JP2004501103A - アミド結合を形成するためのライゲーション方法及び試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
(発明の分野)
本発明は、ペプチド化学の分野に属し、特に、ペプチド及びタンパク質の合成に有用であると共に、誘導体化ペプチドまたはタンパク質の合成においても有用なアミド結合を形成するための方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
新しい方法はタンパク質の全化学合成を容易にしている。歴史的な参考文献として、Merrifield,R.B.Science 1984,232,341−347、Kent,S.B.Annu.Rev.Biochem.1988,57,957−989、Kaiser,E.T.Acc.Chem.Res.1989,22,47−54が参照される。特に、Kent他は、「天然型(native)化学ライゲーション」と呼ばれる、2つの保護されていないペプチドを水溶液中でつなぎ合わせる簡潔な手段を開発した(Dawson,P.E.;Muir,T.W.;Clark−Lewis,I.;Kent,S.B.Science 1994,266,776−779)。重要な先例としては、Wieland,T.;Bokelmann,E.;Bauer,L.;Lang,H.U.;Lau,H.Liebigs Ann.Chem.1953,583,129−149、Kemp,D.S.;Galakatos,N.G.J.Org.Chem.1986,51,1821−1829が参照される。概説としては、Muir,T.W.;Dawson,P.E.;Kent,S.B.H.Methods Enzymol.1997,289,266−298、Wilken,J.;Kent,S.B.H.Curr.Opin.Biotechnol.1998,9,412−426、Kochendoerfer,G.G.;Kent,S.B.H.Curr.Opin.Chem.Biol.1999,3,665−671、Tam,J.P.:Yu Q.;Miao,Z.Biopolymers 1999,51,311−332;Dawson,P.E.;Kent,S.B.H.Annu.Rev.Biochem.2000,69,923−960、Borgia,J.A.;Fields,G.B.Trends Biotechnol.2000,18,243−251が参照される。
【0003】
天然型化学ライゲーションでは、1つのペプチドのN−末端システイン残基のチオレートが別のペプチドのC−末端チオエステルの炭素を攻撃し、最終的に2つのペプチド間にアミド結合が生成される(スキーム1)。このライゲーション法は、緩衝水溶液中のValSPhとCysOHの反応がジペプチド:ValCysOHをもたらすと示された(Wieland他,1953)ときに発見された。
【0004】
近年、Muir他は、組換えDNA(rDNA)技法を用いてチオエステルフラグメント(断片)を容易に生成することができると証明することによって、天然型化学ライゲーションの有用性を発展させた。Muir,T.W.;Sondhi,D.;Cole,P.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998,9,6705−6710、Evans,Jr.,T.C.;Benner,J.;Xu,M.−Q.Protein Sci.1998,7,2256−2264、Ayers,B.;Blaschke,U.K.;Camarero,J.A.;Cotton,G.J.;Holford,M.;Muir,T.W.Biopolymers 2000,51,343−354。概説としては、Holford,M.;Muir,T.W.Structure 1998,15,951−956、Cotton,G.J.;Muir,T.W.Chem.Biol.1999,6,R247−R256、Evans,Jr.,T.C.;Xu,M.−Q.Biopolymers 2000,51,333−342が参照される。「天然型化学ライゲーション」のこの発展は、「発現(expressed)タンパク質ライゲーション」と称されている。
【0005】
【化9】
天然型化学ライゲーションは強力ではあるが、重大な制限を有する。この方法は、システイン残基にペプチド結合を形成することに絶対的に依存する。球状タンパク質ではシステインは残基を1.7%だけしか含まない(McCaldon,P.;Argos,P.Proteins 1988,4,99−122)ので、天然Xaa−Cys結合における連結の形成は、必ずしも可能とは限らない。近代的なペプチド合成は、典型的には、50より少ない残基のペプチドへ制限される(Dawson他,1994、Wieland他,1953、Kemp他,1986、Muir他,1997、Wilken他,1986、Kochendoerfer他,1999、Tam他,1999、Dawson他,2000、 Borgia他,2000)。したがって、ペプチドがシステイン残基でのみカップリングされることを要求する方法では、大部分のタンパク質は調製できない。
【0006】
さらに、余分なシステイン残基の導入は望ましくないことが多い。システインは、ジスルフィド結合、O2(g)、および他の求電子試薬に対してとびぬけて反応性の最も高い残基である(Schneider,C.H.;de Weck,A.L.Biochim.Biophys.Acta 1965,168,27−35、Raines,R.T.Nature Struct.Biol.1997,4,424−427)。さらに、システインのスルフヒドリル基はβ脱離を受けてデヒドロアラニンを形成することができ、これは、さらなる反応を起こすことが可能である(Friedman,M.Adv.Exp.Med.Biol.1999,459,145−159)。より一般的なライゲーションテクノロジを適用してシステイン制限を排除することは、全タンパク質合成の有用性を大きく発展させるであろう。
【0007】
OfferおよびDawsonは、最近、システインの存在を必要としないペプチドライゲーション法について記載している(Offer,J.;Dawson,P.E.Org.Lett.2000,2,23−26)。彼らの方法では、ペプチド結合は、チオエステルおよびo−メルカプトベンジルアミンから形成される。この方法は有効であるが、必然的に、ライゲーション生成物中にo−メルカプトベンジルアミンを残す。
【0008】
既知のStaudinger反応では、ホスフィンを用いて、アジドをアミンへ還元する。
【0009】
PR3+N3R’+H2O → O=PR3+H2NR’+N2(g)
(Staudinger,H.;Meyer,J.Helv.Chim.Acta 1919,2,635−646。概説としては、Gololobov,Yu.G.;Zhmurova,I.N.;Kasukhin,L.F.Tetrahedron 1981,37,437−472、Gololobov,Yu.G.;Kasukhin,L.F.Tetrahedron 1992,48,1353−1406が参照される。)この反応の中間体はイミノホスホラン(R”3P+−−NR)であり、これは求核体窒素を有する。
【0010】
Vilarassa他は、分子間反応および分子内反応の両方において、イミノホスホランの窒素をアシル化できることを示した。これは、スキーム2の反応1および反応2に例示されるように「Staudinger ライゲーション」と呼ばれている。例えば、Garcia,J.;Urpi,F.;Vilarrasa,J.Tetrahedron Lett.1984,25,4841−4844、Garcia,J.;Vilarrasa,J.Tetrahedron Lett.1986,27,639−640、Urpi,F.;Vilarrasa,J.Tetrahedron Lett.1986,27,4623−4624、Bosch,I.;Romea,P.;Urpi,F.;Vilarrasa,J.Tetrahedron Lett.1993,34,4671−4674、Inazu,T.;Kobayashi,K.Synlett.1993,869−870、Molina,P.;Vilaplana,M.J.Synthesis−Stuttgart 1994,1197−1218、Bosch,I.;Urpi,F.;Vilarrasa,J.J.Chem.Soc.,Chem.Commun.1995,91−92、Shalev,D.E.;Chiacchiera,S.M.;Radkowsky,A.E.;Kosower,E.M.J.Org.Chem.1996,61,1689−1701、Bosch,I.;Gonzalez,A.;Urpi,F.;Vilarrasa,J.J.Org.Chem.1996,61,5638−5643、Maunier,V.;Boullanger,P.;Lafont,D.J.Carbohydr.Res.1997,16,231−235、Afonso,C.A.M.Synthetic Commun.1998,28,261−276、Tang,Z.;Pelletier,J.C.Tetrahedron Lett.1998,39,4773−4776、Ariza X.;Urpi,F.;Viladomat,C.;Vilarrasa J.Tetrahedron Lett.1998,39,9101−9102、Mizuno,M.;Muramoto,I.;Kobayashi,K.;Yaginuma,H.;Inazu,T.Synthesis−Stuttgart 1999,162−165、Mizuno,M.;Haneda,K.;Iguchi,R.;Muramoto,I.;Kawakami,T.;Aimoto,S.;Yamamoto,K.;Inazu,T.J.Am.Chem.Soc.1999,121,284−290、Boullanger P.;Maunier,V.;Lafont,D.Carbohydr.Res.2000,324,97−106、Velasco,M.D.;Molina,P.;Fresneda,P.M.;Sanz,M.A.Tetrahedron 2000,56,4079−4084、Malkinson,J.P.;Falconer,R.A.;Toth,I.J.Org.Chem.2000,65,5249−5252が参照される。
【0011】
SaxonおよびBertozziは、スキーム2の反応3に示されるように、ホスフィンがアシル供与体の役割も果たせることを報告した。Saxon,E.;Bertozzi,C.R.Science 2000,287,2007−2010。
【0012】
スキーム2
Vilarrasa他(1980年代および1990年代に多数の例)
【0013】
【化10】
SaxonおよびBertozzi(Science 2000,287,2007)
【0014】
【化11】
最近、Saxon他は、ホスフィン試薬を用いてアジドからアミドを形成するためにStaudingerライゲーションの変形を報告した。(Saxon,E.;Armstrong,J.I.;Bertozzi,C.R.Org.Lett.2000,2,2141−2143。)ホスフィン試薬、
【0015】
【化12】
は、アジドヌクレオシドと反応されると、アシル基転移によるアミド形成をもたらすと報告される。ライゲーションは、ホスフィン試薬のアシル基以外の部分が生成物中にまったく残らないので、「痕跡がない(traceless)」と言われる。また著者らは、同じアジドヌクレオシドとホスフィノチオエステル、
【0016】
【化13】
との反応は、始めに、アシル転移よりもアザ−イリド加水分解を生じることについても報告している。数日後のアミド生成物の観察は、アミン加水分解生成物とチオエステルの反応の予想される結果であると特徴付けられる。著者他は、使用されるホスフィノチオエステルは反応に「従順」でないと指摘している。
【0017】
(発明の概要)
本発明は一般的に、スキーム3に示されるように、ホスフィノチオエステルとアジドの間にアミド結合を形成するための方法および試薬を提供する。反応は、広範な種類の化学種(スキーム3ではRPおよびRBで示される)の間でアミド結合の形成を可能にする。これらの反応が特に重要であるのは、ライゲーションされる部分がアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質フラグメントという点である。特定の実施形態では、本発明は、システイン残基に対する必要性を排除し、ライゲーションされたペプチド生成物中に残留原子をまったく残さない(すなわち、痕跡がない)ペプチドライゲーションのための方法および試薬を提供する。
【0018】
【化14】
このライゲーションで有用なホスフィノチオエステルは、多数の方法で生成することができる。スキーム3に示されるように、例えばチオエステルまたはN−アシルスルホンアミドなどの活性カルボン酸誘導体は、ホスフィノチオエステルへ転換することができる。ホスフィノチオエステルを形成するために当該技術で既知の任意の方法を一般的に使用することができる。本発明は、ホスフィノチオール試薬を用いてホスフィノチオエステル、特に、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質フラグメントのホスフィノチオエステルを生成するための効率的な方法を提供する。この試薬を使用して、活性カルボン酸誘導体(例えば、チオエステルまたは活性スルファミル基)から、あるいはジシクロヘキシルカルボジイミドで媒介される従来のカップリング反応または同様のカップリングによってカルボン酸から、所望のホスフィノチオエステルを生成することができる。
【0019】
