DE102011109187A1

DE102011109187A1 - Immobilisierte Reagenzien für die Staudinger Kopplung mit "Imaging Tracern"

Info

Publication number: DE102011109187A1
Application number: DE102011109187A
Authority: DE
Inventors: Marco Pazzi; Guiseppe Zanoni; Alessio Porta
Original assignee: APTENIA Srl
Current assignee: APTENIA Srl
Priority date: 2011-08-02
Filing date: 2011-08-02
Publication date: 2013-02-07

Abstract

Vorliegende Erfindung betrifft ein Konjugationsmittel, einen makroskopische Träger oder ein Nanopartikel, das bevorzugt mit Phosphinyl- und acylierbaren Gruppen funktionalisiert ist. Acylierung des Trägers mit einer Carbonyl-Komponente und nachfolgender Umsatz mit einem organischen Azid führt zu einer Staudinger Kopplung wobei Carbonsäure- und Azido-Komponente konjugiert werden und als Carboxamid- vom Träger abgespalten werden. Die Phosphinylgruppe kann erfindungsgemäß mit einer Schutzgruppe versehen sein um ungewollte Oxidation zu vermeiden. Der Träger kann auch mit speziell gearteten, Verbindungsstücken” acyliert, vorliegen. Die Verbindungsstücke erlauben in acylierter Form die selektive Bindung mit vielseitig gearteten Ionen oder Molekülen ohne, dass die Staudinger Kopplung erfolgt. Die Anwendungsbreite der Staudinger Kopplung und deren kommerzielle Anwendung werden somit erhöht und können zur Einführung von Radioisotopen, für Bioassays in der „Drugdelivery aber auch in der Archäologie und Paläontologie herangezogen werden.

Description

Vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein generell verwendbares Konjugationsmittel. Es ist lange unzersetzt lagerungsfähig und erlaubt organische Moleküle die Azidogruppen tragen (Azido-Komponenten) mit anderen organischen Molekülen die e Carboxyl-Gruppe tragen (Carboxyl-Komponenten) miteinander durch eine Staudinger Kopplung zu verknüpfen. Hierbei wird zunächst eine der beiden Komponenten an das Konjugationsmittel gebunden und anschließend mit der zweiten Komponente zur Reaktion gebracht wobei das Konjugat entsteht. Erfindungsgemäß kann nun eine der beiden Komponenten, nach dem sie mit dem Konjugationsmittel verknüpft ist, weiter funktionalisiert werden, ohne dass eine Abspaltung der modifizierten Komponente erfolgt. In eine an das Konjugationsmittel gebundene Carboxyl-Komponente, können noch vor der Konjugation, Ionen, Radioisotope, organische Molekuele, darunter biologisch aktive Substanzen, (z. B. Proteine, Antikörper, Oligosaccharide, Oligonucleotide), Nanopartikel, Liposomen, sogar ganze Zellen leicht eingeführt, oder angehängt werden. Jene können dann mit einer zweitem, der Azido-Komponente die ebenfalls aus organisch chemischen Verbindungen, bioaktiven Molekülen (z. B.: Proteine, Antikörper, Oligosaccharide, Oligonucleotide), Nanopartikeln, Farbstoffen, Liposomen, ganze Zellen oder Polymeren Metalloberflächen, Feststoffen aus kovalenten und/oder aus ionischen Bindungen oder Kompositmaterialien aus mehreren zuvor aufgezählten Materialien bestehen kann, konjugiert werden. Eine bevorzugt Anwendung des Verfahrens liegt in bildgebenden Verfahren auf molekularer Basis oder ”Molecular Imaging”. Hierbei können Tracer (oftmals radioaktive ionen oder Moleküle die mit Radioisotpen markiert sind) in die immobilisierte Carboxyl-Komponente noch vor der Kopplung eingeführt. Vorliegendes Verfahren erforderte wenige Manipulationen und alle überschüssigen Reagenzien, Nebenprodukte, sowie das gewünschte Konjugat fallen konzentriert an definiertem Ort an. Bei der Verwendung häufig angewendeter Radionuklide mit kurzen Halbwertszeiten wird hierdurch die Arbeitssicherheit im Labor oder Krankenhaus erhöht. Neben Anwendungen in der Medizin können die im Patent beschriebenen Konjugaten auch in der Archäologie und der Paläontologie eingesetzt werden.
Eine weitere Anwendung liegt in der „Drugdelivery”: Durch vorliegendes Verfahren können chemische Komponenten, die für sich genommen biologisch nur schwach aktiv sind in den Organismus eingeführt werden, und dort an genau nachweisbaren Stelle miteinander konjugiert werden wobei ein hochaktives Wirkstoffmolekül entsteht. Dieses Prinzip kann für vielfältigste Bioasseys herangezogen werden. Um z. B. die Bioverfügbarkeit eines Pharmazeutikums in gewissen Zelltypen zu bestimmen kann die Carboxyl-Komponente an einen bifunktionellen Träger binden der aus einem leicht mikroskopisch erfassbaren Nanopartikel besteht die zudem in die zu untersuchende Zelle aufgenommen wird. Die Azido-Komponente kann man frei in die Zellen diffundieren lassen. Nur wenn beide Komponenten an dem Nanopartikel aufeinandertreffen entsteht der Wirkstoff. Entsteht er im richtigen Kompartment der Zelle entfaltet er dort seine Wirkung.
Stand der Technik
Anwendung: Molekulare Bildgebende Verfahren (Molecular Imaging)
Molekulare Bildgebende Verfahren werden unter anderem in folgender weise verwendet:

1) Lokalisierung von krankhaft verändertem Gewebes,
2) Identifizierung des Phänotyps des krankhaft veränderten Gewebes,
3) Verfolgung eines biologischen oder therapeutischen Effektes herangezogen werden.

Verschiedene nicht oder wenig invasive Verfahren können hierzu Anwendung finden. Allen liegt ein Konstrukt zu Grunde bei dem eine Traceraktivität mit einer Erkennungsaktivität verbunden ist (siehe Bild 1).
Der Tracer:
Der Tracer ermöglicht den Nachweis der Rezeptoren für die Erkennungsaktivität. Dieser Nachweis muss selbst bei selbst in großer Verdünnung der Rezeptoren und in Anwesenheit vieler, strukturell und funktionell ähnlicher oder sehr unterschiedlicher Stoffe oder Moleküle, Molekülkomplexe möglich sein. Die Tracer sind aus diesem Grund oft Atome, funktionelle Gruppen, Moleküle oder nano-Materialien die sich durch eine charakteristische Absorption, Emission oder Streuung einer Strahlung auszeichnen. Hierzu gehören z. B. Radioisotope, Farbstoffe oder Chromophore in vielen Bereichen des elektromagnetischen Spektrums z. B. UV, sichtbar, IR bis hin zum Teraherzbereich, aber auch Kontrastreagenzien für Röntgenstrahlen und Ultraschall.
Die Erkennungsaktivität:
Vorteilhaft ist hierbei eine hohe, selektive Affinität der Erkennungsaktivität für spezielle Rezeptoren. Vor allem sind solche lösliche oder membranständige Rezeptoren bevorzugte Ziele, die nur oder vorwiegend in krankhaft verändertem Gewebe auftreten, wodurch die die Unterscheidung zwischen krankhaft verändertem und gesundem Gewebe ermöglicht wird. Beispiele für solche Rezeptoren sind Tumormarker die bevorzugt im Krebsgewebe anzutreffen sind. (Bigbee W, Herberman R. B. Tumor markers and immunodiagnosis. In: Bast RC Jr., Kufe DW, Pollock RE, et al., editors. Cancer Medicine. 6th ed. Hamilton, Ontario, Canada: BC Decker Inc., 2003.)
Hierzu zählen auch veränderte Glycane (William R. Alley, Jr., Milan Madera, Yehia Mechref, Milos V. Novotny. Anal. Chem. 2010, 82, 5095–5106).
Aber auch bestimmte Proteine z. B. CEA (Carcinoembryonic Antigen spezifisch für Colonkarzinoma), a) Thomas S. N. et al. 2008, J Biol Chem 283, 15647–55; b) Konstantopoulos K., Thomas S. N. Annu Rev Biomed Eng, 2009, 11, 177–202; c) Thomas S. N. et al. Biorheology 2009, 46, 207–25.) Interessant ist z. B. im Falle des Tumormarkers PSA (Prostate-specific antigen (PSA)), wenn Ort und Konzentration lösliche, im Blut befindliche und membranständige Rezeptoren getrennt bestimmt werden können. (Andriole G. L. et al. "Mortality Results from a Randomized Prostate-Cancer Screening Trial". New Eng. J. Med. 2009, 360, 1310; Schröder, F. H. et al. "Screening and Prostate-Cancer Mortality in a Randomized European Study". New Eng. J. Med. 2009. 360, 1320.) Es wird angenommen dass somit weniger invasive Biopsien nötig wären. (Catalona W, Smith D, Ornstein D "Prostate cancer detection in men with serum PSA concentrations of 2.6 to 4.0 ng/mL and benign prostate examination. Enhancement of specificity with free PSA measurements". JAMA 1997, 277, 1452–5; Herschman J. D. et al. "Effect of ejaculation on serum total and free prostate-specific antigen concentrations". Urology 1997, 50, 239–43)
Es können aber auch Veränderungen des Metabolismus darunter therapeutische oder Effekte durch Bildgebende Verfahren nachgewiesen werden. Hierbei kann ein geeigneter Metabolit, mit einem Tracer konjugiert werden. Das bekannteste Beispiel eines solchen Präparats ist die 2-¹⁸F-fluorodeoxyglucose (¹⁸FDG) (J. Nucl. Med. 1978, 19, 1154–1161, A. C. Kole et al. J. Nuc. Med. 1998; 39, 810–815.) FDG zeigt hierbei erhöhte Glucose Metabolismus an, allerdings auch schnell wachsendes Gewebe und Entzündungen. Aus diesem Grunde werden nicht nur andere niedermolekulare Marker z. B. FIT sondern auch Makromoleküle z. B. Proteine mit Radiotracern markiert. Hierzu werden allerdings nasschemisch hergestellte radioaktiv-markierte Linker-Moleküle z. B. 4-([18F]fluoromethyl)-2-chlorophenylisothiocyanat dargestellt, die dann an ein Protein konjugiert werden müssen. (F. Wüst, M. Müller; R. Bergmann 2004 Radiochimica Acta, 92, Issue 4–6 Stöcklin Memorial Issue, 349–353.) Auch Konjugate mit anderen Positronen Emittern sind besschrieben (Long-Lived Positron Emitters Zirconium-89 and Iodine-124 for Scouting of Therapeutic Radioimmunoconjugates with PET: Iris Verel et al. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 2003, 18, 655–661.)
In einem anderen Verfahren werden radioaktiv markierte Rezeptor Antagonisten als Erkennungs- Funktionalität verwendet. (Prenanta et al. Appl. Radiation, Isotopes, 2010, 68, 1721–1727) In letzter Zeit werden auch, mit ¹⁸F-markierte kurze, synthetische Nukleinsäuren oder Peptide, sogenannte Aptamere verwendet, die selektiv an die Oberflächen krankhaft veränderter Zellen binden können. (Friebe, Matthias et al. PCT Int. Appl., WO2009033876 A1 ). Beispielsweise werden in der Onkologie in letzter Zeit Aptamere verwendet, die selektiv an gewisse Tumormarker, binden können. (Hoppe-Seyler F, Butz K. J. Mol. Med. 2000, 78, 426–30; The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications, Sven Klussmann (Editor) ISBN: 978-3-527-31059-3 March 2006, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA) Mit solch, neuartigen Aptameren kann eine selektivere PET durchgeführt werden.
Schließlich kann auch die Präsenz und/oder Zugänglichkeit verschiedener RNA-Sequenzen mittels siRNA analysiert ermittelt werden, die mit einem ¹⁸F-fluorocarrier markiert werden können. (T. Veil et al. J. Label. Compd. Radiopharm. 2007, 50, 1159–1168).
Die Wahl der Tracer
Die Art des Tracers hängt von der Art des verwendeten bildgebenden Verfahrens ab. Das bildgebende Verfahren muss nach Diagnoseziel und Patient ausgewählt werden.
Wahrend CT und Ultraschall und MRI-Verfahren die Morphologie des Krankhaften bei MRI auch die Physiologie des erkrankten Gewebes beobachten lassen, lassen PET, SPECT und optische bildgebende Verfahren die Erkennung von Metabolismus und speziellen Molekülen (z. B. Tumormarkern) zu.
So wird z. B. optisches „Imaging” oft der präklinischen Entwicklung neuer Pharmazeutika bei Tierversuchen mit kleinen Tieren z. B. Mäusen und Ratten eingesetzt. Es ist beschränkt durch die Lichtdurchlässigkeit des Gewebes. (Majoros, I. J.; et al.: PAMAM dendrimer-based multifunctional conjugate for cancer therapy: synthesis, characterization, and functionality. Biomacromolecules 2006, 7, 572–579; Thomas, T. P. et al. Targeting and inhibition of cell growth by an engineered dendritic nanodevice. J. Med. Chem. 2005, 48, 3729–3735; Majoros, I. J.; et al. Poly(amidoamine) dendrimer-based multifunctional engineered nanodevice for cancer therapy. J. Med. Chem. 2005, 48, 5892–5899)
CT (Computertomographie) ist ein bildgebendes Verfahren bei dem mittels Röntgenstrahlen Schnittbilder durch den Körper angefertigt werden können. Dieses Verfahren wird zum Erkennen der Morphologie krankhafter Gewebe verwendet. Häufige Anwendungen sind z. B. Angiographie, Venographie, VCUG (Ausscheidungs-Zystourethrographie), HSG (Hysterosalpinogramm) oder IVU (Intravenöse Urographie), Kolonographie bei Patienten mit einem hohen Risiko für Dickdarmkrebs oder Full-Motion-Herz-Scans für Patienten mit hohem Risiko von Herzkrankheiten. Eine Reihe von Institutionen bieten Full-Body-Scans für die allgemeine Bevölkerung an. Sie werden aber aufgrund des Strahlenrisikos selten bei Kindern durchgeführt. Ultraschalluntersuchung oder Kernspintomographie stellen Alternativen (zum Beispiel zur Appendizitisdiagnose) ohne Strahlenbelastung dar. (Roxanne Nelson (December 17, 2009). ”Thousands of New Cancers Predicted Due to Increased Use of CT”. Medscape. http://www.medscape.com/viewarticle/714025.) Die für häufigsten, für CT verwendeten Kontrastmittel sind Barium Sulfat (Bariumeinlauf), aber auch iodhaltige Kontrastmittel z. B. geladene Verbindungen wie Diatrizoate (Hypaque 50), Metrizoate (Isopaque 370), Ioxaglate (Hexabrix) oder nichtionische Verbindungen wie Iopamidol (Isovue 370), Iohexol (Omnipaque 350), Ioxilan (Oxilan 350), Iopromide (Ultravist 370), Iodixanol (Visipaque 320). Im Tierversuch haben sich ferner Gold-Nanopartikel (Cai, Q. Y. et al. Invest. Radiol. 2007, 42, 797–806; Hainfeld, J. F. et al. The British J. Radiol. 2006, 79, 248–253) oder Bi₂S₃ Nanopartikel (Rabin, O. et al. Nat. Material. 2006, 5, 118–122) bewährt.
