DE60110127T2

DE60110127T2 - Ligationsverfahren und reagenzien zur bildung einer amid-bindung

Info

Publication number: DE60110127T2
Application number: DE60110127T
Authority: DE
Inventors: T. Ronald RAINES; L. Laura KIESSLING; L. Bradley NILSSON
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2021-05-12
Also published as: CA2405105C; AU6153001A; EP1399465A4; DE60110127D1; AU2001261530B2; EP1399465A2; US6972320B2; WO2001087920A3; CA2405105A1; US20040087779A1; WO2001087920A2; ATE293125T1; JP4694085B2; JP2004501103A; EP1399465B1

Description

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Peptidchemie, insbesondere betreffend Verfahren zur Ausbildung von Amidbindungen, die für die Synthese von Peptiden und Proteinen und auch die Synthese von derivatisierten Peptiden oder Proteinen verwendbar sind.
Neue Verfahren erleichtern die chemische Gesamtsynthese von Proteinen. Als historische Referenzen, siehe: Merrifield, R. B. Science 1984, 232, 341–347; Kent, S. B. Annu. Rev.Biochem. 1988, 57, 957–989; Kaiser, E. T. Acc. Chem. Res. 1989, 22, 47–54. Insbesondere Kent und andere haben elegante Mittel entwickelt, um zwei ungeschützte Peptide in wässriger Lösung zu verknüpfen, genannt "native chemische Ligation", Dawson, P. E.; Muir, T. W.; Clark. Lewis, I.; Kent, S. B. Science 1994, 266, 776–779. Als wichtige Vorgänger, siehe: Wieland, T.; Bokelmann, E.; Bauer, L.; Lang, H. U.; Lau, H. Liebigs Ann. Chem. 1953, 583, 129–149; Kemp, D. S.; Galakatos, N. G.J Org. Chem. 1986, 51, 1821–1829. Als Übersichten, siehe: Muir, T. W.; Dawson, P. E.; Kent, S. B. H. Methods Enzymol. 1997, 289, 266–298; Wilken, J.; Kent, S. B. H. Curr. Opin. Biotechnol. 1998, 9, 412-426;Kochendoerfer, G. G.; Kent, S. B. H. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 665–671; Tam, J. P.: Yu Q.; Miao, Z. Biopolymers 1999, 51, 311–332; Dawson, P. E.; Kent, S. B. H. Annu. Rev. Biochem. 2000, 69, 923–960; Borgia, J. A.; Fields, G. B. Trends Biotechnol. 2000, 18, 243–251.
Bei nativer chemischer Ligation des Thiolats eines N-terminalen Cysteinrests in einem Peptid greift der Kohlenstoff eines C-terminalen Thioesters in einem anderen Peptid an, um letztendlich eine Amidbindung zwischen den beiden Peptiden zu bilden (Schema 1). Dieses Ligationsverfahren wurde entdeckt, als die Reaktion von ValSPh und CysOH in wässrigem Puffer erwies sich als das Dipeptid ergebend: ValCysOH (Wieland et al., 1953).
Vor Kurzem haben Muir und andere die Nützlichkeit nativer chemischer Ligation ausgeweitet, indem sie zeigten, dass das Thioesterfragment direkt mit rekombinan ten DNA-, (rDNA)-Techniken erzeugt werden kann. Muir, T. W.; Sondhi, D.; Cole, P. A. Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 1998, 9, 6705–6710; Evans, Jr., T. C.; Benner, J.; Xu, M.-Q. Protein Sci. 1998, 7, 2256–2264; Ayers, B.; Blaschke, U. K.; Camarero, J. A.; Cotton, G. J.; Holford, M.; Muir, T. W. Biopolymers 2000, 51, 343–354. Als Übersichten siehe: Holford, M.; Muir, T. W. Structure 1998, 15, 951–956; Cotton, G. J.; Muir, T. W. Chem. Biol. 1999, 6, R247-R256 ; Evans, Jr., T. C.; Xu, M.-Q.Biopolymers 2000, 51, 333–342. Diese Ausweitung von "nativer chemischer Ligation" ist als "exprimierte Proteinligation" bezeichnet worden.
Schema 1
Obwohl Leistungsfähig hat die native chemische Ligation eine ernste Einschränkung. Dieses Verfahren hat eine absolute Zuverlässigkeit bei der Bildung einer Peptidbindung an einen Cysteinrest. Die Erzeugung einer Verknüpfung an einer natürlichen Xaa-Cys-Bindung ist nicht immer möglich, da Cystein nur 1.7% der Reste in globularen Proteinen ausmacht (McCaldon, P.; Argos, P.Proteins 1988,4,99–122). Die moderne Peptidsynthese ist typischerweise auf Peptide von < 50 Resten beschränkt (Dawson et al., 1994; Wieland et al., 1953; Kemp et al., 1986; Muir et al, 1997; Wilken et al., 1986; Kochendoerfer et al., 1999; Tam et al., 1999; Dawson et al., 2000; Borgia et al., 2000). Daher können die meisten Proteine nicht durch ein Verfahren hergestellt werden, das erfordert, dass die Peptide nur an einen Cysteinrest gebunden werden.
Weiterhin ist das Installieren eines extra Cysteinrests oft nicht wünschenswert. Cysteine ist bei weitem der reaktivste Rest gegenüber Disulfidbindungen,O2 (g), und anderen elektrophilen (Schneider, C. H.; deWeck, A. L.Biochim. Biophys. Acta 1965, 168,27–35; Raines, R. T. NatureStruct. Biol. 1997,4,424–427). Zusätzlich kann die Sulfhydrylgruppe von Cystein einer β-Eliminierung unterliegen, um Dehydroalanin zu bilden, welches weiterer Reaktion unterliegen kann (Friedman,M. Adv.Exp. Med. Biol. 1999,459, 145–159). Die Entfernung der Cysteineinschränkung durch Anwenden einer allgemeineren Ligationstechnik würde die Anwendbarkeit einer Gesamtproteinsynthese erweitern.
Offer und Dawson haben kürzlich ein Peptidligationsverfahren beschrieben, das keine Gegenwart von Cystein erfordert. (Offer, J.; Dawson, P. E. Org. Lett. 2000,2,23–26). In ihrem Verfahren wird eine Peptidbindung aus einem Thioester und einem o-Mercaptobenzylamin gebildet. Obwohl effizient hinterlässt dieses Verfahren zwangsläufig o-Mercaptobenzylamin in dem Ligationsprodukt.
In der wohlbekannten Staudingerreaktion wird ein Phosphin verwendet, um ein Azid zu einem Amin zu reduzieren: PR₃ + N₃R' + H₂O → O = PR₃ + H₂NR' + N₂(g). (Staudinger, H.; Meyer, J. Helv. Chim. Acta 1919,2,635–646. Als Übersichten siehe: Gololobov, Yu. G.; Zhmurova,I. N.; Kasukhin, L. F. Tetrahedron 1981, 37, 437–472; Gololobov, Yu. G.; Kasukhin, L. F. Tetrahedron 1992,48, 1353–1406). Die Zwischenstufe in der Reaktion ist ein Iminophosphoran (R''₃P⁺-^–NR), welches einen nucleophilen Stickstoff hat.
Vilarassa und andere haben gezeigt, dass der Stickstoff von Iminophosphoran acyliert werden kann, sowohl in intermolekularen als auch intramolekularen Reaktionen, welche als "Staudinger-Ligationen" bezeichnet worden sind wie beispielhaft darge stellt in den Reaktionen 1 und 2 in Schema 2. Als Beispiele, siehe: Garcia, J.; Urpi, F.; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 4841–4844; Garcia, J.; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 639–640;Urpi, F.; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 4623–4624; Bosch, I.; Romea, P.;Urpi, F.; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 4671–4674; Inazu, T.; Kobayashi, K. Synlett. 1993, 869–870; Molina, P.; Vilaplana, M. J. Synthesis-Stuttgart 1994, 1197–1218; Bosch,I.;Urpi, F.; Vilarrasa, J.J Clzem. Soc., Claern. Commun. 1995, 91–92; Shalev, D. E.; Chiacchiera, S. M.; Radkowsky, A. E.; Kosower, E. M. J ; Org. Chem. 1996, 61, 1689–1701; Bosch, I.; Gonzalez, A.; Urpi, F.; Vilarrasa, J. J. Org. Chem. 1996, 61, 5638–5643; Maunier, V.; Boullanger, P.; Lafont, D. J.Carbohydr. Res. 1997, 16, 231–235; Afonso, C. A. M. Synthetic Commun. 1998, 28, 261–276; Tang, Z.; Pelletier, J. C. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 4773–4776; Ariza X.;Urpi, F.; Viladomat, C.; Vilarrasa J. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 9101–9102; Mizuno, M.; Muramoto, I.; Kobayashi, K.; Yaginuma, H.; Inazu, T. Synthesis-Stuttgart 1999, 162–165; Mizuno, M.; Haneda, K.; Iguchi, R.; Muramoto, I.;Kawakami, T.; Aimoto, S.; Yamamoto, K.; Inazu, T.J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 284–290; Boullanger P.; Maunier, V.; Lafont, D.Carbohydr. Res. 2000, 324, 97–106; Velasco, M. D.; Molina, P.; Fresneda, P. M.; Sanz, M. A. Tetrahedron 2000, 56; 4079–4084 ;Malkinson, J. P.; Falconer, R. A.; Toth, I. J. Org. Chem. 2000, 65, 5249–5252.
Saxon und Bertozzi haben berichtet, dass das Phosphin auch als Acyldonor dienen kann wie in Schema 2, Reaktion 3 veranschaulicht, Saxon, E.; Bertozzi, C. R. Science 2000, 287, 2007–2010.
Schema 2 Vilarrasa und andere (viele Beispiele in den 1980gern und 1990gern)
Saxon und Bertozzi (Science 2000,287,2007)
Kürzlich haben Saxon et al. eine Modifikation der Staudinger-Ligation berichtet, um aus einem Amid ein Azid unter Verwendung eines Phosphinreagenzes zu bilden (Saxon, E.; Armstrong, J. I.; Bertozzi, C. R. Org. Lett. 2000,2,2141–2143.) Es wurde berichtet, dass die Phosphinreagenzien:
wenn reagiert mit einem Azidonucleosid, zur Bildung eines Amids durch Acylgruppenüberführung führen. Die Ligation wird "spurenfrei" genannt, da kein anderer Anteil des Phosphinereagenzes als die Acylgruppe im Produkt verbleibt. Die Autoren berichten auch, dass die Reaktion des Phosphinothioesters:
mit demselben Azidonucleosid anfangs eher zu einer Aza-Ylid-Hydrolyse als Acylübertragung führt. Die Beobachtung von Amidprodukten nach einigen Tagen ist als wahrscheinliches Ergebnis der Reaktion von Aminhydrolyseprodukten mit dem Thioester kennzeichnend. Die Autoren zeigen, dass der eingesetzte Phosphin-Thioester (bzw. Phosphinothioester, im folgenden Phosphinothioester genannt) nicht der Reaktion „zugänglich" ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung ergibt allgemein ein Verfahren und Reagenzien zur Bildung von Amidbindungen zwischen einem Phosphinothioester und einem Azide, wie in Schema 3 veranschaulicht. Die Reaktion ermöglicht die Bildung einer Amidbindung unter einer Großen Vielzahl chemischer Spezies (veranschaulicht in Schema 3 als R^P und R^B). Von besonderem Interesse sind jene Reaktionen, in welchen die ligierten Einheiten Aminosäuren, Peptide oder Proteinfragmente sind. In einer spezifischen Ausführung ergibt diese Erfidnung ein Verfahren und Reagenzien zur Peptidligation, die den Bedarf an einem Cysteinrest erübrigen und hinterlässt keine restlichen Atome in dem ligierten Peptidprodukt (d.h. ist spurenfrei).
Perez-Lourido und andere haben Startmaterialien angegeben, einschließlich o-(Diphenylphosphin)-Benzothiol, die verwendet werden, um Organozinnkomplexe herzustellen. (Perez-Lourido., P; Romero, J.; Garcia-Vazquez, J.A.; Sousa, A.; Zubieta, J; Russo, U. Journal of Organometallic Chemistry 2000, 595, 59–65.) Hingegen wurden die offenbarten Verbindungen nicht verwendet, um Amidbindungen zu bilden oder um Phosphinothioester zu erzeugen.
Schema 3
Ein bei dieser Ligation verwendbarer Phosphinothioester kann auf eine Vielzahl von Arten erzeugt werden. Wie in Schema 3 veranschaulicht kann ein aktiviertes Carboxylsäurederivat, zum Beispiel ein Thioester oder ein N-Acylsulfonamid in einen Phosphinothioester umgewandelt werden. Jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Ausbildung eines Phosphinothioesters kann im Allgemeinen verwendet werden. Diese Erfindung ergibt ein effizientes Verfahren zum Erzeugen von Phosphinothioestern, insbesondere jenen von Aminosäuren, Peptiden und Proteinfragmenten unter Verwendung eines Phosphinothiolreagenzes. Dieses Reagenz kann verwendet werden, um den gewünschten Phosphinothioester aus aktivierten Carboxylsäurederivaten (z.B. Thioester oder aktivierte Sulfamylgruppen) oder aus einer Carboxylsäure durch konventionelle Kopplungsreaktionen, vermittelt durch Dicyclohexylcarbodiimid oder ein ähnliches Koppeln zu erzeugen.
Ein bei dieser Ligationsreaktion dieser Erfindung verwendbarer Phosphinothioester kann auch aus einem Peptid- oder Proteinfragment erzeugt werden, das an ein Harz an seinem C-Terminus angeheftet werden kann. Zum Beispiel kann ein Peptid- oder Proteinfragment von einem Harz durch Reaktion mit einem Phosphinothiolreagenz dieser Erfindung freigesetzt werden, um einen Phosphinothioester zu erzeugen. Ein Peptid- oder Proteinfragment kann an einem geeigneten Harz unter Verwendung bekannter Verfahren von Festzustandspeptidsynthese synthetisiert werden, z.B. Fmoc-basierte Verfahren. Das Peptid- oder Proteinfragment, das an dem Harz synthetisiert ist, kann dann durch Reaktion mit einem Phosphinothiol freigesetzt werden, um einen Phosphinothioester zu erzeugen, welcher dann mit einem Azid ligiert werden kann, um einen Amidbindung zu bilden. Unter diesem Aspekt der Erfindung kann jedes im Stand der Technik als zur Peptidsynthese geeignet bekannte Harz und welches für Reaktion mit einem Phosphinothiol kompatibel ist, um einen Phosphinothiolester zu bilden, in dieser Erfindung eingesetzt werden. Im Stand der Technik bekannte Harze wie "Safety-Catch"-Harze sind von besonderem Interesse. Siehe: Backes, B.J.; Ellman, J.A. J. Org. Chem. 2000, 64, 2322–2330.
Die R^P- und R^B-Einheiten, welche ligiert werden, können jede von einer großen Vielzahl chemischer Einheiten sein, die verträglich sind mit den Reaktionsbedingungen und in welchem sie keiner ungewünschten Reaktion miteinander oder mit anderen funktionellen Gruppen unterliegen, zum Beispiel bei R_1-2 oder X in dem Phosphinothioester. Die X-Einheit und R₁- und R₂-Gruppen in Schema 3 leiten sich vom Phosphinothiolreagenz ab und werden gewählt, um die Bildung des Amids wie unten beschrieben zu erleichtern.
