XL; y (c) clasificar al paciente como resistente al inhibidor de molécula peq ueña de Bcl-2 si el gen de Bcl-xL está amplificado.
En esta modalidad , la amplificación de gen puede determinada por u na prueba de hibridación in situ fluorescente (F ISH) de colores múltiples, por ejemplo, efectuada en u na muestra de biopsia de de tumor de cáncer de pulmón . En otras modalidades, se utiliza la reacción en cadena de polimerasa (PCR) .
En otra modalidad, la invención está dirig ida a métodos para mon itorear a u n paciente que está siendo tratado con un agente anti-familia de Bcl-2 que comprende: (a) proveer una muestra de prueba proveniente de un paciente con cáncer; (b) identificar en, o extraer de, la muestra de prueba células de tumor o de cáncer; (c) determinar en las células de tumor o de cáncer si un gen de Bcl-xL está amplificado; y (d) comparar el número de células de tumor o de cáncer que tienen un gen de Bcl-xL amplificado con el nivel de línea basal de dichas células de tumor o de cáncer determinadas antes de o al inicio de la terapia.
De nuevo, se pueden utilizar los métodos FISH y PCR para detectar la amplificación de Bcl-xL.
La invención también comprende métodos para clasificar a un paciente que tiene un cáncer que es resistente a un inhibidor de la familia de Bcl-2, que comprende (a) proveer una muestra de prueba proveniente de un paciente; (b) determinar en la muestra de prueba: (i) si el gen de Bcl-xL está amplificado; y (ii) una cantidad de Bcl-xL en la muestra de prueba; (c) determinar si la cantidad de Bcl-xL en la muestra es más alta o más baja entonces la cantidad de Bcl-xL en un control; y (d) clasificar al paciente como que tiene un cáncer que es resistente al inhibidor de la familia de Bcl-2 tomando como base: (i) la amplificación del gen de Bcl-xL; y (ii) la cantidad de Bcl-xL es más alta en la muestra de prueba que en el control.
Estos mismos métodos se pueden utilizar para identificar aquellos pacientes que son elegibles para recibir una terapia con inhibidor de la familia de Bcl-2.
La invención también está dirigida a estuches el empaque, por ejemplo, polinucleótidos diseñados para ser utilizados como iniciadores de PCR, sondas para FISH, etc.
La invención tiene capacidad significativa para proveer estratificación mejorada de pacientes para terapia contra cáncer, y en particular para terapia con inhibidor de la familia de Bcl-2. La evaluación de estos biomarcadores con la invención también permite el rastreo de la respuesta del paciente individual hacia la terapia.
Definiciones Un "inhibidor de la familia de Bcl-2" se refiere a un compuesto terapéutico de cualquier tipo, incluyendo compuestos de molécula pequeña, de anticuerpo, de antisentido, de ARN interferente pequeño, o basados en micro-ARN, que se une a por lo menos uno de Bcl-2, Bcl-xL, y Bcl-w, y antagoniza la actividad del ácido nucleico o proteína relacionado con la familia de Bcl-2. Los métodos de la invención son útiles con cualquier inhibidor de la familia de Bcl-2 conocido o que se desarrolle posteriormente. Un ejemplo de un inhibidor de la familia de Bcl-2 es ABT-737, N-(4-(4-((4'-cloro(1 ,1'-bifenil)-2-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3- (dimetilamino)-l -( (feniisu Ifan i I) metí l)propil)ami no)-3-n¡trobencen-sulfonamida, el cual se une a cada uno de Bcl-2, Bcl-xL, y Bcl-w. Otro inhibidor de la familia de Bcl-2 es ABT-263, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetil-1-ciclohex-1 -en-1-il)metil)piperazin-1 -il)benzoil)-4-(((1 R)-3-(morfolin-4-il)-1 -((fenilsulfanil)metil)propil)-amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)bencensulfonamida. La estructura química de ABT-263 está relacionada con ABT-737 y su estructura química se muestra en la Fórmula (I): Las pruebas de la invención se pueden utilizar con terapia para cáncer dirigida, tal como las terapias dirigidas a linfoma y cáncer de pulmón de célula pequeña. Las pruebas se pueden efectuar con relación a cualquier tipo de cáncer en el cual está implicada la amplificación de Bcl-xL. Otros ejemplos de dichos cánceres incluyen cánceres del epitelio, por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer del esófago. Las pruebas de la invención se efectúan en una muestra de tejido de cualquier tipo del paciente o en un derivado de la misma, incluyendo sangre periférica, tejidos de tumor o de los que se sospecha son tumores (incluyendo tejido fresco congelado y fijo incrustado en parafina), aislados celulares tales como células del epitelio en circulación separadas o identificadas en una muestra de sangre, tejido de nódulo linfático, médula ósea y aspirados con aguja fina.
Bcl-2 (también conocido como BCL2) significa el gen 2 de CLL/linfoma de célula B de humano; Bcl-xl (también conocido como BCL2L1) significa el gen 1 tipo BCL2 de humano; Bcl-w (también conocido como BCL2L2) significa el gen 2 tipo BCL2 de humano.
"Hibridar específicamente" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico de unirse en forma detectable y específicamente a un segundo ácido nucleico. Los polinucleótidos se hibridan específicamente con las cadenas de ácido nucleico objetivo bajo condiciones de hibridación y lavado que reducen al mínimo cantidades apreciables de unión detectable por parte de ácidos nucleicos no específicos.
"Secuencia objetivo" o "secuencia de ácido nucleico objetivo" significa una secuencia de ácido nucleico que abarca, por ejemplo, un gen, o complementos o fragmentos del mismo, que se amplifica, detecta, o ambos, utilizando un iniciador o sonda de polinucleótido. De manera adicional, aunque el término secuencia objetivo algunas veces se refiere a una secuencia de ácido nucleico de cadena doble; una secuencia objetivo también puede ser de una sola cadena. En casos en los cuales el objetivo es de doble cadena, las secuencias de iniciador de polinucleótido de preferencia amplifican ambas cadenas de la secuencia objetivo. Una secuencia objetivo se puede seleccionar de modo que sea más o menos específica para un organismo particular. Por ejemplo la secuencia objetivo puede ser específica para un género completo, para más de un género, para una especie o subespecie, serogrupo, auxotipo, serotipo, cepa, aislado u otro subconjunto de organismos.
"Muestra de prueba" significa una muestra tomada a partir de un individuo, o un fluido biológico, en el cual la muestra puede contener una secuencia objetivo. Una muestra de prueba se puede tomar a partir de cualquier fuente, por ejemplo, tejido, sangre, saliva, esputo, moco, sudor, orina, frotis de la uretra, frotis cervicales, frotis urogenitales o anales, frotis de la conjuntiva, líquido para lentes oculares, fluido cerebro-espinal, etc. Una muestra de prueba se puede utilizar (i) directamente tal como se obtiene de la fuente; o (ii) después de un pre-tratamiento para modificar el carácter de la muestra. Por lo tanto, una muestra de prueba se puede pre-tratar antes del uso mediante, por ejemplo, preparación de plasma o suero a partir de la sangre, ruptura de células o partículas virales, preparación de líquidos a partir de materiales sólidos, dilución de fluidos viscosos, filtración de líquidos, adición de reactivos, purificación de ácidos nucleicos, etc.
"Individuos" incluyen un mamífero, un ave, o un reptil. El individuo puede ser una vaca, caballo, perro, gato, o un primate. El individuo también puede ser un humano. Los individuos pueden estar vivos o muertos.
Un "polinucleótido" es un polímero de ácido nucleico de ácido ribonucleico (ARN), ácido desoxirribonucleico (ADN), ADN o ARN modificado, o imitadores de ARN o ADN (tales como PNAs), y derivados de los mismos, y homólogos de los mismos. Por lo tanto, polinucleótidos incluyen polímeros constituidos por nucleobases normalmente presentes en la Naturaleza, azúcares y entrelazamientos covalentes inter-nucleósido (estructura base) así como polímeros que tienen porciones no presentes en la Naturaleza que funcionan de manera similar. Dichos polímeros de ácido nucleico modificados o sustituidos son bien conocidos en la técnica y son referidos como "análogos". Los oligonucleótidos generalmente son polinucleótidos cortos de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 160 o 200 nucleótidos.