また、本発明のライゲーション反応で有用なホスフィノチオエステルは、そのC−末端で樹脂へ付着されたペプチドまたはタンパク質フラグメントから生成することもできる。例えば、ペプチドまたはタンパク質フラグメントは、本発明のホスフィノチオール試薬との反応によって樹脂から遊離され、ホスフィノチオエステルを生成することができる。ペプチドまたはタンパク質フラグメントは、既知の固体ペプチド合成法、例えばFmocに基づく方法を用いて、適切な樹脂上で合成することが可能である。樹脂上で合成されたペプチドまたはタンパク質フラグメントは、次に、ホスフィノチオールとの反応により遊離されてホスフィノチオエステルを生成することができ、これは次に、アジドとライゲーションされてアミド結合を形成することができる。本発明のこの態様では、ペプチド合成に適切であると当該技術で知られており、ホスフィノチオールエステルを生成するためのホスフィノチオールとの反応に適合することができる任意の樹脂は、本発明で使用することができる。当該技術で「セーフティキャッチ(safety−catch)」樹脂として既知の樹脂は特に重要である。Backes,B.J.;Ellman,J.A.J.Org.Chem.2000,64,2322−2330が参照される。
【0020】
ライゲーションが行われるRPおよびRB部分は、反応条件と適合することができると共に、互いに、もしくはホスフィノチオエステルの他の官能基、例えばR1−2またはXと、望ましくない反応を起こさない、広範な種類の化学的部分のいずれでもよい。スキーム3のX部分ならびにR1およびR2基はホスフィノチオール試薬から誘導され、以下に記載するように、アミド形成を容易にするように選択される。
【0021】
RPおよびRBは、1つまたは複数のハライド(特に、FまたはCl)、OH、OR、COH、COR、COOH、COOR、CONH、CONR、またはN(R’)2基で置換されることがどれも可能な脂肪族、ヘテロ脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族、およびへテロ芳香族より成る群から選択される部分を含む。ここで、Rは、他のRとは独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族、またはヘテロ芳香族基であり、各R’は、他のR’とは独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族基の群から選択される。RおよびR’はまた、任意に、上に記載したように置換されてもよい。特に、脂肪族および/または脂環式部分を含むRPおよび/またはRBでは、1つまたは複数の隣接しないCH2基は、O、S、CO、COO、N(R’)2、またはCONR’で置き換えることができ、ここでR’は上記に定義されたとおりである。RPまたはRB基の反応性官能基はどれも、保護基(Pr)の使用によって、望ましくない反応から保護することができる。
【0022】
特定の実施形態では、RPおよびRBはアミノ酸、ペプチド、またはタンパク質である。例えば、ペプチドまたはタンパク質のカルボキシ末端(C−末端)において、あるいはペプチドまたはタンパク質中の1つまたは複数のアミノ酸の酸側鎖基において、ホスフィノチオエステル基を形成することができる。例えば、ペプチドまたはタンパク質のアミノ末端(N−末端)において、あるいはペプチドまたはタンパク質中の1つまたは複数のアミノ酸の塩基側鎖基において、アジド基を形成することができる。ライゲーション法は、2つ以上のアミノ酸、2つ以上のペプチド、または2つ以上のタンパク質をライゲーションするために使用することができる。例えば、ペプチドを構成要素のアミノ酸から固体合成するためには、多サイクルのライゲーションを使用することができる。多サイクルのライゲーションを用いて、2つ以上の小さいペプチドを結合して、より大きいペプチドを形成することができる。結合されるペプチドは、固体合成法によって、自然源から、または組換え法によって得ることができる。
【0023】
本発明の方法は、例えば、スキーム4に示されるペプチドおよびタンパク質の合成のために特に有用である。ここで、一緒にライゲーションされるアミノ酸部分において、RA1およびRA2は、互いに独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族、またはヘテロ芳香族であり、これらはいずれも上記のように置換されてもよい。本発明の方法を使用して、13Cおよび15N同位体が濃縮されたように、特定の同位体が濃縮された天然アミノ酸と同様に非天然アミノ酸をライゲーションすることができる。
【0024】
また、本発明の方法を使用して、ハロゲン化アルキルまたはエポキシドのような求電子側鎖基を有する1つまたは複数のアミノ酸を互いにライゲーションすることもできるし、あるいは、求電子側鎖基を有する1つまたは複数のアミノ酸をペプチドおよび/またはタンパク質に取り込むこともできる。また本発明の方法は、2つ以上のβ−アミノ酸を互いにライゲーションするため、1つまたは複数のβアミノ酸をα−アミノ酸へライゲーションするため、あるいは1つまたは複数のβ−アミノ酸をペプチドおよび/またはタンパク質に取り込むためにも使用することができる。
【0025】
特に、RA1およびRA2基は、酸性、塩基性、非極性または極性の任意のアミノ酸側鎖基を含む。RA1およびRA2は、20個の通常のα−アミノ酸側鎖または側鎖基、ならびにタンパク質中に見られる珍しいアミノ酸(例えば、ホモセリン)側鎖基および他の生物活性アミノ酸(例えば、オルニチンまたはシトルリン)側鎖基を含む。スキーム4に示される反応でアミド結合を含む生成物はジペプチドである。
【0026】
【化15】
(1)ペプチドのN−末端にアジド基を付加し、アジド−ペプチドを別のアミノ酸(またはペプチド)のホスフィノチオエステルと反応させることによって、あるいは(2)ペプチドのC−末端にホスフィノチオエステルを形成し、次に形成されたホスフィノチオエステルをアジド酸(またはN−末端アジドペプチド)と反応させることによって、スキーム4に示されるペプチド生成物へさらなるアミノ酸を結合させることができる。本発明のホスフィノチオール試薬は、ホスフィノチオエステルを生成するために使用することができる。これらの工程はスキーム5に示される。工程1および/または工程2の繰り返しサイクルは、より長いペプチドを生成するために使用することができる。
【0027】
【化16】
また、本発明の方法は、2つ以上の小さいペプチド(典型的には、50個のアミノ酸の長さよりも短い)のライゲーションによってより大きいペプチドまたはタンパク質を合成するため、あるいは2つ以上のペプチドまたはタンパク質のライゲーションによるタンパク質の合成のために使用することもできる。この方法では、ライゲーションされるべき2つ以上のペプチドまたはタンパク質(同じでも異なっていてもよい)は、従来の固相法、例えば、自然源から得られる、または組換え法によって得られる、Fmocに基づく方法によって合成することができる。ライゲーションされるべき2つのペプチドまたはタンパク質の一方は、そのC−末端でホスフィノチオエステル基により誘導体化され、N−末端は適切な保護基で保護される。ライゲーションされるべき2つのペプチドまたはタンパク質の他方は、そのN−末端でアジド酸基により誘導体化され、適切な保護基で保護される。ペプチドホスフィノチオエステルは、例えば、本発明のホスフィノチオール試薬を用いて樹脂結合ペプチドまたはタンパク質フラグメントから生成でき、あるいはペプチドチオエステルとホスフィノチオール試薬の反応(エステル交換反応またはカップリング反応)によって生成することができる。ペプチドホスフィノチオエステルは次に、加水分解および窒素損失を伴って、アジドペプチドと反応されて、2つのペプチドをライゲーションするアミド結合を生成する。ライゲーション反応は、加水分解およびアミド生成を容易にするのに十分な水を含有する有機溶媒中、例えばTHFと水の混合物中、で実行することができる。あるいは、ホスフィノチオエステルとアジドの反応は有機溶媒(両反応物が可溶である)中で開始され、加水分解およびアミド結合形成のために後で水が添加されてもよい。
【0028】
ある実施形態では、ライゲーションは固相技法を用いて実行される。特に、樹脂に付着された第1のペプチドを本発明のホスフィノチオール試薬と反応させて、第1のペプチドを遊離させ、第1のペプチドのC−末端にホスフィノチオエステルを形成する。C−末端で樹脂に付着された第2のペプチドは、そのN−末端アミノ酸でアジド基により誘導体化される。樹脂から遊離した後、第1のペプチドは、樹脂に結合した第2のペプチドと加水分解および窒素損失を伴って反応し、2つのペプチドをライゲーションするアミド結合を生成する。ライゲーションされたペプチドは樹脂へ付着したままである。第1のペプチドは従来の固体法により形成することができる。第2のペプチドも従来の固相合成法で形成することができ、この場合、アジド酸はペプチド鎖へ付加された最後のモノマーである。すなわち、アジド基は最後のアミノ酸のアミノ基から元の位置で生成される。ライゲーションされたペプチド(または、タンパク質)は脱保護され、所望される場合には従来の方法によって樹脂から切断される。あるいは、N−末端脱保護、N−末端アジド酸形成、およびホスフィノチオエステルペプチドとの反応のサイクルを更に実行して、より長鎖のペプチドおよびタンパク質を生成することもできる。
【0029】
本発明のライゲーション方法は、固相ペプチド合成の既知の変形と組み合わせることができる。例えば、本発明のライゲーション方法は、リシンベースの分枝コアを用いる多数の抗原ペプチド(MAPs)の合成において使用することができる。Tam,J.P.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1988 85,5409−5413が参照される。
【0030】
別の特定の実施形態では、RPまたはRB(スキーム3)の一方はペプチドまたはタンパク質基であり、他方は炭水化物基である。たとえば、RBは、単糖類、二糖類、三糖類、または多糖類でよい。別の特定の実施形態では、RPまたはRBの一方はペプチドまたはタンパク質基であり、他方はヌクレオシドまたは核酸である。別の実施形態では、RPまたはRBの一方はペプチドまたはタンパク質基であり、他方は脂質である。更に別の特定の実施形態では、RPまたはRBの一方はペプチドまたはタンパク質基であり、他方は、レポータ基、タグまたは標識(例えば、光学分光学、質量分析法または他の機器分析法によってその存在が検出可能な基)であり、蛍光または燐光基、同位体標識、もしくは放射能標識が含まれる。
【0031】
本発明の方法は、一般的に、生合成経路においてチオエステル中間体を阻止する、すなわちチオエステル中間体と反応するために有用である。この点については、この方法は、単に、同定のためにこのような中間体を識別、タグ付けおよび/またはラベル付けするために使用することができる。あるいは、アミド結合の形成によって唯一の生成物を合成するために使用することができる。この方法は、例えば、ポリケチドの生合成においてチオエステル中間体を阻止するために使用することができる。その結果得られるカップリング生成物は、生物活性について試験することもできるし、生物活性生成物、例えば、天然に存在するポリケチドとは構造が変更され、おそらく機能も変更されたポリケチド、のさらなる合成において使用することもできる。
【0032】
本発明の方法は、その実施形態のいずれにおいても、固相法を用いて実行することができる。ホスフィノチオエステル反応物またはアジド反応物はどちらも、反応性末端フリーな固体支持材料へ付着され得る。反応性ホスフィノチオエステル基を有して固体支持体へ結合された反応物は、フリーのアジド(すなわち、ここでは、アジド反応物は固体支持体へライゲーションされない)へライゲーションできる。反応性アジド基を有して固体支持体へ結合された反応物は、フリーのホスフィノチオエステルへライゲーションできる。一般的に、この方法を使用して、2つの生物学的分子の間、すなわち2つのペプチドの間、ペプチドと炭水化物(糖類、砂糖など)との間、ペプチドとヌクレオシドとの間、ペプチドと脂質との間など、にアミド結合を形成することができる。更に詳細には、この方法は、生物学的分子のうちの1つが固体支持体(すなわち、樹脂)へ付着されるライゲーションへ適用することができる。固体支持体へN−末端を介して付着されたホスフィノチオエステルペプチド反応物は、例えば、DDC、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト(PyBOP)のようなカップリング試薬を用いて、付着ペプチドのC−末端をホスフィノチオールへカップリングさせることによって生成することができる。アジド基をそのN−末端に有する樹脂結合されたペプチドは、トリフィルアジド(trifyl azide)または同様の試薬の反応によって生成することができる。
【0033】
本発明のライゲーション法は、ペプチド、タンパク質、またはアミド結合を含む種々の化学種のコンビナトリアルライブラリの形成において使用することができる。また、本発明のライゲーション法は、当該のペプチドおよびタンパク質生成物の形成のための天然型化学ライゲーション方法と組み合わせて使用することもできる。
【0034】
最も一般的には、本発明はホスフィノチオエステルとアジドの反応を提供する。特定の実施形態では、ホスフィノチオエステルは、ホスフィノチオール試薬を用いて調製することができる。本発明の反応の試薬として有用な新規のホスフィノチオールが提供される。
【0035】
本発明はまた、本発明のホスフィノチオール試薬、および特に本明細書中に記載される種々の式のホスフィノチオール試薬の1つ以上を含む、ホスフィノチオエステルとアジドとの間にアミド結合を形成するための試薬キットも提供する。さらにキットは、アジドを形成するための試薬を含み得る。キットはまた、必要に応じて、固相法を用いて本発明の連結を実行するのに適切な樹脂または他の固相材料を含む。キットはまた、後でホスフィノチオエステルへ転換されるチオエステルを生成するための試薬を含み得る。キットはまた、必要に応じて、連結を実行するための溶媒または他の試薬、および反応を行うための使用説明書、ならびに/または所望の連結についてのホスフィノチオール試薬を選択するための説明書を含み得る。
【0036】
