KR101732054B1 - 비천연 아미노산 복제 의존성 미생물 및 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비천연(non-natural, unnatural) 아미노산 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 사용을 통해 전 유기체(whole organism) 백신에 제한된 복제 능력을 제공하고, 이로써 백신 안전성 및 효능을 증가시키는 방법을 비롯한, 백신을 생산하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

비천연 아미노산 복제 의존성 미생물 및 백신{NON-NATURAL AMINO ACID REPLICATION-DEPENDENT MICROORGANISMS AND VACCINES}

본 발명은 백신에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 비천연(non-natural, unnatural) 아미노산 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 사용을 통해 복제 능력이 제한되거나 없는 전 유기체(whole organism) 백신을 포함한 백신을 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

지금까지 기술적 진보가 비교적 천천히 이루어졌고, 심지어 루이 파스퇴르(Louis Pasteur)가 사망한 후 100년이 넘도록 그의 "III"(단리, 불활성화, 주입: Isolation, Inactivation, Injection) 프로토콜은 계속해서 적용가능하다. 그러나, 분자 생물학 및 재조합 단백질 기술의 도래로 인해, 사람들은 서브유닛 백신 및 유전공학으로 조작된 전 유기체(whole-organism) 유사 백신을 개발하기 시작했다. 더욱 최근에는, 면역학의 진보로 인해 톨 유사 수용체(Toll-Like Receptor)(TLR) 리간을 포함한, 수가지 부류의 면역증강자가 이용가능하게 되었다. 일반적으로, 더욱 신규한 생산 백신 및 그에 따른 보조제는 화학적으로나 유전적으로 더욱 더 잘 정의되게 되어지고 있다.

바이러스, 박테리아, 원생동물, 진균과 같은 병원체에 지정된 치료제 및 특히 백신의 개발이 진행 중에 있다. 그러한 연구는 인간을 비롯한 동물에서의 질환이 전파되는 것을 예방하는 데 중요한 것으로 입증되었다. 실제로, 현대 의학에서 백신접종을 비롯한 면역요법으로 천연두가 근절되었고, 소아마비, 파상풍, 폐결핵, 수두 및 홍역과 같은 질환도 실질적으로 근절되었다.

일반적으로, 이상적 백신은 긴 반감기를 가지고, 사전선택된 병원체 및 모든 표현형의 변이체들에 대한 장기 지속 면역력을 유도할 수 있고, 백신이 지정되는 대상이 되는 질환을 유도할 수 없으며, 치유적으로나 예방적으로 유효하고, 경제적인 표준 방법을 이용하여 용이하게 제조되며, 당분야에 용이하게 투여될 수 있다.

상업적으로 입수가능한 백신에는 4가지 주요 부류가 있다. 이에는 무생(non-living) 전 유기체 백신, 생 약독화 백신, 벡터 백신 및 서브유닛 백신이 포함된다. 단백질과 같은 무생 물질을 이용한 백신접종은 일반적으로 항체 반응 또는 CD4+ 헬퍼 T 세포 반응을 초래하고, 한편 생 물질(예를 들어, 감염성 바이러스)을 이용한 백신접종은 일반적으로 CD8+ 세포독성 T-림프구(CTL) 반응을 초래한다. CTL 반응은 감염성 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체로부터의 보호를 위해 중요하다. 이는 실제적 문제를 제기하는데, 이는 CTR 반응을 달성하는 확실한 유일 방법이 자체가 병원성인 생 제제를 사용하는 것이기 때문이다. 이 문제는 일반적으로 약독화 바이러스 및 박테리아 균주를 사용하거나, 백신접종을 위해 사용될 수 있는 전 세포를 사멸함으로써 면해진다. 이 방법들은 잘 작용해왔으나, 약독화 균주의 사용이 항상 약독화 제제가 숙주 내에서 유전적으로 재조합하여 독성 균주로 변할 수 있다는 위험을 지닌다. 따라서, 특정 방식으로 단백질과 같은 무생 물질을 이용한 백신접종에 의해 CD8+ CTL 반응을 초래할 수 있는 치료제 및 방법이 필요하다.

서브유닛 백신은 상기 문제들 중 일부를 해소하기 위한 하나의 수단을 제공하였다. 그러한 백신은 일반적으로 관심의 대상이 되는 병원체로부터 유래된 세포 이하의 성분을 포함한다. 서브유닛 성분은 병원체의 세포 이하의 정의된 분획이거나, 정제된 단백질, 핵산 또는 다당류로부터 생성될 수 있다. 이들 요소 모두는 관심의 대상이 되는 병원체 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 항원성 결정자를 가진다. 일반적으로, 서브유닛 백신의 세포 이하의 성분은 방해된 병원체의 제제를 정제함으로써 수득되거나 공지된 절차를 이용하여 합성된다.

그러나, 서브유닛 백신과 관련하여 몇가지 한계가 있다. 첫째, 그러한 백신의 생산을 위한 한 요건은 항원성 결정자(들)가 특징분석되고 동정되어야 한다는 것이다. 이는 그것의 사용 시에, 특히 매우 가변성인 항원성 결정자에 대해 사용 시에 한계를 부과한다. 둘째, 서브유닛 백신은 일반적으로 세포독성 T 세포 반응을 자극하는 데 비효과적이다. 셋째, 서브유닛 백신에 의해 부여된 면역력은 종종 수명이 짧고, 이에 따라 연속 부스터 주입을 필요로 한다. 극소수의 재조합 발현 서브유닛 백신만이 (인간을 비롯한) 백신접종된 동물에서 강하고 장기 지속되는 면역력을 유도하는 것으로 나타났다. 한 주목할 만한 예외는 인간에게 사용되는 재조합 표면 항원 B형 간염 B 백신이다. 그러한 백신의 사용과 관련된 문제점들 중 하나는, 강한 체액성 면역력 및 강한 세포 매개 면역력이 유도되도록 면역계에 항원을 올바로 제시하는 것에 있는 것으로 보인다. 특히, 기준의 재조합 (서브유닛) 백신은 백신접종된 동물이 병원체에 의해 유발되는 자연 감염에 노출될 때 매우 재빨리 반응하도록 하는 강한 '기억' 반응을 초래하도록 호소하지 않는다.

단지 예로서, 소 바이러스 설사 바이러스(BVDV)와 같은 페스티바이러스로부터 제조된 현 서브유닛 백신의 결핍이 광위하게 보고되어왔다. 이 연구들은, 다량의 재조합 단백질이 백신에 사용될지라도, 백신이 생 BVDV 단리물(동종 보호 또는 이종 보호)을 이용하여 챌린지로부터 보호하지 못하는 것으로 나타나, 열악한 보호율이 관찰됨을 보여주었다.

유효한 백신이 아직 개발되지 못한 감염성 질환들이 많이 있고, 현재 입수가능한 백신들 중 다수는 질환에 대해 단지 부분적 보호만을 제공한다. 또한, 백신 분야에 공백(gap)이 있다. 생 백신은 다른 유형의 백신보다 더 강하고 더 넓고 더 지속적인 면역력을 생성한다. 면역억제된 개체에서도 질환을 유발할 수 없는, 보다 안전한 생 백신 비히클이 필요하다. 또한, 세포 매개 면역력을 유도하나 항체 기재의 면역력은 유도하지 않는 백신이 필요하다. 또한, 가장 많은 병원체가 도입되는 부분인 신체의 점막면에 면역 반응을 직접 유도할 필요가 있다. 따라서, 향상된 백신이 필요하다. 본 발명은 기존의 종래 기술에 있어서의 결점들 중 적어도 일부를 개선하는 향상된 치료 백신을 제공하고자 모색한다.

본 발명은 화학적으로 조절되는 복제 의존성 전 유기체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 복제능이 비천연 아미노산의 존재에 의존하도록 하는 변형을 가지는 화학적으로 조절되는 전 유기체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 유기체의 복제능이 비천연 아미노산의 존재 하에서의 배양에 의존하도록 하는 1가지 이상의 변형을 가지는 전 유기체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 유기체의 복제능이 하나 이상의 비천연 아미노산(들)의 존재 하에서의 배양에 의존하도록 하는 1가지 이상의 변형을 가지는 전 유기체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 유기체의 복제능이 비천연 아미노산(들)의 존재 하에서의 배양에 의존하도록 하는 2가지 이상의 변형을 가지는 전 유기체를 제공한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 전 유기체는 완화된 백신, 즉 하나 이상의 부위 특이적으로 도입된 비천연 아미노산에 의해 조절되는 백신으로서, 여기에서 면역화제의 복제 또는 발현은 비천연 아미노산의 존재 또는 부재에 의해 조절된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 전 유기체의 복제 또는 발현은 단일 유전 변형을 통해 비천연 아미노산의 존재 또는 부재에 의해 조절된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 전 유기체의 복제 또는 발현은 하나 이상의 유전 변형을 통해 비천연 아미노산의 존재 또는 부재에 의해 조절된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 전 유기체의 복제 또는 발현은 2가지 유전 변형을 통해 비천연 아미노산의 존재 또는 부재에 의해 조절된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 전 유기체의 복제 또는 발현은 3가지 유전 변형을 통해 비천연 아미노산의 존재 또는 부재에 의해 조절된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 전 유기체의 복제 또는 발현은 4가지 유전 변형을 통해 비천연 아미노산의 존재 또는 부재에 의해 조절된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 전 유기체의 복제 또는 발현은 5가지 유전 변형을 통해 비천연 아미노산의 존재 또는 부재에 의해 조절된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 전 유기체의 복제 또는 발현은 4가지 이상의 유전 변형을 통해 비천연 아미노산의 존재 또는 부재에 의해 조절된다.

유기체, 항원, 단백질 또는 자가 단백질에 대한 강한 면역 반응을 선택적으로 유도하는 능력 또는 외래 항원의 특정 에피토프의 면역원성을 증가시키는 능력은 다수의 질환 상태들(이에는 암 및 단백질 폴딩(folding) 질환이 포함되나 이에 한정되지 않음) 및 감염 질환(예를 들어, 박테리아 또는 바이러스 감염)에 대한 백신의 생산에 있어서 중요하다. 본 발명은 전 유기체 백신접종에 사용되는 복제 의존성 및/또는 복제 결핍 면역원을 생성시키거나 수동 면역화에 사용되는 항체를 생성시키기 위해 단백질 내로의 비천연 아미노산의 도입을 이용한다. 본 발명은 또한 백신접종에 사용되는 면역원을 생성시키거나 수동 면역화에 사용되는 항체를 생성시키기 위해, 단백질, 항원 및/또는 폴리펩티드 내로의 비천연 아미노산의 도입을 이용한다 본 발명에서, 비천연 아미노산이 부가되는 면역원은 백신접종될/면역화될 대상 내의 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분)에 상응하거나, 대상 내에 존재할 수 있는 표적 부분(예를 들어, 질환 관련 부분)에 상응한다. 비천연 아미노산을 가진 면역원이 대상에게 투여되는 실시양태에서, 비천연 아미노산의 존재는 표적(예를 들어, 질환 관련) 부분에 대한 교차 반응성을 보이는 면역원에 대한 면역학적 반응을 일으킨다.

제1 측면에서, 본 발명은 대상에서, 대상 내에 존재하거나 대상 내에 존재할 수 있는 표적 부분, 예를 들어, 폴리펩티드, 탄수화물 또는 이들의 조합에 대한 면역학적 반응, 예를 들어, B 세포 매개 반응 및/또는 T 세포 매개 반응을 일으키거나 증강시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유전적으로 변형된 비천연 아미노산 의존성 유기체를 제공하는 단계 및 그 유기체를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 유전적으로 변형된 비천연 면역원을 제공하는 단계 및 그 비천연 면역원을 대상에게 투여하는 단계도 또한 포함한다. 대상(예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 가축, 돼지, 소, 닭, 관행 케이지 사육조(cage bird), 개방형 복지 케이지 사육조(aviary bird), 가정용 애완동물, 개, 고양이, 파충류 및/또는 양서류)은 표적 부분에 대해 교차 반응성인(이로써 표적에 대한 면역학적 반응을 일으키거나 증강시키는), 비천연 면역원에 대한 하나 이상의 항체를 생성한다.

특정 실시양태에서, 유전적으로 변형된 전 유기체는 대상, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마, 원생동물, 연충 또는 프리온을 면역화하는 것이 바람직한 그 대상이 되는 임의의 전 유기체일 수 있다. 전 유기체 백신은 임의적으로 하기의 것들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 박테리아 항원, 바이러스 항원, 진균 항원, 마이코플라스마 항원, 원생동물 항원, 연충 항원, 프리온 항원, HIV 항원, HIV gp120, HIV gp41, HIV gag, HIV pol, HIV env, HIV tat, HIV nef, HIV rev, 칼리시바이러스(calicivirus) 캡시드 항원, B형 간염 코어 항원, B형 간염 표면 항원, 간염 델타 물질, 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질, 수두 대상포진 바이러스 당단백질, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제, 인플루엔자 바이러스 핵단백질, HPV 캡시드 단백질, 파라인플루엔자(parainfluenza) 바이러스 헤마글루티닌/뉴라미니다제, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩티드, Hep A 항원, 백시니아 바이러스 폴리펩티드, 공수병 바이러스 당단백질 G, B. 버그도페리(B. burgdorferi) OspA, H. 인플루엔자(H. influenzae) 타입 b 외막 단백질, 마이코박테리움 리포아라비노만난, 마이코박테리움 mAPG, S. 파이오진스(S. pyogenes) M 단백질, S. 뉴모니아(S. pneumoniae) 캡슐형 다당류, Y. 페스티스(Y. pestis) F1, Y. 페스티스 V 항원, P. 팔시파룸 서컴스포로조이트(P. falciparum circumsporozoite)(PfCSP), P. 팔시파룸 스포로조이트(P. falciparum sporozoite) 표면 단백질 2(PfSSP2), 간 상태(liver state) 항원 1의 P. 팔시파룸 카르복실 말단(PfLSA1 c-말단), P. 팔시파룸 외수송 단백질 1(PfExp-1), Pfs 48/45, Pfs 28, Pfs 25 또는 Pfs 230.

유전적으로 변형된 비천연 아미노산-복제 의존성 유기체는 하기의 것들 중 하나일 수 있다: 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마, 원생동물, 연충, 프리온, 액티노마이세스(Actinomyces), 바실러스(Bacillus), 박테로이드(Bacteroides), 보르데텔라(Bordetella), 바르토넬라(Bartonella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 캠필로박터(Campylobacter), 캡노사이토파가(Capnocytophaga), 클라미디아(Chlamydia), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 콕시엘라(Coxiella), 더마토필러스(Dermatophilus), 엔테로코커스(Enterococcus), 에를리히아(Ehrlichia), 에스케리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 해모바르토넬라(Haemobartonella), 해모필러스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 크렙시엘라(Klebsiella), L형 박테리아, 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria), 마이코박테리움, 마이코플라스마, 네이세리아(Neisseria), 네오릿케치아(Neorickettsia), 노카르디아(Nocardia), 파스투렐라(Pasteurella), 펩토코커스(Peptococcus), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus), 뉴모코커스(Pneumococcus), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 릿케치아(Rickettsia), 로칼리매아(Rochalimaea), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 여시니아(Yersinia), 아데노바이러스(adenovirus), 알파바이러스(alphavirus), 칼리시바이러스, 코로나바이러스(coronavirus), CMV, 디스템퍼(distemper) 바이러스, 에볼라(Ebola) 바이러스, 엔테로바이러스(enterovirus), EBV, 플라비바이러스(flavivirus), Hep C, 헤파드나바이러스(hepadnavirus), Hep B, 간염 델타 물질, Hep E 또는 F 바이러스, GBVC, 헤르페스바이러스(herpesvirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 면역결핍 바이러스, HIV, 감염성 복막염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 백혈병 바이러스, 마버그(Marburg) 바이러스, 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus), 파필로마(papilloma) 바이러스, HPV, 파라인플루엔자 바이러스, 파라믹소바이러스(paramyxovirus), RSV, 파르보바이러스(parvovirus), 페스티바이러스(pestivirus), 피코나(picorna) 바이러스, 폴리오바이러스, 폭스(pox) 바이러스, 백시니아 바이러스, 공수병 바이러스, 레오바이러스(reovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 로타바이러스(rotavirus), 압시디아(Absidia), 아크레모늄(Acremonium), 알터나리아(Alternaria), 아스퍼질러스(Aspergillus), 바시디오볼루스(Basidiobolus), 비폴라리스(Bipolaris), 블라스토마이세스(Blastomyces), 칸디다(Candida), 콕시디오이드(Coccidioides), 코니디오볼루스(Conidiobolus), 크립토코커스(Cryptococcus), 쿠르발라리아(Curvalaria), 에피더모파이톤(Epidermophyton), 엑소피알라(Exophiala), 지오트리쿰(Geotrichum), 히스토플라스마(Histoplasma), 마두렐라(Madurella), 말라스세지아(Malassezia), 마이크로스포룸(Microsporum), 모닐리엘라(Moniliella), 모르티에렐라(Mortierella), 뮤코(Mucor), 패실로마이세스(Paecilomyces), 페니실륨(Penicillium), 피알레모늄(Phialemonium), 피알로포라(Phialophora), 프로토테카(Prototheca), 슈달레스케리아(Pseudallescheria), 슈도마이크로도키움(Pseudomicrodochium), 파이티움(Pythium), 리노스포리듐(Rhinosporidium), 리조푸스(Rhizopus), 스콜레코바시듐(Scolecobasidium), 스포로트릭스(Sporothrix), 스템파일리움(Stemphylium), 트리코파이톤(Trichophyton), 트리코스포론(Trichosporon), 크실로하이파(Xylohypha), 바베시아(Babesia), 발란티듐(Balantidium), 베스노이티아(Besnoitia), 크립토스포리듐(Cryptosporidium), 에이메리아(Eimeria), 엔세팔리토조온(Encephalitozoon), 엔타모에바(Entamoeba), 기아르디아(Giardia), 함몬디아(Hammondia), 헤파토조온(Hepatozoon), 이소스포라(Isospora), 레이쉬마니아(Leishmania), 마이크로스포리디아(Microsporidia), 네오스포라(Neospora), 노세마(Nosema), 펜타트리코모나스(Pentatrichomonas), 플라스모듐(Plasmodium), 피. 팔시파룸, 뉴모시스티스(Pneumocystis), 사코시스티스(Sarcocystis), 스키스토소마(Schistosoma), 테일레리아(Theileria), 톡소플라스마(Toxoplasma), 트리파노소마(Trypanosoma), 아칸소케일로네마(Acanthocheilonema), 앨루로스트론길루스(Aelurostrongylus), 안실로스토마(Ancylostoma), 안지오스트론길루스(Angiostrongylus), 아스카리스(Ascaris), 브루기아(Brugia), 부노스토뭄(Bunostomum), 캐필라리아(Capillaria), 차베르티아(Chabertia), 코오페리아(Cooperia), 크레노소마(Crenosoma), 딕티오카울루스(Dictyocaulus), 디옥토파임(Dioctophyme), 디페탈로네마(Dipetalonema), 디파일로보스륨(Diphyllobothrium), 디플라이듐(Diplydium), 디로필라리아(Dirofilaria), 드라쿤쿨러스(Dracunculus), 엔테로비우스(Enterobius), 필라로이데스(Filaroides), 해몬쿠스(Haemonchus), 라고킬라스카리스(Lagochilascaris), 로아(Loa) 폴리펩티드, 만소넬라(Mansonella), 무엘레리우스(Muellerius), 나노파이에투스(Nanophyetus), 네카토르(Necator), 네마토디루스(Nematodirus), 오에소파고스토뭄(Oesophagostomum), 온코세르카(Onchocerca), 오피스토르키스(Opisthorchis), 오스터타기아(Ostertagia), 파라필라리아(Parafilaria), 파라고니무스(Paragonimus), 파라스카리스(Parascaris), 파이살로프테라(Physaloptera), 프로토스트론길루스(Protostrongylus), 세타리아(Setaria), 스피로세르카(Spirocerca), 스피로메트라(Spirometra), 스테파노필라리아(Stephanofilaria), 스트론길로이데스(Strongyloides), 스트론길루스(Strongylus), 텔라지아(Thelazia), 톡사스카리스(Toxascaris), 톡소카라(Toxocara), 트리키넬라(Trichinella), 트리코스트론길루스(Trichostrongylus), 트리쿠리스(Trichuris), 운시나리아(Uncinaria) 또는 우케레리아(Wuchereria).

