MX2011003196A

MX2011003196A - Microorganismos y vacunas dependientes de replicacion de aminoacidos no naturales.

Info

Publication number: MX2011003196A
Application number: MX2011003196A
Authority: MX
Inventors: Feng Tian; Brad Hehli
Original assignee: Ambrx Inc
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-28
Publication date: 2011-04-27
Also published as: PT2337846T; KR20110076970A; ES2660000T3; US20130323821A1; MX357314B; CN102224238A; US20110195483A1; CN102224238B; KR101732054B1; US20130280301A1; JP2012503991A; PE20110480A1; US10428333B2; EP2337846A4; US9121024B2; TR201802361T4; US9121025B2; EP2337846A1; IL236063A; AU2009296267B2

Abstract

Composiciones y métodos de producción de vacunas, incluyendo métodos en los que se dotan unas vacunas de organismos completos de capacidades limitadas de replicación, aumentando de ese modo la seguridad y la eficacia de la vacuna, a través del uso de aminoácidos no naturales o no codificados de manera natural.

Description

MICROORGANISMOS Y VACUNAS DEPENDIENTES DE REPLICACIÓN DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES CAMPO DE LA PRESENTE INVENCIÓN La invención se refiere a vacunas. En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a composiciones y métodos de producción de vacunas, incluyendo vacunas de microorganismos completos, con capacidades de replicación limitadas o ausencia de las mismas a través del uso de aminoácidos no naturales o no codificados de manera natural.

ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCIÓN Hasta ahora, ha . habido un progreso técnico relativamente lento e incluso más de 100 años después del fallecimiento de Louis Pasteur, su protocolo "III" (Isolation, Inactivation, Injection) (aislamiento, inactivación, inyección) continúa siendo aplicable. Sin embargo, con la llegada de la biología molecular y la tecnología de proteínas recombinantes, se han comenzado a desarrollar vacunas de subunidades y vacunas de tipo organismo completo : modificadas mediante ingeniería genética. Más recientemente, avances en inmunología han puesto a disposición varias clases de inmunopotenciadores, incluyendo ligandos de receptor tipo toll (TLR) . Generalmente, las vacunas de generación más reciente y sus adyuvantes ' se han definido química y genéticamente cada vez mejor.

El , desarrollo de productos terapéuticos y en particular vacunas dirigidas frente a patógenos tales como virus, bacterias, protozoos, hongos, está en curso. Tal investigación ha demostrado ser inestimable en la prevención de la propagación de enfermedades en animales incluyendo seres humanos. De hecho, en la medicina moderna, la inmunoterapia, incluyendo la vacunación, ha erradicado la viruela y prácticamente ha erradicado enfermedades tales como polio, tétanos, tuberculosis, varicela y sarampión.

Genéralmente, las vacunas ideales tienen un término de caducidad largo, pueden inducir inmunidad de larga duración frente a un patógeno preseleccionado y todas las variantes fenotipicas, no pueden provocar la enfermedad frente a la que se dirige la vacuna, son terapéutica y profilácticamente eficaces, se preparan fácilmente usando metodologías convencionales económicas y pueden administrarse fácilmente en el campo.

Hay cuatro clases principales de vacunas comercialmente disponibles. Incluyen vacunas de microorganismos completos no vivos, vacunas atenuadas vivas, vacunas de vector y vacunas de subunidad1. La vacunación con materiales no vivos tales como proteínas conduce generalmente a una respuesta de anticuerpos o una respuesta de células T cooperadoras CD4+ mientras que la vacunación con materiales vivos (por ejemplo virus infecciosos) conduce generalmente a una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. Una respuesta de CTL es crucial para la protección frente a patógenos como virus infecciosos y bacterias.. Esto plantea un problema práctico, ya que la única manera segura . de lograr una respuesta de CTL es usar agentes vivos que son por si mismos patógenos. El problema se salva generalmente usando cepas bacterianas y virales atenuadas o inactivando células completas que pueden usarse para la vacunación.. Estas estrategias han funcionado bien pero el uso de cepas atenuadas siempre conlleva el riesgo de que el agente atenuado pueda recombinarse genéticamente en el huésped y convertirse en una cepa virulenta. Por tanto, existe la necesidad de productos terapéuticos y métodos que puedan conducir a una respuesta de CTL CD8+ mediante vacunación con materiales no vivos tales como proteínas de una manera específica.

Las vacunas de subunidades han proporcionado un medio para tratar algunos de estos problemas. Tales vacunas comprenden generalmente un componente subcelular derivado de un patógeno de interés. Un componente de subunidad puede producirse a partir de una fracción subcelular definida del patógeno, ser una proteína, ácido nucleico o un polisacárido purificados. Todos estos elementos' tienen un determinante antigénico que puede estimular una respuesta inmunitaria 'frente al patógeno de interés. Generalmente, el componente subcelular de la vacuna de subunidad se obtiene o bien purificando una preparación de patógeno alterado o bien se, sintetiza usando procedimientos bien conocidos.

Sin jembargo, hay varias limitaciones asociadas con vacunas de subunidades. En primer lugar, un requisito para la producción de una vacuna de este tipo que es que el/los determinante ( s ) antigénico (s) debe (n) caracterizarse e identificarse. Esto impone limitaciones sobre su uso, particularmente frente a determinantes antigénicos altamente variables. En segundo lugar, las vacunas de subunidades son generalmente ineficaces en la estimulación de respuestas de células T citotóxicas. En tercer lugar, la inmunidad conferida por las vacunas de subunidades es con frecuencia de corta duración y por tanto requiere inyecciones de refuerzo continuas. Muy pocas vacunas de subunidades expresadas recombinantes se ha mostrado que induzcan inmunidad fuerte y dé larga duración en animales vacunados (incluyendo el ser humano) .

Una excepción notable es la vacuna de la hepatitis B de antigeno de superficie recombinante usada en el ser humano. Uno de los problemas asociados con el uso de tales vacunas parece ser presentar correctamente los antigenos al sistema inmunitario de tal manera que se induzca una fuerte inmunidad humoral y fuerte inmunida'd mediada por células. En particular, las vacunas recombinantes (de subunidades) existentes no parecen dar como resultado' fuertes respuestas "de memoria" de tal manera que los animales vacunados puedan reaccionar muy rápidamente cuando se exponen a; infecciones naturales provocadas por un patógeno. Únicamente a modo de ejemplo, se han notificado ampliamente deficiencias en las vacunas de subunidades actuales preparadas a partir de pestivirus como el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) . Estos estudios han mostrado que aunque se usaron grandes cantidades de proteina recombinante en las vacunas, se observaron escasas tasas de protección mostrando que las vacunas no lograron proteger frente a la exposición con aislados de VDVB vivos (o bien protección homologa o bien protección heterologa) .

Hay muchas enfermedades infecciosas para las que aún no se ha desarrollado una vacuna eficaz, y muchas de las vacunas actualmente disponibles sólo proporcionan protección parcial frente a la enfermedad. Además, existen vacíos en el campo de las vacunas. ; Las vacunas vivas producen inmunidad más fuerte, más amplia y más duradera que otros tipos de vacunas. Existe la necesidad de un vehículo de vacuna viva más seguro, que no puedan provocar la enfermedad incluso en individuos inmunosuprimidos . También existe la necesidad de vacunas que induzcan inmunidad mediada por células y no sólo inmunidad, basada en anticuerpos. Y existe la necesidad de inducir respuestas inmunitarias protectoras directamente en las superficies mucosas del organismo, por las que entran la mayoría de los patógenos. Por tanto, existe la necesidad de vacunas mejoradas. La presente invención busca proporcionar una vacuna terapéutica mejorada que mejore al menos algunas de las desventajas con respecto a la técnica anterior existente.

SUMARIO DÉ LA PRESENTE INVENCIÓN La presente invención proporciona organismos completos dependientes de replicación modulados químicamente. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un organismo completo modulado químicamente con una modificación mediante la cual su capacidad para reproducirse depende de la presencia de un aminoácido no natural. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un organismo completo con una o más ¦modificaciones mediante las cuales la capacidad del organismo para replicarse depende de que se cultive en presencia de un aminoácido no natural. En algunas realizaciones- la presente invención proporciona un organismo completo con una o más modificaciones mediante las cuales la capacidad del organismo para replicarse depende de que se cultive en presencia de uno o más aminoácidos no naturales. En algunas realizaciones la presente invención proporciona un organismo completo con dos o más modificaciones las cuales la capacidad del organismo para replicarse depende de que se cultive en presencia de uno o más aminoácidos no naturales. En algunas realizaciones de la presente invención, el organismo completo es una vacuna mitigada, una vacuna modulada por uno o más aminoácidos no naturales incorporados específicamente en el sitio, en la qué la replicación o expresión del agente inmunizante se modula mediante la presencia o ausencia de un aminoácido no natural. 1 En ^algunas realizaciones de la presente invención, la replicación o expresión de un organismo completo se modula mediante la presencia o ausencia de un aminoácido no natural a través de una única modificación genética. En algunas realizaciones de la presente invención, la replicación o expresión de un organismo completo se modula mediante la presencia o ausencia de un aminoácido no natural a través de una o más modificaciones genéticas. En algunas realizaciones de la presente invención, la replicación o expresión de un organismo completo se modula mediante la presencia o ausencia de un aminoácido no natural a través de dos modificaciones genéticas. En algunas realizaciones de la presente invención, la replicación o expresión de un organismo completo se modula mediante la presencia o ausencia 1 de un aminoácido no natural a través de tres modificaciones genéticas. En algunas realizaciones de la presente invención, la replicación o expresión de un organismo completo se modula mediante la presencia o ausencia de un aminoácido no natural a través de cuatro modificaciones' genéticas. En algunas realizaciones de la presente invención, la replicación o expresión de un organismo completo se modula mediante la presencia o ausencia de un aminoácido no natural a través de cinco modificaciones genéticas. En algunas realizaciones de la presente invención, la replicación o expresión de un organismo completo se modula mediante la presencia o ausencia de un aminoácido no natural a través de cuatro o más modificaciones genéticas.

La capacidad para inducir selectivamente una respuesta inmunitaria frente a organismos, antigenos, proteínas, o autoproteínas o para aumentar la inmunogenicidad de epítopos específicos de antígenos foráneos, 1 es significativa en la producción de vacunas para varios estados patológicos (incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer y enfermedades de plegamiento de proteínas) y enfermedades infecciosas (por ejemplo, infecciones bacterianas o virales) . La invención actual utiliza la incorporación de aminoácidos no naturales en organismos para producir inmunógenos dependientes de replicación y/o deficientes en la replicación para usarse en vacunaciones con organismos completos o para producir anticuerpos que van a usarse en inmunización pasiva. La invención actual también utiliza la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas, antígenos y/o polipéptidos para producir inmunógenos para usarse en vacunaciones o para producir anticuerpos para usarse en inmunización pasiva. En la invención, los inmunógenos a los que se añaden los aminoácidos no naturales corresponden a restos diana (por ejemplo, restos relacionados con enfermedades) dentro del sujeto que va a vacunarse/inmunizarse o corresponden a restos diana (por ejemplo, restos relacionados con enfermedades) que pueden estar dentro del sujeto. En realizaciones en las que él inmunógenp con el aminoácido no natural se administra a un sujeto, la presencia del aminoácido no natural provoca una respuesta inmunológica frente al inmunógeno que presenta reacción cruzada frente al' resto diana (por ejemplo, relacionado con enfermedades) .

En ún primer aspecto, la invención proporciona métodos para producir o potenciar una respuesta inmunológica, por ejemplo, una respuesta mediada por células B y/o una respuesta mediada por células T, en un sujeto frente a un resto diana, por ejemplo, un polipéptido, un hidrato de carbono, o una combinación de ambos, que está en el sujeto o que puede estar dentro del sujeto. Los métodos . incluyen proporcionar un organismo dependiente de aminoácidos no naturales genéticamente modificado y administrar el organismo al sujeto. Los métodos también incluyen proporcionar un inmunógeno no natural genéticamente modificado que comprende uno o más aminoácidos no naturales, y administrar el inmunógeno no natural al sujeto. El sujeto (por ejemplo, un ser humano, un mono, un ratón, una rata, un animal de ganado, un cerdo, una- vaca, un pollo, un ave de jaula, un ave de pajarera, una mascota, un perro, un gato, un reptil y/o un anfibio) produce uno o más anticuerpos frente al inmunógeno no natural, anticuerpos que presentan reacción cruzada frente al resto diana (produciendo o potenciando así la respuesta inmunógena frente a la diana) .

En determinadas realizaciones, el organismo completo genéticamente modificado puede ser cualquier organismo completo frente al cual es deseable inmunizar al sujeto por ejemplo, una bacteria,: un virus, un hongo, un micoplasma, un protozoo, un helminto ¡ o un prión. Una vacuna de organismo completo puede incluir opcionalmente uno o más de: un antígeno bacteriano, un antígeno viral, un antígeno fúngico, un antígeno de micoplasma, un antígeno ,de protozoo, un antígeno de helminto, un antígeno de prión, un antígeno de VIH, gpl20 de VIH, gp41 de VIH, gag de VIH, pol de VIH, env de VIH, tat de VIH, nef de VIH, rev de VIH, un antígeno de cápside de calicivirus, un antígeno de núcleo de la hepatitis B, un antígeno de superficie de la hepatitis B, un agente delta de la hepatitis, una glicoproteina del virus del herpes simple, una glicoproteina del virus varicela-zóster , una hemaglutinina del virus Influenza , una neuraminidasa del virus Influenza , una nucleoproteina del virus Influenza , una protéina de cápside del VPH, una hemaglutinina/neuraminidasa del virus Parainfluenza, un polipéptido de cápside de poliovirus, un antigeno de Hep A, un polipéptido del virus Vaccinia , una glicoproteina G del virus de la rabia, OspA de B. burgdorferi, proteina ¦ de membrana exterior de tipo b de H. influenzae, Mycobacterium lipoarabinomannan, mAPG de micobacteria, proteina M de S. pyogenes, polisacárido capsular de S. pneumoniae, Fl de Y. pestis, antigeno V de Y. pestis, circumsporozoito de P. falciparum (PfCSP) , proteina 2 de superficie de esporozoito de P. falciparum (PfSSP2) , extremo carboxilo terminal del antigeno del estadio hepático 1 de P. falciparum (PfLSAl c-term) , proteina 1 exportada de P. falciparum (PfExp-1), Pfs 48/45, Pfs 28, Pfs 25, o Pfs 230.

El organismo dependiente de replicación de aminoácidos no naturalesi genéticamente modificado puede ser uno o más de: una bacteria un virus, un hongo, un Mycoplasma, un protozoo, un helminto, ; un prión, un Actinomyces, un Bacillus, un Bacteroides, una Bordetella, una Bartonella , una Borrelia, una Brucella, un Ca pylobacter, una Capnocytophaga, una Chlamydia, un Clostridium, una Corynejbacterium, una Coxiella, un Dermatophilus, un Enterococcus, una Ehrlichia , una Escherichia, una Francisella , una Fusobacterium, una Haemobartonella , un Haemophilus, una Helicobacter, una Klebsiella, una bacteria en forma de L, una Leptospira , una histeria, una Mycobacteriu , un Mycoplasma, una Neisseria , una Neorickettsia, una Nocardia, una Pasteurella , un Peptococcus, un Peptostreptococcus, un Pneumococcus, un Proteus, una Pseudomonas, una PicA-ettsia, una Rochalimaea , una Salmonella , una Shigella , un Staphylococcus, un Streptococcus, una Treponema, una Yersinia, un adenovirus, un alfavirus, un calicivirus, un coronavirus, un C V, un virus distemper, un virus del ébola, un enterovirus, un VEB, un flavivirus, una Hep C, un hepadnavirus , una Hep B, un agente delta de la hepatitis, un virus de Hep E o F, un VGB-C, un herpesvirus, un virus del herpes simple, un virus de varicela-zóster, un virus de inmunodeficiencia, un VIH, un virus de peritonitis infecciosa, un virus Influenza , un virus Influenza A, un virus de leucemia, un virus de Marburgo, un ortomixovirus, un papilomavirus, un VPH, un virus Parainfluenza , un paramixovirus , un VRS, un parvovirus, un pestivirus, un picornavirus, un poliovirus, un virus de la viruela, un virus vaccinia,1 un virus de la rabia, un reovirus, un retrovirus, un rotavirus1, una Absidia, un Acremonium, una Alternaría, un Aspergillus, un Basidiobolus, un Bipolaris, un Blastomyces, una Candida,' una Coccidioides, un Conidiobolus, un Cryptococcus, una Curvalaria, un Epidermophyton, una Exophiala , un Geotrichum, un Histoplasma , una Madurella, una Malassezia , una Microsporum, una Moniliella , una Mortierella, un Mucor, un Paecilo yces, una Penicillium, una Phialemonium, una Phialophora , una Prototheca , una Pseudallescheria, . un Pseudomicrodochium, un Pythium, un Rhinosporidiu , un Rhizopus, un Scolecobasidium, una Sporothrix, un Stemphylium, un Trichophyton, un Trichosporon, una Xylohypha, una Babesia, un Balantidium, una Besnoitia, un Cryptosporidium, una Eimeria, un Encephalitozoon, una Entamoeba, una Giardia, una fíai7unondia, una Hepatozoon, una Isospora, una Leishmania, una Microsporidia, una Neospora, una Nosema, una Pentatric^omonas, una Plasmodium, ' una P. falciparum, una Pneumocystis, una Sarcocystis, una Schistosoma, una Theileria, una Toxoplasma, una Trypa noso/na, una Acanthocheilonema, una Aelurostrongylus, una Ancylostoma, una Angiostrongylus, una Ascaris, una Brugia, un Bunostojnum, una Capillaria, una Chabertia, una Cooperia, una Crenoso/na, un D ctyocaulus, una Dioctopnyme, una Dipetalonema, un Diphyllobothrium, un Diplydium, una Dirofílaria, una Dracunculus, una JEnterojius, una Filaroides, una Haemonchus, una Lagochilascaris, un polipéptido de Loa, una Mansonella, una uelleriu's, un Nanopnyetus, una Necator, una Nematodirus, una Oesophagostomu/n, una Onchocerca, una Opisthorchis, una Ostertagia, una Parafilaria, una Paragoni us, una Parascaris, una P ysaloptera, una Prptostrongylus, una Setaria , una Spirocerca , una Spirpmetra, una Etapahanofilaria, una Strongyloides, una Strongylus, una Thelazia, una Toxascaris, una Toxocara, una Trichinella, una richostrongylus, una Trichuris, una C/ncinaria, o , una IVuchereria.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratar profiláctica o terapéuticamente un estado patológico en un sujeto, por ejemplo, produciendo una respuesta mediada por células B y/o una respuesta mediada por células T en el sujeto. En diversas realizaciones, el estado patológico puede ser, pero no se limita a, uno o más de: una infección bacteriana, una infección viral, una infección fúngica, una infección por> Mycoplasma, una infección por prión, una infección por protozoo, o una infección por helminto. Un conjuntó de métodos del aspecto incluye administrar i un organismo completo genéticamente modificado a un sujeto, por ejemplo, un ser humano, un mono, un ratón, una rata, un cerdo, una vaca, un, pollo, un ave de jaula, un ave de pajarera, un reptil o un anfibio. El organismo completo genéticamente modificado estimula por tanto la producción de anticuerpos dentro del sujeto. En un segundo conjunto de métodos de este aspecto, la invención I comprende tratar profiláctica o terapéuticamente un estado patológicb en un sujeto produciendo un anticuerpo frente a una o más enfermedades, estados u organismos que implica producir una respuesta1 de anticuerpos y aislar el anticuerpo o los anticuerpos que entonces se administran a un sujeto.

Con la última herramienta de ingeniería de proteínas, la tecnología Ambrx' , la incorporación de aminoácidos no naturales específica del sitio presenta una gran oportunidad en el desarrollo de' vacunas. Puede crear nanoestructuras bien definidas químicamente combinando antígenos con inmunopotenciadores . Estas nano.estrücturas, que pueden usarse para el desarrollo de vacunas de subunidad, presentan funcionalidad de inmunopotenciación e información de antigeno.

Además, la tecnología Ambrx también puede usarse para crear novedosa vacunas de tipo de organismo completo atenuadas en las que los aminoácidos no naturales servirán como interruptores para la expresión de genes esenciales en organismos patógenos, en vez de vehículos para introducir grupos funcionales no naturales en la proteína Los organismos resultantes simularán el organismo de tipo natural, pero sólo podrán realizar la replicación en presencia de aminoácidos no naturales Ambrx, que no existen en la' naturaleza .

Vacuna de subunidad: Debido a la baja eficacia de las vacunas de subunidades, se requieren adyuvantes para' estimular una respuesta inmunitaria. Tradicionalmente, los adyuvantes se formulan como mezclas con antígenos;. Tras la administración, los antígenos se captarán por células dendfíticas (CD) y se presentarán a células T. Los adyuvantes estimularán las células dendríticas para la liberación de citocinas, potenciación de presentación de antígenos y maduración de las células dendríticas. Se logrará una respuesta inmunitaria ' específica de antígeno eficaz cuando estos dos procesos independientes, presentación de antígenos e inmunoactivación, converj an en la misma CD . Se requiere una dosis relativamente grande. Sin embargo, la gran dosificación de adyuvante provocará una activación inmunitaria independiente de antigeno, un efecto secundario no deseado. Por tanto, de manera intrínseca este enfoque no es ideal y confiere a la vacuna una baja eficacia y alta toxicidad.

Al contrario que los adyuvantes tradicionales, tales como alúmina, , muchos adyuvantes recién descubiertos están bien definidos molecularmente . Con su incorporación de aminoácidos no naturales específica del sitio única y sus capacidades de conjugación específica del sitio, la tecnología Ambrx proporciona las herramientas necesarias para crear vacunas de nueva generación con alta potencia y baja toxicidad. La característica clave de las vacunas de subunidades Ambrx será la combinación de antígeno e inmunopotenciador en una nanoestructura químicamente definida. Cuando se capta por una CD los dos procesos, presentación de antígeno y activación inmunitaria, convergen en la misma CD.

La incorporación de aminoácidos no naturales específica del sitio es una tecnología que permite incorporar aminoácidos no naturales; con restos altamente inmunogénicos tales como mononitrofenilo, dinitrofenilo, directamente en antígenos de proteína.: Recientemente, están volviéndose disponibles inmunopotenciadores de molécula pequeña, tales como imidazoquinolina ligando de receptor tipo toll 7 (TLR7) . Es viable diseñar aminoácidos no naturales con estos inmunopotenciadores de molécula pequeña como cadenas laterales e incorporarlos en un antígeno de proteína.

La tecnología de conjugación específica del sitio de Ambrx proporciona- incluso más flexibilidad. Permite conjugar no sólo las moléculas pequeñas mencionadas anteriormente a la superficie de antígenos de proteína, ¦ sino también una variedad de otros inmunopotenciadores (por ejemplo lípido, lipopéptido, polisacárido, ADN, ARN y nanopartículas) .

La conjugación específica del sitio de ADN monocatenario sobre superficies de proteínas crea otra' dimensión de libertad para el diseño de vacunas. Los ADN con CpG sin metilar son ligandos de TLR-9 ,. que de manera interesante están presentes no sobre la superficie de la célula sino en el interior de las células. El ADN conjugado con el antígeno puede servir no sólo como inmunopotenciador, sino también como elemento estructural para crear de una a tres dimensiones y nanoestructuras con i múltiples valencias de antígeno mediante procesos de hibridación específica de secuencia. Este esquema general también puede usarse para combinar antígenos con otros elementos, tales como reactivos de direccionamiento de APC y otros ligandos de TLR. Se ha mostrado que el direccionamiento de APC (anticuerpo o péptido) puede potenciar; la eficacia de la vacuna y fomentar la presentación cruzada. ¡La combinación de dos ligandos de TLR diferentes tendrá un efecto sinérgico mayor.

La conjugación específica del sitio de Ambrx permite el diseño preciso y la optimización de vacunas. Sin la tecnología Ambrx, un proceso de conjugación no específica tiene un control limitado o ningún control sobre la modificación de sitios en el antígeno de proteína. La conjugación no específica podría alterar los epítopos T y B. También podría modificar la conformación 3D del antígeno que es crítica para el reconocimiento de anticuerpos. Además, algunas modificaciones podrían dificultar el procesamiento dé antígenos. Todos v estos factores hacen que las vacunas conjugadas de manera no específica sean menos eficaces.

Vacuna de organismo completo: La vacunología comenzó con vacunas de organismo completo y todavía en la actualidad son las vacunas más satisfactorias, clasificadas como o bien vivas atenuadas o bien inactivadas . La esencia de las vacunas de organismo completo es que la vacuna debe ser lo más próxima posible al propio organismo patógeno con el fin de provocar una respuesta inmunitaria protectora pero con capacidades de replicación muy limitadas o ausentes en el huésped.

Por tanto, si se desea' una replicación limitada o ausente, ¿es posible usar pequeñas moléculas para controlar el ciclo vital de los microorganismos para crear vacunas mejores y más seguras? La respuesta, usando la tecnología Ambrx, es ahora sí. Si el aminoácido no natural se incorpora en un gen en una bacteria, virus o incluso un parásito que es esencial para la replicación del microorganismo, la vida de estos organismos dependerá de la presencia del aminoácido no natural. Dado que el aminoácido no natural incorporado no existe en la naturaleza, el resultado será organismos, tales como virus y bacterias, que tienen componentes y estructuras virales y celulares casi idénticos, sin la capacidad de replicarse en el huésped. Además, los virus o bacterias modificados mediante ila tecnología Ambrx no sólo pueden servir como la¡ propia vacuna, sino también como vectores para la administración de genes y antígenos.

La plataforma de vacunas de subunidades de Ambrx tiene una amplia variedad de aplicaciones en los campos de vacunas tanto de enfermedades infecciosas como de vacunas contra el cáncer terapéuticas. Las vacunas actuales contra el cáncer son generalmente infecciosas. Se han propuesto enfoques de activación de células T sistémica e inhibición de la ruta reguladora negativa y algunos de ellos están en ensayos clínicos. El desacoplamiento de la activación de células T y el reconocimiento de antígeno puede provocar graves efectos secundarios. La ineficacia de las vacunas contra el cáncer se debe a la falta de tecnología para inducir una fuerte respuesta inmunitaria específica del tumor sin provocar efectos secundarios graves. Ambrx proporciona la tecnología para crear nanoestructuras que pueden provocar fuertes respuestas inmunitarias específicas del cáncer, incluyendo respuestas de células T y células B, y de ese modo abre un nuevo mundo de posibilidades ventajosas, tanto terapéuticas como preventivas .

La plataforma de vacuna de organismo completo puede encontrar innumerables aplicaciones en el campo de las enfermedades infecciosas. Virus, bacterias o incluso parásitos que pueden cultivarse y tienen un genoma capaz de mutación son buenos candidatos. Las. vacunas de la presente invención mejorarán la gestión de riesgos en el desarrollo de vacunas y las vacunas se definen mejor, tanto química como genéticamente, y proporcionan eficacias sin precedentes.

Para expandir el código genético, la invención proporciona composiciones y métodos para producir ARNt ortogonales. Las aminoacil-ARNt · sintetasas aminoacilan ARNt de la presente invención con un aminoácido no codificado de manera natural. Estos componentes de traducción pueden usarse para incorporar un aminoácido seleccionado en una posición específica en una cadena de polipéptido en crecimiento (durante la traducción del ácido nucleico) en respuesta a un codón selector que se reconoce por el ARNt.

Métodos para producir una proteína en una célula con un aminoácido seleccionado en una posición específica también son una característica de la presente invención. Por ejemplo, un método incluye hacer crecer, en un medio apropiado, una célula, en el que la célula comprende un ácido nucleico que comprende al menos un codón selector y codifica para una proteína; y, proporcionar el aminoácido seleccionado. La · célula comprende además: un ARNt ortogonal (O-ARNt) que funciona en la célula y reconoce el codón selector; y, una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) que aminoacila preferiblemente el O-ARNt con el aminoácido seleccionado. Normalmente, el O-ARNt comprende actividad de supresión en presencia de una sintetasa relacionada. Una proteina producida mediante este método también es una característica de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 - Se muestra la estructura en forma de hoja de trébol de, ARNt de J17 con sitios de mutación de tallo ???.

Figüra 2 - Se muestra la supresión de una mutación ámbar en la hormona del crecimiento humana usando J17 o mutantes de J17 (F12, F13, F14) . Se analizó el lisado celular total para cada muestra mediante SDS PAGE.

Figura 3 - Se muestra la supresión de una mutación ámbar en la hormona del crecimiento humana en diferentes líneas celulares usando F13.

Figura 4 - Muestra un diagrama del vector pVKlO-camR que contiene el sistema de supresión Ambrx.

Figura 5 - Muestra un diagrama del vector pKD46 que contiene componentes de Lambda Red (bet, gam, exonucleasa) .

Figura 6 - Muestra un esquema de cebadores solapantes y los métodos usados en el ejemplo 5. Los cebadores se indican mediante flechas e identificador numérico, y por ejemplo cebadores 1 para los clones Y31 y N51 serían SEQ ID NO: 18 y 26, irespectivamente ; cebadores 2 para los clones Y31 y N51 serían SEQ ID NO: 19 y 27, respectivamente; cebadores 3 para los clones Y31 y N51 serían SEQ ID NO: 20 y 28, respectivamente; cebadores 4 para los clones Y31 y N51 serían SEQ ID NO: 21 y 29, respectivamente; cebadores 5 para los clones Y31 y N51 serían SEQ ID NO: 22 y 30, respectivamente; cebadores 6 para los clones Y31 y N51 serían SEQ ID NO: 23 y 31, respectivamente; cebadores 7 para los clones Y31 y N51 serían SEQ ID NO:' 24 y 32, respectivamente; cebadores 8 para los clones Y31 y N51 serían SEQ ID NO: 25 y 33, respectivamente. Los productos de PCR se identifican mediante una letra. Se generó un sitio ámbar que contenía metionina aminopeptidasa solapando PCR sobre la mutación ámbar (A y B) , haciéndolo de manera que sea condicionalmente mortal para E. coli, como organismo completo. Entonces se fusionó la metionina aminopeptidasa mutante en un gen completo (C) y se combinó con un marcador seleccionable (D) y una trozo parcial de metionina aminopeptidasa mutante (E) para la seleccióni en sentido 3' .

Figura 7 - Muestra un esquema de examen para seleccionar dependencia de aminoácidos artificiales. Las tres etapas mostradas son 1) seleccionar transformantes, tales como transformantes-positivos para KanR, AmpR, tratando las placas; 2) cultivar los supervivientes en KanR, AmpR, + aminoácido no natural; y 3) hacer crecer colonias individuales sobre placas con y sin el aminoácido no natural y seleccionar las colonias que crecen en presencia del aminoácido no natural y mueren cuando se cultivan sin el aminoácido no natural.

Figura 8 - Muestra dos placas de cultivo celular de E. coli que están examinándose para seleccionar una mutación ámbar en el gen de metionina aminopeptidasa en Y31, recubierta cada una con agar LB y con medids que contienen ampicilina 50 µg/mL y kanamicina 50 µg/mL, _ conteniendo adicionalmente la placa en la izquierda para-acetilfenilalanina 2 mM y no conteniendo nada la placa en la derecha. A12, C5, y E3 son ejemplos de E. coli dependiente de replicación químicamente modulada.

Figura 9 - Muestra dos placas de cultivo celular de E. coli que están examinándose para seleccionar una mutación ámbar en el gen de metionina aminopeptidasa en N51, recubierta cada una con agar LB 1 y con medios que contienen ampicilina 50 µg/mL y kanamicina 50 µg/mL, conteniendo adicionalmente la placa a la izquierda1 para-acetilfenilalanina 2 mM y no conteniendo nada la placa a \ la derecha. A12, C5, y E3 son ejemplos de E. coli dependiente de replicación químicamente modulada.

Figuras 10A y 10B - Muestran el crecimiento en medios permisivos y no permisivos. Se inoculan cultivos durante la noche en medio de glucosa (rombos) o arabinosa (círculos) a las razones de dilución óptimas mostradas en la esquina superior derecha de cada panel. Se monitorizó la DO600 en una placa de 96 pocilios en un lector de placas Spectramax con agitación a 37°C con extracción periódica de muestras para el microscopio y sembrando sobre placas de arabinosa. Se calculó el cambio en la viabilidad, proporcionado en el e e de la derecha (triángulos) , usando la concentración de UFC normalizada dividiendo entre la DO600. Para cada punto de tiempo, se dividió este valor entre, el valor a T = 0 y en este caso se presenta el logaritmo de ese valor. Los números de UFC por mililitro por unidad de DO a T = 0 medidos a partir del inoculo saturado ' y corregidos para la dilución fueron los siguientes: WT, 4,6 x 109; mutante frr, 3,2 x 109; mutante gcpE, 3,4 x 109; mutante lpxC, 2,2 x 109; mutante map, 2,9 x 109; mutante murA, 8,7 x 108; mutante ppa, 1,5 x 109 mutante rpsA, 1,2 x 109. La DO se muestra en una escala lineal en vez de una logarítmica para mostrar mejor la dinámica de los cultivos en decaimiento, y la escala en el eje de la derecha se diferencia para lpxC y map para evitar que las líneas de tendencia se solapen. Para los dos últimos puntos de tiempo de la medición de murA, no creció ninguna colonia. De Herring y. Blattner JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 2004, págs . 2673-2681, incorporado al presente documento como referencia.

Figura 11 - Muestra un esquema de la caracterización de las tasas de reversión en el que se hacen crecer células dependientes de la replicación de aminoácidos no naturales genéticamente modificadas hasta una densidad óptica de 1,0 en medios + aminoácido no natural, después se siembran en placa esas células en diluciones en serie en medios con adición de aminoácido no natural para calcular las unidades de formación de colonias y las células- restantes se cultivan sin presencia del aminoácido no natural para detectar las que revierten.

Figura 12 - Muestra un esquema de una estrategia de mutagénesis. Se produce un fragmento de ADN lineal a partir de un molde WT de ADN genómico mediante PCR de extensión con solapamiento . Las posiciones de cebadores se indican mediante flechas en una dirección. El producto de fusión de ECR se somete a electroporación en células, y se seleccionan las integraciones resultantes de un acontecimiento de doble recombinación. Tras la identificación de un clon que lleva el codón de terminación ámbar que sigue, se induce el gen I-Scel, dando como resultado la eliminación del gen que codifica para Camr. La recombinación dentro de una región duplicada corta conduce a la generación de un mutante ámbar que por lo demás no tiene cicatrices.

Figura 13 - Muestra plásmidos usados en la mutagénesis que sigue.

Figura 14 - Muestra un esquema de las etapas en la creación de un mutante letal condicional en E. coli incluyendo, comenzando por la parte superior, 1) crear un molde -de mutante condicional; 2) transformar en un recombinante lambda RED, una cepa competente para la supresión ámbar; e 3) inducir la recombinación de lambda RED.

Figura 15 - Muestra un esquema de las etapas en . la caracterización de un mutante letal condicional en E. » coli incluyendo, comenzando por la parte superior, 1) caracterizar el crecimiento en presencia y ausencia del aminoácido no natural del que dependerá un organismo transformado satisfactoriamente; 2) caracterizar la mutación como bactericida o bacteriostática, y 3) caracterizar la frecuencia -de reversión.

Figura 16 - Muestra una vista estructural de los picos de residuos de MAP.

Figura 17 - Muestra una vista estructural de los picos de residuos de MAP.

DEFINICIONES Antes de describir la invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se ,limita a sistemas biológicos particulares que, por supuesto, varían. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es únicamente para los fines de describir realizaciones particulares, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, que se limitará únicamente por las reivindicaciones adjuntas. Tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", y "el/la" incluyen la referencia en plural1 a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células e incluye equivalentes de la misma conocidas por los expertos habituales en la técnica, etcétera. La referencia a "bacteria" incluye mezclas de bacterias, y similares.

A menos que se defina en el presente documento y a continuación, en el resto de la memoria descriptiva, todos los términos técnicos y científicos usados en el. presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención.

Todas las publicaciones y patentes mencionadas en el presente documentó se incorporan en el presente documento como referencia para el fin de describir y dar a conocer, por ejemplo, los constructos y metodologías que se describen en las publicaciones, que pueden usarse en relación con la invención descrita ahora. Las publicaciones tratadas en el presente documento se proporcionan únicamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No debe interpretarse nada en el presente documento como admisión de que los inventores no tienen derecho a una fecha anterior a tal divulgación en virtud de la invención previa o por cualquier otro motivo.

Las ' proteínas y/o secuencias de proteínas son "homologas" cuando se derivan, de manera natural o artificial, de una proteína o secuencia de proteína ancestral común. De manera similar, los ácidos nucleicos y/o secuencias de ácido nucleico son homólogos cuando se derivan, de manera natural o artificial, de un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico ancestral común. Por ejemplo, cualquier ácido nucleico que se produce de manera natural puede modificarse · mediante cualquier método de mutagénesis disponible para incluir uno o más codones selectores. Cuando se expresa, este ácido nucleico mutagenizado codifica para un polipéptido que comprende uno o más aminoácidos seleccionados, por ejemplo aminoácido no natural. Evidentemente, el proceso de mutación - puede alterar adicionalmente uno o más codones convencionales, cambiando también asi uno o más aminoácidos convencionales en la proteina mutante resultante. El' uno o más aminoácidos convencionales pueden cambiarse por un aminoácido no natural o un aminoácido natural. La homología se deduce generalmente a partir de la similitud de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o proteínas (o secuencias de los mismos) . El porcentaje de similitud preciso entre secuencias que es útil para establecer la homología varía con el ácido nucleico y la proteína en cuestión, pero de manera rutinaria se usa una similitud de secuencia de tan sólo el 25% para establecer la homología. También pueden usarse niveles superiores de similitud de secuencia, por ejemplo, el 30% , 35% , 40 % , 45% , 50 % ,' 55% , 60% , 65% , 70 % , 75% , 80% , 85% , 90 % , , 91 % , 92% , 93% , . 94 % , 95% , 96% , 97 % , 98 % o el 99% o más, para establecer la homología. En el presente documento se describen métodos para determinar porcentajes de similitud de secuencia (por ejemplo, BLASTP y BLASTN usando parámetros por defecto) y están generalmente disponibles.

