PT110722B - Uso de anticorpos para o antigénio thomsen-friedenreich num método e estojo para avaliação de instabilidade de microsatelites - Google Patents
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Abstract
A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A USO DE ANTICORPOS CONTRA O ANTIGÉNIO THOMSEN-FRIEDENREICH (TF) COMO REAGENTES PARA O DIAGNÓSTICO IN VITRO DE INSTABILIDADE DE MICROSSATÉLITES (MSI). A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE TAMBÉM A COMPOSIÇÕES PARA O DIAGNÓSTICO IN VITRO DE MSI COMPREENDENDO ANTICORPOS ANTIANTIGÉNIO TF. A PRESENTE INVENÇÃO DIVULGA AINDA UM MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO IN VITRO DE MSI QUE COMPREENDE CONTACTAR AS REFERIDAS COMPOSIÇÕES CONTENDO ANTICORPOS PARA O ANTIGÉNIO TF COM NUMA AMOSTRA DE TECIDO E AVALIAR A EXPRESSÃO DO ANTIGÉNIO TF NAS CÉLULAS TUMORAIS. A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE TAMBÉM A UM ESTOJO COMPREENDENDO AS COMPOSIÇÕES ACIMA MENCIONADAS PARA A DETECÇÃO DE MSI PELA REALIZAÇÃO DO MÉTODO DIVULGADO NA PRESENTE INVENÇÃO. O USO, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E ESTOJO DA PRESENTE INVENÇÃO PODEM SER VANTAJOSAMENTE APLICADOS AO CANCRO, INCLUINDO COMO EXEMPLOS NÃO LIMITANTES OS CARCINOMAS GÁSTRICOS E COLORRECTAL, PARA FACILITAR SIGNIFICATIVAMENTE O DIAGNÓSTICO IN VITRO DE MSI NO CONTEXTO CLÍNICO, ATRAVÉS DE UM ENSAIO BASEADO NUM ÚNICO MARCADOR, SIMPLES, RÁPIDO, SENSÍVEL E ESPECÍFICO PARA DIAGNÓSTICO, PROGNÓSTICO OU PREVISÃO DE RESPOSTA AO TRATAMENTO COM IMUNOTERAPIA.
Description
USO DE ANTICORPOS PARA O ANTIGÉNIO THOMSEN-FRIEDENREICH NUM MÉTODO E ESTOJO PARA AVALIAÇÃO DE INSTABILIDADE DE
MICROSATELITES
Campo técnico da invenção
A presente invenção refere-se ao uso de anticorpos ou outros agentes com afinidade para o antigénio Thomsen-Friedenreich (TF) numa composição para o diagnóstico in vitro de Instabilidade de Microssatélites (MSI) através de um método que compreende incubar a referida composição empregando os anticorpos anti-antigénio TF com uma amostra biológica e avaliar a expressão do antigénio TF por coloração imunohistoquimica ou por ensaios imunoenzimáticos. A presente invenção também se refere a um estojo que compreende as composições supramencionadas para realizar o método da presente invenção.
uso, composições, métodos e estojo da presente invenção podem ser vantajosamente aplicados ao cancro, incluindo como exemplos não limitantes os carcinomas gástricos e colorrectal, para facilitar significativamente o diagnóstico in vitro de MSI no contexto clínico, através de um ensaio baseado num único marcador, simples, rápido, sensível e específico para diagnóstico, prognóstico ou previsão de resposta ao tratamento com imunoterapia.
Assim, a presente invenção enquadra-se no campo técnico da medicina, farmacêutica e bioquímica.
Estado da arte cancro gástrico é uma doença heterogénea que requer tratamento multidisciplinar [1] . Atualmente têm sido propostas pelo TCGA (The Câncer Genome Atlas) e ACRG (Asian Câncer Research Group) novas classificações moleculares para o cancro gástrico nas quais a instabilidade de microssatélites (Microsatellite Instability - MSI) é descrita como um subgrupo distinto[I, 2],
A MSI é, portanto, um subtipo molecular distinto do cancro gástrico e, de acordo com o TCGA, o subgrupo de casos com MSI está ligado à hipermutação, ao fenótipo metilador de ilhas CpG, ao silenciamento MLH1 e às vias mitóticas[1].
Nos últimos anos, as consequências clínicas da MSI e as oportunidades terapêuticas para abordar esse peculiar subtipo de cancro tornaram-se evidentes. Diversas publicações descreveram a MSI do ponto de vista clínico, sendo encontrada em 5,6% a 33,3% de todos os cancros gástricos e fortemente associada a sexo feminino, idade avançada, histótipo intestinal, posição gástrica média/baixa, estádio NO e estádio TNM I/II com sobrevida global favorável [1-5] .
É importante ressaltar que o grupo de casos com MSI não é homogéneo e já foi demonstrado que a MSI é um fator prognóstico devido à associação com localização tumoral e classificação de Lauren [6].
