KR100355437B1 - 고유의화학적연결에의한단백질의합성방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고유 펩티드 골격을 갖는 중간 크기의 단백질를 제조하는 고유 화학 결합 방법에 관한 것이다. 고유 화학 결합은 2개의 비보호된 펩티드 단편의 화학 선택적인 반응을 사용하여 일시적인 티오에스테르 연결 중간체를 제조한다. 일시적인 티오에스테르 연결 중간체는 이어서 자발적으로 재배열하여 결합 부위에 고유 펩터드 결합을 갖는 완전한 길이의 결합 산물을 제공한다. 완전한 길이의 결합 산물은 세포외 합성에 의해 제조된 단백질과 화학적으로 동일하다. 완전한 길이의 결합 산물은 재폴딩될 수 있고/있거나 산화되어 고유 디설피드 함유 단백질 분자를 형성한다. 고유 화학 결합의 기술은 화학적으로 완전한 길이의 단백질을 합성하는데 사용할 수 있다.

Description

고유의 화학적 연결에 의한 단백질의 합성 방법

단백질은 화학적으로, 세포의 시스템에서 리보소옴에 의해 또는 세포내에서 리보소옴에 의해 합성될 수 있다. 이들 분야 각각의 발전은 많은 단백질의 획득을 현저히 개선시켰지만 또한 추가의 개선에 대한 요구를 자극시켰다.

단백질은 이의 폴리펩타이드 쇄의 정확하게 폴딩되는 3차원 구조에 의해 다양한 성질을 갖는다. 단백질의 3차원 구조는 이의 기능적인 성질을 결정한다. 하지만, 현재 이의 3차원 구조만으로 단백질의 생물학적 특성을 예상하고/하거나 완전히 설명하기는 어렵다. 단백질의 구조가 어떻게 이의 생물학적 특성을 결정하는가에 대한 보다 우수한 이해는 이 분자의 공유결합 구조를 체계적으로 변화시키고 폴딩된 구조 및 생물학적 기능과의 효과를 관련시킴으로써 달성될 수 있다. 따라서, 신규 단백질 및 단백질 동족체를 합성하기 위해 향상된 합성 기술에 대한 요구가 증가하고 있다.

재조합 DNA를 기초로 하는 분자 생물학으로부터 유래된 기술은 유전자 조작된 미생물내에서 단백질의 발현을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 문헌[참조: M. Smith, Angew. Chem. Int. Ed, Engl (1994): vol. 33, p 1214]에 기술된 부위 지시된 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)을 사용하여 체계적 연구에 유용한 양의 변형된 단백질을 다수 제조할 수 있다[참조: C. Eigenbrot and A. Kossiakoff, Current Opinion in Biotechnology (1992): vol. 3, p 333]. 혁신적인 방법의 사용은 발현 시스템에 도입될 수 있는 아미노산의 범위를 증가시키고 단백질의 공유 결합 구조의 생합성적 변형의 이용을 상당히 확장시키지만[참조: C. J. Noren et al., Science(1989): vol. 244, p 182(1989); J. A. Ellman et al., Science(1992): vol. 255, p 197], 리보소옴 단백질 합성의 고유 성질에는 한계가 있는 것으로 여겨진다[참조: V. W. Cornish, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA(1994): vol. 91. p 2910].

또한 단백질의 화학적 합성은 단백질 구조와 기능간의 상호관계를 설명하는데 기여한다. 단계적 고체상 합성은 작은 단백질의 새로운 합성을 허용한다[참조:T. W. Muir et al., Curr. Opin. Biotech. (1993). Vol. 4, p 420.], 또한 전체 단백질의 단계적 고체상 합성을 이용하여 생물학적 기능의 분자 원리를 설명하는 여러 일례가 있다[참조: M. Miller, et al., Science(1989): vol. 246, p 1149; A. Wlodawer, et al., Science(1989): vol. 245, p 616: L, H. Huang, et al., Biochemistry(1991): vol. 30, p 7402; and K. Rajarathnam, et al., Science(1994): vol. 264, p 90].

또한, 구조적으로 보존된 펩타이드 단편의 재연결을 통한 반합성은 특정 예에서 단백질의 구조/기능 관계를 연구하는데 사용될 수 있다[참조: R. E. Offord, "Chemical Approaches to Protein Engineering", in Protein Design and the Development of New therapeutics and Vaccines, J. B, Hook, G. Poste, Eds.,(Plenum Press, New York, 1990) pp. 253-282; C. J. A. Wallace, et al., J. Biol. Chem. (1992): Vol. 267, p 3852]. 상당히 광범위해진 반합성 방법은 클로닝되거나 합성된 펩타이드 단편의 효소적 연결을 이용하는 것이다[참조: L. Abrahmsen, et al., Biochemistry(1991): vol. 30, p 4151; T, K. Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1994): in press]. 상기 방법이 단백질 및 단백질 동족체의 합성에 성공적으로 적용된다 할지라도 티. 더블유. 뮤이르(T. W. Muir) 등은 단백질 연구시 유기화학 방법의 광범위한 적용에 대한 관심이 계속되고 있다는 것을 보고하고 있다[Curr. Opin. Biotech. (1993): vol. 4, p 420].

최근에 켄트 스티븐(Kent Stephen) 등은 비보호된 펩타이드 단편의 화학적 연결을 단백질의 전체 합성에 대한 개선된 방법으로써 도입하였다[참조: M.Schnlzer, et al., Science(1992): vol., 3256, p 221]. 화학적 연결은 연결 부위에 인공적인 골격 구조를 갖는 산물을 수득하기 위한 비보호된 펩타이드의 화학선택적인 반응을 포함한다. 비보호된 펩타이드의 사용은 복잡하게 배합된 보호 그룹을 통해 많은 합성 중간체의 용해도를 제한시키는 전형적인 화학 합성에 따른 난점을 피할 수 있게 한다[참조: K. Akaji, et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo)(1985): vol. 33, p 184]. 이와는 달리, 화학적 연결 기술은 통상적으로 길이에 있어 50개 이상의 잔기를 갖는 비보호된 펩타이드를 제조하고 정제하며 특성화할 수 있는 능력을 잘 이용하도록 한다. 최적화된 단계적 고체 상 방법을 이용하여 잔기가 60개 이하인 우수한 수율과 고순도의 펩타이드를 제조한다. 바람직한 경우에, 잔기가 80개 이상인 펩타이드를 제조할 수 있다[참조: M. Schnolzer, et al., Int. J. Pept, Prot, Res (1992): vol. 40, p 180-193].

화학적 연결에 대한 상기 방법의 주요 양태는 연결 부위에 인공적인(예: 비 펩타이드) 골격 구조를 형성함으로써 연결 펩타이드에 대해 특이적으로 확실한 화학선택적 반응을 사용하는 것이다. 이것은 단백질 도메인의 동족체, 예를 들어, 연결된 10F3, 피브로넥틴(95개의 잔기)의 인테그린-연결 모듈을 포함하여, 광범위하게 골격이 변형된 단백질을 제조할 수 있게 한다[참조: M. Williams, et al., J. Am, Chem. Soc.(1994): in Press]. HIV-1 프로테아제에서 플렙-기질 수소 결합(flap-substrate hydrogen bond)의 촉매적 기여는 화학적 연결에 의한 상기 단백질의 99개의 잔기 소단위인 단독이량체의 화학적 합성으로 밝혀졌다[참조: M. Baca et al., Proc. Natl. Acad, Sci, U.S., (1993): vol. 90, p 11638.), 또한 화학적 연결은 완전한 생물학적 활성(20)을 갖는 다량의 고 순도 단백질을 통상적으로 반복 합성하는데 유용하다는 것을 입증하였다[참조: R. C. deLisle Milton, et al., "Synthesis of proteins by Chemical Ligation of unprotected Peptide Segments: Mirror-Image Enzyme Molecules, D- & L-HIV Protease Analogs," in Techniques in Protein Chemistry IV, Academic Press, New York, pp. 257-267(1992)].

