CN101300266A - 侧链延伸连接 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括羧基硫酯的第一成分与包括带支链侧链的氨基官能化化合物的第二成分的化学连接，从而产生在连接部位具有酰胺键的连接产物的方法和组合物，所述侧链包括可除去的巯基辅助物。本发明的反应物是化学选择性的而巯基部分是可从连接产物中除去的。巯基的除去可以被利用以在连接部位产生天然的侧链。本发明的方法和组合物对肽和多肽的连接特别有用。本发明的连接系统可应用于各种分子，因此可以被用以生成肽、多肽和其他含氨基酸的聚合物。

Description

侧链延伸连接

相关申请的交叉参考

本申请要求2005年6月16日递交的美国临时专利中请No.60/691,396的优先权，该专利为了所有的目的全部通过引用结合到本文中。

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发明背景

化学连接涉及第一化学成分和第二化学成分之间的共价连接的形成。存在于第一和第二成分上的独特的、相互反应的官能基团可用于使连接反应具有化学选择性。几种不同的化学过程已用于该目的，其实例包括形成酰胺的连接反应(Dawson等，Science 1994，266，776-779；Kent等，WO 96/34878；Kent等，WO 98/28434；Botti等，WO02/20557；及Kent等，WO 02/20034)；形成肟的化学连接反应(Rose等，J.Amer.Chem.Soc.1994，116，30-34)，形成硫酯的连接反应(

等，Science 1992，256，221-225)，形成硫醚的连接反应(Englebretsen等，Tet.Letts.1995，36，8871-8874)，形成腙的连接反应(Gaertner等，Bioconj.Chem.1994，5，333-338)，形成噻唑烷的连接反应和形成噁唑烷的连接反应(Zhang等，Proc.Natl.Acad.ScL 1998，95，9184-9189；Tam等，WO 95/00846；美国专利No.,589,356)。

最广泛使用的形成酰胺的连接反应称为天然化学连接反应(“NCL”)(Kent等，WO 96/34878)。天然化学连接反应涉及具有C-端α-羧基硫酯部分的第一肽或多肽片段与具有N-端半胱氨酸残基的第二肽或多肽片段之间的化学选择性反应。硫醇交换反应产生最初的硫酯连接的中间体，该中间体自然重排在连接部位生成天然酰胺键，同时使半胱氨酸侧链巯基再生。天然化学连接反应被用于多种目的，包括多肽和蛋白质的固相合成(Canne等，WO 98/56807；Low等，WO04/105685)、膜多肽和蛋白质的合成及难合成的肽的通用合成方法(Kochendoerfer等，WO 00/12536)、可溶性受体区域的合成(Kochendoerfer，G.，WO 00/53624)、聚合物修饰的肽和蛋白质的构建(Kochendoerfer等，WO 02/20033)，以及被修改为应用于水可溶性保护基团(Kochendoerfer等，WO 04/060925)、减少副反应(Kochendoerfer等，WO 02/20033；Botti等，WO 04/007661)、扩展保护基团的选项(Kochendoerfer等，WO 02/20033；Villain等，WO 02/098902)、及培养另外的硫酯生成策略(Botti等，WO 02/18417；Botti等，WO03/106615；Miranda等，WO 04/061094；Miranda等，WO 04/011424；Miranda，L.，WO 04/060863)。原始的NCL技术的主要缺点是要求有N-端半胱氨酸，即它仅允许在连接部位拥有半胱氨酸的肽和多肽片段的结合。

在半胱氨酸以外的位置形成酰胺的化学连接反应已有报道。一种方法，称为延伸的天然化学连接反应或ENCL，采用将带C-端羧基硫酯的第一肽与带N-端氨基取代的、连接反应后可除去的辅助巯基的第二肽片段邻接(Botti等，WO 02/20557；Botti等，WO 03/042235)。第二种方法，称为假天然化学连接反应PNCL，涉及将C-端羧基硫酯肽与带N-端半胱氨酸的肽片段反应(如NCL)，接着进行连接部位的半胱氨酸侧链巯基的化学修饰生成“假氨基酸”(Kent等，WO 02/20034)。ENCL和PNCL的缺点是与连接反应部位所采用的特定氨基酸有关的可变的反应产率。例如，如NCL方法，ENCL和PNCL方法在涉及β-支链氨基酸的连接反应部位进行得很差。

因此，所需要的是除先前的形成酰胺的连接技术之外，提供可选择的、广泛适用的和耐用的化学连接系统。本发明针对这些和其他需要。

发明简要概述

本发明涉及用于侧链延伸的化学连接的方法和组合物。有利的是，连接反应具有快的反应速度并以高产率产生连接产物。

根据一个方面，本发明提供通过酰胺键连接成分的方法。该方法包括将式J₁-C(O)SR的成分与式NH₂-CH(XSH)-J₂的成分在足够形成具有式J₁-C(O)-NH-CH(XSH)-J₂的巯基取代的连接产物的条件下接触，其中，J₁为第一目标分子、聚合物或表面的残基；R为可与硫酯相容的基团；XSH为具有可除去的巯基辅助物(auxilliary)的支链氨基酸侧链并选自式-CH(R′)-SH的β-巯基辅助物和式-CH₂-CH(R′)-SH的γ-巯基辅助物，其中R′为氢以外的氨基酸侧链的残基；且J₂为第二目标分子、聚合物或表面的残基。在另一方面，本发明也提供了除去巯基辅助物生成式J₁-C(O)-NH-CH(XH)-J₂的连接产物的方法，其中XH为选自式-CH₂(R′)和式-CH₂-CH₂(R′)的氨基酸侧链。

根据另一方面，本发明提供了具有式P₁-NH-CH(XSH)-J₂的成分，其中P₁为可除去的氨基保护基团或氢；XSH为支链氨基酸侧链成分并选自式-CH(R′)-SH的β-巯基辅助物和式-CH₂-CH(R′)-SH的γ-巯基辅助物，其中R′不同于氢，而除去巯基辅助物后产生的残基CH₂R′和CH₂-CH₂R′为氨基酸侧链；且J₂为目标分子、聚合物或表面的残基。

根据再一方面，本发明提供了具有式J₁-C(O)-NH-CH(XSH)-J₂的连接产物，其中J₁为第一连接成分的残基，XSH为具有可除去的巯基辅助物的支链氨基酸侧链并选自式-CH(R′)-SH的β-巯基辅助物和式-CH₂-CH(R′)-SH的γ-巯基辅助物，其中R′为不同于氢的氨基酸侧链残基，且J₂为第二连接成分的残基。