Além disso, verificou-se que a MSI está ligada à expressão da proteína PD-L1 e que vários fármacos específicos são atualmente utilizados para o tratamento clínico do cancro gástrico visando a via de controlo imune PD1/PD-L1 [7], diagnóstico de cancro gástrico com MSI é da maior importância, especialmente antes do tratamento multidisciplinar. Apresenta respostas diferente à quimioterapia neoadjuvante, requer tratamento cirúrgico específico em metástases síncronas, incluindo a possibilidade de linfadenectomia adaptada; e estratifica para a administração de terapias direcionadas [3, 8],
A transformação de células epiteliais é acompanhada por várias alterações na maquinaria de glicosilação de proteínas resultando em aberrações na glicosilação celular, tais como o truncamento de glicanos ligados a 0 e a expressão de epítetos de glicano sialofucosilados [9], 0 truncamento de glicanos ligados em 0 tem sido amplamente descrita em vários carcinomas gastrointestinais e resulta na expressão de novos O-glicanos curtos, tais como os antigénios Thomsen- Friedenreich (TF ou T, Galpl-3GalNAcoíl) , Thomsen-nouvelle (Tn, GalNAc oíI) e sua forma sialilada sialyl Tn (STn, Neu5Aca2-3GalNAcal) [9], Além disso, a expressão de estruturas sialofucosiladas complexas, tais como sialil- Lewis A (SLea, Neu5Aca2-3Galpl-3 [Fuc al-4] GlcNAcp-) e sialil- Lewis X (SLex, Neu5Aca2-3Galpl-4 [Fuc al3] GlcNAcp-) tem sido frequentemente descrito em tumores gástricos com um papel importante na progressão do cancro e na formação de metástases[9].
antigénio TF, também conhecido como estrutura nuclear 1, é uma estrutura intermediária durante a maturação dos O-glicanos do tipo mucina dentro do aparelho de Golgi. Em condições fisiológicas, o antigénio do TF está abaixo do limite de detecção porque é modificado com sacarideos adicionais e tornado inacessível devido ao aumento da quantidade de glicanos [10, 11] . É encontrado apenas nas superfícies luminais do dueto pancreático, túbulo distai do rim e dueto coletor renal [11] . Além disso, macrófagos do timo, baço e nódulos linfáticos apresentam o antigénio TF, sugerindo um potencial papel imunológico [11]. É importante ressaltar que o antigénio TF não é encontrado no epitélio gástrico saudável nem em condições gástricas pré-malignas [12], No cancro gástrico, o antigénio TF é expresso em quantidades consideráveis em cerca de 21% dos tumores, associando-se a maior resposta imune [12].
Como moléculas que são secretadas na circulação e devido à sua especificidade de expressão para células malignas, os glicanos e glico-conjugados aberrantes têm uma longa história como biomarcadores de cancro [13] .
O antigénio TF tem várias características adicionais que podem permitir que seja aplicado como biomarcador serológico, uma vez que praticamente não é expresso em tecidos humanos, nem em condições saudáveis ou sob outras condições patológicas [11, 14]. Em segundo lugar, os níveis basais do TF exposto são muito baixos na corrente sanguínea, devido aos anticorpos IgG e IgG anti-TF que circulam naturalmente e à depuração rápida dos compostos glico-conjugados galactosilados terminalmente circulantes pelo fígado [15], Por fim, como uma O-glicosilação do tipo mucina, pode ser transportada por uma ampla gama de glicoproteínas segregadas que são sobre-expressas no cancro gástrico, tal como MUGI ou CD44.
Geralmente, a MSI ou a deficiência de reparação de erros de emparelhamento (Mismatch Repair deficiency - dMMR) MSI/dMMR também são testados em amostras de cancro colorretal para a identificação de doentes com risco elevado para a síndrome de Lynch, bem como para estratificação prognóstica. No entanto, dados recentes surgiram mostrando que o MSI/dMMR pode ter valor preditivo para terapia com inibidores do checkpoint imunológico, independentemente do tecido de origem dos cancros [16] . De facto, foi aprovado pela FDA (Food and Drug Administration), que o pembrolizumab (um fármaco contra a proteína PD-1) pode ser utilizado em qualquer tumor sólido com MSI/dMMR que tenha progredido após tratamento prévio.
Atualmente, um método de realizar o diagnóstico de MSI é realizado por extracção de ADN tumoral e de ADN constitucional. São avaliadas repetições de mononucleótidos com iniciadores da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) marcados com compostos fluorescentes para amplificação de repetições nos loci BAT-26, NR-21, BAT-25, NR-27 e NR-24 em equipamentos como o ABI PRISM da Applied Biosystems. As repetições são co-amplifiçadas em ADN tumoral e constitucional emparelhado de cada doente numa PCR multiplex de 5 reações usando o protocolo para PCR multiplex divulgado pela Qiagen. Os perfis alélicos das referidas repetições são detectados pelo sequenciador automatizado de DNA ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer da Applied Biosystems e o status do MSI é determinado de acordo com as diretrizes do National Câncer Institute on MSI para detecção de cancro e predisposição familiar: sempre que 2 ou mais marcadores mostrem instabilidade num dos 5 loci, o tumor é considerado MSI alta. Em contraste, quando um ou nenhum locus é instável, é diagnosticada instabilidade de microssatélites baixa ou negativa, respetivamente.
Um teste de deficiência de MMR também pode ser realizado por imuno-histoquimica em secções de tecido incluído em parafina utilizando anticorpos disponíveis comercialmente para avaliar a expressão de quatro proteínas do sistema de MMR (MLH1, PMS2, MSH2 e MSH6) em núcleos de células tumorais.