R^P und R^B umfassen Einheiten, die gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Aliphaten, Heteroaliphaten, Allzyklen, Heteroalizyklen, Aromaten und Heteroaromaten, von denen alle mit einem oder mehreren Haliden (insbesondere F oder Cl), OH-, OR-, COH-, COR-, COOH-, COOR-, CONH-, CONR- oder N(R')₂-Gruppen substituiert sein können, worin R, unabhängig von anderen R, eine aliphatische, heteroaliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' gewählt ist aus den Gruppen Wasserstoff, aliphatischen, heteroaliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen. R und R' können im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein. Insbesondere können bei R^P und/oder R^B, welche aliphatische und/oder alizyklische Teile enthalten, eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂ Gruppen mit O, S, CO, COO, N(R')₂ und CONR' ersetzt werden, worin R' wie oben definiert ist. Jede reaktive funktionelle Gruppe von der R^P o der R^B Gruppe kann vor ungewünschter Reaktion unter Verwendung von Schutzgruppen (Pr) geschützt sein.
In spezifischen Ausführungen sind R^P und R^B Aminosäuren, Peptide oder Proteine. Die Phosphinothioestergruppe kann zum Beispiel am Carboxyterminus (C-Terminus) eines Peptids oder Proteins oder an einer Säureseitengruppe von einer oder mehreren Aminosäuren in einem Peptid oder Protein gebildet werden. Die Azidgruppe kann zum Beispiel an dem Aminoende (N-Terminus) von einem Peptid oder Protein oder an der basischen Seitengruppe von einer oder mehreren Aminosäuren in einem Peptid oder Protein gebildet werden. Das Ligationsverfahren kann verwendet werden, um zwei oder mehr Aminosäuren, zwei oder mehr Peptide oder zwei oder mehr Proteine zu ligieren. Mehrere Ligationszyklen können zum Beispiel eingesetzt werden zur Festzustandsynthese eines Proteins aus Aminosäurekomponenten. Mehrere Ligationszyklen können eingesetzt werden, um zwei oder mehrere kleinere Peptide zu verbinden, um ein größeres Peptid zu bilden. Die verbundenen Peptide können durch Festzustandsyntheseverfahren erhalten werden aus natürlichen Quellen oder durch rekombinante Verfahren.
Das Verfahren dieser Erfindung ist besonders nützlich zum Beispiel für die Synthese von Peptiden und Proteinen wie in Schema 4 veranschaulicht, wo die zusammen ligierten Aminosäureeinheiten R^A1 und R^A2 unabhängig voneinander aliphatisch, heteroaliphatisch, allzyklisch, heteroalizyklisch, aromatisch oder heteroaromatisch sind, von denen jede wie oben angemerkt substituiert sein kann. Das Verfahren dieser Erfindung kann verwendet werden um nicht natürliche Aminosäuren sowie durch spezielle Isotope angereicherte natürliche Aminosäuren zu ligieren, wie jene mit ¹³C- und ¹⁵N-Isotopen angereicherten.
Das Verfahren dieser Erfindung kann auch eingesetzt werden, um eine oder mehrere Aminosäuren zu ligieren, die eine elektrophile Seitengruppe tragen, wie ein Alkylhalid oder ein Epoxid, aneinander oder um eine oder mehrere Aminosäuren mit elektrophilen Seitengruppen in Peptide und/oder Proteine einzuverleiben. Das Verfahren dieser Erfindung kann auch eingesetzt werden, um zwei oder mehr β-Aminosäuren aneinander zu ligieren, um eine oder mehrere β-Aminosäuren an α-Aminosäuren zu ligieren oder eine oder mehrere β-Aminosäuren in Peptide und/oder Proteine einzuverleiben.
Insbesondere umfassen R^A1- und R^A2-Gruppen jede Seitengruppe einer sauren, basischen, unpolaren oder polaren Aminosäure. R^A1 und R^A2 umfassen Seitenketten oder Seitengruppen von 20 gewöhnlichen α-Aminosäuren sowie Seitengruppen von ungewöhnlichen Aminosäuren (z.B. Homoserin), die in Proteinen gefunden werden, und Seitengruppen von anderen biologisch aktiven Aminosäuren (z.B. Ornithin oder Citrullin). Dieses die Amidbindung enthaltende Produkt in der in Schema 4 veranschaulichten Reaktion ist ein Dipeptid.
Schema 4
Zusatzaminosäuren können dem in Schema 4 veranschaulichten Peptidprodukt zugefügt werden durch (1) Addition einer Azidogruppe an den N-Terminus des Peptids und Reagieren des Azidopeptids mit einem anderen Phosphinothioester einer Aminosäure (oder eines Peptids) oder (2) durch Bildung eines Phosphinothioesters am C-Terminus des Peptids und nachfolgende Reaktion des Phosphinothioesters, gebildet mit einer Azidosäure (oder einem N-terminalen Azidopeptid). Ein Phosphinothiol reagenz dieser Erfindung kann verwendet werden, um den Phosphinothioester zu erzeugen.
Diese Schritte sind in Schema 5 veranschaulicht. Wiederholte Zyklen der Schritte 1 und/oder 2 können verwendet werden, um längere Peptide zu erzeugen.
Schema 5
Das Verfahren dieser Erfindung kann auch zu Synthese größerer Peptide oder Proteine durch Ligieren von zwei oder mehr kleineren Peptiden eingesetzt werden (typischerweise weniger als 50 Aminosäuren lang) oder zur Synthese eines Proteins durch Ligation von zwei oder mehr Peptiden oder Proteinen. In diesem Verfahren können die zwei oder mehreren Peptide oder Proteine (welche die gleichen oder verschieden sein können), die zu ligieren sind, durch konventionelle Festphasenverfahren synthetisiert werden, zum Beispiel Fmoc-basierte Verfahren, erhalten aus natürli chen Quellen oder erhalten durch rekombinante Verfahren. Eines der beiden Peptide oder Proteine, die zu ligieren sind, wird mit einer Phosphinothioestergruppe an seinem C-Terminus derivatisiert und der N-Terminus wird geschützt mit einer geeigneten Schutzgruppe. Das andere der beiden Peptide oder Proteine, das zu ligieren ist, wird derivatisiert mit einer Azidogruppe an seinem N-Terminus und wird mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt. Der Peptidphosphinothioester kann zum Beispiel aus einem Harz-gebundenen Peptid- der Proteinfragment unter Verwendung eines Phosphinothiolreagenzes dieser Erfindung oder durch Reaktion (Transesterifizierungs- oder Kopplungsreaktion) eines Peptidthioesters mit dem Phosphinothiolreagenz erzeugt werden. Der Peptidphosphinothioester wird dann mit dem Azidopeptid reagiert, begleitet von einer Hydrolyse oder einem Verlust von Stickstoff, um eine Amidbindung zu erzeugen, die die beiden Peptide ligiert. Die Ligationsreaktion kann in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, das genügend Wasser enthält, um Hydrolyse und Amidbildung zu erleichtern, zum Beispiel ein Gemisch von THF und Wasser. Alternativ kann die Reaktion des Phosphinothioesters und des Azids in einem organischem Lösungsmittel (in welchem beide Reaktionspartner löslich sind) gestartet werden und Wasser kann anschließend zur Hydrolyse und Amidbindungsbildung zugegeben werden.
In bestimmten Ausführungen wird die Ligation umgesetzt unter Verwendung von Festphasentechniken. Speziell wird ein erstes Peptid an ein Harz mit einem Phosphinothiolreagenz dieser Erfindung reagiert, um das erste Peptid freizusetzen und einen Phosphinothioester am C-Terminus des ersten Peptids zu bilden. Ein zweites Peptid wird an ein Harz angeheftet an seinem C-Terminus derivatisiert mit einer Azidgruppe an seiner N-terminalen Aminosäure. Das erste Peptid nach Freisetzen von dem Harz wird reagiert mit dem am Harz gebundenen zweiten Peptid, begleitet von Hydrolyse und Stickstoffverlust, um eine Amidbindung zu bilden, die die beiden Peptide ligiert. Das ligierte Peptid verbleibt an das Harz angeheftet. Das erste Peptid kann durch konventionelle Festzustandsverfahren gebildet werden. Das zweite Peptid kann auch durch konventionelle Festphasensyntheseverfahren gebildet werden, in welchen eine Azidosäure das letzte an die Peptidkette zugefügte Monomer ist oder die Azidogruppe in situ aus der Aminogruppe der letzten Aminosäure gebildet wird. Das ligierte Peptid (oder Protein) kann entschützt werden und, wenn gewünscht, von dem Harz durch konventionelle Verfahren gespalten werden. Alter nativ können zusätzliche Zyklen von N-terminalem Entschützen, N-terminaler Azidsäurebildung und Reaktion mit einem Phosphinothioesterpeptid durchgeführt werden, um längere Peptide und Proteine zu erzeugen.
Das Ligationsverfahren dieser Erfindung kann mit bekannten Varianten von Festphasenpeptidsynthesen kombiniert werden. Zum Beispiel können die Ligationsverfahren dieser Erfindung in den Synthesen von mehrfachen antigenen Peptiden (MAPs) eingesetzt werden, welche einen Lysin-basierten Verzweigungskern einsetzen. Siehe: Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998 85, 5409–5413.
In einer anderen spezifischen Ausführung ist eines von R^P oder R^B (von Schema 3) eine Peptid- oder Proteingruppe und das andere eine Kohlenhydratgruppe. Zum Beispiel kann R^B ein Mono-, Di-, Tri- oder Polysaccharid sein. In einer anderen spezifischen Ausführung ist eines von R^P oder R^B eine Peptid- oder Proteingruppe und die andere ist ein Nukleosid oder Nukleinsäure. In einer anderen Ausführungsform ist R^P oder R^B eine Peptid- oder Proteingruppe und die andere ein Lipid. In einer weiteren spezifischen Ausführung ist eines von R^P oder R^B eine Peptid- oder Proteingruppe und das andere eine Reportergruppe, ein Schwanz oder eine Markierung (z.B. eine Gruppe, deren Gegenwart durch optische Spektroskopie oder Massenspektroskopie oder andere instrumentelle Verfahren detektiert werden kann), einschließlich einer fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Gruppe, einer Isotopenmarkierung oder einer Radioaktivmarkierung.
Das Verfahren dieser Erfindung ist allgemein anwendbar zum Abfangen: d.h. Reagieren mit jedem Thioesterzwischenprodukt in einem Biosynthesestoffwechselweg. In dieser Hinsicht kann das Verfahren einfach verwendet werden, um Schwanz und/oder Markierung als Zwischenstufe zur Identifizierung zu identifizieren oder verwendet werden, um einzig Produkte durch Amidbindungsbildung zu synthetisieren. Das Verfahren kann zum Beispiel verwendet werden, um Thioesterzwischenstufen in Polyketidbiosynthesen abzufangen. Das resultierende Kopplungsprodukt kann auf biologische Aktivität getestet werden oder in der weiteren Synthese von biologisch aktiven Produkten verwendet werden, zum Beispiel Polyketide, die strukturverändert sind und möglicherweise in Abhängigkeit von natürlich auftretenden Polyketiden verändert sind.
Das Verfahren dieser Erfindung in jeder seiner Ausführungen kann unter Verwendung von Festphasenverfahren implementiert werden. Entweder der Phosphinothioesterreaktionspartner oder der Azidreaktionspartner können an ein festes Trägermaterial mit dem reaktiven Ende freibleibend geheftet werden. Ein an einen festen Träger gebundener Reaktionspartner mit einer reaktiven Phosphinothioestergruppe kann an ein freies Azid ligiert werden (d.h., wo der Azidreaktionspartner nicht an einen festen Träger ligiert ist). Ein an einem festen Träger mit einer reaktiven Azidgruppe gebundener Reaktionspartner kann an einen freien Phosphinothioester ligiert werden. Das Verfahren kann allgemein verwendet werden, um eine Amidbindung zwischen zwei biologischen Molekülen zu bilden, d.h. zwischen zwei Peptiden, zwischen einem Peptid und einem Kohlenhydrat (Saccharid, Zucker, usw.), zwischen einem Peptid und einem Nukleosid, zwischen einem Peptid und einem Lipid, usw. Spezifischer kann das Verfahren auf eine Ligation angewandt werden, wo eines der biologischen Moleküle an einen festen Träger geheftet ist (oder Harz). Ein Phosphinothioesterpeptidreaktionspartner, angeheftet an einen festen Träger über seinen N-Terminus kann zum Beispiel erzeugt werden durch Koppeln des C-Terminus des angehefteten Peptids an ein Phosphinothiol unter Verwendung eines Kopplungsreagenz wie DCC, Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-Pyrrolidino-Phosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP). Ein harzgebundenes Peptid mit einer Azidgruppe an seinem N-Terminus kann durch Reaktion von Trifyl-Azid oder ähnlichem Reagenz erzeugt werden.
Das Ligationsverfahren dieser Erfindung kann in der Reaktion von kombinatorischen Bibliotheken von Peptiden, Proteinen oder verschiedenen chemischen Spezies, die eine Amidbindung enthalten, eingesetzt werden. Das Ligationsverfahren dieser Erfindung kann auch in Kombination mit Verfahren nativer chemischer Ligation zur Bildung von Peptid- und Proteinprodukten von Interesse verwendet werden.
Am allgemeinsten führt die Erfindung zur Reaktion eines Phosphinothioesters und eines Azids. In spezifischen Ausführungen kann der Phosphinothioester unter Einsatz eines Phosphinothiolreagenzes hergestellt werden. Neue Phosphinothiole, die als Reagenzien in den Reaktionen dieser Erfindung verwendbar sind, werden bereitgestellt.
Die Erfindung ergibt auch Reagenzkits zum Ausbilden einer Amidbindung zwischen einem Phosphinothioester und einem Azid, welche eines oder mehrere Phosphinothiolreagenzien dieser Erfindung und insbesondere jene der verschiedenen hier beschriebenen Formeln umfassen. Zusätzlich können die Kits Reagenzien zum Ausbilden eines Azids enthalten. Die Kits umfassen optional Harz oder andere Festphasenmaterialien, die geeignet sind zum Durchführen der Ligation dieser Erfindung unter Verwendung von Festphasenverfahren. Der Kit kann auch ein Reagenz zum Erzeugen eines Thioesters umfassen, welches später zu einem Phosphinothioester umgewandelt werden würde. Der Kit kann auch optional Lösungsmittel oder andere Reagenzien zum Durchführen der Ligation sowie Anweisungen zum Durchführen der Reaktion und/oder Anweisungen zum Auswählen eines Phosphinothiolreagenzes für eine geeignete Ligation umfassen.
In einer spezifischen Ausführung ergibt die Erfindung einen Kit zur Synthese von Peptiden oder Proteinen, welcher eines oder mehrere Phosphinothiolreagenzien dieser Erfindung umfasst. Der Kit kann optional weiterhin eine oder mehrere Aminosäureseitenkettenschutzgruppen, eines oder mehrere Reagenzien zum Ausbilden eines Thioesters einer Aminosäure oder eines Peptids oder eines oder mehrere Reagenzien zum Erzeugen einer Azidogruppe von einer Aminosäure oder einem Peptid enthalten. Der Kit kann auch eine oder mehrere Aminosäuren, Aminosäurethioester oder Azidosäuren enthalten. Die Kits umfassen optional Harz oder andere Festphasenmaterialien, die zu Durchführung der Ligation dieser Erfindung unter Verwendung von Festphasenverfahren geeignet sind. Der Kit kann auch optional Lösungsmittel oder andere Reagenzien zum Durchführen der Ligation sowie Anweisungen zum Durchführen der Synthese und/oder Anweisungen zur Auswahl eines Phosphinothiolreagenzes für eine gewünschte Ligation umfassen. Reagenzkits dieser Erfindung umfassen solche, welche eine oder mehrere 2-Phosphinobenzothiole oder eines oder mehrere Phosphinomethanthiole umfassen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Veranschaulichung der Anwendung des Ligationsverfahrens dieser Erfindung auf die Proteinsynthese.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In dem Verfahren dieser Erfindung wird eine Amidbindung zwischen einem Phosphinothioester und einem Azid ausgebildet. Die Reaktion ist spurenfrei darin, dass keine Atome des Reagenzes in dem ligierten Produkt belassen werden. Die Reaktion ist nützlich in einer Vielzahl von Anwendungen zur Derivatisierung von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, zur Ligation verschiedener biologischer Moleküle (z.B. Peptide an Saccharide, Peptide an Lipide, Peptide an Peptide, Peptide an Nukleoside oder Nukleinsäuren, usw.) und insbesondere für die Synthese von Peptid und Proteinen.
