MXPA03001456A

MXPA03001456A - Proteinas sinteticas modificadas con polimero.

Info

Publication number: MXPA03001456A
Application number: MXPA03001456A
Authority: MX
Inventors: Jill G Wilken
Original assignee: Gryphon Therapeutics Inc
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2001-07-12
Publication date: 2004-12-13
Also published as: EP1315513A2; EP1315513B1; WO2002019963A2; JP2007302668A; EP1315511A4; NO20031047D0; JP2007269799A; IL153924A0; KR20030057529A; IL154118A0; SK2772003A3; YU17603A; CN1457257A; AU7338801A; CZ2003678A3; BG107590A; JP2004508338A; PL365671A1; CA2412279A1; MXPA03001451A

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos y composiciones para modificar peptidos, polipeptidos y proteinas con polimeros, especialmente polimeros glicomimeticos, para mejorar su actividad biologica o propiedades farmacocineticas. La invencion, proporciona ademas metodos y usos para estos peptidos, polipeptidos y proteinas modificados con polimero. La invencion es particularmente adecuada para el uso en la sintesis de proteinas bioactivas, sinteticas, modificadas con polimero y composiciones farmaceuticas que contienen estas proteinas.

Description

PROTEÍNAS SINTÉTICAS MODIFICADAS CON POLÍMERO Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones y métodos para modificar péptidos, polipéptidos y proteínas sintéticas biológicamente activos con polímeros, especialmente polímeros glicomiméticos .para mejorar su actividad biológica o propiedades f rmacocinéticas . La invención proporciona adicionalmente métodos y usos para estos péptidos, proteínas y polipéptidos modificados con polímero .

Referencia Cruzada a las Solicitudes Relacionadas Esta solicitud es una continuación en parte de las Solicitudes de patente de los Estados Unidos No. de Serie 60/231,330 (presentada el 8 de Septiembre de 2000) y 60/236,367 (presentada el 29 de Septiembre de 2000), ambas solicitudes se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.

Antecedentes de la Invención Durante los últimos 30 años, la atención médica ha recurrido cada vez más a la posibilidad de usar proteínas como fármacos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades (ver, por ejemplo "Therapeutic Proteins 1999," EF: 144211 Datamonitor pie, Londres, 1999) . La mayoría de los productos terapéuticos de proteína se basan en formas humanas o de animal de la proteína que se presentan de manera natural, (tal como insulina, hormona del crecimiento, eritropoyetina, interleucina-2 , etc.) y se producen en células bacterianas o eucarióticas , manejadas con ADN recombinante .

Desdichadamente, las proteínas recombinantes elaboradas en células de insecto, tal como E. coli, carecen frecuentemente de modificaciones post-traduccionales que se encuentran normalmente en la forma naturalmente producida de la proteína. Esta carencia de modificación puede tener un impacto negativo significante en las propiedades farmacéuticas de la proteína cuando se introduce a un paciente . · La glicosilación es un ejemplo de una modificación común post-trasduccional en eucarióticas que comprende la unión enzimática de las cadenas complejas de azúcar a la proteína. Debido a que las proteínas recombinantes elaboradas en sistemas de expresión bacterianos carecen de la capacidad para glicosilar proteínas, los sistemas de expresión eucarióticos tal como células de planta, levadura, insecto o mamífero se han usado en su lugar cuando se requiere una forma glicosilada o "glicoproteínas" . Un problema significativo en la elaboración de glicoproteínas recombinantes es que el producto resultante consiste típicamente de una mezcla compleja de "glicoformas " , diferentes, que pueden tener propiedades fisiológicas o farmacológicas ampliamente variables. Sin embargo, las técnicas de ADN recombinante han llegado a ser el método principal de producción comercial de muchos polipéptidos y proteínas debido a las grandes cantidades que se pueden producir en bacterias y otras células hospedadoras . La producción de proteínas recombinantes comprende transfectar o transformar células hospedadoras con ADN que codifica para la proteína exógena, deseada y cultivar las células bajo condiciones que favorezcan la expresión de la proteína recombinante. E. coli y levaduras se favorecen como hospedadores debido a que se pueden elaborar para producir proteínas recombinantes a altos títulos (ver, patente de los Estados Unidos No. 5, 756, 672) . Se han emitido numerosas patentes de los Estados Unidos con respecto a la expresión bacteriana general de proteínas codificadas con ADN recombinante (ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos Nos. 4,565,785; 4,673,641; 4,738,921; 4,795,706; 4,710,473)·.

Desdichadamente, el uso de técnicas de ADN recombinante no ha sido universalmente exitoso. Con algunas condiciones, ciertas proteínas heterólogas expresadas en grandes cantidades de hospedadores bacterianos se precipitan dentro de las células en agregados densos, reconocidos como puntos brillosos visibles dentro del encierro de las células bajo un microscopio de contraste de fase . Estos agregados de proteínas precipitadas se refieren como "cuerpos refractivos" y pueden constituir una porción significativa de la proteina celular total (Brems et al., Biochemistry (1985) 24 : 7662) . La recuperación de la proteína de estos cuerpos ha presentado numerosos problemas, tal como separar la proteína encerrada dentro de la célula del material celular y proteínas que las hospedan, y como recuperar la proteína del cuerpo de inclusión en forma biológicamente activa. Para revisión general, de los artículos de cuerpos refractivos, ver Marston, supra; Mitraki y King, Bio/Technology, 7:690 (1989); Marston y Hartley, Methods in Enzymol . , 182: 264-276 (1990) ; Wetzel, "Protein Aggegation In Vivo: Bacterial Inclusión Bodies and Mammalian Amyloid, " en Stability of Protein Pharmaceuticals : In Vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization, Ahern and Manning (eds.) (Plenum Press, 1991); y Wetzel, "Enhanced Folding and Stabilization of Proteins by Suppression of Aggregation In itro and In Vivo, " en Protein Engineering--A Practical Approach, Rees, A. R. et al. (eds.) (IRL Press at Oxford Unive sity Press, Oxford, 1991) . Las proteínas también se han producido como reactivos de investigación por síntesis química total (Ver, por ejemplo, ilkin et al., Curr. Opinión Biotech. (1999) 9:412-426). Este proceso comprende la síntesis química de proteínas por el acoplamiento gradual de los aminoácidos individuales, o estrategias convergentes que emplean la síntesis separada de segmentos de péptidos o polipéptidos seguido por el enlace de los segmentos, incluyendo ligación química de estos segmentos, para generar productos de longitud completa (Ver, por ejemplo Dawson et al., Ann. Rev. Biochem (2000) 69:923-960). En algunos casos, se ha utilizado síntesis química para elaborar glicoproteínas pequeñas modificadas con azúcares simples de bajo peso molecular (Shin et al., J. Am. Chem. Soc . (1999) 121:11684-11689) . En otros casos, se han elaborado proteínas de forma química para contener marcas detectables y similares (Bolin et al., FEBS Letters (1999) 451:125-131). Desdichadamente, estas proteínas marcadas ofrecen poca o ninguna ventaja terapéutica sobre sus contrapartes recombinantemente producidas. Sin embargo, unas pocas proteínas que muestran potencial terapéutico se han elaborado por síntesis química con un enfoque en la mejora de la potencia mediante el uso de cambios tipo molécula pequeña a las regiones de farmacóforo de la proteína objetivo (patente de los Estados Unidos No. 6,168,784). En tanto que la potencia es un aspecto importante en la elaboración de un producto terapéutico, otros factores permanecen como problemas con los productos terapéuticos de proteína. Los esfuerzos para desarrollar fármacos de proteína terapéuticamente útiles han padecido bastante por la bioactividad, biodisponibilidad y biocinética indeseables (tal como tiempo de depuración, etc.) de los candidatos putativos de fármaco en la administración in vivo. Los factores principales que han limitado severamente el uso de las proteínas y de péptidos en particular, como agentes terapéuticos ha sido el hecho que estos compuestos frecuentemente producen una respuesta inmunogénica en el sistema circulatorio (ver, patente de los Estados Unidos No. 4,179,337 (Davis et al.))- Este efecto tiene una o ambas de dos consecuencias secundarias . La primera que es la destrucción de los polipéptidos por los anticuerpos producidos y la segunda de forma más seria es la emergencia de una respuesta alérgica. Por ejemplo, la destrucción de insulina mediada por anticuerpos se cree que es responsable de un tiempo de residencia más bien bajo de la insulina en el sistema circulatorio humano. En el caso de enzimas, no sólo existe un problema de destrucción del polipéptido y la negación subsiguiente de su actividad fisiológica sino también la producción más indeseada de una reacción alérgica. Contrariamente, ciertas proteínas, tal como factores de coagulación, factores de crecimiento y citocinas, etc., pueden exhibir una vida media biológica que se prolonga de manera desventajosa en su administración in vivo . Otro planteamiento para mejorar las proteínas para el uso como productos terapéuticos ha comprendido la derivatización de la proteína con polímeros solubles en agua. Esta conjugación se ha propuesto como un medio para mejorar la vida en circulación, solubilidad en agua o antigenicidad de las proteínas administradas, in vivo (ver, patente de los Estados Unidos No. 4,179,337 (Davis et al.)). Se han usado muchos polímeros diferentes solubles en agua y químicas de unión hacia este objetivo, tal como polietilenglicol , copolímeros de etilenglicol/propilen-glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico , polivinil -pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1 , 3 , 6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maléico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) y similares. El polietilenglicol ("PEG") es una porción química que se ha usado en los esfuerzos para obtener proteínas terapéuticamente útiles (Zalipsky, S.

(Bioconjugate Chemistry (1995) 6:150-165; ehvar, . (J. Pharm. Pharmaceut . Sci. (2000) 3(1): 125-136)). Su estructura (CH2C¾0)n es flexible, anfifílica, no susceptible a proteasas y no inmunogénica . La unión de PEG también se ha mostrado que protege las proteínas contra la proteólisis (Blomhoff, H.K. et al., Biochim Biophys Acta /1983) 757:202-208) . También puede mejorar otras propiedades fisicoquímicas de las proteínas . Por ejemplo, la pegademasa bovina (Adagen®) , una formulación de adenosina-desaminasa con un polímero unido de PEG, se ha desarrollado para tratar enfermedad de inmunodeficiencia combinada severa (SCID) ; la superóxido-dismu asa con una porción unida de PEG ha estado en ensayos clínicos para tratar lesión de la cabeza; interferón-alfa con una porción unida de PEG se ha probado para tratar la hepatitis. La IL-6 pegilada se ha descrito (ver, EP 0 442 724, y patente de los Estados Unidos No. 5,264,209). La EP 0 154 316 informa la reacción de una linfocina con un aldehido de polietilenglicol . La publicación de patente europea EP 0 401 384, describe materiales y métodos para preparar el factor de estimulación de colonias de granulocitos ("G-CSF") al cual se unen moléculas de polietilenglicol. El G-CSF modificado y análogos del mismo también se informan en la EP 0 473 268, que declara el uso de varios G-CSF y derivados covalentemente conjugados a un polímero de partículas solubles ' en agua, tal como polietilenglicol. La patente de los Estados Unidos No. 5,880,255 resume muchas de las proteínas que se han modificado con cadenas de PEG. Se han usado una variedad de medios para unir las porciones de polímero tal como PEG y polímeros relacionados a grupos reactivos encontrados en la proteína (ver, patente de los Estados Unidos No. 4,179,337 (Davis et al.), y patente de los Estados Unidos No. 4,002,531 ( oyer) . Para una revisión, ver Abuchowski et al., en "Enzymes as Drugs " , (J. S. Holcerberg y J. Roberts, eds . pp. 367-383 (1981) y Zalipsky, S (Bioconjugate Chemistry (1995) 6:150-165. El uso de PEG y otros polímeros para modificar proteínas también se analiza por Cheng, T.-L. et al., Bioconjugate Chem. (1999) 10:520-528; Belcheva, N. et al., Bioconjugate Chem. (1999). 10:932-937; Bettinger, T. et al., Bioconjugate Chem. 1998) 9:842-846; Huang . S . -Y et al., Bioconjugate Chem. (1998) 9:612-617; Xu, B. et al. Langmuir (1997) 13:2447-2456; Schwarz, J. B. et al., J. Amer. Chem. Soc . (1999) 121:2662-2673; Reuter, J. D. et al., Bioconjugate Chem. (1999) 10:271-278; Chan, T.-H. et al., J. Org. Chem. (1997) 62:3500-3504. Los sitios típicos de unión en las proteínas incluyen grupos amino primarios, tal como aquellos en los residuos de lisina o en el N-término, grupos tiol, tal como aquellos en las cadenas laterales de cisteína, y grupos carboxilo, tal como aquellos en residuos de glutamato o aspartato o en el C-término. Algunos de los sitios - más comunes de unión son a los residuos de azúcar de glicoproteínas , cisteínas o al N-término y lisinas de las proteínas objetivo.

Aunque se han descrito muchos planteamientos diferentes para la conjugación de polímeros a proteínas, el proceso de conjugación no está libre de complicaciones. Se debe tomar cuidado de limitar la pérdida de actividad biológica provocada por la reacción de conjugación. Por ejemplo, las proteínas plegadas o re-plegadas se usan típicamente para reducir al mínimo el número de sitios de unión. Sin embargo, si se une demasiado polímero activado a la proteína objetivo o polipéptido, se puede reducir o perder de manera severa la actividad biológica. Igualmente, si se usa un ligador erróneo que une el polímero a la proteína o se une una cantidad insuficiente de polímero al objetivo, el valor terapéutico del conjugado resultante se puede limitar y no puede demostrar suficiente de un incremento en la vida en circulación para compensar la pérdida de su bioactividad . Los problemas pueden resultar debido a un bloqueo del sitio activo de la proteína por el polímero de modificación. Este problema puede ser difícil de evitar puesto que el polímero y la proteína se unen típicamente en reacciones basadas en solución. El pre-bloqueo de los sitios activos o' materiales tal como piridoxal-fosfatos se ha sugerido, pero los resultados han sido inconsistentes (ver, patente de los Estados Unidos No. 4,179,337) (Davis et al)). Estos problemas son particularmente agudos con proteínas y péptidos de bajo peso molecular, que frecuentemente tienen pocos sitios de unión no asociados con la bioactividad. Por ejemplo, una técnica común ha sido la unión de polímeros solubles en agua a las aminas primarias en la proteína objetivo (por ejemplo, el grupo amino N- erminal y los grupos amino épsilon de lisinas) . Los conjugados poliméricos reactivos con tiol también se han usado para unir polímeros a las cadenas laterales de tiol de cistelnas. Ambos planeamientos representan problemas significativos puesto que la mayoría de las proteínas contienen múltiples copias de estos grupos reactivos extendidos sobre varias regiones de la estructura del polipéptido que juegan un papel importante en la definición de la actividad, plegado, replegado y estabilidad de una proteína. De esta manera aunque ampliamente usados, estos planteamientos sufren de más o menos reducción incompleta o indeseada en la bioactividad de una proteína y usualmente las mezclas complejas son difíciles de separar y caracterizar (Delgada et al., Pharmaceutical Sciences (1997) 3:59-66). En un intento para reducir la unión aleatoria, se han elaborado proteínas en las cuales se remueven las lisinas naturales en unión con la adición de glicinas en los sitios deseados de la unión de polímero (patente de los Estados Unidos No. 4,904,584). Por ejemplo G-CSF e IL-2 se han modificado de esta manera. Otros intentos para evitar la unión aleatoria ha sido elaborar proteínas en las cuales se remueven las cisteínas naturales en unión con la adición de cisteínas en los sitios deseados de la unión de polímero, o cisteínas se adicionan sin remover las cisteínas naturales, si están presentes (EP 0 668 353) . Por ejemplo, se han elaborado de esta manera G-CSF, IL-3 y EPO. En tanto que estas variantes de cisteína o lisina permiten teóricamente la unión específica al sitio de polímero, aun no hay garantía que todos los sitios seleccionados se puedan modificar de una manera controlada. Dada la incapacidad de modificar específicamente en el sitio las proteínas que contienen múltiples aminoácidos con cadenas laterales que tienen los mismos o similares grupos funcionales reactivos, los esfuerzos recientes se han enfocado en la modificación del término amino o carboxi de las proteínas. La modificación de término amino o carboxi ha dependido de la capacidad de algunas técnicas de conjugación química para modificar excepcionalmente estos sitios (WO 90/02136 y O 90/02135) . Por ejemplo, esta técnica se utilizó para la unión de cadenas de PEG al residuo N-terminal de G-CSF y la quimiocina IL-8 (Gaertner et al., Bioconjug. Chem. (1996) 7(l):38-44; y WO 9S/41813) . Sin embargo, la modificación del N- o C-término reduce típicamente la actividad de la proteína (ver por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 5,985,265 que analiza la unión de PEG al N-término y cadenas laterales de lisina de G-CSF) . A pesar de las desventajas con la modificación de proteínas con polímeros solubles en agua, la PEGilación y la unión de otros polímeros solubles en agua a proteínas continua siendo demandada. Por ejemplo, la unión de PEG a histidina en IF-alfa se ha descrito en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,951,974 y 6,042,822. La unión de PEG a lisinas en el interferón-alfa se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,595,732. También se ha descrito la unión de PEG a cadenas de azúcar de eritropoyetina (EPO) y aminoácidos internos tal como lisinas (EP 0 605 963 y WO 00/32772) , y el N-término (patente de los Estados Unidos No. 6,077,939 y WO 00/32772). Otro problema es que todos los polímeros analizados anteriormente son altamente no homogéneos, y que vuelven difícil la caracterización analítica y la purificación de las mezclas de las proteínas modificadas con polímero (Delgada et al., Pharmaceutical Sciences (1997) 3:59-66). Por ejemplo, las técnicas usadas para preparar PEG o cadenas basadas en PEG, aun aquellas de una masa molecular relativamente pequeña tal como 3400,' comprenden un paso de polimerización pobremente controlado que conduce a preparaciones que tienen una extensión de longitudes de cadena aproximadamente un valor medio; es decir, que comprenden preparaciones de polímero de (CH2CH20)n donde n no tiene un valor discreto sino más bien tiene un intervalo de valores aproximadamente una media. La heterogeneidad resultante de las proteínas derivatizadas frecuentemente se asocia con un intervalo de proteínas que nos se puede identificar fácilmente, mucho menos separar. El uso de los aductos de polipéptido se debe considerar los cuales ofrecen una solución posible en principio, el uso de polipéptidos es desventajoso puesto que están susceptibles a la escisión proteolítica y pueden volver inmunogénica a la proteína derivatizada . Sin embargo, desdichadamente, el problema de identificar y emplear un polímero adecuado se exacerba por el hecho que todas las proteínas actualmente empleadas para uso terapéutico se derivan de tecnologías de ADN recombinante . El uso de tecnologías de ADN recombinante pone severas limitaciones en los tipos y especificidad de los enlaces que se pueden formar entre una porción que mejora el desempeño y la proteína recombinantemente producida. Esto es debido primero a que sólo existe un número muy limitado de grupos funcionales adecuados para el enlace y segundo que habrá en general varias copias del grupo funcional reactivo en la proteína que se modifica, previniendo de esta manera cualquier especificidad de la modificación. Por ejemplo, se ha mostrado que en el caso de conjugación no selectiva de superóxido-dismutasa con PEG, se inactivaron completamente varias fracciones de la enzima modificada (P. McGoff et al., Chem. Pharm. Bull . (1988) 36:3079-3091). También, si se unen aleatoriamente diferentes números de porciones, la farmacocinética de la proteína terapéutica no se puede predecir de manera precisa, haciendo la dosificación un gran problema. La cantidad de control de unión adicionalmente puede conducir a (a) potencia reducida, (b) , una necesidad de elaborar esquemas de purificación para separar una gran mezcla de derivados y (c) unión posiblemente inestable de la porción de modificación. Varios enlaces, tal como enlaces basados en cloruro de tresilo, conocidos en la técnica también se conoce que son inmunogénicos . De esta manera, para mejorar la vida media en circulación, reducir la proteólisis e inmunogenicidad y ,mejorar otras propiedades de las proteínas biológicamente producidas, se pueden unir polímeros solubles en agua tal como PEG, pero con resultados mezclados dada la dificultad de la unión de los mismos de una manera controlada y con precisión definida por el usuario. También, debido al éxito limitado en la unión de polímeros en sitios precisos definidos por el usuario, se conoce muy poco acerca de los sitios preferidos de unión que podrían ser aplicables a proteínas en general. Además, debido a la naturaleza estocástica de la unión, y la naturaleza heterodispersa de PEG ? otros polímeros solubles en agua actualmente empleados para estos propósitos, ha sido difícil la purificación y caracterización analítica de los conjugados de PEG-proteína . De esta manera, el problema combinado de control pobre sobre unión reproducible y heterogeneidad del polímero ha entorpecido severamente la aprobación rutinaria de las proteínas modificadas con polímero como productos terapéuticos (sólo unos pocos aprobados a la fecha para uso terapéutico a pesar de su introducción antes de 1970) . Por consiguiente, existe la necesidad de métodos para formar proteínas bioactivas los cuales sean distintos de las tecnologías de ADN recombinante, y que se puedan usar para formar proteínas capaces de la modificación de polímero. También existe la necesidad de un polímero preferido que se puede emplear para formar proteínas derivatizadas que tengan aductos poliméricos de estructura definida en lugar de una mezcla de cadenas de diferentes longitudes. Los polímeros que se pueden emplear para formar proteínas derivatizadas que tienen aductos de polímero con estructuras que se pueden adaptar para imitar las propiedades deseables de las proteínas naturales también se necesita. Además, existe una necesidad de derivatizar proteínas que tengan aplicabilidad general a muchas proteínas . La presente invención satisface estas y otras necesidades .

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a proteínas bioactivas, sintéticas, modificadas con polímero, composiciones farmacéuticas que las contienen y métodos para su producción y uso. Las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención se producen en totalidad o en parte por síntesis química, y de esta manera difieren marcadamente de las proteínas biológicamente producidas. En detalle, la invención proporciona proteínas bioactivas, sintéticas, modificadas con polímero que tienen un peso molecular de monómero mayor de aproximadamente 25 kilodalton ("kDa)". La invención proporciona adicionalmente proteínas bioactivas, biosintéticas modificadas- con polímero que tienen uno o más residuos de aminoácido, irregulares. La invención proporciona de manera particular proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero que poseen una bioactividad que imita una bioactividad asociada con una proteína ribosómicamente especificada tal como una proteína de mamífero, natural (por ejemplo, proteína ' humana, de simio, bovina, murina, porcina, ovina o equina, avícola o pisciforme) . La invención proporciona de manera más particular estas proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero que tienen una bioactividad que imita una bioactividad asociada con una proteina ribosómicamente especificada seleccionada del grupo que consiste de un receptor de proteína o fragmento del mismo, un ligando de receptor de proteína o fragmento del mismo y una citocina. En una modalidad preferida, la invención se refiere a una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero, molecularmente homogénea de la fórmula: Proteina-U.n-si-B-s2 -Polímero-s3 -J* donde Proteína comprende una cadena de polipéptido de una proteína ribosómicamente especificada, donde la cadena de polipéptido comprende uno o más segmentos peptídicos de no traslape unidos covalentemente por uno o más sitios de ligación químico, U es un residuo de un grupo funcional único unido covalentemente a un grupo funcional único mutuamente reactivo de una cadena lateral n de uno o más aminoácidos de uno o más segmentos peptídicos de no traslape, donde n es un número entero discreto de 1 a 6, B es un núcleo de ramificación que tiene tres o más brazos que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar presentes o ausentes; Polímero es un polímero soluble en agua, sustancialmente no antigénico que puede ser el mismo o diferente donde B esta presente, J* es un residuo de un grupo colgante que tiene una carga neta bajo condiciones fisiológicas seleccionada del grupo que consiste de negativa, positiva y neutral, donde si, s2 y s3 son porciones espadadoras o ligadoras que pueden ser las mismas o diferentes, y pueden estar individualmente presentes o ausentes. Una proteína bioactiva, sintética, modificada con polímero, molecularmente homogénea, preferida, de la invención es una que está monodispersa que tiene un peso molecular de monómero de más de 25 kDa. En otra modalidad, la invención se refiere a una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero que tiene una cadena de polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una glicoproteína ribosómicamente especificada, donde la cadena de polipéptido tiene uno o más polímeros solubles en agua unidos a la misma. En una modalidad más preferida, uno o más de los polímeros solubles en- agua están unidos covalentemente en uno o más sitios de la cadena de polipéptido que corresponde a un sitio de glicosilación de la glicoproteína ribosómicamente especificada. Los polímeros solubles en agua, preferidos son óxido de polialquileno, poliamida-óxido de alquileno y derivados de los mismos que son polímeros solubles en agua, glicomiméticos . Los más preferidos son proteínas sintéticas modificadas con polímero que comprenden una cadena de polipéptido de una glicoproteína de citosina. La invención se refiere adicionalmente a composiciones farmacéuticas que comprenden estas proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención. La invención proporciona adicionalmente un método para tratar una enfermedad o condición humana que comprende administrar a un individuo en necesidad de este tratamiento una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una o más de las composiciones farmacéuticas de la invención . La invención también se refiere a métodos para producir proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención. Un método preferido para producir las proteínas bioactivas, sintéticas de la invención comprende ligar químicamente los segmentos peptídicos que comprenden secuencias de aminoácidos de no traslape de una cadena de polipéptido de la proteína sintética modificada con polímero, donde uno o más de los segmentos peptídicos usados para la ligación tienen un polímero soluble en agua unido al mismo en un sitio definido por el usuario o preseleccionado . La cadena de polipéptido modificada con polímero entonces se puede plegar para producir una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero de la invención . Otro método preferido para producir las proteínas bioactivas, sintéticas de la invención comprende ligar químicamente segmentos peptídicos que comprenden secuencias de aminoácidos de no traslape de una cadena de polipéptido de una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero de la invención, y unir uno o más polímeros solubles en agua a una cadena lateral de un aminoácidos en uno o más sitios de ligación del mismo. La cadena de polipéptido modificada con polímero entonces se puede plegar para producir una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero de la invención. La invención también se refiere a un método para producir una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero que comprende (1) ligar químicamente los segmentos peptídicos que comprenden secuencias de aminoácidos de no traslape de una cadena de polipéptido de una proteína bioactiva, sintética para formar una cadena de polipéptido de longitud completa que corresponde a la proteína bioactiva, sintética, donde al menos un segmento peptídico comprende un aminoácido irregular que tiene un primer grupo funcional quimioselectivo, (2) plegar la cadena de polipéptido, y (3) unir un polímero soluble en agua a el mismo que comprende un segundo grupo quimioselectivo que es reactivo excepcionalmente y de forma mutua con el primer grupo quimioselectivo. Otra modalidad de la invención se refiere a polímeros solubles en agua, glicomiméticos , moleculármente homogéneos de la fórmula U-sl-B-s2-Polímero-s3-J*7 donde U es un residuo de un grupo funcional único, B es un núcleo de ramificación que tiene tres o más brazos que pueden ser los mismos o diferentes y puede estar presente o ausente, Polímero es una poliamida que tiene un peso molecular mayor de aproximadamente 5,000 Daltones de la fórmula - [C (O) -X-C (O) -NH-Y-NH] n- o - [NH-Y-NH-C (O) -X-C (O) ] n- , donde X e Y son radicales divalentes que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar ramificados o lineales, y n es un número entero discreto de 2 a 50, donde cualquiera de ambos de X o Y comprenden una unidad de repetición soluble en agua, sustancialmente no antigénica que puede ser lineal o ramificada, J* es un residuo de un grupo colgante sustancialmente no antigénico que tiene una carga neta bajo condiciones fisiológicas seleccionada del grupo que consiste de negativa, positiva o neutral, donde si, s2 y s3 son porciones espadadoras o ligadoras que pueden ser las mismas o diferentes o pueden estar individualmente presentes o ausentes . La invención se refiere adicionalmente a un polímero soluble en agua molecularmente homogéneo de la fórmula: U-sl-B-s2-Polímero-s3-J* donde U 'es un residuo de un grupo funcional único, B es un núcleo de ramificación que tiene tres o más brazos que pueden ser los mismos o diferentes y puede estar presente o ausente, Polímero es una poliamida que tiene un peso molecular de más de aproximadamente 5,000 Da de la fórmula - [C (O) -X-C (O) -NH-Y-NH] n- o - [ H-Y-NH-C (O] -X-C (O) ] n- , donde X e Y son radicales divalentes que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar ramificados o lineales, y n es un número entero discreto de 2 a 50, donde ambos o cualquiera de X o Y comprenden una unidad de repetición soluble en agua, sustancialmente no antigénica que puede ser lineal o ramificada, J* es un residuo de un grupo colgante sustancialmente no antigénico que tiene una carga neta bajo condiciones fisiológicas seleccionada del grupo que consiste de negativa, positiva o neutral, donde si, s2 y s3 son porciones espaciadoras o ligadoras que pueden ser las mismas o diferentes y pueden estar individualmente presentes o ausentes, si están presentes comprende de manera preferente de- 1 a 18 carbonos. La invención se refiere de manera particular a polímeros solubles en agua, moleculármente homogéneos en donde U es un residuo de un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de acrilato, aldehido, cetona, aminooxi, amina, ácido carboxilico, éster, tioéster, tiol, cianoacetato, dipalmitoil-fosfatidiletanolamina, diestearoil-fosfatidiletanolamina, epóxido, hidrazida, azida, isocianato, maleimida, metacrilato, carbonato de nitrofenilo, disulfuro de ortopiridilo, silano, sulfhidrilo, vinil-sulfonas , glutarato de succimidilo, succinato de succimidilo, ácido succínico, tresilato y un grupo funcional activable . La invención se refiere adicionalmente a polímeros solubles en agua, moleculármente homogéneos en donde U es un residuo de un grupo funcional capaz de formar un enlace seleccionado del grupo de carbonato, éster, uretano, ortoéster, amida, amina, oxima, imida, urea, tiourea, tioéter, tiouretano, tioéster, éter, taizolidina, hidrazona y oxazolidina, y particularmente polímeros en donde U está protegido. La invención se refiere adicionalmente a polímeros solubles en agua, molecularmente homogéneos, en donde el polímero tiene un peso molecular de más de aproximadamente 10,000 Da, y de manera más preferente de más de aproximadamente 15,000 Da. La invención se refiere adicionalmente a polímeros solubles en agua, molecularmente homogéneos, en donde B comprende cuatro o más brazos, y/o en donde B comprende un núcleo de ramificación unido a s2 o Polímero a través de uno o más enlaces de amida, y/o en donde B comprende un núcleo de ramificación unido a Polímero á través de enlaces de amida . La invención se refiere adicionalmente a polímeros solubles en agua molecularmente homogéneos, en donde la unidad de repetición comprende un óxido de etileno de la fórmula - (CH2-CH2-0) - o - (CH2-CH2-CH2-0) - ; y/o en donde X, Y, o X y Y se seleccionan a partir de: - ( (CH2) nl- (CH2-CH2-0) n2- (CH2al-)- o - ( (CH2)nl- (0-CH2-CH2)n2- (CHa)al-) , donde nl es un número entero discreto de 1 a 6 , n2 es un número entero discreto de 2 a 50; y/o en donde uno de X o Y se selecciona del grupo que consiste de fenilo, una porción de alquileno de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, un fenilo que contiene eteroátomo, una porción de alquileno de 1 a 10 átomos de carbono que contiene heteroátomo, un grupo alquilo de 1 a 10 átomos de carbono que contiene heteroátomo y una combinación de los mismos . La invención se refiere de manera particular a polímeros solubles en agua molecularmente homogéneos en donde X es - (CH2-CH2) - , o -X'-NH- o -NH-X'-. La invención se refiere de manera particular a polímeros solubles en agua molecularmente homogéneos en donde Y es - (CH2- (CH2-CH2-0) 3-CH2-CH2-CH2) n o - (CH2-CH2-CH2- (0-CH2-CH2)3-n, donde n es 6 a 36; o -Y'-NH- o - H-Y 1 - , especialmente donde al menos uno de X' e Y' comprenden óxido de polietileno de la fórmula (-CH2-CH2-0) n o (0-CH2-CH2- ) n donde n es 2 a 50. La invención se refiere de manera particular a polímeros solubles en agua, molecularmente homogéneos, en donde J* está protegido, o comprende (i) un grupo no ionizable que tiene una carga neutral neta bajo condiciones fisiológicas, o (ii) un grupo ionizable que comprende una carga positiva neta bajo condiciones fisiológicas, o (iii) un grupo ionizable que comprende una carga negativa neta bajo condiciones fisiológicas. La invención se refiere de manera particular a polímeros solubles en agua, molecularmente homogéneos en donde el polímero soluble en agua está monodisperso.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A - 1E representan esquemas de procesos para preparar las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención. Las Figuras 2A - 2C representan esquemas de procesos para preparar proteínas bioactivas sintéticas de la invención . Las Figuras 3A - 3B representan esquemas de procesos para ligaciones de multisegmento que comprende una ligación química de tres o más segmentos peptídicos de no traslape, es decir, al menos un segmento es un segmento intermedio que corresponde al producto final de ligación de longitud completa. Las Figuras 4A - 4C ilustran ligación química nativa y modificación química del tiol resultante de cadena lateral.

Las Figuras 5A - 5B representan un proceso de fase sólida para generar el núcleo de ramificación (B) y el grupo funcional (U) quimioselectivo, único del polímero soluble en agua, U-B-Polímero-J* de la invención. Las Figuras 6A - 6D representan un proceso de fase sólida para generar los componentes preferidos de poliamida-Polímero-J* solubles en agua, sustancialmente no antigénicos de la invención para la unión subsiguiente al núcleo U-B. La Figura 7 representa un proceso para el acoplamiento del componente U-B al componente de Polímero-J* para generar las construcciones sintéticas preferidas de polímero de la invención de la fórmula U-B-Polímero-J* . La Figura 8 representa una ruta alternativa para la unión con precisión de un polímero soluble en agua a un segmento peptídico empleable para la ligación y producción de proteínas sintéticas, bioactivas de la invención. La Figura 9 ilustra el proceso completo para preparar las proteínas bioactivas, sintéticas de la presente invención . La Figura 10 representa la estructura básica de un tipo preferido de proteínas sintéticas que estimulan la eritropoyesis . pPEG = "PEG de precisión" La Figura 11 muestra la estructura general de los análogos de SEP circularmente permutados que tienen un término amino y carboxi recolocado.

La Figura 12 muestra la estructura básica de las proteínas bioactivas, sintéticas de G-CSF. En la Figura, "J" designa un residuo no codificado de forma natural que tiene una cadena lateral hidrófoba. La Figura 13 muestra la estructura de los análogos sintéticos preferidos de RANTES . En la Figura, ?G?? = nonanoilo, X = aminoácido no codificado de forma natural que tiene una cadena lateral hidrófoba, y FA = ácido graso. Las Figuras 14A a 14D muestran una estructura de un polímero referido soluble en agua, y varias construcciones lineales y ramificadas del mismo. La Figura 15 representa esquemáticamente la formación de los polímeros de pPEG de cadena ramificada. Las Figuras 16A a 16E representan la síntesis de una citosina sintética designada SEP1-L30, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de la EPO humana preparado como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 17 representa una citosina sintética designada SEP1-L30, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de la EPO humana preparado como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 18 representa una citosina sintética designada SEP1-L26, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de la EPO humana preparado como se describe en el Ejemplo 3.

Las Figuras 19A y 19B representan esquemáticamente la formación de un polímero preferido soluble en agua de cadena ramificada que se une a una citosina sintética designada SEP1-B50, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de la EPO humana preparado como se describe en el Ejemplo 4. La Figura 20 representa una citosina sintética designada SEP1-B50, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de la EPO humana preparado como se describe en el Ejemplo 4. Las Figuras 21A y 21B representan la síntesis de una citosina sintética designada SEP3-L42, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de la EPO humana preparada como se describe en el Ej emplo 5. La Figura 22 representa la citosina sintética designada SEP3-L42, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de la EPO humana preparado como se describe en el Ejemplo 5. Las Figuras 23A y 23B representan la síntesis de un polímero preferido soluble en agua para la unión a una citosina sintética designada SEP1-B51, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de la EPO humana preparada como se describe en el Ej emplo 7. La Figura 24 representa una citocina sintética designada SEP1-B51, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de la EPO humana preparado como se describe en el Ejemplo 7. Las Figuras 25A y 25B representa la síntesis de un polímero preferido soluble en agua para la unión a una citocina sintética designada SEP1-B52, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de la EPO humana preparada como se describe en el Ej emplo 8. La Figura 26 representa una citocina sintética designada SEP1-B52, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de la EPO humana preparado como se describe en el Ejemplo 8. La Figura 27 muestra datos analíticos representativos para los análogos sintéticos de precisión modificados con polímeros de la EPO humana preparados como se describen en los Ejemplos 2-5 y 7-8. Como se muestra, un Gel de enfoque Isoeléctrico (IEF) y un gel SDS-PAGE no reductor, representativos, demuestran el peso molecular de monómero relativo de la SEP1-B51 purificada, plegada La Figura 28 muestra la actividad in vitro en una línea de células dependientes del factor de los compuestos de SEP, SEPO, SEP1-L26, SEP1-L230, SEP1-B50, SEP1-51 y SEP1-L42. La Figura 29 muestra un perfil farmacocinético representativo que compara la concentración en plasma en nanogramos por mililitros (ng/ml) de SEP3-L42 y -SEP1-B50 contra tiempo en horas. La Figura 30 muestra análisis de regresión lineal de la actividad in vivo como se mide por la captación de ( BC) -S9Fe de células sanguíneas rojas a las 72 horas (como un % de dosis) para SEP1-B51 y eritropoyetina humana glicosilada; recombinante en células CHO ("rhEPO") en un modelo de rata hipóxica. La Figura 31 muestra un perfil farmacocinético representativo para la depuración en ratas en ratas que compara las concentraciones del plasma en ng/ml de SEP1-B51 contra tiempo en horas después de una dosis individual IV de 5 ug/kg para cada compuesto. La Figura 32 representa una quimiocina sintética designada de RANTES G1755-01, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de RANTES preparado como se describe en el Ejemplo 18. La Figura 33 representa una quimiocina sintética designada de RANTES G1755, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de RANTES preparado como se describe en el Ejemplo 19. La Figura 34 es una ' quimiocina sintética designada de RANTES G1805, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de RANTES preparado como se describe en el Ejemplo 20. La Figura 35 representa una quimiocina sintética designada RA TES G1806, que es un análogo sintético de precisión modificado con polímero de RANTES preparado como se describe en el Ejemplo 21. La Figura 36 muestra datos analíticos representativos para los análogos de quimiocina sintética preparados en los Ejemplos 18-21. Como se muestra, un gel de SDS-PAGE representativo compara los pesos moleculares relativos de RANTES tipo silvestre (Wt) a el análogo sintético de quimiocina RANTES G1806 bajo condiciones reductoras (R) y no reductoras (N) . La Figura 37 muestra un perfil farmacocinético para la depuración en ratas que compara la concentración en plasma en pico gramos por mililitros (pg/ml) de análogos sintéticos de RANTES G1755, G1806 y G1805 contra tiempo y minutos después de una dosis individual IV de cantidades Equimolares/kilogramo (kg) de peso de cada animal para cada compuesto . La Figura 38 es una construcción de SEP modificada con polímero, circularmente permutada.

Descripción de la Modalidades Preferidas La invención se refiere a proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero, métodos de producción y uso. La invención también se refiere a polímeros de poliamida solubles en agua, glicomiméticos .

I. Proteínas Bioactivas, Sintéticas, Modificadas con Polímero de la Invención Aunque se han descrito previamente las proteínas modificadas con polímero, la naturaleza y manera de las posibles modificaciones con polímero de la presente invención difieren notablemente de los esfuerzos anteriores. Por ejemplo, las proteínas bioactivas sintéticas modificadas con polímero de la presente invención se sintetizan químicamente, por completo. Además, las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención se modifican con polímeros solubles en agua en uno o más sitios particulares, seleccionados por el usuario y definidos por el usuario. Además, la producción sintética de las proteínas en · la presente invención permite asegurar que estas modificaciones se presenten en cada uno de los sitios seleccionados por el usuario y definidos por el usuario de cada molécula en una preparación. Esta uniformidad y control de la síntesis distinguen notablemente la presente invención de las modificaciones aleatorias permitidas al uso de los métodos de la técnica anterior. De manera significativa, la presente invención permite diseñar una proteína sintética en la cual se puede derivatizar cualquier residuo no crítico para obtener un aducto de polímero. Además, para cada sitio seleccionado por el usuario y definido por el usuario, el usuario puede definir el enlace preciso (amida, tioéster, tioéter, oxima, etc.), a través del cual se unirán estos aductos al polipéptido o estructura de protelna. Adicionalmente, los aductos particulares de polímero deseados para estas presentes en un sitio particular se pueden variar y controlar, tal que se obtenga una preparación final en la cual cada proteína o polipéptido presente contenga " precisamente los mismos aductos derivatizados en precisamente los mismos sitios derivatizados . De esta manera, la presente invención permite la formación de preparaciones homogéneas de polipéptidos y proteínas modificadas con polímero. Además de proporcionar un medio para variar la posición y el número de sitios de unión al cual se puede unir un polímero soluble en agua, la presente invención permite variar la naturaleza del polímero unido. Los aductos de polímero que se pueden incorporar en cualquier sitio particular seleccionado para el usuario y definido por el usuario pueden ser de cualquier longitud definida. Igualmente, consistente con los métodos de la presente invención, es posible emplear polímeros de diferentes latitudes en diferentes sitios. De esta manera, en una modalidad, las proteínas bioactivas sintéticas modificadas con polímero de la presente invención pueden ser ya sea mono-modificadas o poli-modificadas, con un aducto de polímero soluble en agua. Donde se introduce más de un aducto de polímero en un polipéptido o proteína particular, los polímeros empleados pueden ser de "de monoespecie", de "de poliespecie" , "uniformemente de varias especies", o de "especies diversas" . Como se usa la presente, el término "de monoespecie" se propone para referirse a un polipéptido o proteína que se ha modificado por una especie individual de polímero. En contraste, el término "de poliespecie" se propone para referirse a un polipéptido o proteína que se ha modificado por más de una especie individual de polímero.

Estos polipéptidos o ' proteínas de poliespecie se dice que son "uniformemente de varias especies", si en cada sitio modificado del polipéptido o proteína, la misma especie individual de polímeros esta presente. En contraste, un polipéptido o proteína de poliespecie se dice que es "diversamente de varias especies" si, los sitios modificados del polipéptido o proteína se modifican con diferentes especies de polímero. Además, es posible variar el grado de linealidad o ramificación del aducto de polímero en cada uno de los sitios seleccionados por el usuario o definidos por el usuario. De esta manera, los aductos de polímero pueden ser lineales, ramificados o uniformemente ramificados. El término "uniformemente ramificado" se propone para querer decir que todas las ramificaciones de un polímero en un sitio particular tienen la misma estructura y longitud. Como se apreciará, la presente invención permite variar independientemente tanto la longitud de cualquier ramificación individual, así como la estructura del polímero presente en este punto de ramificación. En resumen, la presente invención permite definir (1) la ubicación y (2) la frecuencia de los sitios modificados con polímero, seleccionados por el usuario y definidos por el usuario en una estructura de polipéptido o proteína, así como controlar la (3) longitud, (4) especie y (5) grado de ramificación presente en cada sitio. Adicionalmente, con respecto al polipéptido y proteínas que tienen múltiples modificaciones de polímero, la presente invención permite definir independientemente cada una de las cinco variables identificadas anteriormente para cada sitio. Además, con respecto a los polipéptidos y proteínas que tienen modificaciones de polímero ramificadas, la presente invención permite definir independientemente cada una de las cinco variables identificadas anteriormente para cada punto de ramificación. Esto permite la síntesis de composiciones homogéneas de las proteínas bioáctivas, sintéticas de precisión modificadas con polímero que tienen múltiples copias de cualquiera o todos las 20 cadenas laterales de aminoácidos genéticamente codificados presentes y dejados sin afectar por la unión indeseada del polímero.