特定の実施形態では、本発明は、1つ以上の本発明のホスフィノチオール試薬を含むペプチドまたはタンパク質の合成のためのキットを提供する。キットは、必要に応じて、1つ以上のアミノ酸側鎖保護基、アミノ酸またはペプチドのチオエステルを生成するための1つ以上の試薬、もしくはアミノ酸またはペプチドのアジド酸を生成するための1つ以上の試薬さらに含み得る。キットはまた、1つ以上のアミノ酸、アミノ酸チオエステルまたはアジド酸を含み得る。キットはまた、必要に応じて、固相法を用いて本発明の連結を行うのに適切な樹脂または他の固相材料を含み得る。キットはまた、必要に応じて、連結を実行するための溶媒または他の試薬、ならびに合成を行うための使用説明書、および/または所望の連結ついてホスフィノチオール試薬を選択するための説明書を含むことができる。本発明の試薬キットには、1つ以上の2−ホスフィノベンゼンチオールまたは1つ以上のホスフィノメタンチオールを含むキットが含まれる。
【0037】
(発明の詳細な説明)
本発明の方法では、アミド結合は、ホスフィノチオエステルとアジドとの間に形成される。反応は、連結生成物中に試薬の原子が残されないという点で痕跡がない。反応は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の誘導体化のため、種々の生物学的分子の連結(例えば、ペプチドと糖類、ペプチドと脂質、ペプチドとペプチド、ペプチドとヌクレオシドまたは核酸など)のため、および特にペプチドおよびタンパク質の合成のための多数の用途において有用である。
【0038】
いずれの特定の機構にも束縛されることを望まないが、この反応についての可能性のある機構が、スキーム6に示される。連結はホスフィノチオエステルとアジドとのカップリングによって始まり、反応性イミノホスホランおよび窒素ガスの形成に至る。イミノホスホラン窒素のチオエステルへの攻撃は、アミドホスホニウム塩をもたらす。アミドホスホニウム塩の加水分解は、アミドおよびホスフィンオキシドを生成する。重要なことは、ホスフィノチオールからの原子がアミド生成物中にまったく残らない、すなわち連結が痕跡を残さないことである。スキーム6は、チオエステルからのエステル交換反応によるホスフィノチオエステルの形成を示すが、有用なホスフィノチオエステルを製造する他の方法も利用可能である。最も一般的には、ホスフィノチオエステルは、ホスフィノチオール試薬と活性カルボン酸誘導体との反応によって形成され得る。「活性化」カルボン酸誘導体は、当該技術で理解されているように、求核攻撃に対して活性化されており、例としては、チオエステル、ハロゲン化アシル、アシルイミダゾール、活性化エステル、およびN−アシルスルホンアミド(ある種のセーフティキャッチリンカーにおいて使用される)が挙げられる。
【0039】
本発明の連結反応は、ホスフィノチオール試薬として、o−ホスフィノベンゼンチオール(R1R2PC6H4−o−SH)(特にo−(ジフェニルホスフィノ)ベンゼンチオール(2))と、ホスフィノメタンチオール(R1R2P−CH2−SH)(特に(ジフェニルホスフィノ)メタンチオール20)と、をそれぞれ用いるスキーム7およびスキーム8の特定の反応により例示される。
【0040】
o−ホスフィノベンゼンチオールは、アシル転移のための遷移状態において六員環の形成を可能にする(スキーム6参照)ので、試薬として最初に選択した。さらに、R1R2PC6H4−o−SHは、R1R2PCH2CH2SHなどのチオールのようにアミドホスホニウム塩のC−P結合の切断によってエピスルフィドおよび安定なアミドホスフィン(R1R2PNR’C(O)R’’)の形成を可能にしない。さらに、チオフェノール自体は、ネイティブの化学連結中にチオエステルのチオエステル交換反応をもたらすことが知られている(Dawson,P.E.;Churchill,M.;Ghadiri,M.R.;Kent,S.G.H.J.Am.Chem.Soc.1997,119,4325−4329)。リン上のR基(R1およびR2)は、リンの求核性を低くし、それにより、O2(g)による有害な酸化に対するホスフィンの感受性を最小限にする電子吸引性(withdrawing)フェニル基であるように選択した。
【0041】
【化17】
スキーム7に示される変換では、o−(ジフェニルホスフィノ)ベンゼンチオール(2)の作用によって、フェニルアラニルチオエステル(1、ここでRはBnである)およびグリシルアジド(4)から、ペプチドAcPheGlyNHBn(5、ここでRはベンジル(Bn)である)を合成した。o−(ジフェニルホスフィノ)ベンゼンチオール(2)は、Block,E.;Ofori−Okai,G.;Zubieta,J.J.Am.Chem.Soc.1989,111,2327−2329により記載されるように、クロロジフェニルホスフィンとオルトリチウム化チオフェノールの反応により調製した。チオエステル3(ここで、RはBnである)は、ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を含有するDMF中、過剰のホスフィノベンゼンチオール2を用いて、チオエステル(1、ここでRはBn)のチオエステル交換反応により、定量的な収率で調製された。ホスフィンはアシル交換反応の注目すべき触媒である。Vedejs,E.;Diver,S.T.J.Am.Chem.Soc.1993,115,3358−3359。したがって、チオエステル3(ここで、RはBnである)は、おそらく、アシルホスホニウム塩(Ph2P+(C6H4−o−SH)C(O)R)の形成が生じ、次に分子内のP−からS−へアシル移動が起こった結果である。
【0042】
【化18】
【0043】
【化19】
Merrifield樹脂(クロロメチルポリスチレン−ジビニルベンゼン)へ共有結合で固定化することによって、過剰なチオールを除去した。チオエステル3(ここで、RはBnである)の非緩衝THF:H2O(3:1)溶液へアジド4(1当量)を添加し、得られた溶液を室温で12時間攪拌した。次に、2NのHClを添加して反応を酸性にし、減圧下で溶媒を除去した。シリカゲルのクロマトグラフィーによって、精製アミド5(ここでRはBn、である)が収率35%で得られた。他の主要な生成物は、Staudinger反応(Staudingerら、1919年)から誘導され得るGlyNHBnであった。RがHである場合のスキーム7の反応の結果は、表1に示される。
【0044】
チオエステル3とアジド4のカップリング効率に対する効果を決定するために、代替の溶媒条件もまた模索した。pH2、4、8および13.5で緩衝したTHF:H2O(3:1)中で反応を実行した。塩化メチレンまたはジメチルホルムアミド中でも反応を行い、次いで酸性水溶液を作用させた。これらの条件下の生成物の収率は、非緩衝THF:H2O(3:1)での収率と同様であった。連結はまた、N−アセチルグリシン(スキーム7でR=H)のo−ホスフィノベンゼンチオエステルとアジド4とをカップリングするためにも有効であった。
【0045】
アミド5は、スキーム6に示される機構とは異なる機構で形成され得た。特に、連結のアミド生成物は、理論上は、アジドの還元、それに続く生じるアミンへのアシル転移から生じ得た。チオエステル3とグリシルアジド4との連結をもたらすために使用された条件と同一の条件(反応物濃度、溶媒、温度および時間)下で、チオエステル3および真正のGlyNHBnを混合したコントロール実験によって、この機構は(少なくとも主要な経路として)除外された。アミド5の形成の証拠はまったく観察されなかった。
【0046】
ホスフィノチオール2は、本発明の連結をもたらすのに十分な特性を有する。このホスフィノチオール試薬を用いる反応の収率は低かった。これは、ホスフィノチオール2の低い水溶性の結果であり得る。反応の溶媒を最適化することによって、または水溶液に対する高い溶解度を有する試薬を使用することによって、収率を改善し得る。ホスフィノチオール2との連結は、六員環の遷移状態を通じて発生する(スキーム6)。遷移状態のこの環のサイズを小さくすることは、求核性イミド窒素を求電子性チオエステル炭素の近位へ運び、そして、改善された連結生成物の収率を生じる。
【0047】
より小さい環状遷移状態の効果は、五員環の遷移状態を形成するホスフィノチオール20を用いるスキーム8の連結反応において評価した。AcOH、AcGlyOH、およびAcPheOHから誘導される20のチオエステルは、チオエステル交換反応またはジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)とのカップリングのいずれかによって調製した。これらの反応をTLC分析により完了した後、Merrifield樹脂を用いて、未反応ホスフィノチオールを固定した。ワークアップおよびクロマトグラフィーの後、90%を越える収率で精製チオエステルを単離した。
【0048】
連結をもたらすために、THF/H2O(3:1)中、室温で12時間、それぞれのチオエステルをN3CH2C(O)NHBn(1当量)と共に攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、クロマトグラフィーにより生成物のアミドを精製した。ホスフィノチオール20を用いて得られたアミド生成物の収率は、ホスフィノチオール2を用いて得られた収率よりもはるかに高い(表1を参照)。AcGlyNHBnは、2を用いては微量の収率であったのと比較して、20を用いては91%の単離収率で得られた。AcGlyGlyNHBnは、2を用いると15%であったのと比較して、20を用いると80%の収率で得られた。AcPheGlyNHBnは、2では35%であったのと比較して、20では92%の収率で得られた。表1は、ホスフィノチオール2および20を用いる連結の収率を要約する。
【0049】
ホスフィノチオール20の使用の別の利点は、クロロホルム中で過剰のトリクロロシランを用いる還元によって、試薬をそのホスフィンオキシドから再生し得ることである。
【0050】
(表1:ホスフィノチオール2および20を用いた連結の収率)
【0051】
【表1】
a条件:THF/H2O(3:1);室温;12時間
観察された収率の劇的な改善は、チオエステルおよびアジドの連結をもたらしアミドを形成するために、ホスフィノチオール20が優れた試薬であることを示す。それに対して、Bertozziおよび共同研究者ら(Saxon,E.;Armstrong,J.I.;Bertozzi,C.R.Org.Lett.2000,2,2141−2143)は、Staudinger連結をもたらすためのホスフィノチオール2および20のオキソ類似体の能力を評価した。驚いたことには、彼らは、Ph2PC6H4−o−OHがPh2PCH2OHよりも高い収率を与えることを見出した。チオエステルとエステルの明白な正反対の反応性の根拠は不明確である。
【0052】
ホスフィノチオール20を用いて得られる高収率は、試薬中の求核体および求電子体の近接に起因し得る。連結の重要な中間体は、イミノホスホランであると考えられる(スキーム6)。20のイミノホスホランからアミドホスホニウム塩へ至る遷移状態は、五員環を含む。この環のC−S結合およびP−N結合は両方とも、重要な二重結合特性を有する。従って、イミノホスホランは、比較的少数のコンホメーションを採用し得る。これに対して、ラクタムを形成するためのN3(CH2)10C(O)SPyとPBu3の反応は、12員環による遷移状態を介して進行する(Bosch,I;Romea,P;Urpi,F;Vilarassa,J.Tetrahedron Lett.1993 34:4671−4674)。この反応の収率はわずか28%である。
【0053】
ホスフィノチオール20を用いて得られる高収率に寄与し得る別の因子は、アミド形成を容易にする安定なコンホメーションである。分子力学的計算は、イミノホスホラン中間体がβターン様コンホメーションを採用し得ることを示す。βターンは10員環を定義するO…HN水素結合により安定化される。イミノホスホランのチオエステル、イミド、およびアミド基は、βターンの3つのアミド基に対応する位置に配置される。このコンホメーションでは、求核体イミド窒素は求電子体チオエステル炭素の3.0Å以内にある。さらに、O…HN水素結合はチオエステルを分極し、その炭素を更により求電子性にする。最後に、2つのフェニル基のバルクは、βターン様コンホメーションのイミノホスホランの画分を増大させることによって、アシル転移を加速するであろう(「反応性回転異性体効果」の例として:(a)Bruice,T.C.;Pandit,U.K.J.Am.Chem.Soc.1960,82,5858−5865、(b)Jung,M.E.;Gervay,J.J.Am.Chem.Soc,1991,113,224−232を参照のこと)。この好ましいコンホメーションは、2との連結の間、および非ペプチジルアジドとチオエステルとの連結において近づきつらい。
【0054】
ホスフィノチオール20は、ホスフィノチオール2以上のさらなる本質的な利点を有する。一般的に、脂肪族チオール(例えば、20)は、芳香族チオール(例えば、2)よりも高いpKa値を有する。チオエステルの加水分解速度は、そのチオールのpKa値と反対に相関する(Janssen,M.J.The Chemistry of Carboxylic Acids and Esters;Patai,S.編;Interscience Publishers:New York,1969;730−736頁)ので、脂肪族チオエステルは水溶液中でより長い半減期を有する。イミノホスホラン形成の前か後に起こるチオエステルの加水分解は連結と競合する副反応であるようなので、半減期が長いことは重要である。
【0055】
したがって、ホスフィノチオール試薬の選択は、本発明のチオエステルおよびアジドの連結をもたらす際に、重要な側面である。本発明で有用なホスフィノチオールは、以下の一般構造を有する。
【0056】
【化20】