Tal ' como se usa en el presente documento, el término "ortogonal" se refiere a una molécula (por ejemplo, un ARNt ortogonal (O-ARNt) y/o una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal' (0-RS) ) que se usa con una eficacia reducida por un sistema de interés ¡(por ejemplo, un sistema de traducción, por ejemplo, una célula) . : Ortogonal se refiere a la incapacidad o eficacia reducida, por ejemplo, inferior al 20% de eficacia, inferior al 10% de eficacia, inferior al 5% de eficacia, o por ejemplo, inferior , al 1% de eficacia, de un ARNt ortogonal y/o RS ortogonal para funcionar en el sistema de traducción de interés. Por ejemplo, un ARNt ortogonal en un sistema de traducción de interés se aminoacila mediante cualquier RS endógena de un sistema de traducción de interés con eficacia reducida o incluso nula, en comparación con la aminoacilación de un ARNt endógeno por una RS endógena En otro ejemplo, una RS ortogonal aminoacila cualquier ARNt endógeno en el sistema de traducción de interés con eficacia reducida o incluso nula, en comparación con el ARNt endógeno por una RS endógena. Puede introducirse una segunda molécula ortogonal en la célula que funciona con la primera molécula ortogonal. Por ejemplo, ' un par de ARNt/RS ortogonal incluye componentes complementarios introducidos que funcionan juntos en la célula con una eficacia (por ejemplo, aproximadamente el 50% de eficacia, aproximadamente el 60% de eficacia, aproximadamente el 70% de eficacia, aproximadamente el 75% de eficacia, aproximadamente el 80% de eficacia, aproximadamente el 85% de eficacia, aproximadamente el 90% de eficacia, aproximadamente el 95% de eficacia, o aproximadamente el 99% o más de eficacia) con respecto a la de un par endógeno de ARNt/RS correspondiente. "Mejora en la ortogonalidad" se refiere a ortogonalidad potenciada en comparación con un material de partida o un ARNt o RS que se produce de manera natural .

El ·' término "relacionado" se refiere a componentes que funcionan juntos, por ejemplo, un ARNt y una aminoacil-ARNt sintetasa. Los componentes también pueden denominarse complementarios.

La expresión "aminoacila preferiblemente" se refiere a una eficacia,: por ejemplo, aproximadamente el 70% de eficacia, aproximadamente el 75% de eficacia, aproximadamente el 80% de eficacia, aproximadamente el 85% de eficacia, aproximadamente el 90% de , eficacia, aproximadamente el 95% de eficacia, o aproximadamente el 99% o más de eficacia, a la que una O-RS aminoacila un O-ARNt con un aminoácido seleccionado, por ejemplo, un aminoácido no natural, en comparación con la O-RS que aminoacila un ARNt que se produce de manera natural o un material de partida usado para generar el O-ARNt. Entonces se incorpora el aminoácido no natural en una cadena de polipéptido en crecimiento con alta fidelidad, por ejemplo, superior a aproximadamente el 70% de eficacia para un codón selector dado, superior a aproximadamente el 75% de eficacia para un codón selector dado, superior a aproximadamente el 80% de eficacia para un codón selector dado, superior a aproximadamente el 85% de eficacia para un codón selector dado, superior a aproximadamente el 90% de eficacia para un codón selector dado, superior a aproximadamente el 95% . de eficacia para un codón selector dado, o superior a aproximadamente el 99% de eficacia para un codón selector dado.

Un "tratamiento profiláctico" es un tratamiento administrado a un sujeto que no presenta signos o síntomas de una enfermedad, patología o trastorno médico, o sólo presenta signos o síntomas tempranos de una enfermedad, patología o trastorno, de tal manera que el tratamiento se administra con el fin de disminuir, prevenir o reducir el riesgo de desarrollo de la enfermedad, patología o trastorno médico. Un tratamiento profiláctico funciona como un tratamiento preventivo contra una enfermedad o trastorno. Una "actividad profiláctica" es una actividad de un agente, tal como un inmunógeno no natural y/o anticuerpo, o composición del mismo, que, cuando se administra a un sujeto que no presenta signos o síntomas ; de una patología, enfermedad o trastorno (o' que sólo presenta signos o síntomas tempranos de la misma) disminuye, previene : o reduce el riesgo de que el sujeto desarrolle la patología, enfermedad o trastorno. Un agente o compuesto "profilácticamente útil" (por ejemplo, un inmunógeno no natural y/o anticuerpo de la invención) se ,refiere a un agente o compuesto que es útil en la disminución, prevención, tratamiento o reducción del desarrollo de una patología, enfermedad o trastorno.

Los tratamientos, vacunas y/o tratamientos profilácticos pueden administrarse a un paciente que los necesita. Los tratamientos, vacunas y/o tratamientos profilácticos también pueden administrarse a una variedad de animales incluyendo, pero sin limitarse a, ganado doméstico, tal como vacas, cerdos, cabras, ovejas, pollos y/u otros animales de granja comunes y mascotas comunes, ¡ por ejemplo, gatos, perros, papagayos, periquitos, etc.

La expresión "codón selector" se refiere a codones reconocidos por el O-ARNt en el proceso de traducción y no reconocidos por un ARNt endógeno. El bucle anticodón de O-ARNt reconoce el codón selector en el ARNm e incorpora su aminoácido, por ejemplo, un aminoácido seleccionado, tal como un aminoácido no natural, en este sitio en el polipéptido. Los codones selectores pueden incluir, pero no se limitan a, por. ejemplo, codones antisentído, tales como, codones de terminación, incluyendo pero sin limitarse a, codones ámbar, ocre y ópalo; codones de cuatro o más bases; codones raros; codones derivados de pares de bases naturales o no naturales y/o similares. Para un sistema dado, un codón selector también puede incluir uno de los codones de tres bases naturales, en el que el sistema endógeno no usa (o usa con poca frecuencia) dicho codón de tres bases natural. Por ejemplo, esto incluye un sistema que carece de un ARNt que reconoce el codón de tres bases natural, y/o un sistema en el que el codón de tres bases natural es un codón raro.

Un ARNt supresor es un ARNt que altera la lectura de un ARN mensajero1 (ARNm) en un sistema de traducción dado, por ejemplo, proporcionando un mecanismo para incorporar un aminoácido en una cadena de polipéptido en respuesta a un codón selector. Por ejemplo', , un ARNt supresor puede leer a través de un codón incluyendo-, pero sin limitarse a, un codón de terminación, un codón de cuatro bases o un codón raro.

La ! expresión "actividad de supresión" se refiere a la capacidad de un ARNt, por ejemplo, un ARNt supresor, para leer a través de un codón selector. La actividad puede expresarse como un porcentaje de actividad observada en comparación con un control (por ejemplo, que carece de una sintetasa relacionada) .

La ' expresión "sistema de traducción" se refiere a los componentes necesarios para incorporar un aminoácido que se produce de manera natural en una cadena de polipéptido en crecimiento (proteina) . Los componentes de un sistema de traducción pueden incluir, por ejemplo, ribosomas, ARNt, sintetasas, ARNm y similares. Los componentes de la presente invención, pueden añadirse a un sistema de traducción in vitro o in vivo. Ejemplos de sistemas de traducción incluyen, pero no se limitan a, una célula no eucariota, por ejemplo, una bacteria (tal como E. coli) , una célula eucariota, por ejemplo, una célula de levadura, ' una célula de mamífero, una célula vegetal, una célula de alga, Una célula de hongo, una célula de insecto, un sistema de traducción libre de células por ejemplo, un lisado celular, y/o similares : Los 1 sistemas de traducción pueden ser celulares o estar libres de células, y pueden ser procariotas o eucariotas . Los sistemas de traducción celulares incluyen, pero no se limitan a, preparaciones de células completas tales como células permeabilizadas o cultivos celulares en los que puede transcribirse una secuencia de ácido nucleico deseada en ARNm y traducirse el ARNm. Los sistemas de traducción libres de células están comercialmente disponibles y se conocen bien muchos tipos y sistemas diferentes. Ejemplos de sistemas libres de células incluyen, pero no se limitan a, lisados procariotas tales como lisados de Escherichia coli, y lisados eucariotas tales como extractos de germen de trigo, lisados de célula de insectos, lisados de reticulocitos de conejo, lisados de ovocitos de conejo y lisados de células humanas. Pueden preferirse lisados o extractos eucariotas' cuando la proteina resultante se glicosila, fosforila o modifica de otro modo porque muchas de tales modificaciones sólo son posibles en sistemas eucariotas. Algunos de estos' extractos y lisados están comercialmente disponibles (Promega; Madison, Wis. Stratagene; La Jolla, Calif.; Amersham; Arlington Heights, 111.; GIBCO/BRL; Grand Island, N.Y.) . También hay disponibles extractos membranosos, tales como los extractos de páncreas caninos que contienen membranas microsomales , que son útiles para traducir proteínas secretoras.

También pueden usarse sistemas de traducción reconstituidos. También se han usado satisfactoriamente mezclas de factores de traducción purificados para traducir ARNm en proteína así como combinaciones de lisados o lisados complementados con factores de traducción purificados tales como factor de iniciación 1 (IF-1), IF-2, IF-3 (a o ß) , factor de elongación T (EF-Tu) , o factores de terminación. Los sistemas libres de células también pueden ser sistemas de transcripción/traducción acoplados en los que se introduce ADN en el sistema, se transcribe para dar ARNm y se traduce el ARNm tal como se describe en Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. editores, Wiley Interscience, 1993) , que se incorpora específicamente al presente documento como referencia. El ARN transcrito en un sistema de transcripción eucariota puede estar en forma de ARN heteronuclear (ARNhn) o ARN maduro con caperuzas en el extremo 5' (7-metiloguanosina) y con cola de poli A en el extremo 3' , que pueden ser una 1 ventaja en determinados sistemas de traducción. Por ejemplo, los ARNm con caperuza se traducen con alta eficacia en el sistema de lisado de reticulocitos .

La expresión "aminoácido seleccionado" se refiere a cualquier aminoácido que se produce de manera natural o aminoácido no natural deseado. Tal como s^e usa en el presente documento, la expresión1 "aminoácido no natural" o "aminoácido no codificado de manera natural" se refiere a cualquier aminoácido, aminoácido modificado y/o análogo de aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural comunes o selenocisteína o pirrolisina. Otras expresiones que pueden usarse de manera sinónima a la expresión "aminoácido no codificado de manera natural" y "aminoácido no natural" son "aminoácido que no se produce de manera natural" y diversas versiones con guión y sin guión de las mismas. La expresión "aminoácido no codifica'do de manera natural" también incluye, pero no se limita a, aminoácidos que se producen mediante modificación (por ejemplo modificaciones tras la traducción) de un aminoácido codificado de manera natural (incluyendo, pero sin limitarse a, los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina y selenocisteina) pero no se incorporan por si mismos de manera natural en una cadena de polipéptido en crecimiento mediante el complejo de traducción. Ejemplos de tales aminoácidos que no se producen de manera natural incluyen, pero no se limitan a, IV-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina, y O-fosfqtirosina .

Aminoácido no natural : tal como se usa en el presente documento, un aminoácido no natural se refiere a cualquier aminoácido, aminoácido modificado, o análogo de aminoácido distinto de selenocisteina y/o pirrolisina y los siguientes veinte alfa-aminoácidos canónicos codificados genéticamente: alanina, arginina,' asparagina, ácido aspártico, cisteina, glutamina, ácido glutámico, · glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina. En diversas realizaciones de la invención, el uno o más aminoácidos no naturales que se incorporan en el inmunógeno no natural pueden ser cualquier aminoácido no natural. Por tanto, se apreciará que la mención de aminoácidos no naturales específicos en el presente documento no debe interpretarse necesariamente como limitación de la invención. Se ha incorporado una amplia variedad de aminoácidos no naturales en proteínas codificándolas in vivo, por ejemplo, usando sistemas de traducción que comprenden elementos ortogonales. Véase, por ejemplo, Liu, et al. (2007) "Genetic incorporation of unnatural amino acids in proteins : in mammalian cells" Nat Methods 4:239-244; Wang, et al. (2006) "Expanding the genetic code" Annu Rev Biophys Biomol Struct 35:225-249; Xie & Schultz (2006) "A chemical toolkit for proteins-an expanded genetic code" Nat Rev Mol Cell Biol 7:775-782; Wang y Schultz "Expanding the Genetic Code", Angewandte Chemie Int. Ed, 44(l):34-66 (2005) y Chin, et al. (2003) "An expanded eukaryotic genetic code" Science 301:964-967 para una revisión.

En algunas realizaciones de la presente invención resulta deseable usar aminoácidos no naturales que no son uno de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural comunes o los aminoácidos que se producen de manera natural raros por ejemplo, selenocisteína o pirrolisina. Por ejemplo, los aminoácidos no naturales, p-nitrofenilalanina, p-sulfotirosina, 'y p-carboxifenilalanina encuentran uso en diversas realizaciones en el presente !documento. En algunas realizaciones, el aminoácido no natural puede incluir, pero no se limita a: p-nitrofenilalanina; una o-nitrofenilalanina; una m-nitrofenilalanina; una p-boronil-fenilalanina; una o-boronilfenilalanina; una m-boronilfenilalanina; una p-aminofenilalanina; una o-aminofenilalanina; . una m-aminof.enilalanina; una ¦ p-acilfenilalanina; una o-acilfenilalanina; una m-acilfenilalanina; una p-OMe-fenilalanina; una o-OMe-fenilalanina ; una m-OMe-fenilalanina; una p-sulfofenilalanina; una o-sulfofenilalanina; una m-sulfofenilalanina; una 5-nitro-His; una 3-nitro-Tyr; una 2-nitro-Tyr; una Leu sustituida con nitro; una His sustituida con nitro; una De sustituida con nitro; una Trp sustituida con nitro; una 2-nitro-Trp; una 4-nitro-Trp; una 5-nitro-Trp; una 6-nitro-Trp; una 7-nitro-Trp; 3-aminotirosina, 2-aminotirosina, O-sulfotirosina, 2-sulfooxifenilalanina, 3-sulfooxioxifenilalanina o p-carboxifenilalanina, o-carboxifenilalanina, y m-carboxifenilalanina . De nuevo, se apreciará que la invención no se limita a aminoácidos no naturales particulares .

Además, en diversas realizaciones de la presente invención, pueden incorporarse aminoácidos no naturales en inmunógenos in vitro, por ejemplo, usando métodos biosintéticos en los que se acila químicamente un ARNt supresor con un aminoácido no natural deseado y se añade a un extracto in vitro que puede soportar la biosintesis de inmunógeno. Para una descripción de tales métodos sintéticos in vitro, véase, por ejemplo, V. W. Cornish, D. Mendel y P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 1995, 3.4:621 (1995); CJ. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, "A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids int proteins", Science 244 182-188 (1989); y, J.D. Bain, CG. Glabé, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Díala, "Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide", J. Ara. Chem. Soc. II 1 8013-8014 (1989) . También pueden añadirse aminoácidos no naturales a proteínas producidas de manera natural o sintética mediante químicas de péptidos sintéticos disponibles (o pueden convertirse aminoácidos naturales en aminoácidos no naturales mediante tales métodos) , o mediante procesamiento tras la traducción. Sin embargo, de nuevo, se apreciará que tales modificaciones tras la traducción y químicas se realizan normalmente junto con, o además, de, la incorporación de uno p' más aminoácidos no naturales durante la síntesis de una ' i molécula ¡ (por ejemplo, incorporación directa tal como traducción ortogonal, síntesis en fase sólida, etc.).' Por tanto, la adición tras la 1 traducción o modificación química de aminoácidos se i realiza normalmente, si es que se realiza, únicamente en moléculas que ya tienen aminoácidos no naturales que se añadieron durante la síntesis de la molécula. A continuación- se facilita información adicional sobre la incorporación no ortogonal de aminoácidos no naturales; en inmunógenos .

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "derivado de" se refiere a un componente que se aisla de o se prepara , usando información de una molécula u organismo especificado .

Una "célula huésped recombinante" o "célula huésped" se refiere a una célula que incluye un polinucleótido exógeno, independientemente del método usado para la inserción, por ejemplo, captación directa, transducción, apareamiento f, u otros métodos conocidos en la técnica para crear células huésped recombinantes . El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásraido, o alternativamente, puede integrarse en el genoma huésped.

Tal1 como se usa en el presente documento, el término "medio" o "medios" incluye cualquier medio de cultivo, disolución, sólido, semi-sólido, o soporte rígido que puede soportar o contener cualquier célula ^huésped, incluyendo células huésped bacterianas, células huésped de levadura, células huésped de insecto, células huésped vegetales, células huésped eucariotas, células huésped de mamífero células CHO, células huésped procariotas, E. coli, o células huésped de Pseudomonas, y contenidos celulares. Por tanto, el término puede abarcar medio en el que se ha hecho crecer la célula huésped, por ejemplo, medio en el que está creciendo un cultivo u organismo completo o célula, y el medio puede tener un aminoácido no natural ' incluido para soportar el crecimiento de células ü organismos deficientes en la replicación, incluyendo medio o bien antes o bien después de la etapa de proliferación. El término también puede abarcar tampones o reactivos que contienen i lisados de célula huésped, tales como en el caso en el que los antígenos se producen de manera intracelular y las células huésped se lisani o alteran para liberar los antígenos o antígenos recombinantes.

"Agente reductor", tal como se usa en el presente documento con respecto al replegamiento de la proteína, se define como cualquier compuesto o material que mantiene los grupos sulfhidrilo en el e:stado reducido y reduce los puentes disulfuro intra o intermoleculares. Agentes reductores adecuados incluyen, pero no se limitan a, ditiotreitol (DTT) , 2-mercaptoetanol , ditioeritritol , cisteina, cisteamina ( 2-aminoetanotiol ) , y glutatióri reducido. Resulta fácilmente evidente para los expertos en la técnica que una amplia variedad de agentes reductores son adecuados para su uso en los métodos y composiciones de la presente 'invención.

"Agente oxidante", tal como se usa en el presente documento i con respecto al replegamiento de la proteina, se define como cualquier compuesto o material que puede extraer un electrón de un compuesto: que está oxidándose. Agentes oxidantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, glutatión oxidado, cistina, cistamina> ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado y oxigeno. Para los expertos en la técnica resulta fácilmente evidente que una amplia variedad de agentes oxidantes son adecuados para su uso en los métodos de la presente invención.

"Replegamiento", tal como se usa en el presente documento describe cualquier proceso, reacción o método que transforma polipéptidos que contienen puentes disulfuro de un estado plegado de manera inapropiada o no plegado a una conformación nativa o plegada de manera apropiada con respecto á los puentes disulfuro.

"Plegamiento conjunto", tal como se usa en el presente documento,1 se refiere específicamente a procesos, reacciones o métodos de . replegamiento que emplean al menos dos polipéptidos que interaccionan entre si y dan como resultado la transformación de polipéptidos no. plegados o plegados de manera inapropiada en polipéptidos nativos, plegados de manera apropiada.

Un "grupo de modificación de extremo amino terminal" se refiere a cualquier molécula que puede unirse al extremo amino terminal de un polipéptido. De manera similar, un "grupo de modificación de extremo carboxilo terminal" se refiere a cualquier molécula 1 que puede unirse al extremo carboxilo terminal de un polipéptido. Los grupos de modificación de extremo terminal incluyen, pero no se limitan a, diversos polímeros, péptidos o proteínas' solubles en agua tales como albúmina sérica, u otros restos que aumentan la semivida en suero de péptidos.

Las expresiones "grupo funcional", "resto activo", "grupo activante", "grupo saliente", "sitio reactivo", "grupo químicamente reactivo" y "resto químicamente reactivo" se usan en la técnica y en el presente documento para hacer referencia a partes o unidades diferenciadas, definibles, de una molécula. Las expresiones son algo sinónimas en las técnicas químicas y se usan en el presente documento para indicar las partes de moléculas que realizan alguna función o actividad y son reactivas con otras moléculas .

Los ¡términos "enlace" o "ligador" se usan en el presente documento para referirse a grupos o ; enlaces que se forman i normalmente como resultado de una reacción química y normalmente son enlaces covalentes. Enlaces hidrolíticamente estables significa que los enlaces son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a valores de pH útiles, incluyendo, pero sin limitarse a, en condiciones fisiológicas durante un periodo prolongado de tiempo, quizás incluso indefinidamente. Enlaces hidrolíticamente inestables o degradables significa que los enlaces son degradables en agua o en disoluciones acuosas, incluyendo por ejemplo, sangre. Enlaces enzimáticamente inestables o degradables significa que el enlace puede degradarse por una o más enzimas. Tal como se entiende en la técnica, PEG y polímeros relacionados pueden "" incluir enlaces degradables en la estructura del polímero o en el grupo ligador entre la estructura del polímero , y uno o más de los grupos funcionales terminalés de la molécula de polímero. Por ejemplo, los enlaces éster formados por la reacción de PEG-ácidos carboxílicos o PEG-ácidos carboxílicos activados con grupos alcohol en un agente biológicamente activo se hidrolizán generalmente en condiciones fisiológicas para liberar el agente. Otros enlaces hidrolíticamente degradables incluyen, pero no se limitan a, enlaces carbonato; enlaces imina resultantes de la reacción de una amina y un aldehido; enlaces de éster fosfato formados haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; ,enlaces hidrazona que son un producto de reacción de una hidrazida1 y un aldehido; enlaces acetal que son el producto de reacción de un aldehido y un alcohol; enlaces ortoéster que son el producto de reacción de un formiato y un alcohol; enlaces peptídicps formados por un grupo amina, incluyendo, pero sin limitarse a, en un extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces oligonucleotídicos formados por un grupoi fosforamidita, incluyendo, pero sin limitarse a, en el extremo 'de un polímero, y un grupo hidroxilo en 5' de un oligonucíeótido .

Las expresiones "molécula biológicamente activa", "resto biológicamente activo" o "agente biológicamente activo" cuando se usan en 'el presente documento significan' cualquier sustancia que puede afectar a cualquier propiedad física o bioquímica de un sistema, ruta, molécula o interacción biológicos referente a un organismo, incluyendo, pero sin limitarse a, virus, bacterias, bacteriófagos, transposón, prión, insectos, hongos, plantas, animales y seres humanos. En particular, tal como se usa en el presente , documento, moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, cualquier sustancia prevista para el diagnóstico, cura, alivio, tratamiento o prevención de enfermedad en seres ; humanos u otros animales, o potenciar de otro modo el bienestar1 físico o mental de seres humanos o animales. Ejemplos de moléculas' biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de molécula pequeña, vacunas, inmunógenos, fármacos duros, fármacos blandos, hidratos de carbono, moléculas o átomos inorgánicos, colorantes, lípidos, nucleósidos, radionúclidos , oligonucleótidos, toxoides, toxinas, células procariotas y eucariotas, virus, polisacáridos , ácidos nucleicos y partes de los mismos obtenidos o derivados de virus, bacterias, insectos, animales- o cualquier otra célula o tipo celular,' liposomas, microparticulas y micelas. Clases de agentes biológicamente activos que son adecuadas para su uso con la invención incluyen,' pero no se limitan a, fármacos, profármacos, radionúclidos , agentes de obtención de imágenes, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirales, agentes antiinflamatorios, agentes antitumorales, agentes cardiovasculares, agentes antiansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esteroideos, toxinas derivadas de microbios y similares.

El término "arilo" significa, a menos que se indique lo contrario, un sustituyente hidrocarbonado, aromático, poliinsaturado que puede ser un anillo único o múltiples anillos (incluyendo, pero sin limitarse a, desde 1 hasta 3 anillos) que se condensan juntos o se unen de forma covalente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos (o anillos) ^arilo que contienen desde uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados de N, 0 y S, en los que , los átomos de nitrógeno y azufre están opcionalmente oxidados,' y el/los átomos de nitrógeno está(n) opcionalmente cuaternizado ( s ) . Un grupo heteroarilo puede unirse al resto de la molécula mediante un heteroátomo. Ejemplos no limitativos .de grupos de arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 14-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilp, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo. Sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillo de arilo: y heteroarilo indicados anteriormente se seleccionan del grupo de , sustituyentes aceptables descritos a continuación.

Por motivos de 'brevedad, el término "arilo" cuando se usa en i combinación con otros términqs (incluyendo, pero sin limitarse a, ariloxilo, ariltioxilo, arilalquilo) incluye tanto anillos arilo como heteroarilo tal como se definieron anteriormente. Por tanto, se pretende que el término "arilalquilo" incluya los radicales en los que un grupo arilo está unido a un grupo alquilo (incluyendo, pero sin limitarse a, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similarest) incluyendo aquellos grupos alquilo en los que se ha sustituido un átomo de carbono (incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo' metileno) por, por ejemplo, un átomo de oxigeno (incluyendo, pero sin limitarse a, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3- ( 1-naftiloxi ) propilo, y similares) .

Se ¡pretende que cada uno de los términos anteriores i (incluyendo, pero sin limitarse a, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y' "heteroarilo") incluya tanto formas sustituidas como no sustituidas del radical indicado. A continuación se proporcionan sustituyentes a modo de ejemplo para cada tipo de radical.

Sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo los grupos denominados con frecuencia alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados de, pero sin limitarse a: -0R' , =0, =NR' , =N-OR' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR'R"R"', -0C(0)R', -C (0) R' , -C02R' , -LC0NR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C (0) R' , -NR' -C (0) NR"R"' , NR"C(0)2R', -NR-C (NR' R"R' ") =NR"", -NR-C (NR' R" ) =NR"', -S(0)R', S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R',. -CN y -N02 en un número que oscila desde cero hasta (2m'+l), en el que m' es el número total de átomos de carbono en tal radical. R' , R", R'" y R"" se refieren cada uno independientemente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o nó sustituido, arilo sustituido o no sustituido, incluyendo, pero sin limitarse a, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxilo o tioalcoxilo, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada grupo R' , R", R' " y R"" cuando hay más de uno de esos grupos presente. Cuando R' y R" están unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 ó 7 miembros. Por ejemplo, se pretende que -NR'R" incluya, pero no se limite a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo . A partir de la discusión anterior de sustituyentes, un experto en la técnica entenderá que se pretende: que el término "alquilo" incluya grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos distintos de grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo, pero sin limitarse a, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo, pero sin limitarse a, -C(0)CH3, C(0)CF3, -C (0) CH'2OCH3, y similares).

De manera similar a los sustituyentes descritos para el radical ' alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo son variados y se seleccionan de, pero no se limitan a: halógeno, -0R' , =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR'R"R" -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", -OC(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR' -C (O) R"R"' , -NR"C (O) 2R' , -NR-C (NR' R"R' ") =NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02, -R' , -N3, -CH(Ph)2, fluoroalcoxilo Ci-C4 y fluoroalquilo Ci-C , en un número que oscila desde cero hasta · el número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y en los que R' , R", R"' y R"" se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo y heteroarilo. Cuando un compuesto de la invención! incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R 'se selecciona independientemente como lo son cada grupo R' , R", R' " y R"" cuando hay más de uno de esos grupos presente.

La .1 expresión "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos o bien en forma monocateharia o bien bicatenaria. A menos que se limite específicamente, la expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metab'olizan de una manera similar a nucleótidos que se producen de manera natural. A menos que se limite específicamente de otro modo, la expresión también se refiere a análogos de oligonuc.leótidos incluyendo APN (ácido peptidonucleico) , análogos de ADÑ usados en la tecnología antisentido (fosforotioatos, fosforoamidatos, y similares) . A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de manera conservativa de la misma (incluyendo, pero sin limitarse a, sustituciones de codón dégenerado) y secuencias complementarias así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente,. las sustituciones de codón degenerado pueden lograrse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye por residuos de bases mixtas y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Cuando los grupos sustituyentes se especifican mediante sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, abarcan igualmente los sustituyentes químicamente idénticos que resultarían de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, la estructura CH20 es equivalente a la estructura -OCH2. • El término "sustituyentes" incluye, pero no se limita a, "sustituyentes que no interfieren". Los "sustituyentes que no interfieren" son aquéllos grupos que proporcionan compuestos estables. Radicales o sustituyentes que no interfieren adecuados incluyen, pero no se limitan a, halógeno, alquilo Cj-Cio, alquenilo C2-C10, 'alquinilo C2-Ci0/ alcoxilo Ci-C10, aralquilo C1-C12, alquilarilo C1-C12, cicloalquilo C3-Ci2, cicloalquenilo C3-Ci2, fenilo, fenilo sustituido, toluilo, xilenilo, bifenilo, alcoxialquilo C2-C12, alcoxiarilo C2-C12, ariloxialquilo C7-C12, oxiarilo C7-C12, alquilsulfinilo Ci-C6, alquilsulfonilo C:-Cio, (CH2)m—O— (alquilo 0:-0?0) en el que m es de desde 1 hasta 8, arilo, arilo sustituido, alcoxilo sustituido, fluoroalquilo, ¦radical ' heterociclico, radical heterociclico sustituido, nitroalquilo, —N02, —CN, — RC (O) - (alquilo Ci-C10) , —C (O)— (alquilo Ci-Cio) , alquil-tioalquilo C2-Ci0, —C (O) O-- (alquilo Ci-C10) , —OH, —S02, =S, —COOH, —NR2, carbonilo, —C(0)— (alquilo Ci-C10) -CF3, -C(0)-CF3, —C(0)NR2, --(arilo C!-C10) -S-- (arilo C6-C10) , —C(O)- (arilo Ci-Cio) , — (CH2)m—O— (-(CH2)ra-0— (alquilo C1-C10) en el que cada m es de desde 1 hasta 8, —C(0)NR2, —C(S)NR2, —S02NR2, — RC(0)NR2, — RC(,S)NR2, sales de los mismos, y similares. Cada R tal como se usa en el presente documento es H, alquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, aralquilo o alcarilo.

El término "halógeno" incluye flúor, cloro, yodo y bromo.

El término "alquilo", en si mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada, o cíclico, o combinación de los mismos, que puede estar totalmente saturado, mono o poliinsaturado, y puede incluir radicales di y multivalentes , que tiene el número de átomos de carbono designado (es decir C1-C10 significa de uno a diez carbonos) . Ejemplos de radicales hidrocarbonados saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil) metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, ¦ 2-isopentenilo, 2- (butadienilo) , 2 , 4-pentadienilo, 3-(1, 4-pentadienilo) , etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homólogos: e isómeros superiores. El término "alquilo", a menos que se indique lo contrario, también pretende incluir los derivados de alquilo definidos en más detalle a continuación, . tales como "heteroalquilo" . Los grupos alquilo que se limitan a grupos hidrocarbonados se denominan "homoalquilo" .

El término "alquileno" en sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de un alcano, tal como se muestra a modo de ejemplo, pero no se limita, por las estructuras -CH2CH2- y -CH2CH2CH2CH2-, y además incluye los grupos descritos a continuación como "heteroalquileno" . Normalmente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá desde 1 hasta 24 átomos de carbono, ' siendo los grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono una realización particular de los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que tiene generalmente ocho o menos átomos de carbono.

¦ Los; términos "alcoxilo", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxilo) se usan en su sentido convencional, y se refieren a los grupos alquilo unidos al resto de la molécula mediante un átomo dé oxigeno, un grupo amino, o un átomo de azufre, respectivamente .

El término "heteroalquilo" , en si mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical hidrocarbonado estable de cadena lineal o ramificada, o cíclico, o combinaciones de los mismos, que consiste en el número indicado ' de átomos de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, N, Si y S, y en el que i los átomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. El/los heteroátomo ( s ) O, N y S y Si pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la que se une el grupo alquilo al resto de la molécula.1 Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, -CH2-CH2-0-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N (CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S (O) -CH3, -CH2-CH2-S-(0)2-CH3, -CH=CH-0-CH3,. -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, y -CH=CH-N(CH3)-CH3. Puede haber hasta dos heteroátomos consecutivos, tal como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0-Si (CH3) 3. De manera similar, , el término "heteroalquileno" en si mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, tal como se muestra como ejemplo, pero no se limita, por -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2- . Para los grupos heteroalquileno, los mismos o diferentes heteroátomos también pueden ocupar uno cualquiera o ambos de los extremos terminales de la cadena (incluyendo, pero sin limitarse a, alquilenoxilo, alquilendioxilo, alquilenamino, alquilendiamino, aminooxialquileno, y similares). Todavía adicionalmente , para los grupos de unión alquileno y heteroalquileno, no se implica ninguna orientación del grupo de unión por la dirección en la que se escribe la fórmula del grupo de unión. Por ejemplo, la fórmula -C(0)2R'- representa tanto -C(0)2R'- como -R'C(0)2-.

Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", en sí mismos o : en combinación con otros términos, representan, a menos que se indique lo contrario, versiones cíclicas de , "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Por tanto, un cicloalquilo o heterocicloalquilo incluye enlaces de anillo saturados, parcialmente insaturados y completamente insaturados. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la1 posición en la que se une el heterociclo al resto de la molécula . ? Ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, ciclohepfilo, y similares. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen1, pero- no se limitan a, 1- (1, 2, 5, 6-tetrahidropiridilo) , 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo, y similares. Adicionalmente, el término abarca estructuras de anillo biciclicas y triciclicas. De manera similar, el término "heterocicloalquileno" en si mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heterocicloalquilo, y el término "cicloalquiléno" en si mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado 'de cicloalquilo .

El itérmino "aminoácido" se refiere a aminoácidos que se producen de manera natural y que no se producen de manera natural, asi comoi a análogos de aminoácidos y compuestos miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos que se :producen de manera natural. Los aminoácidos que se codifican de manera natural son los 20 aminoácidos comunes (alanina,': arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, ' triptófano, tirosina, y valina) y pirrolisina y selenocisteina . Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce de manera natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, tal como, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfonio de metionina. Tales análogos tienen grupos ¡R modificados (tales como norleucina) o estructuras peptidicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce de manera natural. La referencia a un aminoácido incluye, por ejemplo, L-aminoácidos i proteogénicos que se producen de manera natural; D-aminoácidos , aminoácidos químicamente modificados tales como variantes y derivados de aminoácidos; aminoácidos no proteogénicos que se producen : de manera natural tales como a-alanina, ornitina, etc.; y compuestos sintetizados químicamente que tienen propiedades que se i sabe en la técnica que son características de aminoácidos. Ejemplos de aminoácidos que no se producen de manera natural incluyen,1 pero no se limitan a, a-metil-aminoácidos (por ejemplo, a-métil-alanina) , D-aminoácidos, aminoácidos de- tipo histidina (por > ejemplo, 2-amino-histidina, a-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina y ot-metil-histidina) , aminoácidos que tienen un metileno complementario en la cadena lateral (aminoácidos "homo") , y aminoácidos en los que el grupo funcional1 ácido carboxílico en la cadena lateral se sustituye por un grupo ácido sulfónico (por ejemplo, ácido cistéico) .

En el presente documento puede hacerse referencia a los aminoácidos o bien por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o bien por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión: de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Asimismo, puede hacerse referencia a los nucleótidos mediante sus códigos de letras únicas comúnmente aceptados.

"Variantes modificadas de manera conservativa" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto' a secuencias de ácido nucleico particulares, "variantes modificadas de manera conservativa" se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican para secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica para una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número dé ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican para cualquier1 proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos para el aminoácido 'alanina . Por tanto, en cada posición en la que se especifica una alanina por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos, sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una clase de variaciones modificadas de manera conservativa. Cada secuencia de ácido nucleico en el presente documento que codifica para un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto habitual en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es habitualmente el único ' codón para metionina, y TGG, que es habitualmente el único codón para triptófano) puede modificarse para dar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

^ En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto habitual 1 en la técnica reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que alteren, añadan o eliminen un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de manera conservativa" en la que i la alteración da como resultado la deleción de un I aminoácido, adición de un aminoácido o sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Los expertos habituales en la técnica conocen tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares¡. Tales variantes modificadas de manera conservativa son además de, y no excluyen, las variantes polimórficas , homólogos entre especies y alelos de la invención.

Los ; expertos habituales en la técnica conocen tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Los ocho grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas unos de otros: 1) Alanina (A) , glicina (G) ; 2) 1 Ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) 3) ' Asparagina (N) , glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , lisina (K) 5) Isoleucina (I) , leucina (L) , metionina ( ) , valina (V) ; 6) 1 Fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano (W) ; 7) Serina (S) , treonina (T) ; y 8) Cisteina (C) , metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2a edición (diciembre de 1993) ! Los' términos "idéntico" o "identidad" en porcentaje, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Las secuencias son "sustancialmente idénticas" si tienen un porcentaje de residuos de aminoácido o nucleótidos que son iguales (es decir, aproximadamente el 60% de identidad, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95% de identidad a lo largo de una región especificada) , cuando se comparan y alinean para una 1 correspondencia máxima a lo largo de un intervalo de comparación, o región designada según se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias (u otros algoritmos disponibles para los expertos habituales en la técnica) o mediante alineación manual e inspección visual. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. La identidad puede existir a lo largo de una región que tiene al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o a lo largo de una región que tiene 75-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o, cuando no se especifica, a lo largo de la totalidad de la secuencia de un polinucleótido o polipéptido. Un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos de especies distintas del ser humano, ¦ puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas de examinar una - biblioteca en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene una secuencia de polinucleótido de la invención o un fragmento de la misma, y aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótido. El experto en la técnica conoce bien tales técnicas de hibridación.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se designan coordinaciones de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Pueden usarse parámetros de programa por defecto, o pueden designarse parámetros alternativos. Entonces, el algoritmo de comparación de secuencias calcula las identidades de secuencia en porcentaje para las secuencias de prueba en relación con la secuencia 'de referencia, basándose en los parámetros de programa. • Un "intervalo de comparación", tal como se usa en el presente documentó, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera de las .varias posiciones contiguas seleccionada del grupo que consiste en desde 20 hasta 600, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en la que puede compararse una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas tras haber alineado de manera óptima las dos secuencias. Los expertos ¦ habituales en la técnica conocen bien métodos de alineación de secuencias para la comparación. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse, incluyendo, pero sin1 limitarse a, mediante el algoritmo de homología local de Smith y .Waterman (1970) Adv. Appl. ath. 2: 482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol . 48:443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearsón y Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante ; implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, !FASTA, y TFASTA en el paquete de software de genética de Wisconsin¡, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, lAusubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (1995 suplemento) ) .

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la identidad de secuencia en porcentaje y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar análisis de BLAST está disponible al público mediante I el Centro Nacional de Información Biotecnológica disponible en la World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como defectos una longitud de palabra de 3, y esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915) alineaciones (B) de 50, esperanza" (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. El algoritmo BLAST se realiza normalmente con el filtro de "baja complejidad" desactivado.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul ' (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787) . Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor suma de probabilidades (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca por azar una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la menor suma de probabilidades en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, o inferior a aproximadamente 0,01, o inferior a aproximadamente 0,001.

La frase "se híbrida selectivamente (o específicamente) con" se refiere a la unión, formación de dúplex, o hibridación de una molécula únicamente con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones de hibridación rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (incluyendo, pero sin limitarse a, ARN o ADN de biblioteca o celular total) .