参考本说明书的剩余部分(包括附图和权利要求)，将实现本发明的其他特征和优势。本发明的其他特征和优势，以及本发明的各种实施方案的结构和操作，在下面用附属的图和反应流程详细描述。

附图简要说明

图1显示采用β-支链巯基辅助物的肽侧链延伸的化学连接；相同的反应流程可用于进行任何合适的分子的连接，包括与γ-支链巯基辅助物的连接。

图2描述了反式-(2R，2S)-苯基半胱氨酸衍生物的合成反应流程。

图3描述了顺式-(2R，2S)-苯基半胱氨酸衍生物的合成反应流程。

图4描述了反式和顺式苯基半胱氨酸衍生物和一锅化连接/烷基化/脱硫反应的联合反应流程。

图5显示采用反式-苯基半胱氨酸(2R，3S)的C-端肽LYRAG-硫酯与N-端肽^HSF-YAKYAKL的一锅化连接/烷基化/脱硫反应的HPLC色谱图。

图6显示采用顺式-苯基半胱氨酸(2R，3S)的C-端肽LYRAG-硫酯与N-端肽^HSF-YAKYAKL的一锅化连接/烷基化/脱硫反应的HPLC色谱图。

发明详述

本发明涉及与宽范围的肽、多肽、其他聚合物和其他分子的侧链化学连接相关的方法和组合物。特别是，本发明提供将成分连接形成酰胺键的方法。

I.定义

如本文中使用，术语“目标分子”指小分子、聚合物或表面。目标分子可以是一价的或多价的。此类目标分子可以是分子量至少为100且至多10,000或大于10,000的有机分子(它们包括生物来源的分子以及具有无机成分的有机分子)。此类有机分子的分子量将典型地为至少1000，更典型地在约1000-2000的范围内。典型地，目标分子将是生物学上重要的蛋白、多肽、肽、氨基酸、核酸、脂质体或治疗药剂。小分子意味着分子量小于1,000，优选，该小分子为有机分子。

术语“聚合物”意味着由结构性单位和由共价化学键连接的重复单位组成的长分子。重复单位是低到中等分子量的小分子，并在聚合反应期间相互连接。聚合物，包括低聚物，可以是合成的聚合物或天然存在的聚合物。聚合物的实例包括但不限于蛋白质、核酸、脂质体和碳水化合物。典型地，聚合物的分子量大于1000。

如本文中使用，术语“表面”指二维的多方面(dimensionalmanifold)。表面材料的实例包括但不限于例如玻璃、塑料、金属、纤维和各种层析材料。

如本文中使用，术语“肽”指通过肽键共价连接的两个或多个氨基酸。肽有意指天然存在的和重组形式的、以及其他非天然存在形式的肽或蛋白质。非天然存在形式的肽可以充分地与天然存在的肽或蛋白质相同以拥有类似的生物学或化学活性。肽优选具有2-50个氨基酸。蛋白质通常可具有大于50个氨基酸。可用于肽分子中的氨基酸包括在蛋白质中发现的天然存在的那些氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、谷酰胺、天门冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。术语氨基酸还包括天然存在的氨基酸的类似物、衍生物和同类物，它们中的一种或多种可存在于肽衍生物中。例如，氨基酸类似物可具有增长的或缩短的侧链或具有适当官能基的变体侧链。

当氨基酸的结构具有立体异构体形式时也包括氨基酸的D和L立体异构体。术语“肽衍生物”还包括含有模拟肽主链但不是氨基酸的分子(所谓的肽模拟物)，例如苯并二氮杂分子的化合物(参见例如James，G.L.等，Science 1993，260，1937-1942)。

如本文中使用，术语“硫酯”指由硫与酰基基团的键合产生的化合物，通式为R²⁰-C(O)S-R³⁰，其中R²⁰和R³⁰各自独立地为小分子、聚合物或表面的残基。

如本文中使用，术语“HBTU”指O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基-脲阳离子-六氟-磷酸盐-肽偶联剂。

如本文中使用，术语“TBTU”指O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲阳离子四氟硼酸盐-肽偶联剂。

如本文中使用，术语“TCEP”指三(2-羧乙基)膦-水可溶性还原剂。

II.概述

本发明涉及与侧链延伸的连接相关的方法和组合物。在一个方面中，本发明的侧链延伸的连接方法涉及将式J₁-C(O)SR的第一成分与式NH₂-CH(XSH)-J₂的第二成分在足够在该第一和第二成分之间形成酰胺键并产生具有式J₁-C(O)-NH-CH(XSH)-J₂的巯基取代的连接产物的条件下接触。在某些实施方案中，J₁为第一目标分子、聚合物或表面的残基；-R可以是具有可与硫酯相容的官能基团的小分子、聚合物或表面的残基；R基团的实例包括但不限于芳基、苄基、烷基和如“有机合成中的保护基团(Protecting Groups in Organic Synthesis)”，第3版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts著，John Wiley & Sons，Inc.，出版，1999中描述的硫保护基团；XSH为包括可除去的巯基辅助物的任选为支链的氨基酸侧链并选自式-CH(R′)-SH的β-巯基辅助物和式-CH₂-CH(R′)-SH的γ-巯基辅助物，条件是XSH不是具有式(CH₃)₂CSH、或

的基团；R′为氢以外的氨基酸侧链的残基；且J₂为第二目标分子的残基。J₁和/或J₂的最小长度优选为至少10、15、20、30或40个残基长度。R′基团的实例包括但不限于烷基，例如异丙基、甲基、乙基和亚乙基(ethylene)；芳基，例如苯基和羟苯基；烯丙基硫烷基；氨基甲酰基(-C(O)NH₂)；氨基甲酰基烷基；吲哚基、羟基羰基；氨基烷基；胍烷基；和咪唑基。本领域技术人员将理解，可能干扰连接反应的官能基团可以适当地保护。

本发明也涉及可能还包括除去巯基辅助物生成式J₁-C(O)-NH-CH(R′)-J₂的连接产物的步骤的方法。优选，J₁-、R′和-J₂如上所定义。

本发明的组合物涉及前体化合物，例如一种成分，该成分包含式P₁-NH-CH(XSH)-J₂，以及包含具有式J₁-C(O)-NH-CH(XSH)-J₂的巯基取代的连接产物的组合物。在某些优选的实施方案中，P₁是可除去的氨基保护基团或氢；-CH(XSH)、J₁-和-J₂如上所定义。合适的氨基保护基团在“有机合成中的保护基团(Protecting Groups in OrganicSynthesis)”，第3版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts著，John Wiley &Sons，Inc.，出版，1999中有描述。在另一个方面中，本发明也涉及包括本发明的一种或多种组合物作为一种或多种成分的药盒。