Ohne an irgendeinen speziellen Mechanismus gebunden sein zu wollen, ist ein wahrscheinlicher Mechanismus für die Reaktion in Schema 6 veranschaulicht. Die Ligation beginnt durch Kopplung eines Phosphinothioesters mit einem Azid, was zur Bildung eines reaktiven Iminophosphorans und Stickstoffgas führt. Der Angriff von Iminophosphoranstickstoff an den Thioester führt zu einem Amidophosphoniumsalz. Die Hydrolyse des Amidophosphoniumsalzes erzeugt ein Amid und ein Phosphinoxid. Signifikant verbleiben keine Atome von dem Phosphinothiol in dem Amidprodukt; d.h. die Ligation ist spurenfrei. Schema 6 veranschaulicht die Bildung des Phosphinothioesters durch Transesterifizierung aus einem Thioester, hingegen sind andere Verfahren verfügbar, um verwendbare Phosphinothioester zu machen. Am allgemeinsten kann der Phosphinothioester durch Reaktion eines Phosphinothiolreagenzes mit einem aktivierten Carboxylsäurederivat gebildet werden. Ein "aktiviertes" Carboxylsäurederivat wird zum nukleophilen Angriff aktiviert, wie es im Stand der Technik verstanden wird und ist beispielhaft veranschaulicht durch Thioester, Acylhalide, Acylimidazole, aktivierte Ester und N-Acylsulfonamide (verwendet in bestimmten Safety-Catch-Verknüpfern).
Die Ligationsreaktionen dieser Erfindung sind beispielhaft veranschaulicht durch spezifische Reaktionen von Schema 7 und 8, welche ein o-Phosphinobenzothiol (R₁R₂PC₆H₄-o-SH), spezifisch o-(Diphenylphosphino)-Benzothiol (2) und ein Phosphinomethanthiol (R₁R₂P-CH₂-SH), spezifisch (Diphenylposphino)-Methanthiol 20, jeweils als Phosphinothiolreagenzien einsetzen.
Das o-Phosphinobenzothiol wurde zuerst als Reagenz ausgewählt, da es es ermöglicht, einen sechsgliedrigen Ring bei dem Übergangszustand zum Acyltransfer (siehe: Schema 6) auszubilden. Darüber hinaus erlaubt R₁R₂PC₆H₄-o-SH nicht die Bildung eines Episulfids und eines stabilen Amidophosphins (R₁R₂PNR'C(O)R'') durch C-P-Bindungsspaltung in dem Amidophosphoniumsalz, wie es ein Thiol wie R₁R₂PCH₂CH₂SH tun würde. Weiterhin ist von Thiophenol selbst bekannt, dass es Transesterifizierung von Thioestern bei nativer chemischer Ligation bewirkt (Dawson, P.E.; Churchill, M.; Ghadiri, M.R.; Kent, S.G.H. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 4325–4329). Die R-Gruppen an dem Phosphor (R₁ und R₂) werden als Elektronenabziehende Phenylgruppen gewählt, welche den Phosphor weniger nukleophil machen und dabei die Neigung des Phosphins zu schädlicher Oxidation durch O₂(g) zu minimieren.
Schema 6
Bei der in Schema 7 veranschaulichten Umwandlung wurde das Peptid AcPheGlyNHBn (5, worin R Benzyl (Bn) ist) aus einem Phenylalanylthioester (1, worin R Bn ist) und einem Glycylazid (4) durch die Wirkung von o-(Diphenylphosphino)-Benzothiol (2) synthetisiert. o-(Diphenylphosphino)-Benzothiol (2) wurde durch Reak tion von Chlordiphenylphosphin und ortho-Lithiertem Thiophenol hergestellt, wie beschrieben durch Block, E.;Ofori-Okai, G.; Zubieta, J. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111,2327–2329.) Thioester 3 (worin R ist Bn) wurde hergestellt in quantitativer Ausbeute durch die Transthioesterifizierung von Thioester (1, worin R Bn ist) mit einem Überschuss von Phosphinobenzothiol 2 in DMF, das Düsopropylethylamin (DIEA) enthielt. Phosphine sind bemerkenswerte Katalysatoren von Acylübertragungsreaktionen, Vedejs, E.; Diver, S. T. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115,3358–3359. Thioester 3 (worin R Bn ist) resultiert daher wahrscheinlich aus der Bildung eines Acylphosphoniumsalzes (Ph₂P⁺(C₆H₄-o-SH)C(O)R), gefolgt von intramolekularer P-zu-S-Acyl-Migration.
Schema 7
Überschüssiges Thiol wurde durch kovalente Immobilisieunrg an ein Merrifield-Harz (Chlormethylpolystyrol-Divinylbenzol) entfernt. Azid 4 (1 Äquivalent) wurde zu einer Lösung von Thioester 3 zugegeben (worin R Bn ist) in ungepuffertem THF : H₂O (3: 1) und die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur für 12 h gerührt. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 2 N HCl angesäuert und die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Chromatographie aus Silica-Gel ergibt gereinigtes Amid 5 (worin R Bn ist) bei 35% Ausbeute. Das andere Hauptprodukt war GlyNHBn, welches aus einer Staudingerreaktion hervorgehen kann (Staudinger et al., 1919). Ergebnisse der Reaktionen von Schema 7, worin R H ist, sind in Tabelle 1 angegeben.
Alternative Lösungsmittelbedingungen sind auch untersucht worden, um deren Wirkung auf die Kopplungseffizienz von Thioester 3 und Azid 4 zu bestimmen. Die Reaktion wurde in THF: H₂O (3: 1), gepuffert bei pH 2, 4, 8, und 13.5 durchgeführt. Die Reaktion wurde auch in Methylenchlorid oder Dimethylformamid durchgeführt„ gefolgt von saurer wässriger Aufarbeitung. Produktausbeuten unter diesen Bedingungen waren ähnlich zu jenen in ungepuffertem THF:H20 (3: 1). Die Ligation war auch wirksam zum Koppeln von Azid 4 mit dem o-Phosphinobenzolthioester von N-Acetylglycin (R=H in Schema 7).
Amid 5 könnte durch einen anderen Mechanismus gebildet worden sein, der in Schema 6 veranschaulicht ist. Spezifisch könnte das Amidprodukt der Ligation in der Theorie aus der Reduktion des Azids, gefolgt durch Acyltransfer auf das resultierende Amin, hervorgerufen worden sein. Dieser Mechanismus wurde (zumindest als ein Hauptstoffwechselweg) durch ein Kontrollexperiment ausgeschlossen, in welchem Thioester 3 und authentisches GlyNHBn unter Bedingungen (Reaktionspartner, Konzentration, Lösungsmittel, Temperatur und Zeit) gemischt wurde, die identisch zu jenen waren, die zum bewirken der Ligation von Thioester 3 und Glycl-Azid 4 verwendet wurden. Kein Nachweis der Bildung von Amid 5 wurde beobachtet.
Phosphinothiol 2 hat ausreichende Eigenschaften, um die Ligation dieser Erfindung zu bewirken. Die Reaktionsausbeuten unter Verwendung dieses Phosphinothiolreagenzes waren gering, was das Ergebnis der niedrigen Wasserlöslichkeit von Phosphinothiol 2 sein kann. Die Ausbeuten können durch Optimierung von Lösungsmittel für die Reaktion oder durch Verwendung von Reagenzien verbessert werden, die höhere Löslichkeit in einer wässrigen Lösung haben. Die Ligation mit Phosphinothiol 2 tritt bei einem Übergangszustand mit einem sechsgliedrigen Ring (Schema 6) auf. Die Verminderung der Größe dieses Rings in dem Übergangszustand würde den nucleophilen Imidstickstoff näher an den elektrophilien Thioesterkohlenstoff bringen und zu verbesserten Ausbeuten für die Ligationsprodukte führen.
Die Wirkung eines kleineren Ringübergangszustandes wurde bei den Ligationsreaktionen von Schema 8 unter Verwendung des Phosphinothiols 20 eingeschätzt, welches einen fünfgliedrigen Ringübergangszustand bilden sollte. Thioester von 20, abgeleitet von AcOH, AcGlyOH, und AcPheOH wurden entweder durch Transthioesterifizierung oder Koppeln mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) hergestellt. Nachdem diese Reaktionen durch TLC-Analyse vervollständigt waren, wurde Merrifield-Harz verwendet, um reagiertes Phosphinothiol zu immobilisieren. Nach Aufarbeitung und Chromatographie wurden die gereinigten Thioester in > 90% Ausbeuten isoliert.
Um die Ligation zu bewirken wurde jeder Thioester mit N₃CN₂C(O)NHBn (1 Äquivalent) in THF/H2O (3: 1) bei Raumtemperatur für 12 h gerührt. Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt und die Amidprodukte wurden durch Chromatographie gereinigt. Die Amidproduktausbeuten, die unter Verwendung von Phosphinothiol 20 erhalten wurden, sind viel größer als jene , die unter Verwendung von Phosphinothiol 2 erhaltenen (Siehe: Tabelle 1). AcGlyNHBn wurde bei 91 % isolierter Ausbeute unter Verwendung von 20 erhalten, verglichen mit einer Spurenausbeute mit 2. AcGlyGlyNHBn wurde in 80% Ausbeute unter Verwendung von 20 erhalten, verglichen mit 15% unter Verwendung von 2. AcPheGlyNHBn wurde in 92% Ausbeute mit 20 erhalten, verglichen mit 35% mit 2. Tabelle 1 fasst die Ausbeuten zur Ligation unter Verwendung der Phosphinothiole 2 und 20 zusammen.
Ein anderer Vorteil der Verwendung von Phosphinothiol 20 ist, dass das Reagenz aus seinem Phosphinoxide regeneriert werden kann durch Reduktion mit einem Überschuss von Trichlorsilan in Chloroform.
Tabelle 1: Ausbeuten für Ligationen mit Phosphinothiolen 2 und 20
Die dramatischen Verbesserungen bei Ausbeute, die beobachtet wurden, zeigen an, dass Phosphinothiol 20 ein überlegenes Reagenz zum Bewirken der Ligation eines Thioesters und eines Azids ist, um ein Amid zu bilden. Hingegen schätzten Bertozzi und Mitarbeiter (Saxon, E.; Armstrong, J.L.; Bertozzi, C.R. Org. Lett. 2000, 2, 2141–2143), dass das Vermögen der Oxo-Analoga von Phosphinothioen 2 und 20 eine Staudinger-Ligation bewirken würde. Überraschend fanden sie, dass Ph₂PC₆H₄-o- OH eine höhere Ausbeute ergibt als Ph₂PCH₂OH. Die Basis dieser scheinbaren gegenpoligen Reaktivität von Thioestern und Estern ist unklar.
Die hohen mit Phosphinothiol 20 erhaltenen Ausbeuten können aus der Nähe des Nucleophils und Elektrophils in diesem Reagenz herrühren. Der unmittelbare Schlüssel bei dieser Ligation wird vermutet, das Iminophosphoran (Schema 6) zu sein. Der Übergangszustand, der vom Iminophosphoran von 20 zu dem Amidophosphoniumsalz führt, enthält einen fünfgliedrigen Ring. Sowohl C-S- als auch P-N-Bindungen in diesem Ring haben signifikant Doppelbindungscharakter. Daher kann das Aminophosphoran relativ wenige Konformationen einnehmen. Im Gegensatz dazu verläuft die Reaktion von N₃(CH₂)₁₀C(O)SPy und PBu₃, um ein Lactam zu bilden, über einen Übergangszustand mit einem 12-gliedrigen Ring (Bosch, I; Romea, P; Urpi, F; Vilarassa, J. Tetrahedron Lett. 1993 34:4671–4674). Die Ausbeute dieser Reaktion ist nur 28 %.
Ein anderer Faktor, der zu den hohen mit Phosphinothiol 20 erhaltenen Ausbeuten beitragen würde, ist eine stabile Konformation, die Amidbildung erleichtert. Molekularmechanismenberechnungen zeigen, dass die Iminophosphoran-Zwischenstufe eine β-Turn-artige Konformation annehmen kann. Eine β-Turn ist stabilisiert durch eine O···HN-Wasserstoffbindung, welche einen 10-gliedrigen Ring definiert. Die Thioester-, Imid- und Amidgruppen des Iminophosphorans sind an Positionen gelegen, die drei Amidgruppen in einer β-Turn entsprechen. In dieser Konformation ist der nucleophile Imid Stickstoff innerhalb von 3,0 Å von dem elektrophilen Thioesterkohlenstoff. Darüber hinaus würde die O···HN-Wasserstoffbindung den Thioester polarisieren, wobei er seinen Kohlenstoff noch elektrophiler macht. Schließlich könnte die Ansammlung der beiden Phenylgruppen Acylüberführung durch Verstärken der Iminophosphoranfraktion in der β-Turn-artigen Konformation beschleunigen (Als Beispiele des "reaktiven Rotamereffekts", siehe: (a) Bruice, T.C.; Pandit, U.K. J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 5858–5865. (b) Jung, M.E.; Gervay, J. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 224–232). Diese günstige Konformation würde unzugänglich bei einer Ligation mit 2 sowie bei der Ligation eines Thioesters mit einem Nicht-Peptidylazid.
Phosphinothiol 20 hat einen zusätzlichen intrinsischen Vorteil gegenüber Phosphinothiol 2. Im Allgemeinen haben aliphatische Thiole (wie 20) höhere pKa-Werte als aromatische Thiole (wie 2). Da Thioesterhydrolysegeschwindigkeiten umgekehrt mit deren Thiol-pKa-Werten korrelieren (Janssen, M. J. The Chemistry of Carboxylic Acids and Esters; Patai, S., Ed.; Interscience Publishers; New York, 1969, S. 730–736), haben aliphatische Thioester eine längere Halbwertszeit in wässriger Lösung. Diese längere Halbwertszeit ist wichtig, da die Hydrolyse der Thioester entweder vor oder nach Iminophosphoranbildung wahrscheinlich eine kompitierende Nebenreaktion für die Ligation sein wird.