ここで、nおよびmは0または1〜3に等しい整数であり、n+m=0〜4である。点線は、二重結合が存在するか、または結合が芳香族基の一部であることを示す(示されるように、炭素間に二重結合が存在するか、あるいはこの結合が芳香環の一部である場合には、R4、R6およびR8は存在しない)。R1およびR2は、例えばハライド(特にFまたはCl)、OH、OR、COH、COR、COOH、COOR、またはN(R’)2基で必要に応じて置換される脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族、またはヘテロ芳香族基から独立的に選択される基である。ここでRは、他のRとは独立して、脂肪族、脂環式、へテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族基であり、各R’は、他のR’とは独立して、水素、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族基である。RおよびR’は、R1およびR2について上に記載されたように必要に応じて置換され得る。R1およびR2において、1つ以上の隣接しないCH2基はO、S、CO、COO、またはCONR’で置換され得、R1およびR2は一緒に、P原子を含む環を形成し得、そしてR3〜R8は、独立的して、R1およびR2について上に記載されたように任意に置換される、水素、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族基から選択される。R3〜R8では、1つ以上の隣接しないCH2基はO、S、CO、COO、またはCONR’基で置換され得、ここで各R’は他のR’とは独立して、R1およびR2について上に記載されたように必要に応じて置換される、水素、脂肪族、脂環式または芳香族基であり、R3〜R8のうちの2つ以上が共有結合されて、2環式基を含む環式基を形成し得る。
【0057】
R1およびR2基として、とりわけ、アルキル基、アルケニル基、環式アルキル、環式アルケニル、二環式基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、エーテル基、エステル基、アミド基、チオエーテル基およびケトン基が挙げられる。
【0058】
R5〜R8はすべて水素ではないことが好ましい。n+mは0、1、または2であることもまた好ましい。特定の実施形態では、R3およびR4は両方とも水素であり、nおよびmは両方ともゼロである。
【0059】
特定の実施形態では、ホスフィノチオールは次式を有する。
【0060】
【化21】
ここで、R1およびR2は、上記のように必要に応じて置換される芳香族またはヘテロ芳香族基であり、R3およびR4は上記で定義されたとおりである。R3およびR4は、好ましくは水素である。R1およびR2は、好ましくは、フェニル基および置換されたフェニル基を含む電子吸引基である。R3および/またはR4のうちの1つならびにR2は共有結合されて、上記のような基で置換され得るヘテロ芳香環を形成し得る。
【0061】
他の実施形態では、ホスフィノチオールは次式を有し得る。
【0062】
【化22】
ここで、R1〜R6は上記で定義されたとおりであり、R1およびR2ならびに/またはR4およびR5は必要に応じて共有結合されて、脂環式または芳香族の環を形成する。ここで、炭素間の点線は任意の二重結合または芳香環の一部を示し、示されるように炭素間に二重結合が存在する場合、R3およびR6は存在しない。
【0063】
別の実施形態では、ホスフィノチオールは次の構造を有する。
【0064】
【化23】
ここで、R1〜R8は上記に定義されたとおりであり、R1−R2、またはR4−R5、またはR5−R7、R4−R7、またはR4−R5−R7は必要に応じて共有結合されて、脂環式または芳香族の環を形成する。
【0065】
さらなる実施形態では、ホスフィノチオールは次の構造を有する。
【0066】
【化24】
ここで、nおよびmは0または1であり、R1およびR2は上記に定義されたとおりであり、X1〜X4は芳香族基上の置換基であり、そのうちの2つは共有結合されて、脂環式または芳香族の環を形成し得る。X1〜X4は、脂肪族、脂環式、または芳香族基であり得るか、またはハライド、OH、OR、COR、COOH、COOR(ここで、Rは脂肪族、脂環式または芳香族である)またはN(R’)2基であり得る。ここで、各R’は他のR’とは独立して、水素、脂肪族、脂環式または芳香族基であり、RおよびR’は、R1およびR2について上記に記載されたように、必要に応じて置換される。
【0067】
別の実施形態では、ホスフィノチオールは次の構造を有する。
【0068】
【化25】
ここでR1およびR2は上記に定義されたとおりであり、Mは、二環式を含む脂環式、またはヘテロ芳香族を含む芳香族の環を表す。Mはフェニル環、ナフタレン(または他の融合環)、ピリジン(または他のヘテロ芳香環)、もしくはシクロヘキセン(または他の脂環式環)を表し得る。R1およびR2は必要に応じて共有結合されて、リンを含有する環を形成する。
【0069】
この構造の特定の例として、以下が挙げられる。
【0070】
【化26】
ここで、X1〜X4は、存在する場合には、ヘテロ芳香環上の置換基であり、水素、ハライド、アルキル基、芳香族基、OR、CORまたはCOOR基から独立して選択され得る。ここでRは、水素、脂肪族基、脂環式基、芳香族基、CONR’またはN(R’)2基であり、各R’は他のR’と独立して、水素もしくは脂肪族または芳香族基であり得る。
【0071】
さらなる特定の実施形態では、本発明のホスフィノチオール試薬として、以下が挙げられる:
【0072】
【化27】
(ここでR1、R2、X1〜X4は上記に定義されたとおりである。);および
【0073】
【化28】
。
ここでR1およびR2は上記に定義されたとおりであり、点線は任意の二重結合を示し、X1〜X10は、存在する場合には、水素、脂肪族、脂環式または芳香族基であり得るか、またはハライド、OH、OR、COR、COOH、COOR(ここでRは脂肪族、脂環式または芳香族である)、CONR’、またはN(R’)2基であり得る。ここで、各R’は、他のR’とは独立して、水素、脂肪族、脂環式、または芳香族基であり、RおよびR’は、R1およびR2について上記に記されたように必要に応じて置換され、括弧内の置換基は二重結合が存在する場合には存在しない。
【0074】
ホスフィノチオール試薬のR1およびR2基は、一般的に、好ましくない立体的または電子的相互作用を回避することによって反応の遷移状態の自由エネルギーの上昇を回避するように、また有機溶媒(その合成のため)および緩衝水溶液(応用のため)の両方に溶解性を提供するように選択される。ポリエチレングリコール基を使用して、例えば、有機溶媒および水溶液の両方に溶解性を与え得る。例示的なR1およびR2基は、次式のポリエーテル基を含む。
【0075】
【化29】
ここで、pは0または1〜約10の範囲の整数であり、好ましくはpは1〜4であり、Rは水素またはアルキル基である。ポリエーテル基の炭素は、必要に応じて、ハライドまたは小さいアルキル基で置換される。特定の実施形態では、本発明のホスフィノチオール試薬はR1およびR2がフェニル基であり、これらのフェニル基は、水中での試薬の溶解度を増強するために1つ以上のポリエーテル基で置換され得る。
【0076】
他の特定の実施形態では、本発明の試薬は次式を有する。
【0077】
【化30】
ここで、p1およびp2は0または1〜約10の範囲の整数(1および10を含む)であり、Rは水素またはアルキル基である。整数p1およびp2は同じであるのが好ましく、1〜4の範囲(1および4を含む)が好ましい。
【0078】
これらのホスフィネート試薬は、本発明のライゲーションで使用するための水溶性チオール試薬として特に興味深い。このタイプの試薬は、以前はアルコールをリン酸化するために使用されたホスホラミダイトPCl2(N(C2H5)2)によって合成することができる(Perch,J.W.;およびJohns,RB 1988 Synthesis−Stuttgart 2,142−144)。ホスホラミダイトを市販の1ヶ所保護された(monoprotected)テトラ(エチレングリコール)と反応させた後、N(C2H5)2置換基をClで置き換える。チオフェノールを用いるオルトリチウム化および脱保護によって、所望のホスフィネートが生じる。
【0079】
【化31】
一般的に、ポリエーテル基を含むR1およびR2基は、容易に入手可能な出発物質から、当該分野で周知の方法によって合成することができる。
【0080】
ホスフィノチオール試薬の反応性は、当該分野で公知のように、置換基R1およびR2の選択によって調整することができる。一般的に、これらの基は、アジドの電子的および立体的特性に少なくとも部分的に基づいて選択されたアジドとの所望の反応性を得るように、そして、酸素に対する試薬の感度を最小限にするように選択される。酸素に対してより敏感な試薬は、一般的に、取り扱いがより困難であり、試薬の有効性を消失または減少させ得る所望されないレベルの酸素を避けるために、使用の際により注意が必要である。しかし、グリコシドのアジドのように反応性の低いアジドを用いるライゲーションは、より反応性の高いホスフィノチオール試薬の使用によって有意に改良することができる。例えば、R1およびR2基としてn−ブチル基などのn−アルキル基を使用すると、試薬の反応性は有意に増大され得る。
【0081】
さらなる例として、ホスフィノチオール試薬のフェニル置換基の電子供与基(当該分野で公知のように適切な環位置のアルコキシ基など)または電子吸引基(当該分野で公知のように適切な環位置のNO2基など、特にp−NO2)の置換は、試薬の反応性を調整するために使用することができる。電子吸引基の付加は反応性を減少させる傾向にあり、そしてフェニル置換基の電子供与基の付加は試薬の反応性を増大させる傾向にある。
【0082】
本発明において有用なホスフィノチオール試薬は、本明細書の教示の観点から、容易に入手可能な出発物質から、当該分野で周知の方法によって調製することができる。本発明の試薬はキットの形態で提供することができ、所望の反応用の溶媒を必要に応じて含み、反応を実行するための使用説明書を必要に応じて含み、そして、1以上のアジドまたはチオエステル反応物を任意に含む。キットはチオエステルおよび/またはアジドを生成するための試薬を含むことができる。また、試薬キットは、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質へカップリングするための標識基、タグ、またはレポータ分子を有する1以上の試薬ホスフィノチオールを含んでもよい。試薬キットは、例えば、選択された反応を実行するための成分の測定された相対量を含有するバイアルまたは他の容器を含むことができる。これらの試薬は、単一のライゲーション反応で使用するためにパッケージングされ、かつそのような大きさにされ得るか、または2つ以上のアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質フラグメントをライゲーションする段階的合成のためにパッケージングされ、かつそのような大きさにされ得る。
【0083】
まだ知られていないホスフィノチオール20の合成は、以下に実施例2で記載され、スキーム9に図示される。臭化フェニルマグネシウムをクロロメチル−ホスホン酸ジクロリド23へ添加し、その結果生じるGrignard反応を12時間還流させ、ホスフィンオキシド24を得た。乾燥THF中、チオ酢酸およびトリエチルアミンと24の混合物を12時間還流しながら加熱した(Lamoureux,G.V.;Whitesides,G.M.J.Org.Chem. 1993,58,633−641、Woycechowsky,K.J.;Wittrup,K.D.;Raines,R.T.Chem.Biol.1999,6,871−879)。フラッシュクロマトグラフィーにより精製し、脱色木炭で処理したあと、2つの工程の合計収率54%でチオホスフィンオキシド25を単離した。クロロホルム中で72時間、過剰のトリクロロシランを用いて、25をホスフィノチオエステル26へ還元し、フラッシュクロマトグラフィーによってほぼ定量的な収率で26を単離した。メタノール中で2時間、水酸化ナトリウムを用いてホスフィノチオエステル26の加水分解を行い(Charrier,C.;Mathey,F.Tetrahedron Lett.1978,27,2407−2410)、ホスフィノチオール20を得た(酸性条件下での加水分解は失敗した)。この反応の間、得られたチオールの酸化を防止するために、反応混合物中にAr(g)を通気させた。アルミナによるクロマトグラフィーによりホスフィノチオール20を精製し、75%の収率で単離した。スキーム9のプロセス全体の収率は39%であった。
【0084】
【化32】
以下の用語は、本明細書および特許請求の範囲において示された意味を有する。
【0085】
脂肪族という用語は、飽和または不飽和の炭化水素(アルカン、アルケン、アルキン)を示し、直鎖または分枝鎖であってもよい。脂肪族基は、とりわけハライド、ヒドロキシ基、チオール基、エステル基、ケトン基、カルボン酸基、アミンおよびアミドを含む種々の置換基または官能基によって必要に応じて置換することができる。ヘテロ脂肪族基は、炭化水素鎖中に1以上の非炭素原子を含有する脂肪族基である(例えば、1以上の隣接しないCH2基がO、SまたはNHで置き換えられる)。
【0086】
脂環式という用語は、1以上の飽和または不飽和環(例えば、3〜10員環)を有する炭化水素を示し、二環式でもよい。脂環式基は、環状炭化水素と組み合わせて、分枝鎖および/または直鎖の脂肪族である部分を含むことができる。脂環式基は、脂肪族基について上記されたように置換することができる。ヘテロ脂環式基は、脂環式基の炭化水素鎖、環または直鎖もしくは分枝鎖の脂肪族部分に、1以上のヘテロ原子(非炭素原子)を含有する脂環式基である(例えば、1以上の隣接しないCH2基がO、SまたはNHで置き換えられ得る)。
【0087】
芳香族という用語は、1以上の芳香環を含む炭化水素を示し、これらは縮合環(例えば、ナフタレン基のような)でもよい。芳香族基は、芳香族と組み合わせて、分枝鎖および/または直鎖の脂肪族および/または脂環式である部分を含むことができる。
【0088】
芳香族基は、脂肪族基について上記されたように置換することができる。ヘテロ芳香族基は、芳香環(例えば、ピリジン環)に1以上のヘテロ原子(非炭素原子)を含有する芳香族基である、芳香環のCHは、O、SまたはNで置き換えることが可能である。芳香族基の任意の脂環式または脂肪族部分において、1以上の隣接しないCH2基はヘテロ原子(例えば、O、S、NH)で置き換え可能である。
【0089】
また、脂肪族基、脂環式基、芳香族基、および対応するヘテロ原子含有基は、上記のような官能基で置換することもできる。芳香環は、例えば、所望され得るように、電子供与基または電子吸引基で置換することができる。電子供与基および電子吸引基は当該分野で周知である。
