CN116904521A - 一种突变型肺腺癌细胞系、构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种突变型肺腺癌细胞系、构建方法和应用。本发明要解决的技术问题是为研究SCLC转化的机制提供新的工具。本发明的技术方案是一种突变型肺腺癌细胞系的构建方法，包括如下主要步骤：将稳定传代的人肺腺癌HLA19细胞系进行目标基因的突变；所述突变的方法包括对目标基因进行编辑、敲除、干扰表达或超量表达。采用本发明方法可获得具备特定基因突变的肺腺癌细胞系。该细胞系可用作为研究癌症成因的工具，还可以用作筛选治疗癌症药物的工具。

Description

一种突变型肺腺癌细胞系、构建方法和应用
技术领域
本发明属于癌症治疗技术领域，具体涉及一种突变型肺腺癌细胞系、构建方法和应用。
背景技术
表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）突变是肺癌最常见的驱动基因变异，针对此靶点的EGFR酪氨酸激酶抑制剂（Epidermal Growth FactorReceptor Tyrosine Kinase Inhibitor，EGFR-TKI）展现出疗效好，副作用小等优点，使很多具有EGFR基因敏感突变的晚期非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者从中获益。然而不幸的是，患者在接受EGFR-TKI治疗后难以避免耐药的发生。耐药的机制包括：EGFR依赖性耐药，如EGFR第20号外显子获得性T790M突变、C797S突变；旁路信号传导激活，如间质上皮转化因子（Mesenchymal to epithelial transition factor，MET）扩增、人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor2，HER2）扩增；组织学转化，如非小细胞肺癌会发生小细胞肺癌（Small-cell lung cancer，SCLC）的组织学转化。
表皮生长因子受体(EGFR)突变型非小细胞肺癌(NSCLC)具有临床和遗传异质性，多项研究表明RB1/TP53突变的NSCLC患者有转化为小细胞肺癌(SCLC)的高风险；同时在转化后的小细胞肺癌患者的肿瘤组织中，多发现RB1及TP53的基因突变，然而仅有TP53及RB1突变不足以促使NSCLC向SCLC转化的发生。既往文献指出EGFR信号通路有促进肺泡上皮分化的作用，2015年Nature Communications的一项研究也发现与耐药前的NSCLC对照组肿瘤样本相比，发生SCLC转化后的肿瘤EGFR表达缺失；此外，NSCLC向SCLC转化几乎都发生在接受EGFR-TKI治疗后，因此推测当NSCLC存在RB1缺失同时TP53突变时，EGFR表达缺失或功能受到抑制可能会消除肿瘤细胞向NSCLC谱系分化的动力，肿瘤中具有分化潜能的细胞在缺失EGFR的作用下继续生长并沿着其他谱系如SCLC的方向分化，最终形成SCLC，即EGFR表达缺失在NSCLC向SCLC的转化中可能具有驱动作用。同时我们推测， 当转化后的SCLC重新获得EGFR表达时可能会重新分化为NSCLC。然而，与这种转化相关的分子变化尚不清楚，且同时具有TP53及RB1基因同时突变的细胞系鲜有报道，因此建立具有TP53和RB1基因突变，且EGFR表达缺失的新非小细胞肺癌细胞系至关重要，这将为研究SCLC转化的机制提供新的工具。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为研究SCLC转化的机制提供新的工具。