또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어, 대상에서 B 세포 매개 반응 및/또는 T 세포 매개 반응을 일으킴으로써, 상기 대상에서 질환 상태를 예방적으로 또는 치유적으로 치료하는 방법을 제공한다. 각종 실시양태에서, 질환 상태는 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 마이코플라스마 감염, 프리온 감염, 원생동물 감염 또는 연충 감염 중 하나 이상일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 상기 측면의 방법들 중 한 세트는 유전적으로 변형된 전 유기체를 대상, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 소, 닭, 관형 케이지 사육조, 개방형 복지 케이지 사육조, 파충류 또는 양서류에 투여하는 단계를 포함한다. 따라서, 유전적으로 변형된 전 유기체는 이에 따라 대상 내의 항체의 생성을 자극한다. 본 측면의 방법의 제2 세트에서, 본 발명은 항체 반응을 생성시키는 것과 관련된, 하나 이상의 질환, 상태 또는 유기체에 대한 항체를 생성하고, 상기 항체 또는 항체를 단리하여, 이를 대상에게 투여함으로써, 대상에서 질환 상태를 예방적으로 또는 치유적으로 치료하는 것을 제공한다.

암브룩스(Ambrx) 기술인 궁극적 단백질 조작 툴을 이용하여, 비천연 아미노산의 부위 특이적 도입은 백신 개발에 있어 한 중대한 기회를 제공한다. 그것은 항원을 면역증강자와 조합함으로써 화학적으로 잘 정의된 나노 구조를 생성시킬 수 있다. 서브유닛 백신 개발을 위해 사용될 수 있는 상기 나노 구조는 항원 정보 및 항원증강 기능성을 제공한다.

또한, 암브룩스 기술은 또한 비천연 아미노산이 비천연 작용기를 유기체 내로 도입하기 위한 비히클 대신에, 병원성 유기체 내 필수 유전자의 발현을 위한 스위치로 작용할 것이다. 생성되는 유기체는 야생형 유기체를 모방할 것이나, 자연계에 존재하지 않는 암브룩스 비천연 아미노산의 존재 하에 단지 복제할 수 있을 것이다.

서브유닛 백신:

서브유닛 백신의 낮은 효능으로 인해, 면역 반응을 자극하기 위해 보조제가 필요하다. 종래부터, 보조제는 항원과의 혼합물로서 제형된다. 투여 시에, 항원은 수지상 세포(DC)에 의해 취입되어, T 세포에 제시된다. 보조제는 사이토카인 방출, 증강된 항원 제시 및 수지상 세포 성숙을 위해 수지상 세포를 자극할 것이다. 한 효과적인 항원 특이적 면역 반응은 의존성 공정의 두 과정인 항원 제시 및 불활성화가 동일한 DC 상에 수렴할 때 달성될 것이다. 비교적 큰 용량이 필요하다. 그러나, 큰 용량의 보조제는 항원 비의존성 면역 활성화, 원치 않는 부작용을 유발할 것이다. 그러므로, 본래 이러한 접근법은 이상적이지 않고 백신에게 낮은 효능 및 높은 독성을 제공하게 된다.

알룸(alum)과 같은 종래 보조제와 달리, 많은 신규 발견 보조제는 분자상으로 잘 정의된다. 그것의 특유의 부위 특이적 비천연 아미노산 도입 및 그것의 부위 특이적 접합 능으로, 암브룩스 기술은 본 발명자들에게 고 강도 및 저 독성의 차세대 백신 생산을 위한 필수 툴을 마련한다. 암브룩스 서브유닛 백신의 핵심 특성은 항원 및 면역증강자의 한 화학적으로 정의된 나노구조 내로의 조합이다. 그것이 DC에 의해 취해질 때, 2가지 과정인 항원 제시 및 면역 활성화가 동일 DC 상에 수렴한다.

비천연 아미노산의 부위 특이적 도입은, 본 발명자들로 하여금 고 면역원성 부분, 예컨대 모노니트로페닐, 디니트로페닐을 가지는 비천연 아미노산을 단백질 항원 내에 직접 도입하도록 하는 기술이다. 최근, 소분자 면역증강자, 예컨대 톨 유사 수용체(TLR7) 리간드 이미다조퀴놀린이 이용가능해지고 있다. 자체 측쇄로서 상기 소분자 면역증강자를 이용하여 비천연 아미노산을 설계하고 이를 단백질 항원 상에 도입하는 것이 가능하다.

암브룩스의 부위 특이적 접합 기술은 더욱 큰 융통성을 제공한다. 그것은 본 발명자로 하여금 상기 소분자를 단백질 항원의 표면뿐만 다양한 다른 면역증강자(예를 들어, 지질, 지질펩티드, 다당류, DNA, RNA 및 나노입자)에 접합하도록 한다.

단일 가닥의 DNA의 단백질 표면 상에의 부위 특이적 접합은 백신 설계를 위한 또 다른 자유 차원을 발생시킨다. 비메틸화 CpG를 가지는 DNA는 TLR-9 리간드로서, 이는 세포 표면 상뿐만 아니라 세포 내에도 존재한다. 항원에 접합된 DNA는 면역증강자로서 뿐만 아니라 서열 특이적 혼성화 과정을 통해 1 내지 3차원 및 다가항원 나노구조를 생성시키기 위한 구성 요소로서 작용할 수 있다. 이 일반적 방식은 또한 다른 요소, 예컨대 APC 표적화 시약 및 기타 TLR 리간드와 항원을 조합하는 데 사용될 수도 있다. APC 표적화(항체 또는 펩티드)는 백신 효율을 증진시키고 교차 제시를 촉진할 수 있는 것으로 나타났다. 2개의 상이한 TLR 리간의 조합은 보다 큰 상승효과를 가질 것이다.

암브룩스의 부위 특이적 접합은 정확한 설계 및 백신의 최적화를 허용한다. 암브룩스 기술이 없다면, 비특이적 접합 과정은 단백질 항원 상의 변형 부위에 대한 조절을 제한하거나 그러한 조절을 제공하지 않는다. 비특이적 접합은 T 에피토프 및 B 에피토프를 변경시킬 수 있다. 그것은 또한 항원 인식에 있어 중요한 항원의 3D 형태를 변형시킬 수도 있다. 또한, 일부 변형은 항원 처리를 저해할 수 있다. 이 모든 인자들은 비특이적으로 접합된 백신이 덜 효과적이도록 한다.

전 유기체 백신:

백신학은 전 유기체 백신에서 시작하였고 여전히 오늘날까지도 생 약독화 또는 사멸로 분류되는 가장 성공적인 백신이다. 전 유기체 백신의 본질은, 백신이 보호적 면역 반응, 단 숙주 내 복제능이 제한되거나 복제능이 없는 면역 반응을 일으키기 위해 병원성 유기체 자체에 가능한 한 가까워야 한다는 것이다.

따라서, 복제가 제한되거나 복제가 없도록 하는 것이 바람직한 경우, 소분자를 사용하여, 보다 우수하고 보다 안전한 백신의 생산을 위해 미생물의 수명 사이클을 조절하는 것이 가능할까? 그 답은, 암브룩스 기술을 이용할 때, 이제는 '가능하다'이다. 비천연 아미노산이 미생물의 복제에 필수적인 박테리아, 바이러스 또는 심지어 기생충 내의 유전자에 도입되는 경우, 상기 유기체의 수명은 비천연 아미노산의 존재에 의존하게 된다. 도입된 비천연 아미노산이 자연 상에 존재하지 않는 경우, 그 결과물은 숙주 내 복제능이 없는, 거의 자체 그대로의 바이러스 및 세포 성분 및 구조를 가지는, 유기체, 예컨대 바이러스 및 박테리아일 것이다. 추가로, 암브룩스 기술로 변형된 바이러스 또는 박테리아는 백신 자체로 작용할 뿐만 아니라, 유전자 및 항원 전달을 위한 벡터로서도 작용한다.

암브룩스의 서브유닛 백신 플랫폼은 감염성 질환 및 치료적 암 백신 부문에 있어서 매우 다양한 용도들을 가진다. 현 암 백신은 일반적으로 비효과적이다. 계통적 T 세포 활성화 및 음성 조절 경로 억제에 대한 접근법이 제안되었고, 이들 중 일부가 임상 시험 중이다. T 세포 활성화 및 항원 인식의 분리가 심각한 부작용을 유발할 수 있다. 암 백신의 비효과적임은, 심각한 부작용을 유발하지 않으면서 종양 특이적 면역 반응을 유도하는 기술의 부족으로 인한 것이다. 암브룩스는 T 세포 반응 및 B 세포 반응을 포함한, 강한 암 특이적 면역 반응을 유발할 수 있는 나노구조를 생성시키는 기술을 제공하고, 이러한 제공에 의해 치유적으로나 예방적으로 유익한 가능성의 새장을 열게 된다.

전 유기체 백신 플랫폼은 감염성 질환 부문에 있어 무수한 용도들을 발견할 수 있다. 배양될 수 있고 돌연변이가 가능한 게놈을 가지는 바이러스, 박테리아 또는 심지어 기생충은 양호한 후보 물질이다. 본 발명의 백신은 백신 개발에 있어 위험 관리를 개선할 것이며, 백신은 화학적으로나 유전학적으로 잘 정의되며, 전례없는 효능을 제공한다.

유전 암호를 확장하기 위해, 본 발명은 오르소고날 tRNA를 생산하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 아미노아실-tRNA 합성효소는 본 발명의 tRNA를 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 아미노아실화한다. 이러한 번역 성분은, tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 (핵산 번역 중에) 성장 폴리펩티드 사슬 내의 특정화된 위치에 선택된 아미노산을 도입하는 데 사용될 수 있다.

특정화된 위치에 선택된 아미노산을 가지는 세포내 단백질의 생산 방법도 또한 본 발명의 한 특성이다. 예를 들어, 상기 방법은 적절한 매질 내에, 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하고 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 성장시키는 단계; 및 선택된 아미노산을 제공하는 단계를 포함한다. 세포는 세포 내에서 작용하고 셀렉터 코돈을 인식하는 오르소고날 tRNA(O-tRNA); 및 선택된 아미노산으로 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 추가로 포함한다. 전형적으로, O-tRNA는 동족 합성효소의 존재 하에 억제 활성을 가진다. 이러한 방법에 의해 생산된 단백질도 또한 본 발명의 한 특성이다.

도 1 - TΨC 줄기 돌연변이 부위를 가지는 J17 tRNA의 클로버잎 구조를 도시한다.
도 2 - J17 또는 J17 돌연변이체(F12, F13, F14)를 이용하여, 인간 성장 호르몬에서의 앰버 돌연변이의 억제를 도시한다. 각 샘플에 대한 총 세포 용해물을 SDS PAGE로 분석하였다.
도 3 - 인간 성장 호르몬에서의 앰버 돌연변이의 억제를, F13을 이용하여 상이한 세포주에서 도시한다.
도 4 - 암브룩스 억제 시스템을 포함한 pVK10-camR 벡터의 다이어그램을 도시한다.
도 5 - 람다 Red 성분(bet, gam, 엑소뉴클레아제)을 포함한 pKD46 벡터의 다이어그램을 도시한다.
도 6 - 실시예 5에서 사용된 중첩 프라이머 및 방법의 방식을 도시한다. 프라이머는 화살 및 숫자 식별자로 표시되고, 예를 들어 Y31 및 N51 클론에 대한 프라이머 1은 각각 서열 번호 18 및26이고; Y31 및 N51 클론에 대한 프라이머 2는 각각 서열 번호 19 및 27이며; Y31 및 N51 클론에 대한 프라이머 3'은 각각 서열 번호 20 및 28이고; Y31 및 N51 클론에 대한 프라이머 4'는 각각 서열 번호 21 및 29이며; Y31 및 N51 클론에 대한 프라이머 5'는 각각 서열 번호 22 및 30이고; Y31 및 N51 클론에 대한 프라이머 6'는 각각 서열 번호 23 및 31이며; Y31 및 N51 클론에 대한 프라이머 7'는 각각 서열 번호 24 및 32이고; Y31 및 N51 클론에 대한 프라이머 8'은 각각 서열 번호 25 및 33이 된다. PCR 산물은 문자로 식별된다. 메티온 아미노 펩티다제를 포함한 앰버 부위는 앰버 돌연변이(A 및 B) 상에서의 중첩 PCR에 의해 생성되고, 이에 따라 그것은 전 유기체로서 E. 콜라이에 대해 조건부 치사가 된다. 이어서, 돌연변이체 메티온 아미노 펩티다제를 완전 유전자(C)에 융합시키고, 다운스트림 선택을 위해 선택 마커(D) 및 돌연변이체 메티온 아미노 펩티다제(E)의 일편과 조합시킨다.
도 7 - 인공 아미노산 의존성 선별의 개략도를 도시한다. 3개의 단계는 1) 플레이트를 처리함으로써 형질전환체, 예컨대 KanR, AmpR 양성 형질전환체를 선출하는 단계; 2) 생존자를 KanR, AmpR, + 비천연 아미노산 중에 배양하는 단계; 및 3) 비천연 아미노산의 존재 및 부재 하의 플레이트 상에서 개별 콜로니를 성장시키고, 비천연 아미노산의 존재 하에서는 성장하고 비천연 아미노산 부재 하에서는 사멸하는 콜로니를 선택하는 단계이다.
도 8 - LB 아가, 및 50 ㎍/mL 암피실린 및 50 ㎍/mL 카나마이신 함유 매질로 각기 코팅된, Y31에서의 메티온 아미노 펩티다제 유전자 내 앰버 돌연변이에 대해 선별하는 중의 E. 콜라이의 2개의 세포 배양 플레이트(좌측 플레이트는 2 mM 파라-아세틸페닐알라닌을 추가로 포함하고, 우측 플레이트는 아무것도 포함하지 않음)를 도시한다. A12, C5 및 E3는 화학적으로 조절된 복제 의존성 E. 콜라이의 예이다.
도 9 - LB 아가, 및 50 ㎍/mL 암피실린 및 50 ㎍/mL 카나마이신 함유 매질로 각기 코팅된, N51에서의 메티온 아미노 펩티다제 유전자 내 앰버 돌연변이에 대해 선별할 때의 E. 콜라이의 2개의 세포 배양 플레이트(좌측 플레이트는 2 mM 파라-아세틸페닐알라닌을 추가로 포함하고, 우측 플레이트는 아무것도 포함하지 않음)를 도시한다. A12, C5 및 E3는 화학적으로 조절된 복제 의존성 E. 콜라이의 예이다.
도 10a 및 10b - 투과성 매질 및 비투과성 매질 중에서의 성장을 도시한다. 하룻밤 배양물을 각 패널의 상단 우측 코너에 도시된 최적 희석율로 글루코스(마름모꼴) 또는 아라비노스(원형) 내에 접종하였다. 현미경관찰용 샘플을 주기적으로 제거하고 아라비노스 플레이트 상에 플레이팅하면서, 37℃에서 진탕 스펙트라맥스(Spectramax) 플레이트 리더로 96웰 플레이트 내 OD₆₀₀을 모니터링하였다. 우측(삼각형)에 제시된 생존율(viability)의 변화를, 정규화된 CFU의 농도를 OD₆₀₀으로 나눔으로써 계산하였다. 각 시점에서, 상기 값을 T=0에서의 값으로 나누고, 그 값의 로그를 본 도면에 제시한다. 포화 접종물로부터 측정하여 희석에 대해 보정한 T=0에서의 OD 단위 기준, 밀리리터당 CFU의 수는 다음과 같았다: WT, 4.6×10⁹; frr 돌연변이체, 3.2×10⁹; gcpE 돌연변이체, 3.4×10⁹; IpxC 돌연변이체, 2.2×10⁹; map 돌연변이체, 2.9×10⁹; murA 돌연변이체, 8.7×10⁸; ppa 돌연변이체, 1.5×10⁹; rpsA 돌연변이체, 1.2×10⁹. OD는 흔들리는 배양물의 동력학을 가장 잘 나타내기 위해 대수 눈금이 아닌 선형으로 도시되어 있고, 우측의 눈금은 IpxC와 map 간에 상이하여, 경향 선이 중첩되지 않도록 한다. murA 측정의 마지막 두 시점에 있어, 성장한 콜로니가 없었다. 문헌[Herring and Blattner JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 2004, p. 2673-2681](본원에 참조 인용됨)을 참조한다.
도 11 - 유전적으로 변형된 비천연 아미노산 복제 의존성 세포를 매질+비천연 아미노산 중에서 1.0 광학 밀도로 성장시킨 후, 상기 세포를 비천연 아미노산 부가 배지 중에 일련 희석하여 플레이팅하여, 콜로니 형성 유닛을 계산하고, 나머지 세포를 비천연 아미노산의 부재 하에 배양하여, 복귀 돌연변이체를 검출하는, 복귀율 특징분석의 개략도를 도시한다.
도 12 - 돌연변이유발 기법의 개략도를 도시한다. 한 선형 DNA 단편은 중첩 연장 PCR에 의해 WT 주형 게놈 DNA로부터 생성된다. 프라이머의 위치는 일방향 화살표로 표시된다. PCR 융합 산물을 세포 내로 전기천공법으로 도입하고, 이중 재조합 이벤트로부터 비롯되는 일체화가 선택된다. 태그얼롱(tagalong) 앰버 종결 코돈을 가지는 클론을 동정한 후, I-Scel 유전자를 유도하고, 이에 따라 Camr을 코딩하는 유전자가 제거된다. 짧은 중복 영역 내에서의 재조합은 다른 경우에서라면 무흔(scarless)이게 되는 앰버 돌연변이체가 생성되도록 한다.
도 13 - 태그얼롱 돌연변이유발에 사용되는 플라스미드를 도시한다.
도 14 - 위에서부터 시작하여, 1) 조건부의 돌연변이체 주형을 생성시키는 단계; 2) 람다 RED 재조합, 앰버 억제 적격 균주로 형질전환하는 단계; 및 3) 람다 RED 재조합을 유도하는 단계를 포함하는, E. 콜라이 내 조건부 치사 돌연변이체의 특징분석 시의 단계들의 개략도를 도시한다.
도 15 - 위에서부터 시작하여, 1) 성공적으로 형질전환된 유기체가 의존하게 되는 비천연 아미노산의 존재 및 부재 하에서의 성장을 특징분석하는 단계; 2) 돌연변이를 박테리아 살생성 또는 박테리아 발육저지성으로 특징분석하는 단계, 및 3) 복귀 돌연변이체 빈도를 특징분석하는 단계를 포함하는, E. 콜라이 내 조건부 치사 돌연변이체의 특징분석 시의 단계들의 개략도를 도시한다.
도 16 - MAP 잔기 선출부의 구조도를 도시한다.
도 17 - MAP 잔기 선출부의 구조도를 도시한다.

정의

본 발명을 상세히 기술하기 전에, 본 발명이 특별한 생물학적 시스템에 제한되지 않고, 그 시스템은 물론 다양할 수 있음을 이해하도록 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특별한 실시양태를 기술하기 위한 것으로 본 발명의 범주를 제한하지 않고, 본 발명의 범주는 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다는 것도 이해하도록 한다. 본원과 청구범위에서 사용된 단수 형태를 가리키는 "하나(a)", "하나(an)", "그(the)"는 달리 명시하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포"라고 하는 것은 2종 이상의 세포의 조합을 포함하고, 당업자에게 공지된 이의 등가물 등을 포함한다. "박테리아"이라는 지칭은 박테리아 등의 혼합물을 포함한다.

여기 및 명세서 내 나머지 부분에 있어 달리 정의되지 않으면, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본원에 언급된 모든 공보 및 특허는 예를 들어, 본 발명과 연관되어 사용될 수 있는 공보에 기재되는 구성 및 방법을 기재하고 개시할 목적으로 본원에 참조 인용된다. 본원에서 논의된 공보는 오직 본 출원의 출원일 전 이의 개시 내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서 내 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시 내용을 선행할 권리가 없음을 용인하는 것으로 해석되어서는 안될 것이다.

