CN111187753A - 一种高潜能脑转移肺癌细胞株及其应用、构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高潜能脑转移肺癌细胞株及其应用、构建方法。所述高潜能脑转移肺癌细胞株命名为：荧光素酶基因标记的人肺腺癌脑转移细胞系，株号H1975luc‑BM4，保藏号为：CGMCC No.15586。本发明采用裸鼠左心室反复接种稳定表达荧光素酶的肺癌EGFR双突变细胞H1975‑luc，对脑转移灶进行原代分离纯化原代培养高转移性肺癌细胞，反复进行裸鼠左心室注射，分离纯化得到具有脑转移的肺癌细胞系H1975luc‑BM4，便于肿瘤药理研究中细胞生物学实验的需求。分离筛选肺癌脑转移细胞株，不仅有利于寻找肺癌发生脑转移的关键靶点，鉴定其分子指纹，深入解析肺癌细胞脑转移的分子机制，建立肺癌脑转移预测模型，为优化临床治疗提供新策略，具有重要的科学意义和临床价值。

Description

一种高潜能脑转移肺癌细胞株及其应用、构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种高潜能脑转移肺癌细胞株及其应用、构建方法。

背景技术

肺癌是全球发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，据世界癌症研究机构数据统计，2018年全球肺癌新发约209.4万例，死亡约176.1万例。脑是肺癌最常见的转移部位之一，约20％-50％的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在疾病不同时期出现脑转移。其中，10-20％的NSCLC在初诊时已经存在脑转移，另有约20％患者在病程的其余时期出现脑转移。在肺癌的不同病理类型中，有文献报道表皮生长因子受体(epidermal growthfactor receptor，EGFR)突变NSCLC人群的脑转移发生率更高。随着分子生物学的发展，从分子生物学角度寻找肺腺癌脑转移的分子生物学标记成为目前关注的焦点。由于肿瘤细胞的异质性，肺癌原发病灶中并非所有肺癌细胞均能进行脑转移。高脑转移的细胞亚株为进行脑转移并适应脑的微环境，其在DNA和蛋白表达谱上有所改变。这些改变在使这部分肺癌细胞对脑具有高亲和力的同时，可能促进肺癌细胞与BBB内皮细胞之间的相互作用。

研究肺癌脑转移需要首先建立稳定的脑转移模型，这是分析肺癌脑转移的前提。但由于受到脑转移检测技术限制，很难通过早期影像检测到脑转移灶，使肺癌脑转移模型的建立非常困难。目前，尽管国内外由学者采用筛选的方法成功建立了高转移模型，例如：雷贝等通过反复体内外筛选获得较高脑转移潜能的亚系CPA-Yang1-BM，一次接种可有一半的裸小鼠产生脑转移。公开号为CN1386848的发明公开了一种人肺癌脑转移细胞系LBT72CGMCC No.0577，它是从一位56岁男性原发肺癌脑转移肿瘤患者的脑肿瘤中得到的。LBT72细胞在含10％新生牛血清的DMEM培养液中体外传代培养，连续传100多代后，细胞仍然生长增生活跃。LBT72为上皮细胞，具有典型的肿瘤细胞生物学特征。此细胞系突出特点是遗传(染色体)不稳定性，细胞核型为多倍体，染色体数目达70条，并存在标记染色体。

但是，目前国内外有关肿瘤转移模型研究的报道中，尚无建立EGFR敏感+耐药双突变脑转移肺癌细胞系的报道。并且这些已有的模型不能连续、直观地观察肿瘤细胞在体内生长、转移的动态变化过程。

活体成像技术利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。生物发光是将荧光素酶(Luciferase)基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，在ATP及氧气存在时，外源(腹腔或静脉注射)给予荧光素酶底物(D-Luciferin)，荧光素酶催化荧光素的氧化反应产生发光。作为体内报告源，生物发光在动物体自身不会发光，具有极低的背景。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种高潜能脑转移肺癌细胞株及其应用、构建方法。

本发明针对现有技术中缺少高潜能脑转移肺癌细胞株的问题，提供一种筛选肺癌脑转移的细胞株的制备方法，同时提供一种带荧光素酶高潜能脑转移的人肺癌EGFR敏感+耐药双突变的细胞株，通过非侵袭性的生物发光成像技术，能在活体水平动态观察裸鼠肿瘤细胞生长、转移、定植于颅内生长的过程，为动物水平动态监控肿瘤生长、评价疗效提供了新的研究工具。