【0090】
一般的なアミノ酸は、天然に存在するペプチドおよびタンパク質中に一般的に見出される20個のアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が含まれる。RA基は、とりわけ、一般的なアミノ酸の側鎖または側鎖基を含む。
【0091】
タンパク質中に見出される一般的でないアミノ酸には、ヒドロキシル化、アルキル化、リン酸化、ホルミル化、およびアシル化された側鎖基を有するものが含まれ、とりわけ特に、4−ヒドロキシプロリン、3−メチルヒスチジン、5−ヒドロキシリシン、O−ホスホセリン、カルボキシグルタメート、アセチルリジン、およびN−メチルアルギニンが含まれる。生物学的活性を有するアミノ酸誘導体には、とりわけ、α−アミノ酪酸、チロキシン、シトルリン、オルニチン、ホモシステイン、S−アデノシルメチオニン、β−シアノアラニン、およびアザセリンが含まれる。RA基はまた、一般的なアミノ酸および一般的でないアミノ酸の側鎖基または側鎖、ならびにアミノ酸の生物学的に活性な誘導体の側鎖基を含むことができ、これらは、1以上のハライド、ヒドロキシル、アルキル基、チオール、保護されたチオール、アミノ基、保護されたアミノ基、アセチル、エステル、またはカルボン酸基で置換される。
【0092】
また、本発明の方法は、ハロゲン化アルキル側鎖基またはエポキシド側鎖基などの求電子側鎖基を保有する2以上のアミノ酸を共にライゲーションするために、または1以上のこれらのアミノ酸をペプチドまたはタンパク質に取り込むためにも使用することができる。このようなアミノ酸の取込みは、塩基(典型的には、ピペリジン)でFmoc保護基を除去する必要があるため、従来のペプチド合成では困難である。塩基は求核体としても作用することができ、求電子側鎖を攻撃する。たとえば、求電子側鎖を有するアミノ酸は、求電子側鎖を含むアジド酸を、最終モノマーとして合成ペプチドへ添加することによって製造され得る。そのペプチドの脱保護および樹脂からの切断は、求電子側鎖を保有するアジドペプチドを生じ、これは次に、本発明の方法を用いて、ホスフィノチオエステル基を保有する別のペプチドまたはタンパク質へライゲーションされ得る。
【0093】
本発明の方法によってライゲーション可能なアミノ酸は、特定の同位体が富化されたもの、例えば13Cまたは15N−富化アミノ酸を含む。使用することができる同位体で富化されたアミノ酸には、一般的なアミノ酸または一般的でないアミノ酸、β−アミノ酸、および求電子側鎖基を有するアミノ酸が含まれる。
【0094】
タンパク質およびペプチド中に一般的に見出されるアミノ酸はL−アミノ酸である。しかし、本発明は、D−アミノ酸、ならびにD−アミノ酸を含有するペプチドおよびタンパク質とともに機能する。RA基を含む反応物は、キラル非ラセミ、ラセミまたはアキラルであってもよい。所望のペプチドおよび/またはタンパク質の合成のために、適切なキラリティの反応物を容易に選択でき、かつ容易に入手可能である。RA基上の反応性官能基は、当該分野で公知のように、適切な保護基で保護することができる。保護基には、とりわけ、アセチル基、ベンジル基および他の保護基が含まれ、技術的に公知の方法またはペプチド合成において代表的に使用されるものが含まれる。当業者は、所定の官能基および所定の反応条件セットとともに使用するための技術的に公知の保護基を選択することができる。
【0095】
本明細書中で例証されるライゲーションは、ペプチドまたはタンパク質を生成するために使用することができる。ペプチドは、アミノ酸の間にアミド結合を形成するためのライゲーションサイクルを繰り返すことによって、スキーム5に示されるように合成することができる。特定の実施形態では、ペプチド合成は、アミノ酸のうちの1つが固体支持体または樹脂へ共有結合される固相法を用いて実行することができる。本発明のライゲーション方法と組み合わせて使用するために、種々の樹脂が当該分野で利用可能である。例えば、有機溶媒および水性溶媒の両方での使用に適合性のあるTentagel、PEGA、または他の樹脂は、本発明のライゲーション方法との組み合わせにおいて有用である。
【0096】
本発明のライゲーション方法は、固体支持体または樹脂上で成長中のペプチド鎖へアミノ酸を順次付加するために、従来の方法と組み合わせることができる。例えば、従来のFmoc化学は、本発明のホスフィノチオエステルおよびアジド反応物を使用する1以上のライゲーション工程と組み合わせることができる。特定の例では、本発明のライゲーション方法を用いて、従来の方法(例えばFmocベースの化学)で合成中のペプチド鎖へ、1以上のβ−アミノ酸、または求電子側鎖基を有する1以上のアミノ酸を導入することができる。
【0097】
図1は、固体法と組み合わせて本発明のライゲーション方法を使用する、タンパク質構築物のための典型的なアプローチを示す。このアプローチでは、第1のペプチド100は、そのC−末端を介して、チオエステル結合により樹脂101へ付着される。この第1のペプチドは、適切な保護基によりそのN−末端で保護される。この第1のペプチドは、例えば、従来の固相ペプチド合成法(例えばFmoc法)によって合成することができる。結合された第1のペプチド(100)は、2または20のようなホスフィノチオール試薬102と反応され、N−末端保護されたペプチドをホスフィノチオエステル104として樹脂から遊離させる。
【0098】
そのC−末端で樹脂101’へ付着され、そのN−末端に未保護のNH2基を有する(脱保護の後)第2のペプチド105は、アジド酸106と反応し、そのN−末端にアジド基を有する樹脂結合ペプチド107を形成する。アジド−N−末端ペプチド107は、次に、加水分解および窒素消失を伴って、非結合N−末端保護ホスフィノチオエステル104と反応し、第1および第2のペプチド108をライゲーションするアミド結合を形成する。ライゲーションされたペプチドは樹脂へ連結されたままである。
【0099】
ライゲーションされたペプチド108のN−末端を脱保護し;
脱保護されたペプチドをアジド酸と反応させて、そのN−末端にアジド酸を有する樹脂結合ペプチド107を生成し;そして
樹脂結合アジド酸ペプチドとホスフィノチオエステル104を、加水分解および窒素消失を伴って反応させて、ライゲーションされた樹脂結合ペプチド108を生成する、
というさらなるサイクルは、成長中のペプチド鎖へペプチドを付加する。このサイクルは所望のより大きなペプチドまたはタンパク質が合成されるまで継続される。
【0100】
図1のアプローチでは、ライゲーションされるべきペプチドのアミノ酸の反応性(または潜在的な反応性)の側鎖または側鎖基は、適切な保護基を用いて反応から保護される。所望されるより大きなペプチドまたはタンパク質が合成された後、側鎖保護基は、従来の方法および試薬を用いて除去される(脱保護)。より大きなペプチドまたはタンパク質は、所望の折りたたみを容易にする条件へ必要に応じて供され、ペプチドまたはタンパク質生成物は、樹脂から必要に応じて切断される。タンパク質の折りたたみはまた、樹脂からタンパク質を切断した後に行われることができることに留意のこと。
【0101】
従来の固体法で形成されるペプチドは、代表的には、約30〜50個の範囲のアミノ酸長であるため、約300個のアミノ酸長のタンパク質は、約8〜10回のさらなるサイクルを必要とする。
【0102】
ペプチドチオエステルは、従来の固相ペプチド合成(例えば、Fmocベースの固相合成)(Ingenito,R.;Bianchi,E.;Fattori,D.;Pessi,A.J.Am.Chem.Soc.1999,121,11369−11374、Shin,Y.;Winans,K.A.;Backes,B.J.;Kent,S.B.H.;Ellman,J.A.Bertozzi,C.R.J.Am.Chem.Soc.1999,121,11684−11689;Swinnen,D.;Hilvert,D.Org.Lett.2000,2,2439−2442)、またはrDNA技法(Muir他,1998、Evans,Jr.他,1998、Ayers他,2000、Holford他,1998、Cotton他,1999、Evans,Jr.,2000)から生じることができる。あるいは、ペプチドは、例えばタンパク質のフラグメントとして天然から、または組換えシステムでの発現によって、生成することができる。これらのペプチドは、従来の試薬および方法を用いてチオエステルへ誘導体化することができる。いかなる供給源由来のペプチドでも、例えば保護ペプチドのα−アミノ基とCF3SO2N3との反応によって、そのN−末端をアジドで誘導体化することができる(Zaloom,J.;Roberts,D.C.J.Org.Chem.1981,46,5173−5176)。アジド基はまた、従来の試薬および方法によってペプチドアミノ基へ付加することができる。
【0103】
本発明のライゲーションで用いられるような有機溶媒および水性溶媒での使用に適した固体支持材料、例えば樹脂は当該分野で公知であり、当業者は、実行される合成工程と適合可能な支持材料を容易に選択することができる。特に興味深いのは、本発明の方法を用いて後でライゲーションできるペプチドの合成のために、樹脂へのセーフティキャッチリンカー(safty−catch linker)を使用することである。ネイティブな化学的ライゲーションはセーフティキャッチリンカーを用いて実行されている。Brik,A.;Keinan E.;Dawson,P.E.;J.Org.Chem.2000(Jun)16:65(12):3829−3835を参照のこと。スキーム10は、セーフティキャッチ樹脂上で従来の方法によりペプチドを合成し、本発明のホスフィノチオール試薬を用いてペプチドを遊離させることを示す。
【0104】
当業者は、本発明のライゲーション工程と適合可能な従来の方法によって、樹脂結合ペプチドを容易に合成することができる。特定の実施形態では、感光性結合基によって、ペプチドを固相合成用樹脂へ連結することができる。このような基は適切な波長の照射により切断される。
【0105】
本発明の方法で有用な種々の側鎖基の保護基は当該分野で公知であり、所定の反応条件に対して容易に選択することができる。生成物ペプチドまたはタンパク質に対する実質的な損害なく、側鎖を脱保護し、樹脂からペプチドおよびタンパク質を切断するための方法は当該分野で公知である。アジド置換アミノ酸は、市販の供給源からか、または当該分野で周知の慣用的方法の適用により、容易に入手可能である。
【0106】
【化33】
本発明の方法で使用される反応物および試薬は市販の供給源から容易に入手可能であるか、または、本明細書中での説明の観点から、当該分野で周知の方法を用いて調製することができる。例えば、アジドグリコシド(例えば、アジドマンノース)およびアジドヌクレオシド(例えば、AZT)は当該分野で公知の方法により調製することができる。種々の生物学的に興味深い分子のチオエステルも、周知の方法により容易に入手することができる。ホスフィノチオエステルは、本明細書に説明された方法または当該分野で公知の方法により調製され、特に、転移チオエステル化(transthioesterification)反応またはカップリング反応による合成によって調製することができる。典型的な方法は実施例で提供される。アジド酸は容易に入手でき(Zaloom, J.;他、1981)、固相合成において使用することができる(Meldal,M.;Juliano,M.A.;Jansson,A.M.Tetrahedron Lett.1997,38,2531−2534)。また、シアル酸または特定の脂質のような種々の生物学的に興味深い分子のチオエステルも、公知の方法によって容易に入手可能である。
【0107】
ホスフィノチオール20を用いる本発明のライゲーション方法は、容易なタンパク質合成を可能にするために特に有用である。
【0108】
さらに、本発明のライゲーション方法はネイティブな化学的ライゲーション(および、他の有効なカップリングストラテジー、Tam,J.P.;Lu,Y.A.;Chuan−Fa,L.;Shao,J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995,92,12485−12489;Tam,J.P.;Yu,Q.;Miao,Z.Biopolymers 2000,51,311−332)に対して直交性であり、それゆえ、タンパク質合成の範囲を拡大する。さらには、両カップリング反応は、H2Oの存在下にて、未保護のペプチドで実行することができる。
【0109】
スキーム11はネイティブな化学的ライゲーション単独、Staudingerライゲーション単独、および2つの方法の連続的な組み合わせによって得ることができる最も単純なタンパク質を示す。チオール保護基またはアジド保護基の使用は、これらの方法の汎用性をさらにより拡大することができる。
【0110】
【化34】
本発明のライゲーション方法はまた、一般的に、生合成経路において天然のチオエステル中間体を阻止するために使用され得る。多数の生合成経路はチオエステル中間体の合成を介して進行する。(最近のレビューとしては、Katz,L Chem.Rev.1997,97,2557−2575;Khosla,C.Chem.Rev.1997,97,2577−2590;Marahiel,M.A.;Stachelhaus,T.;Mootz,H.D.Chem.Rev.1997,97,2651−2673;von Dohren,H;Keller,U.;Vater,J.;Zocher,R Chem.Rev.1997,97,2675−2705;Cane,D.E.;Walsch,C.T.;Khosla,C.Science 1998,282,63−68;Konz,D.;Marahiel,M.A.Chem.Biol.1999,6,R39−R48;Keating,T.A;Walsch,C.T.Curr.Opin.Chem.Biol.1999,3,598−606を参照のこと。)