本发明的技术方案是一种突变型肺腺癌细胞系的构建方法，包括如下主要步骤：将稳定传代的人肺腺癌HLA19细胞系进行目标基因的突变；所述突变的方法包括对目标基因进行基因编辑、敲除或使其表达缺失。
其中，所述目标基因为肺癌形成或发展相关基因。
特别的，所述肺癌形成或发展相关基因为EGFR基因。
具体的，所述基因编辑为采用CRISPR方式实现。
进一步的，所述CRISPR方式中，sgRNA为SEQ ID No.1~3中至少一条核苷酸所示。
本发明还提供了上述方法构建得到的细胞系。
具体的，所述细胞系为HLA19EKO细胞系，该细胞系在保藏与存活证明中的名称为“人肺腺癌细胞HLA19EKO”，已于2023年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏单位地址：中国武汉武汉大学，其保藏号为CCTCC NO:C2023212。
本发明还进一步提供了上述细胞系作为实验材料在研究癌症中的应用。
具体的，所述癌症为肺腺癌。
本发明还提供了上述细胞系作为实验材料在研究NSCLC转化为SCLC中的应用。
本发明进一步提供了上述细胞系作为实验材料在研究肺癌治疗过程中产生EGFR-TKI耐药性原因中的应用。
本发明还提供了上述细胞系在制备肺癌动物模型中的应用。
特别的，所述肺癌为肺腺癌。
本发明还提供了上述细胞系在筛选治疗肺癌药物中的应用。
进一步的，所述肺癌为肺腺癌。
本发明的有益效果：本发明将一名病理证实为TP53和RB1双等位基因改变的女性非小细胞肺癌患者的肿瘤组织经分离纯化，并稳定传代。在此基础上，申请人对该细胞的目标基因进行了突变，为获得更为丰富的肺腺癌研究模型奠定了基础。尤其是，通过基因编辑手段获得了EGFR基因敲除的新细胞系HLA19EKO。HLA19EKO细胞系可用于研究NSCLC转化为SCLC机制的工具，亦可为克服耐药性提供研究基础。
本发明的人肺腺癌HLA19细胞系在保藏与存活证明中的名称为“人肺腺癌细胞HLA19”，已于2023年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为 CCTCCNO:C2023211，保藏地址：中国武汉武汉大学。
本发明的人肺腺癌HLA19EKO细胞系在保藏与存活证明中的名称为“人肺腺癌细胞HLA19EKO”，已于2023年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为 CCTCCNO:C2023212，保藏地址：中国武汉武汉大学。
附图说明
图1、肿瘤细胞的分离及纯化：a、肿瘤细胞纯化前镜下可见较多成纤维细胞；b、经限制性稀释法挑选肿瘤细胞单克隆后，镜下为形态一致的贴壁式生长的肿瘤细胞；c、细胞经免疫组化染色证实所有细胞CK7染色阳性，证实其为腺上皮来源。
图2、肿瘤细胞全外显子测序覆盖图。
图3、细胞系构建及STR鉴定：a～f分别为经STR检测鉴定，HLA19细胞中基因座2-D13S317、5-VWA、3-D7S820、6-TH01、4-D16S539和 8-TOPX检测鉴定。
图4、不同 sgRNA 的敲除效率检测及敲除后细胞EGFR表达验证：a、不同sgRNA敲除EGFR后，细胞的EGFR阳性率（EGFR+）；经 sgRNA2 敲除后的 EGFR 蛋白表达阴性的细胞含量最高；b、流式细胞术分选EGFR敲除的肺腺癌细胞的结果，在敲除 EGFR 之前 HLA19细胞EGFR高表达，经分选后的HLA19EKO细胞均为 EGFR 阴性的细胞（右图中双峰重叠）；c、HLA19EKO及HLA19镜下形态，均为多角型贴壁式生长细胞；d、Western Blot 验证HLA19EKO细胞EGFR蛋白表达阴性。
图5、划痕实验结果：a、划痕实验展示EGFR敲除后的HLA19EKO细胞的48小时内的迁移状态；b、HLA19EKO的迁移率明显低于EGFR敲除前的细胞HLA19。