La frase "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a la hibridación de secuencias de ADN, ARN o APN, u otras moléculas que imitan ácidos nucleicos, o combinaciones de las mismas en condiciones de baja fuerza iónica y alta temperatura tal como se conoce en la técnica. Normalmente, en condiciones rigurosas una sonda se hibridará con su subsecuencia diana en una mezcla compleja de ácido nucleico (incluyendo, pero sin limitarse a, ARN o ADN de 'biblioteca o celular total) pero no se hibrida con otras secuencias en la mezcla compleja. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas superiores. Se encuentra una guía exhaustiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, -Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strat'egy of nucleic acid assays" (1993) . Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5-10°C inferiores al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia especifica a una fuerza iónica definida pH. La Tm es la temperatura (a una fuerza iónica definida, pH,. y concentración de ácido nucleico) a la que el 50% de las sondas complementarias a la diana se hibridan con la secuencia diana en el equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, el 50% de las sondas está ocupado en el equilibrio) . Las condiciones rigurosas pueden ser aquellas en las que la concentración en sal es inferior a aproximadamente ión sodio 1,0 M, normalmente una concentración de ión sodio (u otras sales) de aproximadamente 0,01 a 1,0 M a pH de 7,0 3, 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (incluyendo, pero sin limitarse a, de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (incluyendo, pero sin limitarse a, más de 50 nucleótidos) . Las condiciones rigurosas también pueden lograrse con la adición de agentes ! desestabilizantes tales como formamida. Para la hibridación selectiva o especifica, una señal positiva puede ser al menos dos veces la hibridación de fondo, opcionalmente 10 veces la hibridación de fondo. Condiciones de hibridación rigurosas a modo de ejemplo pueden ser tal como sigue: formamida al 50%, 5X SSC, y SDS al 1%, incubar a 42°C, o 5X SSC, SDS al 1%, incubar a 65°C, con un lavado con 0,2X SSC, y SDS. al 0,1% a 65°C. Tales lavados pueden realizarse durante 5, 15, 30, 60, 120, o más minutos .

El término "sujeto" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un animal, en algunas realizaciones un mamífero, y en otras realizaciones un ser humano, que es el objeto de tratamiento, observación o experimento. Un animal puede ser un animal de compañía (por ejemplo, perros, gatos y similares) , un animal de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares) o un animal de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, 1 cobayas y similares) .

La -expresión "cantidad eficaz" tal como se usa en el presente documentó se refiere a la cantidad del polipéptido con aminoácido no natural modificado que se administra que aliviará en cierta medida uno o más de los síntomas de la enfermedad, estado o i trastornó que está tratándose. Las composiciones que contienen el polipéptido con aminoácido no natural modificado descrito en el presente ' documento pueden administrarse para tratamientos profilácticos, de potenciación y/o terapéuticos.

Los términos "potenciar" o "potenciación" significan aumentar o prolongar, o bien en cuanto a la potencia o bien en cuanto a la duración,; un efecto deseado. Por tanto, con respecto a la potenciación del efecto de agentes terapéuticos, el término "potenciación" se refiere a la capacidad para aumentar o prolongar, o bien en cuanto a la potencia o bien en cuanto a la duración,! el efecto de otros agentes terapéuticos en un sistema.

Una "cantidad eficaz para la potenciación", tal como se usa en el presente 'documento, se refiere a una cantidad adecuada para potenciar el efecto de otro agente terapéutico en un sistema deseado. Cuando se usa en un paciente, las cantidades eficaces para estie uso dependerán de la intensidad y el transcurso de . la enfermedad, trastorno o estado, terapia previa, el estado de salud y la respuesta a los fármacos del paciente, y el criterio del médico encargado.

Tal' como se usa en el presente documento, la expresión "selección positiva" o "marcador de selección" se refiere a un marcador que cuando está presente, por ejemplo, expresado, activado o similares, da como resultado la identificación de una célula con el marcador de selección positiva con respecto a aquellas 1 sin el marcador de selección positiva.

Tal' como se usa en el presente documento, la expresión "selección negativa" o "marcador de selección" se refiere a un marcador que cuando está presente, por ejemplo, expresado, activado ? similares, permite la identificación de una célula que no tiene la propiedad deseada (por ejemplo, en comparación con una célula que si que tiene la propiedad deseada) .

Tal , como se usa en el presente documento, el término "indicador" se refiere a un componente que puede usarse para seleccionar componentes diana de un sistema de interés. Por ejemplo, un indicador puede incluir una proteina, por ejemplo, una enzima, que confiere resistencia o sensibilidad a antibióticos (incluyendo, pero sin limitarse a, ß-lactamasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , y similares) , un marcador de selección fluorescente (incluyendo, pero sin limitarse a, proteina verde fluorescente (por ejemplo, GFP) , YFP, EGFP, RFP, un marcador luminiscente (incluyendo pero sin limitarse a, una proteina de luciferasa de luciérnaga) , un marcador de selección basado en afinidad, o genes de marcador seleccionable positivo o negativo tales como lacZ, ß-gal/lacZ (ß-galactosidasa) , ADH (alcohol deshidrogenasa) , his3, ura3, leu2, lys2, o similares.

¦Tal como se usa en el presente documento, el término "eucariota" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eucarya tales como animales (incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos, insectos, reptiles, aves, etc.), ciliados, plantas (incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas , dicotiledóneas, algas, etc.), hongos, levaduras, flagelados, microsporidios, protistas, etc. / Tal 1 como se usa en el presente documento, la expresión "no i eucariota" se refiere a organismos no eucariotas. Por ejemplo, un organismo: no eucariota puede pertenecer al dominio filogenético Eubacteria (incluyendo, pero sin limitarse a, Escherichia coli, Thermus lthermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.), o al dominio filogenético Archaea (incluyendo, pero sin limitarse a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tal como Haloferax volcanii y especies de Halobacterium NRC-I, Archaeoglobus fulgidus, Pirococcus furiosus, Pirococcus horikoshii, Aeuropirum pernix, etc.) .

También se incluyen los siguientes ejemplos no limitativos de proteína' de la envuelta viral: proteínas de la envuelta de filovirus (tales como virus del ébola) , ortomixovirus (tales como virus Influenza) , VSV-G, alfa-virus (tales como virus del bosque Semliki y virus de Sindbis) , arenavirus (tales como virus de la córiomeningitis linfocítica) , flavivirus (tales como virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y virus del Dengue) , rabdovirús (tales como virus de la estomatitis vesicular y virus de la rabia) , virus de la leucemia de Moloney, VSH, VZV, virus de las paperas, rinovirus, sarampión, rubéola, arbovirus, enterovirus (tales como polio, Coxsackie, ecovirus), virus de la polio, Coxsackie B, A & ecovirus, rinovirus, virus de la hepatitis, virus de Norwalk, astrovirus, togavirus, alfavirus, pestivirus, coronavirus, Parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio (VSR) , Bunyaviridae, Reoviridue, reovirus, rotavirus, VLTH, poliomavirus , papilomavirus, adenovirus, parvovirus, VEB, CMV, virus de la varicela-'zóster, virus del herpes, y virus de la varicela.

Variante conservativa: la expresión "variante conservativa" se refiere a un componente de traducción, por ejemplo, una variante conservativa de O-ARNt o una variante conservativa de 0-RS, que se comporta funcionalmente como el componente en el que se basa la variante conservativa, por ejemplo, un O-ARNt o 0-RS, pero tiene variaciones en la secuencia. Por ejemplo, una 0-RS aminocilará un O-ARNt complementario o una variante conservativa de¦ O-ARNt con un aminoácido seleccionado, por ejemplo, un aminoácido no natural, aunque el O-ARNt y la variante conservativa de O-ARNf no tengan la misma secuencia. De manera similar, un ARNt se aminocilará con un aminoácido seleccionado, por ejemplo, un aminoácido no natural, mediante cualquier O-RS complementaria o una variante conservativa de O-RS, aunque la O-RS y la variante conservativa de O-RS no tengan la misma secuencia. La variante conservativa puede tener, por ejemplo, una variación, dos variaciones, tres variaciones, cuatro variaciones, o cinco o más variaciones en la secuencia, siempre que la variante conservativa sea complementaria al O-ARNt- o O-RS complementario.

Agente de selección o examen: tal como se usa en el presente documento, la expresión "agente de selección o examen" se refiere a un 'agente que, cuando está presente, permite una selección/examen de determinados componentes de una población. Por ejemplo, un agente de selección o examen incluye, pero no se limita a,; por ejemplo, un nutriente, un antibiótico, una longitud de onda de luz, un anticuerpo, un polinucleótido expresado o similares. El agente de selección puede variar, por ejemplo, en cuanto a la concentración, intensidad, etc.

La expresión "no reconocido de manera eficaz" se refiere a una eficacia, por ejemplo, inferior a aproximadamente el 10%, inferior a aproximadamente el 5%, o inferior a aproximadamente el 1%, a la que una RS de un organismo aminoacila O-ARNt.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Hasta ahora, las vacunas se han limitado a las producidas con organismos inactivados o atenuados. La inactivación ^de microorganismos mediante el tratamiento de calor, UV, formaldehido da como: resultado epitopos nativos reducidos, y los virus atenuados normalmente se producen a través de la deleción y truncamiento génicos que conduce a replicación extremadamente baja pero no ¡a ausencia de la misma, lo que constituye un' riesgo para el paciente y particularmente para pacientes más jóvenes, pacientes mayores y aquellos con los sistemas inmunitarios comprometidos .

En una realización, la presente invención proporciona vacunas modificadas de organismos completos. En otra realización, la presente 1 invención proporciona vacunas de organismos completos modificados genéticamente con replicación dependiente de uno o más aminoácidos no naturales. La presente invención proporciona vacunas que incorporan microorganismos nativos, que pueden usarse con o sin adyuvantes. Éstas pueden proporcionar adicionalmente una alta densidad de epitopos nativos que son altamente inmunogénicos y que desencadenarán las respuestas humorales y mediadas por células T, proporcionando de ese modo una vacuna más eficaz. La presente invención proporciona vacunas que incorporan uno o más aminoácidos no naturales o no codificados de manera natural en uno o más sitios en el virus o la bacteria. En algunas realizaciones de la présente invención, el aminoácido no codificado de manera natural se incluye en una parte del microorganismo requerida para la replicación, eliminando de ese modo los riesgos asociados con los virus atenuados y eliminando la necesidad de inactivar el virus/la' bacteria. La vacuna con aminoácido ( s ) no codificado (s ) de manera natural incorporado (s) proporcionará un microorganismo que estructuralmente es extremadamente próximo al microorganismo nativo, aunque incapaz de replicación, o capaz sólo de replicación limitada en un entorno natural. Los controles absolutos de la replicación del microorganismo se realizan usando incorporación de aminoácidos especifica del sitio, detallada más adelante, para controlar la expresión¦ génica esencial (función) usando supresión del codón de terminación. Para los virus, una linea celular de producción huésped incorpora de manera especifica del sitio un aminoácido no natural requerido para el desarrollo. Para las bacterias, el genoma se modifica por ingeniería genética para incluir uno o más aminoácido ( s ) no natural/naturales incorporado (s) de manera específica del sitio.

La ,función génica esencial de control puede realizarse a niveles funcionales estructurales y genéticos, Por ejemplo, tabla 2. A nivel genético, el gen esencial de longitud completa se expresa en presencia del aminoácido no incorporado de manera natural. A nivel funcional estructural, el gen .esencial se modifica por ingeniería genética para que sólo sea funcional en presencia del aminoácido no natural en un sitio específico. La incorporación de cualquier aminoácido natural en este sitio dará como resultado la' supresión de su función nativa. La libertad de elección del/de los- aminoácido (s) no natural/naturales permite que un experto en la técnica module la inmunogenicidad de la vacuna deseada >y la libertad de replicación excesiva o controlada en exceso. Mientras que tradicionalmente ha sido necesario equilibrar entre atenuación de replicación y producción, la incorporación de un aminoácido, no natural especifica del sitio proporciona las herramientas de desarrollo para una vacuna sin capacidad de replicación en ausencia del aminoácido no natural.

Las t bacterias y los virus a partir de los cuales pueden desarrollarse vacunas usando esta tecnología incluyen virus conocidos. Como ejemplos no limitativos, éstos incluyen, virus que afectan a las vías respiratorias superiores tales como rinovirus humano (RVH) , adenovirus, virus de Coxsackie, Influenza , Parainfluenza, virus smcitial respiratorio (VSR) , virus de Epstein-B rr (VEB) y citomegalovirus (CMV) ; virus que afectan al tracto gastrointestinal (GI) tales como rotavirus, agente Norwalk, hepatitis, A (VHA) , poliovirus y otros picornavirus; virus transmitidos sexualmente incluyendo, pero sin limitarse a, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , virus del papiloma humano (VPH) , virus del herpes simple (VHS) 1, VHS-2, VVZ, CMV, VEB, VHH-6, VHH-7 y VHH-8; CMV, virus de la hepatitis B (VHB) , virus de la hepatitis \ C (VHC) . Ejemplos no limitativos de bacterias incluyen tanto bacterias gram positivas como gram negativas, incluyendo Staphylocóccus , Streptococcus, Mycobacterium (por ejemplo, Mycobacte' rium . avium, y Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis) , Enterococcus , Corynebacterium, Borrelia , Bacillus , Chlamydia , Mycoplasma, y similares.

Sistemas de traducción que son adecuados para obtener i proteínas que incluyen uno o más aminoácidos seleccionados, por ejemplo, un aminoácido no natural, se describen en las Solicitudes de · patente estadounidenses' 10/126.931, titulada "METHODS AND COMPO'SITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL tRNA SYNTHETASE . PAIRS" y 10/126.927, titulada "IW VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS". Además, véase el documento USSN 10/825.867 titulado "EXPANDING THE EUKARYGTIC GENETIC CODE" . Cada una de estas solicitudes se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Tales · sistemas de traducción comprenden generalmente células que incluyen un ARNt ortogonal (O-ARNt) , una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , y un aminoácido seleccionado, por ejemplo, un aminoácido no natural, en el que i la O-RS aminoacila el O-ARNt con el aminoácido seleccionado. Un par ortogonal de la presente invención está compuesto; por un O-ARNt, por ejemplo, un ARNt supresor, un ARNt de desplazamiento de marco, o similares, y una O-RS. El O-ARNt reconoce un primer codón selector y tiene actividad de supresión en presencia de una sintetasa relacionada en respuesta a un codón selector. La célula usa los componentes para incorporar el aminoácido seleccionado en una cadena de polipéptido en crecimiento. Por ejemplo, también puede estar presente un ácido nucleico, que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés, en el que el polinucleótido comprende un codón selector que reconoce el O-ARNt . El sistema de traducción también puede ser un sistema in vitro. Las moléculas de ARNt de la presente . invención son útiles en cualquier sistema de traducción, incluyendo sistemas que utilizan ribosomas en la traducción.

El sistema de traducción también puede ser un sistema de traducción libre de células (in vitro) . En estos sistemas, que pueden incluir o bien ARNm como molde (traducción in vitro) o bien ADN como' molde (transcripción y traducción in vitro combinadas), la síntesis in vitro la dirigen los ribosomas. Se ha aplicado un esfuerzo considerable al desarrollo de sistemas de expresión de proteínas libres de células. Véanse, por ejemplo, Kim, D.M. y J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001); Kim, D.M. y J:R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.Ml, y J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); ! Kim, D.M., y J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999); y Patnaik, R. y J.R. Swartz, Biotécnicas 24, 862-868, (1998); la patente estadounidense n.° 6.337.191'; la publicación de patente estadounidense n.° 2002/0081660; el documento WO 00/55353; el documento WO 90/05785, que se incorporan como referencia al presente documento. En este enfoque, se traduce un molde de ARNm unido a puromicina para dar un péptido en el ribosoma. Véanse, por ejemplo, R. Roberts and J. Szostak, >Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 98:12297-12302(1997); A.

Franket,; et. al. Chemistry & Biology 10 : 1043-1050 (2003) . En este enfoque un molde de mRNA vinculado a puromicina es traducida en péptido en el ribosoma. Si se han modificado una o más moléculas de AR t^ pueden incorporarse también aminoácidos no naturales en el péptido. Tras haberse leído el último codón de ARNm, la puromicina captura el extremo C-terminal del péptido. Si se encuentra que el conjugado de ARNm-péptido resultante tiene propiedades interesantes en un ensayo in vitro, su identidad puede revelarse fácilmente a partir de la secuencia de ARNm. De este modo, pueden examinarse bibliotecas de polipéptidos que comprenden uno o más aminoácidos no codificados de manera natural para identificar polipéptidos que tienen propiedades deseadas. Más recientemente, se han notificado traducciones en ribosomas in vitro con componentes purificados que permiten la síntesis de péptidos sustituidos con aminoácidos no codificados de manera i natural. iVéase, por ejemplo, A. Forster et al, Proc. Nati Acad. Sci. (USA) 100 6353 (2003).

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula en la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, una célula se ha modificado genéticamente para incluir un aminoácido no natural en un producto génico que se requiere para la 1 replicación. En ciertas realizaciones, la presente invencióni proporciona una bacteria en la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado genéticamente una bacteria para incluir un aminoácido no natural en un producto génico que se requiere para la replicación. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un virus en el que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto, génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado' genéticamente un virus para incluir un aminoácido no natural en un producto génico que se requiere para i la replicación. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis en la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado genéticamente una célula de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis para incluir un aminoácido no natural en un producto génico que se requiere para la replicación. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula de meningitis en la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado genéticamente una célula de meningitis para incluir un aminoácido no natural en un producto génico que se requiere para la replicación. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula de rabia en la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado genéticamente una célula de .rabia para incluir un- aminoácido no natural en un producto génico que se requiere para la replicación. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula de alga en la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado genéticamente una célula de alga para incluir un aminoácido no natural en un producto génico que se requiere para la replicación. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula viral en la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado genéticamente una célula viral para incluir un aminoácido no natural en un producto génico que se requiere para la replicación. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula bacteriana en la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado genéticamente una célula bacteriana para incluir un aminoácido no natural en un producto génico que se requiere para la replicación. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula fúngica en la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado genéticamente una célula fúngica para incluir un aminoácido no natural en un producto génico que se requiere para la replicación.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula de polio en la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado genéticamente una célula de polio para incluir un aminoácido no natural en un producto génico ,que · se requiere para la replicación. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula de E. coli en 'la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado genéticamente una célula de E. coli para incluir un aminoácido no natural en un producto génico que se requiere , para la replicación. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una célula de Mycobacterium en la que se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. En otras realizaciones de la presente invención, se ha modificado genéticamente una célula de Mycobacterium para incluir un aminoácido no natural en un producto génico que se requiere para la replicación.

En ciertas realizaciones, pueden usarse células modificadas genéticamente dependientes de aminoácidos no naturales de la presente , invención para producir una vacuna. En ciertas realizaciones, pueden usarse células modificadas genéticamente dependientes de aminoácidos no naturales de la presente invención para producir anticuerpos que pueden administrarse como una vacuna. En ciertas realizaciones, pueden usarse células modificadas genéticamente dependientes de aminoácidos no naturales de la presente invención en una inoculación.

En ciertas realizaciones, una célula de E. coli que comprende el ARNt de la presente invención incluye un sistema de traducción de este 'tipo. Por ejemplo, la célula de E. cqlí de la presente invención incluye un ARNt ortogonal (O-ARNt) , en el que el O-ARNt comprendé actividad de supresión en presencia de una sintetasa relacionada en respuesta a un codón selector; una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) ; un aminoácido seleccionado; y un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés, en el que el polinucleótido comprende un codón selector que se reconoce por el O-ARNt.

La invención también muestra múltiples pares de 0-ARNt/O-RS en una célula, lo que permite la incorporación de más de un aminoácido seleccionado. En ciertas realizaciones, la célula puede incluir además un par de 0-ARNt/O-RS adicional diferente y un segundo aminoácido seleccionado, en el que el O-ARNt reconoce un segundo c dón selector y la O-RS aminoacila preferentemente el 0-ARNt con el segundo aminoácido seleccionado. Por ejemplo, una célula puede comprender además, por ejemplo, un par de ARNt supresor ámbar - aminoacil-ARNt sintetasa derivado de la tirosil-ARNt sintétasa de Methanococcus jannaschii .

El O-ARNt y/o la O-RS pueden producirse de manera natural o pueden derivarse por mutación de un ARNt y/o una RS que se producen de manera natural, por ejemplo, lo que genera bibliotecas de ARNt y/o bibliotecas de RS, a partir de una variedad de organismos. Por ejemplo, una estrategia de producir- un par de i ARNt/aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal implica importar un par de ARNt/sintetasa heterólogo de, por ejemplo, una fuente distinta de la célula huésped, o de múltiples fuentes, en la célula huésped. Las propiedades del candidato de sintetasa heteróloga incluyen, por ejemplo, que no cargue ningún ARNt de la célula huésped, y las propiedades del candidato de ARNt heterólogo incluyen, por ejemplo, ; que no se aminoacile por ninguna sintetasa de la célula huésped. Además, el ARNt heterólogo es ortogonal para todas las sintetasas de la célula huésped.

- Una: segunda estrategia para generar un par ortogonal implica generar bibliotecas mutantes de las que examinar y/o seleccionar un O-ARNt o una O-RS. Estas estrategias también pueden combinarse.

En diversas realizaciones, el O-ARNt y la O-RS se derivan de al menos un organismo. En otra realización, el O-ARNt se deriva de un ARNt ¡que se produce de manera natural o que se produce de manera natural mutado procedente de un primer organismo y la O-RS se deriva; de RS que se produce de manera natural o que se produce de manera natural mutada procedente de un segundo organismo. En una realización, los organismos prim'ero y segundo son diferentes. Por ejemplo, un par ortogonal puede incluir una ARNt sintetasa derivada i de Methanobacterium thermoautotrophicum, y un ARNt derivado ele un ARNt de Archaea (por ejemplo, de Halobacterium sp. NRC-1) . lternativamente, los organismos primero y segundo son iguales.' Véase la sección titulada "Organismos fuente y huésped" en el presente documento para obtener información adicional.

En ciertas realizaciones de la presente invención, un O-ARNt de la presente invención comprende o está codificado por una secuencia de polinucleótido tal como se muestra en SEQ ID NO. : 1, 2 ó 3, 'o una secuencia de polinucleótido complementaria de la misma, o' una variación conservativa de la misma. Véase también la sección titulada "Secuencia y variantes de ácido nucleico y i polipéptido" en el presente documento. i ARNt ortogonal (O-ARNt) Un ARNt ortogonal (O-ARNt) media la incorporación de un aminoácido seleccionado en una proteina que se codifica por un polinucleótido que comprende un codón selector que se reconoce por el O-ARNt, por ejemplo, in vivo o in vitro. Un O-ARNt de la presente invención puede aminoacilarse con un aminoácido deseado mediante Icualquier método o técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, aminoacilación química o enzimática. El O-ARNt aminoacilado de la presente invención puede añadirse directamente a un sistema de traducción. Un O-ARNt de la presente invención puede aminoacilarse por una RS con un aminoácido seleccionado in vitro o in vivo. Además, la RS puede ser una O-RS,. Un O-ARNt de la presente invención! puede proporcionarse al sistema de traducción (por ejemplo, . componentes dé traducción in vitro, o una célula) directamente, o proporcionando un polinucleótido que codifica para un O-ARÑt o una parte del mismo. Por ejemplo, un O-ARNt, o una parte del mismo, se codifica por una secuencia de polinucleótido tal como se muestra en SEQ ID NO. : 1, 2, 3, o una secuencia de polinucleótido complementaria de la misma, o una variación conservativa de la misma.

Un 1 O-ARNt de la presente invención comprende actividad de supresión en presencia de una sintetasa relacionada en respuesta a un codón selector. La actividad de supresión puede determinarse mediante -cualquiera de varios ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, ípuede usarse un ensayo de indicador de ?-galactosidasa . Se usa un derivado de un plásmido que expresa el gen lacZ bajo el control del promotor, por ejemplo, en el que la Leu-25 del péptido WLQRRDWÉN de lacZ se sustituye por un codón selector, por ejemplo, 1 AG, TGA, AGGA, etc. codones, o codones sentido (como control) para tirosina, serina, leucina, etc. El plásmido de lacZ derivatizado se introduce en las células de un organismo apropiado (por ejemplo, un organismo en el que pueden usarse los componentes ortogonales) junto con el plásmido que comprende un O-ARNt de la presente , invención. También puede introducirse una sintetasa relacionada (o bien como polipéptido o bien como polinucleótido que codifica para la sintetasa relacionada cuando se expresa) . Las células se hacen crecer en medio hasta una densidad deseada, por ejemplo, hasta una DO600 de aproximadamente 0,5, y se realizan los ensayos de ß-galactosidasa, por ejemplo, usando el kit de ensayo de ß-galactosidasa BetaFluor™ (Novagen) . Se calcula el porcentaje de supresión como el porcentaje de actividad para una muestra con' respecto a un control comparable, por ejemplo, el valor observado del constructo de lacZ derivatizado, el en que el constructo tiene un codón sentido correspondiente en la posición deseada en lugar de un codón selector.

En la molécula de ARNt, la timina ' (T) se sustituye por uracilo (U) . Además, pueden . estar presentes modificaciones adicionales en las bases. La invención también incluye variaciones conservativas de O-ARNt. Por ejemplo, las variaciones conservativas de O-ARNt incluyen aquellas moléculas que funcionan como el O-ARNt y mantienen la estructura en forma de L del ARNt, pero no ' tienen la misma secuencia (y son distintas de las moléculas de ARNt de tipo natural) . Véase también la sección en el presente , documento titulada "Secuencia y variantes de ácido nucléico y polipéptido" .

La composición que comprende un O-ARNt puede incluir además una aminóacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , en la que la O-RS aminoacila preferentemente el O-ARNt con un aminoácido seleccionado (por ejemplo, un aminoácido no natural) . En ciertas realizaciones, una composición que incluye un O-ARNt puede incluir además un sistema de traducción (por ejemplo, un sistema de traducción in vitro o in vivo) . También puede estar presente un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés, en. el que el' polinucleótido comprende uno o más codones selectores reconocidos por el O-ARNt, o una combinación de uno o más de ellos, en la célula u otro sistema de traducción. Véase también, la sección en el presente documento titulada "Aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales (O-RS)". i Losi métodos de producción de un ARNt ortogonal (O-ARNt) , por ejemplo, un O-ARNt, también son una característica de la presente invención. Un ARNt, por ejemplo, un O-ARNt, producido mediante el método también es una característica de la presente invención.

Los: métodos de producción de un ARNt ortogonal incluyen mutar el bucle: de anticodón de cada uno de un conjunto de ARNt para permitir el reconocimiento de un codón selector (por ejemplo, un codón ámbar, un codón ópalo, un codón de cuatro bases, etc.), proporcionando de ese modo una pluralidad de O-ARNt posibles; y analizar la estructura secundaria de un miembro de la pluralidad de O-ARÑt posibles para identificar los pares de bases no canónicos en la estructura secundaria, y mutar opcionalmente los pares de ; bases no canónicos (por ejemplo, los pares de bases no canónicos se mutan a pares de bases canónicos) . Los pares de bases no canónicos pueden ubicarse en la región de tallo de la estructura secundaria. Un O-ARNt puede poseer una mejora de una o más características o actividades, tales como mejora en la ortogonalidad para un organismo deseado en comparación con el material de partida, por ejemplo, la pluralidad de secuencias de ARNt, mientras se conserva su afinidad hacia una RS deseada.

Alternativamente, los O-ARNt pueden desarrollarse mutando un ARNt conocido para modular su interacción con o su afinidad de unión a una o más moléculas que influyen en la traducción o que son componentes de la maquinaria de traducción. Tales componentes incluyen, pero no se limitan a, factores de elongación. El factor de elongación bacteriano EF-Tu desempeña un papel clave en la etapa de elongación en la síntesis de proteínas. Tras la aminoaciiación del ARNt por la ARNt sintetasa, EF-Tu se une al ARNt aminoacilado y lo lleva al sitio A del ribosoma. El enlace éster entre el aminoácido cargado y el ARNt se protege de la i hidrólisis espontánea debida a la unión entre EF-Tu y el ARNt aminoacilado. Stortchevoi et al. investigaron mutantes del par de bases fluctuante U50:G64 de ARNtfMet de iniciación de E. coli en el tallo ???, puesto que se encontró que este par de bases era un determinante negativo secundario que bloqueaba la actividad del ARNt en la elongación, presumiblemente debido a una interacción debilitada entre EF-Tu. GTP y el ARNt aminoacilado (JBC 2003 278 (20) : 17672 -17679 ) . Además, LaRiviere et al. describieron en Science 5 de oct. de 2001 ; 294 (5540) : 165-8 las contribuciones termodinámicas del aminoácido y el cuerpo de ARNt a la afinidad de unión global a EF-Tu. Indicaron que las contribuciones del cuerpo de ARNt y el aminoácido son independientes entre sí y que se compensan; entre sí cuando los ARNt se acilan correctamente. Las alteraciones de la interacción entre EF-Tu. GTP y el ARNt aminoacilado con el aminoácido no natural pueden afectar a la eficacia de la carga del ARNt en el sitio A del ribosoma. También se han 1 encontrado posibles sitios de mutación analizando estructuras ¦ cristalinas de complejos entre el ARNt y otros componentes de la maquinaria de traducción tales como EF-Tu. Por ejemplo, Nissen et al. han indicado que EF-Tu. GTP se une directamente a la estructura principal de fosfato del tallo ??? de fenilala ina-ARN de transferencia de levadura (Phe-ARNt) (Science 1995 270 (5241) : 1464-1472) .

Los métodos incluyen opcionalmente analizar la homología de secuencias de los ARNt y/o las aminoacil-ARNt sintetasas para i determinar posibles candidatos para un O-ARNt, O-RS y/o pares de los mismos, que parecen ser ortogonales para un organismo específico. Pueden usarse para el análisis programas informáticos conocidos en la técnica y descritos en el presente . documento . En un ejemplo, para elegir los posibles componentes de traducción ortogonales para su uso en un organismo procariota, se elige una sintetasá y/o un ARNt que no presenta homología inusual con organismos procariotas.

También puede producirse un conjunto de ARNt mediante una estrategia consenso. Por ejemplo, el conjunto de ARNt se produce alineandoi una pluralidad de secuencias de ARNt; que determinan una secuencia' consenso; y generando una biblioteca de ARNt usando al menos unai parte, la mayor parte de, o toda la secuencia consenso. Por ejemplo, una secuencia consenso puede compilarse con un programa , informático, por ejemplo, el programa pileup de GCG. Opcionalmente, las posiciones degeneradas determinadas por el programa se cambian a la base más frecuente en esas posiciones. Se sintetiza una biblioteca mediante técnicas conocidas en la técnica usando la secuencia consenso. Por ejemplo, puede usarse la extensión con solapamiento de oligonucleótidos en la que cada sitio del gen de ARNt puede sintetizarse como una mezcla dopada del 90% de la secuencia consenso y el 10% de una mezcla de las otras 3 ' bases para proporcionar la biblioteca basándose en la secuenciá consenso. También pueden usarse otras mezclas, por ejemplo, un 75% de la secuencia consenso y un 25% de una mezcla de las otras 3 bases, un 80% de la secuencia consenso y un 20% de una mezcla de las otras 3 bases, un 95% de la secuencia consenso y un 5% de una mezcla de las otras 3 bases, etc.

Las t bibliotecas de ARNt mutantes pueden generarse usando diversas técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Por ejemplo, los ARNt mutantes pueden generarse mediante mutaciones especificas de sitio, mutaciones puntuales al azar, recombinación homologa,' intercambio de ADN u otros métodos de mutagénesis recursivos, construcción quimérica o cualquier combinación de los mismos, ? Pueden introducirse mutaciones adicionales en una(s) posición/posiciones especifica (s) , por ejemplo, en una(s) posición/posiciones no conservativa (s ) , o en una(s) posición/posiciones conservativa (s) , en una(s) posición/posiciones al azar, o una combinación de las mismas en un blucle o región deseados de un ARNt, por ejemplo, un bucle anticodón, el tallo aceptor, brazo o blucle D, bucle variable, brazo o bucle ???,' otras regiones de la molécula de ARNt, o una combinación de los mismos. Las mutaciones pueden incluir pares de bases apareados en la región de tallo.

, Normalmente, se obtiene un O-ARNt sometiendo a selección negativa una población de células de una primera especie, en la que las células comprenden un miembro de la pluralidad de O-ARNt posibles. La selección negativa elimina las células que comprenden un miembro de la pluralidad de O-ARNt posibles que se aminoacila por una aminoacil-ARNt sintetasa (RS) que es endógena para las células. Esto proporciona un conjunto de ARNt que son ortogonales a la célula de la primera especie.

En ciertas realizaciones de la selección negativa, se introduce un/unos codón/codones selector/selectores en el polinucleótido que codifica para un marcador de selección negativa, por ejemplo, una enzima que confiere resistencia a antibióticos, por ejemplo, ß-lactamasa, una enzima que confiere un producto detectable, por ejemplo, ß-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , por ejemplo, un producto tóxico, tal como barnasa, en una posición no esencial, etc. Pueden realizarse examen/selección haciendo crecer la población de células en presencia de un agente de selección (por ejemplo, un antibiótico, tal cómo ampicilina) . En una realización, se varia la concentración del agente de · selección .

Por ejemplo, para medir la actividad de los ARNt supresores, se usa un sistema de selección que se basa en la supresión in vivo del codón selector, por ejemplo, mutaciones sin sentido o de desplazamiento . de marco de lectura introducidas en un polinucleótido que codifica para un marcador de selección negativa,; por ejemplo, un gen para ß-lactamasa (bla) . Por ejemplo, se construyen variantes de polinucleótido, por ejemplo, variantes de bla, con, por ejemplo, TAG, AGGA y TGA, colocadas en úna cierta posición.1 Se transforman células, por ejemplo, bacterias, con i estos poíinucleótidos . En el caso' de un ARNt ortogonal, que no puede cargarse eficazmente por las sintetasas endógenas de E. coli, la resistencia a antibióticos, por ejemplo, la resistencia a ampicilina, debe ser · aproximadamente igual o inferior a la de una bacteria transformada sin plásmido. Si el ARNt no es ortogonal, o si una sintetasa heteróloga que puede cargar el ARNt se coexpresa en el sistema, · se observa un nivel superior de resistencia a antibióticos, por ejemplo, a ampicilina. Se escogen células, por ejemplo, Ibacterias, que no puede crecer en placas de agar LB con concentraciones de antibióticos aproximadamente iguales a las de las céluljas transformadas sin plásmidos.

En el caso de un producto tóxico (por ejemplo, ribonucleasa barnasa) , cuando se aminoacila un miembro de la pluralidad de ARNt posibles por el huésped endógeno, por ejemplo, sintetasas de Escherichia coli (es decir, no es ortogonal al huésped, por ejemplo, sintetasas de Escherichia coli) , el codón selector se suprime y el producto de polinucleótido tóxico producido conduce a la muerte celular. Las células que portan ARNt ortogonal o ARNt no funcionales sobreviven.

En(una realización, el conjunto de ARNt que son ortogonales a un organismo deseado se someten entonces a una selección positiva en la que se coloca un codón selector en un marcador de selección positivo, por ejemplo, codificado por un gen de resistencia a fármacos^ tal como el gen de ß-lactamasa. La selección positiva se realiza en la célula que comprende un polinucleótido que codifica para o 1 que comprende un miembro del conjunto de ARNt, un polinucleótido que codifica para un marcador de selección positiva, y un polinucleótido que codifica para una RS relacionada. Estos polinucleótidos se expresan en la célula y la célula se hace crecer en presencia de un agente de selección, por ejemplo, 1 ampicilina. Entonces se seleccionan los ARNt por su capacidad para aminoacilarse por la sintetasa relacionada coexpresada y para insertar un aminoácido en respuesta a este codón selector. Normalmente, estas células muestran una mejora en la eficacia de supresión en comparación con las células que portan ARNt no funcionales, o ARNt que no pueden reconocerse eficazmente por la s'intetasa de interés. La célula que porta los ARNt no funcionales que no se reconocen eficazmente por la sintetasa de interés e!s sensible al antibiótico. Por tanto, ARNt que: (i) no son sustratos para un huésped endógeno, por ejemplo, sintetasas de Escherichia coli; (ii) pueden aminoacilarse por la sintetasa de interés; y (iii) son funcionales en la traducción y sobreviven a ambas selecciones.

La; rigurosidad de la selección, por ejemplo, la selección positiva, la selección negativa o tanto la selección positiva como la negativa, en los métodos descritos anteriormente, ' puede variarse1 opcionalmente . Por ejemplo, puesto que la barnasa es una proteina extremadamente tóxica, la rigurosidad de la selección negativa puede controlarse introduciendo diferentes números de codones selectores en el gen de barnasa y/o usando un promotor inducible. En otro ejemplo, se varia la concentración del agente de selección o examen (por ejemplo, ampicilina) . En un aspecto, la rigurosidad se varia porque la actividad deseada puede disminuirse durante las rondas iniciales. Por tanto, se aplican criterios de selección menos rigurosos en las rondas iniciales y se aplican criterios más rigurosos en las rondas final.es de selección. En ciertas 1 realizaciones, la selección negativa, la selección positiva,; o tanto la selección negativa como la positiva pueden repetirse^ múltiples veces. Pueden usarse marcadores de selección negativa, marcadores de selección positiva o tanto marcadores de selección1 negativa como positiva diferentes múltiples. En ciertas realizaciones, el marcador de selección positiva y negativa puede ser el mismo.

Pueden usarse otros tipos de selección/examen en la invención para producir componentes de traducción ortogonales, por ejemplo, un O-ARNt, una O-RS, y un par de 0-ARNt/O-RS. Por ejemplo, el marcador de selección negativa, el marcador de ^selección positiva o tanto el marcador de selección positiva como negativa pueden incluir un marcador que. fluoresce o cataliza una reacción luminiscente en presencia de un reactivo adecuado. En otra realización, se detecta un producto del marcador mediante citometria de flujo activada por fluorescencia (FACS) o mediante luminiscencia. Opcionalmente , el marcador incluye un marcador de examen basado en afinidad. Véase Francisco, J. A., et al., (1993) Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. ,Proc Nati Acad Sci U S A. .90: 10444-8.

Pueden encontrarse métodos adicionales para producir un ARNt ortogonal recombinante, por ejemplo, en las solicitudes de patente estadounidenses 10/126.931/ titulada " ethods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs" y 10/126.127, titulada "In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids", y USSN 10/825.867 titulada "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE". Véase también, Forster et al., (2003) Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codés designed de novo. PNAS 100 (11) : 6353-6357; y, Feng et al., (2003), Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change, PNAS 100(10): 5676-5681.

Un ARNt de la presente invención puede aminoacilarsé con un aminoácido deseado mediante cualquier método o técnica, incluyendo pero sin limitarse a, aminoacilación química o enzimática.