단백질 및/또는 단백질 서열은 공통된 조상 단백질 또는 단백질 서열로부터 천연적으로 또는 인공적으로 유래되었을 때, "상동성"이다. 유사하게, 핵산 및/또는 핵산 서열은 공통된 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 천연적으로 또는 인공적으로 유래되었을 때, 상동성이다. 예를 들어, 임의의 천연 발생 핵산이 임의의 이용가능한 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 돌연변이유발된 핵산은 발현될 때, 하나 이상의 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 돌연변이화 과정은 물론 부가적으로 하나 이상의 표준 코돈을 변경함으로써 결과 돌연변이체 단백질에서 하나 이상의 표준 아미노산을 변화시킬 수 있다. 하나 이상의 표준 아미노산은 비천연 아미노산 또는 천연 아미노산으로 변화될 수 있다. 상동성은 일반적으로 2개 이상의 핵산 또는 단백질(또는 이의 서열) 간의 서열 유사성으로부터 유추된다. 상동성을 구축하는데 유용한 서열 간의 정확한 유사도(%)는 해당 핵산 및 단백질에 따라 다양하나, 상동성을 구축하는데 25% 정도로 낮은 서열 유사도가 통상 이용된다. 상동성을 구축하기 위해, 보다 높은 수준의 서열 유사도, 예컨대 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 또는 그 이상을 사용할 수 있다. 서열 유사도(%)를 결정하는 방법(예를 들어, 디폴트 매개변수를 이용하는 BLASTP 및 BLASTN)이 본원에 기재되어 있고, 일반적으로 이용가능하다.

본원에 사용되는 용어 "오르소고날(orthogonal)"은 관심의 대상이 되는 시스템(예를 들어, 번역 시스템, 예컨대 세포)에 의해 감소된 효율로 사용되는 분자(예를 들어, 오르소고날 tRNA(O-tRNA) 및/또는 오르소고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS))를 지칭한다. 오르소고날은 관심의 대상이 되는 번역 시스템에서의 오르소고날 tRNA 및/또는 오르소고날 RS의 기능의 불능, 또는 감소된 효율, 예컨대 20% 미만의 효율, 10% 미만의 효율, 5% 미만의 효율, 또는 예컨대, 1% 미만의 효율을 지칭한다. 예를 들어, 관심의 대상이 되는 번역 시스템에서의 오르소고날 tRNA는, 내인성 RS에 의한 내인성 tRNA의 아미노아실화에 비해, 감소되거나 0인 효율로 관심의 대상이 되는 번역 시스템의 임의의 내인성 RS에 의해 아미노아실화된다. 또 다른 예로서, 오르소고날 RS는 내인성 RS에 의한 내인성 tRNA의 아미노아실화에 비해, 감소되거나 0인 효율로 관심의 대상이 되는 번역 시스템의 임의의 내인성 tRNA를 아미노아실화된다. 제2 오르소고날 분자는 세포에 도입되어, 제1 오르소고날 분자와 함께 작용할 수 있다. 예를 들어, 오르소고날 tRNA/RS 쌍은 상응하는 tRNA/RS 내인성 쌍의 효율 대비, 일정 효율(예를 들어, 약 50% 효율, 약 60% 효율, 약 70% 효율, 약 75% 효율, 약 80% 효율, 약 85% 효율, 약 90% 효율, 약 95% 효율, 또는 약 99% 이상의 효율)로 세포내에서 함께 작용하는 상보적 도입 성분을 포함한다. "오르소고날의 향상"은 출발 물질 또는 천연 발생 tRNA 또는 RS에 비해 증진된 오르소고날성을 지칭한다.

용어 "동족"은 서로 작용하는 성분들, 예를 들어 오르소고날 tRNA(O-tRNA)와 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소를 지칭한다. 이 성분들은 또한 상보적이라고도 칭해진다.

용어 "우선적으로 아미노아실화하다"는 ORS가 O-tRNA의 생성에 사용되는 출발 물질 또는 천연 발생 tRNA를 아미노아실화하는 O-RS에 비해, 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산으로 O-tRNA를 아미노아실화하는 효율, 예컨대 약 70% 효율, 약 75% 효율, 약 80% 효율, 약 85% 효율, 약 90% 효율, 약 95% 효율, 또는 약 99% 이상의 효율을 지칭한다. 이어서, 비천연 아미노산을 고 적합도로, 예컨대 소정의 셀렉터 코돈에 대해 약 70% 초과의 효율, 소정의 셀렉터 코돈에 대해 약 75% 초과의 효율, 소정의 셀렉터 코돈에 대해 약 80% 초과의 효율, 소정의 셀렉터 코돈에 대해 약 85% 초과의 효율, 소정의 셀렉터 코돈에 대해 약 90% 초과의 효율, 소정의 셀렉터 코돈에 대해 약 95% 초과의 효율, 또는 소정의 셀렉터 코돈에 대해 약 99% 초과의 효율로 성장 폴리펩티드 사슬에 도입된다.

"예방적 치료"는 질환, 병태 또는 의학적 장애의 징후 또는 증상을 보이지 않거나, 또는 상기 질환, 병태 또는 의학적 장애의 초기 징후 또는 증상만을 보이는 대상에게 투여되는 치료로서, 이러한 치료는 질환, 병태 또는 의학적 장애의 위험을 경감하거나, 방지하거나 감소시키기 위한 목적으로 실시된다. 예방적 치료는 질환 또는 장애에 대한 방지적 치료로서 작용한다. "예방적 활성"은 병태, 질환 또는 장애의 징후 또는 증상을 보이지 않는 대상(또는 상기 병태, 질환 또는 장애의 초기 징후 또는 증상만을 보이는 대상)에 투여되는 경우 대상이 상기 병태, 질환 또는 장애를 발달시킬 위험을 경감시키거나, 방지하거나 감소시키는 비천연 면역원 및/또는 항체와 같은 물질 또는 이들의 조성물의 활성이다. "예방적으로 유용한" 물질 또는 화합물(예를 들어, 본 발명의 비천연 면역원 및/또는 항체)은 병태, 질환 또는 장애의 발달을 경감시키거나, 방지하거나, 치료하거나 또는 감소시킴에 있어서 유용한 물질 또는 화합물을 의미한다.

치료, 백신 및/또는 예방적 치료가 필요 환자에게 투입될 수 있다. 치료, 백신 및/또는 예방적 치료는 또한 가축, 예컨대, 소, 돼지, 염소, 양, 닭, 및/또는 다른 일반 농장 동물, 및 일반 가정 애완동물, 예를 들어, 고양이, 개, 앵무새, 잉꼬 등을 비롯한 각종 동물들에게 투입될 수도 있다.

용어 "셀렉터 코돈"은 번역 과정에서 O-tRNA에 의해 인식되고 내인성 tRNA에 의해서는 인식되지 않는 코돈을 의미한다. O-tRNA 안티코돈 루프는 mRNA 상의 셀렉터 코돈을 인식하여 이의 아미노산, 예를 들어 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내의 이 부위에 도입한다. 셀렉터 코돈에는 예를 들어, 넌센스(nonsense) 코돈, 예컨대 종결 코돈, 예를 들어 앰버(amber), 오커(ochre) 및 오팔(opal) 코돈; 4 이상 염기 코돈; 희귀 코돈; 천연 또는 비천연 염기쌍으로부터 유래된 코돈 및/또는 기타 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 소정의 시스템에 있어, 셀렉터 코돈은 또한 천연의 3 염기 코돈 중 하나를 포함할 수 있고, 여기에서 내인성 시스템은 상기 천연의 3 염기 코돈을 전혀 (혹은 거의) 사용하지 않는다. 예를 들어, 이는 천연의 3 염기 코돈을 인식하는 tRNA가 결핍된 시스템, 및/또는 천연의 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.

억제자 tRNA는 예컨대, 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 폴리펩티드 사슬에 아미노산을 도입하기 위한 기작을 제공함으로써, 소정의 번역 시스템 내 메신저 RNA(mRNA)의 판독을 변경하는 rRNA이다. 예를 들어, 억제자 tRNA 는 종결 코돈, 4 염기 코돈, 또는 희귀 코돈을 포함하나 이에 한정되지 않는 코돈을 통해 판독할 수 있다.

용어 "억제 활성"은 셀렉터 코돈을 통한 tRNA, 예컨대 억제자 tRNA의 판독 능력을 지칭한다. 활성은 대조군(예를 들어, 동족 합성효소 결핍) 과의 비교로서 관찰된 활성의 백분율(%)로서 표시될 수 있다.

용어 "번역 시스템"은 천연 발생 아미노산을 성장 폴리펩티드 사슬(단백질)에 도입하는데 필요한 성분을 지칭한다. 번역 시스템의 성분은 예컨대, 리보솜, tRNA, 합성효소, mRNA 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 성분을 시험관내 또는 생체내 번역 시스템에 첨가할 수 있다. 번역 시스템의 예는 비진핵생물 세포, 예를 들어 박테리아(예컨대, E. 콜라이), 진핵생물 세포, 예컨대 효모 세포, 포유동물 세포, 식물 세포, 조류 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 및 무세포 번역 시스템, 예컨대 세포 용해물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

번역 시스템은 세포내 또는 무세포 시스템일 수 있고, 원핵생물 또는 진핵생물 시스템일 수 있다. 세포내 번역 시스템은, 원하는 핵산 서열을 mRNA에 전사하고, mRNA를 번역할 수 있는 전세포 제제, 예컨대 투과화된 세포 또는 세포 배양물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 무세포 번역 시스템은 상업적으로 입수가능하고, 다수의 상이한 유형 및 시스템이 공지되어 있다. 무세포 시스템의 예에는 원핵생물 용해물, 예컨대 에쉐리키아 콜라이 ( Esherichia coli ) 용해물, 및 진핵생물 용해물, 예컨대 밀 배아 추출물, 곤충 세포 용해물, 토끼 망상적혈구 용해물, 토끼 난모세포 용해물 및 인간 세포 용해물이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 진핵세포 추출물 또는 용해물은 수득되는 단백질이 당화, 인산화, 또는 기타 방식으로 변형될 때 바람직할 수 있는데, 그 이유는 다수의 그러한 변형들이 단지 진핵생물 시스템에서 가능하기 때문이다. 이러한 추출물 및 용해물 중 일부는 상업적으로 입수가능하다(프로메가(Promega)(미국 위스콘신주 매디슨 소재); 스트라타겐(Stratagene)(미국 캘리포니아주 라졸라 소재); 아머샴(Amersham)(미국 일리노이즈주 알링톤 하이츠 소재); 기브코(GIBCO)/BRL(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)). 막 추출물, 예컨대 분비 단백질을 번역하는데 유용한, 소포체막 함유의 견치 췌장 추출물 또한 이용가능하다.

재구성된 번역 시스템도 또한 사용될 수 있다. 용해물, 또는 개시 인자-1(IF-1), IF-2, IF-3(α 또는 β), 신장 인자 T(EF-Tu), 또는 종결 인자와 같은 정제 번역 인자로 보충된 용해물의 조합뿐만 아니라, 댄백질로 mRNA를 번역하기 위해 정제된 번역 인자의 혼합물이 또한 성공적으로 사용되었다. 무세포 시스템은 또한 본원에 구체적으로 인용되는 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., editors, Wiley Interscience, 1993)]에 기재된 바와 같이, DNA 가 시스템에 도입되어, mRNA로 전사되며, mRNA는 번역되는 커플링된 전사/번역 시스템일 수 있다. 진핵생물 전사 시스템에서 전사된 RNA는 이종핵 RNA(hnRNA) 또는 5'-말단 캡(7-메틸 구아노신) 및 3'-말단 폴리 A 꼬리를 가지는 성숙한 mRNA의 형태일 수 있고, 후자는 특정 번역 시스템에서 유리할 수 있다. 예를 들어, 캡핑된 mRNA는 망상적혈구 용해물 시스템에서 고효율로 번역된다.

용어 "선택된 아미노산"은 임의의 원하는 천연 발생 아미노산 또는 비천연 아미노산을 지칭한다. 본원에 사용되는 용어 "비천연 아미노산" 또는 "비천연적으로 코딩된 아미노산"은 20종의 통상의 천연 발생 아미노산, 또는 셀레노시스테인 또는 피롤리신중 하나가 아닌, 임의의 아미노산, 변형 아미노산, 및/또는 아미노산 유사체를 지칭한다. "비천연적으로 코딩된 아미노산" 및 "비천연 아미노산"이라는 용어와 함께 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어들로는 "비천연 아미노산," "비천연 발생 아미노산" 및 이들의 각종 하이픈으로 결합된 형식 및 하이픈으로 결합되지 않은 형식이 있다. 또한, 용어 "비천연적으로 코딩된 아미노산"은 천연적으로 코딩된 아미노산(20종의 통상의 아미노산, 또는 피롤리신 및 셀레노시스테인을 포함하나 이에 한정되지 않음)의 변형(예를 들어, 번역후 변형)에 의해 발생하지만, 그 자체로는 번역 복합체에 의해 성장 폴리펩티드 사슬에 천연적으로 도입되지 않는 아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 그러한 비천연 발생 아미노산의 예는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

비천연 아미노산: 본원에서 사용되는 비천연(non-natural, unnatural) 아미노산은 셀레노시스테인 및/또는 피롤리신 및 하기 20종의 정규 유전적으로 코딩된 알파-아미노산 이외의 임의의 아미노산, 변형된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 의미한다: 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린. 본 발명의 각종 실시양태에서, 비천연 면역원 내로 도입되는 하나 이상의 비천연 아미노산은 임의의 비천연 아미노산일 수 있다. 따라서, 본원에서 특정 비천연 아미노산의 언급은 반드시 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안됨을 인식할 것이다. 예를 들어, 오르소고날 요소들을 포함하는 번역 시스템을 이용하여 생체 내에서 비천연 아미노산을 코딩함으로써 매우 다양한 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하였다. 검토를 위해서는 예를 들어, 문헌[Liu, et al., (2007) "Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells" Nat Methods 4:239-244]; 문헌[Wang, et al., (2006) "Expanding the genetic code" Annu Rev Biophys Biomol Struct 35:225-249]; 문헌[Xie & Schultz (2006) "A chemical toolkit for proteins-an expanded genetic code" Nat Rev Mol Cell Biol 7:775-782]; 문헌[Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed, 44(1):34-66 (2005)]; 및 문헌[Chin, et al., (2003) "An expanded eukaryotic genetic code" Science 301:964-967]을 참조한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 20종의 통상의 천연 발생 아미노산 또는 희귀 천연 발생 아미노산, 예를 들어 셀레노시스테인 또는 파이로리신 중 하나가 아닌 비천연 아미모산을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 비천연 아미노산, p-니트로페닐알라닌, p-술포티로신, 및 p-카르복시페닐알라닌은 본원의 각종 실시양태에 사용된다. 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산에는 하기의 것들이 포함될 수 있으나 이에 한정되지 않는다: p-니트로페닐알라닌; o-니트로페닐알라닌; m-니트로페닐알라닌; p-보로닐 페닐알라닌; o-보로닐페닐알라닌; m-보로닐페닐알라닌; p-아미노페닐알라닌; o-아미노페닐 알라닌; m-아미노페닐알라닌; p-아실페닐알라닌; o-아실페닐알라닌; m-아실페닐알라닌; p-OMe 페닐알라닌; Q-OMe 페닐알라닌; m-OMe 페닐알라닌; p-술포페닐 알라닌; o-술포페닐알라닌; m-술포페닐알라닌; 5-니트로 His; 3-니트로 Tyr; 2-니트로 Tyr; 니트로 치환 Leu; 니트로 치환 His; 니트로 치환 De; 니트로 치환 Trp; 2-니트로 Trp; 4-니트로 Trp; 5-니트로 Trp; 6-니트로 Trp; 7-니트로 Trp; 3-아미노 티로신, 2-아미노티로신, O-술포티로신, 2-술포옥시페닐알라닌, 3-술포옥시옥시페닐알라닌 또는 p-카르복시페닐알라닌, o-카르복시페닐알라닌, 및 m-카르복시페닐알라닌. 이 역시도, 본 발명이 특정 비천연 아미노산에 한정되지 않음이 명백하다.

추가로, 본 발명의 각종 실시양태들에서, 예를 들어, 억제자 tRNA가 원하는 비천연 아미노산으로 화학적으로 아실화되어 면역원 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 부가되는 생합성 방법을 이용하여 시험관내에서 비천연 아미노산을 면역원 내로 도입할 수 있다. 이러한 시험관내 합성 방법의 설명을 위해서는 예를 들어, 문헌[V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995)]; 문헌[C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, "A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins", Science 244 182-188 (1989)]; 및 문헌[J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E.S. Diala, "Biosynthetic site-specific incorporation of a nonnatural amino acid into a polypeptide," J. Am. Chem. Soc. 111 8013-8014 (1989)]을 참조한다. 비천연 아미노산은 이용가능한 합성 펩티드 화학기법(또는 천연 아미노산이 이 방법에 의해 비천연 아미노산으로 전환될 수 있음) 또는 번역 후 가공에 의해 천연적으로 또는 합성적으로 제조된 단백질에 부가될 수도 있다. 그러나, 또한, 이러한 번역 후 변형 및 화학적 변형은 전형적으로 분자의 합성 과정 동안 하나 이상의 비천연 아미노산의 도입(예를 들어, 오르소고날 번역, 고체상 합성 등과 같은 직접적인 도입)과 함께 또는 더불어 수행됨을 인식할 것이다. 따라서, 아미노산의 번역 후 부가 또는 화학적 변형은 반드시는 아니지만 전형적으로 분자의 합성 과정 동안 부가된 비천연 아미노산을 이미 가진 분자에 대해서만 수행된다. 면역원 내로의 비천연 아미노산의 비오르소고날 도입에 대한 추가적 정보는 하기에 제시되어 있다.

본원에 사용되는 용어 "~로부터 유래된"은 성분이 특정화된 분자 또는 유기체로부터 단리되거나, 그로부터의 정보를 이용하여 제조됨을 지칭한다.

"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 삽입에 사용되는 방법, 예를 들어 직접적 흡수, 전달, f-메이팅(f-mating) 또는 재조합 숙주 세포를 생성시키기 위해 당업계에 공지된 기타 방법에 상관없이, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 가리킨다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비일체화 벡터, 예를 들어 플라스미드로서 유지되거나, 대안적으로 숙주 게놈 내로 일체화될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "매질(medium, media)"에는, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵생물 숙주 세포, 포유동물의 숙주 세포, CHO 세포 또는 E. 콜라이 또는 슈도모나스 숙주 세포 및 세포 내용물을 포함한, 임의의 숙주 세포를 지지하거나 함유할 수 있는 임의의 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 경질 지지체가 포함된다. 따라서, 그 용어는 숙주 세포가 성장된 매질, 예를 들어 배지 또는 전 유기체 또는 세포가 성장하고 있는 매질을 포함할 수 있고, 매질은 증식 단계 전 또는 후의 매질을 포함한, 복제 결핍 유기체 또는 세포의 성장을 지지하기 위해 포함되는 비천연 아미노산을 가질 수 있다. 그 용어는 또한 예컨대 항원이 세포내 생성되고, 숙주 세포가 분해되거나 붕괴되어 항원 또는 재조합 항원을 방출하는 경우에서와 같이, 숙주 세포 분해물을 함유하는 완충액 또는 시약을 포함할 수 있다.

단백질 리폴딩과 관련하여 본원에 사용되는 "환원제"는 술프히드릴기를 환원 상태로 유지시키고, 세포내 또는 세포간 디술피드 결합을 환원시키는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적당한 환원제에는 디티오트레이톨(DTT), 2-메르캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민(2-아미노에탄티올) 및 환원된 글루타티온이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 매우 다양한 환원제들이 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 적당하다는 것이 당업자에게 자명하다.