Assim, a análise actual de MSI / dMMR requer procedimentos que requerem recursos intensivos para avaliar o perfil tumoral de 5 marcadores MSI analisados por PCR e compará-los com o perfil do correspondente ADN normal ou para avaliar a ausência de pelo menos um de 4 marcadores nucleares expressos em secções de tumores.
No geral, apesar da importância da MSI para a estratificação dos doentes, o tempo e os recursos necessários para o diagnóstico da MSI ainda apresenta um obstáculo por não ser conhecido no estado da técnica um ensaio baseado num único biomarcador para detectar esta característica.
Sumário da invenção
A presente invenção refere-se ao uso de um agente com afinidade pelo antigénio de Thomsen-Friedenreich (TF) selecionado do grupo consistindo de: anticorpos para o antigénio TF, fragmentos do domínio variável dos ditos anticorpos ou lectinas com afinidade para o antigénio TF como reagentes para o diagnóstico in vitro de Instabilidade de Microsatélites (MSI). Numa forma de realização da presente invenção o dito agente com afinidade pelo antigénio TF é o anticorpo contra o antigénio TF do clone A68/B-A11.
Noutra forma de realização da presente invenção o dito agente com afinidade pelo antigénio TF é o anticorpo contra o antigénio TF do clone B79-H/B8.
Noutra forma de realização da presente invenção o dito agente com afinidade pelo antigénio TF é o anticorpo contra o antigénio TF do clone C80-I/C9.
Noutra forma de realização da presente invenção o dito agente com afinidade pelo antigénio TF é um fragmento do domínio variável dos ditos anticorpos contra o antigénio TF selecionados do grupo consistindo de: A68/B-A11, B79-H/B8 e C80-I/C9.
Noutra forma de realização da presente invenção o dito agente com afinidade pelo antigénio TF é a lectina Jacalina.
Noutra forma de realização a presente invenção corresponde a um estojo para diagnóstico in vitro de MSI caracterizado por compreender, pelo menos, um dos agentes descritos anteriormente.
Noutra forma de realização a presente invenção corresponde a um estojo caracterizado por compreender ainda, amostras biológicas de tecido ou células que expressam o antigénio TF para controlo e/ou calibração.
A presente invenção refere-se ainda a um método para o diagnóstico in vitro de MSI a partir de uma amostra biológica obtida in vitro caracterizado por compreender, os seguintes passos:
a) Seccionar uma amostra biológica obtida in vitro, em cortes de blocos de tecido embebidos em parafina fixados em formalina em seções de 3pm montadas em lâminas de vidro e desparafinadas com 100% de xileno e reidratadas por lavagens sucessivas em etanol a 100%; 95%; 70%; 50% e finalmente submersas em água destilada;
b) Inativar as peroxidases endógenas com 3% de peróxido de hidrogénio (H2O2) em metanol;
c) Bloquear por 30 minutos com soro de coelho normal em BBS com albumina de soro bovino (BSA) a 10%;
d) Contatar os cortes com um agente com afinidade pelo antigénio TF selecionado do grupo consistindo de: anticorpos para o antigénio TF, fragmentos do domínio variável dos ditos anticorpos ou lectinas com afinidade para o antigénio TF e incubar as referidas secções durante 1 hora ou durante a noite a temperaturas entre os 25°C e os 4°C, respetivamente, mais preferencialmente durante a noite a 4°C;
e) Incubar com um anticorpo secundário marcado com biotina durante 30 minutos;
f) Incubar com um sistema de avidina-biotina-corante (ABC), ou outros do tipo, por mais 30 minutos;
g) Coloração das referidas secções por adição de tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e coloração de contraste com solução de hematoxilina de Gill e aplicação de uma lamela sobre um meio de montagem;
h) Examinar as lâminas utilizando um Microscópio e estimar a proporção de células tumorais positivas dentro do tumor para classificação em diagnóstico de MSI positivo ou negativo com um cut-off entre 5% e 25%, mais preferivelmente de mais de 5% de células tumorais positivas para marcação do antigénio TF.
Noutra forma de realização, o dito método é caracterizado por, no passo d) os cortes são colocados em contacto com um anticorpo contra o antigénio TF, selecionado do grupo consistindo de: A68/B-A11, B79-H/B8 e C80-I/C9; fragmentos do domínio variável dos ditos anticorpos ou a lectina, Jacalina. Noutra forma de realização do dito método a amostra biológica compreende tecido congelado ou células presentes em citologia líquida, lavagens gástricas, lavagem vesical ou urina, líquido pleural ascítico ou fluido cerebrospinal ou numa amostra fecal diluída.
Noutra forma de realização o dito método para o diagnóstico in vitro de MSI em doentes com cancro a partir de uma amostra biológica in vitro caracterizada por compreender os seguintes passos:
a) Obter de uma amostra biológica de soro ou plasma in vitro; e
b) Efetuar um ensaio imunoenzimático (ELISA) para detetar o antigénio de TF empregando um anticorpo contra o antigénio TF, selecionado do grupo consistindo de: A68/B-A11, B79-H/B8 e C80-I/C9; fragmentos do domínio variável dos ditos anticorpos ou a lectina, Jacalina.