Ein auch häufig eingesetztes Verfahren zur Bildgebung ist SPECT (Single Photon Emission Computertomographie). Die Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) (dt. Einzelphotonen-Emissions-Tomografie a) Hardy A, Entlarvende Blicke ins Gewebe, in Frankfurter Allgemeine Zeitung, vom 30. Mai 2007; b) Nach EN 61675-2 (Europäische Norm) vom 15. Mai 1998) ist ein diagnostisches Verfahren zur Herstellung von Schnittbildern lebender Organismen. SPECT-Bilder zeigen die Verteilung eines Radiopharmakons im Körper. Sie eignen sich, je nach Art des Radiopharmakons, zur Beurteilung der Funktion verschiedener Organe. Basierend auf dem Prinzip der Szintigrafie, wird dem Patienten zu Beginn der Untersuchung ein Radiopharmakon (ein Radionuklid oder eine mit einem Radionuklid markierte Substanz) verabreicht, meist als Injektion in eine Armvene. Die verwendeten Radionuklide emittieren Gammastrahlung, die mit Gamma-Kameras detektiert wird. Im Gegensatz zu 'statischen' SPECT-Untersuchungen, bei denen nur die Verteilung des Radiopharmakons zu einem Zeitpunkt bestimmt wird, gibt es auch sog. 'dynamische' Untersuchungen, wobei man durch wiederholte Messungen im Abstand von Minuten, Stunden oder Tagen zu einer Beurteilung der zeitlichen Änderung der Radioaktivitätsverteilung gelangt (z. B. mit ¹³³Xe). Häufige Anwendung findet SPECT im Rahmen der Kardiologie, wobei man die gemessenen Zerfälle in Relation mit dem Herzschlag (gemessen z. B. durch ein zusätzliches EKG) registriert. Letzteres Verfahren nennt man gated SPECT, denn die Daten werden in verschiedene Gates oder Bins einsortiert. Nach neueren Verfahren werden auch Konjugate von ¹³¹I-Tracern mit Antikörpern verwendet die dann die Bestimmung der Tumorart mittels SPECT und dessen Morphologie mittels CT zulassen. (Koral et al. J. Nuc. Med. 2000, 41, 1579–86.) ⁹⁹Tc-Tracer und werden in ähnlicher Weise als Bestandteil Tumor erkennender Konjugate verwendet (Mindt, T. L. et al. ChemMedChem 2010, 5, 2026–2038; Yang et al. J Nucl Med. 2006; 47 (Supplement 1):520P)
Unter den in der Radiologie angewendeten Verfahren ist die Positronemissionstomographie (PET) ein bevorzugtes um Krankheitsverläufe und deren Therapie in vielen Indikationsgebieten z. B. in der Onkologie zu verfolgen. Hierzu wird bevorzugt das, künstlich in einem Cyclotron dargestellte, Fluorisotop ¹⁸F verwendet. Unter den Positronen emittierenden Radionukliden wird das Fluorisotop ¹⁸F oft bevorzugt, weil es in viele organische Verbindungen einführbar die dann als PET-”Tracer” verwendet werden können. Vorteilhaft hierfür ist die relativ lange Halbwertszeit von 109.6 Min. und eine niedrig energetische β+ Emission (635 keV) dieses Nuklids. Allerdings können auch andere Nuklide herangezogen werden. Mit ihm werden markierte Verbindungen dargestellt, die selektiv durch das krankhaft verändertes Gewebe aufgenommen werden, oder an krankhaft veränderte Zellen selektiv binden können. Solche ¹⁸F-markierten Verbindungen werden hier weiterhin als PET-”Tracer” bezeichnet. Sie ermöglichen die Sichtbarmachung des Gewebes an das sie binden oder in das sie aufgenommen werden mittels Autoradiaographie. Durch die Positronemissionstomographie (PET), mit PET-”Traceren” lässt sich das erkrankte Gewebe im Körper des Patienten lokalisieren und seine Größe bestimmen.
Die bei den Bildgebenden Verfahren verwendeten Tracer sind somit sehr unterschiedlich und sind beispielhaft in Tabelle 1 zusammengefasst.
Neben den medizinischen Anwendungen werden bildgebende Verfahren auch in der Materialforschung, der Archäologie und der Paläontologie eingesetzt. Beispielsweise können paläontologische und archäologische Funde mittels CT_Scans untersucht werden. (O'Connor, S. J. Archaeological Sci 2011, 38, 1641–1654; Balanoff, A. M., et al. Digital preparation of a probable neoceratopsian preserved within an egg, with comments on microstructural anatomy of ornithischian eggshells. Naturwissenschaften 2008, 95, 493–500; Polcyn, M. J. et al. Computed tomography of an Anolis lizard in Dominican amber: systematic, taphonomic, biogeographic and evolutionary implications. Paleontologia Electronica 2001. 21, 8A–9A; http://paleo-electronica.pangaea.de/2002_1/amber/amber.pdf; Witmer, L. and Rigley, R. New insights Into the brain, braincase, and ear region of tyrannosaurs (Dinosauria, Theropoda), with implications for sensory organization and behavior. The Anatomical Record. 2009, 292, 1266–1296)
Radio Markierung
Die Markierung organischer Moleküle mit kurzlebigen Radioisotopen ¹¹C (Halbwertszeit: 20 min) und ¹⁸F (Halbwertszeit: 110 min). erfordert oft mehrere nasschemische Stufen, darunter einigen, die oberhalb 100°C, sowie aufwendige Chromatographieschritte. Das herkömmliche Einführen von kurzlebigen Radioisotopen ist somit aufgrund der hohen Radioaktivität mit hohen Risiken für die durchführenden Personen verbunden. (http://www.klinikum.uniheidelberg.de/PET.392.0.html) Außerdem ist hier die Schnelligkeit des Verfahrens besonders wichtig. Bei Verwendung von Radioisotopen mit noch kürzeren Halbwertszeiten, wie ¹³N (Halbwertszeit: 9,97 min) und ¹⁵O (Halbwertszeit: 2 min), sind Syntheseverfahren in der Regel nicht mehr sinnvoll. So verwendet man oft Ein-Topf-Reaktionen, Mikro-Reaktoren, Ultraschall- und Mikrowellen-Verfahren sowie festphasengebundenen Reaktanten. (Långström, B. et al., Acta Chem. Scand. 1999, 53, 651; Miller, P. M. et at. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8998.) Radioaktive Markierungen mit kurzen Halbwertszeiten werden bevorzugt in den letzten Schritten in einer Synthese einführt. Da die hierfür verwendeten Reaktionen und alle nachfolgenden Schritte schnell und mit hohen Ausbeuten verlaufen müssen kommt die Huisken 2 + 3 Zykloaddition oder ”Klick-Chemie” oft hierbei oft zum Einsatz. (Walsh, J. C.; Kolb, H. C. Chimia 2010, 64, 29; Für Markierung mit ¹⁸F-und ¹¹C: K. Nwe, M. W. Brechbiel, Cancer Biotherap. Radiopharm. 2009, 24, 289.) Verbindungen oder Reagenzien die radioaktive Strahlung abgeben werden oft beschleunigt abgebaut. Die Entsorgung radioaktiver Abfälle kann eine Herausforderung darstellen, und muss separat von entsprechend geschultem Personal gehandhabt werden. Radioaktive Abfälle sollten nicht mit den allgemeinen Laborabfällen vermischt werden. Die Entsorgung mancher Abfallmischungen z. B. aus brennbaren oder hochgiftigen radioaktiven Abfällen kann extrem teuer sein. (C. S. Elmore, Ann. Rep. Med. Chem. 2009, 44, 515.)
Besonders vorteilhaft erscheinen Markierungsverfahren mit festphasengebundenen Reaktanten, d. h. einem Konjugationsmittel. Durch die geschickte Wahl der Chemie lassen sich solche Verfahren so gestallten, das eine Abtrennung der Nebenprodukte sehr leicht erfolgen kann. So kann ist beschrieben, dass ein Tracermolekül an ein spezielles, thiolgruppentragendes Polymer mittels einer Carboxylgruppe gebunden werden kann. Nach Waschen des Polymers verbleibt nur noch die Tracer-Komponente, hochrein auf der Festphase. Zugabe der Erkennungsaktivität, die mit einer Arid-Gruppe versehen ist. Das Polymer das so beschaffen ist, dass es eine Staudinger-Reaktion zwischen der Carboxyl-Komponente, (Tracer) und der Azido-Komponente (Erkennungsaktivität) ermöglicht, wobei das Konjugat aus Tracer und Erkennungsaktivität hochrein freigesetzt wird. (Annie Tam, Ronald T. Raines Bioorganic & Medicinal Chemistry 2009, 17, 1055–1063). Besonders geeignet erscheint dieses Verfahren für die Markierung mit Radioisotopen z. B. ¹⁸F (Raines, T. et al. DE60110127T2 2006.02.02 ; Robbillard, M. S. et al. WO2006/038184 A2 )
Die in der Medizin verwendeten bildgebenden Verfahren haben unterschiedliche Charakteristika bezüglich auf was und wie abgebildet werden kann. Hierbei kann man Rezeptoren an der Oberfläche der Zellen nutzen, die Substanzen mit passenden Oberflächenmolekülen erkennen können. Die Rezeptoren variieren von Zelltyp zu Zelltyp bzw. von Gewebe zu Gewebe. Nach dem heutigen Stand der Technik werden Erkennungsaktivitäten für Rezeptoren die charakteristisch für erkranktes Gewebe oder einzelner erkrankter Zellen sind, oft mit bildgebenden Tracern konjugiert. Hierdurch kann das erkrankte Gewebe selektiv abgebildet, und nach seinen Eigenschaften charakterisiert werden. Oft ist es notwendig einige, verschiedene bildgebende Verfahren zu kombinieren um eine verlässliche Diagnose zu erhalten.
Verschiedene Proben für bildgebende Verfahren nach Baukastensystem
Diese Erfindung ermöglicht, bedingt durch einen normierten Konjugationsprozess, viele der bildgebenden Tracer aber auch Toxine und Neutronenabsorber mit vielen Erkennungsaktivitäten frei zu kombinieren. Hieraus resultiert eine hoch standardisierte und schnell durchführbare, sichere Diagnose. Der Grundprozess, der als zentraler Bestandteil eine Staudinger-Kopplung (Staudinger, H.; Meyer, J. Helv. Chim. Acta 1919, 2, 635–64) enthält ist in Bild 2 dargestellt. Der Konjugationsprozess findet hierbei an einem grau schraffierten Konjugationsmittel statt, wobei „M¹” und „X¹” essentielle Heteroatome sind die die Staudinger Kopplung ermöglichen (siehe Bild 2).
In bevorzugter Ausführung ist das Konjugationsmittel sie stationäre Phase einer Kolonne. Die Reagenzien, die für die Konjugation, Modifikation der immobilisierten Intermediate und Waschschritte notwendig sind werden am Kolonneneinlass appliziert. Die Nebenprodukte und die Endprodukte, die Konjugate fallen am Kolonnenauslauf an. Der Konjugationsprozess verläuft wie folgt:

1) Die Staudinger Kopplung beginnt mit der Acylierung der Gruppe X¹ des Konjugationsmittels mit der Carboxyl-Komponente. (Bild 2) Überschüssige Reagenzien werden durch Waschschritte entfernt.
2) Anschließend erfolgt die Zugabe der Azido-Komponente (L⁵) die, die Erkennungsaktivität tragen kann.
3) Die Intramolekulare Reaktion der Azido-Komponente und der Carboxyl-Komponente am Konjugationsmittel bildet das Konjugat.

In Sonderfällen kann aber auch zuerst die AzidoKomponente mit dem Konjugationsmittel zur Reaktion gebracht werden die auch den Tracer Tragen kann. Die Nachfolgende Acylierung des Konjugationsmittels führt zur Freisetzung des Konjugats.
In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Konjugationsmittels wird die, aus dem Konjugationsmittel austretende Produktlösung durch eine Chromatographiesäule geleitet, die mit chemischen Funktionalitäten z. B. Phosphin-Gruppen belegt ist, die überschüssige Azido-Komponente binden kann. Im Falle der einer Konjugation, in der zunächst die Azido-Komponente eingeführt wird, um dann, mit der aktivierten Carboxyl-Komponente zur Reaktion gebracht zu werden, ist es vorteilhaft die, aus dem Konjugationsmittel austretende Produktlösung durch eine Chromatographiesäule zu leiten die die überschüssige Carboxyl-Komponente binden und somit aus der Produktlösung entfernen kann.