例えば、ポリケチドの生合成およびタンパク質の非リボソーム生合成はどちらも、チオエステル中間体によって進行する。ホスフィノチオールによるこれらの中間体の阻止によって、アジドへのライゲーションはアミド結合を形成することが可能である。意義深いことには、チオエステルの生合成ライブラリとアジドの化学ライブラリとのライゲーションは、分子の多様性を増大するための容易な手段である。本発明のライゲーション方法を用いて形成される化学ライブラリは、当該分野で公知の種々の方法により生物学的機能についてスクリーニングされ得る。
【0111】
図1に例示されるように、本発明のライゲーション方法は、固相合成で実行され得る。ライゲーションにおけるチオエステルまたはアジド反応物のどちらかを、固体表面または支持材料へ結合し得る。固相法の使用は、本発明のライゲーションの繰り返しサイクルによるペプチドの合成のために、特に有利である。固相法の使用はまた、より大きいペプチドまたはタンパク質を製造するための2つ以上のペプチドまたはタンパク質のライゲーションのためにも有利である。結合チオエステルとホスフィノチオール試薬および非結合アジド、または結合アジドと非結合チオエステルおよびホスフィノチオール試薬の反応は、結合ライゲーション生成物を生じる。様々な種を固体表面または支持材料へ付着させるための従来の方法を使用して、チオエステル反応物またはアジド反応物のいずれかをこのような材料へ付着し得る。
【0112】
本発明のホスフィノチオールおよびアジドのライゲーションは、好ましくは、THFおよび水の混合物などの混合された有機/水性溶媒中で実行される。水はアミドホスホニウム塩の加水分解に関与し、所望のアミドを生成する。THFまたは他の有機溶媒(例えば、塩化メチレン、DMF)は、ホスフィノチオール試薬または反応物を可溶化するために含有される。従って、溶媒中に存在する水の量は、所望の加水分解をもたらすのに十分でなければならない。十分に水溶性のホスフィノチオール試薬では、ライゲーションを水性溶媒中で実行し得る。
【0113】
当業者は、本明細書の説明から見て、ライゲーションに使用される特定の反応条件(例えば、溶媒、反応温度および反応時間)が、所与の反応の特定の試薬(例えば、ホスフィノチオール)、反応物および生成物(例えば、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質)にまさに依存し得ることを理解する。反応条件は当該分野で理解される方法によって容易に最適化され得る。
【0114】
ホスフィノチオール2を用いる反応は、かつては、生成物の精製の前に(HClで)酸性にして実行された。少なくともホスフィノチオール20を使用する場合には、所望のアミド生成物を得るために反応混合物へ酸を添加する必要はないと考えられる。しかしながら、反応混合物の酸性化は、生成物の収率に影響を及ぼし得る。反応混合物へ塩基を添加することによって、適切な場合には、加水分解もまた容易になり得る。
【0115】
本発明のライゲーション方法の生成物は、当該分野で周知の従来の方法によって精製される。ペプチドおよびタンパク質を精製するための広範な種々の方法はいずれも、本発明の方法と組み合わせて使用され得る。
【0116】
チオエステルおよびアジドのライゲーションに基づくプロセスは、基礎研究および創薬のどちらにとっても、タンパク質の貴重な源である。本発明の方法は、強力な生物学的活性を有する、均質で、正確に折りたたまれたタンパク質への信頼できる経路として使用され得る。本発明の使用者は、タンパク質試薬およびタンパク質治療を製造および改良するために、合成および医化学の手段を応用し得る。
【0117】
以下の実施例は本発明をさらに説明することを意図したもので、決して、本発明を限定するつもりではない。
【0118】
(実施例)
(一般的な実験)
化学薬品および溶媒は、N−メチルメルカプトアセトアミド(Fluka(登録商標))、臭化ブロモアセチル(Acros(登録商標))、およびMerrifield樹脂(Novabiochem(登録商標))を除いて、Ardrich(登録商標)から購入した。使用したMerrifield樹脂(クロロメチルポリスチレン−ジビニルベンゼン)は、200〜400メッシュ(置換0.63mmol/g)および70〜90メッシュ(1.26mmol/g)であった。Whatman(登録商標)TLCプレート(AL SIL G/UV)を用いる薄層クロマトグラフィーによって反応を監視し、UVまたはI2によって視覚化した。BrukerのAC−300またはVarianのUNITY−500スペクトロメータを用いてNMRスペクトルを得た。リン−31NMRスペクトルをプロトンデカップリングし、重水素化リン酸の外部標準に対して参照した。マススペクトルは、ウィスコンシン大学バイオテクノロジセンター(University of Wisconsin Biotechnology Center)においてエレクトロスプレーイオン化(ESI)技術を用いて得られた。
【0119】
(実施例1)
(チオエステル1(ここで、Rは、HまたはBnである)(スキーム7を参照))
フレーム乾燥された反応容器へN−アセチルアミノ酸(N−アセチルグリシンまたはN−アセチルフェニルアラニン)および1当量のN−メチルメルカプトアセトアミド(NMA)をアルゴン雰囲気下でチャージし、最終濃度が0.5〜0.7Mになるように乾燥DMF(N,N−ジメチルホルムアミド)中に溶解した。DCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド、1.1当量)を添加して、室温で10〜12時間、混合物を攪拌した。DCU(ジシクロヘキシル尿素)副産物をろ過して除去し、減圧下で溶媒を除去した。CH2Cl2およびヘキサンから生成物を再結晶した。チオエステル1R=H)は収率90%で得られ、チオエステル1R=Bn)は収率92%で得られた。チオエステル1R=H)。1H NMR(DMSO−d6、1:1、300MHz)δ8.62(t、J=6Hz、1H)、8.05(bs、1H)、4.00(d、J=6Hz、2H)、3.56(s、2H)、2.59(d、J=4.5Hz、3H)、1.93(s、3H)ppm;13C NMR(DMSO−d6、75MHz)δ197.95、170.07、167.13、48.54、31.81、25.84、22.26ppm;MS(ESI)m/z204.25(M+=204.9、フラグメント105.9、100.0、72.0)。チオエステル1R=Bn)。1H NMR(CDCl3:CD3OD、1:1、500MHz)δ7.30−7.27(m、2H)、7.24−7.19(m、3H)、4.79(dd、J=10、5Hz、1H)、3.57(見かけ上(apparent)1、J=15Hz、2H)、3.24(ABX、J−14、5Hz、1H)、2.91(ABX、J=14、10Hz、1H)、2.76(s、3H)、1.95(s、3H)ppm;13C NMR(CDCl3:CD3OD、1:1、125MHz)δ200.26、172.83、169.92、136.93、129.47、128.98、127.40、61.24、37.73、32.72、26.72、22.40ppm;MS(ESI)m/z294.37(MH+−295.0、フラグメント190.0、162.2、120.2)。
【0120】
(2−ホスフィノベンゼンチオール(2))
化合物2(o−を、Block,E.;Ofori−Okai,G.;Zubieta,J.J.Am.Chem.Soc.1989,111,2327−2329の方法によって調製し、NMRデータ(1Hおよび31P)をその公表データと相関させた。さらなるスペクトルデータ。13C NMR(CDCl3、125MHz)δ137.71(d、J=30Hz)、135.93(d、J=8.75Hz)、135.35(d、J=9.75Hz)、133.98、133.83、130.45、129.25、129.00、128.67(d、J−6.75Hz)、125.92ppm;MS(ESI)m/z294.35(MH+−295.0)。
【0121】
(チオエステル3(R=HまたはBn))
方法A(チオエステル交換反応)。フレーム乾燥された反応容器へ化合物1(1当量)および化合物2(10当量)をアルゴン雰囲気下でチャージし、乾燥DMF(0.25M)中に溶解した。乾燥アルゴンを混合物中でバブリングさせ、ジイソプロピルエチルアミン(DIEA、5当量)を添加した。混合物を12時間攪拌したあと、さらに5当量のDIEAを添加した。少なくとも化合物2のモル量に等しい負荷容量(loading capacity)を有するMerrifield樹脂(高負荷容量および低負荷容量の両方を別々の場合に使用した)を混合物へ添加し、過剰のホスフィノベンゼンチオールおよびN−メチルメルカプトアセトアミドを除去した。この混合物をアルゴン下でさらに12時間攪拌し、樹脂をろ過して除去した。減圧下で溶媒を除去し、残渣をCH2Cl2中に溶解させ、不溶のDIEA塩をろ過して除去した。再び溶媒を除去し、残渣は、さらに精製することなく次のカップリング反応で使用した。反応は、TLCで判断されるように、定量的収率で進行した。
【0122】
方法B(DCCカップリング)。フレーム乾燥された反応容器へ化合物1R=HまたはR=Bn)(1当量)および化合物2(1当量)をアルゴン雰囲気下で添加した。DCC(1.1当量)を添加し、反応を12時間攪拌した。DCU副産物をろ過して除去し、減圧下で溶媒を除去した。クロマトグラフィー(シリカゲル、酢酸エチル:ヘキサン1:1、その後100%酢酸エチル)により化合物3R=HまたはR=Bn)を精製した。化合物3R=H)は61%の収率で得られ、化合物3R=Bn)は52%の収率で得られた。チオエステル3(R=H)。1H NMR(CDCl3、500MHz)δ7.48(ddd、J−5.5、4、1.5Hz、1H)、7.41(td、J=7.5、1.5Hz、1H)、7.37−7.32(m、7H)、7.28−7.24(m、4H)、6.92(ddd、J=7.5、3、1.5Hz、1H)、5.86(bs、1H0、4.07(d、J=6Hz)、2H)、2.02(s、3H)ppm;13C NMR(CDCl3、125MHz)δ194.83、170.63、144.04、138.00、136.68(d、J=10.75Hz)、134.84、134.69、130.95、130.30、129.68、129.34(d、J=6.88Hz)、49.78、23.69ppm;31P NMR(CDCl3、202Hz)−9.91ppm;MS(ESI)m/z393.44(MH+−394.2、フラグメント295.2、225.2)。チオエステル3(R=Bn)。1H NMR(CDCl3、500MHz)δ7.44(ddd、J=7.5、4、1.5Hz、1H)、7.40(td、J=7.5、1.5Hz、1H)、7.36−.31(m、7H)、7.28−7.21(m、7H)、7.12−7.10(m、2H)、6.89(ddd、J=8、3、1Hz、1H)、5.63(d、J=13.5Hz、1H)、4.92(m、1H)、2.95(ABX、J=14.5、5.5Hz、1H)、2.64(ABX、J−14、8Hz、1H)、1.91(s、3H)ppm;13C NMR(CDCl3、125MHz)δ197.47、170.43、137.94、136.40、134.83、134.75、134.67、134.58、130.79、130.30、129.94、129.64(d、J=5.9Hz)、129.33、127.77、60.29、38.24、23.79ppm;31P NMR(CDCl3、202Hz)−10.33ppm;MS(ESI)m/z483.56(MH+−484.2、フラグメント295.2)。
【0123】
(アジド4)
フレーム乾燥された反応容器へベンジルアミン(20.4mL、186mmol)および塩化メチレン(186mL)をアルゴン雰囲気下で添加し、溶液を氷浴中で0℃まで冷却した。臭化ブロモアセチル(8.1mL、93mmol)を溶液へ滴下した。ほぼ即座に、溶液からベンジルアミンのHBr塩が沈殿した。反応を室温まで暖め、1時間攪拌した。ベンジルアミン塩をろ過して除去し、有機相を2NのHCl(75mL)で2回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で溶媒を除去した。得られた白色固体をTHF(200mL)および水(50mL)中に溶解させた。アジ化ナトリウム(30.3g、466mmol)を添加し、混合物を17時間還流させながら激しく攪拌した。次に有機層を水層から分離させ、飽和食塩溶液(75mL)で2回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で溶媒を除去した。アジド6を98%の収率で単離し、更に精製することなく使用した。スペクトルデータ。1H NMR(CDCl3、300MHz)δ7.39−7.27(m、5H)、6.71(bs、1H)、4.47(d、J=5、7Hz)、4.00(s、2H)ppm;13C NMR(CDCl3、125MHz)δ166.66、137.39、128.43、127.45、127.35、52.06、43.08ppm;MS(ESI)m/z190.20(MH+=191.0、フラグメント91.2)。
【0124】
(アミド5R=HまたはBn))
チオエステル3R=HまたはBn)(1当量)およびアジド6(1当量)をTHF:H2O(3:1)中0.2Mの濃度へ溶解させた。おそらく、遊離したチオレートから、黄色が急速に生じた。室温で12〜16時間、混合物を攪拌し、次に、黄色が透明になるまで2NのHClで酸性にした。減圧下で溶媒を除去し、クロマトグラフィー(シリカゲル、塩化メチレン中2.5〜10%メタノール)によって、アミド生成物をホスフィンオキシド副産物(これもスペクトル的に特徴付けたが、データは示さない)から分離した。精製はしばしば複数のカラムを必要とした。アミド7および8の収率は15%〜40%の範囲であった。アミド5R=H)。1H NMR(CDCl2:CD3OD、1:1、500MHz)δ7.33−7.22(M、5H)、4.41(s、2H)、3.92(s、2H)、3.86(s、2H)、2.01(s、3H)ppm;13C NMR(CDCl3:CD3OD、1:1、125MHz)δ173.56、171.52、170.67、138.83、129.04、218.02、127.78、43.70、43.62、43.16、22.45ppm;MS(ESI)m/z263.29(MH+−264.0)。アミド5R=Bn)。1H NMR(CDCl3:CD3OD、1:1、500MHz)δ7.32−7.19(m、10H)、4.48(見かけ上、t、J−7.5Hz、1H)、4.44(d、J=15Hz、1H)、4.34(d、J=14.5Hz、1H)、3.95(d、J=16.5Hz、1H)、3.71(d、J=16.5Hz、1H)、3.11(dd、J=13.5、7Hz、1H)、2.94(dd、J=14、8Hz、1H)、1.88(s、3H)ppm;13C NMR(CDCl3:CD3OD、1:1、125MHz)δ173.42、172.81、170.34、138.61、137.18、129.55、129.01、128.93、127.86、127.68、127.40、56.12、43.53、43.18、37.76、22.36ppm;MS(ESI)m/z353.42(MNa+=376.2、MH+=354.2、フラグメント165.2、120.2、91.2)。