La aminoacilación puede lograrse mediante aminoacil-ARNt sintetasas o mediante otras moléculas enzimáticas, incluyendo pero sin limitarse a ribozimas. El término "ribozima" es intercambiable con "ARN catalítico". Cech y colaboradores (Cech, 1987, Science, 236: 1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226) demostraron la presencia de ARN que se producían de manera natural que pueden actuar como catalizadores (ribozimas) . Sin i embargo, i aunque se ha mostrado que estos catalizadores de ARN i naturales actúan sólo sobre sustratos de ácido ribonucleico para la escisión y el corte y empalme, el reciente desarrollo de la evolución artificial de ribozimas ha expandido el repertorio de catálisis a diversas reacciones químicas. Los estudios han identificado moléculas de ARN que pueden catalizar enlaces aminoacil-ARN en sus propios extremos (2' ) 3' -terminales ( Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647), y una molécula de ARN que puede transferir un aminoácido de una molécula de ARN a I otra (Lohse et al., 1996, Nature 381 :442-444) .

La ¡publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0228593, que se incorpora como referencia al presente documento, describe métodos para construir ribozimas y su uso en la aminoacilación de ARNt con aminoácidos codificados de manera i natural y, no codificados de manera natural. Formas inmovilizadas en sustrato de moléculas enzimáticas que pueden aminoacilar ARNt, incluyendo pero sin limitarse a ribozimas, pueden permitir una purificación por afinidad eficaz de los productos aminoacilados .

Los ejemplos de sustratos adecuados incluyen agarosa, Sepharose y perlas ¡magnéticas. La producción y el uso de una forma inmovilizada en sustrato de ribozima para la aminoacilación se describe' en Chemistry and Biology 2003, 10:1077-108 y la publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0228593, que se incorpora como referencia al presente documento.

Los métodos de aminoacilación química incluyen, pero no se limitan a, los introducidos por Hecht y colaboradores (Hecht, S.

M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; . Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) y por Schultz, Chamberlin, Dougherty y otros (Cornish, V. .; endel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34/ 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J. ; Anthony-Cahill , S.

J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem.

Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan,: j. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. w: et ,al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34),1 para evitar el uso de sintetasas en la aminoacilación. Tales métodos u otros métodos de aminoacilación química pueden usarse para aminoacilar las moléculas de ARNt de la invención.

Se ' han usado métodos biosintéticos que emplean aminoacil-ARNt modifica'dos químicamente para incorporar varias sondas biofísicas en proteínas sintetizadas in vitro. Véanse¦ las siguientes publicaciones y referencias citadas en las mismas: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514 (1993); y, rieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent. preprolactin of the 54-kilodalton polipeptide of the signal recognition partióle, Proc. Nati. Acad. Sci, 83 (22) : 8604-8608 (1986).

Previamente, se ha mostrado que pueden incorporarse aminoácidos no naturales de manera específica del sitio en proteínas in vitro mediante la adición de ARNt supresores aminocilados químicamente a reacciones de síntesis de proteínas programadas con un gen que contiene una mutación sin sentido ámbar deseada. Usando estos enfoques, pueden sustituirse varios de los t veinte aminoácidos comunes por homólogos estructurales cercanos, por ejemplo, fenilalanina por fluorofenilanalina, usando cepas auxótrofas para un aminoácido particular. Véanse, por ejemplo, Noren, GJ., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids intp proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M.W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C. G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Díala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999)'; Ellman, J.A., Mendel, D . , Anthony-Cahill , S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins. Methods in Enz. , vol .202, 301-336 (1992); y Mendel, D . , Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys . Biomol Struct, 24, 435-62 (1995).

Por ejemplo, se preparó un ARNt supresor que reconocía el codón de terminación UAG y se aminoaciló químicamente con un aminoácido no' natural. Se usó mutagénesis dirigida al sitio convencional para introducir el codón de terminación TAG, en el sitio de¡ interés en el gen de la proteína. Véase por ejemplo, Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5' -3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16 (3) : 791-802 (1988) . Cuando se combinaron el ARNt supresor acilado y el gen mutante en un sistema de transcripción/traducción in vitro, el aminoácido no natural se incorporó: en respuesta al codón UAG que dio una proteína que contenía ¡ese aminoácido en la posición especificada. Experimentos usando [3H]-Phe y experimentos con cc-hidroxiácidos demostraron que sólo se incorpora el aminoácido deseado en la posición especificada por el codón UAG y que este aminoácido no se incorpora¡ en ningún otro sitio en la proteína. Véanse, por ejemplo, ¡Noren, et al, citado anteriormente; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10 ( 6) : 25-432; y, Ellman, J.A. , Mendel, D;. > Schultz, P, G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255 (5041) : 197-200 (1992) . ¦ Los, métodos para generar ARN catalítico pueden implicar generar 1 conjuntos separados de secuencias de ribozimas i aleatorizadas , realizar la evolución dirigida en los conjuntos, examinar los · conjuntos para detectar la actividad de aminoacilación deseada y seleccionar las secuencias de las riboziraas que presentan la actividad de aminoacilación deseada.

Las; ribozimas pueden comprender motivos y/o regiones que facilitan la actividad de acilación, tales como un motivo GGU y una región rica en U. Por ejemplo, se ha notificado que regiones ricas en U pueden facilitar el reconocimiento de un sustrato de aminoácido, y un motivo GGU puede formar pares de bases con los extremos ;3' terminales de un ARNt . En combinación, el motivo GGU y la región rica en U facilitan el reconocimiento simultáneo tanto del aminoácido como del ARNt simultáneamente, y de ese modo facilitan la aminoacilación del extremo 3' terminal del ARNt.

Las , ribozimas pueden generarse mediante selección in vitro usando un r24mini parcialmente aleatorizado conjugado con ARNtAsnccc seguido por modificación sistemática por ingeniería genética de una secuencia consenso que se encuentra en los clones activos. Una ribozima a modo de ejemplo obtenida mediante este método se1 denomina "ribozima Fx3" y se describe en la solicitud de publicación estadounidense n.° 2003/0228593, cuyo contenido se incorpora como referencia al presente documento, y actúa como un catalizador versátil para, la síntesis de ciertos aminoacil-ARNt cargados con aminoácidos no naturales relacionados.

La 1 inmovilización sobre un sustrato puede usarse para permitir, una purificación por afinidad eficaz de los ARNt aminoaciíados . Los ejemplos de sustratos adecuados incluyen, pero no se limitan a, agarosa, Sepharose y perlas magnéticas. Las ribozimas pueden inmovilizarse sobre resinas aprovechándose de la estructura química del ARN, tal como que el 3'-cis-diol en la ribosa del ARN puede oxidarse con peryodato para producir el correspondiente dialdehído para facilitar la inmovilización del ARN sobre la resina. Pueden usarse diversos tipos de resinas incluyendo resinas de hidrazida baratas en las que la aminación reductora hace que la interacción entre la resina y la ribozima sea una unión irreversible. La síntesis de aminoacil-ARNt puede facilitarse significativamente mediante esta técnica de aminoacilación en columna. Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4 describen un sistema de aminoacilación basado en columna.

El aislamiento de los ARNt aminoaciíados puede lograrse de una variedad de modos. Un método' adecuado es eluir los ARNt aminoaciíados de una columna con un tampón tal como una disolución de acetato de sodio con EDTA 10 mM, un tampón que contiene ácido N- (2-hidroxietil) piperazin-N' - (3-propanosulfónico) 50 mM, KC1 12,5 mM pH , EDTA 10 mM, o simplemente agua tamponada con EDTA (pH 7,0) .

Los ARNt aminoacilados de la presente invención pueden añadirse a reacciones de traducción con el fin de incorporar el aminoácido con . el que se aminoaciló el ARNt en una posición de elección, en un polipéptido preparado mediante la reacción de traducción. Los ejemplos de sistemas de traducción en los que los ARNt aminoacilados de la presente invención pueden usarse incluyen, pero no se limitan a lisados celulares. Los lisados celulares proporcionan componentes de reacción necesarios para la traducción in vitro de un polipéptido a partir de un ARNm de entrada. Los ejemplos de tales componentes de reacción incluyen pero no se .limitan una proteínas ribosómicas, ARNr, aminoácidos, ARNt, GTP, ATP, factores de elongación e iniciación de la traducción y factores adicionales asociados con la traducción. Adicionalmente, los sistemas de traducción pueden ser traducciones por lote.s o traducción compartimentalizada . Los sistemas de traducción por lotes combinan los componentes de reacción en un único compartimento mientras que los sistemas de traducción compartimentalizada separan los componentes de la reacción de traducción de los productos de reacción que pueden inhibir la eficacia :de la traducción. Tales sistemas de traducción están disponibles comercialmente .

Además, puede usarse un sistema de transcripción/traducción acoplado. Los sistemas de transcripción/traducción acoplados permiten tanto la transcripción de un ARN de entrada para dar un ARNm correspondiente, que a su vez se traduce -mediante los componentes de reacción. Un ejemplo de una transcripción/traducción acoplada disponible comercialmente es el sistema Rapid Translation (RTS, Roche Inc.). El sistema incluye una mezcla que contiene lisado de E. coli para proporcionar componentes de la traducción tales como ribosomas y factores de traducción. Adicionalmente, se incluye una ARN polimerasa para la transcripción del ADN de entrada para dar un molde de ARNm para su uso en la traducción. El RTS puede usar la compartimentalización de los ; componentes de reacción por medio de una membrana interpuesta entre los compartimentos de reacción, incluyendo un compartimento de suministro/desechos y un compartimento de transcripción/traducción .

La aminoacilación del ARNt puede realizarse mediante otros agentes, incluyendo pero sin limitarse a, transferasas, polimerasas, anticuerpos catalíticos, proteínas multifuncionales y similares.

Aminoacilj-ARNt sintetasas ortogonales (O-RS) Una i O-RS aminoacila preferentemente un O-ARNt de la presente invención! con un aminoácido seleccionado in vitro o in vivo. Una O-RS de la presente invención puede proporcionarse al sistema de traducción (por ejemplo, componentes de traducción in vitro, o una célula) mediante un pdlipéptido que incluye una O-RS y/o mediante un polinucleótido que codifica para una O-RS o una parte de la misma. Una O-RS, . o una parte de la misma, se codifica por una secuencia de polinucleótido o una secuencia de polinucleótido complementaria de ¦ la misma, o una variación conservativa de la misma. Un O-ARNt de la presente invención puede aminoacilarse por diversas' moléculas de O-RS diferentes, incluyendo pero sin limitarse a, .las dadas a conocer en el presente documento.

Losi métodos para identificar una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , por ejemplo, una O-RS, para su uso con un 0- ARNt, por ejemplo, un O-ARNt, también son una característica de la i presente I invención. Por ejemplo un método incluye someter a selección positiva una población de células de una primera especie, en el que las células comprenden cada una: 1) un miembro de una pluralidad de aminoacil-ARNt sintetasas (RS) , en el que la pluralidad de RS comprenden RS mutantes, RS derivadas de una especie distinta de la primera especie o tanto RS mutantes como RS derivadas1 , de una especie distinta de la primera especie; 2) el ARNt ortogonal (O-ARNt) de una segunda especie; y 3) un polinucleptido que codifica para un marcador de selección positiva y comprende al menos un codón selector. Se seleccionan o se examinan , las células para determinar aquéllas que muestran una mejora en la eficacia de supresión en comparación con las células i que carecen de o que tienen una cantidad reducida del miembro de la pluralidad de RS . Las células que tienen una mejora en la eficacia de supresión comprenden una RS activa que aminoacila el I . O-ARNt. Un nivel de aminoacilación ( in vitro o in vivo) producida por la RS activa de un primer conjunto de ARNt de la primera especie se compara con el nivel de aminoacilación {in vitro o in vivo) producida por la RS activa de un segundo conjunto de ARNt de la segunda especie. El nivel de aminoacilación puede determinarse mediante1 una sustancia detectable (por ejemplo, un aminoácido no natural p aminoácido- o marcado) . Se selecciona la RS activa que aminoacila de manera más eficaz el segundo conjunto de ARNt en comparación con el primer conjunto de ARNt, proporcionando de ese modo la aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal para su uso con el O-ARNt. Una O-RS, por ejemplo, una O-RS, identificada mediante el método también es una característica de la presente invención.

Puede usarse cualquiera de diversos ensayos para determinar la aminoacilación. Estos ensayos pueden realizarse in vitro o in vivo. Por ejemplo, se describen ensayos de aminoacilación in vitro en, por ejemplo, Hoben, P., y Solí, D. (1985) Methods Enzymol. 113:55-59 y en la publicación de solicitud de' patente estadounidense n.° 2003/0228593.' La aminoacilación también puede t determinarse usando un indicador junto con componentes de I traducción ortogonales y detectando el indicador en una célula que I expresa un polinucleótido que comprende al menos un codón selector que codifica para una proteína. Véase también, la solicitud de patente estadounidense 10/126.927, titulada "IW VIVO INCORPORATION OF UUNATURAL A INO ACIDS"; y, USSN 10/825.867 titulada "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE". i Una O-RS identificada puede manipularse adicionalmente para alterar la especificidad de sustrato de la sintetasa de modo que sólo se' cargue un aminoácido no natural deseado, pero no cualquiera de los 20 aminoácidos comunes, en el O-ARNt. Los métodos para generar aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales con una especificidad de sustrato por un aminoácido no natural incluyen mutar la sintetasa, · por ejemplo, en el sitio activo en la sintetasá, en el sitio del · mecanismo de edición en la sintetasa, en sitios diferentes combinando dominios diferentes de sintetasas, o similares, y aplicando un proceso de selección. Se usa una estrategia que se basa en la combinación de una selección positiva seguida por una' selección negativa. En la selección positiva, la supresión del codón selector introducido en una(s) posición/posiciones no esencial/esenciales de un marcador positivo permite que las células sobrevivan bajo la presión de selección positiva.1 En presencia tanto de aminoácidos naturales como no i naturales, los supervivientes codifican por tanto para sintetasas activas que cargan el ARNt supresor ortogonal con un aminoácido o bien natural o bien no natural. En la selección negativa, la supresión; de un codón selector introducido en una(s) posición/posiciones no esencial/esenciales de un marcador negativo elimina las sintetasas con especificidades de aminoácido natural.

Los supervivientes de la selección positiva y negativa codifican para sintetasas que aminoacilan (cargan) el ARNt supresor i ortogonal, únicamente con aminoácidos no naturales. Estas sintetasas pueden someterse entonces a mutagénesis adicional, por ejemplo, 1 intercambio de ADN u otros métodos de mutagénesis recursivos .

La , biblioteca de O-RS mutantes puede generarse usando diversas1 técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Por ejemplo, ? las RS mutantes pueden generarse mediante mutaciones especificas de sitio, mutaciones puntuales al azar, recombinación homologa, intercambio de ADN u otros métodos de mutagénesis recursivos, construcción quimérica o cualquier combinación de los mismos'. ' Por ejemplo, una biblioteca de RS mutantes puede producirse a partir de dos o más de otras "sub-bibliotécas", por ejemplo, ^ás pequeñas, menos diversas. Las bibliotecas quiméricas de RS también se incluyen en la invención. Debe observarse que se construyen y se examinan opcionalmente bibliotecas de ARNt sintetasas de diversos organismos (por ejemplo, microorganismos tales como Eubacteria o Archaebacteria) tales como bibliotecas que comprenden diversidad natural (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.238.884 concedida a Short et al; la patente estadounidense n.° 5.756.316 concedida a Schallenberger et al; la patente estadounidense n.° 5.783.431 concedida a Petersen et al; la patente estadounidense n.° 5.824.485 concedida a Thompson et al; la patente estadounidense n.° 5.958.672 concedida a Short et al), para, pares ortogonales.

Una ¡vez que las sintetasas se someten a la estrategia de selección^ positiva y negativa/examen, estas sintetasas pueden someterse; entonces a mutagénesis adicional. Por ejemplo, puede aislarse un ácido, nucleico qué codifica , para la O-RS; puede generarse un conjunto de polinucleótidos que codifican para O-RS mutadas (por ejemplo, mediante mutagénesis al azar, mutagénesis especifica del sitio, recombinación o cualquier combinación de las mismas) a partir del ácido nucleico; y, estas etapas individuales o una combinación de estas etapas pueden repetirse hasta que se obtiene una O-RS mutada que aminoacila preferentemente el O-ARNt con el aminoácido no natural. En un aspecto de la presente invención, las etapas se realizan múltiples veces, por ejemplo, al menos dos veces.

También pueden usarse niveles adicionales de rigurosidad de selección/examen en los métodos de la presente invención, para producir O-ARNt, O-RS, o pares de los mismos. La rigurosidad de la selección o el examen puede variarse en una o ambas etapas del método para producir una O-RS. Esto podría incluir, por ejemplo, variar la cantidad de agente de selección/examen que se usa, etc. También !pueden realizarse rondas adicionales de selecciones positivas1 y/o negativas. La selección o el examen también pueden comprender una o más selecciones positivas o negativas o examen que incluyen, por ejemplo, un cambio en la permeabilidad del aminoácido, un cambio en la eficacia de la traducción, un cambio en la fidelidad de la traducción, etc. Normalmente, el uno o más cambios se basan en una mutación en uno o más genes en un organismo, en el que se usa un par de ARNt-ARNt sintetasa ortogonal para producir la proteína.

En la presente invención pueden usarse otros tipos de selecciones para, por ejemplo, 0-RS, 0-ARNt, y el par de 0-ARNt/O-RS . El marcador de selección positiva puede ser cualquiera de una variedad ¡ de moléculas- incluyendo, pero sin limitarse a, un producto que proporciona un suplemento nutriciona^l para el crecimiento y la selección se realiza en un medio que carece del suplemento nutricional. Los ejemplos de polinucleótidos que i codifican para marcadores de selección positiva incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un gen indicador basado en complementar la auxotjrofía de aminoácidos de una' célula, un gen his3 (por ejemplo, en el que el gen his3 codifica para una imidazol-glicerol-fosfato deshidratasa, detectada proporcionando 3-aminotriazol (3-AT) ) , gen ura3, gen leu2, gen lys2, gen lacZ, gen adh, etc. Véase por ejemplo, G. M. Kishore, & D. M. Shah, (1988), Amino acid biosynthesis inhibitors as herbicides, Annual Review of Biochemistry 57:627-663. En una realización, la producción de lacZ se detecta mediante hidrólisis de orto-nitrofenil-ß-?- i galactopiranósido (ONPG) . Véase por ejemplo, I. G. Serebriiskii, & E. A. Golemis, (2000), Uses of lacZ to study gene function: evaluation of beta-galactosidase assays employed in the yeast two-hybrid system, Analytical Biochemistry 285:1-15. Los marcadores de selección positiva adicionales incluyen, por ejemplo, luciferasa, proteina fluorescente verde (GFP) , YFP, EGFP, RFP, el producto de un gen resistente a antibióticos (por ejemplo, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) ) , una proteina moduladora de la transcripción (por ejemplo, GAL4) , etc. Opcionalmente, un polinucleótido que codifica para un marcador de selección positiva comprendé un codón selector.

Un polinucleótido que codifica para el marcador de selección positiva! puede unirse operativamente a un elemento de respuesta. También puede estar presente un polinucleótido adicional que codifica para una proteina moduladora de la transcripción que modula la transcripción del elemento de respuesta, y comprende al menos un codón selector. La incorporación del aminoácido no natural en la¦ proteina moduladora de la transcripción por el 0-ARNt aminoacilado con el aminoácido no natural da como resultado la transc iripción del polinucleótido (por ejemplo, gen indicador) que codifica para el marcador de selección positiva. Opcionalmente, el codón selector se ubica en o sustancialmente cerca de una parte del polinucleótido que codifica para un dominio de unión a ADN de la proteina moduladora de la transcripción.

Un polinucleótido que codifica para el marcador de selección negativa también puede estar operativamente unido a un elemento de respuesta1 a partir del cual se media la transcripción mediante la proteina moduladora de la transcripción. Véase por ejemplo, A. J. DeMaggio, . et al., .( 2000 ) , The yeast split-hybrid system, Method Enzymol. ' 328 : 128 - 137 ; H. M. Shih, et al., ( 1996 ) , A positive genetic selection for disrupting protein-protein interactions : identification of CREB mutations that prevent association with the coactivatpr CBP, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 93 : 13896- 13901 ; M. Vidal, et al., (1996), Genetic characterization of a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid s'ystem, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 93:10321-10326; y, M. Vidal, et al . , (1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid system to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions (Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 93:10315-10320) . La incorporación de un aminoácido natural en la proteina moduladora de la transcripción por el O-ARNt aminoacilado con un aminoácido natural · da como resultado la transcripción del marcador de selección negativa. Opcionalmente, el marcador de selección negativa comprende un codón selector. El marcador de selección positiva y/o él marcador de selección negativa de la invención pueden comprender al menos dos codones selectores, comprendiendo cada uno , c ambos al menos dos codones selectores diferentes o al menos dos1 codones selectores iguales.

La proteina moduladora de la transcripción es una molécula que se une (directa o indirectamente) a una secuencia de ácido i nucleico '¦ (por ejemplo, un elemento de respuesta) y modula la transcripción de una secuencia que está unida operativamente al elemento de respuesta. Una proteina moduladora de la transcripción puede ser una proteina activadora de la transcripción (por ejemplo, GAL4, receptores nucleares de hormonas, API, CREB, miembros 'de la familia LEF/tcf, S AD, VP16, - SP1, etc.), una proteina represora de la transcripción (por ejemplo, receptores nucleares de hormonas, /familia Groucho/tle, familia Engrailed, etc.), o una proteina que puede tener ambas actividades dependiendo del entorno (por ejemplo, LEF/tcf, proteínas "homeobox", etc.). Un elemento de respuesta es normalmente una secuencia de ácido nucleico que se reconoce por la proteína moduladora de la transcripción o un agente adicional que actúa conjuntamente con la proteína moduladora de la transcripción.

Otro ejemplo de una proteína moduladora de la transcripción es la proteína activadora de la transcripción, GAL4. Véase por ejemplo, A. Laughon, et al., (1984), Identification of two proteins encoded by the Saccharomyces cerevisiae GAL4 gene, Molecular & Cellular Biology 4:268-275; A. Laughon, & R. F. Gesteland, (1984), Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae GAL gene, Molecular & Cellular Biology 4:260-267; L.

Keegan, et al., (1986), Separation of ADN binding from the transcrip ion-activating function of a eukaryotic regulatory protein, Science 231:699-704; y, M. Ptashne, (1988), How eukaryotic transcriptional activators work, Nature 335:683-689. Los 147 aminoácidos de extremo N terminal de esta proteína de 881 aminoácidos forman un dominio de unión a ADN (DBD) que se une específicamente a la secuencia de ADN. Véase por ejemplo, M. i Carey, et al., (1989), An amino-terminal fragment of GAL4 binds DNA as a dimer, J. Mol. Biol. 209:423-432; y, E. Giniger, et al., (1985) , Specific DNA binding of GAL4 , a positive regulatory protein of yeast, Cell 40:767-774. El DBD se une, mediante una secuencia, de proteínas intermedia, a un dominio de activación (AD) de 113 aminoácidos en el extremo C terminal que puede activar la transcripción cuando está unido al ADN. Véase por ejemplo, J. Ma, & M. Ptashne, (1987) , Deletion analysis of GAL defines two transcriptional activating segments, Cell 48:847-853: y, J. Ma, & M. Ptashne, (1987) , The carboxy-terminal 30 amino acids of GAL4 are recognized by GAL80, Cell 50:137-142. Colocando codones ámbar hacia, por ejemplo, el DBD de extremo N terminal de un único polipéptido que contiene tanto el DBD de extremo N terminal de GAL4 como su AD de extremo C terminal, la supresión de ámbar por el par de O-ARNt/0-RS puede asociarse a la activación de la ' transcripción por GAL4. Pueden usarse genes indicadores activados por GAL4Í para llevar a cabo tanto selecciones positivas como negativas con el gen.

El medio usado para la selección negativa puede comprender un agente de selección o examen que se convierte en una sustancia detectable por el marcador de selección negativa. En un aspecto de la invención, la sustancia detectable es una sustancia tóxica. Un polinucleótido que codifica para un marcador de selección negativa puede ser1, por ejemplo, un gen ura3. Por ejemplo, el indicador de URA3 puede colocarse bajo el control de un promotor que contiene sitios de unión a ADN GAL4. Cuando se produce el marcador de selección negativa, por ejemplo, mediante la traducción de un polinucleótido que codifica para GAL4 con codones selectores, GAL4 activa la, transcripción de URA3. La selección negativa se lleva a cabo en un medio que comprende ácido 5-fluoro-orótico (5-FOA) , que se convierte en una . sustancia detectable (por ejemplo, una sustancia tóxica que destruye la célula) mediante el producto génico del gen ura3. Véase por ejemplo, J. D. Boeke, et al., (1984), !A positive selection for mutants lacking orotidine-5' -phosphaté decarboxylase activity in yeast: 5-fluoroorotic acid resistance, Molecular & General Genetics 197:345-346); M. Vidal, et .al., (1996), Genetic characterization of a mammalian protein-protein interaction domain by . using a yeast reverse two-hybrid system., 1 Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 93:10321-10326; y, M. Vidal, et al., (1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and ADN-protein interactions . , Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 93:10315-10320.

Como con el marcador de selección positiva, el marcador de selección negativa también puede ser cualquiera de una variedad de moléculas!. El marcador de , selección positiva y/o el marcador de selección negativa puede ser un polipéptido que fluoresce o cataliza ¡una reacción luminiscente en presencia de un reactivo adecuado.' Por ejemplo, los marcadores de selección negativa incluyen,, pero no se limitan a, por ejemplo, luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP) , YFP, EGFP, RFP, el producto de un gen resistente a antibióticos (por ejemplo, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) ) , el producto de un gen lacZ, proteína moduladorá de la transcripción, etc. El marcador de selección positiva y/o el marcador de selección negativa pueden detectarse mediante citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) o mediante luminiscencia. El marcador de selección positiva y/o el marcador de selección negativa pueden comprender un marcador de examen basado en afinidad. El mismo polinucleótido puede codificar tanto para el marcador de selección positiva como para el marcador de selección negativa. Por ejemplo, la etapa de selección positiva^ la etapa de selección negativa o tanto la etapa de selección positiva como la de selección negativa pueden incluir usar un indicador, en el que el indicador se detecta mediante citometria de flujo activada por fluorescencia (FACS) . Por ejemplo, puede realizarse en primer lugar una selección positiva con un marcador de selección positiva, por ejemplo, gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , en el que el gen de CAT comprende, un codón selector, por ejemplo, un codón de terminación ámbar, en el gen de CAT, lo que va seguido por un examen de selección, negativa, que se basa en la incapacidad para suprimir un/unos codón/codones selector/selectores, por ejemplo, dos o más, en posiciones dentro de un marcador negativo, por ejemplo, gen de ARN polimerasa de T7. El marcador de selección positiva y el marcador :de selección negativa pueden encontrarse en el mismo vector, por ejemplo, un plásmido. La expresión del marcador negativo dirige la expresión del indicador, por ejemplo, la proteina ¡fluorescente >verde (GFP) . Puede variarse la rigurosidad de la selección y el examen, por ejemplo, puede variarse la intensidad de la luz necesaria para hacer fluorescer el indicador. Puede realizarse una selección positiva con un indicador como marcador 1 de selección positiva, que se estudia mediante FACS, seguido por un estudio de selección negativa, que se basa en la incapacidad para · suprimir un/unos codón/codones selector/selectores, por ejemplo, dos o más, en posiciones dentro de un marcador negativo, por ejemplo, el gen de barnasa.

Opcionalmente, el indicador se presenta en una superficie celular, Ipor ejemplo, en una presentación en fago o similares. La presentación en la superficie celular, por ejemplo, el sistema de presentación en la superficie celular basado en OmpA, se basa en la expresión de un epitopo particular, por ejemplo, un péptido C3 de- poliovirus fusionado a una proteina de membrana externa OmpA, en la superficie de la célula de Escherichia coli. El epitopo se presenta ¡en la superficie celular sólo cuando se suprime un codón selector .en el mensaje de la proteina durante la traducción. El I péptido presentado contiene entonces el aminoácido reconocido por una de las aminoacil-ARNt sintetasas mutantes en la biblioteca, y la célula que contiene el gen de sintetasa correspondiente puede aislarse ¡con anticuerpos generados contra péptidos que contienen aminoácidos no naturales específicos. El sistema de presentación en la superficie celular basado en OmpA se desarrolló y optimizó por Georgiou et al. Como una alternativa a la presentación en fago. Véase Francisco, J. A., Campbell, R. , Iverson, B. L. & Georgoiu, ; G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the externa! surface. Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 90:10444-8 (1993) .

Otras realizaciones de la presente invención incluyen llevar a cabo una o más de las etapas de selección in vitro. El componente seleccionado, por ejemplo, sintetasa y/o ARNt, puede i introducirse . entonces en una célula para su uso en la incorporación m vivo de un aminoácido no natural. i Detalles adicionales para producir O-RS, y alterar la I especificidad de sustrato de la sintetasa pueden encontrarse en la solicitud de patente estadounidense 10/126.931 titulada "Methods and Compósitions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs"; y, USSN 10/825.867 titulada "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE",. que se incorporan como referencia al presente idocumento. Detalles adicionales para producir O-RS pueden encontrarse en Hamano-Takaku et al., (2000) .A mutant Escherichia coli Tyrosyl-ARNt Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine, Journal of Biological Chemistry, 275 (51) : 0324-40328; Kiga et al. (2002), An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorpor.ation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translation and its application in a wheat germ cell-free system, PNAS 99(15): 9715-9723; y, Francklyn et al., (2002), Aminoacyl-tRNA sythetases: Versatile players in the changing theater of translation; RNA, 8:1363-1372, incorporándose cada uno como referencia en el presente documento.

ORGANISMOS FUENTE Y HUÉSPED Los componentes de la traducción de la presente invención normalmente se derivan de organismos no eucariotas . Por ejemplo, el O-ARNt ortogonal puede derivarse de un organismo no ecuariota, por ejemplo, Archaebacterium, tales como Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tales como i Haloferax volcanii y Halobacterium especie NRC-1, Archaeoglobus fulgidus , Pyrococcus furiosus , Pyrococcus horikoshii , Aeuropyru pernix, o similares, o Eubacterium, tales como Escherichia coli, Thermus \thermophilus , Bacillus stearothermphilus , o similares, mientras. que la O-RS ortogonal puede derivarse de un organismo no eucariotá, por ejemplo, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tales como Haloferax volcanii y Halobacterium especie NRC-1, Archaeoglobus fulgidus , Pyrococcus furiosus , Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, o similares, o Eubacterium, tales como Escherichia coli, Thermus thermophilus , Bacillus ¡ stearothermphilus , o similares. En una realización, también pueden usarse fuentes eucariotas, incluyendo pero sin limitarse; a, plantas, algas, protistas, hongos, levaduras, animales (por ejemplo, mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), o similares.

Los componentes individuales de un par de 0-ARNt/O-RS pueden derivarse del mismo organismo o de organismos diferentes. En una realización, el par de 0-ARNt/O-RS procede del mismo organismo. Alternativamente, el O-ARNt y la O-RS del par de O-ARNt/0-RS proceden 'de organismos diferentes. Por ejemplo, el O-ARNt puede derivarse de, por ejemplo, Halobacterium sp NRC-1, y la O-RS puede derivarse de, por ejemplo, Methanobacterium thermoautrophicum.

. El ¡O-ARNt, O-RS o par de O-ARNt/O-RS puede seleccionarse o examinarse in vivo . o in vitro y/o usarse en una célula, por i ejemplo, :una célula no eucariota (tal como una célula de E. coli) , o una célula eucariota, para producir un polipéptido con un aminoácido seleccionado (por ejemplo, un aminoácido no natural). Una célula no eucariota puede proceder de una variedad de fuentes, tales como el dominio filógenético de Archaea, incluyendo pero sin limitarse a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium i ther oautotrophicum, Halobacteriu tales como Haloferax volcanii y Halobacterium especie NRC-1, Archaeoglobus fulgidus , Pyrococcus furiosus,\ Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, o similares, o puede pertenecer al dominio filógenético de Eubacteria (incluyendo i pero sin limitarse a, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.), o similares. Una célula eucariota! puede proceder de una variedad de fuentes, incluyendo pero sin limitarse a, una planta (por ejemplo, plantas complejas tales como: monocotiledóneas o dicotiledóneass ) , un alga, un protista, un hongo, una levadura (incluyendo pero sin limitarse a, Saccharomyces cerevisiae) , un animal (incluyendo pero sin limitarse1 a, un mamífero, un insecto, un artrópodo, etc.), o similares j. Las composiciones de células con componentes de la traducción de la presente invención son también una característica i de la presente invención. Véase también USSN 10/825.867 titulada "Expanding the Eukaryotic Genetic Code" para estudiar O-ARNt y/o O-RS en una especie para su uso en otras especies.

Para expresar un polipéptido de interés con un aminoácido seleccionado en una célula huésped, pueden subclonarse polinu.clejótidos que codifican para un polipéptido de interés en un vector de expresión que contiene un promotor para dirigir la transcripción, un terminador de la transcripción/traducción, y si es para un ácido nucleico que codifica para una proteina, un sitio de unión1 a ribosoma para el inicio de la traducción. Los promotores bacterianos adecuados se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. y Ausubel et al.

Sistemas de expresión bacteriana para expresar un polipéptido de interés están disponibles en, ' incluyendo, pero sin limitarse a, E. coli,' Bacillus sp. , Pseudomonas fluorescens , Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas putida, y Salmonella (Palva et al, Geh 22:229-235 (1983); Mosbach et al, Nature 302:543-545 (1983)). Hay kits para tales sistemas de expresión comercialmente disponibles. Los sistemas de expresión eucariota para células de mamífero, células de levadura e insecto se "conocen bien en la técnica y también están comercialmente disponibles.

Un ARNt y/o RS de la presente invención y/o un polipéptido de interés pueden utilizarse y/o expresarse en cualquier número de sistemas de expresión adecuados incluyendo, por ejemplo, células de levadura, de insecto, células de mamífero, y bacterias. Se facilita a continuación una descripción de sistemas de expresión a modo de ej emplo . Levadura . Tal como se usa en el presente documento, el término "levadura" incluye cualquiera de las diversas ¡levaduras que puede expresar un polipéptido de interés. Tales levaduras incluyen, pero no se limitan a, ' levaduras i Ascosporogenous (Endomycetales) , levaduras Basidiosporogenous y ? levaduras pertenecientes. al grupo Fungí imperfecti {Blastomycetes) . Las levaduras ascosporogenous se dividen en dos familias,1. Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae. Esta última se compone ! de cuatro subfamilias, Schizosaccharomycoideae (por ejemplo, ¡género Schizosaccharomyces) , Nadsonioideae, Lipomycoideae y Saccharomycoideae (por ejemplo, géneros Pichia, Kluyveromyces y Saccharomyces) . Las levaduras Basidiosporogenous incluyen los géneros . · Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, y Filobasidiella. Las levaduras pertenecientes al grupo Fungí imperfecti {Blastomycetes) se dividen en dos familias, Sporobolomycetaceae (por ejemplo, géneros Sporobolomyces y Bullera) y Cryptococcaceae (por ejemplo, género Candida.

Son ! de particular interés ' para su uso con la presente invención; las especies dentro de los géneros Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansemtla , Torulopsis y Candida, incluyendo, pero sin limitarse a, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. i diastatichs, S. douglasii, S. kluyveri, S, norbensis, S. oviformis] K. lactis, K. fragius, C. albicans, C. maltosa y H. polimorpha . Las levaduras están disponibles generalmente a partir de una variedad de fuentes incluyendo, pero sin limitarse a, el Centro de Reserva Genética de Levaduras, Departamento de Biofísica y Fisicai Médica, Universidad de California (Berkeley, CA) , y la Colección Americana de Cultivos Tipo ("ATCC") (Manassas, VA) . i La expresión "huésped de levadura" o "célula huésped de levadura" incluye levaduras que pueden usarse, o se han usado, i como receptor para vectores recombinantes u otro ADN de transferéncia . La. expresión incluye la progenie de la célula huésped 'de levadura original que ha recibido los vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. Se entiende que la progenie ,de una única célula parental puede no ser necesariamente idéntica por completo en morfología o en ADN genómico o total complementario al progenitor original,' debido a una mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula parental que son suficientemente similares a la célula parental que va a caracterizarse mediante la propiedad relevante, tal como la presencia! de una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de interés, están incluidos en la progenie pretendida mediante esta definición.

Se han desarrollado vectores de expresión y transformación, incluyendo replicones extracromosómicos o vectores de integración, para su transformación en muchos huéspedes de levadura. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para S. cerevisiae (Sikorski et al., GENETICS (1989) 122:19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153: 163; Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142); C. maltosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141); H. polimorpha (Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459; Roggenkamp¦ et al., MOL. GENETICS. AND GENOMICS. (1986) 202:302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERIOL . (1984) 158 : 1165),; · ff. lactis (De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154:737; Van den- Berg et al., BIO/TECHNOLOGY (1990) 8:135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); P. pastoris (patentes estadounidenses n.°s 5.324.639; 4.929.555; y 4.837.148.; Cregg et al, MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376); Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, NATURE (1982) 300:706); e Y. lipolytica; A. nidulans (Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMfN. (1983) 112:284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26:205-221; y Yetlton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74); A. niger, (Kelly y Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479); T.' reesia (documento EP 0 244 234); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicilliu , Tolypocladium (documento WO 91/00357)!, incorporados cada uno como referencia en el presente documento!.

Los expertos habituales en la técnica conocen bien secuencias control para vectores de levadura e incluyen, pero no se limitan a, regiones promotoras de genes tales como alcohol deshidrogenasa (ADH) (documento EP 0 284 044) ; enolasa; glucocinasa; glucosa-6-fosfato i'somerasa; gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH) ; hexocinasa; fosfofructocinasa; 3-fosfoglicerato mutasa; y piruvato cinasa (PyK) (documento EP 0 329 203) . El gen PH05 de levadura,! que codifica para fosfatasa ácida, también- puede proporcionar secuencias promotoras útiles (Miyanohara et al., PROC. NATL, ACAD. SCI. USA (1983) 80:1) . Otras secuencias i promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura pueden incluir los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (198.0) 255: 12073); y otras enzimas i glicoliticas, tales como piruvato descarboxilasa, triosafosfato isomerasa, y fosfoglucosa isomerasa (Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900; Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149) . Los promotores inducibles de levadura que tienen la ventaja adicional' de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento pueden incluir las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2; isocitocromo C; fosfatasa ácida; metalotioneina; gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa; enzimas degradativas asociadas! con el metabolismo del nitrógeno; y enzimas responsables de la ¡utilización de maltosa y galactosa. Se describen adicionalmente vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras en el documento EP 0 073 657.