Die Staudinger-Konjugationschemie ermöglicht die z. B. Konjugation verschiedener Makromoleküle wie Oligosaccharide, Oligonucleotide, Liposomen oder Peptide mit allen Molekültypen von kleinen organischen Molekülen, metallorganischen Verbindungen, Metallkomplexen, Polymeren wie Oligonucleotiden, Oligosacchariden, Peptiden, Antikörpern oder deren Teile bis hin zu Kompositstrukturen aus z. B. verschiedenen künstlichen und/oder Biopolymeren. Besonderes vorteilhaft ist hierbei, dass die Konjugation ein Zweistufenprozess ist der das Abwaschen der der Nebenprodukte des ersten Schrittes vor alter dann ermöglicht. Weiterhin vorteilhaft ist die Möglichkeit weitere chemische Modifikationsschritte zwischen der Acylierung der Carboxyl-Komponente und der Abspaltung des fertigen Konjugats einfügen lassen. Hierbei ist für das Abtrennen der Nebenprodukte vorteilhaft, wenn das Konjugationsmittel auf einer leicht abtrennbaren Phase, z. B. einem unlöslichen, und/oder polymeren Träger oder einer ferromagnetischen Substanz oder einer Metalloberfläche oder einem Nanomaterial immobilisiert ist (Bild 2, grau schraffierte Flächen).
Hieraus ergibt sich eine hoch integrierte Diagnostik/Therapie Strategie die auf die jeweils die gleiche Zielstruktur im zu behandelten Patienten erkennt. Im Gegenzug wird es erfindungsbedingt möglich unterschiedliche Erkennungsfunktionalitäten mit jedem möglichen Tracer zu Konjugieren so dass ein Diagnostik Baukastensystem entsteht. Eine flexible Imaging-Plattform die es ermöglicht unterschiedliche Tracer Abbildungsverfahren und Tracer-Konjugate einzusetzen ist unbedingt erforderlich, da nachweislich unterschiedliche Tracer oder Tracer-Konjugate einen und denselben Tumor in anderer Art abbilden, so dass je nach Wahl des Agenzes unterschiedliche Tumorvolumina angezeigt werden. (Nestle, U. J. Nucl. Med. 2005, 46, 1342–1348) Mit einem hochflexiblen Diagnostiksystem kann dann außerdem der Erfolg einer Therapie schon im Frühstadium angezeigt werden, da entsprechende Zytotoxica, Zytostatica, Agonisten, Antagonisten, Aktivatoren oder Inhibitoren den krankhaft veränderten Zellen gezielt mittels Konjugat mit einer Erkennungsaktivitäten verabreicht werden kann.
Bild 3 veranschaulicht am Beispiel einer erfindungsgemäßen Tumordiagnose die Kombinations-möglichkeiten der Erkennungsaktivitäten und der Tracer. Diese Konjugation erfolgt an einem schraffierten Konjugationsmittel.
Ein besonderer Vorteil dieses allgemeinen Konjugationsverfahrens liegt darin, dass die Erkennungsaktivitäten und die Tracer chemisch sehr unterschiedlich beschaffen sein können. So sind beispielsweise ¹⁸F-Träger meist niedermolekular, während paramagnetische Gd-Komplexe besonders effizient für MRI genutzt werden können, wenn sie in hoher lokaler Konzentration als Bestandteil eines Polymers oder Dendrimers vorliegen.
Bei kurzlebigen Radioisotopen kann nun eine Sonderform des Verfahrens zum Tragen kommen. Hierbei wird zunächst der mit dem Radioisotop zu derivatisierende „Carrier” auf einem Polymer immobilisiert das sich in einer Säule befindet. Essentiell ist hierbei, dass die Umhüllung jener Säule das Austreten von ionisierender Strahlung verhindert.
Anschließend erfolgt die Einführung des Radionuklids in den, auf fester Phase immobilisierten „Carrier”. Nachdem Überschüssige Radionuklide von dem Polymer eluiert worden sind, verbleibt der, mit dem „Radionuklid” beladene „Carrier”. Die Schutzhülle die die Konjugationssäule umgibt verhindert bewirkt, dass radioaktive Substanzen nur durch eine definierte Auslassvorrichtung die Säule verlassen können, was die Arbeitsicherheit des Bedienungspersonals erhöht.
Mit Zugabe der Azido-Komponente die Freisetzung des amidverknüpften Konjugats. Überschüssige Azido-Komponte kann vom Konjugat durch spezielle immobilisierte Reagenzien gebunden werden.
Im Gegensatz zu dem Stand der Technik werden bei dem hier beschriebenen Prozess unter minimalen Aufwand ein hohen Grad an Arbeitssicherheit zu gewährleisten. Dies geschieht dadurch, dass vor allem nasschemische Manipulationen mit Radionukliden minimiert werden und der radioaktive Abfall konzentriert anfällt.
Die Ausführung des Konjugationsmittels (Bild 4) ermöglicht eine Reihe von chemischen und enzymatischen Prozessen durchzuführen bevor das fertige Konjugat mithilfe der Azido-Komponente von der Festphase abgespalten wird. Um viele solcher Prozesse durchzuführen ist es vorteilhaft das Atom „M¹” des Konjugationsmittels mit einer Schutzgruppe „PG” zu versehen, die dann weitere Modifikationen an der Carboxyl-Komponente ermöglichen (siehe Bild 4).
Konjugationsmittel auf Nanopartikel
Ein weiterer Vorteil eines solchen Konjugationssystems wird dadurch erhalten wenn das Konjugationsmittel auf einem Nanopartikel immobilisiert ist. Hieraus ergeben sich neue Möglichkeiten für Bioassay-Typen die zur Charakterisierung von Wirkstoffen im HTS in Zellkulturen, Gewebekulturen bis hin zur präklinischen Entwicklung. Von Vorteil liegt hierbei im erleichterten Nachweis, des Konjugationsmittels durch das es tragende Nanopartikel unter Verwendung verschiedener mikroskopischer Verfahren (Cheng, J. et al. Anal. Chem. 2010, 82, 8744–8749) aber auch mittels CT (z. B. Popovtzer, R. et al. Nanoletters 2008, 8, 4593–6), MRI, PET oder auch Kombinationen verschiedener bildgebender Methoden (Chen, F. Dalton Trans. 2011, DOI: 10.1039/c1dt10374a; Nahrendorf, M. et al. Circulation 2008, 117, 379–387) je nach Typus des verwendeten Nanopartikel lokalisiert werden kann. Darüber hinaus haben Nanomaterialien aufgrund spezieller Eigenschaften z. B. die Blut-Hirn-Schranke passieren (Umwelt Bundes Amt: Nanotechnik: Chancen und Risiken für Mensch und Umwelt. 2006). Beschichtet man die gewünschten Nanomaterialien mit Biomolekülen, wie z. B. monoklonalen Antikörpern (siehe Antikörper) oder Zuckerresten, die hochspezifische Eigenschaften haben und somit nur von bestimmten Zellrezeptoren erkannt werden können, ist es möglich, sie mittels rezeptorgesteuerter Endozytose in ganz bestimmtes Körpergewebe zu dirigieren und in spezifische Zelltypen eindringen zu lassen. (S. S. Davis: Trends in Biotechnology 1997, 15, 217–224)
Erfindungsgemäß kann ein Wirkstoff aus mehreren Komponenten selektiv innerhalb des Zielgewebes oder diverser Zelltypen dargestellt werden. Hierbei wird nun eine Carboxyl-Komponente, die nicht einmal bio-verfügbar zu sein braucht, mit einem Konjugationsmittel zur Reaktion gebracht, das sich auf einem Nanopartikel befindet. Durch die Beschichtung des Nanopartikels kann nun die Carboxyl-Komponente wirt dann in welches Zielgewebe die Carboxyl-Komponente transportiert werden kann.
Es kann, nachdem durch bildgebende Verfahren nachgewiesen worden ist, dass die Nanopartikel den Wirkort erreicht haben, die zweite, die Azido-Komponente, der z. B. der Zellsuspension oder Gewebekultur verabreicht werden. Nur in Anwesenheit des Nanopartikels mit der Carboxyl-Komonente kann eine Konjugation erfolgen, die dann ein Produkt entstehen lässt, das seine Biologische Wirkung im loco nascendi entfalten kann. Letztere biologische Aktivität kann durch die üblichen Indikatoren für die zellularen Lebensprozesse verifiziert werden.
Erfindungsgemäß können auch kleine, mit kurzlebigen Isotopen markierte, oder hyperpolarisierte Azid-Komponenten den Zellen oder dem Gewebe verabreicht werden, die dann das Konjugat verfolgen, oder dessen Metabolismus untersuchen lassen.
Die Verwendung eines Konjugationsmittels, zwischen verschiedenen zu konjugierenden Moleküle oder Molekülgruppen unterscheidet.
In einer Sonderausführung des Konjugationsmittels kann die Staudinger Komponente (I) sich innerhalb organischer oder anorganischer Polymere eingelagert sein, die mittels „Molecular Imprinting” hergestellt werden. In einem solchen Fall kann ein Konjugationsmittel erhalten werden, das nur selbst bei einer Mischung möglicher Reagenzien nur ein ganz bestimmtes Reagenzienpaar konjugieren kann (siehe Bild 5).
Die Differenzierung ist durch die Carboxyl-Komponente und die Azido-Komponente (Bild 5) einzeln oder gemeinsam möglich. Der erfindungsgemäße Vorteil eines solchen Konjugationsmittels liegt darin, dass Verwechselungen minimiert werden, da ein „falsches” Substrat nicht effizient z. B. mit ¹⁸F markiert werden kann. Darüber hinaus können vor allem polyfunktionelle Moleküle, z. B. Proteine an reproduzierbar der gleichen Stelle konjugiert werden. Hieraus ergibt sich der Vorteil, dass die Erkennungsaktivität durch unterschiedliche Konjugation nicht beeinträchtigt wird und reproduzierbare bildgebende Verfahren ermöglicht.
Ein solches Konjugationsmittel kann in der Forschung oder Analytik eingesetzt werden um z. B. leicht ähnliche Substanzen zu identifizieren oder deren Aufenthalts ort in unterschiedlichen Gewebetypen und sogar lebenden Organismen zu erkennen.
Weitere Anwendungen eines solchen Konjugationsmittels können unter anderem in der medizinischen Diagnostik, dem Screening von Wirkstoffen, der Therapie bis hin zur Paläontologie und Archäologie liegen.
Das Konjugationsmittel
Zentraler Bestandteil der Erfindung ist das Konjugationsmittel. Das Konjugationsmittel besteht aus einer zentralen „Staudinger Komponente” (allgemeine Formeln I und I') die mit einer Phase, einem Träger („Pol”) verbunden ist, (siehe Formeln IIa–IIn) die die Abtrennung des Konjugationsmittels von den Konjugaten, Nebenprodukten und Lösungsmitteln ermöglicht.
Der Träger ”Pol” (allgemeine Formeln IIa–IIn) exponiert die „Staudinger Komponente” (allgemeine Formeln I, I') so, dass sie ein möglichst breites Spektrum von Molekülen und/oder deren Komplexe miteinander konjugieren kann, unabhängig davon, ob der Träger in deren organische oder in wässrige Lösungen eintaucht. Diese Eigenschaften können sowohl durch das Material des Trägers „Pol” die Linker „L¹, L¹', L^1''” und „L^p” oder die Substituenten von „M¹”, die Gruppen „L², L³, L⁴” erreicht werden. Der Träger „Pol” kann über die 1–3 Linker „L¹, L^1', L^'' und L^p” kovalent, metallisch oder ionisch mit den Substituenten von „M¹” den Gruppen „L², L³, L⁴” verbunden sein. Darüber hinaus kann der Träger „Pol” über spezielle Linker „L^p” direkt mit dem Heteroatom „M¹” verbunden sein. In letzterem Fall übt der Linker „L^p” eine Schutzgruppenfunktion für das Heteroatom „M¹” aus. Das Heteroatom „M¹” kann durch eine Gruppe „PG” oder „L^p” vor ungewollten chemischen Reaktionen geschützt werden. Diese Reaktionen sind meist, aber nicht ausschließlich Oxidationen oder Bindung an M¹-affine Reagenzien z. B. Schwermetalle oder Alkylierungsreagenzien wie sie bei langer, eventuell unsachgemäßer Lagerung auftreten können. Vor dem Einsatz als Kopplungsreagenz muss die Schutzgruppe des M¹-Atoms entfernt werden. Bei der Staudinger Kopplung wird „M1” durch die Azido-Komponente oxidiert wobei es die Kopplungsreaktion einleitet. Diese erfolgt mit einem, in der Nachbarschaft von „M¹”, befindlichen aktivierten Ester der die Gruppe (bevorzugt SH, NH OH) „X¹” beinhaltet.