Noutra forma de realização o dito ensaio imunoenzimático é caracterizado por compreender a detecção dos níveis de autoanticorpos contra TF.
uso, métodos e estojo da presente invenção podem ser vantajosamente aplicados em doentes com cancro, incluindo como exemplos não limitantes o carcinoma gástrico e colorrectal, para facilitar significativamente o diagnóstico in vitro de MSI no contexto clínico, através de um ensaio baseado num único marcador, simples, rápido, sensível e específico para diagnóstico, prognóstico ou previsão de resposta ao tratamento com imunoterapia.
Descrição da Invenção
A presente invenção divulga a análise da expressão do antigénio TF, entre cinco epítetos de glicanos associados ao cancro, em carcinomas com status de MSI alta (positivos) ou MSI baixa ou negativa (negativos), revelando uma nova associação altamente significativa entre a expressão do antigénio TF e o estado de MSI (Tabelas 1 e 2), sem a detecção indesejada em lesões normais ou não malignas (Figura 1).
Tabela 1: Descreve a análise de associação de epítetos de glicano aberrantes com o estado de MSI. A) A expressão de cinco marcadores de glicosilação aberrante, ou seja, os antigénios Thomsen-Friedenreich (TF, Galpl-3GalNAcal) , Thomsen-nouvelle (Tn, GalNAc oíI) e a sua forma sialilada - sially Tn (STn, Neu5Aca2-3GalNAcal) , bem como os antigénios sialil -Lewis A (SLea, Neu5Acoí2-3Galpl-3 [Fuc od-4] GlcNAcp-) e sialil- Lewis X (SLex, Neu5Aca2-3Galpl-4 [Fuc al-3] GlcNAcp -) foram avaliados em 13 carcinomas gástricos com MSI positivos e 17 MSI negativos. B) A análise estatística dos marcadores com MSI foi realizada pelo teste exato de Fisher, revelando uma associação altamente significativa de TF com MSI, conforme indicado pelo símbolo (**). Valores ausentes são indicados por (/) ·
Tabela 1
Doente MSI TF Tn STn Sle x Sle a | ||||||
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 | - | + | + | + | - | - |
- | - | + + | + | + | + + | |
- | - | + | - | - | + | |
- | - | + + + | + | + | + | |
- | - | - | - | - | + | |
- | - | + + + | + + | + + + | ||
- | - | / | - | - | - | |
— | — | + + | + | — | + | |
- | - | / | - | - | + | |
- | - | + | + | - | + + | |
+ | + | + | - | - | - | |
+ + + | + + + | + + + | + + | + | + | |
+ | + | + | - | - | - | |
+ + + | + + + | + + + | + + | - | + | |
+ + + | + | + + | + + | + | + + | |
+ + | - | + | + | — | — |
Β)
Ρ = | 0,00041** | TF + | Σ | |
+ | 9 | 4 | 13 | |
MSI | - | 1 | 16 | 17 |
Σ | 10 | 20 | 30 | |
Ρ> | 0,99 | Τη + | — | Σ |
+ | 11 | 2 | 13 | |
MSI | - | 13 | 2 | 15 |
Σ | 24 | 4 | 28 | |
Ρ = | 0,713 | STn + | — | Σ |
+ | 7 | 6 | 13 | |
MSI | - | 7 | 10 | 17 |
Σ | 14 | 16 | 30 | |
Ρ> | 0,99 | SLe χ + | — | Σ |
+ | 2 | 11 | 13 | |
MSI | - | 2 | 14 | 16 |
Σ | 4 | 25 | 29 | |
Ρ = | 0,063 | SLe a + | — | Σ |
+ | 4 | 9 | 13 | |
MSI | - | 12 | 5 | 17 |
Σ | 16 | 14 | 30 |
Tabela 2: Descreve a análise de parâmetros clinico-patológicos de doentes com cancro gástrico de acordo com o estado do antigénio TF. Uma coorte total de 30 doentes, compreendendo doentes com TF positivo (10) e doentes com TF negativo (20), juntamente com a comparação do status do TF (negativo / positivo) de acordo com caracteristicas clinico-patológicas. As associações entre os grupos clinico-patológicos e os dois grupos de status do marcador TF foram calculadas usando o teste exato de Fisher para caracteristicas com duas categorias e o teste do χ2 para caracteristicas com mais de três categorias. Diferença nas médias de idade e sobrevivência (em meses) entre grupos de status de TF foi avaliada estatisticamente usando o teste de Mann-Whitney-Wilcoxon. Valores de P<0,05 foram consideradas como sendo estatisticamente significativos, como indicado com o símbolo (**).