Daher ist die Wahl des Phosphinothiolreagenzes ein wichtiger Aspekt beim Durchführen der Ligation eines Thioesters und eines Azids dieser Erfindung. Ein bei dieser Erfindung verwendbares Phosphinothiol hat die allgemeine Struktur:
worin:
n und m 0 oder ganze Zahlen gleich 1–3, einschließlich, und n + m = 0 – 4, sind; die gestrichelte Linie anzeigt, dass die Doppelbindung vorliegen kann oder dass die Bindung Teil einer aromatischen Gruppe sein kann (R₄, R₆ und R₈ sind nicht vorliegend, wenn es eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffen gibt oder die Bindung Teil eines aromatischen Rings ist, wie angezeigt);
R₁ und R₂ unabhängig gewählte Gruppen sind aus aliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sind mit Halogeniden (insbesondere F oder Cl), OH-, OR-, COH-, COR-, COOH-, COOR- oder n(R')₂-Gruppen, worin R, unabhängig von anderen R eine aliphatische, allzyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizykli sche, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist, R und R' im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein können für R₁ und R₂; in R₁ und R₂ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können durch O, S, CO, COO oder CONR' und R₁ und R₂ zusammen einen Ring bilden können , der das P-Atom einschließt, und
R₃–R₈ unabhängig gewählt sind unter Wasserstoff, aliphatischen alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sein können wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, bei R₃–R₈ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können mit O-, S-, CO-, COO- oder CONR'-Gruppen, wobei jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, welche optional wie oben aufgelistet substituiert ist für R₁ und R₂ und worin zwei oder mehr R₃–R₈ kovalent gebunden sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe.
R₁- und R₂-Gruppen umfassen unter anderem Alkylgruppen, Alkenylgruppen, zyklische Alkylgruppen, zyklische Alkenylgruppen, bizyklische Gruppen, aromatische Gruppen, heteroaromatische Gruppen, Ethergruppen, Estergruppen, Amidgruppen, Thioethergruppen und Ketongruppen.
Es ist bevorzugt, dass R₅–R₈ nicht alle Wasserstoffe sind. Es ist auch bevorzugt, dass n + m = 0, 1 oder 2 ist. In spezifischen Ausführungen sind R₃ und R₄ beide Wasserstoffe und n und m beide Null.
In spezifischen Ausführungen hat das Phosphinothiol die Formel:
worin R₁ und R₂ aromatische oder heteroaromatische Gruppen sind, welche optional substituiert sind wie oben beschrieben und R₃ und R₄ sind wie oben beschrieben. R₃ und R₄ sind vorzugsweise Wasserstoffe. R₁ und R₂ sind vorzugsweise Elektronenabziehende Gruppen, einschließlich Phenylgruppen und substituierte Phenylgruppen. Eines von R₃, und/oder R₄ und R₂ können kovalent gebunden sein, um einen heteroaromatischen Ring zu bilden, der mit Gruppen wie oben aufgelistet substituiert sein kann.
In anderen Ausführungen kann das Phosphinothiol die Formel haben:
worin R₁–R₆ wie oben definiert sind, R₁ und R₂ und/oder R₄ und R₅ sind optional kovalent verknüpft, um einen alicyclischen oder aromatischen Ring zu bilden, worin die gestrichelte Linie zwischen Kohlenstoffen eine optionale Doppelbindung oder Teil eines aromatischen Rings anzeigt, R₃ und R₆ sind nicht vorhanden, wenn es eine Doppelbindung zwischen Kohlenstoffen gibt wie angezeigt.
In einer anderen Ausführung hat das Phosphinothiol die Struktur:
worin R₁–R₈ wie oben definiert sind und R₁–R₂, oder R₄–R₅, oder R₅–R₇, R₄–R₇ oder R₄–R₅–R₇ optional kovalent verknüpft sind, um einen alicyklischen oder aromatischen Ring zu bilden.
In weiteren Ausführungen hat das Phosphinothiol die Struktur:
worin n und m 0 oder 1 sind, R₁ und R₂ wie oben definiert sind, und X₁–X₄ Substituenten an der aromatischen Gruppe sind, von denen zwei kovalent verknüpft sein können, um einen alizyklischen oder aromatischen Ring zu bilden, X₁–X₄ aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppen sein können oder Halogenid, OH, OR, COR, COOH, COOR sein können (worin R aliphatisch, alizyklisch oder aromatisch ist) oder N(R')₂-Gruppe ist, worin jedes R' unabhängig von dem anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist und R und R' wie oben für R₁ und R₂ aufgelistet optional substituiert sind.
In einer anderen Ausführung hat das Phosphinothiol die Struktur:
worin R₁ und R₂ wie oben definiert sind und M einen alizyklischen, einschließlich einen bizyklischen oder aromatischen, einschließlich eines heteroaromatischen Rings darstellt; M einen Phenylring, Naphthalin (oder anderen verschmolzenen Ring), ein Pyridin (oder anderen heteroaromatischen Ring) oder ein Cyclohexen (oder anderen alizyklischen Ring) und R₁ und R₂ optional kovalent verknüpft sind, um einen phosphorhaltigen Ring zu bilden.
Spezifische Beispiele dieser Struktur umfassen:
worin X₁–X₄, wenn vorliegend, Substituenten an dem heteroaromatischen Ring sind und unabhängig gewählt werden können unter einem Wasserstoff, einem Halid, einer Alkylgruppe, einer aromatischen Gruppe, einer OR-, COR- oder COOR-Gruppe, worin R ein Wasserstoff, eine aliphatische Gruppe, eine alizyklische Gruppe, eine aromatische Gruppe, eine CONR'- oder N(R')₂-Gruppe ist, worin jedes R' unabhängig von anderen R' Wasserstoff oder eine aliphatische oder aromatische Gruppe sein kann.
In zusätzlichen spezifischen Ausführungen umfassen die Phosphinothiolreagenzien dieser Erfindung:
worin R₁, R2, X₁–X₄ wie oben definiert sind; und
worin R₁ und R₂ wie oben definiert sind, die gestrichelte Linie eine optionale Doppelbindung anzeigt und X₁–X₁₀, wenn vorliegend, Wasserstoff, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppen sein können oder Halid, OH, OR, COR, COOH, COOR (worin R aliphatisch, alizyklisch oder aromatisch ist), CONR' oder N(R')₂-Gruppen sein können, worin R' unabhängig von anderen R' Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppen sind, R und R' optional substituiert sind wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, Substituenten, in Anführungszeichen, nicht vorliegen wenn die Doppelbindung vorliegt.
R₁- und R₂-Gruppen in dem Phosphinothiolreagenz werden im Allgemeinen gewählt, um das Ansteigen freier Energie des Übergangsreaktionszustandes zu vermeiden unter Vermeidung ungünstiger sterischer oder elektronischer Interaktionen und um Löslichkeit in sowohl organischen Lösungsmitteln (für deren Synthese) und wässrigen Puffern (für Anwendungen) zu ergeben. Polyethylenglykolgruppen können zum Beispiel verwendet werden, um Löslichkeit sowohl in organischen Lösungsmitteln als auch wässrigen Lösungen zu verleihen. Beispielhaft umfassen R₁- und R₂-Gruppen die Polyethergruppen:
worin p 0 oder eine ganze Zahl ist, reichend von 1 bis etwa 10, einschließlich, vorzugsweise ist p 1 bis einschließlich 4. und R ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe. Kohlenstoffe in den Polyethergruppen werden optional mit Haliden oder kleinen Alkylgruppen substituiert. In spezifischen Ausführungsformen sind Phosphinothiolreagenzien dieser Erfindung, in welchen R₁ und R₂ Phenylgruppen sind, können diese Phenylgruppen mit einer oder mehreren Polyethergruppen substituiert werden, um die Löslichkeit des Reagenzes in Wasser zu verstärken.
In anderen spezifischen Ausführungen haben Reagenzien dieser Erfindung die Formeln:
worin p1 und p2 Null oder ganze Zahlen, reichend von 1 bis etwa einschließlich 10 sind, R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist. Die ganzen Zahlen p1 und p2 bevorzugt die gleichen sind, vorzugsweise von 1 bis einschließlich 4 reichend.
Diese Phosphinatreagenzien sind von besonderem Interesse als wasserlösliches Thiolreagenz zur Verwendung in Ligationen dieser Erfindung. Dieser Reagenztyp kann über das Phosphoramidit PCl₂(N(C₂H₅) ₂ ) synthetisiert werden, welches vorher verwendet worden ist, um Alkohole zu phosphorylieren (Perch, J.W.; und Johns, RB 1988 Synthesis-Stuttgart 2, 142–144). Nachdem das Phosphoramidit mit monogeschütztem Tetraethylenglykol reagiert hat, welches kommerziell verfügbar ist, wird N(C₂H₅)₂-Substituent durch Cl ersetzt. Ortho-Lithierung mit Thiophenol und Entschützen ergibt das gewünschte Phosphinat:
Im Allgemeinen können die R₁- und R₂-Gruppen, die Polyethergruppen enthalten, durch Verfahren synthetisiert werden, die im Stand der Technik von bereits erhältlichen Startmaterialien bekannt sind.
Die Reaktivität des Phosphinothiolreagenzes kann eingestellt werden durch Wahl der Substituenten R₁ und R₂, wie im Stand der Technik bekannt. Im Allgemeinen werden diese Gruppen gewählt, um die gewünschte Reaktivität mit einer ausgewählten Azid basierend, wenigstens teilweise auf der elektronischen und sterischen Eigenschaften des Azids, zu erhalten und um die Sensitivität des Reagenzes gegenüber Sauerstoff zu minimieren. Reagenzien, die gegenüber Sauerstoff sensitiver sind, sind im Allgemeinen schwierig zu handhaben und erfordern mehr Sorgfalt bei der Anwendung, um ungewünschte Sauerstoffgehalte zu vermeiden, die die Effizienz des Reagenzes zerstören oder vermindern können. Hingegen können Ligationen mit weniger reaktivem Azid wie Aziden von Glycosiden signifikant durch Verwendung von reaktiveren Phosphinothiolreagenzien verbessert werden. Zum Beispiel kann die Verwendung von n-Alkylgruppen wie n-Butylgruppen als R₁- und R₂-Gruppen signifikant die Reaktivität des Reagenzes erhöhen.
In einem zusätzlichen Beispiel können die Substitution von Elektronendonorgruppen (wie Alkoxygruppen in geeigneten Ringpositionen wie im Stand der Technik bekannt) oder Elektronen-abziehenden Gruppen (wie NO₂-Gruppen in geeigneten Ringpositionen wie im Stand der Technik bekannt, insbesondere p-NO₂) an Phenylgruppensubstituenten der Phosphinothiolreagenzien verwendet werden, um die Reaktivität der Reagenzien abzustimmen. Zusätzlich werden die Elektronen-abziehenden Gruppen dazu neigen, die Reaktivität und Addition von Elektronendonorgruppen an Phenylsubstituenten zu vermindern, welche dazu neigen die Reagenzreaktivität zu verstärken.
Phosphinothiolreagenzien, die in dieser Erfindung verwendbar sind, können durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren aus bereits erhältlichen Ausgangsmaterialien angesichts der Lehren hierin hergestellt werden.
Reagenzien dieser Erfindung können in Kit-Form bereitgestellt werden, optional umfassend Lösungsmittel für eine gewünschte Reaktion, optional umfassend Anwei sungen zum Ausführen der Reaktion sowie optional umfassend eines oder mehrere Azid- oder Thioesterreagenzien. Ein Kit kann Reagenzien zum Erzeugen von Thioestern und/oder Aziden umfassen. Ein Reagenzkit kann auch eines oder mehrere Phosphinothiolreagenzien enthalten, die eine Markierungsgruppe, einen Schwanz oder ein Reportermolekül zum Koppeln an eine Aminosäure, Peptid oder Protein tragen. Reagenzkits können zum Beispiel Gefäße oder andere Behälter umfassen, die abgemessene relative Mengen an Bestandteilen zum Ausführen einer ausgewählten Reaktion umfassen. Die Reagenzien können verpackt und abgemessen werden zur Verwendung in einer einzigen Ligationsreaktion oder verpackt und abgemessen für eine schrittweise Synthese, die zwei oder mehr Aminosäuren, Peptide oder Proteinfragmente ligiert.
Die Synthese des zuvor unbekannten Phosphinothiols 20 ist unten in Beispiel 2 beschrieben und in Schema 9 veranschaulicht. Phenylmagnesiumbromid wurde zur Chlormethylphosphondichlorid 23 gegeben und die resultierende Grignard-Reaktion ließ man für 12 Stunden unter Rückfluss laufen, um Phosphinoxid 24 zu ergeben. Das Gemisch 24 mit Thioessigsäure und Triethylamin in trockenem THF wurde bei Rückfluss für 12 Stunden geheizt (Lamoureux, G.V.; Whitesides, G.M. J. Org. Chem., 1993, 58, 633–641; Woycechowsky, K.J.; Wittrup, K. D.; Raines, R. T. Chem. Biol. 1999, 6, 871–879). Nach Reinigung durch Flashchromatographie bzw. Blitzchromatographie und Behandlung mit Aktivkohle, wurde Thiophosphinoxid 25 in einer kombinierten Ausbeute von 54 % für die beiden Schritte isoliert. Ein Überschuss an Trichlorsilan in Chloroform für 72 Stunden wurde verwendet, um 25 zu Phosphinothioester 26 zu reduzieren, welcher durch Flashchromatographie bzw. Blitzchromatographie in nahezu quantitativer Ausbeute isoliert wurde. Die Hydrolyse des Phosphinoesters 26 (Charrier, C.; Mathey, F. Tetrahedron Lett. 1978, 27, 2407–2410) mit Natriumhydroxid in Methanol für 2 Stunden ergab Phosphinothiol 20. (Hydrolyse unter sauren Bedingungen war nicht erfolgreich.) Bei dieser Reaktion wurde Ar(g) durch das Reaktionsgemisch gesprudelt, um die Oxidation des resultierenden Thiols zu vermeiden. Phosphinothiol 20 wurde durch Chromatographie über Aluminiumoxid gereinigt und in 74 % Ausbeute isoliert. Die Gesamtausbeute für das Verfahren in Schema 9 war 39 %.
Schema 9
Die folgenden Ausdrücke haben die angezeigte Bedeutung in der Beschreibung und den Ansprüchen:
Der Ausdruck aliphatisch betrifft Kohlenwasserstoffe, welche gesättigt oder ungesättigt sind (Alkane, Alkene, Alkyne) und welche geradkettig oder verzweigt sein können. Aliphatische Gruppen können optional mit verschiedenen Substituenten oder funktionellen Gruppen substituiert sein, unter anderem einschließend Halide, Hydroxygruppen, Thiolgruppen, Estergruppen, Ketongruppen, Carboxylsäuregruppen, Amine und Amide. Eine heteroaliphatische Gruppe ist eine aliphatische Gruppe, die eines oder mehrere Nicht-Kohlenstoffatome in der Kohlenwasserstoffkette enthält (zum Beispiel eine oder mehrere benachbarte CH₂-Gruppen werden ersetzt durch O, S oder NH).
Der Ausdruck alizyklisch betrifft Kohlenwasserstoffe, die einen oder mehrere ungesättigte Ringe haben (z.B. drei- bis zehngliedrige Ringe) und welche bizyklisch sein können. Alizyklische Gruppen können Anteile einschließen, die verzweigt- und/oder geradkettig aliphatisch sind in Kombination mit einem zyklischen Kohlenwasserstoff. Alizyklische Gruppen können substituiert sein wie oben bemerkt für aliphatische Gruppen. Eine heteroalizyklische Gruppe ist eine alizyklische Gruppe, die eines oder mehrere Heteroatome (Nicht-Kohlenstoffatome) in der Kohlenwasserstoffkette, in einem Ring oder in einem geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Anteil einer alizyklischen Gruppe enthält (z.B. können eine oder mehrere benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein durch O, S oder NH).