De esta manera, la invención proporciona flexibilidad significativa en el diseño, síntesis y uso de proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero, particularmente aquellas que tienen como objetivo receptores de citocinas, factores de crecimiento y similares. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos en las proteínas bioactivas, sintéticas de la invención puede comprender una o más supresiones, inserciones o sustituciones con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína genéticamente codificada en la cual se basa. La secuencia de aminoácidos se puede sustituir con uno o más aminoácidos irregulares, tal como un pseudoaminoácido y otro aminoácido que tiene una cadena lateral no natural, tal como por ejemplo una que se modifique para tener un grupo funcional quimioselectivo, único para la unión de un aducto de polímero soluble en agua a la misma. De esta manera, el polímero soluble en agua se puede unir a través de un aminoácido irregular, o un aminoácido genéticamente codificado. El polímero soluble en agua puede ser lineal o ramificado, y puede tener un grupo terminal que comprende una porción química tal como un ácido carboxílico, alifático, amida o amina. Además, el polímero soluble en agua puede estar monodisperso, es decir, se puede hacer que comprenda una especie molecular individual de estructura y composición definida de manera precisa. De esta manera, el polxmero soluble en agua se puede diseñar para contener características para ajustar de forma precisa la vida media, inmunogenicidad, potencia, estabilidad en almacenamiento, dosis, distribución y el tipo de proteína objetivo modificada con el mismo. En una modalidad preferida, la invención se refiere a proteínas bioactivas, sintéticas, moleculármente homogéneas, modificadas con polímero. Estas proteínas tienen la fórmula : Proteína-Un-si-B-s2-Polímero-s3-J* En esta fórmula, Proteína comprende una cadena de polipéptido de una proteína ribosómicamente especificada. La cadena de polipéptido comprende uno o más segmentos de péptido de no traslape unidos covalentemente por uno o más sitios de ligación química. · Por "proteína ribosómicamente especificada" se quiere decir una proteína producida de manera ribosómica en una célula. En una modalidad preferida, la cadena de polipéptido modificada con polímero posee una bioactividad que imita una bioactividad asociada con esta proteína ribosómicamente especificada tal como una proteína de mamífero natural (por ejemplo proteína humana, de simio, bovina, murina, porcina ovina o equina, avícola o pisiforme) . De manera más preferente, es una bioactividad que imita una bioactividad asociada con una proteína ribosómicamente especificada seleccionada del grupo que consiste de un receptor de proteína o fragmento del mismo, un ligando de receptor de proteína o fragmento del mismo y una citosina. Las cadenas de polipéptido bioactivas de proteínas ribosómicamente especificadas incluyen nuevas y también como aquellas obtenibles de varias bases de datos de proteínas o genes. Los ejemplos de estas bases de datos incluyen de manera enunciativa y sin limitación GeneBank (Benson, et al., Nucleic Acids Res (1998) 26(1): 1-7; USA National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), Base de datos TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD, USA) , Banco de Datos de Proteína (Brookhaven National Laboratory, USA) , y la base de datos ExPASy y Swiss-Protein (Swiss Institute of Bioinformatics, Geneve, Suiza) . Las proteínas ribosómicamente especificadas, más preferidas son citocinas, de los cuales son bien conocidas las cadenas de polipéptido y sus secuencias específicas de aminoácido (Ver, por ejemplo., "The Cytokine Handbook" 3rd Edition, Ed. A. Thomas, Associated Press, 1998; "Citokines", Ed. A. Mire-Sluis & R. Thorpe, Academic Press, 1998; y "Cytokines Reference", Vol . 1 , Ligands , A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds . J.J. Oppendheim y M. Feldmann, Acedemic Press, 2001) ) . Por "sitio de ligación química" se quiere decir el aminoácido N-terminal de un primer péptido o polipéptido y el aminoácido C-terminal de un segundo péptido o polipéptido que forma o es capaz de formar un enlace covalente no reversible en el mismo entre la ligación química. Como se usa en la presente, "ligación química" se refiere a una reacción quimioselectiva que comprende la unión covalente de dos porciones químicas, cada una de las porciones tiene un grupo funcional mutuamente reactivo que es capaz de formar excepcionalmente un enlace covalente no reversible con la otra. La ligación química incluye ligación covalente de -(1) un primer péptido o polipéptido que tiene un grupo C-terminar reactivo excepcionalmente con (2) un segundo péptido o polipéptido que tiene un grupo N-terminal reactivo excepcionalmente, donde los grupos reactivos C-terminal y N-terminal forman un enlace covalente no reversible entre ellos. En particular, la ligación química incluye cualquier química de reacción quimioselectiva que se puede aplicar a la ligación de segmentos peptídicos no protegidos. U es un residuo de un grupo funcional único unido covalentemente a un grupo funcional único mutuamente reactivo de una cadena lateral n de · uno o más aminoácidos de uno o más de los segmentos de péptido de no traslape, y en donde n es un número entero discreto de 1 a 6. De manera más preferente, la cadena lateral n es un número entero discreto de 1 a 4. Como se usa en la presente, el término "aminoácido" se propone para incluir los 20 aminoácidos genéticamente codificados, aminoácidos raros o inusuales que se encuentran en la naturaleza y cualquiera de los aminoácidos que no se presentan de forma natural, tal como aminoácidos irregulares; algunas veces referidos como residuos de aminoácido cuando están en el contexto de un péptido, polipéptido o proteína. Las modalidades preferidas de U y la cadena lateral n son enlaces covalentes formados de grupos únicos mutuamente reactivos, donde estos enlaces se seleccionan de oxima, amida, amina, uretano, éter, tioéter, éster, hidracida, oxazolidina, taizolidina, tioéter, éter y éster. El enlace de U y n más preferido es uno donde u se une covalentemente a la cadena lateral n a través de un enlace formado por ligación química seleccionado del grupo que consiste de amida, oxima, tioéster, hidrazona, taizolidina, oxazolidina. B es un núcleo de ramificación que tiene tres o más brazos que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar presentes o ausentes. De manera más preferente, B esta presente y comprende tres o más brazos, y de manera más preferente cuatro o más brazos. En particular, un brazo de B está unido a U (opcionalmente a través de un espaciador o ligador si) y un segundo brazo de B que está unido a Polímero (opcionalmente a través de un espaciador o ligador s2) . Una proteína bioactiva, sintética favorecida modificada con polímero es una en la cual al menos uno de los brazos de ramificación de "la porción B comprende un residuo de unión seleccionado del grupo que consiste de oxima, amida, amina, uretano, tioéter, éster, hidrazida, oxazolidina y taizolidina. Un grupo B de ramificación, preferido, de una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero de la invención comprende un núcleo de ramificación seleccionado del grupo que consiste de amino-carboxilato y amino-carboxilato mezclados. El núcleo de ramificación de amíno, preferido comprende lisina, el núcleo de ramificación de carboxilato preferido comprende ácido glutámico o aspártico y el núcleo de ramificación de amino-carboxilato mezclados, preferido comprende ácido gamma-glutámico o derivados de los mismos . · El componente Polímero es un polímero soluble en agua, sustancialmente no antigénico, que puede ser el mismo o diferente donde B está presente . Por "polímero soluble en agua" se propone un polímero sustancialmente no antigénico que es soluble en agua y que tiene un peso molecular atómico mayor de aproximadamente 1,000 Daltones. El Polímero tendrá de manera preferente un peso molecular hidrodinámico efectivo de más de 10,000 Da, y de manera más preferente cerca de 20,000 a 500,000 Da, y de manera más preferente cerca de 40,000 a 300,000 Da. Por "peso molecular hidrodinámico efectivo" se propone el peso efectivo solvatado en agua de una cadena de polímero como se determina por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) en base acuosa. Cuando el polímero soluble en agua contiene cadenas de polímero que tienen unidades de repetición de polialquileno, tal como unidad de repetición de óxido de etileno, se prefiere que cada cadena tenga un peso molecular atómico de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 80,000 Da y de manera preferente entre aproximadamente 1,500 y aproximadamente 42,000 Da, con 2,000 a aproximadamente 20, 000 Da que es más preferido. A menos que se prefiera específicamente, el peso molecular se propone que se refiera a peso molecular atómico. El componente Polímero puede tener un amplio intervalo de peso molecular, y subunidades de polímero. Estas subunidades pueden incluir un polímero biológico, un polímero sintético, o una combinación de los mismos. Los ejemplos de estos polímeros solubles en agua incluyen: dextrano y derivado de dextrano, incluyendo sulfato de dextrano, dextrina reticulada con P-amino y carboximetil-dextrina, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo metilcelulosa y carboximetilcelulosa, almidón y dextrinas, y derivados e hidroilactos de almidón, polietilenglicol y derivados del mismo, incluyendo polietilenglicol, metoxipolietilenglicol , homopolímeros de polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol , copolímeros de etilenglicol con propilenglicol , en donde los homopolímeros y copolímeros están insustituidos o sustituidos en un extremo con un grupo alquilo, heparina y fragmentos de heparina, alcohol polivinílico y éteres etílicos de polivinilo, polivínilpirrolidona, aspartamida, y polioles polioxietilados, con el dextrano y derivados de dextrano, dextrina y derivados de dextrina. Se apreciará que varios derivados de los polímeros insolubles en agua específicamente citados también se contemplan. Los polímeros solubles en agua tal como aquellos descritos anteriormente son bien conocidos, de manera particular los polímeros basados en óxidos de polialquileno tal como polietilenglicol "PEG" (Ver, por ejemplo, "Poly (ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications", J.M. Harris, Ed. , Plenum Press, New York, MY (1992); y "Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications " , J.M. Harris y S. Zalipsky, Eds . , ACS (1997) ; y Solicitudes de Patente Internacional : WO 90/13540, WO 92/00748, O 92/16555, C ) 94/04193, O 94/14758, O 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28937, O 95/11924, WO 96/00080, WO 96/23794, WO 98/07713, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/30727, WO 99/32134, O 99/33483 , WO 99/53951, O 01/26592, WO 95/13312, O 96/21469, WO 97/03106, WO 99/45964, y Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,179,337; 5,075,046; 5,089,261; 5, 100, 992 5,134,192; .5, 166,309; 5,171,264; 5,213,891; 5,219,564 5,275,838; 5, 281, 698; 5,298, S43 ; 5,312,808; 5,321, 095 5,324,844; 5,349, 001; 5,35'2, 756; 5, 405, 877; 5,445, 027 5,446,090; 5,470, 829; 5,478, 805; 5, 567, 422; 5, 605, 976 6, 612,460; 5, 614, 549; 5, 618, 528 ; 5, 672, 662 ; 5, 637, 749, 5, 643, 575; 5, 650, 388; 5, 681, 567; 5, 686, 110; 5, 730, 990, 5, 739, 208; 5, 756, 593; 5, 808, 096; 5, 824, 778 ; 5, 824, 784, 5, 840, 900; 5, 874, 500; 5, 880, 131; 5, 900, 461; 5,902, 588, 5, 919,442; 5, 919,455; 5,932,462; 5, 965, 199; 5, 965, 566, 5, 985,263; ¦ 5, 990, 237; 6, 011, 042 ; 6, 013, 283; 6, 077, 939, 6, 113,906; 6, 127, 355; 6, 177, 087; 6, 180, 095; 6,194,580, 6,214, 966) . El componente Polímero más preferido comprende un óxido de polialquileno, poliamida-óxido de alquileno, o derivados de los mismos. Un componente Polímero aún más preferido es una poliamida que tiene un peso molecular mayor de aproximadamente 1,000 Daltones de la fórmula - [C (0) -X-C (O) -NH-Y-NH] n- o - [NH-Y- H-C (O) -X-C (O) ] - , donde X e Y son radicales divalentes que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar ramificados o lineales, y n es un número entero discreto de 2-100, y de manera más preferente de 2 a 50, y donde cualquiera de X e Y comprende una unidad de repetición soluble en agua, sustancialmente no antigénica, biocompatible que puede ser lineal o ramificada. La unidad de repetición soluble en agua más preferida comprende un óxido de etileno de la fórmula - (CHa-CH2-0) - o - (CH2-CH2-0) - . El número de unidades de repetición solubles ¦ en agua puede variar de manera significativa, pero el número más preferido de estas unidades es de 2 a 500, de 2 a 400, de 2 a 300 de 2 a 200, de 2 a 100, y de manera más preferente de 2 a 50. Un ejemplo de una modalidad más preferida es donde uno o ambos de X o Y se selecciona a partir de - ( (CH2) nl- (CH2-CH2-0) n2- (CH2nl- ) - o - ( (CH2)nl- (0-CH2-CH2)n2- (CH2)nl-) , donde nl es 1 a 6, 1 a 5, l a 4 y de manera más preferente de 1 a 3 , y donde n2 es de 2 a 50, de 2 a 25, de 2 a 15, de 2 a 10, de 2 a 8 , y de manera más preferente de 2 a 5. Un ejemplo de una modalidad altamente preferida es donde X es -(CH2-CH2)-, y donde Y es - (CH2- (CH2-CH2-0) 3-CH2-CH2-CH2) - o - (CH2-CH2-CH2- (0-CH2-CH2) 3-CH2-) - . El componente Polímero o uno o más de los espaciadores o ligadores, cuando están presentes, pueden incluir cadenas o unidades de polímero que son bioestables o biodegradables . Por ejemplo, los Polímeros con enlaces de repetición tienen grados variables de estabilidad bajo condiciones fisiológicas dependiendo ' de la labilidad de la unión. Los polímeros con estas uniones o enlaces se pueden categorizar por sus velocidades relativas de hidrólisis bajo condiciones fisiológicas basadas en las velocidades conocidas de hidrólisis de análogos de bajo peso molecular, por ejemplo de policarbonatos menos estables a más estables (-O-C(O)-O-) mayor a poliéteres (-C(O)-O-) > a poliuretanos (-NH-C(O) -O-) > a poliortoésteres (-0-C ( (OR) (R1 ) ) -0-) mayor a poliamidas (-C(O)-NH-) . De manera similar, los sistemas de enlace que unen un polímero soluble en agua a una molécula objetivo pueden ser bioestables o biodegradables , por ejemplo, de carbonato menos estable a más estable (-O-C(O) -0-) > a éster (-C(O)-O-) > a uretano (-NH-C (O) -0-) > a ortoéster (-0-C ( (OR) (R> ) ) -0-) > a amida (-C(O)-NH-) . Estos enlaces se proporcionan a manera de ejemplo y no se proponen para limitar los tipos de uniones empleables en las cadenas de polímero o sistemas de enlace de los polímeros solubles en agua de la invención. El componente J* es un residuo de un grupo colgante que tiene una carga neta bajo condiciones fisiológicas seleccionadas del grupo que consiste de negativa, positiva y neutral. Esto incluye alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, arilalquilo, acilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, amideo, amino, grupos carbonilo y similares, que están sustituidos o insustituidos , así como sales de los mismos . Los grupos' neutrales de manera preferente son grupos alquilo o alcoxi, y pueden incluir, de manera enunciativa y sin limitación, porciones que contienen de 1 a 18 carbonos, y pueden ser lineales o ramificados. Cuando se proporcionan como un grupo cargado, J* comprende un grupo funcional ionizable. Los ejemplos de grupos funcionales incluyen de manera enunciativa y sin limitación, ácidos carboxílicos , ésteres, amidas, nitrilos, tioles e hidroxilos. Estos grupos J* puede ser un componente de aminoácidos, ácidos nucleicos, ácidos grasos, carbohidratos y derivados de los mismos, y porciones tal como quitina, quitosan, heparina, sulfato de heparano, condroitina, sulfato de condroitina, dermatan y sulfato de dermatan, ciclodextrina, dextrano, ácido hialurónico, fosfolípido, ácido siálico y similares. J* comprende de manera preferente una porción ionizable seleccionada de carboxilo, amino, tiol, hidroxilo, fosforilo, guanidinio, imidazol y sales de los mismos. Lo más preferido es donde J* comprende una porción de carboxilato ionizable y tiene una carga negativa neta bajo condiciones fisiológicas. Los componentes -si, s2 y s3 son porciones espadadoras o ligadoras que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar presentes o ausentes de forma individual . Los espaciadores o ligadores preferidos incluyen porciones lineales o ramificadas que comprenden una o más unidades de repetición empleadas en 'un polímero soluble en agua, unidades de diamino y diácido, aminoácidos neutrales o no naturales, o derivados de los mismos, así como porciones alifáticas, incluyendo alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, alcoxi y similares, que contienen de manera preferente hasta 18 átomos de carbono o aun una cadena de polímero adicional. De manera más preferente, el espaciador o ligador comprende una cadena de polímero. De manera alternativa, la fórmula anterior Proteína-Un-sl-B-s2-Polímero-s3-J"*, se puede representar como "Proteína-Un-B-Polímero-J* " donde los grupos si, s2 y s3 pueden estar presentes o ausentes. El componente Polímero más preferido es donde el polímero soluble en agua U-sl-B-s2-Polímero-s3 -J* , se produce en total por síntesis gradual. Esto significa que estos polímeros tendrán un peso molecular preciso y estructura definida. En contraste, la síntesis normal de polímero que es un proceso de polimerización, da por resultado una mezcla en la cual las cadenas son de longitud diferente, y existe una distribución de pesos moleculares y tamaños que es difícil sino que imposible de separar. La capacidad para controlar la pureza molecular es ventajosa ya que se puede construir una proteína sintética que tenga un polímero soluble en agua unido a la misma y que este monodisperso . Esto representa una ventaja significativa ya que se pueden evitar las propiedades variables que resultan de los compuestos heterogéneos y solo estos compuestos con las propiedades más preferidas se pueden preparar al aislar con facilidad relativa. De manera alternativa, la fórmula anterior Proteína-Un-sl-B-s2 -Polímero-s3 -J* se puede representar como "Proteína-Un-B-Polímero-J* " donde los grupos si, s2 y s3 pueden estar presentes o ausentes . Los compuestos más preferidos de la fórmula Proteína-Un-sl-B-s2-Pol£mero-s3-J* , tienen una cadena de polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína ribosomicamente especificada, y de manera más preferente donde la cadena de polipéptido tiene uno o más aminoácidos irregulares. Como se usa en la presente, "aminoácido irregular" se refiere a un aminoácido que tiene una cadena lateral no genéticamente codificada, una estructura no genéticamente codificada, una porción Na o aC(0) sustituida no genéticamente codificada, o una combinación de las mismas, es decir, diferente de uno de los 20 aminoácidos genéticamente codificados, ribosómicamente instalados. Los ejemplos de aminoácidos irregulares preferidos incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales que tienen un grupo funcional único diferente de un grupo funcional genéticamente codificado, asi como pseudo-aminoácidos y varios derivados de aminoácidos. A este respecto, la presente invención permite una amplia selectividad y flexibilidad en el diseño y/o construcción de proteínas bioactivas, sintéticas. Los ejemplos de aminoácidos no ribosómicamente instalados que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen de manera enunciativa y sin limitación: D-aminoácidos, ß-aminoácidos, pseudo-glutamato, ?-aminobutirato, ornitina, homocisteína, aminoácidos N-sustituidos (R. Simón et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 9367-71; WO 91/19735 (Bartlett et al.), Patente de los Estados Unidos No. 5,646,285 (Baindur) , ácidos a-aminometilenoxi acéticos (un aminoácido-Gly-dipéptido-isostero) y -aminooxiácidos y otros derivados de aminoácidos que tienen grupos funcionales de cadena lateral no genéticamente no codificados, etc. Los análogos peptidicos que contienen tioamida, amida vinilogosa, hidrazino, metilenoxi, tiometileno, fosfonamidas, oxiamida, hidroxietileno, amida reducida y amida-isosteros reducida, sustituida y ß-sulfonamida (s) se pueden emplear. Por "pseudo-aminoácido" se propone un aminoácido que tiene una estructura idéntica y un grupo de cadena lateral como un aminoácido genéticamente codificado, pero que difiere en la composición atómica de los átomos de la cadena lateral . En una modalidad preferida, se proporcionan proteínas bioactivas, sintéticas que tienen un polímero soluble en agua o unido a un aminoácido regular de una cadena de polipéptido de la misma. Los aminoácidos irregulares más preferidos para la unión de un polímero soluble en agua a la misma emplean química de ligación quimioselectiva que se puede usar en la presencia de grupos funcionales genéticamente codificados sin reaccionar con ellos . En otra modalidad, la invención se refiere a una proteina bioactiva sintética que comprende una cadena de polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una glicoproteína ribosómicamente especificada, donde la cadena de polipéptido tiene uno o más polímeros solubles en agua o unidos a la misma, y que de manera preferente tiene un peso molecular de monómero mayor a 25 kDa. Esto incluye proteínas bioactivas sintéticas que poseen una bioactividad que imita una bioactividad asociada con la glicoproteína ribosómicamente especificada. Como se usa en la presente, "glicoproteína" se refiere a una proteína que contiene una cadena de carbohidratos enlazada covalentemente a una cadena lateral de aminoácidos de la proteína a través de un residuo de - azúcar, y se refiere algunas veces como a la proteína glicosilada. El carbohidrato de una glicoproteína puede estar en la forma de un monosacárido, disacárido (s) , oligosacárido (s) , polisacárido (s) , o sus derivados (por ejemplo, sulfo- o fosfo-sustituidos) . Incluye glicoproteínas que tienen más ' de un carbohidrato unido a la proteína y se ejemplifican por glicoproteínas que tienen glicosilación IT-enlazada' y O-enlazada. Incluye dominios bioactivos glicosilados de glicoproteínas naturales o no naturales. Se apreciará que las glicoproteínas que se han mutado para eliminar uno o más sitios de glicosilación, o que se expresan en células que no glicolisan la proteina (por ejemplo E. coli) se incorporan en esta definición, puesto que el sitio residual para la modificación de polímero será posicionalmente el mismo. Las cadenas de polipéptido preferidas de una proteína bioactiva sintética modificada con polímero de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos de una glicoproteína de mamífero ribosómicamente especificada, tal como una glicoproteína humana. Las cadenas de polipéptido más preferidas comprenden una secuencia de aminoácidos de una glicoproteína ribosómicamente especificada que es una citosina, de la cual se conocen muchas cadenas de polipéptido y sus secuencias específicas de aminoácidos y las propiedades biológicas asociadas (Ver, por ejemplo, "The Cytokine .Handbook" 3rd Edítion, Ed. A. Thomas, Associated Press, 1998; "Citokines", Ed. A. Mire-Sluis & R. Thorpe, Academic Press, 1998; y "Cytokine Reference" , Vol . 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds . J.J. Oppendheim and M. Feldmann, Acedemic Press, 2001)). En una modalidad preferida, la glicoproteína ribosómicamente especificada comprende uno o más sitios de glicosilación, y un polímero soluble en agua se une a la cadena de polipéptido de la proteína bioactiva sintética en uno o más sitios que corresponden a uno o más sitios de glicosilación de la glicoproteína ribosómicamente especificada. En una modalidad más preferida, el polímero insoluble en agua se une a la cadena de polipép idos exclusivamente en uno o más sitios que corresponden a uno o más sitios de glicosilacion. Este aspecto de la invención incluye proteínas bioactivas sintéticas donde la glicoproteína ribosómicamente especificada es una glicoproteína recombinantemente producida, que puede ser una glicoproteína natural una glicoproteína no natural, esta última puede incluir adicionalmente uno o más sitios de glicosilacion no naturales. Por "sitio de glicosilación" se propone una secuencia de aminoácidos de una proteína que codifica para la unión enzimática de una cadena de oligosacárido (carbohidrato) a la cadena lateral de un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de la proteína; ejemplificado por sitios de glicosilación N-enlazados y O-enlazados. Se apreciará que las glicoproteínas que se han mutado para eliminar uno o más de los sitios de glicosilación se incorporan en la definición de "sitio de glicosilación" , puesto que el sitio residual para la modificación de polímero será posicionalmente el mismo. Por "sitio de glicosilación que se presenta de forma natural" se propone un sitio de glicosilación de una glicoproteína encontrada en la naturaleza por "sitio de glicosilación que no se presenta de forma natural" se propone un sitio de glicosilación que se ha manejado genéticamente en una proteína. Por ejemplo, la EPO humana, recombinante y fue G-CSF se han manejado de esta manera (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nos. 5,856,298 y 5,218,092). Esta modalidad preferida de la invención se basa en parte en el hallazgo que cuando una proteína sintética que tiene una cadena de polipéptido de una glicoproteína se modifica en uno o más sitios de glicosilación de la misma con un polímero soluble en agua, tal como los polímeros descritos en la presente, el polímero soluble en agua se puede utilizar para sacar provecho de uno o más de los efectos biológicos atribuidos a una cadena de carbohidrato encontrada normalmente en esa posición en la glicoproteína que se presenta de manera natural de contraparte, glicoproteínas que se han manejado para contener sitios de glicosilación adicionales o no glicoproteínas que se han manejado para estar glicosiladas . Estos efectos biológicos incluyen modulación de resistencia a proteasas, inmunogenicidad, especificidad del receptor, actividad específica, potencia y farmacocinética . Sin embargo, al iluminar la presencia de una cadena de carbohidrato y reemplazarla con polímeros preferidos" solubles en agua de la invención, se obtienen beneficios significativos que incluyen la evasión de la degradación enzimática y depuración tal como cuando se remueven residuos colgantes de ácido siálico de las cadenas de azúcar, inestabilidad, vida media en circulación limitada, distribución, pobres propiedades de manejo, etc. De manera significativa, se ha encontrado que estas proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la reacción retienen estas propiedades biológicas ventajosas en la ausencia sustantiva de pérdida de actividad biológica en comparación a una proteína no modificada de contraparte, incluyendo bioactividad incrementada, aun cuando el peso molecular de monómero de la proteína sintética es mayor de 25 kDa. De esta manera, en otra modalidad preferida, la invención se refiere a una proteína bioactiva, sintética que comprende una cadena de polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una glicoproteína ribosómicamente especificada, donde la cadena de polipéptido tiene uno o más polímeros solubles en agua unidos a la misma y un peso molecular de monómero de más de 25 kDa, y donde la proteína bioactiva sintética comprende una bioactividad que es igual o mejor que una proteína bioactiva sintética correspondiente que tiene una cadena de polipéptido que esta desprovista del polímero soluble en agua. La bioactividad puede ser in vitro, in vivo o ambas . En una modalidad preferida, la bioactividad es in vivo. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a una proteína bioactiva, sintética que comprende una cadena de polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una glicoproteína ribosómicamenté especificada, donde la cadena de polipéptido tiene uno o más polímeros solubles en agua unidos a la misma y un peso molecular de monómero de más de 25 kDa, donde la proteína bioactiva sintética comprende una bioactividad que es igual o mejor que la glicoproteína ribosómicamente especificada. Aquí, nuevamente, la bioactividad puede ser in vitro, in vivo o ambas. En una modalidad preferida, la bioactividad es in vivo. De manera más preferente, estas proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero tendrán un número discreto de polímeros solubles en agua unidos a las mismas. Un beneficio de seleccionar como objetivo los sitios de glicosilación que no se presentan de forma natural de una proteína es que una proteína encontrada en la naturaleza, ya sea una glicoproteína natural o no, se puede modificar para contener un sitio de glicosilación en uno o más sitios o regiones, tal como aquellas regiones desordenadas, desprotegidas o expuestas en la superficie responsables de la inmunogenicidad o sensibilidad a proteasas, usando técnicas de ADN recombinante (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o evolución directa) . Por ejemplo, se diseñan sitios de glicosilación que no se presentan de forma natural en sitios sensibles a proteasa o inmunogénicos potenciales de una secuencia de polipéptido objetivo, y se detectan en un sistema recombinante para la producción (por ejemplo, sistemas de expresión de células de levadura y células CHO, etc.), y se valoran para la bioactividad deseada, pertinente. Entonces se utilizan los nuevos sitios encontrados que son tratables a la glicosilación en el diseño y síntesis de las proteínas bioactivas sintéticas de la invención que tienen un polímero soluble en agua unido exclusivamente a una o más de estas posiciones. En otra modalidad, la invención se refiere a una proteína bioactiva, sintética que comprende un pseudo-aminoácido en un sitio de ligación de la proteína y opcionalmente, un polímero soluble en agua unido a la proteína. Estos compuestos se producen al formar un producto de ligación que tiene un grupo funcional no protegido de cadena lateral en el sitio de ligación al ligar un primer segmento de polipéptido o péptido que tiene un aminoácido N-terminal que comprende un grupo funcional reactivo, quimioselectivo, tal como una cisterna, a un segundo péptido o polipéptido que tiene un grupo funcional C-terminal compatible a la ligación química, tal como una ot-carboxi-tioéster, y convertir químicamente el grupo funcional de cadena lateral, no protegido en el sitio de ligación a un pseudoaminoácido, tal como carboximetilación de la cadena lateral de cisteína-tiol para formar un pseudoaminoácido de glutamato. Los pseudoaminoácidos formados por conversión de cisteínas en sitios de ligación química nativos se refieren en la presente como "Ligación Química Pseudo Nativa", que se describe en detalle posteriormente. También se proporciona una proteína bioactiva, sintética que comprende un polímero soluble en agua unido a una cadena lateral de un aminoácido en un sitio de ligación de la proteína. Esuos compuestos se sintetizan al formar un producto de ligación que tiene un grupo funcional no "protegido de cadena lateral en el sitio de ligación al ligar un primer segmento de péptido a polipéptido que tiene un aminoácido N-terminal que comprende un grupo funcional reactivo, quimioselectivo, tal como una cisteína, a un segundo péptido o polipéptido que tiene un grupo funcional C-terminal, compatible con la ligación, tal como un oc-carboxi-tioéster, y unir un polímero soluble en agua al grupo funcional de cadena lateral no protegido en el sitio de ligación. La utilización de los métodos de ligación química de pseudoaminoácidos y modificación de polímero en el sitio de ligación química de la invención proporciona varias ventaj s con respecto a la técnica anterior, incluyendo la síntesis fuerte de proteínas bioactivas, sintéticas que de otro modo están desprovistas de sitios de ligación adecuados, de expansión de los sitios (y químicas de unión) a los cuales la modificación de polímero específica del sitio se puede explotar de una manera rutinaria y redituable, asi como la síntesis de proteínas bioactivas, sintéticas de peso molecular sustancial, entre otras cosas. También son particularmente adecuados para la comparación de alto rendimiento para el ajuste fino de las propiedades biológicas deseadas, incluyendo exploración de sitios individuales o múltiples para la unión de polímero soluble en agua. Como se señala anteriormente, las propiedades biológicas de las proteínas bioactivas, sintéticas, modificadas con polímero de la invención se pueden modificar al ajustar en forma precisa los sitios y químicas de enlace en la unión de polímero en combinación con el ajuste de precisión del peso molecular, la composición del polímero, la- estructura (por ejemplo, lineal contra-ramificada, o mezclas de los mismos) y el grupo colgante (por ejemplo, cargado contra no cargado, o mezclas de los mismos) del polímero soluble en agua. En particular, además de incrementar el peso molecular de una proteína para mejorar la vida media y la ramificación, etc., el polímero soluble en agua unido al mismo puede convertir la proteína sintética para tener una carga precisa, como se mide por el punto isoeléctrico que es aproximadamente igual a la carga de una proteína biológicamente producida, correspondiente en la cual se basa la secuencia de aminoácidos de la proteína bioactiva, sintética. Esto tiene la ventaja de imitar la carga natural de una proteína ribosomicamente especificada, correspondiente. Una modalidad preferida de la invención se refiere de este modo a proteínas bioactivas, sintéticas que combinan las características anteriores, así como los polímeros solubles en agua utilizados para lo mismo, los aductos de polímero estructuralmente definidos de forma particular que son capaces de ser unidos en posiciones preseleccionadas . También como se indica anteriormente, las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la presente invención pueden tener un peso molecular total, sustancial, que es mayor de aproximadamente 25 kDa. Para los propósitos de la presente invención, estas determinaciones de- peso molecular se van hacer por electroforesis en SDS-poliacrilamida desnaturalizante. El término "peso molecular de monómero" se propone para referirse al peso molecular de una proteína sintética de monómero, como se distingue de proteínas sintéticas que pueden poseer múltiples copias de úna proteína o polipéptido. El término "peso molecular de polipéptido de monómero" se propone para referirse al peso molecular de un polipéptido de monómero, como se distingue de proteínas sintéticas que pueden poseer polímeros unidos a las mismas y/o múltiples copias de una proteína o polipéptido.

Como se usa en la presente, una proteína se dice que es "sintética" si se ha empleado tecnología no recombinante para polimerizar algunos, y de manera más preferente todos, sus residuos de aminoácido. El término "tecnología no recombinante" se propone para distinguir tecnologías que comprenden química orgánica y otros planteamientos de polimerización de síntesis de tecnologías que comprenden la traducción del ARN en proteína, ya sea in vivo o in vitro. Las proteínas sintéticas incluyen proteínas totalmente sintéticas y semi-sintéticas . Se produce una proteína totalmente sintética donde todos los componentes de ligación se elaboran por el hombre por síntesis química, es decir, síntesis libre de ribosomas . Una proteína semisintética se produce donde al menos parte de un componente de ligación se elabora por síntesis biológica, es decir, ribosómicamente en un sistema de traducción celular o libre de célula y otra parte se elabora por síntesis química . Como se usa en la presente, una proteína sintética se dice que es "bioactiva" si posee una bioactividad discernible que es dependiente de la' estructura o secuencia de aminoácidos en la proteína sintética, esta variación en esta estructura o secuencia mejora, modifica o atenúa la bioactividad de la proteína. Sin limitación, esta "bioactividad" incluye la capacidad de la proteína para mediar una reacción catalítica, de señalización o inducción. Como se usa en la presente, una protelna se dice que "media una reacción catalítica" al convertir un sustrato en un producto sin que se consuma o modifique de manera permanente por sí misma. Una proteína se dice que "media una reacción de señalización o inducción" si su presencia provoca que un organismo o sus tejidos o células, inicien, continúen, mejoren, modifiquen o atenúen la expresión génica, diferenciación celular o proliferación celular. Los ejemplos de estas reacciones de señalización o inducción incluyen inducción de la expresión de citocinas o una respuesta a la expresión de citocinas, inducción de la eritropoyesis, inducción o atenuación de la inflamación y/o un proceso inflamatorio, iniciación de la angiogénesis o vascularización, inducción de la apoptosis y la afectación del ciclo celular, etc. Por consiguiente, por "proteína bioactiva, sintética modificada con polímero" como se usa en la presente se refiere a una proteína bioactiva, sintética que tiene uno o más polímeros solubles en agua unidos a la misma. La bioactividad de las ' proteínas bioactivas, sintéticas de la presente invención también incluye la capacidad de la proteína para unirse específicamente a un receptor, ligando o anticuerpo. Como se usa en la presente, el término unión "específica" se propone para referirse a una interacción de unión basada en la estructura, tal como la que existe entre una hormona y su receptor, o un anticuerpo y un epítope antigénico, como se distingue de unión "no específica" basada en carga, solubilidad, hidrofobicidad, etc. Las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la presente invención se pueden diseñar para poseer una bioactividad que emite una bioactividad asociada con una proteína de mamífero (incluyendo humana, de simio, bovina, murina, porcina, ovina, equina, etc.), avícola o pisciforme. Como se usa en la presente, una primera proteína se dice que imita a una segunda proteína si la segunda proteína prosee una bioactividad que se modifica, mejora o atenúa con respecto a la ¦ bioactividad de la segunda proteíria. Una bioactividad se dice que esta "asociada" con la proteína si su presencia es directa o indirectamente dependiente de la secuencia de aminoácidos de la proteína. En una modalidad alternativa, las proteínas bioactivas de la presente invención se pueden manejar completa o parcialmente, sin referencia a ninguna contraparte bioactiva natural, correspondiente. Las proteínas bioactivas, sintéticas preferidas de la presente invención incluyen proteínas modificadas con polímero diferente de receptores y dominios de receptor solubles, modificados con polímero. Por ejemplo, las proteínas bioactivas, sintéticas que comprende un dominio de receptor soluble modificado con polímero son particularmente preferidas. Los ejemplos de dominio de receptor solubles que se prefieren para la modificación de polímero se describen en PCT/USOO/06297 , e incluyen dominios solubles del receptor de la hormona adrenocorticotrópica y sus fragmentos bioactivos, receptor de angiotensina, receptor natriurético atrial, receptor de bradicininina, receptor de hormona de crecimiento, receptor quimiotático, receptor de dinorfina, receptor de endorfina, el receptor para ß-lipotropina y sus fragmentos bioactivos, receptor de encefaliña, receptores de inhibidores de enzima, el receptor para fibronectina y sus fragmentos bioactivos, receptores peptídicos de liberación de hormona y gastrointestinales, el receptor para el péptido de- liberación de hormona luteinizante, el receptor para la hormona que estimula los melanocitos, receptor de neurotensina, receptor opioide, receptor de oxitocina, receptor de vasopresina, receptor de vasotocina, el receptor para hormona paratiroide y fragmentos, receptor de proteína-cinasa, receptor de somatostatina, receptor de sustancia P. Las citocinas sintéticas modificadas con polímero son modalidades particularmente preferidas de la invención. En particular, las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención incluyen citocinas sintéticas, incluyendo quimiocinas sintéticas, que media los efectos específicos en la interacción célula-célula, comunicación y en el comportamiento de otras células en un ambiente biológico. Como se usa en la presente el término "citosina" se propone para incluir las interleucinas ("IL") (tal como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, etc.), linfocinas y moléculas de señalización tal como proteínas que estimulan la eritropoyesis (por ejemplo eritropoyetina (EPO) , trombopoyetina (TPO) ) , factor de necrosis de tumor (TNF) , interferones etc., factores de crecimiento, tal como factor de crecimiento de transformación, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de cerebro, neurotrofina-3 , neurotrofina-4 , factor de crecimiento de hepatocitos, Factor de Crecimiento de células T, (TGF, TGF-ß2, TGF-P2, TGF- 3, etc.), Factores de Estimulación de Colonias (G-CSF, GM- CSF, M-CSF etc.), Factores de Crecimiento Epidérmicos (EGF, LIF, KGF, OSM, PDGF, IGF-I, etc.), Factor de Crecimiento de Fibroblastos (aFGF, FGF, etc.), y hormonas, particularmente hormonas de péptidos de señal, y tal como hormona de crecimiénto y quimiocinas. Como se usa en la presente, el término "quimiocina" se propone para referirse a citocinas quimiotácticas, tal como 6Ccina, 9E3, ATAC, ABCD-1, ACT-2, ALP, AAC-1, AMCF-1, AMCF-2, AIF, AAP, Angie, beta-Rl, Beta-Tromboglobulina, BCA-1, BLC, ligando blr-1, BRAK, CIO, CCF18 , Ck-beta-6, Ck-beta-8, Ck-beta-8-1, Ck-beta-10, Ck-beta-11, cCAF, CEF-4, CINC, ' C7, CKA-3, CRG-2, CRG-10, CTAP-3, DC-CK1, ELC, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-1, Exodus-2, ECIP-1, ENA-78, EDNAP, ENAP, FIC, FDNCF, FINAP, Fractalkina, G-26 , GDCF, GOS-19-1, GOS-19-2, GOS-19-3, GCF, GCP-2, GCP-2-tipo, GROl, GR02, GR03 , GRO-alfa, GRO-beta, GRO-gamma, H400, HC-11, HC-14, HC-21, HCC-1, HCC-2, HCC-3, HCC-4, H174, proteína de neutralización de Heparina, Humig, 1-309, ILINCK, I-TAC, IfilO, IL8 , IP-9, IP-10, IRH, JE, KC, Linfotacina, L2G25B, LAG-1, LARC, LCC-1, LD78-alfa, LD78-beta, LD78-gamma, LDCF, LEC, Lkn-1, LMC, LAI , LCF, LA-PF4, LDGF, LDNAP, LIF, LIX, LUCT, Lungcina, LYNAP , Inhibidor de Manchester, MARC, MCAF, MCP-1, MCP-2, CP-3, CP-4, MCP-5, MDC, ???-1-alf , ???-1-beta, MIP-1-delta, MIP-1-gamma, MIP-3, ???-3-alfa, ???-3-beta, MIP-4, MIP-5, Monotactina-1, MPIF-1, MPIF-2, MRP-1, MRP-2, 119, DNAP, MDNCF; Factor de estimulación de Megacariocito, MGSA, Mig, MIP-2, mob-1, OC, MONAP; NC28, NCC-1, NCC-2, NCC-3, NCC-4 N51, NAF, NAP-1, NAP-2, NAP-3, NAP-4, NAP S, NCF . NCP, Neutrotactina, Oncostatina A, P16, P500, PARC, pAT464, pAT744, PBP, PBP-tipo, PBSF, PF4-tipo', PF4-ALT. PF4V1, PLF, PPBP, RANTES; SCM-l-alfa, SCI, SCY A26, SLC, SMC-CF,' ST38, STCP-1, SDF-l-alfa, SDF-l-beta, TARC, TCA-3, TCA-4, TDCF, TECK, TSG-8, TY5, TCF, TLSF-alfa, TLSF-beta, TPAR-1, y TSG-1.

Estas citocinas, y sus subfamilias de quimiocinas y sus cadenas polipeptídicas correspondientes, variantes de los mismos y bioactividades asociadas son bien conocidos y públicamente disponibles a través de múltiples fuentes (ver, por ejemplo "The Cytokine Handbook" 3rd Edición, Ed. A. Thomas, Associated Press, 1998; "Cytokine" Ed. A. Mire-Sluis & R. Thorpe, Academic Press, 1998; y "Cytokine Reference", Vol . 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds . J.J. Oppendheim and M. Feldmann, Acedemic Press, 2001)).

II. Producción de Proteínas Bioactivas, Sintéticas Modificadas con Polímero de la Invención La producción de las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención se pueden contemplar como que tienen los siguientes pasos : diseño, síntesis de péptido, ligación de péptido, plegado del producto de ligación de longitud completa para generar proteína y valoración de la bioactividad de la proteína. Se ha encontrado que se puede realizar la modificación del polímero en una o más de las síntesis de péptido, ligación o en los pasos del producto plegado. Se prefiere, sin embargo, unir el polímero a los péptidos o al producto de ligación antes del plegado. Las proteínas producidas de esta manera que exhiben una bioactividad deseada se seleccionan y representan las proteínas bioactivas sintéticas de la invención. En una modalidad particularmente preferida, se proporciona un método para producir las proteínas bioactivas, sintéticas de la invención que comprende ligar químicamente segmentos de péptido que comprenden secuencias de aminoácidos de no traslape de una cadena de polipeptido de una proteína bioactiva, sintética, objetivo modificada con polímero de la invención, donde uno o más de los segmentos de péptido usados para la ligación tiene un polímero soluble en agua unido al mismo en un sitio definido por el usuario y preseleccionado . La cadena de polipéptido modificada con polímero entonces se puede plegar para producir una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero de la invención. Otro método preferido para producir las proteínas bioactivas, sintéticas de la invención comprende ligar químicamente los segmentos peptídicos que comprenden secuencias de aminoácidos de no traslape de una cadena de polipéptido de una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero de la invención y unir uno o más polímeros solubles en agua a una cadena lateral de un aminoácido en uno o más sitios de ligación de los mismos. La cadena de polipéptido modificada con polímero entonces se puede plegar para producir una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero de la invención. La invención también se refiere a un método para producir una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero, el método comprende (1) ligar químicamente los segmentos de péptido que comprenden secuencias de aminoácidos de no traslape de una cadena de polipéptido de una proteína bioactiva, sintética para formar una cadena de polipéptido de longitud completa que corresponde a la proteína bioactiva, sintética, donde al menos un segmento de péptido comprende un aminoácido irregular que tiene un primer grupo funcional quimioselectivo , (2) plegar la cadena de polipéptido, y (3) unir un polímero soluble en agua al mismo que comprende un segundo grupo quimioselectivo que es reactivo excepcionalmente y de forma mutua con el primer grupo quimioselectivo. En particular, estos varios procesos incorporados en la invención, y como se ejemplifica en los Ejemplos, se pueden ilustrar como se muestra en las Figuras. Por ejemplo, las Figuras 1? - 1E representan esquemas de ligación que comprenden la unión de un polímero soluble en agua (U-B- Polímero-J* como se define en la ' presente) a segmentos peptídicos parcial o completamente desprotegidos ^ j^j\jxn^nj^r ^ an es o después de la ligación o combinación de los mismos. Las Figuras 1A - ID, Yaa representa el aminoácido C-terminal en un primer segmento de péptido que tiene una porción quimioselectiva única (por ejemplo, un aminoácido que tiene alfa-carboxil-tioéster) para la ligación química a un segundo segmento de péptido que tiene una porción Xaa (por ejemplo, cisteína amino-terminal ) de aminoácido N-terminal único y mutuamente reactivo, que es capaz de la ligación química quimioselectiva con Yaa. La reacción quimioselectiva entre Yaa y aa genera un enlace covalente entre los mismos (por ejemplo enlace de amida) . De esta manera Yaa e Xaa forman un apareamiento de ligación quimioselectiva. Un-, como se muestra en las Figuras, representa una segunda porción quimioselectiva, única, que se ha incorporado en un sitio preciso definido por el usuario en la cadena lateral de un aminoácido y es quimioselectiva para, y mutuamente reactivas con el grupo U- · del polímero soluble en agua U-B-Polímero-J* . Por ejemplo, cuando Un es una cadena lateral que se ha modificado para tener un grupo a cetona, U- del polímero soluble en agua U-B-Polímero-J* es un grupo quimioselectivo para reaccionar con acetona, por ejemplo, un grupo aminooxi que produce un enlace de oxima entre los mismos. El subíndice "n" de Un- representa el número de aminoácidos y sus cadenas laterales diseñadas para tener el grupo quimioselectivo U, por ejemplo, donde dos sitios específicos y definidos por el usuario se van a modificar con polímero n = 2, que también se puede representar como Uz o En todos los casos n es un número entero positivo que se controla de manera precisa por diseño. De esta manera Un y U representan un segundo apareamiento de ligación quimioselectiva que es compatible y no reactivo con grupos quimioselectivos de Xaa e Yaa. Las Figuras 1A y IB ilustran dos diferentes reacciones potenciales. En la primera reacción representada, una cadena de polipéptido que tiene una f ncionalidad Un se liga a un segundo polipéptido, y entonces se hace reaccionar con una porción de U-B-Polímero-J* a fin de obtener un polipéptido modificado con polímero. En la segunda reacción representada, la cadena de polipéptido que tiene la funcionalidad Un se hace reaccionar con una porción U-B-Polímero-J* a fin de obtener un polipéptido modificado con polímero, y entonces ligarse a un segundo polipéptido, para obtener un mayor polipéptido modificado con polímero. Las Figuras difieren ya que en la Figura 1A, el polipéptido que tiene el polipéptido que tiene el residuo Xaa va a recibir la modificación de polímero, en tanto que en la Figura IB, el polímero que tiene el residuo Yaa recibe la modificación de polímero. En la Figura 1 se ilustra la capacidad de la presente invención para modificar múltiples cadenas de polipéptido, ya sea antes o después de su ligación para formar un polipéptido más grande. En la Figura ID, PG y PC representa grupos protectores, donde PC representa un grupo protector ortogonal, es decir, PG y PG' se pueden remover bajo diferentes condiciones, y son útiles donde diferentes polímeros solubles en agua se unen vía la misma química a grupos Un, o donde grupos Un representan grupos funcionales de cadena lateral que no se desea que se modifiquen con un polímero (por ejemplo, cadenas laterales que tienen -NH2 o -SH reactivos donde el grupo U del polímero soluble en agua se diseña para reaccionar exclusivamente con tioles de cadena lateral o amino primario) . La Figura ID muestra que los grupos protectores se pueden emplear a fin de proteger las cadenas laterales deseadas de los polipéptidos que se ligan de acuerdo con los métodos de la presente invención. La Figura 1E ilustra la diversidad de grupos que pueden estar presentes o ausentes en los segmentos peptídicos empleados en la ligación y modificación con polímeros de acuerdo a las Figuras 1A - ID. Las Figuras 2A - 2C representan esquemas adicionales de procesos para preparar proteínas bioactivas, sintéticas de la invención. En particular, las Figuras 2A -2B representan el esquema de ligación que comprende la unión de un polímero soluble en agua U-B-'Polímero-J* a la cadena lateral del grupo amino-terminal Xaa en un sitio de ligación (por ejemplo, tiol de cadena lateral de cisteína) . La Figura 12 ilustra la diversidad de grupos que pueden estar presentes o ausentes en los segmentos de péptido empleados en la ligación y modificación con polímero de acuerdo a las Figuras 2A - 2B. Las Figuras 3A - 3B representan esquemas adicionales de procesos para lograr ligaciones de múltiples segmento que comprenden la ligación química de tres o más segmentos de péptido de no traslape, es decir, al menos un segmento que es un segmento intermedio que corresponde a un producto de ligación final de longitud completa. Los péptidos preparados de esta manera se pueden usar para preparar segmentos de péptido comprendidos en otra reacción de ligación, por ejemplo, como se muestra en las Figuras 1A-1E, Figuras 2A-2C, y Figuras 4A-4C. En general, para las ligaciones de multisegmento, el (los) segmento (s) intermedio (s) tienen ya sea un grupo Xaa protegido o un grupo Yaa protegido para evitar la ciclización o formación de concatómero de ese péptido dependiendo de la química de ligación empleada. Para ligaciones secuenciales o en serie, y grupo Xaa de un segmento intermedio se protege (por ejemplo Cys (Acm) ) en tanto que el grupo Yaa esta desprotegido (por ejemplo Yaa-COSR, donde -COSR es un alfa-carboxil-tioéster) . Aquí, el grupo Yaa esta libre para reaccionar con un segundo péptido que tiene un grupo Xaa desprotegido, cuando el segundo péptido esta desprovisto de un grupo Yaa libre. Después de la ligación, el grupo protector se remueve para generar el grupo Xaa para la próxima reacción de ligación. Este proceso se puede continuar, conforme se necesita generando de este modo una cadena alargada de polipéptido. La protección del grupo Yaa es particularmente útil para la ligación química convergente que comprende la producción de un producto final de ligación compuesto de cuatro o más segmentos. Por ejemplo, para un objetivo de proteína generado de una ligación de cuatro segmentos (es decir,- tres reacciones de ligación) , dos segmentos que corresponden a un extremo de la proteína y dos segmentos que corresponden al otro extremo de la proteína se pueden ligar en paralelo, como lo opuesto a lo secuencial, y los dos extremos unidos en una reacción final de ligación. Este esquema de ligación química convergente también puede emplear químicas de ligación ortogonal. Aquí, nuevamente, la diversidad de grupos que pueden estar presentes o ausentes en estos segmentos peptídicos se ilustran en las Figuras 1E, 2C y 4C. Las Figuras 4A - 4C ilustran como las ligación química nativa y la modificación química del tiol resultante de cadena lateral se pueden lograr de acuerdo con los principios de la presente invención. En particular, las Figuras 4A - 4B representan en uso de ligación química nativa de modificación química del tiol resultante de cisteína de cadena lateral en el (los) sito(s) de ligación para formar un "pseudo aminoácido" (representado por vXaa) vía tioalquilación y generación de la cadena lateral químicamente modificada (representada por ?) que comprende un enlace de tioéter. En una modalidad alternativa, no representada, el tiol de cadena lateral se puede convertir a una alanina en una reacción de desulfurización (Liang et al, J. Amer. Chem. Soc. (2001) 123 ( 4 ): 526-533 ) . Un aspecto significativo para ambas reacciones es que cualquier otro tiol de cadena lateral que no se desee que se convierta o modifique se protege con un grupo protector adecuado (PG) o para ligaciones de multisegmento y un grupo protector ortogonal (PG1) donde el segmento que tiene el grupo Yaa carboxi-terminal comprende un grupo Xaa amino-terminal, protegido, es decir PG-Xaa-péptido, que se proporciona a manera de ejemplo en la Figura 4B. La Figura 4C ilustra la diversidad de grupos que pueden estar presentes o ausentes en los segmentos peptídicos empleados en la ligación y modificación con polímero de acuerdo a la Figuras 4A - 4B, así como las Figuras 1A-1E, Figuras 2A-2C y Figuras .3A-3B. En el diseño de las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención, una secuencia de aminoácidos de estructura de polipéptido, inicial para una proteína objetivo se obtiene, típicamente de cualquier número de varias fuentes incluyendo bases de datos tal como bases de datos de proteínas y/o genes, u obtenidas de novo, por ejemplo, a través de la identificación proteómica de una nueva proteina objetivo de interés. Como se señala anteriormente, los ejemplos de estas bases de datos incluyen de manera enunciativa y sin limitación GeneBank (Benson, et al . , Nucleic Acids Res (1998) 26(1): 1-7; USA National Center · for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, ' MD, EUA) , Base de datos TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD, EUA) , Banco de Datos de Proteína (Brookhaven National Laboratory, USA) , y la base de datos ExPASy y Swiss-Protein (Swiss Institute of Bioinformatics , Geneve, Suiza) . Las bases de datos de patentes públicamente disponibles también se pueden usar para este propósito. La estructura de polipéptido empleada para el diseño puede representar una poción (por ejemplo, un dominio) o toda la secuencia objetivo (por ejemplo una forma madura de la cadena de polipéptido) . Con la secuencia inicial de la estructura de polipéptido, la estructura deseada de polipéptido modificada con polímero de longitud completa se diseña para una proteína sintética objetivo, dada o un panel de análogos de la misma. Esto comprende el diseñó de la estructura de polipéptido, la estructura del (los) polímero (s) soluble (s) en agua y la estrategia de unión de polímero soluble en agua y ligación para una construcción dada de proteína sintética de interés. En particular, la secuencia de aminoácidos del polipéptido en la cual se basa un diseño se revisa para la presencia de uno o más sitios de glicosilación, uno o más sitios inmunogénicos, uno o más sitios sensibles a proteasa (es decir, regiones sustancialmente desprovistas de estructura secundaria de hélice o beta-lámina; típicamente regiones de asa y vuelta) . Se pueden recabar otros sitios también, incluyendo sitios de agregación y sitios de unión a glicosaminoglicano (GAG) , estos últimos que son comunes a todas las quimiocinas . Además, las estructuras tridimensionales de muchas proteínas se conocen y se pueden usar para ayudar en el diseño. Los sitios de glicosilación incluyen sitios de glicosilación N-enlazados y O-enlazados, que se presentan típicamente en regiones desordenadas encontradas en asas y vueltas. Los sitios inmunogénicos incluyen sitios hidrófilos en vueltas que están en la superficie de la proteína. Los sitios sensibles a proteasas, de interés, incluyen secuencias de aminoácidos que se reconocen por proteasas y en la superficie de la proteína, típicamente regiones desordenadas. Los sitios de agregación y de GAG para muchas proteínas y métodos para su identificación, particularmente quimiocinas, son bien conocidos (Ver por ejemplo, "The Cytokine Handbook" 3rd Edition, Ed. A. Thomas, Associated Press, 1998; "Citokines", Ed. A. Mire-Sluis & R. Thorpe, Academic Press, 1998; y "Cytokine Reference", Vol . 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds . J.J. Oppendheim and M. Feldmann, Acedemic Press, 2001) ) . Por ejemplo, la inmunogenicidad o estabilidad a proteasas de una proteína objetivo dada se puede reducir o eliminar por la unión específica al sitio de uno o más polímeros al epítope inmunogénico o secuencias de reconocimiento de proteasa para generar una proteína bioactiva modificada con polímero, soluble en agua, resistente a proteasas o no inmunogénica, de la invención. Otros sitios tratables a la unión de polímero incluyen el término amino y/o carboxi para un objetivo dado de proteína. Los sitios de glicosilación, incluyendo sitios naturales así como manejados para contenerlos, son sitios particularmente preferidos para la unión' de los polímeros solubles en agua. Esto se basa en un hallazgo de la presente invención de proteínas bioactivas, sintéticas se pueden producir que se modifican de forma exclusiva en uno o más de estos sitios con polímeros solubles en agua para reemplazar e imitar el efecto biológico positivo de una o más de las cadenas de carbohidrato dé una glicoproteína que se presenta de manera natural en esa posición. Estos sitios de unión de polímero soluble en agua se puede determinar usando planteamientos de modelado y/o análisis biológico o químico. El modelado incluye planteamientos bioinformáticos, tal como el uso de algoritmos de computo de modelado de homología o programas que comparan porciones a toda una secuencia de aminoácidos o ácido nucleico, dada, de una proteína objetivo, la información de la estructura bidimensional para un polipéptido de interés, e información de la estructura tridimensional para una proteína de interés, o una combinación de los mismos. Se conocen un gran número de programas de computo y base de datos y están disponibles para este propósito (ver, por ejemplo GeneBank (Benson, et al., Nucleic Acids Res (1998) 26(1) :l-7 USA National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA) , Base de datos TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD; USA) , Banco de Datos de Proteína (Brookhaven National Laboratory, EUA) , y la base de datos ExPASy y Swiss-Protein (Swiss Institute of Bioinformatics, Geneve, Suiza) . Un ejemplo de un programa de cómputo que integra estos métodos es "MAXVECTOR" (Oxford Molecular Group) , que contiene múltiples herramientas de análisis de herramientas para predecir la estructura secundaria (Métodos de Chou-Fasman y Robson-Garnier) ; hidrofilicidad (Hopp-Woods, Kyte-Dooíittle, Goldman-Engelman-Steitz (GES) , y (métodos de von-Heijne) ; hidrofilicidad (métodos de Fauchere-Pliska, Janin, Manavalan, Sweet-Eisenberg) ; antigenicidad (métodos de Hopp-Woods, Parker Protrusion Indexó (Tontón) , Welling) ; probabilidad superficial (métodos de Karplus & Sclultz) ; Flexibilidad (métodos de Janin y Emini) ; amfifilicidad (método de Eisenberg) ; base de datos de subsecuencias basadas en P OSITE y subsecuencias definidas por del usuario; conjuntos personalizados de subsecuencias; y predicciones de digestión proteolítica y sitios de proteasa. Por ejemplo, cuando se explora un objetivo de proteína para la presencia de uno o más sitios de glicosilacion, parte o toda la secuencia de aminoácidos nativa se revisa típicamente para los sitios de glicosilacion N-enlazados (que se presentan típicamente en la secuencias Asn-Xaa-Thr o Asn-Xaa-Ser en asas o vueltas) y los sitios O-enlazados (que se presentan típicamente en las secuencias Ser-Xaa-Xaa-Pro o Thr-Xaa-Xaa-Pro en asas o vueltas) . Varios algoritmos y programas de modelado son adecuados para este propósito (Ver, por ejemplo base de datos ExPASy y Swiss-Protein (Swiss Institute of Bioinformatics , Geneve, Suiza); Gupta et al., Glicobiology (199) 9 (10) :1009-1022; "DICTYOGLYC" , Hansen et al., Biochemical Journal (1995) 308:801-813; "O-GLYCBASE" Hansen et al., Nucleic Acids Research (1997) 25:278-282; NETOGLYX" Hansen et al., Glycoconjugate J. (1998) 15:115-130). Para predecir sitios inmunogénicos en proteínas, se puede usar el siguiente planteamiento. Se corre una predicción de estructura secundaria en la secuencia de proteína. Los parámetros de Chou-Fasman son particularmente útiles para este propósito (Chou et al., Acvanced Enzymology (1978) 47:45-148; Maclin et al., "Refining algorithms with knowledge-based neural networks : Improving the Chou-Fasman algorithm for protein folding", Wolking Paper 91-2, Computer Sciences Dept . , Univ. of Wisconsin - Madison, 1991; y Qian et al., J. Molecular -Biology (1988) 202:865-884; "PEPEPLOT" program from Genetics Computer Group, Inc.). Las regiones desordenadas y particularmente en las vueltas se identifican. La secuencia de proteína también se explora para la hidrofobicidad, típicamente usando un promedio de corrida de seis residuos siguiendo métodos normales (por ejemplo, métodos de predicción de hidrofobicidad de Fauchere-Pliska o Hopp- oods o Bull-Breese) , y las regiones más hidrofílicas se identifican con atención particular a aquellas que están en las vueltas. En unión, se identifican los sitios de glicosilación, incluyendo sitios N-enlazados y sitios O-enlazados. El sitio más hidrófilo en la proteína, si esta en una vuelta y no se produce que se va a glicosilar, tendrá una alta probabilidad de inmunogenicidad y por esto sirve como un sitio para la modificación con polímero. Se pueden aplicar las mismas reglas básicas a regiones sucesivamente menos hidrófilas para identificar sitios secundarios para la modificación con polímero.