Variável | Categoria | Total | TF positivo | TF negativo | Valor P | |||
n | % | n | % | n | % | |||
30 | 100% | 10 | 33% | 20 | 67% | |||
Idade | Média | 72,5 | 76 | 71,5 | 29 | |||
Sobrevivência em meses | Média | 44,5 | 88 | 31,5 | 15 | |||
Género | F | 13 | 43% | 5 | 50% | 8 | 40% | 0,70 |
M | 17 | 57% | 5 | 50% | 12 | 60% | ||
Status MSI | Alto | 13 | 43% | 9 | 90% | 4 | 20% | 0,000 4** |
Estável ou Baixo | 17 | 57% | 1 | 10% | 16 | 80% | ||
Terapia Adjuvante | não | 17 | 57% | 8 | 80% | 9 | 45% | 12 |
sim | 13 | 43% | 2 | 20% | 11 | 55% | ||
Sobrevivência | sem informação | 2 | 7% | 0 | 0% | 2 | 10% | 18 |
Alta (> 5 anos) | 13 | 43% | 7 | 70% | 6 | 30% | ||
Média 2 anos e <5 anos) | 5 | 17% | 1 | 10% | 4 | 20% | ||
Baixa (<2 anos) | 10 | 33% | 2 | 20% | 8 | 40% | ||
História de CG na Família | FALSO | 17 | 57% | 7 | 70% | 10 | 50% | 44 |
VERDADE | 13 | 43% | 3 | 30% | 10 | 50% | ||
Tumor | TI | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0,58 |
Primário | T2 | 7 | 23% | 3 | 30% | 4 | 20% | |
T3 | 10 | 33% | 4 | 40% | 6 | 30% | ||
T4 | 13 | 43% | 3 | 30% | 10 | 50% | ||
Nódulos Linfáticos Regionais | NO | 12 | 40% | 5 | 50% | 7 | 35% | 0,80 |
NI | 5 | 17% | 2 | 20% | 3 | 15% | ||
N2 | 7 | 23% | 2 | 20% | 5 | 25% | ||
N3a | 2 | 7% | 0 | 0% | 2 | 10% | ||
N3b | 4 | 13% | 1 | 10% | 3 | 15% | ||
Metástase | MO | 27 | 90% | 9 | 90% | 18 | 90% | 99 |
Ml | 3 | 10% | 1 | 10% | 2 | 10% | ||
Estádio | I | 4 | 13% | 2 | 20% | 2 | 10% | 0,82 |
II | 11 | 37% | 4 | 40% | 7 | 35% | ||
III | 12 | 40% | 3 | 30% | 9 | 45% | ||
IV | 3 | 10% | 1 | 10% | 2 | 10% | ||
Classificação da OMS | sem informação | 1 | 3% | 1 | 10% | 0 | 0% | 37 |
Adenocarcinoma Papilar | 1 | 3% | 0 | 0% | 1 | 5% | ||
Pouco coeso | 11 | 37% | 3 | 30% | 8 | 40% | ||
Células em anel de sinete e Mucinoso | 7 | 23% | 1 | 10% | 6 | 30% | ||
Adenocarcinoma tubular | 10 | 33% | 5 | 50% | 5 | 25% | ||
Classificação de Borrman | I | 2 | 7% | 0 | 0% | 2 | 10% | 0,64 |
II | 7 | 23% | 2 | 20% | 5 | 25% | ||
III | 17 | 57% | 7 | 70% | 10 | 50% | ||
IV | 4 | 13% | 1 | 10% | 3 | 15% | ||
Classificação de Lauren | sem informação | 2 | 7% | 1 | 10% | 1 | 5% | 10 |
Difuso | 5 | 17% | 0 | 0% | 5 | 25% | ||
Intestinal | 22 | 73% | 8 | 80% | 14 | 70% | ||
Misto | 1 | 3% | 1 | 10% | 0 | 0% | ||
Local do tumor | Difuso | 1 | 3% | 0 | 0% | 1 | 5% | 0,73 |
Cardia | 1 | 3% | 0 | 0% | 1 | 5% | ||
Corpus | 10 | 33% | 3 | 30% | 7 | 35% | ||
Antro | 18 | 60% | 7 | 70% | 11 | 55% | ||
Infiltração vascular | sem informação | 3 | 10% | 0 | 0% | 3 | 15% | 0,23 |
FALSO | 14 | 47% | 7 | 70% | 7 | 35% | ||
VERDADE | 13 | 43% | 3 | 30% | 10 | 50% | ||
Infiltração de nervos | sem informação | 6 | 20% | 3 | 30% | 3 | 15% | 99 |
FALSO | 16 | 53% | 5 | 50% | 11 | 55% | ||
VERDADE | 8 | 27% | 2 | 20% | 6 | 30% |
Assim, a presente invenção divulga o uso de anticorpos para o antigénio TF ou outros agentes com afinidade para o antigénio TF numa composição utilizada num método ou estojo para diagnóstico in vitro de Instabilidade MicroSatélites (MSI) em amostras de tecido de tumores, incluindo, mas não limitado a tumores gástricos e coloretais.
Os anticorpos específicos que podem ser usados para o propósito desta invenção compreendem os anticorpos para o antigénio TF dos clones A68/B-A11, B79-H/B8 e C80-I/C9, todos caracterizados por ter afinidade pelo antigénio TF, que podem ser obtidos de fontes comerciais, tais como a Novus Biologicals, Invitrogen, Cell Sciences, Creative Diagnostics, Creative Biolabs a Abcam, Santa Cruz, Histosearch, Life Span Biosciences, Creative Diagnostics, ou noutras empresas como a Abnova , Raybiotech , NSJ Reagents, MyBiosource , American Research Products Inc, Fitzgerald Industries International e Progen .
Noutras formas de realização podem ser utilizados para os fins desta invenção fragmentos das regiões variáveis dos anticorpos acima mencionados.
Noutras formas de realização da presente invenção, podem ser usadas para o propósito desta invenção lectinas com alta afinidade para o antigénio TF, tal como a Jacalina.
Os referidos anticorpos, fragmentos de anticorpo ou lectinas são utilizados numa composição para detectar MSI.