Un "polinucleótido variante" o una "secuencia de ácido nucleico variante" significa un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia de ácido nucleico, de manera más preferida por lo menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de identidad de secuencia de ácido nucleico e incluso de manera más preferida por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico dada. Las variantes no abarcan la secuencia de nucleótido original.
Comúnmente, los polinucleótidos variantes son por lo menos de aproximadamente 8 nucleótidos de longitud, con frecuencia por lo menos aproximadamente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 nucleótidos de longitud, o incluso aproximadamente 75-200 nucleótidos de longitud, o más.
"Por ciento (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a secuencia de ácido nucleico se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidato que son Idénticos con los nucleótidos en la secuencia de interés, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el por ciento de identidad de secuencia máximo. La alineación para los propósitos de determinar el % de identidad de secuencia de ácido nucleico se puede lograr en varias maneras que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, utilizando software para computadora disponible al público tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualesquiera algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima a través de la longitud completa de las secuencias que están siendo comparadas. Cuando las secuencias de nucleótidos se alinean, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico C dada a, con, o contra una secuencia de ácido nucleico D dada (lo cual de manera alternativa se puede redactar como una secuencia de ácido nucleico C dada que tiene o que comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácido nucleico a, con, o contra una secuencia de ácido nucleico D dada) se puede calcular de la siguiente manera: % de identidad de secuencia de ácido nucleico = W/Z* 100 en la cual W es el número de nucleótidos calificados como pares idénticos por la alineación del algoritmo o programa de alineación de secuencia de C y D y Z es el número total de nucleótidos en D.
Cuando la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácido nucleico de D a C.
"Que consiste esencialmente de un polinucleótido que tiene un % de identidad de secuencia" significa que el polinucleótido no difiere sustancialmente en longitud, pero podría diferir sustancialmente en la secuencia. Por lo tanto, un polinucleótido "A" que consiste esencialmente de un polinucleótido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia "B" conocida de 100 nucleótidos significa que el polinucleótido "A" es de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, pero hasta 20 nucleótidos pueden variar de la secuencia "B". La secuencia de polinucleótido en cuestión puede ser más larga o más corta debido a modificación de los extremos terminales, tal como, por ejemplo, la adición de 1-15 nucleótidos para producir tipos específicos de sondas, iniciadores y otras herramientas moleculares, etc., tal como el caso de cuando se agregan secuencias sustancialmente no idénticas para crear estructuras secundarias pretendidas. Dichos nucleótidos no idénticos no son considerados en el cálculo de identidad de secuencia cuando la secuencia es modificada por "que consiste esencialmente de".
La especificidad del ADN de cadena individual para hibridar fragmentos complementarios se determina mediante la astringencia de las condiciones de reacción. La astringencia de hibridación se incrementa a medida que disminuye la propensión para formar dúplex de ADN. En las reacciones de hibridación de ácido nucleico, la astringencia se puede elegir de modo que se favorezcan hibridaciones específicas (alta astringencia). Se pueden utilizar hibridaciones menos específicas (baja astringencia) para identificar moléculas, o segmentos, de ADN relacionadas, pero no exactas, (homólogas, pero no idénticas).
Los dúplex de ADN se estabilizan mediante: (1) el número de pares de bases complementarias, (2) el tipo de pares de bases, (3) concentración de sal (fuerza iónica) de la mezcla de reacción, (4) la temperatura de la reacción, y (5) la presencia de ciertos solventes orgánicos, tal como formamida, lo cual disminuye la estabilidad del dúplex de ADN. Una estrategia común es variar la temperatura: temperaturas relativamente más altas dan como resultado condiciones de reacción más astringentes. (Ausubel et al., 1987) proveen una excelente explicación de astringencia de las reacciones de hibridación.
Hibridación bajo "condiciones astringentes" significa protocolos de hibridación en los cuales secuencias de nucleótidos por lo menos 60% homólogas entre sí permanecen hibridadas.
Polinucleótidos puede incluir otros grupos anexados tales como péptidos (por ejemplo, para elegir como blanco receptores de célula hospedera in vivo), o agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular. Además, los oligonucleótidos se pueden modificar con agentes de corte activados por hibridación (van der Krol et al., 1988) o agentes para intercalado (Zon, 1988). El oligonucleótido se pude conjugar a otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente de entrelazamiento activado por hibridación, un agente de transporte, un agente para corte activado por hibridación, y similares.
Los análogos de polinucleótido útiles incluyen polímeros que tienen estructuras base modificadas o enlazamientos inter-nucleósido no naturales. Las estructuras base modificadas incluyen aquellas que conservan un átomo de fósforo en la estructura base, tales como fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil-fosfonatos y otros alquil-fosfonatos, así como aquellas que ya no tienen un átomo de fósforo, tales como las estructuras base formadas por enlazamientos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta inter-nucleósido, enlazamientos inter-nucleósido mixtos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlazamientos inter-nucleósido de cadena corta heteroatómicos o heterocíclicos. Los polímeros de ácido nucleico modificados (análogos) pueden contener una o más porciones de azúcar modificada.
Los análogos que son imitadores de ARN o ADN, en los cuales tanto el azúcar como el enlazamiento inter-nucleósido de las unidades de nucleótido están remplazadas con grupos novedosos, también son útiles. En estos imitadores, las unidades base se mantienen para hibridación con la secuencia objetivo. Un ejemplo de dicho imitador, el cual ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación, es un ácido nucleico peptídico (PNA) (Buchardt et al., 1992; Nielsen et al., 1991).
El reino de los nucleótidos incluye derivados en los cuales la molécula de ácido nucleico ha sido covalentemente modificada mediante sustitución, medios químicos, medios enzimáticos, u otros medios apropiados con una porción diferente de un nucleótido presente normalmente en la Naturaleza.
Los polinucleótidos comprenden iniciadores que se hibridan específicamente a las secuencias objetivo, incluyendo análogos y/o derivados de las secuencias de ácido nucleico, y homólogos de las mismas.
Los polinucleótidos se pueden preparar utilizando técnicas convencionales, tales como síntesis en fase sólida utilizando equipo comercialmente disponible, tal como el disponible de Applied Biosystems USA Inc. (Foster City, CA; EE.UU), DuPont, (Wilmington, DE; EE.UU), o Milligen (Bedford, MA; EE.UU.). Los polinucleótidos modificados, tal como los fosforotioatos y derivados alquilados, también se pueden preparar fácilmente utilizando métodos similares conocidos en la técnica (Fino, 1995; Mattingly, 1995; Ruth, 1990).
"Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que están antes (secuencias 5' no codificadoras) y después (secuencias 3' no codificadoras) de la secuencia codificadora. "Gen original" se refiere a un gen tal como se encuentra en la Naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. En contraste, "construcción quimérica" se refiere a una combinación de fragmentos de ácido nucleico que normalmente no se encuentran juntos en la Naturaleza. Por consiguiente, una construcción quimérica puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que se obtienen a partir de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras obtenidas a partir de la misma fuente, pero acomodadas en una manera diferente a la que normalmente se encuentra en la Naturaleza. (El término "aislado" significa que la secuencia se retira de su entorno natural).
Una "sonda" o "iniciador" tal como se utiliza en la presente solicitud es un polinucleótido que es de por lo menos 8 nucleótidos de longitud y forma una estructura híbrida con una secuencia objetivo, debido a complementariedad de por lo menos una secuencia en la sonda o iniciador con una secuencia en la región objetivo. Las regiones de polinucleótido de la sonda pueden estar constituidas por ADN y/o ARN y/o análogos de nucleótido sintéticos. De preferencia, la sonda no contiene una secuencia que sea complementaria a la secuencia o secuencias utilizadas para el cebado para una secuencia objetivo durante la reacción en cadena de polimerasa.
"Expresión" se refiere a la producción de un producto final funcional. Expresión de un gen implica la transcripción del gen y la traducción del ARNm en una proteína precursora o madura. "Inhibición antisentido" se refiere a la producción de transcritos de ARN antisentido que tienen capacidad de suprimir la expresión de la proteína objetivo. "Co-supresión" se refiere a la producción de transcritos de ARN sentido con capacidad para suprimir la expresión de genes exógenos o endógenos idénticos o sustancialmente similares (Patente E.U.A. No. 5,231,020).
"Recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia de otro modo separados, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética.
"PCR" o "Reacción en Cadena de Polimerasa" es una técnica para la síntesis de cantidades grandes de segmentos de ADN específicos, que consiste de una serie de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Típicamente, el ADN de doble cadena se desnaturaliza con calor, se fijan los dos iniciadores complementarios a los límites 3' del segmento objetivo a baja temperatura y después se extienden a una temperatura intermedia. Un conjunto de esos tres pasos consecutivos es referido como un ciclo.
PCR es una técnica poderosa utilizada para amplificar el ADN millones de veces, mediante replicación repetida de una plantilla, en un periodo breve de tiempo. ((Mullís et al., 1986); Erlich et al., Solicitud de Patente Europea No. 50,424; Solicitud de Patente Europea No. 84,796; Solicitud de Patente Europea No. 258,017, Solicitud de Patente Europea No. 237,362; Solicitud de Patente Europea No. 201,184, Patente E.U.A. No. 4,683,202; Patente E.U.A. No. 4,582,788; y Patente E.U.A. No. 4,683,194). El procedimiento utiliza conjuntos de oligonucleótidos específicos sintetizados in vitro para iniciar la síntesis de ADN. El diseño de los iniciadores es dependiente de las secuencias de ADN que se van a analizar. La técnica se efectúa a través de muchos ciclos (usualmente 20-50) de fundir la plantilla a temperatura elevada, permitir que los iniciadores se fijen a las secuencias complementarias dentro de la plantilla y después replicar la plantilla con ADN polimerasa.
Los productos de las acciones de PCR se pueden analizar mediante separación en geles de agarosa seguido por tinción con bromuro de etidio y visualización con trans-iluminación con UV.
De manera alternativa, se pueden agregar dNTPs radioactivos a la PCR con el fin de incorporar una marca en los productos. En este caso, los productos de PCR se visualizan mediante exposición del gel a una película de rayos X. La ventaja agregada de radiomarcar los productos de PCR es que se pueden cuantificar los niveles de los productos de amplificación individuales.
Práctica de la invención Pruebas de polinucleótido Los métodos de prueba de ácido nucleico útiles en la invención comprenden la detección de regiones de ADN amplificadas mediante: (i) pruebas de hibridación in situ a muestras de tejido intacto o muestras celulares, (ii) pruebas de hibridación en micro-arreglo a ADN cromosómico extraído a partir de una muestra de tejido, y (ii¡) reacción en cadena de polimerasa (PCR) u otras pruebas de amplificación para el ADN cromosómico extraído a partir de una muestra de tejido. También se pueden utilizar pruebas que utilizan análogos sintéticos de ácidos nucleicos, tales como ácidos nucleicos peptídicos, en cualquiera de estos formatos.
Las pruebas de la invención se utilizan para identificar regiones de Bcl-xL amplificadas, que den como resultado un incremento en los biomarcadores del número de copias de Bcl-xL tanto para predecir la respuesta a la terapia como para monitorear la respuesta del paciente hacia la terapia con inhibidor de la familia de Bcl-2. Las pruebas para predicción de respuesta se pueden correr antes del inicio de la terapia , y los pacientes que muestran u na amplificación en la región o regiones de Bcl-xL son elegibles para recibir la terapia con in hibidor de la familia de Bcl-2. La ganancia en el n úmero de copias también puede indicar resistencia a otras terapias para cáncer, tal como q uimioterapia o terapia con radiación . Para monitoreo de la respuesta del paciente, la prueba se corre al in icio de la terapia para establecer los n iveles de línea basal del biomarcador en la muestra de tej ido, por ejemplo, el por ciento de células total o el número de células q ue muestran la gana ncia de n úmero de copias en la muestra. Después se muestrea y analiza el mismo tejido y los niveles del biomarcador se comparan con la l í nea basal . En casos en los que los niveles permanecen iguales o disminuyen , es probable que la terapia sea efectiva y se puede continuar. En casos en los q ue ocurre u n incremento sig nificativo con respecto al nivel de l ínea basal, puede ser que el paciente no esté respond iendo.
La invención comprende la detección de los biomarcadores genómicos mediante pruebas de h ibridación utilizando sondas basadas en ácido n ucleico marcadas en forma detectable , tales como sondas de ácido desoxirribonucleico (ADN) o sondas de ácido n ucleico proteín ico (PNA) , o iniciadores no marcados los cuales se diseñan/seleccionan para que se hibriden al objetivo cromosómico designado específico. Los iniciadores no marcados se utilizan en las pruebas de amplificación , tal como med ia nte la reacción en cadena de polimerasa (PCR), en la cual después de la unión dei iniciador, una polimerasa amplifica la secuencia de ácido nucleico objetivo para detección subsiguiente. Las sondas de detección utilizadas en PCR u otras pruebas de amplificación de preferencia son fluorescentes, y de manera incluso más preferida, sondas de detección útiles en "PCR en tiempo real". Las marcas fluorescentes también son preferidas para uso en hibridación in situ pero también se pueden utilizar otras marcas detectables comúnmente utilizadas en técnicas de hibridación , por ejemplo, marcas enzimáticas, cromogénicas e isotópicas. Las técnicas útiles para marcado de sonda se describen en la literatura (Fan, 2002) (incorporado para referencia) . En la detección de los biomarcadores genómicos mediante análisis en micro-arreglo, estas técnicas de marcado de sonda se aplican para marcar un extracto de ADN cromosómico proveniente de una muestra del paciente, la cual después se híbrida al micro-arreglo.
La secuencia de polinucleótido para Bcl-xL de humano (SEO. I D NO: 1 ; No. de Acceso GenBank NMJ38578) se muestra en la Tabla 1 .
