CN108070562A - 一种“双打击”弥漫大b细胞淋巴瘤细胞系制备方法 - Google Patents

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胡慧仙
王赛斌
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Abstract

本发明公开了一种“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系制备方法：在患者的知情同意的前提下，收集经FISH确诊的“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤患者胸水100ml，通过离心、防污染和无菌流式细胞分选技术分离出原代“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞，再经含有15％胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，每3天更换培养液一次，15天后即可获得“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系。该细胞系伴有c‑myc基因和BCL‑2易位，具有高度侵袭性和体内成瘤能力，可用于高度侵袭性淋巴瘤的研究、药物开发等相关领域。

Description

一种“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系制备方法
所属技术领域
本发明涉及一种细胞系，尤其涉及一种人体内“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系。
背景技术
弥漫大B细胞淋巴瘤是最常见的非霍奇金淋巴瘤，其形态学及生物学行为异质性大，其预后与多种因素有关。随着近年来分子生物学的进展，发现6％-14％的DLBCL存在c-myc基因易位和BCL-2易位同时发生，称为所谓的“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤。2016年WHO造血与淋巴系统肿瘤分类重新修订，将这部分患者被作为一个独立的分类呈现，即伴有c-myc基因和BCL-2易位的高侵袭性的“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤。伴有c-myc基因和BCL-2易位的双打击淋巴瘤患者预后极差，临床上对“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤缺乏有效治疗手段，较多采用类似“伯基特”的较强化疗方案，然后用自体干细胞移植巩固化疗，然而欧美多中心对比发现双打击淋巴瘤患者经强化疗联合自体干细胞移植并没有从中获益。
c-myc基因首次在Burkitt淋巴瘤中发现，Adams等人首先报道了c-myc 基因在转基因小鼠中通过易位的方式与免疫球蛋白启动子形成融合基因，导致了B细胞淋巴瘤的形成，这标志着人类研究原癌基因的开端。c-myc作为多效性的转录因子，参与细胞发育和生理过程的多个方面，70％的肿瘤都显示出c-myc 基因的高表达。作为转录因子的c-myc蛋白不仅参与了细胞增殖与凋亡、细胞周期调控、能量合成代谢等正常生命活动，也在多种肿瘤形成过程中发挥了重要作用。c-myc基因已被确定为一种重要的转录因子，它调节人类基因组中10％以上的基因，在促进细胞生长，增加细胞代谢和线粒体生物合成，核酸、核糖体和蛋白质的生物合成等方面起关键角色，并且在细胞凋亡中具有重要作用。 BCL-2是细胞凋亡蛋白调节剂BCL-2家族的成员，该家族通过诱导(促凋亡)或抑制(抗凋亡)凋亡因子来调节细胞凋亡。BCL-2蛋白是一种促生存因子，具有稳定线粒体膜通透性的作用，能抑制细胞色素C和凋亡蛋白酶激活因子的释放，从而抑制细胞凋亡。
目前国内还没有成熟的c-myc/BCL-2双打击生物学特征的细胞系，我们从初诊双打击淋巴瘤患者的胸腔积液中获得新型c-myc/BCL-2细胞系，原代培养后经染色体及FISH鉴定符合“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤生物学特点；在重症免疫缺陷小鼠中注射该细胞系成功研制出“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤动物模型，瘤组织经FISH鉴定符合双打击淋巴瘤的特征，为双打击淋巴瘤的研究奠定了基础。
发明内容
由此，本发明的目的是提供一种具有“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系制备方法，该细胞系表达伴有c-myc基因易位和BCL-2易位，具有高度侵袭性和体内成瘤能力，可用于高度侵袭性淋巴瘤的研究、药物开发和相关领域。
本发明提供一种“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系制备方法包括以下步骤：
1.收集原代细胞系；
2.分离原代“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系；
3.原代“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系体外培养；
4.培养获得“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系。
同时，本发明还提供了该细胞系的鉴定方法如下：
医学鉴定：通过对制备所得细胞系进行HE染色、流式细胞仪鉴定和荧光原位杂交(FISH)分析，确定其具备“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞体系特征。
试验鉴定：将制备所得细胞系注射免疫缺陷小鼠，5周日后可见小鼠成瘤，进一步验证了该细胞系的体内成瘤能力。
本发明借用患者体内原代细胞进行体外培养，制备出伴有c-myc基因易位和BCL-2基因易位特征的“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系，具有高度侵袭性和体内成瘤能力，可用于高度侵袭性淋巴瘤的研究、药物开发等相关领域。
具体实施方式：
为使本发明的目的和技术方案更加清楚，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的制备及鉴定步骤为：
1.在患者的知情同意下，收集经FISH确诊的“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤患者胸水100ml，通过离心从胸水中纯化收集原代细胞系；
2.对原代细胞系使用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，使用2mM谷氨酰胺和50μg/ mL庆大霉素预防细胞污染，用无菌流式细胞分选技术分离出原代“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系；