또한, 화학적 연결은 독특한 형태를 갖는 단백질형 분자, 예를 들어 4개의 헬릭스 번들 주형-조립된 합성 단백질(four-helix bundle template-assembled synthetic protein)(MW 6647 Da)[참조: P. E. Dawson, et al., J. Am. Chem. Soc. (1993): vol. 115, p 7263], 균일한 다가 인공 단백질(MW 19,916 Da)[참조: K. Rose, J. Am. Chem. Soc. (1994): vol 3116, p 30], 다중쇄 인테그린 수용체의 세포질성 도메인을 모방한 인공 네오단백질(MW 14,194 Da)[참조: T. W. Muir, et al., Biochemistry, (1994): vol. 33, pp 7701-7708) 및 펩타이드 덴드리머(peptide dendrimer)(mw 24,205 Da)[참조: C. Rao, et al.. J. Am. Chem. Soc.(1994): vol. 116, p 6975]의 직접적인 제조를 위해 사용될 수 있다. 상기 기술을 사용할 수 있는 단백질의 범위는 합성 펩타이드 단편의 크기에 의해 제한된다.

전형적인 단백질 도메인 크기 이하인 본래의 골격 폴리펩타이드 쇄로의 직접적인 합성 방법이 있는 경우에 유용하게 확장시킬 수 있다[참조: A. L. Berman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994): vol. 91, p 4044]. 이어서 화학적 연결은 이들 도메인을 함께 배열하여 일반적인 형태의 단백질을 개발하는데 사용된다.

단백질의 전체 합성을 위한 모듈 전략은 비보호된 펩타이드의 집중적인 화학 연결을 근거로하여 개발되었고 문헌(참조: L. E. Canne, et al., the Annual Meeting of the protein Society, San Diego, July 1994)에 기술되어 있다. 단백질 도메인(모듈)을 잔기가 50 내지 70개인 단편의 화학적 연결로 제조한다. 이어서 이들 도메인을 함께 연결하여 표적 단백질을 수득한다. 상호 양립할 수 있는 연결 화학이 요구된다. 내부 도메인 연결로 최적으로 안정한, 펩타이드형 결합이 수득되어야 한다. 내부 도메인 연결은 연결 부위에 형성되는 다양하게 변형된 구조의 특성을 허용해야 한다.

단백질의 직접적인 총 화학적 합성은 유기 화학의 중요한 목적을 현실화시킬 수 있다. 이것은 일반적인 합성 방법에 의해 가능해진 단백질 공유 연결 구조의 제한되지 않는 변형에 대한 흥분된 전망을 불러일으키고 구조적인 것을 기초로 한 특징, 예를 들어, 폴딩, 안정성, 촉매 활성, 결합 및 생물학적 작용을 개발하는데 새로운 자극을 부여한다.

요구되는 것은 비보호된 펩타이드의 화학선택적 반응의 잇점과 함께 연결 부위에서 고유 펩타이드 결합 형성을 연합하는 고유의 화학적 연결(native chemical ligation) 기술이다. 이러한 제2 세대 연결 화학은 전체 화학적 합성에 의해 직접 수득할 수 있는 고유의 골격 폴리펩타이드의 크기를 현저히 증가시킨다. 이것은 중간 크기의 단백질을 포함하여 광범위한 합성 표적에 유용하게 적용될 수 있고, 단백질 기능적 도메인을 직접 수득하도록 한다. 고유의 화학적 연결은 단백질의 전체화학 합성에 대한 일반적인 모듈 방법의 기반이 된다. 더욱이, 화학적으로 합성된 펩타이드 및 또 다른 공급원에서 유래된 펩타이드 단편 모두를 사용하는 것이 양립될 수 있다.

요약:

본 발명의 한가지 양태는 고유의 화학적 연결 방법에 관한 것이다. 고유의 화학적 연결 방법은 단백질 및 거대한 올리고펩타이드의 화학적 합성을 용이하게 한다. "고유의 화학적 연결"의 원리는 도 1에 나타낸다. 제1 단계는 비보호된 합성 펩타이드-α-테오에스테르와 N-말단 시스-잔기를 포함한 비보호된 또 다른 펩타이드 단편과의 화학선택적 반응을 수행하여 최초의 공유 연결 산물로서 티오에스테르-연결된 중간체를 수득하는 것이다. 반응조건의 변화 없이, 상기 중간체는 분자내에서 자발적이고 신속하게 반응하여 연결 부위에 고유 펩타이드 결합을 형성한다. 완전한 길이의 폴리펩타이드 표적 산물을 추가의 조작 없이 바람직한 최종 형태로 수득한다. 고유의 화학적 연결 방법에 의해 제공되는 일반적인 합성 방법은 단백질 분자의 공유 연결 구조의 변형 범위를 크게 확장시킨다.

본 발명의 한가지 양태는 제 1 올리고펩타이드와 제 2 올리고펩타이드를 말단 대 말단으로 연결시켜 올리고펩타이드 산물을 수득하는 방법을 제공한다. 제 1 및 제 2 올리고펩타이드는 촉매 티올을 포함하는 반응 용액중에서 혼합된다. 촉매 티올은 비공액 머캅탄 또는 공액 티올일 수 있다. 바람직한 촉매 티올은 벤질 머캅탄, 티오페놀, 1-티오-2-니트로페놀, 2-티오-벤조산, 2-티오-피리딘, 4-티오-2-피리딘카복실산 및 4-티오-2-니트로-피리딘을 포함한다. 제 1 올리고펩타이드는 C-말단 티오에스테르를 포함한다. 제 2 올리고펩타이드는 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄를 갖는 N-말단 시스테인을 포함한다. 이어서, N-말단 시스테인의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄를 C-말단 티오에스테르와 축합시켜 β-아미노티오에스테르 결합으로 제 1 및 제 2 올리고펩타이드를 결합하는 중간체 올리고펩타이드를 제조한다. 중간체 올리고펩타이드의 β-아미노티오에스테르 결합은 분자내에서 재배열하여 아미드 결합으로 제 1 및 제 2 올리고펩타이드를 연결하는 올리고펩타이드 산물을 생산한다.

본 발명의 또 다른 양태는 C-말단 티오에스테르를 갖는 제 1 올리고펩타이드 단편, N-말단 시스테인을 갖는 제 2 올리고펩타이드 단편, 및 C-말단 티오에스테르 및 N-말단 시스테인을 결합시키는 β-아미노티오에스테르 연결 단위를 갖는 올리고펩타이드 중간체에 관한 것이다. β-아미노티오에스테르 연결 단위는 자발적으로 분자내에서 재배열하여 제 1 및 제 2 올리고펩타이드 단편을 말단 대 말단으로 연결하는 아미드 결합을 형성한다.

본 발명의 또 다른 양태는 C-말단 티오에스테르를 갖는 올리고펩타이드를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 Boc-아미노 티오에스테르-수지를 제조하는 반응 조건하에서 링커(linker)를 갖는 수지와 Boc-아미노산 숙신이미드 에스테르를 갖는 산화되지 않은 티올을 혼합하는 것이다. 이어서, 이 올리고펩타이드를 단계적 고체상 펩타이드 합성에 의해 Boc-아미노 티오에스테르-수지상에 조립한다. 올리고펩타이드를 완성한 경우 Boc-아미노 티오에스테르-수지를 HS로 분해하여 C-말단 티올을 갖는 올리고펩타이드를 제조한다. 이어서, 이 C-말단 티올을 C-말단티오에스테르를 갖는 올리고펩타이드로 전환시킨다.

도 1의 올리고펩타이드 티오에스테르(α-COSR 잔기)는 티오에스테르 수지상에 고도로 최적화된 단계적 SPPS에 의해 제조된 상응하는 올리고펩타이드 티올(-α COSH)로부터 용이하게 제조할 수 있다. 티오에스테르 수지는 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: L. E. Canne et al., Tetrahedron Letters (1995): vol. 36, pp. 1217-1220]의 방법으로 제조한다. 캔(Canne)의 방법은 문헌[참조: Blake and Yamashiro, J. Blake, Int. J. Pept. Protein Res.(1981): vol. 17, p 273; D. Yamashiro, et al., Int. J. Pept, Protein Res.(1988): vol. 31, p 322[에 기술된 티오에스테르 수지를 사용한다. 펩타이드 산물을 통상적인 방법으로 절단, 정제 및 특성화한다[참조: M. Schnolzer. et al., Int. J. Pept. Protein Res.,(1992): vol. 40, pp. 180-193].