단백질 리폴딩에 대해 본원에 사용되는 "산화제"는 화합물로부터 전자를 제거하여 산화시킬 수 있는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적당한 산화제에는 산화된 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오트레이톨, 산화된 에리트리톨 및 산소가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 매우 다양한 산화제들이 본 발명의 방법에 사용하기에 적당하다는 것이 당업자에게 자명하다.

본원에 사용되는 "리폴딩"은 디술피드 결합을 함유하는 폴리펩티드를, 디술피드 결합에 대해 부적절하게 접혀있거나 접히지 않은 상태에서 본연의 구조 또는 적절하게 접힌 구조로 변환시키는 임의의 공정, 반응 또는 방법을 나타낸다.

본원에 사용되는 "동시 폴딩(cofolding)"은 상호 반응하여, 접히지 않거나 부적절하게 접힌 폴리펩티드를 본연의 적절하게 접힌 폴리펩티드의 변환시키는, 2개 이상의 폴리펩티드를 이용하는 리폴딩 공정, 반응 또는 방법을 가리킨다.

"아미노 말단 변형기"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 결합될 수 있는 임의의 분자를 가리킨다. 유사하게, "카르복시 말단 변형기"는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 결합될 수 있는 임의의 분자를 가리킨다. 말단 변형기에는 각종 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 면역글로불린 불변 영역 부분, 예컨대 Fc, 또는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 기타 부분이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

용어 "작용기", "활성 부분", "활성화 기", "이탈기", "반응성 부위", "화학적으로 반응성인 기" 및 "화학적으로 반응성인 부분"이 분자의 구분된, 정의가능한 부분 또는 단위를 가리키기 위해 당업계 및 본원에서 사용된다. 상기 용어들은 화학적 기술 분야에서 다소 동의적이고, 일부 기능 또는 활성을 수행하고, 다른 분자와 반응성인 분자의 부분을 가리키기 위해 본원에서 사용된다.

용어 "연결기" 또는 "링커"는 본원에서 화학적 반응의 결과로서 정상적으로 형성되는 기 또는 결합을 가리키기 위해 본원에서 사용되고, 전형적으로는 공유 연결기이다. 가수분해 안정성 연결기는, 연장된 시간 동안, 아마도 심지어는 무한의 시간 동안의 생리학적 조건 하에서(단, 이에 한정되지 않음), 유용한 pH 값에서 물 내에서 실질적으로 안정하고, 물과 반응하지 않는 연결기를 의미한다. 가수분해 불안정성 또는 분해성 연결기는 물, 또는 예를 들어, 혈액을 포함한 수용액 중에서 분해가능한 연결기를 의미한다. 효소 불안정성 또는 분해성 연결기는 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있는 연결기를 의미한다. 당업계에서 이해되어지는 바와 같이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격, 또는 중합체 골격과 중합체 분자의 말단 작용기 간의 링커기에서의 분해성 연결기를 포함할 수 있다. 예를 들어, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산의 생물 활성제 상의 알코올기와의 반응에 의해 형성된 에스테르 연결기는 일반적으로 생리학적 조건 하에서 가수분해하여, 그 활성제를 방출한다. 다른 가수분해 분해성 연결기에는 카르보네이트 연결기; 아민과 알데히드의 반응으로부터 수득되는 아민 연결기; 알코올의 인산염기와의 반응에 의해 형성되는 인산염 에스테르 연결기; 히드라지드와 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 연결기; 알데히드와 알코올의 반응 생성물인 아세탈 연결기; 포르메이트와 알코올의 반응 생성물인 오르소에스테르 연결기; PEG와 같은 중합체 말단에 있는(단, 이에 한정되지 않음) 아민기와, 펩티드의 카르복실기에 의해 형성되는 펩티드 연결기; 및 중합체 말단에 있는(단, 이에 한정되지 않음) 포스포르아미다이트 기와 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실기에 의해 형성되는 올리고뉴클레오티드 연결기가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

본원에 사용되는 용어 "생물학적 활성 분자", "생물 활성 부분" 또는 "생물 활성제"는 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 트랜스포존, 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물 및 인간을 포함하나 이들에 한정되지 않는 유기체와 관련된, 생물학적 시스템, 경로, 분자, 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 성질에 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본원에 사용되는 생물학적 활성 분자에는, 인간 또는 기타 동물에서의 질환의 진단, 치유, 경감, 치료 또는 예방을 위해 의도되거나, 그와 다른 방식으로 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 안녕을 증진시키는 임의의 물질이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 생물학적 활성 분자의 예에는 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 경질 약물, 연질 약물, 탄수화물, 무기 원자 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성핵종, 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포좀, 마이크로입자 및 미셀이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적당한 생물 활성제의 부류에는 약물, 전구약물, 방사성핵종, 영상제, 중합체, 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드제, 미생물 유래 독소 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

용어 "아릴"은 달리 명시되지 않는 한, 함께 융합되거나 공유 연결된 단환 또는 다환(바람직하게는 1 내지 3개 환을 포함하나 이에 한정되지 않음)일 수 있는 다중불포화, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 4개 이종원자를 함유하는 아릴기(또는 환)을 가리키고, 여기에서 질소 및 황 원자는 임의적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 임의적으로 4급화된다. 헤테로아릴기는 헤테로 원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴기의 비제한적 예에는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴이 포함된다. 상기 나타낸 아릴 및 헤테로아릴 환계 각각에 대한 치환기는 하기 허용가능한 치환기들로 구성된 군으로부터 선택된다.

간략히 말해, 다른 용어와 조합되어 사용되는 용어 "아릴"(아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬을 포함하나 이들에 한정되지 않음)은 상기 정의된 아릴 및 헤테로아릴 환을 모두 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 탄소 원자(메틸렌기의 것을 포함하나 이에 한정되지 않음)가 예를 들어 산소 원자(페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등의 것을 포함하나 이들에 한정되지 않음)로 치환된 알킬기를 포함한 알킬기(벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등을 포함하나 이들에 한정되지 않음)에 아릴기가 부착된 라디칼을 포함하는 의미이다.

상기 용어들의 각각("알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴"을 포함하나 이들에 한정되지 않음)은 표시된 라디칼의 치환 및 비치환 형태 모두를 포함하는 의미이다. 각 유형의 라디칼에 대한 예시적 치환기들이 이하에 나와 있다.

알킬 및 헤테로알킬 라디칼(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐로 종종 칭해지는 상기 기들을 포함함)에 대한 치환기는, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)₂R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NIR"', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O) ₂NR'R", -NRSO₂R', -CN 및 -NO₂ (수는 0 내지 (2m'+1)의 범위임)(여기에서, m'은 그러한 라디칼 내의 총 탄소수임) 로부터 선택되는 각종 기들 중 하나 이상이다. R', R", R"' 및 R""은 각기 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나 이에 한정되지 않는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기이다.

본 발명의 화합물이 1개 초과의 R 기를 포함할 때, 예를 들어 각각의 R 기는, 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기가 1개 초과가 존재할 때의 그것들과 같이 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착될 때, 그것들은 질소 원자와 조합되어, 5-, 6-또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나 이에 한정되지 않는 의미이다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"은 수소기 외의 기들에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃을 포함하나 이들에 한정되지 않음) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하나 이들에 한정되지 않음)를 포함하는 의미임을 이해할 것이다.

알킬 라디칼에 대해 기재된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴기에 대한 치환기가 다양하고, 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R", -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NIR"C(O)₂R', -NR-C(NIR'R"R")=NR", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN 및 -NO₂, -R', -N₃, -CH(Ph)₂, 플루오로(C1-C4)알콕시 및 플루오로(C1-C4)알킬(수는 0 내지 방향족 환계 상의 개방 원자가의 총수임)로부터 선택되나, 이에 한정되지 않고; 여기에서 R', R", R"' 및 R""은 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다. 본 발명의 화합물이 1개 초과의 R 기를 포함할 때 예를 들어, 각각의 R 기는 상기 기들 중 1개 초과가 존재할 때의 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기와 같이 독립적으로 선택된다.

용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의, 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 또는 리보뉴클레오티드 및 그것의 중합체를 가리킨다. 특별히 제한되지 않는 한, 그 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 가지고, 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사 작용하는, 천연 뉴클레오티드의 공지 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 특별히 제한되지 않는 한, 그 용어는 또한 PNA(펩티도핵산)의 올리고뉴클레오티드 유사체, 안티센스 기술에 사용되는 DNA의 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)를 가리킨다. 달리 표시되지 않는 한, 특별한 핵산 서열은 또한 그것의 보존적으로(conservatively) 변형된 변이체(퇴화 코돈 치환을 포함하나 이들에 한정되지 않음) 및 상보적 서열, 및 명시된 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 퇴화 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 발생시킴으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; 문헌[Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; 문헌[Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]).

치환기가 좌측에서 우측으로 쓰여지는 통상적 화학식에 의해 표현되는 경우, 그것은 우측에서 좌측으로 쓰여지는 구조에서 비롯되는 화학적으로 동일한 치환기를 마찬가지로 포괄하며, 예를 들어 구조 CH₂O는 구조 -OCH₂-와 동등하다.

용어 "치환기"에는 "비간섭 치환기"가 포함되나 이에 한정되지 않는다. "비간섭 치환기"는 안정한 화합물을 수득하도록 하는 기이다. 적당한 비간섭 치환기 또는 라디칼에는 할로, C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, C1-C10 알콕시, C1-C12 아랄킬, C1-C12 알카릴, C3-C12 시클로알킬, C3-C12 시클로알케닐, 페닐, 치환 페닐, 톨루오일, 자일레닐, 비페닐, C2-C12 알콕시알킬, C2-C12 알콕시아릴, C7-C12 아릴옥시알킬, C7-C12 옥시아릴, C1-C6 알킬술피닐, C1-C10 알킬술포닐, --(CH₂)_m--O--(C1-C10 알킬)(식 중에서, m은 1 내지 8임), 아릴, 치환 아릴, 치환 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로시클릭 라디칼, 치환 헤테로시클릭 라디칼, 니트로알킬, --NO₂, --CN, --NRC(O)--(C1-C10 알킬), --C(O)--(C1-C10 알킬), C2-C10 알킬 티오알킬, --C(O)O--(C1-C10 알킬), --OH, --SO₂, =S, --COOH, --NR₂, 카르보닐, --C(O)--(C1-C10 알킬)-CF₃, --C(O)-CF₃, --C(O)NR₂, --(C1-C10 아릴)-S--(C6-C10 아릴), --C(O)--(C1-C10 아릴), --(CH₂)_m--0--(--(CH₂) _m--0(C1-C10 알킬)(식 중에서, 각 m은 1 내지 8임), --C(O)NR₂, --C(S)NR₂, --SO₂NR₂, --NRC(O)NR₂, --NRC(S)NR₂, 이들의 염 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 여기에 사용되는 각 R은 H, 알킬 또는 치환 알킬, 아릴 또는 치환 아릴, 아랄킬 또는 알카릴이다.

용어 "할로겐"에는 불소, 염소, 옥소 및 브롬이 포함된다.

용어 "알킬"은 단독으로 또는 다른 한 치환기의 일부로서 달리 명시되지 않는 한, 직쇄형 또는 분지형 사슬, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합이 포함되고, 이는 완전 포화, 단일-또는 다중불포화일 수 있고, 표시된 탄소수를 갖는(즉, C1-C10은 탄소수가 1 내지 10임을 의미함) 이가 및 다가 라디칼일 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 이들의 동종체 및 이성질체, 예를 들어 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 기가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가지는 알킬기이다. 불포화 알킬기의 예에는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동종체 및 이성질체가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 또한, 용어 "알킬"은 달리 명시되지 않는 한, 이하 더욱 상세하게 기재되는 알킬의 유도체, 예컨대 "헤테로알킬"을 포함하는 의미이다. 탄화수소기로 한정되는 알킬기는 "동종알킬"로 칭해진다.

용어 "알킬렌"은 단독으로 또는 다른 한 치환기의 일부로서 구조 -CH₂CH₂- 및 -CH₂CH₂CH₂CH₂-로 비제한적으로 예시되는 알칸으로부터 유래된 이가 라디칼을 의미하고, 그 예에는 이하 "헤테로알킬렌"으로 기재되는 기가 포함된다. 전형적으로, 알킬 (또는 알킬렌) 기는 탄소수 1 내지 24이고, 본 발명에서 한 특정 실시양태에서, 상기 기의 탄소수는 10 이하이다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 탄소수가 8 이하인, 보다 짧은 사슬의 알킬 또는 알킬렌기이다.

용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)는 그것들의 통상적 의미로 사용되고, 각기 산소 원자, 아미노기 또는 황 원자를 통해 분자의 나머지에 부착된 알킬기를 가리킨다.

용어 "헤테로알킬"은 단독으로 또는 다른 한 용어와 조합되어, 달리 명시되지 않는 한, 안정한 직쇄형 또는 분지형 사슬 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미하고, 이들은 표시된 수의 탄소 원자, 및 O, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이종원자로 구성되고, 여기에서 질소 및 황 원자는 임의적으로 산화될 수 있고, 질소 이종원자는 임의적으로 4급화될 수 있다. 이종원자(들) O, N 및 S, 및 Si는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치, 또는 알킬기가 분자의 나머지에 부착되는 위치에 있을 수 있다. 그 예에는 -CH₂-CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂, -S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, -CH=CH-O-CH₃, -Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃ 및 -CH=CH-N(CH₃)-CH₃이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, -CH₂-NH-OCH₃ 및 -CH₂-O-Si(CH₃)₃과 같이 2개 이하의 이종원자가 연속적일 수 있다. 유사하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 단독으로 또는 다른 한 치환기의 일부로서 -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂- 및 -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-에 의해 비제한적으로 예시되는 헤테로알킬로부터 유래되는 이가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬기에 있어, 동일하거나 상이한 이종원자는 또한 사슬 말단(알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등이 포함되나 이에 한정되지 않음) 중 어느 하나 또는 양자 모두를 차지할 수 있다. 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기에 대해서는, 연결기의 배향이 연결기의 화학식이 쓰여진 방향에 의해 나타내어지지 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)₂R'-는 -C(O)₂R'- 및 -R'C(O)₂-를 모두 나타낸다.

용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 단독으로 또는 다른 한 용어와 조합되어, 달리 명시되지 않는 한, 각기 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 시클릭 양태를 나타낸다. 따라서, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬에는 포화 및 불포화 환 연결기가 포함된다. 부가적으로, 헤테로시클로알킬에 대해, 이종원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지에 부착되는 위치를 차지할 수 있다. 시클로알킬의 예에는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 헤테로시클로알킬의 예에는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피레라지닐, 2-피레라지닐 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 부가적으로, 그 용어는 이환 및 삼환 구조를 포괄한다. 유사하게, 용어 "헤테로시클로알킬렌"은 단독으로 또는 다른 한 치환기의 일부로서 헤테로시클로알킬로부터 유래된 이가 라디칼을 의미하고, 용어 "시클로알킬렌"은 단독으로 또는 다른 한 치환기의 일부로서 시클로알킬로부터 유래된 이가 라디칼을 의미한다.

용어 "아미노산"은 천연 발생 및 비천연 발생 아미노산, 및 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는, 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 가리킨다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 통상의 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린), 및 파이로리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 가지는 화합물, 즉 수소에 결합된 α-탄소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기, 예컨대 호모세린, 노르루이신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 가리킨다. 그러한 유사체는 변형된 R 기(예컨대, 노르루이신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지나, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 가진다. 아미노산이라고 언급하는 경우로는, 예를 들어 천연 발생 단백질 생성과 관련된 L-아미노산, D-아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 변이체와 그 유도체, 천연 발생 단백질 생성과 관련이 없는 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 오르니틴 등과, 아미노산의 특정으로 당업계에게 알려진 성질을 보유하는 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다. 비천연 발생 아미노산의 예로서는, 이에 한정하는 것은 아니지만, α-메틸 아미노산(예컨대, α-메틸 알라닌), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(예컨대, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘), 측쇄에 추가의 메틸렌을 가지는 아미노산("동종" 아미노산) 및 측쇄의 카복실산 작용기가 술폰산기로 치환된 아미노산(예를 들어, 시스테산)을 포함한다.

아미노산은 통상 공지된 3개의 문자 기호에 의해, 또는 [IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)]가 권장하는 1개 문자 기호로 본원에서 칭해질 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 통상 수용되는 단일 문자 코드에 의해 칭해질 수 있다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 대해 적용된다. 특별한 핵산 서열에 대해, "보존적으로 변형된 변이체"는 일치하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 가리킨다. 유전 암호의 퇴행으로 인해, 수많은 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코딘에 의해 특정화되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이들 중 한 종인 "침묵 변이(silent variations)"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산 내의 각 코돈(메티오닌에 대한 통상 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 통상 유일한 코돈인 TGG 제외)은 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성시킬 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각 기재된 서열에 내포된다.

아미노산 서열에 대해, 당업자는 코딩된 서열 내의 단일 아미노산 또는 낮은 백분율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"임(여기에서, 변경은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키게 됨)을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 공지되어 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동종체 및 대립유전자에 부가되는 것으로, 이들을 배제하지 않는다.

기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 당업자에게 공지되어 있다. 하기 8개 기는 상호 보존적 치환기인 아미노산을 각기 함유한다:

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소루이신(I), 루이신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)

(예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2^nd Edition (December 1993)] 참조)

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련한 내용에서 "동일한" 또는 % "동일성"이라는 용어는 동일한 2개 이상의 서열 또는 부분서열을 지칭한다. 대상 서열들을 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 조사에 의해 측정하여, 비교 창 또는 지정된 영역에 대한 최대 관련성을 비교하여 정렬할 때, 서열들이 동일한 (즉, 특정 영역에 대하여 약 60% 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 %를 가지는 경우, 그 서열들은 "실질적으로 동일하다"고 한다. 또한, 이 정의는 시험 서열의 보체를 지칭하기도 한다. 동일성은 길이가 약 50개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 길이가 75 내지 100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재할 수 있거나, 또는 특정되지 않은 경우에는, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 인간 이외의 종의 동족체를 비롯한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 엄격한(stringent) 하이브리드 조건 하에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 가지는 표지된 프로브를 사용하여 라이브러리를 스크리닝하는 단계 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 전장 cDNA와 유전체 클론을 단리하는 단계를 포함하는 과정에 의해 수득될 수 있다. 이러한 혼성화 기법들은 당업자에게 잘 알려져 있다.

서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 기준 서열로 작용하고, 그에 대해 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하여, 필요한 경우 부분서열 좌표가 표시되고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 표시된다. 바람직하게, 디폴트 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 대안적 매개변수가 표시될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수에 기초하여, 기준 서열에 대한 시험 서열에 대한 서열 동일성(%)을 계산한다.

본원에 사용되는 "비교 창"은 통상적으로 약 20 내지 600, 주로 약 50 내지 200, 더욱 주로 약 100 내지 150으로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 수의 인접 위치의 세그먼트를 지칭하는 것을 포함하고, 여기에서 서열은 2개 서열이 최적으로 정렬된 후, 동일한 수의 인접 위치들의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법이 당업계에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예컨대 문헌[Smith and Waterman(1981) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman(1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사도 방법 검색, 이 알고리즘의 컴퓨터처리 이행([위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지(Wisconsin Genetics Software Package), 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 575 Science Dr., 미국 위스콘신주 매디슨]에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동적 정렬 및 가시적 검사(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1995년 부록) 참조)에 의해(단, 이에 한정되지 않음) 수행될 수 있다.

서열 동일성(%) 및 서열 유사성을 결정하는데 적당한 알고리즘의 한 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이는 문헌[Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402] 및 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각기 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어가 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개 입수가능하다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열을 위한) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. BLASTP 프로그램은 아미노산 서열에 대해, 디폴트로서 3의 단어 길이, 및 10의 기대치(E), 및 50의 BLOSUM62 스코어링 행렬(문헌[Henikoff and Henikoff(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조) 정렬(B), 10의 기대치(E), M=5, N=-4, 및 양 나선의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘은 전형적으로 "저착화성(low complexity)" 필터를 작동시키지 않고 수행된다.

BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 척도는 최소 총 확률(P(N))이며, 이는 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 일어날 수 있는 확률을 가리킨다. 예를 들어, 핵산은 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소의 합 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우, 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.