本发明的方法和组合物扩展了形成酰胺的化学连接反应的范围，而本发明的起始、中间和最终产物已发现广泛的用途。一个优势是式中的J₁、J₂或J₁和J₂可包括宽范围的化学部分或被连接以结合宽范围的化学部分，这些化学部分包括氨基酸、肽、多肽、核酸或其他化学部分例如染料、半抗原、碳水化合物、脂类、固体支持物、可生物相容的聚合物或其他聚合物等。另一个优势是本发明的形成酰胺的连接化学是耐用的并且可以在接近中性pH的系统中和在一定范围的水性条件下进行。再一个优势是本发明能进行“一锅化”连接和巯基辅助物除去、以及保留或除去其他巯基保护基团(当它们在可相容的条件下存在时)。再一个优势是快的连接反应速度和连接产物的高产率。

III.连接方法

在一个方面中，本发明的方法涉及将式J₁-C(O)SR的第一成分与式NH₂-CH(XSH)-J₂的第二成分在足够在该第一和第二成分之间形成酰胺键并产生式J₁-C(O)-NH-CH(XSH)-J₂的巯基取代的连接产物的条件下接触。在一个实施方案中，该方法可还包括除去巯基辅助物生成式J₁-C(O)-NH-CH(XH)-J₂的连接产物的步骤，其中XH为选自式-CH₂(R′)和式-CH₂-CH₂(R′)的氨基酸侧链。该方法可举例说明如下：

(a)J₁-C(O)SR+NH₂-CH(XSH)-J₂

(b)J₁-C(O)-NH-CH(XSH)-J₂

(c)J₁-C(O)-NH-CH(XH)-J₂

在某些实施方案中，J₁-为第一目标分子的残基。J₁可以是与化学选择性连接反应相容的任何化学部分，例如受保护的或未受保护的氨基酸、肽、多肽、其他聚合物、染料、连接剂等。-C(O)-为羰基基团，-S-为硫基团，-R为具有可与硫酯相容的官能基团的小分子、聚合物或表面的残基。R基团的实例包括但不限于芳基、苄基、烷基和如“有机合成中的保护基团(Protecting Groups in Organic Synthesis)”，第3版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts著，John Wiley & Sons，Inc.，出版，1999中描述的硫保护基团。在某些实施方案中，R基团可以是C_1-15官能化的烷基，直链的或支链的；C_1-15芳香结构；20个氨基酸或其衍生物；及分子量大于1000的肽。-XSH为支链氨基酸侧链，它包括可除去的巯基辅助物并选自式-CH(R′)-SH的β-巯基辅助物和式-CH₂-CH(R′)-SH的γ-巯基辅助物，其中R′为不同于氢的氨基酸侧链残基。J₂为第二目标分子的残基。目标分子J₁和J₂可以相同或不同，例如小分子、聚合物或表面的残基。

在某些实施方案中，J₁和J₂各自独立地为小分子、聚合物或表面的残基。J₁和/或J₂的最小长度优选为至少10、15、20、30或40个残基长度。J₁和/或J₂的长度可以为45、50、60、70、80、90或100个残基长度。优选的J₁和J₂基团的实例包括肽或多肽的残基，它们可任选包括一个或多个受保护的氨基酸侧链。肽或多肽的残基可包括选自天然存在的氨基酸、类似物、衍生物、同类物、非天然存在的氨基酸及其组合的氨基酸。优选的肽残基可包含范围为约10-20、20-30、25-35、30-40、35-50、40-60、50-80或50-100个的氨基酸。

小分子的实例包括但不限于永久的或可除去的保护基团、染料、荧光团、连接剂、洗涤剂、示踪剂、小分子药物和各种小有机物例如氨基酸、核苷酸、核苷、糖、脂类等。聚合物包括但不限于肽、多肽、核酸、脂类、碳水化合物、纤维等。表面的实例包括但不限于例如玻璃、塑料、金属、纤维和各种层析材料，并且优选适合于官能化氨基酸的连接。

R可以是与硫酯基团相容的任何基团，这些基团包括但不限于芳基、苄基、烷基基团和硫保护基团。R的实例包括3-羧基-4-硝基苯基硫酯、苄基硫酯和巯基丙酸亮氨酸硫酯(参见，例如Dawson等，Science1994，266，776-779；Canne等，Tetrahedron Lett.1995，36，1217-1220；Kent等，WO 96/34878；Kent等，WO 98/28434；Ingenito等，J.Am.Chem.Soc.1999，121，11369-11374；及Hackeng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999，96，10068-10073)。其他实例包括二硫苏糖醇或烷基或芳基硫酯，它们可以通过intein-介导的生物学技术制备，它们也是众所周知的(参见，例如Chong等，Gene 1997，192，277-281；Chong等，Nucl.Acids Res.1998，26，5109-5115；Evans等，Protein Science 1998，7，2256-2264；及Cotton等，Chemistry & Biology 1999，6，247-256)。

在某些实施方案中，羧基硫酯可以按照本领域已知的标准技术通过化学或生物学方法制备，例如本文中，包括实施例中描述的那些。对化学合成而言，羧基硫酯肽可以在溶液中合成或者由硫酯生成树脂合成，这些技术是众所周知的(参见，例如Dawson等，同上；Canne等，同上；Hackeng等，同上，Hojo H，Aimoto，S.(1991)Bull Chem Soc Jpn64；111-117)。例如，化学合成的硫酯肽可以由相应的肽-α-硫代酸制备，而肽-α-硫代酸又可以在硫酯树脂上或在溶液中合成，虽然更优选树脂方法。肽-α-硫代酸可以转化成相应的3-羧基-4-硝基苯基硫酯、相应的苄酯、或者各种烷基硫酯中任一种。所有这些硫酯为连接反应提供了满意的离去基团，其中3-羧基-4-硝基苯基硫酯显示出比相应的苄基硫酯稍快的反应速度，而苄基硫酯又可能比烷基硫酯反应性更强。作为另一个实例，三苯甲基相关联的巯基丙酸亮氨酸硫酯生成树脂可用于构建C-端硫酯(Hackeng等，同上)。C-端硫酯的合成也可以采用3-羧基丙磺酰胺安全制动装置连接器，通过用重氮甲烷或碘乙腈激活，接着用合适的硫醇置换实现(Ingenito等，同上；Shin等，(1999)J.Am.Chem.Soc，121，11684-11689)。硫酯化合物也可以为需要一步或多步涉及亲核条件的合成而构建，例如基于Fmoc的肽的合成(WO02/18417；WO 03/106615)，或者为具有反应性接近硫酯部分的酸性基团的硫酯化合物而构建(WO 04/007661)。