야마시로(Yamashiro) 방법에서는 보호된 올리고펩타이드상의 티오카복실 그룹을 디아릴 디설파이드로 활성화시켜 아실 디설파이드를 수득한다[참조: Yamashiro et. al., Int. J. Peptide Protein Res, (1992): vol. 31, pp 322-334]. 이들 C-말단-펩타이드-아실-디설파이드는 고도로 반응성인 친전자성 중간체로서 제2 펩타이드의 N-말단의 α-아미노 그룹을 공격하여 이와 커플링하면서 고유의 펩타이드 결합을 형성한다. 티오카복실 그룹의 활성화제로서 2,2'-디피리딜디설파이드를 사용하여 보고된 커플링에 의해서는 목적하는 α-IB-92 산물이 45%의 수율로 제조된다. α-IB-92의 3-단편 합성을 위한 출발수지를 기준으로 한 전체 수율은 8%로 보고된 반면, 2-단편 합성은 11%이다.

디아릴 디설파이드 결합의 높은 반응성으로 인해 야마시로 방법은 펩타이드 분자에 존재하는 아미노산 잔기의 광범위한 보호 및 탈보호를 필요로 한다. 예를 들어, 라이신 그룹은 반응성인 아민 작용기로 인하여 시트라코닐 유도체로 보호한다. 추가로, Msc 그룹 또는 tBOC 그룹을 사용하여 분자내에 존재하는 말단 아민 작용기를 보호한다.

본원에 기술한 발명은 아실 디설파이드 잔기(야마시로의 방법)대신에 보다 적은 반응성(따라서 보다 화학선택적임) 티오에스테르 친전자체를 사용하기 때문에 2개의 올리고펩타이드의 커플링을 위한 어떠한 보호 그룹의 사용을 요구하지 않는다. 분자내 커플링 단계에서, 상기 티오에스테르 친전자체는 유리 아민보다는 더욱 친핵성인 설프하이드릴 잔기를 필요로 한다. 친핵성 설프하이드릴 잔기는 시스테인 잔기상에서 발견될 수 있다. 아미노 및 하이드록실 작용기는 티오에스테르 친전자체보다 비교적 비반응성이기 때문에 2개의 비보호된 올리고펩타이드의 선택적 커플링을 시스테인 설프하이드릴 잔기를 사용하여 달성한다. 제 2 펩타이드의 시스테인상의 설프하이드릴 그룹은 우선 제 1 펩타이드의 티오에스테르를 공격하여 커플링된 티오에스테르 중간체를 형성한다. 이러한 커플링된 티오에스테르 중간체는 동시에 시스테인으로 부터의 유리 α-아미노산 잔기에 의해 공격받아 자발적으로 재배열하여 고유의 펩타이드 결합을 형성한다. 따라서, 바람직하지 않은 부반응이 감소되기 때문에 보호 및 탈보호 단계가 제거되므로 수율은 증가한다(참조: 도 1).

티오에스테르 잔기는 최적화된 단계적 고체상 펩타이드 합성에 의해 티오에스테르 수지 링커를 갖는 아미노에틸 수지 지지체상에서 수득한 전구체 티오산으로부터 제조된다. 이어서 전구체 티오산은 1시간 이내에 0℃에서 액체 HF중에서 제조된다[참조: Yamashiro et al., Int. J. Pept. Protein Res, (1988): vol. 31, p 322].

단계적 고체 상 펩타이드 합성의 사용과 함께 티오에스테르 링커의 합성을 위한 공정은 문헌[참조: Blake at. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1981): vol. 78, 4055 및 Yamashiro et. al,. Int. J. Pept. Protein Res.(1988): vol. 31, p 322]에 의해 보고되었다. 그러나, 상기 방법은 황화수소를 사용하여 Boc-아미노산 숙신이미드 에스테르를 상응하는 Boc-아미노 티오산으로 전환시켜야 하기 때문에 바람직하지 못하다. 본원에 보고된 개선된 방법은 Boc-아미노산 숙신이미드 에스테르를 직접 사용하므로 황화 수소 가스의 불편함과 위험성을 피한다[참조: Kent et. al., Tetrahedron Lett.(1995): vol. 36, p 1217).

상기 방법(도 2)에서, 티올 (3)은 클로라이드 (2)를 티오우레아와 반응[참조: Yamashiro et. al. Int. J. Pept. Protein Res.(1988): vol. 31, p 322]시킨 후 액체 염기에서 수득한 티오우로늄 염을 가수분해시켜 합성한다. 티올 (3)은 시판되는 광범위한 Boc-아미노산 숙신이미드 에스테르와 반응하여 디사이클로헥실아민(DCHA) 염으로서 간편하게 분리되는 목적하는 티오에스테르 링커 (1)를 제조할 수 있는 일반적인 중간체이다.

모델 연구는 고유의 화학적 연결 방법을 조사하기 위해 작은 펩타이드를 사용하여 시작한다. 반응 기작의 설명을 돕기위해, 펩타이드인 Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-α-COSBzl를 Ac-Cys와 반응시킨다. 수득한 연결 산물의 정확한 질량은 전자스프레이 질량 분광분석법으로 측정하고 이는 펩타이드의 α-티오에스테르 잔기상의 Ac-Cys 측쇄의 친핵성 공격에 의해 생성된 연결 산물로서의 티오에스테르-연결된 펩타이드와 일치한다. Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-α-COSBzl과 H-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser의 반응(차단되지 않은 a-NH₂작용 그룹을 포함)은 pH 6.8에서 신속하게 진행하고(pH 6 이하에서는 반응이 매우 느리게 진행하며 이는 Cys 측쇄의 이온화된 티올레이트의 형태가 관여한다는 것을 제안한다), 예상되는 질량을 가진 단일 산물이 수득된다. 이러한 산물은 친핵체에 대해 민감하지 않고 디설파이드 연결된 이량체성 펩타이드를 형성하는 능력을 갖는데, 이는 연결 부위에 고유의 아미드 결합이 형성되는 것이 명백함을 나타낸다. 이들 연구는 도 1에서 나타낸 기작과 일치하고, 여기에서 최초의 티오에스테르 결합 산물은 안정한 펩타이드 결합을 형성하기 위한 신속한 재배열 때문에 구분가능한 중간체로 관찰되지 않는다. 최초의 화학선택적 연결 반응에서 형성된 티오에스테르에 대한 α-NH₂잔기의 호의적인 기하학적 배열에 의해 분자내 반응은 용이하게 일어난다. 펩타이드 결합을 형성하기 위한 상기 "엔트로피 활성화"의 사용은 브레너(Brenner)에 의해 밝혀진 원리를 근거로 한 것이다[참조: M. Brenner, in Peptides. Proceedings of the Eighth European Peptide Symposium H.C. Beyerman, Eds. (North Holland, Amsterdam, 1967) PP. 1-7]. 펩타이드 결합을 형성하기 위한 "엔트로피 활성화"의 개념은 최근에 켐프 디. 에스.(Kemp D. S.) 등[참조: J. Org. Chem. (1993): vol. 58, p 2216] 및 리우 시. 에프.(Liu C. F.) 등[참조: J. Am. Chem. Soc.(1994): vol. 116, p 4149]에 의해 가장 최근에 채택되었다.

여러개의 펩타이드 모델이 고유의 화학적 연결 방법에 의해 합성되었다. 이들 펩타이드 모델의 성공적인 합성은 단백질내에서 정상적으로 발견되는 전체 범위의 작용성 그룹을 포함하는 펩타이드에 일반적으로 적용된다는 것을 입증한다. 심지어 유리된 내부 Cys 잔기가 반응 단편중의 하나에 존재할 수 있다. 내부 Cys 잔기는 펩타이드-a-티오에스테르 성분과 에스테르를 교환할 수 있으나, 이 반응은 아미드 결합에 대한 재배열이 일어날 수 없기 때문에 비생산적이다. 형성된 티오에스테르는 용이하게 가역적이고 부분적인 생산 반응 시스템을 가지고 있다. 본원에서 기술된 바와 같이, 고유의 화학적 연결은 N-말단 Cys 잔기의 반응에 의해 제한되지 않는다. 상기 Cys의 측쇄 티올을 산화로부터 방지하는 것은 연결시 비반응적이기 때문에 디설파이드 연결된 이량체를 형성하기 위해 중요하다. 티오에스테르 이탈 그룹에 상응하는 과량의 티올을 사용하여 연결 반응을 방해하지 않으면서 환원된 형태로 Cys 잔기를 유지시킨다. 아미노 말단 펩타이드 단편은 필요한 α-COSR 작용기를 갖추기 위해 화학적 합성에 의해 제조되어야 한다. 더욱이 , 최적의 연결을 위해 상기 성분은 방해되지 않는(예: β-측쇄되지 않은) C-말단 아미노산을 가져야 한다. 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드와 같은 가용화제는 연결을 방해하지 않고 펩타이드 단편의 농도를 증가시키는데 사용될 수 있으므로 반응율을 증가시킨다.