一种高潜能脑转移肺癌细胞株，命名为：荧光素酶基因标记的人肺腺癌脑转移细胞系，株号H1975luc-BM4，于2018年4月23日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15586。本发明高潜能脑转移肺癌细胞株由人肺腺癌细胞株H1975(EGFR敏感+耐药双突变细胞株)经慢病毒转染荧光素酶报告基因，获得稳定表达荧光素酶的肺腺癌H1975-luc单克隆细胞株。将H1975-luc肿瘤细胞悬液注射入裸鼠左心室，活体成像提示发生脑转移后，将脑转移瘤进行原代培养，后反复4轮接种裸鼠，经原代培养后筛选获得具有脑高转移能力的一株细胞。

本发明又提供了所述高潜能脑转移肺癌细胞株的子代细胞。所述子代细胞基本或全部保留了亲代肺癌细胞株H1975luc-BM4的特性，具有高转移性和侵袭性。

本发明又提供了所述高潜能脑转移肺癌细胞株作为肺癌脑转移机制研究细胞模型中的应用。

本发明又提供了所述高潜能脑转移肺癌细胞株在构建肺癌脑转移的哺乳动物肺癌模型中的应用。所述的哺乳动物为裸小鼠或裸大鼠。通过将一定细胞数量的所述所述高潜能脑转移肺癌细胞株接种于裸小鼠或裸大鼠的左心室或者尾静脉注射，获得高潜能脑转移肺癌的动物模型。

本发明又提供了所述高潜能脑转移肺癌细胞株在筛选或预测肺癌脑转移的分子标志物中的应用。通过与亲代细胞进行蛋白组学比较研究，可以发现肺癌脑转移的分子标记，针对该分子标记可以进行后续的疾病治疗及药物研发等方面的应用。

本发明又提供了所述高潜能脑转移肺癌细胞株在筛选或评估治疗脑转移性的肺癌药物中的应用。

本发明又提供了所述高潜能脑转移肺癌细胞株在开发肺癌脑转移风险评估检测试剂盒中的应用。筛选出肺癌脑转移特异性的分子标志物后，可根据该肿瘤标志物建立肺癌脑转移的预测模型，开发出预测肺癌脑转移相关的试剂盒，用于临床上预测脑转移发生风险。

本发明还提供了所述高潜能脑转移肺癌细胞株的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建稳定表达荧光素酶的H1975-luc细胞株；

(2)1975-luc细胞进行裸鼠左心室注射，建立脑转移模型，并进行活体成像观察脑转移灶，6-8周后取裸鼠大脑，分离肿瘤转移灶，进行原代培养；

(3)将步骤(2)原代培养的肿瘤细胞重复进行步骤(2)操作，共重复操作4轮，筛选获得高潜能脑转移肺癌细胞株。

本发明采用裸鼠左心室反复接种稳定表达荧光素酶的肺癌EGFR突变细胞H1975-luc，对脑转移灶进行原代分离纯化原代培养高转移性肺癌细胞，反复进行裸鼠左心室注射，分离纯化得到具有脑转移潜能的肺癌细胞系H1975luc-BM4，便于肿瘤药理研究中细胞生物学实验的需求。分离筛选肺癌脑转移细胞株，不仅有利于寻找肺癌发生脑转移的关键靶点，鉴定其分子指纹，深入解析肺癌细胞脑转移的分子机制，建立肺癌脑转移预测模型，为优化临床治疗提供新策略，具有重要的科学意义和临床价值。

附图说明

图1为亲代H1975细胞和病毒转染后稳定表达荧光素酶的H1975-luc的生物学特征对比示意图，其中，图A为细胞形态比较图，图B为生长曲线图，图C为细胞周期结果，图D为细胞迁移和侵袭结果。

图2为肿瘤细胞建立小鼠脑转移模型的活体成像对比示意图，其中，图A为H1975-luc细胞株，图B为H1975luc-BM4细胞株。

图3为脑转移灶的HE染色对比示意图，上下两行分别为两种细胞光镜下结果，左右两列分别是不同放大倍数下的图。

图4为亲代细胞H1975和经体内外反复筛选4个周期的具有高潜能脑转移细胞株H1975luc-BM4生物学特征对比示意图，其中图A为细胞形态结果，图B为生长曲线，图C为克隆形成检测结果，图D为细胞周期结果。