Numa forma de realização da presente invenção, a composição referida para a detecção de MSI é preparada diluindo um anticorpo específico, um fragmento de anticorpo ou uma lectina com afinidade para o antigénio TF em Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) com 2% (p/v) de Albumina Sérica Bovina (BSA), em quantidades que variam de 5-100 microgramas, mais preferencialmente 33 microgramas.
Utilizando a referida composição, é possível desenvolver uma forma de realização da presente invenção que se refere a um método para diagnóstico in vitro de MSI com base na expressão do antigénio TF (Figura 1), que compreende os seguintes passos:
a) Seccionar uma amostra biológica obtida in vitro, em cortes de blocos de tecido embebidos em parafina fixados em formalina em seções de 3gm montadas em lâminas de vidro e desparafinadas com 100% de xileno e reidratadas por lavagens sucessivas em etanol a 100%; 95%; 70%; 50% e finalmente submersas em água destilada;
b) Inativar as peroxidases endógenas com 3% de peróxido de hidrogénio (H2O2) em metanol;
c) Bloquear por 30 minutos com soro de coelho normal em PBS com albumina de soro bovino (BSA) a 10%;
d) Contatar os cortes com um agente com afinidade pelo antigénio TF selecionado do grupo consistindo de: anticorpos para o antigénio TF, fragmentos do domínio variável dos ditos anticorpos ou lectinas com afinidade para o antigénio TF e incubar as referidas secções durante 1 hora ou durante a noite a temperaturas entre os 25°C e os 4°C, respetivamente, mais preferencialmente durante a noite a 4°C;
e) Incubar com um anticorpo secundário marcado com biotina durante 30 minutos;
f) Incubar com um sistema de avidina-biotina-corante (ABC), ou outros do tipo, por mais 30 minutos;
g) Coloração das referidas secções por adição de tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e coloração de contraste com solução de hematoxilina de Gill e aplicação de uma lamela sobre um meio de montagem;
h) Examinar as lâminas utilizando um Microscópio e estimar a proporção de células tumorais positivas dentro do tumor para classificação em diagnóstico de MSI positivo ou negativo com um cut-off entre 5% e 25%, mais preferivelmente de mais de 5% de células tumorais positivas para marcação do antigénio TF.
Ao empregar este método em 30 casos de carcinoma gástrico (13 MSI positivos e 17 MSI negativos pela análise baseada em PCR), obtém-se uma associação marcante e altamente significativa entre o status de expressão de TF e de MSI (p <0,001; teste exato de Fisher). Entre os 10 casos positivos para TF, 9 são positivos para MSI, o que sugere uma especificidade sem precedentes do antigénio TF para este subtipo molecular de cancro gástrico (Tabela 1) . Os resultados indicam que o antigénio TF também se destaca quanto à sensibilidade, uma vez que 16 dos 20 casos negativos para TF eram MSI negativos (Tabela 1). Isso resulta em valores de sensibilidade e especificidade de 69,2% (9/13) e 94,1% (16/17), respetivamente. Os Valores preditivos positivos e negativos são 90% (9/10) e 80% (16/20), respetivamente.
Outra vantagem do método é que a mucosa adjacente aos tumores, incluindo glândulas normais e regiões altamente inflamadas, bem como regiões de metaplasia intestinal e displasia, são completamente negativas, sublinhando a ausência deste marcador em condições não malignas e pré-malignas. (Fig. 1 a-c). Entre os casos positivos, a coloração é tipicamente membranar e encontrada em média em cerca de 30% de todas as células cancerígenas do tumor. Nos carcinomas gástricos bem diferenciados, a coloração é tipicamente na membrana apical e inclui secreção (Fig. ld). A localização subcelular entre os carcinomas gástricos pouco diferenciados passa a citoplasmática (Fig. 1 g-j) . A expressão do TF parece associarse ao bom prognóstico dos doentes, refletida pelo aumento da sobrevida média dos doentes (88 meses vs. 31,5 meses) e pela alta proporção de doentes vivos 5 anos após o diagnóstico (70% vs. 30%) (Tabela 2). Este melhor prognóstico está de acordo com as expectativas, uma vez que, em média, a sobrevivência é melhor em doentes com MSI.
Noutra forma de realização do método da presente invenção, a referida amostra biológica pode compreender tecido tumoral congelado ou células obtidas de citologia em meio liquido, lavagens gástricas, lavagens vesicais ou urina, líquido pleural, líquido ascítico, fluido cerebrospinal ou uma amostra fecal diluída.
A presente invenção refere-se ainda a um estojo compreendendo as composições acima mencionadas para a detecção de MSI por realização do método da presente invenção.
Numa forma de realização da presente invenção, o referido estojo compreende ainda amostras biológicas de tecido ou células que expressam o antigénio TF como controlo e/ou calibrador.
Em suma, o uso, a composição, os métodos e o estojo da presente invenção pode ser vantajosamente aplicado no diagnóstico in vitro de MSI nos carcinomas do estômago, colo-rectal e de outros tecidos para melhorar significativamente a identificação de este subtipo distinto de cancro no contexto clínico através de um ensaio baseado num único marcador, rápido, sensível e específico para diagnóstico, prognóstico ou previsão de resposta ao tratamento de doentes com cancro.