También pueden usarse potenciadores de levadura con promotores de levadura. Además, los promotores sintéticos también pueden funcionar como promotores de levadura. Por ejemplo, las secuencias de activación en sentido 5' (UAS) de un promotor de levadura ¡ pueden unirse con la región de activación de la I transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de ADH unida a la región de activación de la transcripción de GAP. Véanse las patentes estadounidenses n.os 4.880.734 y 4.876.197, que se incorporan como referencia al presente documento. Otros ejemplos de promotores híbridos j incluyen promotores que consisten en las secuencias reguladoras de los genes ADH2, GAL4, GALIO o PH05, combinadas con la región de activación de la transcripción de un gen ,de enzima glicolítica tal como GAP o PyK. Véase el documento EP 0 164 556.

Además, .un promotor de. levadura puede incluir promotores que se i producen de manera natural de origen distinto a levadura que tienen la capacidad para unirse a ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción.

Otros elementos de control que pueden comprender parte de los vectores de expresión de levadura incluyen terminadores , por ejemplo, de. los genes de GAPDH o enolasa (Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385) . Además, el origen de replicación del origen del plásmido 2µ es adecuado para levadura. Un gen de seleccióni adecuado para su uso en levaduras es el gen trpl presente en el plásmido de levadura. Véase Tschumper et al., GENE (1980) 10|:157; Kingsman et al., GENE (1979) 7:141. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de i levadura que .carece de la capacidad para crecer en triptófano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan mediante plásmidos conocidos que i llevan el gen Leu2.

Los expertos habituales en la técnica conocen bien métodos de introducción de ADN. exógeno en huéspedes de levadura, y normalmente incluyen, pero no se limitan a, o bien la transformación de esferoplastos o bien de células, huésped de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la transformación de levadura según el método descrito en Hsiao et al., PROC. NATL . ACAD. SCI." USA (1979) 76:3829 y Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946. Sin embargo, , también pueden usarse otros métodos para introducir ADN en células tales como mediante inyección nuclear, electroporación o fusión de protoplastos según se describe generalmente en SAMBROOK . ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001). Las células huésped de levadura pueden cultivarse entonces usando técnicas convencionales conocidas por los expertos habituales en i la técnica.

Los ; expertos habituales en la técnica conocen bien otros métodos para expresar proteínas heterólogas en células huésped de levadura.. Véanse generalmente la publicación de patente estadounidense n.° 20020055169, las patentes estadounidenses n.os 6.361.969; 6.312.923; 6.183.985; 6.083.723; 6.017.731; 5.674.706; 5.629.203; 5.602.034; y 5.089.398; las patentes estadounidenses reexaminadas n.os RE37.343 y RE35.749; las solicitudes de patente PCT publicadas WO 99/07862; WO 98/37208; y O 98/26080; las solicitudes de patente europea EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480;, WO 90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; y EP 0 164 556. Véanse también Gellissen et al., ANTO IE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62 ( 1-2 ) : 79-93 ; Romanos et al., YEAST (1992) 8 (6) : 23r488; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7, incorporados cada uno como referencia en el presente documento.

Las, cepas huésped de levadura pueden hacerse crecer en termentadores durante la fase de amplificación usando métodos de fermentación semicontinuos¦ convencionales conocidos por los expertos j en la técnica. Los métodos de fermentación pueden adaptarse para tener en cuenta diferencias en una ruta de utilización de carbono o modo de control de la expresión del huésped de levadura particular. Por ejemplo, la fermentación de un huésped '(de levadura Saccharomyces puede requerir una única alimentación de glucosa, una fuente de nitrógeno compleja (por ejemplo, hidrolizados de caseína) , y complementacion con múltiples vitaminas,. Por el contrario, la levadura metilotrófica P.,pastoris puede requerir alimentaciones de glicerol, metanol y oligoelementos, pero sólo sales de amonio sencillas (nitrógeno) para una expresión y un crecimiento óptimos. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.324.639; Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95; y Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) ; 9:1113, incorporados como referencia al presente documento Tales métodos de fermentación, sin embargo, pueden tener ciertas características comunes independientes de la cepa huésped de levadura empleada. Por ejemplo, un nutriente limitante del crecimiento, normalmente carbono, puede añadirse al¦ termentador durante la fase de amplificación para permitir un crecimiento máximo. Además, los métodos de fermentación emplean generalmente un medio de fermentación diseñado para contener cantidades adecuadas de carbono, nitrógeno, sales básales, fósforo y otros nutrientes minoritarios (vitaminas, oligoelementos¦ y sales, etc.) . Se describen ejemplos de medios de fermentación adecuados para su uso con Pichia en las patentes estadounidenses n.os 5.324.639 y 5.231.178, que se incorporan como referencia al presente documento .

Células de insecto infectadas por baculovirus. La expresión "huésped ¡de insecto" o "célula huésped de insecto" se refiere a un insecto que puede usarse, o se ha usado, como receptor para vectores ¡recombinantes u otro ADN de transferencia. La expresión incluye la progenie de la célula huésped de insecto original que se ha transíectado . Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente idéntica por completo en morfología o en complemento de ADN genómico o total al progenitor original, debido a una mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula parental que son suficientemente similares a' la célula parental que va a caracterizarse mediante la propiedad relevante, tal como la presencia de un secuencia de nucleótidos que codifica para un polipépt do de interés, están incluidos en la progenie pretendida mediante1 esta definición.

La selección de células de insecto adecuadas para un polipéptido de interés la conocen bien los expertos habituales en la técnica. Se describen bien varias especies de insecto en la técnica : y están comercialmente disponibles incluyendo Aedes aegypti,, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni. Al seleccionar huéspedes de insecto para la expresión, los huéspedes adecuados pueden incluir los que han mostrado que tienen, entre otros, buena capacidad de secreción, baja actividad proteolitica y robustez global. Los insectos 1 están disponibles generalmente a partir de una variedad de fuentes incluyendo, pero sin limitarse a, el Centro de Reserva Genética de Insectos, Departamento de Biofísica y Física Médica, Universidad de California (Berkeley, CA) , y la Colección Americana de Cultivos Tipo ("ATCC") (Manassas, VA) .

Generalmente, los componentes de un sistema de expresión en insecto ¡ infectado por baculovirus incluyen un vector de transferencia, habitualmente un plásmido bacteriano, que contiene tanto un .fragmento del genoma del baculovirus, como un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen heterólogo que va a expresarse; un baculovirus de tipo natural con secuencias homologas al fragmento específico de baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homologa del gen heterólogo en el genoma del baculovirus) ; y células huésped de insecto ; y medios de crecimiento apropiados. Los materiales, métodos y técnicas usados en la construcción de los vectores, la transfección de las células, la recogida de las placas, el crecimiento de células en cultivo, y similares se conocen en la técnica y están disponibles manuales que describen estas técnicas.

Tras insertar el gen heterólogo en el vector de transferencia, el vector y el genoma viral de tipo natural se transfectan en una célula huésped de insecto en la que se recombinan el vector y el genoma viral. Se expresa el virus recombinante empaquetado y se identifican y purifican las placas recombinantes . Están comercialmente disponibles materiales y métodos para sistemas de expresión en baculovirus/célula de insecto 'en forma de kit de, por ejemplo, Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) , Estas técnicas las conocen generalmente los expertos ien la técnica y se describen en detalle en SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987), incorporado al presente documento como referencia. Véase también, RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PR0T0C0LS IN MOLECULAR' ' BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); y O' REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS : A LABORATORY MANUAL (1992) .

De ' hecho, la producción de diversas proteínas heterólogas usando sistemas de expresión en baculovirus/célula de insecto se conoce bien en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.368.825; 6.342.216; 6.338.846; 6.261.805; 6.245.528; 6.225.060; 6.183.987; 6.168.932; 6.126.944; 6.096.304; 6.013.433; 5.965.393; 5.939.285; 5.891.676; 5.871.986; 5.861.279; 5.858.368; 5.843.733; 5.762.939; 5.753.220; 5.605.827; 5.583.023; 5.571.709; 5.516.657; 5.290.686; documentos WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332· WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078;1 WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037;' WO 88/07082, que se incorporan como referencia al presente documento.

Se conocen- en la técnica vectores que son útiles en sistemas de expresión en baculovirus/célula de insecto e incluyen, por ejemplo, . vectores de transferencia y expresión en insectos derivados; del virus de polihedrosis nuclear del baculovirus Autographa californica (VPNAc) , que es un vector de expresión viral, independiente, auxiliar. Los vectores de expresión viral derivados , de este sistema usan normalmente el promotor del gen de polihedrina viral fuerte para dirigir la expresión de genes heterólogos. Véase en general, O'Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992) .

Antes de insertar el gen foráneo en el genoma del baculovirus, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, secuencia líder (si se desea) , secuencia codificante de interés, y secuencia de terminación de la transcripción, se ensamblan normalmente en un constructo de transposición intermedio (vector de transferencia) . Los constructos de transposición intermedios se mantienen a menudo en un replicón, como un elemento cromosómico extra (por ejemplo, plásmidos) que puede proporcionar el mantenimiento · estable en un huésped, { tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, que le permite por tanto mantenerse en un huésped adecuado para la clonación y amplificación. Más específicamente, el plásmido puede contener la señal de poliadenilación de polihedrina (Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177) y un gen de resistencia a la ampicilina (amp) procariota y un origen de. replicación para la selección y propagación en E. coli.

Un vector de transferencia usado comúnmente para introducir genes foráneos en VPNAc es pAc373. Se han diseñado también muchos otros vectores, conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, pVL985, que altera el codón de iniciación de la polihedrina de ATG a ATT, y que introduce un sitio de clonación', BamHI 32 pares de bases en el sentido de 3' respecto a ATT. Véase Luckow y Summers, VIROLOGY 170:31 (1989). Otros vectores disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, PBlueBac4.5N5-His; pBlueBacHis2 ; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) .

Tras la inserción del gen heterólogo, el vector de transferencia y el genoma de baculovirus de tipo natural se transfectan conjuntamente en un huésped de células de insecto. Se conocen en la técnica métodos para introducir ADN heterólogo en el sitio deseado en el virus baculovirus. Véase SUMMERS Y SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); Smith et, al., MOL. CELL . BIOL. (1983) 3:2156; Luckow y Summers, VIROLOGY, (1989) 170:31. Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el gen de la polihedrina, mediante recombinación de sobrecruzamiento doble homologa; la inserción también puede ser en un sitio' de enzima de restricción diseñado mediante ingeniería genética en el gen de baculovirus deseado. Véase Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11(4) : 91.

La transfección puede lograrse mediante electroporación . Véase TROTTER Y WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann y King, ÍT. GEN. VIROL. (1989) 70:3501. Alternativamente, pueden usarse liposomas para transfectar las células de insecto con el vector de expresión recombinante y el baculovirus. Véase, por ejemplo, Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1) :36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18:45; TILKINS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17:491; Kost et al., GENE (1997) 190:139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (37) : 22376; Reversey1 et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (39) : 23607-10; Stanley et al., ' 3. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121; Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68(2):766; y Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14.2:274.

¦Los liposomas disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, Cellfectin® y Lipofectin® (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA) . Además, puede usarse Ta transfección con fosfato de calcio. Véase TROTTER Y WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19) :5667; y Mann y King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501.

Los vectores de expresión de baculovirus contienen habitualmente un. promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier s.ecuencia de ADN que puede unirse a una ARN polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción en el sentido de 3' de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) para dar ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que está situada habitualmente de manera proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción incluye normalmente un sitio de , unión a ARN polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor de baculovirus puede tener también un segundo dominio denominado potenciador que, si está presente, es habitualmente distal respecto al gen estructural. Además, la expresión puede ser o bien regulada o bien constitutiva.

Los genes estructurales, transcritos de manera abundante en momentosi tardíos en el ciclo de infección, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica para la proteína polihedrina viral (FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression en THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986);. documentos EP 0 127 839 y 0 155 476) y el gen que codifica para la proteína 'plO (Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69:765).

El vector de expresión de baculovirus recién formado se empaqueta en un baculovirus recombinante infeccioso y posteriormente pueden purificarse las placas que crecen mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Véase Miller et al, BIOESSAYS (1989) 11(4) :91; SUMMERS Y SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987) .

Se han desarrollado vectores de expresión de baculovirus recombinantes para la infección en varias células de insecto. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes para, entre otros, Aed' es aegypti (n.° de la ATCC CCL-125), Bombyx morí (n.° de la ATCC CRL-8910), Drosophila melanogaster (n.° de la ATCC 1963), Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni. Véanse Wright, NATURE (1986) 321:718; Carbonell et al, J. VIROL. (1985) 56:153; Smith et al., MOL., CELL. BIOL. (1983) 3:2156. Véase de manera general, Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225. Más específicamente, las líneas celulares usadas para sistemas de vector de expresión de baculovirus incluyen comúnmente, pero no se limitan a, Sf9 (Spodoptera frugiperda) (n.° de la ATCC CRL-1711) , Sf21 (Sppdoptera frugiperda) (Invitrogen Corp., n.° de cat. 11497-013 (Car,lsbad> CA) ) , Tri-368 {Trichopulsia ni) y High-Five™ BTI-TN-5B1-4, (Trichopulsia ni).

Están disponibles comercialmente células y medios de cultivo para la lexpresión tanto directa como por fusión de polipéptidos heterólogos en un baculovirus/expresión, y los expertos en la técnica conocen generalmente la tecnología de cultivo celular.

E. coli, especies- de Pseudomonas y otros procariotas. Se conocen bien en la técnica técnicas de expresión bacteriana. Está disponible una amplia variedad de vectores para su uso en huéspedes; bacterianos. Los vectores pueden ser de una única copia o vectoreis de muchas o pocas múltiples copias. Los vectores pueden servir para la clonación y/o expresión. En vista de la amplia bibliografía referente a vectores, la disponibilidad comercial de muchos vectores e incluso manuales que describen vectores y sus mapas de : restricción y características, no se requiere en el presente documento una discusión extensa. Tal como se sabe bien, los vectores normalmente implican marcadores que permiten la selección; marcadores que pueden proporcionar resistencia a agentes citotóxicos, prototrofía o inmunidad. Frecuentemente, está presente una pluralidad de marcadores, que proporcionan diferentes características .

Un , promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN que pueda unirse a ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción en el sentido de- 3' de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) para dar ARNm . Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que está situada habitualmente de manera proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción incluye normalmente un' sitio de unión a ARN polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción-. Un promotor bacteriano también puede tener un segundo dominio denominado operador, que puede solaparse con un sitio de unión a ARN polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de ARN. El operador permite una transcripción regulada negativa (inducible) , de modo que una proteína (r.eprésora de genes puede unirse al operador e inhibir de ese modo , la transcripción de un gen específico. Puede producirse expresión, constitutiva en ausencia de elementos reguladores negativos y tales como el operador. Además, puede lograrse una regulación positiva mediante una secuencia de unión a proteínas activadoras de genes que, si está presente, es habitualmente proximal ,(5') respecto a la secuencia de unión a ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de genes es la proteína activadora de catabolitos (CAP) , que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli [E. coli) [Raibaud et al., ANNU.. REV. GENET . (1984) 18:173]. Por tanto, la expresió'n regulada puede ser o bien positiva o bien negativa, o bien potenciando o bien reduciendo de ese modo la transcripción.

Las secuencias que codifican para enzimas de rutas metabólicas proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. 'Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas >que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al., NATURE (1977) 198:1056], y maltosa. Los ejemplos, adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goeddel et al.} NUC. ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731; la patente estadounidense n.° 4.738.921; las publicaciones EP n.os 036 776 y 121 775. El sistema promotor de ß-galactosidasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes". En Interferon 3 (Ed. I. Gresser) ] , sistemas promotores de bacteriófago lambda PL [Shimatake et al., NATURE (1981) 2'92: 128] y T5 [patente estadounidense n.° 4.689.406 también proporcionan secuencias promotoras útiles. Los métodos preferidos de la presente invención utilizan promotores fuertes, tales como el promotor de T7 para inducir el polipéptido de interés a! altos niveles. Se conocen bien en la técnica ejemplos de tales vectores e incluyen la serie pET29 de Novagen, y los vectores ¡ pPOP descritos en el documento WO99/05297, que se incorpora : como referencia al presente documento. Tales sistemas de expresión \ producen altos niveles de polipéptido en el huésped sin comprometer la viabilidad de la célula huésped ni los parámetros de crecimiento. pET19 (Novagen) es otro vector conocido en la técnica .

Además, promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo,i pueden unirse secuencias de activación de la t transcripción de un promotor bacteriano o de bacteriófago con las secuencias de operón de otro promotor bacteriano o de bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [patente estadounidense n.° 4.551.433, que se incorpora como referencia al presente documento] . Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido compuesto tanto por el promotor trp como por secuencias de operón lac que está regulado por el represor lac [Amann et al., GENE (1983) 25:167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD.. SCI. (1983) 80:21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se producen de manera natural de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unirse a ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. También puede acoplarse un promotor que se produce de manera natural de origen no bacteriano con una ÁRN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión1 de algunos genes en procariotas. El sistema de promotor/ARN polimerasa de bacteriófago T7 es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113;: Tabor et al., Proc Nati. Acad. Sci. (1985) 82:1074]. Además, un promotor híbrido también puede estar compuesto por un promotor de bacteriófago y una región de operador de E. coli (publicación EP n.° 267 851) .

•Además de una secuencia promotora que funciona, un sitio de unión a ribosomas eficaz es también útil para la expresión de genes foráneos en procariotas. En E. coli, el sitio de unión a ribosomas se denomina secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de' iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud ; ubicada 3-11 nucleótidos en el sentido de 5' del codón de I iniciación [Shine et al., NATURE (1975) 254:34]. Se cree que la secuencia SD estimula la unión de ARNm al ribosoma mediante el apareamiento de bases entre la secuencia SD y el extremo 3' del AR r 16S'de E. coli [Steitz et al. "Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA", en Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]. Para expresar genes eucariotas y genes procariotas con un sitio de unión a Ribosomas débil [Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989] .

La ' expresión "huésped bacteriano" o "célula huésped bacteriana" se refiere a una bacteria que puede usarse, o se ha usado, cómo receptor para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. La expresión incluye la progenie de la célula huésped bacteriana original que se ha transíectado . Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente idéntica por completo en morfología o en ADN total o genómico complementario al del progenitor original, debido a una mutación' accidental o deliberada. La progenie de la célula parental1 que es suficientemente similar al progenitor que va a caracterizarse mediante la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia >de nucleótidos que codifica para un polipéptido de interés, ¦ se incluye en la progenie pretendida mediante , esta definición.

Los, expertos habituales en la técnica conocen la selección de bacterias huésped adecuadas para la expresión, de polipéptidos . En la selección de huéspedes bacterianos para la expresión, los huéspedes adecuados pueden incluir los que han · mostrado que tienen, entre otros, buena capacidad de formación de cuerpos de inclusión, baja actividad proteolitica y robustez global. Generalmente, están disponibles huéspedes bacterianos de una variedad de fuentes incluyendo, pero sin limitarse a, el Centro de Reserva Genética Bacteriana, Departamento de Biofísica y Física Médica, Universidad de California (Berkeley, CA) ; y la Colección Americanai de Cultivos Tipo ("ATCC") (Manassas, VA) . La fermentación industrial/farmacéutica usa generalmente bacterias derivadas, de cepas K (por ejemplo W3110) o de bacterias derivadas de cepas ; B (por ejemplo BL21) . Estas cepas son particularmente útiles porque sus parámetros de crecimiento son extremadamente bien conocidos y robustos. Además, estas cepas no son patógenas, lo que es comercialmente importante por motivos de seguridad y medioambientales. Otros ejemplos de huéspedes, de E. coli adecuados i incluyen, pero no se limitan a, cepas de BL21, DH10B o derivados en las mismas. En otra realización de los métodos de la "presente invención, el huésped de E. coli es una cepa deficiente en proteasas incluyendo, pero sin limitarse a, OMP- y LON- . La cepa de célula huésped puede ser una especie de Pseudomonas, incluyendo pero sin limitarse a, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida. Se sabe que Pseudomonas fluorescens biovar 1, designada como cepa MB101, es útil para la producción recombinante y está disponible para procesos de producción de proteínas terapéuticas. Los ejemplos de un sistema de expresión de Pseudomonas incluyen los sistemas disponibles de The Dow Chemical Company como cepa huésped (Midland, MI disponible en la World Wide Web en dow.com) . Las patentes estadounidenses n.os 4.755.465 y 4.859.600, que se incorporan como referencia al presente documento, describen el uso de cepas de Pseudomonas como célula huésped para la producción de hGH.

Una 1 vez que se ha establecido una cepa de célula huésped recombinante (es decir, el constructo de expresión se ha introducido en la célula huésped y se aislan células huésped con el constructo de expresión apropiado) , se cultiva la cepa de célula hüésped recombinante en condiciones apropiadas para la producción del polipéptido de interés. Tal como resultará evidente para un experto en la técnica, el método de cultivo de la cepa de i célula huésped recombinante dependerá de la naturaleza del constructo de expresión utilizado y la identidad de la célula huésped. Normalmente, se cultivan cepas huésped recombinantes usando métodos que conocen los expertos habituales en la técnica. Normalmente, se cultivan células huésped recombinantes en medio liquido ¡que contiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas, y, opcionalmente , que contiene vitaminas, aminoácidos, factores de crecimiento y otros complementos de cultivo proteicos conocidos por los expertos habituales en la técnica.' Los medios líquidos para el cultivo de células huésped pueden contener opcionalmente antibióticos o antifúngicos para impedir el crecimiento de microorganismos no deseados y/o compuestos que incluyen, pero no se limitan a, antibióticos para seleccionar células huésped que contienen el vector de expresión.

Están disponibles varios métodos bien conocidos de introducción de ácidos nucleicos diana en células, cualquiera de los cuales puede usarse en la invención. Éstos incluyen: fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, électroporacion, bombardeo con proyectiles e infección con vectores ¡virales (tratados adicionalmente, a continuación), etc. Pueden usarse células bacterianas para amplificar el número de plásmidos que contienen constructos de ADN de esta invención. Se hacen crecer las bacterias hasta fase logarítmica y pueden aislarse : los plásmidos dentro de las bacterias mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook) . Además, hay una gran cantidad de kits comercialmente disponibles para la purificación de plásmidos a partir de bacterias, (véanse, por ejemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; . StrataClean™ de Stratagene, y QIAprep™ de Qiagen) .. Los plásmidos aislados y purificados se manipulan adicionalmente para producir otros plásmidos, se usan para transfectar células o se incorporan en vectores relacionados para ¦ infectar organismos. Los vectores típicos contienen terminadores . de la transcripción y la traducción, secuencias de iniciación de la transcripción y la traducción, y promotores útiles para regulación de la expresión del ácido nucleico diana particular. Los vectores comprenden opcionalmente casetes de expresión genéricos que contienen al menos una secuencia de terminación independiente, secuencias que permiten la replicación del cásete en eucariotas, o procariotas, o ambos, (incluyendo, pero sin limitarse a, vectores lanzadera) y marcadores de selección para sistemas 1 tanto procariotas como eucariotas. Los vectores son adecuados para la replicación e integración en procariotas, eucariotas, o preferiblemente ambos. Véanse, Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al, Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al, Protein Expr. Purif. 6(1):10.14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos citados anteriormente) . Se proporciona un catálogo de bacterias y bacteriófagos útiles para la clonación, por ejemplo, por la ATCC, por ejemplo, The ATCC Catalogue of I Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds) publicado por la !ATCC. También se encuentran procedimientos básicos adicionales para la secuenciación, clonación y otros aspectos de la biología molecular y consideraciones teóricas subyacentes en Watson -et al (1992) Recombinant DNA segunda edición Scientific American Books, NY. Además, esencialmente cualquier ácido nucleico (y prácticamente cualquier ácido nucleico marcado, ya sea convencional o no convencional) puede encargarse de manera convencional o personalizada a cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como Midland Certified Reagent Company i (Midland^ TX disponible en la ' World Wide Web en mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponible en la World t Wide Web ¡en genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponible en la Worldj Wide Web en expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda,1 CA) y muchas otras.

Pueden cultivarse células huésped recombinantes en formatos continuos o discontinuos, con o bien recogida de células (en el caso en! el que el polipéptido de interés se acumula intracelularmente) o bien recogida del sobrenadante de cultivo en formatos o bien continuos o bien discontinuos. Para la producción en células huésped procariotas, se prefieren el cultivo discontinuo y la recogida de células.

CODONES SELECTORES Los codones ' selectores de la invención expanden el armazón de codones genético de la maquinaria de biosíntesis de proteínas. Por i ejemplo, un codón selector incluye, pero no se limita a, un codón I de tres bases único, un codón sin sentido, tal como un codón de terminación, incluyendo, pero sin limitarse a, un codón ámbar (UAG) , un codón ocre, o un- codón ópalo (UGA) , un codón no natural, un codóri de cuatro bases (o más), un codón raro, o similares. Pueden ¦ introducirse en un gen o polinucleótido deseado varios codones selectores, por ejemplo, uno o más, dos o más, tres, o más, etc.

Los1 codones selectores de la invención expanden el armazón de codones genético de la maquinaria de biosintesis de proteínas. Por ejemplo, un codón selector incluye, pero no se limita a, un codón de tres bases único, un codón sin sentido, tal como un codón de terminación, incluyendo, pero sin limitarse a, un codón ámbar (UAG), un codón ocre, o un codón ópalo (UGA), un codón no natural, un codóm de cuatro bases (o más), un codón raro, o similares. Resulta fácilmente evidente para los expertos en la técnica que existe un amplio intervalo en el número de codones selectores que pueden introducirse en un gen o polinucleótido deseado, incluyendo, pero sin limitarse a, uno o más, dos o más, tres o más, 4, 5, 6, 7, 8,' 9, 10 o más en un polinucleótido individual que codifica para el antígeno o el organismo completo, siendo ejemplos 1 no limitativos de organismos completos modificados genéticamente usando la presente invención, MAP y E. coli.

En una realización, los métodos implican el uso de un codón selector que es un codón de terminación para la incorporación de un aminoácido seleccionado, por ejemplo, un aminoácido no natural, in vivo. Por ejemplo, se produce un O-ARNt que reconoce el codón de terminación y se aminoacila mediante una ORS con un aminoácido no natural deseado. Este O-ARNt no lo reconocen las aminoacil-ARNt sintetasas del huésped que se producen de manera natural. Puede usarse mutagénesis dirigida al sitio convencional para introducir el codón de terminación en el sitio de interés en un polipéptido de interés. Véase, por ejemplo, Sayers, J.R., et al. (1988), 5'-3' Exonucleases ín phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagénesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802. Cuando la O-RS, el 0- ARNt y el ácido nucleico que codifica para el polipéptido de interés se combinan in vivo, el aminoácido seleccionado se incorpora en respuesta al codón de terminación para dar un polipéptido que contiene el aminoácido seleccionado, por ejemplo, un aminoácido no natural, en la posición especificada. En una realización de la presente invención, un codón de terminación usado como codón selector es. un codón ámbar, UAG, y/o un codón ópalo, UGA. Por ejemplo, véase la SEQ ID NO. : 6 para un ejemplo de un O-ARNt que reconoce un codón ámbar, y véase la SEQ ID NO. : 7 para un ,ejemplo de un O-ARNt que reconoce un codón ópalo. Un código genético en el que UAG y UGA se usan ambos como codón selector puede codificar para 22 aminoácidos mientras se conserva en codón ocre sin sentido, UAA, que es la señal de terminación más abundante 1 La incorporación de aminoácidos seleccionados, por ejemplo, aminoácidos no naturales, in vivo puede realizarse sin alteración significativa de la célula huésped. Por ejemplo en células no eucariota, tales como -Escherichia coli, dado que la eficacia de supresión para el codón UAG depende de la competición entre el 0-ARNt, pór ejemplo, el ARNt supresor ámbar, y el factor de liberación 1 (RF1) (que se une a un codón AUG e inicia la liberación del péptido en crecimiento del ribosoma) , la eficacia de supresión puede modularse mediante, por ejemplo, o bien el aumento (del nivel de expresión de 0-ARNt, por ejemplo, ARNt supresor; o bien usando una cepa deficiente en RF1. En células eucariotas, dado que la eficacia de supresión para el codón UAG depende de la competición entre el 0-ARNt, por ejemplo, el ARNt supresor ámbar, y un factor de liberación eucariota (por ejemplo, eRF) (que se une a un codón de terminación e inicia la liberación del péptido en crecimiento del ribosoma) , la eficacia de supresión puede modularse mediante, por ejemplo, el aumento del nivel de expresión de 0-ARNt, por ejemplo, el ARNt supresor.

Los aminoácidos no naturales también pueden codificarse con i codones raros. Por ejemplo, cuando se reduce la concentración de arginina 'en una reacción de síntesis de proteínas in vitro, el codón de, arginina raro, AGG, ha demostrado ser eficaz para la inserción1 de Ala mediante un ARNt sintético acilado con alanina. Véase, por ejemplo, Ma et al., Biochemistry . 32:7939 (1993) . En este caso, el , ARNt sintético compite con la Arg de ARNt .que se produce dé manera natural, que existe como una especie minoritaria en¦ Escherichia coli. Algunos organismos no usan todos los codones triplete.1 Se ha utilizado un codón AGA no asignado en Micrococcus luteus para la inserción de aminoácidos en un extracto de transcripción/traducción in vitro. Véase, por ejemplo, Kowal y Oliver, , Nucí. Acid. Res., 25:4685 (1997) . Pueden generarse componentes de la presente invención para usar estos codones raros in vivo.

Los! codones selectores también comprenden codones extendidos, por ejemplo, codones de cuatro bases o más, tales como, codones de cuatro, cinco, seis o más bases. Los ejemplos de codones de cuatro bases incluyen, pero no se limitan a, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU y similares Los ejemplos de codones de cinco bases incluyen, pero no se limitan a, AGGAC, GCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC y similares. Una característica de lá invención incluye usar codones extendidos basados en la supresión del desplazamiento del marco de lectura. 1 Codones de cuatro bases o más pueden insertar, por ejemplo, : uno o múltiples aminoácidos seleccionados incluyendo, pero sin, limitarse a, aminoácidos no naturales, en la misma proteína. ' Por ejemplo, en presencia de O-ARNt imitados, por ejemplo, un ARNt supresor del desplazamiento del marco de lectura .. especial,1 con bucles anticodón, por ejemplo, con una secuencia CU(X) n XXXAA (en la que n = 1) , el codón de cuatro bases o más se lee como aminoácido individual. Por ejemplo, véanse las SEQ ID NO: 6, 12 del documento PCT/US04 22061 para los O-ARNt que reconocen un codón, de cuatro bases. En otras realizaciones, los bucles anticodón pueden decodificar, por ejemplo, al menos un codón de cuatro bases, al menos un codón de cinco bases, o al menos un codón dé seis bases o más. Puesto que existen 256 codones de cuatro bases posibles, pueden codificarse múltiples aminoácidos no naturales en la misma célula usando un codón de cuatro bases o más. Véase, Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J.

Mol. Bioí. 307: 755-769. i Por¡ ejemplo, se han usado codones de cuatro bases para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas usando métodos biosintétiicos in vitro. Véanse, por ejemplo, Ma et al., (1993) Biochemis.try, 32:7939; y Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:34. CGGG y AGGU se usaron para incorporar simultáneamente 2-naftilalanina y un derivado de NBD de lisina en estreptavidina in vitro con dos ARNt supresores del desplazamiento del marco de lectura acilados químicamente. Véase, por ejemplo, Hohsaka ep al., (1999) J.! Am. Chem. Soc, 121:12194. En un estudio in vivo, Moore et al. examinaron la capacidad de derivados de ARNtLeu con anticodonés NCUA para suprimir codones ÜAGN (N puede ser U, A, G o C) , : y encontraron que el cuadruplete UAGA puede decodificarse mediante un ARNtLeu con un anticodón UCUA con una eficacia del 13 al 26% con poca decodificación en el marco 0 ó -1. Véase, Moore et al., (2000) J, Mol. Biol., 298:195. En una realización, pueden usarse codones extendidos basados en codones raros o codones sin sentido en la presente invención, que pueden reducir la lectura en sentido erróneo y la supresión del desplazamiento del marco de lectura en otros sitios no deseados.

Para, un sistema dado, un codón selector también puede incluir uno de los codones de tres bases naturales, en los que el sistema endógeno no usa (o usa rara vez) el codón de bases natural. Por ejemplo, ' esto incluye un sistema que carece de un ARNt que reconoce el codón de tres bases natural, y/o un sistema en el que el codón >de tres bases es un codón raro.

Los codones selectores incluyen opcionalmente pares de bases no naturales. Estos pares de bases no naturales expanden adicionalmente el alfabeto genético existente. Un par de bases extra aumenta el número, de codones triplete de 64 a 125. Las propiedades de los terceros pares de bases incluyen apareamiento de bases estable y selectivo, incorporación enzimática eficaz en ADN con alta fidelidad mediante una polimerasa, y la extensión por cebadores^ continuada eficaz tras la síntesis del par de bases no natural naciente. Las descripciones de pares de bases no naturales que pueden adaptarse para los métodos y las composiciones incluyen,, por ejemplo, Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for ' incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20: 177-182. Véase, también, Wu, Y., et al., (2002) L Ani. Chem. Soc. 124:14626-14630. A continuación se indican otras publicaciones relevantes.

Para la utilización in vivo, el nucleósido no natural es permeable en membrana y se fosforila para formar el trifosfato correspondiente. Además, .la información genética aumentada es estable 'y no se destruye por enzimas celulares. Los esfuerzos previos de Benner y otros se aprovechaban de patrones de puentes de hidrógeno que son diferentes de los que se encuentran en pares de Watson-Crick canónicos, cuyo ejemplo más notable es el par iso-C:iso-G. ^éanse, por ejemplo, Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:8322; y Piccirilli et al.; (1990) Nature, 343:33; Kool, (2000) Cttrr. Opin, Chem. Biol., 4:602. Estas bases en general se aparean erróneamente en cierto grado con bases naturales y no pueden replicarse enzimáticamente . Kool y colaboradores demostraron que las interacciones de empaquetamiento hidrófobas entre bases pueden sustituir los puentes de · hidrógeno para impulsar lia formación del par de bases. Véase, Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; y Guckian y Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl . , 36, 2825. En un esfuerzo por desarrollar un par de bases no natural que satisficiera todos los requisitos anteriores, Schultz, Romesberg y colaboradores han sintetizado sistemáticamente y estudiado una serie de bases hidrófobas no naturales!. Se encuentra que un autopar PICS:PICS es más estable que los pares de bases naturales, y puede incorporarse eficazmente en ADN mediante el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I de Escherichia coli (KF) . Véanse, por ejemplo, McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:11585-6; y Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem.

Soc, 122': 3274. Puede sintetizarse un auto par 3MN:3MN mediante KF con eficacia y selectividad suficientes para la función biológica. Véase, por ejemplo, Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803: Sin embargo, ambas bases actúan como un terminador de cadena para la replicación adicional. Recientemente se ha desarrollado una ADN polimerasa mutante que puede usarse, para replicar el autopar de PICS .. Además, puede replicarse un autopar de 7AI . Véase, por ejemplo, Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439.' También se ha desarrollado un par de metalobases novedoso,; Dipic:Py, que forma un par estable con la unión de Cu(II). Véase, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem, Soc, 122:10714. Dado que los codones extendidos y los codones no naturales son intrínsecamente ortogonales a los codones naturales, los métodos de la invención pueden aprovecharse de esta propiedad para generar ARNt ortogonales para los mismos.

También puede usarse un sistema para sortear la traducción para incorporar un aminoácido seleccionado, por ejemplo, un aminoácido no natural, en un polipéptido deseado. En un sistema para sort!ear la traducción, se incorpora una secuencia grande en un gen pero no se traduce en proteína. La secuencia contiene una estructura que sirve como impulso para inducir que el ribosoma se salte la secuencia y reanude la traducción en sentido 3' de la inserción.

AMINOÁCIDOS SELECCIONADOS Y NO NATURALES Tal como se usa en el presente documento, un aminoácido seleccionado se refiere a cualquier aminoácido que se produce de manera natural o aminoácido no natural deseado. Un aminoácido que se produce de manera natural incluye uno cualquiera de los veinte alfa-aminoácidos codificados genéticamente: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, I glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, ' treonina, triptófano, tirosina, valina. ¦ En una realización, el aminoácido seleccionado se incorpora en una cadena de polipéptido en crecimiento con alta fidelidad, por ejemplo, a una eficacia mayor de aproximadamente el 70% para un codón selector dado, a una eficacia mayor del 75% para un codón selector dado, a una- eficacia mayor de aproximadamente el 80% para un codón selector dado, a una eficacia mayor de aproximadamente el 85% para un codón selector dado, a una eficacia mayor, de aproximadamente el 90% para un codón selector dado, a una eficacia ,mayor de aproximadamente el 95% para un codón selector dado, o a una eficacia mayor de aproximadamente el 99% o más para un codón selector dado.

Tal 'como se usa en el presente documento, un aminoácido no i natural se refiere a cualquier aminoácido, aminoácido modificado, o análogo: de aminoácido distinto de selenocisteina y/o pirrolisina y los siguientes veinte alfa-aminoácidos codificados genéticamente: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, - treonina, triptófano, tirosina, valina. La estructura genérica ' de un alfa-aminoácido se ilustra mediante la fórmula I: Un aminoácido no natural es normalmente cualquier estructura que tiene la fórmula I en la que el grupo R es cualquier sustituyente distinto de uno usado en los veinte aminoácidos naturales. Véase, por ejemplo, Biochemistry por L. Stryer, 3a ed. 1988, Freeman and Company, Nueva York, para estructuras de los veinte aminoácidos naturales. Obsérvese que. los aminoácidos no ¦ naturales! de la presente invención pueden ser compuestos que se producen de manera natural distintos de los veinte alfa- aminoácidps anteriores.