추가로 모델 반응은 보다 우수한 이탈 그룹의 사용이 보다 신속한 연결 반응을 일으킨다는 것을 입증한다. 본 발명자는 도 5에 나타낸 바와 같이 상기 관찰된결과를 사람 사이토킨 수용체의 세포외 도메인으로부터 펩타이드의 고유의 화학적 연결에 적용시켰다[참조: R. D'Andrea, et al., Blood, (1994): vol. 83, p 2802]. 엘만 시약(Elman's reagent)의 환원된 형태에 상응하는 5-티오-2-니트로벤조산(-SNB) 이탈 그룹의 사용은 신속한 고 수율의 반응을 수득하도록 한다. 도 5와 연계하여 하기에 기술된 바와 같이 펩타이드 단편들간의 반응은 필연적으로 5분 이내에 완료되어 연결 부위에 고유의 펩타이드 결합을 갖는 50개 잔기의 산물이 수득되게 하는 것으로 관찰된다. 따라서, 신속한 고유의 화학적 연결은 적당히 조율된 특성을 가진 티오에스테르 이탈 그룹의 사용으로 달성될 수 있다.

단백질 분자의 전체 합성에 대한 고유의 화학적 연결 방법의 적용은 사람 인터루킨 8(IL-8)의 제조에 의해 설명된다[참조: M. Baggiolini, et al., FEBS Lett.(1989): vol. 307, p 97; I. clack-Lewis, et al., J. Biol. Chem.(1994): vol. 269, p 16075(1994); I. Clark-Lewis, Biochemistry(1991): vol. 30, p 3128; and K. Rajarathnam , et al., (1994): Biochemistry, (1994): vol. 29, p 1689]. 72개의 아미노산 폴리펩타이드 쇄는 고유의 단백질 분자내에 작용적으로 중요한 2개의 디설파이드 브릿지를 형성하는 4개의 Cys 잔기를 포함한다. IL-8의 총 합성은 도 7에 나타낸다. 2개의 비보호된 합성 펩타이드 단편을 완전히 반응시켜 추가의 화학적 조작없이 환원된 형태인 완전한 길이의 폴리펩타이드 쇄를 수득한다. 이러한 성공적인 연결은 특히 잔기가 각각 33 및 39개인 IL-8단편이 2개의 Cys 잔기를 포함하기 때문에 중요하고 단백질내에서 발견되는 유전적으로 암호화된 20개의 아미노산중 18개를 함께 포함한다. 정제된 산물을 이전에 기술된 바와 같이 폴딩시키고 산화시켜 원래의 연결 산물 보다 적은 정확하게 질량이 4돌턴인 IL-8을 수득하며, 이는 2개의 디설파이드 결합이 형성됨을 나타낸다. 상기 폴딩된 산물의 특성은 이전에 연구된 확실한 IL-8 샘플의 질량과 동일하다. 호중구 엘라스타제 방출에 대한 검정에서의 적정은 폴딩되고 연결된[Ala33]IL-8 및 통상적인 합성에 의해 수득한 상응하는 분자의 효능(ED₅₀=0.3nM) 및 최대 반응이 고유의 서열 IL-8과 구별할 수 없고 동일함을 입증한다. 고유의 디설파이드 결합을 형성하는 유리된 Cys³⁴측쇄를 수득하기 위해서는 티오에스테르 대 아미드의 재배열이 일어나야 하기 때문에 상기 결과는 연결 부위에서 펩타이드 결합의 형성을 명확히 입증한다(참조: 도 7).

단백질은 통상적으로 재조합 DNA를 기초로 한 분자 생물학 방법을 사용하는 유전적으로 조작된 미생물내에서 발현시켜 연구한다. 부위 지시된 돌연변이와 같은 방법은 체계적인 연구에 유용한 양의 변형된 단백질을 다수 제조하는 능력에 있어 주요한 영향을 미친다. 혁신적인 방법은 발현 시스템내에 도입될 수 있는 아미노산의 범위를 증가시키고 단백질 공유 결합 구조의 생합성적 변형체를 이용하는 것을 상당히 확장시켰다. 그러나, 이는 리보소옴 단백질 합성의 특성에 따른 한계가 있는 것으로 여겨진다.

윌랜드(Wieland)는 티오에스테르 중간체를 사용하여 디펩타이드를 합성하기 위한 방법을 기술하고 있다[참조: Wieland et al. Liebigs Ann. Chem.(1953): vol. 580, p 159]. 윌랜드는 S-글리실-(또는 또 다른 측쇄되지 않은 아미노아실-) 티오페놀과 시스테인의 반응을 이용하고 있다. 즉, 시스테인 잔기상의 설프하이드릴 그룹이 우선 S-글리실-티오페놀의 티오에스테르를 공격하여 커플링된 티오에스테르 중간체를 형성한다. 이러한 커플링된 티오에스테르 중간체는 동시에 시스테인으로부터의 유리된 α-아미노 잔기에 의해 공격받아 자발적으로 재배열함으로써 고유의 펩타이드 결합을 형성한다.

윌랜드 방법에서의 제한은 사용되는 분자의 크기이며(단지 하나의 아미노산이 시스테인과 커플링된다) 티오에스테르의 합성을 위해 사용되는 방법에서 유래한다. 티오에스테르를 형성하기 위해, 윌랜드의 방법은 혼합된 무수물, 산 클로라이드 또는 티오산으로서 말단 카복실산의 활성화를 필요로 한다. 산성 잔기가 Asp(D) 및 Glu(E)와 같은 아미노산 잔기에 존재하는 경우에는 문제가 발생한다. 이러한 경우, 윌랜드의 방법은 바람직하지 못한 부반응물을 생산하므로 특히 올리고펩타이드가 합성되는 경우 복잡한 보호 그룹 전략을 필요로 한다.

본원에 기술된 발명은 올리고펩타이드-티오에스테르 잔기가 전구체 티오산으로부터 유래하기 때문에 정규한 보호 그룹 전략이 필요하지 않다. 이 전구체인 티오산(펩타이드-α-COSH)은 티오에스테르 수지 링커를 갖춘 아미노메틸 수지 지지체상에서 표준 단계적 고체상 펩타이드 합성에 의해 합성된다. 전구체 티오산은 0℃에서 1시간동안 액체 HF중에서 거의 정량적으로(99%) 링커/수지로부터 분해된다.

티오에스테르 펩타이드(펩타이드-α-COSR)는 2개의 일반적인 방법으로 합성될 수 있다.

(1) 동결건조된 티오산 조 펩타이드(펩타이드-α-COSH)를 엘만 시약[알드리크 사(Aldrich Company)로부터 구입한 5,5'-디티오비스-2-니트로벤조산]과 pH5.5(2.0 당량), 100mM Na 아세테이트 완충액중의 6M 구아니딘중에서 반응시켜 SNB-티오에스테르 펩타이드(펩타이드-α-CONB)를 수득하고 이를 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RPHPLC)로 정제한다.

(2) 동결건조된 티오산 조 펩타이드(펩타이드-α-COSH)를 pH 4.0, 6M 구아니딘 및 100mM Na 아세테이트 완충액중에서 벤질 브로마이드와 반응시킨다. 이후 벤질 티오에스테르(펩타이드-α-COSBn)를 RPHPLC로 정제한다.

상기 기술한 조건은 활성화된 티오에스테르를 갖춘 비보호된 올리고뉴클레오티드의 형성을 허용한다. 이어서 말단 시스테인 잔기를 포함하는 제 2 펩타이드와의 연속된 반응은 고유의 펩타이드 결합의 형성과 함께 용이한 커플링을 허용하고 아미노산 잔기가 100개 이상인 올리고펩타이드 쇄를 생성할 수 있다(참조: 도 1).