Der Begriff aromatisch betrifft Kohlenwasserstoffe, die einen oder mehrere aromatische Ringe umfassen, welche fusionierte Ringe sein können (z.B. in einer Naphthalingruppe). Aromatische Gruppen können Anteile einschließen, die verzweigt und/oder geradkettig, aliphatisch und/oder alizyklisch sind in Kombination mit Aromaten.
Aromatische Gruppen können substituiert sein wie oben für aliphatische Gruppen bemerkt. Eine heteroaromatische Gruppe ist eine aromatische Gruppe, welche eines oder mehrere Heteroatome (Nicht-Kohlenstoffatome) in einem aromatischen Ring enthält (z.B. ein Pyridinring). Ein CH in einem aromatischen Ring kann ersetzt sein mit O, S oder N. In jedem alizyklischen oder aliphatischen Anteil der aromatischen Gruppe können eine oder mehrere benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt werden durch ein Heteroatom (z.B. O, S, NH).
Aliphatische, alizyklische, aromatische Gruppen und die entsprechenden Heteroatom-haltigen Gruppen können auch mit funktionellen Gruppen wie oben bemerkt substituiert sein. Aromatische Ringe können zum Beispiel substituiert sein mit Elektronengebenden oder Elektronen-abziehenden Gruppen wie gewünscht. Elektronengebende und Elektronen-abziehende Gruppen sind dabei im Stand der Technik gut bekannt.
Gewöhnliche Aminosäuren sind jene 20 Aminosäuren, die gewöhnlich in natürlich vorkommenden Peptiden und Proteinen gefunden werden und umfassen: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Cystein, Lysin, Arginin, Histidin, Asparaginsäure und Glutaminsäure. R^A-Gruppen umfassen unter anderem Seitenketten oder Seitengruppen von gewöhnlichen Aminosäuren.
Ungewöhnliche Aminosäuren, die in Proteinen gefunden werden, umfassen solche mit hydroxylierten, alkylierten, phosphorylierten, formylierten und acylierten Seitengruppe und umfassen unter anderem insbesondere 4-Hydroxyprolin, 3- Methylhistidin, 5-Hydroxylysin, o-Phosphoserin, Carboxyglutamat, Acetyllysin und N-Methylarginin. Aminosäurederivate mit biologischer Aktivität umfassen unter anderem α-Aminobuttersäure, Thyroxin, Citrullin, Ornithin, Homocystein, S-Adenosylmethionin, β-Cyanoalanin und Azaserin. R^A-Gruppen können Seitengruppen oder Seitenketten gewöhnlicher und ungewöhnlicher Aminosäuren und Seitengruppen von biologisch aktiven Derivaten von Aminosäuren umfassen, welche mit einem oder mehreren Haliden, Hydroxylen, Akylgruppen, Thiolen, geschützten Thiolen, Aminogruppen, geschützten Aminogruppen, Acetyl-, Ester- oder Carboxylsäuregruppen substituiert sind.
Das Verfahren dieser Erfindung kann auch eingesetzt werden, um zwei oder mehrere Aminosäuren zu ligieren, die elektrophile Seitengruppen tragen wie Alkylhalidseitengruppen oder Epoxidseitengruppen zusammen oder eine oder mehrere dieser Aminosäuren in ein Peptid oder Protein einverleiben. Einverleiben solcher Aminosäuren ist schwierig mit konventionellen Peptidsynthesen aufgrund des Bedarfs, die Fmoc-Schutzgruppe mit einer Base (typischerweise Piperidin) zu entfernen. Die Base kann auch als Nukleophil wirken, dass die elektrophile Seitenkette angreift. Zum Beispiel könnte eine Aminosäure mit einer elektrophilen Seitenkette durch Zusetzen einer Azidsäure gemacht werden, die eine elektrophile Seitenkette als Endmonomer eines synthetischen Peptids enthält. Entschützen dieses Peptids und Spalten von dem Harz würde ein Azidpeptid ergeben, das eine elektrophile Seitenkette trägt, welche dann unter Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung an ein anderes Peptid oder Protein ligiert werden könnte, das eine Phosphinothioestergruppe trägt.
Aminosäuren, die durch das Verfahren dieser Erfindung ligiert werden können, schließen solche ein, welche durch ein spezielles Isotop angereichert sind, zum Beispiel ¹³C- oder ¹⁵N-angereicherte Aminosäuren. Isotopen angereicherte Aminosäuren, die eingesetzt werden können, umfassen gewöhnliche oder ungewöhnliche Aminosäuren, β-Aminosäuren und Aminosäuren mit elektrophilen Seitengruppen.
Gewöhnlich in Proteinen und Peptiden gefundene Aminosäuren sind L-Aminosäuren. Die Erfindung wird hingegen mit D-Aminosäuren sowie Peptiden und Proteinen, die D-Aminosäuren enthalten. Reagenzien, die R^A-Gruppen umfassen, können chiral nichtracemisch, racemisch oder achiral sein. Zur Synthese der gewünschten Peptide und/oder Proteine kann ein Reagenz mit geeigneter Chiralität einfach ausgewählt werden und solche sind bereits verfügbar. Reaktive funktionale Gruppen an R^A-Gruppen können mit geeigneten Schutzgruppen wie im Stand der Technik bekannt geschützt werden. Schutzgruppen umfassen unter anderem Acetylgruppen, Benzylgruppen und andere Schutzgruppen, einschließlich jener, die typischerweise im Stand-der-Technik-Verfahren oder Peptidsyntheseverfahren eingesetzt werden. Fachleute können eine Stand-der-Technik-Schutzgruppe zur Verwendung mit einer vorgegebenen funktionalen Gruppe und einem vorgegebenen Satz von Reaktionsbedingungen auswählen.
Die Ligation, wie hierin beispielhaft veranschaulicht, kann verwendet werden, um ein Peptid oder ein Protein zu erzeugen. Peptide können, wie in Schema 5 veranschaulicht, synthetisiert werden durch wiederholte Zyklen von Ligation, um Amidbindungen zwischen Aminosäuren zu bilden. In einer spezifischen Ausführung kann Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren implementiert werden, in welchen die Aminosäure kovalent an einen festen Träger oder Harz geheftet ist. Eine Vielzahl von Harzen ist im Stand der Technik zur Verwendung in Kombination mit dem Ligationsverfahren dieser Erfindung verfügbar. Zum Beispiel Tentagel, PEGA oder andere Harze, die verträglich mit der Verwendung in sowohl organischen als auch wässrigen Lösungsmitteln sind, sind in Kombination mit den Ligationsverfahren dieser Erfindung verwendbar.
Das Ligationsverfahren dieser Erfindung kann mit konventionellen Verfahren zum sequenziellen Zugeben von Aminosäuren kombiniert werden zu einer wachsenden Peptidkette an einem festen Träger oder Harz. Zum Beispiel kann konventionelle Fmoc-Chemie kombiniert werden mit einem oder mehreren Ligationsschritten, welche die Phosphinothioester- und Azidreagenzien dieser Erfindung einsetzen. In einem speziellen Beispiel können eine oder mehrere β-Aminosäuren oder eine oder mehrere Aminosäuren mit elektrophilen Seitengruppen in eine Peptidkette eingeführt werden, die durch konventionelle Verfahren (z.B. Fmoc-basierte Chemie) unter Verwendung des Ligationsverfahrens dieser Erfindung synthetisiert wird.
1 veranschaulicht einen exemplarischen Ansatz zum Proteinaufbau unter Einsatz des Ligationsverfahrens dieser Erfindung in Kombination mit Festzustandsver fahren. In diesem Ansatz wird zuerst Peptid 100 über seinen C-Terminus an ein Harz 101 über Thioesterverknüpfung angeheftet. Das erste Peptid wird an seinem N-Terminus mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt. Dieses erste Peptid kann zum Beispiel durch konventionelle Festzustandspeptidsyntheseverfahren synthetisiert werden, zum Beispiel Fmoc-Verfahren. Das gebundene erste Peptid (100) wird reagiert mit einem Phosphinothiolreagenz 102 wie 2 oder 20, welches N-terminales geschütztes Peptid von dem Harz als Phosphinothioester 104 freisetzt.
Ein zweites Peptid 105 wird an ein Harz 101' an seinem C-Terminus angeheftet und welches ein ungeschütztes NH₂ an seinem N-Terminus (nach Entschützen) hat, wird mit Azidsäure 106 reagiert, um ein harzgebundenes Peptid 107 mit einer Azidgruppe an seinem N-Terminus zu bilden. Das Azido-N-terminierte Peptid 107 wird dann mit ungebundenem N-terminal geschützten Phosphinothioester 104 reagiert, begleitet durch Hydrolyse und Verlust von Stickstoff, um eine Amidbindung zu bilden, welche die ersten und zweiten Peptide 108 ligiert. Das ligierte Peptid bleibt an das Harz geknüpft.
Zusätzliche Zyklen von:
Entschützen des N-Terminus des ligierten Peptids 108;
Reagieren des entschützten Peptids mit einer Azidsäure, um ein harzgebundenes Peptid zu erzeugen mit einer Azidsäure an seinem N-Terminus 107; und
Reagieren des harzgebundenen Azidsäurepeptids mit Phosphinothioester 104 mit Hydrolyse und Stickstoffverlust, um harzgebundenes ligiertes Peptid 108 zu erzeugen,
Zugabe von Peptiden zu einer wachsenden Peptidkette. Die Zyklen werden fortgesetzt, bis das gewünschte größere Peptid oder Protein synthetisiert ist.
In dem Ansatz von 1 werden reaktive (oder potenziell reaktive) Seitenketten oder Seitengruppen von Aminosäuren oder Peptiden, die zu ligieren sind, vor Reaktion unter Verwendung geeigneter Schutzgruppen geschützt. Nachdem das gewünschte größere Peptid oder Protein synthetisiert ist, werden die Seitenketten schützenden Gruppen entfernt (Entschützen) unter Verwendung konventioneller Verfahren und Reagenzien. Das größere Peptid oder Protein wird optional Bedingungen unterzogen, welche eine gewünschte Faltung erleichtern und das Peptid- oder Prote inprodukt wird optional von dem Harz abgespalten. Wohlgemerkt kann die Proteinfaltung auch nach Abspalten des Proteins von dem Harz vollbracht werden.
Peptide, die durch konventionelle Festzustandsverfahren gebildet werden, reichen in der Länge typischerweise von etwa 30 bis 50 Aminosäuren, so dass ein Protein von etwa 300 Aminosäuren Länge etwa 8 bis 10 Additionszyklen erfordern würde.
Peptidthioester können aus konventioneller Festphasenpeptidsynthese kommen (z.B., Fmoc-basierte Festphasensynthese) (Ingenito, R.; Bianchi, E.; Fattori, D.; Pessi, A. J Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11369–11374; Shin, Y.; Winans, K. A.; Backes, B. J.; Kent, S. B. H.;Ellman, J. A. Bertozzi, C. R. J.Am. Chem. Soc.1999, 121, 11684–11689 ; Swinnen, D.; Hilvert, D. Org. Lett. 2000, 2, 2439–2442) oder rDNA-Technologie (Muir et al., 1998; Evans, Jr., et al., 1998; Ayers, et al., 2000; Holford et al., 1998; Cotton et al., 1999; Evans, Jr., 2000). Alternativ können Peptide aus natürlichen, z.B., als Proteinfragmente, oder durch Expression in rekombinanten Systemen erzeugt werden. Diese Peptide können derivatisiert werden zu Thioester unter Verwendung konventioneller Reagenzien und Verfahren. Peptide aus welcher Quelle auch immer können derivatisiert werden (an deren N-Terminus mit Azid, z.B. durch Reaktion der α-Aminogruppe eines geschützten Peptids mit CF₃SO₂N₃. (Zaloom, J.; Roberts, D. C. J.Org Chem. 1981, 46, 5173–5176). Azidgruppen können auch zu den Peptidaminogruppen durch konventionelle Reagenzien und Verfahren zugegeben werden.
Feste Trägermaterialien, z.B. Harz, die zur Verwendung in organischen und wässrigen Lösungsmitteln geeignet sind, wie sie in den Ligationen dieser Erfindung eingesetzt werden, sind im Stand der Technik bekannt und ein Durchschnittsfachmann kann leicht Trägermaterialien auswählen, die kompatibel mit den Syntheseschritten sind, die auszuführen sind. Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Safety-Catch-Verknüpfern an Harze zur Synthese von Peptiden, welche hiernach unter Verwendung von den Verfahren dieser Erfindung ligiert werden können. Native chemische Ligation ist unter Verwendung eines Safety-Catch-Verknüpfers umgesetzt worden. Siehe: Brik, A.; Keinan E.; Dawson, P. E.;J Org. Chem. 2000 (Jun) 16: 65 (12): 3829–3835. Schema 10 veranschaulicht die Peptidsynthese durch konventionel le Verfahren auf einem Safety-Catch-Harz und die Freisetzung des Peptids unter Verwendung eines Phosphinothiolreagenzes dieser Erfindung.
Der Durchschnittsfachmann kann leicht harzgebundene Peptide synthetisieren durch konventionelle Verfahren, die mit den Ligationsschritten dieser Erfindung verträglich sind. In einer spezifischen Ausführung kann das Peptid an das Harz zur Festphasensynthese über eine photolabile Verknüpfungsgruppe verknüpft werden. Eine solche Gruppe wird durch Bestrahlung bei einer geeigneten Wellenlänge abgespalten.
Eine Vielzahl von Seitengruppen schützenden Gruppen, in dem Verfahren dieser Erfindung verwendbar sind, ist im Stand der Technik bekannt und können leicht für vorgegebene Reaktionsbedingungen ausgewählt werden. Verfahren zum Seitenkettenentschützen und Spaltung von Peptiden und Proteinen von Harzen ohne substantielle Schädigung der Produktpeptide oder -proteine sind im Stand der Technik bekannt. Azidsubstituierte Aminosäuren sind leicht aus kommerziellen Quellen oder aus Anwendung von Routineverfahren erhältlich, die im Stand der Technik wohlbekannt sind.
Schema 10
Reaktionspartner und Reagenzien, die in den Verfahren dieser Erfindung eingesetzt werden, sind leicht entweder aus kommerziellen Quellen verfügbar oder können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, mit Blick auf die Beschreibung hierin. Z.B. können Azidoglycoside (z.B. Azidomannose) und Azidonucleoside (z.B. AZT) durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Thioester verschiedener biologisch interessanter Moleküle sind auch leicht durch wohlbekannte Verfahren zugänglich. Phosphinothioester werden durch hier veranschaulichte Verfahren oder im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt und können insbesondere synthetisiert werden durch Transthioesterifizierungs- oder Kopplungsreaktionen. Exemplarische Verfahren sind in den Beispielen angegeben. Azidosäuren sind leicht zugänglich (Zaloom, J.; et al.,1981) und können bei Festphasensynthese (Meldal, M.; Juliano, M. A.; Jansson, A. M. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 2531–2534) verwendet werden. Thioester zahlreicher biologisch interessanter Moleküle wie Sialinsäure oder bestimmte Lipide sind auch leicht durch bekannte Verfahren zugänglich.
Ligationsverfahren dieser Erfindung von diese Erfindung einsetzendem Phosphinothiol 20 sind insbesondere verwendbar, um die Proteinsynthese zu erleichtern.
Ferner ist das Ligationsverfahren dieser Erfindung orthogonal zur nativen chemischen Ligation (sowie anderen effektiven Kopplungsstrategien, Tam, J. P.; Lu, Y. A.; Chuan-Fa, L.; Shao, J. Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995, 92, 12485–12489; Tam, J. P.; Yu, Q.; Miao, Z. Biopolymers 2000, 51, 311–332), und erweitert daher die Proteinsynthesereichweite. Darüber hinaus können auch Kopplungsreaktionen an ungeschützten Peptiden in Gegenwart von H₂O durchgeführt werden.