TABLA 1 Secuencia de polinucleótido de Bcl-xL de humano (SEO ID NO:1 ; No. de Acceso Genbank NM 138578) ggaggaggaa gcaagcgagg gggctggttc ctgagcttcg caattcctgt gtcgccttct 60 gggctcccag cctgccgggt cgcatgatcc ctccggccgg agctggtttt tttgccagcc 120 accgcgaggc cggctgagtt accggcatcc ccgcagccac ctcctctccc gacctgtgat 180 acaaaagatc ttccgggggc tgcacctgcc tgcctttgcc taaggcggat ttgaatctct 240 ttctctccct tcagaatctt atcttggctt tggatcttag aagagaatca ctaaccagag 300 acgagactca gtgagtgagc aggtgttttg gacaatggac tggttgagcc catccctatt 360 ataaaaatgt ctcagagcaa ccgggagctg gtggttgact ttctctccta caagctttcc 420 cagaaaggat acagctggag tcagtttagt gatgtggaag agaacaggac tgaggcccca 480 gaagggactg aatcggagat ggagaccccc agtgccatca atggcaaccc atcctggcao 540 ctggcagaca gccccgcggt gaatggagcc actggccaca gcagcagttt ggatgcccgg 600 gaggtgatcc ccatggcagc agtaaagcaa gcgctgaggg aggcaggcga cgagtttgaa 660 ctgcggtacc ggcgggcatt cagtgacctg acatcccagc tccacatcac cccagggaca 720 gcatatcaga gctttgaaca ggtagtgaat gaactcttcc gggatggggt aaactggggt 780 cgcattgtgg cctttttctc cttcggcggg gcactgtgcg tggaaagcgt agacaaggag 840 atgcaggtat tggtgagtcg gatcgcagct tggatggcca cttacctgaa tgaccaccta 900 gagccttgga tccaggagaa cggcggctgg gatacttttg tggaactcta tgggaacaat 960 gcagcagccg agagccgaaa gggccaggaa cgcttcaacc gctggttcct gacgggcatg 1020 actgtggccg gcgtggttct gctgggctca ctcttcagtc ggaaatgacc agacactgac 1080 catccactct accctcccac ccccttctct gctccaccac atcctccgtc cagccgccat 1140 tgccaccagg agaaccacta catgcagccc atgcccacct gcccatcaca gggttgggcc 1200 cagatctggt cccttgcagc tagttttcta gaatttatca cacttctgtg agacccccac 1260 acctcagttc ccttggcctc agaattcaca aaatttccac aaaatctgtc caaaggaggc 1320 tggcaggtat ggaagggttt gtggctgggg gcaggagggc cctacctgat tggtgcaacc 1380 cttacccctt agcctccctg aaaatgtttt tctgccaggg agcttgaaag ttttcagaac 1440 ctcttcccca gaaaggagac tagattgcct ttgttttgat gtttgtggcc tcagaattga 1500 tcattttccc cccactctcc ccacactaac ctgggttccc tttccttcca tccctacccc 1560 ctaagagcca tttaggggcc acttttgact agggattcag gctgcttggg ataaagatgc 1620 TABLA 1 (cont.) aaggaccagg actccctcct cacctctgga ctggctagag tcctcactcc cagtccaaat 1680 gtcctccaga agcctctggc tagaggccag ccccacccag gagggagggg gctatagcta 1740 caggaagcac cccatgccaa agctagggtg gcccttgcag ttcagcacca ccctagtccc 1800 ttcccctccc tggctcccat gaccatactg agggaccaac tgggcccaag acagatgccc 1860 cagagctgtt tatggcctca gctgcctcac ttcctacaag agcagcctgt ggcatctttg 1920 ccttgggctg ctcctcatgg tgggttcagg ggactcagcc ctgaggtgaa agggagctat 1980 caggaacagc tatgggagcc ccagggtctt ccctacctca ggcaggaagg gcaggaagga 2040 gagcctgctg catggggtgg ggtagggctg actagaaggg ccagtcctgc ctggccaggc 2100 agatctgtgc cccatgcctg tccagcctgg gcagccaggc tgccaaggcc agagtggcct 2160 ggccaggagc tcttcaggcc tccctctctc ttctgctcca cccttggcct gtctcatccc 2220 caggggtccc agccaccccg ggctctctgc tgtacatatt tgagactagt ttttattcct 2280 tgtgaagatg atatactatt tttgttaagc gtgtctgtat ttatgtgtga ggagctgctg 2340 gcttgcagtg cgcgtgcacg tggagagctg gtgcccggag attggacggc ctgatgctcc 2400 ctcccctgcc ctggtccagg gaagctggcc gagggtcctg gctcctgagg ggcatctgcc 2460 cctcccccaa cccccacccc acacttgttc cagctctttg aaatagtctg tgtgaaggtg 2520 aaagtgcagt tcagtaataa actgtgttta ctcagtgaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2575 De preferencia, ia h ibridación in situ se utiliza pa ra detecta r la presencia de incremento del n úmero de copias cromosómicas o amplificación de gen en el locus de Bcl-2 , así como en los loci definidos por las sondas A_67_P0474261 7 y A_53_P 1 74456 (d isponibles de Agilent (Santa Clara, CA) ; micro-arreglo CG H 244A de ratón, número de catálogo G441 5A) . Las sondas pueden ser elaboradas por un experto en la técn ica utilizando las secuencias de S EQ I D NO : 1 .
Las sondas para uso en los métodos de h ibridación in situ de la invención caen en dos gru pos amplios: sondas para enumeración de cromosoma, es decir, sondas que se hibridan a una región cromosómica, usualmente una región de secuencia de repetición, e indican la presencia o ausencia de un cromosoma completo; y sondas específicas de locus, es decir, sondas que se hibridan a un locus específico en un cromosoma y detectan la presencia o ausencia de un locus específico. Las sondas para brazo de cromosoma, es decir, sondas que se hibridan a una región cromosómica e indican la presencia o ausencia de un brazo de un cromosoma específico, también se pueden utilizar. Se prefiere utilizar una sonda específica de locus que pueda detectar cambios de las secuencias de ADN cromosómico únicas en el locus interrogado tal como Bcl-xL. Los métodos para el uso de sondas de secuencia única para hibridación in situ se describen en la Patente E.U.A. 5,447,841, incorporada en la presente solicitud para referencia.
Una sonda para enumeración de cromosoma se puede hibridar a una secuencia repetitiva, localizada ya sea cerca o retirada de un centrómero, o se puede hibridar a una secuencia única localizada en cualquier posición en un cromosoma. Por ejemplo, una sonda de enumeración de cromosoma se puede hibridar con ADN repetitivo asociado con el centrómero de un cromosoma. Los centrómeros de cromosomas de primate contienen una familia compleja de repeticiones en tándem largas de ADN constituida por una longitud de repetición de monómero de aproximadamente 171 pares de bases, que son referidas como ADN satélite alfa. Las sondas para hibridación in situ fluorescentes para centrómero para cada uno de los cromosomas 14 y 18 se pueden conseguir comercialmente a partir de Abbott Molecular (Des Plaines, IL).
Las sondas para hibridación in situ excepcionalmente útiles son sondas fluorescentes marcadas directamente, tales como las descritas en la Patente E.U.A. 5,491,224, incorporada en la presente solicitud para referencia. La patente E.U.A. 5,491,224 también describe pruebas FISM simultáneas que utilizan más de una sonda marcada en forma fluorescente.
Las sondas específicas de locus útiles se pueden producir en cualquier manera y generalmente contienen secuencias para que se hibriden a una secuencia objetivo de ADN cromosómico de aproximadamente 10,000 hasta aproximadamente 1,000,000 bases de longitud. De preferencia la sonda se híbrida a un tramo objetivo de ADN cromosómico en el locus objetivo de por lo menos 100,000 bases de largo hasta aproximadamente 500,000 bases de largo y también incluye ácido nucleico bloqueador no marcado en la mezcla de la sonda, como se describe en la Patente E.U.A. 5,756,696, incorporada en la presente solicitud para referencia, para evitar la unión no específica de la sonda. También es posible utilizar ácido nucleico oligomérico o ácido nucleico peptídico sintetizado, no marcado como el ácido nucleico bloqueador. Para elegir como blanco el locus del gen particular, se prefiere que las sondas incluyan secuencias de ácido nucleico que abarquen al gen y por lo tanto se hibriden a ambos lados del locus codificador genómico completo del gen. Las sondas se pueden producir comenzando con clones que contengan ADN de humano tales como los Cromosomas Artificiales Bacterianos (BACs) o similares. Las genotecas de BAC para el genoma humano se pueden conseguir a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA) y se pueden investigar para la identificación de clones útiles. Se prefiere utilizar el navegador de Genoma de la Universidad de California en Santa Cruz para identificar secuencias de ADN en el locus objetivo. Estas secuencias de ADN después se pueden utilizar para sintetizar los iniciadores para PCR para uso en el tamizaje de genotecas de BAC para identificar clones útiles. Los clones se pueden marcar después mediante métodos de traducción de muesca convencionales y se prueban como sondas de hibridación in situ.
Los ejemplos de fluoróforos que se pueden utilizar en los métodos de hibridación in situ descritos en la presente solicitud son: ácido 7-amino-4-metilcumarin-3-acético (AMCA), Texas Red™ (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); 5-(y -6)-carboxi-X-rodamina, lissamina rodamina B, 5-( y -6)-carboxifluoresceína; fluorescein-5-isotiocianato (FITC); ácido 7-dietilaminocumarin-3-carboxílico, tetrametil-rodamina-5-( y -6)-isotiocianato; 5-( y -6)-carboxitetrametilrodamina; ácido 7-hidroxi-cumarin-3-carboxílico; ácido 6-[fluorescein 5-( y -6)-carboxamido]hexanoico; ácido N-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-3-indacenpropionico; eosin-5-isotiocianato; eritrosin-5-isotiocianato; 5-( y -6)-carboxirodamina 6G; y aectilazida azul Cascade™ (Molecular Probes; una marca de I nvitrogen) .
Las sondas se pueden visualizar con un microscopio para fluorescencia y u n filtro apropiado para cada fluoróforo, o mediante el uso de conjuntos de filtro de paso de banda duales o triples para observar fluoróforos múltiples . Véase, por ejemplo, Patente E . U .A. No . 5,776,688 para Bittner, et al. , la cual se incorpora en la presente solicitud para referencia. Se puede utilizar cualqu ier método pa ra formación de imágenes microscópicas apropiado para visualizar las sondas hibridadas, incluyendo sistemas pa ra formación de imagen digital automatizados. De manera alternativa, se pueden utilizar técnicas tales como citometria de flujo para examinar el patrón de hibridación de las sondas cromosómicas.