Die Verknüpfung des Polymers über die Linker „L', L¹', L^1''” kann beliebig an den Gruppen „L², L³, L⁴ erfolgen. Es können auch mehrere oder alle Gruppen „L², L³, L⁴” mit dem Trager ”Pol” verknüpft sein. Das Heteroatom M¹ ist essentiell für die Staudinger Kopplung (Allgemeine Formeln IIa–IIn)
Pol:
Hierin ist „Pol” in den Ausführungen IIa–n, ist eine Phase die die Abtrennung des Konjugationsmittels von den Lösungsmitteln ermöglicht. Es ist bevorzugterweise ein unlösliches, organisches oder anorganisches Polymer, eine Metalloberfläche oder makromolekulare Oberfläche auf welcher organischen und wässrigen Milieu chemische Reaktionen durchgeführt werden können. (Arshady, R. J. Chromatography A 1991, 586, 181–197; Delgado M.; Janda K. D. Current Organic Chemistry, 2002, 6, 1031–1043) Bevorzugt sind grobporige, makroporöse Materialien, wie sie z. B. in der Affinitätschromatographie engesetzt werden (Varilova, T. et al. Current Proteomics 2006, 3, 55–79), weil diese die Konjugation mit Makromolekülen wie z. B. Antikörpern, Oligonucleotiden oder Dendrimeren zulassen. Solche Materialien ähnlich oder -identisch der Medien für die Affinitätschromatographie sind z. B. Agarose (Biorad, Life Science Research 2000 Alfred Nobel Drive Hercules, CA 94547), Amylose, oder Sepharose (GE Healthcare) Diese Materialien beinhalten auch monolithische Materialien und Materialien die eine hohe Affinität für spezielle Moleküle mittels „Molecular Imprinting” erhalten haben. Es können auch CoreShell Harze (Cho, Jin Ku et al. Macromol. Chem. Phys. 2002, 203, 2211–2217; Carter, S. R.; Rimmer, S. Advanced Functional Materials, 2004, 14, 553–561) ROMP-Harze und Rasta Harze (Linsley, C. et al. J. Comb. Chem. 2000, 2, 550; McAlpine, S. et al. J. Comb. Chem. 2001, 3, 1; Wisnoski, D. et al. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 4321) Verwendung finden. Unter den organischen Polymeren z. B. folgende Materialien als Homo- oder Mischpolymer in allen möglichen Variationen verwendet: Polystyrol (Huck, Ch. W.; Bonn, G. K. Chemical Engineering & Technology 2005, 28, 1457–1472), Polyethylen, Polypropylen, Polyphenylen, Polyacrylamiden, Polyacrylestern, Polyamiden, Polysulfonen, Polyurethan, Polysaccharide, Kautschuk Derivate, und deren Derivate z. B. Dextran, PEG, Polypropylenglycol sowie alle partiell oder erschöpfend fluorierten Derivaten der vorgenannten Materialien. Bevorzugt sind auch Polymere ähnlich oder -identisch dem ”Pol” Tentagel^® (Rapp Polymere GmbH, Ernst-Simon-Str. 9, D-72072 Tübingen, Germany), Polymerkörper der durch ”Injektion Molding” erzeugt wurde z. B. (Mimotopes Pty Ltd, 11 Duerdin Street, Clayton Victoria 3168, Australien, www.mimotopes.com) oder Materialien die aus ferromagnetischen Substanzen bestehen.
In einer Sonderausführung kann die Staudinger Komponente (I oder I') selbst mit allen möglichen zweifachen und dreifachen Verknüpfungen in Polymerketten eingelagert sein, wie in den allgemeinen Formeln „IId_n, IIe_n, IIf_n, IIg_n, IIg'_n, IIg''_n” dargestellt. Solche Verknüpfungsarten können bevorzugt bei Harzen realisiert werden die mittels „Molecular Imprinting” hergestellt werden. In einem solchen Fall kann ein Konjugationsmittel erhalten werden, das nur selbst bei einer Mischung möglicher Reagenzien nur ein ganz bestimmtes Reagenzienpaar konjugieren kann.
Die Staudinger Komponente I und I' und ihre zwei und dreifachen Verknüpfungen als Bestandteil einer Polymerkette. Es können auch Polymere „Pol” mit unterschiedlichem Verzweigungsgrad verwendet werden, die in jeder möglichen Kombination mit den vorgenannten Staudinger Komponenten I oder I' co-polymerisiert sein können (siehe Bild 6).
Eine weitere Ausführung von „Pol” ist die eines Kompositmaterials aus einer anorganischen oder metallischen Komponente. Hierzu zahlen die Oberflächen von TiO₂, Eisenoxiden z. B. Fe₂O₃, Fe₃O₄, Polysilicate, z. B. Controlled Pore Glass, mesomorphes SiO₂ oder Fractrosil, Aluminiumoxid, Zirkoniumphosphat, Hydroxyappatit, Preußisch Blau, Bornitrid, Silizium, Graphene, Kohlenstoffnanoroehren, Quantum Dots, Au etc. Einige der aufgeführten Materialien beschränken die Anwendung des Konjugationgeräts hinsichtlich der möglichen Chemie die die Carboxyl-Komponente modifizieren kann. Eine Fluorierung der Carboxyl-Komponente mit HF oder nacktem Fluorid ist mit den meisten SiO₂-haltigen Trägermaterialien nicht durchführbar. Diese Oberflächen können unterschiedlich beschichtend sein, um die Konjugation mit der Staudinger Komponente zu ermöglichen, die Materialoberfläche zu passivieren oder ihr andere chemische, physikalische oder biologische Eigenschaften zu geben.
Neben Materialien, die „Molecular Imprinting” ermöglichen, können diese anorganischen oder metallischen Phasen jedwede Form haben z. B. sphärisch, kubisch, unregelmäßig geformt, Schichtartig etc. Die Größe der Partikel kann sehr variieren, von Nanopartkeln bis hin zu monolithisch, makroskopischen Materialen die Größe einer Chromatographiesäule mit einigen cm-Länge und Durchmesser haben. Darüber hinaus können die Materialien spezielle physikochemische Eigenschaften besitzen, die deren Auffinden in komplexen Gemischen oder der Analyse des Fortgangs der Staudinger Kopplung zuträglich sind. Solche Eigenschaften können z. B. Fluoreszenz, starke optische wellenlängenspezifische Absorption, oder magnetisches Verhalten z. B. Superparamagnetismus sein. Die Verwendung eines paramagnetischen Trägers erlaubt z. B. das Abtrennen des Konjugations-geräts mit Hilfe eines magnetischen Feldes.
Die Gruppen L¹, L^1' und L^1''
Die Gruppen „L¹, L^1'” und „L^1''” stellen die Verbindung zwischen Staudinger Komponente (I oder I') und dem Träger „Pol” dar. Sie können in minimaler Ausführung eine chemische Bindung zwischen der Staudinger Komponente und „Pol” sein. Darüber können sie unabhängig voneinander in jeder möglichen Weise variiert werden, wobei „L¹, L^1' und L^1''” unabhängig von einander aus 0-400 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-400 Heteroatomen bestehen können, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jeder möglichen Kombination vorkommen können. „L¹, L^1' und L^1''” können unabhängig voneinander Heteroatome aus folgender Liste enthalten: F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ti, Zr, Hf, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn, H und deren Isotope. Die Gruppen „L¹, L^1' und L^1''” können mit „Pol” ionische, metallische, kovalente oder Van der Waals-Bindungen unterhalten.
Die Gruppen L², L³
„L²” und „L³” können unabhängig voneinander in jeder möglichen Weise variiert werden. Sie bestehen unabhängig von einander aus 1-400 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-400 Heteroatomen, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jedem möglichen Kombination vorkommen können. „L² und „L³” können unabhängig voneinander die Atome F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ti, Zr, Hf, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn, H und deren Isotope enthalten. Die Gruppen „L²” und „L³” können unabhängig voneinander entweder direkt oder mittels der Gruppen „L¹, L^1,” und „L¹” ionische, metallische, konvalente oder Van der Waals-Bindungen mit einem Träger des Typs „Pol” unterhalten. Sie können mit „M¹” eine Bindung unterhalten. Sie können aber auch je eine Bindung mit „Pal, L¹, L¹'” oder „1¹” einerseits und eine Bindung mit „M¹” andererseits unterhalten. Die Verknüpfung mit „M¹” erfolgt vorzugsweise über eine M¹-C Bindung, wobei C bevorzugterweise ein zu einem Aromat gehört.
Die Gruppe L⁴, die Atome M¹ und X¹ bilden den zentralen Teil der Staudinger Komponente des Konjugationsmittels.
Die Gruppe L⁴
„L⁴” bildet das Bindeglied zwischen „M¹” und „X¹”. Sie hat die Aufgabe die acylierbare Gruppe „X¹” so zu positionieren, das nach ihrer Acylierung eine intramolekulare Staudinger Reaktion erfolgen kann. Solche Strukturen sind Bestandteil der Patente DE60110127T2 2006.02.02.; WO 2006/038184 A2 ; EP 1399465 B1 . „L⁴” kann aus 1-400 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-400 Heteroatomen bestehen, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatischen gesättigten oder ungesättigten Zyklen aliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten vorkommen können. Für „L⁴” können die Atome F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn, H in allen möglichen Kombinationen und deren Isotope verwendet werden. In bevorzugter Ausführung ist „L⁴” eine Methylengruppe oder eine Ethylengruppe an der teilweie oder erschöpfend beide H-Atome mit den vorher aufgeführten Atomen substituiert sein können. Hieraus ergeben sich Gruppen mit der allgemeinen Formeln -CR¹R²- oder (-CR¹R²-CH₂-) wobei die Reste R¹ jene sind, die für die M¹-Schutzgruppe „PG” beschrieben werden. In spezieller Ausführung ist „L⁴” Bestandteil eines Rings. Bevorzugt hierbei sind Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl Ringe sowie deren heterozyklische Derivate die O und S Atome enthalten und in den allgemeinen Formeln IIa–f dargestellt sind.
In einer anderen Ausführung ist „L⁴” eine substituierte Methylengruppe worin ein Substituent die direkte Verbindung mit dem Träger „Pol” über einen Linker L¹, L¹', oder L¹'' darstellt wie in der allgemeinen Formel IV wiedergegeben. In einer anderen bevorzugten Ausführung ist „L⁴” ein 1,2 bisubstituierter Aromat oder Heteroaromat. Hierbei sind „M¹” und „X¹” in 1, bzw. 2-Stellung, wie in der allgemeinen Formel Va wiedergegeben. Es kann aber darüberhinaus auch eine Verknüpfung des Aromats mit „Pol” über einen Linker L¹, L¹' oder „L¹” vorkommen (allgemeine Formel Vb). Zu den bevorzugten Strukturen zählen auch, aber nicht ausschließlich, 2-Diarylphosphinyl Thiophenole oder 2-Diarylphosphinyl Phenole, die über ihre Ringatome 3, 4, 5 oder 6 durch einen Linker des Typs „L¹, 1¹'” oder „L¹” mit dem Träger ”Pol” verbunden sind, wie in der allgemeinen Formel Vb wiedergegeben. Vorteilhaft ist, das 2-Diarylphosphinyl Thiophenole oder 2-Diarylphosphinyl Phenole durch eine Phospho-Fries Reaktion (Taylor, C. M.; Watson, A. J. Current Organic Chemistry 2004, 8, 623–636; Au-Yeang, T.-L. et al. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 457–460; Li. X. J. Org. Chem. 2003, 68, 5500–11; Jayasundera et al. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 4311; Ngono, C. J. et al. Eur. J. Org. Chem. 2006, 6, 1499–1507) darstellbar sind. Die Atome A in den allgemeinen Formeln IV, Va und Vb können C, N, S, O in allen sinnvollen Kombinationen sein.
Die Gruppe X¹
X¹ stellt eine acylierbare Gruppe dar. X' kann in anderer Ausführung auch eine Abgangsgruppe einer nukleophilen Substitution an einem aliphatischen Rest oder an einem aktivierten aromatischen Rest der Bestandteil von L⁴ ist sein. X¹ kann aus 1-50 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-50 Heteroatomen bestehen, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen aliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten vorkommen können. Für „X¹” können Heteroatome aus folgender Liste in allen möglichen Kombinationen verwendet werden: F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn, H und deren Isotope. Bevorzugt sind Heterozyclen mit 1-10 Kohlenstoffatomen und/oder 0-10 Heteroatomen, Halogene, Schwefel- oder phosphorhaltige Abgangsgruppen. Hierzu zählen, Phosphate, Pyrophosphate, Phosphosphonate, Phosphinate, Sulfate und deren Ester, sowie Sulfonate und Fluorosulfaonat, N-Imidazolysulfonat. Die organischen Reste dieser Abgangsgruppen können aromatisch oder aliphatisch gemäß vorheriger Aufzählung sein. Die Abgangsgruppen können thermisch, photochemisch oder enzymatisch aktiviert werden um die Einfügung der Carboxyl-Komponente zu ermöglichen. In bevorzugter Ausführung sind X¹ SH, OH, sowie Imidazol. (Saxon, E. Org. Lett. 2000, 2, 2141–2143).
M¹: M¹ kann P, As, Sb, Bi, V sein.
Die Schutzgruppe für M¹: „PG”
Um die Lagerungsstabilität des Konjugationsmittels sicher zu stellen wird „M¹” erfindungsgemäß geschützt. Hieraus ergibt sich eine stabile, langlebige Lagerungsform des polymeren Konjugationsmittels. Mögliche Schutzgruppen sind Borane der allgemeinen Formel VII und β-elliminierbare Gruppen der allgemeinen Formeln Vla–e (Itao, H. et al. Synthesis 2005, 3035–38).
Hierbei können die Reste „R¹–R¹⁰” unabhängig von einander aus 0-20 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-20 Heteroatomen bestehen, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatischen Zyklen aliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jedem möglichen Kombination vorkommen können. die Reste „R¹–R¹⁰” können Heteroatome aus folgender Liste enthalten: F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ti, Zr, Hf, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn, H und deren Isotope. Als Schutzgruppe hierfür dient vorzugsweise eine BH₃-Gruppe. Letztere kann frei, d. h. nicht an den Träger „Pol” gebunden sein oder ionische oder kovalente Bindungen mit „Pol” unterhalten. Darüber hinaus ermöglicht ein so geschütztes Konjugationsmittel als unreaktiver Syntheseträger viele chemische Transformationen an der Carboxyl-Komponente.
Letztere kann durch verschiedene Basen wie Diethylamin (Imamoto, T. Pure Appl. Chem. 1993, 65, 655; Jugé, S. et al. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1993, 531; Ramsden, J. A. et al. Tetrahedron Assymmetry 1994, 5, 2033; Langer, F. et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 491; Muci, A. R. et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9075; Brown, J. M. J. Organomet. Chem. 1997, 529, 435.), Morpholin (Imamoto, T. et al. Heteroatom Chem. 1993, 4, 475; Brenchley, G. et al. Tetrahedron 1995, 50, 10581; Longeau, A. et al. Tetrahedron Assymmetry 1997, 8, 987), DABCO (Brisset, et al. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 4523; Brenchley, G. et al. Tetrahedron, 1995, 50, 10581; Morimoto, T. et al. Synlett 1996, 1211; Marinetti, A. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 2947), Dibutylamin, Tetrabutylammonium Cyanid, Olefine, CO oder unter stark sauren Bedingungen (Kleineweischede R. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 5984–5988) abgespalten werden. Vor allem DABCO (Tam, A. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 1055–1063) und Ethanol (Von Overschelde, M. et al. Tetrahedron 2009, 65, 6410–6415) sind im Zusammenhang mit der Aktivierung einer Staudinger-Komponente durch Freisetzug des Phosphins als Abspaltungsreagenz beschrieben worden. Mit jenen Reagenzien sind selektive Abspaltungen der BH₃-Gruppe in Anwesenheit des Thioesters möglich.