어구 "~에 선택적으로 (또는 특이적으로) 혼성화하다"는, 서열이 착혼합물(예를 들어, 총 세포 내 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA) 내에 존재할 때, 엄격한 혼성화 조건 하에서 한 특별한 뉴클레오티드 서열에 대해서만 분자에 결합하거나 복제되거나 혼성화함을 가리킨다.

어구 "엄격한 혼성화 조건"은 당업계에 공지된 바와 같은 저이온성 강도 및 고온의 조건을 가리킨다. 전형적으로, 엄격한 조건 하에 프로브는 핵산(전 세포내 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나 이들에 한정되지 않음)의 착 혼합물 내의 그것의 표적 부분서열에 혼성화하나, 착 혼합물 내의 다른 서열에는 혼성화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 서열이 길수록, 특이적으로 혼성화하는 온도가 더 높다. 핵산의 혼성화에 대한 광대한 지침이 문헌[Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)]에 나와 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점(T_m)보다 약 5 내지 10℃가 더 낮도록 선택된다. T_m은 표적에 대해 상보적인 프로브의 50%가 평형 하에 표적 서열에 혼성화하는 (한정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서의) 온도이다(T_m에서 표적 서열이 과량으로 존재할 때, 프로브의 50%가 평형 하에 놓이게 된다). 엄격한 조건은, 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 통상적으로는 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도(또는 기타 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예를 들어, 약 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에서 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브(예를 들어, 약 50개 초과의 뉴클레오티드)에서 약 60℃ 이상인 조건이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 통상적으로 2배 이상의 백그라운드, 바람직하게는 10배 이상의 백그라운드 혼성화일 수 있다. 예시적 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5× SSC, 및 1% SDS, 42℃에서의 항온배양, 또는 5× SSC, 1% SDS, 0.2× SSC에서의 세척과 함께 65℃에서의 항온배양, 및 65℃의 0.1% SDS. 상기 세정은 5 세척은 5분, 15분, 30분, 60분, 120분 또는 그 이상 동안 수행될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "진핵생물"은 계통 도메인 진핵생물에 속하는 유기체, 예컨대 동물류(포유류, 곤충류, 양서류, 조류 등을 포함하나 이들에 한정되지 않음), 섬모충, 식물류(단자엽식물, 쌍자엽식물, 조류 등을 포함하나 이들에 한정되지 않음), 진균, 효모, 편모충, 마포자충류, 원생생물 등을 가리킨다.

본원에 사용되는 용어 "비진핵생물"은 비진핵생물 유기체를 가리킨다. 예를 들어, 비진핵생물 유기체는 진정세균(에쉐리키아 콜라이, 써무스 써모필러스(Thermus thermophilus), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 슈모모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등을 포함하나 이들에 한정되지 않음) 계통 도메인, 또는 고세균(메타노코커스 잔나쉬이(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모아우토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움(Halobacterium), 예컨대 할로페락스 볼카니(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 파이로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 파이로코커스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii), 아에우로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 등을 포함하나 이들에 한정되지 않음) 계통 도메인에 속할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "대상"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인, 동물, 일부 실시양태에서는 포유동물, 다른 실시양태에서는 인간을 지칭하는 것이다. 동물은 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등), 또는 실험용 동물(예를 들어, 래트, 마우스, 기니아 피그 등)일 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "유효량"은 처리하는 질환, 상태 또는 장애의 증상들 중 하나 이상을 어느 정도 경감시키기 위해 투여되는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 총양을 가리킨다. 본원에 기재된 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방, 증진 및/또는 치유적 치료를 위해 투여될 수 있다.

용어 "증진하다" 또는 "증진시키는"은 원하는 효과를 그 강도 또는 기간에 있어 증가 또는 연장시키는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과를 증진시키는 것에 대한 용어 "증진시키는"은 시스템에 대한 다른 치료제의 효과를 그 강도 또는 기간에 있어 증가 또는 연장시키는 능력을 가리킨다. 본원에 사용되는 "증진 유효량"은 원하는 시스템에서 다른 한 치료제의 효과를 증진시키기에 적당한 양을 가리킨다. 환자에게 사용할 때, 이 용도에 효과적인 양은 질환, 장애 또는 상태의 중도 및 과정, 과거 치료, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 의존할 것이다.

본원에 사용되는 용어 "양성 선택 또는 선별 마커"는, 존재할 경우, 예를 들어 발현되거나 활성화되는 등의 경우에, 양성 선택 마커가 없는 세포로부터 양성 선택 마커가 있는 세포를 동정하도록 하는 마커를 지칭한다.

본원에 사용되는 용어 "음성 선택 또는 선별 마커"는, 존재할 경우, 예컨대 발현되거나 활성화되는 등의 경우에, (예를 들어, 원하는 성질을 가지는 세포와 비교하여) 원하는 성질을 갖지 않는 세포를 동정하도록 하는 마커를 지칭한다.

본원에 사용되는 용어 "리포터"는 관심의 대상이 되는 시스템의 표적 성분을 선택하는 데 사용될 수 있는 성분을 지칭한다. 예를 들어, 리포터는 항생제 내성 또는 감도를 부여하는 단백질, 예컨대 효소(β-락타마제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase: CAT) 등을 포함하나 이에 한정되지 않음), 형광 선별 마커(녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP), YFP, EGFP, RFP를 포함하나 이에 한정되지 않음), 발광 마커(개똥벌레 루시퍼라제 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않음), 친화성 기재 선별 마커, 또는 양성 또는 음성 선택성 마커 유전자, 예컨대 lacZ, β-gal/lacZ(β-갈락토시다제), ADH(알코올 탈수소효소), his3, ura3, leu2, lys2 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "진핵생물"은 계통 도메인 유카리아(Eucarya)에 속하는 유기체, 예컨대 동물(포유동물, 곤충, 파충류 및 조류를 포함하나 이에 한정되지 않음), 섬모충, 식물(단자엽, 쌍자엽 식물 및 조류를 포함하나 이에 한정되지 않음), 진균, 효모, 편모충, 미세포자충, 원생생물 등을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "비진핵생물"은 비진핵생물 유기체를 지칭한다. 예로서, 비진핵 유기체는 진정세균(에쉐리키아 콜라이, 써무스 써모필러스, 바실러스 스테아로써모필러스, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 푸티다 등을 포함하나 이에 한정되지 않음) 계통 도메인, 또는 고세균(예를 들어, 메타노코커스 잔나쉬이, 메타노박테리움 써모아우트로피쿰, 할로박테리움, 예컨대 할로페락스 볼카니 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아르카에오글로부스 풀기두스, 파이로코커스 푸리오서스, 파이로코커스 호리코쉬이, 아에우로피룸 페르닉스 등) 계통 도메인에 속할 수 있다.

바이러스 엔벨로프 단백질의 하기 비제한적 예도 또한 포함된다; 필로바이러스(예컨대, 에볼라 바이러스), 오르소믹소바이러스(예컨대, 인플루엔자바이러스), VSV-G, 알파 바이러스(예컨대, 셈리키 포레스트(Semliki forest) 바이러스 및 신드비스(Sindbis) 바이러스), 아레나(arena) 바이러스(예컨대, 림프구성 맥락 수막염 바이러스), 플라비바이러스(예컨대, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 뎅기 바이러스), 랍도 바이러스(예컨대, 소수포성 구내염 바이러스 및 광견병 바이러스), 몰로니 백혈병 바이러스, HSV, VZV, 멈프스 바이러스, 라이노바이러스, 홍역, 풍진, 일본뇌염 바이러스, 장내 바이러스(예컨대, 소아마비, 콕사키, 에코바이러스), 폴리오 바이러스, 콕사키 B, A & 에코바이러스, 라이노바이러스, 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 아스트로바이러스, 토가바이러스, 알파바이러스, 페스티바이러스, 코로나바이러스, 파라인플루엔자, 멈프스 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus: RSV), 분야비리다에(Bunyaviridae), 레오비리다에(Reoviridae), 레오바이러스, 로타바이러스, HTLV, 폴리오마바이러스, 파필로마바이러스, 아데노바이러스, 파르보바이러스, EBV, CMV, 바리셀라 조스터(Varicella Zoster) 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 폭스 바이러스로부터의 엔벨로프 단백질.

보존적 변이체: 용어 "보존적 변이체"는 보존적 변이체의 기초가 되는 성분, 예컨대 O-tRNA 또는 O-RS와 같이 작용적으로 수행하나, 서열에 있어 변이를 가지는 번역 성분, 예컨대 보존적 변이체 O-tRNA 또는 보존적 변이체 O-RS를 지칭한다. 예를 들어, O-RS는 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산으로 상보적 O-tRNA 또는 보존적 변이체 O-tRNA를 아미노아실화하나, O-tRNA 및 보존적 변이체 O-tRNA는 동일한 서열을 갖지 않는다. 유사하게, tRNA는 상보적 O-RS 또는 보존적 변이체 O-RS에 의해 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산으로 아미노아실화될 것이나, O-RS 및 보존적 변이체 O-RS는 동일한 서열을 갖지 않는다. 보존적 변이체는, 그 보존적 변이체가 상응하는 O-tRNA 또는 O-RS에 상보적인 한, 서열에 있어 1개 변이, 2개 변이, 3개 변이, 4개 변이, 또는 5개 이상의 변이를 가질 수 있다.

선택 또는 선별제 : 본원에 사용되는 용어 "선택 또는 선별제"는, 존재할 경우, 모집단으로부터의 특정 성분을 선택/선별하도록 하는 제제를 지칭한다. 예를 들어, 선택 또는 선별제에는 예컨대, 영양소, 항생제, 광 파장, 항체, 발현된 폴리뉴클레오티드 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 선택제는 예를 들어 농도, 강도 등에 의해 변화될 수 있다.

용어 "효율적으로 인식되지 않는다"는 한 유기체로부터의 RS가 O-tRNA를 아미노아실화하는 효율이, 예컨대 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 1% 미만임을 지칭한다.

상세한 설명

지금까지, 백신은 사멸 유기체 또는 약독화 유기체로 생산한 것들로 국한되어 왔다. 열, UV, 포름알데히드 처리에 의한 미생물의 사멸은 본래의 에피토프의 감소를 초래하였고, 약독화 바이러스는 전형적으로 환자, 특히 저연령층 환자, 고연령층 환자, 면역시스템이 저해된 자들에 대한 위험요소인, 극도로 낮으나 영(0)은 아닌 복제를 초래하는 유전자 결실 및 절단을 통해 생산된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 전 유기체 변형 백신을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 비천연 아미노산에 대한 복제 의존성을 가지는 유전적으로 변형된 전 유기체 백신을 제공한다. 본 발명은 보조제의 존재 또는 부재 하에 사용되어도 되는, 본래의 미생물이 도입된 백신을 제공한다. 이는 부가적으로 고면역원성이고 체액성 및 T 세포 매개 반응을 촉발하게 되는 고밀도의 본래의 에피토프를 제공할 수 있고, 이로써 더욱 효과적인 백신을 제공한다. 본 발명은 하나 이상의 비천연 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 바이러스 또는 박테리아 상의 하나 이상의 부위에 도입된 백신을 제공한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 복제에 필요한 미생물의 한 부분 상에 포함되며, 이로써 약독화 바이러스와 관련된 위험이 소거되고, 바이러스/박테리아 사멸의 필요성도 소거된다. 비천연적으로 코딩된 아미노산(들)이 도입된 백신은 본래의 미생물에 구조적으로 극히 가까운, 단 복제 불능이고 천연 환경에서 단지 제한된 복제능만을 가지는 미생물을 제공한다. 미생물 복제의 절대적 조절은 이하 상세히 설명되는 아미노산의 부위 특이적 도입을 이용하여 구현되어, 종결 코돈 억제를 이용하여 필수 유전자 발현(기능)을 조절한다. 바이러스의 경우, 숙주 생산 세포주에는 발달에 필요한 비천연 아미노산이 부위 특이적으로 도입된다. 박테리아의 경우, 게놈을 하나 이상의 부위 특이적으로 도입된 비천연 아미노산(들)을 포함하도록 조작된다.

조절 필수 유전자 기능은 유전적 및 구조적 기능 수준으로 구현될 수 있다. 예를 들어, 표 2를 참조한다. 유전적 수준으로, 전장 필수 유전자가 비천연적으로 도입된 아미노산의 존재 하에 발현된다. 구조적 기능 수준으로는, 필수 유전자가 특정 부위에 비천연 아미노산의 존재 하에서만 기능적으로 되도록 조작된다. 이 부위에서의 임의의 천연 아미노산의 도입은 그것의 본래의 기능이 소실되게 된다. 비천연 아미노산(들)의 선택의 자유도는, 당업자로 하여금 요망되는 백신의 면역원성, 및 과잉 또는 과다 조절 복제의 자유도를 조절할 수 있도록 하고, 여기에서 종래로부터 복제 약독화와 생산 간에 균형을 맞추는 것이 필요하였고, 비천연 아미노산의 부위 특이적 도입은 비천연 아미노산의 부재 하에 복제능이 없는 백신용 개발 툴을 제공한다.

상기 기술을 이용하기 위해 백신이 개발될 수 있는 박테리아 및 바이러스에는 공지의 바이러스가 포함된다. 비제한적 예로서, 여기에는 호흡기관에 영향을 미치는 바이러스, 예컨대 인간 라이노 바이러스(human rhino viruses: HRV), 아데노바이러스, 콕사키바이러스, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytia virus: RSV), 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus: EBV), 및 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus: CMV); 위장관(GI)에 영향을 미치는 바이러스, 예컨대 로타바이러스, 노르워크제(Norwalk agent), A형 간염A(FfAV), 소아마비 바이러스 및 기타 피코르나바이러스; 성감염 바이러스, 비제한적 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스(HfV), 인간 유두종 바이러스(human papilloma virus: HPV), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus: HSV) 1, HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV-6, HHV-7 및 HHV-8; CMV, B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV)이 포함된다. 박테리아의 비제한적 예에는 그램 양성 박테리아 및 그램 음성 박테리아 모두가 포함되며, 여기에는 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 마이코박테리박테리움(Mycobacterium)(예를 들어, 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) 및 마이코박테리움 아비움 아종 파라튜버쿨로시스(paratuberculosis)), 엔테코커스(Enterococcus), 코르니박테리움(Corynebacterium), 보렐리아(Borrelia), 바실러스(Bacillus), 클라미디아(Chlamydia), 마이코플라스마 등이 포함된다.

하나 이상의 선택된 아미노산, 예컨대, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질의 제조에 적합한 번역 시스템이 미국 특허 출원 제10/126,931호(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL tRNA SYNTHETASE PAIRS") 및 제10/126,927호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS")에 기재되어 있다. 또한, USSN 제10/825,867호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE")을 참조한다. 이러한 출원들 각각은 전체적으로 본원에 참조 인용된다. 그러한 번역 시스템은 일반적으로 오르소고날 tRNA(O-tRNA), 오르소고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS), 및 선택된 아미노산, 예컨대, 비천연 아미노산을 포함하고, 여기에서 O-RS는 선택된 아미노산으로 O-tRNA를 아미노아실화한다. 본 발명의 오르소고날 쌍은 O-tRNA, 예컨대, 억제자 tRNA, 프레임쉬프트 tRNA 등, 및 O-RS로 구성된다. O-tRNA는 제1 셀렉터 코돈을 인식하고, 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 동족 합성효소의 존재 하에 억제 활성을 가진다. 세포는 선택된 아미노산을 성장 폴리펩티드 사슬에 혼입시키는 성분을 이용한다. 예를 들어, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 또한 존재할 수 있고, 여기에서 폴리뉴클레오티드는 O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함한다. 번역 시스템은 또한 시험관내 시스템일 수 있다. 본 발명의 tRNA 분자는 번역 시에 리보솜을 이용하는 시스템을 포함한, 임의의 번역 시스템에서 유용하다.

번역 시스템은 또한 무세포(시험관내) 번역 시스템일 수 있다. mRNA를 주형으로서 포함하거나(시험관내 번역), DNA를 주형으로서 포함할 수 있는(시험관내 전사 및 번역 조합) 이러한 시스템에서, 시험관내 합성은 리보솜에 의해 지정된다. 무세포 단백질 발현 시스템의 개발을 위해 상당한 노력이 가해졌다. 예를 들어, 문헌[Kim, D. M. and J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74:309-316 (2001)]; [Kim, D. M. and J. R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000)]; [Kim, D. M., and J. R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000)]; [Kim, D. M., and J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188(1999)]; 및 [Patnaik, R. and J. R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868 (1998)]; 미국 특허 제6,337,191호; 미국 특허 공보 제2002/0081660호; WO 00/55353; 및 WO 90/05785](본원에서 참조 인용됨)를 참조한다. 적용될 수 있는 또 다른 접근법은 mRNA-펩티드 융합 기법을 포함한다. 예를 들어, 문헌[R. Roberts and J. Szostak, Proc . Natl . Acad . Sci .( USA ) 94:12297-12302(1997)]; [A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10:1043-1050(2003)](본원에서 참조 인용됨)을 참조한다. 이러한 접근법에서, 퓨로마이신에 연결된 mRNA 주형은 리보솜상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형된 경우, 비천연 아미노산 또한 펩티드에 혼입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 판독된 후에, 퓨로마이신은 펩티드의 C-말단을 포획한다. 생성된 mRNA-펩티드 접합체가 시험관내 검정에서 관심의 대상이 되는 성질을 가지는 것으로 나타난 경우, 그의 실체는 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이러한 방식으로, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 선별하여, 원하는 성질을 가지는 폴리펩티드를 동정할 수 있다. 보다 최근, 정제된 성분을 가지는 시험관내 리보솜 번역은, 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 펩티드가 합성되도록 하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 문헌[A. Forster et al., Proc . Natl Acad . Sci .(USA) 100: 6353 (2003)]을 참조한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 세포는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 박테리아를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 박테리아는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 바이러스를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 바이러스는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 마이코박테리움 아비움을 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 마이코박테리움 아비움 아종 파라튜버쿨로시스 세포는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 뇌수막염 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 뇌수막염 세포는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 광견병 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 광견병 세포는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 조류 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 조류 세포는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 바이러스 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 바이러스 세포는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 박테리아 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 박테리아 세포는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 진균 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 진균 세포는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 소아마비 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 소아마비 세포는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 E. 콜라이 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, E. 콜라이 세포는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물 내로 도입된 마이코박테리움 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 마이코박테리움 세포는 복제에 필요한 유전자 산물 내에 비천연 아미노산을 포함하도록 유전적으로 변형되었다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 비천연 아미노산 의존성 세포는 백신을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 비천연 아미노산 의존성 세포는 백신으로서 투여되어도 되는 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 비천연 아미노산 의존성 세포는 접종에 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 tRNA를 포함하는 E. 콜라이 세포는 그러한 번역 시스템을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 E. 콜라이 세포는 오르소고날 tRNA(O-tRNA)(여기에서, O-tRNA는 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 동족 합성효소의 존재 하에 억제 활성을 가짐); 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS); 선택된 아미노산; 및 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산(여기에서, 폴리뉴클레오티드는 O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함함)을 포함한다.

본 발명은 또한 1개 초과의 선택된 아미노산이 도입될 수 있도록 하는 세포내 다중 O-tRNA/O-RS 쌍을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 세포는 추가의 상이한 O-tRNA/O-RS 쌍 및 제2의 선택된 아미노산을 추가로 포함할 수 있고, 여기에서 O-tRNA는 제2 셀렉터 코돈을 인식하고, O-RS는 제2의 선택된 아미노산으로 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 예를 들어, 세포는 예컨대, 메타노코커스 잔나쉬이의 티로실-tRNA 합성효소로부터 유래된 앰버 억제자 tRNA-아미노아실 tRNA 합성효소 쌍을 추가로 포함할 수 있다.