También se puede usar el análisis biológico y químico para identificar sitios específicos para la unión al polímero en la generación de proteínas bioactivas sintéticas de la invención. Por ejemplo, una glicoproteína aislada que se va a usar en base al diseño y síntesis de una proteína bioactiva, sintética de la invención se puede someter a digestión enzimática y análisis, por ejemplo, por correlación peptídica con HPLC y espectrometría de masas para identificar de manera experimental sitios de glicosilación O- y N-enlazados. Para identificar sitios inmunogénicos , los sitios sensibles a proteasas, se pueden identificar regiones de "asa" más altamente desordenados en la superficie de la molécula de proteína que contiene estas regiones, de varias maneras biológicas o químicas. Por ejemplo, una proteína aislada que se va a usar como base o diseño y síntesis de una proteína bioactiva, sintética de la invención, se puede someter a digestión proteolítica limitada con una variedad de proteasas, seguido por análisis espectrométrico de masa de los fragmentos resultantes de péptido para correlacionar los sitios de mayor susceptibilidad a proteasas siguiendo protocolos normales (Ver, por ejemplo Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher D , ingfield PT, editors, Current Protocols in Protein Structure, vol II, New York: John Wiley & Sons, 1997; Chait, BT, Structure (1994) 2:465-467; Kriwacki et al., J.

Chromatogr A (1997) 777:23-30; Hillenkamp et al., Anal Chem (1991) 63: A1193-1201; Fenn et al . , Mass Spectr Rev (1990) 9:37-70; y Síuzdak G. Mass Spectrometry for Biotechnology. San Diego: Academic Press, 1996) . Y hay muchas proteasas usadas comúnmente para estos planteamientos (Konigsberg H, Methods Enzymol (1995) 262:331-346; Carrey, EA, In: Creighton T, editor, Protein Structure, a Practical Approach. New York:- IRL Press, (1989) pp: 117-144; y Coligan, JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher D , ingfield PT, editors. Current Protocols in Protein Structure, vol II. New York: John Wiley & Sons, 1997) . Las regiones de asa de superficie de la cadena de polipéptido de la proteina plegada se asocian usualmente con susceptibilidad incrementada a la digestión proteolítica . Un planteamiento similar que usa modificación química "aleatoria" limitada seguida por digestión y correlación de péptidos por espectrometría de masas también se puede usar para identificar las regiones superficiales expuestas de una proteína de estructura tridimensional desconocida. Para identificar sitios inmunogénicos , los sitios sensibles a proteasa u otros sitios adecuados para la modificación con polímero, exploración con alanina también se puede realizar para identificar residuos específicos en la estructura de polipéptido que son tratables como sitios de unión a polímero soluble en agua. Esto es particularmente útil para identificar residuos constantes requeridos para la actividad biológica y cuando un sitio de unión de polímero soluble en agua se coloca en un sitio sensible a proteasas o inmunogénico de la molécula objetivo. La exploración con alanina es particularmente útil cuando se usa en combinación con otras herramientas de análisis de proteína, tal como se describe anteriormente . Otro planteamiento es preparar de manera sistemática una biblioteca de proteínas sintéticas y de interés con la porción de polímero soluble en agua de modificación localizada en un sitio diferente en la cadena de polipéptido de cada molécula. Después del plegado de la biblioteca de las cadenas de polipéptido modificadas con polímero, se puede realizar una selección/ensayo funcional para separar, por ejemplo, las moléculas plegadas en las no plegadas, o moléculas de unión a receptor de las de no unión. Luego, se puede determinar la ubicación de los sitios de modificación con polímero para las moléculas funcionales. Este planteamiento puede hacer uso de los principios del método de "análisis de firma de proteína" para facilitar la identificación de sitios de no interferencia de modificación con polímero (Muir et al., Chemistry & Biology (1996) 3:817-825) . En unión con el diseño, se construyen los péptidos o segmentos de polipéptido utilizados para sintetizar la estructura de polipéptido. Esto comprende la selección de sitios de ligación adecuados que se eligen en base a la química de ligación seleccionada para el montaje de los varios segmentos de estructura de polipéptido, la química de unión con polímero elegida para una proteína objetivo dada, y los sitios particulares de unión con polímero. Cuando se emplea ligación química nativa, los sitios de ligación de cisteína se determinan al explorar la secuencia objetivo de aminoácidos de la estructura de polipéptido para el residuo de cisteína adecuado que se presenta de forma natural. Cuando se emplea "ligación química nativa extendida", como se describe en la presente, se pueden seleccionar sitios de ligación al explorar la secuencia objetivo de aminoácidos de la estructura de polipéptido para uniones del sitio de ligación que se presenta de manera natural, adecuados que permiten ligaciones fuertes, tal como sitios Xaa-Gly. Debido a que la ligación química nativa extendida no se limita a la ligación en residuos de cisteína, cualquier número de residuos puede servir como la unión del sitio de ligación. En algunos casos, una combinación de la ligación química nativa extendida y la nativa puede ser parte del diseño. En una modalidad preferida, se usa la ligación química nativa para generar parte o toda la cadena de polipéptido de longitud completa. Las cisteínas presentes en la proteína que se presenta de manera natural en la cual la proteína bioactiva sintética se basa, se pueden usar como los sitios de ligación química. Sin embargo, donde una unión de ligación preferida este desprovista de una cisteína adecuada, el aminoácido de no cisteína en esa posición se puede reemplazar con una cisteína para permitir la ligación química nativa en ese sitio. Si se desea, la cisteína recién introducida se puede convertir a un residuo de pseudo aminoácido que corresponde al aminoácido original en esa posición, como se describe en la presente. De manera alternativa, cuando se introduce la cisteína en un sitio para la modificación con polímero, el tiol de cadena lateral se puede explotar para la unión de una construcción de polímero soluble en agua, reactiva con tiol, con la condición que todas las otras cisternas en el polipéptido objetivo que no desee que se modifiquen, se protejan. · En otra modalidad preferida, la ligación química nativa, extendida, como se describe en la presente, se puede utilizar para generar parte o todo el polipéptido de longitud completa. Por este método, se pueden emplear los aminoácidos de alquil- o aril-tiol de cadena de 2 ó 3 carbonos N-terminales , ?a-sustituidos . Estos residuos (donde están presentes en el N-término de uñ segmento de péptido o polipéptido usado para la ligación) se puede usar de manera • ventajosa para ligar ese polipéptido a un polipéptido que tiene üna porción de a-carboxi-tioéster C-terminal, de acuerdo con los métodos de ligación química nativa extendida descritos en la presente. Típicamente, la síntesis de péptidos emplea síntesis de- péptidos en fase sólida Boc y/o Fmoc normales, graduales, que usan sintetizadores automatizados, normales de péptidos, o siguiendo manualmente los protocolos normales, o se ordenan y compran de vendedores comerciales ("Synthetic Peptides, A User ' s Guide, " G.A. Grant, Ed., .H. Freeman & Company, " ew York, NY, 1992; "Principies of Peptide Synthesis, 2nd ed. , "M. Bodanszky, Ed. , Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed. , " M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds . , Springer-Verlag, 1994; and "Protecting Groups," P.J. Kocienski, Ed. , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1994; "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, Eds. W:C: Chan and P.D. hite, Oxford University Press, 2000) . Para los péptidos utilizados para la ligación mediada con tioéster, tal como para la ligación química nativa, se pueden elaborar también siguiendo protocolos normales, (ver, por ejemplo., Dawson et al., Science (1994) 266:776-779; Canne et al. Tetrahedron Lett. (1995) 36:1271-1220; Kent , et al., WO 96/34878; Kent, et al., WO 98/28434; ingénito et al., JACS (1999) 121 (49) :11369-11374; y Hackeng et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96:10068-10073); Amiato et al., supra) . Para la ligación y unión específica al sitio de polímeros solubles en agua, se emplean estrategias químicamente ortogonales en la síntesis de los péptidos (ver por ejemplo Figuras 1-4 y Ejemplos) para evitar reacciones laterales que den por resultado unión indeseada. Por ejemplo, dependiendo del diseño de ligación y el planteamiento de unión con polímero, se pueden explotar una variedad de . estrategias de síntesis ortogonales. En particular, la naturaleza del polímero soluble en agua que se va a unir, y en particular el grupo funcional para unirlo al polipéptido se consideran, por ejemplo como se analiza particularmente para los polímeros preferidos glico-miméticos de la invención. En particular, el polímero soluble en agua se elabora para comprender un grupo U funcional, único que es selectivamente reactivo con un grupo funcional único en un péptido objetivo empleado para la ligación, del material de longitud completa o aun el polipéptido plegado. Cuando se emplea síntesis química, el péptido se hace que contenga un grupo quimioselectivo, mutuamente reactivo en un sitio preciso definido por el usuario. Este aspecto de la invención comprende los principios de síntesis de péptidos (estrategias de grupos protectores) y ligación química (estrategias de grupos no protectores o parciales) . Para la estrategia de grupos protectores, todos los grupos funcionales potencialmente reactivos excepto para el grupo funcional deseado en el polímero soluble en agua y su grupo funcional mutuamente reactivo presente en la molécula objetivo se bloquean con grupos protectores adecuados. Se conocen muchos grupos protectores y adecuados para este propósito (Ver, por ejemplo "Protecting Groups in Organic Syinthesis", 3rd Edition, T:W: Greene and P.G.M. Wuts, Eds . , John iley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," G.A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, ??, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry, " .D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M:L: Peterson, M.R. Rhodes, y H:H: Saneii, Eds,., Advanced Chemtech, 1998; "Principies of Peptide Synthesis, 2nd ed. , "M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed. , " M. Bodanszky y A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; y "Protecting Groups," P.J. Kocienski, Ed. , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1994) . De esta manera, el polímero soluble en agua se puede hacer que posea un amplio intervalo de grupos funcionales, tal como aquellos descritos anteriormente para la estrategia de grupo no protector o parcial, el grupo funcional en el polímero y su grupo funcional mutuamente reactivo presente en el péptido o polipéptido objetivo emplean un par de reacción quimioselectiva en la cual pueden estar presentes otros grupos funcionales en el sistema de reacción pero son no reactivos. Esto incluye grupos tratables con estrategias de captura de amina (por ejemplo ligación por formación de hemiaminal, por formación de imina o por adición de Michael) , estructuras de captura de tiol (por ejemplo, ligación por formación de mercaptido, por intercambio de disulfuro) , estrategias de ligación química nativa (por ejemplo, ligación por intercambio de tioéster que comprende un derivado de aminoácido de cadena lateral que contiene cisteína o tiol) , y estrategias de acoplamiento de ligación ortogonal (por ejemplo, ligación por formación de tiazolidina, por intercambio de tioéster, por formación de tioéster, por intercambio de disulfuro, y por formación de amida (Ver, por ejemplo Coltart, DM. , Tetrahedron (2000) 56 :3449-3491) . · Un grupo U quimioselectivo preferido para esta modalidad comprenderá un residuo de grupo funcional único empleado en una química de ligación compatible, acuosa tal como ligación química nativa (Dawson, et al., Science (1994) 266:776-779; Kent, et al., WO 96/34878), ligación química general extendida (Kent, et al., WO 98/28434), ligación química de formación de oxima (Rose, et al., J. AMER. Chem. Soc . (1994) 116:30-33), ligación de formación de tioéster (Schnólzer, et al., Science (1992) 256:221-225), ligación de formación de tioéter (Englebretsen, et al., Tet . Letts. (1995) 36 (48 ): 8871-8874 ) , ligación de formación de hidrazona (Gaertner, et al . , Biocon . Chem. (1994) 5(4):333-338) , y ligación de formación de tiazolidina y ligación de formación de oxazolidina' (Zhang, et al., Proc . Nati. Acad. Sci (1998) 95 (16) : 9184-9189; Tam, et al., WO 95(00846) o por otros métodos (Yan, L.Z. y Dawson, P.E., "Síntesis of Peptides and Proteins without Cysteine esidues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization, " J. Am. Chem. Soc . 2002, 123, 526-533, incorporado a la presente como referencia; Gieselnan et al., Org. Lett . 2001 3 (9) : 1331-1334; Saxon, E . et al., "Tráceles" Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amida Bonds . Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143). Dadas las varias químicas de unión descritas anteriormente, la unión formada entre el polímero soluble en agua y un polipéptido o péptido objetivo puede comprender un residuo de una unión seleccionada de carbonato, éster, uretano, ortoéster, amida, amina, oxima, imida, urea, tiourea, tioéter, tiouretano, tioéster, éter, taizolidina, hidrazona, oxazolidina y similares. Las unidades más preferidas son uniones de oxima y amida. El paso de ligación de péptido, por ejemplo como se muestra en las Figuras 1-4, puede emplear estrategias de ligación en fase sólida o en solución. La Figura 8 representa otra ruta para la unión con precisión de un polímero soluble en agua a un segmento de péptido empleable para la ligación y producción de proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención. El primer paso emplea síntesis de péptido en fase sólida ("SPPS") (por ejemplo, SPPS con Fmoc o Boc) , en la cual una cadena lateral de aminoácido -seleccionada como objetivo para la unión a polímero se protege con un grupo protector ortogonal (por ejemplo, si se usa SPPS con Fmoc, se puede usar un grupo Boc para proteger el sitio de unión a polímero, o si se usa SPPS con Boc, se puede emplear un grupo Fmoc como el grupo protector ortogonal) . Siguiendo la síntesis de péptido, el grupo protector ortogonal se remueve selectivamente en tanto que permanece protegido el resto del péptido. Esto da un sitio de unión individual para el próximo paso, la síntesis de polímero en fase sólida. Una vez que se remueve el grupo protector ortogonal, la cadena de polímero se une como un precursor. De manera más preferente, la cadena de polímero se construye a través de rondas sucesivas de síntesis de polímero usando un proceso representado en las Figuras 6A - 6D. Aunque se muestra un sitio individual de unión a polímero, se puede proporcionar más de uno . Como se señala anteriormente, la ligación química comprende la formación de un enlace covalente selectivo entre un primer componente químico y un segundo componente químico. Los grupos funcionales, únicos, mutuamente reactivos presentes en el primero y segundo componente se pueden usar para volver quimioselectiva la reacción de ligación. Por ejemplo, la ligación química de péptidos y polipéptidos comprenden la reacción quimioselectiva de segmentos de péptido o polipéptido que tienen residuos de aminoácido C-terminales y N-terminales , únicos, mutuamente reactivos, compatibles. Se han utilizado varias químicas diferentes para este propósito, los ejemplos de las cuales incluyen ligación química nativa ( (Dawson, et al., Science (1994) 266:776-779; Kent, et al., WO 96/34878; Kent , et al., WO 98/28434) , ligación química de formación de oxima (Rose, et al., J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116:30-33), ligación de formación de tioéster (Schnólzer, et al., Science (1992) 256:221-225), ligación de formación de tioéter (Englebretsen, et al., Tet . Letts. (1995) 36 (48) : 8871-8874) , ligación de formación de hidrazona (Gaertner, et al., Bioconj . Chem. (1994). 5 (4) :333-338) , y ligación de formación de tiazolidina y ligación de formación de oxazolidina (Zhang, et al., Proc . Nati. Acad. Sci (1998) 95 (16) :9184-9189; Tam, et al., WO 95/00846; US Patent No. 5,589,356); Gieselman et al., ligación química nativa mediada con Selenocisteína (Org. Lett. (2001) 3 (9) : 1331-1334) ; y ligación química de formación de amida de Staudinger (Saxon et al., Org. Lett. (2000) 2:2141-2143). De esta manera, como se apreciará, cualquier química de reacción quimioselectiva que se pueda aplicar a la ligación de segmentos peptídicos no protegidos también es tratable para este propósito. Las condiciones de reacción para una química de ligación dadas se seleccionan para mantener la interacción deseada de los segmentos peptídicos o polipeptídicos empleados para la ligación. Por ejemplo, el pH y la temperatura, la solubilidad en agua de la marca de ligación, la relación del primer segmento y el segundo segmento, el contenido de agua y la composición de la mezcla de reacción se pueden variar para optimizar la ligación. La adición o exclusión de reactivos que solubilicen los segmentos de ligación a diferentes grados se puede usar adicionalmente para controlar la especificidad y velocidad de la reacción de liberación deseada, es decir, para controlar la exposición y presentación de los grupos reactivos al manipular la solubilidad de los segmentos de polipéptido o péptido. Las condiciones de reacción se terminan fácilmente al valorar el producto deseado de la reacción quimioselectiva en comparación a uno o más controles internos y/o externos. Donde la ligación comprende la unión de un polipéptido que posee un residuo de cisterna N-terminal, el procedimiento de la ligación química nativa se emplea de manera preferente (Dawson, et al., Science (1994) 266:776-779; Kent , et al., WO 96/34878; Kent, et al., WO 98/28434)).

Esta metodología ha empleado una fuerte metodología para generar un enlace de amida nativa en el sitio de ligación. La ligación química nativa comprende una reacción quimioselectiva entre un primer segmento de polipeptido o péptido que tiene una porción de oc-carboxitioéster C-terminal y un segundo péptido o polipéptido que tiene un residuo de cisteína N-terminal. Una reacción de intercambio de tiol produce un compuesto intermedio inicial enlazado a tioéster que se rearregla espontáneamente para dar un enlace de amida nativo en el sitio de ligación en tanto que regenera el tiol de cadena lateral de cisteína. En muchos casos, la secuencia de la proteína natural comprenderá residuos de cisteína adecuadamente colocados tal que los fragmentos de polipéptido que tienen un residuo de cisteína N-terminal se pueden sintetizar y usar en una reacción de ligación química nativa. En otros casos, la síntesis de péptido se puede llevar a cabo para introducir residuos de cisteína en un polipéptido para este propósito. De esta manera en su forma normal, la ligación química nativa comprende la reacción quimioselectiva mediada por tioéster en un residuo de cisteína en una secuencia de polipéptido objetivo; se forma un enlace de péptido en el sitio de ligación y la cadena lateral del Cys se regenera en forma nativa . De manera alternativa, las proteínas de la presente invención se pueden sintetizar a través del uso de "Ligación Química Pseudo-Nativa" , o "Ligación Química Nativa Extendida" . La ligación química pseudonativa comprende el uso de residuos de pseudoaminoácidos que no se presentan de manera natural en posiciones preseleccionadas en los péptidos empleados en la síntesis de proteínas (ver, por ejemplo Figura 4) . Las estructuras de los Pseudoaminoácidos que imitan ambas estructuras de cisteína y las estructuras de los aminoácidos que se encuentran de manera natural en estas posiciones preseleccionadas en la proteína se sintetizan. La ligación química pseudonativa de esta manera se dirige a la tioalquilación de cadenas laterales de cisteína generadas en los sitios de ligación de la ligación química nativa. Un aspecto preferido es la tioalquilación de los sitios de ligación de cisteína en donde al menos un péptido contiene una cisteína nativa que tiene su cadena lateral de tiol protegida con un grupo protector adecuado. En una modalidad preferida de la invención la porción de tiol de un grupo de cisteína se modifica en una cadena lateral deseada, por ejemplo, la cadena lateral de un aminoácido ribosomicamente especificado, un análogo de este aminoácido, o en un aminoácido no ribosomicamente especificado. Como se usa en la presente, un aminoácido ribosomicamente especificado es un aminoácido que se reconoce por ribosomas en el proceso de traducción de la proteína y se puede incorporar en una proteína ribosómicamenté producida. Existe una considerable literatura publicada que describe las modificaciones químicas de la porción de tiol de cadena lateral de cisteína (Ver, por ejemplo "Current Protocols in Protein Science," Editado por John E. Coligan et al., John Wiley & Sons NY (2000)) . Kaiser, E.T. ha descrito la conversión de las cadenas laterales de residuo de cisteína para imitar las propiedades químicas de una cadena lateral de aminoácidos que se presentan de forma natural (ver, por ejemplo (Kaiser, E. T. et al., "Chemical Mutation Of Enzyme Active Sites" Science, 1984 Nov 2; 226 (4674) : 505-11) . Adicionalmente, se ha descrito el uso de una cadena lateral de cisteína para introducir una marca en un péptido o proteína. Las modificaciones de la cadena lateral de cisteína se revisan en Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, S. S. Wong, (1991, CRC Press) ; Chemical Modification of Proteins, Gary E. Means et al., (1971, Holden-Day) , Chemical Modification of Proteins: Selected methods and analytical procedures, Glazer, A.N. et al. (1975, Elsevier); Chemical Reagents for Protein Modification, RL Lundbland (1991, CRC Press) . Tam et al. (Biopolymers (1998) 46:319-327) han descrito el uso de homocisteína (-CH2-CH2-SH) para la ligación química nativa no cys seguido por tioalquilación usando p-nitrobencensulfonato de metilo (reactivo de metilación) para convertir la cadena lateral de homocistelna a una cadena lateral de metionina nativa ( -CH2-CH2-S-CH3) . La presente invención también se puede usar para convertir homocisteinas a pseudoaminoácidos también, es decir, a aminoácidos diferente de metionina. Sin embargo, como con la conversión de cisteínas descritas en la presente, de acuerdo con la presente invención, es necesario usar grupos protectores para evitar la destrucción de cisteínas nativas comprendidas en el apareamiento de disulfuro para péptidos que contienen al menos una cisteína nativa que no se desea que se convierta. Se describen posteriormente grupos protectores adecuados. En tanto que el método de ligación química pseudonativa no facilita la imitación de las cadenas laterales de ciertos aminoácidos ribosómicamente especificados (por ejemplo, las cadenas laterales de glicina, alanina, valina y prolina) (la cadena lateral de alaniña se puede formar, sin embargo, a través de una reacción de desulfuración (Liang, Z.Y. y Dawson, P.E., "Síntesis of Peptides and Proteins Without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization, " J. Am. Chem. Soc . 2001, 123, 526-533. incorporado en la presente como referencia) se puede usar para formar cadenas laterales que emiten muchos aminoácidos ribosómicamente especificados o no codificados. Los aminoácidos producidos de acuerdo con el método de ligación química pseudonativa de la presente invención contendrán un enlace de tioéter, y no tendrán una ramificación beta (es decir incluirán todas un grupo metilo en la posición beta, es decir, aa-CH2-S-) . De esta manera, las versiones de pseudoaminoácidos de los aminoácidos beta-ramificados, isoleucina y treonina se pueden hacer que tengan la estructura colgante de cadena lateral, sin tener la geometría beta y sus restricciones anexas . De manera significativa, los métodos de la presente invención se pueden usar para formar cadenas laterales de aminoácidos que son de la misma longitud como aquella de los aminoácidos ribosómicamente especificados, o son más largas o más cortas que esta longitud. Esta alteración en la longitud de la cadena lateral se puede utilizar para estabilizar (o desestabilizar) la conformación tridimensional, para incrementar la estabilidad de la proteína (o para mejorar la capacidad de la proteína para alterar su conformación y aceptar de este modo un diferente intervalo de sustratos, inhibidores, receptores o ligandos, etc., con relación a aquellos aceptados por la proteína que se presenta de forma natural. Por ejemplo, Cys-CH2SH + Br-CH2-COOH produce Cys-CH2-S-CH2-COOH (este "pseudoácido glutámico" tiene un átomo adicional de cadena lateral, específicamente el grupo -S-; de manera alternativa, si se usa en lugar de ácido aspártico, poseerá dos átomos adicionales de cadena lateral, específicamente un grupo -CH2-S-) . Otras cadenas laterales tienen el mismo número de átomos en la cadena lateral, pero difieren por la inclusión del enlace de tioéter (-S-) . Por ej mplo, Cys-CH2SH + Br-CH2-CH2NH-PG, seguido por la remoción de PG produce Cys-CH2-S-CH2-CH2-NH2. La estructura resultante no tiene átomos adicionales en la cadena lateral, pero un grupo -CH2- se reemplaza con -S-. La metionina es otro ejemplo aguí, Cys-CH2SH + I-CH2-CH3 produce Cys-CH2-S-CH2-CH3 (contra estructura met nativa de Met-CH2-CH2-S-CH3) ; de esta manera se recoloca el tioéter. La argínina también: Cys-CH2-SH + Br-CH2-NH-CH ( (-NH2)(=NH2+)) produce Cys-CH2-S-CH2-NH-CH ( (-NH2) (=NH2+) ) . De manera preferente, la protección de grupos amino reactivos, particularmente para la construcción de pseudolisinas se puede emplear para evitar reacciones laterales indeseadas. Una vez que se realiza la reacción de tioalguilación, se puede remover el grupo protector. En general, donde se desee imitar una proteína que se presente de forma natural tan cercanamente como sea posible, es más preferido emplear una molécula de pseudoaminoácido que tiene una longitud de cadena lateral que es la misma longitud como aquella del aminoácido ribosómicamenté especificado presente normalmente en esta posición en la proteína; es menos preferido emplear una molécula de pseudoaminoácido que tiene una longitud de cadena lateral que es un átomo más larga que aquella del aminoácido ribosómicamente especificado, y aun menos preferido emplear una molécula de pseudoaminoácido que tiene una longitud de cadena lateral que dos átomos más larga que aquella del aminoácido ribosómicamente especificado. Además, se prefiere seleccionar un sitio de ligación de cisteína que este en una ubicación donde los cambios genéticos no vayan a interrumpir con probablemente la función o donde los aminoácidos en ese sitio en proteínas relacionadas se conserven. Estos sitios se pueden identificar por exploración con alanina, modelado por homología y otros métodos . En la ligación química pseudonativa, un péptido que contiene un residuo de cisteína amino-terminal se liga a un péptido que tiene un tioéster carboxi-terminal , como en la ligación química nativa. La cadena lateral de tiol de la cisteína entonces se hace reaccionar con un compuesto de la fórmula Raa-X, donde X es un buen grupo saliente y Raa es un grupo cuya estructura imita la porción terminal de la cadena lateral de un aminoácido ribosómicamente especificado o sintético. De manera significativa, las reacciones de la ligación química pseudonativa trabajan con ya sea la L-configuración natural de la cadena lateral de cisteína o la D-configuración. El uso de la D-configuración puede impartir resistencia a proteasas en este sitio de ligación, y de esta manera se puede desear cuando se desea una estabilidad incrementada a proteólisis. Sin embargo, al usar la D-cistelna, la estructura en ese sitio se alterará. Esta alteración, además de la resistencia a proteasa puede ser deseada para alterar la bioactividad. Sin embargo, para reducir al mínimo el impacto en la bioactividad, se prefiere colocar la D-cisteína en un sitio de alta flexibilidad, tal como una región desordenada, tal como en una asa desordenada que se localizará en la superficie de la molécula plegada, resultante, en un término desordenado de la molécula. De manera deseable, las reacciones de ligación química pseudonativa se pueden usar para colocar cadenas laterales grandes, cargadas (por ejemplo, cadenas laterales de Lys, Arg, Asp o Glu) en la superficie de la molécula sintetizada. Los ejemplos de buenos grupos salientes adecuados, X, incluyen halógenos, especialmente Yodo y Bromo. Los ejemplos de grupos Raa incluyen P04, COOH, COO, C0NH2, guanidinio, amina, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, imidazol, imidazol alquilado, indol, o grupos indol alquilados. La selección de la cual Raa empleará dependerá de la cadena lateral de aminoácido deseada que este presente en una posición particular. De esta manera, por ejemplo, un polipéptido o proteína deseada que tenga la secuencia de aminoácidos : aaNH-Q-aax-aay~W-aaC00H donde Q y W denotan cada uno la presencia o ausencia opcional de residuos adicionales de aminoácido y aax y aay denotan residuos adyacentes internos (que tienen cadenas laterales x e y, respectivamente) y aaNH2 y denotan respectivamente el residuo (N-) terminal de amino y el residuo (C-) terminal de carboxi del polipéptido o proteina y se sintetiza al preparar dos fragmentos de péptido: aaNH2-Q-aax-COSR y Cys-W-aaC00H donde Cys denotan el reemplazo de aay con cisteína y R es cualquier grupo compatible con el grupo tioéster, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, grupos arilo, bencilo y alquilo. Los ejemplos de R incluyen 3-carboxi-4-nitrofenil-tioésteres , esteres de bencilo y éteres de leucina de ácido mercaptopropiónico (Ver, por ejemplo Dawson et al., Science (1994) 266:776-779; Canne et al. Tetrahedron Lett. (1995) 36:1271-1220; Kent , et al., WO 96/34878; Kent, et ' al., WO 98/28434; Ingénito et al., JACS (1999) 121 (49) :11369-11374; y Hackeng et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96:10068-10073). Otros ejemplos incluyen ditiotreitol, o tioésteres de alquilo o arilo, que se pueden producir por técnicas biológicas mediadas por inteina que también son bien conocidas (Ver, por ejemplo Chong et al., Gene (1997) 192:277-281; Chong et al., Nucí. Acids Res. (1998) 26:5109-5115; Evans et al., Protein Science (1998) 7:2256-2264; y Cotton et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (9) : 247-256) ; y luego ligar los fragmentos conjuntamente para forma : aaHH2-Q-aa,.-Cys-W-aaC0OH_ El fragmento ligado entonces se hace reaccionar con Ry-X, donde Ry es un grupo natural que imita la estructura de la cadena lateral y) . La reacción se lleva a cabo bajo condiciones suficientes para convertir el grupo tiol de la cisteína en una cadena lateral "pseudo-y" . Por ejemplo, si Raa se selecciona que sea CH,-COOH o (CH2)2-COOH, entonces la reacción conducirá la formación de un residuo de aminoácido que imita la estructura y función de ácido aspártico ( "pseudo-Asp" o ácido glutámico ( "pseudo-Glu" ) . Como se apreciará, en vista de la descripción anterior, se pueden llevar a cabo síntesis más complicadas empleando más de dos fragmentos de péptido. Una característica significativa de este planteamiento es que los residuos de cisteína que no se desea que se modifiquen en los segmentos de reacción se protegen con cadena lateral, por ejemplo, como Cys (Acm) , para prevenir la modificación química de los residuos de Cys diferentes de uno(s) en el (los) sitio(s) de ligación, o cualquiera de los otros residuos de Cys en los segmentos de reacción se proponen para la formación simultánea de "pseudoaminoácidos idénticos" por la reacción de modificación química después de la ligación. Como se usa en la presente, el símbolo f denota un grupo bencilo; IM denota un grupo imidazol, e IN denota un grupo indol ; PG denota un grupo protector. Posteriormente hay un resumen de grupos laterales Raa que se pueden usar para imitar péptidos que contienen residuos de pseudoaminoácidos de acuerdo con la presente invención (donde X es un halógeno (I, Br, Cl , F, con I y Br que son más preferidos y F es preferido para la unión f) : Aminoácidos Básicos: Lys (no átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-CH2- H-PG, seguido por desprotección da -CH2-S-CH2-CH2-NH2 Arg (no átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-NH-C ( (NH2) (=N¾+) ) ¿a -CH2-S-CH2-NH-C( (N¾) (=NH2+) ) His (2 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-IM da -C¾-S-CH2-IM Aminoácido Ácidos : Asp (2 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-C00H da -CH2-S-CH2-COOH Glu (1 átomo adicional) -CH2-SH + X-CH2-COOH da -CH2-S-CH2-COOH Aminoácidos Polares no cargados: Tys (no átomo adicional o 1 átomo adicional) -CH2-SH + F-f-??? da -CH2-S-cp-pOH) (no átomos adicionales, misma geometría -CH2-SH + Br/I-CH2-(p-pOH da -CH2-S-CH2-cp-pOH (1 átomo adicional) Gln (1 átomo adicional) -C¾-SH + X-CH2-C(0) (NH2) da -CH2-S-CH2-C (0) (NH2) Asn (2 átomo adicionales) -CH2-SH + X-CH2-C(0) ( H2) da -CH2-S-CH2-C (0) (NH2) Ser (2 o 3 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2OH) da -CH2-S-CH2OH (2 átomos adicionales) · -CH2-SH + X-CH2-CH2OH) da -CH2-S-CH2-CH2OH (3 átomos adicionales) Thr (2 o 3 átomos adicionales, ramificación beta ausente) -CH2-SH + X-CH((CH3) (0-PG) ) seguida por remoción de PG da ~C¾-S-CH ( (C¾) (OH)) (2 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-CH( (CH3) (0-PG) ) seguida por remoción de PG da -CH2-S-C¾-CH ( (CH3) (OH) ) (3 átomos adicionales) Aminoácidos no Polares: Leu (1 o 2 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH( (CH3) (CH3) ) da -CH2-S-CH ( (CH3) (CH3) ) (1 átomo adicicional) -CH2-SH + X-CH2-CH( (C¾) (CH3) ) da -CH2-S-C¾~ CH ( (CH3) (CH3) ) (2 átomos adicionales) lie (2 o 3 átomos adicionales, ramificación beta ausente) C¾-SH + X-CH (C¾) -CH2-CH3 da -CH2-S-CH (CH3) -CH2-CH3 (2 átomos adicionales) -CH2-SH + X-CH2-CH(CH3) -CH2-CH3 da -CH2-S-CH2-CH (CH3) -CH2-CH3 (3 átomos adicionales) Phe (1 o 2 átomos adicionales) -CH2-SH + F-cp da -CH2-S-(p (1 átomo adicional) -CH2-SH + Br/l-C¾-cp da -C¾-S-CH2-cp (2 átomos adicionales) Met (ningún átomo adicional) -C¾-SH + I-CH2-CH3 da -CH2-S-CH2-CH3 Trp (1 átomo adicional) -CH2-SH + F-JN da -CH2-S-JJT Sin embargo, donde es ya sea inconveniente o indeseable modificar una secuencia de proteína para introducir un residuo de cisteína u homocisteína en un N-término dado de un polipéptido utilizado para la ligación, o utilizar un pseudo-aminoácido en el' sitio de ligación, el método de ligación química nativa se puede extender usando polipéptidos cuyo N-término se ha modificado para contener un amino-alquilo o aril-tiol de 2 o 3 cadenas de carbono, N-sustituido de manera preferente ?a-sustituido, y permitir de este modo que los principios de ligación química nativa se empleen con los polipéptidos que carecen de residuos de cisteína (ver, solicitud de patente de los Estados Unidos No. de serie 60/231,339, incorporada en la presente como referencia) . El método de "Ligación Química Nativa Extendida" comprende ligar un primer componente que comprende un carboxil-tioéster y de manera más preferente un a-carboxil-tioéster con un segundo componente que comprende un amino-alquilo o aril-tiol de 2 o 3 cadenas de carbono, N-sustituido de manera preferente ?a-sustituido . La reacción quimioselectiva entre el carboxitioéster del primer componente y el tiol de alquil- o aril-tiol de 2 o 3 cadenas de carbono N-sustituido del segundo componente prosigue a través de un compuesto intermedio enlazado a tioéster, y se resuelve en un producto de ligación inicial. De manera más específica, el intercambio de tiol se presenta entre el componente de tioéster de COSR y el componente de amino-alquil-tiol genera un producto de ligación del compuesto intermedio enlazado a tioéster que después del rearreglo espontáneo genera un primer producto de ligación enlazado a amida a través de un compuesto intermedio de anillo de 5 a 6 miembros dependiendo de si el componente de amino-alquil-tiol tiene la fórmula I o II respectivamente: Jl-C(O) -N(C1(R1) -C2-SH) -J2 I Jl-C(O) -N(C1 (Rl) -C2 (R2) -C3 (R3) -SH) ~J2 II donde Jl es un péptido o polipéptido que tiene una o más cadenas laterales de aminoácidos, opcionalmente protegidas, o una porción de este péptido o polipéptido, un polímero, un tinte, una superficie adecuadamente funcionalizada, un ligador o marcador detectable, o cualquier otra porción química compatible con la síntesis química de péptidos o la ligación química nativa extendida; Rl, R2 y R3 son independiente H o un grupo donador de electrones conjugado a Cl; con la condición que al menos uno de Rl, R2 y R3 comprenda un grupo donador de electrones conjugado a Cl; y J2 es un péptido o polipéptido que tiene una o más cadenas laterales de aminoácidos opcionalmente protegidas, o una porción de este péptido o polipéptido, un polímero, un tinte, una superficie adecuadamente funcionalizada, un ligador o marcador detectable; o cualquier otra porción química compatible con la síntesis química de péptido o ligación química nativa, extendida. El alquil- o aril-tiol de 2 o 3 cadenas de carbono N-sustituido [HS-C2-C1 (Rl) -] o [HS- (C3 (R3 ) -C2 (R2) -Cl (Rl) -] en el sitio de ligación es tratable para ser removido, bajo condiciones compatibles con el péptido, sin daño al producto, para generar un producto final de ligación de la fórmula III, que tiene un enlace de amida nativa en el sitio de ligación: Jl-C(O) -HN-J2 III donde Jl, J2, l , R2 y R3 son como se definen anteriormente . Los grupos Rl, R2 y R3 se seleccionan para facilitar la escisión del enlace de N-Cl bajo condiciones de escisión compatibles con el péptido. Por ejemplo, los grupos donadores de electrones, particularmente si se conjugan a Cl se pueden usar para formar un catión estabilizado por resonancia en Cl que facilita la escisión. La reacción de ligación química incluye de manera preferente como un excipiente un catalizador de tiol, y se lleva a cabo a aproximadamente condiciones de pH neutral en condiciones orgánicas-acuosas mezcladas u acuosas, la ligación química del primero y segundo componente puede proseguir a través de un anillo de cinco o seis miembros que sufre rearreglo espontáneo para producir el producto de ligación enlazado a amida N-sustituido. Donde el primero y segundo componente son péptidos o polipéptidos, el producto de ligación enlazado amida N-sustituido tiene la fórmula IV o V: Jl-C (0) -Na (Cl (Rl) -C2-HS) -CH (Z2) -C (0) -J2 IV Jl-C (O) -Na(Cl (Rl) -C2 (R2) -C3 (R3) -HS) -CH(Z2) -C (O) -J2 V donde Jl , J2 y Rl , R2 , R3 Y Z2 son como se definen anteriormente . Los grupos donadores de electrones, conjugados Rl, R2 o R3 , del producto de ligación unido a amida N-sustituido facilitan la escisión del enlace de N-Cl y la remoción del alquil- o aril-tiol de 2 o 3 cadenas de carbono de producto de ligación enlazado a amida N-sustituido. La remoción de la cadena de alquil- o aril-tiol de N bajo condiciones de escisión compatibles con el péptido genera un producto de ligación que tiene un enlace de amida nativa en el sitio de ligación. Donde el primero y segundo componentes son péptidos o polipéptidos , el producto de ligación tendrá la fórmula : Jl-CONaH-CH(Z2)-C(0)-J2 X Los sustituyentes Rl de Ejemplo para la Fórmula I se representan en la Tabla I Tabla 1 Tórmula I Gru pos Sustituyentes 1U para la Tórmula G ( i ncluido por referencia) Los sustituyentes Rl, R2 y R3 de Ejemplo para Fórmula II se representan en la Tabla II. TABLA II FORMULA II Grupos substituyentes Rl, R2, Y R3 de la formula II (Cl incluido por referencia) Como con los compuestos de 2 cadenas de carbono N-sustituidas, la colocación de los sustituyentes donadores de electrones de bencilo y picolilo, Rl' R3 ' y R5' en las posiciones orto o para es necesaria para mantener la conjugación electrónica al carbono Cl para la escisión fuerte del enlace ?a-Cl después de la ligación. Sin embargo, cuando R2 y R3 forman un grupo bencilo con C2 y C3 , al menos uno de El' y R3 ' comprende un grupo donador de electrones, fuerte donde Rl' o R3 ' se selecciona de metoxi (-0CH3) , tiol (-SH), hidroxilo (-0H), y tiometilo (-SCH3). Para los tioles de 3 cadenas de carbono N-sustituidos en los cuales R2 y R3 son hidrógenos, Rl comprende un grupo bencilo o picolilo en el cual Rl ' , R3 ' y R5 ' incluyen grupos donadores de electrones, fuertes o moderados, o combinaciones de los mismo. Como con los alquil- o aril-tioles de 2 cadenas de carbonos N-sustituidos , los grupos ¦ fuertes donadores de electrones mejoran la sensibilidad del alquil- o aril-tiol de 3 cadenas de carbono para la escisión después de la ligación. De esta manera, se puede seleccionar por consiguiente un grupo particular donador de electrones o una combinación del mismo. · Similar a los compuestos de 2 cadenas de carbono N-sustituidos , los compuestos de 3 cadenas de carbono N-sustituidos de la presente invención pueden incluir un tiol como un sustituyente de Rl en las posiciones de Rl' y R5' cuando esté disponible para la sustitución en una construcción de interés. Aquí nuevamente, el grupo tiol donador de electrones se conjuga a Cl y su introducción en estas ubicaciones permite que los compuestos tengan dos rutas para el caso de ligación que forma el anillo de 6 miembros . También incrementa la concentración local de tioles disponibles para la reacción con el a-carboxi-tioéster, y proporciona conformaciones adicionales en términos de restricciones estructurales que pueden mejorar la ligación. La síntesis de los aminoácidos de alquil- o aril-tiol de 2 o 3 cadenas de carbono N-sustituidos de la invención se puede llevar a cabo como se describe en la presente, por ejemplo, en el esquema I y el esquema II, y de acuerdo con técnicas -normales de química orgánica conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, "Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms, and Structure," 4th Edition, J. March (Ed.), John Wiley & Sons, New York, NY, 1992; "Comprehensive Organic Transformations , A Guide to Functional Group Preparations , " R. Larock (Ed.), VCH Publishers, New York, NY 1989. Se puede sintetizar en solución, por síntesis soportada en polímero, o una combinación de las mismas. El planteamiento preferido emplea precursores de aminoácidos de alquil- o aril-tiol de amino S-protegidos , N-alquilados , ?a-protegídos . Los reactivos utilizados para la síntesis se pueden obtener de cualquier número de fuentes comerciales. También, será bien entendido que los componentes de inicio y varios compuestos intermedios, tal como los derivados individuales de aminoácido se pueden almacenar para el uso posterior provistos en equipos y similar. En la preparación de los aminoácidos de alquil- o aril-tiol de 2 o 3 cadenas de carbono ? -sustituidos , N-terminales , de la invención, se emplea una estrategia de grupos protectores. Los grupos protectores preferidos (PG) utilizados en las varias estrategias de síntesis en general son compatibles con la síntesis de péptidos en fase sólida ("SPPS"). En algunos casos, también es necesario utilizar grupos protectores ortogonales que se remuevan bajo condiciones diferentes. Muchos de estos grupos protectores se conocen y son adecuados para este propósito (ver, por ejemplo "Protecting Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, T.W. Green and P.G.M. Wuts, Eds . , John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User' s Guide," G.A. Grant, Ed. , W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry" , W.D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R.Rhodes, y H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Priciples of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky Ed. , Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.," . Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; y "Protecting Groups", P.J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1994). Los Ejemplos incluyen benciloxicarbonilo (Z) , Boc, Bpoc, Trt, Wps, FmocCl-Z, Br-Z; NSC; MSC, Dde, etc. Para las porciones de azufre, los ejemplos de grupos protectores adecuados incluyen de manera enunciativa y sin limitación, bencilo, 4-metilbencilo, 4-metoxibencilo, trifilo, ACM, TACAM, xantilo, derivados de sulfuro, picolilo y fenancilo. De manera más particular, los alquil- o aril-tioles de 2 o 3 cadenas de carbono ?a-sustituidos se pueden preparar de acuerdo con el Esquema I (preparación en fase sólida de precursor ?a-sustituido) , Esquema II (preparación en fase sólida de precursor ?a-sustituido) . En el Esquema I los' alquil- o aril-tioles de 2 o 3 cadenas de carbono Na-sustituidos se montan directamente en la fase sólida usando métodos normales de síntesis orgánica soportada en polímero, en tanto que el precursor de aminoácidos de amino alquil- o aril-tiol S-protegidos, N-alquilados , ?a-protegidos del Esquema II se acoplan a la resina usando protocolos normales de -acoplamiento. Donde se producen productos racémicos o diastereoméricos puede ser necesario separar estos por métodos normales antes del uso en la ligación química nativa, extendida.

Esquema I Síntesis en fase sólida de moléculas derivatizadas auxiliares de ECL X = halógeno Esquema II Los a-carboxitioésteres se pueden generar por métodos químicos o biológicos siguiendo técnicas normales conocidas, tal como aquellas descritas en la presente, incluyendo los ejemplos. Para la síntesis química los péptidos de a-carboxitioéster se pueden sintetizar en solución o a partir de resinas de generación de tioéster, técnicas que son bien conocidas (ver por ejemplo., Dawson et al., Science (1994) 266:776-779; Canne et al. Tetrahedron Lett. (1995) 36:1217-1220; Kent , et al., WO 96/34878; Kent, et al., WO 98/28434; Ingénito et al., JACS (1999) 121 (49) :113S9-11374; y Hackeng et al . , Proc . Natl . Acad. Sci. Ü.S.A. (1999) 96:10068-10073); Amiato et al . , supra.). Por ejemplo, los péptidos de tioéster químicamente sinterizados se pueden elaborar a partir de los a-tioácidos peptídicos correspondientes, que a su vez, se pueden sintetizar en una tioéster-resina o en solución, aunque se prefiere el planteamiento de la resina. Los péptido-a-tioácidos se pueden convertir a los 3-carboxi-4-nitrofenil-tioésteres correspondientes, al éster bencílico correspondiente, o a cualquiera de una variedad de alquil-tioésteres. Todos estos tioésteres proporcionan grupos salientes satisfactorios para las reacciones de ligación, con los 3-carboxi-4-nitrofenil-tioésteres que demuestran una reacción algo más rápida que los bencil-tioésteres correspondientes, que a su vez pueden ser más reactivos que los alquil-tioésteres . Como otro ejemplo, se puede utilizar una resina de generación de tioéster de leucina de ácido mercaptopropionico asociada a tritilo para construir tioésteres C-terminales (Hackeng et al., supra). La síntesis de los tioésteres C-terminales también se puede lograr usando ligadores seguros de 3-carboxipropanosulfonamida por activación con diazometano o yodoacetonitrilo seguido por desplazamiento con un tiol adecuado (Ingénito et al., supra; Bertozzi et al . ) .