Breve Descrição das Figuras
Figura 1: Colorações representativas da expressão de antigénio Thomsen- Friedenreich (TF) em amostras de tecido gástrico humano. (a)A mucosa gástrica é negativa para o TF, aqui representado por mucosa normal histologicamente adjacente ao tumor positivo para MSI e positivo para TF. (b) Imagem representativa da metaplasia intestinal mostrando que mesmo as células caliciformes, que são comumente enriquecidas em portadores O-glicanos truncados, foram negativas para TF. (c) Displasia TF negativa ao lado de carcinoma TF positivo, mostrando a especificidade do TF para células malignas, (d-f)
Carcinomas gástricos bem diferenciados que mostram uma típica coloração de TF membranar na superfície apical, incluindo secreções mucinosas. (g- i) Carcinomas gástricos pouco diferenciados em que domina a coloração citoplasmática. (i) células de carcinoma positivas para TF infiltradas dentro de um vaso.
EXEMPLOS
Exemplo 1 - Preparação das composições para a detecção de MSI que compreendem anticorpos para o antigénio TF
Num exemplo de realização da invenção, uma composição para diagnóstico ín vítro de MSI é produzida diluindo um anticorpo contra o antigénio TF em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 2% (p/v) de Albumina Sérica Bovina (BSA), em quantidades que variam de 5-10 0 microgramas.
Exemplo 2 - Preparação de composições para a detecção de MSI compreendendo fragmentos de anticorpos ou de receptores de antigénios
Numa forma de realização da invenção, uma composição para o diagnóstico ín vítro de MSI compreende fragmentos de regiões variáveis de anticorpos ou receptores visando o antigénio TF, compreendendo por exemplo, as regiões variáveis das cadeias pesada ou leve das imunoglobulinas, bem como as regiões variáveis dos receptores de células-T.
Exemplo 3 - Preparação de composições para a detecção de MSI compreendendo lectinas
Numa forma de realização da invenção, uma composição para diagnóstico ín vítro de MSI compreende lectinas com afinidade para o antigénio TF, por exemplo a Jacalina, e suas misturas.
Exemplo 4 - Método para diagnóstico in vitro de MSI em amostras de tecido
Num exemplo de realização da invenção, um método que emprega as composições preparadas como descrito nos exemplos anteriores compreende os seguintes passos:
a) Seccionar uma amostra biológica obtida in vitro, em cortes de blocos de tecido embebidos em parafina fixados em formalina em seções de 3pm montadas em lâminas de vidro e desparafinadas com 100% de xileno e reidratadas por lavagens sucessivas em etanol a 100%; 95%; 70%; 50% e finalmente submersas em água destilada;
b) Inativar as peroxidases endógenas com 3% de peróxido de hidrogénio (H2O2) em metanol;
c) Bloquear por 30 minutos com soro de coelho normal em PBS com albumina de soro bovino (BSA) a 10%;
d) Contatar os cortes com um agente com afinidade pelo antigénio TF selecionado do grupo consistindo de: anticorpos para o antigénio TF, fragmentos do domínio variável dos ditos anticorpos ou lectinas com afinidade para o antigénio TF e incubar as referidas secções durante 1 hora ou durante a noite a temperaturas entre os 25°C e os 4°C, respetivamente, mais preferencialmente durante a noite a 4°C;
e) Incubar com um anticorpo secundário marcado com biotina durante 30 minutos;
f) Incubar com um sistema de avidina-biotina-corante (ABC), ou outros do tipo, por mais 30 minutos;
g) Coloração das referidas secções por adição de tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e coloração de contraste com solução de hematoxilina de Gill e aplicação de uma lamela sobre um meio de montagem;
h) Examinar as lâminas utilizando um Microscópio e estimar a proporção de células tumorais positivas dentro do tumor para classificação em diagnóstico de MSI positivo ou negativo com um cut-off entre 5% e 25%, mais preferivelmente de mais de 5% de células tumorais positivas para marcação do antigénio TF.
A vantagem deste método é que, através da expressão do antigénio TF, como um único marcador, é obtido um preditor altamente confiável do estado MSI em cancro e assim a medição do antigénio TF tem um enorme potencial para a estratificação dos doentes com MSI de uma maneira eficiente e económica.
Exemplo 5 - Método para diagnóstico in vitro de MSI em amostras celulares
Noutro exemplo, a amostra biológica a ser empregue no método descrito no exemplo anterior pode ser tecido congelado ou compreender células fixadas em lâminas de vidro obtidas de citologia em meio líquido; lavagens gástricas; lavagens vesicais ou urina; líquido ascítico, pleural ou cefalorraquidiano ou de uma amostra fecal diluída. A vantagem destas amostras celulares é que podem ser obtidos a partir de procedimentos minimamente invasivos que não requerem cirurgia para o uso de biópsias de tecido ou peças cirúrgicas.
Exemplo 6 - Métodos serológicos para diagnóstico in vitro de MSI
Outro exemplo refere-se à aplicabilidade de um teste sorológico baseado em ELISA (Enzyme-linked-Immunosorbent Assay) para detecção de antigénio de TF, para o diagnóstico do subtipo MSI que tem potencial utilidade no contexto clínico.