O-tRNA 및/또는 O-RS는 천연적으로 발생하거나, 각종 유기체들로부터 예컨대, tRNA의 라이브러리 및/또는 RS의 라이브러리를 생성시키는 천연 발생 tRNA 및/또는 RS의 돌연변이화에 의해 유래될 수 있다. 예를 들어, 오르소고날 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍을 생산하는 하나의 기법은 이종 tRNA/합성효소 쌍을, 예컨대 숙주 세포 이외의 공급원, 또는 다중 공급원로부터 숙주 세포로 이동시키는 것을 포함한다. 이종 합성효소 후보물질의 성질은 예컨대, 그것이 임의의 숙주 세포 tRNA를 충전하지 않음을 포함하고, 이종 tRNA 후보물질의 성질은, 예컨대 그것이 임의의 숙주 세포 합성효소에 의해 아미노아실화되지 않음을 포함한다. 또한, 이종 tRNA는 모든 숙주 세포 합성효소에 대해 오르소고날이다.

오르소고날 쌍을 생성하는 제2 기법은 O-tRNA 또는 O-RS를 선별 및/또는 선택하도록 하는데 이용되는 돌연변이체 라이브러리를 생성하는 것을 포함한다. 이러한 기법들은 또한 조합될 수 있다.

각종 실시양태들에서, O-tRNA 및 O-RS는 하나 이상의 유기체로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, O-tRNA는 천연 발생되거나 제1 유기체로부터의 돌연변이화된 천연 발생 tRNA로부터 유래되고, O-RS는 천연 발생되거나 제2 유기체로부터의 돌연변이화된 천연 발생 RS로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 유기체는 상이하다. 예를 들어, 오르소고날 쌍은 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum)으로부터 유래된 tRNA, 및 고세균 tRNA(예를 들어, 할로박테리움 종 NRC -1(Halobacterium sp . NRC -1))로부터 유래된 tRNA를 포함할 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 유기체는 동일하다. 추가의 정보를 위해 본원에서의 단락(제목: "공급원 및 숙주 유기체(Sources and Host Organisms)")을 참조한다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 O-tRNA는 서열 번호 1, 2, 또는 3에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 보존적 변이를 포함하거나, 그에 의해 코딩된다. 또한 본원에서의 단락(제목: "핵산 및 폴리펩티드 서열 및 변이체(Nucleic Acid and Polypeptide Sequence and Variants)")을 참조한다.

오르소고날 tRNA(O- tRNA )

오르소고날 tRNA(O-tRNA)는, 예컨대 생체내 또는 시험관내, O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질로 선택된 아미노산을 도입하는 것을 매개한다. 본 발명의 O-tRNA는 화학적 또는 효소적 아미노아실화를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 방법 또는 기법에 의해 원하는 아미노산으로 아미노아실화될 수 있다. 본 발명의 아미노아실화된 O-tRNA는 번역 시스템에 직접 첨가될 수 있다. 본 발명의 O-tRNA는 시험관내 또는 생체내, 선택된 아미노산을 이용하여 RS에 의해 아미노아실화될 수 있다. 또한, RS는 O-RS일 수 있다. 본 발명의 O-tRNA는 직접적으로, 또는 O-tRNA 또는 이의 일부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공함으로써 번역 시스템(예를 들어, 시험관내 번역 성분, 또는 세포)에 제공될 수 있다. 예를 들어, OtRNA 또는 이의 일부분은 서열 번호 1, 2, 3에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 보존적 변이에 의해 코딩된다.

본 발명의 O-tRNA는 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 동족 합성효소의 존재 하에 억제 활성을 포함한다. 억제 활성은 당업계에 공지된 다수의 검정법들중 임의의 검정법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, β-갈락토시다제 리포터 검정법이 이용될 수 있다. 프로모터의 조절 하에 lacZ 유전자를 발현하는 플라스미드의 유도체를 사용하며, 예컨대 여기에서, lacZ의 펩티드 VVLQRRDWEN의 Leu-25는, 티로신, 세린, 루이신 등에 대한 센스 코돈(대조군) 또는 셀렉터 코돈, 예컨대 TAG, TGA, AGGA 등의 코돈으로 대체된다. 유도체화된 lacZ 플라스미드는 본 발명의 OtRNA를 포함하는 플라스미드와 함께 적절한 유기체(예를 들어, 오르소고날분이 사용될 수 있는 유기체)로부터의 세포에 도입된다. 동족 합성효소도 또한 (발현될 때 동족 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로서) 도입될 수 있다. 세포를 원하는 밀도, 예컨대 약 0.5의 OD₆₀₀으로 매질 내에서 성장시키고, β-갈락토시다제 검정법을, 예컨대 베타플루오르(BetaFluor)™ β-갈락토시다제 검정 키트(노바겐(Novagen))를 이용하여 수행한다. 억제율(%)을, 예컨대 유도체화된 lacZ 작제물로부터 관찰되는 값인 필적하는 대조군 대비 샘플의 활성도(%)로서 산출하고, 여기에서 작제물은 원하는 위치에 셀렉터 코돈이 아닌 상응하는 센스 코돈을 가진다.

tRNA 분자에서, 티민(T)은 우라실(U)로 대체된다. 또한, 염기에 대한 추가의 변형이 존재할 수 있다. 본 발명은 또한 O-tRNA의 보존적 변이체를 포함한다. 예를 들어, O-tRNA의 보존적 변이체는 O-tRNA와 같이 작용하고 tRNA L-형상 구조를 유지하나, 동일한 서열을 갖지 않는(또한 야생형 tRNA 분자가 아니다) 분자들을 포함한다. 또한, 본원에서의 단락(제목: "핵산 및 폴리펩티드 서열 및 변이체")을 참조한다.

O-tRNA를 포함하는 조성물은 추가로 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 포함할 수 있고, 여기에서 O-RS는 선택된 아미노산(예를 들어, 비천연 아미노산)으로 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 특정 실시양태에서, O-tRNA를 포함하는 조성물은 추가로 번역 시스템(예를 들어, 시험관내 또는 생체내 번역 시스템)을 포함할 수 있다. 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산(여기에서, 폴리뉴클레오티드는 O-tRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 셀렉터 코돈, 또는 이들 중 하나 이상의 조합을 포함한다)이 또한 세포 또는 기타 번역 시스템 내에 존재할 수 있다. 또한, 본원에서의 단락(제목: "오르소고날 tRNA 합성효소(O-RS)")을 참조한다.

오르소고날 tRNA(O-tRNA), 예를 들어 O-tRNA의 생산 방법도 또한 본 발명의 한 특성이 된다. tRNA, 예를 들어 상기 방법에 의해 생산된 O-tRNA 또한 본 발명의 한 특성이 된다.

오르소고날 tRNA의 생성 방법은, 셀렉터 코돈(예를 들어, 앰버 코돈, 오팔 코돈, 4 염기 코돈 등)을 인식하도록 하는 tRNA의 각 풀의 안티코돈 루프를 돌연변이화함으로써, 복수개의 잠재적 O-tRNA를 제공하고; 복수개의 잠재적 O-tRNA의 구성원의 2차 구조를 분석하여, 2차 구조내 비정규 염기쌍을 동정하고, 임의적으로 비정규 염기쌍을 돌연변이화하는 것(예를 들어, 비정규 염기쌍은 정규 염기쌍으로 돌연변이화됨)을 포함한다. 비정규 염기쌍은 2차 구조의 줄기 영역 내에 위치할 수 있다. O-tRNA는 하나 이상의 특성 또는 활성의 향상, 예컨대 출발 물질, 예컨대 복수개의 tRNA 서열 대비, 원하는 유기체에 대한 오르소고날의 향상을 가지면서, 한편 원하는 RS에 대한 친화성을 유지할 수 있다.

대안적으로, O-tRNA는 번역에 영향을 주거나 번역 기구의 성분인 하나 이상의 분자와의 상호 작용 또는 그에 대한 결합 친화성을 조절하기 위해 공지된 tRNA를 돌연변이화함으로써 개발될 수 있다. 그러한 성분은 신장 인자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 박테리아 신장 인자 EF-Tu는 단백질 합성에서의 신장 단계에서 핵심적 역할을 한다. tRNA 합성효소에 의해 tRNA를 아미노아실화한 후에, EF-Tu는 아미노아실화된 tRNA에 결합하여, 그것을 리보솜의 A 부위로 보낸다. 충전된 아미노산과 tRNA 사이의 에스테르 결합은 EF-Tu와 아미노아실화된 tRNA 사이의 결합으로 인해 자발적 가수분해로부터 보호된다. Stortchevoi 등은, TΨC 줄기에서의 E. 콜라이 개시 tRNA^fMet U50:G64 동요(wobble) 염기쌍의 돌연변이체를 조사하였는데, 그 이유는 이러한 염기쌍이 추정컨대 EF-Tu.GTP와 아미노아실화된 tRNA 사이의 약화된 상호작용으로 인해 신장에 있어 tRNA의 활성을 막는 2차적 음성 결정자인 것으로 나타났기 때문이다(문헌[JBC 2003 278(20):17672-17679]). 또한, (LaRiviere) 등은 문헌[Science 2001 Oct 5; 294(5540):165-8]에서 EF-Tu에 대한 전반적 결합 친화성에 대한 아미노산 및 tRNA 체의 열역학적 기여를 기재하였다. 그들은 tRNA 체와 아미노산의 기여가 상호 독립적이며, tRNA가 올바로 아실화될 때 그것들을 상호 상보함을 보여주었다. EF-Tu.GTP와 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 tRNA 사이의 상호작용의 변경은 리보솜의 A부위에 tRNA를 로딩하는 효율에 영향을 줄 수 있다. 잠재적 돌연변이 부위는 또한 tRNA와 번역 기구의 다른 성분, 예컨대 EF-Tu 사이의 복합체의 결정 구조를 분석함으로써 밝혀질 수 있다. 예를 들어, Nissen 등은 EFTu. GTP가 효모 페닐알라닐-전이 RNA(Phe-tRNA)의 TΨC 줄기의 인산염 골격에 직접 결합함을 보여주었다(문헌[Science 1995 270(5241):1464-1472]).

상기 방법은 임의적으로 tRNA 및/또는 아미노아실-tRNA 합성효소의 서열 상동성을 분석하여, 특정 유기체에 대해 오르소고날인 것으로 보이는 O-tRNA, O-RS 및/또는 이의 쌍에 대한 잠재적 후보물질을 결정하는 것을 포함한다. 당업계에 공지되고 본원에 기술된 컴퓨터 프로그램은 분석을 위해 사용할 수 있다. 일례로, 원핵생물 유기체에 사용하기 위한 잠재적 오르소고날 번역 성분을 선택하기 위해, 원핵생물 유기체에 특이적 상동성을 나타내지 않는 합성효소 및/또는 tRNA를 선택할 수 있다.

tRNA 풀 또한 일치 기법(consensus strategy)에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 복수개의 tRNA 서열을 정렬하고; 일치 서열을 결정하고; 전체 일치 서열중 적어도 일부, 대부분, 또는 전부를 이용하여 tRNA의 라이브러리를 생성함으로써 tRNA 풀을 생산한다. 예를 들어, 일치 서열을 컴퓨터 프로그램, 예컨대 GCG 프로그램 파일업(pileup)을 이용하여 컴파일할 수 있다. 임의적으로, 프로그램에 의해 결정된 축퇴 위치를 그 위치들에서 가장 빈번한 염기로 바꾼다. 일치 서열을 이용하여 당업계에 공지된 기법을 이용하여 라이브러리를 합성한다. 예를 들어, tRNA 유전자의 각 부위가 90% 일치 서열 및 10% 다른 3개 염기의 혼합물로 된 도핑 혼합물로서 합성될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 중첩 연장을 사용하여, 일치 서열에 기초한 라이브러리를 제공할 수 있다. 다른 혼합물, 예를 들어 75% 일치 서열 및 25% 다른 3개 염기의 혼합물; 80% 일치 서열 및 20% 다른 3개 염기의 혼합물; 95% 일치 서열 및 5% 다른 3개 염기의 혼합물 등도 또한 사용할 수 있다.

돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 당업계에 공지된 각종 돌연변이유발 기법을 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 tRNA는 부위 특이적 돌연변이, 무작위 점 돌연변이, 상동 재조합, DNA 셔플링 또는 기타 재귀적 돌연변이유발, 키메라 구성, 또는 이의 임의의 조합에 의해 생성될 수 있다.

추가의 돌연변이화가 tRNA의 원하는 루프 또는 영역, 예컨대 안티코돈 루프, 어셉터 줄기, D 암(arm) 또는 루프, 가변성 루프, TΨC 암 또는 루프, tRNA 분자의 다른 영역, 또는 이의 조합내 특정 위치(들), 예컨대 비보존적 위치(들) 또는 보존적 위치(들), 또는 무작위 위치(들), 이의 조합에서 도입될 수 있다. 돌연변이화는 줄기 영역에 매칭된 염기쌍을 포함할 수 있다.

전형적으로, O-tRNA는 제1 종의 세포 집단을 음성 선택에 적용함으로써 수득되고, 여기에서 세포는 복수개의 잠재적 O-tRNA의 한 구성원을 포함한다. 음성 선택은 세포에 대해 내인성인 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화된 복수개의 잠재적 O-tRNA의 한 구성원을 포함하는 세포를 제거한다. 이로써, 제1 종의 세포에 대해 오르소고날인 O-tRNA 풀이 제공된다.

음성 선택의 특정 실시양태에서, 셀렉터 코돈(들)은 비필수 위치 등에서, 음성 선택 마커, 예컨대 항생제 내성을 부여하는 효소, 예컨대 β-락타마제, 검출가능한 산물을 부여하는 효소, 예컨대 β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 예컨대 독성 산물, 예컨대 바나제(barnase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 도입된다. 선별/선택은 선택제(예를 들어, 암피실린과 같은 항생제)의 존재 하에 세포 집단을 성장시킴으로써 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 선택제의 농도가 변화된다.

예를 들어, 억제자 tRNA의 활성을 측정하기 위해, 음성 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 β-락타마제(bla)를 위한 유전자에 도입된 넌센스 또는 프레임쉬프트 돌연변이와 같은 셀렉터 코돈의 생체내 억제에 기초한 선택 시스템을 사용한다. 예를 들어, 특정 위치에 예를 들어, TAG, AGGA 및 TGA를 가지는 폴리뉴클레오티드 변이체, 예를 들어 bla 변이체가 작제될 수 있다. 세포, 예를 들어 박테리아는 이러한 폴리뉴클레오티드를 이용하여 형질전환되고, 내인성 E. 콜라이 합성효소에 의해 효율적으로 충전될 수 없는 오르소고날 tRNA의 경우, 항생제 내성, 예를 들어 암피실린 내성은 플라스미드 없이 형질전환된 박테리아의 상기 내성과 유사하거나 그 미만이어야 한다. tRNA가 오르소고날이 아닌 경우, 또는 tRNA를 충전할 수 있는 이종 합성효소가 시스템 내에 동시 발현되는 경우, 높은 수준의 항생제 내성, 예를 들어 암피실린 내성이 관찰된다. 플라스미드 없이 형질전환된 세포와 대략 동등한 항생제 농도로 LB 아가 플레이트 상에서 성장할 수 없는 세포, 예를 들어 박테리아가 선택된다

독성 산물(예를 들어, 리보뉴클레아제 바나제)의 경우, 복수개의 잠재적 tRNA의 한 구성원이 내인성 숙주, 예를 들어 에쉐리키아 콜라이 합성효소에 의해 아미노아실화될 때(즉, 그것이 숙주, 예를 들어 에쉐리키아 콜라이 합성효소에 대해 오르소고날이 아님), 셀렉터 코돈이 억제되고, 생산된 독성 폴리뉴클레오티드 산물은 세포 사멸을 초래한다. 오르소고날 tRNA 또는 비작용성 tRNA를 제공하는 세포가 생존한다.

한 실시양태에서, 이어서 원하는 유기체에 대해 오르소고날인 tRNA 풀을 양성 선택에 적용하고, 여기에서 셀렉터 코돈을, 예컨대 약물 내성 유전자, 예컨대 β-락타마제 유전자에 의해 코딩된 양성 선택 마커에 둔다. 양성 선택을 tRNA 풀의 한 구성원을 코딩하거나 그것을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 양성 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 동족 RS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에 대해 수행한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현되고, 세포는 선택제, 예컨대 암피실린의 존재 하에 성장된다. 이어서, 동시 발현된 동족 합성효소에 의해 아미노아실화하고, 이러한 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 아미노산을 삽입하는 능력을 가지는 tRNA를 선택한다. 전형적으로, 이러한 세포는 비작용성 tRNA, 또는 관심의 대상이 되는 합성효소에 의해 효율적으로 인식될 수 없는 tRNA를 제공하는 세포에 비해 증진된 억제 효율을 나타낸다. 비작용성 tRNA, 또는 관심의 대상이 되는 합성효소에 의해 효율적으로 인식될 수 없는 tRNA를 제공하는 세포는 항생제에 대해 민감하다. 그러므로, (i) 내인성 숙주, 예컨대 에쉐리키아 콜라이, 합성효소에 대한 기질이 아니고; (ii) 관심의 대상이 되는 합성효소에 의해 아미노아실화될 수 있으며; (iii) 번역에 있어 작용성인 tRNA이 두 개의 선택, 양자 모두에서 생존한다.

상기 방법들에 있어 선택, 예컨대 양성 선택, 음성 선택, 또는 양성 및 음성 선택 모두의 엄격성은 임의적으로 변화될 수 있다. 예를 들어, 바나제가 극히 독성인 단백질이기 때문에, 음성 선택의 엄격성은 상이한 수의 셀렉터 코돈을 바나제 유전자에 도입하고/하거나 유도성 프로모터를 이용함으로써 조절될 수 있다. 또 다른 일례에서, 선택 또는 선별제(예를 들어, 암피실린)의 농도가 변화된다. 하나의 측면에서, 원하는 활성이 초기 실행(round) 동안 낮을 수 있기 때문에, 엄격성이 변화된다. 따라서, 덜 엄격한 선택 기준이 초기 실행 동안 적용되고, 더 엄격한 기준은 더 나중의 실행 단계에서 적용된다. 특정 실시양태에서, 음성 선택, 양성 선택, 또는 양성 및 음성 선택 모두는 다수회 반복될 수 있다. 다수의 상이한 음성 선택 마커, 양성 선택 마커, 또는 양성 및 음성 선택 마커 모두가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 양성 및 음성 선택 마커가 동일할 수 있다.

다른 유형의 선택/선별을 오르소고날 번역 성분, 예컨대 O-tRNA, O-RS, 및 O-tRNA/O-RS 쌍을 생산하기 위해 본 발명에 이용될 수 있다. 예를 들어, 음성 선택 마커, 양성 선택 마커, 또는 양성 및 음성 선택 마커, 양자 모두가 적당한 반응물의 존재 하에 발광 반응을 촉매하거나 형광화하는 마커를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 마커의 산물은 형광 활성화 세포 분류법(fluorescence-activated cell sorting: FACS) 또는 발광에 의해 검출된다. 임의적으로, 마커는 친화성 기재 선별 마커를 포함한다. 문헌[Francisco, J. A., et al. (1993) Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing afunctional antibody fragment on the external surface . Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90:10444-8]을 참조한다.

재조합 오르소고날 tRNA의 생산을 위한 추가의 방법을 예컨대, 미국 특허 출원 제10/126,931호(발명의 명칭: "Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs") 및 제10/126,127호(발명의 명칭: "In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids") 및 USSN 제10/825,867호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE")에서 찾아볼 수 있다. 또한, 문헌[Forster et al., (2003), Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo PNAS 100(11):6353-6357]; 및 [Feng et al., (2003), Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change, PNAS 100(10):5676-5681]을 참조한다.

본 발명의 tRNA는 화학적 또는 효소적 아미노아실화를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 방법 또는 기법에 의해, 원하는 아미노산으로 아미노아실화될 수 있다.