Aunq ue se prefiere el análisis de amplificación de gen célula por célula que resulta de una hibridación in situ, los biomarcadores genómicos también se pueden detectar med iante PC R cuantitativa . En esta modalidad , se extrae ADN cromosómico a partir de la muestra de tejido , y después se amplifica med iante PC R utilizando u n par de iniciadores específicos para por lo menos uno de Bcl-2 , BCI-XL O Bcl-w, O mediante PC R de multiplex, utilizando pares múltiples de in iciadores. Se puede utilizar cualq uier secuencia de iniciador para los biomarcadores. Después se determina el número de copias del tejido mediante comparación con un patrón de referencia de amplificación.
También se puede utilizar el análisis de n úmero de copias en micro-arreglo. En esta modalidad , después que se extrae el ADN cromosómico, éste se marca para hibridación a un micro-arreglo que comprende un substrato que tiene sondas de ácido nucleico no marcado inmovilizadas múltiples ordenadas a densidades de sonda de hasta varios millones de sondas por centímetro cuadrado de superficie del substrato. Existen múltiples formatos de micro-arreglo y se puede utilizar cualquiera de estos, incluyendo micro-arreglos basados en BACs y en oligonucleótidos, tales como aquellos disponibles de Agilent Technologies (Palo Alto; CA), y Affymetrix (Santa Clara; CA). Cuando se utiliza un micro-arreglo de oligonucleótido para detectar las amplificaciones, se prefiere utilizar un micro-arreglo que tenga secuencias de sonda para más de tres ubicaciones separadas en la región elegida como blanco.
Detección de la expresión: ARNm El nivel de expresión de gen de Bcl-xL se puede determinar evaluando la cantidad de una o más moléculas de ARNm en la muestra de prueba. Los métodos para medir el ARNm en muestras son conocidos en la técnica. Para medir los niveles de ARNm, se pueden lisar las células en una muestra de prueba, y los niveles de ARNm en los Usados o en ARN purificado o semi-purificado proveniente de los Usados se pueden medir mediante cualquier variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen pruebas de hibridación utilizando sondas de ADN o ARN marcadas en forma detectable (es decir, análisis Northern blot) o metodologías de RT-PCR cuantitativas o semi-cuantitativas utilizando iniciadores de oligonucleótido apropiados. De manera alternativa, las pruebas de hibridación in situ cuantitativas o semi-cuantitativas se pueden efectuar utilizando, por ejemplo, secciones de tejido, o suspensiones de célula no lisada, y sondas de ARN o ADN marcadas en forma detectable (por ejemplo, fluorescentes, o marcadas con enzima). Los métodos adicionales para cuantificar ARNm incluyen prueba de protección de ARN (RPA), micro-arreglos de ADNc y oligonucleótido, análisis de diferencia de representación (RDA), despliegue diferencial, análisis de secuencia EST, y análisis en serie de expresión de gen (SAGE).
En modalidades apropiadas, la amplificación con PCR se utiliza para detectar al gen de Bcl-xL en la muestra de prueba. Brevemente, en la PCR, se preparan dos secuencias de iniciador que sean complementarias a las regiones en las cadenas complementarias propuestas de la secuencia marcadora, por ejemplo, el gen de Bcl-xL. Se agrega un exceso de trifosfatos de desoxinucleótido a una mezcla de reacción junto con una ADN polimerasa, por ejemplo, Taq polimerasa. Si la secuencia objetivo está presente en una muestra, los iniciadores se unen a la secuencia y la polimerasa ocasiona que los iniciadores se extiendan a lo largo de la secuencia marcadora agregando nucleótidos. Mediante elevación y disminución de la temperatura de la mezcla de reacción, los iniciadores extendidos se disocian del marcador para formar productos de reacción, los iniciadores en exceso se unen al marcador y a los productos de reacción y se repite el procedimiento, con lo cual se generan productos de amplificación. Se puede efectuar un procedimiento de amplificación con PCR de transcriptasa inversa con el fin de cuantificar la cantidad de ARNm amplificado.
Se puede amplificar y detectar cualquier fragmento apropiado del gen de Bcl-xL. El diseño de iniciadores eficientes para PCR está dentro de la habilidad ordinaria en la técnica. Típicamente, los fragmentos amplificados para detección son de aproximadamente 50 a 300 nucleótidos de longitud.
Los productos de amplificación se pueden detectar de varias maneras. Los productos de amplificación se pueden visualizar mediante electroforesis de la muestra en un gel y después tinción con un colorante para unión a ADN, por ejemplo, bromuro de etidio. De manera alternativa, los productos de amplificación se pueden marcar integralmente con un radio-nucleótido o nucleótido para fluorescencia y después se visualiza utilizando película de rayos X o bajo el espectro estimulador apropiado.
La amplificación también se puede monitorear utilizando métodos en "tiempo real". La PCR en tiempo real permite la detección y cuantificación de un objetivo de ácido nucleico. Típicamente, esta estrategia para PCR cuantitativas utiliza un colorante fluorescente, el cual puede ser un colorante específico de doble cadena, tal como SYBR GREEN®. I. De manera alternativa, se pueden conjugar otros colorantes fluorescentes (por ejemplo, FAM o HEX) a una sonda de oligonucleótido o un iniciador. Se conocen varios instrumentos capaces de efectuar PCR en tiempo real en la técnica e incluyen, por ejemplo, los sistemas ABI PRISM® 7900 (Applied Biosystems) y LIGHTCYCLER® (Roche). La señal fluorescente generada en cada ciclo de PCR es proporcional a la cantidad de producto de PCR. Se utiliza una gráfica de fluorescencia contra número de ciclo para describir la cinética de amplificación y se utiliza un nivel umbral de fluorescencia para definir un número de ciclo fraccionario relacionado con la concentración de plantilla inicial. Cuando la amplificación se efectúa y detecta en un instrumento que pueda leer la fluorescencia durante el ciclado térmico, se puede diferenciar el producto de PCR pretendido de los productos de PCR no específicos utilizando análisis de fusión. Mediante medición del cambio en fluorescencia al tiempo que se incrementa gradualmente la temperatura de la reacción posterior a la amplificación y generación de señal es posible determinar la Tm del producto o productos pretendidos así como la del producto no específico.
Los métodos pueden incluir amplificar ácidos nucleicos múltiples en la muestra, también conocido como "detección de multiplex" o "multiplexión". PC de Multiplex" se refiere a PCR que implica agregar más de un conjunto de iniciadores de PCR a la reacción con el fin de detectar y cuantificar ácidos nucleicos múltiples, incluyendo ácidos nucleicos de uno o más marcadores de gen objetivo. Asimismo, multiplexar con un control interno (por ejemplo, ARNr 18S, GADPH, u O-actina) provee un control para la PCR sin reacción.