Schema 11 bildet die einfachsten Proteine ab, die durch native chemische Ligation allein, die Staudinger-Ligation allein, und eine sequentielle Kombination der beiden Verfahren zugänglich sind. Die Verwendung von Thiol- oder Azid-schützenden Gruppen kann die Vielseitigkeit dieser Verfahren noch weiter ausdehnen.
Schema 11
Das Ligationsverfahren dieser Erfindung kann auch allgemein verwendet werden, um natürliche Thioesterzwischenprodukte in biosynthetischen Stoffwechselwegen abzufangen. Eine Vielzahl von biosynthetischen Stoffwechselwegen verläuft über die Ausarbeitung von Thioesterzwischenprodukten. (Als neuere Übersichten, siehe: Katz, L, Chem. Rev. 1997, 97, 2557–2575; Khosla, C. Chem. Rev. 1997, 97, 2577–2590; Marahiel, M. A.; Stachelhaus, T.; Mootz, H. D. Chem. Rev. 1997, 97, 2651–2673; von Dohren, H; Keller, U.; Vater, J.; Zocher, R Chem. Rev. 1997, 97, 2675–2705; Cane, D. E.; Walsch, C. T.; Khosla, C. Science 1998,282,63–68; Konz, D.; Marahiel, M. A., Chem. Biol. 1999,6, R39–R48; Keating, T. A; Walsch, C. T., Curr. Opin. Chem. Biol. 1999,. 3,598–606.)
Zum Beispiel verlaufen sowohl die Biosynthese von Polyketiden als auch die nicht ribosomale Biosynthese von Proteinen über Thioesterzwischenstufen. Die Einfügung dieser Zwischenstufen mit einem Phosphinothiol ermöglicht die Ligation eines Azids, die eine Amidbindung bildet. Die Ligation einer biosynthetischen Bibliothek von Thioestern mit einer chemischen Bibliothek von Aziden ist ein leichtes Mittel, um die molekulare Vielfalt zu vergrößern. Chemische Bibliotheken, die unter Verwendung des Ligationsverfahrens dieser Erfindung gebildet sind, können auf biologische Funktion durch eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren gescreent bzw. abgesucht werden.
Wie in 1 beispielhaft dargestellt, können die Ligationsverfahren dieser Erfindung bei Festphasensynthese umgesetzt werden. Entweder die Thioester- oder Azidreaktionspartner in der Ligation kann eine feste Oberfläche oder Trägermaterial gebunden werden. Die Verwendung von Festphasenverfahren ist insbesondere für die Synthese von Peptiden durch wiederholte Zyklen der Ligation dieser Erfindung zuträglich. Die Verwendung von Festphasenverfahren ist auch zuträglich für die Ligation von zwei oder mehr Peptiden oder Proteinen, um längere Peptide oder Proteine zu bilden. Die Reaktion eines gebundenen Thioesters mit dem Phosphinothiolreagenz und ungebundenen Azid oder einem gebundenen Azid mit einem ungebundenen Thioester und dem Phosphinothiolreagenz wird zu einem gebundenen Ligationsprodukt führen. Konventionelle Verfahren zum Anheften verschiedener Spezies an eine feste Oberfläche oder Trägermaterial können verwendet werden, um entweder Thioesterreaktionspartner oder Azidreagenz an solche Materialien zu heften.
Die Ligation des Phosphinothiols und Azids dieser Erfindung wird vorzugsweise in einem gemischten organischen/wässrigen Lösungsmittel durchgeführt wie Gemische von THF und Wasser. Wasser nimmt an der Hydrolyse des Amidophosphoniumsalzes teil, um das gewünschte Amid zu bilden. THF oder ein anderes organisches Lösungsmittel (z.B. Methylenchlorid, DMF) wird eingefügt, um das Phosphinothiolreagenz oder die Reaktionspartner zu lösen. Die in dem Lösungsmittel vorliegende Wassermenge muss daher ausreichend sein, um die gewünschte Hydrolyse zu bewirken. Mit Phosphinothiolreagenzien, die ausreichend wasserlöslich sind, kann die Ligation im wässrigen Lösungsmittel durchgeführt werden.
Fachleute werden mit Blick auf die Beschreibung hierin wissen, dass die spezifischen Reaktionsbedingungen (z.B. Lösungsmittel, Reaktionstemperatur und Reaktionszeit), die zur Ligation eingesetzt werden, abhängig von spezifischen Reagenzien (z.B. Phosphinothiol), Reaktionspartnern und Produkten (z.B. Aminosäuren, Peptide oder Proteine) einer vorgegebenen Reaktion variieren können. Die Reaktionsbedingungen können leicht durch im Stand der Technik verstandene Verfahren optimiert werden.
Reaktionen, die Phosphinothiol 2 einsetzen, wurden gleichzeitig durch Ansäuern (mit HCl) vor Produktreinigung ausgeführt. Es wird vermutet, dass es nicht notwendig ist, Säure zum Reaktionsgemisch hinzuzufügen, um das gewünschte Amidprodukt zu erhalten, wenigstens wenn Phosphinothiol 20 eingesetzt wird. Ansäuern des Rektionsgemisches kann hingegen Produktausbeuten beeinträchtigen. Hydrolyse kann auch in geeigneten Fällen durch Zugabe einer Base zum Reaktionsgemisch erleichtert werden.
Produkte der Ligationsverfahren dieser Erfindung werden durch konventionelle Verfahren gereinigt, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Jedes einer großen Vielzahl von Verfahren zur Peptid- und Proteinreinigung kann in Kombination mit den Verfahren dieser Erfindung eingesetzt werden.
Ein auf der Ligation von Thioestern und Aziden basierendes Verfahren ist eine wertvolle Quelle von Proteinen sowohl zur Grundlagenforschung als auch zur Medikamentauffindung. Verfahren dieser Erfindung können als ein verlässlicher Weg zu homogenen, korrekt gefalteten Proteinen mit hoher biologischer Aktivität verwendet werden. Der Anwender dieser Erfindung kann Werkzeuge von synthetischer und medizinischer Chemie verwenden, um Proteinreagenzien und Proteintherapeutika herzustellen und zu verbessern.
Die folgenden Beispiele sind vorgesehen, um die Erfindung weiter zu veranschaulichen und sind in keiner Weise vorgesehen, um die Erfindung zu begrenzen.
BEISPIELE
Allgemein Experimentelles
Chemikalien und Lösungsmittel wurden von Aldrich^® bezogen, mit Ausnahme von N-Methylmercaptoacetamid (Fluka^®), Bromacetylbromid (Acros^®), und Merrifield-Harze (Novabiochem^®). Verwendete Merrifield-Harze (Chlormethylpolystyrol-Divinylbenzol) waren 200–400 mesh (Substitution 0.63 mmol/g) und 70–90 mesh (1.26 mmol/g). Die Reaktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Whatman^® TLC Platten (AL SILG/UV) verfolgt und visualisiert durch UV oder I₂. NMR-Spektren wurden erhalten unter Verwendung von Bruker AC-300- oder Varian-UNITY500-Spectrometern. Phosphor-31-NMR-Spectren wurden protonen-entkoppelt und bezogen auf einen externen Standard von deuterierter Phosphorsäure. Massenspektren wurden erhalten unter Verwendung von Elektrosprayionisierungstechniken (ESI) am Biotechnology Center der University of Wisconsin.
BEISPIEL 1:
Thioester 1 (worin R H oder Bn ist) (bezogen auf Schema 7)
N-Acetylaminosäure (N-Acetylglycin oder N-Acetylphenylalanin) und ein Äquivalent N-Methylmercaptoacetamid (NMA) wurden in ein flammengetrocknetes Reaktionsgefäß unter einer Argonatmosphäre gegeben und gelöst in trockenem DMF (N,N-Dimethylformamid) zu einer Endkonzentration von 0.5–0.7 M. DCC (Dicyclohexylcarbodiimid, 1.1 Äquivalente) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 10–12 h gerührt. Das Nebenprodukt DCU (Dicyclohexylharnstoff) wurde abfiltriert und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Die Produkte wurden umkristallisiert aus CH₂Cl₂ und Hexanen. Thioester 1 (R = H) wurde erhalten in einer 90%-Ausbeute und Thioester 1 (R = Bn wurde erhalten in einer 92%-Ausbeute. Thioester 1 (R= H). ¹H NMR (DMSO-d6, 1: 1,300 MHz) δ 8.62 (t, J=6 Hz, 1H), 8.05 (bs, 1H), 4.00 (d,J = 6 Hz, 2H), 3.56 (s, 2 H), 2.59 (d, J=4.5 Hz, 3H), 1.93 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (DMSO-d₆, 75 MHz) δ 197.95, 170.07, 167.13, 48.54, 31.81, 25.84, 22.26 ppm; MS(ESI) m/z 204.25 (M⁺ = 204.9, Fragmente bei 105.9, 100.0, 72.0). Thioester 1 (R=Bn). ¹H NMR (CDCl₃:CD₃OD, 1: 1,500 MHz) δ 7.30–7.27 (m, 2H), 7.24–7.19(m, 3H), 4.79 (dd, J=10,5 Hz, 1H), 3.57 (sichtbar 1, J=15 Hz, 2H), 3.24 (ABX, J-14,5 Hz, 1H), 2.91 (ABX, J=14, 10 Hz, 1 H), 2.76 (s, 3 H), 1.95 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃ : CD₃OD, 1:1, 125 MHz) δ 200.26, 172.83, 169.92, 136.93, 129.47, 128.98, 127.40, 61.24, 37.73, 32.72, 26.72, 22.40 ppm; MS(ESI) m/z 294.37(MH⁺-295.0 Fragmente bei 190.0, 162.2, 120.2).
2-Phosphinobenzothiol (2)
Verbindung 2 (wurde hergestellt durch das Verfahren von Block, E.; Ofori-Okai, G.; Zubieta, J., J. Am. Chem. Soc. 1989, 111,2327–2329 und NMR-Daten (¹H und ³¹P) korrelierten mit deren publizierten Daten. Zusatzspektraldaten: ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 137.71 (d, J=30Hz), 135.93 (d, J=8.75 Hz), 135.35 (d, J=9.75 Hz), 133.98, 133.83, 130.45, 129.25, 129.00, 128.67 (d, J-6.75 Hz), 125.92 ppm; MS (ESI) m/z 294.35(MH⁺-295.0).
Thioester 3 (R=H oder Bn)
Verfahren A (Transthioesterifizierung)
Verbindung 1 (1 Äquivalent) und Verbindung 2 (10 Äquivalente) wurden in ein flammengetrocknetes Reaktionsgefäß unter einer Argonatmosphäre beschickt und gelöst in trockenem DMF (0.25 M). Trockenes Argon wurde durch das Gemisch gesprudelt und Düsopropylethylamin (DIEA, 5 Äquivalente) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde gerührt für 12 h, nach welchen weitere 5 Äquivalente DIEA zugegeben wurden. Merrifield-Harz (Sowohl mit hoher als auch mit niedriger Beladungskapazität wurden zu verschiedenen Anlässen verwendet) mit einer hohen Beladungskapazität wurde wenigstens ein Äquivalent zur molaren Menge der Verbindung 2 zu dem Gemisch zugegeben, um überschüssiges Phosphinobenzothiol und N-Methylmercaptoacetamid zu entfernen. Dieses Gemisch wurde gerührt für weitere 12h unter Argon und das Harz wurde abfiltriert. Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ aufgenommen und die unlöslichen DIEA-Salze wurden abfiltriert. Lösungsmittel wurde erneut entfernt und der Rückstand wurde in der nachfolgenden Kopplungsreaktion ohne weitere Reinigung verwendet. Die Reaktion verlief in quantitativer Ausbeute, wie durch TLC bewertet.
Verfahren B (DCC-Kopplung).
Verbindung 1 (R= H oder R = Bn) (1 Äquivalent) und Verbindung 2 (1 Äquivalent) wurden zu einem flammengetrockneten Reaktionsgefäß unter einer Argonatmosphäre zugegeben. DCC (1.1 Äquivalente) wurde zugegeben und die Reaktion wurde für 12 h gerührt. Das DCU Nebenprodukt wurde abfiltriert und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Verbindungen 3 (R = H oder R =Bn) wurden durch Chromatographie gereinigt (Silicagel, Ethylacetat: Hexan 1:1, gefolgt von 100% Ethylacetat). Verbindung 3 (R = H) wurde erhalten in 61 % Ausbeute und Verbindung 3 (R = Bn) wurde erhalten in 52% Ausbeute. Thioester 3 (R=H). ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.48 (ddd, J-5.5, 4, 1.5 Hz, 1H), 7.41 (td, J=7.5, 1.5 Hz, 1H), 7.37–7.32 (m, 7H), 7.28–7.24 (m, 4H), 6.92 (ddd, J=7.5,3, 1.5 Hz, 1H), 5.86 (bs, 1H), 4.07 (d, J=6 Hz, 2H), 2.02 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 194.83, 170.63, 144.04, 138.00, 136.68 (d, J=10.75 Hz), 134.84, 134.69, 130.95, 130.30, 129.68, 129.34 (d, J=6.88 Hz), 49.78, 23.69 ppm ; ³¹P NMR (CDCl₃, 202 Hz) –9.91 ppm; MS(ESI) m/z 393.44 (MH⁺-394.2, Fragmente bei 295.2,225.2). Thioester 3 (R=Bn). ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.44 (ddd, J=7.5, 4, 1.5 Hz, 1H), 7.40 (td, J=7.5, 1.5 Hz, 1H), 7.36–.31 (m, 7H), 7.28–7.21 (m, 7H), 7.12–7.10 (m, 2H), 6.89 (ddd, J=8,3, 1 Hz, 1H), 5.63 (d,J=13. 5 Hz, 1H), 4.92(m, 1H), 2.95 (ABX, J=14.5, 5.5 Hz, 1H), 2.64 (ABX, J-14,8 Hz, 1H), 1.91 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 197.47, 170.43, 137.94, 136.40, 134.83, 134.75, 134.67, 134.58, 130.79, 130.30, 129.94, 129.64 (d, J=5.9 Hz), 129.33, 127.77, 60.29, 38.24,23.79 ppm; ³¹P NMR (CDCl₃, 202 Hz) –10.33 ppm; MS(ESI) m/z 483.56(MH⁺-484.2, Fragment bei 295.2).
Azid 4
Benzylamin (20.4 mL, 186 mmol) und Methylenchlorid (186 ml) wurden zu einem flammengetrockneten Reaktionsgefäß unter einer Argonatmosphäre zugegeben und die Lösung wurde auf 0°C in einem Eisbad gekühlt. Bromacetylbromid (8.1 ml, 93 mmol) wurde tropfenweise zu der Lösung zugegeben. Das HBr-Salz von Benzylamin fiel aus der Lösung fast unmittelbar aus. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur erwärmt und für 1 h gerührt. Das Benzylaminsalz wurde abfiltriert und die organische Phase wurde zweimal mit 2 N HCl (75 ml) gewaschen. Die organische Lage wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der resultierende weiße Festkörper wurde gelöst in THF (200 ml) und Wasser (50 ml). Natriumazid (30.3 g, 466 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde kräftig bei Rückfluss für 17 h gerührt. Die organische Lage wurde dann von der wässrigen Lage getrennt, wurde zweimal mit gesättigter Salzlösung (75 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert, und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Azid 6 wurde isoliert in 98% Ausbeute und wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Spektraldaten: 'H-NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.39–7.27 (m, 5H), 6.71 (bs, 1H), 4.47 (d, J=5.7 Hz), 4.00 (s, 2H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 166.66, 137.39, 128.43, 127.45, 127.35, 52.06, 43.08ppm ; MS(ESI) m/z 190.20 (MH⁺= 191.0, Fragment bei 91.2).