图6、CCK8实验结果。
图7、免疫组化及免疫荧光EGFR染色证实，HLA19EKO的EGFR蛋白表达为阴性。
图8、裸鼠成瘤实验：a、HLA19EKO细胞在裸鼠皮下成瘤拍照；b、镜下肿瘤组织学检查。
图9、肿瘤细胞全外显子测序拷贝图，图中下方横坐标的数字代表在染色体上的位置，单位为Mb。
图10、肿瘤细胞全外显子测序后RB1（a）和p53（b）突变位点展示图。
具体实施方式
本发明肿瘤组织标本取自诊断为TP53基因突变及RB1基因缺失的肺腺癌患者肿瘤组织一例。在通过了医院伦理审查后进行了构建人源肿瘤异种移植模型（patient-derivedtumor xenograft PDX）及肺癌原代细胞系的研究。
申请人对分离的样本进行了培养、纯化，并通过全基因外显子测序和分型检测证明了该细胞系为新的，并命名为HLA19。目前，该细胞系已传至75代，稳定性好。为了确认该细胞系可用于构建人源肿瘤异种移植模型，在体外实验中对细胞系的迁移和增殖能力进行了检测，都取得了较好的效果。在此基础上，进行了裸鼠成瘤实验，成瘤率100%。
为了获得更多的移植模型，申请人提出可以对该细胞系进行突变。突变方式为对目标基因进行编辑、敲除或使其表达缺失。在本发明的一个实施例中，选择了CRISPR-cas9的基因编辑方式对EGFR基因进行了敲除。敲除EGFR后的细胞进行了传代、分选、染色等一系列鉴定试验，说明得到稳定的新的人肺腺癌细胞系，命名为HLA19EKO。还通过划痕实验和CCK8细胞生长实验等证实了HLA19EKO具备较好的迁移和增殖能力。同样的，裸鼠成瘤实验的成瘤率达到了100%。
实施例1人肺腺癌HLA19细胞系的建立
1、原代培养
（1）为防止肿瘤组织污染及坏死，在患者肿瘤组织离体后立即将组织浸泡于无菌生理盐水中，并置于冰面保存，将组织置于10cm2培养皿中，用含有4%双抗（链霉素1000μg/mL、青霉素1000 U/mL）的DMEM-F12培养基（美国Gibco公司）清洗3遍，并去除多余脂肪及坏死组织；
（2）灭菌的手术剪及镊子将肿瘤组织剪切成体积在2mm3的组织块，再用10mL含有4%双抗的DMEM-F12培养基再次清洗一遍，去除组织内部的坏死物；
（3）将组织块尽量剪细（不能用撵磨钵，以免破坏细胞结构）；
（4）含4%双抗的培养基重悬步骤（3）中的处理好的组织，组织悬液在1200rmp室温条件下离心3min，倾倒出离心后的上清，用7mL含10%胎牛血清的培养基重悬肿瘤组织，同时用70μm的细胞筛将重悬后的组织悬液过滤，细胞悬液放于25cm2方瓶中，放置于37℃孵箱中培养；
（5）待细胞贴壁后用培养基轻柔将未贴壁的细胞碎片洗脱，根据细胞密度加入适量培养基，剩余贴壁细胞继续以上述培养条件培养。
获得的结果如图1a所示，镜下可见贴壁生长的细胞，细胞形态多样，其中可见梭形的成纤维细胞。
2、细胞传代
当贴壁细胞长至瓶内面积80%时可以进行细胞传代，方法如下：
（1）吸出瓶内的培养基，1mL胰酶清洗中和瓶内的残留培养基，再重新加入2mL胰酶，务必使胰酶能够覆盖接触到瓶内所有的贴壁细胞，37℃孵箱中培养；
（2）细胞在胰酶的作用下发生皱缩，轻摇瓶体即可脱落的状态为最佳消化状态；
（3）加入3mL含有10%胎牛血清的DMEM-F12培养基中和胰酶，终止消化；
（4）细胞悬液1200rmp室温条件下离心3min，弃掉上清；
（5）用新培养基重悬离心后的细胞，重新接种于新的培养瓶，约3天后即可重复上述步骤进一步传代。
目前已传至75代。
3、肿瘤细胞纯化
（1）胰酶消化细胞，方法同细胞传代；
（2）细胞计数：Count Star计数仪设置细胞悬液浓度，细胞大小，吸取50个细胞所需体积，将50个细胞以10mL完全培养基重悬后加入到96孔板中，每孔加入100μL的细胞悬液，每孔内只含有1个细胞；
