CN115896227A - 一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其方法包括如下步骤：首先从泌乳期和干奶期山羊乳腺组织中分离培养了乳腺上皮细胞，通过免疫染色检测乳腺上皮细胞中角蛋白8的表达，以确定细胞纯度，随后对乳腺上皮细胞进行ATAC‑seq和RNA‑seq；本发明通过筛选出可用于制备乳腺生物反应器的基因整合位点FAM13A，并在细胞水平上验证了该位点的有效性和安全性，将有助于在奶山羊乳腺生物反应器中生产重组蛋白。该增强转基因表达的方法，结合ATAC‑seq和RNA‑seq来筛选奶山羊泌乳期乳腺上皮细胞染色质特异性开放的区域，并利用CRISPR/Cas9将人溶菌酶基因整合到4个不同的开放区域，通过比较在不同打靶位点插入基因的表达水平，筛选出有利于转基因表达的整合位点FAM13A。
Description
技术领域
本发明涉及基因表达及整合技术领域，具体为一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法。
背景技术
乳腺生物反应器是生产具有生物活性的重组蛋白的理想反应器，具有广阔的应用前景，其关键在于转基因的高水平表达和稳定整合。
位点特异性基因整合可以减少实验结果的异质性，解决位置效应引起的不稳定性，规范乳腺生物反应器的生产。然而，基因安全港的缺乏，尤其是构建乳腺生物反应器的靶位点的缺乏，阻碍了该技术的应用。为了解决这一问题，我们筛选出了可用于制备乳腺生物反应器的基因整合位点，来帮助在奶山羊乳腺生物反应器中生产重组蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，以解决上述背景技术提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其方法包括如下步骤：
(1)首先从泌乳期和干奶期山羊乳腺组织中分离培养了乳腺上皮细胞；
(2)通过免疫染色检测乳腺上皮细胞中角蛋白8的表达，以确定细胞纯度；
(3)对乳腺上皮细胞进行ATAC-seq和RNA-seq；
(4)对ATAC-seq和RNA-seq数据进行了Venn分析，以筛选泌乳期蛋白表达量高和染色质可及性高的基因；
(5)在排除被敲除后对宿主有害的基因后，得到两个候选靶位点UACA(ATAC-seqmaximumsignalvalue:72.90)和ANTXR1(ATAC-seqmaximumsinglevalue:174.91)；
(6)在染色质开放性高于ANTXR1的基因位点中按照上述步骤进行筛选，得到16个候选打靶区域，并在比较了奶山羊与小鼠中这些基因的核苷酸序列以及氨基酸序列的同源性后，最终选择8个打靶位点；
(7)针对步骤(6)中不同的候选靶位点共构建8个供体载体和相应的Cas9一元表达载体，并将ROSA26位点作为对照，并根据不同的靶位点替换相应的同源臂和sgRNA序列；
(8)在293T细胞中进行SSA检测，构建针对这些位点的最优Cas9-sgRNA打靶载体；
(9)通过电穿孔将供体载体和打靶载体转入奶山羊乳腺上皮细胞内，将BLG-hLYZ分别插入基因组中的不同靶位点，经嘌呤霉素筛选后，通过5'JunctionPCR和3'JunctionPCR鉴定得到阳性细胞克隆，扩大培养后，加入诱导培养基诱导乳腺上皮细胞表达重组人溶菌酶；
(10)采用BCA法检测总蛋白浓度，并调整上样量使总蛋白量一致，然后进行westernblot检测，得到实验结果。
优选的，所述步骤(1)中，分离培养乳腺上皮细胞的方法为组织块贴壁法。
优选的，所述步骤(1)中，所分离培养的乳腺上皮细胞为3对。
优选的，所述步骤(4)中，所筛选的蛋白表达量和染色质可及性均要高于平均水平。
优选的，所述步骤(6)中，在由16个候选打靶区域到8个打靶位点的过程中，需要比较奶山羊与小鼠中这些基因的核苷酸序列以及氨基酸序列的同源性。
优选的，所述步骤(7)中，8个载体的基本结构为pBLG-hLYZ-EGFP-PuroR-pEF1α。
优选的，所述步骤(9)中，当细胞在60mm培养皿中生长至70％～80％时，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养72h后再收集细胞。