아미노아실화는 아미노아실 tRNA에 의해, 또는 리보자임을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 효소 분자에 의해 달성될 수 있다. 용어 "리보자임"은 "촉매적 RNA"와 상호 혼용된다. (Cech) 및 동료 연구원들(문헌[Cech, 1987, Science, 236:1532-1539]; [McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226])은 촉매(리보자임)로서 작용할 수 천연 발생 RNA의 존재를 입증하였다. 그러나, 이러한 천연 RNA 촉매는 단지 절단 및 스플라이싱을 위한 리보핵산 기질에 대해 작용하는 것으로 나타났으나, 최근 리보자임의 인위적 진화의 발달은 촉매의 영역을 각종 화학 반응들로 확장시켰다. 연구는 자체의 (2')3'-말단에서의 아미노아실-RNA 결합을 촉매할 수 있는 RNA 분자(문헌[Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647]), 및 한 RNA 분자에서 다른 한 RNA 분자로 아미노산을 이동시킬 수 있는 RNA 분자(문헌[Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444])를 규명하였다.

미국 특허 출원 공보 제2003/0228593호(본원에 참조 인용됨)는 리보자임의 작제 방법, 및 그의, 천연적으로 코딩된 아미노산 및 비천연적으로 코딩된 아미노산을 이용한 tRNA의 아미노아실화에 있어서의 용도를 기재한다. 리보자임을 포함하나 이에 한정되지 않는, tRNA를 아미노아실화할 수 있는 효소적 분자의 기질-고정화 형태는 아미노아실화 산물의 효율적 친화성 정제를 가능하게 할 수 있다. 적당한 기질의 예는 아가로스, 세파로스 및 자기 비드를 포함한다. 아미노아실화를 위한 리보자임의 기질-고정화 형태의 생산 및 용도가 문헌[Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084] 및 미국 특허 출원 공보 제2003/0228593호(본원에 참조 인용됨) 에 기재되어 있다.

화학적 아미노아실화 방법은, 아미노아실화에 있어 합성효소의 사용을 피하기 위한, 헤흐트(Hecht) 및 동료 연구원들에 의해 도입되는 방법들(문헌[Hecht, S. M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545]; [Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254]; [Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517]) 및 슐츠, 샴베를린, 도우어티(Schultz, Chamberlin, Dougherty) 등(문헌[Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621]; [Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722]; [Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182]; [Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.]; [Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013]; [Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537]; [Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740]; [Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991]; [Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439]; [Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169]; [Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34])을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 방법 및 기타 화학적 아미노아실화 방법이 tRNA 분자의 아미노아실화를 위해 사용될 수 있다.

화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 이용하는 생합성 방법을 사용하여 수개의 생체물리적 프로브를 시험관내에서 합성된 단백질에 도입시켰다. 하기 공보 및 본원에 참조 인용된 참조 문헌을 참조한다: 문헌[Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods , Annu . Rev Biochem, 62:483-514(1993)]; 및 [Krieg, U. C., Walter, P., Hohnson, A. E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54 kilodaton polypeptide of the signal recognition particle, Proc . Natl . Acad . Sci , 83(22):86048608(1986)].

앞서, 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 가지는 유전자로 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써, 비천연 아미노산이 시험관내에서 부위 특이적으로 도입될 수 있다는 점이 밝혀졌다. 이러한 접근법을 사용하여, 특정 아미노산에 대해 영양요구성인 균주를 사용하여 다수의 통상의 20종의 아미노산을 근접한 구조적 상동체, 예를 들어 페닐알라닌의 경우에는 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산에 대한 문헌[Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M. C, Schultz, P. G. A general method for site - specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244:182-188 (1989)]; [M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995)]; [Bain, J. D., Glabe, C. G., Dix, T. A., Chamberlin, A. R., Diala, E. S. Biosynthetic site - specific Incorporation of a non - natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989)]; [N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999)]; [Ellman, J. A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P. G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site - specifically into proteins . Methods in EnZ., vol. 202, 301-336 (1992)]; 및 [Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P. G. Site - Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code , A nnu Rev Biophys . Biomol Struct . 24, 435-62 (1995)]을 참조한다.

예를 들어, 종결 코돈 UAG를 인식하고, 비천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 제조하였다. 통상적인 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여, 단백질 유전자의 관심의 대상이 되는 부위에서 종결 코돈 TAG를 도입하였다. 예를 들어, 문헌[Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonuclease in phosphorothioate-based olignoucleotide - directed mutagenesis , Nucleic Acids Res, 16(3):791-802(1988)]을 참조한다. 아실화된 억제자 tRNA 및 돌연변이체 유전자가 시험관내 전사/번역 시스템에서 조합된 경우, 특수 위치에서 그 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 대한 반응으로 비천연 아미노산이 도입되었다. [3H]-Phe를 사용한 실험 및 α-히드록시산을 사용한 실험은 오직 원하는 아미노산이 UAG 코돈에 의해 특정화된 위치에 도입되고, 이러한 아미노산이 단백질 중의 임의의 다른 부위에서는 도입되지 않는다는 점을 입증하였다. 예를 들어, 문헌[Noren, et al., 상기 동일]; [Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432]; 및 [Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P. G. Site -specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200(1992)]을 참조한다.

촉매 RNA의 생성 방법은 무작위화된 리보자임 서열의 분리된 풀을 생성하고, 풀에 지정 진화를 수행하며, 바람직한 아미노아실화 활성을 위한 풀을 선별하며, 원하는 아미노아실화 활성을 나타내는 리보자임의 서열을 선택하는 것을 포함할 수 있다.

리보자임은 아실화 활성을 촉진하는 모티프 및/또는 영역, 예컨대 GGU 모티프 및 U-풍부 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, U-풍부 영역은 아미노산 기질의 인식을 촉진할 수 있고, GGU-모티프는 tRNA의 3' 말단과 염기쌍을 형성할 수 있음이 보고되었다. 이와 함께, GGU와 모티프, 및 U-풍부 영역은 아미노산 및 tRNA를 함께 동시 인식할 수 있도록 촉진하고, 이로써 tRNA의 3' 말단의 아미노아실화를 촉진한다.

리보자임은 tRNA^Asn CCCG와 접합된 부분 무작위화 r24mini를 이용한 시험관내 선택에 의해, 그 후 활성 클론에서 나타나는 일치 서열의 계통적 조작에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법에 의해 수득되는 예시적 리보자임을 "Fx3 리보자임"으로 명명하고, 이는 미국 특허출원 공보 제2003/0228593호(그 내용이 본원에서 참조 인용됨)에 기재되어 있으며, 동족 비천연 아미노산으로 충전된 각종 아미노아실-tRNA의 합성을 위한 다방면의 촉매로서 작용한다.

기질 상에서의 고정화를 사용하여, 아미노아실화된 tRNA의 효율적 친화성 정제를 가능하게 할 수 있다. 적합한 기질의 예는 아가로스, 세파로스 및 자기 비드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 리보자임은 RNA의 화학적 구조를 이용함으로써 수지 상에 고정될 수 있으며, 예컨대 RNA의 리보스 상의 3'-시스-디올은 과요오드산염으로 산화되어 상응하는 디알데히드를 생성시켜, 수지 상에서의 RNA의 고정을 촉진한다. 환원 아민화가 수지와 리보자임 간의 상호작용으로 비가역적 연결기를 만드는 저비용의 히드라지드 수지를 포함한 각종 유형의 수지들이 사용될 수 있다. 아미노아실-tRNA의 합성은 상기 작동(on)-칼럼 아미노아실화 기법에 의해 상당히 촉진될 수 있다. 문헌[Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4]에 칼럼 기재 아미노아실화 시스템이 기재되어 있다.

아미노아실화된 tRNA의 단리는 각종 방식들로 달성될 수 있다. 하나의 적합한 방법은 10 mM EDTA를 가지는 아세트산 나트륨 용액과 같은 완충액, 50 mM N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판술폰산) 함유 완충액, 12.5 mM KCl(pH 7.0), 10 mM EDTA, 또는 단순히 EDTA 완충수(pH 7.0)를 가지는 칼럼으로부터 아미노아실화된 tRNA를 용리하는 것이다.

본 발명의 아미노아실화된 tRNA를 번역 반응에 첨가하여, tRNA가 번역 반응에 의해 생산된 폴리펩티드에서 선택 위치에 아미노아실화하는데 이용되는 아미노산을 도입할 수 있다. 본 발명의 아미노아실화된 tRNA가 사용될 수 있는 번역 시스템의 일례로는 세포 용해물을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 세포 용해물은 유입(input) mRNA로부터 폴리펩티드를 시험관내 번역하는데 필요한 반응 성분들을 제공한다. 그러한 반응 성분의 예는 리보솜형 단백질, rRNA, 아미노산, tRNA, GTP, ATP, 번역 개시 및 신장 인자, 및 번역 관련 추가의 인자들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가로, 번역 시스템은 배치 번역 또는 구획화 번역일 수 있다. 배치 번역 시스템은 단일 구획에서 반응 성분들을 조합하나, 구획화 번역 시스템은 번역 효율을 억제할 수 있는 반응 산물로부터 번역 반응 성분을 분리한다. 그러한 번역 시스템은 상업적으로 입수가능하다.

또한, 커플링된 전사/번역 시스템이 사용될 수 있다. 커플링된 전사/번역 시스템은 유입 DNA의 상응 mRNA로의 양 번역을 허용하고, 상기 mRNA는 이후 반응 성분에 의해 번역되게 된다. 상업적으로 입수가능한 커플링된 전사/번역의 예는 급속 번역 시스템(RTS, 로쉐 인코포레이티드(Roche Inc.))이다. 그 시스템은 리보솜 및 번역 인자와 같은 번역 성분을 제공하기 위한 E. 콜라이 용해물을 함유하는 혼합물을 포함한다. 추가로, RNA 중합효소는 번역시 사용하기 위한 mRNA 주형으로의 유입 DNA의 전사를 위해 포함된다. RTS는 공급/배출 구획과 전사/번역 구획을 포함한 반응 구획들 사이에 삽입된 막에 의해 반응 성분을 구획화하는 것을 이용할 수 있다.

tRNA의 아미노아실화는 트랜스퍼라제, 중합효소, 촉매 항체, 다작용 단백질 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 기타 제제에 의해 수행될 수 있다.

오르소고날 아미노아실 - tRNA 합성효소(O- RS )

O-RS는 시험관내 또는 생체내에서, 선택된 아미노산으로 본 발명의 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 본 발명의 O-RS는, O-RS를 포함하는 폴리펩티드 및/또는 O-RS 또는 이의 일부분을 코딩하는 폴리펩티드에 의해 번역 시스템(예를 들어, 시험관내 번역 성분, 또는 세포)에 제공될 수 있다. O-RS, 또는 이의 일부분은 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 보존적 변이에 의해 코딩된다. 본 발명의 OtRNA는 본원에 개시된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 상이한 O-RS 분자들에 의해 아미노아실화될 수 있다.

오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS), 예컨대 O-tRNA, 예컨대 O-tRNA와 함께 사용하기 위한 O-RS를 동정하는 방법도 또한 본 발명의 한 특성이다. 예를 들어, 방법은 제1 종의 세포 집단을 양성 선택에 적용하는 것을 포함하고, 여기에서 세포는 각각 1) 복수개의 아미노아실-tRNA 합성효소들(RS)의 한 구성원(여기에서, 복수개의 RS는 돌연변이체 RS, 제1 종 이외의 종으로부터 유래된 RS, 또는 돌연변이체 RS 및 제1 종 이외의 종으로부터 유래된 RS, 양자 모두; 2) 제2 종으로부터의 오르소고날 tRNA(O-tRNA); 및 3) 양성 선택 마커를 코딩하고, 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 복수개의 RS의 구성원이 결핍되거나 그 양이 감소된 세포에 비해, 증진된 억제 효율을 나타내는 세포를 선택하거나 선별한다. 억제 효율이 증진된 세포는 O-tRNA를 아미노아실화하는 활성 RS를 포함한다. 제1 종으로부터의 제1 세트의 tRNA의 활성 RS에 의한 (시험관내 또는 생체내) 아미노아실화 수준을, 제2 종으로부터의 제2 세트의 tRNA의 활성 RS에 의한 (시험관내 또는 생체내) 아미노아실화 수준과 비교한다. 아미노아실화 수준은 검출가능한 물질(예를 들어, 표지된 아미노산 또는 비천연 아미노산)에 의해 결정될 수 있다. 제1 세트의 tRNA에 비해 제2 세트의 tRNA를 더욱 효율적으로 아미노아실화하는 활성 RS를 선택하고, 이로써 O-tRNA와 함께 사용하기 위한 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소가 제공된다. O-RS, 예컨대 상기 방법에 의해 동정되는 O-RS도 또한 본 발명의 한 특성이다.

다수의 검정법들 중 임의의 검정을 이용하여, 아미노아실화를 결정할 수 있다. 이러한 검정법은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 아미노아실화 검정법은 예를 들어, 문헌 [Hoben, P., and Soil, D. (1985) Methods Enzymol . 113:55-59] 및 미국 특허 출원 공보 제2003/0228593호에 기재되어 있다. 아미노아실화는 또한 오르소고날 번역 성분과 함께 리포터를 사용하고, 단백질을 코딩하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 세포내 리포터를 검출함으로써 결정될 수 있다. 또한, 미국 특허 출원 제10/126,927호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS") 및 USSN 제10/825,867호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE")를 참조한다.

동정된 O-RS를 추가 조작하여, 통상의 20종의 아미노산 중 임의의 것이 아닌, 오직 원하는 비천연 아미노산만을 O-tRNA에 충전하는 합성효소의 기질 특이성을 변경시킬 수 있다. 비천연 아미노산에 대한 기질 특이성을 가지는 오르소고날 아미노아실 tRNA를 발생시키는 방법은, 합성효소를 예컨대, 합성효소내 활성 부위, 합성효소내 편집 기작 부위, 합성효소의 상이한 도메인의 조합에 의한 상이한 부위 등에서 돌연변이화하고, 선택 공정을 적용하는 것을 포함한다. 양성 선택 후에 음성 선택이 조합되는 것에 기초하는 기법이 사용된다. 양성 선택에서, 양성 마커의 비필수 위치(들)에 도입된 셀렉터 코돈의 양성 억제는 세포가 양성 선택 압력 하에 생존하도록 한다. 천연 및 비천연 아미노산의 양자 모두의 존재 하에, 생존자는 그에 따라 천연 또는 비천연 아미노산으로 오르소고날 억제자 tRNA를 충전하는 활성 합성효소를 코딩한다. 음성 선택에서, 음성 마커의 비필수 위치(들)에 도입된 셀렉터 코돈의 억제는 천연 아미노산 특이성을 가지는 합성효소를 제거한다. 음성 및 양성 선택의 생존자는 비천연 아미노산만으로 오르소고날 억제자 tRNA를 아미노아실화(충전)하는 합성효소를 코딩한다. 이어서, 이러한 합성효소는 추가적 돌연변이유발, 예컨대 DNA 셔플링 또는 기타 재귀적 돌연변이유발에 적용될 수 있다.

돌연변이체 O-RS의 라이브러리를 당업계에 공지된 각종 돌연변이유발을 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 O-RS는 부위 특이적 돌연변이, 무작위 점 돌연변이, 상동 재조합, DNA 셔플링 또는 기타 재귀적 돌연변이유발, 키메라 구성, 또는 이의 임의의 조합에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 RS의 라이브러리는 2개 이상의 다른, 예컨대 보다 작거나, 보다 덜 각종 "서브-라이브러리"로부터 생산될 수 있다. RS의 키메라 라이브러리 또한 본 발명에 포함된다. 각종 유기체(예를 들어, 진정세균 또는 고세균과 같은 미생물)로부터의 tRNA 합성효소의 라이브러리, 예컨대 천연 다양성을 가지는 라이브러리(예를 들어, 미국 특허 제6,238,884호(Short et al.); 미국 특허 제5,756,316호(Schallenberger et al.); 미국 특허 제5,783,431호(Petersen et al.); 미국 특허 제5,824,485호(Thompson et al.); 미국 특허 제5,958,672호(Short et al.) 참조)가 임의적으로 작제되고, 오르소고날 쌍에 대해 선별됨을 주목하도록 한다.

일단 합성효소를 양성 및 음성 선택/선별 기법에 적용하면, 이에 이러한 합성효소를 추가 돌연변이유발에 적용할 수 있다. 예를 들어, O-RS를 코딩하는 핵산을 단리할 수 있고; 돌연변이화된 O-RS를 (예를 들어, 무작위 돌연변이유발, 부위 특이적 돌연변이유발, 재조합 또는 이의 임의의 조합에 의해) 코딩하는 한 세트의 폴리뉴클레오티드를 핵산으로부터 생성될 수 있고; 이러한 개별 단계 또는 이러한 단계들의 조합을, 비천연 아미노산으로 OtRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 돌연변이화된 O-RS가 수득될 때까지 반복할 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에서, 단계들을 다수회, 예를 들어 2회 이상 수행한다.

선택/선별 엄격성의 추가적 수준을 또한 본 발명의 O-tRNA, O-RS, 또는 이의 쌍의 생산 방법에 이용할 수 있다. 선택 또는 선별 엄격성은 O-RS의 생산 방법의 한 단계 또는 양 단계 모두에서 변화될 수 있다. 이는 예컨대 선택제/선별제의 사용량 등의 변화를 포함할 수 있다. 추가의 실행 회수의 양성 및/또는 음성 선택을 또한 수행할 수 있다. 선택 또는 선별은 또한 예컨대, 아미노산 투과도의 변화, 번역 효율의 변화, 번역 신뢰도의 변화 등을 포함하는 하나 이상의 양성 또는 음성 선택 또는 선별을 포함할 수 있다. 전형적으로, 하나 이상의 변화는 오르소고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 사용하여 단백질을 생산하는 유기체내 하나 이상의 유전자에서의 돌연변이화에 기초한다.

예를 들어, O-RS, O-tRNA 및 O-tRNA/O-RS 쌍에 대해 본 발명에서 다른 유형의 선택을 또한 이용할 수 있다. 양성 선택 마커는 성장을 위한 영양 보충물을 제공하는 산물을 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 분자들 중 임의의 것일 수 있고, 선택을 영양적 보충물이 결여된 매질에서 수행할 수 있다. 양성 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 예는 예컨대, 세포의 아미노산 보조영양의 보충에 기초한 리포터 유전자, his3 유전자(예를 들어, 여기에서 his3 유전자는 3-아미노트리아졸(3-AT)을 제공함으로써 검출되는 이미다졸 인산염 데히드라타제를 코딩한다), ura3 유전자, leu2 유전자, lys2 유전자, lacZ 유전자, adh 유전자 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌[G. M. Kishore, & D. M. Shah (1988), Amino acid biosynthesis inhibitors as herbicides, Annual Review of Biochemistry 57:627-663]를 참조한다. 한 실시양태에서, lacZ 생산은 오르소-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(ONPG) 가수분해에 의해 검출된다. 예를 들어, 문헌[I. G. Serebriiskii, & E. A. Golemis, (2000), Uses of lacZ to study gene function: evaluation of beta-galactosidase assays employed in yeast two-hybrid system, Analytical Biochemistry 285:1-15]를 참조한다. 추가의 양성 선택 마커는, 예컨대 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), YFP, EGFP, RFP, 항생제 내성 유전자의 산물(예를 들어, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)), 전사 조절자 단백질(예를 들어, GAL4) 등을 포함한다. 임의적으로, 양성 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 셀렉터 코돈을 포함한다.

양성 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 반응 요소에 작용적으로 연결될 수 있다. 반응 요소로부터의 전사를 조절하는 전사 조절자 단백질을 코딩하고, 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 하나의 추가적인 폴리뉴클레오티드 또한 존재할 수 있다. 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 O-tRNA에 의한 전사 조절자 단백질로의 비천연 아미노산의 도입은 양성 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 리포터 유전자)의 전사를 초래한다. 임의적으로, 셀렉터 코돈은 전사 조절자 단백질의 DNA 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부에, 또는 이의 실질적 부근에 위치한다.

음성 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 반응 요소에 작용적으로 연결될 수 있고, 그 반응 요소로부터의 전사는 전사 조절자 단백질에 의해 매개된다. 예를 들어, 문헌[A. J. DeMaggio, et al., (2000), The yeast split- hybrid system, Method Enzymol. 328:128-137]; [H. M. Shih, et al., (1996), A positive genetic selection for disrupting protein-protein interactions: identification of CREB mutations that prevent association with the coactivator CBP, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:13896-13901]; [M. Vidal, et al., (1996), Genetic characterization of a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid system, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10321-10326]; 및 [M. Vidal, et al., (1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10315-10320)])를 참조한다. 천연 아미노산으로 아미노아실화된 O-tRNA에 의한 전사 조절자 단백질 내로의 천연 아미노산의 도입은 음성 선택 마커의 전사를 초래한다. 임의적으로, 음성 선택 마커는 셀렉터 코돈을 포함한다. 본 발명의 양성 선택 마커 및/또는 음성 선택 마커는 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있고, 이의 각각 또는 양자 모두는 2개 이상의 상이한 셀렉터 코돈 또는 2개 이상의 동일한 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다.