图5为亲代肺癌细胞H1975与具有高潜能脑转移细胞株H1975luc-BM4的体外迁移、侵袭能力比较示意图，其中图A为划痕实验结果，左侧为显微图，右侧为统计结果；图B为transwell实验结果，左侧为显微图，右侧为统计结果，“**”表示p<0.01，“***”表示p<0.001。

图6为亲代肺癌细胞H1975和具有高潜能脑转移细胞株H1975luc-BM4细胞中EMT相关蛋白的表达情况对比示意图，其中图A为细胞EMT相关marker蛋白，左侧为WesternBlot图，右侧为定量数据分析图；图B为转录因子，左侧为WesternBlot图，右侧为定量数据分析图，“*”表示p<0.05，“***”表示p<0.001。

具体实施方式

实验材料：

细胞系：H1975人肺腺癌(EGFR L858R+T790M双突变)细胞系，购买自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

耗材：RPMI1640培养基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，Giemsa染色试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，细胞培养瓶(Corning公司)，6孔板、96孔板(Corning公司)，24孔Transwell小室(孔径8μm，Corning公司)、基质胶(matrigel，BD公司)。

试剂：ZO-1抗体、E-cadherin抗体、N-cadherin抗体、Vimentin抗体、Slug抗体、Smad2/3抗体、Snail抗体、p-Smad2抗体、GAPDH抗体均购买自CST公司。

实施例1

H1975-luc细胞株建立。

(1)带荧光素酶基因的慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司包装和浓缩。

(2)将H1975细胞悬液(细胞数约为5×10⁴个)接种于6孔板中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱培养待细胞融合度达到约20％。

(3)加入滴度5×10⁸TU/mL的慢病毒(MOI为20)，并加入Polybrene(5μg/ml)感染H1975细胞；继续培养24h后更换培养基；转染48h后加入2μg/ml嘌呤霉素。按时更换含嘌呤霉素的培养基。

(4)待细胞约80％-90％汇合后，消化、洗涤后部分细胞传代培养，部分细胞内加入裂解液，4℃离心去除细胞碎片后，上清中加入荧光素酶分析缓冲液和荧光素液，在562nm条件下进行检测。

(5)挑选单克隆：细胞稀释至<10个/ml，100μl/孔铺96孔板，12h后镜检，选择只有1个细胞的孔继续培养10-14天，消化转移至6孔板继续培养后冻存。

实施例2

亲代H1975细胞和病毒转染后稳定表达荧光素酶的H1975-luc的生物学特征。

(1)将H1975和H1975-luc细胞悬液(细胞数约为5×10⁴个)接种于6孔板中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱培养，细胞贴壁后光学显微镜下观察，结果如图1所示，光镜下H1975-luc与H1975细胞在形态上无差异，依然呈细长梭形，细胞核较大，呈类圆形，核浆比例较高，可见异常核分裂相(图1A)；

(2)将H1975和H1975-luc细胞悬液(细胞数约为1×10³个)分别接种于96孔板中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱培养，采用CCK8方法绘制细胞生长曲线。结果表明稳定表达荧光素酶的H1975-1uc细胞与H1975细胞具有相似的生长趋势，生长曲线基本吻合(图1B)；

(3)将H1975和H1975-luc细胞悬液(细胞数约为1×10⁵个)分别接种于6孔板内，利用流式细胞仪检测细胞周期，结果表明稳定表达荧光素酶的H1975-luc细胞与亲代细胞相比，细胞周期无显著改变(图1C)；

(4)将H1975和H1975-luc细胞悬液(细胞数约为5×10⁵个)接种于6孔板内，待细胞融合生长后，用200μl枪头进行划痕，划痕0h和24h进行光镜下成像，采用image J软件进行迁移距离分析；用不含血清的RPMI1640培养基分别重悬H1975和H1975-luc细胞(细胞数约为1×10⁵个)，接种于24孔板transwell内室，内室预先包被matrigel基质胶，外室含10％血清，24h后甲醇固定上室，0.1％结晶紫染色后显微镜下成像。细胞划痕实验和transwell小室实验结果均提示，构建luc的过程未对H1975细胞的迁移、侵袭能力产生显著影响(图1D)。