Detección de la expresión : polipéptidos Los métodos y pruebas de la invención también están dirigidos en partir hacia la evaluación de la expresión de polipéptido, tal como el monitoreo de la expresión del polipéptido de Bcl-xL. La cantidad de expresión de los polipéptidos se puede evaluar ya sea cualitativamente o cuantitativamente. En otras modalidades, la cantidad de expresión de los polipéptidos se compara entre células no tumorales o de cáncer y células de tumor o de cáncer. Para esto se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica, pero son especialmente convenientes los inmunoensayos, en los cuales se utilizan anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido Bcl-xL. Los ejemplos de anticuerpos anti-Bcl-xL comercialmente disponibles se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3 Anticuerpos anti-Bcl-Xi comercialmente disponibles Hay dos tipos básicos de inmuno-ensayos, competitivos y no competitivos (por ejemplo, inmunométricos y emparedado, respectivamente). En ambos pruebas, los reactivos de anticuerpo o antígeno se unen de manera covalente o no covalente a la fase sólida. Los agentes enlazadores para unión covalente son conocidos y pueden ser parte de la fase sólida o derivatizar a éste antes del recubrimiento. Los ejemplos de fases sólidas utilizadas en inmunoensayos son materiales porosos y no porosos, partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas, cintas, glóbulos, membranas, cavidades de microtitulación y tubos de plástico. La elección del material de la fase sólida y el método para marcar en forma detectable al reactivo de antígeno o anticuerpo se determinan tomando como base las características de desempeño del formato de prueba deseado. Para algunos inmunoensayos, no se requiere marca detectable. Por ejemplo, si el antígeno está sobre una partícula detectable tal como un glóbulo rojo, la reactividad se puede establecer tomando como base la aglutinación. De manera alternativa, una reacción antígeno-anticuerpo puede dar como resultado un cambio visible (por ejemplo, inmunodifusión radial). En la mayoría de los casos, uno de los reactivos de anticuerpo o antígeno utilizados en un inmunoensayo se une a un compuesto generador de señal (marca detectable). Este compuesto o marca generadora de señal es por sí mismo detectable o se puede hacer reaccionar con uno o más compuestos adicionales para generar un producto detectable (véase también Patente E.U.A. No. 6,395,472 B1). Los ejemplos de dichos compuestos generadores de señal incluyen cromógenos, radioisótopos (por ejemplo, 125l, 131l, 32P, 3H, S, y C), compuestos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina), compuestos quimioluminescentes, partículas (visibles o fluorescentes), ácidos nucleicos, agentes para formación de complejos, o catalizadores tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa, y ribonucleasa). En el caso de uso de enzima, la adición de un substrato cromogénico, fluorogénico, o lumogénico da como resultado la generación de una señal detectable. También son útiles otros sistemas de detección tales como fluorescencia resuelta en tiempo, fluorescencia por reflexión interna, amplificación (por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa) y espectroscopia Raman. Existen dos formatos generales comúnmente utilizados para monitorear el título y tipo de anticuerpo específico en humanos: (1) el antígeno se presenta en una fase sólida, como se describió anteriormente, se deja que el fluido biológico humano que contiene los anticuerpos específicos reaccione con el antígeno, y después se detecta el anticuerpo unido al antígeno con un anticuerpo antihumano acoplado a un compuesto generador de señal, y (2) un anticuerpo anti-humano se une a la fase sólida, se deja que el fluido biológico humano que contiene los anticuerpos específicos reaccione con el anticuerpo unido, y después se agrega el antígeno unido a un compuesto generador de señal para detectar el anticuerpo específico presente en la muestra de fluido. En ambos formatos, el reactivo de anticuerpo anti-humano puede reconocer todas las clases de anticuerpo, o de manera alternativa, ser específico para una clase o subclase particular de anticuerpo, dependiendo del propósito pretendido de la prueba. Se pretende que estos formatos de pruebas así como otros formatos conocidos estén dentro del alcance de la presente invención y son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Cualquiera de los formatos de ejemplo en la presente solicitud y cualquier prueba o estuche de conformidad con la intención se puede adaptar u optimizar para uso en sistemas automatizados y semi-automatizados (incluyendo aquellos en los cuales hay una fase sólida que comprenda una micropartícula), como se describe, por ejemplo, en las Patentes E.U.A. Nos. 5,089,424 y 5,006,309, y como, por ejemplo, se venden comercialmenüe por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) incluyendo pero sin limitarse a las plataformas ARCHITECT®, AxSYM, IMX, PRISM, y Quantum II de Abbott, así como otras plataformas.
Las pruebas y estuches de la presente invención se pueden adaptar u optimizar para sistemas de prueba en el punto de atención, incluyendo el sistema de inmunoensayo electroquímico Point of Care (i-STAT™) de Abbott. Los inmunosensores y métodos de fabricación y operación de los mismos en dispositivos de prueba de un solo uso se describen, por ejemplo en Patente E.U.A. No. 5,063,081 y solicitudes publicadas de Patente E.U.A. Nos. 20030170881, 20040018577, 20050054078, y 20060160164 (incorporadas para referencia en la presente solicitud por sus enseñanzas referentes a lo mismo).
Procesamiento de la muestra y desempeño de la prueba La muestra de tejido que se va a analizar utilizando los métodos de la invención puede comprender cualquier tipo, incluyendo una muestra de sangre periférica, un tejido de tumor o un tejido de tumor sospechoso, una muestra citológica de capa fina, una muestra de aspirado de aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de nódulo linfático, una muestra de orina, una muestra de ascitis, una muestra de lavado, una muestra de cepillado del esófago, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra de aspirado de conducto, una muestra de descarga del pezón, una muestra de efusión de la pleura, una muestra de tejido congelado fresca, una muestra de tejido incrustada en parafina o un extracto o muestra procesada producida a partir de cualquiera de una muestra de sangre periférica, un tejido de tumor o un tejido de tumor sospechoso, una muestra citológica de capa fina, una muestra de aspirado de aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de nódulo linfático, una muestra de orina, una muestra de ascitis, una muestra de lavado, una muestra de cepillado del esófago, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra de aspirado de conducto, una muestra de descarga del pezón, una muestra de efusión de la pleura, una muestra de tejido congelado fresca, una muestra de tejido incrustada en parafina. Por ejemplo, una muestra de sangre periférica del paciente puede procesarse inicialmente para extraer una población de células epiteliales, y este extracto después se puede analizar. También se puede utilizar una microdisección de la muestra de tejido para obtener una muestra celular enriquecida con células de tumor sospechosas. Las muestras de tejido preferidas para uso en la presente solicitud son sangre periférica, tejido de tumor o tejido de tumor sospechoso, incluyendo aspirados de aguja fina, tejido congelado fresco y tejido incrustado en parafina, y médula ósea.
La muestra de tejido se pude procesar mediante cualquier método deseable para efectuar hibridación in situ u otras pruebas de ácido nucleico. Para las pruebas de hibridación in situ preferidas, una muestra de tejido de tumor o muestra de médula ósea incrustada en parafina se fija en un portaobjetos de vidrio y se retira la parafina con un solvente, típicamente xileno. Los protocolos útiles para remoción de la parafina del tejido e hibridación in situ están disponibles a partir de Abbott Molecular Inc. (Des Plaines, Illinois). Se puede utilizar cualquier instrumentación o automatización apropiada en la ejecución de las pruebas de la invenció. Las pruebas basadas en PCR se pueden efectuar en el sistema de instrumento m2000 (Abbott Molecular, Des Plaines, IL). Se puede utilizar la formación de imágenes automatizada para las pruebas de hibridación in situ fluorescentes preferidas.
En una modalidad, la muestra comprende una muestra de sangre periférica proveniente de un paciente la cual se procesa para producir un extracto de células de tumor o de cáncer en circulación que tienen una amplificación en el locus de Bcl-xL. Las células de tumor circulantes se pueden separar mediante tecnología de separación inmuno-magnética tal como la disponible de Immunicon (Huntingdon Valley, Pensilvania). El número de células de tumor circulantes que muestran por lo menos una ganancia de número de copia se compara después con el nivel de línea basal de células de tumor circulantes que tienen número de copia incrementado determinado de preferencia al inicio de la terapia. Incrementos en el número de dichas células de tumor circulantes pueden indicar falla de la terapia.
Las muestras de prueba pueden comprender cualquier número de células que sea suficiente para una diagnosis clínica, y típicamente contienen por lo menos aproximadamente 100 células. En una prueba FISH típica, el patrón de hibridación se evalúa en aproximadamente 25-1,000 células. Las muestras de prueba típicamente se consideran "prueba positiva" cuando se encuentra que contienen la amplificación de gen en una proporción suficiente de la muestra. El número de células identificadas con número de copia cromosómica y utilizadas para clasificar una muestra particular como positiva, en general, varía con el número de células en la muestra. El número de células utilizadas para una clasificación positiva también es conocido como el valor de corte. Los ejemplos de valores de corte que se pueden utilizar en las determinaciones incluyen aproximadamente 5, 25, 50, 100 y 250 células, o 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50% y 60% de las células en la población de muestra. U n valor tan bajo como una célula puede ser suficiente para clasificar u na muestra como positiva . En u na muestra de tejido incrustada en parafina típica , se prefiere identificar por lo menos 30 células como positivas y de manera más preferida identificar por lo menos 20 célu las como positivas por tener la ganancia de número de copia cromosómica . Por ejemplo , la detección de 30 células en u n tejido de cáncer de pu lmón de célu la pequeña i ncrustado en parafina típico q ue tienen una amplificación de BCI -XL sería suficiente para clasificar al tejido como positivo y eleg ible para tratamiento.