Amid 5 (R=H oder Bn)
Thioester 3 (R= H oder Bn) (1 Äquivalent) und Azid 6 (1 Äquivalent) wurden gelöst in THF:H₂O (3:1) auf eine Konzentration von 0.2 M. Eine gelbe Farbe, vermutlich von freigesetztem Thiolat, bildete sich schnell. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 12–16 h gerührt und wurde dann mit 2N HCl angesäuert bis die gelbe Farbe klar wurde. Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und die Amidprodukte wurden von den Phosphinoxidnebenprodukten getrennt (auch spektral charakterisiert, Daten nicht gezeigt) durch Chromatographie (Silicagel, 2.5 – 10% Methanol in Methylenchlorid). Die Reinigung erforderte häufig mehrere Kolonnen. Die Ausbeuten für Amide 7 und 8 reichten von 15 bis 40%. Amid (5 R =H). ¹H NMR (CDCl₂ CD₃OD, 1: 1,500 MHz) δ 7.33–7.22 (M,5H), 4.41 (s, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.86 (s, 2H), 2.01 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃ : CD₃OD, 1:1, 125 MHz) δ 173.56, 171.52, 170.67, 138.83, 129.04, 218.02, 127.78, 43.70, 43.62, 43.16,22.45 ppm; MS(ESI) m/z 263.29 (MH⁺-264.0). Amid 5 (R =Bn). ¹H NMR (CDCl₃ : CD₃OD, 1:1,500 MHz) δ 7.327.19 (m, 10H), 4.48 (sichtbar t, J-7.5 Hz, 1H), 4.44 (d, J=15 Hz, 1H), 4.34 (d, J=14.5 Hz, 1H), 3.95 (d, J=16.5 Hz, 1H), 3.71 (d, J=16.5 Hz, 1H), 3.11 (dd, J=13.5,7 Hz, 1H), 2.94 (dd, J=14,8 Hz, 1H), 1.88 (s, 3H) ppm ; ¹³C NMR (CDCl₃ CD₃OD, 1: 1, 125 MHz) δ 173.42, 172.81, 170.34, 138.61, 137.18, 129.55, 129.01, 128.93, 127.86, 127.68, 127.40, 56.12, 43.53, 43.18, 37.76, 22.36 ppm; MS (ESI) m/z 353.42 (MNa⁺=376.2,MH⁺=354.2 Fragmente bei 165.2, 120.2, 91.2).
BEISPIEL 2:
Phosphinoxid 24 (Bezogen auf Schema 9)
Chlormethylphosphondichlorid 23 (20g, 120 mmol) wurde gelöst in frisch destilliertem THF (240 ml). Eine Lösung von Phenylmagnesiumbromid (1.0 M) in THF (240 mL, 240 mmol) wurde tropfenweise zugegeben über 1 h. Das resultierende Gemisch wurde bei Rückfluss für 24 h gerührt. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von Wasser (20 ml) abgeschreckt und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ aufgenommen und wurde einmal mit Wasser (50 ml) und einmal mit Salzlösung (50 ml) gewaschen. Die organische Lage wurde über wasserfreiem MgSO₄(s) getrocknet und filtriert, und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde gereinigt durch Blitzchromatographie (flash chromatography) (Silicagel, 3% Methanol in Methylenchlorid). Phosphinoxid 24 wurde als eine weißer Festkörper in 63% Ausbeute isoliert. Spektraldaten 'H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.84–7.79 (m, 4H), 7.62-7.58 (m, 2H), 7.54– 7.50 (m, 4H), 4.05 (d, J=7 Hz, 2H) ppm ; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 132.60, 131.51 (d, J=9.6 Hz), 129.64 (d, J=103.9 Hz), 128.72 (d, J=11.6 Hz), 37.64 (d, J=71.9 Hz) ppm; ³¹P NMR (CDCl₃, 202 Hz) 28.46 ppm; MS(ESI) m/z 250.03 (MH⁺=251.0, M₂H⁺-501.2 Fragmente bei 173.0, 143.0, 91.0).
Verbindung 25
Phosphinoxid 24 (18.94 g, 75.6 mmol) wurde gelöst in THF (0.45 L). Thioessigsäure (34.3 mL, 480 mmol) wurde zugegeben, und die resultierende Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt. Ar(g) wurde durch das Reaktionsgemisch für 1 h gesprudelt. Düsopropylethylamin (83.6 mL, 480 mmol) wurde tropfenweise zugegeben und das resultierende Gemisch wurde bei Rückfluss für 24 h gerührt. Eine weitere Portion Thioessigsäure wurde als ein oranges Öl isoliert, das beim Stehen bei Raumtemperatur fest wurde. (35.2 mL, 492 mmol) wurden dann zugegeben, gefolgt von Triethylamin (60.0 mL, 492 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss für weitere 24 h erhitzt, nach welchen Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt wurde in einer gut gelüfteten Haube (Gestank!). Das resultierende schwarze Öl wurde gelöst in Methylenchlorid (0.35 L), und diese Lösung wurde mit 2N HCl (0.15 L), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (0.15 L) und Salzlösung (0.15 L) gewaschen. Die organische Lage wurde über wasserfreiem MgSO₄(s) getrocknet und filtriert. Aktivkohle wurde zu dieser Lösung zugegeben, welche dann bei Rückfluss für 30 min gerührt wurde. Die Aktivkohle wurde entfernt durch Filtration, Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatography) gereinigt (Silicagel, 70 % Ethylacetat in Hexanen). Die gesammelten Fraktionen wurden gelöst in Methylenchlorid (0.30 L), und die Aktivkohlebehandlung wurde wiederholt. Bei Lösungsmittelentfernung wurde Thioacetat 25 als oranges Öl isoliert, das beim Stehen bei Raumtemperatur fest wurde. Die Ausbeute für diese Reaktion war 85%. Spektraldaten: 'H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.80–7.75 (m, 4H), 7.56–7.52 (m, 2H), 7.49–7.46 (m, 4H), 3.77 (d, J=8 Hz, 2H), 2.25 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 192.82, 132.11, 131.05 (d, J= 102 Hz), 130.86 (d, J=9.75 Hz), 128.46 (d, J=12.63 Hz), 29.83, 27.12 (d, J=69.88 Hz) ppm; ³¹P NMR (CDCl₃, 202 MHz) δ 29.14 ppm; MS(ESI) m/z 290.05(MH⁺= 291.0, M²H⁺ = 581.2, Fragmente bei 249.2, 171.0, 125.0).
Phosphin 26
Thioacetat 25 (18.65 g, 64.2 mmol) wurde gelöst in wasserfreiem Chloroform (160 ml). Zu dieser Lösung wurde Trichlorsilan (97mL, 963 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde unter Ar(g) für 72 h gerührt. Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt (merke: überschüssiges Trichlorsilan in dem entfernten Lösungsmittel wurde durch langsame Zugabe von Natriumbicarbonatlösung in einer gut gelüfteten Haube abgeschreckt) und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatograpy) gereinigt (Silicagel, 3% Methanol in Methylenchlorid). Phosphin 26 wurde als weißer Feststoff in 98% Ausbeute isoliert. Spektraldaten: ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.43–7.40 (m, 4H), 7.33–7.30 (m, 6H), 3.50 (d, J=4 Hz, 2H), 2.23 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 194.01, 136.42 (d,J=13.6 Hz), 132.28 (d, J=19.4 Hz), 128. 69, 128.11 (d, J=6.8 Hz), 29.83, 25.41 (d, J=23.4 Hz) ppm; ³¹P NMR (CDCl₃, 202 MHz) -15.11 ppm; MS(ESI) m/z 274.06(MH⁺= 275.0, Fragmente bei 233.0, 199.2, 121.2).
(Diphenylphosphino)-Methanthiol (20)
Phosphin 26 (17.27 g, 63.0 mmol) wurde gelöst in wasserfreiem Methanol (0.40 L), und Ar(g) wurde durch die Lösung für 1 h gesprudelt. Natriumhydroxid (5.04 g, 127 mmol) wurde dann zugegeben und das Gemisch wurde unter Argon für 2 h gerührt. Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde gelöst in Methylenchlorid (0.30 L). Die resultierende Lösung wurde mit 2H HCl (2 × 0.10 L) und Salzlösung (0.10 L) gewaschen. Die organische Lage wurde über MgSO₄(s) getrocknet und filtriert und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatograpy) gereinigt (Aluminiumoxid, 25% Ethylacetat in Hexanen). (Diphenylphosphi no)Methanthiol 2 wurde als ein klares Öl in 74% Ausbeute isoliert. Spektraldaten: 'H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.41–7.38 (m, 4H), 7.33–7.26 (m, 6H), 3.02 (d, J=7.8 Hz, 2H), 1.38 (t, J=7.5 Hz, 1H) ppm13C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 132.54 (d, J=17.1 Hz), 128.86, 128.36, 128.14,20.60 (d, J=21.7 Hz) ppm ; 31P NMR (CDCl₃, 121 MHz) δ -7.94 ppm ; MS(ESI) m/z 232.05 (MH⁺-233.0, Fragmente bei 183.0, 155.0, 139.0, 91.2).
AcPheCH2PPh2 (Tabelle 1)
Verfahren A (Transthioesterifizierung). Phosphinothiol 20 (500 mg, 2.2 mmol) wurde gelöst in trockenem THF (5ml). Die Lösung wurde deoxygeniert durch Sprudeln von Ar(g) für 0.5 h. Zu dieser Lösung wurde NaH (51.6 mg, 2.2 mmol) zugegeben. Das Gemisch bildete eine Suspension, welcher DMF (2 ml) zugegeben wurde, um jeglichen Niederschlag zu lösen. Der N-Methylmercaptoacetamidthioester (NMA) von N-Acetylphenylalanin (63 mg, 0.22 mmol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde für 8 h gerührt. Unreagiertes Phosphinothiol 20 wurde entfernt durch Zusetzen von Merrifield-Harz (1.5 g, 1.26 mmol/g), Rühren für 6 h, und Entfernen des Harzes durch Filtration. Der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatograpy) gereinigt (Silicagel, 50% Ethylacetat in Hexanen). AcPheSCH2PPh2 wurde als weißer Feststoff in 92% Ausbeute isoliert.
Verfahren B (DCC Kopplung). Verbindung 20 (500 mg, 2.15 mmol) und N-Acetylphenylalanin (446 mg, 2.15 mmol) wurden in DMF (15 ml) unter Ar(g) gelöst. 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC; 489 mg, 2.37 mmol) wurde dann zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde für 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Das 1,3-Dicyclohexylharnstoffnebenprodukt (CU) wurde entfernt durch Filtration, Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch Chromatographie wie in Verfahren A gereinigt. AcPheSCH2PPh2 wurde als weißer Feststoff in 84% Ausbeute isoliert. Spektraldaten: 'H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.44–7.39 (m, 4H), 7.35–7.33 (m, 6H), 7.26–7.21 (m, 3H), 7.11–7.09 (m, 2H), 6.29 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.98–4.91(m, 1H), 3.57–3.44 (m, 2H), 3.09 (dd, J=14.1,5.4 Hz, 1H), 2.93 (dd, J=14.1,7.5 Hz, 1H), 1.88 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 198.901, 169.86, 135.50, 132.62 (d,J=19. 4 Hz), 129.11 (d, J-9.8 Hz) 128.79 (d, J=35.9 Hz), 128.50, 128.45, 126.99, 59.56, 37.99, 25.61 (d, J=24.4 Hz), 22.88 ppm ; ³¹P NMR (CDCl₃, 121 MHz) -44.55 ppm.
AcGlyCH2PPh2 (Tabelle 1)
Verfahren A. Phosphinothiol 20 (500 mg, 2.2 mmol) wurde gelöst in 5 mL trockenem THF. Die Lösung wurde deoxygeniert durch Sprudeln von Ar(g) für 0.5 h. Zu dieser Lösung wurde NaH (51.6 mg, 2.2 mmol) zugegeben. Das Gemisch bildete eine Suspension, zu welcher DMF (2 ml) zugegeben wurde, um jeglichen Niederschlag zu lösen. Der NMA-Thioester von N-Acetylglycin (44 mg, 0.22 mmol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde für 8 h gerührt. Unreagiertes Phosphinothiol 20 wurde entfernt durch zugeben von Merrifield-Harz (1.5 g, 1.26 mmol/g), Rühren für 6 h, und Entfernen des Harzes durch Filtration. Der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatograpy) gereinigt (Silicagel, 50% Ethylacetat in Hexanen). AcGlyCH₂PPh₂ wurde als weißer Feststoff in 91 % Ausbeute isoliert.
Verfahren B. Phosphinothiol 20 (100 mg, 0.43 mmol) und N-Acetylglycin (55 mg, 0.47 mmol) wurden gelöst in DMF (3ml) unter Ar(g). DCC (98 mg, 0.47 mmol) wurde zugegeben, und Das Gemisch wurde gerührt für 12 h bei Raumtemperatur. Das DCU-Nebenprodukt wurde entfernt durch Filtration, Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch Chromatographie gereinigt wie in Verfahren A. AcGlyCH2PPh2 wurde als weißer Feststoff in 67% Ausbeute isoliert. Spektraldaten: 'H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.46–7.39 (m, 4H), 7.38–7.36 (m, 6H), 6.44 (bs, 1H), 4.15 (d, J=5/7 Hz, 2H), 3.53 (d, J=3.6 Hz, 2H), 2.02 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 196.13, 170.29, 136.45 (d, J=13. 6 Hz), 132.62 (d,J=19. 1 Hz), 129.17, 128.54 (d, J=6. 7 Hz), 48.98,25.29 (d, J-24.2 Hz), 22.84 ppm ; ³¹P NMR (CDCl₃, 121 MHz) δ -15.20 ppm; MS(ESI) m/z 331.08 (MH⁺-332.2, MK⁺-370.0).
AcGlyNHBn (Table 1)
Thioester AcSCH2PPh2 (271 mg, 0.99 mmol) und Azid N₂GlyNHBn (187 mg, 0.99 mmol) wurden gelöst in THF/H2O (3: 1,9.4ml), und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 12 h gerührt. Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatograpy) gereinigt (Silicagel, 5% Methanol in Methylenchlorid). AcGlyNHBn wurde als weißer Feststoff in 91 % Ausbeute erhalten. Spektraldaten: 'H NMR (CDCl₃ : CD₃OD, 1: 1,125 MHz) δ 171.76, 169.37, 137.49, 127.83, 126.77, 126.59,42.50, 42.09,21.32 ppm; MS (ESI) m/z 206.11(MH⁺-207.0).
Experimental- und Spektralinformation für die anderen Amidprodukte und für die NMA-Thioester können in der unterstützenden Information von Nilsson, B. L.; Kiessling, L. L.; Raines, R. T., Org. Lett. 2000,2, 1939–1941 gefunden werden, welche vollständig als Bezugnahme hierin eingefügt ist.