（3）孔板放于37℃孵箱中，24小时后镜下观察细胞贴壁数量及细胞形态，选取只含有一个细胞的孔继续培养，直至细胞克隆团形成；
（4）胰酶消化细胞克隆团，依次转移至24孔板，12孔板、6孔板，进一步得到更多的细胞单克隆，最终得到镜下形态一致的肿瘤细胞。
获得的结果如图1b所示，经单克隆挑选后细胞均表现为多角的上皮细胞形态学特征。
4、细胞爬片免疫组化检测
（1）计数收集细胞；
（2）每孔 2×105 个细胞滴入 6 孔板中，尽量使细胞滴于细胞爬片上，使细胞粘附；
（3）将配制好的培养基沿 6 孔板壁加入；
（4）将加好细胞的 6 孔板放于 37℃ 孵箱中培养 24 小时；
（5）将孔板中的培养基吸出，PBS 清洗爬片；
（6）加入 3mL的 4%多聚甲醛充分固定细胞。
（7）PBS 浸泡冲洗细胞爬片；
（8）细胞破膜液浸泡处理细胞 5min，2次（膜抗原省略此步骤）；
（9）吸出破膜液后 PBS 清洗 5min，2次；
（10）滴加过氧化氢于细胞爬片上，室温孵育 10min 后 PBS 清洗 3 次，每次5min；
（11）滴加血清封闭细胞爬片；
（12）PBS 清洗血清 3 次，每次 5min；
（13）根据说明书将一抗稀释成相应的浓度，滴加于细胞爬片上，4℃ 冰箱静置过夜；
（14）前一天的爬片室温静置半小时，PBS 清洗一抗 3 次，每次 5min；
（15）滴加相应种属的二抗，室温孵育 20min，PBS 清洗去除二抗，清洗 3次，每次5min；
（16）DAB 显色：避光条件下滴加显色液于细胞爬片上，避光室温孵育10min；
（17）苏木素复染：细胞爬片上滴加苏木素染色液室温孵育 30s 后流水冲洗返蓝，滴加中性树脂封片后镜下观察。
将肿瘤组织剪碎至2～3mm3的组织块并将其培养于细胞培养瓶中，数天后可见部分细胞贴壁；利用有限稀释法获得肿瘤细胞单细胞克隆；通过挑选肿瘤细胞单克隆，将肿瘤细胞从成分复杂的细胞群中挑出，并在96孔板中继续扩增培养。
细胞爬片免疫组化染色结果（图1c）显示所有细胞上皮标记CK7阳性表达，证明所有细胞均为腺上皮来源。将此肺腺癌原代细胞命名为HLA19。
后续对该细胞系进行一系列的检测实验，具体如下：
5、肺腺癌原代细胞系HLA19全外显子测序（由Novogene公司进行）
建库测序流程：1、DNA样本检测；2、随机打断小片段DNA（180～280bp）；3、末端修复，磷酸化、加A尾；4、连接接头；5、探针杂交，捕获外显子区域；6、去除未结合的DNA片段；7、文库质量检测；8、Hiseq上机测序。
DNA样品检测：琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否存在杂带、RNA及蛋白污染；Qubit 2.0对DNA浓度进行精确定量。其中DNA浓度≥20 ng/µL，总量0.6 µg以上的DNA样品被用来建库。
文库构建：将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成长度为180~280 bp的片段，建库和捕获实验采用Agilent SureSelect Human All Exon V5/V6试剂盒，末端修复、磷酸化以及加A尾后，片段两端分别连接上接头制备DNA文库。带有特异index的文库与多达543,872个生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将20,965个基因的334,378个外显子捕获下来，经PCR线性扩增后进行文库质检，合格即可进行测序。
库检：文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，随后使用Agilent 2100对文库的Insert size进行检测，Insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度（3 nmol/L）进行准确定量，以保证文库质量。