바람직한 경우에, 화학적 합성은 이미 단백질 구조 대 기능의 관계를 설명하는데 중요한 기여를 하였다. 단계적 고체상 합성은 작은 단백질(14)의 새로운 제조를 허용하고 분자 수준의 생물학적 기능을 설명하기 위한 상기 전체 단백질 합성 방법의 사용에 관한 두드러진 여러 실시예가 존재한다. 특별한 경우에 허용되는 화학을 단백질 연구에 적용시키는 또 다른 방법은 펩타이드 단편의 구조적으로 보조된 재연결을 통한 반합성이다. 상당히 확장된 반합성 방법은 클로닝되거나 합성된 펩타이드 단편의 효소적 연결을 이용한다. 이들 방법이 현재에 엄격히 제한되어 있다 할지라도 유기화학 방법을 단백질의 연구에 광범위하게 적용시킨다는 점에서 관심이 지속적으로 고조되고 있다.

고유의 화학적 연결은 정확하게 다음 특성을 제공한다. 연결 부위에 고유의펩타이드 연결 형성과 비보호된 펩타이드의 화학선택적인 반응의 잇점을 접목시킨다. 상기 제2 세대 연결 화학은 직접적으로 전체 화학 합성에 의해 획득될 수 있는 고유의 골격 폴리펩타이드의 크기를 현저히 증가시킨다. 이는 중간 크기의 단백질을 포함하여, 광범위한 합성 표적에 유동하게 적용시킬 수 있고, 단백질 기능성 도메인에 대한 직접적인 접근을 허용한다. 고유의 화학적 연결은 단백질의 전체 화학적 합성에 대한 일반적인 모듈 방법의 초석이 된다. 더욱이, 화학적으로 합성된 펩타이드 및 또 다른 공급원에서 유리된 펩타이드 단편 모두의 사용을 허용한다.

단백질의 직접적인 전체 화학적 합성은 유기 화학의 중요한 목적을 실현하는 것이다. 이는 일반적인 합성 방법에 의해 가능하게 된 단백질 공유 결합 구조의 제한되지 않은 변형을 제공하고 폴딩, 안정성 , 촉매 활성, 결합 및 생물학적 활성과 같은 구조적인 기본 특성을 설명하는데 있어 새로운 추진력을 부여한다.

또 다른 양태에서, 산물이 N-말단 Cys 잔기를 포함하는 경우, 카복시-말단 펩타이드 단편 또는 단백질 모듈은 표준 recDNA 수단에 의해 발현될 수 있으며, 본원에 기술한 고유의 화학적 연결을 사용하여 합성 아미노-말단 펩타이드-α-COSR과 반응시킴으로써 단백질의 일부가 화학적 합성 및 리보소옴 합성의 일부로 부터 유래되는 산물을 수득할 수 있다.

본 발명은 아미드 결합으로 2개의 올리고펩타이드를 말단 대 말단으로 화학적 연결하기 위한 방법 및 중간체에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 첫번째 올리고펩타이드의 산화되지 않은 N-말단 시스테인을 두번째 올리고펩타이드의 C-말단 티오에스테르와 축합시켜 분자내에서 자발적으로 재배열시킴으로써 아미드 결합 및 연결 산물을 형성하는 β-아미노티오에스테르를 형성시키는 올리고펩타이드를 화학적으로 연결시키기 위한 방법 및 중간체에 관한 것이다.

정부 권리:

본원에 기술된 발명은 국립 보건원(The National Institutes of Health)의 승인번호 제R01 GM 48897-01호, 제P01 GM 48870-03호 및 제GM 50969-01호에 의해 일부 지원되었다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가질수 있다.

펩타이드-α-티오산 형성

펩타이드-α-티오산의 고체상 합성에 사용하기 위한 티오에스테르 수지 링커의 형성과 이용을 위한 전형적인 방법은 다음과 같다[참조: Kent et. al.Tetrahedron Lett.(1955): vol. 36, p 1217].

4-(α-머캅토벤질)페녹시아세트산, 디사이클로헥실아민(3) 도 2. 야마시로(Yamashiro)[참조: Int. J. Pept. Protein Res. (1988): vol. 31, pp 322-334]에 의해 확립된 조건을 사용하여 형성된 화합물 (2)(7.5g, 27mmol), 티오우레아(2.3g, 30mmol) 및 에탄올(100ml)의 혼합물을 가열하여 환류시킨다[문헌(참조: Koenig et al J. Org. Chem. (1958): vol. 23, pp 1525-1530)에 보고된 조건]. 4시간 후에 티오우로늄 염으로의 전환이 TLC(90:5:5 클로로포름:메탄올:아세트산)에 의해 나타난 바와 같이 종결된다. 10N NaOH(30ml)를 첨가하고 2 내지 3시간 동안 환류를 계속한다. 실온으로 냉각시킨 후 반응 혼합물을 대략 원래 용적의 반으로 진공 농축시키고 농염산(pH 2.0)으로 산성화하며 에틸 아세테이트(4 x 30ml)로 추출한다. 합한 에틸아세테이트 추출물을 포화된 NaCl(1 × 30ml)로 세척하고 MgSO₄로 건조시킨다. 휘발성 물질은 진공 제거한다. 수득한 오일을 에틸아세테이트(100ml)중에 용해시키고 불용성 물질을 여과한다. DCH[(알드리크 사(Aldrich Company)에서 구입한 디사이클로헥실아민](6.0ml, 30mmol)을 교반하면서 여액에 첨가한다. 몇분 이내에 백색 고체가 침전하기 시작한다. 디에틸에테르(150ml)를 첨가하고 현탁액을 몇시간동안 -20℃로 냉각시킨다. 수득한 백색 고체를 여과하고 디에틸에테르로 세척하며 진공 건조시켜 화합물 (3)(10.3g, 23mmol, 84%)을 수득한다.

Boc-아미노 티오에스테르 링커 (1), 디사이클로헥실아민 염의 일반적인 합성(참조: 도 2).

화합물 (3)(3.67mmol), Boc-Ala-OSu[노바비오켐 사(Novabiochem Corp.)에서 구입](3.68mmol), DIEA(디이소프로필에틸아민-5.74mmol) , 디메틸포름아미드(35ml) 및 메틸렌 클로라이드(4ml)의 혼합물을 실온에서 교반시킨다. 몇시간 후에 최초의 백색 현탁액을 완전히 용해시켜 투명한 무색 용액을 수득한다. 24시간 후에 반응 혼합물을 1N HCl(150ml)에 붓고 에틸 아세테이트(4 × 35ml)로 추출한다. 합한 에틸아세테이트 추출물을 1N HCl(2 × 30ml), H₂O(1 × 30ml) 및 포화된 NaCl(1 × 30ml)로 세척하고 MgSO₄로 건조시킨다. 휘발물질을 진공 제거한다. 수득한 오일을 섬광 크로마토그래피(925:50:25의 클로로포름:MeOH:아세트산)으로 정제하여 아세트산으로 오염된 오일을 수득한다. 잔여 아세트산을 제거하기 위해, 오일을 클로로포름(40ml)중에 용해시키고 0.1N HCl(7 × 10ml) 및 포화된 NaCl(1 x 10ml)로 세척하며 MgSO₄로 건조시킨다. 휘발물질을 진공제거하여 오일로서의 화합물 (1)을 수득한다. 상기 오일을 디에틸에테르(10ml)중에 용해시키고 여기에 디사이클로헥실아민(1 당량)을 첨가한다. 헥산(100ml)을 교반하면서 첨가하여 반응되지 않은 디사이클로헥실아민으로부터 농 오일로서의 화합물 (1)의 디사이클로헥실아민 염을 분리한다. 용매를 오일에서 버리고 오일을 CH₂Cl₂(30 - 40ml)중에 용해시킨다. 수득한 용액을 진공 농축시켜 백색 발포제 고체로서 디사이클로헥실아민 염 (1)을 수득한다(참조: 도 2).