实施例3

人高潜能脑转移肺癌H1975luc-BM4细胞株建立。

(1)取6-8周龄、雄性BALB/C裸鼠(购买自浙江省医学科学院实验动物中心)，麻醉，仰卧固定于平板上，胸部消毒备皮。

(2)用29G胰岛素注射器(BD公司)吸取100μl细胞悬液。在胸骨上切迹与剑突的中点偏左标记注射点，从左心室正上方垂直进针，进针5mm见血液喷射涌入后固定针头，将肿瘤细胞注射入左心室，注射后以轻微负压退针。

(3)接种后的裸鼠置于SPF环境内继续饲养，并每天观察裸鼠的神志、活动、进食进水及营养情况；有无走路不稳、抽搐等神经症状；有无显著消瘦、无力等恶病质表现等。

(4)左心室接种造模6周开始每周进行活体成像：将裸鼠麻醉，腹腔注射浓度为30mg/ml荧光素酶底物0.2ml。10分钟后放入活体成像系统中检测，并拍照记录。

(5)活体成像确认发生脑转移后，裸鼠置于75％酒精中消毒，快速用剪刀断头取脑，置于加有冰冷的D-hanks的无菌培养皿内。

(6)用消毒眼科镊分离大脑左右半球，去除嗅球、海马、纹状体和基底脑组织。

(7)根据活体成像提示的荧光部位，体式显微镜下观察脑转移结节病灶形成部位，取出含肿瘤组织的大脑皮层，置于含有冰冷D-hanks的培养皿中，小心剔除软脑膜和血管。

(8)用灭菌的眼科剪将组织剪碎，加入0.25％胰酶在37℃下消化10-15分钟。然后加入含20％灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液，用吸管吹打成细胞悬液，接种到细胞培养瓶中。培养后48小时去除上清，选择贴壁肿瘤上皮细胞，继续培养。

(9)反复贴壁法纯化脑转移肺癌细胞：用0.25％胰蛋白酶消化细胞后，Hanks液洗2次，加入不含血清的培养液吹打分散，制成单细胞悬液，接种至第一个培养瓶；置培养箱中静置培养15-20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，慢慢吸出未贴壁细胞悬液，接种至第二个培养瓶；细胞静置培养15-20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，吸出未贴壁细胞悬液加入第三个培养瓶，并在第三个培养瓶中补加胎牛血清(终浓度为10％)，继续培养。经过2-3次反复纯化细胞，脑转移肺癌细胞株命名为H1975luc-BM1。

(10)重复步骤(1)-(9)，经过体内外的4轮筛选，获得高潜能脑转移肺癌细胞株H1975luc-BM4。命名为：荧光素酶基因标记的人肺腺癌脑转移细胞系，株号H1975luc-BM4，于2018年4月23日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15586。

实施例4

活体成像观察肿瘤生长情况。

H1975-luc细胞悬液进行裸鼠左心室注射造模，于造模后第6-8周进行活体成像。裸鼠用戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，随后腹腔注射D-Luciferin工作液，10min后进行小动物化学发光成像检测。结果如图2所示，注射H1975-luc细胞组发现5只小鼠中只有1只小鼠脑部有荧光信号；经过4轮体内外筛选后，H1975luc-BM4进行造模后进行活体成像，发现5只裸鼠中有3只裸鼠脑部有强荧光信号(60％脑转移发生率)。

实施例5

病理解剖观察裸鼠肺癌经血脑转移情况。

实施例4中，活体成像明确脑转移灶后，取部分裸鼠大脑，4％多聚甲醛固定后，进行脱水、透明、浸蜡、包埋，制成5μm切片，经过二甲苯乙醇脱蜡水化后，行苏木素-伊红(HE)染色，观察肺癌脑转移灶。

结果如图3所示，发现亲代细胞H1975-luc经血发生的脑转移病灶稀疏、成瘤较小，部分肿瘤细胞仍呈梭形，核染色较浅，分裂相少见。经体内外反复筛选4次获得的高转移细胞(H1975luc-BM4)发生的脑转移灶体积较大，肿瘤细胞呈圆形、椭圆形或不规则形，细胞分化差，核大，深染，分裂相多见。HE染色结果提示，在脑高转移亚株的筛选过程中，肿瘤的形态出现改变，提示肿瘤恶性程度增高。