Die Schutzgruppe für M¹ L^P
In besondere Ausführung kann „L^P” eine Schutzgruppe für das Atom „M¹” sein, die aber im Gegensatz zu der Ausführung mit „PG” an dem Polymer „Pol” gebunden ist. In jenem Fall unterhält sie ionische oder kovalente Bindungen mit „Pol”. Vor allem bei Trägern, die durch „Molecular Imprinting” erhalten werden kommt die Schutzgruppe zur Anwendung. L^P kann aus 1-400 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-400 Heteroatomen bestehen, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jedem möglichen Kombination vorkommen können.
L^P kann Heteroatome aus folgender Liste enthalten: F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ti, Zr, Hf, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn, H und deren Isotope. In einer Ausführung unterhält „L^P” eine Wasserstoff Brückenbindung mit der Boran Schutzgruppe für das Atom M¹.
Die Carboxyl-Komponente
Die Carboxyl-Komponente ist Vorzugsweise eine Gruppe die mit einem Tracer z. B. einem Radioisotop, einem paramagnetischen Komplex oder Partikel, einem Neutronenabsorber, einem Streuungsagenz für Röntgenstrahlen, einem Farbstoff oder Teil eines pharmazeutischen Wirkstoffes verbunden ist. In einem besonderen Fall ist die Carboxyl-Komponente ein Spacer (Abstandhalter) der die Konjugation mit spezifischen Gruppen eines Tracers oder Teil eines Teiles eines pharmazeutischen Wirkstoffes ermöglicht. Die allgemeine Struktur der Carboxyl-Komponente mit der Staudingerkomponente ist in den Formeln VIII und VIII' dargestellt.
Einige solcher Adapter-Gruppen sind in Bild: 7 zusammengefasst wobei hierin ist „R” ein bifunktioneller Rest „Spacer” der aus 1-400 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-400 Heteroatomen besteht, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen aliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jedem möglichen Kombination vorkommen können. Sie können die Heteroatome aus folgender Liste enthalten: F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ti, Zr, Hf, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn, H und deren Isotope.
„T” ist eine Gruppe innerhalb der Formeln VIII und VIII', die die Konjugation mit dem Tracer oder einem anderen Molekül ermöglicht.
Im einfachsten Fall kann die Carboxyl-Komponente direkt ohne weitere Modifikation eingesetzt werden. In vielen Fällen allerdings sind die entsprechenden Tracer nicht mit Carbonsäuregruppen vorhanden, so das Verbindungsstücke zwischen Konjugationsmittel und Tracer zum Einsatz kommen.
Die Verbindungsstücke:
Im Fall A (Bild 7) verbindet der „Spacer” das Konjugationsmittel mit Michaelakzeptoren vor allem für die Konjugation mit Proteinen über bevorzugt Sulfhydryl- und Amino-Gruppen ermöglichen. Auch Aminoglycoside verschiedener Mono und Oligosaccharide sowie Derivate von FDG lassen sich so immobilisieren. (Wuest, F. et al. Bioconjugate Chemistry 2008, 19, 1202–1210; Šardzik, R. et al. Beilstein J. Org. Chem. 2010, 6, 699–703)
Im Fall B (Bild 7) verbindet der „Spacer” das Konjugationsmittel mit einer Azido-Gruppe. Der „Spacer” ist hierbei so beschaffen, dass eine Zyklisierug ausgeschlossen ist, d. h. dass die Azido-Ggruppe nicht mit dem Element „M¹” Konjugationsmittel reagiert. Die Azido-Gruppe ermöglicht eine Konjugation mit jedem Molekül, das eine Azetylen-Gruppe trägt mittels einer 2 + 3 heterodipolaren Cycloaddion. (Vala, C. et al. Tetrahedron Lett. 2011, 52, 17–20) Auch eine photochemische Konjugation ist möglich, wenn der Träger „Pol” durchlässig für die Aktivierungsfrequenz für das azidhaltige Chromophor ist.
Im Fall C (Bild 7) verbindet der „Spacer” das Konjugationsmittel mit einer Acetylenyl-Gruppe. Die Acetylenyl-Gruppe ermöglicht eine Konjugation mit jedem Molekül, das eine Azido-Gruppen trägt. Die Konjugation nach Fall C kann nur, dann erfolgen, während das Atom „M¹” geschützt ist es sei denn, man will eine Konjugation zweier azidhaltiger Moleküle bewirken.
Im Fall D (Bild 7) verbindet der „Spacer” das Konjugationsmittel mit einer Hydrazin-Gruppe die auch zu einem Carbazid oder Semicarbazid gehören kann. Es kann aber auch ein O-alkyliertes Oxylamin oder ein S-alkyliertes Mercaptylamin hierfür verwendet werden. Eine solche Gruppe wie durch Formeln IX und X beschrieben, ermöglicht die Konjugation mit einem Aldehyd, Keton (Lee, Y.-S. et al. Nucl. Med. Biol. 2006, 33, 677–683; Rennen, H. J. J. M. Nuc. Med. Biol. 2007, 34, 691–695) oder einem anomeren C-Atom eines Kohlenhydrats oder kohlenhydrathaltigen Moleküls z. B. FDG. (Wuest, F. et al. Bioorg Med. Chem. Lett. 2009, 19, 5426–5428; Wuest, F. et al. Bioconjugate Chem., 2008, 19, 1202–1210).
Bei dem hier verwendeten Aldehyd- oder Keton spezifischen Reagenzien nach Formeln IX und X ist „X³” eine bifunktionelle Gruppe, bestehend aus, S, O, NH, oder NR^H. R^H kann aus 1-10 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-10 Heteroatomen bestehen, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatischen Zyklen aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jeder möglichen Kombination vorliegen können. Sie können die Heteroatome aus folgender Liste enthalten: F, Cl, Br, I, S, O, N enthalten. In einer besonderen Anwendung kann der verwendete Hydrazinhaltige „Spacer” ein „Hynic” Derivat sein, das bevorzugt zur Markierung mit ^99mTc in Anwesenheit eines spezifischen Chelators verwendet werden kann. (Zhang, Y. et al. Eur. J. Nucl. Med. 2000, 27, 1700–1707; Hnatowich, D. J. et al. J. Nucl. Med. 1995, 36, 2306–2314; He, J. et al. Nucl. Med. Commun. 2004, 25, 731–736)
„X³” ist hierbei eine bifunktionelle Gruppe, bestehend aus, S, O, NH, oder NR^H wobei R^H wie folgt definiert ist:
R^H: „R^H” besteht aus 1-10 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-10 Heteroatomen, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatischen Zyklen aliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jedem möglichen Kombination vorkommen können. Sie können die Heteroatome aus folgender Liste enthalten: F, Cl, Br, I, S, O, N.
Im Fall E (Bild 7) verbindet der „Spacer” das Konjugationsmittel mit einem Molekül mit hoher Affinität für Sulfhydryl-Gruppen. Es kann auch eine Konjugation mit Metalloberflächen, z. B. Gold-Nanopartikel erfolgen. Manche Chelatoren z. B. Desferrioxamine B (Df) ein Chelator für ⁸⁹Zr können ebenfalls über eine via Thioether an das Konjugationsmittel gebunden werden. (Tinianow, J. N. et al. Nucl. Med. Biol. 2010, 37, 289–297).
Im Fall F (Bild 7) verbindet der „Spacer” das Konjugationsmittel mit einer Abgangsgruppe die durch ein anderes Molekül oder Ion ausgetauscht oder angelagert werden kann. Ein solches Konjugationssystem kann z. B. für die Konjugation von Proteinen mittels Sulfhydrylgruppen mit anderen Molekülen verwendet werden, wobei durch die Art des Polymers „Pol” bestimmte Konjugate bevorzugt werden können. In einem Solchen Fall wäre X⁴ bevorzugterweise ein Halogenid, während Y¹ eine Sulfhydrylgruppe eines Proteins sein kann. Viele Radioisotope lassen sich auf diese Weise in die Carboxyl-Komponente einführen. (Wilbur, D. S. Bioconjugate J. 1992, 3, 433–70) Im Falle der Einführung von ¹⁸F wird eine Gruppe X⁴ durch ¹⁸F Ionen ausgetauscht, wobei die Gruppe X⁴ an Kohlenstoff oder aber an Heteroatomen gebunden sein kann. Im Falle des ¹⁸F Austauschs werden bevorzugt die folgenden Heteroatme Si, Ti, Zr Hf, B, Al, P, B verwendet. In einem Sonderfall ist das Hetroatom das Zentralion eines Komplexions oder eines Chelats, das die Möglichkeit besitzt das ¹⁸F fest an sein Zentralion zu binden ohne, dass der Kompexbildner hierbei dissoziiert wird. Beispiele, solcher Heteroatome. Moleküle sind Derivate des Chelators NOTA und NETA, die Al³⁺, Ionen fest binden können. An solche komplexierten Aluminium-Ionen kann dann ¹⁹F angelagert werden. (McBride, W. J. et al. Bioconjugate Chem. 2010, 21, 1331–1340) Die Synthese jener Chelatoren ist durch die folgenden Literaturstellen beschrieben (Guérin, B. et al. Organ. Lett. 2010, 12, 280–283; De Sa, A. et al. J. Inorg. Biochem. 2010 104, 1051–1062) Beispiele für solche Chelatoren mit unterschiedlichen Verknüpfungspunkten sind durch die allgemeinen Formeln XI-XV wiedergegeben.
R¹⁰, R¹¹: Die bifunktionellen Reste R¹⁰ und R¹¹ „Spacer” aus 1-400 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-400 Heteroatomen besteht, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen aliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jedem möglichen Kombination vorkommen können. Sie können die Heteroatome aus folgender Liste enthalten: F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ti, Zr, Hf, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn, H und deren Isotope.
Diese Chelatoren können erfindungsgemäß zunächst mit der acylierbaren Gruppe des Konjugationsmittels zur Reaktion gebracht werden. Diese Acylierung kann in den meisten Fällen über ein geschütztes Derivat des Chelators erfolgen. Anschließend erfolgt die Beladung des ionischen „Tracers” oder die Beladung eines ionischen Carriers (z. B. Al³⁺ für F^–) gefolgt von der Beladung des Tracers. Spezielle Gruppen die selektiv bestimmte Elemente binden die als Tracer dienen können hier auch zur Anwendung kommen. So z. B. der verwendete hydrazinhaltige „Spacer” ein „Hynic” der bevorzugt ^99mTc in Anwesenheit eines spezifischen Chelators fest bindet. (Zhang, Y. et al. Eur. J. Nucl. Med. 2000, 27, 1700–1707; Hnatowich, D. J. et al. J. Nucl. Med. 1995, 36, 2306–2314; He, J. et al. Nucl. Med. Commun. 2004, 25, 731–736)
Neben Chelatoren können allerdings auch andere fluor-bindende Moleküle eingesetzt werden Neben verschiedenen Agenzien mit C-F Bindungen kann ¹⁸F auch an Heteroatome gebunden werden. Beispiele hierfür sind z. B. bestimmte Silane (Mu, L. et al. Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 2008, 47, 4922–4925), Phosphor oder Bor Verbindungen (Schirrmacher, R. et al. Mini-Reviews in Organic Chemistry, 2007, 4, 317–329) sowie gewisse Titanocene. (allgemeine Formeln XIX, XX)
R¹²–R²³:
Die Reste R¹²–R²¹ unabhängig variierbar von einander H-Atome oder organische Reste aus 1-200 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-200 Heteroatomen bestehen, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatischen Zyklen aliphahtische, gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische Ketten vorkommen können. Benachbarte Reste können außerdem durch Brücken aus Kohlenstoff- und Heteroatomen verbrückt sein.
Als Heteroatome können folgende verwendet werden: F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce.
X⁴¹–X⁴²
X² ist eine Gruppe ist, die durch Fluorid substituiert werden kann. Die Reste X⁴¹ und X⁴² können unabhängig variierbar von einander H-Atome oder organische Reste aus 1-200 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-200 Heteroatomen bestehen, die gesättigt und ungesättigt sein können. Die in aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische Zyklen, hetroaliphatischen Zyklen alipahtische Ketten und heteroaliphatische Ketten vorkommen können. X⁴¹ und X⁴² können außerdem durch Brücken aus Kohlenstoff- und Heteroatomen verbrückt sein wie z. B. bei einer Bikoordination von Benzol-1,2-Dithiol, 2-Hydroxythiophenol, Ethen-1,2-dithiol und seinen Derivaten. Als Heteroatome können folgende verwendet werden: F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce. Die Bindung dieser Gruppen zu dem Titanatom kann durch Kohlenstoffatome, aber auch durch Heteratome, bevorzugterweise O, N, S, Se, Te, erfolgen, die in folgend Gruppen auch eingebunden sein können: Carboxylat, Thiocarboxylat, Dithiocarboxylat, Carbamat, Thiocarbamat, Dithiocarbamat, Alkylsulfid, Arylsulfid, Heteroarylsulfid, Alkylselenid, Arylselenid, Heteroarylselenid, Alkyltelurid, Aryltelurid, Heteroaryltelurid, Alkoxy, Aryloxy, Heteroaryloxy OH, SH, Cl, Br, I. Ferner können folgende Heterocyclen in unsubstituierter oder substituierter Form eingesetzt werden: Imidazol, Triazole, Tetrazol, Thiazol, Benzimidazol, Benzotriazol, Indol, Indazole, Anilin, Pyrazol, Pyrrolidon, Azetan, Azepin, Benzodiazepin, Pipeidin, Purin, Morpholin, Piperazin, Triazin, Oxazol, Hydantoin, Aziridin, Pyrrolidin, Pyrrol, Hexamethyeneimine, Azaindoloder eine Gruppen deren konjugierte organische oder anorganische Säuren einen pKa < 12 haben.