3.将分离出的原代“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系重新悬浮于含有15％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，将培养液置于含有5％CO 2和37℃的细胞培养箱中培养，每天使用倒置显微镜检查细胞，用标准血细胞计数仪计数；
4.每3天更换培养液1次，15天后获得“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系，通过离心从培养液中获得该细胞系并贮藏。
5.“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞体系的鉴定：根据1-4步骤所获得细胞系经HE染色，形态符合大B淋巴细胞特征；细胞系再经流式细胞仪鉴定， CD10、CD19、CD20、CD79a阳性，符合大B细胞淋巴瘤细胞表现；细胞系再荧光原位杂交(FISH)分析显示IgH/BCL-2融合基因的多个拷贝和等位基因C-MYC 重排，从而得到该“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系。
6.“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系成瘤试验：根据5鉴定所获得细胞系注射免疫缺陷小鼠，5周后可见小鼠成瘤，通过肿瘤的石蜡切片H&E染色和肿瘤组织免疫组化CD20染色，符合其“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤动物模型特征。
显然，本发明的上述实例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系的制备方法，包含以下步骤：
1)收集原代细胞系；
2)分离原代“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系；
3)原代“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系体外培养；
4)培养获得“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系。
2.根据权利要求1所述的一种“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系的制备方法，其中，步骤1)中收集原代细胞须在在患者的知情同意的前提下，收集经FISH确诊的“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤患者胸水100ml，通过离心从胸水中纯化收集原代细胞系。
3.根据权利要求1所述的一种“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系的制备方法，其中，步骤2)中对原代细胞使用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，使用2mM谷氨酰胺和50μg/mL庆大霉素预防细胞污染，采用无菌流式细胞分选技术分离出原代“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系；。
4.根据权利要求1所述的一种“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系的制备方法，其中，步骤3)中将分离出的原代“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系重新悬浮于含有15％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，将培养液置于含有5％CO2和37℃的细胞培养箱中培养。
5.根据权利要求1所述的一种“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系的制备方法，其中，步骤4)中应每3天更换培养液1次，15天后获得“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系，通过离心从培养液中获得该细胞系并贮藏。
6.根据权利要求1所述的一种“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系的制备方法所得细胞系，可通过HE染色、流式细胞仪鉴定和荧光原位杂交(FISH)分析，确定其具备“双打击”弥漫大B细胞淋巴瘤细胞体系特征。
7.根据权利要求1所述的一种“双打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系的制备方法所得细胞系，可将其注射免疫缺陷小鼠，5周后可见小鼠成瘤，从而进一步验证了该细胞系的体内成瘤能力。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2877434A1 (en) * 2012-06-25 2014-01-03 Oncoethix Sa Method of treating lymphoma using thienotriazolodiazepine compounds
CN106244552A (zh) * 2015-06-05 2016-12-21 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种弥漫性大b细胞型淋巴瘤动物模型的建立方法及其应用
CN107406881A (zh) * 2015-01-12 2017-11-28 尤特罗皮克斯制药股份有限公司 用于指导癌症治疗的内容相关的诊断测试

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2877434A1 (en) * 2012-06-25 2014-01-03 Oncoethix Sa Method of treating lymphoma using thienotriazolodiazepine compounds
CN107406881A (zh) * 2015-01-12 2017-11-28 尤特罗皮克斯制药股份有限公司 用于指导癌症治疗的内容相关的诊断测试
CN106244552A (zh) * 2015-06-05 2016-12-21 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种弥漫性大b细胞型淋巴瘤动物模型的建立方法及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PHAM, LV等: "Establishment and characterization of a novel MYC/BCL2 "double-hit" diffuse large B cell lymphoma cell line, RC", 《JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY》 *

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