También los péptidos de a-carboxitioéster C-terminales se puede elaborar usando procesos biológicos, tal como técnicas biológicas mediadas por inteina (Ver, por ejemplo, Chong et al., Gene (1997) 192:277-281; Chong et al., Nucí. Acids Res. (1998) 26:5109-5115; Evans et al., Protein Science (1998) 7:2256-2264; y Cotton et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (9) :247-256) . Por ejemplo, los sistemas de expresión "de interna, con o sin marcas tal como marcas de afinidad se pueden utilizar para explotar la activada de auto-escisión inducible de un elemento de empalme de proteína de "inteina" para generar un segmento de péptido o polipéptido de éster de ditiotreitol C-terminal (DTT) en particular, la inteina se somete a auto-escisión específica en la presencia de tioles tal como DTT, b-mecaptoetanol o cisteína, que genera un segmento de péptido que tiene un tioéster C-terminal. Ver por ejemplo Chong et al., (1997) supra;. Chong et al., (1998) supra; Evans et al., supra; y Cotton et al., supra. Sin embargo, cuando se usa un segmento recombinantemente producido, la porción químicamente sintetizada de la construcción final contendrá típicamente la modificación con polímero donde se incluya. La ligación de los componentes de alquil- o ariltiol de 2 o 3 cadenas de carbono N-sustituidos de la invención con el primer componente de carboxitioester genera un producto de ligación que tiene un enlace de amida N-sustituido en el sitio de ligación. Las condiciones de ligación de la reacción se eligen para mantener la reactividad selectiva del tioéster con la porción de alquil-o aril-tiol de 2 o 3 cadenas de carbono N-sustituidas . En una modalidad preferida, la reacción de ligación se lleva a cabo en una solución de amortiguador que tiene pH 6-8, con el intervalo preferido de pH que es de 6.5-7.5. La solución de amortiguador puede ser acuosa, orgánica a una mezcla de las mismas. La reacción de ligación también puede incluir uno o más catalizadores y/o uno o más agentes reductores, lípidos, detergentes, otros desnaturalizantes o reactivos solubilizantes y similares. Los ejemplos de catalizadores preferidos son porciones que contienen tiol y fosfina, tal como tiofenol, bencilmercaptano, TCEP y alquil-fosfinas . Los ejemplos de agentes desnaturalizantes y/o solubilizantes incluyen guanídinio, urea en agua o solventes orgánicos tal como TFE, HFIP, D F, MP, acetonitrilo mezclado con agua, o con guanidinio y urea en agua. La temperatura también se puede utilizar para regular la velocidad de la reacción de ligación, que usualmente esta entre 5°C y 55°C, con la temperatura preferida que está entre 15 °C y 40°C. Como un ejemplo, las reacciones de ligación proseguirán bien en un sistema de reacción que tiene 2% de tiofenol en guanidinio 6 M a un pH entre 6.8 y 7.8. Para los alquil- o aril-tioles de 2 cadenas de carbono N-sustituidos , el evento de ligación resulta de un intercambio de tiol que se presenta entre el componente de tioéster de COS y el componente de amino-alquil-tiol . El intercambio genera un producto de ligación intermedio enlazado a tioéster que después del rearreglo espontáneo a través de un compuesto intermedio de un anillo de 5 miembros genera un primer producto de ligación que tiene la fórmula Jl-HN-CH (Zl) -C (0) -Na (Cl (Rl) -C2-SH) -CH (Z2) -J2 que tiene un alquil- o aril-tiol de 2 cadenas de carbono N-sustituido, removible [HS-C2-C1 (Rl) -] en el sitio de ligación, donde los sustituyentes son como se definen anteriormente. El alquil -o aril-tiol de 2 cadenas de carbono N-sustituido [HS-C2-C1(R1)-] en el sitio de ligación es tratable para ser removido, bajo condiciones compatibles con el péptido, para generar un producto final de ligación de la fórmula Jl-HN-CH (Zl) -CO-NH-CH (Z2 ) -CO-J2 que tiene un enlace de amida nativa en el sitio de ligación. Para los aril- o alquil-tioles de 3 cadenas de carbono N-sustituidos, el intercambio de tiol entre el componente de tioéster de COSR y el componente de amino-alquil-tiol genera un producto de ligación intermedio enlazado a tioéster que después del rearreglo espontáneo a través de un compuesto intermedio de anillo de 6 miembros genera un primer producto de ligación de la fórmula Jl-HN-CH (Zl) -C (0) -Na (C1-C2 (R2) -C3 (R3) -SH) -CH (Z2) J2 que tiene un aril- o alquil-tiol de 3 cadenas de carbono N-sustituido removible [HS-C3 (R3) -C2 (R2) -Cl (Rl) -] en el sitio de ligación. El aril-tiol de 3 cadenas de carbono N-sustituido [HS-C3 (R3) -C2 (R2) -Cl (Rl) -] en el sitio de ligación es tratable para ser removido bajo condiciones compatible con el péptido, para generar un producto final de ligación de la fórmula Jl-HN-CH (Zl) -CO-NH-CH (Z2 ) -C0-J2 que tiene el enlace de amida nativa en el sitio de ligación. La remoción del grupo alquil- o aril-tiol N-sustituido se realiza de manera preferente en condiciones ácidas para facilitar la escisión del enlace N-Cl que produce un enlace de amida insustituido , estabilizado en el sitio de ligación. Por "condiciones de escisión compatibles con el péptido" se proponen condiciones fisicoquímicas, compatibles con péptidos y adecuadas para la escisión de la porción alquil- o aril-tiol del producto de ligación. Las condiciones de escisión compatibles con el péptido en general se seleccionan dependiendo del compuesto a-sustituido empleado, que se puede deducir fácilmente a través de planteamientos de rutina bien conocidos (Ver por ejemplo, "Protectíng Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition,' T. . Greene and P.G.M. Wuts, . Eds . , John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," G.A. Grant, Ed. , W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry, " W.D.. Bennet , J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R.Rhodes, and H.H. Saneii, Eds . , Advanced Chemtech, 1998; "Priciples of Peptide Synthesis, 2nd ed.,n M. Bodanszky, Ed. , Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; y "Protecting Groups," P.J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, , Alemania, 1994) . Por ejemplo, donde los sustituyentes Rl, R2 o R3 comprenden un metoxi, hidroxilo, tiol o tiometilo, metilo y similar, en método o masa universal para la remoción comprende condiciones de escisión ácidas típicas para las químicas de síntesis de péptidos . Esto incluye escisión del enlace N-Cl bajo condiciones ácidas fuertes ? condiciones ácidas acuosas, con o sin agentes reductores y/o sistemas de eliminación (por ejemplo ácido tal como fluoruro de hidrógeno anhidro (HF) , ácido trifluoroacético (TFA) o ácido trimetilsulfonil-fluoroacético (TMSFA) y similares) . Los sistemas de escisión ácidos más específicos se pueden elegir para optimizar la escisión del enlace ?a-Cl para remover la porción aril- o alquil-tiol para una construcción dada. Estas condiciones son bien conocidas y compatibles con el mantenimiento de la integridad de los péptidos . Se puede incluir un eliminador de tiol, particularmente donde estén presentes triptofanos en una secuencia de péptido o polipéptido para evitar la reacción de la cadena lateral de triptofano con la porción liberada de aril- o alquil-tiol. Los ejemplos de eliminación de tiol incluyen etanodiol, cisteína, beta-mercaptoetanol y tiocresol. Otras condiciones especializadas de escisión incluyen condiciones de escisión reductiva o ligera cuando el grupo picolilo es el sustituyente . Como un ejemplo, cuando los sustituyentes Rl o R2 y R3 comprenden una poción picolilo, se puede usar la fotolisis (por ejemplo luz ultravioleta) , zinc/ácido acético o reducción electrolítica para la escisión después de los protocolos normales. Donde Rl del tiol de 2 cadenas de carbono N-sustituido comprende un tiometano en Rl, se pueden usar escisiones de mercurio o HF: El sistema de escisión también se puede usar para la escisión simultanea de un soporte sólido y/o como un reactivo de desprotección cuando el primero o segundo componentes de ligación comprende otros grupos protectores. En una modalidad de la presente invención, se emplean alquil- o aril-tioles de 2 o 3 cadenas a-sustituidas, en el paso de síntesis de péptido (particularmente en la síntesis automatizada de péptidos y las estrategias de ligación ortogonal y convergente) para producir polipéptidos N-terminalmente derivatizados de forma apropiada que se pueden usar como sustratos para la ligación química extendida para producir proteínas bioactivas, sintéticas. Estos compuestos comprenden un amino-alquil- o aril-tiol de 2 o 3 cadenas de carbono, Na-sustituido, estable al ácido, completamente protegido, parcialmente protegido, o completamente desprotegido de la fórmula (PGl)S-C2-Cl(Rl)-Na(PG2)-CH(Z2)-C(0)-J2 o (PG1) S-C3 (R3) -C2 (R2)-C1 (Rl)-Na(PG2)-CH(Z2)-C(0)-J2, que se representa posteriormente en la Tabla III y la Tabla IV. En particular, uno o más de Rl, R2 y R3 comprende un grupo donador de electrones conjugado a Cl que, después de la conversión del amino-alquil- o aril-tiol ?a-sustituido al amida-alquil- o aril-tiol ?a-sustituido es capaz de formar un catión estabilizado por resonancia en Cl que facilita la escisión del enlace ?a-Cl bajo condiciones de escisión compatibles con el péptido. PG1 y PG2 son grupos protectores que están presente de manera individual o en combinación o están ausentes y pueden ser los mismos o diferentes, donde Z2 es cualquier porción química compatible con la síntesis química de péptido o la ligación química nativa extendida, y donde J2 es cualquier porción química compatible con la síntesis química de péptido o la ligación química nativa extendida. PG1 (o XI) es un grupo para proteger la amina. PG2 (o X2) es un grupo para proteger el tiol . Muchos de estos grupos protectores se conocen y son adecuados para este propósito (Ver, por ejemplo "Protecting Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds . , John iley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide', " G.A. Grant, Ed. , W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry, " W.D.. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R.Rhodes, y H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Priciples of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky, Ed. , Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed. , " M. Bodanszky y A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; y "Protecting Groups," P.J. Kocienski, Ed.-, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1994) .

Tabla III Los ejemplos de grupos protectores preferidos para PG1 y XI incluyen de manera enunciativa y sin limitación [Boc (t-Butilcarbamato) , Troc (2 , 2 , 2 , -Tricloroetílcarbamato) , Fmoc (9-Fluorenilmetilcarbamato) , Br-Z o Cl-Z(Br- o Cl-Bencilcarbamato) , Dde (4 , 4 , -dimetil-2 , 6-dioxocicloexl-ilideno) , MsZ (4-Metilsulfinilbencilcarbamato) , Msc(2- Metilsulfoetilcarbamato) Nsc(4-nitrofeniletilsulfoniletiloxi-carbonil] . Los grupos protectores PG1 y XI preferidos se seleccionan a partir de """Protective Groups in Organic Synthesis," Green y uts, Third Edition, Wiley-Interscience , (1999) con el más preferido que es Fmoc and Nsc. Los ejemplos de grupos protectores preferidos para PG2 incluyen de manera enunciativa y sin limitación [Acm (acetamidometilo) , MeoBzl o Mob (p-Metoxibencilo) , Me (p-Metilbencilo) , Trt (Tritilo) , Xan (Xantenilo) , tButio (s-t-butilo) , Mmt (p-Metoxitritilo) , 2 o 4 Picolil(2 o 4 piridilo) , Fm(9-Fluorenilmetilo) , tbut (t-Butilo) , Tacam(Trimetilacetamidometilo) ] . Los grupos protectores preferidos PG2 y X2 se seleccionan a partir de "Protective Groups in Organic Synthesis," Green y Wuts, Third Edition, Wiley-Interscience, (1999) , con los más preferidos que son Acm, Mob, MeB, Picolilo.

Tabla IV Las formas preferidas para los aquil- o aril-tioles de 2 o 3 cadenas ?a-sustituidos de la invención se pueden preparar como en los Esquema I y II anteriores . Los compuestos de la presente invención se pueden producir por cualquiera de una variedad de medios, incluyendo amino-alquilación mediada por halógeno, aminación reductiva o por la preparación de precursores de aminoácido de amino-alquil- o aril-tiol S-protegidos , N-alquilados, NOÍ-protegidos compatibles con los métodos de síntesis de aminoácidos en fase sólida. Cuando es deseable, la resolución de los racematos o diastereomeros producidos para dar los compuestos de pureza quiral aceptable se puede llevar a cabo por métodos normales .

III. Polímeros Preferidos Solubles en Agua de la Invención y Producción. Como se usa en la presente, el termino ""heterogeneidad molecular'1 se propone que se refiera a una variación en el número de moléculas de polímero unidas a cada proteína de una preparación de proteína. El término ""diversidad molecular1' se propone que se refiera a (a) una variación en el (los) sitio (s) de la proteína que se modifica por el polímero, (b) una variación en la longitud de los aductos de polímero de diferentes sitios de la misma proteína, o del mismo (s) sitio (s) de diferentes proteínas de una preparación de proteína, o (c) una preparación en el grado y/o naturaleza de cualquier ramificación de los aductos de polímero de diferentes sitios de la misma proteína o del mismo (s) sitio (s) en diferentes proteínas de una preparación de proteína. Como se usa en la presente el término ""molecularmente homogéneo'' se propone para referirse a una preparación de una proteína en la cual todas las moléculas de proteína contienen la secuencia de aminoácidos y las mismas modificaciones de polímero en las mismas posiciones. Una mezcla de dos o más preparaciones de proteína ""molecularmente homogéneas ' ' se refiere a la presente como una preparación ""molecularmente definida'1.

De cuerdo con este aspecto de la invención, una solución a los problemas identificados anteriormente de la heterogeneidad, diversidad e inestabilidad del polímero comprende la producción de una nueva clase de polímeros biocompatibles que comprende las ventajas de ambos polipéptidos (longitud precisa, síntesis conveniente) y "" PEG" ("PEG de precisión'1), un polímero no inmunogénico, anfifílico, flexible, no susceptible a proteasa) Rose, K. et al. (solicitud de patente de los Estados Unidos No. de serie 09/379,297, incorporada en la presente por referencia). Esta nueva clase de polímero biocompatible tiene la fórmula: -[CO-X-CO-NH-Y-NH]n-n es un número entero, de manera preferente de 1-100 y de manera más preferente 2-100, donde X e Y son elementos de repetición biocompatibles de estructura precisa enlazados por un enlace de amida. De manera preferente, X e Y se dan radicales orgánicos divalentes que carecen de grupos funcionales reactivos cuando están ausentes y son los mismos o diferentes y pueden variar independientemente con cada unidad de repetición (n) . De manera preferente cuando, cuando n=2 , al menos uno de X o Y se seleccionara del grupo que consiste de un grupo alifático y aromático, ramificado lineal, sustituido, o insustituido . De manera más preferente, uno de X o Y se seleccionará del grupo que consiste de fenilo, porción de alquileno de 1 a 10 átomos de carbono, grupo alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, un fenilo que contiene un heteroátomo, una porción de alquileno de 1 a 10 átomos de carbono que contiene un heteroátomo, un grupo alquilo de 1 a 10 átomos de carbono que contiene heteroátomo y una combinación de los mismo. En las porciones pPEG particularmente preferidas tienen las fórmulas : - {CO- (CHS) 2-CO-NH- (CHa) 3- (OCH2CH2) 3-CH2-NH}n_ donde n varia de manera preferente de 1-100 y de manera más preferente de 2-100; o - {CO- (CH2) 2-CO- H- (CH2) 6-NH-CO- (CH2) 2-CO-NH- (CH2) 3- (OCH2CH2) 3-CH2- H- }n_, donde n varia de manera preferente de 1-50 y de manera más preferente 2-50. Estas porciones pPEG se pueden sintetizar de una amplia variedad de maneras. Estas porciones sin embargo se producen de manera preferente usando un montaje de cadena gradual en fase sólida de unidades, en lugar de un proceso de polimerización. El uso de este proceso de montaje permite que las porciones de una preparación tengan una estructura definida y homogénea, en tanto que su longitud, la naturaleza de sus sustituyentes X e Y, la posición (es) (si la hay) de los punto de ramificación, y la longitud, X e y sustituyentes, y posiciones de cualquier ramificación. De manera preferente, estas porciones se sintetizaran por pasos tales como: (a) acidar el grupo amino o hidroxilo de un compuesto de la fórmula Z-Q-soporte con un exceso molar de un derivado de un diácido que tiene la fórmula HOOC-X-COOH, donde Z es H2N- o H0- ; Q es un ligador o una molécula objetivo; y el soporte es una fase sólida, matriz o superficie. (b) activar el grupo carboxilo libre del producto del paso (a) ; (c) aminolizar el producto del paso (b) con un exceso molar de una diamina que tiene la fórmula NH2-Y- H2; y (d) repetir opcionalmente los pasos (a) - (c) usando HOOC-X-COOH y NH2-Y-NH2, donde X e Y son radicales orgánicos divalentes o están ausentes y son los mismo o diferentes y pueden variar independientemente con cada una de las unidades opcionalmente repetidas, y son los mismo o diferentes de los sustituyentes X e Y usados en cualquiera de los pasos previos de acilación y aminólisis. En una modalidad preferida, se emplean 6-meros, 12-meros, 18-meros y 32 -meros de la unidad de repetición anterior. Cuando se desea, la unidad de repetición se puede usar, por ejemplo, en la unión con el grupo amino de lisina para formar estructuras ramificadas de pPEG. La pPEG se puede unir a las proteínas sintéticas de la presente invención por una variedad de químicas, incluyendo formación de enlace de tioéter, oxima y amida. En una modalidad, el montaje de cadena gradual en fase sólida de unidades comprende : Paso 1 : Acoplar el diácido protegido o desprotegido a amino en la resina para generar un enlace de amida en el sitio de enlace (donde PG es un grupo protector que está presente o ausente dependiendo del diácido empleado : PG-OOC-X-COOH + H2-Y- H-Resina Paso 2:-. Remover el grupo protector (PG) en la resina, si está presente HOOC-X-CO- H-Y- H-Resina Paso 3 : Acoplar el diamino protegido o desprotegido a carboxi en la resina para generar enlace de amina en el sitio de enlace (donde PG está presente o ausente dependiendo del diamino empleado) · PG-NH-Y-NH + HOOC-X-CO-NH-Y-NH-Resina Paso 4: Remover el grupo protector (PG) en la resina si está presente -NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-Resina Paso 5: Repetir pasos 1-4 ""nM veces para adicionar ""n1' unidades entonces escindir de la resina - [CO-X-CO-NH-Y-NH] - [CO-X-CO-NH-Y-NH] -[CO-X-CO-NH-Y-NH] - [CO-X-CO-NH-Y-NH] - Como se analiza, las construcciones pPEG lineales o ramificadas son polímeros preferidos solubles en agua para la unión a moléculas bioactivas sintéticas de la invención.

Los pPEG empleados tienen grupos colgantes que se cargan o están en tales bajo condiciones fisiológicas y se puede hacer que varíen en la química de unión, longitud, ramificación y solubilidad dependiendo de la estructura de pPEG que se emplee. Como se señala anteriormente, los pPEG preferidos de la invención comprenden una poliamida soluble en agua que tiene la unidad de repetición -CO-X-CO- H-Y-NH- , donde uno o ambos de X e Y comprende una unidad de repetición soluble en agua, y de manera más preferente una unidad de repetición basada en "*PEGM. Aunque las oligoureas son en principio accesibles usando un procedimiento en fase sólida de dos pasos, simple, como se muestra posteriormente para el caso de un amino-resina, NH2-Resina, y una diamina simétrica, NH2-Y-NH2: · Activación con carbonildiimidazol — im-CO-NH- Resina Aminólisis con diamina H2-Y-NH2 ? H2-Y-NH-CO- H- Resina donde estos dos pasos se pueden repetir un número de veces para dar una oligourea con la unidad de repetición -NH-Y- H-CO-, este planteamiento es menos preferido. Esto es debido a que los ' rendimientos de los pasos anteriores pueden ser cuantitavos o no a temperatura ambiente aun con grandes excesos de reactivos y largos tiempos de reacción. Por consiguiente se prefiere usar un procedimiento en fase sólida de tres pasos, mostrado posteriormente para el caso de una amina-resina, H2-Resina, para formar una poliamida. Los reactivos H02C-X-C02H y NH2-Y-NH2 deben ser simétricos a fin de evitar los productos isométricos. Acilación con diácido H02C-X-C02H ? HO-CO-X-CO-NH- Resina Activación con carbonildiimidazol —» im-CO-OCO-X-CO-NH-Resina Aminólisis con diamina NH2-Y-NH2 ? H2-Y- H-CO-X-CO-NH-Resina Estos tres pasos se pueden repetir en secuencia varias veces para dar una poliamida con la unidad de repetición -NH-Y-NH-CO-X-CO- . El polímero contiene un número preciso de unidades monoméricas, X e Y se pueden variar independientemente en cada paso y los grupos terminales se pueden elegir a voluntad. Por ejemplo, al usar anhídrido succinico ("Succ11) para el paso de acilación y 4 , 7 , 10-trioxa-l , 13-tridecanodiamina (también referido, ""EDAM o "TTD1') para el paso de aminólisis, las poliamidas basadas en PEG se forman en donde X es -CH2CH2-, Y es NH-CH2CH2CH2- (OCH2CH2) 3-CH2-NH- y la unidad de repetición es NH-CH2CH2CH2- (OCH2CH2) 3-CH2-NH-COCH2CH2CO- . A pesar del hecho que el procedimiento comprende reactivos divalentes sin grupos protectores, la reticulación no es un problema cuando se usan resinas de síntesis de péptido comerciales, normales (Rose et al., (solicitud de patente de los Estados Unidos No. de serie 09/379,297); y Rose et al., J Am. Chem. Soc . (1999) 121:7034, se espera como se señala posteriormente para el caso de núcleos ramificados de Lys para elaborar construcciones ramificadas. Por ejemplo, las construcciones ramificadas de pPEG se pueden elaborar de manera similar como para las construcciones de "^quimiocuerpo ' ' descritas en Rose et al., (solicitud de patente de los Estados Unidos No. de serie 09/379,297) y Rose, K. y Vizzavona, J. (J. Am, Chem. Soc. (1999) 121: 7034). De esta manera, las construcciones ramificadas de pPEG se pueden hacer que tengan un núcleo de ramificación tal como un núcleo de ramificación de lisina, que se acopla a través del ligadores de oxima a una poliamida preferida soluble en agua tal como - (COCH2CH2CO-NH-CH2CH2CH2 (0CH2CH2) 3-CH2-NH)n.. Por ejemplo, las uniones o enlaces de oxima pueden formarse fácilmente entre un grupo de aminooxiacetilo en una cadena lateral de Lys en la otra extremidad de la poliamida, y grupos glioxililo, en un núcleo de lisina, por ejemplo, el núcleo tetramérico (0=CHCO) 4Lys2Lys- . De esta manera un ligador de oxima de cada punto de ramificación de lisina de puede preparar como la estructura -Lys (COCH2ON=CHCO- ) amida- . Una construcción alternativa puede colocar el enlace de oxima entre la poliamida y el grupo colgante libre de la poliamida, de manera preferente usando una diamina monoprotegida y desprotección después del acoplamiento de la poliamida, para generar una construcción ramificada tetravalente representada a continuación: [0=CHCO- (NH-CH2CH2CH2- [OCH2CH2] 3-CH2-NH-COCH2CH2CO-) n] 4Lys2Lys- Se puede usar la química de la oxima en la elaboración no sólo de productos diméricos y tetraméricos ramificados, sino también es adecuada para el montaje de construcciones ramificadas octaméricas (Rose, K. , J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:30; Rose, K. et al., Bioconj . Chem. (1996) 7:552). Por su puesto es posible usar otras químicas para estos propósitos cuando se usan poliamidas de pPEG (ver por ejemplo Figura 15) . Además,, se puede incorporar la formación de poliamida en un esquema sintético para la síntesis de péptido que comprende la química de Boc o Fmoc, pero cuando se elaboran estos esquemas, debe tenerse en cuenta que el paso de aminólisis removerá el grupo Fmoc y removerá la protección de formilo del indol si se va a usar la química de Boc. Por consiguiente, estos pPEG se puede hacer que tengan varios núcleos de ramificación (por ejemplo, núcleo de ramificación de lisina, etcétera) enlazados a través de un enlace de elección (por ejemplo amida, tioéter, oxima etcétera) a una poliamida lineal soluble en agua (por ejemplo - (Succ-TTD) n- , etcétera), donde el extremo libre de cada poliamida lineal soluble en agua se puede rematar cada uno con un grupo colgante deseado (por ejemplo carboxilato, amino, amida, etcétera) para proporcionar una carga deseada. Además, los pPEG lineales y ramificados de la presente invención se pueden hacer que comprendan un grupo funcional único para la unión a una proteína sintética que tiene uno o más grupos funcionales únicos y mutuamente reactivos en los grupos colgantes de los pPEG serán de manera preferente no antihigiénicos (ver, por ejemplo Figura 15) . En una modalidad particularmente preferida, la invención se refiere a polímeros solubles en agua, glicomimético molecularmente homogéneos de la fórmula: U-si-B-s2-Polímero-s3 -J* donde U es un residuo de un grupo funcional único, B es un núcleo de ramificación que tiene tres o más brazos que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar presentes o ausentes, Polímero es una poliamida que tiene un peso molecular mayor de aproximadamente 5,000 Da de la fórmula - [C (0) -X-C (0) -NH-Y-NH] n- o - [NH-Y-NH-C (O) -X-C (O) n- , donde X e Y son radicales divalentes que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar ramificados o ser lineales y n es un número entero discreto de 2 a 50 y donde cualquiera o ambos de X e Y comprenden una unidad de repetición soluble en agua, sustancialmente no antigéníca que puede ser lineal o ramificada, J* es un residuo de un grupo colgante sustancialmente no antigénico que tiene una carga neta bajo condiciones fisiológicas seleccionadas del grupo que consiste de negativa, positiva neutral, y donde si, s2 y s3 son porciones espadadoras o ligadoras que pueden ser las mismas o diferentes y pueden estar individualmente presente o ausentes. Estos polímeros incluyen aquellos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos no. de serie 60/236,337, que se incorpora en la presente en su totalidad. La fórmula U-sl-B-s2-Polímero-s3-J* también se puede representar por la fórmula U-B-s2 -Polímero-J* , donde los grupos espaciadores o ligadores si, s2 y s3 pueden estar presentes o ausentes . El proceso preferido para formar los polímeros glicomiméticos preferidos de la invención se ilustra en las Figuras 5-7. Las Figuras 5A-5B representan el proceso de fase sólida para generar el núcleo de ramificación (B) y el grupo funcional quimioselectivo único (U) del polímero soluble en agua U-B-Polímero-J* . El proceso se puede llevar a cabo en solución, aunque el planteamiento de fase sólida como se muestra se prefiere. En particular, la Figura 5A muestra la porción de precursor U-B ortogonalmente protegida con el grupo reactivo ( ^") y la estructura geométrica básica de esta construcción se representa por puntos enlazados con guiones (·—·); esa estructura geométrica básica no se propone que limite estos tipos de enlaces químicos o grupos empleados, si no es sólo ilustrativa de los puntos relativos de geometría para construir estructuras y puntos de elaboración química adecuados para la generación de las porciones U-B de la invención. El precursor U-B ortogonalmente protegido se acopla a un soporte de polímero/resina que comprende un grupo ligador y co-reactivo escindible, adecuado ( ^') después de la activación que es capaz del enlace covalente al precursor U-B: Soporte de Polímero Este sistema emplea los principios de la química orgánica soportada en polímero. Después de que el acoplamiento del núcleo de ramificación se elabora (sólo se muestra un primer punto de ramificación, y los puntos de ramificación adicionales pueden estar presentes o ausentes) como se ilustra para generar un núcleo de ramificación que es adecuado para la unión subsiguiente de un componente de Polímero deseado, tal como un polímero lineal, soluble en agua, sustancialmente no antigénico.' También se muestra el grupo U, que se puede proporcionar al comienzo de la síntesis como parte del precursor U-B ortogonalmente protegido, o elaborar durante o después de la elaboración del núcleo de ramificación B. En tanto que la unión del componente de Polímero se puede lograr en resina, es decir, antes de la escisión, una ruta preferida se escinde de la porción U-B del soporte de polímero/resina para generar un núcleo de U-B que se puede purificar para la unión subsiguiente del componente del Polímero. Como se ilustra, los grupos de ramificación colgantes del grupo B de núcleo se construyen para comprender un grupo funcional (Func) , que puede ser el mismo o diferente y puede estar protegido de manera reversible (PG, PG' o PG'1) o no protegido. En cada caso, el paso final para la unión del componente del Polímero comprende la generación de un grupo funcional (Func) en los puntos de ramificación colgante, y la generación del grupo U (ver Figura 7) . La Figura 5B representa un' proceso alternativo en el- cual se emplea un precursor U-B protegido en combinación con un soporte de polímero que tiene un ligador, que en la escisión genera el grupo U protegido o desprotegido, deseado. La Figura 5B también representa la unión de un núcleo de ramificación B pre-montado a un soporte de polímero y el uso de una resina de generación del grupo U para elaborar la porción U-B para la unión subsiguiente del componente de polímero. Las Figuras 6A-6D representan un proceso de fase sólida para generar los componentes de polímero-J* de poliamida solubles en agua, substancialmente no antigénicos preferidos de la invención para la unión subsiguiente al núcleo U-B . Aunque se ilustra el proceso a fase sólida, que es el proceso preferido, un proceso a fase en solución se puede adaptar para lograr el mismo resultado final. Las Figura 6A y 6B , las unidades de diácido y diamino se acoplan usando los principios de química orgánica de fase sólida. Opcionalmente, las unidades de amino-X ' -ácido y/o amino-Y1-ácido protegidas se pueden incorporar para la diversidad adicional de los grupos X e Y en el producto final de escisión que tiene una estructura de poliamxda de la fórmula - [ H-Y-NHCO-X-CO] - . La Figura 6A representa la síntesis en la dirección N- a C-terminal, en tanto que la Figura 6B representa la síntesis en la dirección C a N-terminal. Las Figuras 6C y 6D, las unidades amino-X ' -ácido y/o amino-Y'-ácido protegidas se acoplan usando los principios de química orgánica en fase sólida. La Figura 6C representa la síntesis en la dirección N- a C-terminal, en tanto que la Figura 6D representa la síntesis en la dirección C a N-terminal. Como es evidente de las Figuras 6A-6D, la naturaleza de los productos finales de poliamida se puede controlar de manera precisa, que depende del número de ciclos que se lleven a cabo para la síntesis. Además, el grupo colgante J* se puede construir a virtualmente cualquier especificación definida por el usuario. Donde se empleen unidades de repetición monodispersas X, Y, X' y Y', la estructura molecular exacta del producto final de poliamida de puede controlar de manera precisa . Un proceso preferido para acoplar el componente U-B al componente polímero J* para generar las construcciones preferidas de polímero sintético de la invención de la fórmula U-B-Polímero-J* se representa en la Figura 7. Como se ilustra, se pueden proporcionar varios grupos protectores y son opcionales dependiendo del uso final propuesto de una construcción dada. También se ilustran diferentes rutas para producir las construcciones deseadas de U-Polímero-J* que incluye un planteamiento en fase sólida y un planteamiento en fase en solución. Como se señala anteriormente, las unidades de repetición preferidas solubles en agua comprenden un óxido de- polialquileno, una poliamida-óxido de alquileno, o derivados de los mismos. La unidad de repetición soluble en agua más preferida comprende un óxido de etileno de la fórmula - (CH2-CH2-0) - o (CH2-CH2-0) - . El número de estas unidades de repetición solubles en agua pueden variar de manera significativa, pero el número más preferido de estas unidades es de 2 a 500, de 2 a 400, de 2 a 300, de 2 a 200, de 2 a 100, de 2 a 50 y de manera más preferente 2 a 32, con 3 a 8 que es lo más preferido. Un ejemplo de una modalidad más preferida es donde uno o ambos de X e ? se seleccionan a partir de: - ( (CH2) nl- (CH2-CH2-0) n2- (CHa) nl- ) - o - ( (CH2) nl- (0-CH2-CH2) n2- (CH2) nl- ) , donde ni es 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4 y de manera más preferente 1 a 3, y donde n2 es 2 a 50, 2 a 25, 2 a 15, 2 a 10, 2 a 8 y de manera más preferente de 2 a 5. Un ejemplo de una modalidad altamente preferida es donde X es - (CH2-CH2)-, y donde Y es (CH2- (CH2-CH2-0) 3-CH2-CH2-CH2) - o - (CH2-CH2-C¾- (0-CH2-CH2) 3-CH2) - . Aun más preferidas son las composiciones monodispersas donde cada n es un número entero o discreto. En una modalidad altamente preferida, X es (CH2-CH2)-, e Y es (CH2- (CH2-CH2-0) 3-CH2-CH2-CH2) n- o - (CH2-CH2-CH2- (0-CH2-CH2) 3-CH2) -n donde n es 12 a 36. En particular, el Polímero tendrá de manera preferente cuando el polímero soluble en agua contenga cadenas de polímero que tiene unidades de repetición de óxido de polialquileno, tal como unidades de repetición de óxido de etileno, se prefiere que cada cadena tenga un peso molecular de entre aproximadamente 1500 y aproximadamente 42,000 Da y de manera preferente entre aproximadamente 2,000 a aproximadamente 20,000 Da que es lo más preferido. Un grupo U comprende una porción capaz de ligación química. Los polímeros preferidos se ramifican donde el grupo B comprende tres o más brazos . Un componente preferido J* comprende un grupo que es ionizable bajo condiciones fisiológicas y de manera más preferente uno que está negativamente cargado. Cualquiera o ambos de U y J pueden comprender un grupo protector que es capaz de ser removido sin dañar la integridad de la construcción. Los espaciadores o ligadores preferidos incluyen porciones lineales o ramificadas que comprenden una o más unidades de repetición empleadas en un polímero soluble en agua, unidades de diamino o de diácido, aminoácidos naturales o no naturales o derivados de los mismos, así como porciones alifáticas incluyendo alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, alcoxi, y similares, que contienen de manera preferente hasta 18 átomos de carbono o aun una cadena de polímero adicional. Como se señala anteriormente, el componente U es un residuo de un grupo funcional que es capaz de ser unido o estar unido a una molécula objetivo, que es un péptido o polipéptido, u otra superficie de interés. Cuando U es un residuo de un grupo funcional para la conjugación a una molécula objetivo U que comprende un grupo nucleófilo o un grupo electrófilo, y la molécula objetivo comprende un grupo electrófilo mutuamente reactivo o grupo nucleófilo, respectivamente . Muchos de estos grupos funcionales mutuamente reactivos se conocen y son capaces de la unión a los grupos funcionales de cadena lateral comunes a péptidos y polipéptidos , o grupos funcionales derivatizados de cadena lateral (Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry (1995) 6:150-165; ""Perspectives in Bioconjugate Chemistry1', C.F., Meares Ed., ACS, 1993; ^Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking" , S.S. Wong, Ed., C C Press, Inc. (1993)). Los ejemplos de estos grupos funcionales incluyen grupos capaces de reaccionar con un grupo amino tal como (a) carbonatos tal como p-nitrofenilo o succinimidilo ; (b) carbonxl-imidazol ; (c) azalactonas ,· (d) imida-tionas cíclicos; (e) isocianatos o isotiocianatos . Los ejemplos de grupos funcionales capaces de reaccionar con grupos de ácido carboxílico y grupos carbonilos reactivos incluyen (a) aminas primarias; o (b) hidrazina y grupos funcionales de idracina tal como acil-hidrazinas , carbazatos, semicarbamatos , tiocarbazatos , aminooxi, etcétera. Los grupos opcionales capaces de reaccionar con grupos mercapto o sulfhidrilo incluyen fenil-glioxales , maleimidas y halógenos. Los ejemplos de grupos funcionales capaces de reaccionar con grupos hidroxilo tal como ácidos (carboxílicos) , u otros nucleófilos capaces de reaccionar con un centro electrófilo, incluyen grupos hidroxilo, amino, carboxilo, tiol, metileno activo y similares. Por ejemplo, el polímero anterior se puede preparar para tener el componente U como un grupo funcional para lá unión a una molécula objetivo, donde el grupo funcional es acrilato, aldehido, cetona, aminooxi, amino, ácido carboxílico, éster, tioéster, halógeno, tiol, cianoacetato, dipalmitoilo-fosfatidil-etanol-amina, diestearoil-fosfatidiletanolamina, epóxido, hidrazina, azida, isocianato, maleimida, raetacrilato, carbonato de nitrofenilo, disulfuro de ortopiridilo, silano, sulfhidrilo, sulfotas de vinilo, glutarato de succinimidilo, succinato de succimidilo, ácido succínico, trisilato y similares. U también se puede proporcionar en una forma activable, por ejemplo, un ácido carboxílico que se puede convertir a un éster activo del mismo que es capaz de reaccionar con un nucleófilo tal como una amina. En una modalidad preferida, U es un residuo de un grupo funcional único que es selectivamente reactivo con un grupo funcional único en la molécula objetivo. Este aspecto de la invención incorpora los principios de la síntesis de péptidos (estrategias de grupos protectores) y ligación química (estrategias de grupos no protectores o parciales) como se analiza anteriormente en la sección II. De esta manera, U puede representar un residuo de un amplio intervalo de grupos funcionales, tal como aquellos descritos anteriormente . Los grupos U preferidos son tratables a las estrategias de captura de amina (por ejemplo, ligación por formación de hemiaminal, por formación de imina y por adición de Michael) , estrategias de captura de tiol (por ejemplo, ligación por formación de mercaptido, intercambio de disulfuro) , estrategias de ligación química nativa (por ejemplo ligación por intercambio de tioéster que comprende derivado de aminoácido de cadena lateral que contiene cisteína o tiol) o estrategias de acoplamiento de ligación ortogonal (por ejemplo, ligación por formación de tiazolidína, por intercambio de tioéster, por formación de tioéster, por intercambio de disulfuro y por formación de amida) (ver por ejemplo Coltart, DM. , Tetrahedron (2000) 56:3449-3491). Un U particularmente preferido comprende un residuo de un grupo funcional único empleado en una química de ligación química compatible, acuosa tal como se describe anteriormente en la sección II. Por consiguiente, U puede ser un grupo funcional capaz de formar un enlace o unión seleccionada del grupo que consiste de carbonato, éster, uretano, ortoéster, amida, amina, oxima, imida, urea, tiourea, tioéter, tiouretano, tioéster, éter, taizolidina, hidrazona, oxazolidina y similares. Los enlaces preferidos son enlaces de oxima y amida. Como se señala anteriormente, B es una porción de núcleo de ramificación que tiene tres o más brazos, y puede estar presente o ausente. Cuando B está presente, un brazo está unido a U o un espaciador o ligador unido a U y cada brazo diferente está unido a un Polímero o un espaciador o ligador unido a un polímero con U. Los ejemplos de núcleo de ramificación B incluyen de manera enunciativa y sin limitación, amino, amida, carboxílico y combinaciones de los mismos. Estos incluyen oligoamidas de lisina y similares, oligómeros preparados de alcanodiaminas y ácido acrílico ( "poliamidoaminas " ) , este último que proporciona una carga positiva neta en el núcleo de ramificación, (ver por ejemplo Zeng et al., J. Pept . Sci . (1996) 2:66-72; Rose et al., Bioconjugate Chem. , (1996) 7 (5) :552-556 ,- NovoBiochem Catalog and Peptide Synthesis Handbook, Laufelfingen, 2001; Wells et al., Biopolymers (1998) 47:381-396; Mahajan et al., (1999) 40:4909-49-12; Judson-et al. (19S8) 39: 1299-1302; Swali et al., (1997) 62:4902-4903; patentes de los Estados Unidos nos.: 5,932,462, 5,919,455, 5,643,575, 5,681,567). Se pueden usar muchos otros núcleos de ramificación diferentes y son adecuados para este propósito, incluyendo diaminas sustituidas, diácidos sustituidos, alquil-ácidos tal como porciones de glicerol y otras que tienen tres o más grupos funcionales o activables que incluyen porciones multivalentes de alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo y alcoxi y similares, y oligosacáridos (por ejemplo Nierengarten et al., Tetrahedron Lett . (1999) 40:5681-5684; Matthews et al., Prog. Polym. Sci. (1998) 1-56; Suner et al., Macromolecules (2000) 33:253; Fischer et al., Angew.

Chem. Int. Ed. (1999) 38:884; Sunder et al., Adv. Mater. (2000) 12:235; ulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38:631-634; Mulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38 rosóse ,- y Turnbull et al., Chembiochem (2000) 1(1): 70-74). El núcleo de ramificación más preferido enlazado al componente Polímero se une con enlaces de amida. Los núcleos de ramificación preferidos emanan de funcionalidades de amino, carboxílico o amino y carboxílico mezclados. Los ejemplos de núcleos de ramificación preferidos son núcleos de amino de lisina, núcleos de ramificación de ácido aspártico o glutámico, y núcleos de ramificación de ácido gamma-glutámico respec ivamente. Además, las construcciones preferidas de polímero ramificado son aquellas en las cuales la ramificación emana de un núcleo de ramificación individual, tal como un núcleo de oligoamida o poliamidoamina . Sin embargo, se pueden emplear otras clases de construcciones ramificadas, tal como estructuras tipo gusano en las cuales la ramificación emana de una secuencia de múltiples núcleos de ramificación distribuidos a lo largo de una estructura de polímero (Schlüter et al., Chem. Int. Ed. (2000) 39:864). Dependiendo de la composición química y/o la voluminocidad de la estructura de polímero y unidades de repetición, las estructuras resultantes de tipo gusano se pueden diseñar para ser solubles en agua y estar propensas para inducir organización cristalina líquida (Ouali et - al., Macromolecules (2000) 33:6185), que pueden ser ventajosas para aplicaciones de distribución, estabilidad y duración de acción. Como con las otras construcciones de polímero ramificado de la invención, las construcciones tipo gusano se hace que contengan un grupo funcional colgante que comprende U. El componente Polímero, o uno o más de los espaciadores o ligadores, puede incluir cadenas de polímero o ligadores interseparados o enlaces que son bioestables o biodegradables , por ejemplo como se analiza anteriormente en la Sección I . También como se señala anteriormente en la Sección I , el componente J* es un residuo del grupo colgante que tiene una carga neta bajo condiciones fisiológicas seleccionadas del grupo que consiste de negativa, positiva y neutral . Lo más preferido es donde J* comprende una porción de carboxilato ionizable y tiene una carga negativa neta bajo condiciones fisiológicas. Los componentes si, s2 y s3 son porciones espaciadoras y ligadoras que pueden ser las mismas o diferentes y pueden estar individualmente presente o ausentes, tal como aquellas analizadas en la selección I. De manera más preferente, el espaciador o ligador comprende una cadena ,de polímero, donde el espaciador o ligador comprende una o más unidades de repetición de la fórmula - [C0-X-C0-NH-Y-NH]n..

IV. Proteínas Bioactivas Sintéticas Preferidas Modificadas con Polímero de la Invención Como se señala anteriormente, las citocinas sintéticas modificadas con polímero y las citocinas quimiotácticas comprenden ejemplos particularmente preferidos de la invención. Las citocinas más preferidas son glicoproteinas . Muchas de estas citocinas son glicoproteínas e incluyen por ejemplo muchas de las interleucinas, interferones , factores de crecimiento, quimiocinas y similares. A manera de ejemplo, las citocinas tal como EPO, TPO, GCSF, G -CSF, IL-1, IL-2, IL-3 , IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IFa-IL, IF-?, LIL, IF-beta, factor de crecimiento de nervios y Rantes, y muchas otras quimiocinas son glicoproteínas y los sitos de glicosilación de estas y otras proteínas se conocen. La EPO es un ejemplo particularmente preferido de una proteína cuya secuencia de aminoácido se puede usar para ayudar en el diseño de una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero que tiene actividad que estimula la eritropoyesis . Los factores de estimulación de colonias y RANTES también comprenden ejemplos particularmente preferidos de proteínas cuya secuencia de aminoácidos se puede usar para ayudar en el diseño de una proteína bioactiva, sintética dentro del ámbito de la presente invención . La EPO es un factor principal responsable de la regulación de la producción de células sanguíneas rojas durante las condiciones de estado estable y para acelerar la recuperación de la masa de células rojas sanguíneas después de la hemorragia (Jelkmann, W. (1992) Physiol . Reviews 72: 449; Krantz, S.B. (1991) Blood 77:419; Porter, D.L. and M.A. Goldberg (1993) Exp. Hematol . 21:399; Nissenson, A.R. (1994) Blood Purif.. 12:6). La forma de circulación de la EPO humana es un glicoproteína de 165 aminoácidos (aa) con un peso molecular de aproximadamente 30,000 (Sawyer, S.T. et al. (1994) Hematol, Oncol . Clinics NA 8:895; Jacobs, K.J. et al. Nature (1985) 313:806; Lin, F-K. et al. Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. (1985) 82:7580). Aunque el ADN para la EPO predice de una molécula con 166 residuos de aminoácido, la arginina caboxi-terminal se remueve en una modificación pos-traduccional . Hay tres sitios potenciales para la glicosilación N-enlazada y todos están llenos. También está presente una porción de carbohidrato O-enlazada. Los efectos de · la glicosilación son complejos. Aunque la EPO derivada de E. coli no glicosilada muestra actividad biológica completa in vitro, la glicosilación es aparentemente necesaria para la activación completa in vivo. De esta manera, la EPO producida con E. coli y desglicolisada, derivada de forma natural muestra muy baja actividad en los estudios en animales (Krantz, S.B. (1991) Blood' 77:419; Sasaki, H. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:12059; Lowy, P.H. et al. (1960) Nature 185:102; Wojchwski, D.M. et al. Biochem. Biophys, Acta 910:224; Dordal, .S. et al. (1985) Endocrinology 116:2293).

Consistente con lo anterior, los patrones de glicosilación variables muestran efectos variables. Por ejemplo, la EPO desialilada exhibe tanto actividad mejorada in vitro como disminuida in vivo, un efecto atribuido a exposición de residuos de galactosa que se reconocen, unen y depuran por los hepatocitos (Spivak, J.L. y B.B. Hongans (1989) Blood 73v:90; Gold asser, E. et al. (1974) J. Biol . Chem. 249:4202). El patrón de ramificación de la EPO completamente sialilada también hace, una diferencia en la actividad biológica. La EPO ramificada, predominantemente de cuatro antenas muestra actividad equivalente a la EPO "norraal ' ' , en tanto que la EPO ramificada predominantemente de dos antenas muestra tres veces más actividad in vitro pero sólo 15% de la actividad normal in vivo (Tekeuchi, M. et- al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 86: 7819). Los estudios indican que sólo los azúcares -enlazados y no los O-enlazados son importantes en el funcionamiento de la EPO (Higuchi. M. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267(770319). En una modalidad particularmente preferida, las proteínas bioactivas sintéticas de la presente invención comprenden una proteína que estimula la eritropoyesis, sintética, modificada con polímero. Como se usa en la presente, una proteína que estimula la eritropoyesis en una proteína que media la producción de células sanguíneas rojas. La bioactividad de estimulación de la eritropoyesis de una proteína se puede determinar por cualquiera de una variedad de medios, tal como al seguir la eritropoyesis después de la administración in vivo, al valorar la capacidad de la proteína para mediar la proliferación de líneas de células dependiente de EPO, etcétera. Una proteína preferida que estimula la eritropoyesis es la EPO de mamífero de manera más preferente humana y sus análogos (ver, por ejemplo patentes de los Estados Unidos Nos. 5,856,298; 5,955,422; 8,888,772; 5,858,347; 5,614,184; 5,457,089; y 6,077,939; W00/32772) . La erítropoyetina se sintetiza y segrega de manera predominante por células endoteliales e intersticiales tubulares y juxtatubulares, capilares de riñon. La enfermedad crónica del riñon provoca la destrucción de las células productoras de- la EPO en el riñon. La carencia resultante de la EPO induce f ecuentemente anemias. El uso crónico principal de la EPO por lo tanto es el tratamiento de pacientes con insuficiencia severa del riñon (hematocritos por abajo de 0.3) quienes usualmente también reciben transfusiones así como el tratamiento de pacientes anémicos después de la quimioterapia. Típicamente, la EPO se sintetiza de manera recombinante en células de ovario de hámster para uso clínico. La EPO es una proteína ácida (pl=4.5) estable a calor y pH, relativa de 165 residuos de aminoácidos en su forma natural. La EPO transmite su actividad a través del receptor de la EPO. Aproximadamente 40 por ciento de la masa molecular de la EPO es debido a su glicosilación. La glicosilación es un factor importante que determina el comportamiento farmacocinético de la EPO in vivo. La EPO no glicosilada tiene una vida media biológica extremadamente corta. Aun se une a su receptor y puede aun tener una mayor actividad especifica in vitro. Sin embargo, experimentos recientes han mostrado que la PEGilación de la EPO mejora significativamente su tiempo de vida, pero disminuye significativamente la actividad de la EPO en un sistema de ensayo basado en células . Las proteínas sintéticas que estimulan la eritropoyesis (" SEPM) de la presente invención son análogos sintéticos preferentemente modificados con polímero de la EPO urinaria, humana. En una modalidad preferida, contienen una o más porciones de polímero (de manera más preferente porciones de pPEG) unidas a uno o más residuos de péptido a través de un enlace de tioéster, oxima, amida, u otro. En una modalidad altamente preferida, estos enlaces estarán en una o más de las posiciones que se glicosilan de forma natural en la EPO urinaria, humana (es decir, posiciones 24, 38, 83 y 126) . De manera más preferente, las moléculas de SEP tendrán porciones de pPEG en dos o más de estas posiciones. En una modalidad alternativa, otros residuos de proteína se pueden modificar por las porciones de polímero.