Assim, noutras formas de realização, pode ser realizado um método para diagnóstico de MSI compreendendo os seguintes passos:
a) Obter de uma amostra biológica de soro ou plasma in vitro; e
b) Efetuar um ensaio imunoenzimático (ELISA) para detetar o antigénio de TF empregando um anticorpo contra o antigénio TF, selecionado do grupo consistindo de: A68/B-A11, B79-H/B8 e C80-I/C9;
fragmentos do domínio variável dos ditos anticorpos ou a lectina, Jacalina.
Exemplo 7 - Métodos sorológicos para diagnóstico in vitro de MSI
Noutra forma de realização os métodos serológicos descritos no exemplo anterior podem seguir uma estratégia de detecção de um nível elevado de auto-anticorpos contra o TF, que pode ter propriedades indicadoras para o estado de MSI.
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S. M., Goldberg, R. M., de la Chapelle, A., Koshiji, M.,
Bhaijee, F., Huebner, T., Hruban, R. H., Wood, L. D., Cuka,
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Claims (13)
1. Uso de um agente com afinidade pelo antigénio de ThomsenFriedenreich (TF) selecionado do grupo consistindo de: anticorpos para o antigénio TF, fragmentos do domínio variável dos ditos anticorpos ou lectinas com afinidade para o antigénio TF como reagentes para o diagnóstico in vitro de Instabilidade de Microsatélites (MSI).
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o dito agente com afinidade pelo antigénio TF é o anticorpo contra o antigénio TF do clone A68/B-A11.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o dito agente com afinidade pelo antigénio TF é o anticorpo contra o antigénio TF do clone B79-H/B8.
4. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o dito agente com afinidade pelo antigénio TF é o anticorpo contra o antigénio TF do clone C80-I/C9.
5. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o dito agente com afinidade pelo antigénio TF é um fragmento do domínio variável dos ditos anticorpos contra o antigénio TF selecionados do grupo consistindo de: A68/B-A11, B79-H/B8 e C80-I/C9.
6. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o dito agente com afinidade pelo antigénio TF é a lectina Jacalina.
7. Um estojo para diagnóstico in vitro de MSI caracterizado por compreender, pelo menos, um dos agentes descritos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. Um estojo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender ainda, amostras biológicas de tecido ou células que expressam o antigénio TF para controlo e/ou calibração.
9. Um método para o diagnóstico in vitro de MSI a partir de uma amostra biológica obtida in vitro caracterizado por compreender, os seguintes passos:
a) Seccionar uma amostra biológica obtida in vitro, em cortes de blocos de tecido embebidos em parafina fixados em formalina em seções de 3pm montadas em lâminas de vidro e desparafinadas com 100% de xileno e reidratadas por lavagens sucessivas em etanol a 100%; 95%; 70%; 50% e finalmente submersas em água destilada;
b) Inativar as peroxidases endógenas com 3% de peróxido de hidrogénio (H2O2) em metanol;
c) Bloquear por 30 minutos com soro de coelho normal em PBS com albumina de soro bovino (BSA) a 10%;
d) Contatar os cortes com um agente com afinidade pelo antigénio TF selecionado do grupo consistindo de: anticorpos para o antigénio TF, fragmentos do domínio variável dos ditos anticorpos ou lectinas com afinidade para o antigénio TF e incubar as referidas secções durante 1 hora ou durante a noite a temperaturas entre os 25°C e os 4°C, respectivamente, mais preferencialmente durante a noite a 4°C;
e) Incubar com um anticorpo secundário marcado com biotina durante 30 minutos;
f) Incubar com um sistema de avidina-biotina-corante (ABC), ou outros do tipo, por mais 30 minutos;
g) Coloração das referidas secções por adição de tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e coloração de contraste com solução de hematoxilina de Gill e aplicação de uma lamela sobre um meio de montagem;
h) Examinar as lâminas utilizando um Microscópio e estimar a proporção de células tumorais positivas dentro do tumor para classificação em diagnóstico de MSI positivo ou negativo com um cut-off entre 5% e 25%, mais preferivelmente de mais de 5% de células tumorais positivas para marcação do antigénio TF.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que no passo d) os cortes são colocados em contacto com um anticorpo contra o antigénio TF, selecionado do grupo consistindo de: A68/BAll, B79-H/B8 e C80-I/C9; fragmentos do domínio variável dos ditos anticorpos ou a lectina, Jacalina.
11. Método de acordo com as reivindicações 9 ou 10, em que a amostra biológica compreende tecido congelado ou células presentes em citologia líquida, lavagens gástricas, lavagem vesical ou urina, líquido pleural ascítico ou fluido cerebrospinal ou numa amostra fecal diluída.
12. Método para o diagnóstico in vitro de MSI em doentes com cancro a partir de uma amostra biológica in vitro caracterizada por compreender os seguintes passos:
a) Obter de uma amostra biológica de soro ou plasma in vitro; e
b) Efetuar um ensaio imunoenzimático (ELISA) para detetar o antigénio de TF empregando um anticorpo contra o antigénio TF, selecionado do grupo consistindo de: A68/B-A11, B79-H/B8 e C80-I/C9; fragmentos do domínio variável dos ditos anticorpos ou a lectina, Jacalina.
13. Um método para o diagnóstico in vitro de MSI de acordo com a reivindicação 12, em que o dito ensaio imunoenzimático é caracterizado por compreender a detecção dos níveis de autoanticorpos contra TF.
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