【0125】
(実施例2)
(ホスフィンオキシド24(スキーム9参照))
新たに蒸留したTHF(240mL)中にクロロメチルホスホン酸ジクロリド23(20g、120mmol)を溶解した。臭化フェニルマグネシウム(1.0M)のTHF(240mL、240mmol)溶液を1時間にわたって滴状で添加した。得られた混合物を24時間還流させながら攪拌した。次に水(20mL)の添加によって反応を失活させ、減圧下で溶媒を除去した。残渣をCH2Cl2中に溶解させ、水(50mL)で1回、および食塩水(50mL)で1回洗浄した。無水MgSO4(s)により有機層を乾燥させ、ろ過し、減圧下で溶媒を除去した。フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、塩化メチレン中3%のメタノール)によって残渣を精製した。ホスフィンオキシド24は、白色固体として収率63%で単離された。スペクトルデータ。1H NMR(CDCl3、500MHz)δ7.84−7.79(m、4H)、7.62−7.58(m、2H)、7.54−7.50(m、4H)、4.05(d、J=7Hz、2H)ppm;13C NMR(CDCl3、125MHz)δ132.60、131.51(d、J=9.6Hz)、129.64(d、J=103.9Hz)、128.72(d、J=11.6Hz)、37.64(d、J=71.9Hz)ppm;31P NMR(CDCl3、202Hz)28.46ppm;MS(ESI)m/z250.03(MH+=251.0、M2H+−501.2、フラグメント173.0、143.0、91.0)。
【0126】
(化合物25)
ホスフィンオキシド24(18.94g、75.6mmol)をTHF(0.45L)中に溶解した。チオ酢酸(34.3mL、480mmol)を添加し、得られた溶液を氷浴中で冷却した。Ar(g)を反応混合物中に1時間バブリングさせた。ジイソプロピルエチルアミン(83.6mL、480mmol)を滴状で添加し、得られた混合物を24時間還流させて加熱した。別の一定量のチオ酢酸を、室温に放置すると凝固するオレンジオイルとして単離した。次に(35.2mL、492mmol)を添加した後、トリエチルアミン(60.0mL、492mmol)を添加した。反応混合物をさらに24時間還流させて加熱し、その後、よく換気したフード内で(悪臭!)、減圧下で溶媒を除去した。得られた黒色オイルを塩化メチレン(0.35L)に溶解し、この溶液を2NのHCl(0.15L)、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(0.15L)、および食塩水(0.15L)で洗浄した。有機層を無水MgSO4(s)で乾燥させ、ろ過した。この溶液へ活性炭を添加し、次に30分間還流させて加熱した。活性炭をろ過によって除去し、減圧下で溶媒を除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン中70&酢酸エチル)で精製した。溜まった画分を塩化メチレン(0.30L)に溶解し、活性炭による処理を繰り返した。溶媒を除去して、チオアセテート25を、室温に放置すると凝固するオレンジオイルとして単離した。この反応の収率は85%であった。スペクトルデータ。1H NMR(CDCl3、500MHz)δ7.80−7.75(m、4H)、7.56−7.52(m、2H)、7.49−7.46(m、4H)、3.77(d、J=8Hz、2H)、2.25(s、3H)ppm;13C NMR(CDCl3、125MHz)δ192.82、132.11、131.05(d、J=102Hz)、130.86(d、J=9.75Hz)、128.46(d、J=12.63Hz)、29.83、27.12(d、J=69.88Hz)ppm;31P NMR(CDCl3、202MHz)δ29.14ppm;MS(ESI)m/z290.05(MH+=291.0、M2H+=581.2、フラグメント249.2、171.0、125.0)。
【0127】
(ホスフィン26)
チオアセテート25(18.65g、64.2mmol)を無水クロロホルム(160mL)中に溶解した。この溶液へ、トリクロロシラン(97mL、963mmol)を添加し、混合物をAr(g)下で72時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し(注意:除去した溶媒中の過剰のトリクロロシランは、十分換気したフード内で飽和炭酸水素ナトリウム溶液をゆっくり添加することによって失活させた)、残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、塩化メチレン中3%のメタノール)により精製した。ホスフィン26は、白色固体として98%の収率で単離された。スペクトルデータ。1H NMR(CDCl3、500MHz)δ7.43−7.40(m、4H)、7.33−7.30(m、6H)、3.50(d、J=4Hz、2H)、2.23(s、3H)ppm;13C NMR(CDCl3、125MHz)δ194.01、136.42(d、J=13.6Hz)、132.28(d、J=19.4Hz)、128.69、128.11(d、J=6.8Hz)、29.83、25.41(d、J=23.4Hz)ppm;31P NMR(CDCl3、202MHz)−15.11ppm;MS(ESI)m/z274.06(MH+=275.0、フラグメント233.0、199.2、121.2)。
【0128】
((ジフェニルホスフィノ)メタンチオール(20))
ホスフィン26(17.27g、63.0mmol)を無水メタノール(0.40L)中に溶解し、Ar(g)を1時間、溶液中にバブリングさせた。次に水酸化ナトリウム(5.04g、127mmol)を添加し、混合物をアルゴン下で2時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、残渣を塩化メチレン(0.30L)に溶解させた。得られた溶液を2NのHCl(2×0.10L)および塩水(0.10L)で洗浄した。有機層をMgSO4(s)で乾燥させ、ろ過し、減圧下で溶媒を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(アルミナ、ヘキサン中25%の酢酸エチル)で精製した。(ジフェニルホスフィノ)メタンチオール2は、透明オイルとして収率74%で単離された。スペクトルデータ。1H NMR(CDCl3、300MHz)δ7.41−7.38(m、4H)、7.33−7.26(m、6H)、3.02(d、J=7.8Hz、2H)、1.38(t、J=7.5Hz、1H)ppm;13C NMR(CDCl3、75MHz)δ132.54(d、J=17.1Hz)、128.86、128.36、128.14、20.60(d、J=21.7Hz)ppm;31P NMR(CDCl3、121MHz)δ−7.94ppm;MS(ESI)m/z232.05(MH+−233.0、フラグメント183.0、155.0、139.0、91.2)。
【0129】
(AcPheCH2PPh2(表1))
方法A(チオエステル転移反応)。ホスフィノチオール20(500mg、2.2mmol)を乾燥THF(5mL)に溶解した。溶液を、0.5時間Ar(g)をバブリングさせることによって、酸素除去した。この溶液へNaH(51.6mg、2.2mmol)を添加した。混合物はスラリーを形成し、これにDMF(2mL)を添加して、任意の沈殿物を溶解させた。N−アセチルフェニルアラニンのN−メチルメルカプトアセトアミド(NMA)チオエステル(63mg、0.22mmol)を添加し、反応混合物を8時間攪拌した。Merrifield樹脂(1.5g、1.26mmol/g)を添加し、6時間攪拌し、ろ過で樹脂を除去することによって、未反応ホスフィノチオール20を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン中50%の酢酸エチル)で精製した。AcPheSCH2PPh2は、白色固体として収率92%で単離された。
【0130】
方法B(DCCカップリング)。化合物20(500mg、2.15mmol)およびN−アセチルフェニルアラニン(446mg、2.15mmol)をDMF(15mL)にAr(g)下で溶解させた。次に、1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、489mg、2.37mmol)を添加し、反応混合物を室温で12時間攪拌した。1,3−ジシクロヘキシル尿素(CU)副産物をろ過により除去し、減圧下で溶媒を除去し、方法Aと同様に残渣をクロマトグラフィーで精製した。AcPheSCH2PPh2は、白色固体として84%の収率で単離された。スペクトルデータ。1H NMR(CDCl3、300MHz)δ7.44−7.39(m、4H)、7.35−7.33(m、6H)、7.26−7.21(m、3H)、7.11−7.09(m、2H)、6.29(d、J=8.4Hz、1H)、4.98−4.91(m、1H)、3.57−3.44(m、2H)、3.09(dd、J=14.1、5.4Hz、1H)、2.93(dd、J=14.1、7.5Hz、1H)、1.88(s、3H)ppm;13C NMR(CDCl3、125MHz)δ198.901、169.86、135.50、132.62(d、J=19.4Hz)、129.11(d、J−9.8Hz)、128.79(d、J=35.9Hz)、128.50、128.45、126.99、59.56、37.99、25.61(d、J=24.4Hz)、22.88ppm;31P NMR(CDCl3、121MHz−44.55ppm。
【0131】
(AcGlyCH2PPh2(表1))
方法A。ホスフィノチオール20(500mg、2.2mmol)を5mLの乾燥THFに溶解させた。溶液を、0.5時間Ar(g)をバブリングさせることによって、酸素除去した。この溶液へNaH(51.6mg、2.2mmol)を添加した。混合物はスラリーを形成し、これにDMF(2mL)を添加して、任意の沈殿物を溶解させた。N−アセチルグリシンのNMAチオエステル(44mg、0.22mmol)を添加し、反応混合物を8時間攪拌した。Merrifield樹脂(1.5g、1.26mmol/g)を添加し、6時間攪拌し、ろ過で樹脂を除去することによって、未反応ホスフィノチオール20を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン中50%の酢酸エチル)で精製した。AcGlyCh2PPh2は、白色固体として収率91%で単離された。
【0132】
方法B。ホスフィノチオール20(100mg、0.43mmol)およびN−アセチルグリシン(55mg、0.47mmol)をDMF(3mL)にAr(g)下で溶解させた。DCC(98mg、0.47mmol)を添加し、混合物を室温で12時間攪拌した。DCU副産物をろ過により除去し、減圧下で溶媒を除去し、方法Aと同様に残渣をクロマトグラフィーで精製した。AcGlyCH2PPh2は、白色固体として67%の収率で単離された。スペクトルデータ。1H NMR(CDCl3、300MHz)δ7.46−7.39(m、4H)、7.38−7.36(m、6H)、6.44(bs、1H)、4.15(d、J=5/7Hz、2H)、3.53(d、J=3.6Hz、2H)、2.02(s、3H)ppm;13C NMR(CDCl3、75MHz)δ196.13、170.29、136.45(d、J=13.6Hz)、132.62(d、J=19.1Hz)、129.17、128.54(d、J=6.7Hz)、48.98、25.29(d、J−24.2Hz)、22.84ppm;31P NMR(CDCl3、121MHz)δ−15.20ppm;MS(ESI)m/z331.08(MH+−332.2、MK+−370.0)。
【0133】
(AcGlyNHBn(表1))
チオエステルAcSCH2PPh2(271mg、0.99mmol)およびアジドN2GlyNHBn(187mg、0.99mmol)をTHF/H2O(3:1、9.4mL)に溶解させ、混合物を室温で12時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、塩化メチレン中5%のメタノール)によって残渣を精製した。AcGlyNHBnは、白色固体として収率91%で得られた。スペクトルデータ。1H NMR(CDCl3:CD3OD、1:1、125MHz)δ171.76、169.37、137.49、127.83、126.77、126.59、42.50、42.09、21.32ppm;MS(ESI)m/z206.11(MH+−207.0)。
【0134】
他のアミド生成物について、およびNMAチオエステルについての実験的およびスペクトル的情報は、Nilsson,B.L.;Kiessling,L.L.;Raines,R.T.Org.Lett.2000,2,1939−1941のサポーティングインフォメーション(Supporting Information)に見出され得、これはその全体が本明細書中に参考として援用される。
【0135】
(実施例3:セーフティキャッチ樹脂を用いるペプチドホスフィノチオエステルの合成)