Las posiciones de modificación para las proteínas bioactivas, sintéticas de la presente invención incluyen residuos localizados en una asa desordenada, región o dominio de la proteina o en o cerca de sitios de escisión potencial por proteasas . Por ejemplo, las modificaciones con polímero se pueden introducir en una o más posiciones de 9, 69 y/o 125 de la EPO. El peso molecular total de las moléculas de SEP de la presente invención puede variar de aproximadamente 25 a aproximadamente 150 kDa, y de manera más preferente de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 kDa. El peso molecular se puede controlar al incrementar o disminuir el número de estructuras del polímero (tal como pPEG) utilizado para la modificación de un análogo dado. El peso molecular hidrodinámico mediado por pPEG para las construcciones más grandes en mayor de aproximadamente 100 kDa. Los ensayos in vivo en células que expresan el receptor de la EPO humana indican que las SEP de la presente invención tienen una ED50 que es equivalente a aquella de la EPO humana, glicosilada, recombinantemente producida. Los análogos de pPEG enlazados a oxima se construyen de manera preferente al unir un pPEG con grupos funcionales aminooxi, cetona o aldehido a la proteína SEP en un aminoácido no codificado de forma natural que tiene una funcionalidad de aminooxi, cetona o aldehido de cadena natural. Por ejemplo, las posiciones 89 y 117 de SEP-0 y 1 contienen pseudoglutamatos (un aminoácido no codificado de forma natural que tiene una cadena lateral de la fórmula -CHa-CH2-S-C!OOH (en comparación a la cadena lateral de glutamato -CHa-CH2-CH2-COOH) ) . Los análogos de SEP que utilizan enlaces de tioéter se construyen de manera preferente para contener una funcionalidad de tiol proporcionada por un aminoácido de cisteína o no natural con una cadena lateral que tiene el tiol. La Figura 10 representa la estructura básica de un tipo de la proteina sintética preferida que estimula la eritropoyesis . En una modalidad alternativa las moléculas de SEP de la presente invención pueden comprender análogos de EPO "circularmente permutados" en los cuales los términos amino y carboxi naturales de la EPO se han recolocado . De manera más preferente, esta recolocación moverá los términos amino y carboxi a posiciones de menor restricción estructural, tal como asas desordenadas, etcétera. La asa desordenada al alrededor de las posiciones 125 y 126 (con relación al sistema de numeración de residuos de EPO nativos) es un ejemplo de este sitio de recolocación. De manera más preferente, estas SEP estarán libres de disulfuro y se modificarán químicamente para contener porciones de polímero en residuos preseleccionados . De manera alternativa, las moléculas de SEP pueden tener términos amino y carboxi recolocados a un sitio de glicosilación que se presenta de manera natural u otros sitios tratables a la glicosilación, tal como la posición 125 y 126. Las moléculas de SEP también pueden incluir modificaciones del término amino carboxi para eliminar o modificar la carga (tal como por amidación con carboxi, etcétera) . En un ejemplo preferido de estas moléculas circuíármente permutadas, los nuevos N- y C-términos se proporcionan por las posiciones 125 y 126, respectivamente. Las cisteínas naturales que forman disulfuro en las posiciones 7, 29, 33, y 161 se reemplazan de manera preferente por el aminoácido no codificado de manera natural, ácido L-a-N-butírico (Aba) que no puede formar puente de disulfuro. Los residuos K.166. E37 y V82 se reemplazan de manera preferente con alanínas para mejorar la producción. También, se inserta de manera preferente una cisteína adicional entre las posiciones 1 y 166 con relación al esquema de números de EPO nativa, que se numera tan abajo como "0" . La molécula resultante contiene cuatro cisteínas (de las posiciones 126, 0, 38, y 83 (como se lee en la dirección N- a C-terminal) ) , que se utilizan como (1) sitios de ligación y (2) sitios de unión a pPEG de formación de tioéter. Opcionalmente , una cisteína puede remplazar A125 para proporcionar un sitio adicional de unión de pPEG. El peso molecular total de estas moléculas de SEP de la presente invención puede variar desde aproximadamente 25 a aproximadamente 150 kDa, de manera más preferente de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 kDa. El peso molecular puede controlar al incrementar o disminuir el número y estructura del polímero (tal como pPEG) utilizado para la modificación de un análogo dado. El peso molecular hidrodinámico mediado por pPEG para las construcciones más grandes es mayor de 100 kDa. Se localizan sitios opcionales de unión de pPEG en las posiciones 125, 9 y 24 (como se lee en la dirección N- a C-terminal) . Los diseños adicionales de análogos de SEP tienen N- y C-términos alternativos en la región de asa desordenada y/o residuos truncados para los nuevos N- y/o C-términos. La estructura básica de las moléculas preferidas circularmente permutadas se muestra en la Figura 11. · Por ejemplo, se diseñó una secuencia al permutar circularmente la secuencia nativa de la EPO humana de la siguiente manera: la Ala1 N-terminal y la Arg156 C-terminal naturales se unieron por un residuo adicional de Cys, dando de esta manera un polipéptido de 167 aminoácidos, las nuevas N- y C-terminales se crearon al desunir la cadena en los residuos 125-126 de la secuencia nativa; todos los residuos nativos ' de Cys se reemplazaron con residuos de ácido L-D amino-n-butírico; y se hicieron las siguientes sustituciones: Glu37Ala; Asn38Cys; Val82Ala; Ans83Cys; Serl26Cys; Argl66Ala (todos los números de residuos se basan - en la secuencia nativa de la EPO humana) . Con untamente, estos elementos de diseño dan por resultado la secuencia de aminoácidos de SEP-5 como se muestra. La proteína SEP-5-L28 se modificó con polímero en los residuos de Cys 126, 0, 24, 38 y 83 (la numeración se basa en la secuencia de la EPO humana) con una construcción de polímero de (TTD-Succ)6 carboxilato lineal, modificado con maleimida, por una reacción de adición de Michael . Estos cambios se diseñaron para mejorar la síntesis y manejo de la proteína SEP-5-L28. La secuencia diseñada se elaboró a partir de cuatro segmentos de · péptido, cada uno con un residuo Cys N- terminal . Los sitios de ligación química fueron Cys0, Cys38, Cys83. Se sintetizaron péptidos donde el péptido C-terminal fue un -carboxilato; los otros tres péptidos fueron tioésteres, y los residuOs Cys N-terminales dé esta manera estuvieron protegidos con Acm de la cadena lateral . Cys24 no está protegido en la cadena lateral. Los segmentos se unieron secuencialmente por ligación química nativa, iniciando con los dos segmentos C-terminales . Después de la ligación, la cadena lateral Cys libre en el sitio de ligación se hizo reaccionar con la construcción de polímero de (TTD-Succ)s carboxilato lineal modificada con maleimida, por una reacción de adición de Michael, entonces el grupo protector Acm de cadena lateral de Cys se removió y la ligación del próximo segmento y la modificación con polímero se realizó de manera similar. Después de la remoción del grupo Acm, la ligación del próximo (cuarto) segmento se realizó, el grupo Acm final se removió y se realizó la modificación con polímero de manera similar dando la construcción de SEP modificada con polímero, circularmente permutada, descrita anteriormente, mostrada en la Figura 38. En una modalidad alternativa, las proteínas bioactivas, sintéticas de la presente invención son un C-GSF de mamífero, de manera más preferente humana. El G-CSF induce la rápida proliferación y liberación de granulocitos neutrófilos a la corriente sanguínea, y proporciona de este modo efecto terapéutico en el combate de la infección. La proteína humana de G-CSF es de 174 aminoácidos de longitud (Patente: EP 0459630 (Cambie, R. et al.), y se han aislado variantes de su secuencia. (Ver por ejemplo, patentes de los Estados Unidos Nos. 6,004,548; 4,810,643; 5,218,092; 5,214,132; 5,416,195; y 5,580,755) . La proteína tiene cuatro residuos de cisteína y un sitio de O-glicosilación en la posición 133 de treonina. En una modalidad de estas moléculas sintéticas de G-CSF, la secuencia de aminoácidos de la molécula se puede alterar, con relación a la secuencia de la G-CSF nativa para contener residuos hidrófobos, naturales o de manera más preferente, no naturalmente codificados en una o más de las posiciones 1, 2, o 3. Opcionalmente , estas moléculas se modificarán adicíonalmente para contener un residuo hidrófobo, natural o de manera más preferente no naturalmente codificado en la posición 5 de G-CSF, y/o en las posiciones 173 y/o 174. En una modalidad preferida, adicional, las moléculas sintéticas de G-CSF se modificarán con polímero (de manera preferente pPEG) en una o más de las posiciones 63, 64, y/o 133 y/o en una o más de las posiciones 1 y 174. Los polímeros de pPEG pueden ser lineales o ramificados, cargados, sin carga o mezclados; y pueden tener un intervalo de peso molecular de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 kDa y de manera más preferente, una distribución de PM total de pPEG de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 kDa dependiendo del número y estructura de pPEG utilizados para la- modificación. El radio hidrodinámico exhibe un efecto mayor de PM in vivo (por ejemplo, un pPEG ramificado de 10 kDa exhibe un PM efectivo de aproximadamente 55 kDa) . El PM hidrodinámico mediado por pPEG estimado es mayor de 100 kDa. Para análogos que utilizan enlace de oxima el pPEG se une de manera preferente a residuos no naturalmente codificados que tienen una funcionalidad aminooxi, cetona, o aldehido en la cadena lateral. Para análogos que utilizan enlace de tioéster, el pPEG se une de manera preferente a un aminoácido no natural o de cisteína con una cadena lateral que tiene un tiol. Para análogos que utilizan un enlace de amida, el pPEG se une a un aminoácido no natural o natural que tiene una amina reactiva de cadena lateral. La estructura básica de las proteínas bioactivas, sintéticas de G-CSF se muestra en la Figura 12. La Figura ""J designa un residuo no naturalmente codificado que tiene una cadena lateral hidrófoba. La bioactividad de estas proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de G-CSF se puede valorar por medios convencionales tal como al evaluar su capacidad para mediar la proliferación de una línea de células de ratón o de humano dependientes del factor (por ejemplo línea de células NFS60) , o al medir la estimulación de neutrófilos, vida media e inmunogenicidad in vivo, ya sea con o sin un sistema de distribución que tiene como objetivo una vida media/liberación mayor a 20 días) . En una modalidad alternativa, las proteínas bioactivas, sintéticas de la presente invención son una quimiocina, humana, de manera más preferente humana, RANTES. RANTES bloquea la entrada de las cepas de HIV M-trópicas a través del receptor primario CCR5, y también modula descendentemente las rutas de inflamación comprendidas en asma, rechazo al transplante y curación de heridas (Kalinkovich A, et al., Immunol Lett . (1999) 68:281-287). Las moléculas sintéticas de RANTES de la presente invención difieren de manera preferente de la quimiocina de RANTES al estar químicamente modificadas tal que: (1) la serina N-terminal encontrada en la posición 1 de RANTES 1-68 está sustituida con un grupo n-nonanoilo ( " NY ); y (2) la tirosina en la posición 3 está sustituida con un aminoácido no naturalmente codificado que tiene una cadena lateral hidrófoba . Se ha encontrado que estos compuestos son extremadamente potentes, poseyendo ED50 en el intervalo de pM, en comparación al intervalo de mM para " et-RANTES 1-68 ' ' recombinante . Se han creado análogos potentes de RANTES que tienen uno o más cambios adicionales a aquellos señalados anteriormente, tal como el reemplazo de la prolina en la posición 2 con un aminoácido no naturalmente codificado que tiene una cadena lateral hidrófoba y por la unión de un ácido graso al C-término de la molécula. Se ha mejorado la especificidad al receptor en combinación con la potencia por modificaciones a la región de N-asa que corresponde a los residuos 12-20 de RANTES. En una modalidad preferida, adicional, las moléculas sintéticas de RANTES de la invención incorporan una porción de polímero (tal como pPEG, o nonanoilo ("NNY1') o ?3? en su N- o C-término para mejorar inter alia la vida media in vivo. La porción pPEG se une de manera preferente a través de un enlace de oxima a un aminoácido no naturalmente codificado que se introduce en la posición 66, 67, 68 o ligador en la posición 68, con preferencia a la posición 67, que es una región responsable para la región de agregación. El ácido graso se une de manera preferente a través de un enlace de oxima (de manera preferente a través de un ligador) - al residuo 68, tal como un ligador de di- o tri-péptido de aminoácido modificado con amino-oxi. Se pueden emplear de manera alternativa otras químicas de unión. El peso molecular de las construcciones más grandes de los análogos sintéticos de RANTES varía desde aproximadamente 25 kDa a aproximadamente 45 kDa dependiendo de la naturaleza y estructura de la unión de pPEG y para las construcciones más grandes tienen un PM hidrodinámico, mediado por pPEG de más de 60 kDa. La estructura de los análogos sintéticos, preferidos de RANTES se muestra en la Figura 13.

V. Productos Farmacéuticos Las proteínas bioactivas sintéticas modificadas con polímero de la presente invención se pueden emplear con agentes farmacéuticos para efectuar el tratamiento de enfermedades y condiciones. De manera más preferente, cuando se administran a un paciente o individuo en necesidad de la terapia, ' estos polipéptidos y/o proteínas bioactivas, sintéticas se administrarán usando un sistema de distribución de f rmacos. El uso de este sistema permite que un fármaco esté presente en un paciente de una manera que sea aceptable para los mismos y mejore la efectividad de la bioactividad deseada. Los propósitos de la presente invención, sistemas preferidos de distribución de fármacos incluyen sistemas capaces de administrar polipéptidos o proteínas incluyen las rutas oral, nasal u inhalación, o de manera intramuscular, subcutánea, transdérmica intravenosa, intraural o intraocular. Estos sistemas de distribución de fármacos pueden incluir formulaciones que proporcionen generación específica del sitio, o que mejoren la protección para la mucosa intestinal. Las formulaciones adecuadas incluyen: formulaciones en polvo seco, distribución vía encapsulación de partículas virales, encapsulación de liposomas, parches transdérmicos , transporte eléctricamente ayudado (terapia de eletroporación) y conjugación de polímero/niazona. En una modalidad preferida, estos dispositivos de distribución de fármacos responderán a cambios en el ambiente biológico y distribuirán o cesarán de distribuir, fármacos en base a estos cambios . Se ha empleado un intervalo de materiales para controlar la liberación de fármacos y otros agentes activos: poli (uretanos) , poli (siloxanos) , poli (metil-metacrilato) , poli (alcohol vinílico) para hidrofilicidad y concentración, poli (etileno) , poli (vinil-pirrolidona) , poli (2-hidroxi-etil-metacrilato) , poli (n-vinil-pirrolidona) , poli (metil-metacrilato) , poli (alcohol vinílico) , poli (ácido acrílico) , poliacrilamida, poli (etilen-co-vinil-acetato) , poli (etilenglicol) , poli (ácido metacrílico) , etcétera. En una modalidad preferida, adicional, se emplearán polímeros biodegradables para facilitar la distribución del fármaco. Estos polímeros incluyen poliláctidos (PLA) , poliglicólidos (PGA) , poli (láctido-co-glicólidos) (PLGA) , polianhídridos, y poliortoésteres . Los dispositivos de distribución de fármacos y métodos para su uso se describen en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,072,041; 6,041,253; 6,018,678; 6,017,318; 6,002,961; 5,879,712; 5,849,331; 5,792,451; 5,783,212; 5,766,633; 5,759,566; 5,690,954; 5,681,811; 5,654,000; 5,641,511; 5,438,040; 4,810,499; y 4,659,558. Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas y métodos para tratar un mamífero en necesidad del mismo al administrar cantidades terapéuticamente efectivas de compuestos que comprenden las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Por ""sal farmacéuticamente aceptables1' se propone que signifique una sal que retiene la efectividad biológica y propiedades de los polipéptidos de la invención y que no sean biológicas o de otra manera indeseables. Las sales se pueden derivas de ácidos o bases. Las sales de adición de ácido se derivan de ácidos inorgánicos tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico (que dan sales de sulfato y bisulfato) , ácido nítrico, ácido fosfórico y similares y ácidos orgánicos tal como ácido acético, ácido propionico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido salicílico, ácido, p-toluenosulfónico y similares. Las sales de adición de base se pueden derivar de bases inorgánicas, incluyendo sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen aquellas formadas de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas sustituidas que se presentan de forma natural, y aminas cíclicas incluyendo isopropilamino, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol , trometamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaina, etilendiamina, glucosamina, N-alquilglucaminas , teobrorao, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, y similares. Las bases orgánicas preferidas son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, piperidina, trometamina y colina. El termino ""tratamiento 1 ' como se usa en la presente cubre cualquier tratamiento de alguna enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (i) prevenir que la enfermedad se presente en un sujeto que puede estar predispuesto en la enfermedad pero aun no se ha diagnosticado como que la tiene,- (ii) inhibir la enfermedad, es decir detener su desarrollo; o (iii) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad . Por el termino ""un estado de enfermedad en mamíferos que se previene o alivia por tratamiento con un antagonista o agonista de proteína 11 como se usa en la presente se proponen cubrir todos los estados de enfermedad que se reconocen en general en la técnica que se tratan de forma útil con inhibidores de proteína en general y aquellos estados de enfermedad que se han encontrado que se previenen o alivian de manera útil por tratamiento con' los compuestos específicos de la invención. Estos incluyen a manera de ilustración y no limitación, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, enfermedades virales, ateroma/aterosclerosis , artritis reumatoide y rechazo de transplante de órgano . Como se usa en la presente, el término ""cantidad terapéuticamente efectiva'1 se refiere a aquella cantidad de una proteína bioactiva, sintética o modificada con polímero que, cuando se administra a un mamífero en necesidad del mismo, es suficiente para efectuar el tratamiento (como se define anteriormente) por ejemplo, como una gente antiinflamatorio, agente anti-asmático, un agente inmunosupresor, o un agente de enfermedad anti-autoinmunitaria para inhibir la infección viral en mamíferos. La cantidad que constituye una ""cantidad terapéuticamente efectiva'1 variará dependiendo del derivado de proteína, la condición o enfermedad y su severidad y el mamífero que se trate, su peso, edad etcétera, pero se puede determinar por rutina por un experto en la técnica con respecto al conocimiento contemporáneo y a esta descripción. Como se usa en la presente, el termino ""c.s.1' significa adicionar una cantidad suficiente para lograr una función señalada, por ejemplo, llevar una solución a un volumen deseado (por ejemplo, 100 mL) . Las proteínas bioactivas, sintéticas, modificadas con polímero de esta invención y sus sales farmacéuticamente aceptables, es decir, el ingrediente activo se administra a una dosis terapéuticamente efectiva, es decir, aquella cantidad que, cuando se administra un mamífero en necesidad de la misma, es suficiente para efectuar el tratamiento como se describe anteriormente. La administración de las proteínas bioactivas, sintéticas descritas en la presente puede ser vía cualquiera de los modos aceptados de administración para agentes que sirvan para utilidades similares.' Como se usa en la presente, los términos ""proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de esta invención'1, ""sales farmacéuticamente aceptables de los polipéptidos de la invención'1 y ""ingrediente activo1' se usan de manera indistinta. El nivel de las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero en una formulación puede variar dentro del intervalo amplio empleado por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, de aproximadamente 0.0.1 por ciento en peso (% en peso) a aproximadamente 99.99% en peso del antagonista o agonista de la proteína en base a la formulación total y de aproximadamente 0.01% en peso a 99.99% en peso de excipiente. De manera más típica, las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero se presentarán a un nivel de aproximadamente 0.5% en peso a aproximadamente 80% en peso. En tanto que los niveles de dosis en humanos aun no se han optimizado para las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención, en general, la cantidad de compuesto administrado será dependiente, por supuesto, del sujeto y el estado de enfermedad buscado como objetivo para la prevención o alivió, la naturaleza o severidad de la aflicción, la manera y programa de administración y el juicio del facultativo. Esta optimización de uso está bien dentro del ámbito de aquellos expertos en la técnica. La administración puede ser vía cualquier ruta sistémica o local aceptada, por ejemplo, vía ruta parenteral , oral (particularmente para formulaciones de infante) intravenosa, nasal, inhalación bronquial (es decir, formulación en aerosol) , transdérmica o tópica, en la forma de formas de dosis sólidas, semisólidas o líquidas o en aerosol, tal como por ejemplo, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, líquidos, soluciones, emulsiones, suspensiones inyectables, supositorios, aerosoles y similares. Las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención también se pueden administrar en las formas de dosis de liberación sostenida o controlada incluyendo inyecciones de depósito, bombas osmóticas, pildoras, parches transdérmicos (incluyendo electrotransporte) · y similares, para la administración prolongada del polipéptido a una velocidad predeterminada, de manera preferente en formas de dosis unitarias adecuadas para la administración individual de dosis precisas. Las composiciones incluirán un portador o excipiente farmacéutico convencional y una antagonista o agonista de proteína de la invención y además, pueden incluir otros agentes médicos, agentes farmacéuticos, portadores, adyuvantes, etcétera. Se pueden seleccionar portadores de los varios aceites, incluyendo de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua, solución salina, dextrosa acuosa y glicoles son portadores líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables . Los portadores f rmacéuticos adecuados incluyen almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propilenglicol , agua, etanol y similares. Otros portadores farmacéuticos adecuados y sus formulaciones describen en ""Remington 1 s Pharmaceutical Sciences1' por E. W. Martin. Si se desea, la composición farmacéutica que se va a administrar ' también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no toxicas tal como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores del pH similares tal como por ejemplo acetato de sodio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, etcétera. Aunque se puede requerir más del ingrediente activo, se puede usar la administración oral para distribuir las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención usando un régimen de dosis diario conveniente, que se puede a ustar de acuerdo al grado de prevención deseado o al alivio de la aflicción. Para esta administración oral, una composición no tóxica, farmacéuticamente aceptable se forma mediante la incorporación -de cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tal como por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, povidona, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, cross-carmelosa sódica, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas dispersables, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. Las formulaciones orales son particularmente adecuadas para el tratamiento de trastornos gastrointestinales. La biodisponibilidad oral para propósitos sistémicos generales se puede ajustar al utilizar excipientes que mejoren la captación a la circulación sistémica, tal como la formulación que comprende aminoácidos acetilados . Ver, por ejemplo patentes de los Estados Unidos Nos. 5,935,601 y 5, 629, 020. Las composiciones pueden tomar la forma de una cápsula, pildora o tableta y de esta manera la composición contendrá, junto con el ingrediente activo, un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato de dicalcio y similares; un desintegrante tal como cross-carmelosa sódica, almidón o derivados de los mismos; un lubricante tal como estearato de magnesio y similares; y un aglutinante tal como un almidón, polivinilpirrolidona, goma de acacia, gelatina, celulosa y derivados de los mismo y similares. Las composiciones líquidas farmacéuticamente administrables se pueden preparar, por ejemplo al disolver, dispersar, etcétera, una proteína bioactiva, sintética, modificada con polímero de la invención (aproximadamente 0.5% a aproximadamente 20%) y adyuvantes farmacéuticos, opcionales en un portador tal como por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, gliceroles, glicoles, etanol , conservadores y similares, para formar de este modo una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica que se va administrar puede contener también cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tal como agentes humectantes, agentes de suspensión, agentes de emulsión o agentes solubilizantes , agentes amortiguadores del pH y similares, por ejemplo acetato de sodio, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, polioxietileno, monolaurato de sorbitan o estearato, etcétera. Los métodos reales para preparar las formas de dosis se conocen, o serán evidentes para aquellos expertos en la técnica; ver por ejemplo Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania . La composición o formulación que se va a administrar contendrá en cualquier caso una cantidad del ingrediente activo en una cantidad efectiva para prevenir o aliviar los síntomas del sujeto que se trate. Para la administración oral a infantes, se prefiere una formulación liquida (tal como un jarabe o suspensión) . Para una forma de dosis sólida que contiene líquido, la solución o suspensión, en por ejemplo carbonato de propileno, aceites vegetales o triglicéridos , se encapsula de manera preferente en una cápsula de gelatina. Para una forma de dosis líquida, la solución, por ejemplo en un polietilenglicol , se puede diluir con una cantidad suficiente de un portador líquido f rmacéuticamente aceptable, por ejemplo, agua, que se va a medir fácilmente para la administración. De manera alternativa, se pueden preparar formulaciones orales líquidas o semisólidas al disolver o dispersar el ingrediente activo en aceites vegetales, glicoles, triglicéridos, ésteres de propilenglicol (por ejemplo carbonato de propileno) y similares y encapsular estas soluciones o suspensiones en envolturas de cápsula de gelatina- dura o suave . Al aplicar las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de esta invención al tratamiento de las condiciones anteriores, la administración de los ingrediente activos descritos en la presente se administran de manera preferente de forma parenteral . En general, la administración parenteral se caracteriza por inyección, ya sea subcutánea, intramuscular o intravenosa y puede incluir inyecciones intradérmicas o peritoneales así como técnicas de infusión o inyección intraesternal . Se pueden preparar soluciones inyectables en formas convencionales ya sea como soluciones líquidas o suspensiones, formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión del liquido antes de la inyección, o como emulsiones de o en microesferas basadas en polímero biocompatible (por ejemplo, liposomas, derivados de polietilenglicol , poli (D, C) láctido y similares). Los excipientes adecuados son por ejemplo agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares. Además, si se desea las composiciones farmacéuticas que se van a administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tal como agentes humectantes o de emulsión, agentes- amortiguadores del pH, mej oradores de la solubilidad, portadores de proteínas y similares tal como por ejemplo, acetato de sodio, polioxietileno, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, ciclodextrinas, albúmina sérica, etcétera. Las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la presente invención se pueden administrar de manera parenteral, por ejemplo, al disolver el compuesto en un solvente adecuado (tal como agua o solución salina) o por incorporación en una formulación liposómica seguida por la dispersión en un fluido de infusión, aceptable. Una dosis diaria típica de un polipéptido de la invención se puede administrar por una infusión, o por una serie de infusiones separadas en intervalos periódicos. Para la administración parenteral , son especialmente adecuadas las soluciones acuosas de un ingrediente activo en forma soluble en agua, por ejemplo, en la forma de una sal soluble en agua, o suspensiones de inyección, acuosas que contienen sustancias que incrementan la viscosidad, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano y si se desea, estabilizadores. El ingrediente activo conjuntamente de forma opcional con excipientes, también puede estar en la forma de un liofilisado y se puede elaborar en una solución, antes de la administración parenteral, mediante la adición de solventes, adecuados. Un planteamiento más recientemente contemplado para la administración parenteral emplea la implantación de un- sistema de liberación lenta o liberación sostenida, tal que se mantenga un nivel constante de dosis. Ver por ej.emplo US 3,710,795, US 5,714,166 y 5,041,292, que se incorporan de este modo como referencia. El por ciento del ingrediente activo contenido en las composiciones para parenterales es altamente dependiente de la naturaleza específica del mismo, asi como de la actividad del polipéptido y las necesidades del sujeto. Sin embargo, los porcentajes del ingrediente activo de 0.01% a 10% en solución son empleables, y serán mayores si la composición es un sólido que se diluirá subsiguientemente a los porcentajes anteriores. De manera preferente, la composición comprenderá 0.02-8% del ingrediente activo en solución . Otro método para administrar las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de la invención utiliza tanto una inyección de bolo como una infusión continua. La administración de un aerosol es un medio efectivo para distribuir las proteínas bioactivas, sintéticas, modificadas con polímero de la invención directamente al tracto respiratorio. Algunas de las ventajas de este método son: 1) evade los efectos de la degradación enzimática, absorción pobre del tracto gastrointestinal, o pérdida del agente terapéutico debido al efecto hepático de primera pasada; 2) administra los ingredientes activos que de otro modo fallarían en alcanzar sus sitios objetivo en el tracto respiratorio debido a su tamaño molecular, carga o afinidad a sitios extrapulmonares ; 3) proporciona absorción rápida en el cuerpo vía los alvéolos de los pulmones, y 4) evita la exposición a otros sistemas de órganos al ingrediente activo, que es importante donde la exposición pueda provocar efectos laterales indeseables. Por estas razones, la administración en aerosol es particularmente ventajosa para el tratamiento de asma, infecciones locales del pulmón, y otras enfermedades o condiciones de enfermedad del pulmón y tracto respiratorio. Hay tres tipos de dispositivos f rmacéuticos de inhalación, nebulizadores, inhaladores, inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvos secos. Los dispositivos nebulizadores producen una corriente de aire de alta velocidad que provoca que el derivado de proteína (que se ha formulado en un forma líquida) se rocié como neblina que se transporta en el - tracto respiratorio del paciente. Típicamente los inhaladores de dosis medida tienen la formulación empacada con un gas comprimido y en el accionamiento, descargan una cantidad medida del polipéptido por gas comprimido, dando de esta manera un método confiable para administrar una cantidad establecida del agente. Los inhaladores de polvo seco administran el polipéptido en la forma de un polvo fluido que se puede dispersar en la corriente aérea del paciente durante la respiración por el dispositivo. A fin de lograr un polvo fluido, el derivado de proteína se formula con un excipiente tal como lactosa. Se almacena una cantidad medida del derivado de proteína en una cápsula y se distribuye al paciente con cada accionamiento. Todos los métodos anteriores se pueden usar para administrar la presente invención. Las formulaciones farmacéuticas basadas en liposomas también son adecuadas para el uso con las proteínas bioactivas, sintéticas modificadas con polímero de esta invención. Ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 5,631,018, US 5,723,147 y 5,766,627. Los beneficios de los liposomas se cree que están relacionados a cambios favorables en la distribución en tejido y parámetros farmacocínéticos que resultan del atrapamiento en los liposomas de los fármacos, y se pueden aplicar a los polipéptidos de la presente invención por aquellos expertos en la técnica. También se pueden usar formulaciones farmacéuticas, líquidas, liposómicas, de liberación controlada para la administración oral o por inyección. Para la administración sistémica vía supositorio, los aglutinantes y portadores tradicionales incluyen, por ejemplo, polietilenglicoles o triglicéridos , por ejemplo, PEG 1000 (96%) y PEG 4000 (4%) . Estos supositorios se pueden formar de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de aproximadamente 0.5% p/p a aproximadamente 10% p/p; de manera preferente de aproximadamente 1% p/p a aproximadamente 2% p/p. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente como referencia al mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara de manara específica e individual para ser incorporada por referencia. El análisis de los antecedentes de la invención en la presente, se incluyen para explicar en contexto de la invención. Esto no se va a tomar como una admisión que cualquier material referido que se publicó, se conoce o es parte de la técnica anterior o del conocimiento general común donde quiera en el mundo como la fecha de prioridad de cualquiera de las reivindicaciones. Ahora, viendo descrito en general la invención, la misma se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a la manera de ilustración y no se proponen para limitar la presente invención, a menos que se especifique.

EJEMPLOS Abreviaciones Acm = grupo protector de acetamidometil-tiol [es decir -CH2NHC0CH3] AoA = aminooxiacetilo Arg(Tos) = L-arginina (cadena lateral protegida con IÑ^toluenosulfonilo) ART = cuenta absoluta de reticulocitos Asp(cHex) = ácido L-aspártico (cadena lateral, protegida con éster ciclohexílico) AUC = área bajo la curva Boc - ter-butoxicarbonilo CD = dicroísmo circular CDI = carbonildiimidiazol CHO = ovario de hámster chino CL = depuración (mL/hr/kg) Cmax = concentración máxima Cys(4MeBzl) = L-cisteína (cadena lateral, protegida con (4-metil) bencilo) Cys (Acm) = L-cisteína (cadena lateral, protegida con acetamidometilo [es decir -CH2 HCOCH3] - ) DCM = diclorometano DIC = diisopropilcarbodiimida DIEA = diisopropiletilamina DMF = dimetilformamida DMSO = dimetilsulfóxido DPC = dodecilfosfocolina Dpr = ácido L-1 , 2-diaminopropióni o ED50 = dosis efectiva requerida para alcanzar 50% de efecto máximo EDA = (4, 7, 10) -trioxatridecano-1, 13-diamina ELISA = immunoensayo enlazado a enzimas EPO = eritropoyetina ES-MS = espectrometría de masas con ionización por electroróciado FBS = suero bovino fetal Glu(cHex) = ácido L-glutámico (cadena lateral, protegida con éster ciclohexílico) GM-CSF = factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos HATU = 0- (7-azabenzotriazol-l-il) -1, 1,3, 3-tetrametilamonio hexafluorofosfato HCT = hematocrito HGB = hemoglobina His (Dnp) = L-histidina (protegida con NImdinitrofenilo) HOBT = N-hidroxibenzotriazol HPLC = cromatografía líquida de alta presión I DM = medio de Dulbecco modificado con Iscove IPA = isopropanol Lev = ácido levulinico Lys (ClZ) = L-lisina (cadena lateral, protegida con 2-clorobenciloxicarbonilo) MBHA = 4-metilbenzhidrilamina MRT = tiempo promedio de residencia MTT = 4-metilTritilo MTT = azul de tiazolilo HS = N-hidroxisuccinimida -OCH2-Pam-resina = -0-CH2-Bz-CH2CONHCH2 (copoliestireno-divinilbenceno) -resina Pbo = 4- (CH3S (0) -)bencilo PBS = solución salina amortiguada con fosfato PCV = volumen celular empacado RBC = células sanguíneas rojas RET = reticulocito rhEPO = EPO humana, recombinante RSA = albúmina de suero de vaca SDS = dócil-sulfato de sodio SDS-PAGE = electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida Ser(Bzl) = L-serina (cadena lateral, protegida con bencilo) Código de letra individual para aminoácidos: A = alanina,- C = cisterna; D = ácidos aspártico; E = ácido glutámico; F = fenilalanina; G = glicina; H = histidina; I = isoleucina; K = lisina; L = leucina; M = metionina; N = asparagina; P = prolina; Q = glutamina; R = arginina; S = se- rina; T = treonina; V = valina; W = triptofan; Y = tirosina SPPS = síntesis de péptido en fase sólida gradual Succ = succinilo [es decir, -COCH2CH2CO-] TCEP = clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina TFE = 2 , 2 , 2-trifluoroetanol Thr(Bzyl) = L-trionina (cadena lateral, protegida con bencilo) Código de tres letras para los aminoácidos: Ala = alanina; Arg = arginina; Asn = asparagina; Asp = ácido aspártico; Chg = ciclohexilglicina; Cys = cisterna; Gln = glutamina; Glu = ácido glutámico; Gly = glicina; His = histidina; lie = isoleucina; Leu = leucina; Lys = lisina; Met = metionina; Phe = fenilalanina; Pro = prolina; Ser = serina; Thr = treonina; Thz 4-tioprolina; Trp = triptofan; Tyr = tirosina; Val = valina Tr (formilo) = L-triptofano (cadena lateral, protegida con NInformilo) TTD = (4 , 7, 10) -trioxatrídecano-1, 13 -diamina Tyr(BrZ) = L-tirosina (cadena lateral, protegida con 2-bromobenciloxicarbonilo) Ve = volumen de distribución del compartimiento central Ei emplo 1 Síntesis de Proteína Sintética de Estimulación de Eritropoyesis , SEP-0 · Se sintetizó una proteína sintética de estimulación de eritropoyesis (SEP) . La secuencia de la proteína sintetizada de longitud completa (designada ""SEP-0 (1-166) " es: APPRLICDSR VLERYLLEAKEAEKITTGCAEHCSLNEKIT VPDTKV FYA WKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW\P LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQK\|/AIS PPDAASAAPL RTITADTFRKLFRVySNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ IN NO: 1) donde ? denota un residuo de aminoácido no nativo que consiste de una cisteína que está carboximetilada en el grupo sulfhidrilo. La proteína SEP-0 se sintetizó en-solución a partir de cuatro segmentos polipeptídicos : Segmento SEP-0 : 1 (GRFN 1711; compuesto de residuos 1-32 de SEQ ID NO : 1) : APPRLICDS VLERYLLEAKEAEKITTGCAEH-tioéster Segmento SEP-0: 2 (GRFN 1712; compuesto de residuos 33-88 de SEQ ID NO : 1) : CSLNE ITVP DTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSE AVLRGQALLV KSSQPW-tioéster (donde Cys33 está protegido con Acm) Segmento SEP-0 :3 (GRFN 1713, compuesto de residuos 89-116 de SEQ ID N0:1) : CPLQLHVDKA VSGLRSLTTLLRALGAQK-tioéster (donde Cys89 está protegido con Acm) Segmento SEP-0 : 4 (GRFN 1714, compuesto de residuos 117-166 de SEQ ID NO:l) : CAISPPDAAS AAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR-carboxilato (donde la cisteína C-terminal (Cys161) tiene un grupo protector de picolilo (pico) ) Los péptidos SEP-0 :1 y SEP-0: 2 y SEP-0: 3 se sintetizaron en la resina de generación de tioéster por el protocolo de neutralización in sítu para la química de Boc (ter-butoxicarbonilo) y la síntesis de péptidos en fase sólida, gradual (SPPS) usando las estrategias de resina de tioéster y protección de cadena lateral, de SPPS establecidas (Hackeng, et al., PNAS (1999) 96: 10068-10073 and Schnolzer, et al., Int. J. Pept . Prot . Res., (1992) 40: 180-193)) en un sintetizador automatizado de péptidos ???433? o por montaje manual de la cadena, u ordenado y adquirido de vendedores comerciales. Por ejemplo, un conjunto normal de grupos protectores de Boc SPPS se usó, específicamente: Arg(Tos); Asp(cHex); Cys(4MeBzl) & Cys(Acm); Glu(cHex); His (DNP) ; Lys (ClZ) ,- Ser(Bzl); Thr(Bzl); Trp (formilo) ; Tyr(BrZ); Met, Asn, Gln estaban sin proteger en- la cadena lateral. El segmento SEP-0:4 se sintetizó de manera análoga en una -OCH2-Pam-resina . Los péptidos se desprotegieron y escindieron simultáneamente del soporte de resina usando HF/ -cresol de acuerdo al procedimiento normal de la química de Boc; sin embargo, para aquellos péptidos que contienen grupos protectores no removidos en HF/p-cresol se retuvieron los grupos protectores. Los péptidos se purificaron por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de fase invertida C4. Se identificaron las fracciones que contienen el péptido puro usando ES-MS (espectrometría de masas con ionización por electrorociado) , se mezclaron y liofilizaron para ligación subsiguiente. Paso 1: Ligación #2. El segmento SEP-0:4 y el segmento SEP-0:3 se disolvieron en TFE a una concentración de 15 mM. Se adicionó amortiguador de fosfato saturado (pH 7.9) que contiene cloruro de guanidinio 6 M y 1% de tiofenol, dando por resultado una solución clara de los segmentos peptídicos . Después de la ligación, la mezcla de ligación se adicionó a una solución de 2 mi de TFE (trifluoroetanol ) 6 mi de cloruro de guanidinio 6 M, fosfato 100 mM que contiene ß-mercaptoetanol al 25% y se incubó durante 20 minutos. La solución se acidificó con una solución de 15 mg/ml de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina .HCl) en ácido acético glacial y se cargó en una columna de HPLC de fase invertida C4 , preparativa (2:54 centímetros (1 pulgada) de diámetro). Los péptidos entonces se purificaron por HPLC de fase invertida, gradiente, preparativa. Se identificaron por ES-MS y se mezclaron las fracciones que contienen el producto ligado, deseado SEP-0 :Acm+SEP-0 :3+SEP-0 :4. Paso 2: remoción #1 de Acm. Para la remoción de Acm la solución acuosa de acetonitrilo que contiene las fracciones mezcladas de SEP-0 :Acm+SEP- 0 : 3+SEP-0 : 4 se diluyó Ix con agua grado HPLC, y se adicionó urea sólida para una concentración final de 2 molar. Un exceso molar de tres veces (con relación a la concentración total esperada de cisteína) de una solución de 30 mg/ml de Hg (acetato) 2 en ácido acético acuoso al 3% se adicionó y la solución se agita durante una hora. La solución entonces se hace al 20% en ß-mercaptoetanol, se carga en una columna de HPLC de fase invertida, semi-preparativa y se purifica con un gradiente gradual. Se identificaron por ES- S las fracciones que contienen el producto deseado SEP-0 : 3+SEP- 0 : 4 y se liofilizaron durante la noche. Paso 3: ligación #2. Se disolvieron conjuntamente cantidades iguales de SEP-0 : 3+SEP- 0 : 4 y SEP-0: 2 en que TFE puro a una concentración de 15 mM. Se adicionó amortiguador de fosfato 250 mM (pH 7.5) que contiene cloruro de guanidinio 6 M y 1% de tiofenol, dando por resultado una solución clara de los segmentos peptídicos. Después de un día de liberación, la mezcla de liberación se adicionó a una solución de 10 mi de TFE, 10 mi de ß—mercaptetanol, 10 mi de piperidina y 20 mi de cloruro de guanidinio 6 M, pH 4, y se incubó durante 20 minutos para remover cualquier grupo protector restante. La solución se acidificó con una solución de 15 mg/ml de TCEP en ácido acético acuoso al 20%, se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, preparativa y se purificó con un gradiente lineal. Se identificaron por ES-MS las fracciones que contienen el producto ligado, deseado SEP-0 :Acm+SEP-0 : 2+SEP-O : 3+SEP-0 :4 y se liofilizaron durante la noche.

Paso 4: carboximetilación se disolvió SEP- 0:Acm+SEP-0:2+SEP-0:3+SEP-0:4 en TFE a una concentración de 15 mM. Se adicionó un exceso de dos veces (v/v) de amortiguador de Fosfato 200 mM (pH 7.9) que contiene cloruro de guanidinio 6 M, dando por resultado una solución clara del segmento peptídico. Se adicionó un exceso de 25 veces de ácido bromoacético disuelto en una cantidad mínima de metanol, y la solución se dejó reaccionar durante dos horas. La solución se acidificó con una solución de 15 mg/ml de TCEP en ácido acético acuoso al 20%, se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, preparativa y se purificó con un gradiente gradual. Se identificaron por ES-MS y se mezclaron las fracciones que contienen el producto carboximetilado, deseado SEP-0 :Acm+SEP-0 :2+SEP-0 :3+SEP-0 :4+Et . . Paso 5: remoción de picolilo. Se activo con polvo de zinc en HC1 2 M durante 30 minutos. Se disolvió el péptido SEP-0 :Acm+SEP-0 : 2+SEP-0 : 3+SEP-0 : 4+Et en TFE a aproximadamente 10 mg/ml de concentración. La solución se diluyo con 4x (v/v con relación a TFE) de cloruro de guanidinio 6 M, acetato 100 mM, pH 4 que contiene (recientemente adicionado) 35 mg/ml de L-metionina y 35 mg/ml de dodecilsarcosina (es decir, N-dodecanoilsarcosina sódica) . La solución se adicionó al polvo de Zn activado. La reacción se monitoreó a intervalos de aproximadamente una hora y se terminó después de cinco horas. Después del término, el sobrenadante se removió y el polvo restante de Zn se lavó dos veces durante cinco minutos con cloruro de guanidinio 6 , pH 4, acetato 100 M que contiene 35 mg/ml de L-metionina y 35 mg/ml de dodecilsarcosina que contiene TFE al 20% así como una vez con la misma solución que contiene 20% de ß-mercarptoetanol . El producto combinado se acidificó con una solución de 15 mg/ml de TCEP en ácido acético acuoso al 20%, se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, preparativa y se purificó con un gradiente gradual. Se identificaron por ES-MS y se mezclaron las fracciones que contienen el producto modificado, deseado SEP-0 :Acm+SEP-0 : 2+SEP-0 : 3+SEP-O :4+Et-Pico. Paso 6: remoción #2 de Acm. La solución mezclada de SEP-0 :Acm+SEP-0 :2+SEP-0 :3+SEP-0 :4+Et-Pico se diluyó 3x con agua grado HPLC, y se adicionó urea sólida para una concentración final de 2 molar. Un exceso molar de tres veces (con relación a la concentración total esperada de cisteína) de una solución de 30 mg/ml de Hg(acetato)2 en ácido acético acuoso al 3% se adicionó y la solución se agitó durante una hora. La solución entonces se hizo al 20% en ß-mercaptoetanol, se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, semi-preparativa y se purificó con un gradiente gradual. Se identificaron por ES-MS, la fracciones que contienen producto deseado SEP- 0 : 2+SEP-0 : 3+SEP-O : 4+Et-Pico, se diluyeron 2x (v/v) con agua que contiene 2x (p/p con relación a la masa de péptido) de DPC (dodecilfosfocolina) y se liofilizaron durante la noche. Paso 7: ligación #3. Cantidades iguales de SEP-0 :2+SEP-0 :3+SEP-0 :4+Et-Pico y SEP-0:1 se disolvieron conjuntamente en TFE puro a una concentración de 15 mM y se adicionó amortiguador de fosfato 250 mM (pH 7.5) que contiene cloruro de guanidinio 6 . A la solución se adicionó 1% de ticfenol. Después de un día de ligación, la mezcla de ligación se adicionó a una solución de 10 mi de TFE, 10 mi de ß-mercaptoetanol , 10 mi de piperidina y 20 mi de cloruro de guanidinio 6 M, pH 4 y se incubó durante 20 minutos para remover cualquier producto protector restante. La solución se acidifico con una solución de 15 mg/ml de TCEP en ácido acético acuoso al 20%, se cargó en una columna de -HPLC de fase invertida, preparativa y se purificó con un gradiente lineal. Las fracciones que contiene el producto ligado, deseado SEP-0 (1-166) : (SEQ ID NO:l) se identificaron por espectrometría de masas con electrorociado, se diluyeron 2x (v/v) con agua que contiene 2x (p/p con relación a la masa de péptido) de dodecilsarcosina y se liofilizaron. Paso 8 Plegado: Se disolvió el péptido ligado de longitud completa SEP-0 (1-166) en amortiguador Tris 200 mM (pH 8.7) que contiene cloruro de guanidinio 6 M y 20% de TFE y un exceso molar de diez veces (con relación a los residuos de Cys en proteína) de cisteína. Esta solución se dializó durante la noche con una solución de amortiguador Tris 200 m (pH 8.7) que contiene cloruro de guanidinio 3 M a temperatura ambiente. La solución entonces se dializó contra una solución de amortiguador Tris 200 mM (pH 8.7) que contiene cloruro de guanidinio 1 M a temperatura ambiente durante 4 horas a 4°C y finalmente contra amortiguador de fosfato de 10 mM (pH 7.0) durante 4 horas a 4°C para producir el producto plegado, final. Se verificó el plegado por ES-MS con electrorociado y espectrometría de CD (dicroísmo circular) . Paso 9 purificación: el polipéptido plegado se concentro 5x en frascos concentradores Centricon y se cargó en una columna de intercambio catiónico Resource S puesta en equilibrio a fosfato 10 mM, pH 7.0. La proteína plagada se eluyó en una gradiente salino lineal a NaCl 50 mM en 10 minutos. Se identificaron por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) , las fracciones que contienen el producto plegado, deseado SEP-0 (1-166) , y se congelaron y almacenaron a -80°C. Un cromatograma de HPLC de fase invertida, analítica y un espectro de ES-MS del producto de la proteína plegada así como un espectro de CD demostraron la presencia de la proteína plegada.

Ejemplo 2 Síntesis de la Proteína Sintética que Estimula la Eritropoyesis , SEP-1-L30 Se sintetizó una segunda proteína sintética que estimula la eritropoyesis (designada a SEP-1-L30) para contener grupos formadores de oxima en las posiciones 24 y 126 de SEP-0. Estos grupos entonces se usaron para formar SEP-1-L30, en los cuales se han unido los polímeros lineales de (EDA-succ-) ia carboxilato (EDA = (4, 7, 10) -trioxatridecano-1, 13-diamina, también llamada TTD; Succ) -C0-CH2CH2C0- ) a la estructura de la proteína. La secuencia SEP-0 (1-166) de longitud completa es : APPRLICDSR VLERYLLEAKEAEKoxITTGCA EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA W R E GQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPWY|/P LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKvAIS PPDAAKoxAAPL RTITADTFRKLFRWSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ ID NO : 2 ) donde ? denota un residuo de aminoácido no nativo que consiste de una cisteína que está carboximetilada en el grupo sulfhidrilo, y donde Kox denota una lisina no nativa que está químicamente modificada en el grupo e-amino como un grupo ligador de oxima acoplado a un polímero designado soluble en agua a través de una unión de oxima. La estructura de SEP-1-L30 también se muestra en la Figura 17. En la Figura 16 se muestra un esquema que ilustra la síntesis química de SEP-1-L30 descrita posteriormente. De manera breve, en las Figuras 16A y 16B, el polímero soluble en agua GRFN32 (GP32) se une a los péptidos SEP-1:1 y SEP-1:4 a través de una reacción de ligación química que forma un enlace de oxiraa . Como se muestra, el péptido SEP-1:1 tiene un grupo Yaa C-terminal en la posición 32 que comprende un histidina-alfa-carboxil-tioéster para la ligación química nativa subsiguiente, y un residuo de lisina no nativo en la posición 24 (un sitio de glicosilación de EPO humana, natural) , la cadena lateral de la cual se ha modificado químicamente para tener un grupo Un=1 que comprende una porción de aminooxi-acilo . La alanina N-terminal que corresponde a la posición 1 del producto final de longitud completa se muestra por referencia. El péptido SEP-1:4 tiene un grupo Xaa N-terminal, no protegido en la posición 117 que comprende una cisteína, un grupo Un=1 que comprende una Lisina modificada con aminooxi-acilo en la posición 126 (un sitio de glicosilación de EPO, humana, natural) y cisteína en la posición 161 (una cisteína que forma disulfuro) que tiene su tiol de cadena lateral protegido con un grupo picolilo. Cys161 está protegido para prevenir su tioalquilación en una conversión subsiguiente de cisteínas introducidas pos los sitios de ligación química, nativos (ver Figura 16D) ; también se usa un grupo protector de picolilo puesto que su remoción es ortogonal a las condiciones requeridas para la remoción de una cisteína protegida con Acm (acetamidometilo) en una primera reacción nativa de ligación química (Ver Figura 16C) . La unión especifica al sitio y exclusiva de las construcciones de polímero GP32 en las posiciones 24 y 126 se logra a través de la ligación química de formación de oxima para producir los péptidos de precisión modificados con polímero: SEP-1:1+GP32 y SEP-1 : +GP32. La Figura 16C muestra la ligación química nativa de SEP-1 :4+GP32 a .un segmento peptídico intermedio SEP-1: 3 y la generación de SEP-1 : 3 -SEP-1 : 4+GP32 , el sitio de ligación del cual está en Lys116 y Cys117. Como se muestra el péptido SEP-1: 3 comprende un grupo Xaa N-terminal en la posición 89 que comprende una cisteína protegida con Acm, y un grupo Yaa C-terminal en la posición 116 que comprende una lisina alfa-carboxil-tioéster . Después de la ligación química, nativa, el grupo protector de Acm se remueve para preparar este producto de ligación para la próxima reacción de ligación. La Figura 16D muestra la ligación química nativa de SEP-1 :2+SEP-l :4+GP32 a un segmento peptídico intermedio SEP-1: 2 y la generación de SEP-1 : 2+SEP-l : 3 SEP-1 : 4+GP32 , el sitio de ligación del cual está en Trp88 y Cys89. Como se muestra, el péptido SEP-1: 2 comprende un grupo Xaa N-terminal en la posición 33 que comprende una cisteína de Acm y un grupo Yaa C-terminal en la posición 89 que comprende un triptofan-alfa-carboxil-tioéster. Después de la ligación química nativa, el producto de ligación se expone a ácido bromoacético para la carboximetilación de los tioles de cadena lateral de las cisteínas 89 y 117 del sitio de ligación, y de esta manera su conversión a ácidos pseudo-glutámicos . Después de la carboximetilación, los grupos protectores de Acm y Picolilo se remueven para preparar este producto de ligación modificado con polímero, no protegido para la próxima reacción de ligación. La Figura 16E muestra la ligación química nativa de SEP-1 : 3 -SEP-1 : 4+GP32 al segmento peptídico SEP-1 :1+GP32 (que corresponde al segmento N-terminal del producto de longitud completa) y la generación del producto de SEP-1-L30 de longitud completa SEP-1 : 1+GP32+SEP-1 : 2+SEP-1 : 3+SEP-l : 4+GP32 , el sitio del ligación final del cual está en- His32 y Cys33. Como se muestra, el producto SEP-1-L30 de longitud completa comprende dos polímeros solubles en agua (G32) unidos exclusivamente en los sitios definidos por el usuario, es decir, sitios de glicosilación que corresponden a la posición 24 y la posición 126 de la EPO humana, natural. Los detalles de la síntesis de describen posteriormente .