优选的，所述步骤(9)中，将克隆来源相同的阳性细胞进行传代培养，形成同源的两皿细胞，分别收集样品提取RNA和蛋白质。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明通过筛选出可用于制备乳腺生物反应器的基因整合位点FAM13A，并在细胞水平上验证了该位点的有效性和安全性，将有助于在奶山羊乳腺生物反应器中生产重组蛋白。该增强转基因表达的方法，结合ATAC-seq和RNA-seq来筛选奶山羊泌乳期乳腺上皮细胞染色质特异性开放的区域，并利用CRISPR/Cas9将人溶菌酶基因整合到4个不同的开放区域，通过比较在不同打靶位点插入基因的表达水平，筛选出有利于转基因表达的整合位点FAM13A。
附图说明
图1为本发明基因表达示意图；
图2为本发明统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其方法包括如下步骤：
(1)首先从泌乳期和干奶期山羊乳腺组织中分离培养了乳腺上皮细胞；
(2)通过免疫染色检测乳腺上皮细胞中角蛋白8的表达，以确定细胞纯度；
(3)对乳腺上皮细胞进行ATAC-seq和RNA-seq；
(4)对ATAC-seq和RNA-seq数据进行了Venn分析，以筛选泌乳期蛋白表达量高和染色质可及性高的基因；
(5)在排除被敲除后对宿主有害的基因后，得到两个候选靶位点UACA(ATAC-seqmaximumsignalvalue:72.90)和ANTXR1(ATAC-seqmaximumsinglevalue:174.91)；
(6)在染色质开放性高于ANTXR1的基因位点中按照上述步骤进行筛选，得到16个候选打靶区域，并在比较了奶山羊与小鼠中这些基因的核苷酸序列以及氨基酸序列的同源性后，最终选择8个打靶位点；
(7)针对步骤(6)中不同的候选靶位点共构建8个供体载体，并将ROSA26位点作为对照，并根据不同的靶位点替换相应的同源臂和sgRNA序列；
(8)在293T细胞中进行SSA检测，构建针对这些位点的最优Cas9-sgRNA打靶载体；
(9)通过电穿孔将供体载体和打靶载体转入奶山羊乳腺上皮细胞内，将BLG-hLYZ分别插入基因组中的不同靶位点，经嘌呤霉素筛选后，通过5'JunctionPCR和3'JunctionPCR鉴定得到阳性细胞克隆，扩大培养后，加入诱导培养基诱导乳腺上皮细胞表达重组人溶菌酶；
(10)采用BCA法检测总蛋白浓度，并调整上样量使总蛋白量一致，然后进行westernblot检测，得到实验结果。
实施例二：一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其方法包括如下步骤：
(1)首先从泌乳期和干期山羊乳腺组织中分离培养了乳腺上皮细胞，分离培养乳腺上皮细胞的方法为组织块贴壁法，所分离培养的乳腺上皮细胞为3对；
(2)通过免疫染色检测乳腺上皮细胞中角蛋白8的表达，以确定细胞纯度；
(3)对乳腺上皮细胞进行ATAC-seq和RNA-seq；
(4)对ATAC-seq和RNA-seq数据进行了Venn分析，以筛选泌乳期蛋白表达量高和染色质可及性高的基因，所筛选的蛋白表达量和染色质可及性均要高于平均水平；
(5)在排除被敲除后对宿主有害的基因后，得到两个候选靶位点UACA(ATAC-seqmaximumsignalvalue:72.90)和ANTXR1(ATAC-seqmaximumsinglevalue:174.91)；
(6)在染色质开放性高于ANTXR1的基因位点中按照上述步骤进行筛选，得到16个候选打靶区域，比较奶山羊与小鼠中这些基因的核苷酸序列以及氨基酸序列的同源性，并最终选择8个打靶位点；
(7)针对步骤(6)中不同的候选靶位点共构建8个供体载体，并将ROSA26位点作为对照，并根据不同的靶位点替换相应的同源臂和sgRNA序列，8个载体的基本结构为pBLG-hLYZ-EGFP-PuroR-pEF1α；
(8)在293T细胞中进行SSA检测，构建针对这些位点的最优Cas9-sgRNA打靶载体；
(9)通过电穿孔将供体载体和打靶载体转入奶山羊乳腺上皮细胞内，将BLG-hLYZ分别插入基因组中的不同靶位点，经嘌呤霉素筛选后，通过5'JunctionPCR和3'JunctionPCR鉴定得到阳性细胞克隆，扩大培养后，加入诱导培养基诱导乳腺上皮细胞表达重组人溶菌酶；