Debido a que los aminoácidos no naturales de la presente invención¡ difieren normalmente de los aminoácidos naturales sólo en la estructura de la cadena lateral, los aminoácidos no naturales1 forman enlaces amida con otros aminoácidos, incluyendo pero sin limitarse a, naturales o no naturales, de la misma manera que se forman en proteínas que se producen de manera natural. Sin embargo, los aminoácidos no naturales tienen grupos de cadena lateral que los distinguen de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R en la fórmula I puede comprender un alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, · tiol, seleno, sulfonilo, borato, boronato; fosfo, fosfono, fosfina, heterociclico, enona, imina, aldehído> éster, tioácido, hidroxilamina, amina, y similares, o cualquier combinación de los mismos. Otros aminoácidos que no se producen1 de manera natural incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos que comprenden un agente de reticulación fotoactivable, aminoácidos con marcador de espin, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos que se unen a metales, aminoácidos que contienen metales, aminoácidos radiactivos, aminoácidos con grupos funcionales novedosos, aminoácidos que interaccionan de forma, covalente o no covalente con otras moléculas, aminoácidos I fotoenj aulados y/o fotoisomerizables, aminoácidos que comprenden biotina ó un análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tales como una serina sustituida con azúcar, otros aminoácidos modificados con hidratos de carbono, aminoácidos que contienen ceto, aminoácidos que comprenden polietilenglicol o poliéter, aminoácidos sustituidos con átomos pesados, aminoácidos escindibles químicamente y/o fotoescindibles, aminoácidos con una cadena lateral alargada en comparación con los aminoácidos naturales^ incluyendo, pero sin limitarse a, poliéteres o hidrocarburos de cadena larga, incluyendo, pero sin limitarse a, más de aproximadamente 5 o más de aproximadamente 10 carbonos, aminoácidos que contienen azúcar unidos a carbono^ aminoácidos activos redox, aminoácidos que contiene aminotioácido, y aminoácidos que comprenden uno o más restos tóxicos. Véanse, también, , las publicaciones de solicitud de patente estadounidense 2003/0082575 y 2003/0108885, que se incorporan como referencia al presente documento. Los aminoácidos no naturales pueden tener un agente de reticulación fotoactiyable que se usa, por ejemplo, para unir una proteina a un soporte sólido. Los aminoácidos no naturales pueden tener un resto de sacárido unido a la cadena lateral de aminoácido.

Además de los . aminoácidos no naturales que contienen cadenas laterales novedosas, los aminoácidos no naturales también comprenden opcionalmente estructuras principales modificadas, por ejemplo, ¡según se ilustra mediante las estructuras de fórmula II y III : II III en las qué Z comprende normalmente OH, NH2, SH, NH-R' , o S-R' ; X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, normalmente comprenden S u O, y R y R' , que son opcionalmente iguales o diferentes, se seleccionan normalmente de la misma lista de constituyentes para el grupo R descrito anteriormente para los aminoácidos no naturales que tienen fórmula I así como hidrógeno. Por ejemplo, los aminoácidos no naturales pueden comprender sustituciones en el grupo amino o carboxilo según se ilustra mediante las fórmulas II y III. Los aminoácidos no naturales de este tipo incluyen, pero no i se limitan a, a-hidroxiácidos, a-tioácidos, oc-aminotiocarboxilatos, incluyendo, por ejemplo, con cadenas laterales correspondientes a los veinte aminoácidos naturales comunes 1 o cadenas laterales no naturales. Además, las sustituciones .en el carbono a incluyen opcionalmente aminoácidos L, D, o a-a-disustituidos tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, y similares. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos, tales como análogos de prolina así como análogos de prolina de anillos de 3, 4, 1 6, 7, 8 y 9 miembros, ß y ?-aminoácidos tales como ß-alanina sustituida y ácido ?-aminobutírico .

Muchos aminoácidos no naturales se basan en aminoácidos naturales, tales como tirosina, glutamina, fenilalanina, y similares. Los análogos de tirosina incluyen tirosinas para-sustituidas, tirosinas orto-sustituidas y tirosinas meta-sustituidas, en las que la tirosina sustituida comprende un grupo ceto (incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo acetilo) , un grupo benzoílo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxilo, un grupo isopropilo, un grupo metilo, 'un hidrocarburo. C6-C2o de cadena lineal o ramificado, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter un grupo nitro, o similares. Además, también se contemplan anillos de arilo sustituidos de forma múltiple. Los análogos1 de glutamina incluyen,' pero no se limitan a, -hidroxiderivados, derivados ?-sustituidos, derivados cíclicos, y derivados de glutamina sustituidos con amida. Los análogos de fenilalaniná a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, fenilalaninas para-sustituidas, fenilalaninas orto-sustituidas y fenilalaninas meta-sustituidas, en las que el sustituyente comprende un grupo hidroxilo, un grupo metoxilo, un grupo metilo, un grupo ;alilo, un aldehido, un azido, un yodo, un bromo, un grupo ceto (incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo acetilo) , o similares:. Los ejemplos específicos de aminoácidos no naturales incluyen,- pero no se limitan a, una p-acetil-L-fenilalanina, una p-propargil-fenilalanina, una O-metil-L-tirosina, una L-3-(2-naftil ) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una 0-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcP-serina, una L-Dopa, n fenilalaniná fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L^fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una •p-amiho-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina y una p-propargiloxi-fenilalanina, y similares. Se proporcionan ejemplos de estructuras de una variedad de aminoácidos no naturales en, por .ejemplo, : el documento WO 2002/085923 titulado "In vivo incorporation of non-natural amino acids", que se incorpora como referencia al presente documento. Véase también Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoseléctive modification by the Staudinger ligat.ion, PNAS 99:19-24, que se incorpora como referencia al presente documento, para análogos de metionina adicionales.

Un aminoácido no natural incorporado en un polipéptido en el extremo amino terminal puede componerse de un grupo R que es cualquier sustituyente distinto de uno usado en los veinte aminoácidos naturales y un 2° grupo reactivo diferente del grupo NH2 presente normalmente en a-aminoácidos (véase la fórmula I) . Un aminoácidp no natural similar puede incorporarse en el extremo carboxiloi terminal con un 2o grupo reactivo diferente del grupo COOH presente normalmente en a-aminoácidos (véase la fórmula I) .

Los ( aminoácidos no naturales de la invención pueden seleccionarse o diseñarse para proporcionar características adicionales no disponibles en los veinte aminoácidos naturales. Por ejemplo, el aminoácido no natural puede diseñarse o seleccionarse opcionalmente para modificar las propiedades biológicas de una proteína, por ejemplo, en la que se incorporan. Por ejemplo, pueden modificarse opcionalmente las siguientes propiedades mediante la inclusión de un aminoácido no natural en una proteína: toxicidad, biodistribución, solubilidad, estabilidad, por ejemplo, térmica, hidrolitica, oxidativa, resistencia a la degradación enzimática, y similares, facilidad de purificación y procesamiento, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas , propiedades químicas y/o I fotoquímicas, actividad catalítica, potencial redox, semivida, capacidad para reaccionar con otras moléculas, por ejemplo, de forma covalente o no covalente, y similares.

Las estructuras de una variedad de aminoácidos no naturales se proporcionan, por ejemplo, en las figuras 16, 17, 18, 19, 26 y 29 del documento WO 2002/085923 titulado "In vivo incorporation of unnatural amino acids", que se incorpora como referencia al presente 'documento. Los ejemplos no pretenden limitar de ningún Í modo los aminoácidos que pueden unirse a un ARNt de la presente invención.

Una [ ventaja de un aminoácido no natural es que ^presenta restos químicos adicionales que pueden usarse para añadir moléculas adicionales. Esas modificaciones pueden realizarse in vivo en una célula eucariota o no eucariota, o in vitro. Por tanto, en determinadas realizaciones, la modificación postraduccional es a través del aminoácido no natural. Un aminoácido no natural en un polipéptido puede usarse para unir I otra molécula al polipéptido, incluyendo pero sin limitarse a, un marcador, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietilenglicol, un agente de fotorreticulación, un radionúclido, un compuesto citotóxico, un fármaco, un marcador de afinidad, un marcador de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelante de metales, un cofactor, un ácido graso, un hidrato de carbono, un polinucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido antisentido, un sacérido, un dendrimero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido ribonucleico inhibidor, un biomaterial, una nanopartícula, un marcador de espín, un fluoróforo, un resto que contiene metal, un resto radiactivo, un grupo funcional novedoso, un grupo que interacciona de forma covalente o no covalente con otras moléculas, un resto fótoenjaulado, un resto excitable mediante radiación actinica, un resto fotoisomerizable , biotina, un i derivado de biotina, un análogo de 'biotina, un resto que incorpora un átomo! pesado, un grupo escindible químicamente, un grupo fotoescindible, una cadena lateral alargada, un azúcar unido a carbono, ; un agente activo redox, un aminotioácido, un resto tóxico, un resto marcado isotópicamente, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminiscente, un grupo electrodenso, un grupo magnético, un grupo de intercalación, un cromóforoj un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, un marcador detectable, una molécula pequeña, un punto cuántico, un nanotransmisor , o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o sustancia 1 deseable, comprendiendo un segundo grupo reactivo frente a al menos un aminoácido no natural que comprende un primer grupo reactivo utilizando · metodología química que un experto habitual en la técnica sabe que es adecuada para los grupos reactivos particulares. 1 Por' ejemplo, la modificación postraduccional puede ser a través de una reacción nucleófilo-electrófilo . La mayoría de las reaccionés usadas actualmente para la modificación selectiva de í proteínas implican la formación de enlaces covalentes entre homólogos de reacción nucleófilos y electrófilos , incluyendo, pero sin limitarse a, la reacción de a-halocetonas con cadenas I laterales de histidina o cisteína. La selectividad en estos casos viene determinada por el número y la accesibilidad de los residuos nucleófilos en la proteína. En las proteínas de la invención, pueden usarse otras reacciones más selectivas tales la reacción de un cetoaminoácido no natural con hidrazidas o compuestos de aminooxilo, in vitro e in vivo. Véase, por ejemplo, Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc, 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:902-6-9027; Chin, et ,al., (2002) Proc. Nati. Acad. Sci . , 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Nati. Acad. Sci., 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:6735-6746; y, Chin, et al., (2003) Science, 301:964-7, todos los cuales se incorporan como referencia al presente documento. Esto permite el mareaje selectivo de prácticamente cualquier proteína con una multitud de reactivos incluyendo fluoróforos, agentes de reticulación, derivados de sacárido 1 y moléculas citotóxicas. Véase también, la patente • estadounidense n.° 6.927.042 titulada "Glycoprotein synthesis", que se incorpora como referencia al presente documento. También pueden realizarse modificaciones postraduccionales, incluyendo pero sin limitarse a, a través de un aminoácido azido, mediante la ligadura de Staudinger (incluyendo pero siñ limitarse a, reactivos de triarilfosfina) . Véase, por ejemplo, Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoseléctive modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24.' Síntesis química de aminoácidos no naturales Muchos aminoácidos no naturales están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.), Novabiochem (una división de EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania), o Peptech (Burlington, MA, EE.UU.) . Los que no están I disponibles comercialmente se sintetizan opcionalmente tal como se proporciona en el presente documento o usando métodos habituales conocidos por los expertos en la técnica. Para las técnicas de síntesis : orgánica, véanse, por ejemplo, Organic Chemistry de Fessendon y Fessendon, (1982, segunda edición, Willard Grant Press, Boston Mass); Advanced Organic Chemistry de March (tercera edición, 1985, Wiley and Sons, Nueva York) ; y Advanced Organic Chemistry' de Carey y Sundberg (tercera edición, Partes A y B, 1990, Plenum Press, Nueva York) . Publicaciones adicionales que describen la síntesis aminoácidos no naturales incluyen, por ejemplo, > el documento WO 2002/085923 titulado "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"; Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A I New Synthesis of Glutamine and of ?-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates . J. Chem. Soc, 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model i Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752'; Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the' Enantiomérs of 7-Chloro-4 [ [4- (diethylamino) -1-methylbut l] amino] quinoline (Chloroquine) . J. Org. Chem. 53, 1167- 1170; Azoulay, M. , Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine i analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201- 5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues,. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985;) Synthesis of . Optically Puré Pipecolates from L-As'paraginé. Application to the Total Synthesis of ( + ) -Ápovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. v.

Org. Chem'. 50:1239-1246; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel alfa-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- y D-alfa-Amino-Adipic Acids, L-alfa-aminopimelic i Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308; y, ¡ Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Véase también la publicación de patente estadounidense n.° US 2004/0198637 titulada "Protein Arrays", que se incorpora como referencia.

Captación celular de aminoácidos no naturales La captación de aminoácidos no naturales por una célula eucariota es una cuestión que se considera normalmente cuando se diseñan y seleccionan aminoácidos no naturales, por ejemplo, para su incorporación en una proteina. Por ejemplo, la alta densidad de carga de1 los a-aminoácidos sugiere que es improbable que estos compuesto's sean permeables a las células. Los aminoácidos naturales1 se captan en la célula por medio de una colección de sistemas ¡de transporte basados en proteínas. Puede realizarse un examen rápido que evalúe qué aminoácidos no naturales, si alguno, se captan por las células. Véanse, por ejemplo, los ensayos de toxicidad; en; por ejemplo, la publicación ' de patente estadounidense n.° "Protein Arrays", que se incorpora como referencia al presente documento, y Liu, D. . & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code . PNAS United States 96:4780-4785. Aunque la captación se analiza fácilmente con diversos ensayos, una alternativa al diseño de aminoácidos no naturales que son adecuados para rutas de captación celular es proporcionar rutas biosintéticas para crear aminoácidos in vivo.

Biosíntesis de aminoácidos no naturales Ya existen muchas rutas biosintéticas en células para la i producción de aminoácidos y otros compuestos. Aunque puede no existir én la naturaleza un método biosintético para un aminoácido particular no natural, incluyendo, pero sin limitarse a, en una célula, la invención proporciona tales métodos. Por ejemplo, se generan ¡opcionalmente rutas biosintéticas para aminoácidos no naturales en células huésped mediante la adición de nuevas enzimas o la modificación de rutas de células huésped existentes. Nuevas enzimas adicionales son opcionalmente enzimas que se producen de manera natural o enzimas desarrolladas artificialmente. Por ejemplo, la biosintesis de p-aminofenilalanina ¦ (tal como se presenta en un ejemplo en el documento WO 2002/085923 titulado "In vivo incorporation of unnatural amino acids") se basa en la adición de una combinación de enzimas conocidas a partir de otros organismos . Los genes para estas enzimas pueden introducirse en una célula mediante transformación de la célula con un plásmido que comprende los genes. Los genes, cuando se expresan en la célula, proporcionan una ruta enzimática para sintetizar el compuesto1 deseado. Se facilitan ejemplos de los tipos de enzimas que se añaden opcionalmente en los ejemplos a continuación. Se encuentran secuencias de enzimas adicionales, por ejemplo, en I Genbank. Las enzimas desarrolladas artificialmente también se añaden opcionalmente en una célula de la misma manera. De esta manera, se manipulan la maquinaria celular y los recursos de una célula para producir aminoácidos no naturales.

Una variedad de métodos están disponibles para producir enzimas novedosas para su uso en rutas bios.intéticas o para el desarrollo de rutas existentes. Por ejemplo, la recombinación i recursivá, por ejemplo, según se desarrolla por Maxygen, Inc. (disponible en la World Wide Web en www.maxygen.com), se usa opcionalmente para desarrollar rutas y enzimas y novedosas. Véanse, por ejemplo, Stemmer (1994) , Rapid evolution of a protein in vitro: by DNA shuffling, Nature 370 (4) : 389-391; y, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. , 91:10747-10751. De manera similar DesignPath™, desarrollíado por Genencor (disponible en la World Wide Web en genencor . pom) se usa opcionalmente para la ingeniería genética de rutas metabólicas , por ejemplo, para modificar mediante ingeniería' genética ^ una ruta para crear O-metil-L-tirosina en una célula.

Esta tecnología reconstruye rutas existentes en organismos huésped usando una combinación de nuevos genes, incluyendo, pero sin limitarse a, los identificados a través de genómica funcional, y desarrollo y diseño moleculares. Diversa Corporation (disponible en la World Wide Web en diversa.com). también proporciona tecnología para examinar rápidamente bibliotecas de genes y rutas génicas, 'incluyendo, pero sin limitarse a, para crear nuevas rutas.

Normalmente, el aminoácido no natural producido con una ruta biosintética modificada por ingeniería genética de la presente invención se produce en una concentración suficiente para la biosintesis eficaz de proteínas, por ejemplo, una cantidad celular natural, pero no hasta un grado tal que afecte a la concentración de los otros aminoácidos o agote los recursos celulares. Las concentraciones típicas producidas in vivo de esta manera son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0,05 mM. Una vez que se transforma una célula con un plásmido que comprende los genes usados para producir enzimas deseadas para una ruta específica y se genera un aminoácido no natural, se usan opcionalmente selecciones in vivo para optimizar adicionalmente la producción i del aminoácido no natural tanto para la síntesis ribosómica de proteínas como para el crecimiento celular.

SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO Y DE POLIPÉPTIDO Y VARIANTES Tal como se describió anteriormente y a continuación, la invención; proporciona secuencias de polinucleótido de ácido nucleico ¡y secuencias de aminoácidos de polipéptido, por ejemplo, ARNt y RS, y, por ejemplo, composiciones y métodos · que comprenden dichas secuencias. Ejemplos de dichas secuencias, por ejemplo, ARNt y RS1 se dan a conocer en el presente documento. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que la invención no se limita a las secuencias dadas a conocer en el presente documento, por ejemplo, los ejemplos. Un experto apreciará que la invención también 1 proporciona muchas secuencias relacionadas y no relacionadas con las funciones descritas en el presente documento, por ejemplo, que codifican para un O-ARNt o una O-RS .

La i invención proporciona polipéptidos (O-RS) y polinucleótidos , por ejemplo, O-ARNt, polinucleótidos que co.difican para O-RS o partes de los mismos, oligonucleótidos usados para aislar clones de aminoacil-ARNt sintetasa, etc. Los polinucleótidos de la presente invención incluyen los que codifican para proteínas o polipéptidos de interés de la presente invención con uno o más codones selectores. Además, los polinucléótidos de la presente invención incluyen, por ejemplo, un polinucle'ótido que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se expone en una cualquiera de la SEQ ID NO.: 1, 2, 3; un polinucle'ótido que es complementario a, o una variación conservativa de la misma. De manera similar, un ácido nucleico que híbrida ' con un polinucleótido indicado anteriormente en condiciones altamente rigurosas sustancialmente por toda la longitud ;del ácido nucleico es un polinucleótido de la presente invención1.

En determinadas realizaciones, un vector (por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un fago, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo, un . polinucleótido conjugado, etc.) comprende' un polinucleótido de la presente invención. En una realización, el vector es un vector de expresión. En otra realización, el vector de expresión incluye un promotor operativamente unido a uno o más de los polinucleótidos de la presente > invención . En otra realización, una célula comprende un vector que incluye un polinucleótido de la presente invención.

Un experto también apreciará que muchas variantes de las secuencias dadas a conocer están incluidas en la invención. Por ejemplo, 'se incluyen en la invención variaciones conservativas de las secuencias dadas a conocer que proporcionan una secuencia funcionalmente idéntica. Variantes de las secuencias de polinucléótido de ácido nucleico, en las que las variantes se hibridan ¡con al 'menos una secuencia dada a conocer, se consideran incluidas! en la invención. Subsecuencias únicas de las secuencias dadas a conocer en el presente documento, tal como se determina mediante, por ejemplo, técnicas de comparación de secuencias convencionales, también se incluyen en la invención.

Variaciones conservativas Debido a la degeneración del código genético, las "sustituciones silenciosas" (es decir, sustituciones en una secuencia' de ácido nucleico no dan como resultado una alteración en un polipéptido codificado) son una característica implicada de cada secuencia de ácido nucleico que codifica para un aminoácido.

De manera similar, las "sustituciones conservativas de i aminoácido", en uno o algunos aminoácidos en una secuencia de aminoácidos se sustituyen por aminoácidos diferentes con I propiedadés altamente similares, también se identifica fácilmente que son 'altamente similares al constructo dado a conocer. Tales variaciones conservativas de cada secuencia dada a conocer son una característica de la presente invención.

"Variaciones conservativas" de una secuencia de ácido nucleico . particular se refiere a aquellos ácidos nucleicos que i codifican para secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmenté • idénticas, o, cuando el ácido nucleico no codifica para una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Un experto 'habitual¦ en la técnica reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o delecionan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada son "variaciones modificadas de manera conservativa" o "variantes modificadas de manera conservativa" cuando las alteraciones dan como resultado la deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido, o la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. , Por tanto, las "variaciones conservativas" de una secuencia; de polipéptido indicada de la presente invención incluyen ' sustituciones de un pequeño porcentaje, normalmente inferior al 5%, más normalmente inferior al 4%, 2% o el 1%, de los aminoácidos de la secuencia de polipéptido, con un aminoácido seleccionado de manera conservativa del mismo grupo de sustituciones conservativas. La adición de secuencias que no alteran lá actividad codificada de una molécula de ácido nucleico, tal como la adición de una secuencia no funcional, es una variación¦ conservativa del ácido nucleico básico.

Los expertos habituales en la técnica conocen tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Los ocho grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas unos de otros 1) Alanina (A) , glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), leucina (L) , metionina (M) , valina (V) ; 6) Fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano (W) ; i 7) Serina (S) , treonina (T) ; y 8) Cisteina (C) , metionina (M) (véase, ppr ejemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co . ; 2a edición (diciembre de 1993) .

I Hibridación de ácidos nucleicos Puede usarse hibridación comparativa para identificar ácidos nucleicos de la presente invención, tales como la SEQ ID NO. : 1- I 3, incluyendo variaciones conservativas de ácidos nucleicos de la presente invención, y este método de hibridación comparativa es un método preferido para distinguir ácidos nucleicos de la presente invención! Además, ácidos nucleicos diana que se hibridan con los ácidos nucleicos representados por las SEQ ID NO: 1-3 en condiciones de alta, ultra-alta y/o ultra-ultra-alta rigurosidad son- una característica de la presente invención. Ejemplos de tales i ácidos nucleicos incluyen aquéllos con una o algunas sustituciones de ácido nucleico silenciosas o conservativas en comparación con una secuéncia de ácido nucleico dada.

Se dice que un ácido nucleico de prueba se híbrida específicamente con un ácido nucleico de sonda cuando se híbrida al menos la mitad de bien con la sonda que con la diana complementaria perfectamente apareada, es decir, con una razón de señal con respecto a ruido al menos la mitad de alta que la hibridación de la sonda con la diana en condiciones en las que la sonda perfectamente apareada se une a la diana complementaria perfectamente apareada con una razón de señal con respecto a ruido que es al menos aproximadamente 5x-10x tan alta como la observada para la hibridación con cualquiera de los ácidos nucleicos diana no apareados.

Los . ácidos nucleicos "se hibridan" cuando se asocian, normalmente en disolución. Los ácidos nucleicos se hibridan debido a una variedad de fuerzas fisicoquímicas bien caracterizadas, tales como enlaces de hidrógeno, exclusión por disolvente, apilamiento de bases y similares. La frase "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a condiciones de baja fuerza iónica y alta temperatura tal como se conoce en la técnica. Normalmente, en condiciones rigurosas una sonda se hibridará con su subsecuencia diana en una mezcla compleja de ácido nucleico (incluyendo, pero( sin limitarse a, ARN o ADN de biblioteca o celular total) pero no se híbrida con otras secuencias en la mezcla compleja. Se encuentra una guía exhaustiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques - in Biochemistry and. Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays", . (Elsevier, Nueva York), así como en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular . Biology (1995). Hames y Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Inglaterra, (Hames y Higgins 1) y Hames y Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Hames y Higgins 2) proporcionan detalles sobre la síntesis, mareaje, detección y cuantificación de ADN y ARN, incluyendo oligonucleótidos . Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5-10°C inferiores al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica dejfinida pH. La Tm es la temperatura (a una fuerza iónica definida, pH, y concentración de ácido nucleico) a la que el 50% de las sondas complementarias a la diana se hibridan con la secuencia; diana en el equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, el 50% de las sondas está ocupado en el equilibrio) . Las condiciones rigurosas pueden ser aquellas en las que la concentración en sal es inferior a aproximadamente ¦ion sodio 1,0 M, normalmente una concentración de ión sodio (u otras sales), de aproximadamente 0,01 a 1,0 M a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (incluyendo, pero sin limitarse a, de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (incluyendo, pero sin limitarse a, más de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para la hibridación selectiva' o especifica, una señal positiva puede ser al menos dos veces lá hibridación de fondo, opcionalmente 10 veces la hibridación de fondo. .Condiciones de hibridación rigurosas a modo de ejemplo pueden ser tal como sigue: formamida al 50%, 5X SSC, y SDS al 1%, incubar a 42°C, o 5X SSC, SDS al 1%, incubar a 65°C, con un lavado con 0,2X SSC, y SDS al 0,1% a 65°C. Tales lavados pueden realizarse durante 5, 15, 30, 60, 120, o más minutos.

Un éjemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residíaos complementarios en un filtro en transferencia de tipo Southern |o Northern es formalina al 50% con 1 mg de heparina a 42 °C, llevándose a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado con 0,2x SSC a- 65°C durante 15 minutos (véase, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a ed. 2001) para una descripción del tampóñ SSC) . Con frecuencia, el lavado de alta rigurosidad va precedido ! de un lavado de baja rigurosidad para eliminar la señal de sonda de fondo. Un ejemplo de lavado de baja rigurosidad es 2x SSC a 40°C durante 15 minutos. En general, una razón de señal con respecto a ruido de 5x (o superior) que la¦ observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación especifica.

Las "condiciones de lavado de hibridación rigurosas" en el contexto de experimentos de hibridación de ácidos nucleicos tales como hibridaciones de tipo Southern y Northern son dependientes de las' .secuencias, y son diferentes en parámetros ambientales diferentes. Secuencias más largas se hibridan específicamente, a temperaturas más altas. Se encuentra una guía exhaustiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993), citado anteriormente, y en Hames y Higgins, 1 y 2, citado anteriormente. Las condiciones de lavado y de hibridación rigurosas pueden determinarse fácilmente de manera empírica para cualquier ácido nucleico de prueba. Por ejemplo, para determinar las condiciones de lavado y de hibridación altamente rigurosas, se aumentan gradualmente las condiciones de lavado y de hibridación (por ejemplo, aumentando la temperatura, reduciendo la concentración en sal, aumentando la concentración de detergente y/o aumentando la concentración de disolventes orgánicos tales como formalina en la hibridación o el lavado) , hasta que se cumple un conjunto seleccionado de criterios. Por ejemplo, las condiciones de lavado y de hibridación se aumentan gradualmente hasta que una sonda se t une a una diana complementaria perfectamente apareada con una razón de \ señal con respecto a ruido que es al menos 5x tan alta como la observada para la hibridación de la sonda con una diana no apareada.

Las condiciones "muy rigurosas" se seleccionan para ser iguales al punto de fusión térmico (TJ para una sonda particular. La Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 5:0% de la secuencia de prueba se híbrida con una sonda perfectamente apareada. Para los fines de la presente invención, • I generalmente, las condiciones de lavado y de hibridación "altamente rigurosas" se seleccionan para ser aproximadamente 5°C inferiorejs a la Tm para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. i Condiciones de lavado y de hibridación de "ultra-alta j rigurosidad" son aquéllas en las que la rigurosidad de las condicionas de lavado y de hibridación se aumenta hasta que la razón de ¡señal con respecto a ruido para la unión de la sonda al ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado es al menos lOx tal alta como la observada para la hibridación con cualquiera de los ácidos nucleicos diana no apareados. Se dice que un ácido nucleico diana que se híbrida con un sonda en tales condiciones, con una razón de señal con respecto a ruido de al menos la mitad que la del ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado, se une a la sonda en condiciones de ultra-alta rigurosidad.

? De manera similar, pueden determinarse niveles incluso más altos de: rigurosidad aumentando gradualmente las condiciones de hibridación y/o de lavado del ensayo de hibridación relevante. Por ejemplo, j aquéllos en los que la rigurosidad de las condiciones de lavado y de hibridación se aumenta hasta que la razón de señal con respecto :a ruido para la unión de la sonda al ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado es al menos 10X, 20X, 50X, 100X o 500X o más tal alta como la observada para la hibridación con cualquiera de los ácidos nucleicos diana no apareados. Se dice que un ácido nucleico diana que se híbrida con una sonda en tales condiciones, con una razón de señal con respecto a ruido de al menos lat mitad que la del ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado, se une a la sonda en condiciones de ultra-ultra-alta rigurosidad. Ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones rigurosas son todavía sustancialmente idénticos si los polipépti&os que codifican son sustancialmente idénticos. Esto sucede, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la máxima degeneración de codones permitida por el "código genético . ; i i Subsecuencias únicas i En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende ' una subsecuencia única en un ácido nucleico seleccionada de las secuencias de los O-ARNt y O-RS dados a conocer en el -presente documento. La subsecuencia única es única en comparación con un ácido nucleico correspondiente a cualquier secuencia de ácido nucleico de O-ARNt o O-RS conocida. La alineación puede realizarse usando, por ejemplo, BLAST ' configurado con los parámetros por defecto. Cualquier subsecuencia única es útil, por ejemplo, 'como sonda para identificar los ácidos nucleicos de la presente ¡invención.

De manera similar, la invención incluye un polipéptido que comprende1, una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado de las secuencias de O-RS dadas a conocer en el presente documento.

En este caso, la subsecuencia única es única en comparación con un polipéptido correspondiente a cualquier secuencia de polipéptido conocida .' La invención también proporciona ácidos nucleicos diana que se hibridan en condiciones rigurosas con un oligonucleótido I codificante único que codifica para una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado de las secuencias de O-RS en las que las subsecuencia . única es única en comparación con un polipéptido i correspondiente a cualquiera de los polipéptidos control (por ejemplo, secuencias originales de partir de las que se derivan sintetasas de la presente invención, por ejemplo, mediante mutación) . Las secuencias únicas se determinan tal como se indicó anteriormente .

Comparación, identidad y homología de secuencias Los términos "idéntico" o "identidad" en porcentaje, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son . iguales o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y se alinean para determinar la correspondencia máxima a lo largo de un intervalo de comparación, o región designada, tal como se ' mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias descrito a continuación (u otros algoritmos disponibles para los ¡expertos habituales en la técnica) o mediante alineación manual e inspección visual.

I La frase "sustancialmente idéntico", en el contexto de dos ácidos nücleicos o polipéptidos (por ejemplo, ADN que codifican para un O-ARNt o. una O-RS, o la secuencia de aminoácidos de una 0-RS) se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen una identidad de residuos de aminoácidos o nucleótidos de al menos aproximadamente el 60%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90-95%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o más, cuando se comparan y alinean para determinar la correspondencia máxima a| lo largo de un intervalo de comparación, o región designada, tal como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias (u otros algoritmos disponibles para los expertos habituales en la técnica) o mediante' alineación manual e inspección visual. Tales secuencias "sustancialmente idénticas" se consideran normalmente que son "homologas", sin referencia a la ascendencia real. Puede existir "identidad sustancial" a lo largo de una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 50 residuos de longitud, una región de al menos aproximadamente 100 residuos, o una región de al menos aproximadamente 150 residuos,1 o a lo largo de la longitud completa de las dos secuencias que van a compararse.

Para la comparación de secuencias y determinación de la homología', ¦ normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y ¡de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se . designan parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Entonces, el algoritmo! de comparación de secuencias calcula la identidad de secuencia en porcentaje para la(s) secuencia (s) de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa designados.

Los expertos habituales en la técnica conocen bien métodos de alineación de secuencias para la comparación. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl . Math. 2: 482c, (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante 'el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., adison, WI), I o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, > Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (1995 suplemento) ) .

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la identidad de secuencia en porcentaje y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST y los algoritmos BLAST 2.0, que se describen i en Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, y Altschul et al. J.! Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para realizar análisis ¡de BLAST está disponible al público mediante el Centro Nacional de Información Biotecnológica disponible en la World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov. Este algoritmo implica identificar en i ' \ primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, ! que o bien coinciden o bien satisfacen cierta puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabra adyacente (Altschul et al., citado anteriormente) . Estos resultados positivos de palabra adyacente iniciales ! actúan como semillas para iniciar búsquedas para hallar HSP más largas que las contengan. Los resultados positivos de palabra se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia mientras pueda aumentarse la puntación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, 1 para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos con apareamiento; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos 1 con apareamiento erróneo; siempre < 0) . Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los resultados positivos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa disminuye la cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa llega a cero o inferior, debido a la. acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como defectos i una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, un limite de corte de 100, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. ;Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como defe'ctos una longitud de palabra ( ) de 3, una esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff ,(1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915) alineaciones (B) de 50, esperanza (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. El algoritmo BLAST se realiza normalmente con el filtro de "baja complejidad" desactivado.

Además de calcular la identidad de secuencia en porcentaje, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)) . Una medida dé similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor suma de probabilidades (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca por azar una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de i aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico puede considerarse similar a una secuencia de referencia si la menor suma de probabilidades en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, inferior a aproximadamente 0,01·, o inferior a aproximadamente 0,001.

Mutagénesis y otras técnicas de biología molecular El polinucleótido y los polipéptidos de la presente invención y usados en la invención pueden manipularse usando técnicas de biología molecular. Una secuencia de nucleótidos puede modificarse convenientemente mediante mutagénesis dirigida al sitio según métodos ¡ convencionales . Alternativamente, la secuencia de nucleótidos puede prepararse mediante síntesis química, incluyendo, pero sin limitarse a, mediante el uso de un sintetizador de oligonucleótidos , en el que se diseñan oligonucleótidos basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado, y preferiblemente seleccionando aquellos codones que están favorecidos en la célula huésped en la que se producirá el polipéptido recorabinante . Por ejemplo, pueden sintetizarse varios pequeños ligonucleótidos que codifican para partes del polipéptido deseado y ensamblarse mediante PCR, ligamiento o reacción en cadena de ligamiento. Véanse, por ejemplo, Barany, et al, Proc. Nati. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991); patente estadounidense 6.521.427 que se incorporan como referencia al presente documento.

Esta invención utiliza técnicas rutinarias en el campo de la genética ¡ recombinante . Textos básicos que dan a conocer los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sam rook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a ed. 2001); riegler,! Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al'., eds., 1994)).

Los 1 textos generales que' describen técnicas de biología moleculan incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc.', San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual (2a Ed) . , Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., i Current protocols, una edición conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementada en 1999) ("Ausubel") ) . Estos textos describen mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros temas relevantes relacionados con, pon ejemplo, la generación de genes o polinucleótidos que incluyen ¡ codones selectores para la producción de proteínas que incluyen aminoácidos seleccionados (por ejemplo, aminoácidos no naturales1) , ARNt ortogonales, sintetasas ortogonales, y pares de los mismo;s.

Se · usan diversos tipos de mutagénesis en la invención para I una variedad de fines, incluyendo, péro sin limitarse a, producir sintetasas o ARNt novedosos, mutar moléculas de ARNt, producir bibliotecas de ARNt, mutar moléculas de RS, producir bibliotecas i de sintetasas, producir codones selectores, insertar codones selectores que codifican para un aminoácido seleccionado en una proteína b un polipéptido de interés. Incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis dirigida al sitio, puntual al azar, recombinación homologa, intercambio de ADN u otros métodos de mutagénesis recursivos, construcción quimérica, mutagénesis usando moldes que contienen; uracilo, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis de ADN modificado por fosforotioato, mutagénesis usando ADN dúplex discontinuo o similares, o cualquier combinación de los mismos. Los métodos adecuados adicionales incluyen reparación de un apareamiento erróneo puntual, mutagénesis usando cepas huésped deficientes en la reparación, restricción-selección y restricción-purificación, mutagénesis de deleción, mutagénesis mediante ¡síntesis génica total, reparación de rotura de doble cadena, y similares. También están incluida la mutagénesis, incluyendo, pero sin limitarse a, que implica constructos quiméricos, en la presente invención. En una realización, la mutagénesis puede estar guiada por información conocida de la molécula que se produce de manera natural o la molécula que se produce de manera natural alterada o mutada, incluyendo, pero sin limitarse' a, secuencia, comparaciones de secuencias, propiedades físicas, estructura secundaria, - terciaria o cuaternaria, estructura cristalina o similares.

Los textos y ejemplos que se encuentran en el presente documento: describen estos procedimientos. Se encuentra información adicionall en las siguientes publicaciones y referencias citadas en las mismas: Ling et al., Approaches to DNA mutagénesis: an overview,' Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucletide-directed random mutagénesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagénesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagénesis, Science 229: 1193-1201 (1985); Cárter, Site-directed Mutagénesis, Biochem J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonücleotide directed mutagénesis, en Nucleic Acis & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M.J. eds . , Springer Verlag, Berlín) .¡(1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagénesis without phenotypic selection, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors ith new! DNA-binding specificities , Science 242:240-245 (1988); Zoller y; Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the productidn of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragmente cloned into M13 vectors, Methods in i Enzymol. 100: 468-500 (1983); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed ¡mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA témplate, Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Tailor et al., The use of phosphorothioate-modified ' DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucí. Acids Res. 13: 8749-876 (1985); Tailor et al, the rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucí. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucí. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., 5' -3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucí. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucí. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al., The gapped dúplex DNA ¦ approach to oligonucleotide-directed mutation construcción, Nucí. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped dúplex DNA, Methods in Enzymol . 154:350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucí. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped dúplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucí. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Different base/base1 mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coli, Cell 38:879-887 (1984); Cárter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucí. Acids Res. 13: 4431-4443 (198.5) ; Cárter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to genérate large deletions, Nucí. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans . R. Soc. Lond. A' 317: 415-423 (,1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984) ; Sakamar y Khorana, Total synthesis and expression of a gene for , the alfa-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin) , Nucí. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988).; Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstróm et al., Oligonucleotide-directed mutagenesiis by microscale xshot-gun' gene synthesis, Nucí. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-stjrand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Nati-. Acad. Sci. USA, 83:7177-71181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinión in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, ét al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); W. P. C.

Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); y, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acis Res-. 23, 3067-8 (1995). Pueden encontrarse detalles adicionales de muchos de los métodos anteriores en ethods in Enzymology Volumen 154, que también describe controles útiles para resolver los problemas de diversos métodos de mutagénesis.

Oligonucleótidos , por ejemplo, para su uso en mutagénesis de la presente invención, por ejemplo, mutando bibliotecas de sintetasas, o alterando ARNt, normalmente se sintetizan químicamente según el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts . 22 (20) : 1859-1862, (1981) por ejemplo, usando un sintetizador automatizado, tal como se describe en Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984) .

Además, esencialmente cualquier ácido nucleico puede encargarse de manera convencional o personalizada a una variedad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company : (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (www.genco.com), ExpressGen Inc. (www.expressgen.com)., Operon Technologies Inc. (Alameda, Calif.) y muchas otras.

La invención también se refiere a células huésped eucariotas, células huésped no eucariotas, y organismos para la incorporación in vivo de un aminoácido no natural por medio de pares de ARNt/RS ortogonales.. Las células huésped se modifican mediante ingeniería genética (incluyendo, pero sin limitarse a, transformar, i transducir o transfectar) con los polinucleótidos de la presente invención, o constructos que incluyen un polinucleótido de la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse a, un vector de la presente invención, que puede ser, por ejemplo, un vector de clonación, o un vector de expresión. Por ejemplo, las regiones codificantes para el ARNt ortogonal, la ARNt sintetasa ortogonal y la proteina que va a derivatizarse están operativamente unidas a elementos de control de la expresión génica que son funcionales en la célula' huésped deseada. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, un cósmido, un fago, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos mediante métodos habituales incluyendo electroporación (Fromm et al., Proc, Nati. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), infección mediante vectores virales, penetración balística de alta velocidad mediante pequeñas partículas con el ácido nucleico o bien dentro de la matriz de pequeñas perlas o partículas, o bien en la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)), y/o similares.