A. Oximación de GRFN1776 ? GRFN1711 con GRFNP32 Se realizó la formación de oxima para unir los polímeros solubles en agua que tienen un grupo aminooxiacetilo a péptidos que tienen un grupo de cetona-carbonilo. Para lograr esto, se sintetizaron los siguientes segmentos peptídicos : Segmento SEP-1:4 (GRFN 1776; compuesto de los residuos 117-166 de SEQ ID NO:2) : CAISPPDAAK AAPLR ITADTFRKLFRWSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR-carboxilato (donde Lys126 está modificada con un residuo de ácido levulínico en el grupo e-amino, y donde Cys117 está protegido con Acm) Segmento SEP-1:1 (GRFN 1771, compuestos de los residuos 1-32 de SEQ ID NO: 2) : APPRLICDSR VLERYLLEAKEAEKITTGCAEH-tioéster (donde Lys34 está modificado con un residuo de ácido levulínico) El segmento SEP-1:1 (GRFN 1711) se sintetizó en una resina de generación de tioéster y el segmento SEP-1:4 (GRFN 1776) en una -OCH2-Pam-resina como en el Ejemplo 1. Las Usinas 24 y 126 de estos dos segmentos de péptido se protegieron inicialmente con un grupo Fmoc en el grupo e-amino. Después del término de montaje de la cadena, los grupos amino que tienen Fmoc se desprotegieron siguiendo los procedimientos normales de desprotección de Fmoc y se modificaron por unión de ácido levulínico a cada resina peptidica, respectivamente. Los péptidos entonces se desprotegieron y escindieron simultáneamente del soporte de resina como se describe en el Ejemplo 1. Los péptidos se purificaron por HPLC de fase invertida, C4 , preparativa. Las fracciones que contienen el péptido puro ¡se identificaron usando ES-MS, se mezclaron y liofilizaron para ligación subsiguiente. Se montó GRFNP32 [- (EDA-Succ) 1S carboxilato] en una resina de generación de carboxilo, Sasrin siguiendo protocolos normales (Rose, K. et al., Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de serie 09/379,297; Rose, et al., J Am Chem Soc . (1999) 121: 7034). Se unió una porción de aminooxiacetilo (AoA) al grupo amino N-terminal del polímero por acoplamiento de un exceso de cinco veces de ácido Boc-aminooxiacético activado. La cadena de polímero se escindió del soporte de resina usando procedimientos clásicos de química de Fmoc . La cadena de polímero se purificó por HPLC de fase invertida, C4, preparativa. Se identificaron las fracciones que contienen el polímero puro usando Es-MS, se mezclaron y liofilizaron para ligación subsiguiente. El segmento SEP-1:4 y GRFNP32 se disolvieron conjuntamente en una relación equimolar en acetonitrilo acuoso la 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución entonces se liofilizó. El polvo seco se disolvió y el péptido modificado con polímero se separó del péptido no modificado y el polímero sin reaccionar por HPLC de fase invertida, C4, gradiente, preparativa. Se identificaron por ES-MS las fracciones que contienen el producto oximado,^ deseado SEP-1:4+GP32 y se mezclaron y liofilizaron . El segmento SEP-1:1 y GRFNP32 se disolvieron conjuntamente a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución entonces se liofilizó. El polvo seco se disolvió y el péptido modificado con polímero se separó del polímero sin reaccionar por HPLC de fase invertida, C4 , gradiente, preparativa. Las fracciones que contienen el producto oximado, deseado SEP-1:1+GP32 se identificaron por ES-MS y se mezclaron y liofilizaron.

B. Síntesis de Proteína Sintética que Estimula la Eritropo esis SEP-1-L30 Se sintetizó SEP-1-L30 en solución a partir de cuatro segmentos de polipéptido: Segmento SEP-1:1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32, que corresponde a los residuos 1-32 de SEQ ID NO: 2) : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EH-tioéster (donde Lys24 se modifica en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima levulínica que está acoplado a GRFNP32 a. través de una unión de oxima de levulínico-aminooxiacetilo (Lev-AoA) denotada Kox) .

Segmento SEP-1:2 (GRFN 1712, que corresponde a los residuos 33-88 de SEQ ID NO: 2) : CSLNEKIT VPDT V FYA KRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioéster (donde Cys33 está protegido con Acra) Segmento SEP-1:3 (GRFN 1713, que corresponde a los residuos 89-116 de SEQ ID NO : 2 ) : CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioéster (donde Cys89 está protegido con Acm) Segmento SEP: 1:4+GP32 (GRFN 1776 + GRFNP32 , que corresponde a los residuos 117-166 de SEQ ID NO: 2) : · CASI PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR-carboxilato (donde Lys126 está modificado en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima levulínica que está acoplado a GRFNP32 a través de una unión de oxima de levulínica-aminooxiacetilo (Lev-AoA) denotada Kox, y donde la cisteína C-terminal tiene un grupo protector de picolilo (pico) ) . La síntesis de los péptidos adicionales, reacciones de ligación, carboximetilación, reacciones de remoción de grupos protectores, plegado y purificación se realizaron como se describe en el Ejemplo 1 para producir SEP-1-L30 plegada, que longitud completa. Un cromatograma de HPLC de fase invertida, analítica y un espectro de ES-MS del producto de proteína plegada así como un espectro de CD demostraron la presencia de proteína plegada.

E emplo 3 Síntesis de Proteína Sintética que Estimula la Eritropoyesis SEP-1-L26 Se sintetizó un tercera proteína sintética que estimula la eritropoyesis (designada SEP-1-L26) para contener grupos formadores de oxima en las posiciones 24 y 126 de SEP-0. Estos grupos entonces se usaron para formar SEP-1-L26, en la cual los polímeros lineales (EDA-Succ)18 carboxilato y (EDA-Succ) 6-amida se han unido a la estructura de- proteína a través de ligaduras de oxima en las posiciones 24 y 126, respectivamente. La secuencia de SEP-1 (1-166) de longitud completa es : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPWV|/P LQLHVDKAVS GLRSLTTLLRALGAQtyAIS PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ ID NO: 2) donde ? denota un residuo de aminoácido no nativo que consiste de una cisteína que está carboximetilada en el grupo sulfhidrilo, y donde Kox denota una lisina no nativa que está químicamente modificada en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima acoplado a un polímero designado soluble en agua a través de un enlace de oxima. En contraste a SEP-1-L30, la construcción de SEP-1-L26 se diseño para tener un polímero soluble en agua, más pequeño y no cargado, unido en la posición 126. El polímero unido en la posición 24 fue el mismo como SEP-1-L30. El montaje del producto de longitud completa fue como se describe en el Ejemplo 2. La estructura de SEP-1-L26 se muestra en la Figura 18.

A. Oximación de GRFN1776 con GRFNP6 y oximación de GRFN1711 con GRFNP32 Se realizó la formación de oxima para unir los polímeros solubles en agua que tienen un grupo aminooxiacetilo a péptidos que tienen un grupo de cetona-carbonilo. Para lograr esto, se sintetizaron los siguientes segmentos de péptido : Segmento SEP-1:4 (GRFN 1776; compuesto de los residuos 117-166 de SEQ ID NO: 2) : CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR-carboxilato (donde Lys126 está modificada con un residuo de ácido levulínico en el grupo e-amino, y donde Cys117 está protegido con Acm) Segmento SEP-l.l (GRFN 1771, compuestos de los residuos 1-32 de SEQ ID NO: 2) : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-tioéster (donde Lys24 está modificado con un residuo de ácido levulínico) El segmento SEP-l:l (GRFN 1711) se sintetizó en una resina de generación de tioéster, y el segmento SEP-1:4 (GRFN 1776) en una -0CH2-Pam-resina como en el Ejemplo 1. Las lisinas 24 y 126 de estos dos segmentos de péptido se protegieron inicialmente con un grupo Fmoc en el grupo e-amino. Después del termino del montaje de la cadena, los grupos amino que tienen Fmoc se desprotegieron siguiendo los procedimientos normales de desprotección de Fmoc y se modificaron por unión de ácido levulínico a cada resina peptidico, respectivamente, siguiendo protocolos normales de acoplamiento. Entonces, los péptidos se desprotegieron y escindieron simult neamente del soporte de resina de acuerdo a los procedimientos normales de la química de Boc como en el Ejemplo 1. Los péptidos se purificaron de manera separada por HPLC de fase invertida, C , preparativa. Para cada péptido, se identificaron las fracciones que contienen el péptido puro usando ES-MS, se mezclaron y liofilizaron para ligación subsiguiente.

El polímero soluble en agua (EDA-Succ)18 carboxilato (GRFNP32) se montó en una resina de generación de carboxi, Sasrin siguiendo protocolos normales (Rose, K. et al., solicitud de patente de los Estados Unidos No. de serie 09/379,297; Rose, et al., J Am Chem Soc . (1999) 121: 7034). El polímero soluble en agua (EDA-Succ) s-amida (GRFNP6) se montó en una resina de generación de amida Sieber siguiendo protocolos normales (Rose, K. et al., solicitud de patente de los Estados Unidos no. de serie 09/397,297; Rose, et al., J Am Chem Soc. (1999) 121:7034). Se unió una porción de aminooxiacetilo (AoA) al grupo amino N-terminal de cada polímero unido a resina mediante acoplamiento de un exceso de cinco veces de ácido Boc-aminooxiacético activado. Las dos cadenas de polímero se escindieron de manera separada de los soportes respectivos de resina usando procedimientos clásicos de química de Fmoc . Cada cadena de polímero se purificó por HPLC de fase invertida, preparativa. Para cada polímero, se identificaron fracciones que contienen en polímero puro usando ES-MS, se mezclaron y liofilizaron para ligación subsiguiente. Los segmentos SEP-1:4 y GRFNP6 se disolvieron conjuntamente a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución entonces se liofilizó. El polvo seco se disolvió y el péptido modificado con polímero se separó del péptido no modificado y el polímero sin reaccionar por HPLC de fase invertida, C4, gradiente, preparativa. Las fracciones que contiene el producto oximado, deseado SEP-1:4+GP6 se identificaron por ES-MS y se mezclaron y liofilizaron . El segmento SEP-1:1 y GRFNP32 se disolvieron conjuntamente a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución entonces se liofilizó. El polvo seco se disolvió y el péptido modificado con polímero se separo del polímero sin reaccionar por HPLC de fase invertida, C4 , gradiente, preparativa. Se identificaron por ES-MS las fracciones que contienen el producto oximado, deseado SEP-1:1+GP32 y mezclaron y liofilizaron .

?.· Síntesis de Proteína Sintética que Estimula la Eritropovesis SEP-1-L26 Se sintetizó SEP-1-L26 en solución a partir de cuatro segmentos de polipéptido: Segmento SEP-1:1+GP32 (GRFN 1711 + GRFNP32 , que corresponde a los residuos 1-32 de SEQ ID NO: 2) : ' APPRLICDSR VLERRYLLEAK EAEKoxITTGCA EH-tioéster (donde Lys24 está modificada en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima levulínica que está acoplado a GRFNP32 a través de un enlace de oxima de levulínico-aminooxiacetilo (Lev-AoA) denotado Kox) Segmento SEP-1:2 (GRFN 1712, que corresponde a los residuos 33-88 de SEQ ID N0:2) : CSLNEKIT VPDTKVNFYA RMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioéster (donde Cys33 está protegido con Acm) Segmento SEP-1:3 (GRFN 1713, que corresponde a los residuos 89-116 de SEQ ID NO: 2): CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioéster (donde Cys89 está protegido con Acm) Segmento SEP-1:4+GP32 (GRFN 1776 + GRFNP6 , que corresponde a los residuos 117-166 de SEQ ID NO: 2) : CASI PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR-carboxilato (donde Lys12S está modificado en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima levulínica que está acoplado a GRFNP6 a través de un enlace de oxima de levulxnico-aminooxiacetilo (Lev-AoA) denotado Kox, y donde la cisterna C-terminal [es decir Cys161] tiene un grupo protector de picolilo (pico) ) .

La síntesis de péptidos adicionales, reacciones de ligación, carboximetilación, reacciones de remoción del grupos protector, plegado y purificación se realizaron como se describe en los Ejemplos 1 y 2 para producir SEP-1-L26 plegada, de longitud completa. Un cromatograma de HPLC de fase invertida C4 analítica y un espectro de ES-MS del producto de proteína plegada así como un espectro de CD demostraron la presencia de la proteína plegada.

Ejemplo 4 Síntesis de Proteína Sintética que Estimula la Eritropoyesis SEP-1-B50 Se sintetizó una cuarta proteína sintética que estimula la eritropoyesis (designada a SEP-1-B50) . La secuencia de aminoácidos de SEP-1-B50 de longitud completa es la misma como aquella de SEP-1-L30 APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSE VLRGQAL LVKSSQPW\|/P LQLHVDKAVS GLRSLTTLLRALGAQK\|/AIS PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ ID NO : 2) donde ? denota un residuo de aminoácido no nativo que consiste de una cisteína que está carboximetilada en el grupo sulfhidrilo, y donde Kox denota una lisina no nativa que está modificada químicamente en el grupo e-amino como un grupo ligador de oxima acoplado a un polímero designado soluble en agua a través de un enlace de oxima. soluble en agua a través de un enlace de oxima. Sin embargo, la proteína se derivatizó con una construcción de polímero ramificado que tiene cuatro porciones lineales (Succ-EDA)12 en lugar del polímero lineal (Succ-EDA)13 de SEP-1-L30. La derivatización se logró vía enlaces de oxima. La Figura 19 es una ilustración esquemática de la síntesis química del' polímero ramificado soluble en agua G FNP29 (GP29) que se unió a la SEP-1-B50 a través de la ligación de formación de oxima como se describe en detalle posteriormente. Como se muestra en la Figura 19, se usó un precursor U-B de lisina ortogonalmente protegido para generar el componente U-B, GRFN17 (GP17) que tiene un aminooxiacilo como el grupo U, y que tiene un núcleo B de ramificación de lisina 3X que tiene cuatro grupos tiol colgantes para el acoplamiento subsiguiente a través de los enlaces de tioéter a una construcción de oxido de etileno-poliamida, soluble en agua, lineal designada GP29, que tiene un carboxilato colgante denotado por un residuo de ácido succínico. El montaje del producto de longitud completa fue como se describe en el Ejemplo 2. La estructura de SEP-1-B50 se muestran en la Figura 20.

A. Síntesis De la Plantillan GRFNP17 que tiene múltiples Grupos Tiol La plantilla GRFNP17 se sintetizó de manera manual en una (4-metil) benzhidrilamina (MBHA) -resina de generación de amida a una escala de 0.4 mmol . Se ha acoplo Fmoc-Lys(Boc)-OH usando protocolos normales de acoplamiento (Schnólzer, . , In J Pept Protein Res. (1992) 40: 180-93). Se usaron 2.1 mmol de aminoácido, 10% de DIEA en 3.8 mi de HBTU; 0.5 M; es decir, exceso de 5 veces de aminoácido. Después de la remoción del grupo protector de Fmoc, se acopló Fmoc-Lys (Fmoc) -OH usando protocolos normales de acoplamiento de aminoácidos (2.1 mmol de aminoácido, 10% de DIEA en 3.8 mi de HBTU; 0.5 M; es decir exceso de 5 veces de aminoácido) después de un segundo paso de remoción de Fmoc, se- acopló Fmoc-Lys (Fmoc) -OH usando protocolo normales de acoplamiento de aminoácido (4.2 mmol de aminoácido, 10% de DIEA en 7.6 mi de HBTU 0.5 M; es decir exceso de 5 veces de aminoácidos con relación a la amina libre) . Después de un paso final de desprotección de Fmoc, se acopló durante 30 minutos un exceso de 5 veces (con relación a aminas libres) del éster pentafluorofenílico del ácido S-acetil-tioglicólico (SAMA-oPfp) en DMF . El grupo protector de Boc de la cadena lateral del residuo de lisilo C-terminal se removió por dos lavados en lotes de un minuto con TFA puro, seguido por neutralización de la resina por lavado con 10% de DIEA en DMF . Se disolvieron 2 mmol de ácido Boc-aminooxiacético y 2 mmol N-hidroxisuccinimida (NHS) en 3 mi de DMF. Después de la adición de 2 mmol de DIC (diisopropilcarbodiimida) , el ácido se activo durante 30-60 minutos. La solución se adicionó a la resina neutralizada y se acopló 1 hora. Finalmente, los grupos acetilo S-enlazado se removieron con piperidina al 20% en DMF durante 30 minutos. La plantilla se desprotegió y se escindió simultáneamente del soporte de resina usando HF/p-cresol de acuerdo a procedimientos normales de la química de Boc en la presencia de cisteína como un eliminador para el aldehido libre (Schnólzer, M. , Int J Pept Protein Res. (1992) 40: 180-93) . La poliamida recuperada en 50% de B [es decir, acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%] (aldehido libre) se congeló y liofilizó. Para la purificación, el producto crudo de plantilla se disolvió en 2 mi de B al 50%, 100 mi de A al 100% [es decir, TFA al 0.1% en agua] se adicionó para diluir el mismo (Evitar edición de acetato o cloruro de guanidinio, puesto que se garantiza la adición de aldehido. La plantilla se cargo en una columna de HPLC de fase invertida, preparativa, C4 puesta en equilibrio a T = 40°C a 3% de B. Las sales se eluyeron isocráticamente y la plantilla deseada, GRFNP17 se purificó en un gradiente lineal . Las fracciones que contienen el producto deseado se identificaron por ES-MS, se mezclaron y liofilizaron .

B. síntesis de Polímero Ramificado Soluble en Agua GRNP29 Un polímero ramificado (EDA-Succ) 12 GRFNP29 de peso molecular de 15kDa se sintetizó por la ligación de generación de tioéter de la platilla purificada que contiene tiol, GRFNP17 y un polímero lineal GRFNP31, Br-acetil- (EDA-Succ) 12-carboxilato, donde GRFNP31 se sintetizó en una resina de generación de carboxi de Sasrin siguiendo protocolos normales (Rose, K. et al., solicitud de patente de los Estados Unidos No. de serie 09/379,297; Rose, et al., J Am Chem Soc. (1999) 121: 7034). Un exceso molar de 1.3x (con respecto a tiole.s totales) del GRFNP31 purificado, Br-acetilado (EDA-Succ) 12, y la platilla purificada que contiene tiol GRFNP17 se disolvieron conjuntamente con Tris-HCl 0.1 M/cloruro de guanidinio 6 M, pH 8.7 a una concentración de aproximadamente 10 mM. Después de la disolución, la solución se diluyo 3 veces (v/v) con un amortiguador de Tris-HCl 0.1 M, pH 8.7. La mezcla de ligación se agitó a temperatura ambiente y la reacción se monitoreó por HPLC de fase invertida y ES/MS. Se adicionó reactivo adicional de GRFNP31 en una base conforme se necesite, hasta que el producto de reacción' deseado era el producto principal. Para el tratamiento, se adicionó 3x (v/v a la mezcla de ligación) acetato 0.1 M/cloruro de guanidinio 6 M pH 4 y la solución se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, C , preparativa y su purificó con un gradiente lineal . Se identificaron usando ES-MS reacciones que contienen la construcción pura GRFNP29, se mezclaron y liofilizaron .

C. Oximación de GRFN1776 y GRFN1711 con GRFNP29 El segmento SEP-1:4, y el segmento SEP-1:1 se sintetizaron como se describe en el Ejemplo 2. El segmento SEP-1:4 y GRFNP29 se disolvieron conjuntamente a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución se liofilizó. El polvo seco se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, preparativa (2.54 centímetros (1 pulgada) de diámetro). El péptido modificado con polímero se separó del péptido no modificado y el polímero sin reaccionar por HPLC de fase invertida, C4 gradiente, preparativa. Se identificaron por ES-MS y se mezclaron las fracciones que contiene el producto oximado, deseado SEP- 1 : +GP29. El segmento SEP-1:1 y GRFNP29 se disolvieron conjuntamente a una relación equimolar acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución se congeló y liofilizó. El polvo seco se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se cargó en una columna de GPC preparativa (cromatografía de permeación en gel) (2.54 centímetros (1 pulgada diámetro) . El péptido modificado con polímero se separó del péptido no modificado y el polímero sin fraccionar por elución isocrática. Las fracciones que contienen el producto oximado, deseado SEP-1:1+GP29 se identificaron por ES-MS y se mezclaron.

D. Síntesis de Proteína Sintética que Estimula la Eritropoyesis , SEP-1-B50 Se sintetizó SEP-1-B50 (SEQ ID NO: 2) en solución de cuatro segmentos de polipéptido: Segmento SEP-1.-1+GP29 (GRFN 1711 +GRFNP29 , que corresponde a los residuos 1-32 de SEQ ID NO: 2) : APPRLICDSR VLERRYLLEAK EAEKoxITTGCA EH-tioéster (donde Lys24 está modificada en el grupo e-amino con un grupo ligador de oxima levulínica que está acoplado a GRFNP29 a través de un enlace de oxima de levulínico-aminooxiacetilo (Lev-AoA) denotado Kox) Segmento SEP-1:2 (GRFN 1712, que corresponde a los residuos 33-88 de SEQ ID NO: 2) : CSLNEKIT VPDTKVNFYA KRMEVGQQA VE QGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioéster (donde Cys33 está protegido con Acm) Segmento SEP-1:3 (GRFN 1713, que corresponde a los residuos 89-116 de SEQ ID N0:2) : 89-116 de SEQ ID N0:2) : CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioéster (donde Cys89 está protegido con Acm) Segmento SEP11:4+GP32 (GRFN 1776 + GRFNP29, que corresponde a los residuos 117-166 de SEQ ID NO: 2) : CASI PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR-carboxilato (donde Lys126 está modificada en el grupo e-amino como un grupo ligador de oxima levulínica que está acoplado a GRFNP29 a través de un enlace de oxima de levulínico-aminooxiacetilo (Lev-AoA) denotada Kox, y donde la cisterna C-terminal tiene un grupo protector de picolilo (pico) ) .

La síntesis de los péptidos adicionales, reacciones de ligación, carboximetilación, reacciones de remoción de grupos protectores, plegado y purificación se realizaron como se describe en los Ejemplos 1 y 2, excepto que fue en una columna Resource Q para producir SEP-1-B50 (SEQ ID NO: 2) plegada, de longitud completa. Un cromatograma de HPLC de fase invertida, C4 , analítica y un espectro de ES-MS del producto SEP-1-B50 de proteína plegada así como un espectro de CD demostraron la presencia de la proteína plegada.

Ejemplo 5 Síntesis de Proteína Sintética que Estimula la Eritropoyesis SEP-3-L42 Se sintetizó una quinta proteína sintética que estimulación de eritropoyesis (designada SEP-3-L42). La secuencia de aminoácidos de la proteína SEP-3 de longitud completa es : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNECIT VPDTKVNFYA KR EVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LACSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS PPDAACAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ ID NO : 3) Los residuos de cisteína en las posiciones: 24, 38, 83 y 126 se modificaron con unidades de polímero (EDA-Succ)18 (GRFNP32) funcionarizadas con maleimida (vía una reacción de adición de Michael) para formar SEP-3-L42. La estructura de SEP-3-L42 se muestra en la Figura 22. En la Figura 21 se muestra un esquema que ilustra la síntesis química de SEP-3 -L42 descrito posteriormente. De manera breve las Figuras 21A y 21B muestra la ligación química nativa de cuatro segmentos de péptido de SEP-3 -L42, SEP-3 :1 hasta SEP-3 : 4 , que genera cisteínas en los sitios de ligación que corresponde a los cuatro sitios de ligación nativos en ??? humana. En particular, la Figura 2IB muestra el polipéptido de longitud completa que tiene todas las cisteinas de formación de disulfuro protegidas, que permite la unión especifica al sitio de los cuatro polímeros lineales, cargados solubles en agua (designados GRFN32-maleimida (GP32 -maleimida) ) en los sitios de ligación de cisteína a través de una reacción de adición de íchael. La Figura 2IB también muestra el paso final de desprotección de la cisteína de formación de disulfuro, y la generación del producto modificado con polímero de longitud completa. En detalle, se sintetizó SEP-3 en solución de cuatro segmentos de polipéptido: Segmento SEP-3 :1 (GRFN 1747, que corresponde a los residuos 1-37 de SEQ ID NO: 3) : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE-tioéster (donde Cys7, Cys29 y Cys33 están protegidos con Acm) Segmento SEP-3 : 2 (GRFN 1774, que corresponde a los residuos 38-82 de SEQ ID NO: 3) : CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LA-tioéster (donde Cys38 está protegido en la cadena lateral con el grupo Acm) Segmento SEP-3 : 3 (GRFN 1749, que corresponde a los residuos 83-125 de SEQ ID NO: 3) : CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS PPDAA-tioéster (donde Cys83 es la cadena lateral protegida con el grupo Acm) Segmento SEP-1:4 (GRFN 1750, que corresponde a los residuos 126-166 de SEQ ID NO:3) : CAAPL RTITADTF K LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDT-carboxilato (donde Cys161 es Pbo [es decir, 4-(CH3S(0) -) encil-] rotegido) .

Síntesis de péptido. Los péptidos SEP-3:1 y SEP-3:2 y SEP-3:3 se sintetizaron en una resina de generación de tioéster por el protocolo de neutralización in situ para SPPS, de la química de Boc, usando estrategias de protección de cadena lateral, establecidas, como se describe en' el Ejemplo 1, con cambios en la estrategia de los grupos protectores como se señala en los péptidos específicos anteriormente. El segmento SEP-3:4 se sintetizó de manera análoga en una -OCH2-Pam-resina . Los péptidos se desprotegieron y se escindieron de manera simultanea del soporte de resina como se describe en el Ejemplo 1. Los péptidos resultantes descritos anteriormente se purificaron por RP-HPLC preparativa. Se identificaron usando ES-MS las fracciones que contienen el péptido puro, se mezclaron y liofilizaron para la ligación subsiguiente. Paso 1: Ligación #1. El segmento SEP-3:4 y el segmento SEP-3:3 se disolvieron en TFE a una concentración de 15 ????. Se adicionó amortiguador de fosfato saturado (pH 7.5) que contiene cloruro de guanidinio 6 M y 1% de tiofenol, dando por resultado una solución clara de los segmentos peptídicos. Después de la ligación, la mezcla de ligación (definida como 1 volumen) se adicionó a 2 volúmenes de una solución de {2 mi de TFE', 6 mi de cloruro de guanidinio 6 M, fosfato 100 m que contiene 25% de ß-mercaptoetanol } y se incubó durante 20 minutos. La solución se acidificó con una solución de 15 mg/ml de TCEP en ácido acético glacial, se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, C4 , preparativa y se purificó con un gradiente lineal. Las fracciones que contienen el producto ligado, deseado SEP-3 :Acm+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4 se identificaron por ES-MS y se mezclaron. · · Paso 2: remoción #1 de Acm. Para la remoción de Acm, la solución acuosa de acetonitrilo que contiene las fracciones mezcladas de SEP-3 :Acm+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4 se diluyó lx con agua grado HPLC y se adicionó urea sólida para una concentración final de 2 molar. Se adicionó un exceso molar de tres veces (con relación a la concentración total esperada de cisteína) de una solución de 30 mg/ml de Hg (acetato) 2 en ácido acético acuoso al 3% y la solución se agitó durante una hora. La solución entonces llevó al 20% en ß-mercaptoetanol, se cargó en una columna de HPLC, de fase invertida, C , semi-preparativa y se purificó con un gradiente gradual. Las fracciones que contienen el producto ligado, deseado SEP-3 : 3+SEP-3 : 4 se identificaron por ES-MS y se liofilizaron durante la noche Paso 3: ligación #2. Se disolvieron conjuntamente cantidades iguales de SEP-3 : 3+SEP-3 : 4 y SEP-3.2 en TFE puro, trifluoroetanol , a una concentración de 15 mM. Se adicionó amortiguador de fosfato 250 mM (pH 7.5) que contiene guanidinio 6 M y 1% de tiofenol, dando por resultado una solución clara de los segmentos de péptido. Después de un día de ligación, la mezcla de ligación (definida como 1 volumen) se adicionó 2 volúmenes de una solución de 10 mi de TFE, 10 mi de ß-mercaptoetanol, 10 mi de piperidina y 20 mi de guanidinio 6 M, pH 4, y se incubó durante 20 minutos para remover cualquier grupo protector, restante. La solución se acidificó con una solución de 15 mg/ml de TCEP en ácido acético acuoso al 20%, se cargó en una columna de HPLC, de fase invertida, C4 , preparativa y se purificó con un gradiente lineal. Las fracciones que contienen el producto ligado, deseado SEP-3 :Acm+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4 se identificaron por ES-MS y se liofilizaron durante la noche. Paso 4 remoción de Acm. Para la remoción de Acm, la solución acuosa de acetonitrilo que contiene las fracciones mezcladas de SEP-3 :Acm+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4 se diluyó lx con agua grado HPLC, y se adicionó urea sólida para una concentración final de 2 molar. Se adicionó un exceso malar de tres veces (con relación a la concentración total preparada cisteína) de una solución de 30 mg/ml de Hg (acetato) 2 en ácido acético acuoso al 3% y la solución se agitó durante 1 hora. La solución entonces se hizo al 20% ß-mercaptoetanol, se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, semi-preparativa y se purificó con un gradiente gradual. Las fracciones que contiene el producto ligado, deseado SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4 se identificaron por ES-MS y se liofilizaron durante la noche. Paso 5: Ligación #3 cantidades iguales de SEP- 3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3 : y SEP-3 :1 se disolvieron conjuntamente en TFE puro a una concentración de 15 mM. Se adicionó amortiguador de fosfato 250 mM (pH 7.5) que contiene guanidinio 6 M y 1% de tiofenol, dando por resultado una solución clara de los segmentos de péptido . Después de 1 día de ligación, la mezcla de ligación (definida como 1 volumen) se adicionó a 2 volúmenes de una solución de 10 mi de TFE, 10 mi de ß-mercaptoetanol, 10 mi de piperidina y 20 mi de guanidinio 6 M, pH , y se incubó durante 20 minutos para remover cualquier producto protector restante. La solución se acidificó con una solución de 15 mg/ml de TCEP en ácido acético acuoso al 20%, se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, C4, preparativa y se purificó con un gradiente lineal. Las fracciones que contienen el producto ligado, deseado SEP-3 : l+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4 se identificaron por ES-MS y se liofilizaron durante la noche. Paso 6: unión de polímero GRFNP32. Un polímero (EDA-Succ) 18 lineal, funcionarizado con maleimida llamado GRFNP32-maleimida se preparó al funcionalizar GRFNP32 con BMPS (éster de NHS de ácido 3-maleimido-propiónico, Pierce, E.U.A.) siguiendo los protocolos de los fabricantes para forma un polímero (EDA-Succ) 1B funcionalizado con maleimida [es decir, maleimida- (EDA-Succ) 18] . Se disolvió SEP-3 :1+SEP-3 :2+SEP-3 :3+SEP.3 :4 en la cantidad mínima de TFE requerida. Se disolvió un exceso de tres veces de GRFNP32 -maleimida en cloruro de guanidinio 6 M, fosfato 100 mM, pH 7.5 se adicionó a la solución de TFE. El progreso de la reacción de adición de Michael se siguió por HPLC de fase invertida analítica. Después de que se terminó la reacción, la solución se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, C4, preparativa y se purificó con un gradiente lineal. Las fracciones que contienen el producto deseado modificado con polímero SEP-3 :Acm+SEP-3 : l+SEP-3 :2+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4+pPEG [es decir, la cadena de polipéptido de 166 residuos de longitud completa, ligada, con cuatro copias de GRFNP32 unida a los tioles de cadena lateral de Cys24, Cys38, Cys83 y Cys125, y de esta manera también llamada SEP3 :Acm+SEP-3 : l+SEP-3 : 2+SEP-3 :3+SEP-3 :4+GP32] , de identificaron por ES-MS y se liofilizaron durante la noche. Paso 7: remoción de Pbo. Para la reducción Pbo, el polvo liofilizado de SEP3 :Acm+SEP-3 : l+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3:4+GP32 se disolvió en TFA puro que contiene 5% de etanoditiol. El grupo Pbo entonces se escindió por adición de 10% de tioanisol y 15% de bromotrimetilsilano durante 30 minutos. La solución se secó en un rotador-evaporador y se tomó en acetonitrilo acuoso que contiene TFA al 0.1%. La solución resultante se cargó en una columna HPLC de fase invertida, semi-preparativa y se purificó con un gradiente gradual . Las fracciones que contiene el producto deseado desprotegido de Cys161 SEP3 :Acm+SEP-3 : l+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3:4+PG32-Pbo se identificaron por ES-MS y se liofilizaron durante la noche. Paso 8: remoción de Acm. Para la remoción final de Acm de las cadenas laterales de Cys7, Cys29, y Cys33, la solución acuosa de acetonitrilo que contiene las fracciones mezcladas de SEP-3 :Acm+SEP-3 : l+SEP-3 : 2+SEP-3 : 3+SEP-3 : 4+GP32 -Pbo se diluyó lx con agua grado HPLC, se adicionó urea sólida para una concentración final de 2 molar. Se adicionó un exceso molar de tres veces (con relación a la concentración total esperada de cisteina) de una solución de 30 mg/ml de Hg (acetato) 2 en ácido acético acuoso al 3% y la solución se agitó durante una hora. La solución se hizo al 20% en ß-mercaptoetanol, se cargó en una columna de HPLC, de fase invertida, C4 semi-preparativa y se purificó con un gradiente gradual. Las fracciones que contienen el producto ligado, deseado modificado con polímero SEP-3 (1-166) se identificaron por ES-MS y se liofilizaron durante la noche. Paso 9 Plegado: el péptido ligado, de longitud completa modificado con polímero SEP-3 (1-166) se disolvió en amortiguador de Tris 200 mM (pH 8.7) que contiene cloruro de guanidinio 6 M y TFE al 20% y un exceso molar de 10 veces (con relación a los residuos de Cys en SEP-3) de cisteína. Esta solución se dializó durante la noche contra una solución de amortiguador de Tris 200 mM (pH 8.7) que contiene cloruro de guanidinio 3 M a temperatura ambiente. La solución entonces se dializó contra una solución de amortiguador Tris 200 mM (pH 8.7) que contiene cloruro de guanidinio 1 M durante 4 horas a 4°C y finalmente contra amortiguador de fosfato de 10 mM (pH 7.0) durante 4 horas a 4°C para producir el producto plegado, final. Se verificó el plegado por ES-MS con electrorociado y espectrometría de CD. Paso 10 purificación: el polipéptido plegado se concentro 5x en frascos concentradores Centricon y se cargó en una columna de intercambio catiónico esource puesta en equilibrio a fosfato 10 mM, pH 7.0. La proteína plagada se eluyó en una gradiente salino lineal a NaCl 50 mM en 10 minutos.' Las fracciones que contienen el producto plegado, deseado SEP-3 -L42 se identificaron por SDS-PAGE se congelaron y almacenaron a -80°C.

Ejemplo 6 Ensayo de Bioactividad de Proteínas Sintéticas que Estimulan la Eritropoyesis La bioactividad de las proteínas sintéticas plegadas que estimulan la eritropoyesis, SEP-O, SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, y SEP-3-L42 se determinó usando líneas de células UT/7 y 32D 103197, en ensayos de proliferación de línea celular dependiente del factor, usando eritropoyetina recombinante , comercial como una norma de control. La UT/7 es un línea células de leucemia megacarioblástica, humana con una dependencia absoluta en uno de interleucina-3 , factor de estimulación de colonias de granulositos-macróf gos (MG-CSF) , o eritropoyetina (EPO) para crecimiento y supervivencia (Miura Y, et al., Acta Haematol (1998) 99-180-184); Komatsu N, et al., Cáncer Res (1991) 51:341-8). La 32D 103197 es una línea de células hemopoyéticas murina (Metcalf, D. Int J Cell Cloning (1992) 10:116-25). Las soluciones concentradas de las construcciones de SEP se elaboraron en el medio de Dulbecco modificado con Iscove (IMD ) , FBS al 10% (suero bovino fetal) , glutamina y Penstrep, y se adicionaron diluciones en serie 2x de estas soluciones concentradas a placas de varias cavidades a las cuales se adicionaron células humanas UT/7 EPO a una concentración de 5000 células/ 50 µ? . Las placas se incubaron a 37°C en la presencia de C02 al 5% y se monitorearon diariamente para el crecimiento. Después de cuatro días se adicionaron 20 µ? de MTT 2.5 mg/ml (metiltiazol-tetrazolio) en PBS (solución salina amortiguada con fosfato) y las placas se incubaron durante cuatro horas. Se adicionaron 150 µ? de IPA y la absorbancia para cada cavidad se leyó a 562 nm. Los valores de ED50 (dosis efectiva para alcanzar 50% de efecto máximo) para los compuestos de SEP se determinaron y compararon a aquellos de rhEPO (eritropoyetina humana recombinante) producida con células de CHO (ovario de hámster Chino) . Los resultados de estos experimentos demostraron que todas las proteínas sintéticas que estimulan la eritropoyesis exhibieron bioactividad. Los resultados de ED50 para SEP-0, SEP-1-L26, SEP-1-L30, y SEP-1-B50 se muestran en la tabla VI.

Tabla VI Los resultados adicionales de estos experimentos cuando se normalizaron para el contenido de péptido usando sólo un coeficiente de extinción para calcular la concentración de proteína por absorbancia para SEP-1-L30 modificado con polímeros se muestran en la Tabla VII y la Figura 28 para SEP-O, SEP-1-L26, SEP-1-L30, SEP-1-B50, SEP-3-L42, y SEP-1-B51 (síntesis del compuesto SEP-1-B51 se describe en Ejemplo 7 posterior) . De manera colectiva, estos ensayos in vi tro demuestran el efecto diferencial de variar las estructuras oliméricas y sitios de unión en la bioactividad in vitro donde estos compuestos tienen el siguiente orden relativo de potencia cuando se prueban para (1) actividad del receptor de EPO humano (desde más potente o menos potente) : SEP-1-L26 « SEP-1-L30 > SEP-1-B50 « SEP-1-B51 > SEP-3-L42 > SEP-0; y (2) actividad del receptor de EPO de -ratón (de más potente a menos potente) : SEP-1-L26 > SEP-1-L30 > SEP-0 > SEP-3-L42 > SEP-1-B50 « SEP-1-B51 Tabla VII Los resultados en la Tabla VII y Figura 28 también muestran una diferencia significativa en la preferencia del receptor, para las construcciones de SEP, modificadas con polímero en comparación a la construcción SEP-0 no modificada con polímero. En particular, SEP-1-L26 se modifica con diferentes polímeros lineales unidos a la posición 24 del sitio de glicosilación de EPO humana (un polímero lineal de 5.5 kDa con una carga negativa colgante unida en este sitio) y la posición 126 (un polímero lineal de 1.8 kDa con una carga neutral colgante a este sitio); esta construcción tiene una actividad similar contra receptores tanto de humanos como de ratón. SEP-1-L30 se modifica con un polímero lineal de 5.5 kDa que tiene una carga negativa colgante en las posiciones 24 y 126 del sitio de glicosilación de EPO humana correspondiente; esta construcción juega aproximadamente 5X más activa contra el receptor humano en comparación al receptor de ratón. SEP-3-L42, que se modifica con un polímero lineal de 5.5 kDa que tiene una carga negativa colgante en las posiciones 24, 38, 83, y 126 del sitio de glicosilación de EPO humana correspondiente fue aproximadamente 10X más activa contra el receptor humano en comparación con el receptor del ratón. El diferencial más grande se observo para SEP-1-B50 y SEP-1-B51, que se modificaron con polímeros de 15 kDa negativamente cargados, ramificados, unidos en las posiciones 24 y 126 de sitio de glicosilación de EPO humana correspondiente, y tienen un pl de aproximadamente 5 (similar a la EPO humana) ; estas dos construcciones fueron aproximadamente 60X más activas contra el receptor humano en comparación al receptor de ratón. Puesto que la EPO de ratón está carente de un sitio de glicosilación en una posición que corresponde a la posición 126 de la EPO humana (la EPO de ratón tiene prolina no glicosilada en lugar de la serina O-glicosilada encontrada en la EPO humana) , la actividad alterada del receptor puede ser debida en parte a esta diferencia, y de esta manera la preferencia del receptor de ratón para una EPO que está carente de la glicosilación O-enlazada en la posición 126 correspondiente. Esto esta de acuerdo con la comparación de SEP-1-L26 y SEP-1-L30 a SEP-1-B50 y SEP-1-B52. Por ejemplo, 3EP-1-L26 tiene un polímero no cargado de 1.8 kDa en la posición 126 en tanto que SEP-1-L30 tiene un polímero negativamente cargado de 5.5 kDa en la posición 126. Aunque se observó actividad equivalente contra el receptor de EPO humana, se encontró una diferencia de 4 veces contra' el receptor de EPO de ratón. La mayor diferencia se observó para las construcciones SEP-1-B50 y SEP-1-B51, con polímeros de 15 kDa negativamente cargados unidos en la posición 126 de sitio de glicosilación de EPO humana, correspondiente. La adición de polímeros negativamente cargados de 5.5 kDa en sitios que corresponden a las cuatro posiciones de glicosilación nativas en la EPO humana, es decir, 24, 38, 83 y 126 como con la construcción SEP-3-L42 redujo la preferencia para ratón aun adicionalmente, pero menos que las construcciones SEP-1-B50 y SEP-1-B51. Estos resultados demuestran que la especificidad al receptor se puede modular por modificación con precisión de los sitios que corresponden a los sitios de glicosilación en una proteína glicosilada, biológicamente producida, y al ajustar el tamaño, la naturaleza de ramificación y la carga del polímero.

Ejemplo 7 Síntesis de Proteína Sintética de Estimulación de Eritropoyesis SEP-1-B51 A. Composición de SEP-1-B51. Se sintetizó una sexta proteína sintética que estimula la eritropoyesis (designada a SEP-1-B51) . La secuencia de aminoácidos de la SEP-1-B51 de longitud completa es la misma como aquella de SEP-1-B50. APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPWyP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK\|/AIS PPDAAK0XAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR - GKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ ID NO: 2) donde ? denota un residuo de aminoácido no nativo que consiste de una cisteína que está carboximetilada en el grupo sulfhidrilo, y donde Kox denota una lisina no nativa que está químicamente modificada en el grupo e-amino como un grupo ligador de oxima acoplado a un polímero designado soluble en agua a través de un enlace de oxima. Sin embargo, en contraste con SEP-1-B50, la proteína se derivatizó con una construcción de polímero ramificado que tiene cuatro polímeros (Succ-TTD) i2-Succ-Alanina-OH [es decir, (Succ-TTD) i2-Succ-Ala-OH, o (Succ-TTD) i2Succ-Ala] lineales acoplados a través de enlaces de amina al núcleo de ramificación de lisina. El acoplamiento de los polímeros lineales al núcleo de ramificación a través de enlaces de amida se diseñó para mejorar la estabilidad. Los cuatro polímeros lineales también se diseñaron para tener una porción de alanina y cargas negativas colgantes, con las cargas negativas que imitan los ácidos siálicos y la alanina en carácter en un carácter hidrófobo similar a porciones colgantes de azúcar de las cadenas de carbohidratos. Los polímeros ramificados también se diseñaron para tener un espaciador soluble en agua entre el núcleo de ramificación y el sitio de unión de la estructura de proteína para mejorar la síntesis y propiedades de manejo de la plantilla del núcleo de ramificación y para imitar la separación encontrada en las cadenas naturales de carbohidratos entre el sitio de unión de azúcar a la estructura de proteína y el primer punto de ramificación del carbohidrato . La Figura 23 es un esquema que ilustra la síntesis química del polímero ramificado soluble en agua GRFNP41 que se unió a la SEP-1-B51 a través de la ligación de formación de oxima como se describe posteriormente. El montaje del producto de longitud completa fue como se describió en el Ejemplo 2. La estructura de SEP-1-B51 se muestra en la Figura 24. B. Síntesis de (Succ-TTD) 12Succ-AlaOtBu (GRFNP39) para el acoplamiento de la plantilla de ramificación (GRFNP40) El polímero lineal (Succ-TTD) 12Succ-AlaOtBu (GRFNP39) se sintetizó a una escala de 0.5 mmol en resina de generación de ácido carboxílico, lábil, ácida, Sasrin. La resina de poliestireno de generación de carboxílico, lábil, ácida Sasrin 0.5 mmol (aproximadamente 0.5 gramos) (sustitución de hidroxilo 1.02 mmol/g); se hincho en DMF durante 15 minutos y luego se drenó. A esta resina funcionalizada con hidroxilo se adicionaron 450 mg (4.5 mmol) de anhídrido succínico y 488 mg de 4- (dimetilamino) piridina (4 mmol) disueltos en 8 mi de DMF que contiene 500 microlitos (3.9 mmol) de DIEA (diisopropiletilamina) y se dejó reaccionar durante 30 minutos con agitación con vórtice y se drenó. El acoplamiento se repitió y se removieron los reactivos en exceso y los coproductos solubles por un lavado con flujo de vórtice de un minuto con DMF (aproximadamente 50 mi) y luego se drenó. La HOOC-CH2CH2C0-0-resina (0.5 mmol) se activó por adición de 8 mi de solución de CDI (carbonildiimidazol ) 1.0 M (8 mmol) en DMF y se dejó reaccionar durante 40 minutos y luego se drenó. Se removieron los reactivos en exceso y los co-productos solubles por un lavado de flujo de vórtice de un minuto con DMF (aproximadamente 50 mi) y luego se drenó. Se adicionaron 4 mi (4 gramos, 18.2 mmol) de (4,7,10)-trioxat idecano - 1 , 13 - diamina (TTD) disuelto en 4 mi solución de HOBT 0.5 M (2 mmol) en DMF y se dejó reaccionar con agitación con vórtice durante 30 minutos, luego se drenó. Se removieron los reactivos en exceso y los co-productos solubles por un lavado de flujo de vórtice de 1 minuto con DMF (aproximadamente 50 mi) , luego se drenó. Se adicionó anhídrido succínico (450 mg, 4.5 mmol) disuelto en 8 mi de una solución de HOBT (N-hidroxibenzotriazol) 0.5 M (4 mmol) que contiene 500 microlitos (3.9 mmol) de DIEA a la resina y se dejó reaccionar con agitación con vórtice durante 15 minutos, luego se drenó. Los tres pasos (activación de CDI ; acoplamiento de TTD; reacción de anhídrido succínico) se repitieron once veces [es decir, un total de doce veces] . Se removieron los reactivos en exceso y los co-productos solubles por un lavado de flujo de vórtice de un minuto con DMF (aproximadamente 50 mi) y se drenaron. La HOOC-CH2CH2CO (TTD-succinil ) 12-0-resina (0.5 mmol) se activo con 8 mi de una solución de CDI 1.0 M (8 mmol) fresca en DMF y se dejó reacciona durante 40 minutos y luego se drenó. Los reactivos en exceso y los co-productos solubles se removieron por un lavado de flujo de vórtice de 1 minuto con DMF (aproximadamente 50 mi) luego se drenó. Se disolvieron 2.5 mmol de H-AlaOtBu.HCl en 4.75 mi de HÓBT 0.5 M (2.375 mmol) en DMF que contiene 150 microlitros (111 mg, 0.825 mmol) de DIEA, y se dejó reaccionar con HOOC-CH2CH2CO) TD-succinil) 12-O-resina activada con CDI (0.5 mmol) durante 1 hora con agitación con vórtice y luego se drenó. Se removieron los reactivos en exceso y los co-productos solubles por un lavado de flujo de vórtice de 1 minuto con DMF (aproximadamente 50 mi) y luego se drenaron. El producto terBuOOC-CH(CH3) - H-OC-CH2CH2CO (TTD-succinil) 12-0-resina se lavó extensivamente con DCM (dielorómetaño) , se drenó y luego la resina se secó bajo vació en peso constante. El peso típico del producto-resina fue de aproximadamente 2 gramos . El polímero (Succ-TTD) 12SuccAlaOtBu lineal se escindió del soporte de resina de acuerdo a los procedimientos normales de la química de Fmoc usando TFA al 4% en DCM. El producto crudo precipitado se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se liofilizó. El polímero liofilizado se disolvió en una cantidad pequeña de acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se eluyó para reducir la concentración de los orgánicos por abajo de 1%. El producto crudo se cargó en una columna de fase invertida, preparativa C4 puesta en equilibrio a T = 40°C a 3% de B. Las sales se eluyeron de manera isocrática y la plantilla deseada se purificó con un gradiente lineal de amortiguador B al 20-35% (acetonitrilo que contiene TFA al 0.1%) contra TFA acuoso al 0.1% durante 60 minutos. Las fracciones que contienen el material de (Succ-TTD) 12-Succ-AlaOtBu deseado (GRFNP39) se identificaron por ES-MS, se congelaron y liofilizaron .

C. Síntesis de una plantilla que tiene múltiples grupos amina para ramificación y un grupo aminooxi protegido para la unión (posterior) a la proteína (GRFNP40) La plantilla GRFNP40 se sintetizó manualmente en una resina de generación de amida Sieber a una escala de 0.4 mmol. Hubo un paso de lavado con flujo de 1 minuto con D F entre cada paso de acoplamiento, desprotección y activación. Se acoplaron 2 mmol de ácido N^-Fco-N13 (Boc-aminooxiacetil) -L-diaminopropiónico a la resina, usando una pre-activación de NHS-éster de 30 minutos con 2 mmol de DIC y 2 mmol de NHS en DC /DMF (dimetilformamida) , durante 1 hora. Después de la remoción del grupo protector de Fmoc (2 x 3 minutos, 20% v/v de · piperidina en DMF y lavado, 4 mmol de anhídrido succínico disuelto en 8 mi de una solución de HOBT (N-hidroxibenzotriazol ) 0.5 M que contiene 2.2 mmol de DIEA se acoplaron a la resina y durante 10 minutos. Después de este paso, el grupo carboxilo se activo a 8 mi de solución fresca de CDI 0.5 M (4 mmol) en DMF. Se adicionaron 4 mi (18.2 mmol) de TTD en 4 mi de solución de HOBT 0.5 M en DMF y se acoplaron durante 30 minutos. Se acopló Fmoc-Lys (Fmoc) -OH (2 mmol) a la amino-TTD-Succ-Dp (Bocaza) -resina resultante (donde Dpr = ácido diaminopropiónico) usando una pre-activación de 30 minutos con 2 mmol de DIC y 2 mmol de NHS en DMF y acoplamiento durante 1 hora. Este acoplamiento se repitió una vez. Después de un paso de remoción de Fmoc (2 x 3 minutos 20% v/v de piperidina en DMF) , se acoplaron 4 mmol de Fmoc-Lys (Fmoc) - OH como se describe anteriormente, incluyendo reacoplamiento . Después de un paso final de protección de Fmoc (2 3 minutos de piperidina al 20% v/v en DMF) , la plantilla se escindió del soporte de resina de acuerdo a los procedimientos normales de la química de Fmoc usando TFA al 4% en DCM. El producto precipitado se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA a 0.1% y se liofilizó. El producto crudo liofilizado se disolvió en una cantidad pequeña de acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se diluyó para reducir la concentración de los productos orgánicos por abajo de 1%. La plantilla se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, preparativa, C4 puesta en equilibrio a T = 40°C en amortiguador B al 3% (TFA al 0.1% en acetonitrilo) . Las sales y otro material de no amida se eluyeron isocráticamente y la plantilla deseada se purificó con un gradiente lineal de amortiguados B al 5-12% (acetonitrilo que contiene TFA al 0.1%) contra TFA acuoso al 0.1% durante 60 minutos. Las fracciones que contienen el material deseado de Lys-Lys (Lys) TD-Succ-Dpr (Bocaza) . amida (GRFNP40) se identificaron por Es-MS, se congelaron y liofilizaron .