肽或多肽C-端羧基硫酯也可以采用生物学方法制备。例如，有或无标记(例如亲合力标签)的intein表达系统，可用于在合适的硫醇的存在下开发“intein”蛋白-接合元素的可诱导的自身裂解活性，以产生C-端硫酯肽或多肽片段。特别是，intein在硫醇例如DTT、β-巯基乙醇、β-巯基乙烷磺酸或半胱氨酸的存在下经历专属性的自身裂解，这产生带C-端硫酯的肽的片段。参见，例如Chong等，(1997)同上；Chong等，(1998)同上；Evans等，同上；和Cotton等，同上；WO 03/106615；WO02/098902。

本发明的带巯基的成分与带羧基硫酯成分的连接生成在连接部位具有酰胺键，并具有可除去的巯基辅助物的连接产物。选择该反应的连接条件以维持硫酯与巯基部分的选择性反应性。在优选的实施方案中，连接反应在pH6-8，优选pH范围为6.5-7.5的缓冲溶液中进行。该缓冲溶液可以是水性溶液、有机溶液或其混合物。连接反应也可以包括一种或多种催化剂和/或一种或多种还原剂、脂类、洗涤剂、其他变性剂或增溶剂等。优选的催化剂的实例有硫醇、咪唑和含磷化氢部分，例如苯硫酚、组氨酸、苄硫醇、TCEP和烷基膦。变性剂和/或增溶剂的实例包括胍盐、在水中的脲，或者与水混合或与水中的胍盐和脲混合的有机溶剂例如TFE、HFIP、DMF、NMP、乙腈。温度也可用于调节连接反应的速度，通常在5℃-55℃之间，其中优选的温度为15℃-40℃之间。作为一个实例，连接反应在2％苯硫酚/6M胍盐、pH在6.8-7.8之间的反应系统中进行得很好。

巯基辅助物基团的除去优选在连接反应完成后进行。在优选的方法中，将巯基烷基化，接着水解生成巯基辅助物从其中除去的连接产物，例如反应流程I中所描述的(以β-支链辅助物巯基衍生物为例)，其中烷基化反应优选用卤化物官能化的烷基基团，例如溴乙酰胺或碘乙酰胺进行。烷基化反应后(或者与其同时)，所改变的巯基辅助物可以通过水解除去，例如如反应流程II中所例举的用锌-醋酸促进巯基键的裂解，在连接部位生成稳定的、未取代的残基侧链。

流程I

可认识到，一种或多种催化剂和/或赋形剂也可在裂解系统中使用，例如一种或多种清除剂、洗涤剂、溶剂、金属等。一般而言，特定清除剂的选择取决于所存在的氨基酸。例如，清除剂的存在可用于抑制裂解期间产生的阳碳离子对某些氨基酸可能具有的破坏作用(例如Met、Cys、Trp和Tyr)。其他添加剂像洗涤剂、聚合物、盐、有机溶剂等也可用于通过调节溶解度改善裂解。催化剂或其他调节氧化还原系统的化学品也可能是有利的。

流程II

也将是显而易见的是，各种其他物理-化学条件例如缓冲系统、pH和温度可以按常规调节使特定的裂解系统，例如肽可相容的裂解条件最佳化。“肽可相容的裂解条件”指可与肽相容的并且适合于巯基部分从连接产物中裂解的物理-化学条件。肽可相容的裂解条件一般根据所采用的巯基部分选择，这可以通过常规和众所周知的方法轻易地推断出(参见，例如“有机合成中的保护基团(Protecting Groups inOrganic Synthesis)”，第3版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts著，John Wiley&Sons，Inc.出版，1999；NovaBiochem Catalog 2000；″合成肽，使用者指南(Synthetic Peptides，A User′s Guide)″，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman&Company，New York，NY，1992；″组合&固相有机化学高级化学技术手册(Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid PhaseOrganic Chemistry)″，W.D..Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；″肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis )，第2版″，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；″肽合成实践(The Practice ofPeptide Synthesis)，第2版″，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；及″保护基团(Protecting Groups)″，PJ.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。

本发明的连接方法可用于制备各种治疗上重要的蛋白质，这些蛋白质包括但不限于单克隆和多克隆抗体；抗病毒蛋白；激素例如胰岛素；细胞因子例如肿瘤坏死因子，包括菌落刺激因子例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；干细胞生长因子；淋巴因子；IL-2和IL-3；生长因子，包括PDGF、EGF；肽激素，包括hGH和红细胞生成素；血液凝固因子，包括因子VIII；免疫原；酶和酶抑制剂；配体；疫苗抗原；血浆蛋白例如纤维蛋白原、免疫球蛋白或其片段；酶例如组织纤溶酶原激活剂等。

IV.组合物

在一个实施方案中，本发明的组合物包括带有用可除去的巯基辅助物取代的侧链的β-分支的或γ-分支的氨基酸残基，以及前体、中间体和包含该残基的连接产物。优选的氨基酸组合物包含式I的β-分支的巯基辅助物(即2-巯基氨基)：

在某些优选的实施方案中，J₁和J₂各自独立地为小分子、聚合物或表面的残基；R为氢或巯基保护基团；R₁和R₂各自独立地为氢或有机基团，条件是至少R₁和R₂之一包含有机基团。R₁和R₂基团的实例包括但不限于烷基，例如异丙基、甲基、乙基和亚乙基；芳基，例如苯基和羟苯基；烯丙基硫烷基；氨基甲酰基(-C(O)NH₂)；氨基甲酰基烷基；吲哚基、羟基羰基；氨基烷基；胍氨基；和咪唑基，条件是R₁和R₂不同时为CH₃基团或者R₁和R₂一起不形成五元或六元碳环。本领域技术人员将理解，可能干扰连接反应的官能基团可以合适地保护。小分子的实例有永久的或可除去的保护基团、染料、荧光团、连接剂、洗涤剂、示踪剂、小分子药物和各种小有机物例如氨基酸、核苷酸、核苷、糖、脂类等。聚合物包括肽、多肽、核酸、脂类、碳水化合物、纤维等。表面的实例包括例如玻璃、塑料、金属、纤维和各种层析材料，并且优选适合于官能化氨基酸的连接。优选的J₁和J₂基团的实例包括肽或多肽的残基，它们可任选包括一种或多种受保护的氨基酸侧链。有机基团的实例包括不同于甘氨酸的氨基酸侧链的组分，尤其是未受保护或受保护形式的标准的20个基因编码氨基酸的侧链。式I的化合物也可包括环状衍生物，例如用R₁和R₂取代的噻唑烷衍生物。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含γ-分支的巯基辅助物(即3-巯基氨基)的氨基酸组合物，并包含式II；