Im Fall G (Bild 7) verbindet der „Spacer” das Konjugationsmittel mit einem Chelator der ein Ion aufnehmen kann das als Tracer dienen kann. Y¹: Ist ein Anion oder Kation, das als Tracer dienen kann. Die Chelatoren für Y¹ können einzeln aber auch monomere Bestandteile eines linearen oder verzweigten Oligomers sein.
Im Falle von DOTA „XXI” ist eine direkte Konjugation unter Bedingungen der unendlichen Verdünnung möglich. In vielen Fällen können man aber auch kommerzielle DOTA Derivate wir Derivate SCN-benzyl-DOTA „XXIII” und DOTA-NHS „XXII” benutzen die dann über einen Amino-Adapter wie im Fall H mit dem Konjugationsmittel verbunden werden können. DOTA bildet sehr stabile Komplexe mit ¹¹¹In³⁺, ⁵⁷Ga³⁺, ⁹⁰Y³⁺, ²¹³Bi) (Geninatti Crich, S. et al. J. Med. Chem. 2006; 49, 4926–36; Liu, Y. et al. Materials 2010, 3, 3204–17). Andere häufig eingesetzte Chelatoren sind DTPA „XXIV”(¹¹⁰In, Gd), MAG³ „XXV”, sowie ein spezieller Chelator für ⁸⁹Zr (Tinianow J. N. et al. Nuclear Medicine and Biology 2010, 37, 289–297) Die DOTA-Chelatoren werden auch zu Immobilisierunng einer Mischung aus natürlichen Gd-Isotopen für MRI verwendet. Vor allem für die MRI Anwendungen werden auch Cluster von Chelatoren eingesetzt. Weitere Beispiele für Chelatoren sind u. a. durch Wadas, T. J. et al. Chem. Rev. 2010, 110, 2858–2902 beschrieben.
Im Fall H (Bild 7) verbindet der „Spacer” das Konjugationsmittel mit einem Bocgeschützten Amin. Letzteres ist unter anderem hilfreich zur Konjugation verschiedener Farbstoffe, die eine Isothiocyanat-Gruppe tragen, aber auch manchen Chelatoren für Radiotracer. Ein Beispiele hierfür sind die DOTA „XXI” und seine DerivateSCN-benzyl-DOTA „XXIII” und DOTA-NHS „XXII”, sowie Desferrioxamine B (Df) „XXVI”, ein Chelator für ⁸⁹Zr (Tinianow, J. N. et al. Nucl. Med. Biol. 2010, 37, 289–297).
Im Fall I (Bild 7) kann die Konjugation über eine Olefinmetathese erfolgen, die die Konjugation mit Molekülen die C=C-Doppelbindungen tragen ermöglicht. Viele Lipide können hiermit konjugiert werden, aber auch Moleküle, die nur unter sehr milden Bedingungen Konjugiert werden können.
Die Azido-Komponente
Essentiell für das erfindungsgemäße Verfahren unter Zuhilfenahme des Konjugationsmittels ist die Azidokomponente. Sie ist aufgrund der Azido-Gruppe befähigt, mit dem Atom M¹ des Konjugationsmittels eine M¹ = N Bindung mit der „Azido-Komponente einzugehen die die Staudinger Kopplung (Bild 2–5) ermöglicht. Neben der Azido-Gruppe sind auch andere M¹ = N Bindung bildende Funktionelle Gruppen, z. B. Haloamine hierfür einsetzbar. Die Azido-Gruppe oder ein isofunktionelles Analogon ist bevorzugt mit eine Substanz oder definierten Komplexen hiervon verbunden, die selektiv an spezifische Zellen, z. B. Tumorzellen, binden können (Bild 1, 2). In speziellen Fällen ist es allerdings auch möglich ein Azido-Gruppe tragendes Tracer-Molekül für Diagnostiganwendungen, ein Therapeutikum oder ein Neutronenabsorber einzusetzen, und zwar dann wenn die Erkennungsaktivität mit der Carboxyl-Komponente eingeführt wurde. Eine solche Struktur kann mit der allgemeinen Formel XXVII wiedergegeben werden
Ein azidtragendes Tracer-Molekül ist das verbreitet beschriebene 1-¹⁸Fluoro ethyl-2-azid. Im letzteren Fall würde eine als Erkennungsaktivität dienende Carboxyl-Komponente mit einer Fluoroethylamino-Gruppe konjugiert werden, also einem Bioisosteren einer Hydroxyethylamino-Gruppe. (Graeta, A. et al. Bioorg Med. Chem Lett. 2010, 20, 4649–4652)
Alle in der Beschreibung geschilderten Konjugationsprozesse, lassen sich natürlich auch auf alle möglichen Träger inklusive Nanopartikel übertragen. In einer besonderen Ausführung kann die Konjugation innerhalb lebenden Gewebes oder Zellen erfolgen, wobei eine Azio-Komponente verwendet wird, die Barrieren der Zellorganellen und Membranen leicht überwinden kann.
Im Falle eines Trägers der durch „Molecular-Imprinting” eines Analogons aus Konjugationsmittel, Carboxyl-Komponente und Azido-Komponente entstanden ist lassen sich aus einer Mischung von Azido-Komonenten gezielt bestimmte für die Konjugation auswählen. Letzteres ist besonders vorteilhaft wenn Proteine mit kommerziellen Reagenzien unselektiv an bestimmten Oberflächenstrukturen z. B. an Cysteinen mit einem „Spacer” der Azido-Gruppen trägt derivatisiert worden sind. Die Selektivität gestaltet eine Konjugation sehr reproduzierbar so, dass konjugierte Azido-Komponenten ihre gewünschten Erkennungsaktivitäten nicht durch die Konjugation einbüßen oder verlieren. Spezielle Anwendungen einer solchen Konjugation sind z. B. Bioassay Verfahren für durch konvergente Evolution entstandene, isofunktionale Bio Moleküle.
Die Synthese von Peptiden oder Proteinen, die Azidogruppen tragen kann auf chemischem Wege (Zaloon, J. et al. J. Org. Chem 1981, 46, 5173–76; Myers, J. K. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 8959–60; Evans, D. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 4011–30), mittels Translation (Kiick, K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 2002, 99, 19–24; Deiters, A. et al. J. Am Chem Soc. 2003, 125, 11782–3; Deiters, A. et al. Bioconjugate J. 2004, 14, 5743–5747), oder durch Konjugation mittels eines azidhaltigen „Spacers” erfolgen. Der „Spacer” kann im Beispiel von Azidofarnesyl-Gruppen enzymatisch auf verschiedene Proteine übertragen werden (Kho, Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 12479–84) oder aber durch chemoselektive Reaktionen an die Proteine gebunden werden. (Means, G. E. et al. Bioconjugate Chem. 1990, 1, 2–12). Die chemische Konjugation mittels „Spacer” die Azigo-Gruppen tragen sind auf viele Molekültypen z. B. Lipide oder Kohlenhydrate ausgedehnt worden. (Sen Gupta, S. et al. Bioconjugate Chem. 2005, 16, 1572–79; Vocadlo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, 9117–9121). Um chemoselektiv werden oft die in Bild 7 dargestellten Gruppen verwendet. Im speziellen Fall der Oligonucleotide oder Aptamere sind einige spezielle Verfahren bekannt (Polushin, N. N. et al. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 3227–30; Seo, T. S. et al. J. Organ. Chem. 2003, 68, 609–12; Pourceau, G. et al. J. Org. Chem. 2009, 74, 1218–22)
In besonderer Ausführung ist die Azido-Komponente „L5” aus einem Oligonucleotid das aus 0-400 natürlichen Nucleotiden oder künstlichen Analoga (z. B. Spiegelmeren) und Isosteren bestehen kann, das als Internucleotidbindungen: Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Phosphorotrithioate, Phosphortetrathioate, Arsenates, Thioarsenate, Dithioasenate, Trithioarsenate, Tetrathioarsenate, Fluorophosphate, Phosphorofluorothioate, Phosphorofluorodithioate, Phosphorofluorotrithioate, H-Phosohonate, Alkylphosohonate, Arylphosphonate, H-Phosphonothioate, Alkylphosphonothioate, Arylphosphonodithioate, H-Phosphonodithioate, Alkylphosphonodithioate, Arylphosphonodithioate, H-Phosphonotrithioate, Alkylphosphonotrithioate, Arylphosphonotrithioate, Phosphoramide, Phosphorodiamides, Phosphorotriamide, Phosphoroamidothioate, Phosphoroamidodithioate, Phosphorodiamidothioate, Phosphorotriamidothioate, Actale, Ketale, Phosphinoxide, Phosphinsulfide, Silylgruppen, Carbonsaeureamide, Triazole, Oxadiazole, Sulfate, Sulfamide, Sulfonamide, Dissulfide, Amineoxide, Nitrone, sowie BH₃-Addukte der Phosphite, Thiophosphite, Dithiophosphite, Trithiophosphite, Phosphoamidite, Phosphodiamidite, Triaminophosphine, Phosphorothioamidite; Alkylboran Addukte der Phosphite, Thiophosphite, Dithiophosphite, Trithiophosphite, Phosphoamidite, Phosphodiamidite, Triaminophosphine, Phosphorothioamidite, oder Dialkylboranaddukte der Phosphite, Thiophosphite, Dithiophosphite, Trithiophosphite, Phosphoamidite, Phosphodiamidite, Triaminophosphine, Phosphorothioamidite ferner Trialkylboranaddukte der Phosphite, Thiophosphite, Dithiophosphite, Trithiophosphite, Phosphoamidite, Phosphodiamidite, Triaminophosphine, Phosphorothioamidite in jeder möglichen Kombination, aufweisen kann.
Die Azido-Komponente kann aber auch ein synthetisches Polymer sein, das aus 0 bis zu 500 Einheiten der Gruppen Ethylen, Propylen Ethylenglycol, Propylenglycol, Acrylester, Acrylamid, Pyruvat, Caprolactam, Styrol, Polyamine verschiedener Kettenlänge, ein durch ROM-dargestelltes Polymer und dessen arylierte und alkylierte Derivate in allen möglichen Mischungen und Kombinationen besteht. Diese Polymer kann durch aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische Zyklen, hetroaliphatischen Zyklen alipahtische Ketten und heteroaliphatische Ketten substituiert sein und die Heteroatome F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn, H und deren Isotope. aufweisen. Beispiele für solch ein synthetisches Polymer sind beschrieben. (Kleiner et al. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 4646–4659, Heemstra et al. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 11347–11349, Ura et al. Science (Washington) 2009, 325, 73–77.)
Die bioaktive Azido-Komponente kann aber auch aus einem Peptid oder Protein aus 0-1000 natürlichen und synthetischen Aminosäuren deren Analoga, Stereoisomeren oder Isosteren bestehen und z. B. D-Aminosäuren, α-o-Aminosäuren Taurinderivate und PNA-Bausteine aufweisen können. Ferner kann die bioaktive Substanz ein Kohlenhydrat aus 0–50 Saccharidbaustainen, seinen Analoga oder Stereoisomeren, sein. Schließlich kann ein bioaktives niedermolekulares Molekül, ein natürlicher oder künstlicher Protein Agonist, Antagonist, Enzyminhibitor, oder Nukleinsäurenbinder, ein Lipid der Gruppe der Steroide, Terpene, Macrolide, Poliketide und/oder deren natürliche und künstliche Derivate sein.
Beispiele
Beispiel 1: Darstellung von 4-(Butylamino-3-methoxyphenoxy)butyryl Harz.
4-Formyl-3-methoxyphenoxy)butyryl Harz (1g, Belegungsdichte 1 mmol/g, Polymermatrix: Copolymer aus Styrol – 1% DVB) nach der Estep et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 5300–5301 unter Verwendung von NaBH₃CN und N-Butylamin reduktiv aminiert, wobei 4-(Butylamino-3-methoxyphenoxy)butyryl Harz entsteht. Das Harz wird mit Dimethylformamid, H₂O, Methanol, Dichloromethan und Ether mehrmals gewaschen und im Exsikkator über P₄O₁₀/KOH unter Vakuum getrocknet.
Beispiel 2: Darstellung von 4-(N-(3-Formyl-benzoyl)-N-butylamido-3-methoxyphenoxy)butyryl Harz
500 mg des Produkts aus Beispiel 1 werden mit 1 mmol 3-Formylbenzoesaurechlorid in n 20 mL trockenem Pyridin/Dichloromethan 1/1 (V/V) umgesetzt. Das Harz wird mit Dimethylformamid, H₂O, Methanol, Dichloromethan und Ether mehrmals gewaschen und im Exsikkator über P₄O₁₀/KOH unter Vakuum getrocknet. Der Umsatz einer kleinen Menge (20 mg) des Produktharzes mit 20% Trifluoroessigsäure in Dichloromethan ergibt nach 30 min. N-Butyl(3-Formyl benzamid) frei ESI-MS: (M + H)⁺206.
Beispiel 3: Darstellung von 4(N-butyl-3-[(diphenylphosphoryl)(hydroxy)methyl]benzamido)-3-methoxyphenoxy)butyryl Harz.
200 mg des Harzes aus Beispiel 2 werden bei Raumtemperatur unter Ausschluss von Sauerstoff und Feuchtigkeit mit 2 mL einer 1M Lösung aus Lithiumdiphenyl Phosphinat in THF umgesetzt. Die rote Lösung entfärbt sich und der Vorgang wird 4 mal wiederholt. Das Harz wird mit Dimethylformamid, H₂O, Methanol, Dichloromethan und Ether mehrmals gewaschen und im Exsikkator über P₄O₁₀/KOH unter Vakuum getrocknet. Der Umsatz einer kleinen Menge (20 mg) des Produktharzes mit 20% Trifluoroessigsäure in Dichloromethan ergibt nach 30 min. (N-butyl-3-[(diphenylphosphoryl)(hydroxy)methyl]benzamid frei. ESI-MS: (M + NH₄)⁺425.
Beispiel 4: Reduktion des Harzes aus Beispiel 3 mit Silicochloroform.