수지상의 연결 및 합성의 예는 다음과 같다: 4-[a-(Boc-Ala-S)벤질]페녹시아세트산(0.80mmol)을 9ml의 메틸렌 클로라이드중에서 1.00g의 아미노메틸-수지(0.4mmol)에 첨가하고 0℃에서 15분 동안 메틸렌 클로라이드중에서 1.33ml의 0.6M DCCI(디사이클로헥실카보디이미드)를 사용하여 처리하고 24℃에서 30분 동안 처리한다. 이어서 산물을 표준 고체상 펩타이드 합성 조건에 적용시킨다[참조: Kent et. al. Tetrahedron Leters (1995): vol. 36, p 1217: J. Blake, Int. J. Pept. Protein Res. (1981): vol. 17, p 273]. 목적하는 쇄가 합성되면 펩타이드 수지(대략 45μmol의 최초 로딩)를 0℃에서 1시간 동안 8ml의 액체 HF(0.8ml 아니졸)중에서 처리한다. 질소를 사용하여 증발시킨 후에 잔사를 에틸 아세테이트로 세척한다. 고체를 0℃에서 물(대략 15mL)중에서 교반시키면서 중탄산 암모늄 고체를 사용하여 pH 6.0으로 조정한다. 여과 및 동결건조하여 조 티오산 산물을 수득하고 이를 30mg의 배치에서 예비 HPLC을 사용하여 추가로 정제한다.

티오에스테르 말단 펩타이드 단편의 제조

α-COSR 티오에스테르 펩타이드를 2개의 일반적인 방법으로 합성할 수 있다:

(1) 동결건조된 티오산 조 펩타이드를 엘만 시약(알드리크 사로부터 구입한 5,5'-디티오비스-2-니트로벤조산)과 pH 5.5(2.0 당량), 100mM Na 아세테이트 완충액중의 6M 구아니딘중에서 반응시켜 SNB-티오에스테르 펩타이드를 수득하고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RPHPLC)로 정제한다.

(2) 동결건조된 티오산 조 펩타이드를 pH 4.0, 6M 구아니딘 및 100mM Na 아세테이트 완충액중에서 벤질 브로마이드와 반응시킨다. 벤질 티모에스테르를 RPHPLC로 정제한다.

상기 기술한 조건은 활성화된 티오에스테르를 갖춘 비보호된 올리고뉴클레오티드의 형성을 허용한다. 이어서 말단 시스테인 잔기를 포함하는 제 2 펩타이드와의 반응으로 고유의 펩타이드 연결을 형성하면서 커플링이 용이하게 되도록 하고 아미노산 잔기가 100개 이상인 올리고펩타이드 쇄를 합성할 수 있다(참조: 도 1).

실시예 1

모델 펩타이드 Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSH(서열 1)를 아미노메틸 수지상에 최적화된 단계적 고체 상 펩타이드 합성으로 제조한다. 문헌[참조: Kent et. al. Tetrahedron Letters,(1995): vol. 36, p 1217; J. Blake, Int. J. Pept. Protein Res.(l981): vol, 17, p 273; D. Yamashiro and C.H. Li, ibid (1988): vol. 31, p 322]에서 채택된 바와 같이, 티오에스테르 수지 링커를 일반화된 방법으로 제조한다. 목적하는 쇄가 합성되면, 펩타이드 수지(대략 45μmol의 최초 로딩)를 0℃에서1시간 동안 8ml의 액체 HF(0.8ml의 아니졸)중에서 처리한다. 질소를 사용하여 증발시킨 후 잔사를 에틸 아세테이트로 세척한다. 이어서 고체를 0℃에서 물(대략 15ml)중에서 교반시키면서 중탄산 암모늄 고체를 사용하여 pH 6.0으로 조정한다. 여과 및 동결건조하여 티오산 조 산물을 수득하고 이를 30mg 배치에서 예비 HPLC를 사용하여 추가로 정제할 수 있다.

이어서 티오에스테르 말단 펩타이드 단편을 필요한 α-COSR 작용기(여기서, R은 벤질, 5-티오-2-니트로벤조산(-SNB) 및 티오페놀 등과 같은 알킬 그룹이다)를 갖춘 화학적 합성에 의해 티오산 단편으로부터 제조한다. 보다 우수한 티오에스테르 이탈그룹의 사용은 보다 신속한 연결 반응을 수득하도록 한다. 즉, 펩타이드 모델 Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSH(서열 1)을 우선 6.0M 구아니딘-HCl, pH 4.6, 나트륨 아세테이트 완충액중에서 벤질 브로마이드(15 당량)와 반응시킴으로써 티오벤질에스테르로 전환시켜 Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSBn(서열 3)을 형성한다. 수득한 펩타이드를 분당 1%로, 20 내지 45% 아세토니트릴을 사용하는 표준 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 조건하에서 정제하고 214nm에서 모니터한다.

펩타이드 H-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser(서열 2)에 대한 고체상 방법은 문헌[참조: M. Schnolzer, P. Alewood, D. Alewood, S.B. H. Kent, J. Pept. Protein Res.(1992): vol. 40, 180]에 기술된 바와 같이 잔기가 60개 이하인 펩타이드가 우수한 수율 및 고 순도로 제조되도록 한다.

우선, 반응 기작을 설명하기 위해, 펩타이드 Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSBn(Bn, 벤질; 서열 3)을 Ac-Cys(노바비오켐 사에서 구입한 차단된 α-NH₂작용 그룹을 포함)와 반응시킨다. 수득한 연결 산물, Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOS-CH₂C(NHAc)CO₂H(서열 4)의 정확한 질량을 전자스프레이 질량 분광기를 사용하여 측정하며 이는 펩타이드의 α-티오에스테르 잔기상의 Ac-Cys 측쇄의 친핵성 공격에 의해 합성된 연결 산물로서의 티오에스테르-연결된 펩타이드와 일치한다.

최종적으로 Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSBn(서열 3)과 Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser(서열 2, 차단되지 않은 α-NH₂작용 그룹을 포함)의 반응을 pH 6.8에서 신속하게 진행시키고(pH 6.0이하에서 반응은 매우 서서히 진행되고, 이는 pH 6.8에서 Cys 측쇄의 이온화된 티올레이트가 관여한다는 것을 나타낸다; 도 3) 예상되는 질량의 단독 산물을 수득한다. 펩타이드 Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-α COSBn과 Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser을 25℃의 pH 6.8, pH 6.0 및 pH 4.7에서 0.1M 인산 완충액중에서 반응시킨다. 1시간 후에 반응을 다음과 같이 진행시킨다: 연결된 산물 Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser(서열 5) 펩타이드를 pH 6.8에서는 9.5%초과, pH 6.0에서는 약 10% 및 pH 4.7에서는 약 1.0%, HPLC에 의해 관찰된 바와 같이, 도 3은 25℃에서 1시간 후 반응의 pH 의존성을 보여준다. 상기 산물은 친핵체에 대해 민감하지 않고 디설파이드-연결된 이량체 펩타이드를 형성하는 능력을 가지며, 이는 연결 부위에서 고유 아미드 결합이 형성됨을 명확히 지적한다.

달리는, 2-티오아세트산 유도체 Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-SCH₂COOH[서열 6, 메틸렌 클로라이드중에 2-브로모아세트산에 티오산 Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-SH(서열 1)의공격으로부터 형성됨]과 Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser(서열 2)를 45℃에서 pH 6.8의 0.2M 인산 완충액중에서 연결시킨다. 1시간 후에 반응을 도 4에서 HPLC에 의해 관찰된 바와 같이 80%까지 진행시킨다. 연결된 Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser(서열 5) 및 반응되지 않은 Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser의 산화된 산물의 분리는 유리 티올 연결 산물의 존재를 입증한다.

고유의 화학적 연결 공정은 단백질내에서 정상적으로 발견되는 완전한 범위의 작용성 그룹을 포함하는 펩타이드에 일반적으로 적용된다. 심지어 유리된 내부 Cys 잔기는 반응 단편중의 하나에도 존재할 수 있다. 내부 Cys 잔기는 펩타이드-α-티오에스테르 성분과 에스테르를 교환할 수 있으나, 이러한 반응은 아미드 결합에 대한 재배열이 일어날 수 없기 때문에 비생산적이며, 형성된 티오에스테르는 용이하게 가역적이고 반응 시스템의 생산 부분에 잔류한다.

고유의 화학적 연결 공정은 아미노-말단 Cys 잔기에서의 반응에 제한되지 않는다. 상기 Cys의 측쇄 티올을 산화로부터 방지하여 디설파이드 연결된 이량체를 형성하기 위해서는, 티오에스테르 이탈 그룹에 상응하는 과량의 티올을 사용하여 연결 반응을 방해하지 않으면서 Cys 잔기를 환원형으로 유지시킨다. 또한, 벤질머캅단 또는 티오페놀과 같은 소량의 저분자량의 티올을 커플링 반응 혼합물에 첨가하여 환원 환경을 유지시킨다.