其中J₁、J₂、R、R₁和R₂如上所定义。

根据本发明式I和式II的化合物的合成可以按本文中所描述的，及按照本领域已知的标准有机化学技术进行。参见，例如“高等有机化学、反应、机理和结构(Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms，and Structure)”，第4版，J.March(Ed.)，John Wiley & Sons，New York，NY，1992；“综合有机转化反应，官能基制备指南(Comprehensive Organic Transformations，A Guide to Functional GroupPreparations)”，R.Larock(Ed.)，VCH Publishers，New York，NY，1989。它们可以在溶液中合成、通过聚合物支持的合成方法合成或通过所述方法的组合合成。用于合成的试剂可以从任一商业来源获得。同样，将充分理解的是，起始成分和各种中间体，例如各种氨基酸衍生物可以贮藏供以后使用，以药盒提供等。

优选的纯度为在随后的所期望的化合物的纯化或分离前，连接组合物中所期望的被连接化合物的纯度至少为75、80、85、90、95和100％。

合成可以采用保护基团策略。用于各种合成策略中的优选的保护基团(PG)一般可与固相肽合成(“SPPS”)相容。在某些情况中，使用在不同条件下可除去的直角保护基团也是必要的。许多此类保护基团是已知的并且适合于该目的(参见，例如“有机合成中的保护基团(Protecting Groups in Organic Synthesis)”，第3版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts著，John Wiley & Sons，Inc.出版，1999；NovaBiochem Catalog 2000；″合成肽，使用者指南(Synthetic Peptides，A User′s Guide)″，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；″组合&固相有机化学高级化学技术手册(Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial & Solid Phase Organic Chemistry)″，W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；″肽合成原理(Principles of PeptideSynthesis)，第2版″，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；″肽合成实践(The Practice of Peptide Synthesis)，第2版″，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；及″保护基团(ProtectingGroups)″，PJ.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。实例包括苄氧基羰基(Z)、Boc、Bpoc、Trt、Nps、FmocCl-Z、Br-Z；NSC；MSC、Dde等。对硫部分而言，合适的保护基团的实例包括但不限于苄基、4-甲基苄基、4-甲氧基苄基、三苯甲基、Acm、TACAM、呫吨基、二硫化物衍生物、皮考基(pieolyl)和苯甲酰甲基。

根据式I的优选的化合物包括根据反应流程III合成的受保护的氨基酸衍生物，它们可以方便地被制备为易生成肽或其他相关合成物的受保护衍生物，如叔丁氧基羰基(Boc)和对甲基苄基(P-CH₃-C₆H₄CH₂-)保护的衍生物，其中R′是相关的受保护的或未受保护的氨基酸侧链。例如，当期望与基于Boc的肽合成相容时，相关的氨基酸侧链例如苯丙氨酸(Phe，或F)侧链可以在合成中是未受保护的，而酪氨酸(Tyr或Y)侧链可以带有O-2-溴苄氧基羰基(2BrZ)基团。参照反应流程III，合成可采用区域异构体(如图所示)或单一异构体。一般按照反应流程III，将三苯基膦加至适当溶剂(例如CH₃CN)中的所需叠氮醇，然后回流，除去溶剂并纯化吖丙啶。通过加入在适当溶剂中的4-甲基苄基硫醇，并在温和的Lewis酸催化剂(例如三氟化硼乙醚合物)的存在下，用辅助性硫醇修饰吖丙啶。所期望的对甲基苯磺酰基保护的中间体然后可以通过标准方法从有机层纯化，接着加入N-端保护基团(例如Boc)，并通过标准方法将羧基脱保护。

流程III

根据式II的优选的化合物包括根据反应流程I合成的受保护的氨基酸衍生物，它们可以方便地被制备为易生成肽或其他相关合成物的受保护衍生物。参照反应流程I，制备具有所期望的氨基酸侧链R′(例如苄基/Phe侧链)的(E)-4-(对-甲苯基硫基)-4-R′-2-烯酸苯酯，并加入AD-混合-α和甲磺酰胺的水溶液形成环状硫酸酯。然后将环状硫酸酯转化成叠氮化合物并进一步按反应流程III制备。

本发明也提供本发明的侧链辅助物巯基组合物的受保护形式。这些化合物对自动化肽合成及直角和集合连接策略尤其有用。这些组合物包含完全保护的，以及部分保护的化合物。许多此类保护基团是已知的并适合于该目的(参见，例如“有机合成中的保护基团(ProtectingGroups in Organic Synthesis)”第3版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts著，John Wiley & Sons，Inc.出版，1999；NovaBiochem Catalog 2000；″合成肽，使用者指南(Synthetic Peptides，A User′s Guide)″，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；″组合&固相有机化学高级化学技术手册(Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial &Solid Phase Organic Chemistry)″，W.D..Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，AdvancedChemtech，1998；″肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis)，第2版″，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；″肽合成实践(The Practiceof Peptide Synthesis)，第2版″，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；及″保护基团(Protecting Groups)″，PJ.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。

本发明的侧链辅助物巯基组合物可用于与各种连接方法组合，例如，天然化学连接(Dawson，等，Science(1994)266：776-779；Kent，等，WO 96/34878)，延伸的一般化学连接(Kent，等，WO 98/28434)，形成肟的化学连接(Rose，等，J.Amer.Chem.Soc.(1994)116：30-33)，形成硫酯的连接(

等，Science(1992)256：221-225)，形成硫醚的连接(Englebretsen，等，Tet.Letts.(1995)36(48)：8871-8874)，形成腙的连接(Gaertner，等，Bioconj.Chem.(1994)5(4)：333-338)，及形成噻唑烷的连接和形成噁唑烷的连接(Zhang，等，Proc.Natl Acad.Sci.(1998)95(16)：9184-9189；Tarn，等，WO 95/00846)或其他方法(Yan，L.Z.和Dawson，P.E.，″Synthesis of Peptides and Proteins without CysteineResidues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization(通过天然化学连接与脱硫结合合成无半胱氨酸残基的肽和蛋白质)，″J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，通过引用结合到本文中；Gieselnan等，Org.Lett.20013(9)：1331-1334；Saxon，E.等，″Traceless″StaudingerLigation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds(用于化学选择性合成酰胺键的“无痕”Staudinger连接).Org.Lett.2000，2，2141-2143)。