上机测序：库检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行IlluminaHiSeq PE150测序。PE150（Pair End 150 bp）指高通量双端测序，每端各测150 bp。在构建的小片段文库中，Insert DNA，即插入片段是高通量测序直接测序的单位。双端测序是将每条插入片段的两端进行测序的方法，由于插入片段的长度分布已知，双端测序时不仅可以知道片段两端的序列，也能知道这两段序列之间的长度，从而便于后续比对分析。
基本信息分析A版结果：基本分析A版部分主要用于获取癌症样本基因组的突变信息。首先，对测序原始数据（Raw data）进行质控，得到高质量的Clean data；然后，将Cleandata与人参考基因组序列进行比对分析，获得Bam文件；最后基于Bam进行GermLine和Somatic Mutation的检出与注释，从而得到癌症机制研究的基本突变信息结果，基本分析A版报告主要展示Somatic相关结果。
全外显子测序共获得78,986,228个reads，如图2所示平均覆盖深度为200×。如图9所示EGFR基因拷贝数增加。单个核酸多态性（Single-nucleotide polymorphisms，SNP）检测结果图10a所示，RB1第89位甘氨酸突变为终止子导致RB1表达缺失；如图10b所示，TP53的第248位氨基酸由精氨酸突变为亮氨酸，上述结果与患者临床测序检测结果一致。
6、肺腺癌原代细胞系HLA19的STR检测
取适量细胞进行STR检测（由成都擎科生物有限公司检测）。结果如图3所示，HLA19细胞基因座中未发现多等位基因，与其它细胞无交叉污染；HLA19与收录于CLASTR、ATCC、DSMZ、JCRB和RIKEN数据库的细胞系进行STR数据比对后，未发现100%匹配的细胞；STR分析结果表明HLA19细胞为原代培养的人肺腺癌细胞。
实施例2 HLA19EKO细胞系的获得
1、肺腺癌原代细胞系HLA19的CRISPR基因编辑
NDBI官网查找EGFR基因Gene ID，利用sgRNA在线设计网站（http://www.genscript.com）设计靶向EGFR基因的三对sgRNA序列，基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列信息如表1所示。
表1 SgRNA序列
SgRNA 序列（5，-3，） 序列号
SgRNA1 GAATTCGCTCCACTGTGTTG SEQ ID No.1
SgRNA2 GGTGATCCAAGCTGTCCCAA SEQ ID No.2
SgRNA3 GACAGCTTGGATCACACTTT SEQ ID No.3
。
电转法敲除EGFR基因：无核酸酶TE buffer将EasyEdit sgRNA溶解至100 pmol/µL，保存至-20℃。准备buffer A：2.5mL DMEM-F12完全培养基，82μL P5 Primary Cell 4D-Nucleofector Solution和18 μL Supplement。将100 pmol Cas9蛋白（约16.67μg）、200pmol EasyEdit sgRNA、50 µL buffer A加入2mL的EP离心管中，混匀后在室温下孵育10min。细胞计数吸取7×105HLA19个细胞，PBS清洗细胞一次，离心收集细胞；50μL bufferA重悬的细胞。将Cas9蛋白溶液和细胞溶液轻柔的混合，并在室温下孵育10min。采用Lonza 4DX-Unit电转仪程序CC-2527进行电转，吸取500µL预热好的完全培养基加入电转杯中清洗，随即全部转移至6孔板中，置于37℃孵箱中培养。