Estuches de prueba En otro aspecto, la invención comprende estuches para la detección de los biomarcadores genómicos que comprenden contenedores que contienen por lo menos una sonda específica para u nión a Bcl-xL. Estos estuches también pueden incluir contenedores con otros reactivos asociados para la prueba . Los estuches preferidos de la invención comprenden contenedores q ue contienen , respectivamente, por lo menos una sonda para F I S H que se pueda unir específicamente a Bcl-xL. Los estuches de la invención pueden comprender análogos de sonda de ácido nucleico , tales como sondas de ácido nucleico peptíd ico. Por último, los estuches también pueden comprender instrucciones para uso.
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Claims (66)

REIVINDICACIONES
1. - Un método para clasificar a un paciente que tiene un cáncer que es resistente a un inhibidor de la familia de Bcl-2, que comprende: (a) proveer una muestra de tejido proveniente de un paciente; (b) determinar si está amplificado un gen de Bcl-xL; y (c) clasificar al paciente como resistente al inhibidor de molécula pequeña de Bcl-2 si el gen de Bcl-xL está amplificado.
2. - Un método para identificar a un paciente con cáncer como elegible para recibir una terapia con inhibidor de la familia de Bcl-2 que comprende: (a) proveer una muestra de tejido proveniente de un paciente; (b) determinar si la expresión de un gen de Bcl-xL está amplificada; y (c) clasificar al paciente como elegible para recibir al inhibidor de la familia de Bcl-2 si el gen de Bcl-xL no está amplificado.
3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el inhibidor de la familia de Bcl-2 es ABT-263.
4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde la amplificación del gen de Bcl-xL se correlaciona con un incremento en la expresión del polipéptido Bcl-xL.
5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde la muestra de tejido comprende una muestra de sangre periférica, un tejido de tumor o un tejido de tumor sospechoso, una muestra citológica de capa fina, una muestra de aspirado de aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de nódulo linfático, una muestra de orina, una muestra de ascitis, una muestra de lavado, una muestra de cepillado del esófago, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra de aspirado de conducto, una muestra de descarga del pezón, una muestra de efusión de la pleura, una muestra de tejido congelado fresca, una muestra de tejido incrustada en parafina o un extracto o muestra procesada producida a partir de cualquiera de una muestra de sangre periférica, un tejido de tumor o un tejido de tumor sospechoso, una muestra citológica de capa fina, una muestra de aspirado de aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de nódulo linfático, una muestra de orina, una muestra de ascitis, una muestra de lavado, una muestra de cepillado del esófago, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra de aspirado de conducto, una muestra de descarga del pezón, una muestra de efusión de la pleura, una muestra de tejido congelado fresca o una muestra de tejido incrustada en parafina.
6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el paso de determinación comprende hibridación in situ.
7.- El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde la hibridación in situ se efectúa con una sonda de ácido nucleico que esté marcada en forma detectable.
8. - El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde la hibridación in situ se efectúa con una sonda de ácido nucleico o sonda de ácido nucleico peptídico que se híbrida específicamente a por lo menos una parte del gen de Bcl-xL.
9. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde determinar comprende la reacción en cadena de polimerasa.
10.- El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde la reacción en cadena de polimerasa se efectúa con por lo menos un iniciador que se híbrida específicamente a por lo menos parte de una secuencia de ácido nucleico del gen de Bcl-xL.
11. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el paso de determinación comprende una prueba de micro-arreglo de ácido nucleico.
12. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde la muestra de tejido proviene de un paciente con un cáncer que se selecciona a partir del grupo que consiste de carcinoma de pulmón de célula pequeña y un linfoma.
13 - El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde el paciente se clasifica como elegible para recibir un agente anti-sentido diseñado para unirse a uno de Bcl-2, Bcl-w, y Bcl-xL.
14.- Un método para monitorear a un paciente que está siendo tratado con un agente anti-familia de Bcl-2 que comprende: (a) proveer una muestra de prueba proveniente de un paciente con cáncer; (b) identificar en, o extraer de, la muestra de prueba células de tumor o de cáncer; (c) determinar en las células de tumor o de cáncer si un gen de Bcl-xL está amplificado; y (d) comparar el número de células de tumor o de cáncer que tienen un gen de Bcl-xL amplificado con el nivel de línea basal de dichas células de tumor o de cáncer determinadas antes de o al inicio de la terapia.
15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste de carcinoma de pulmón de célula pequeña y un linfoma.
16. - El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el paciente está siendo tratado con ABT-263.
17. - El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la amplificación del gen de Bcl-xL se correlaciona con un incremento en la expresión del polipéptido Bcl-xL.
18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el paciente está siendo tratado con un agente anti-sentido diseñado para unirse a por lo menos uno de Bcl-2, Bcl-w, y Bcl-xL.
19. - El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el paso de determinación comprende hibridación in situ.
20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la hibridación in situ se efectúa con una sonda de ácido nucleico que esté marcada en forma detectable.
21. - El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde las células de tumor son células de tumor circulantes.
22. - Un método para clasificar a un paciente que tiene un cáncer que es resistente a un inhibidor de la familia de Bcl-2, que comprende (a) proveer una muestra de prueba proveniente de un paciente; (b) determinar en la muestra de prueba: (i) si el gen de Bcl-xL está amplificado; y (ii) una cantidad de Bcl-xL en la muestra de prueba; (c) determinar si la cantidad de Bcl-xL en la muestra es más alta o más baja entonces la cantidad de Bcl-xL en un control; y (d) clasificar al paciente como que tiene un cáncer que es resistente al inhibidor de la familia de Bcl-2 tomando como base: (i) la amplificación del gen de Bcl-xL; y (ii) la cantidad de Bcl-xL es más alta en la muestra de prueba que en el control.
23. - Un método para identificar a un paciente con cáncer como elegible para recibir una terapia con inhibidor de la familia de Bcl-2 que comprende: (a) proveer una muestra de prueba proveniente de un paciente; (b) determinar en la muestra de prueba: (i) si el gen de Bcl-xL está amplificado; y (ii) una cantidad de Bcl-xL en la muestra de prueba; (c) determinar si la cantidad de Bcl-xL en la muestra es más alta o más baja entonces la cantidad de Bcl-xL en un control; y (d) clasificar al paciente como elegible para recibir la terapia con inhibidor de la familia de Bcl-2 tomando como base: (i) la amplificación del gen de Bcl-xL; y (ii) la cantidad de Bcl-xL es más alta en la muestra de prueba que en el control.
24. - El método de conformidad con la reivindicación 22 o 23, en donde el inhibidor de la familia de Bcl-2 es ABT-263.
25. - El método de conformidad con la reivindicación 22 o 23, en donde la muestra de tejido comprende una muestra de sangre periférica, un tejido de tumor o un tejido de tumor sospechoso, una muestra citológica de capa fina, una muestra de aspirado, de aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de nódulo linfático, una muestra de orina, una muestra de ascitis, una muestra de lavado, una muestra de cepillado del esófago, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra de aspirado de conducto, una muestra de descarga del pezón, una muestra de efusión de la pleura, una muestra de tejido congelado fresca, una muestra de tejido incrustada en parafina o un extracto o muestra procesada producida a partir de cualquiera de una muestra de sangre periférica, un tejido de tumor o un tejido de tumor sospechoso, una muestra citológica de capa fina, una muestra de aspirado de aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de nódulo linfático, una muestra de orina , u na m uestra de ascitis, u na muestra de lavado , una muestra de cepillado del esófago, u na muestra de lavado de vej iga o pulmón , una muestra de flu ido espinal , una muestra de fluido cerebral , una muestra de aspirado de conducto, u na muestra de descarga del pezón , u na muestra de efusión de la pleu ra, una muestra de tej ido congelado fresca o una m uestra de tejido incrustada en parafina .