Están disponibles varios métodos bien conocidos der introducción de ácidos nucleicos diana en células, cualquiera de los cuales puede usarse en la invención. Éstos incluyen: fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, electroporacion, bombardeo con proyectiles e infección con vectores virales (tratados adicionalmente, a continuación), etc. i Pueden usarse células bacterianas para amplificar el número de plásmidosi que contienen constructos de ADN de esta invención. Se I hacen crecer las bacterias hasta fase logarítmica y pueden aislarse | los plásmidos dentro de las bacterias mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook)!. Además, hay una gran cantidad de kits comercialmente disponibles para la purificación de plásmidos a partir de bacterias!, (véanse, por ejemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™ de Stratagene, y QIAprep™ de Qiagen) . ¡ Los plásmidos aislados y purificados se manipulan entonces adicionalmente para producir ' otros plásmidos, se usan para tran'sfectar células o se incorporan en vectores relacionados para infectar organismos. Los vectores típicos contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de iniciación de la transcripción y la traducción, ·. y promotores útiles para regulación de la expresión del ácido nucleico diana particular. Los vectores comprenden o'pcionalmente casetes de expresión genéricos que contienen al menos una secuencia de i terminación independiente, secuencias que permiten la replicación del cásete en eucariotas, o procariotas, o ambos, (incluyendo, pero sin limitarse a, vectores lanzadera) y marcadores de selección para sistemas tanto procariotas .como eucariotas. Los vectores ¡ son adecuados para la replicación y/o integración en procariotas, eucariotas, o ambos. Véanse, Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al, Nature, 328:731 (1987) ; Schneider, E., et al, Protein Expr. Purif. 6(1)10-14 (1995)'; Ausubel, Sambrook^ Berger (todos citados anteriormente) . Se proporciona un l catálogo de bacterias y bacteriófagos útiles para la clonación, por ejemplo, por la ATCC, por ejemplo, The ATCC Catalogue of i Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds) publicado por la, ATCC. También se encuentran procedimientos básicos adicionales para la secuenciación, clonación y otros aspectos de la biología molecular y consideraciones teóricas subyacentes en Watson et al (1992) Recombinant DNA segunda edición Scientific American Books, NY. Además, esencialmente cualquier ácido nucleico (y prácticamente cualquier ácido nucleico marcado, ya sea convencional o no convencional) puede encargarse de manera convencional o personalizada a cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como Midland Certified Reagent Company (Midland, j TX disponible en la World Wide Web en mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponible en la World Wide Web en genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponible en la World Wide Web en expressgen.com), Operon Technologies Inc.

(Alameda, CA) y muchas otras.

Las ' células huésped modificadas mediante ingeniería genética pueden pultivarse en medios de · nutrientes convencionales modificados según sea adecuado para actividades tales como, por ejemplo, etapas de examen, activación de promotores o selección de transformantes. Estas células pueden cultivarse opcionalmente en organismos transgénicos . Otras referencias útiles, por ejemplo, para aislamiento y cultivo celular (por ejemplo, para posterior aislamiento de ácidos nucleicos) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera 'edición, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias citadas en ese documento, Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems Jphn Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY, Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) ' y Atlas and Parks (eds) . The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL.

La capacidad para incorporar aminoácidos no naturales directamente en proteínas in vivo ofrece una amplia variedad de ventajas ¡incluyendo, pero sin limitarse a, altos rendimientos de proteínas ! mutantes , facilidad técnica, la posibilidad de estudiar las proteínas mutantes en células o posiblemente en organismos vivos y 1 el uso de estas proteínas mutantes en tratamientos terapéuticos y usos diagnósticos. La capacidad para incluir aminoácidos no naturales. . con diversos tamaños, acideces, i nucleofilicidades, hidrofobicidades y otras propiedades en proteínas puede expandir en gran medida la capacidad .para manipular, de manera racional y sistemática las estructuras de las proteínas, tanto para estudiar con sonda la función de la proteína como para crear nuevas proteínas u organismos con propiedades novedosas¡. i PROTEÍNAS Y POLIPEPTIDOS DE INTERÉS La incorporación de un aminoácido no natural puede realizarse para una variedad de fines, incluyendo pero sin limitarse a, diseñar a medida cambios en la estructura y/o función de la proteína, 1 cambiar el tamaño, la acidez, nucleofilia, puentes de hidrógeno!, hidrofobicidad, accesibilidad de sitios diana de proteasas, direccionamiento a un resto ' (incluyendo pero sin limitarse a, para una matriz proteica) ,. adición de una molécula biológicamente activa, unión a un polímero, unión a un radionúclido, modular de la semivida en suero, modular de la penetración en tejido (por ejemplo tumores), modular el transporte I activo, modular la distribución o especificidad de tejido, célula u órgano,! modular la inmunogenicidad, modular la resistencia a proteasas, etc. Las proteínas que incluyen un aminoácido no natural pueden tener propiedades biofísicas o catalíticas mejoradas! o incluso' completamente nuevas. Por ejemplo, las siguientes propiedades se modifican opcionalmente mediante la inclusión de un aminoácido no natural en una proteina: toxicidad, biodistribución, . propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, capacidad catalítica, semivida (incluyendo, pero sin limitarse a, semivida en suero) , capacidad para reaccionar con otras moléculas, incluyendo, pero sin limitarse a, de forma covalente o no covalente, y similares. Las composiciones que incluyen proteínas que incluyen al menos un aminoácido no natural son útiles para, incluyendo, pero sin limitarse a, terapéutica novedosa, diagnóstico, enzimas · catalíticas, enzimas industriales, proteínas de unión; (incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos), e incluyendo, pero sin limitarse a, el estudio de la estructura y función de proteínas. Véase, por ejemplo, Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinión in Chemical Biology, 4:645-652.

Una 'proteína puede tener al menos uno, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, l menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez o más aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales pueden ser iguales o diferentes, incluyendo, pero sin limitarse a, puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10; o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más aminoácidos no naturales diferentes. Una proteína puede tener al menos uno, pero menos que todos, de un aminoácido particular presente en la proteína sustituido por el aminoácido no natural. Para una proteina dada con más de un aminoácido no natural, los aminoácidos no naturales pueden ser idénticos o diferentes (incluyendo, pero sin limitarse i a, la proteina puede incluir dos o más tipos diferentes de aminoácidos no naturales, o puede incluir dos del mismo aminoácido no natural) . Para una proteina dada con más de dos aminoácidos no i naturales, los aminoácidos no naturales pueden ser iguales, diferentes o una combinación de múltiples aminoácidos no naturales de la misma clase con al menos un aminoácido no natural diferente.

Mediante la producción de proteínas o polipéptidos de interés con al menos un aminoácido no natural en células eucariotas, las proteínas1 o los polipéptidos incluirán normalmente modificaciones postraduccionales eucariotas. En determinadas realizaciones, una proteína . incluye al menos un aminoácido no natural y al menos una i modificación postraduccional que se realiza in vivo mediante una célula eucariota, en la que la modificación postraduccional no se realiza mediante una célula procariota. Por ejemplo, la modificación postraduccional incluye, incluyendo, pero sin limitarsej a, acetilación, acilación, modificación lipídica, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación por unión! de glicolípidos , glicosilación, y similares. Aún en otro aspecto, la modificación postraduccional incluye procesamiento proteolítico de precursores (incluyendo, pero sin limitarse a, precursor! de calcitonina, precursor de péptido relacionado con el gen de calcitonina, hormona preproparatiroidea, preproinsulina, proinsulina, prepro-opiomelanocqrtina, proopiomelanocortina y similares), ensamblaje en una proteína de múltiples subunidades o ensamblaje · macromolecular, traslado a otro sitio en la célula (incluyendo, pero sin limitarse a, orgánulos, tales como el retículo ? endoplasmático, el . aparato de Golgi, el núcleo, lisosomas, peroxisomas, mitocondrias, cloroplastos , vacuolas, etc., o' a través de la ruta secretora) . En determinadas realizaciones, la proteína comprende una secuencia de secreción o localización, una cola de epítopo," una cola FLAG, una cola de polihisti'dina, una fusión de GST, o similares.

Métodos de producción de una proteína en una célula con un aminoácido seleccionado en una posición especificada son también una característica de la presente invención. Por ejemplo, un método incluye ¦ hacer crecer, en un medio apropiado, la célula, comprendiendo la célula un ácido nucleico que comprende al menos un codóri selector y _ que codifica para una proteína; y, proporcionar el aminoácido seleccionado; en el que la célula comprende! además: un ARNt ortogonal (O-ARNt) que funciona en la célula y reconoce el codón selector; y, una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) que aminoacila preferentemente el 0- ARNt con el aminoácido seleccionado. Normalmente, el O-ARNt comprende, actividad de supresión en presencia de una sintetasa relacionada en respuesta a un codón selector. Una proteína producida; mediante este método también es una característica de la presente invención. i ¦Las ; composiciones de la presente invención y composiciones preparadas- mediante los métodos de la presente invención están opcionalmente en una célula. Los pares 0-ARNt/O-RS o componentes individuales de la presente invención pueden usarse entonces en la maquinaria de traducción de un sistema huésped, lo que da como resultado la incorporación de un aminoácido seleccionado, por ejemplo, aminoácido no natural, en una proteina. Las solicitudes de patente USSN 10/825.867, titulada "Expanding the Eukaryotic Genetic Code"; y 10/126.927, titulada "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL; ANIÑO AGIOS", describen este proceso y se incorporan al presente documento como referencia. Por ejemplo, cuando se introducei un par O-ARNt/O-RS en un huésped, por ejemplo, Escherichia coli, el par conduce a la incorporación in vivo del aminoácido seleccionado, tal como un aminoácido no natural, por ejemplo,. un aminoácido sintético, tal como derivado de un aminoácido leucina, que puede añadirse de manera exógena al medio de crecimiento, en una proteina, en respuesta a un codón selector. Opcionalmente, las composiciones de la presente invención pueden estar en un sistema de traducción in vitro, o en un (os) sistema (s) in vivo.

Cualquier proteina (o parte de la misma) que incluye un aminoácido seleccionado, por ejemplo, un aminoácido no natural, (y cualquier ácido nucleico codificante correspondiente, por ejemplo, que incluye uno o más codones selectores) puede producirse usando las composiciones y los métodos en el presente documento.

Cualquier polipéptido es adecuado para la incorporación de uno o más aminoácidos seleccionados. No se ha realizado ningún intento para identificar los cientos - de miles de proteínas conocidas, cualquiera de las cuales puede modificarse para incluir uno o más aminoácidos no naturales, por 'ejemplo, adaptando cualquier método de mutación disponible para que incluya uno o más codones selectores apropiados en un sistema de traducción relevante. Los depósitos] de secuencias comunes para proteínas conocidas incluyen GenBank ÉMBL, DDBJ y el NCBI . Otros depósitos pueden identificarse fácilmente buscando en internet.

I i Normalmente, las proteínas son, por ejemplo, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el i 90%, al menos el 95%, o al menos el 99% o más idénticas a cualquier proteína disponible (por ejemplo, una proteína terapéutica, una proteína de diagnóstico, una enzima industrial, o parte de las mismas, y similares) , y comprenden uno o más aminoácidos seleccionados. Ejemplos de proteínas terapéuticas, de diagnóstico y otras que pueden modificarse para comprender uno o más aminoácidos seleccionados, por ejemplo, un aminoácido no natural, pueden encontrarse, pero sin limitarse a, aquéllos en el documento! USSN 10/825,867 titulado "Expanding the Eukaryotic Genetic Code"; y, la solicitud de patente estadounidense con número de serie 10/126.927, titulada " IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS".

En determinadas realizaciones, la proteina o el polipéptido de interés (o parte de los mismos) en los métodos y/o las composiciones de la presente invención se codifica por un ácido nucleico.! Normalmente, el ácido nucleico comprende al menos un codón selector, al menos dos codones selectores, al menos tres codones selectores, al menos cuatro codones selectores, al menos i cinco codones selectores, al menos seis codones selectores, al menos siéte codones selectores, al menos ocho codones selectores, al menos nueve codones selectores, diez ó más codones selectores." Los genes que codifican para proteínas o polipéptidos de interés pueden mutagenizarse usando métodos bien conocidos por un experto en la técnica y descritos en el presente documento en "Mutagénesis y otras técnicas de biología molecular" para incluir, por ejemplo, uno o más codones selectores para la incorporación de un aminoábido seleccionado, por ejemplo, un aminoácido no natural. Por ejemplo, un ácido nucleico para una proteína de interés se mutageniza para que incluya uno o más codones selectores, proporcionando la incorporación del uno o más aminoácidos seleccionados, por ejemplo, aminoácidos no naturales. La invención incluye cualquier variante de este tipo, por ejemplo, mutantes, versiones, de cualquier proteína, por ejemplo, que incluyen al I menos un aminoácido seleccionado. De manera similar, la invención también incluye los ácidos nucleicos correspondientes, es decir, cualquier ¡ ácido nucleico con uno o más codones selectores que codifican para uno o más aminoácidos seleccionados .

Para preparar una proteína que incluye un aminoácido seleccionado, pueden usarse células huésped y organismos que están adaptados! para la incorporación ' in vivo del aminoácido seleccionado por medio de pares de ARNt/RS ortogonal. Las células huésped se modifican mediante ingeniería genética (por ejemplo, se transforman, transducen o transfectan) con uno o más vectores que expresan '¦ el ARNt ortogonal, la ARNt sintetasa ortogonal, y un vector que codifica para la proteína que va a derivatizarse . Cada uno de estos componentes puede estar en el mismo vector, o cada uno puede estar en un vector separado, dos componentes pueden I estar en un vector y el tercer componente en un segundo vector. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, un cósmido, un fago, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo, b un polinucleótido conjugado.

SISTEMAS ALTERNATIVOS Se han empleado varias estrategias para introducir aminoácidos no naturales en proteínas en células huésped no recpmbinantes , células huésped mutagenizadas o en sistemas libres de células. La derivatización de aminoácidos con cadenas laterales reactivas tales como Lys, Cys y Tyr dio como resultado la conversión de lisina en N2-acetil-lisina . La síntesis química también proporciona un método sencillo para incorporar aminoácidos no naturales. Con el reciente desarrollo de la ligación enzimática y la ligación química nativa de fragmentos de péptidos, es posible preparar proteínas más grandes. Véase, por ejemplo, P. E. Dawson y S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem. 69:923 (2000). La ligación de péptidos > química y la ligación química nativa se describen en la patente estadounidense n.° 6.184.344, la publicación de patente n.° 2004/0138412, la publicación de patente n.° 2003/0208046, los documentos O 02/098902 y WO 03/042235, que se incorporan como referencia al presente documento. Se ha usado un método biosintético in vitro general en el que se añade un ARNt supresor j acilado químicamente con el aminoácido no natural deseado a un extracto iir¡ vitro que puede soportar la biosíntesis de proteínas, para incorporar de manera específica del sitio más de 100 aminoácidos no naturales en una variedad de proteínas de i prácticamente cualquier tamaño. Véanse, por ejemplo, V. . Cornish, ¡D. Mendel y P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl . , 1995, 34:621 (1995); C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill , M.C.

Griffith, P.G. Schultz, A general method for site-specific I incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989); y J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989). Se ha introducido una gran gama de grupos funcionales en proteínas para estudios de estabilidad de proteínas, plegamiento de proteínas, mecanismo enzimático y transducción de señales.

I Se desarrolló un método in vivo, denominado incorporación por presión selectiva, para aprovechar la . promiscuidad de las sintetasas de tipo natural. Véase, por ejemplo, N. Budisa, C. Minks, S .! Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder y R. Huber, FASEB J., 13 : 4 1 ( 1999 ) . Se hace crecer una cepa auxótrofa, en la que la ruta metabólica relevante que suministra a la célula un aminoácido natural particular está inactivada, en medio mínimo que contiene ' concentraciones limitadas del aminoácido natural, mientras ¡que la transcripción del gen diana está inhibida. Al comienzo de una fase de crecimiento estacionario, el aminoácido natural se agota y se reemplaza por el análogo de aminoácido no natural. La inducción de la expresión de la proteína recombinante da como resultado la acumulación de ' una proteína que contiene el análogo no natural. Por ejemplo, usando esta estrategia, se han incorporado o, m y p-fluorofenilalaninas en proteínas, y presentan dos. hombros característicos' en el espectro UV que pueden identificarse fácilmente, véase, por ejemplo, C. Minks, R. Huber, L. Moroder y N. Budisa, Anal. Biochem. , 284 : 29 ( 2000 ) ; se ha usado trifluorometionina para reemplazar la metionina en lisozima de bacteriófago T4 para estudiar su interacción con ligandos de quitooligpsacárido mediante 19F-RMN, véase, por ejemplo, H. Duewel, E. Daub, V. Robinson y J. F. Honek, Biochemistry, 36 : 3404 ( 1997 ) ; y se ha incorporado trifluoroleucina en lugar de leucina, dando como resultado un aumento de la estabilidad térmica y química de i una protéína con cremallera de leucina. Véase, por ejemplo, Y.

Tang, G-. ! Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, . F. DeGrado y D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int, Ed. Engl . , 40:1494 (2001) . Además, se incorporan selenometionina y telurometionina en diversas proteínas recombinantes para facilitar la resolución de fases en cristalografía de rayos X. Véanse, por ejemplo, W. A. Hendrickson, J. R. Hoiton y D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990); J. O.

Boles, K.i Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda y M. Hatada, Nat, Struct. Biol., 1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, i P. Demange, C. Eckerskom, J. Kellermann y R. Huber, Eur. J. Biochem.,* 230:788 (1995); y N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder y R. Huber, J.¡ Mol. Biol., 270:616 (1997). También se han incorporado eficazmente en análogos de metionina funcionalidades alqueno o alquino, |lo que permite la modificación adicional de proteínas por medios químicos. Véanse, por ejemplo, J. C. van Hest y D. A. Tirrell, !FEBS Lett., 428:68 (1998); J. C. van Hest, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 122: 1282 (2000); y K. L. Kiick y I D. A. Tirrell, . Tetrahedron, 56:9487 (2000); patente estadounidense n.° 6.586.207; publicación de patente estadounidense 2002/0042097, que se incorporan como referencia al presente documento.

El éxito de este método depende del reconocimiento de los análogos ' de aminoácidos no naturales por aminoacil-ARNt sintetasas, que, en general, requieren alta selectividad para garantizar la fidelidad de la traducción de proteínas. Un modo de expandir el alcance de este método es relajar la especificidad de sustrato de las aminoacil-ARNt sintetasas, lo que se ha logrado en un número limitado de casos. Por ejemplo, la sustitución de Ala294 por Gly en fenilalanil-ARNt sintetasa (PheRS) de Escherichia coli aumenta él tamaño del bolsillo de unión a sustratos, y da como resultado' la acilación de ARNtPhe por p-Cl-fenilalanina (p-Cl-Phe) . Véase, . Ibba, P. Kast y H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994). Uria cepa de Escherichia coli que alberga esta PheRS I mutante permite la incorporación de p-Cl-fenilalanina o p-Br-fenilalanina en lugar, de fenilalanina . Véanse, por ejemplo, M.

Ibba y H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995); y N. Sharma, R. i Furter, P. Kast y D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000) . De manera similar, se mostró que una mutación puntual Phel30Ser cerca del sitió de unión a aminoácidos de la tirosil-ARNt sintetasa de Escherichia coli permitía que se incorporase azatirosina más eficazmente que tirosina. Véase, F. Hamano-Takaku, ?. Iwama, S. Saito-Yanó, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil y S. Nishimura, J. Biol, Chem. , 275:40324 (2000) .

Otra estrategia para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas! in vivo es modificar sintetasas que tienen mecanismos de corrección de lectura. Estas sintetasas no pueden discriminar y por tanto! activan aminoácidos que son estructuralmente similares a i los aminoácidos naturales relacionados. Este error se corrige en I un sitio separado, que desacila el aminoácido cargado erróneamente del ARNt para mantener la fidelidad de la traducción de proteínas. Si la actividad correctora de lectura de la sintetasa se desactiva, análogos estructurales que están activados de manera errónea pueden escapar de la función de edición e incorporarse. Este enfoque se ha demostrado recientemente con la valil-ARNt sintetasa (ValRS) . Véase, V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel y P. Marliere, Science, 292:501 (2001). ValRS puede aminoacilar de manera errónea ARNtVal con Cys, Thr o aminobutirato (Abu) ; estos aminoácidos no relacionados se hidrolizan posteriormente por el dominio de edición. Tras la mutagénesis al azar del cromosoma de Escherichia coli, se seleccionó una cepa de Escherichia coli mutante que tiene una mutación en el sitio de edición de ValRS. Esta ValRS de edición defectuosa carga incorrectamente ARNtVal con Cys. Debido a que Abu se parece estéricamente a Cys (el grupo -SH de Cys se sustituye! por -CH3 en Abu) , la ValRS mutante también incorpora Abu en proteínas cuando esta cepa de Escherichia coli mutante se hace crecer enl presencia de Abu. El análisis de espectrometría de masas muestra que aproximadamente el 24% de las valinas se sustituyen por Abu en cada posición de valina en la proteína nativa.

Métodos semisintéticos y de síntesis en fase sólida han permitido también la síntesis de varias proteínas que contienen aminoácidos novedosos. Por ejemplo, véanse las siguientes publicaciones y las referencias citadas en las mismas, que son las siguientes: Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R.

General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides XXXVI.

The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating. potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem, 88 (24) : 5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, . , Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtülisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected I synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256 (5054) 221-225 (1992); Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins,: CRC Crit Rev Biochem. 11 (3) : 255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3): 151-157 (1987); y Jackson, D. Y., Burnier, J. , Quan, C, Stanley, M., Tom, J., Wells!, J. A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266 (5183) :243 (1994).

Se ha usado modificación química para introducir una variedad de cadenas laterales no naturales, incluyendo cofactores, marcadores de espin y oligonucleótidos en proteínas in vitro. Véanse, por ejemplo, Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid- ¡sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238 (4832) : 1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, . E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Re Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E. T., Lawrence, D.

Chemical mutation of enzyme active sites, Science, 226 (4674),: 505-511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of Thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243 (2 ): 6392-6401 (1968); Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetic!ally formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966); y Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody !combining sites, Science, 242 (4881) : 1038-1040 (1988) .

De inición de polipeptidos mediante inmunorreactividad Debido a que los polipéptidos de la presente invención proporcionan una variedad de nuevas secuencias de polipéptido (por ejemplo, | que comprenden los aminoácidos seleccionados (por ejemplo, aminoácidos no naturales) en el caso de proteínas sintetizadas en los sistemas de traducción en el presente documento1, o, por' ejemplo, en el caso de las sintetasas novedosas, secuencias novedosas de aminoácidos convencionales) , los polipéptidos también proporcionan nuevas características estructurales que pueden reconocerse, por ejemplo, en ensayos inmünológicos . La generación de antisueros, que se unen específicamente a los polipéptidos de la presente invención, así como a los polipéptidos que se unen mediante tales antisueros, es i una característica de la presente invención. El término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, incluye, pero no se limita a, un polipéptido sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina o genes- de inmunoglobulina, o fragmentos del mismo que se unen y reconocen específicamente un analito (antígeno) . Ejemplos incluyen anticuerpos policlonales , monoclona!les, quiméricos y de cadena sencilla, y similares. Fragmentos de inmunoglobulinas , incluyendo fragmentos Fab y fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión, incluyendo presentación en fago, también se incluyen en el término "anticuerpo" tal como se usa en el presente documento. Véase, por ejemplo, Paul, Fundamental Immunology, 4a ed., 1999, Raven Press, I Nueva York, para la terminología y estructura de anticuerpos. Ejemplos 1 del uso de aminoácidos no naturales y técnicas inmunológicas se facilitan en el documento WO/2009/099672 de The Scripps Research Institute titulado Breaking Immunological Tolerance With a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid, y se incorporal al presente documento como referencia en su totalidad.

Por ejemplo, la invención incluye proteínas preparadas utilizando los ARNt y/o RS de la presente invención que se unen específicamente a o que son específicamente inmunorreactivos con un anticuerpo o antisueros generados frente a un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos. Para eliminar la reactividad cruzada con · otros homólogos, el anticuerpo o antisueros se sustraen con la proteína disponible, tal como el polipéptido de tipo natural, por ejemplo, los polipéptidos "control". Cuando la proteína de tipo natural corresponde a un ácido nucleico, se genera un polipéptido codificado por el ácido nucleico I y se usa para fines de sustracción de anticuerpo/antisueros .

En un formato típico, el inmunoensayo usa un antisuero policlonal que se generó frente a uno o más polipéptidos o una i subsecuerícia sustancial de los mismos (es decir, al menos aproximadamente el 30% de la secuencia de longitud completa proporciónada) . El conjunto de posibles inmunógenos de polipéptido derivados de la proteína se denominan colectivamente a continuación "los polipéptidos inmunogénicos". Los antisueros ¦resultantes se seleccionan opcionalmente para tener una baja reactividad cruzada frente a los homólogos de sintetasa control y se elimina cualquier reactividad cruzada de este tipo, por ejemplo, mediante inmunoabsorción, con uno o más de los homólogos control, antes de usar el antisuero policlonal en el inmunoensayo.

Con el fin de producir antisueros para su uso en un inmunoensayo, se produce' uno o más de los polipéptidos inmunogénicos y se purifica tal como se describe en el presente documento1. Por ejemplo, puede producirse proteína recombinante en una célula recombinante. Se inmuniza una cepa endogámica de ratones (usada en este ensayo porque los resultados son más reproducibles debido a la casi identidad genética de los ratones) con la(s) proteína (s) inmunogénica ( s ) en combinación con un adyuvante convencional, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratón convencional (véase, por ejemplo, !Harlow y Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications , Nueva York, para una descripción convencional de la generación de anticuerpos, formatos de inmunoensayos y condiciones que pueden usarse para determinar la i inmunorreactividad especifica.

También se encuentran' referencias adicionales y discusión de anticuerpos en el presente documento y pueden aplicarse en este caso paira definir polipéptidos mediante inmunorreactividad. Alternativamente, se conjuga uno o más polipéptidos sintéticos o recombinantes derivados de las secuencias dadas a conocer en el presente ! documento con una proteina portadora y se usa como inmunógeno .

Se recogen sueros policlonales y se valoran frente al polipéptido inmunogénico en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con una o más de las proteínas inmunogénicas inmovilizadas en un soporte sólido. Se seleccionan antisueros policlonales con un título de 106 o superior, se combinan y se sustraen con los polipéptidos de sintetasa control para producir antisueros policlonales valorados combinados sustraídos .

Los antisueros policlonales valorados combinados sustraídos se someten a prueba para determinar la reactividad cruzada frente a homólogos control en un inmunoensayo comparativo. En este ensayo comparativo, se determinan las condiciones de unión i discriminatoria para los antisueros policlonales valorados combinados sustraídos que dan como resultado una razón de señal con respecto a ruido al menos aproximadamente 5-10 veces superior para la ¡ unión de los antisueros policlonales valorados a la proteína . inmunogénica en comparación con la unión a los homólogos de sintetasa control. Es decir, la rigurosidad de la reacción de unión se lajusta mediante la adición de competidores no específicos tales como albúmina o leche deshidratada desnatada, y/o ajustando las condiciones de sal, temperatura, y/o similares. Estas condiciones de unión se usan en ensayos posteriores para determinar si un polipéptido de prueba (un polipéptido que se está i comparando- con los polipéptidos inmunogénicos y/o los polipéptidos control) se une específicamente mediante los antisueros policlonalqs sustraídos combinados.

En otro ejemplo, se usan inmunoensayos en el formato de unión competitiva para la detección de un polipéptido de prueba. Por ejemplo, tal como se indica, se eliminan anticuerpos de reacción cruzada > de la mezcla de antisueros combinados mediante inmunoabsorción con los polipéptidos control. Entonces se inmoviliza (n) el/los polipéptido (s ) inmunogénico (s) a un soporte sólido que se expone a los antisueros combinados sustraídos. Se añaden proteínas de prueba al ensayo para competir por la unión a los antisueros sustraídos combinados. La capacidad de la(s) proteína (s) de prueba para competir por la unión a los antisueros sustraídos combinados en comparación con la(s) proteína (s) inmovilizada (s) se . compara con la capacidad de lo(s) polipéptido (s ) inmunogénico ( s ) añadido (s) al ensayo para competir por la . unión, (los polipéptidos inmunogénicos compiten eficazmente con los' polipéptidos inmunogénicos inmovilizados por la unión a los antisueros combinados) . Se calcula la reactividad cruzada en porcentaje para las proteínas de prueba usando cálculos convencionales.

En un ensayo paralelo, la capacidad de las proteínas control para competir por la unión a los antisueros sustraídos combinados se determina opcionalmente en comparación con la capacidad del/de los polipéptido (s) inmunogénico (s) para competir por la unión a los antisueros. De nuevo, se calcula la reactividad cruzada en porcentaje usando cálculos convencionales. Cuando la reactividad cruzada en porcentaje es al menos 5-10x tan alta para los polipéptidos de prueba en comparación con los polipéptidos control y/o cuando la unión de los polipéptidos de prueba está aproximadamente en el intervalo de la unión de los polipéptidos inmunogénicos, se dice que los polipéptidos de prueba se unen específicamente a los antisueros sustraídos combinados.

En (general, los antisueros inmunoabsorbidos y combinados pueden usarse en un ensayo de unión competitiva tal como se describe en el presente documento para comparar cualquier polipéptido de prueba con el/los polipéptido (s) inmunogénico (s) y/o control. Con el fin de hacer esta comparación, se someten a ensayo cada uno de los polipéptidos inmunogénicos, de prueba y control a un amplio intervalo de concentraciones, y se determina la cantidad de cada polipéptido requerida para inhibir el 50% de la unión de los antisueros sustraídos a, por ejemplo, una proteina control inmovilizada, de prueba o inmunogénica usando técnicas convencionales. Si la cantidad del polipéptido de prueba requerida para la unión¦ en el ensayo- competitivo es inferior al doble de la cantidad del polipéptido inmunogénico que se requiere, entonces se i dice que 1 el polipéptido de prueba se une específicamente a un anticuerpo generado frente a la proteína inmunogénica, siempre que la cantidad sea al menos aproximadamente 5-10x tan alta como para el polipéptido control.

Como determinación adicional de especificidad, los antisueros combinados se inmunoabsorben opcionalmente de manera completa con el/los polipéptido ( s) inmunogénico ( s ) (en lugar de los polipéptidos control) hasta que es detectable poco o nada de unión de los antisueros combinados sustraídos con polipéptido inmunogénico resultantes al/a los polipéptido (s ) inmunogénico (s) usado (s) en la inmunoabsorción. Estos antisueros completamente . i inmunoabsorbidos se someten entonces a prueba para determinar la reactividad con el polipéptido de prueba. Si se observa poco o nada de reactividad (es decir, no más de 2x la razón de señal con respecto : a ruido observada para la unión de los antisueros completamente inmunoabsorbidos al polipéptido inmunogénico) , entonces el polipéptido de prueba se une específicamente mediante los antisúeros generados por la proteína inmunogénica.

Pueden encontrarse detalles adicionales sobre proteínas, anticuerpos, antisueros, etc. en el documento USSN 10/825.867 titulado I "Expanding the Eukaryotic Genetic Code"; documento WO 2002 /085923 , titulado "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"; ' patente estadounidense n . ° 6. 927 . 042 titulada "Glycoprotein synthesis"; y publicación de patente estadounidense n.° US 2?04 /0198637 titulada "Protein Arrays", que se incorpora como referencia.

KITS Kits también son una característica de la presente invención.

Por ejemplo, se proporciona un kit para producir una proteína que comprende al menos un aminoácido seleccionado, por ejemplo, un aminoácido no natural, en una célula, incluyendo el kit un envase que contiene una secuencia de polinucleótido que codifica para un O-ARNt, y/o un O-ARNt, y/o una secuencia de polinucleótido que codifica para una O-RS, y/o una O-RS. En una realización, el kit incluye además al menos un aminoácido seleccionado. En otra realización, el kit incluye un ARNt aminoacilado de la invención.

En otra 1 realización, el kit comprende . además materiales de instrucciones para producir la proteína.

Un ejemplo adicional es un kit para producir una proteína que comprende, al menos un aminoácido seleccionado, por ejemplo, un aminoácido no natural, en un sistema de traducción libre de células, incluyendo el kit un envase que contiene una secuencia de polinucleótido que codifica para un O-ARNt, y/o un O-ARNt, y/o una secuencia ! de polinucleótido que codifica para una O-RS, y/o una O- RS . En una realización, el kit incluye además un aminoácido seleccionado . En otra realización, el kit incluye un ARNt aminoacilado de la invención. En otra realización, el kit comprende, además materiales de instrucciones para producir la proteína.

EJEMPLOS Los j siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada. Un experto reconocerá una variedad ¡ de parámetros no críticos que pueden alterarse sin i apartarse^ del alcance de la invención reivindicada.

Ejemplo 1: I Selección de aminoacil-ARNt sintetasa frente a para-acetil-fenilalanina Se examinaron dos bibliotecas de ADN para seleccionar aminoacil-ARNt sintetasas frente a para-acetilfenilalanina, un aminoácido no codificado de manera natural. Estas bibliotecas consistían en seis mutaciones en el gen de tirosil ARNt sintetasa de Metanococcous janneschii en el plásmido pBK.

Se realizó el procedimiento de selección que consistió en cinco rondas alternativos de selección, tres positivas, dos negativas. Se combinaron las bibliotecas, en una razón 1:1 y se sometieron a electroporación en la línea celular de selección i positiva (GeneHog con plásmido de selección positiva, pREP) y se sembraron; en placas con medios mínimos (GMML) con antibióticos apropiados y el aminoácido no codificado de manera natural para-acetilfenilalanina (pAF) . Se .incubaron las. placas a 37°C durante aproximadamente 40 horas momento en el cual se recogieron las células .mediante raspado. Se extrajo el ADN usando un procedimiento Mini-Prep de Qiagen, y después se purificó en gel de agarosa para aislar el ADN de plásmido de la biblioteca.

Entonces se sometió este ADN a electroporación en la linea celular de selección negativa (GeneHog con derivado de plásmido pBAD de selección negati-va) .. Se sembraron estos transformantes en placas de LB con antibiótico apropiado sin el aminoácido no codificado de manera natural (pAF) . Tras aproximadamente 17 horas se recogieron estas células mediante raspado y se purificó el ADN de plásmido usando el procedimiento Mini-Prep de Qiagen y purificación en gel de agarosa.

Las ' rondas posteriores de selección se realizaron usando el mismo método de electroporación, sembrado en placa, recogida y purificación de ADN. En la última (quinta) ronda de selección, se realizaron diluciones en serie de las células de selección positiva ; transformadas que se sembraron en placas con medios mínimos. Entonces se seleccionaron colonias individuales y se hicieron crecer en un bloque de 96 pocilios durante la noche. Entonces se sembró por duplicado este bloque en placas con medios mínimos !con concentraciones variables de cloranfenicol (el antibiótico de selección positiva) con y sin aminoácido no natural pAF. Tras, aproximadamente 40 horas de crecimiento a 37°C, se compararon visualmente las placas para determinar qué colonias crecieron' con la mayor concentración de cloranfenicol pero no crecieron o crecieron escasamente en ausencia del aminoácido no codificado de manera natural pAF. Se hicieron crecer durante la noche las; colonias que cumplieron estos criterios. Se aisló el ADN de . los cultivos mediante Mini-Prep y purificación en gel de agarosa y se secuenciaron .

A partir de esta selección de pAF, se encontró que 13 clones tenían secuencias de aminoácidos únicas y se sometieron a caracterización adicional para determinar la fidelidad y procesabilidad de la pAF-ARNt sintetasa.

Para caracterizar estas sintetasas, se realizaron supresiones ámbar a ' escala pequeña para mostrar que el aminoácido no codificado de manera natural pAF se incorporó en un polipéptido, y se visualizaron los resultados mediante SDS-PAGE. Se escogió una única colonia y se hizo crecer durante la noche en caldo LB, que entonces se usó para inocular 50 mL de LB. Se hicieron crecer las células hasta una DO de 0,3-0,4, momento en el que se tomaron alícuotas! de 1,5 mL como puntos previos a la inducción y se dividió el cultivo en dos matraces. Se añadió pAF 1 mM en uno y se hicieron crecer ambos durante 30 minutos. Tras el crecimiento de 30 minutos, se indujeron ambos cultivos (+/- pAF) con L-arabinosa al 0,2% y se hicieron crecer durante 4,5 horas y se registró la D060o. Entonces se tomaron alícuotas de 1,5 mL de los matraces +/- pAF para el análisis mediante SDS-PAGE.

Se · centrifugaron las alícuotas de 1,5 mL (previas a la inducción, +pAF, -pAF) a 10.000 xg durante 10 minutos para sedimentad las células.' Entonces se suspendieron las células en cantidades proporcionales de reactivo de extracción de proteínas bacterianas (BPER, Pierce) con respecto a su D060o en el momento de la recogida.. Se añadió ADNasa I a las células lisadas y se incubaron a 4°C durante 20 minutos. Entonces se combinaron las muestras con un agente reductor y un colorante de carga y se corrieron! en un gel de Bis-TRIS al 4-12% en tampón MES durante 30 minutos. Se lavó el gel en DI H20 dos veces durante 10 minutos y se tiñó con ¡colorante azul de coomassie. Se compararon las bandas +/-pAF para determinar la fidelidad de la pAF-ARNt RS para dar como resultado la incorporación de pAF, y comparó la banda + pAF con la pAF-ARNt RS previamente seleccionada.

Para comprobar la procesabilidad de las RS se realizó el mismo procedimiento con un plásmido que contenía C-H6 S4am mioglobina (S4am-Myo) . Entonces se purificó la S4am Myo mediante IMAC y se envió para realizar una secuenciación de proteína para determinar la cantidad de incorporación de pAF.

De las pÁF-ARNt RS identificadas a partir de esta selección, se encontró que una sintetasa (E9) incorpora eficazmente pAF, con más del 95% de eficacia de incorporación de pAF en S4am-Myo. Se I determinó' la incorporación mediante secuenciación de aminoácidos mientras que se mostró la procesabilidad comparando las bandas de proteína én geles de SDS-PAGE. La secuencia de nucleótidos para E9 se muestra en SEQ ID NO: 4, y la secuencia de aminoácidos de E9 se muestra en SEQ ID NO: 5.