D . montaje y desprotección del polímero ramificado acoplado a amida (GRFNP41) El GRFNP41 polímero ramificado GRFNP41 de peso molecular de 16 kDa se sintetizó al acoplar GRFN 39 [ (Succ-TTD) 12Succ-AlaOtBu] a la plantilla purificada GRFNP40. EL (Succ-TTD12-Succ-AlaOtBu purificado (GRFNP39) (1.0 mmol) disuelto en DMSO (dimetilsulfóxido) a 60 °C a una concentración de 20 mg/ml se activó con 0.95 mol de HATU {hexafluorofosfato de 0- (7-azabenzotriazol-l-il) -1, 1,3, 3-tetrametiluronio} en DMSO a una concentración de 10 mg/ml en la presencia de un exceso de veinte veces (molar) de DIEA. La plantilla purifica GRFNP40 (0.24 mol) disuelta en DMSO a una concentración de 3.9 mg/ml se adicionó inmediatamente. Se - monitoreo el progreso de la reacción por HPLC de fase invertida, analítica C4 y ES-MS. Típicamente, el acoplamiento se terminó dentro de unos minutos. Para el tratamiento, se adicionaron 4 volúmenes (con relación a la mezcla de ligación) de acetato de sodio 0.1/cloruro de guanidinio 6 M, pH 4 y la solución se cargó en una columna de PHLC de fase invertida, preparativa (C4) . Las sales y otro material que no contiene amida se eluyeron isocráticamente y el producto deseado de polímero ramificado se purificó con un gradiente lineal de amortiguador B al 20-35% (acetonitrilo que contiene TFA al 0.1%) contra TFA El polímero purificado resultante se disolvió en TFA puro a una concentración de 1 mg/ml durante 1 hora para remover el grupo Boc de la porción de aminooxxacetilo y para remover los grupos éster de ter-butilo de las porciones de -Ala-OtBu. La solución se hizo girar hasta sequedad en un evaporador giratorio y el polímero seco se disolvió en amortiguador B 50% (acetonitrilo que contiene TFA al 0.1%). Se adicionó ácido aminooxiacético (a.k.a. "carboximetoxilamino" ) a .una concentración final de 0.5 M para eliminar las impurezas de formación de aducto. Después de 20 minutos, la solución se diluyó con 3.3 volúmenes de amortiguador A (TFA al 0.1% en agua), se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, C4, preparativa y se bombeó en amortiguador B al 10% hasta que se removió todo el ácido aminooxiacético, entonces el polímero se purificó con un gradiente gradual de amortiguador B de 15% a 45% contra TFA acuoso al 0.1% durante 80 minutos. Las reacciones mezcladas que contiene mezcladas que contienen el material deseado del polímero ramificado (GRFNP41) se congelaron y liofilizaron.

E. Ligación de formación de oxima (Oximación) de los segmentos peptídicos GRFN177S y GRFN1711 con el polímero ramificado GRFNP41 Los segmentos SEP-1:4 (GRFN1776, compuestos de los residuos 117-166 de SEQ ID NO: 2 y el segmento SEP-1:1 (GRFN1711, compuesto de los residuos 1-32 de SEQ ID NO: 2 se sintetizaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 1 usando SPPS de química de Boc de neutralización in situ, normal. El péptido GRFN1776 se sintetizó en una -OCH2 - Parra-Resina siguiendo los protocolos normales también como se describe anteriormente. El péptido GRFN1711 se sintetizó en una resina de generación de tioéster siguiendo los protocolos normales como se describe anteriormente. El segmento GRFN1776 que contiene una porción de acilo levulínico en Lys12S y el GRFNP41 que contiene AoA-se disolvieron conjuntamente a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución se liofilizó. El producto crudo en polvo, seco se re-disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se cargó en una columna de HPLC de fase invertida (C4) preparativa. El péptido modificado con polímero se separó del péptido no modificado y el polímero sin reaccionar por HPLC de fase invertida, de gradiente preparativo. Las fracciones que contienen el producto deseado enlazado a oxima (oximado) SEP-1:4+GP41 se identificaron por ES-MS y se mezclaron y liofili zaron .

El segmento GRFN1711 que contiene una porción de acilo levulínico en Lys24 y el GRFNP41 que contiene AoA se disolvieron conjuntamente a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución se congelo y liofilizó. El polvo seco se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, preparativa C4. El péptido modificado con polímero se separó del péptido no modificado y el polímero sin reaccionar por HPLC de fase invertida, C4 , de elución gradiente, preparativa. Las fracciones que contienen el producto deseado enlazado a oxima (oximado) SEP-1:1+GP41 se identificaron por ES-MS, y se mezclaron y liofilizaron .

F . · Síntesis de proteína sintética que estimula la eritropoyesis SEP-1-B51 La SEP-1-B51 que tiene (SEQ ID NO:2), se sintetizó en solución a partir de cuatro segmentos de polipéptido: Segmento SEP-1:1+GP41 (GRFN 1711 + GRFNP41, que corresponde a los residuos 1-32 de SEQ ID NO: 2) : ' APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EH-tioéster (donde Lys24 tiene una porción colgante de acilo levulínico enlazada a oxima al polímero ramificado GRFNP41 denotado por Kox; donde His32 está protegido con Dnp) Segmento SEP-1:2 (GRFN 1712, que corresponde a los residuos 33-88 de SEQ ID N0:2) : CSLNEKIT VPDTKVNFYA KRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioéster (donde Cys33 está protegido con Acm; y donde los tres residuos de Trp están protegidos con formilo) Segmento SEP-1:3 (GRFN 1713, que corresponde a los residuos 89-116 de SEQ ID NO: 2) : CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioéster (donde Cys69 está protegido con Acm; y donde His94 está protegido con Dnp) Segmento SEP-1:4+GP41 (GRFN 1776 + GRFNP41, que corresponde a los residuos 117-166 de SEQ ID NO: 2) : CASI PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR-carboxilato (donde la cisteína C-terminal (es decir, Lys126) porta un grupo protector de picolilo (pico) y donde Lys126 tiene una porción colgante de acilo levulínico enlazado a oxima a polímero ramificado GRFNP41, como se detona por Kox) .

La síntesis de péptidos adicionales, reacciones de ligación, carboximetilación, reacciones de remoción de grupos protectores, plegado y purificación para producir SEP-1-B51 plegada, de longitud completa (SEQ ID NO:2) se realizaron como se describe en los Ejemplos 1-4, con las siguientes modificaciones: Paso 1: Ligación #1. El segmento SEP- 1.· 4+GP41 se disolvió en TFE (1 volumen) a una concentración de 3 mM. El segmento SEP-1:3 se disolvió en 2 volúmenes de amortiguador de fosfato de Na 300 mM (pH 7.9) que contiene cloruro de guanidinio 6 M una concentración de 2.25 mM. Las dos soluciones se mezclaron, dando concentraciones finales de segmento de SEP-1:4+GP41 1 mM y SEP-1:3 1.5 mM, y se adicionó tiofenol al 1%, dando por resultado una solución ("3 volúmenes") de los segmentos de péptido a un pH de 6.8-7.2. La reacción se dejó proseguir durante la noche a temperatura ambiente. Después de la ligación, se adicionó ß-mercaptoetanol (3 volúmenes) a la mezcla de ligación, seguido por 3 volúmenes de cloruro de guanidinio 6 M, amortiguador de fosfato de Na 300 mM, pH 7.9 y se adicionó TCEP (0.25 en peso del peso total de los segmentos de péptido) y la solución se agitó durante 20 minutos. La solución se acidificó a pH 4.0 +/-0.1 con 0.6 volúmenes de ácido acético glacial para dar una solución clara a la cual se adicionaron 30 volúmenes de amortiguador de dilución de acetato de Na 100 mM, pH 4.0, 6 M en cloruro de guanidinio. La solución resultante se bombeó en una columna de HPLC de fase invertida (C4) preparativa. Se bombeó amortiguador B al 5% [de esta manera el resto es amortiguador A al 95% (TFA al 0.1% en agua)] hasta que todos los materiales no peptídicos se han eluido de la columna, luego el producto de ligación se purificó por un gradiente de amortiguador B al 25-45% durante 80 minutos. Las fracciones que contienen el producto ligado, deseado (Cys83 (Acm) ) {SEP-l : 3+SEP-l : 4+GP41 } se identificaron por. espectrometría de masa con electrorociado y se mezclaron. Paso 2: Remoción #1 de Acm. Para la remoción de Acm, la solución de acetonitrilo acuoso que contiene las fracciones mezcladas de (Cys89 (Acm) ) {SEP-l : 39+SEP-l : 4+GP41} se diluyeron lx con agua grado HPLC y se adicionó urea sólida para una concentración final de 2 M. Se adicionó un exceso molar de tres veces (con relación a la concentración total de cisteína) de una solución de 30 mg/ml de Hg (acetato) 2 en ácido acético acuoso al 3% y la solución se agitó durante 1 hora. La solución entonces se hizo al 20% en ß-mercaptoetanol, se cargo en una columna de HPLC de fase invertida, semi-preparativa se bombeó en un amortiguador B al 25% hasta que todo el material no peptídico se ha eluido, y el producto entonces se purificó con un gradiente gradual a amortiguador B al 50%. Las fracciones que contienen el producto ligado, deseado { SEP-l :3+SEP-l : 4+GP41} se identificaron por espectrometría de masas con electrorociado, se mezclaron y liofilizaron. Paso 3: Ligación #2. El producto { SEP-l : 3+SEP-l:4+GP4l} [es decir 1713-1776-GP41] del paso 2 se disolvió en TFE (1 volumen) a una concentración de 3 mM. El segmento SEP-1:2 (segmento GRFN1712) se disolvió en 2 volúmenes de amortiguador de fosfato de Na 300 mM (pH 7.9) que contiene cloruro de guanidinio 6 M a una concentración de 2.25 mM. Las dos soluciones se mezclaron, dando concentraciones finales de segmento de 1 mM {SEP-1 :3+SEP-l :4+GP4l} y SEP-1:2 1.5 mM y se adicionó tiofenol al 1%, dando por resultado una solución ("3 volúmenes") de los segmentos peptidicos a un pH 6.8-7.2. La reacción se dejó proseguir durante la noche a temperatura ambiente. Luego, la mezcla de ligación se diluyó con 3 volúmenes (es decir, con relación al volumen de TFE usado anteriormente) de amortiguador de dilución: acetato de sodio 100 mM, pH 4.0 que contiene cloruro de guanidinio 6 M y luego se adicionó a una solución, se enfrío a 4°C, que consiste de 3 volúmenes de TFE, 3 volúmenes de ß-carcaptoetanol , 3 volúmenes de piperidina y 6 volúmenes de cloruro de guanidinio 6 M, acetato de Na 100 mM, pH 4.0 y se agitó durante 20 minutos a temperatura ambiente para remover cualquier grupo protector restante. La solución se acidificó con 1.8 volúmenes de ácido acético glacial congelado para dar una solución clara a la cual se adicionó TCEP (0.25 en peso del peso total de segmentos peptidicos) y la solución se incubó durante 20 minutos. Luego, se adicionaron 30 volúmenes de amortiguador de dilución de acetato de sodio 100 mM, ?? 4.0, 6 ? en cloruro de guanidinio y la solución se mezcló. La solución resultante se bombeó en una columna de HPLC de fase invertida (C4) preparativa. El amortiguador se bombeó al 30% (amortiguador C. TFA al 0.1% en 60% de isopropanol/30% de acetonitrilo/10% de agua) hasta que todos los materiales no peptídicos se han diluido de la columna, luego el producto de ligación se purificó por un gradiente de amortiguador C al 37-57% durante 80 minutos. Las fracciones que contienen el producto ligado, deseado (Cys33 (Acm) ) {SEP-1 : 2+SEP-l : 3+SEP-l : 4+GP41 } se identificaron por ES-MS y se mezclaron y liofilizaron . Paso 4: Carboximetilación de residuos Cys89 y cys117. El (Cys33 (Acm)) { SEP-1 : 2+SEP-l : 3+SEP- 1 : 4+GP41 } [es decir (Cys33 (Acm) ) -1712 -1713 -1776-GP41] se disolvió en TFE a una concentración de 1 mM. Se adicionaron 10 volúmenes de amortiguador de fosfato de sodio 300 mM (pH 7.9) que contiene cloro de guanidinio 6 M. Se adicionó un exceso de 25 veces (con respecto a los grupos sulfhidrilo) de ácido bromoácetico disuelto en metanol a 75 mg/ml y la solución se dejó reaccionar con agitación durante dos horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción luego se diluyó con 11 volúmenes de acetato de sodio 100 mM, pH 4.0, cloruro de guanidinio 6 M y se cargó en una columna de HPLC de fase invertida (C4) preparativa y se bombeó a amortiguador C al 20% hasta que todos los componentes no peptídicos se han diluido, entonces el producto de ligación se purificó con un gradiente gradual a amortiguador C al 55%. Las fracciones que contienen el producto modificado, deseado (Cys33 (Acm) ; ?89'117) {SEP-l:2+SEP-l:3+SEP-l:4+GP4l} se identificaron por ??-MS y se mezclaron y liofilizaron. Paso 5: Remoción de picolilo . Polvo de zinc (71 miligramos por miligramo de péptido) se activó en HC1 2 M durante 5 minutos, la activación se repitió una vez, luego el zinc se lavó durante 10 minutos con cloruro de guanidinio 6 M, glicina 50 mM pH 2.2 que contiene 35 mg/ml (recientemente adicionado) de L-metionina y 35 mg/ml de dodecanoilsarcosina sódica y TFE al 10% v/v, para remover el exceso de ácido. El lavado se repitió una vez. El péptido que contiene (Cys161 (Pico) (Cys33 (Acm) ; ?89'117) {SEP-1 : 2+SEP-1 :3+SEP-l : 4+GP41} se disolvió en TFE puro a una concentración de aproximadamente 30 mg/ml. La solución se diluyó con 4 volúmenes (con relación a TFE) de cloruro de guanidinio 6 M, glicina 50 mM, pH 2.2, que contiene 35 mg/ml (recientemente adicionada) de L-metionina y 35 mg/ml de dodecanoilsarcosina sódica y TFE al 10% v/v. La solución se adicionó al polvo de zinc activado y se agitó durante 50 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se monitoreó por HPLC de fase invertida, C4 analítica de alícuotas (tratadas con un volumen igual de ß-mercaptoetanol y unos pocos granos de TCEP, luego se diluyó con 2 volúmenes de cloruro de guanidinio 6 M, acetato de sodio 100 mM, pH 4.0 para análisis) a intervalos de 1 hora y se terminó después de 2 a 5 horas. Después de que se terminó la remoción del grupo picolilo, como se muestra por el análisis de ES-MS de los picos analíticos de H'PLC (es decir pérdida de masa de 91Da) , el sobrenadante se removió por filtración y el polvo restante de Zn se lavó 3 veces con cloruro de guanidinio 6 M, pH 4 acetato 100 mM que contiene 35 mg/ml de L-metionina y 35 mg/ml de dodecilsarcosina que contiene TFE al 20%. Cuentas SM-2 de BioRad (aproximadamente un tercio del volumen de la solución) se adicionaron al sobrenadante y lavados combinados y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego se filtro. Se adicionó ß-mercartoetanol al 10% v/v, luego se adicionaron 0.25x (peso combinado de péptido) de TCEP y la solución se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La solución se diluyó 1:1 con un volumen igual de acetato de Na 100 mM, pH 0.4, cloruro de guanidinio 6 M se cargó en una columna de HPLC de fase invertida (C4) preparativa y amortiguador C al 35% se bombeó hasta que se eluyó todo el material no peptídico, y el producto deseado se purificó con un gradiente gradual de amortiguador C al 55%. Las fracciones que contienen el producto deseado, desprotegido de Cys161 (Cys33 (Acm) ; ?89'117) {SEP-1 :2+SEP-l :3+SEP-l :4+GP41-Pico} se identificaron por espectrometría de masas con electrorociado y se mezclaron . Paso 6: Remoción #2 de Acm. La solución mezclada de (Cys33 (Acm) ; ?85'117) {SEP-1 : 2+SEP-l : 3+SEP-l : 4+GP41-Pico} [es decir (Cys33 (Acm); ?89'117) -1712-1713-1776-GP41] se diluyó 3x con agua grado HPLC, y se adicionó urea sólida para una concentración final de 2 M. Una relación molar de tres veces (con relación a la concentración total cisterna) de una solución de 30 mg/ml de Hg (acetato) 2 en ácido acético acuoso al 3% se adicionó y la solución se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución entonces se hizo al 20% en ß-mercaptoetanol , y se cargó en una columna de HPLC de fase invertida (C4) semi-preparativa . Se bombeó amortiguador C (20%) hasta que se ha eluído todo el material no peptídico y entonces el producto deseado se purifica con un gradiente gradual de amortiguador C al 55%. Las fracciones que contiene el producto deseado (Cys33; ?89,117) {SEP-1 : 2+SEP-1 :3+SEP-l :4+GP41-Pico} se identificaron por ES-MS, se diluyeron 2x (v/v) con agua que contiene 2x (p/p) con relación a la masa de péptido) de DPC (dodecilfosfocolina) y se liofilizaron durante la noche. Paso 7: Ligación #3 (Cys33; ?89'117) { SEP-1 : 2+SEP-l:3+SEP-l:4+GP41-Pico} [es decir (Cys33; ?89'117) -1712-1713-1776-GP41] se disolvió en TFE puro (1 volumen) a una concentración de 3 mM. Se disolvió SEP-1 :1 [es decir 1711-GP41] en 2 volúmenes de amortiguador de fosfato de Na 300 mM (pH 7.9) que contiene cloruro de guanidinio 6 M. Las soluciones se combinaron y se adicionó tiofenol al 1% v/v. La mezcla de ligación se agitó durante la noche a temperatura ambiente. A la solución se adicionaron 3 volúmenes (con relación al volumen de TFE anterior) de ß-mercaptoetanol y 9 volúmenes de amortiguador de ligación (amortiguación de fosfato de Na 300 mM, pH 7.9, que contiene cloruro de guanidinio 6 M) . A la solución se adicionó 0.25x (peso combinado de péptido) de TCEP y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se adicionó ácido acético glacial (0.6 volúmenes) para acidificar la solución a pH 4.0 y la solución entonces se diluyó con 30 volúmenes de acetato de sodio 100 mM, pH 4.0 que contiene cloruro de guanidinio 6 M y se cargó en una columna de HPLC de fase invertida (C4) preparativa. Se bombeo el amortiguador C (25%) hasta que se eluyó todo el material no peptídico, entonces el producto de ligación se purificó con un gradiente . lineal de amortiguador C de 35-55% durante 80 minutos. Las fracciones que contienen el producto ligado, deseado SEP-1 (1-66) (?89'117) {SEPl : 1 (+GP41) +SEP-1 : 2+SEP-1 : 3+SEP-l :4+GP41-Pico} : (SEQ ID N0:2) se identificaron por espectrometría de masas con electrorociado, y se mezclaron. Paso 8 Plegado: A las fracciones que contienen el péptido ligado, de longitud completa SEP-1 (1-66) (?89,117) {SEP-1:1 (+GP41) +SEP-1 : 2+SEP-l : 3+SEP-l : +GP41-Pico} [es decir 1711 (GP41) -1712-1713-1776-GP41] se adicionó cloruro de guanidinio sólido, amortiguador Tris 1 M (pH 8.7) y agua destilada para hacer la solución final 0.1 miligramos por mi de péptido ligado SEP-1 (1-66) , cloruro de guanidinio S M, Tris 100 mM. Esta solución de péptido ligado ( ""proteína 11 ) se cargó en cartuchos de diálisis de 15 mi y se dializó durante la noche a 4°C contra una solución de amortiguador Tris 100 mM (pH 8.5) que contiene cloruro de guanidinio 3 M, cisteína 5 micromolar y cistina 2 micromolar. La solución de proteína entonces se dializó contra una solución de amortiguador Tris 100 M (pH 8.5) que contiene cloruro de guanidinio 1 M durante 8 horas a 4°C y finalmente se dializó' contra amortiguador Tris 10 mM (pH 7.0) durante 14 horas a 4°C para producir el producto plegado, final. Las soluciones que contienen la proteína plegada de los cartuchos de diálisis se combinaron. El plegado se verificó por ES-MS, RP-HPLC analítica y espectrometría con CD. Paso 9 Purificación: La solución que contiene la proteína plegada se cargó en una columna de intercambio iónico Q-Sefaraose puesta- en equilibrio a Tris 10 mM, pH 7.0. La proteína plegada se eluyó usando un gradiente salino lineal a NaCl 125 mM. Se identificaron las fracciones que contienen el producto plegado, deseado SEP-1-B51 por SDS-PAGE no reductora, y se mezclaron. Las fracciones combinadas se concentraron por ultrafiltración a una concentración de aproximadamente 2 miligramos por mililitro, entonces la solución de proteína se cargó en una columna de filtración en gel S-300 de 2.6x100 cm. La SEP-1-B51 purificada se eluyó con Tris 10 mM, pH 7.0, cloruro de sodio 137 mM. Las fracciones que contienen SEP-1-B51 de alta pureza se identificaron por SDS-PAGE no reductora y se mezclaron, se congelaron y almacenaron a -80 °C. La proteína plegada, purificada, final SEP-1-B51 se caracterizó por HPLC de fase invertida (C4) analítica, ES-MS, por SDS-PAGE no reductor, y espectrometría con CD. La Figura 27 muestra un Gel de Enfoque Isoeléctrico (IEF) representativo y un gel de SDS-PAGE no reductor que muestran el peso molecular relativo de la SEP1-B51 purificada, plegada. Una corrida normal de peso molecular en los mismos geles se muestra por comparación. Como se muestra, el peso molecular relativo de SEP-1-B51 como se determina por SDS-PAGE no reductor es de aproximadamente 73 kDa. El pl , relativo es de aproximadamente 5.0. También se muestra un cromatograma de RP-HPLC representativo del producto SEP-1-B51 purificado, plegado. Esto ilustra la pureza y el peso molecular relativo incrementado de las proteínas de precisión modificadas con polímero de la presente invención.

Ejemplo 8 Síntesis de Proteína Sintética que Estimula la Eritropoyesis SEP-1-B52 A. Composición de SEP-1-B52. Una séptima proteína sintética que estimula la eritropoyesis (designada SEP-1-B52) se sintetizó. La secuencia de aminoácidos de la SEP-1-B52 de longitud completa es la misma como aquella de SEP-1-B51: APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEK°ITTGCA EHCSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPWvyP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK\j/AIS PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR (SEQ ID NO: 2) donde ? denota un residuo de aminoácido no nativo que consiste de una cisteína que está carboximetilada en el grupo sulfhidrilo, y donde Kox denota una lisina no nativa que está modificada químicamente en el grupo e-amino como un grupo ligador de oxima acoplado a un polímero designado soluble en agua a través de un enlace de oxima. La proteína SEP-1-B51 se derivatizó en los residuos 24 y 126 con una construcción de polímero (Succ-TTD) 12-Succ- la ramificado similar a SEP-1-B51, pero para este análogo, el polímero se unió vía un enlace de. oxima entre ácido pirúvico y ácido aminooxiacético . Además, el grupo e-amino de los residuos 24 y 126 de lisina se modificaron para tener un grupo funcional de aminooxiacetilo en lugar de una porción de acilo levulínica y la construcción de polímero (Succ-TTD) 12-Succ-Ala ramificado se elaboró para tener una porción de acilo pirúvica colgante. Estos cambios se diseñaron para mejorar la síntesis de manejo y para incrementar adicionalmente la estabilidad de los enlaces de oxima . La Figura 25 es un esquema que ilustra la síntesis química del polímero ramificado soluble en agua GRFNP43 (GP43) que se unió a la SEP-1-B52 a través de la ligación de formación de oxima como se describe posteriormente. El montaje del producto de longitud completa fue como se describe en el Ejemplo 2. La estructura de SEP-1-B52 se muestra en la Figura 26.

B. Síntesis de (Succ-TTD) 1 -Succ-Ala0tBu (GRFNP39) para el acoplamiento en la plantilla de ramificación (GRFNP42) Se sintetizó (Succ-TTD) 12-Succ-AlaOtBu (GRFNP39) a una escala de 0.5 mmol . Se hinchó en DMF durante 15 minutos la resina de poliestireno (sustitución de hidroxilo 1.02 mmol/g) que genera ácido carboxílico, lábil, ácida, Sasrin 0.5 mmol (aproximadamente 0.5 gramos) y luego se drenó. A esta resina con grupos funcionales hidroxilo se adicionaron 450 mg (4.5 mmol) de anhídrido succínico y 488 mg (4 mmol) de 4- (dimetilamino) piridina disuelta en 8 mi de DMF que contiene 500 microlitros (3.9 mmol) de DIEA (diisopropiletilamina) y se dejó reaccionar durante 30 minutos con agitación con vórtice, luego se drenó. El acoplamiento se repitió y los reactivos en exceso y los cóproductos solubles se removieron por un lavado con flujo de vórtice de 1 minutos con DMF (aproximadamente 50 mi) luego se drenaron. La HOOC-CH2CH2CO-0-resina (0.5 mmol) se activó por la adición de 8 mi de solución de CDI 1.0 M (8 mmol) en DMF y se dejó reaccionar durante 40 minutos, luego se drenó. Los reactivos en exceso y los cóproductos solubles se removieron por un lavado de flujo de vórtice de 1 minuto con DMF (aproximadamente 50 mi) y se drenaron. 4 mi (4 gramos, 18.12 mmol) de TTD disuelto en 4 mi de solución de HOBT 0.5 M (2 mmol) en DMF se adicionó y se dejó reaccionar con agitación con vórtice durante 30 minutos y se drenó. Los reactivos en exceso y los coproducíos solubles se removieron por el lavado con flujo de vórtice de un minutos con DMF (aproximadamente 50 mi) y se drenaron. Se adicionó anhídrido succínico (450 mg, 4.5 mmol) disuelto en 8 mi de solución de HOBT (N-hidroxibenzotriazol) 0.5 M (4 mmol) que contiene 500 microlitros (3.9 mmol) de DIEA a la resina y se dejó reaccionar con agitación con vórtice durante 15 minutos, luego se drenó. Los tres pasos (activación con CDI; acoplamiento con TTD; reacción con anhídrido succínico) se repitieron once veces [es decir, un total de doce veces] . Los reactivos en exceso y los co-productos solubles se removieron por un lavado con flujo de vórtice de 1 minuto con DMF (aproximadamente 50 mi) y se drenaron. La HOOC-CH2CH2C0 (TTD-succinil) 12-0-resina (0.5 mmol) se activó con 8 mi de solución de COI 1.0 M (8 mmol) fresca en DMF, se dejó reaccionar durante 40 minutos y se drenó. Se removieron los reactivos en exceso y los co-productos solubles por un lavado con flujo de vórtice de 1 minuto con DMF (aproximadamente 50 mi), y luego se drenó. Se disolvieron 2.5 mmol de H-AlaOtBu . HC1 en 4.75 mi de HOBT 0.5 M (2.375 mmol) en DMF que contiene 150 microlitros (111 mg, 0.825 mmol) de DIEA, y se dejó reaccionar con la HOOC-CH2CH2CO (TTD-succinil ) 12-0-resina activada con CDI (0.5 mmol) durante 1 hora con agitación con vórtice, luego se drenó. Los reactivos en exceso y los coproductos solubles se removieron por un lavado con flujo de vórtice de 1 minuto con DMF (aproximadamente 50 mi) , y luego se drenaron.' El producto terBuOOC-CH(CH3) -NH-0C-CH2CH2C0 (TTD-succinil ) 12-0-resina se lavó extensivamente con DCM, se drenó y luego la resina se secó bajo vació a peso constante. El peso típico del producto-resina fue de aproximadamente 2 gramos. El GRFNP39 lineal se escindió del soporte de resina de acuerdo a los procedimientos normales de la química de Fmoc usando TFA al 4% en DCM. El producto crudo precipitado se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se liofilizó. El polímero liofilizado se disolvió en una cantidad pequeña de acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se diluyó para reducir la concentración de los productos orgánicos por debajo de 1%. El producto crudo se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, preparativa C4 puesta en equilibrio a T = 40°C a 3% de B. Las sales se eluyeron isocráticamente y la plantilla deseada se purificó con un gradiente lineal de amortiguador B al 20-35% (acetonitrilo que contiene TFA al 0.1%) contra TFA al 0.1% acuoso durante 60 minutos. Las fracciones que contienen el material deseado (Succ-TTD) 12-Succ-AlaOtBu (GRFNP39) se identificaron por ES-MS, se congelaron y liofilizaron.

C. Síntesis de plantilla que tiene múltiples grupos amina para ramificación y una porción de acilo pirúvica colgante para la unión (posterior) a la proteína (GRFNP42) La plantilla se sintetizó en forma manual en una Boc-Leu-0CH2-Parm-resina a una escala de 0.4 mmol . Un paso de lavado con flujo de 1 minuto con DMF se usó entre cada paso de acoplamiento, desprotección y activación. El grupo Boc se removió por tratamiento con TFA puro (es decir, 100%) . Después del lavado con DMF, se acoplaron 2 mmol de Fmoc-(Rink-ligador) -OH a la resina después de la activación con 1.8 mmol de HBTU en 3.8 mi de DMF que contiene 1 mi de DIEA. Después de la remoción del grupo protector de Fmoc (2 3 minutos, piperidina la 20% en DMF) ; 2 mmol de Fmoc-Lys(MTT = 4-metiltritilo] se acoplaron a la resina usando la activación con HS-éster con 2 mmol de DIC y 2 mmol de NHS en D F. Después de la remoción del grupo protector de Fmoc (2 x 1 minuto, DBU al 0.5% en DMF), se acoplaron 4 mmol de anhídrido succlnico disuelto en 8 mi de una solución de HOBT 0.5 M que contiene 2.2 mmol de DIEA a la resina durante 10 minutos. Después de este paso, el grupo carboxilo unido a la resina se activo con 8 mi de solución fresca de CDI 0.5 M en DMF. Se adicionaron 4 mi de TTD en 4 mi de solución de HOBT 0.5 M y se acoplaron durante 30 minutos. Se acoplaron 2 mmol de Fmoc-Lys (Fmoc) -OH a la resina usando la activación con NHS-éster con 2 mmol de DIC y 2 mmol de NHS en DMF. Después de un paso de remoción de Fmoc (2 x 1 minuto de DBU al 0.5% en DMF) , se acoplaron 4 mmol de Boc-Lys (Boc) -NHS en 3 mi de DMF. El grupo protector de MTT se removió por múltiples lavados con TFA al 2% en DCM. La desprotección estaba completa cuando el sobrenadante perdió su color amarillo. La resina se neutralizó con DIEA a 10% en DMF durante 1 minuto. Se acoplaron 2 mmol de ácido pirúvico a la resina usando activación con NHS-éster con 2 mmol de DIC y 2 mmol de NHS en DMF durante 45 minutos. La platilla se desprotegió y escindió del soporte de resina usando TFA puro que contiene agua al 5%. La solución de escisión se evaporó a sequedad en un evaporador giratorio. El residuo se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se liofilizó. La platilla liofilizada se disolvió en una cantidad pequeña de acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se diluyó para reducir la concentración de los productos orgánicos por debajo de 1%. La plantilla que contiene piruvato se cargó en una columna Prep C4 puesta en equilibrio a T = 40°C a amortiguador B al 0% [es decir, amortiguador A al 100% = TFA al 0.1% en agua] . Las sales se eluyeron isocráticamente y la plantilla deseada se purificó con un gradiente lineal de amortiguador B al 5-12% contra TFA acuoso al 0.1% a 60 minutos. Las fracciones que contienen el material deseado (GRFNP42) se identificaron por ESI- S se congelaron y liofilizaron .

D.- Montaje y desprotección del polímero ramificado acoplado a amida (GRFNP43) El GRFNP43, un (TTD-Succ) 49-polímero ramificado de peso molecular de 16 kDa se sintetizó por acoplamiento de GRFNP39 a la plantilla purificada GRFNP42. El (Succ-TTD12-Succ-AlaOtBu (GRFNP39) purificado (1.0 mmol) disuelto en DMSO a 60°C a una concentración de 20 mg/ml se activó con 0.95 mmol de HATU en DMSO a una concentración de 10 mg/ml en la presencia de un exceso de 20 veces (molar) de DIEA. La plantilla purifica (0.24 mol) de GRFNP42 disuelta en DMSO a una concentración de 3.9 mg/ml se adicionó inmediatamente.

Se monitoreo el progreso de la reacción por HPLC de fase invertida C4, analítica y ES- S. Típicamente, el acoplamiento se terminó en minutos. Para el tratamiento, se adicionaron 4 volúmenes (con relación a la mezcla de ligación) de acetato 0.1 M/cloruro de guanidinio 6 M, pH 4 y la solución se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, preparativa (C4) . Las sales y otro material que no contiene amida se eluyeron isocráticamente y el polímero ramificado del producto deseado se purificó con un gradiente lineal de amortiguador B al 20-35% (acetonitrilo que contiene TFA al 0.1%) contra TFA acuoso al 0.1% durante 80 minutos. Las fracciones que contienen el material deseado se identificaron por ES-MS, se congelaron y liofilizaron . · La construcción de polímero ramificado, purificado, resultante GRFNP43 se disolvió en TFA puro a una concentración de 1 mg/ml durante 1 hora para remover la protección del éster Ala-OtBu-terButilo . La reacción se evaporó a sequedad en un evaporador giratorio y el polímero seco se disolvió en amortiguador B 50% (acetonitrilo que contiene TFA al 0.1%) . El polímero se desaliñó en una HPLC de fase invertida, preparativa con un gradiente gradual de amortiguador B al 15% hasta 45% contra TFA al 0.1% acuoso, en 80 minutos. Las reacciones mezcladas que contienen el material deseado (GRFNP43) se congelaron y liofilizaron y el polvo seco se usó para el paso de ligación de formación de oximación.

E. Ligación de formación de oxima (Oximación) de GRFN1776 y GRFN1711 con el polímero ramificado GRFNP43 Los segmentos SEP-1:4 y el segmento SEP-1:1 se sintetizaron como se describe anteriormente en los Ejemplos 2, 3, 4, y 7, sólo que en lugar de ácido levulínico, se anexo una porción de aminooxiacetilo (AoA) a Lys24 y Lys126 en los segmentos peptídicos respectivos siguiendo los protocolos normales de acoplamiento. De esta manera, después del montaje de las péptido-resinas , el grupo Fmoc de cadena lateral se removió de cada péptido-resina y 2 mmol de ácido Boc-aminooxiacético se adicionó a la resina usando la activación de NHS-éster con 2 mmol de DIC y 2 mmol de NHS en DMF. Los dos péptidos se desprotegieron y escindieron de la resina con HF y se purificaron por HPLC de fase invertida, C4. Se tomaron precauciones adecuadas para evitar la exposición a compuestos de carbonilo. El segmento SEP-1:4 y GRFNP43 se disolvieron conjuntamente a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA (ácido trifluoroacético) al 0.1%. La solución se liofilizó. El polvo seco se re-disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se cargó una columna de HPLC de fase invertida, C4 preparativa. El péptido modificado con polímero se separó del péptido no modificado y el polímero sin reaccionar por HPLC de fase invertida, con gradiente, preparativa. Se identificaron por ES-MS las fracciones que contienen el producto oximado, deseado SEP-1:4+GP43 y se mezclaron. El segmento SEP-1:1 y GRFNP43 se disolvieron conjuntamente a una relación equimolar en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1%. La solución se congeló y liofilizó. El polvo seco se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% que contiene TFA al 0.1% y se cargó en una columna de HPLC de fase invertida, C4, con gradiente, preparativa. El péptido modificado con polímero se separó del péptido no modificado y el polímero sin reaccionar por elución con gradiente de fase invertida, preparativa. Las fracciones que contienen el producto oximado, deseado SEP-1:1+GP43 se identificaron por ES-MS y se mezclaron.

F. Síntesis de, proteína sintética que estimula la eritropoyesis SEP-1-B52 Se sintetizó SEP-1-B52 (SEQ ID NO: 2) , en solución a partir de cuatro segmentos de polipeptido: Segmento SEP-1:1+GP43 (GRFN 1711 + GRFNP43 ; que corresponde a los residuos 1-32 de SEQ ID NO: 2) : APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKoxITTGCA EH-tio.éster (donde Lys24 tiene una porción colgante de AoA enlazada a oxima al polímero ramificado GRFNP43, como se denota por K°x; y donde His32 está protegido con Dnp) .

Segmento SEP-1:2 (G FN 1712; que corresponde a los residuos 33-88 de SEQ ID NO: 2) : CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVKSSQPW-tioéster (donde Cys33 está protegido con Acm; y donde los tres residuos de Trp están protegidos con formilo) Segmento SEP-1:3 (GRFN 1713, que corresponde a los residuos 89-116 de SEQ ID NO : 2) : CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-tioéster (donde Cys89 está protegido con Acm; y donde His94 está protegido con Dnp) Segmento SEP-1:4+GP43 (GRFN 1776 + GRFNP43, que corresponde a los residuos 117-166 de SEQ ID NO: 2) : CAIS PPDAAKoxAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR-carboxilato (donde la cisteína C-terminal (es decir, Cys161) tiene un grupo protector de picolilo (pico) y donde LysglS tiene una porción colgante de AOA enlazada a oxima a polímero ramificado GRFNP43, como se detona por Kox. La síntesis de péptidos adicionales, reacciones de grupos protectores, plegado y purificación se realizan como se describen en los Ejemplo 1, 2, 3, 4, y 7, para producir SEP-1-B52 plegada de longitud completa (SEQ ID NO: 2) que se caracterizó por HPLC de fase invertida (C4) analítica, ES-MS y SDS-PAGE no reductor. Se realizaron los bioensayos como se describe para las otras construcciones de SEP.

Ejemplo 9 Estudios de eficiencia para SEP-3-L42 Se reformuló SEP-3-L42 en amortiguador de Citrato (citrato de sodio 20 mM + cloruro de sodio 100 mM) + albúmina de suero de rata al 0.25% (RSA) y se administró de manera intravenosa a rata macho normales (5 ratas por grupo) a dosis de 0, 1, 5 o 10 pg/kg, tiw, en los Días 1, 3 y 6. Se recolectaron muestras sanguíneas 4 días después de la última inyección (día 9) y se analizaron para los parámetros hematológicos . No hubo diferencias estadísticamente significativas en los valores de las células sanguíneas rojas (RBC) , hemoglobina (HGB) , hematocrito (HCT) , y cuenta de reticulocitos (RET) a los 4 días después de la última inyección con SEP-3-L42, a estas dosis cuando se compararon con aquellas del grupo de control.

Ejemplo 10 Estudios farmacocinéticos para SEP-3-L42 Se reformuló SEP-3-L42 en amortiguador de citrato (citrato de sodio 20 mM + cloruro de sodio 100 mM) + RSA al 0.25%, pH 6.9 y se administró intravenosamente como una dosis individual a ratas macho anormales a un nivel de dosis de 5 pg/kg. Se recolectaron muestras sanguíneas a las 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 horas después de la dosificación. La concentración en plasma de SEP-3-L42 se determinó por un equipo de ELISA anti-EPO (R & D Systems, Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit#DEP00) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran en la Figura 29. Como se muestra en la Figura 29, SEP-1-B50 exhibió una depuración ligeramente más lenta en comparación a SEP3-L42. A pesar de su vida media en circulación, SEP3-L42 falló en exhibir diferencias estadísticamente significativas en la promoción de la producción de células sanguíneas rojas a las dosis probadas. En contraste, la SEP-1-B50 estimuló la producción de células sanguíneas rojas a las mismas dosis. Esto ilustra que la estructura de polímero se puede explotar para el ajuste fino de las propiedades biológicas in vivo, incluyendo comportamiento farmacocinético y potencia.

Ejemplo 11 Estudios de eficiencia para SEP-1-L30 Se reformuló SEP-1-L30 en amortiguador de citrato (citrato de sodio 200 mM + cloruro de sodio 100 mM) + RSA al 0.25% y se administró de manera intravenosa a ratas macho normales (5 ratas por grupo) a dosis de 0, 1, 5, 25, o 50 pg/kg, tiw, en los días 1, 3, 5. Se recolectaron muestras sanguíneas a 4 y 8 días después de la última inyección (días 9 y 13) y se analizaron para los parámetros hematológicos . No hubo diferencias estadísticamente significativas en los valores de RBC, HGB y HCT a ningún intervalo después del tratamiento con SEP-1-L30, cuando se. comparó con aquellos del grupo de control . Las cuentas de reticulocitos fueron mayores a los 4 días después de la última inyección (Día 9) para ratas tratadas con 25 y 50 yg/kg (diferencia estadísticamente significativa cuando se compara con aquellos del grupo de control) . No se observaron otras diferencias en los parámetros hematológicos ni en el día 9 ni en el día 13 para ninguno de los animales tratados con SEP-1-L30. [Datos no mostrados] Ejemplo 12 Estudios farmacocinéticos para SEP-1-L30 Se reformuló SEP-1-L30 en amortiguador de citrato (citrato de sodio 20 mM + cloruro de sodio 100 mM) más RSA al 0.25% pH 6.9, y se administró de manera intravenosa a ratas macho normales a una dosis individual a un nivel de dosis de 5 o 25 ug/kg. Se recolectaron muestras sanguíneas a las 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 horas después de la dosificación. La concentración en plasma de SEP-1-L30 se determinó por un equipo de ELISA ( & D Systems, Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit#DEP00) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. No se detectó SEP-1-L30 en ninguno de los puntos de tiempo a las dosis dadas.

Ejemplo 13 Estudios de eficiencia para SEP-1-B50 Se reformuló SEP-1-B50 en PBS estéril (solución salina amortiguada con fosfato) más RSA al 0.25% y se administró de manera intravenosa a ratas macho normales (5 ratas por grupo) a dosis de 0, 1, 5, 25 o 125 g/kg, tiw, en los días 1, 3, y 6. Se recolectaron muestras sanguíneas a los 4, 9 y 14 días después de la última inyección (Días 10, 15 y 20) y se analizaron para los parámetros hematologicos. Los datos se muestran en la Tabla VIII posterior. Se observó una respuesta relacionada a la dosis en RBC, HGB HCT y RET incrementados a los 4 días después de la última inyección (Día 10) para los animales que recibieron 5, 25 y 125 ug/kg SEP-1-B50 (diferencia estadísticamente significativa en comparación con aquellos del grupo de control) . RBC, HGB y HCT para estos animales permanecieron mayores que los valores de control en el Día 15 y continuaron siendo significativamente mayores que los valores de control hasta el Día 20 (14 días después de la última inyección) para los animales tratados a 125 g/kg. Se redujo la producción de RET después del día 10, con cuenta significativamente menores en los Días 15 y 20 para los animales con 25 y 125 pg/kg.

Tabla VIII Hallazgos Hematológicos Después de Múltiples Dosis de SEP-1- B50 *diferencia significativa del control, p<0.05 **diferencia significativa del control p<0.01 Ejemplo 14 Estudios farmacocinéticos para SEP-1-B50 Se reformuló SEP-1-B50 en amortiguador de Citrato (citrato de sodio 20 mM y cloruro de sodio 100 mM) más RSA al 0.25%, pH 6.9 y se administró de manera intravenosa a ratas macho normales a una dosis individual a un nivel de dosis de 5 o 25 yg/kg. Se recolectaron muestras sanguíneas a las 0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 horas después de la dosificación. La concentración en plasma de SEP-1-B50 se determinó por un equipo de ELISA (R & D Systems Human Erithoropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit #DEP00) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las vidas medias de eliminación se determinaron que son 9.7 y 9.9 horas para la dosis de 5 y 25 ug/kg, respectivamente. El MRT observado (tiempo de residencia medio) fue de 13.6 y 14.4 horas paras la dosis de 5 y 25 ug/kg, respectivamente. En la Figura 29 se muestra un perfil farmacocinético representativo para SEP-1-B50.

Ejemplo 15 Estudios de eficiencia para SEP-1-B51 Se administró SEP-1-B51 de manera intravenosa a ratas macho, normales en dos experimentos. Experimento 1 : se reformuló SEP-1-B51 en amortiguador de citrato (citrato de sodio 20 mM + cloruro de amortiguador de citrato (citrato de sodio 20 mM + cloruro de sodio 100 mM) más RSA al 0.25% y se administró de manera intravenosa a ratas macho (5 ratas por grupo) a dosis de 0, 1, 5, o 25 g/kg, tiw, en los Días 1, 3, y 6 y se recolectaron muestras sanguíneas a los 4, 9 y 14 días después de la última inyección (Días 10, 15 y 20) para análisis de parámetros hematologicos. Los datos se muestran en la Tabla IX posterior. 4 días después de la tercera y última inyección intravenosa con SEP-1-B51 (Día 10) se observó un incremento estadísticamente significativo en los valores de RBC, HGB, HCT, y las cuentas absolutas de reticulocitos (ART) para los animales que recibieron 25 g/kg de SEP-1-B51, en comparación con los valores para el grupo de control . El valor de RBC para estos animales permaneció mayor que el valor de control en el Día 15 y fue comparable al valor de control en el Día 20. Se redujo la producción de reticulocitos después del Día 10, con cuentas significativamente menores observadas para los animales con 5 y 125 yg/kg en el día 15.

Tabla IX Hallazgos Hematologicos Después de Múltiples Dosis de SEP-1- B51 RBC Día 10 Día 15 Día 20 Control 5.66+0 .497 5.62+0 .385 5.90+0. 286 1 pg/kg 5.32±0 .275 5.2310 .470 5.77+0. 200 5 pg/kg 6.22+0 .377 6.1810 .298 6.39+0. 369 25 g/kg 6.70+0 .257** 6.25+0 .348* 5. 4+0. 294 HGB Día 10 Día 15 Día 20 Control 14.3±1 .10 14.2+0 .88 14.8±0. 72 1 pg/kg 13.3+0 .41 13.2+0 .93 14.3+0. 37 5 ug/kg 15.1±0 .53 1 .8+0 .30 15.4±0. 25 25 g/kg 16.5+0 .52** 15.0+0 .91 14.3±0. 64 HCT Día 10 Día 15 Día 20 Control 36.8+3 .08 36.2±2 .59 37.9+1. 93 1 ']ig/ g 34.5±1 .21 33.4±2 .56 37.1+0. 82 5 g/kg 39.9±1 .51 38.6+0 .91 40.2+1. 36 25 pg/kg 43.8±1 .83** 39.3±2 .77 37.2±1. 60 ART Día 10 Día 15 Día 20 Control 0.2910 .089 0.2810 .086 0.21+0. 034 1 ug/kg 0.34+0 .50 0.2310 .055 0.19+0. 075 5 g/kg 0.28+0 .059 0.11±0 .021** 0.20+0. 081 25 ug/kg 0.4810 .121* 0.0610 .054** 1.45+3. ¦100 **diferencia significativa de control, p<0.01 *diferencia significativa de control p<0.05 Experimento 2 : se reformuló SEP-1-B51 en amortiguador de Citrato (citrato de sodio 20 m + cloruro de sodio 100 mM) más albúmina de suero humano al 0.25% y se administró de manera intravenosa a ratas macho (5 ratas por grupo) a dosis de 0, 1, 5, o 25 pg/kg, tiw, en los Días 1, 3, y 5 y se recolectaron muestras sanguíneas a los 2, 4 y 6 días después de la última inyección (Días 7, 9 y 11) para análisis de los parámetros hematológicos . Además, las muestran sanguíneas para las mediciones de los hematocritos únicamente [como volumen celular empacado (PCV) ] se recolectaron diariamente en los días de estudio restantes (Días 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 y 13 ) . Los datos mostrados en la Tabla X posterior. Los valores de HCT (PCV o calculado) se incrementaron significativamente para los animales que recibieron 5 y 25 ug/kg comenzando 2 días después de la primera inyección (Día 3) y continuando hasta 6 días después de la tercera y última inyección (Día 11) . RBC y HGB también se incrementaron de manera significativa en los días que se midieron (2, 4 y 6 días después de la última dosis; Días 7, 9 y 11) para los animales que reciben 5 y 25 µg/kg. ART se incremento de manera significativa sólo para el grupo de 25 pg/kg a los 2 y 4 días después de la última dosis (Día 7 y 9) .

Tabla X Hallazgos Hematológicos Después de Múltiples Dosisv de SEP- 1-B51 RBC Día 7 Día 9 Día 11 Control 5. 61±0 679 5. 23+0 467 5. 34±0. 405 1 yg/kg 6. 08±0 141 5. 70±0 300 5. 67±0. 547 5 µg/kg 6. 29+0 459 6. 07+0 308** 6. 11+0. 248* 25 ug/kg 6. 61+0 295** 6. 24+0 268** 6. 38±0. 173** HGB Día 7 Día 9 Día 11 Control 13 .7±1 07 12 .9±0 79 13 .3±0. 93 1 pg/kg 14 .6+0 27 13 .9±0 19 13 .9+0. 90 5 ug/kg 15 .8±0 50** 14 .9±0 53** 14 .8±0. 18* 25 g/kg 16 .7+0 86** 15 .1+0 66** 14 .6+0. 69* HCT Día 7 Día 9 Día 11 Control 35 .6+3 61 33 .2+2 39 34 .5±3. 19 1 ' g/kg 38 .9±0 82 35 .9+0 94 35 .9+2 43 5 pg/kg 41 .3+1 92** 39 .1+1 01** 39 .2±0 78* 25 g/kg 44 .4+2 08** 39 .7±2 23** 39 .6±2 32** ART Día 7 Día 9 Día 11 Control 0. 50 + 0 158 0. 36+0 093 0. 34+0. 079 1 ug/kg 0. 30±0 044* 0. 30±0 026 0. 25±0 054 5 g/kg 0. 45+0 125 0. 36+0 056 0. 25+0 045 25 g/kg 0. 78±0 117** 0. 71±0 152** 0. 32±0 099 *diferencia significativa del control, p<0.05 **diferencia significativa de control p<0.01 VNota: día 7 (2 días después de la tercera dosis) ; Día 9 (4 días después de la tercera dosis) ; Día 11 (6 días después de la tercera dosis) Se trataron grupos adicionales de ratas con una dosis intravenosa individual de SEP-1-B51 a 25 g/kg, y se recolectaron muestras sanguíneas a las 48 horas después de la inyección para análisis de los parámetros hematológicos . Se recolectaron muestras sanguíneas para la medición sólo de los hematocritos (como volumen celular empacado) a las 8, 24 y 72 horas y a los 7 días después de la inyección (Días 1, 2, 4 y 8) . Los valores de HCT, HGB y A T para las ratas tratadas de manera intravenosa con SEP-1-B51 fueron mayores que aquellos de los animales de control (estadísticamente significativo) el Día 3 (2 días después de la inyección) y también se incremento de manera significativa HCT en estos animales en el día 4.