(10)采用BCA法检测总蛋白浓度，并调整上样量使总蛋白量一致，然后进行westernblot检测，得到实验结果。
实施例三：一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其方法包括如下步骤：
(1)首先采用组织块贴壁法从泌乳期和干期山羊乳腺组织中分离培养了乳腺上皮细胞，所分离培养的乳腺上皮细胞为3对；
在高通量测序前，再进行下述步骤，(2)通过免疫染色检测乳腺上皮细胞中角蛋白8的表达，以确定细胞纯度，抗体角蛋白8染色显示强阳性信号，表明原代乳腺上皮细胞纯度很高；
(3)对乳腺上皮细胞进行ATAC-seq和RNA-seq，请参阅图1C显示，从干奶期到泌乳期，山羊乳腺的基因表达发生了显著的变化，请参阅图1D显示，同时染色质可及性在基因间区域和内含子也经历了广泛的变化，这与之前的研究结果一致。假设外源基因整合到这些区域也会受到这种变化的调控，那么将外源基因插入泌乳期特异性开放的位点，也许可以促进外源基因在泌乳期的表达，因此我们筛选了在泌乳过程中特异性开放的区域作为打靶位点。基因间区域虽然被认为进化上较为温和，作为外源基因的整合位点较为安全，但由于基因间区域的未知性，转基因整合到这些位点经常被调控性沉默。
目前已经鉴定过的安全港有ROSA26、CCR530等基因区域。此外，实验表明，转基因在高转录活性和开放区域的表达更高。因此，本方法筛选开放且活跃表达的基因区域而不是基因间区域作为靶位点；
(4)对ATAC-seq和RNA-seq数据进行了Venn分析，以筛选泌乳期蛋白表达量高和染色质可及性高的基因，所筛选的蛋白表达量和染色质可及性均要高于平均水平；
(5)在排除被敲除后对宿主有害的基因后，得到两个候选靶位点UACA(ATAC-seqmaximumsignalvalue：72.90)和ANTXR1(ATAC-seqmaximum signalvalue:174.91)；
因为候选基因很少，需要扩大筛选范围，(6)在染色质开放性高于ANTXR1的基因中按照上述步骤进行筛选，得到16个候选打靶区域，并最终选择8个打靶位点，在由16个候选打靶区域到8个打靶位点的过程中，需要比较奶山羊与小鼠中这些基因的核苷酸序列以及氨基酸序列的同源性；
(7)针对步骤(6)中不同的候选靶位点共构建8个供体载体，8个载体的基本结构为pBLG-hLYZ-EGFP-PuroR-pEF1α(图2A)，并将ROSA26位点作为对照，并根据不同的靶位点替换相应的同源臂和sgRNA序列；
请参阅图2B所示，(8)在293T细胞中进行SSA检测，构建针对这些位点的最优Cas9-sgRNA打靶载体，经药物筛选后，只有打靶FAM13A、RNF114、RTN1和UACA四个基因区域才能筛选出阳性细胞，因此将这几个位点作为候选靶位点；
(9)通过电穿孔将供体载体和打靶载体转入奶山羊乳腺上皮细胞内，将BLG-hLYZ分别插入基因组中的不同靶位点，经嘌呤霉素筛选后，通过5'JunctionPCR和3'JunctionPCR鉴定得到阳性细胞克隆，扩大培养后，加入诱导培养基诱导乳腺上皮细胞表达重组人溶菌酶，当细胞在60mm培养皿中生长至70％～80％时，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12诱导培养基(催乳素30ng/ml，1×ITS，氢化可的松1μg/ml，EGF10ng/ml)，培养72h后再收集细胞，为了保证qPCR和Westernblot结果的一致性，将克隆来源相同的阳性细胞进行传代培养，形成同源的两皿细胞，分别收集样品提取RNA和蛋白质；
(10)采用BCA法(Beyotime)检测总蛋白浓度，并调整上样量使总蛋白量一致，然后进行westernblot检测，得到实验结果。
通过定量实验和蛋白凝胶电泳发现，在高开放区整合转基因可以提高重组蛋白的表达(图2C，2D)。从结果可以看出，高开放位点(比如FAM13A)可以提高外源蛋白的表达水平，但是染色质开放性和蛋白表达之间不存在线性相关，较高开放性的靶位点(RTN1)也可能表现出较低的转基因表达水平(图2C，2D)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其特征在于，其方法包括如下步骤：