本发明也包括在连接产物上接枝聚合物的组合物。普遍承认的是，肽或蛋白质的性质可以通过将有机链样分子接枝到其上而提高。这些分子经常是基于聚乙二醇的(基于“PEG”的，即基于重复单位-CH₂CH₂O-)。参见例如，Tsutsumi等，Jpn.J.Cancer Res.1994，85，9-12。基于PEG的链是两性的、非致免疫的和对蛋白水解酶的裂解不敏感的。已由PEG或基于PEG的链改性的材料的制备减少了致免疫性和抗原性。参见例如，Abuchowski等，Journal of Biological Chemistry 1977，252，3578-3581。PEG也起增加它所连接的材料的分子大小的作用，从而增加了其生物半衰期。PEG改性的材料的这些有益的性质使得它们在各种治疗应用中非常有用。下列专利申请(它们通过引用结合到本文中)报道了各种生物学上重要的蛋白质的基于PEG的改性：美国专利No.4,179,337；4,609,546；4,261,973；4,055,635；3,960,830；4,415,665；4,412,989；4,002,531；4,414,147；3,788,948；4,732,863；和4,745,180；欧洲专利No.152,847；1984年1月11日公布的EP98110；和JP5792435。聚酰胺链也可用作提高性质的有机链样分子。另外，啮齿动物急性毒性筛选提示聚酰胺既无毒性也无致免疫性(Hai等，Bioconj.Chem.1998，9，645-654)。

PEG链或基于PEG的链在蛋白质上的接枝是已知的。参见例如，Zalipsky，美国专利No.5,122,614，该专利描述了被转化成其N-琥珀酰亚胺碳酸酯衍生物的PEG。用反应性基团修饰PEG链以促进在蛋白质上的接枝也是已知的。参见例如，Harris，美国专利No.5,739,208,该专利描述了为了选择性地连接于分子和表面上的巯基部分而用砜部分活化的PEG衍生物，及Harris等，美国专利No.5,672,662,该专利公开了具有单个丙酸或丁酸部分的PEG酸的活性酯。该领域在Zalipsky，Bioconjugate Chemistry 1995，6，150-165(1995)中已广泛地述及。除了使用PEG外，Wright，EP 0605963A2描述了含有与蛋白质上的醛基形成腙连接的水可溶性聚合物的连接试剂。

本发明的方法和组合物具有许多用途。本发明的方法和组合物在连接肽、多肽和其他聚合物上特别有用。

实施例

给出了下列制备和实施例使本领域技术人员能够更清楚地理解和实施本发明。它们不应被认为是限制本发明的范围，而仅是例证性和代表性的。

实施例1：一般材料和方法

根据标准程序，在PAM树脂或硫酯生成树脂上，使用用于Boc-化学的原位中和/HBTU活化程序，通过SPPS，用改良的ABI 433A肽合成器，以逐步的方式合成肽(Hackeng等，同上；Schnolzer等，Int.J.Pept.Prot.Res.，1992，40，180-193；及Kent，S.B.H.Ann.Rev.Biochem.1988，57，957-984)。链组装后，将肽脱保护并同时通过用含5％对甲酚的无水氟化氢(HF)处理使之裂解，并冷冻干燥和用制备HPLC纯化。

实施例2：反式-和顺式-苯基半胱氨酸的设计

作为用于本发明侧链延伸的化学连接方法的最初的试验残基，构建了可加入到肽片段中的苯丙氨酸残基。由于苄基位置上硫醇的存在，有两种可能的可用于连接的几何异构体：

这两种异构体，在同侧(顺式苯基半胱氨酸)或在对侧(反式苯基半胱氨酸)具有两个反应部分(硫醇和胺)，在连接中或在脱硫化/裂解步骤或两个步骤期间可能会具有不同的性质。因此，这两种异构体的合成对于找到可用于我们的方案中的最好的异构体(连接和裂解两个步骤)而言是必要的。

实施例3：(2R，3S)-2，3-二羟基-3-苯基丙酸苄酯的制备

参考图2，向室温搅拌着的AD-混合-α(9.8g)和甲磺酰胺(666mg，7mmol)/t-BuOH(ml)和水(ml)的溶液中加入肉桂酸苄酯(1.67g，7mmol)。将所得混合物室温搅拌24小时。加入亚硫酸钠(10.5g)，并将该混合物搅拌30分钟，用乙酸乙酯稀释，水洗涤。有机层用MgSO₄干燥，过滤并浓缩。硅胶闪式层析(乙酸乙酯/戊烷1/2)得到白色固体化合物1(1.55g，81％)。

实施例4：环状硫酸酯的制备

参考图2和3，向冰冷却搅拌着的二醇1(680mg，2.5mmol)和三乙胺(695μl，5mmol)/二氯甲烷(5ml)溶液中经10分钟滴加亚硫酰氯(275μl，3.75mmol)。将混合物搅拌10-15分钟，用冷乙醚稀释并用冷水洗涤。水层用乙醚萃取。合并的有机层用MgSO₄干燥，过滤并浓缩。将粗的环状亚硫酸酯溶于水(14ml)、CH₃CN(7ml)和CCl₄(7ml)的混合物中。加入高碘酸钠(802mg，3.75mmol)和RuCl₃水合物(催化量)并将所获得的混合物室温剧烈搅拌1小时，用乙醚稀释，并将有机层通过C盐垫过滤。将该有机层用水、饱和NaHCO₃溶液和盐水洗涤，MgSO₄干燥，过滤并浓缩。硅胶闪式层析(乙酸乙酯/戊烷1/4)得到无色油状化合物2(568mg，63％)。

实施例5：区域异构体(2S，3S)-2-叠氮基-3-羟基-3-苯基丙酸苄酯和(2R，3S)-3-叠氮基-2-羟基-3-苯基丙酸苄酯混合物的制备

参考图2，向搅拌着的环状硫酸酯2(568mg，1.7mmol)/丙酮(10ml)和水(1ml)的溶液中加入固体NaN₃(138mg，2.13mmol)。将该反应混合物于0℃搅拌5分钟然后室温搅拌2小时，并减压浓缩。加入乙醚(7ml)和水(2ml)，并将该溶液冷却到0℃，接着滴加H₂SO₄ 20％水溶液(7ml)。将所得混合物于0℃搅拌1小时，然后令其缓慢升温到室温并室温搅拌3小时。收集有机层，用饱和NaHCO₃溶液和水洗涤，MgSO₄干燥，过滤并浓缩。硅胶闪式层析(乙酸乙酯/戊烷1/4)得到白色固体区域异构体混合物3a，b(384mg，76％)。

实施例6：(2S，3R)-3-苯基吖丙啶-2-羧酸苄酯的制备

参考图2，向搅拌着的叠氮醇3a，b(384mg，1.29mmol)/CH₃CN(6ml)的溶液中室温下加入固体三苯基膦(351mg，1.34mmol)。将该混合物室温搅拌1小时然后回流6小时。除去溶剂后，由硅胶闪式层析(乙酸乙酯/戊烷1/4)分离得到纯的吖丙啶4(250mg，77％)白色固体。