ペプチドの合成および活性化。BackesおよびEllmanの方法(Backes,B.J.;Ellman,J.A.J.Org.Chem.1999,64,2322−2330)に従って、4−スルファミルブチリルAM樹脂(Novabiochem 01−64−0152)をFmocGlyOHで充填した。Glu(tBu)およびCys(Trt)によるペプチド鎖伸長を、標準PyBOP/HOBtカップリング手順を用いて実行した。
【0136】
樹脂の活性化。約1gの樹脂(0.477mmolのペプチド)をCH2Cl2中で1時間膨潤させ、次に排出した。ヨードアセトニトリル(1.8mL、25mmol)、ジイソプロピル−エチルアミン(DIPEA、1.7mL、10mmol)、および1−メチル−2−ピロリジノン(NMP、40mL)を混合し、塩基性アルミナのプラグによってろ過し、続いて樹脂へ添加した。室温で18時間、Ar(g)をバブリングさせることによって樹脂を攪拌した。次に樹脂をNMP(5×10mL)、DMF(5×10mL)およびCH2Cl2(5×10mL)で洗浄した。次に樹脂を、直ちに次の工程で使用した。
【0137】
ペプチドホスフィノチオエステルの樹脂からの遊離。20mLのDMF中の(ジフェニルホスフィノ)メタンチオール(0.88g、3.8mmol)を活性セーフティキャッチ樹脂へ添加した。Ar(g)をバブリングさせることによって混合物を18時間攪拌した。次に樹脂をろ過し、DMF(5×10mL)およびCH2Cl2(5×10mL)で洗浄した。溶出液を捕集し、減圧下で溶媒を除去した。残渣をクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン中30%EtOAc)により精製し、285mg(0.27mmol)のFmocCys(Trt)Glu(tBu)GlySCH2PPh2を白色固体として得た。活性ペプチドについてのFmoc−充填アッセイ(Fmoc−loading assay)に基づいて、これは、所望のペプチドホスフィノチオエステルの収率57%であることを示す。
【0138】
当業者は、本明細書中に特に開示された以外の方法、試薬、反応物、反応条件(例えば、溶媒、温度、反応時間)および精製方法が、必要以上の実験なしに本発明の実行において使用可能であることを理解する。本明細書中に特に開示または説明された方法、試薬、反応物、反応条件、および精製方法の当該分野で公知の全ての機能的等価物は、それぞれが参考として個々に援用されるように、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、本発明の連結方法のタンパク質合成への適用を示す図である。
Claims (57)
- アミド結合を形成する方法であって、該方法は、アミド結合を形成するために、ホスフィノチオエステルをアジドと反応させ、次いで結合された反応物を加水分解する工程を包含する、方法。
- 前記ホスフィノチオエステルが活性カルボン酸誘導体とホスフィノチオールとの反応によって形成される、請求項1に記載の方法。
- 前記反応が加水分解を容易にするのに十分な水の存在下で実行される、請求項1に記載の方法。
- 前記反応が水性有機媒質中で実行される、請求項1に記載の方法。
- 前記反応がTHFおよび水の混合物中で実行される、請求項4に記載の方法。
- 前記ホスフィノチオールがo−(ジフェニルホスフィノ)−ベンゼンチオールである、請求項2に記載の方法。
- 前記ホスフィノチオールが(ジフェニルホスフィノ)−メタンチオールである、請求項2に記載の方法。
- ペプチドが形成される、請求項1に記載の方法。
- タンパク質が形成される、請求項1に記載の方法。
- 前記ホスフィノチオエステルがアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質のホスフィノチオエステルである、請求項1に記載の方法。
- 前記アジドがアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質のアジドである、請求項1に記載の方法。
- 前記ホスフィノチオエステルまたは前記アジドのうちの少なくとも1つがβ−アミノ酸のホスフィノチオエステルまたはアジドである、請求項1に記載の方法。
- 前記ホスフィノチオエステルまたは前記アジドのうちの少なくとも1つが求電子側鎖基を有するアミノ酸のホスフィノチオエステルまたはアジドである、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記ホスフィノチオールが以下の式:
R1およびR2は、ハロゲン化基、OH基、OR基、COH基、COR基、COOH基、COOR基、またはN(R’)2基で必要に応じて置換される脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から、独立して選択される基であり、ここでRは、他のRとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各R’は、他のR’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、RおよびR’は次いで、R1およびR2について上に列挙されるように必要に応じて置換され得;R1およびR2において、1つ以上の隣接しないCH2基はO、S、CO、COO、またはCONR’で置き換えられ得;そして
R3〜R8は、R1およびR2について上に列挙されるように必要に応じて置換され得る、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から、独立して選択され、R3〜R8において、1つ以上の隣接しないCH2基はO基、S基、CO基、COO基、またはCONR’基で置き換えられ得、ここで各R’は、他のR’とは独立して、R1およびR2について上に列挙されるように必要に応じて置換される水素、脂肪族基、脂環式基、または芳香族基であり、そしてここで、R1およびR2は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得るか、または、R3〜R8のうちの2つ以上は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得る、式、
を有する、方法。 - 請求項14に記載の方法であって、ここで、前記ホスフィノチオールが以下の式:
R3〜R4は、独立して、R1およびR2について上に列挙されるように必要に応じて置換され得る水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から選択される基であり、R3〜R8において、1つ以上の隣接しないCH2基はO基、S基、CO基、COO基、またはCONR’基で置き換えられ得;ここで各R’は、他のR’とは独立して、R1およびR2について上に列挙されるように必要に応じて置換される水素、脂肪族基、脂環式基、または芳香族基であり、そしてここで、R1およびR2は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得るか、または、R3〜R8のうちの2つ以上は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得る、式、
を有する、方法。 - 前記ホスフィノチオールにおいて、R3およびR4はどちらも水素であり、そしてR1およびR2がフェニル基または置換フェニル基の群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記ホスフィノチオールのR1およびR2基がn−ブチル基である、請求項15に記載の方法。
- 前記ホスフィノチオールのR1およびR2基がポリエーテルである、請求項14に記載の方法。
- R1およびR2がフェニル基または置換フェニル基である、請求項20に記載の方法。
- R1およびR2が電子供与基または電子吸引基で置換されたフェニル基である、請求項21に記載の方法。
- ペプチドまたはタンパク質の合成方法であって、ここで該方法は、該ペプチドまたはタンパク質のアミド結合のうちの少なくとも1つが、請求項1に記載の方法によって形成される、方法。
- 従来の固相合成で形成された2つのペプチドが前記アミド結合の形成によってライゲーションされる、請求項23に記載の方法。
- 組換えDNA発現法で形成された2つのペプチドまたはタンパク質が前記アミド結合の形成によってライゲーションされる、請求項23に記載の方法。
- 従来の固相法により形成されたペプチドまたはタンパク質が前記アミド結合の形成によって、組換えDNA発現法で形成されたペプチドまたはタンパク質へライゲーションされる、請求項23に記載の方法。
- ペプチドがアミノ酸の間にアミド結合を形成する連続的な一連のライゲーションによって形成される、請求項23に記載の方法。
- 請求項1に記載のライゲーション工程を包含する、ペプチドまたはタンパク質をレポータ分子で標識するための方法。
- 以下の式:
R1およびR2は、ハロゲン化基、OH基、OR基、COH基、COR基、COOH基、COOR基、またはN(R’)2基で必要に応じて置換される脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から、独立して選択される基であり、ここでRは、他のRとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各R’は、他のR’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、RおよびR’は次いで、R1およびR2について上に列挙されるように必要に応じて置換され得;R1およびR2において、1つ以上の隣接しないCH2基はO、S、CO、COO、またはCONR’で置き換えラ得:そして、
R3〜R8は、R1およびR2について上に列挙されるように必要に応じて置換され得る、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から、独立して選択され、R3〜R8において、1つ以上の隣接しないCH2基はO基、S基、CO基、COO基、またはCONR’基で置き換えられ得、ここで各R’は、他のR’とは独立して、R1およびR2について上に列挙されるように必要に応じて置換される水素、脂肪族基、脂環式基、または芳香族基であり、そしてnおよびmが両方とも0であり、そしてR3およびR4が両方とも水素である場合を除いて、R3〜R8のうちの2つ以上は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得、R1およびR2はフェニル基または置換フェニル基であってはならない、式、
を有する、ホスフィノチオール試薬。 - 前記ホスフィノチオールが、以下の式:
R3〜R4は、独立して、R1およびR2について上に列挙されるように必要に応じて置換され得る水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から選択される基であり、R3〜R8において、1つ以上の隣接しないCH2基はO基、S基、CO基、COO基、またはCONR’基で置き換えられ得、ここで各R’は、他のR’とは独立して、R1およびR2について上に列挙されるように必要に応じて置換される水素、脂肪族基、脂環式基、または芳香族基であり、そしてR3およびR4が両方とも水素である場合を除いて、R1およびR2、または、R3〜R8のうちの2つ以上は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得、次いでR1およびR2はフェニル基または置換フェニル基であってはならない、式、
を有する、請求項29に記載の試薬。 - 前記ホスフィノチオールのR1基およびR2基がn−ブチル基である、請求項30に記載の試薬。
- 前記ホスフィノチオールのR1基およびR2基がポリエーテルである、請求項29に記載の試薬。
- 前記ホスフィノチオールが、以下の式:
を有する、請求項29に記載の試薬。 - R1およびR2がフェニル基または置換フェニル基である、請求項34に記載の試薬。
- R1およびR2が電子供与基または電子吸引基で置換されたフェニル基である、請求項34に記載の試薬。
- nおよびmが両方とも0である、請求項34に記載の試薬。
- R1およびR2が両方とも水素である、請求項34に記載の試薬。
- R1およびR2が両方ともフェニル基である、請求項34に記載の試薬。
- R1およびR2が両方ともn−ブチル基である、請求項34に記載の試薬。
- (ジフェニルホスフィノ)メタンチオールである、請求項29に記載の試薬。
- 請求項29に記載のホスフィノチオール試薬を1つ以上含む、活性カルボン酸誘導体とアジドとの間にアミド結合を形成するためのキット。
- 請求項29に記載のホスフィノチオール試薬を1つ以上含む、ペプチドまたはタンパク質の合成用キット。
- アミノ酸側鎖のための1つ以上の保護剤をさらに含む、請求項43に記載のキット。
- 固相合成用の樹脂をさらに含む、請求項43に記載のキット。
- 前記樹脂がセーフティキャッチ樹脂である、請求項44に記載のキット。
- アジドペプチドを生成するための試薬をさらに含む、請求項44に記載のキット。
- チオエステルを生成するための試薬をさらに含む、請求項46に記載のキット。
- ライゲーションを行うための1つ以上の溶媒をさらに含み、そしてライゲーションを実行するための使用説明書を必要に応じて含む、請求項43に記載のキット。
- 前記ホスフィノチオエステルが脂質のホスフィノチオエステルである、請求項1に記載の方法。
- 前記アジドがアジドペプチドまたはアジドタンパク質である、請求項50に記載の方法。
- 前記アジドがヌクレオシドアジドである、請求項1に記載の方法。
- 前記ホスフィノチオエステルがペプチドまたはアジドタンパク質のホスフィノチオエステルである、請求項52に記載の方法。
- 前記アミド結合が糖類をペプチドへライゲーションさせる、請求項1に記載の方法。
- 前記アミド結合が脂質をペプチドへライゲーションさせる、請求項1に記載の方法。
- 前記アミド結合がヌクレオシドをペプチドへライゲーションさせる、請求項1に記載の方法。
- 前記アミド結合が核酸をペプチドへライゲーションさせる、請求項1に記載の方法。
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