结果如图4a不同 sgRNA 的敲除效率，经sgRNA1敲除EGFR后细胞的EGFR阳性率（EGFR+）为34.32%，经sgRNA2敲除EGFR后细胞的EGFR阳性率（EGFR+）为24.68%，经sgRNA3敲除EGFR后细胞的EGFR阳性率（EGFR+）为63.01%，因此sgRNA2 敲除后的 EGFR 蛋白表达阴性的细胞含量最高，其敲除效率最高。
2、流式细胞术分选EGFR敲除的肺腺癌细胞
胰酶消化收集1×107个细胞于无菌的离心管中；10mL含4%双抗的PBS清洗细胞，室温1200rmp离心，3min，3次；去除离心后的上清，细胞沉渣以1mL PBS重悬细胞，加入10μL的zombie NIR细胞活死染料，室温孵育15min。10mL含4%双抗的PBS离心清洗细胞，离心条件同上；去除离心后的上清，每管细胞以10mL含4%双抗及10%血清的PBS重悬细胞，加入10μL的PE-anti human EGFR为检测抗体，室温孵育30min。另一管加入PE Mouse IgG1κIsotypeControl为同型抗体；10mL含4%双抗的PBS清洗细胞，离心条件同上，洗脱背景中多余的抗体。5mL的4%双抗及10%胎牛血清的PBS重悬细胞，70μL的细胞筛过滤细胞悬液。流式细胞术分选细胞前以含4%双抗的PBS冲洗机器通道，避免细胞污染。流式细胞术分选出EGFR表达阴性的细胞。含4%双抗及10%血清的DMEM-F12培养基重悬分选出来的细胞，放入25cm2方瓶中培养。以上的步骤需重复多次，最终将细胞纯化为100%EGFR表达阴性的细胞。
如图4b所示，在敲除 EGFR 之前 HLA19细胞 EGFR高表达（EGFR阳性率为98.81%），采用流式细胞分选术分选出EGFR表达阴性（EGFR阳性率极低）的CRISPR-cas9敲除细胞，并将其命名为HLA19EKO。目前，HLA19EKO细胞已经稳定传代至60代，镜下形态如图4c所示，EGFR敲除前后细胞形态无明显改变，均为多角型贴壁式生长细胞。
3、蛋白印迹检测（Western Blot）细胞EGFR蛋白表达
PBS贴壁冲洗细胞；加入RIPA裂解液，细胞充分裂解3～5min。用细胞刮刀将细胞刮下；细胞放置于EP管中继续冰上裂解30min。EP管放置于离心机中离心（12000rpm、4℃、10min），离心后的上清收集到新的离心管中，即为提取的总蛋白溶液；收集的蛋白溶液保存于-80℃冰箱备用。
蛋白浓度测定试剂盒测试未变性的蛋白溶液浓度。将蛋白溶液与5×还原型蛋白上样缓冲液按照4︰1的比例配比后，水浴煮沸变性15min，自然冷却后放置于-20℃冰箱保存备用。清洗制胶玻璃板，自然晾干，两端对齐并支架固定。制分离胶；梳子插入初量灌胶的深度，大约与玻璃板上沿距离5～8mm；加入少许纯水压平胶面，待胶凝结后将纯水倒出。注入配好的浓缩胶；将梳子插入胶中，插入时避免气泡产生；待胶凝固后拔出梳子，准备电泳。安装电泳槽，并在槽中加入足够体积的电泳缓冲液。将之前预存在-20℃的变性的蛋白样品取出，取20mL加在泳道中，预染marker取2.5μL加入上样孔，接通电源，浓缩胶电压设置为80V，30min；分离胶电压设置为120V，90min，根据蛋白质的分子大小调整分离胶的时间。当溴酚蓝条带跑至最底部时结束电泳。