26. - El método de conformidad con la reivind icación 22 o 23, en donde determinar la amplificación del gen de Bcl-xL comprende hibridación in situ.
27. - El método de conformidad con la reivindicación 26 , en donde la hibridación in situ se efectúa con una sonda de ácido n ucleico q ue esté marcada en forma detectable.
28. - El método de conformidad con la reivindicación 27 , en donde the hibridación in situ se efectúa con una sonda de ácido nucleico o sonda de ácido nucleico peptídico q ue se híbrida específicamente a por lo menos parte del gen de Bcl-xL.
29. - El método de conformidad con la reivindicación 22 o 23, en donde determinar la amplificación del gen de Bcl-xL comprende una reacción en cadena de polimerasa.
30. - El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde la reacción en cadena de polimerasa se efectúa con por lo menos un iniciador que se h íbrida específicamente a por lo menos parte de una secuencia de ácido n ucleico del gen de Bcl-xL.
31 .- El método de conformidad con la reivindicación 22 o 23, en donde el paso de determinación comprende una prueba de micro-arreglo de ácido n ucleico.
32.- El método de conformidad con la reivindicación 22 o 23, en donde la muestra de tejido proviene de u n paciente con un cáncer que se selecciona a partir del grupo que consiste de carcinoma de pulmón de célula pequeña y u n linfoma .
33 - El método de conformidad con la reivind icación 23, en donde el paciente se clasifica como elegible pa ra recibir un agente anti-sentido diseñado para unirse a u no de Bcl-2 , Bcl-w, y
34.- El método de conformidad con la reivindicación 22 o 23 , en donde el paso de determinar (b)(ii) se efectúa mediante inmuno-ensayo.
35 - El método de conformidad con la reivindicación 34 , en donde el inmunoensayo es un inmunoensayo en emparedado .
36. - El método de conformidad con la reivind icación 34, en donde el inmu noensayo es una ELI SA.
37. - El método de conformidad con la reivind icación 34, en donde el paso de determinar (b)(ii) se efectúa en un instrumento para inmunoensayo automatizado.
38 - El método de conformidad con la reivindicación 22 o 23, en donde el paso de determinar (b)(ii) se efectúa mediante med ición del ARNm de BCI-XL .
39.- Un método para monitorear a u n paciente q ue está siendo tratado con un agente anti-familia de Bcl-2 q ue comprende: (a) proveer u na muestra de prueba proveniente de un paciente con cáncer; (b) identificar en , o extraer de , la muestra células de tumor o de cáncer; (c) determinar si el paciente debe continuar o no siendo tratado con el inh ibidor de la familia de Bcl-2 tomando como base la presencia o ausencia de amplificación del gen de Bcl-xL.
40.- El método de conformidad con la reivind icación 39, en donde el cáncer se selecciona a partir del gru po q ue consiste de carcinoma de pulmón de cél ula peq ueña y u n linfoma .
41 - El método de conformidad con la reivindicación 39 , en donde el paciente está siendo tratado con ABT-263.
42 - El método de conformidad con la reivindicación 39, en donde la amplificación del gen de Bcl-xL se correlaciona con un incremento en la expresión del polipéptido Bcl-xL.
43. - El método de conformidad con la reivindicación 42 , en donde el paciente está siendo tratado con un agente anti-sentido diseñado para un irse a por lo menos uno de Bcl-2 , Bcl-w, y Bcl-xL.
44. - El método de conformidad con la reivind icación 42 , en donde el paso de determinación comprende hibridación in situ.
45. - El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde the h ibridación in situ se efectúa con u na sonda de ácido n ucleico que esté marcada en forma detectable.
46 - El método de conformidad con la reivind icación 44, en donde la hibridación in situ se efectúa con por lo menos dos sondas de ácido nucleico.
47.- El método de conformidad con la reivindicación 46 en donde una de las sondas de ácido nucleico está diseñada para que se hibride a un gen de Bcl-xL.
48.- El método de conformidad con la reivindicación 39, en donde las células de tumor son células de tumor circulantes.
49. - Un método para monitorear a un paciente que está siendo tratado con un agente anti-familia de Bcl-2 que comprende: (a) proveer una muestra de prueba proveniente de un paciente; (b) determinar en la muestra de prueba: (i) si el gen de Bcl-xL está amplificado; y (ii) una cantidad de Bcl-xL en la muestra de prueba; (c) determinar si la cantidad de Bcl-xL en la muestra es más alta o más baja entonces la cantidad de Bcl-xL en un control; y (d) determinar si el paciente debe continuar o no siendo tratado con el inhibidor de la familia de Bcl-2 tomando como base: (i) si el gen de Bcl-xL está amplificado; (ii) si la cantidad de Bcl-xL es más alta en la muestra de prueba que en el control.
50. - El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde el inhibidor de la familia de Bcl-2 es ABT-263.
51. - El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde la muestra de tejido comprende una muestra de sangre periférica, un tejido de tumor o un tejido de tumor sospechoso, una muestra citológica de capa fina, una muestra de aspirado de aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de nódulo linfático, una muestra de orina, una muestra de ascitis, una muestra de lavado, una muestra de cepillado del esófago, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra de aspirado de conducto, una muestra de descarga del pezón, una muestra de efusión de la pleura, una muestra de tejido congelado fresca, una muestra de tejido incrustada en parafina o un extracto o muestra procesada producida a partir de cualquiera de una muestra de sangre periférica, un tejido de tumor o un tejido de tumor sospechoso, una muestra citológica de capa fina, una muestra de aspirado de aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de nódulo linfático, una muestra de orina, una muestra de ascitis, una muestra de lavado, una muestra de cepillado del esófago, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra de aspirado de conducto, una muestra de descarga del pezón, una muestra de efusión de la pleura, una muestra de tejido congelado fresca o una muestra de tejido incrustada en parafina.
52.- El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde determinar la amplificación del gen de Bcl-xL comprende hibridación in situ.
53.- El método de conformidad con la reivindicación 52, en donde la hibridación in situ se efectúa con una sonda de ácido nucleico que esté marcada en forma detectable.
54.- El método de conformidad con la reivindicación 53, en donde la hibridación in situ se efectúa con u na sonda de ácido n ucleico o sonda de ácido n ucleico peptíd ico q ue se híbrida específicamente a por lo menos parte del gen de Bcl-xL.
55. - El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde determinar la amplificación del gen de Bcl-xu comprende u na reacción en cadena de polimerasa .
56. - El método de conformidad con la reivindicación 55, en donde la reacción en cadena de pol imerasa se efectúa con por lo menos u n in iciador q ue se h íbrida específicamente a por lo menos parte de una secuencia de ácido n ucleico del gen de Bcl-xL.
57. - El método de conformidad con la reivindicación 49 , en donde el paso de determinación comprende u na prueba de micro-arreglo de ácido n ucleico.
58.- El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde la muestra de tejido proviene de un paciente con u n cáncer que se selecciona a partir del g rupo que consiste de carcinoma de pulmón de célula pequeña y un linfoma.
59. - El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde el paciente se clasifica como elegible para recibir u n agente anti-sentido diseñado para un irse a uno de Bcl-2 , Bcl-w, y Bcl-xL.
60. - El método de conformidad con la reivind icación 49, en donde el paso de determinar (b)(ii) se efectúa mediante inmuno-ensayo .
61 . - El método de conformidad con la reivind icación 60 , en donde el inmunoensayo es u n inmu noensayo en emparedado.
62. - El método de conformidad con la reivindicación 60 , en donde el inmunoensayo es u na ELI SA.
63. - El método de conformidad con la reivindicación 60 , en donde el paso de determi nar (b)(ii) se efectúa en un instrumento para inmunoensayo automatizado.
64. - El método de conformidad con la reivindicación 49 , en donde el paso de determinar (b)(ii) se efectúa mediante medición del ARNm de Bcl-xL.
65. - U N estuche, q ue comprende: (a) reactivos para detectar un gen de Bcl-xL amplificado; y (b) instrucciones .
66. - El estuche de conformidad con la reivind icación 65, en donde los reactivos para detectar el gen de Bcl-xL amplificado comprenden polinucleótidos marcados en forma detectable que se h ibridan a por lo menos u na porción del gen de Bcl-xL.
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