实施例7：(2R，3S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(4-甲基苄基硫烷基)-3-苯基丙酸

参考图2，向搅拌着的吖丙啶4(125mg，0.5mmol)和4-甲基苄基硫醇(135μl，1mmol)/二氯甲烷(5ml)的溶液中于0℃滴加三氟化硼乙醚合物(95μl，0.75mmol)。将混合物于0℃搅拌6-8小时然后令其缓慢升温到室温过夜。然后通过加入饱和NaHCO₃将该反应猝灭并将有机层用盐水、水洗涤，MgSO₄干燥，过滤并浓缩。硅胶闪式层析(乙酸乙酯/戊烷1/2)得到无色油状化合物5a(150mg，77％)。将该产物溶解于THF(3ml)。该溶液用NEt₃(54μl，0.39mmol)处理，并加入Boc₂O(84mg，0.38mmol)。然后将该反应混合物室温搅拌过夜，浓缩。将粗的残渣溶解于二氧六环(2.2ml)并加入4M NaOH溶液(475μl，1.90mmol)。将所得混合物室温搅拌17小时。加入水并将水层用乙酸乙酯萃取，然后用IM HCl溶液酸化并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用MgSO₄干燥，过滤并浓缩。硅胶闪式层析(乙酸乙酯/戊烷1/1)得到白色固体化合物(2R，3S)-6a(85mg，62％)。

实施例8：(2S，3R)-3-溴-2-羟基-3-苯基丙酸苄酯的制备

参考图2和3，向搅拌着的环状硫酸酯2(2.1g，6.29mmol)/THF(88ml)的溶液中室温加入固体LiBr(2.07g，23.89mmol)。将所得混合物室温搅拌过夜，然后浓缩。加入乙醚(30ml)和水(5ml)，并将该溶液冷却到0℃，接着滴加H₂SO₄20％水溶液(40ml)。将该混合物于0℃搅拌2-3小时然后室温搅拌6小时。收集有机层，用饱和NaHCO₃溶液和水洗涤，MgSO₄干燥，过滤并浓缩。硅胶闪式层析(乙酸乙酯/戊烷1/4)得到白色固体化合物7(1.83g，87％)。

实施例9：(2R，3S)-3-叠氮基-2-羟基-3-苯基丙酸苄酯的制备

参考图2和3，向搅拌着的溴化物7(1.73g，5.16mmol)/DMSO(20ml)的溶液中加入固体NaN₃(671mg，10.33mmol)。将该混合物室温搅拌24小时，然后用戊烷/二氟甲烷1/1混合物稀释并用水洗涤。有机层用MgSO₄干燥，过滤并浓缩。硅胶闪式层析(乙酸乙酯/戊烷1/4)得到白色固体化合物3b(1.13g，74％)。

实施例10：(2S，3S)-3-苯基吖丙啶-2-羧酸苄酯4b的制备

参考图2和3，向搅拌着的叠氮醇3b(400mg，1.35mmol)/二氯甲烷(15ml)的溶液中室温下加入NEt₃(375μl，2.70mmol)接着加入甲磺酰氯(160μl，2.03mmol)。将所得混合物室温搅拌2小时，用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。水层用乙酸乙酯萃取并将合并的有机层用MgSO₄干燥，过滤并浓缩。将粗的残渣溶解于THF/水10/1混合物(27ml)。向该溶液中室温下加入DIEA(460μl，2.70mmol)接着加入三苯基膦(708mg，2.70mmol)。将所得混合物于35℃搅拌3.5小时，冷却至室温。加入水并将水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用MgSO₄干燥，过滤并浓缩。硅胶闪式层析(乙酸乙酯/戊烷1/4)得到白色固体化合物4(170mg，50％)。

实施例11：(2R，3R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(4-甲基苄基硫烷基)-3-苯基丙酸的制备

参考图2和3，用(2R，3S)-6a的制备中描述的相同的方法，以吖丙啶(2R，3R)-4b(170mg，0.67mmol)为起始原料，得到白色固体化合物(2R，3R)-6b(18mg，3步反应的收率为7％)。

实施例12：反式-6a和顺式-6b衍生物与羧基酯树脂结合及随后的HF裂解的一般方法

参考图4，将(2R，3S)-6a或(2R，3R)-6b(0.11mmol)与肽树脂(0.10mmol)/DMF在TBTU(0.11mmol)和DIEA(0.20mmol)的存在下结合1.5小时。结合的完成通过茚三酮试验监控。然后将肽脱保护并通过以500μl对甲酚为清除剂，用无水HF于0℃处理1小时，将肽从树脂上裂解。裂解后，将肽用乙醚沉淀，溶解于乙腈/水50/50混合物中，并冷冻干燥。分别由与(2R，3S)-6a和与(2R，3R)-6b结合获得的肽非对映体7a或7b经反相HPLC纯化，得到ESI质谱确证的白色粉末。对肽7a而言：ESI-MS计算值C51H75N10O11S(M+H)1035.53，实测值1035.55。对肽7b而言：ESI-MS计算值C51H75N10O11S(M+H)1035.53，实测值1035.54。

实施例13：一锅化连接/烷基化/脱硫反应的一般方法

参考图4，将肽7a(或7b)(3mM最终浓度)与肽硫酯LYRAG-COSR(1.25eq.)溶解于磷酸盐缓冲液^*中，并将所得溶液于37℃在苯硫酚(0.3％V/V)的存在下搅拌。连接反应的完成通过HPLC分析监控：将该溶液的等份试样用BME(20％V/V)处理20分钟然后在注射前用TCEP处理5分钟。(其中*缓冲液含NaH₂PO₄0.2M，胍盐6M，20mM蛋氨酸(Met)，pH7.6)。

连接反应完成后，将一些TCEP加入到该反应混合物中，使pH＝3-4。5分钟后将该溶液碱化到pH8，并加入碘乙酰胺或溴乙酰胺。将所得混合物室温搅拌(烷基化反应由HPLC分析监控)，然后用乙醚萃取以除去苯硫酚衍生物。烷基化反应通常得到连接粗产物的定量收率。然后加入醋酸(20％V/V)，接着加入锌粉(μ刮刀)进行脱硫反应(由HPLC分析监控)，1小时后由“一锅化”反应得到收率为～98％的天然产物。电喷雾质谱分析如下：对肽8-而言(未分离的中间体)ESI-MS计算值C₇₇H₁₁₅N₁₈O₁₇S(M+H)1595.84，实测值1595.90；对肽-而言(未分离的中间体)，ESI-MS计算值C₇₉H₁₁₈N₁₉O₁₈S(M+H)1652.86，实测值1652.85；及对肽10而言-ESI-MS计算值C₇₇H₁₁₅N₁₈O₁₇(M+H)1563.87，实测值1563.82。