加入15μL的改良型促凝剂混匀；注入制胶玻璃板中，插入梳齿。PVDF膜在转膜之前需要用甲醇浸泡活化，时间约1min，可将一个直角减去以便标记。在面板上将从一侧到另一侧的顺序为海绵—滤纸—胶—PVDF膜（活化后的）—滤纸—海绵，操作过程中要避免气泡的产生，将转膜夹放入转膜电泳槽中，加满转膜缓冲液，开始冰槽内电泳。取出PVDF膜，放入TBST中清洗，再用5%脱脂奶摇床上室温封闭1小时。按照抗体说明书推荐浓度稀释一抗，加好抗体的膜放于孵育盒中4℃孵育过夜。第二天取出孵育盒，复温后用提前预热的TBST漂洗3次，10min/次。依据一抗种属选择合适二抗，鼠抗︰TBST按1︰5000稀释，兔抗︰TBST按1︰2000稀释，室温摇床孵育1小时，TBST漂洗3次，15min/次。暗室中将化学发光检测试剂盒中的A和B等体积混合，将PVDF膜蛋白面朝上放于暗箱，用移液枪将发光液均匀地涂在膜上，关闭暗箱箱门进行曝光，缓冲液配制见表2。如图4d所示，HLA19EKO细胞的EGFR表达阴性。
表2 缓冲液配制
缓冲液 体系各用量
1×电泳缓冲液（1L） 甘氨酸18.77g、tris base 3g、SDS 1g
1×转膜缓冲液（1L） 甘氨酸 14.4g tris、base 3g、甲醇200mL
TBS/T（1L） tris-HCL2.42g、NaCL8g、Tween-200.5mL
。
4、划痕实验
（1）分别将 EGFR 敲除前后的HLA19EKO细胞加入 96 孔板，每孔 1×104 个细胞；
（2）细胞长至孔板底部面积的 90%时进行划痕处理；
（3）处理后的孔板放入 IncuCyte 分析仪实时记录分析细胞迁移状态；
（4）收集 12-48h 细胞迁移图片，ImageJ 软件数据处理分析实验操作与实施例1同，所用细胞为敲除EGFR前后的HLA19和HLA19EKO细胞。监测细胞48小时，以确定其迁移到划痕区域的时间。使用划痕闭合的百分比来计算迁移率。
如图5a所示，12、24、48 h后，上一排为EGFR敲除前HLA19细胞，下一排为HLA19EKO细胞。迁移能力统计比较见图5b，敲除EGFR后的HLA19EKO细胞的迁移率明显低于HLA19细胞。
5、CCK8细胞生长实验
（1）分别将 EGFR 敲除后的HLA19EKO细胞加入 96 孔板，每孔加入 1.2×104个细胞；
（2）按照 CCK8 试剂盒步骤向孔内添加 CCK8 试剂；
（3）孵箱孵育 3 小时后酶标仪检测 450nm 处各孔吸光值；
（4）统计软件分析细胞生长数据。
结果如图6所示，EGFR敲除后的HLA19EKO细胞的增殖能力相对EGFR敲除前的HLA19细胞减弱。
6、细胞爬片免疫组化及免疫荧光检测
免疫组化染色：
（1）计数收集 HLA19EKO细胞；
（2）每孔 2×105 个细胞滴入 6 孔板中，尽量使细胞滴于细胞爬片上，使细胞粘附；
（3）将配制好的培养基沿 6 孔板壁加入；
（4）将加好细胞的 6 孔板放于 37℃ 孵箱中培养 24 小时；
（5）将孔板中的培养基吸出，PBS 清洗爬片；
（6）加入 3mL 的 4%多聚甲醛充分固定细胞。
（7）PBS 浸泡冲洗细胞爬片；
（8）细胞破膜液浸泡处理细胞 5min，2 次（膜抗原省略此步骤）;
（9）吸出破膜液后 PBS 清洗 5min，2 次;
（10）滴加过氧化氢于细胞爬片上，室温孵育 10min 后 PBS 清洗 3 次，每次5min；
（11）滴加血清封闭细胞爬片；
（12）PBS 清洗血清 3 次，每次 5min；
（13）根据说明书将一抗稀释成相应的浓度，滴加于细胞爬片上，4℃冰箱静置过夜；
（14）前一天的爬片室温静置半小时，PBS 清洗一抗 3 次，每次 5min；
（15）滴加相应种属的二抗，室温孵育 20min，PBS 清洗去除二抗，清洗3次，每次5min;
（16）DAB 显色：避光条件下滴加显色液于细胞爬片上，避光室温孵育10min；
（17）苏木素复染：细胞爬片上滴加苏木素染色液室温孵育 30s 后流水冲洗返蓝，滴加中性树脂封片后镜下观察。
免疫荧光染色：
（1）HLA19EKO细胞爬片准备方法同上；
（2）PBS 清洗细胞爬片；