实施例6

亲代H1975细胞和经过4个周期体内外筛选后获得的带荧光素酶的高潜能脑转移肺癌H1975luc-BM4的生物学特征比较。

(1)将H1975和H1975luc-BM4细胞悬液(细胞数约为5×10⁴个)接种于6孔板中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱培养，细胞贴壁后光学显微镜下观察，结果如图4所示，H1975luc-BM4基本保留了亲代细胞H1975的形态学特点，依然呈长梭形(图4A)，但H1975luc-BM4经细胞体内外4次筛选，细胞呈悬浮、圆形状变化。吉姆萨染色结果显示H1975luc-BM4核浆比例增加、细胞形态呈圆形变化，提示H1975luc-BM4的恶性程度可能比原代细胞增加(图4A)。

(2)将H1975和H1975luc-BM4细胞悬液(细胞数约为5×10³个)分别接种于96孔板中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱培养，采用CCK8方法绘制细胞生长曲线。结果提示H1975luc-BM4的生长速度显著慢于H1975，呈现惰性状态(图4B)。

(3)将H1975和H1975luc-BM4细胞悬液(细胞数约为8×10²个)分别接种于6孔板中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱培养10-14天，结晶紫染色后计数克隆形成实验提示H1975luc-BM4细胞株比亲代细胞H1975株具有更强的克隆形成能力(图4C)。

(4)将H1975和H1975luc-BM4细胞悬液(细胞数约为1×10⁵个)分别接种于6孔板内，利用流式细胞仪检测细胞周期，结果提示筛选过程未引起细胞周期显著变化(图4D)。

实施例7

亲代H1975细胞和带荧光素酶的高潜能脑转移肺癌H1975luc-BM4转移能力比较。

将H1975和H1975luc-BM4细胞悬液(细胞数约为5×10⁵个)接种于6孔板内，待细胞融合生长后，用200μl枪头进行划痕，于划痕0h和24h进行光镜下成像，采用image J软件进行迁移距离分析；用不含血清的RPMI1640培养基分别重悬H1975和H1975luc-BM4细胞(细胞数约为1×10⁵个)，接种于24孔板transwell内室，内室预先包被matrigel基质胶，外室含10％血清，24h后甲醇固定上室，0.1％结晶紫染色后显微镜下成像。结果如图5所示，划痕实验(图5A)和transwell实验结果(图5B)提示H1975luc-BM4的迁移能力和侵袭能力均比亲代细胞显著增强。

实施例8

EMT相关分子标志物H1975细胞和H1975luc-BM4细胞中的表达情况。采用WesternBlot方法，检测细胞EMT相关marker蛋白和转录因子的表达情况。

结果提示H1975luc-BM4的EMT上皮分子标志物E-cadherin和紧密连接蛋白-1(ZO-1)的表达水平均显著低于其亲代细胞H1975。而EMT间质分子标志物N-cadherin在H1975luc-BM4细胞中的表达水平显著高于其亲代细胞H1975。在H1975luc-BM4细胞中转录因子Snail和p-Smad2的表达水平均显著高于其亲代细胞。

Claims (8)

1.一种高潜能脑转移肺癌细胞株，其特征在于，命名为：荧光素酶基因标记的人肺腺癌脑转移细胞系，株号H1975luc-BM4，保藏号为：CGMCC No.15586。

2.如权利要求1所述高潜能脑转移肺癌细胞株的子代细胞。

3.如权利要求1所述高潜能脑转移肺癌细胞株作为肺癌脑转移机制研究细胞模型中的应用。

4.如权利要求1所述高潜能脑转移肺癌细胞株在构建肺癌脑转移的哺乳动物肺癌模型中的应用。

5.如权利要求1所述高潜能脑转移肺癌细胞株在筛选或预测肺癌脑转移的分子标志物中的应用。

6.如权利要求1所述高潜能脑转移肺癌细胞株在筛选或评估治疗脑转移性的肺癌药物中的应用。

7.如权利要求1所述高潜能脑转移肺癌细胞株在开发肺癌脑转移风险评估检测试剂盒中的应用。

8.如权利要求1所述高潜能脑转移肺癌细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将荧光素酶基因导入H1975细胞内，构建稳定表达荧光素酶的H1975-luc细胞株；

(2)H1975-luc细胞进行裸鼠左心室注射，建立脑转移模型，并进行活体成像观察脑转移灶，6-8周后取裸鼠大脑，分离肿瘤转移灶，进行原代培养；

(3)将步骤(2)原代培养的肿瘤细胞重复进行步骤(2)操作，共重复操作4轮，筛选获得高潜能脑转移肺癌细胞株。

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