Se identificó un mutante adicional con actividad similar a E9, y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 17. Ejemplo 2: Mutagénesis de ARNt Se generaron tres mutantes de ARNt de J17. La secuencia de ADN de JÍ7 de tipo natural se muestra como SEQ ID NO: 8 y en las publicaciones de patentes estadounidenses n.os 2003/0108885 como SEQ ID NO: 1 y US 2003/0082575 como SEQ ID NO: 1 (solicitudes de patente estadounidense con n.os de serie 10/126.931 y 10/126.927, respectivamente) , ambas de las cuales se incorporan como referencia al presente documento. El ARNt de J17 tiene un par tambaleante U51:G63 en el tallo ??? tal como se muestra en la figura l.: Se generaron tres mutantes de J17 (F12, F13 y F14) para producir pares de bases de Watson-Crick en las posiciones 51 y 63 del tallo ??0. Se realizó la mutagénesis mediante PCR de solapamiehto, y se clonaron los constructos finales en sitios EcoRI y Ndel en un plásmido pET19 que comprendía la secuencia de polinucleótidos que codifica para la aminoacil ARNt sintetasa E9 (SEQ ID NO: 4) y la secuencia de polinucleótidos que codifica para la hormona del crecimiento humana (hGH) con una sustitución de codón ámbar (SEQ ID NO: 16) . La expresión de hGH estaba bajo el control del promotor de T7.

Se generaron dos fragmentos para la PCR de solapamiento . El primer fragmento se obtuvo mediante extensión con cebador. La secuencia del cebador directo usado para generar cada uno de los tres mutantes fue: GTAACGCTGAATTCCCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTCTAAATCCGCATGGCGC (FTamll; SEQ ID NO: 9) .

Para generar el mutante F12 (51C:63G), se usó el siguiente cebador inverso: GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCCGGATTTGAACCGGCGCCATGCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTG C (FTaml2; SEQ ID NO: 10) .

Para generar el mutante F13 (51U:63A), se usó el siguiente cebador inverso: GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCTGGATTTGAACCAGCGCCATGCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTG C (FTamlS1; SEQ ID NO: 11) .

Para generar el mutante F14 (51A:63U), se usó el siguiente cebador inverso: GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCAGGATTTGAACCTGCGCCATGCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTG C (FTaml4'; SEQ ID NO: 12) .

Para generar el segundo fragmento, se usó el plásmido pET19 J17 E9 hGH que comprendía la secuencia de polinucleótido para ARNt de J17 ¡(SEQ ID NO: 8), la secuencia de polinucleótido que i codificaba para la ARNt sintetasa E9 (SEQ ID NO: 4) y la secuencia de polinucleótido que codificaba para la hormona del crecimiento humana con una sustitución de codón ámbar (SEQ ID NO: 16) como molde para la amplificación con el siguiente conjunto de cebadores: CGCCGGACCACTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTAAGC ( cebador directo; 1 FTaml5; SEQ ID NO: 13) y CAAATTCGTCCATATGGGATTCC (FTam 16; SEQ ID NO: 14) . Se usó el cebador directo para extender la secuencia! desde el extremo 3' de ARNt hacia el sitio Nde I del plásmido. El producto resultante se purificó en gel.

La ¡etapa final de PCR de solapamiento implicó al cebador directo GTAACGCTGAATTCCCGGCG (FTaml7, SEQ ID NO: 15), cebador inverso FTaml6 (SEQ ID NO: 14), el primer fragmento y el segundo fragmento'. Se digirieron los productos ensamblados con EcoR I y Nde I y se ligaron en el plásmido pET19 J17 E9 hGH digerido con EcoR I y Nde I. Se confirmó la secuencia de cada constructo mediante secuenciación, y las secuencias de ADN para cada uno de los ARNt mutantes de J17 se muestran como SEQ ID NO: 1 (F12), SEQ ID NO: 2 (F13), y SEQ ID NO: 3 (F14). Se nombraron los ARNt según sus correspondientes cebadores inversos.

Expresión de proteínas Plásmidos que codificaban para los ARN't (J17, F12, F13 o F14) se transformaron cada uno en células huésped bacterianas de cepa 1 y cepa 2 de E. coli mediante medios químicos y se sembraron en placas de agar LB con carbenicilina 50 ug/ml. Se incubaron las placas a , 37°C durante la noche. Para' cada ARNt, se escogió una única colonia para comenzar un cultivo durante la noche a 37°C en 1, mi de 2xYT con carbenicilina 50 ug/ml. Se usó este cultivo de 1 mi para inocular dos cultivos de 2xYT de 10 mi con carbenicilina 50 ug/ml a 37°C. Se complementó un cultivo de 10 mi con para-acetilfenilalanina 4 mM. A D060o=0,7, se indujo la expresión de hGH con IPTG 0,4 mM. Tras cultivar las células a 37°C durante 4 horas con 250 rpm, se recogieron las células mediante centrifugación a 5000 x g durante 5 minutos. Se lisaron las células con reactivo B-PER (Pierce, Rockford, IL) complementado con ADNasa I 5 ug/ml. Se analizó el lisado celular total mediante SDS-PAGE al 4-12%.

La figura 2 muestra un análisis de Usados celulares totales de cepa 1 de E. coli mediante SDS PAGE. Se realizó la supresión de un codón selector en hormona del crecimiento humana usando ARNt de J17 o mutante de J17 (F12, F13, F14) y la aminoacil ARNt sintetasa E9. Las células que albergaban mutantes de J17 crecieron de manera ligeramente más lenta que las células que albergaban J17. No se observó ningún producto de hGH de longitud completa mediante SDS-PAGE para los mutantes de ARNt en ausencia de ¦ para-acetilfenilalanina 4 mM. En presencia de para-acetilfenilalanina 4 mM, se produjo producto de longitud completa con cada uno de, los mutantes de ARNt, demostrando que esos pares de mutante de ARNt-RS E9 son ortogonales para la maquinaria de E. coli. Basándose en SDS-PAGE,' el rendimiento de hGH suprimido de los mutantes de J17 fue aproximadamente 1,5~2 veces superior al de J17 en la cepa 1 de E. coli.

Un mutante de J17, F13, se sometió a prueba adicionalmente en la línea celular bacteriana de cepa 2 de E. coli para detectar la supresión ámbar, tal como se- muestra en la figura 3. En la cepa 2 de E. coíi, la expresión "asi como los rendimientos de supresión ámbar se redujeron con respecto a los de la cepa 1 de E. colí. En i ausencia ¡de para-acetilfenilalanina, no se observó ningún producto de hGH de longitud completa mediante SDS-PAGE. En presencia de para-acetil fenilalanina 4 mM, se observó hGH de longitud completa para ambos ARNt . Basándose en SDS-PAGE, el rendimiento de hGH suprimido! de F13 fue aproximadamente tres veces superior al de J17.

Se realizó una serie de fermentación comparando J17 y F13 con un volumen final de aproximadamente 1,5 L. El plásmido que codifica para el ARNt de J17 y el plásmido que codifica para el ? ARNt de F13 se transformaron cada uno en la cepa 1 de E. coli. La \ densidad celular final para cada uno fue de aproximadamente 190 g de células húmedas/1. El titulo de hGH fue de 347 mg/L para el clon de J17 y 542 mg/L para el clon de F13.

TABLA 1 ! SEQ ID Etiqueta SECUENCIA HO: ADJI F12 C CGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTC TAAATCC GCATGGCGCCGGTTCAAATCCGGC CCGCCGGACCA ADIJ F 13 C CGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTC TAAATCC GCATGGCGC TGGTTCAAATCCAGC CCGCCGGACCA ADH F14 C CGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTC TAAATCC GCATGGCGCAGGTTCAAATCCTGC CCGCCGGACCA SEQ ID Etiqueta SECUENCIA NO: 4 Ácido ATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATT nucleico ATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAA E9 RS AAATCTGCTGTTATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACAT TTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTGATTTACAA AATGCTGGATTTGATATAATTATATATTTGGCTGATTTACAC ? GCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAA 1 ATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTA AAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTGAACATGGTCTTGATAAG GATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAAC ACC TTAAAAAG GC AGAAGGAGTATGGAACTT TAGCAAGAGAG GATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATG 1 CAGGTTAATGGGATTCATTATGAGGGCGTTGATGTTGCAGTT GGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAG CTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTATTCACAACCCTGTCTTA ACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGG AATTTTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCT AAGATAAAGAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGA AATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCT TTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACA GTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAG GAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAA CTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTAT A SEQ IC Etiqueta SECUENCIA NO: 5 AminoMDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAVIGFEPSGKIH ácido E9 LGHILQIKKMI DLQNAGFDI IIILADLHAILNQKGELDEIRK RS IGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEHGLDKDYTLNVYRLALKTT LKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGIHYEGVDVAV ? GGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKG NFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPI EIAKYFLEYP 1 LTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEE LIKILEPIRKRL 6 ! ADN de CCCAGGGTAGCCAAGCTCGGCCAACGGCGACGGACTCTAAAT ARNt CCGTTCTCGTAGGAGTTCGAGGGTTCGAATCCCTTCCCTGGG HL (TAG) 3 ACCA 7 ADN de GCGGGGGTTGCCGAGCCTGGCCAAAGGCGCCGGACTTCAAAT ARNt CCGGTCCCGTAGGGGTTCCGGGGTTCAAATCCCCGCCCCCGC HL (TGA) 1 ACCA 8 ADN de CCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTCTAAATCC de . GCATGGCGCTGGTTCAAATCCGGCCCGCCGGACCA 1 ARNtm¡¾A J17 1 M. jannas- chii Cebador GTAACGCTGAATTCCCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGG FTamll CGGACTCTAAATCCGCATGGCGC SEQ ID Etiqueta SECUENCIA NO: 10 ' Cebador GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCCGGATTTGAACCGGCGCCAT FTaml2 GCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTGC 11 Cebador GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCTGGATTTGAACCAGCGCCAT FTaml3 GCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTGC 12 ; Cebador GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCAGGATTTGAACCTGCGCCAT i FTaml4 GCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTGC 13 Cebador CGCCGGACCACTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTT FTaml5 TTTAAGC 1 14 Cebador CAAATTCGTCCATATGGGATTCC 1 FTaml6 15 Cebador GTAACGCTGAATTCCCGGCG FTaml7 SEQ ID Etiqueta SECUENCIA NO: 16 hGH ATGGGCCACCACCACCACCACCACTTCCCAACCATTCCCTTA (ADN)' ¦ TCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTG CACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAGAAGCC 1 TAGATCCCÁAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCC 1 ' CAGACGTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCC V AACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCTC 1 CGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTG I CAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGC GCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAG 1 GAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGC 1 CCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTC 1 GACACAAACTCACACAACGATGACGCACTACTCAAGAACTAC i GGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGC 1 TGTGGCTTCTAA SEQ ID Etiqueta SECUENCIA NO: 17 , Mutante MDEFEMIKRN TSEIISEEEL REVLKKDEKS D286R de AVIGFEPSGK IHLGHILQIK KMIDLQNAGF 1 E9 DI I I ILADLH AILNQKGELD EIRKIGDYNK KVFEAMGLKA KYVYGSEHGL DKDYTLNVYR LALKTTLKRA RRS ELIARE DENP VAEVI YPIMQVNGIH YEGVDVAVGG MEQRKIHMLA 1 RELLPKKVVC IHNPVLTGLD GEGK SSSKG 1 NFIAVDDSPE EIRAKIKKAY CPAGVVEGNP 1 IMEIAKYFLE YPLTIKRPEK FGGDLTVNSY EELESLFKNK ELHPMRLKNA VAEELIKILE PIRKRL 18 Cebador . gtattaccctgttatccctatggcgaaattcagaatgattct 1 1 de Y31 c 19 Cebador cagaaaccgcgtgttgttcctaaacaatgtaatcattac 2 de Y31 0 ! Cebador gtaatgattacattgtttaggaacaacacgcggtttctg 3 de Y31 1 Cebador gagagcggtgtttgcgtactg 4 de Y31 2 Cebador attaccctgttatccctagacgctcagtggaacgaaaactca 5 de Y31 cg 3 Cebador tagggataacagggtaatacaatttcaggtg 6 de Y31 SEQ ID Etiqueta SECUENCIA NO: 24 Cebador ggtcagcttgtcgaaagtaccg 7 de Y31 25 Cebador ctacggttcgatcatctccagctagggataacagggtaat 8 de Y31 26 Cebador gtattaccctgttatccctatggcgaaattcagaatgattct 1 de N51 c 27 ! Cebador gattacattgtttaggaacaacacgcggtttctg 2 de N51 28 1 Cebador cagaaaccgcgtgttgttcctaaacaatgtaatc 3 de N51 29 ; Cebador gagagcggtgtttgcgtactg 4 de N51 30 i Cebador attaccctgttatcccta 5 de N51 gacgctcagtggaacgaaaactcacg 31 Cebador tagggataacagggtaatacaatttcaggtg 6 de N51 2 Cebador ggtcagcttgtcgaaagtaccg 7 de N51 3 Cebador ctaaacaatgtaatctagggataacagggtaat 8 de N51 SEO, ID Etiqueta SECUENCIA NO: 34 Mutante atggctatctcaatcaagaccccagaagatatcgaaaaaatg ámbar cgcgtcgctggccgactggctgccgaagtgctggagatgatc ? Al2 de gaaccgtaggttaaaccgggcgtcagcaccggcgagctggat MAP Y31 . cgcatctgtaatgattacattgttaatgaacaacacgcggtt tctgcctgcctcggctatcacggctatccgaaatccgtttgc atctctattaatgaagtggtgtgccacggtatcccggacgat gctaagctgctgaaagatggcgatatcgttaacattgatgtc accgtaatcaaagatggtttccacggcgatacctcgaaaatg 1 tttatcgtcggtaagccgaccatcatgggcgaacgtctgtgc cgcatcacgcaagaaagcctgtacctggcgctacgcatggta aaaccaggcattaatctgcgcgaaatcggtgcggcgattcag 1 aaatttgtcgaagcagaaggcttctccgtcgttcgtgaatat tgcggacacggtattggtcgcggcttccatgaagaaccgcag gtgctgcactatgactcccgtgaaaccaacgtcgtactgaaa cctgggatgacgttcaccatcgagccaatggtcaacgcgggt aaaaaagagatccgcaccatgaaagatggctggacggtaaaa accaaagatcgcagcttgtctgcacaatatgagcatactatt gtggtgactgataacggctgcgaaattctgacgctacgcaag gatgacaccatcccggcgataatctcgcacgacgaataa SEQ IE Etiqueta SECUENCIA NO: 35 utante atggctatctcaatcaagaccccagaagatatcgaaaaaatg ámbar D2 cgcgtcgctggccgactggctgccgaagtgctggagatgatc de ??? gaaccgtatgttaaaccgggcgtcagcaccggcgagctggat 1 N51 cgcatctgtaatgattacattgtttaggaacaacacgcggtt tctgcctgcctcggctatcacggctatccgaaatccgtttgc atctctattaatgaagtggtgtgccacggtatcccggacgat gctaagctgctgaaagatggcgatatcgttaacattgatgtc 1 accgtaatcaaagatggtttccacggcgatacctcgaaaatg tttatcgtcggtaagccgaccatcatgggcgaacgtctgtgc cgcatcacgcaagaaagcctgtacctggcgctacgcatggta aaaccaggcattaatctgcgcgaaatcggtgcggcgattcag aaatttgtcgaagcagaaggcttctccgtcgttcgtgaatat tgcggacacggtattggtcgcggcttccatgaagaaccgcag Í gtgctgcactatgactcccgtgaaaccaacgtcgtactgaaa cctgggatgacgttcaccatcgagccaatggtcaacgcgggt aaaaaagagatccgcaccatgaaagatggctggacggtaaaa accaaagatcgcagcttgtctgcacaatatgagcatactatt gtggtgactgataacggctgcgaaattctgacgctacgcaag gatgacaccatcccggcgataatctcgcacgacgaataa 1 Ejemplo 3: Vacuna Ambrx viva para la Mycobacterium subespecie paratuberculosis Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) es una bacteria 1 patógena estricta que provoca la enfermedad de Johne en el ganado y otros rumiantes. Un estudio reciente estimó que el 21% ? del ganado lechero de los Estados Unidos está infectado, dando como resultado considerables - pérdidas económicas para la industria láctea que representan en total más de 200 millones de dólares al año. La enfermedad de Johne sólo puede tratarse con una combinación de antibióticos tales como rifabutina y un macrólido tal como claritromicina . Los regímenes de tratamiento pueden durar años. Una vacuna para MAP eficaz es crítica porque ha habido vacunas para la paratuberculosis comercialmente disponibles pero desafortunadamente no son completamente eficaces en la prevención de la enfermedad.

Relación entre MAP y la enfermedad de Crohn humana La enfermedad de Crohn afecta a entre 400.000 y 600.000 personas en Norteamérica. Estimaciones de prevalencia para el norte de Europa han oscilado desde 27-48 por cada 100.000. Desde hace mucho tiempo se ha sospechado que es un agente causante de la enfermedad de Crohn en seres humanos; esta relación es controvertida. Suponiendo que MAP es un agente causante de la enfermedad de Crohn,' Giaconda está buscando comercializar una i combinación de rifabutina, claritromicina y clofazimina (Myoconda) como posible terapia farmacológica para la enfermedad de Crohn. Con una respuesta clínica de casi el 95% en un ensayo clínico de fase II. El ensayo de fase Illa demostró una mejora estadísticamente significativa para lograr la remisión a las 16 semanas en comparación con la terapia convencional. Sin embargo, Myoconda® no logró resultados estadísticamente significativos para mantener ¡la remisión tras completarse la terapia en este ensayo.

Actualmente, t las vacunas disponibles ofrecidas son vacunas vivas atenuadas (cepa 316 F) , a base de células completas inactivadas (cepa 18) , y también hay un ensayo de vacuna de subunidad en curso, sin embargo las vacunas actuales sólo retrasan la presencia fecal y la progresión hasta la enfermedad clínica, pero no protegen frente a la infección (Expert Rev. Vaccines 7(6) 2008) . Este campo está buscando de manera ideal una vacuna racionalmente atenuada.

Dado que se publicó la secuencia del genoma completo de MAP (PNAS 2005 12344-12349) y se realiza la expresión de genes foráneos 'en MAP, la deleción específica de genes y la mutación específica del sitio son ahora herramientas disponibles para MAP (Applied and Environmental Microbiology 2008 1687-1695) . La vacuna Ambrx será una · MAP dependiente de aminoácidos no naturales de organismo completo genéticamente modificado que se administrará como vacuna para prevenir la infección por MAP en animales. Se seleccionan genes esenciales y después se transforman para incluir una o más mutaciones ámbar específicas del sitio. La MAP se caracteriza mediante cultivo celular con y sin el aminoácido no natural presente en los medios de cultivo, se caracterizan las tasas de reversión, y el organismo completo Ejemplo 4 : Creación de células competentes con supresión/Lambda Red Se preparó una cepa de E. coli. La cepa de E. coli puede realizar tanto la supresión ámbar como la recombinación de Lambda Red. Se prepararon W3110 E. coli que contenían pKD46n mostrado en la figura 5 y después se transformaron mediante electroporación con el ; plásmido pVKlO/camR mostrado en la figura 4. Se i seleccionaron transformantes positivos sobre placas de agar LB que conteníanj ampicilina 50 µg/mL y cloranfenicol 34 µg/mL crecidas a lo largo de 48 horas a 30°C.

Se prepararon células electrocompetentes que contenían ambos p-lásmidos haciendo crecer un cultivo de 500 mL que contenía ambos i plásmidos; en medios de LB que contenían ampicilina 50 g/mL, cloranfenicol 34 g/mL, y arabinosa al 0,2% hasta una DO600 final de 0,5. Entonces se lavaron las células tres veces con glicerol al 10% y se resuspendieron en 500 µL de glicerol al 10%. Se almacenaron alícuotas de 60 µL a -80°C para su uso futuro.

Ejemplo 5: Creación de metiona aminopeptídasa letal condicional ¦ Se generaron cepas de E. coli con metiona aminopeptídasa letal condicional. Se introdujo una mutación ámbar en uno de dos sitios dentro del gen de metiona aminopeptídasa, Y31 o N51. Para integrar estos mutantes en el cromosoma de E. coli, se generó una pieza lineal de ADN recombinante mediante PCR de solapamiento, tal como se muestra en el diagrama en la figura 6. En primer lugar, usando los cebadores 1 y 2 (SEQ ID NO: 18 ó 26) , se clonó el extremo 5' del gen de la metiona aminopeptidasa (producto A de PCR) , terminando en el aminoácido seleccionado (o bien Y31 o bien i N51) que 'se convirtió del codón nativo en el codón ámbar. Se clonó el extremo 3' del gen de la metiona aminopeptidasa, comenzando con í la mutación ámbar, usando cebadores 3 (SEQ ID NO: 20 ó 28) y 4 (SEQ ID NO: 21 ó 29) (producto B de PCR) . Los 'dos productos de reacción ( se solapan n la secuencia que flanquea la mutación ámbar, y se amplificaron estos productos con los cebadores 1 (SEQ ID NO: 18 ó 26) y 4 (SEQ ID NO: 21 ó 29) para dar el producto C, el gen completo de la metiona aminopeptidasa con una sustitución de codón ámbar en la posición 31 ó 51.

Para crear el molde de mutagénesis completo, se amplificó un marcador de resistencia a kanamicina flanqueado por sitios de reconocimiento de endonucleasa "homing" (dirigida) I-scel usando cebadores. 5 (SEQ ID NO: 22 ó 30) y 6 (SEQ ID NO: 23 ó 31) con ADN procedente de una cepa de E. coli previamente generada (producto D de PCR) . Se usaron los cebadores 7 (SEQ ID NO: 24 ó 32) y 8 (SEQ ID NO: 25 ó 33) para amplificar la secuencia genómica en el í sentido 5' de la metiona aminopeptidasa y el extremo 5' de la metiona aminopeptidasa, para permitir la eliminación del marcador de resistencia a la kanamicina y la recombinación homologa (producto E de PCR) . El molde de ADN final para la transformación se creó amplificando fragmentos E, D y C usando los cebadores 7 (SEQ ID NO: 24 ó 32) y 4 (SEQ ID NO: 21 ó 29).

Ejemplo 7: Transformación y selección de clones de metiona aminopeptidasa letal condicional Se usó el molde de transformación generado mediante PCR de i solapamiénto para transformar células positivas para pKD46, pVKlO-camR eléctrocompetentes . Se seleccionaron los transformantes positivos haciendo crecer colonias en placas de LB agar- que contenían' ampicilina 50 g/mL, kanamicina 50 µg/mL, y pAF 2 mM durante 48-72 horas a 30°C. Para someter a prueba para determinar i ' el crecimiento dependiente de pAF, se hicieron crecer 96 colonias para cada sitio en 1 mL de LB que contenía ampicilina 50 µg/mL, kanamicina 50 µ/mL, y pAF 1 mM durante 72 horas a 30°C, también mostrado : en la figura 7,· figura 8 y figura 9. Entonces se sembraron¡ en placas por duplicado estos clones en agar LB que contenía ampicilina 50 µg/mL, kanamicina 50 µg/mL, y pAF 2 mM y agar LB que contenía ampicilina 50 µg/mL, y kanamicina 50 µg/mL sin pAF. Se hicieron crecer estas placas duplicadas durante 72 horas a 30°C y después se almacenaron para su crecimiento. Se seleccionaron clones que sólo mostraron crecimiento en presencia de pAF 2 mM para su análisis adicional.

Ejemplo 8: Selección y maduración de clones Se seleccionaron clones que eran positivos para la dependencia de pAF para su estudio adicional. Estos clones fueron Y31 A12, Y31 C5, Y31 E3, N5l' D2 y N51 H9. Volvieron a seleccionarse los clones individualmente y todos crecieron sólo en medios que contenían pAF. Se secuenciaron los clones pára determinar la presencia de un codón ámbar (tag) en el sitio apropiado!: Y31 o N51. Los cinco tenían un codón ámbar en la ubicación| apropiada. Entonces se aislaron los clones Y31 A12 y N51 D2 y se extrajo el plásmido pKD46 mediante tratamiento térmico í repetido a 37 grados Celsius.

Una ^ vez perdida la resistencia a ampicilina y pKD46, se transformaron las células con plásmido que contenía la enzima I-Scel. Tras el tratamiento con esta enzima, se seleccionaron varios clones y se sometieron a prueba para determinar la resistencia a kanamicina. Volvieron a secuenciarse los clones que no eran resistentes a kanamicina y se congelaron en disoluciones madre de glicerol ¡ al 10%. Estos clones serán los clones de metiona aminopeptidasa dependiente de pAF finales.

En algunas realizaciones de la presente invención, las tasas de reversión deseadas, contempladas esquemáticamente en la figura 11, serán inferiores a 10"9 de frecuencia de reversión con un único cambio. Se sometieron a prueba los clones Y31 y N51 y las tasas de reversión se muestran en la tabla 2.

TABLA 2: TABLA 3: I b0090 ;murG UDP-N-acetilglucosamina-N-acetilmuramil- (pentapéptido) pirofosfor.il-undecaprenol-N- ácetilglucosamina transferasa (EC 2.4.1.-) b0091 murC UDP-N-acetilmuramato-alanina ligasa (EC i 6.3.2.8) b0093 , ftsQ Proteina de división celular ftsQ b00-94 ftsA Proteina de división celular ftsA b0095 ftsZ Proteina de división celular ftsZ b00.98 secA Subunidad secA de preproteina translocasa b0168 map Metionina aminopeptidasa (EC 3.4.11.18) b0169 rpsB Proteina ribosómica S2 30S b0171 pyrH Uridilato cinasa (EC 2.7.4.-) b0172 frr Factor de reciclaje del ribosoma b0174 uppS Undecaprenil pirofosfato sintetasa (EC 2.5.1.31) b0175 cdsA Fosfatidato citidililtransferasa (EC 2.7.7.41) b0180 fabZ ( 3R) -hidroximiristoil- [proteina portadora de acilo] deshidratasa (EC 4.2.1.-) b0181 lpxA Acil- [proteina portadora de acilo] -UDP-N- acetilglucosamina O-aciltransferasa (EC 1 2.3.1.129) b0182 lpxB Lipido-A-disacárido sintasa (EC 2.4.1.182) b0184 idnaE Subunidad alfa de la ADN polimerasa III (EC 2.7.7.7) b0185 accA Subunidad alfa de la carboxilo transferasa de la acetil-coenzima A carboxilasa (EC 1 6.4.1.2) b0194 proS Prolil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.15) b0416 nusB Proteína B de utilización la sustancia N b0420 dxs l-desoxi-D-xilulosa5-fosfato sintasa (EC 4.1.3.37) b0421 ispA Geraniltranstransferasa (EC 2.5.1.10) b0470 dnaX Subunidad tau de la ADN polimerasa III (EC 2.7.7.7) b0474 adk Adenilato cinasa (EC 2.7.4.3) b0526 cysS Cisteinil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.16) b0634 mrdB Proteína rodA de determinación de la forma de bastón b0635 mrdA Proteína 2 de unión a penicilina b0640 holA Subunidad delta de la ADN polimerasa III (EC 2.7.7.7) b0642 leuS Leucil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.4) b0680 glnS Glutaminil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.18) b0893 serS Seril-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.11) b0914 rrisbA Proteína msbA de unión a ATP de transporte probable I bl288 fabl Enoil- [proteina portadora de acilo] reductasa [NADH] (EC 1.3.1.9) bl714 pheS Cadena alfa de la fenilalanil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.20) bl716 rplT Proteina ribosómica L20 50S bl718 infC Factor IF-3 de inicio de la traducción bl740' nadE NAD ( + ) sintetasa dependiente de NH(3) - (EC 6.3.5.1) bl866 aspS Aspartil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.12) bl876 argS Arginil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.19) b2185 rplY Proteina ribosómica L25 50S b2234 hrdA Cadena alfa de la ribonucleósido-difosfato reductasa 1 (EC 1.17.4.1) b2235 hrdB Cadena beta de la ribonucleósido-difosfato reductasa 1 (EC 1.17.4.1 ) b2323 fabB 3-oxoacil- [proteina portadora de acilo] sintasa I (EC 2.3.1.41) b2400 gltX Glutamil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.17) b2411 ligA ADN ligasa (EC 6.5.1.2) b2412 zipA Proteina de división celular zipA b2496 yfgE Proteina yfgE hipotética b251 hisS Histidil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.21) b2563 acpS Holo- [proteina portadora de acilo] sintasa (EC 2.7.8.7) b2606 rplS Proteína ribosómica L19 50S b2607 trmD ARNt (guanina- (1) -) -metiltrans ferasa (EC 2.1.1.31) b2609 rpsP Proteína ribosómica S16 30S b2610 ffh Proteína de partícula de reconocimiento de señal b2614 grpE Proteína GrpE b3018 plsC l-acil-sn-glicerol-3-fosfato aciltransfer'asa (EC 2.3.1.51) b3019 parC Subunidad A de la topoisomerasa IV (EC 5.99.1.-) ¦ b3030 parE Subunidad B de la topoisomerasa IV (EC 5.99.1.-) b3041 ribB 3, 4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato sintasa b3067 rpoD Factor rpoD sigma de la ARN polimerasa b3165 rpsO Proteína ribosómica S15 30S b3183 yhbZ Proteína yhbZ de unión a GTP hipotética b3230 rpsl Proteina ribosómica S9 30S b3231 rplM Proteína ribosómica L13 50S b3287 def Péptido desformilasa (EC 3.5.1.88) b3298 rpsM Proteína ribosómica S13 30S b3300 secY Subunidad secY de la prepróteína translocasa b3301 rplO Proteína ribosómica L15 50S b3303 rpsE Proteína ribosómica S5 30S b3304 rplR Proteína ribosómica L18 50S b3305 rplF Proteína ribosómica L6 50S b3307 rpsN Proteína ribosómica S14 30S b3309 rplX Proteína ribosómica L24 50S b3310 ;rplN Proteína ribosómica L14 50S b3311 rpsQ Proteína ribosómica S17 30S b3316 rpsS Proteína ribosómica S19 30S , b3317 ,rplB Proteína ribosómica L2 50S b3318 rplW Proteíná ribosómica L23 50S b3319 !rplD Proteína ribosómica L4 50S b3320 !rplC Proteína ribosómica L3 50S b3321 rpsJ Proteína ribosómica S10 30S b3340 !fusA Factor G de elongación b3342 lrpsL Proteína ribosómica S12 30S b3384 trpS Triptofanoil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.2) b3464 ftsY Proteína de división celular ftsY b3559 glyS Cadena beta de la glicil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.14) b3633 kdtA Ácido 3-desoxi-D-mano-octulosónico transferasa (EC 2.-.-.-) b3634 coaD Fosfopanteteína adenililtransferasa (EC 2.7.7.3) b3640 dut Desoxiuridina 5' -trifosfato nucleotidohidrolasa (EC 3.6.1.23) b3648 gmk Guanilato cinasa (EC 2.7.4.8) b3702 dnaA Proteina dnaA iniciadora de la replicación cromosómica b3730 'glmU Proteina glraU bifuncional b3865 'engB Proteina engB de unión a GTP probable b3967 'murl Glutamato raceraasa (EC 5.1.1.3) b3985 xplJ Proteina ribosómica LIO 50S b3986 irplL Proteina ribosómica L7/L12 50S b3987 rpoB Cadena beta de la ARN polimerasa dirigida a ADN (EC 2.7.7.6) b3988 rpoC Cadena beta' de la ARN polimerasa dirigida a ADN (EC 2.7.7.6) b4052 dnaB ADN helicasa replicativa (EC 3.6.1.-) b4142 groS Chaperonina de 10 kDa b4143 groL Chaperonina de 60 kDa b4147. efp Factor P de elongación b4200 rpsF Proteina ribosómica S6 30S b4226 ppa Pirofosfatasa inorgánica (EC 3.6.1.1) b4258 yalS Valil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.9) b4361 dnaC Proteina dnaC de replicación de ADN b4362 dnaT Proteina I primosómica Ejemplo 9: Sembrar una cepa del mismo tipo y pasar tal como se usó para la vacuna, para la poliomielitis (oral), transformar para incluir mutaciones ámbar en más de un gen esencial, y cultivar.

Cultivo celular: i) Diferentes sustratos celulares para la propagación de virus incluyen linea celular diploide humana, células de riñon de i mono, linea celular Vero o cualquier otro cultivo celular adecuado.! ii) Producción de células a gran escala: 1. Preparación del banco de células de trabajo del fabricante (MWCB) : se prepara MWCB en caso de cultivos celulares primarios (células derivadas de tejido normal y almacenadas congeladas a -70°C) o de cualquier otra linea celular continua permitida a partir de las células y se combinan las células tras un subcultivo en serie dentro del número especificado de cultivos celulares. 2. Puede usarse cualquiera de los siguientes sistemas que sea adecuado, para el aumento gradual del volumen de células. Frascos rotativos: el crecimiento en frascos rotativos se diferencia del de cultivos estacionarios en la distribución de células sobre la superficie de vidrio y la densidad '< celular máxima alcanzable. Los cultivos en frascos rotativos¡ no se deterioran menos rápidamente ya que pueden tolerar una densidad casi dos veces superior a la de los. cultivos estacionarios. Las células de mamífero crecidas en cultivo en monocapa 'se adaptarán de la mejor manera a la técnica de frascos rotativos. Fábricas celulares: son pilas de bandejas de cultivo que comparten un orificio de entrada y de salida común.

Proporcionan células con una superficie de crecimiento tan grande como en el interior del frasco rotativo, pero ocupan menos espacio dentro de la incubadora. Son ideales para cultivos celulares adherente¡s, tienen baja contaminación, riesgo y son compactos. Sistema de microportador de frascos de Roux 3. Se incuban muestras para cultivos celulares de control por separado durante al menos dos semanas y se examinan para detectar evidencias de cambios citopáticos .

Propagación del virus de la polio en cultivos celulares: i) Sistema de lote de siembra: a) Nivel de paso tal como se sigue par'a la vacuna para la polio oral o b) Su siguiente nivel de paso derivado para la suspensión a granel monovalente que podría usarse para fabricar la vacuna para la polio oral. 1. Se fabrica la vacunal basándose en el sistema de lote de siembra de virus. El lote de siembra de virus es una cantidad de virus procesado junto y de composición uniforme preparado a partir del lote de siembra. 2. El subcultivo del virus de siembra no debe realizarse más de 10 veces contando desde un lote de siembra usado para la producción de la vacuna sobre la que se realizaron las pruebas originales de laboratorio y en el campo.

Combinaciones monovalentes y recogida individual: Se propaga el virus en los cultivos celulares y se recoge a i partir de| cultivos celulares derivados de un único lote de células y se procesan juntos. Esto se conoce como recogida individual. Las recogidas : individuales de un tipo de suspensión de virus se procesan jal mismo tiempo para conseguir el bruto a partir de la combinación monovalente.

Filtración o clarificación de la combinación monovalente: Se purifica gradualmente la suspensión de virus en bruto de cada combinación monovalente mediante filtros de porosidad decreciente. El propósito de la etapa de filtración es eliminar el materia'l | particulado y otras sustancias que puedan afectar al proceso de inactivación ya que los agregados tienden a aumentar con el reposo.

Concentración de la combinación monovalente: Se concentra mediante ultra-filtración cada combinación monovalente filtrada.

Purificación de la combinación monovalente: Se emplea la cromatografía con DEAE sefarosa/columna de ADN-asa inmovilizada/columna de inmunoadsorción para la purificación de la combinación monovalente. El proceso de purificación reduce sistemáticamente el nivel de ADN celular desde el de la recogida de virus inicial en un factor de al menos 108. Se determina la concentración en antigeno D mediante ELISA y se presenta visualmente. la inmunogenicidad comparable en ratas. Por consiguiente se ajusta la potencia. Se combinan las combinaciones monovalentes de poliovirus para formar el producto a granel trivalente final.

Formulación y fabricación de la vacuna: Se filtra el producto a granel purificado, preferiblemente a través de un filtro de 0,22 mieras o 0,45 mieras. Los virus transformados monovalentes continúan en presencia de aminoácido no natural y opcionalmente se mezclan con estabilizante y/o conservante para ' preparar vacuna monovalente, bivalente, trivalente o multivalente .

Pruebas de la eficacia de la vacuna: Se encuentra que la eficacia de la vacuna según se fabricó I anteriormente, en comparación con una vacuna de referencia establecida, es similar en el método in vitro y/o in vivo.

Se llevaron a cabo varias otras pruebas basadas en métodos aceptados convencionales con la vacuna fabricada anterior tales como detérminación del pH, pruebas de esterilidad, prueba para determinar la transformación eficaz (por ejemplo división y verificación de la muerte en ausencia de aminoácido no natural) , estudio de toxicidad anómala, medición del volumen, determinación de la potencia in vitro, prueba de endotoxina, prueba de identidad estimación del contenido en nitrógeno proteico, y determinación de contenido en estabilizante y contenido en formaldehido para garantizar su eficacia, seguridad y potencia.

Se determinó la potencia in vitro de la SIPV fabricada anterior , usando una ELISA de tipo sándwich. Se usaron dos anticuerpos primarios generados en diferentes especies contra el virus de la polio para el mismo y se usó un anticuerpo secundario conjugado con HRP en el segundo anticuerpo primario. Se analizaron los resultados mediante comparación con un patrón de referencia.

Se llevó a cabo la prueba de identidad para la vacuna usando ELISA directa. Se recubrió antigeno en 96 placas de ELISA y se emplearon sueros anti-polio específicos del tipo para determinar la presencia de los. tres tipos de virus de la polio en la vacuna.

Aunque se ha descrito la invención anterior en cierto detalle para los ¡ fines de claridad y comprensión, resultará evidente para un experto en la técnica a partir de la lectura de esta descripción que pueden realizarse diversos cambios en la forma y los detalles sin apartarse del alcance verdadero de la presente I invención. Por ejemplo, todas las técnicas y aparatos descritos anteriormente pueden usarse en diversas combinaciones. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y/u otros I documentos citados en esta solicitud se incorporan como referencia en su totalidad para todos los fines en la misma medida que si cada publicación, patente, solicitud de patente y/u otro documento individuales se indicaran individualmente que se incorporan como referencia para todos los fines.

Claims

REIVINDICACIONES Célula de Mycobacterium aviu subespecie para tuberculosis "(MAP) , caracterizada porque se ha incorporado un aminoácido no .natural en la secuencia de aminoácidos de un producto génico esencial. MAP 1 según la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido no natural se incorpora en un producto génico de MAP i que se requiere para la replicación. MAP ! según la reivindicación 1, caracterizada porque se incorpora más de un aminoácido no natural en más de un producto génico esencial. Célula de E. coli, caracterizada porqué se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. Célula bacteriana, caracterizada porque se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial. Célula, caracterizada porque se ha incorporado un aminoácido no natural en un producto génico esencial.