(1)首先从泌乳期和干奶期山羊乳腺组织中分离培养了乳腺上皮细胞；
(2)通过免疫染色检测乳腺上皮细胞中角蛋白8的表达，以确定细胞纯度；
(3)对乳腺上皮细胞进行ATAC-seq和RNA-seq；
(4)对ATAC-seq和RNA-seq数据进行了Venn分析，以筛选泌乳期蛋白表达量高和染色质可及性高的基因；
(5)在排除被敲除后对宿主有害的基因后，得到两个候选靶位点UACA(ATAC-seqmaximumsignalvalue:72.90)和ANTXR1(ATAC-seqmaximumsinglevalue:174.91)；
(6)在染色质开放性高于ANTXR1的基因位点中按照上述步骤进行筛选，得到16个候选打靶区域，并在比较了奶山羊与小鼠中这些基因的核苷酸序列以及氨基酸序列的同源性后，最终选择8个打靶位点；
(7)针对步骤(6)中不同的候选靶位点共构建8个供体载体和相应的Cas9一元表达载体，并将ROSA26位点作为对照，并根据不同的靶位点替换相应的同源臂和sgRNA序列；
(8)在293T细胞中进行SSA检测，构建针对这些位点的最优Cas9-sgRNA打靶载体；
(9)通过电穿孔将供体载体和打靶载体转入奶山羊乳腺上皮细胞内，将BLG-hLYZ分别插入基因组中的不同靶位点，经嘌呤霉素筛选后，通过5'JunctionPCR和3'JunctionPCR鉴定得到阳性细胞克隆，扩大培养后，加入诱导培养基诱导乳腺上皮细胞表达重组人溶菌酶；
(10)采用BCA法检测总蛋白浓度，并调整上样量使总蛋白量一致，然后进行westernblot检测，得到实验结果。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，分离培养乳腺上皮细胞的方法为组织块贴壁法。
3.根据权利要求1所述的一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所分离培养的乳腺上皮细胞为3对。
4.根据权利要求1所述的一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所筛选的蛋白表达量和染色质可及性均要高于平均水平。
5.根据权利要求1所述的一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，在由16个候选打靶区域到8个打靶位点的过程中，需要比较奶山羊与小鼠中这些基因的核苷酸序列以及氨基酸序列的同源性。
6.根据权利要求1所述的一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其特征在于：所述步骤(7)中，8个载体的基本结构为pBLG-hLYZ-EGFP-PuroR-pEF1α。
7.根据权利要求1所述的一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其特征在于：所述步骤(9)中，当细胞在60mm培养皿中生长至70％～80％时，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12诱导培养基，培养72h后再收集细胞。
8.根据权利要求1所述的一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其特征在于：所述步骤(9)中，将克隆来源相同的阳性细胞进行传代培养，形成同源的两皿细胞，分别收集样品提取RNA和蛋白质。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN117587013A (zh) * | 2023-11-27 | 2024-02-23 | 湖南师范大学 | 一种血管发育异常的斑马鱼模型的构建方法 |
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| CN117587013A (zh) * | 2023-11-27 | 2024-02-23 | 湖南师范大学 | 一种血管发育异常的斑马鱼模型的构建方法 |
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