Ejemplo 16 Estudios de Eficiencia en Modelo Hipoxico y Policitémico para SEP-1-B51 Grupos de 10 ratones -normales cada uno (control con vehículo, eritropoyetina humana glicosilada, recombinante producida en células CHO- ( "rhEPO" ) a 4 niveles de dosis, y SEP-1-B51 a 4 niveles de dosis: 0.32, 1, 5, 25 µg/kg/dosis asumiendo a 100 mü/ng se expusieron 18 horas por día a aire atmosférico mantenido a 506.5 mb en una cámara de alta altitud estimulada durante 20 días. La rhEPO o SEP-1-B51, formulado en amortiguador de Citrato más albúmina de suero humano al 0.25%, se inyectó intravenosamente (IV) a un volumen de 200 L en el cuarto día pos-hipóxico . Dos días más tarde, cada ratón se inyecto intraperitonealmente (i.p.) con 0.2 µ?? de E9Fe. Se estimula captación de RBC-radiohierro 3 días después al medir la cuenta de radioactividad presente en 500 L de sangre tomada por punción cardiaca. La captación de RBC-59Fe de 72 horas (% de dosis) para SEP-1-B51 y rhEPO mostraron una clara respuesta relacionada a la dosis en la captación incrementada de 59Fe con dosis crecientes hasta 5 ]ig/kg, por arriba de lo cual la respuesta llegó a la meseta (25 pg/kg) . Los tres más bajos niveles de dosis por lo tanto se usaron para calcular la regresión lineal. Los análisis por regresión lineal de SEP-1-B51 y rhEPO se presentan en la Figura 30. Las respuestas de SEP-1-B51 y rhEPO fueron esencialmente las mismas. La "relación de potencia" de SEP-1-B51 a rhEPO fue de 1.0035 (intervalo de confianza de 95% 0.6947 a 1.4498) y la potencia de SEP-1-B51 determinada en ' este ensayo fue de 100 mU/ng (intervalo de confianza al 95% de 69-145) . SEP-1-B51 exhibe actividad in vivo similar aquella de rhEPO y actúa de una manera dependiente de la dosis, incluyendo una meseta de respuesta a altas dosis debido a la inducción de un mecanismo de retroalimentación negativa típico para rhEPO en este modelo. Esto ilustra que las estructuras de polímero unidas a sitios precisos de glicosilación definidos por el usuario en la molécula de SEP-1-B51 imitan la actividad in vivo contribuida por las cadenas de azúcar de rhEPO.

Ejemplo 17 Estudios farmacocinéticos para SEP-1-B51 Se dosificaron grupos de ratas macho normales de manera intravenosa con un dosis individual de 5 pg/kg SEP-1-B51 formulada en amortiguador de Citrato más albúmina de suero humano al 0.25%, o rhEPO (equivalente a 500 U/kg) y se mezclaron a 5, 30, 60 minutos, 2, 4, 8 y 24 horas y 2, 3, 4, 5, ¦ 6 y 7 días después de la dosis. Las concentraciones de SEP-1-B51 o rhEPO de las muestras de plasma se determinaron por ensayos de ELISA usando equipo de ELISA anti-EPO de R&D Systems (R & D Systems Human Erithoropoietin Quantikine IVD Immunoassay it #DEP00) de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes. Un análisis por mínimos cuadrados de los logaritmos de las concentraciones se realizó, produciendo los parámetros farmacocinéticos listados en la Tabla XI posterior. El cambió en la concentración en plasma de SEP-1-B51 con el tiempo en ratas macho que reciben una dosis intravenosa individual de 5 pg/kg se puede escribir por una función de disposición farmacocinetica mono-exponencial con vida media de 10.4±0.5 horas. El volumen de distribución del compartimiento central (Ve) para SEP-1-B51 fue de 32.5+2.0 mL/kg. La depuración (CL) fue de 2.15 mL/hr/kg, con un tiempo de residencia medio ( RT) de 15.1+0.7 horas. Por comparación, el cambio en la concentración en plasma de rhEPO en ratas macho que reciben una dosis intravenosa de 5 pg/kg se describió mejor usando una función de disposición farmacocinética bi-exponencial, con una vida media a de 1.2410.22 horas y una vida media ß de 5.5110.40 horas. La Ve para rhEPO fue de 57.0±3.2 mL/kg. El CL fue de 16.0±0.5 mL/hr/kg, aproximadamente 8 veces mayor que aquel de SEP-1-B51. El tiempo de residencia medio (MRT) de rhEPO fue de 5.73±0.17 horas, aproximadamente 3 veces más corto que aquel de SEP-1-B51.

Tabla XI Parámetros Farmacocinéticos para SEP-1-B51 en Comparación a rhEPO presentación gráfica de la depuración plásmica de SEP-1-B51 y rhEPO está en la Figura 31. Estos datos ilustran un incremento significativo en la vida media en circulación para SEP-1-B51 con respecto a la EPO humana, recombinante, glicosilada, y que este incremento es debido a las estructuras de polímero unidas en sitios precisos definidos por el usuario en la molécula. Ejemplo 18 Síntesis de Proteínas Sintéticas Rántes Modificadas con Polímero A fin de ilustrar adicionalmente las proteínas modificadas con polímero de la presente invención, los derivados modificados con polímero de RANTES 2-68 (RANTES G1755-01; Figura 32 y RANTES G1755; Figura 33) y dos derivados modificados con polímero de RANTES 4-66 (RANTES G1805; Figura 34 y RANTES G1806; Figura 35) se prepararon. Las estructuras de estas proteínas modificadas con polímero se muestran en las Figuras 32-35.

Preparación de análogo G1755-01 de RANTES El análogo de RANTES G1755-01, representado en la Figura 32 se sintetizó como sigue. 1. Preparación de AOP- [RANTES (2-33) ] -tioéster aminooxipetano-glioxalil-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-tioéster El segmento peptídico N-terminal AOP- [RATES (2-33 ·) ] -"tioéster (tioéster como se representa como -C(O)SR) que contiene una porción de oxima de aminooxipentano-glioxalilo N-terminal (AOP) se sintetizó por montaje de la secuencia de RANTES (2-33) en una resina de generación de tioéster (Hackeng, et al., PNAS (1999) 96: 10068-10073, y luego se modificó en el N-termino por acoplamiento directo de una porción de oxima de aminooxipentano-glioxalilo [es decir CH2 (CH2) -0-N=CHCOOH] a la resina siguiendo protocolos normales (Wilken et al., Chemistry & Biology (1999) 6(1): 43-51) . La péptido-resina se escindió con fluoruro de hidrogeno y se purificó por HPLC de fase invertida para producir el péptido de a-carboxi-tioéster AOP-RANTES (2-33) -tioéster. Masa observada = 4179.6 Da; masa calculadas 4178.6 Da (composición promedio de isótopo) . 2. Preparación de [ ANTES (34-68) ] -Lys69 (GP6) -Leu70 CSNPAWFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN SLEMSK(GP6)L donde GP6 está unida al N* de Lys69 : a. Síntesis de polímero soluble en agua de péptido y On-{Péptido-Resina} en fase sólida El segmento peptídico C-terminal [RANTES (34-68) ] Lys69 (Fmoc) -Leu70 se sintetizó por SPPS convencional en una Boc-Leu-0CH2-Pam-resina usando los protocolos de activación de HBTU/neutralización in situ para SPPS de la química de Boc como se describe en Schnolzer, et al, Int. J. Pep. Protein Res. (1992) 40:180-193. Después del término del montaje de la cadena, el grupo Fmoc en el nitrógeno épsilon de Lys69 se removió de la péptido-resina protegida con piperidina al 20% en tratamiento con DMF. Entonces se acopló anhídrido succínico en una solución de HOBT en DMF que contiene DIEA a nitrógeno épsilon en Lys69. Después del lavado, el grupo carboxilo libre del ácido succínico unido a la resina se activó por adición de CDI en DMF. Después de otro ciclo de lavado, se adicionaron TTD al 50% en HOBT 0.5 . Después del lavado, el polímero unido a la resina está listo para el próximo ciclo de acoplamiento de anhídrido succínico/activación con CDI/acoplamiento con TTD. Después de 6 ciclos, se acopló anhídrido succínico a la última amina de TTD en solución de HOBT/DMF más DIEA. La resina con polímero soluble en agua lineal/péptido se escindió de la resina con fluoruro de hidrógeno y el producto se purificó por HPLC preparativa de fase invertida para producir [RANTES (34-68) -Lys69 (GP6) -Leu70. Masa observada = 6253 Da; masa calculada - 6252 Da (composición por medio de isótopo) . 3. Preparación de G1755-01 Aminooxipentano-glioxalil-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAWF VTRK RQVCA NPEKKWVREY INSLEMSK (GP6) L (SEQ IN NO. :4) Los segmentos peptídicos N-terminal y C-terminal descritos anteriormente se unieron conjuntamente por ligación química nativa como se describe por Dawson et al, Science 266: 776-779 (1994). El producto de polipéptido de longitud completa en forma reducida se purificó usando HPLC de fase invertida con un gradiente lineal de acetonitrilo contra agua que contiene ácido trifluoroacético al 0.1%. Masa observada = 10,060 Da. El polipéptido de longitud completa con GP6 unido se plegó con formación concomitante de 2 enlaces de disulfuro en amortiguador acuoso que contiene una copla de reducción de una oxidación de cistexna-cistina y se purificó por HPLC de fase invertida siguiendo protocolos normales (Wilken et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (1) :43-51) . El producto plegado fue homogéneo en HPLC. Masa observada = 10,056 Da; masa calculada = 10,058 Da (composición promedio de isótopo) .

Ejemplo 19 · Preparación de Análogo de RANTES G1755 El compuesto G1755 representado en la Figura 3 se sintetizó como sigue. 1. Preparación de n-nonanoil -RANTES (2-33) n-nonanoil -PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-tioéster Se sintetizó n-nonanoil -RANTES (2-33) én una resina de producción de tioéster como se describe anteriormente en el Ejemplo 18 y luego se modificó en el N-termino por acoplamiento directo de ácido n-nonanoico a la resina. El péptido-resina se escindió con sulfuro de hidrógeno y se purificó por HPLC de fase invertida para producir n-nonanoil-RANTES (2-33). Masa observada = 4177.0 Da; Masa calculada = 4177.6 Da (composición promedio de isótopo) . 2. Preparación de RANTES (34-68) -Lys69 (GP6) -Leu70 CSNPAWFVT RKNRQVCANPEKKWVREYIN SLEMSK(GP6)L a. Síntesis de Polímero Soluble en Agua de Péptido y On-{ Péptido-Resina} en fase sólida Se sintetizó RANTES (34 -68 ) -Lys69 (Fmoc) -Leu70 por síntesis peptídica en fase sólida convencional en una Boc-Leu-OCH2-Pam-resina usando los protocolos de neutralización in- situ/activación con HBTU para la síntesis de péptido en fase sólida con química de Boc como se describe anteriormente en el Ejemplo 18. Después del término del montaje de la cadena, el grupo Fmoc en el nitrógeno épsilon de Lys69 se removió del péptido-resina protegido y la construcción GP6 se sintetizó en el péptido-resina como se describe anteriormente en el Ejemplo 18. La resina con polímero soluble en agua lineal/péptido se escindió con fluoruro de hidrógeno y el producto se purificó por HPLC preparativa de fase invertida para producir RANTES (34-68) -Lys69 (GP6) -Leu70. Masa observada = 6252.9 Da; Masa calculada 6252.2 Da (composición promedio de isótopo) 3. Preparación de G1755 nonanoil-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAWF VTRK RQVCA SPEKKWVREY INSLEMSK (GP6) L (SEQ ID NO. :5 a. montaje de péptido de longitud completa por ligación química nativa Los segmentos peptídicos en N-terminal y C-terminal se unieron conjuntamente por ligación química nativa como se describe anteriormente en el Ejemplo 18. El polipéptido de longitud completa en forma reducida se purificó usando HPLC de fase invertida con un gradiente lineal de acetonitrilo contra agua que contiene ácido trifluoroacético al 0.1%. Masa observada = 10060.7 Da; masa calculada = 10058.7 Da (composición promedio de isótopo). b. Plegado y Purificación de Polipéptido Modificado con Polímero Soluble en Agua El polipéptido en longitud completa con GP6 unido se plegó con formación concomitante de 2 enlaces de disulfuro en amortiguado acuoso que contiene una copla de reducción-reducción de cisteína-cistina y se purificó por HPLC de fase invertida como se describe anteriormente en el Ejemplo 18. El producto plegado homogéneo en HPLC. Masa observada = 10057.4 Da; masa calculada = 10054.7 Da (composición promedio de isótopo) .

E emplo 20 Preparación de Análogo de RANTES G1805 El compuesto G1805 representado en la Figura 34 se sintetizó como sigue. 1. Preparación de n-nonanoil-RANTES (2-33) (Tys3Chg) -tioéster nonanoil-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS KG-tioéster donde X = L-Ciclohexilglicina (Chg) · Se sintetizó n-nonanoil-RANTES (2-33) Tyr3Chg) en una resina de producción de tioéster como se describe anteriormente en el Ejemplo 18 y luego se modificó en el N-termino por acoplamiento directo de ácido n-nonanoico a la resina. El péptido-resina se escindió con fluoruro de hidrogeno y se purificó por HPLC de fase invertida para producir n-nonanoil-RANTES (2-33) (Tys3Chg) . Masa observada = 41512.0 Da; masa calculada = 4152.6 Da (composición promedio de isótopo) . 2. Preparación de RANTES (34-68) (Met67Lvs (Lev) ) -Lvs69-Leu70 C5NPAWFVT RKNROVCANP EKKWVREYIN SLEK (Lev) SKL Se sintetizó RANTES (34-68) (Met67Lys) -Lys69 (Fmoc) -Leu70 por SPPS convencional en una Boc-Leu-0CH2-Pam-resina usando los protocolos de neutralización in situo/activación con HBTU para SPPS con química de Boc como se describe anteriormente en el Ejemplo 18. Después del termino de montaje de la cadena, el grupo Fmoc en el nitrógeno épsilon de Lys67 se removió del péptido-resina protegida con piperidina al 20% en tratamiento con D F. Se activó ácido levulínico como el anhídrido simétrico con 1 , 3 -diisopropilcabodiimida y se acopló en nitrógeno épsilon de Lys67. La péptido-resina se escindió con fluoruro de hidrógeno y el producto se purificó por HPLC preparativa se fase invertida para producir RANTES (34-68) (Met67Lys (Lev) ) -Lys69-Leu70. Masa observada = 4433.2 Da; masa calculada = 4434.2 Da (composición promedio de isótopo) . 3. Preparación de G1805 nonanoil-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAWF VTRKNRQVCA SPEKKWVREY INSLEK (Lev-GP29) SKL (SEQ ID NO.: 6) donde X = L-Ciclohexilgricina (Chg) y donde GP29 = construcción de polímero soluble en agua enlazada oxima ramificada representada en la Figura 34 y preparada con se describe en el Ejemplo 4. a. Montaje de Polipéptido de Longitud Completa por Ligación Química Nativa Los segmentos peptídicos N-terminal y C-terminal se unieron conjuntamente por ligación química nativa como se describe anteriormente en Ejemplo 18. el polipéptido de longitud completa en forma reducida se purificó usando HPLC de fase invertida con un gradiente lineal de acetonitrilo con agua que contiene ácido trifluoroacético al 0.1%. Masa observada = 8213.6 Da; masa calculada = 8216.2 Da (composición promedio de isótopo) . b. Unión de GP29 de Polipéptido Ligado de Longitud Completa El polipéptido liofilizado de longitud completa se disolvió y co-liofilizó con una cantidad equimolar de construcción de polímero GP29 soluble en agua ramificado que contiene aminooxiacetilo (AoA) . El polvo seco se disolvió y purificó por HPLC se fase invertida para producir el polipéptido de longitud completa con GP29 unido covalentemente por un enlace de oxima a la funcionalidad ceto en la cadena lateral modificada de la lisina en la posición 67. Masa observada = 23,836 Da; masa calculada = 23,845 Da (composición promedio de isótopo). De manera alternativa, GP29 se unió covalentemente después del plegado del péptido, sin embargo, esto se observó que daba in rendimiento menor. c. Plegado y Purificación de Polipéptido que Contiene GP29 Enlazado a Oxima El polipéptido en longitud completa con GP29 unido se plegó con formación concomitante de 2 enlaces de disulfuro en amortiguador acuoso que contiene una copla de reducción-oxidación de cisteina-cistina y se purificó por HPLC de fase invertida como se describe anteriormente en el Ejemplo 18. El producto plegado fue homogéneo en HPLC. Masa observada = 23,832 Da; masa calculada = 23,840 Da (composición promedio de isótopo) .

Ejemplo 21 Preparación de Análogos de RANTES G1806 El análogo de RANTES, G1806 representa una Figura 35, se sintetizó como sigue. 1. Preparación de n-nonaoil-RANTES (2-33) (Tys3Chg) -tioéster nonanoil-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-tioéster donde X - L-Ciclohexilglicina (Chg) El segmento peptídico n-nonanoil-RANTES (2-33) (Tyr3Chg) -tioéster (tioéster como se representa como -COSR, donde R es grupo alquilo y se sintetizó en una resina productora de tioéster como se describe anteriormente en el Ejemplo 18 y luego se modificó en el N-termino por acoplamiento directo de ácido n-nonanoico a la resina. La péptido-resina se escindió fluorohidrógeno y se purificó por HPLC fase invertida para producir n-nonanoil-RANTES (2-33)Tys3Chg. Masa observada = 4152.0 Da; masa calculada = 4152.6 Da (composición promedio de isótopo). 2. Preparación de RANTES (34-68) (Met67Lys (Lev) ) -Lys69 (Palm) -Leu70 CSNPAWFVT RPNRQVCANP EKKWVREYIN SLE (Lev) S (Palm) L Donde K(lev) es un nitrógeno épsilon modificado con ácido levúlico de Lys67 de Met67Lys cambio de RANTES tipo silvestres; y donde K(Palm) es un nitrógeno épsilon modificado con palmitrato de Lys69 unido a través de una porción amino-octanoica, que tiene la estructura: [sNitrogen Lys69) -C (0) -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C (0) - (CH2) 14-CH3 Se sintetizó RANTES (34-68) (Met67Lys) -Lys69 (Palm) -Leu70 por SPPS convencional en una Boc-Leu-0CH2-Pam-resina usando los protocolos de neutralización in situ/activación con HBTU para la síntesis de péptido en fase sólida con química de Boc como se describe anteriormente en el Ejemplo 18. Después del acoplamiento de Boc-Lys (Fmoc) -OH en la posición 69, el grupo Fmoc se removió con piperidina al 20% en DMF. Se activo el ácido Fmoc-8-amino-octanoico con HBTU/DIEA y se acoplo al nitrógeno épsilon de Lys69. Después de la remoción del grupo Fmoc, se activó ácido palmítico con l-hidroxi-7-azabenzotriazol (HATU) y 1,3-diisopropilcarbodiimida y se acoplo a la resina. El montaje de la cadena entonces se terminó usando procedimientos normales de SPPS con química de Boc como se describe en el Ejemplo 18. Después del termino del montaje de la cadena, el grupo Fmoc en el nitrógeno épsilon de Lys67 se removió con piperidina al 20% en tratamiento don DMF. Se activó el ácido levulínico como el anhídrido simétrico con 1,3-di-isopropilcarbodi-imida y se acoplo en nitrógeno épsilon de Lys67. La péptido-resína se escindió con fluoruro de hidrógeno y el producto se purificó por HPLC preparativa de fase invertida para producir RANTES (34-68 ) (Met67Lys (Lev) ) -Lys69 (Palmit.ato) -Leu70 , Masa observada = 4813.7 Da; masa calculada = 4813.8 Da (composición promedio de isótopo). 3. Preparación de G1806 nonanoil-PXSSDTTPCC FAYIAPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAWF VTRK RQVCA NPEKKWVREY INSLEK (Lev-GP29) SK (Palm) L (SEQ ID NO . : 7) donde X = L-Ciclohexilglicina (Chg) y donde la unión del ácido graso de plamitato ("Palm1') es a través de una porción de amino-octanoico : [sNitrogen Lys69) -C (0) -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C (0) - (CH2) 14-CH3 a. Montaje de Polipéptido de Longitud Completa Modificado con Ácido Graso por Ligación Química Nativa Los segmentos peptídicos N-terminales y C-terminal se unieron conjuntamente por ligación química nativa como se describe en el Ejemplo 18. El polipéptido de longitud completa en forma reducida se purificó usando HPLC de fase invertida con un gradiente lineal de acetonitrilo contra gua que tiene ácido trifluoroacético al 0.1%. Masa observada = 8598.2 Da; masa calculada = 8596.3 Da (composición promedio de isótopo) . b.- Unión del Polímero Soluble en Agua GP29 al Polipéptido de Longitud Completa Modificado con Ácido Graso, Ligado El polipéptido liofilizado de longitud completa se disolvió y se co-liofilizó con una cantidad equimolar del polímero GP29 que contiene AoA. El polvo seco se disolvió y purificó por HPLC de fase invertida para producir el polipéptido de longitud completa con GP29 unido covalentemente por un enlace de oxima a la funcionalidad ceto en la cadena lateral modificada en la lisina en la posición 67. Masa observada = 24,217 Da; masa calculada = 24,224 Da (composición promedio de isótopo). De manera alternativa, se puede unir covalentemente a GP29 después del plegado del polipéptido, sin embargo, eso se observó que da un rendimiento menor. c. Plecfado y Purificación de Polipéptido que Contiene GP29 Enlazado a C ima y Ácido Graso El polipéptido en longitud completa con GP29 unido se plegó con formación concomitante de 2 enlaces de disulfuro en amortiguador acuoso que- contiene una copla de reducción-oxidación de cisteína-cistina y se purificó por HPLC de fase invertida como se describe anteriormente en el Ejemplo 18. El producto plegado fue homogéneo en HPLC. Masa observada = 24,210 Da; masa calculada = 24,220 Da (composición promedio de isótopo) . · La Figura 36 muestra datos analíticos representativos de los análogos de Rantes sintéticos, purificados, plegados, finales, plegados. En particular, un gel de SDS-PAGE representativo que compara los pesos moleculares relativos de RANTES tipo silvestre (Wt) al análogo de quimiocinas sintético RANTES G1806 bajo condiciones reductoras (R) y no reductoras (N) se muestra en la Figura 36. Los pesos moleculares relativos se representan en el lado izquierdo de cada gel que corresponde a una corrida normal de peso molecular en el mismo que (no mostrado) . También se muestra un cromatograma representativo de RP-HPLC del producto G1806 purificado, plegado. Esto ilustra la pureza en peso molecular relativo incrementado de las construcciones de precisión modificadas con polímero en comparación a RANTES nativo tipo silvestre.

Ejemplo 22 Ensayos de Fusión Celular de G1755-01, G1755, G1805 y G1806 Se realizaron los ensayos de fusión celular para examinar la actividad anti-HIV de varios análogos de RANTES modificados con polímero. La capacidad de un panel dado de compuestos para inhibir la fusión celular dependiente de CCR-5 se determinó usando células manejas para contener proteínas de envoltura viral que se fusionan con células que tiene CD4 y CCR-5 y que contienen un sistema indicador. Se llevaron a cabo ensayos de fusión celular mediados con envoltura viral y mediados con CCR-5, esencialmente como se describe en Simmons et al. (Science (1997) 276: 276-279) usando las líneas celulares HeLa-P5L y HeLa-Env-ADA, ambas de las cuales se proporcionaron cortésmente por el laboratorio de M. Alizon (París) . De forma breve, se sembraron células HeLa-P5L en placas de 96 cavidades (104 células por cavidad en 100 µ?) . 24 horas después se removió el medio y el medio se adicionó medio que contiene 104 células HeLa-Env-ADA por cavidad más quimiocinas (200 µ? de volumen final) . Después de 24 horas adicionales, se lavaron las células una vez en PBS y se lisaron en 50 µ? de PBS/NP-40 al 0.5% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se valoraron Usados para la actividad de ß-galactiosidasa por la adición de 50 µ? de sustrato 2X CPRG (rojo de clorofenol-ß-D-galactopiranosido; 16 mM; Na2HP04, y 120 mM Na2P04í 80 mM, KC1 20 mM, MgSo4, 10 mM y ß-mercaptcetanol) seguido por incubación durante 1-2 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. La absorbancia 575 nm entonces se leyó en un lector de microplacas Labsystems . Estos valores, el porcentaje de inhibición [100 x (0D(prUeba) - OD(COntroi negativo) ) /OD (control positivo) — OD (control negativo)] se Calculó 3. Cada concentración de inhibidor. Una gráfica del porcentaje de inhibición de fusión contra concentración de inhibidor permitió el cálculo de los valores de IC5o para cada compuesto. Los resultados representativos se representan en la Tabla XII posterior.

' Tabla XII Datos de Fisión de Células HeLa P4 -CCR5/HeLa-Env Compuesto EC50 AOP-RANTES (2-68) 1.81 X 10"9 M NNY-RANTES (2-38) 3.23 X 10"10 M RANTES G1755-01 11.00 X 10"9 M RANTES G1755 1.87 X 10"9 M RANTES G1805 1.40 X 10~9 M RANTES G1806 2.98 X 10"10 M Estos resultados demuestran la retención sustancial de la actividad anti-fusión después de la modificación específica del sitio con cualquiera de las construcciones de polímero soluble en agua lineal o ramificado. Este resultado fue sorprendente dado al incremento observado en la actividad de varios análogos de RANTES cuando una porción hidrófoba, tal como un ácido graso, se unió al C-termino, que soporta la hipótesis que el incremento de naturaleza hidrófoba en los análogos de RANTES en general se incrementará la actividad anti-fusión. En contraste, los polímeros solubles en agua usados para la modificación, particularmente los polímeros solubles en agua, ramificados, fueron completamente hidrófilo y estaban negativamente cargados, o un solo se observó una reducción marginal en la actividad que esta bien dentro del intervalo objetivo de potencia buscado para la actividad in vivo. De manera aun más esperada, fue la retención relativa de los análogos de RANTES modificados con las construcciones de polímero soluble en agua, ramificado, negativamente cargado, grandes en comparación a las construcciones de polímero soluble en agua, lineales, más pequeñas, y que los análogos modificados con polímero ramificado, pequeños lineales y grandes ramificados tiene sustancialmente el mismo efecto en la actividad. Esta última observación se cree que es debido en parte a las propiedades anti -agregación cuando las modificaciones de polímero soluble en agua se hacen internas al residuo C-terminal colgante de RANTES tipo silvestre en un región de agregación, como se diseña, y/o las propiedades anti-fusión realizadas de los polímeros solubles en agua. Los cambios adicionales que incrementa la potencia compensaron la pérdida de actividad marginal de la unión de los polímeros solubles en agua con relación a AOP- RANTES y ?? ?- RANTES . Estos cambios incluyeron la introducción de uno o más derivados de aminoácido hidrófobos al N-termino y la adición de una porción hidrófoba de ácido graso al C-termino. Estos resultados indican . que los cambios adicionales en la combinación con los polímeros monodispersos de poliamida-etileno (otros polímeros solubles en agua) puede mejorar la potencia total de las moléculas de quimiocina modificadas tipo NY- y AOP, tal como AOP- o NNY-RA TES que tienen el cambio combinado de Pro2Thz y Tyr3Chg al N-termino o la adición de una porción de lípido al C-termino . Ejemplo 23 Estudios Farmacocinéticas para G1755, G1805 y G1806 Los estudios farmacocinéticos de los análogos de RANTES modificados con polímero se analizaron en ratas Sprague-Dawley macho como sigue. Los análogos de RANTES G1755, G1805 y G1806 preparados como se describe anteriormente (junto con AOP-RANTES como control) se formularon para inyección intravenosa (IV) justo antes de la inyección de la solución concentrada de proteína liofilizada en solución salina amortiguada con fosfato a 7.0. Se prepararon formulaciones para proporcionar dosis equimolares de los análogos de RANTES a animales de prueba individuales [400 pg/kg (AOP-RANTES); 510 g/kg (G1755); 1210 g/kg (G1805); y 1225 g/kg (1806) (µ? de análogo/kg de animal)]. Se ajustaron las concentraciones opcionales donde es necesario para proporcionar un volumen total de dosis de 1 ml/kg para cada animal (es decir, los volúmenes de dosis se mantuvieron contrastes) . Cada análogo formulado se administro de manera intravenosa vía la cola de las ratas en el día 1 del experimento en cada animal recibía una dosis individual .

Después de la inyección, se recolectaron aproximadamente 0.25 mi de sangre de la vena/arteria durante el transcurso del experimento en cada punto de tiempo y recolección de muestra, y se prepararon muestras plásmicas o séricas usando EDTA como anticoagulante siguiendo los protocolos normales y las guías de cuidado de animales del Nacional Institutes of Health y los procedimientos recomendados de prueba. Los tiempos de recolección de muestra se ajustaron en base a la recolección inicial de datos para evitar la recolección de más de 14 muestras de 0.25 mi de cualquier animal en el espacio de 3 semanas (cmo se establece por las guías de cuidado de animales de Nacional Intitules of Health) . Se recolectaron muestras adicionales e intervalos semanales donde las muestras sanguíneas detectable persistieron más haya de las muestras iniciales. La concentración en plasma de cada análogo de RANTES en cada punto de tiempo se determinó usando un inmunoensayo de RANTES humano (R & D Systems Catalog # DRN00) , por las instrucciones del fabricante. La salud total de los animales se monitorio durante el transcurso del experimento, incluyendo peso, hábitos alimenticios, disposición, apariencia, etcétera y no se observaron efectos laterales evidentes. En la Figura 37 se representa los resultados representativos. Estos resultados demuestran la actividad sustantiva en la vida media en circulación proporcionada por la unión de polímero soluble en agua a varios análogos de RA TES precursores, con el incremento aparente en la vida media de G1805 > 1806 > G1755 > AOP-RANTES. Con relación a AOP-RANTES, el incremento fue de 40 veces por G1805, 20 veces para G1806, y 10 veces para G1755. De manera colectiva, el equilibrio de alta potencia retenida y vida media en circulación significativamente mejorada para los análogos de RANTES modificados con polímero soluble en agua se espera que mejore la eficiencia terapéutica de estos compuestos en el establecimiento in vivo y reduzca el número y cantidad de dosis necesaria para el tratamiento. En tanto que la invención se ha descrito con relación a las modalidades específicas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales y esta solicitud se propone que cubra cualquier variación, usó o adaptaciones de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo separaciones de la presente descripción como venga dentro o sean habituales dentro de la práctica del arte al cual corresponde esta invención y como se puedan aplicar' a las características esenciales expuestas posteriormente en la presente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. ribosómicamente especificada comprende un sitio de glicosilación ribosómicamente especificado. 9. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque U se une covalentemente a la cadena lateral n en un sitio de la cadena de polipéptido que corresponde a un sitio de glicosilación ribosómicamente especificado. 10. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque U se une covalentemente a la cadena lateral n exclusivamente en un sitio que corresponde al sitio de glicosilación ribosómicamente especificado. 11. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína ribosómicamente específica es una proteína recombinantemente producida . 12. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la proteína recombinantemente producida es una proteína no natural. 13. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la proteína no natural tiene uno o más sitios de glicosilación, ribosómicamente especificados, no naturales. 14. La proteína bioactiva, sintética de

Claims

305 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una proteína bioactiva, sintética aislada que tiene la formula proteína-Un-B-Polímero-J* , la proteína está caracterizada porque comprende una cadena de polipéptido de una proteína ribosómicamente especificada, la cadena de polipéptido comprende uno o más segmentos peptídicos de no traslape unidos covalentemente por uno o más sitios de ligación química, U es un residuo de un grupo funcional único unido covalentemente a un grupo funcional único mutuamente reactivo de una cadena lateral n de uno o más aminoácidos de uno o más de los segmentos peptídicos de no traslape, en donde n es un número entero discreto seleccionado de 1 a 6, B es un núcleo de ramificación que tiene tres o más brazos que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar presentes o ausentes, Polímero es un polímero soluble en agua sustancialmente no antigénico, y J* es un grupo colgante que tiene carga neta bajo condiciones fisiológicas seleccionadas del grupo que consiste de negativa, neutral y positiva. 2. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína 306 bioactiva, sintética comprende un peso molecular de monómero de más de 25,000 Daltones 3. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteina bioactiva, sintética posee una bioactividad que imita una bioactividad asociada con la proteína ribosómicamente especificada . 4. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína ribosómicamente especificada es una proteína de mamífero. 5. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la proteína de mamífero es una citosina. 6. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la citosina se selecciona del grupo que consiste de una interleucina, una proteína que estimula la eritropoyesis , un interferón, una linfocina, una quimiocina, un factor de crecimiento, un factor de estimulación de colonia, y una hormona peptídica de señal. 7. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la proteína de mamífero es una proteína humana. 8. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la cadena de polipéptido comprende uno o más aminoácidos irregulares . 15. La proteina bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el aminoácido irregular tiene un lado diferente de uno de los 20 aminoácidos genéticamente codificados. 16. La proteina bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el aminoácido irregular se selecciona del grupo que consiste de un pseudoaminoácido y un derivado hidrófobo de un aminoácido. 17. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sitio de ligación química comprende un enlace seleccionado del grupo que consiste en amida, oxima, hidrazona, tioéster, taizolidina, oxazolidina y tioéter. 18. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la cadena lateral n es una cadena lateral no natural. 19. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque U se une covalentemente a la cadena lateral n a través de un enlace formado por la ligación química. 20. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el enlace formado por la ligación química se selecciona del grupo que consiste de amida, oxima, hidrazona, tioéster, taizolidina y oxazolidina. 21. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque uno o más de U, B, Polímero y J* se separan por un espaciador o ligador, y que tiene la fórmula U-sl-B-s2-Polímero-s3-J* , donde si, s2 y s3 son - porciones espadadoras o ligadoras que pueden ser las mismas o diferentes y pueden estar individualmente presentes o ausentes . 22. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque U es un residuo de un enlace seleccionado de oxima, amida, amina, uretano, éter, tioéter, éster, tioéster, hidrazina, oxazolidina y taizolidina. 23. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un brazo de B se une a U y un segundo brazo de B se une a Polímero. 24. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque B comprende cuatro o más brazos . 25. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos uno de los brazos comprende un residuo de un grupo seleccionado que consiste de oxima, amida, amina, uretano, tioéter, éster, tioéster, hidrazida, oxazolidina, taizolidina . 26. La proteina bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque B comprende un núcleo de ramificación seleccionado del grupo que consiste de amino, carboxilato y amino-carboxilato mezclado. 27. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el núcleo de ramificación de amino comprende lisina, el núcleo de ramificación de carboxilato comprende ácido glutámico o aspártico, y el núcleo de ramificación de amino-carboxilato mezclado comprende ácido gamma-glutámico . 28. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el Polímero se selecciona del grupo que consiste de óxido de polialquileno, poli mida-óxido de alquileno y derivados de los mismos. 29. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la cadena lateral n está en un sitio de ligación química de la cadena de polipéptido. 30. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el B-Polímero-J* , comprende un peso molecular de entre 1,500 y 80,000 Daltones. 31. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la cadena lateral n es 2 o más, y en donde uno o mas de B-Polímero-J* es diferente. 32. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque B-Polímero-J* comprende una carga neta bajo condiciones fisiológicas que se seleccionan del grupo que consiste de negativo, neutral y positivo. 33. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con .la reivindicación 1, caracterizada porque B-Polímero-J* está monodisperso. 34. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína bioactiva, sintética está monodispersa. 35. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el Polímero es una poliamida de la formula - [C (O) -X-C (O) H-Y- H]n- o - [NH-Y-NH-C (O) -X-C (O) ] n- , donde X e Y son radicales divalentes que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar ramificados o ser lineales, y n es un número entero de 2 a 100, y donde cualquiera o ambos X e Y comprenden una unidad de repetición soluble en agua que puede ser lineal o estar ramificada. 36. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque X es un radical divalente de la fórmula -NH-X'- o -X'-NH-, donde X' es un radical divalente que comprende una unidad de repetición soluble en agua que puede ser lineal o ramificada . 37. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque Y es un radical divalente de la fórmula -CO-Y' - o -Y'-CO-, donde Y' es un radical divalente. 38. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque n es -un número entero discreto de 2 a 50. 39. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la unidad de repetición soluble en agua comprende una unidad de repetición de óxido de etileno de la fórmula - (CH2-CH2-0) -o - (0-CH2-CH2) - · 40. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la unidad de repetición de óxido de etileno tiene la fórmula - (CH2-CH2-0) n- o - (0-CH2-CH2) n- / donde n es un número entero discreto de 2 a 50. 41. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque J* es un grupo ionizable que tiene una carga neta bajo condiciones fisiológicas seleccionada del grupo que consiste de negativa y positiva. 42. La. proteina bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el grupo ionizable se selecciona de carboxilo, amina e hidroxilo . 43. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque J es un grupo no ionizable que tiene una carga neutral neta bajo condiciones fisiológicas. 44. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque tiene una vida media en circulación incrementada en un mamífero de mayor en comparación a una proteína bioactiva sintética correspondiente que está desprovista del polímero soluble en agua. 45. Una proteína bioactiva, sintética caracterizada porque comprende una cadena de polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos .de una glicoproteína ribosómicamente especificada, la cadena de polipéptidos tiene uno o más polímeros solubles en agua unidos a la misma y un peso molecular de monómero de más de 25 kDa. 46. La protelna bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la protelna bioactiva, sintética posee una bioactividad que imita una bioactividad asociada con la glicoproteína ribosómicamente especificada. 47. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la glicoproteína ribosómicamente especificada es una citosina . 48. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque la citosina se selecciona a partir del grupo que consiste de una proteína de estimulación de la eritropoyesis , Rantes, y el factor de estimulación de colonia de granulocitos . · 49. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la glicoproteína ribosómicamente especificada comprende uno o más sitios de glicosilación . 50. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque el polímero soluble en agua se une a la cadena de polipéptido en uno o más sitios que corresponden a uno o más sitios de glicosilación. 51. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque el polímero soluble en agua se une a la cadena de polipéptido exclusivamente en uno o más sitios que corresponden a uno o más sitios de glicosilación. 52. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la glicoproteína ribosómicamente especificada es una glicoproteína recombinantemente producida. 53. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la glicoproteína recombinantemente producida es una glicoproteína no natural. 54. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque la glicoproteína no natural tiene uno o más sitios de glicosilación no naturales. 55. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con. la reivindicación 45, caracterizada porque la cadena de polipéptido comprende uno o más aminoácidos irregulares . 56. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque el polímero soluble en agua comprende un peso molecular de entre 1,500 y 80,000 Daltones. 57. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque los polímeros solubles en agua comprenden una carga neta bajo condiciones fisiológicas que se seleccionan a partir del grupo que consiste de negativo, neutral y positivo. 58. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque el Polímero se selecciona a partir del grupo que consiste de óxido de polialquileno, poliamida-óxido de alquileno y derivados de los mismos . 59. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque el Polímero es una poliamida de la formula - [C (0) -X-C (0) NH-Y- H]n- o - [ H-Y-NH-C (0) -X-C(O) ] n- , donde X e Y son radicales divalentes que pueden ser los mismos o diferentes y pueden ser ramificados o lineales, y n es un número entero de · 2 a 100, y donde cualquiera o ambos X e Y comprenden una unidad de repetición soluble en agua que puede ser lineal o ramificada . 60. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque n es un número entero discreto de 2 a 50. 61. La proteína bioactiva, sintética de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la unidad de repetición soluble en agua comprende una unidad de repetición de óxido de etileno de la fórmula - (CH2-CH2-0) -o - (0-CH2-CH2) - . 62. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una proteína bioactiva, sintética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 61, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma. 63. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada porque comprende uno o más excipientes seleccionados a partir del grupo que consiste de un amortiguador, una proteina portadora, un aminoácido, un detergente, un lípido, un polímero soluble en agua y un conservador. 64. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque comprende uno o más agentes bioactivos adicionales diferentes de la proteína bioactiva, sintética. · 65. Un método para tratar una enfermedad humana o condición, caracterizado porque comprende administrar a un individuo en necesidad del tratamiento una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una o más composiciones farmacéuticas moleculármente homogéneas de una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero que tiene un peso molecular de monómero mayor de aproximadamente 25 kDa y posee una bioactividad que imita una bioactividad asociada con un receptor de proteína humana natural o fragmento del mismo, el ligando de receptor de proteína o fragmento del mismo, o una citosina. 66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la proteína bioactiva, sintética tiene la bioactividad de una citosina. 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la citosina se selecciona del grupo que consiste de una interleucina, una proteína de la estimulación de la eritropoyesis, un interferón, una linfocina, una quimiocina, un factor de crecimiento, un factor de estimulación de colonia, y una hormona de péptido de señal. 68. Una composición f rmacéutica de conformidad con la reivindicación 62, para el uso en el tratamiento de una enfermedad o condición humana asociada a una bioactividad o carencia de la misma de un receptor de proteína humana natural o un fragmento del mismo, el ligando de receptor de proteína o fragmento del mismo, o una citosina . 69. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la proteína bioactiva, sintética modificada con polímero tiene una bioactividad de una citosina. 70. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque la citosina se selecciona del grupo que consiste de interleucina, una proteína de estimulación la eritropoyesis, un interferón, una linfocina, una quimiocina, un factor de crecimiento, un factor de estimulación de colonia, y una hormona de péptido de señal . 71. Un método para producir una cadena de polipéptido modificada con polímero de una proteína modificada con polímero, bioactiva, sintética, el método está caracterizado porque comprende ligar químicamente los segmentos de péptido que comprenden secuencias de aminoácidos de no traslape de una cadena de polipéptido de la proteína modificada con polímero, bioactiva, sintética, en donde uno o más de los segmentos de péptido tienen un polímero soluble en agua unido a los mismos, por lo que se produce una cadena de polipéptido modificada con polímero de la proteína modificada con polímero, bioactiva, sintética. · 72. El método de conformidad con al reivindicación 71, caracterizado porque la cadena de polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína ribosómicamente especificada . 73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque la proteína ribosómicamente especificada es una proteína de mamífero. 7 . El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la proteína de mamífero es una citosina . 75. El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque la citosina se selecciona del grupo que consiste de interleucina, una proteína de estimulación de eritropoyesis, un interferón, una linfocina, una quimiocina, un factor de crecimiento, un factor de estimulación de colonia, y una hormona de péptido de señal. 76. El método de conformidad con al reivindicación 71, caracterizado porque además comprende el plegado de la cadena de polipéptido modificada con polímero por lo cual se produce una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero. 77. El método de conformidad con al reivindicación 71, caracterizado porque uno o más de los segmentos de péptido se protegen de manera parcial . 78. El método de conformidad con la reivindicación 71; caracterizado porque uno o más de los segmentos de péptido están no protegidos. 79. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque uno o más de los segmentos de péptido comprenden uno o más aminoácidos irregulares. 80. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la ligación química comprende una química de ligación quimioselectiva seleccionada de ligación química nativa, ligación química nativa extendida y pseudoligación química nativa. 81. El método de conformidad con al reivindicación 71, caracterizado porque el polímero soluble en agua comprende un peso molecular de entre 1,500 y 80,000 Daltones . 82. Un método para producir una cadena de polipéptido modificada con polímero de una proteína bioactiva, sintética modificada con polímero, el método está caracterizado porque comprende: a. ligar químicamente segmentos de péptido que comprenden secuencias de aminoácidos- de no traslape de la proteína bioactiva, sintética modificada con polímero para formar una cadena de polipéptido de longitud completa que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la proteína bioactiva, sintética modificada con polímero, en donde uno o más de los segmentos de péptido comprende un primer grupo quimioselectivo, único. b. ligar químicamente un polímero soluble en agua a la cadena de polipéptido de longitud completa, el polímero soluble en agua que comprende un segundo grupo quimioselectivo que es mutuamente y únicamente reactivo con el primer grupo quimioselectivo, único, por lo que se produce una cadena de polipéptido modificada con polímero de la proteína bioactiva, sintética, modificada con polímero. 83. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque además comprende el plegado de la cadena de polipéptido modificada con polímero por lo que se produce una proteína bioactiva, sintética, modificada con polímero . 84. Un método para producir proteína bioactiva, sintética, modificada con polímero, el método está caracterizado porque comprende: a. ligar químicamente segmentos de péptido que comprenden secuencias de aminoácidos de no traslape de la proteína bioactiva, sintética, modificada con polímero para formar una cadena de polipéptido de longitud completa que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la proteína bioactiva, sintética, modificada con polímero, en donde uno o más de los segmentos de péptido comprenden una cadena lateral no nativa que comprende un primer grupo quimioselectivo, único que es no reactivo con un grupo funcional de la cadena lateral de un aminoácido de un aminoácido genéticamente codificado; b. plegar la cadena de polipéptido de longitud completa para formar una cadena de polipéptido plegada; y c. ligar químicamente un polímero soluble en agua a la cadena de polipéptido plegada, el polímero soluble en agua que comprende un segundo grupo quimioselectivo que es reactivo mutuamente y únicamente con el primer grupo quimioselectivo, único, por lo que se produce una cadena de polipéptido modificada con polímero de la proteína bioactiva, sintética modificada con polímero. 85. Un polímero soluble en agua moleculármente homogéneo de la fórmula: U-sl-B-s2-Polímero-s3-J* donde, U es un residuo de un grupo funcional único, B es un núcleo de ramificación que tiene tres o más brazos que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar presentes o ausentes, Polímero es una poliamida que tiene un peso molecular mayor de aproximadamente 5,000 Da de la fórmula - [C(0) -X-C(O) WH-Y- H] n- o - [NH-Y-NH-C (O) -X-C (O) ] - , donde X e Y son radicales divalentes que pueden ser los mismos o diferentes y pueden estar ramificados o lineales, y n es un número entero discreto de 2 a 50, y en donde cualquiera o ambos de X e Y comprenden una unidad de repetición soluble en agua, sustancialmente no antagónica que puede ser lineal o ramificada, J* que es un residuo de un grupo colgante sustancialmente no antigénico que tiene una carga neta bajo condiciones fisiológicas seleccionadas del grupo que consiste de negativa, neutral y positiva, donde si, s2 y s3 son porciones espadadoras o ligadoras que pueden ser las mismas o diferentes y pueden estar individualmente presentes o ausentes . 86. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque U es un residuo de un grupo funcional seleccionado a partir del grupo que consiste de acrilato, aldehido, cetona, aminooxi, amina, ácido carboxílico, éster, tioéster, halógeno, tiol, cianoacetato, dipalmitoil-fosfatidiletanolamina, diestearoil-fosfatidiletanolamina, epóxido, hidrazida, azida, isocianato, maleimida, metacrilato, carbonato de nitrofenilo, disulfuro de ortopiridilo, silano, sulfhidrilo, sulfonas de vinilo, glutarato de succinimidilo, succinato de succimidilo, ácido succínico, tresilato y un grupo funcional activable . 87. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque U es un residuo de un grupo funcional capaz de formar un enlace seleccionado del grupo de carbonato, éster, ur.etano, ortoéster, amida, amina, oxima, imida, urea, tiourea, tioéter, tiouretano, tioéster, éter, taizolidina, hidrazona, y oxazolidina. · 88. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque U está protegido. 89. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque uno o más de si, s2 ,y s3 están presentes y se seleccionan para comprender de 1 a 18 carbonos. 90. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque uno o más de si, s2 y s3 están presentes y se seleccionan y comprenden Polímero. 91. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque si comprende Polímero . 92. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque B comprende cuatro o más brazos . 93. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque el peso molecular es mayor de aproximadamente 10,000 Da. 94. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 93 , caracterizado porque el peso molecular es mayor de aproximadamente 15,000 Da. 95. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque B comprende un núcleo de ramificación unido a s2 o Polímero a través de uno o más enlaces de amida. 96. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque B comprende un núcleo de ramificación unido a Polímero a través de enlaces de amida. 97. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque la unidad de repetición comprende un óxido de etileno de la fórmula -(CH2-CH2-0) - o - (CH2-CH2-0) - . 98. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque X, Y o X e Y se seleccionan a partir de: - ( (CH2) n2- (CH2-CH2-0) n2- (CH2) ni" ) - o -( (CH2)ni- (O-CH2-CH2) n2- (CH2)ni-) , donde ni es un número entero discreto de 1 a 6, n2 es un número entero discreto de 2 a 5.0. 99. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque uno de X o Y se selecciona del grupo que consiste de fenilo, una porción de alquileno de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, un fenilo que contiene heteroátomo, una porción de alquileno de 1 a 10 átomos de carbono que contiene heteroátomo, un grupo alquilo de 1 a 10 átomos de carbono que contiene heteroátomo, y una combinación de los mismos . 100. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque X es - (CH2- CH2) - . 101. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque Y es - (CH2-(CH2-CH2-0)3-CH2-CH2-CH2)n- o - (CH2-CH2-CH2- (0-CH2-CH2) 3-CH2) n, donde n es 6 a 36. 102. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque J* está protegido . 103. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque J* comprende un grupo no ionizable que tiene una carga neta neutral bajo condiciones fisiológicas. 104. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque J* comprende un grupo ionizable que comprende una carga positiva neta bajo condiciones fisiológicas. 105. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque J* comprende un grupo ionizable que tiene una carga negativa neta bajo condiciones fisiológicas. 106. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque X es -X' -NH-o -NH-X'-. 107. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque Y es -Y' -NH-o -??-? ' - . 108. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado porque al menos uno de X' e Y' comprende un óxido de polietileno de la fórmula (-CH2-CH2-O-) n o (0-CH2-C¾-) n donde n es 2 a 50. 109. El polímero soluble en agua de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque el polímero soluble en agua está monodisperso .