如上所指出的那样，上述反应全部在可与连接条件相容的条件下进行：6M胍盐，pH7.6，37℃，因此“一锅化”意味着不必为获得最终的天然产物而进行中间体的纯化。重要的是，“一锅化”反应中的最终产物通过与由序列LYRAGFY AKY AKL的固相肽合成(SPPS)制备的两种标准肽比较，证实是天然肽(在苯丙氨酸(Phe)连接部位有L-残基，无外消旋)，一个对照肽中的F残基是天然L-苯丙氨酸而在另一个对照肽中是非天然的D-苯丙氨酸。连接产物的HPLC分析发现与天然标准品相同并且不含有非天然衍生物的痕迹(数据未显示)。

实施例14：与模型肽硫酯LYRAA-COSR或LYRAI-COSR的连接反应

参考图4，将肽7a(或7b或模型肽CYAKYAKL)分别与肽硫酯LYRAA-COSR或与LYRAI-COSR(1.25eq.)溶解于磷酸盐缓冲液^*中(3mM最终浓度)，并将所得溶液于37℃在苯硫酚(0.3％V/V)的存在下搅拌。连接反应的完成通过HPLC分析监控：将该溶液的等份试样用BME(20％V/V)处理20分钟然后在注射前用TCEP处理5分钟。(其中*缓冲液含NaH₂PO₄0.2M，胍盐6M，20mM蛋氨酸，pH7.6)。

将用反式或顺式苯基半胱氨酸进行的连接试验与天然化学连接(采用半胱氨酸)比较并在下表I和表II中报告。

表I：采用反式苯基半胱氨酸的连接

肽	X(LYRAX-COSR)	1小时后收率(％)	完成时间(96％)(h)
				HSFYAKYAKHSFYAKYAKHSFYAKYAKCYAKYAKCYAKYAK	GAIAI	9690209640	12.5-1-

表II：采用顺式苯基半胱氨酸的连接

肽	X(LYRAX-COSR)	1小时后收率(％)	完成时间(96％)(h)
				HSFYAKYAKHSFYAKYAKHSFYAKYAKCYAKYAKCYAKYAK	GAIAI	9696509640	11-1-

应理解的是，本文中描述的实施例和实施方案仅为了举例说明的目的，根据其的各种修改或变化将是本领域技术人员所了解的并且将包括在本申请的精神和范围及附加的权利要求的范围内。本文中引用的所有公布、专利和专利申请为了所有目的均通过引用全部结合到本文中。

Claims (26)

1.一种通过酰胺键连接成分的方法，所述方法包括：

(a)将式J₁-C(O)SR的成分与式NH₂-CH(XSH)-J₂的成分在足够形成具有式J₁-C(O)-NH-CH(XSH)-J₂的巯基取代的连接产物的条件下接触，

其中，

J₁为第一目标分子、聚合物或表面的残基；

R为可与硫酯相容的基团；

XSH为具有可除去的巯基辅助物的支链氨基酸侧链并选自式-CH(R′)-SH的β-巯基辅助物和式-CH₂-CH(R′)-SH的γ-巯基辅助物，其中R′为氢以外的氨基酸侧链的残基；且

J₂为第二目标分子、聚合物或表面的残基。

2.权利要求1的方法，所述方法还包括：

(b)除去所述巯基辅助物生成式J₁-C(O)-NH-CH(XH)-J₂的连接产物，其中XH为选自式-CH₂(R′)和式-CH₂-CH₂(R′)的氨基酸侧链。

3.权利要求2的方法，其中J₁和J₂相同或不同并且选自肽、聚合物和表面的残基。

4.权利要求1的方法，其中J₁为肽的残基。

5.权利要求4的方法，其中-C(O)SR位于所述肽的C-端。

6.权利要求1的方法，其中J₂为肽的残基。

7.权利要求6的方法，其中NH₂-CH(XSH)-位于所述肽的N-端。

8.权利要求7的方法，其中X为β-支链氨基酸的侧链。

9.权利要求8的方法，其中所述β-支链氨基酸为苯基半胱氨酸。

10.权利要求9的方法，其中所述苯基半胱氨酸为顺式-苯基半胱氨酸。

11.一种具有式P₁-NH-CH(XSH)-J₂的成分，其中P₁为可除去的氨基保护基团或氢；XSH为支链氨基酸侧链成分并选自式-CH(R′)-SH的β-巯基辅助物和式-CH₂-CH(R′)-SH的γ-巯基辅助物，其中R′不同于氢，而除去巯基辅助物后产生的残基CH₂R′和CH₂CH₂R′为氨基酸侧链；且J₂为目标分子、聚合物或表面的残基。

12.权利要求11的成分，其中J₂选自小分子、聚合物和表面的残基。

13.权利要求11的成分，其中J₂为肽残基。

14.权利要求13的成分，其中P₁-NH-CH(XSH)-位于所述肽的N-端。

15.权利要求14的成分，其中X为β-支链氨基酸的侧链。

16.权利要求15的成分，其中所述β-支链氨基酸为苯基半胱氨酸。

17.权利要求16的成分，其中所述苯基半胱氨酸为顺式-苯基半胱氨酸。

18.一种具有式J₁-C(O)-NH-CH(XSH)-J₂的连接产物，其中J₁为第一连接成分的残基，XSH为具有可除去的巯基辅助物的支链氨基酸侧链并选自式-CH(R′)-SH的β-巯基辅助物和式-CH₂-CH(R′)-SH的γ-巯基辅助物，其中R′为不同于氢的氨基酸侧链残基，且J₂为第二连接成分的残基。

19.权利要求18的产物，其中J₁和J₂相同或不同并且选自小分子、聚合物和表面的残基。

20.权利要求18的产物，其中J₁为肽的残基。

21.权利要求18的产物，其中J₂为肽的残基。

22.权利要求18的产物，其中XSH为式-CH(R′)-SH的β-巯基辅助物，和β-支链氨基酸的一部分。

23.权利要求22的产物，其中所述β-支链氨基酸为苯基半胱氨酸。

24.权利要求23的产物，其中所述苯基半胱氨酸为顺式-苯基半胱氨酸。

25.一种包含根据权利要求11的组合物作为成分的药盒。

26.一种在连接部位具有酰胺键，并具有可除去的巯基辅助物的连接产物，所述连接产物由权利要求1的方法制备。

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