특히 첨가된 티올이 이미 형성된 티오에스테르보다 우수한 이탈 그룹인 경우, 티올의 첨가는 티오에스테르의 반응성을 증가시킨다. 상기 관찰의 예는 티오 패놀을 반응에 첨가함으로써 벤질 에스테르를 페닐 에스테르로 전환시키는 경우이다. 반응 수율 및 반응율은 상당히 증가된다. 예를 들어, 벤질 머캅탄을 사용하면 7시간 후 바르나제 반응(Barnase reaction)으로 25%가 수득되는 반면에, 동일한 반응 혼합물로의 티오페놀의 처리로는 90%가 수득된다.

또한, 연결 혼합물에 티올의 첨가는 반응 혼합물을 환원된 형태로 유지한다. 이는 반응성인 N-말단 Cys 잔기의 산화를 예방하며, 내부 시스 잔기가 존재하는 경우 티올 분자내 디설파이드 연결의 형성을 감소시킨다. 추가로 환원 환경은 티오에스테르 단편의 안정성을 증가시킨다(연결 반응을 pH 7.5에서 거의 또는 전혀 가수분해됨이 없이 밤새 진행시킬 수 있다)

실시예 2

신속한 고유의 화학적 연결은 본인에 도입된 사람 IL-3 수용체 β-소단위의 외부 도메인으로부터의 46 내지 95개 잔기에 상응하는 펩타이드 단편의 합성에 의해 설명된다[참조: R. D'Andrea et. al., Blood(1994): vol. 83, p 2802].

합성된 조 IL-3 Msc(46 내지 76)αCOSH를 8M 우레아, pH 4.0, 50mM 암모늄 아세테이트 완충액[Msc, 2(메틸-설포닐)-에틸옥시-카보닐(플루카 #69227) 보호 그룹을 1.1 당량의 2-(메틸설포닐)에틸 4-니트로페닐 카보네이트, 1.1당량의 디이소프로필에틸아민 및 0.5M의 디메틸포름아미드를 사용하여 N-말단에 둔다]중에서 5,5'-디티오-비스(2-니트로벤조산)(10당량)으로 거리하여 5 티오-2-니트로벤조산 에스테르(-COSNB)로 전환시킨다. 상기 티오에스테르-함유 물질은 pH 6.0이하에서 완전히 안정한 것으로 밝혀졌으며 분당 1%에서 대략 20 내지 45%의 아세토니트릴을 사용하는 표준 역상 HPLC 조건하에서 용이하게 정제되고 214nm에서 모니터된다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 연결은 기술된 pH에서 IL-3[Cys77](77 - 95)[표준 고체상 방법으로 제조됨[참조: Kent et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1992): vol. 40, 180]을 정제된 IL-3 Msc(46-76)αCOSNB에 첨가함으로써 개시되고 반응은 UV[치환된 아릴 티올레이트 이탈 그룹은 412nm(ε_TNB,_412nm=13, 700dm³mol^-1cm^-1)]에서 특징적인 UV 흡광도를 갖는다]로 모니터한다. pH 7.0에서, 반응은 5분 이내에 완료된다. Msc(46-76)αCOSNB가 pH 5.0에서 10배 몰 과량의 Leu-엔케팔린(아미노-말단 잔기, Tyr)에 노출되는 경우 어떠한 반응도 관찰되지 않는다. 이러한 조절 실험은 연결 부위에서 아미노 말단 Cys 잔기에 대한 절대적인 요구조건을 입증한다(도 5).

정제된 IL-3[Cys77] (77-95)(0.98mM) 및 IL-3(46-76)αCOSNB(0.9mM)을 23℃에서 8M 우레아, pH 5.0, 50mM 암모늄 아세테이트 완충액중에서 반응시킨다[분당 0.7%;214nm에서 22.5 내지 45% 아세토니트릴을 사용한 역상 분석 HPLC 9C18로 모니터함]. 1시간 후에, 연결 용액을 pH 9.0에서 환원제인 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)에 노출시키고 이어서 MSC 보호 그룹를 제거하기 위해 pH 13.0으로 상승시킨다(TCEP를 사용한 처리는 펩타이드 산물과 함께 용출되는 경향을 갖는 티오페놀 및 벤질 머캅탄 디설파이드 산물을 환원시킴으로써 산물의 정제 및 분석을 보조하는 것으로 밝혀졌다). 도 6은 HPLC에 의한 반응의 진행을 보여준다; 출발 펩타이드의 조 산물로의 전환은 도 6에 나타낸다. 잔기가 50개인 산물은 전자스프레이 질량 분광기에 의한 예상되는 분자량을 갖는다[관측치, 5747.0 돌턴; 계산(평균 방사성동위원소 조성물), 5747.4 돌턴]. 연결 산물은 높은pH 및 환원조건하에서 안정한 것으로 밝혀졌으며 분자내 디설파이드 연결을 형성한다. 이들 관찰은 연결 부위에 고유의 펩타이드 결합의 존재와 일치한다.

유사한 방법은 보호그룹의 제거[참조: J. Blake et. al., Int. J. Pept. Protein Res. (1981). vol. 17, p 273, kemp et. al. J. Org. Chem. (1993): vol. 58, p2216, Liu et. al. J. Am. Chem. Soc. (1994): vol. 116, 4149] 또는 중간체의 최종 형태로의 전환, 또는 이 모든 단계를 필요로 한다. 선행된 방법은 고유의 최종 골격 산물을 수득하기 위한 비보호된 펩타이드 단편의 화학적 반응을 허용하지 않는다.

실시예 3

IL-8(34 내지 72)단편(서열 9)를 문헌[참조: Kent et al., Int. J. Pept. Protein Res (1992): vol. 40, 180]에 기술된 바와 같은 최적화된 단계적 고체상 방법으로 제조하고 잔기가 60 내지 80개인 펩타이드를 우수한 수율 및 고 순도로 수득한다. 펩타이드-αCOSH를 티오에스테르 링커를 가진 아미노메틸 수지상에서 최적화된 단계적 고체 상 펩타이드 합성으로 제조한다. 티오에스테르 링커를 문헌[참조: J. Blake, Int. J. Pept. Protein Res, (1981): vol. 17, p273; D. Yamashiro and C.H. Li, ibid. vol. 31, 322(1988)]에서 채택된 바와 같은 일반적인 방법으로 제조한다. 이어서 산물을 표준 역상 HPLC 조건으로 정제하고 전자스프레이 질량 분광기를 포함하는 표준 방법에 의해 특성화한다.

합성 조 단편 IL-8(1-33)αCOSH(서열 7)를 pH 4.6, 100mM 나트륨 아세테이트 완충액중 6M 구아니딘-HCl중에서 벤질 브로마이드(15 당량)와 반응시켜 티오벤질에스테르로 전환시킨다. 반응 혼합물을 표준 역상 HPLC 조건하에서 정제하고 티오벤질 에스테르, IL-8(1-33)αCOSBn(서열 8)을 형성한다(도 7).

단편 IL-8(1-33)αCOSBn(서열 8)(5.0mg, 1.3μmol) 및 IL-8(34-72)(서열 9)(4.8mg, 1.1mmol)를 벤질 머캅탄(5ml)의 존재하에 23℃에서, 0.5ml 6.0M 구아니딘-HCl, pH 7.6, 인산 완충액중에서 반응시킨다. 적당한 반응 시간(48 내지 72시간)후에 대략 60%의 연결 수율을 수득한다. 산물을 상기 기술한 바와 같이 표준 역상 HPLC로 정제하고 전자스프레이 질량 분광기로 특성화한다.

도 8B에 나타낸 바와 같이, 분석 HPLC 스펙트럼(C₁₈역상; 분당 1%에서 25 내지 45% 아세토니트릴; 214nm에서 모니터됨)은 합성된 펩타이드 단편 IL-8(1-33)αCOSB₂l 및 IL-8(34-72)의 반응전을 나타낸다.

도 8C에 나타낸 바와 같이, 분석 HPLC 스펙트럼(C₁₈역상; 분당 1%에서 25 내지 45% 아세토니트릴; 214nm에서 모니터됨)은 정제된 완전히 환원된 형태의 연결 산물인 IL-8(1-72)(SH)₄(서열 10)을 나타낸다. 전자스프레이 질량 스펙트럼(1가 하전 상태로서 나타낸 원래의 데이타): 분자 질량 8319.8돌턴으로 관찰됨; 계산된 분자 질량(평균 동위원소 조성물), 8319.8 돌턴.