BEISPIEL 3: Synthese eines Peptidphosphinothioesters unter Verwendung eines Safety-Catch-Harzes
Peptidsynthese und Aktivierung. 4-Sulfamylbutyryl-AM-Harz (Novabiochem 01-64-0152) wurde mit FmocGlyOH gemäß dem Verfahren von Backes und Ellman geladen (Backes, B. J.; Ellman, J. A.J. Org. Chem. 1999, 64, 2322–2330). Peptidkettenverlängerung mit Glu (tBu) und Cys (Trt) wurde unter Verwendung von Standard Py-BOP/HOBt-Kopplungsverfahren durchgeführt.
Aktivierung des Harzes. Etwa 1 g Harz (0.477 mmol Peptid) wurde in CH₂Cl₂ für 1 h vorgeschwollen und dann abgetropft. Iodacetonitril (1.8 mL, 25 mmol), Düsopropyl-Ethylamin (DIPEA, 1.7 mL, 10 mmol), und 1-Methyl-2-Pyrrolidinon (NMP, 40 ml) wurden gemischt und filtriert durch ein Abschlussstück aus basischem Aluminiumoxid und anschließend auf das Harz zugegeben. Das Harz wurde durch Sprudeln von Ar(g) bei Raumtemperatur für 18 h geschüttelt. Das Harz wurde dann mit NMP(5 × 10 ml), DMF(5 × 10 ml), und CH₂Cl₂ (5 × 10 ml) gewaschen. Das Harz wurde dann unmittelbar in dem nachfolgenden Schritt verwendet.
Peptid-Phosphinothioesterfreisetzung aus dem Harz. (Diphenylphospino)-Methanthiol (0.88 g, 3.8 mmol) in 20 mL DMF wurden zugegeben zu dem aktivierten Safety-Catch-Harz. Das Gemisch wurde für 18 h durch Sprudeln von Ar(g) geschüttelt. Das Harz wurde dann filtriert und wurde mit DMF (5 × 10ml) und CH₂Cl₂ (5 × 10 ml) gewaschen. Das Eluat wurde gesammelt und Lösungsmittel wurde unter ver mindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Chromatographie gereinigt (Silicagel, 30% EtOAc in Hexanen), um 285 mg (0.27 mmol) FmocCys (Trt)Glu (tBu) GlySCH₂PPh₂ als weißen Feststoff zu ergeben. Basierend auch einem Fmocbeladungsansatz für das aktivierte Peptid, stellt dies 57% Ausbeute des gewünschten Phosphinothioesterpeptids dar.
Fachleute werden merken, dass Verfahren, Reagenzien, Reaktionspartner, Reaktionsbedingungen (z.B. Lösungsmittel, Temperatur, Reaktionszeit) und Reinigungsverfahren, die von den hier spezifisch offenbarten verschieden sind, in der Praxis dieser Erfindung ohne unzumutbares Experimentieren eingesetzt werden können. Alle bekannte funktionellen Äquivalente von Verfahren, Reagenzien, Reaktionspartnern, Reaktionsbedingungen und Reinigungsverfahren, die hier in ihrer Gesamtheit spezifisch offenbart oder beschrieben sind, sind hier als Bezugnahme vollständig eingefügt wie wenn alle einzeln individuell als Bezugnahme eingefügt wären.

Claims

Verfahren zum Ausbilden einer Amidbindung, welches einen Schritt des Reagierens eines Phosphinothioesters mit einem Azid, gefolgt von Hydrolyse kombinierter Reagenzien umfasst, um eine Amidbindung zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Phosphinothioester gebildet wird durch Reaktion eines aktivierten Carboxylsäurederivats mit einem Phosphinothiol.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reaktion ausgeführt wird in Gegenwart von genügend Wasser, um die Hydrolyse zu erleichtern.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reaktion in einem wässrigen organischen Medium ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Reaktion in einem Gemisch von THF und Wasser ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Phosphinothiol o-(Diphenylphosphino)-Thiophenol ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Phosphinothiol (Diphenylphosphino)-Methanthiol ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin ein Peptid gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin ein Protein gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Phosphinothioester ein Phosphinothioester einer Aminosäure, eines Peptids oder eines Proteins ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Azid ein Azid einer Aminosäure, eines Peptids oder eines Proteins ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin wenigstens einer, der Phosphothioester oder das Azid, ein Phosphinothioester oder ein Azid einer β-Aminosäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin wenigstens einer, der Phosphinothioester oder das Azid, ein Phosphinothioester oder ein Azid von einer Aminosäure mit einer elektrophilen Seitengruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Phosphinothiol die Formel hat:
worin n und m 0 oder ganze Zahlen gleich 1–3, einschließlich, und n + m = 0 – 4, einschließlich, sind; die gestrichelte Linie anzeigt, dass die Doppelbindung vorliegen kann oder dass die Bindung Teil einer aromatischen Gruppe sein kann (R₄, R₆ und R₈ sind nicht vorliegend, wenn es eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffen gibt oder die Bindung Teil eines aromatischen Rings ist, wie angezeigt); R₁ und R₂ unabhängig gewählte Gruppen sind aus aliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sind mit Halogenid-, OH-, OR-, COH-, COR-, COOH-, COOR- oder n(R')₂-Gruppen, worin R, unabhängig von anderen R eine aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist, R und R' im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein können für R₁ und R₂; in R₁ und R₂ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können durch O, S, CO, COO oder CONR'; und R₃–R₈ unabhängig Gruppen sind, gewählt unter Wasserstoff-, aliphatischen alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sein können wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, bei R₃–R₈ eine oder mehrere nicht benachbarte CH2-Gruppen ersetzt sein können mit O-, S-, CO-, COO- oder CONR'-Gruppen, wobei jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, welche optional wie oben aufgelistet substituiert ist für R₁ und R₂ und worin R₁ und R₂ kovalent gebunden sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe oder zwei oder mehr R₃–R₈ kovalent gebunden sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das Phosphinothiol die Formel hat:
worin R₁ und R₂, unabhängig Gruppen sind, gewählt aus aliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sind mit Halogenid-, OH-, OR-, COH-, COR-, COOH-, COOR- oder n(R')₂- Gruppen, worin R, unabhängig von anderen R eine aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist, R und R' im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein können für R₁ und R₂; in R₁ und R₂ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können durch O, S, CO, COO oder CONR'; und R₃–R₄ unabhängig Gruppen sind, gewählt unter Wasserstoff, aliphatischen alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sein können wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, bei R₃–R₈ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können mit O-, S-, CO-, COO- oder CONR'-Gruppen, wobei jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, welche optional wie oben aufgelistet substituiert ist für R₁ und R₂ und worin R₁ und R₂ kovalent gebunden sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe oder zwei oder mehr R₃–R₈ kovalent gebunden sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe.
Verfahren nach Anspruch 15, worin in dem Phosphinothiol R₃ und R₄ beide Wasserstoff und R₁ und R₂ gewählt sind aus der Gruppe einer Phenylgruppe oder einer substituierten Phenylgruppe.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols n-Butylgruppen sind.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols Polyether sind.
Verfahren nach Anspruch 18, worin wenigstens eine der R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols die Formel haben:
worin p 0 oder eine ganze Zahl reichend von 1 bis etwa 10, einschließlich, ist und R ein Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das Phosphinothiol die Formel hat:
worin n und m 0 oder 1 sind und X₁–X₄ Substituenten an der aromatischen Gruppe sind, von denen zwei kovalent verknüpft sein können, um einen alizyklischen oder aromatischen Ring zu bilden, X₁–X₄ aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppen sein können oder Halogenid, OH, OR, COR, COOH, COOR sein können, worin R eine aliphatische, alizyklische oder aromatische oder N(R')₂-Gruppe ist, worin jedes R' unabhängig von dem anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, von denen alle optional substituiert sein können.
Verfahren nach Anspruch 20, worin R₁ und R₂ Phenyl oder substituierte Phenylgruppen sind.
Verfahren nach Anspruch 21, worin R₁ und R₂ Phenylgruppen, substituiert mit Elektronendonorgruppen oder Elektronen-abziehenden Gruppen sind.
Verfahren zur Synthese eines Peptids oder Proteins, worin wenigstens eine der Amidbindungen des Peptids oder Proteins nach dem Verfahren von Anspruch 1 gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 23, worin zwei Peptide durch konventionelle Festphasensynthese durch Bildung de Amidbindung ligiert werden.
Verfahren nach Anspruch 23, worin zwei Peptide oder Proteine durch rekombinante DNA-Expressionsverfahren durch Bildung der Amidbindung ligiert werden.
Verfahren nach Anspruch 23, worin ein Peptid oder Protein durch konventionelle Festphasenverfahren an ein Peptid oder Protein ligiert werden, das durch rekombinante DNA-Expressionsverfahren gebildet ist, durch Bildung der Amidbindungen.
Verfahren nach Anspruch 23, worin ein Peptid gebildet wird durch sequenzielle Reihen von Ligationen unter Ausbildung von Amidbindungen zwischen Aminosäuren.
Verfahren zum Markieren eines Peptids oder Proteins mit einem Reportermolekül, welches den Ligationsschritt von Anspruch 1 umfasst.
Phosphinothiolreagens mit der Formel:
worin n und m 0 oder ganze Zahlen gleich 1–3, einschließlich, und n + m = 0 – 4, einschließlich, sind; die gestrichelte Linie anzeigt, dass eine Doppelbindung vorliegen kann oder dass die Bindung Teil einer aromatischen Gruppe sein kann (R₄, R₆ und R₈ sind nicht vorliegend, wenn es eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffen gibt oder die Bindung Teil eines aromatischen Rings ist, wie angezeigt); R₁ und R₂ unabhängig gewählte Gruppen sind aus aliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sind mit Halogenid-, OH-, OR-, COH-, COR-, COOH-, COOR- oder n(R')₂-Gruppen, worin R, unabhängig von anderen R eine aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist, R und R' im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein können für R₁ und R₂; in R₁ und R₂ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können durch O, S, CO, COO oder CONR'; und R₃–R₈ unabhängig gewählt sind unter Wasserstoff, aliphatischen alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sein können wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, bei R₃–R₈ eine oder mehrere nicht benachbarte CH2-Gruppen ersetzt sein können mit O-, S-, CO-, COO- oder CONR'-Gruppen, wobei jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, welche optional wie oben aufgelistet substituiert ist für R₁ und R₂, und zwei oder mehr R₃–R₈ kovalent verknüpft sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe, außer, dass, wenn n und m beide 0 sind und R₃ und R₄ beide Wasserstoff sind, R₁ und R₂ keine Phenylgruppen oder substituierte Phenylgruppen sein können, und worin das Reagenz nicht O-(Diphenylphosphino)-Thiophenol ist.
Reagens nach Anspruch 29, worin das Phosphinothiol die Formel hat:
worin: R₁ und R₂ unabhängig gewählte Gruppen sind aus aliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sind mit Halogenid-, ON-, OR-, COH- COR-, COOH-, COOR- oder n(R')₂-Gruppen, worin R, unabhängig von anderen R eine aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist, R und R' im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein können für R₁ und R₂; in R₁ und R₂ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können durch O, S, CO, COO oder CONR'; und R₃–R₄ unabhängig gewählt sind unter Wasserstoff, aliphatischen alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sein können wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, bei R₃–R₈ eine oder mehrere nicht benachbarte CH2-Gruppen ersetzt sein können mit O-, S-, CO-, COO- oder CONR'-Gruppen, wobei jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, welche optional wie oben aufgelistet substituiert ist für R₁ und R₂, und R₁ und R₂ oder zwei oder mehr R₃–R₈ kovalent verknüpft sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe, außer, dass, wenn R₃ und R₄ beide Wasserstoff sind, R₁ und R₂ keine Phenylgruppen oder substituierte Phenylgruppen sein können.
Reagens nach Anspruch 30, worin die R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols n-Butylgruppen sind.
Reagens nach Anspruch 29, worin die R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols Polyether sind.
Reagens nach Anspruch 29, worin wenigstens eine der R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols eine Einheit mit der folgenden Formel umfassen:
worin p 0 oder eine ganze Zahl ist, die von 1 bis etwa 10 reicht, einschließlich, und R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist.
Reagens nach Anspruch 29, worin das Phosphinothiol die Formel hat:
worin n und m 0 oder 1 sind und X₁–X₄ Substituenten an der aromatischen Gruppe sind, von denen zwei kovalent verknüpft sein können, um einen alizyklischen oder aromatischen Ring zu bilden, X₁–X₄ aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppen sein können oder Halogenid, OH, OR, COR, COOH, COOR sein können, worin R eine aliphatische, alizyklische oder aromatische oder N(R')₂-Gruppe ist, worin jedes R' unabhängig von anderen R' ein Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, von denen alle optional substituiert sein können, außer, dass, wenn n und m beide 0 sind, R₁ und R₂ nicht Phenylgruppen oder substituierte Phenylgruppen sein können.
Reagens nach Anspruch 34, worin R₁ und R₂ Phenyl oder substituierte Phenylgruppen sind.
Reagens nach Anspruch 34, worin R₁ und R₂ Phenylgruppen, substituiert mit Elektronendonorgruppen oder Elektronen-abziehenden Gruppen sind.
Reagens nach Anspruch 34, worin n und um beide 0 sind.
Reagens nach Anspruch 34, worin R₁ und R₂ beide Wasserstoff sind.
Reagens nach Anspruch 34, worin R₁ und R₂ beide Phenylgruppen sind.
Reagens nach Anspruch 34, worin R₁ und R₂ beide n-Butylgruppen sind.
Reagens nach Anspruch 29, welches (Diphenylphosphino)-Methanthiol ist.
Kit zum Ausbilden einer Amidbindung zwischen einem aktivierten Carboxylsäurederivat und einem Azid, welcher eines oder mehrere Phosphinothiolreagenzien von Anspruch 29 umfasst.
Kit zur Synthese von Peptiden oder Proteinen, welcher eines oder mehrere Phosphinothiolreagenzien nach Anspruch 29 umfasst.
Kit nach Anspruch 43, welcher weiterhin eines oder mehrere Schutzreagenzien für Aminosäureseitenketten umfasst.
Kit nach Anspruch 43, welcher weiterhin ein Harz für Festphasensynthese umfasst.
Kit nach Anspruch 44, worin das Harz ein Safety-Catch-Harz ist.
Kit nach Anspruch 44, der ein Reagens zum Erzeugen von Azidopeptiden umfasst.
Kit nach Anspruch 46, weiterhin umfassend ein Reagenz zum Erzeugen von Thioestern.
Kit nach Anspruch 43, weiterhin umfassend eines oder mehrere Lösungsmittel zum Durchführen der Ligation und optional Anweisungen zum Ausführen der Ligation enthaltend.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Phosphinothioester ein Phosphinothioester eines Lipids ist.
Verfahren nach Anspruch 50, worin das Azid ein Azidopeptid oder ein Azidoprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Azid ein Nukleosidazid ist.
Verfahren nach Anspruch 52, worin der Phosphinothioester ein Phosphinothioester eines Peptids oder eines Azidoproteins ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Amidbindung ein Saccharid an ein Peptid ligiert.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Amidbindung ein Lipid an ein Peptid ligiert.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Amidbindung ein Nukleosid an ein Peptid ligiert.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Amidbindung eine Nukleinsäure an ein Peptid ligiert.
Reagens nach Anspruch 29 mit der Formel:
worin R₁ und R₂ aromatische oder heteroaromatische Gruppen sind, welche optional substituiert wie definiert in Anspruch 29 sind und R₃ und R₄ wie in Anspruch 29 definiert sind.
Reagens nach Anspruch 58, worin R₃ und R₄ beide Wasserstoff sind.
Reagens nach Anspruch 59, worin R₁ und R₂ Phenylgruppen oder substituierte Phenylgruppen sind.