100mg des Harzes von Beispiel 3 werden in einen getrockneten Rundkolben überführt und mit einer 3 × mit trockenem THF gewaschen, wobei die Waschlösung mittels einer Kanüle, die einer Fritte trägt entfernt wird. Anschließend werden unter Argon, Trichlorosilan (5 mmol) und trockenes THF (10 mL) hinzugegeben. Mann laesst die Reaktion unter Rückfluss und Argon für 1 Woche reagieren. Das Harz wird abfiltriert und sukzessive mit THF, Methanol, N-Methylpyrrolidon, Methanol, Dichloromethan, und Ether gewaschen. Beispiel 5: Allgemeine Vorschrift zum Austausch der Gruppen X⁴¹ und X⁴² durch benzoyl
Zu einer Emulsion aus Titanocendichlorid (R¹² – R²¹ = H; M² = Ti; X⁴¹, X⁴² = Cl) (249 mg, 1 mmol) in CHCl₃ (15 ml) und dest. Wasser (15 mL) werden Natriumbenzoat (2 mmol) gegeben. Die Mischung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur heftig gerührt wobei die organische Phase von Dunkelrot auf Gelb verfärbt. Die Reaktionsmischung wird in einen Scheidetrichter überführt und die organische Phase 3 × mit dest. Wasser gewaschen. Die organische Phase wird im Vakuum eingeengt (> 70% nach ¹H-NMR, das Produkt zersetzt sich auf Kieselgel 60)
Beispiel 6: Titanocen difluorid: Austausch der Gruppen X⁴¹ und X⁴² durch Fluorid
Die Reaktion mit Titanocendichlorid (R¹²–R²¹ = H; M² = Ti; X⁴¹, X⁴² = Cl) wird analog der Vorschrift des Beispiels 5 mit 2 mmol NaF durchgeführt. Das Produkt ist gelbrot und zersetzt sich auf Kieselgel 60.
Beispiel 7: 1-{[bis(cyclopentadienyl)[(4-nitrophenyl)sulfanyl]titanio]sulfanyl)-4-nitrobenzene: Austausch der Gruppen X⁴¹ und X⁴² durch 4-Nitrothiophenolat.
Zu einer Lösung aus Titanocendichlorid (R¹²–R²¹ = H; M² = Ti; X⁴¹, X⁴² = Cl)(148 mg, 0.594 mmol) in trockenem Toluol (5 ml) gibt man unter Argon 4-Nitrothiophenol (184.2 mg, 1.189 mmol, 2 Äquiv.). Frisch destilliertes NEt₃ (1.189 mmol, 2 Äquiv.) werden anschließend zugetropft bis die Farbe von Dunkelrot auf Hellrot umschlägt. Nach 18 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wir das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird auf Kieselgel chromatographiert. (RF = 0.32; Hexan/Ethylacetat 7/3 (v/v)).
Beispiel 8: 2-{[bis(cyclopentadienyl)(pyridin-2-ylsulfamyl)titanio]sulfanyl}pyridine: Austausch der Gruppen X⁴¹ und X⁴² durch 2-Mercaptopyridin.
Die Reaktion wird mit Titanocendichlorid (R¹²–R²¹ = H; M² = Ti; X⁴¹, X⁴² = Cl)(248 mg, 1 mmol) wird analog der Vorschrift des Beispiels 7 mit 2 mmol 2-Mercaptopyridin und 2 mmol NEt₃ durchgeführt. Die Reaktionsmischung verfärbt sich von Dunkelrot auf ein Hellrot. Nach 18 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird Das Produkt abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, und der Rückstand, das Produkt, 3 × mit Toluol gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Beispiel 9: 2,2-biscyclopentadienylbenzo[d]1,3-dithia-2-titanacyclopentane.
Zu einer Lösung aus Titanocendichlorid (R¹²–R²¹ = H; M² = Ti; X⁴¹, X⁴² = Cl)(248 mg mg, 1 mmol) in trockenem THF (5 ml) gibt man unter Argon 1,2 Dimercaptobenzol (143 mg, 1 mmol, 1 Äquiv.). Frisch destilliertes NEt₃ (2 mmol, 2 Äquiv.) werden anschließend zugetropft. Die Farbe der Reaktionslösung schlägt von Dunkelrot auf Dunkelgrün um. Nach 12 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wir das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird auf Kieselgel chromatographiert: (RF = 0.21; Hexan/Ethylacetat 7/3 (v/v)).
Beispiel 10: Tert-butyl 3-{5-[(cyclopentadienyl)benzo[d]1,3-dithia-2-titanacyclopentan-2-yl]cyclopentadienyl}-3-methylbutanoate.
Zu einer Lösung aus {[4-(Tert-butoxy)-2-methyl-4-oxobutan-2-yl]cyclopenta-2,4-dien-1-yl}dichlorocyclopenta-2,4-dien-1-yltitan (R¹²–R²⁰ = H; R²¹ = Tert-butyl-3-methylbutanoat; M² = Ti; X⁴¹, X⁴² = Cl)(40 mg, 0.1 mmol) in trockenem THF (1.2 mL) gibt man unter Argon 1,2 Dimercaptobenzol (17 mg, 0.11 mmol, 1.1 Äquiv.). Frisch destilliertes NEt₃ (0.21 mmol, 2.1 Äquiv.) werden anschließend zugetropft. Die Farbe der Reaktionslösung schlägt von Dunkelrot auf Dunkelgrün um. Nach 12 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wir das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird auf Kieselgel chromatographiert: (RF = 0.27; Hexan/Ethylacetat 8/2 (v/v)).
Beispiel 11: Beispiel 6: Titanocen difluorid: Austausch der Gruppen X⁴¹ und X⁴² durch Fluorid
Titanocendichlorid (R¹²–R²¹ = H; M² = Ti; X⁴¹, X⁴² = Cl) (25 mg, 0.1 mmol) wird in MeCN-d3 gelöst und das ¹H-NMR aufgenommen. Nach Zugabe von 29 ng (0.5 mmol) KF und 18-crown-6 (5 Äquiv) wird der Reaktionsverlauf alle 30 Minuten NMR-spektroskopisch verfolgt. Indikativ für die Ermittlung des Unsatzes sind die chemische Verschiebung der Protonen der Cyclopentadienylreste die sich aufgrund der Austauschreaktionen ändert. Nach 6 Stunden ist der Cl-F-Austausch vollständig.
Beispiel 12: tert-butyl 2-(3-{[2-(cyclopentadienyl)benzo[d]1,3-dithia-2-titanacyclopentan-2-yl]cyclopentadien-1-yl}-N,3-dimethylbutanamido)acetate
Die [(1-carboxy-2-methylpropan-2-yl)cyclopentadienyl]dichlorocyclopentadien-1-yltitan (Gansaeuer, et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 11622–11623.) wird in das Säurechlorid überführt:
(313 mg, 1.0 mmol) wird mit SOCl₂ (1.0 mL) innerhalb einer Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Überschüssiges SOCl₂ wird abdestilliert. Der Rückstand wird unter Vacuum getrocknet. Anschließend wird der Rückstand in CHCl₃ (10 mL) aufgenommen und mit zunächst 5 Äquiv. DIPEA, dann mit 1.5 Äquiv. Sarkosin tert.butylester versetzt. Nach 2 Stunden Umsatz wird der Reaktionsmischung 1.1 mmol Benzol-1,2-dithiol zugegeben. Nach 2 Stunden wird die Reaktionsmischung zur Trockne eingeengt, danach in CHCl₃ aufgenommen und mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wird durch Chromatographie auf Kieselgel gereinigt.
Beispiel 13: Darstellung eine borangeschützten Trägers
Ein polymeres Konjugationsmittel wurde mit Tentagel als Träger „Pol” nach Kim, H. et al. Organ. Lett. 2006, 8, 1149–1151 dargestellt und nach der Reduktion mit Silicochloroform mit Boran in THF Lösung versetzt. Das resultierende Harz kann nach Kim et al. acyliert und deacyliert werden kann aber keine Konjugation bewirken. Erst nach Abspaltung des Borans mit DABCO wird das Harz wieder befähigt Konjugtionsreaktionen zu bewirken.
Beispiel 14: Acylierung des Trägers mit einem fluorophielen Reagenz
Trietylammonium 2-(3-{[2-(cyclopentadienyl)benzo[d]1,3-dithia-2-titanacyclopentan-2-yl]cyclopentadien-1-yl}-N,3-dimethylbutanamido)acetat (5 Äquiv.), N,N' Diisopropropylcarbodiimid, (5 Äquiv.), 1-Hydroxybenzotriazole (HOBt, 5 Äquiv.), and 4-(dimethylamino)pyridine (DMAP, 0.2 Äquiv.) werden in CH₂Cl₂ (5 mL) gelöst und zu einer Suspension aus Mercaptomethylphospinyl Tentagels (Kim, H. et al. Organ. Lett. 2006, 8, 1149–1151) in DMF(5 mL) gegeben. Nach 10 Stunden wird das Harz abfiltriert und mit DMF, Dioxan, DCM and Ether gewaschen und anschließend im Vakuumexsikkator getrocknet.
Beispiel 15: Acylierung eines Trägers mit 3-Äthynylbenzoesäure
Die Reaktion wird analog der des Beispiels 14 unter Verwendung von 3-Äthynylbenzoesäure als Carboxyl-Komponente durchgeführt.
Beispiel 16: Acylierung eines Trägers mit 3-Äthynylbenzoesäure
Die Reaktion wird analog der des Beispiels 14 unter Verwendung von 3-Äthynylbenzoesäure als Carboxyl-Komponente durchgeführt.
Beispiel 17: Acylierung eines Trägers mit Pent-4-ensäure
Die Reaktion wird analog der des Beispiels 14 unter Verwendung von Pent-4-ensäure als Carboxyl-Komponente durchgeführt.
Beispiel 18: Acylierung eines Trägers mit einem Reagenz was mit Aldehyden und Zuckern reagiert.
Die Reaktion wird analog der des Beispiels 14 unter Verwendung von 5-{[(tert-Butoxy)carbonyl]({[(tert-Butoxy)carbonyl]amino})amino}-2-methoxybenzoesäure (Nowick, J. S. et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 5413–5424) als Carboxyl-Komponente durchgeführt.
Beispiel 19: Acylierung eines Trägers mit DOTA
Die Acylierung eines Trägers erfolgt zunächst mit FMOC-Glycin (Kim, H. et al. Organ. Lett. 2006, 8, 1149–1151). Danach wird die FMOC-Gruppe abgespalten siehe Kim ibid.). Anschließend wird die freie Aminogruppe mit DOTA-NHS zur Reaktion gebracht. (Protocol: NHS Ester Labeling of Amino-Biomolecules: http://www.lumiprobe.com/protocols/nhs-ester-labeling.pdf heruntergeladen am 28.07.2011)
Beispiel 20: Acylierung eines Trägers mit einem Maleimid Derivat, einem Michaelakzeptor für Thiolgruppen.
Ein mit Glyzin acylierter Traeger mit freier Aminogruppe nach Beispiel 19 wird mit 3-(Maleimido)propionic acid N-hydroxysuccinimide ester acyliert. (Protocol: NHS Ester Labeling of Amino-Biomolecules: http://www.lumiprobe.com/protocols/nhs-ester-labeling.pdf heruntergeladen am 28.07.2011)
Beispiel 21: Acylierung eines Boran-geschützten Trägers mit einem Azidoesigsaeure.
Die Reaktion wird analog der des Beispiels 14 unter Verwendung von Cyclohexylammonium(S)-2-Azido-propionprionat als Carboxyl-Komponente mit einem Boran-geschützten Träger durchgeführt. Beispiel 22 Fluorierung des Trägers aus Beispiel 14
50 mg des Harzes aus Bespiel 14 wird in einem Teflon Gefäß, mit Dichloromethan (1 ml) und H₂O (1 mL), HF 48% (18 μL) für 15 Minuten geschüttelt. Das Polymer wird mit Dioxan, H₂O MeOH, DCM und Ether gewaschen.
Erläuterungen zu Zeichnungen
Bild 1: Selektive bildgebende Verfahren benötigen ein Konstrukt einer Traceraktivität, die mit einer Erkennungsaktivität für das erkrankte oder veränderte Gewebe verbunden ist.
Bild 2 zeigt, dass die Staudinger Kopplung durch das Konjugationsmittel vermittelt wird.
Bild 3 veranschaulicht am Bespiel einer erfindungsgemäßen Tumordiagnose die Kombinationsmöglichkeiten der Erkennungsaktivitäten und der Tracer welche die Darstellung bildgebender Agenzien nach einem Baukastensystem ermöglichen. Diese Konjugation erfolgt an schraffierten Konjugationsmitteln.
Bild 4: Die Ausführung des Konjugationsmittels ermöglicht eine Reihe von chemischen und enzymatischen Prozessen durchzuführen bevor das fertige Konjugat mithilfe der Azido-Komponente von der Festphase abgespalten wird kann.
Bild 5 zeigt die Differenzierung am Beispiel verschiedener Azido-Komponente (A–C) oder verschiedener Derivatisierung derselben Azido-Komponente (A, B). Nur ein Typus einer Azido-Konponente, die ihre Azido-Gruppe an ganz bestimmter Stelle trägt kann an der Konjugation teilnehmen.
Bild 6 zeigt einige Beispiele einiger Harztypen mit Staudinger Komponente: Lineares Polymer mit Staudinger Komponenten (A); Träger mit Verzweigungen durch die „Crosslinker” des Polymers „Pol” B, E; Verzweigungen durch die Staudinger Komponenten (siehe auch allgemeine Formeln I, I', IIa–IIn, IIdn–IIg'''n) C, D, E.