도 8D에 나타낸 바와 같이, 정제된 1-72 연결 산물의 공기 산화는 HPLC 정제 후에 나타나는 폴딩된 [Ala³³]IL-8 분자를 형성한다. 환원된 폴리펩타이드와 비교하여 폴딩된 디설파이드 가교 결합된 고유의 단백질의 초기 용출은 전형적인 것이다[참조: Lewis et. al FEB Lett.(1989): vol. 307, p 97; Lewis et al J. Biol Chem.: vol. 269, p 16075; Lewis et. al Biochemistry(1991): vol. 30, 3128].

폴딩 및 산화 조건: 0.2mg/ml, 1M 구아니딘-HCl, pH 8.5 트리스 완충액중에서 폴리펩타이드를 주위 온도의 공기중에서 격렬히 교반시킨다. 산화되고 폴딩된 합성 IL-8(1가 하전 상태로서 나타낸 원래의 데이터) 전자스프레이 질량 분광기. 관찰된 분자 질량, 8315.6 돌턴; 계산된 분자 질량(평균 동위원소 조성물), 8315.8 돌턴(참조: 도 8).

실시예 4:

HIV-1 K41 프로테아제(공개되지 않은 조건)

연결 반응을 여러 방법으로 수행한다. (5-티오-2-니트로벤조산) SNB 티오에스테르를 포함하는 연결 반응을 위한 최적화된 공정에서는 동일 반응 용기내에 고체로서 2개의 펩타이드, HIV(1-40)-COSNB(본원에 기술된 표준 조건에서 형성됨, 서열 11) 및 HIV(41-99)(본원에 기술된 표준 조건에서 형성됨, 서열 12)의 중량을 측정하고 100mM Na 아세테이트와 함께 6.0M 구아니딘 HCl pH 6.5를 첨가한다(대략적인 펩타이드 농도는 각각 펩타이드 7 내지 13mg/ml이다).

5분 후에, 대략 2.0% 티올을 첨가한다. 2개의 티올 촉매를 벤질 머캅탄(동일 반응계내에서 벤질 티오에스테르를 형성; 서열 13) 및 티오페놀(동일 반응계내에서 페닐 티오에스테르를 형성, 서열 14)을 사용한다. HIV PR의 연결시, 벤질 머캅탄과의 반응은 40시간에 60% 초과의 산물 수율을 수득하는 반면, 티오페놀은 10시간에 80% 초과의 산물 수율을 수득함으로써 HIV-1 K41 프로테아제(서열 15)를 형성한다.

TCEP를 사용한 후속적인 처리는 펩타이드 산물과 함께 용출되는 경향이 있는 티오페놀 및 벤질 머캅탄 디설파이드 산물을 환원시킴으로써 산물의 정제 및 분석을 보조하는 것으로 밝혀졌다. 상기 기술한 바와 같이, 산물을 표준 역상 HPLC로 정제하고 전자스프레이 질량 분광기로 특성화한다(참조: 도 9)

실시예 5

바르나제 실시예(공개되지 않은 조건)

2개의 펩타이드 바르나제(1-48)-SNB(본원에 기술된 표준조건에서 형성됨, 서열 16) 및 바르나제(49-110)(본원에 기술한 표준 조건에서 형성됨, 서열 17)를 동일 반응 용기내에서 고체로서 중량을 측정하고 pH 7.5 완충액(6M 구아니딘 100mM인산)중에 용해시킨다. 펩타이드를 용해시킨 직후, 2% 벤질 머캅탄(동일 반응계내에서 벤질 티오에스테르를 형성함, 서열 18) 또는 4% 티오페놀(동일 반응계내에서 페닐 티오에스테르를 형성함. 서열 19)을 첨가한다. 7시간 후에, 벤질 머캅탄 반응은 25% 진행하고 티오페놀 반응은 90% 초과로 진행하여 바르나제(1-110)(서열 20)를 형성한다. 이 산물을 상기 기술한 바와 같이 표준 역상 HPLC로 정제한다(참조: 도 10).

티올의 첨가는 특히 첨가된 티올이 이전에 형성된 티오에스테르보다 우수한 이탈 그룹인 경우에 티오에스테르의 반응성을 증가시킨다. 이러한 관찰의 예는 반응물에 티오페놀을 첨가하여 벤질 에스테르를 페닐 에스테르로 전환시키는 경우이다. 반응 수율 및 반응율은 상당히 증가된다. 예를 들어, 벤질 머캅탄과 함께 7시간 후 바르나제 반응으로 25%가 수득되는 반면, 동일 반응 혼합물에 대한 티오페놀의 처리로 90%가 수득됨으로써 바르나제(1-100)(서열 20)가 형성된다.

또한 연결 혼합물에 티올의 첨가로 반응 혼합물이 환원형으로 유지된다. 이는 반응성 N-말단 Cys 잔기의 산화를 방지하고, 내부 Cys 잔기가 존재하는 경우 티올은 분자내 디설파이드 연결의 형성을 감소시킨다. 추가로, 환원 환경은 티오에스테르 단편의 안정성을 증가시킨다(연결 반응은 pH 7.5에서 거의 또는 전혀 가수분해 없이 밤새 진행시킬 수 있다).

Claims (7)

1. C-말단 티오에스테르를 포함하는 제1 올리고펩타이드 및 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄를 갖는 N-말단 시스테인을 포함하는 제2 올리고펩타이드를 촉매 티올을 함유하는 반응 용액중에서 혼합시키는 단계 A;

   N-말단 시스테인의 산화되지 않은 설프하이드릴 측쇄를 C-말단 티오에스테르와 축합시켜 β-아미노티오에스테르 결합으로 제1 및 제2 올리고펩타이드를 연결하는 중간체 올리고펩타이드를 제조하는 단계 B 및

   단계 B의 중간체 올리고펩타이드의 β-아미노티오에스테르 결합을 재배열하여 아미드 결합으로 제1 및 제2 올리고펩타이드를 연결하는 올리고펩타이드 산물을 제조하는 단계 C를 포함하여, 제1 올리고펩타이드와 제2 을리고펩타이드를 말단 대 말단으로 연결시킴에 의한 올리고펩타이드 산물의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 A의 촉매 티올이 비공액 머캅탄 및 공액 티올로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
3. 제2항에 있어서, 단계 A의 촉매 티올이 벤질 머캅탄인 방법.
4. 제2항에 있어서, 단계 A의 촉매 티올이 티오페놀, 1-티오-2-니트로페놀, 2-티오-벤조산, 2-티오-피리딘, 4-티오-2-피리딘카복실산 및 4-티오-2-니트로피리딘으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공백 티올인 방법.
5. 제4항에 있어서, 단계 A의 공액 티올이 티오페놀인 방법.
6. C-말단 티오에스테르를 갖는 제1 올리고펩타이드 단편, N-말단 시스테인을 갖는 제2 올리고펩타이드 단편, 및 C-말단 티오에스테르 및 N-말단 시스테인을 연결하고, 분자내에서 자발적으로 재배열하여 제1 및 제2 올리고펩타이드 단편을 말단 대 말단으로 연결하는 아미드 연결을 형성하는 β-아미노티오에스테르 연결 단위를 포함하는 올리고펩타이드 중간체.
7. 산화되지 않은 티올을 지닌 링커를 갖는 수지를 제공하는 단계 A;

   Boc-아미노산 숙신이미드 에스테르를 제공하는 단계 B;

   단계 A의 수지 및 단계 B의 Boc-아미노산 숙신이미드 에스테르를 Boc-아미노티오에스테르 수지를 제조하기 위한 반응 조건하에서 혼합하는 단계 C;

   단계적 고체 상 펩타이드 합성에 의해 Boc-아미노티오에스테르 수지상에 올리고펩타이드를 조립하는 단계 D;

   단계 D의 Boc-아미노 티오에스테르 수지를 HF로 분해하여 C-말단 티올을 갖는 올리고펩타이드를 제조하는 단계 E 및

   단계 E의 C-말단 티올을 갖는 올리고펩타이드를 C-말단 티오에스테르를 갖는 올리고펩타이드로 전환시키는 단계 F를 포함하는, C-말단 티오에스테르를 갖는 올리고펩타이드의 제조 방법.

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