（3）在爬片上滴加 Triton X-100，室温孵育 20min，（细胞浆和细胞核表达的标记用此步骤，细胞膜表达标记忽略此步骤）；
（4）PBS 清洗爬片，去除掉 Triton X-100，滴加血清室温封闭 30min；
（5）根据说明书将一抗稀释成相应浓度，滴加到细胞爬片上，放置于湿盒内 4℃冰箱过夜；
（6）第二天将爬片取出后室温复温 1h，PBS 清洗一抗 3 次，每次 5min，滴加荧光二抗，室温孵育 1h；
（7）PBS 清洗荧光二抗，清洗 3 次，每次 5min，滴加稀释后的 DAPI 染色
剂复染核，避光孵育 5min；
（8）PBS 清洗染色剂，清洗 3 次，每次 5min，爬片滴加抗荧光淬灭的荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察荧光染色情况。
结果如图7，HLA19的EGFR蛋白表达阳性而HLA19EKO的EGFR蛋白表达阴性。
7、细胞系裸鼠成瘤实验
（1）计数 HLA19EKO细胞；
（2）按照每只裸鼠接种 2×106个细胞将 HLA19EKO进行收集；
（3）吸取的细胞悬液于离心管中用不含血清的培养基以 1200rmp，室温条件离心清洗3分钟；
（4）离心后的细胞弃上清，每 2×106个细胞用 100μL 不含血清及双抗的培养基重悬，收集于 EP 管中，并置于冰上待用；
（5）裸鼠下肢皮下注射 100μL 细胞悬液；
（6）十天后观察成瘤情况及肿瘤大小；
（7）成瘤后的裸鼠经解剖取出肿瘤组织，经过固定、脱水、石蜡包埋并 H＆E 染色。
结果如图8a所示，两周后裸鼠下肢皮下均可见肿瘤长出，成瘤率100%。如图8b所示，光镜下肿瘤组织形态为低分化NSCLC。

Claims (14)

1.一种突变型肺腺癌细胞系的构建方法，其特征在于：包括如下主要步骤：将稳定传代的人肺腺癌HLA19细胞系进行目标基因的突变；所述突变的方法包括对目标基因进行基因编辑、敲除或使其表达缺失。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于：所述目标基因为肺癌形成或发展相关基因。
3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于：所述肺癌形成或发展相关基因为EGFR基因。
4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于：所述基因编辑为采用CRISPR方式实现。
5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于：所述CRISPR方式中，sgRNA为SEQ IDNo.1~3中至少一条核苷酸所示。
6.一种突变型肺腺癌细胞系，其特征在于：由权利要求1～5任一项所述构建方法构建得到。
7.根据权利要求6所述细胞系，其特征在于：所述细胞系为HLA19EKO细胞系，其保藏号为CCTCC NO:C2023212。
8.权利要求6或7所述细胞系作为实验材料在研究癌症中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于：所述癌症为肺腺癌。
10.权利要求6或7所述细胞系作为实验材料在研究NSCLC转化为SCLC中的应用。
11.权利要求6或7所述细胞系作为实验材料在研究肺癌治疗过程中产生EGFR-TKI耐药性原因中的应用。
12.权利要求6或7所述细胞系在制备肺癌动物模型中的应用。
13.根据权利要求12所述应用，其特征在于：所述肺癌为肺腺癌。
14.权利要求6或7所述细胞系在筛选治疗肺癌的药物中的应用。
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