Bild 7 zeigt, einige Adapter des Konjugationsmittels, die die Darstellung der Konjugate mit vielen unterschiedlichen, vor allem auch kommerziellen „Tracern” ermöglichen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Ein Konjugationsmittel bestehend aus einer geschützten Staudinger Komponente der Formel I' die vor der Konjugationsreaktion in die ungeschützte Staudinger Komponente der Formel I überführt werden kann und über mindestens einen Abstandhalters „L¹”, aber bis zu maximal über 3 Abstandhaltern „L¹, L¹', L¹'', L^P” mit einem Träger „Pol” verknüpft sein kann wie in Formeln IIa–IIn beschrieben, worin „M¹” ein Element aus der Reihe P, As, Sb, Bi oder V ist, das selektiv mit Elektrophilen Stickstoffreagenzien reagieren kann und dabei eine Staudinger Kopplung ermöglicht; PG eine abspaltbare Schutzgruppe für M¹ ist, die M¹ vor Oxidation schützt und nur mit M¹ aber darüber hinaus auch mit dem Abstandhalter „L^P” verknüpft sein kann; „L²–L³” monofunktionelle oder bifunktionelle Reste sind, die mit „M¹” alleine, oder darüber hinaus mit den Abstandhaltern „L¹, L¹', L¹'' verknupft sein können, wobei „L²” und „L³” getrennt oder miteinander verbunden und unabhängig voneinander in jeder möglichen Weise variiert sein können, ferner unabhängig von einander aus 1-400 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-400 Heteroatomen bestehen, die in aromatischen Zyklen, heteroaromatischen Zyklen, aliphatischen, gesättigten oder ungesättigten Zyklen, hetroaliphatischen, gesättigten oder ungesättigten Zyklen, aliphatischen, gesättigten oder ungesättigten Ketten und heteroaliphatischen gesättigten oder ungesättigten Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jedem möglichen Kombination vorliegen können und die Atome F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ti, Zr, Hf, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, S oder H sowie deren Isotope enthalten können; „L⁴” ein bifunktioneller oder trifunktioneller Rest sein kann der M¹ mit X¹ verbindet darüber hinaus mit einem der Abstandhalter L¹, L¹', L¹'' verknüpft und aus 1-400 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-400 Heteroatomen bestehen kann, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen aliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten vorkommen können und aus den Atomen F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn oder H sowie deren Isotope in allen möglichen Kombinationen bestehen können; die Abstandhalter zwischen Staudinger Komponente und Träger „Pol”, L¹, L¹' und L¹'' unabhängig von einander aus 0-400 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-400 Heteroatomen bestehen können, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jedem möglichen Kombination vorkommen können, sowie unabhängig voneinander die Atome F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ti, Zr, Hf, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn oder H und deren Isotope aufweisen können; „X¹” eine acylierbare Gruppe, oder, in anderer Ausführung, eine Abgangsgruppe für die nukleophilen Substitution an einem aliphatischen Rest oder an einem aktivierten aromatischen Rest, der Bestandteil von „L⁴” sein kann, ist und aus 1-50 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-50 Heteroatomen bestehen kann, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten vorkommen können, wobei sie die Atome F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn oder H und deren Isotope in allen möglichen Kombinationen verwendet werden können, wobei Heterozyklen aus 1-10 Kohlenstoffatomen und/oder 0-10 Heteroatomen, Halogene, Schwefel- oder phosphorhaltigen Abgangsgruppen, darunter Phosphate, Pyrophosphatate, Phosphosphonate, Phosphinate, Sulfate und deren Ester, sowie Sulfonate, Fluorosulfonate, und N-Imidazolysulfonat, deren organische Reste, falls vorhanden, aromatisch oder aliphatisch sein können und thermisch, photochemisch oder enzymatisch aktiviert werden können um die Einfügung der Carboxyl-Komponente zu ermöglichen; „Pol” nach den Ausführungen der Formeln IIa–n, eine Phase ist, auf die sie Staudinger Komponenten der Formeln I oder I' immobilisiert sind und die die Abtrennung des Konjugationsmittels von den Lösungsmitteln und Reagenzien ermöglicht.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 1 das aus einer Staudinger Komponente besteht, die an ihrer Gruppe X¹ mit einem Rest gemäß den Formeln VIII und VIII' acyliert ist der entweder zu mindestens einem der folgenden Strukturtypen Molekül, Molekülkomplex, Oberfläche eines Nanomaterials, Biomaterials, Organismus, Kompositmaterials, Polymerkörper, oder anderem anorganischen oder organischen Feststoff oder einem Tracer für bildgebende Verfahren gehört oder damit konjugiert werden kann, wobei R ein bifunktioneller Rest, ein „Spacer”, ist, der aus 1-800 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-800 Heteroatomen besteht, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jedem möglichen Kombination vorkommen können und aus den Atomen F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ti, Zr, Hf, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn oder H und deren Isotopen bestehen können; „T” eine Gruppe ist, die zu einem Molekül, Ion, Molekülkomplex, Oberfläche eines Nanomaterials, Biomaterials, Organismus, Kompositmaterials, Polymerkörper, oder anderem anorganischen oder organischen Feststoff oder einem Tracer für bildgebende Verfahren gehört oder damit konjugiert werden kann, wobei ionische, kovalente, koordinative oder metallische Bindung entstehen können wobei im Falle der Tracer Moleküle oder Atome die Isotope aller Elemente Verwendung finden können; „n” eine Zahl von 1–40 ist, die angibt wie viele Tracer mit der Carboxyl-Komponente verbunden sind.
Eine Staudinger Komponente nach Anspruch 2, ohne Träger „Pol”.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 2 dessen Staudinger Komponente „T” mindestens wahlweise einen Michael Akzeptor, ein Dipolarophil, eine Azido-Gruppe, ein Reagenz das mit Aldehyden, Ketonen, Acetale, Ketalen, Halbacetalen, Ketalen und Aminen reagiert, eine Thiolgruppe, ein Elektrophil mit hoher Affinität für Fluor, einen Chelator, eine geschützte oder ungeschützte Aminogruppe, ein Alken oder ein Alkin aufweist.
Eine Staudinger Komponente nach Anspruch 4, ohne Träger „Pol”.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 2, das selektiv die Ionen oder Molekülen die als radioaktive „Tracer” dienen können binden oder mit ihnen reagieren kann.
Eine Staudinger Komponente nach Anspruch 6, ohne Träger „Pol”.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 2 wobei T ein Metallocen der, allgemeinen Formeln XIX oder XX ist, wobei die Reste R¹²–R²³ unabhängig variierbar von einander H-Atome, oder organische Reste aus 1-200 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-200 Heteroatomen bestehen, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatischen Zyklen aliphahtische, gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische Ketten vorkommen können, wobei jeweils benachbarte Reste direkt oder durch Brücken aus Kohlenstoff- und Heteroatomen miteinander verbunden sein können, und die Atome F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe und Ce, sowie deren Isotope aufweisen können; wobei X⁴¹ und X⁴² Gruppen oder Atome sind, die durch Fluorid substituiert werden können, und unabhängig voneinander variierbar aus H-Atomen oder organischen Resten mit 1-200 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-200 Heteroatomen bestehen koennen, die in aromatischen Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatischen, gesättigten und/oder ungesättigten Zyklen, hetroaliphatischen Zyklen, alipahtischen gesättigten und ungesättigten Ketten und heteroaliphatischen gesättigten und und gesättigten Ketten vorkommen können, die aus den Atomen F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, sowie deren Isotopen bestehen können, wobwi die Bindung zum „M²”-Atom und neben Kohlenenstoff über Heteroatome erfolgen kann, wobei bevorzugterweise Carboxylat, Thiocarboxylat, Dithiocarboxylat, Carbamat, Thiocarbamat, Dithiocarbamat, Alkylsulfid, Arylsulfid, Heteroarylsulfid, Alkylselenid, Arylselenid, Heteroarylselenid, Alkyltelurid, Aryltelurid, Heteroaryltelurid, Alkoxy, Aryloxy, Heteroaryloxy OH, SH, Cl, Br, I, so wie die Heterocyclen Imidazol, Triazole, Tetrazol, Thiazol, Benzimidazol, Benzotriazol, Indol, Imdazole, Anilin, Pyrazol, Pyrrolidon, Azetan, Azepin, Benzodiazepin, Pipeidin, Purin, Morpholin, Piperazin, Triazin, Oxazol, Hydantoin, Aziridin, Pyrrolidin, Pyrrol, Hexamethyeneimine, Azaindol oder eine Gruppen deren konjugierte organische oder anorganische Säuren einen pKa < 12 haben in unsubstituierter oder substituierter Form verwendet werden können, und „M²” Ti, Zr oder Hf sein kann.
Eine Staudinger Komponente nach Anspruch 8 ohne Träger „Pol”.
Ein Metallocenylrest allgemeiner Formel XIX oder XX der über eine bifunktionelle Gruppe R mit einem mit einer Gruppe verbunden ist das Konjugationsmittel nach Anspruch 1 an X¹ acylieren kann.
Ein Metallocenylrest folgender, allgemeiner Formel XIX oder XX, der über eine bifunktionelle Gruppe R mit einer Carbonsäure-, Thiocarbonsäure- oder Dithiocarbonsäure-Gruppe in freier Form und deren Salze, einem Carbonsäure chlorid, Carbonsäure fluorid, Carbonsäure bromid, Carbonsäurecyanid, Carbonsäureazid, Carbonsäurehydrazid, Carbonsäureoxyimid, Carbonsäureanhydrid Carbonsäureimidazolid, Carbonsäuretriazolid, Carbonsäuretetrazolid, Carbonsäurebenzotriazolid, Carbonsäurepyrrazolid, Carbonsäurebenzimidazolid, Carbonsäureoxybenzotriazolid, Carbonsäureazaoxybenzotriazolid Carbonsäurealkylester, Carbonsäurearylester, Carbonsäurethioalkylester, Carbonsäurethioarylester sowie deren mit Halogenen, Nitro-, Alkyl-, Aryl und Cyano-Gruppen substituierten Derivate verbunden sein kann.
Ein Metallocenylrest folgender, allgemeiner Formel XIX oder XX der mit einem Rest R verbunden ist der mit einem Konjugationsmittel nach Anspruch 4 verknüpft werden kann um eine Konjugation durchzuführen.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 4, das über einen Rest R mit einem Michael Akzeptor verbunden ist.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 4, das über einen Rest R mit einer Azido-Gruppe verbunden ist.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 4, das über einen Rest R mit einer Thiol-Gruppe verbunden ist.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 4, das über einen Rest R mit einem Chelator für Ionen verbunden ist.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 4, das über einen Rest R mit einer Thiol-Gruppe verbunden ist.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 4 das über einen Rest R mit mindestens einem Si, C, B, Sn, P, Ti, Zr, Hf, Co, Fe ist, das leicht ein Fluoridion anlagern kann.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 4, das über einen Rest R mit einer geschützten oder ungeschützten Aminogruppe verbunden ist.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 4, das über einen Rest R mit einem ungesättigten Aliphat, einem Alkin oder Alken verbunden ist.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 4 worin der Rest „R” der mindestens eine, über ein Heteroatom „X³” verknüpfte, primäre Aminogruppe trägt wie in den allgemeinen Formeln IX und X beschrieben, worin „X³” eine bifunktionelle Gruppe bestehend aus, S, O, NH, oder NR^H ist, wobei R^H aus 1-10 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-10 Heteroatomen bestehen kann, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatischen Zyklen aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jedem möglichen Kombination vorkommen können und aus den Atomen F, Cl, Br, I, S, O, N bestehen können.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 2, das eine 6-Hydrazinopyridin-3-carbonsäure (HYNIC) Gruppe trägt.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 2, das ein Dendrimer beinhaltet.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 1 wobei „Pol” ein grobporiges, ein makroporöses Material, ein Affinitätsmedium, ein monolithisches Material, ein Material das aus „Molekular Imprinting” möglicher Substrate hervorgegangen ist und speziell geartete Poren aufweist, ein NaonoMaterial, ein Nanopartikel oder ein Material ist, das ganz oder teilweise aus einer oder mehreren ferromagnetischen Substanzen besteht.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 1 wobei „L⁴” eine bifunktionelle Methylengruppe oder eine Ethylengruppe ist, deren H-Atome teilweise oder erschöpfend durch die Gruppen R¹ und R² substituiert sein können, die unabhängig von einander aus 0-20 Kohlenstoff-Atomen und/oder 0-20 Heteroatomen bestehen koennen, die als aromatische Zyklen, heteroaromatische Zyklen, aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Zyklen, hetroaliphatischen Zyklen aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Ketten und heteroaliphatische gesättigte oder ungesättigte Ketten, mit und ohne Verzweigungen in jeder möglichen Kombination vorkommen können und die Elemente F, Cl, Br, I, S, O, N, Se, Te, Si, Al, Ti, Zr, Hf, Ge, P, As, Sb. B, Li, Na, K, Cs, Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Ce, Sn, H und deren Isotope beinhalten können, ferner können R¹ und R² verknüpft sein wodurch Reste der allgemeinen Formeln IIIa–f entstehen, wobei Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl- Ringe sowie deren heterozyklische Derivate die O und S Atome enthalten beforzugt sind.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 1 mit den bevorzugten Teilstrukturen IV, Va und Vb,.
wobei A ein Element aus der Reihe C, N, S, O in allen sinnvollen Kombinationen sein kann, wobei X eine Gruppe ist, die durch ein Carboxylat, Thiocarboxylat oder Dithiocarboxylat ausgetauscht werden kann, so dass eine Staudinger Komponente nach Anspruch 1 entsteht.
Ein Produkt aus Staudinger Komponente von Anspruch 1 die mit einer Azido-Komponente oder einem Reagenz, das ein elektrophiles Stickstoffatom aufweist das befähigt ist eine M¹ = N Bindung unterhält.
Eine Staudinger Komponente von Anspruch 27 die mit einer, einer funktionellen Gruppe konjugiert ist, die einen Tracer tragen kann und durch die allgemeinen Formel „XXVII” beschrieben werden kann.
Ein Kit umfassend einen einer Polymer-gebundenen Staudinger Komponente nach Anspruch 1, welcher geschützt durch seine Säulenummantelung gefahrlos transferierbar ist.
Ein Kit umfassend einen einer Polymer-gebundenen Staudinger Komponente nach Anspruch 24, mit einer Vorrichtung zur Absorption der unverbrauchten Azido-Komponente oder oder Carboxyl-Komponente.
Ein Konjugationsmittel nach Anspruch 1 die aus einem Nano-Material besteht.
Ein Assay das auf die Anwendung eines Konjugationsmittels nach Anspruch 31 beruht.