전사 조절자 단백질은 핵산 서열(예를 들어, 반응 요소)에 (직접적으로 또는 간접적으로) 결합하고, 반응 요소에 작용적으로 연결된 서열의 전사를 조절하는 분자이다. 전사 조절자 단백질은 전사 활성자 단백질(예를 들어, GAL4, 핵 호르몬 수용체, API, CREB, LEF/tcf 부류 구성원, SMAD, VP16, SP1 등), 전사 억제자 단백질(예를 들어, 핵 호르몬 수용체, Groucho/tle 부류, 인그레일드(Engrailed) 부류 등), 또는 환경에 따라 양 활성 모두를 가질 수 있는 단백질(예를 들어, LEF/tcf, 호모박스 단백질 등)일 수 있다. 반응 요소는 전형적으로 전사 조절자 단백질에 의해 인식되는 핵산 서열, 또는 전사 조절자 단백질과 함께 작용하는 추가의 제제이다.

전사 조절자 단백질의 또 다른 예는 전사 활성자 단백질인 GAL4이다. 예를 들어, 문헌[A. Laughon, et al. (1984), Identification of two proteins encoded by the Saccharomyces cerevisiae GAL4 gene, Molecular & Cellular Biology 4:268-275]; [A. Laughon, & R. F. Gesteland (1984), Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae GAL4 gene, Molecular & Cellular Biology 4:260-267]; [L. Keegan, et al. (1986), Separation of DNA binding from the transcription-activating function of a eukaryotic regulatory protein, Science 231:699-704]; 및 [M. Ptashne (1988), How eukaryotic transcriptional activators work, Nature 335:683689]를 참조한다. 이러한 881 아미노산 단백질의 N-말단 147개의 아미노산은 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 DNA 결합 도메인(DBD: DNA binding domain)을 형성한다. 예를 들어, 문헌[M. Carey, et al. (1989), An amino-terminal fraction of GAL4 binds DNA as a dimer, J. Mol. Biol. 209:423-432]; 및 [E. Giniger, et al. (1985), Specific DNA binding of GAL4, a positive regulatory protein of yeast, Cell 40:767-774]를 참조한다. DBD는 간섭 단백질 서열에 의해, DNA에 결합될 때 전사를 활성화할 수 있는 C-말단의 113개의 아미노산 활성화 도메인(AD: activation domain)에 연결된다. 예를 들어, 문헌[J. Ma, & M. Ptashne (1987), Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptional activating segments, Cell 48:847-853]; 및 [J. Ma, & M. Ptashne (1987), The carboxy-terminal 30 amino acids of GAL4 are recognized by GAL80, Cell 50:137-142]를 참조한다. 예를 들어, GAL4의 N-말단 DBD 및 이의 C-말단 AD 모두를 함유하는 단일 폴리펩티드의 N-말단 DBD 측으로 앰버 코돈을 둠으로써, O-tRNA/O-RS 쌍에 의한 앰버 억제는 GAL4에 의한 전사 활성화에 연결될 수 있다. GAL4 활성화 리포터 유전자를 사용하여, 그 유전자로 양성 및 음성 선택 모두를 수행할 수 있다.

음성 선택을 위해 사용되는 매질은 음성 선택 마커에 의해 검출가능한 물질로 전환되는 선택 또는 선별제를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에서, 검출가능한 물질은 독성 물질이다. 음성 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예컨대, ura3 유전자일 수 있다. 예를 들어, URA3 리포터를 GAL4 DNA 결합 부위를 함유하는 프로모터의 조절 하에 둘 수 있다. 음성 선택 마커를, 예컨대 셀렉터 코돈으로 GAL4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 번역에 의해 생산할 때, GAL4는 URA3의 전사를 활성화한다. 음성 선택은, ura3 유전자의 유전자 산물에 의해 검출가능한 물질(예를 들어, 세포를 사멸시키는 독성 물질)로 전환되는 5-플루오로오로트산(5-FOA: 5-fluoroorotic acid)을 포함하는 매질상에서 달성된다. 예를 들어, 문헌[J. D. Boeke, et al. (1984), Boeke, et al. (1984), A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoroorotic acid resistance, Molecular & General Genetics 197:345-346]; [M. Vidal, et al. (1996), Genetic characterization of a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid system., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10321-10326]; 및 [M. Vidal, et al. (1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA protein interactions., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10315-10320]을 참조한다.

양성 선택 마커에서와 같이, 음성 선택 마커도 또한 각종 분자들 중 임의의 것일 수 있다. 양성 선택 마커 및/또는 음성 선택 마커는 적합한 반응물의 존재 하에 발광 반응을 촉매하거나 형광화하는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 음성 선택 마커는 예컨대, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), YFP, EGFP, RFP, 항생제 내성 유전자의 산물(예를 들어, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)), lacZ 유전자의 산물, 전사 조절자 단백질 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 양성 선택 마커 및/또는 음성 선택 마커는 형광 활성화 세포 분류법(FACS) 또는 발광에 의해 검출될 수 있다. 양성 선택 마커 및/또는 음성 선택 마커는 친화성 기재 선별 마커를 포함할 수 있다. 동일한 폴리뉴클레오티드는 양성 선택 마커 및 음성 선택 마커 모두를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 양성 선택 단계, 음성 선택 단계, 또는 양성 및 음성 선택 단계 모두는 리포터의 사용을 포함할 수 있고, 여기에서 리포터는 형광 활성화 세포 분류법(FACS)에 의해 검출된다. 예를 들어, 양성 선택은 먼저 양성 선택 마커, 예를 들어 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자(여기에서, CAT 유전자는 셀렉터 코돈, 예를 들어 앰버 종결 코돈을 CAT 유전자 내에 포함함)를 이용하여 수행된 후, 그에 이어서 음성 마커, 예를 들어 T7 RNA 중합효소 유전자내의 위치에서 셀렉터 코돈(들), 예를 들어 2개 이상의 셀렉터 코돈을 억제할 수 없음에 기초하는 음성 선택 선별을 수행한다. 양성 선택 마커 및 음성 선택 마커는 동일한 벡터, 예를 들어 플라스미드에서 발견될 수 있다. 음성 마커의 발현은 리포터, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 유도한다. 선택 및 선별 엄격성이 변화될 수 있고, 예를 들어 리포터의 형광화에 필요한 광 강도가 변화될 수 있다. 양성 선택은 FACS에 의해 선별되는, 양성 선택 마커로서의 리포터를 이용하여 수행될 수 있고, 그에 이어서 음성 마커, 예를 들어 바나제 유전자 내의 위치에서 셀렉터 코돈(들), 예를 들어 2개 이상의 셀렉터 코돈을 억제할 수 없음에 기초하는 음성 선택 선별을 수행한다.

임의적으로, 리포터는 세포 표면, 예를 들어 파지 디스플레이 등에서 디스플레이된다. 세포-표면 디스플레이, 예를 들어 OmpA-기재 세포-표면 디스플레이 시스템은 에쉐리키아 콜라이 세포의 표면 상에서 특별한 에피토프, 예를 들어 외막 포린(porin) OmpA에 융합된 소아마비 바이러스 C3 펩티드의 발현에 의존한다. 에피토프는 단백질 메세지 내 셀렉터 코돈이 번역 중에 억제될 때에만 세포 표면 상에 디스플레이된다. 이어서, 디스플레이된 펩티드는 라이브러리 내 돌연변이 아미노아실-tRNA 합성효소 중 하나에 의해 인식되는 아미노산을 함유하고, 상응하는 합성효소 유전자를 함유하는 세포는 특정 비천연 아미노산을 함유하는 펩티드에 대한 항체를 이용하여 단리될 수 있다. OmpA-기재 세포-표면 디스플레이 시스템은 파지 디스플레이에 대안으로서 (Georgiou) 등에 의해 개발되고 최적화되었다. 문헌[Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L. & Georgoiu, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 90:10444-8 (1993)]을 참조한다.

본 발명의 다른 실시양태는 시험관내 선택 단계들 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함한다. 이어서, 선택된 성분, 예를 들어 합성효소 및/또는 tRNA는 생체내 비천연 아미노산의 생체내 도입에 사용하기 위해 세포에 도입될 수 있다.

O-RS의 생산 및 합성효소의 기질 특이성 변형에 대한 추가의 상세 내용은 미국 특허 출원 제10/126,931호(발명의 명칭: "Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs") 및 USSN 제10/825,867호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE")(본원에 각기 참조 인용됨)에서 찾아볼 수 있다. O-RS의 생산에 대한 추가의 상세 내용은 문헌[Hamano-Takaku et al., (2000) A mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine, Journal of Biological Chemistry, 275(51):40324-40328]; [Kiga et al. (2002), An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translation and its application in a wheat germ cell-free system, PNAS 99(15):9715-9723]; 및 [Francklyn et al., (2002), Aminoacyl-tRNA synthetases: Versatile players in the changing theater of translation; RNA, 8:1363-1372](본원에 각기 참조 인용됨))에서 찾아볼 수 있다.

공급원 및 숙주 유기체

본 발명의 번역 성분은 전형적으로 비진핵생물 유기체로부터 유래된다. 예를 들어, 오르소고날 O-tRNA는 비진핵생물 유기체, 예를 들어 고세균, 예컨대 메타노코커스 잔나쉬이, 메타노박테리움 써모아우트로피쿰, 할로박테리움, 예컨대 할로페락스 볼카니 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아르카에오글로부스 풀기두스, 파이로코커스 푸리오서스, 파이로코커스 호리코쉬이, 아에우로피룸 페르닉스 등, 또는 진정세균, 예컨대 에쉐리키아 콜라이, 써무스 써모필러스, 바실러스 스테아로써모필러스 등으로부터 유래되는 반면, 오르소고날 O-RS는 비진핵생물 유기체, 예를 들어 메타노코커스 잔나쉬이, 메타노박테리움 써모아우트로피쿰, 할로박테리움, 예컨대 할로페락스 볼카니 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아르카에오글로부스 풀기두스, 파이로코커스 푸리오서스, 파이로코커스 호리코쉬이, 아에우로피룸 페르닉스 등, 또는 진정세균, 예컨대 에쉐리키아 콜라이, 써무스 써모필러스, 바실러스 스테아로써모필러스 등으로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 식물, 해조류, 원생생물, 진균, 효모, 동물(예를 들어, 포유동물, 곤충류, 절지류 등) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 진핵생물 공급원을 이용할 수 있다.

O-tRNA/O-RS 쌍의 개별 성분은 동일한 유기체 또는 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, OtRNA/O-RS 쌍은 동일한 유기체로부터 유래된다. 대안적으로, O-tRNA/O-RS 쌍의 O-tRNA 및 O-RS는 상이한 유기체로부터 유래된다. 예를 들어, O-tRNA는 예를 들어, 할로박테리움 종 NRC-1로부터 유래되고, O-RS는 예를 들어, 메타노박테리움 써모아우트로피쿰으로부터 유래된다.

O-tRNA, O-RS 또는 O-tRNA/O-RS 쌍은 생체내 또는 시험관내 선택 또는 선별되고/되거나, 세포, 예컨대 비진핵생물 세포(예를 들어, E. 콜라이 세포), 또는 진핵생물 세포에서 사용되어, 선택된 아미노산(예를 들어, 비천연 아미노산)을 가지는 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 비진핵생물 세포는 각종 공급원, 예컨대 메타노코커스 잔나쉬이, 메타노박테리움 써모아우트로피쿰, 할로박테리움, 예컨대 할로페락스 볼카니 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아르카에오글로부스 풀기두스, 파이로코커스 푸리오서스, 파이로코커스 호리코쉬이, 아에우로피룸 페르닉스를 포함하나 이에 한정되지 않는 고세균 계통 도메인, 또는 에쉐리키아 콜라이, 써무스 써모필러스, 바실러스 스테아로써모필러스, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 푸티다 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 진정세균 계통 도메인으로부터 유래될 수 있다. 진핵생물 세포는 식물류(예를 들어, 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물과 같은 복합 식물), 해조류, 원생생물, 진균, 효모(사카로마이세스 세레비지아에를 포함하나 이에 한정되지 않음), 동물류(포유동물, 곤충류, 절지류 등을 포함하나 이에 한정되지 않음) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 번역 성분을 가지는 세포의 조성물도 또한 본 발명의 한 특성이다. 또한, 또 다른 종에 사용하기 위한 어느 한 종에서의 O-tRNA 및/또는 O-RS를 선별하는 것에 대해, USSN 제10/825,867호(발명의 명칭: "Expanding the Eukaryotic Genetic Code")를 참조한다.

숙주 세포내 선택된 아미노산을 가지는 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 발현하기 위해, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 전사를 지시하는 강한 프로모터, 전사/번역 종결부위, 및 단백질을 코딩하는 핵산의 경우, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위를 함유하는 발현 벡터에 서브클로닝할 수 있다. 적합한 박테리아 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 문헌[Sambrook et al. and Ausubel et al.]에 기재되어 있다.

관심의 대상이 되는 폴리펩티드 발현용 박테리아 발현 시스템은 E. 콜라이, 바실러스 종, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 푸티다 및 살모넬라를 포함하나 이에 한정되지 않는 것들에서 입수가능하다(문헌[Palva et al., Gene 22:229-235(1983)]; [Mosbach et al., Nature 302:543-545(1983)]을 참조한다). 이러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포용 진핵생물 발현 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 또한 상업적으로도 입수가능하다.

본 발명의 tRNA 및/또는 RS, 및/또는 관심의 대상이 되는 폴리펩티드는 예를 들어, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 박테리아를 비롯한 임의의 수의 적합한 발현 시스템에서 이용되고/되거나 발현될 수 있다. 이하 예시적인 발현 시스템의 설명이 제공된다.

효모 본원에 사용된 용어 "효모"에는 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 임의의 각종 효모들이 포함된다. 이러한 효모들은 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모, 및 불완전 진균(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes)) 군에 속하는 효모를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 자낭포자형성 효모는 2개의 부류, 스퍼모프토라세아에(Spermophthoraceae) 및 사카로마이세타세아에(Saccharornycetaceae)로 나뉜다. 후자는 4개의 아과, 쉬조사카로마이코이데에(Schizosaccharomycoideae)(예를 들어, 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 속), 나드소니오이데이에(Nadsonioideae ), 리포마이코이데에(Lipomycoideae) 및 사카로마이코이데에(Saccharomycoideae)(예를 들어, 피치아(Pichia) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속)를 포함한다. 담자포자 효모는 류코스포리디움 (Leucosporidium) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 스포리디오볼루스 (Sporidiobolus) 속, 필로바시디움(Filobasidium) 속 및 필로바시디엘라 (Filobasidiella) 속을 포함한다. 불완전 진균(블라스토마이세테스) 군에 속하는 효모는 2개의 부류, 스포로볼로마이세타세아에(Sporobolomycetaceae)(예를 들어, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces) 속 및 불레라(Bullera) 속) 및 크립토코카세아에(Cryptococcaceae)(예를 들어, 칸디다(Candida) 속)로 나뉜다.

본 발명에 사용하기에 특히 유익한 것으로는 P. 파스토리스(P. pastoris), P. 길러리몬디(P. guillerimondii), S. 세레비시아에(S. cerevisiae), S. 칼스버겐시스(S. carlsbergensis), S. 디아스타티쿠스(S. diastaticus), S. 더글라시(S. douglasii), S. 클루이베리(S. kluyveri), S. 노르벤시스(S. norbensis), S. 오비포르미스(S. oviformis), K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis), C. 알비칸스(C. albicans), C. 말토사(C. maltosa) 및 H. 폴리모르파(H. polymorpha)를 포함하나 이에 한정되지 않는 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 사카로마이세스 속, 쉬조사카로마이세스 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 토룰롭시스 (Torulopsis) 속 및 칸디다 속에 속하는 종이 있다. 효모는 일반적으로 캘리포니아 대학(University of California)(미국 캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부(Department of Biophysics and Medical Physics) 이스트 제네틱 스톡 센터(Yeast Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션("ATCC": American Type Culture Collection)(미국 버지니아주 만나사스 소재)을 포함하나 이에 한정되지 않은 각종 공급원으로부터 입수가능하다.

용어 "효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수혜자로 사용될 수 있거나 사용된 효모를 포함한다. 이러한 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA를 수혜받은 원래의 효모 숙주 세포의 후손을 포함한다. 단일 모세포의 후손이 우발적 돌연변이화 또는 의도적 돌연변이화로 인해 원래의 모체와 형상, 또는 게놈 또는 총 DNA 보체가 완전히 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 관련 성질, 예를 들어 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 존재에 의해 특성화되는 모체와 충분히 유사한 모세포의 후손은 이러한 정의에 의해 의도되는 후손에 포함된다.

염색체외 레플리콘 또는 도입 벡터를 비롯한 발현 벡터 및 형질전환 벡터가 다수의 효모 숙주로의 형질전환을 위해 개발되었다. 예를 들어, S. 세레비시아에(문헌[Sikorski et al., GENETICS (1998) 112:19]; [Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153:163]; [Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929]) 참조); C. 알비칸스(문헌[Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142] 참조); C. 말토사(문헌[Kunze et al., J. BASICMICROBIOL. (1985) 25:141] 참조); H. 폴리모르파((문헌[Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459]; [Roggenkamp et al., MOL. GEN. GENET. (1986) 202:302])을 참조한다); K. 프라길리스(문헌[Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158:1165] 참조): K. 락티스(문헌[DeLouvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154:737]; [Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY(NY)(1990) 8:135] 참조); P. 길러리몬디(문헌[Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141] 참조); P. 파스토리스(미국 특허 제5,324,639호, 제4,929,555호 및 제4,837,148호; 문헌[Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376] 참조); 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)(문헌[Beach et al., NATURE (1981) 300:706] 참조); 및 Y. 리폴리티카(Y. lipolytica); A. 니둘란스(A. nidulans)(문헌[Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:28489]; [Tilburn et al., GENE (1983) 26:205-221]; 및 [Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74] 참조); A. 나이거(A. niger)(문헌[Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479] 참조); T. 레시아(T. reesia)(EP 0 244 234); 및 섬사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(WO 91/00357)(상기 각각의 문헌은 본원에 참조 인용된다)에 대한 발현 벡터가 개발되었다.

효모 벡터에 대한 조절 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 알코올 데히드로게나제(ADH)(EP 0 284 044); 에놀라제; 글루코키나제; 글루코스-6-포스페이트 이소머라제; 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAP 또는 GAPDH); 헥소키나제; 포스포프룩토키나제(문헌[Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255:2073]); 3-포스포글리세레이트 뮤타제; 및 피루베이트 키나제(PyK)(EP 0 329 203)와 같은 유전자로부터의 프로모터 영역을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 산 포스파타제를 코딩하는 효모 PH05 유전자도 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다(문헌[Myanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1]). 효모 숙주에 사용될 수 있는 다른 적합한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나제; 및 다른 해당 효소, 예를 들어 피루베이트 데카르복실라제, 트리오스인산염 이소머라제, 및 포스포글루코스 이소머라제(문헌[Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900]; [Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1968) 7:149])에 대한 프로모터를 포함할 수 있다. 전사가 성장 조건에 의해 조절되는 추가적인 이점을 가지는 유도성 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2; 이소시토크롬 C; 산 포스파타제; 메탈로티오네인; 글리세르알데히드-3-인산염 데히드로게나제; 질소 기작과 관련된 분해성 효소 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 0 073 657에 추가로 기재되어 있다.

효모 인핸서도 또한 효모 프로모터와 함께 사용할 수 있다. 추가로, 합성 프로모터도 또한 효모 프로모터로서 기능할 수 있다. 예를 들어, 효모 프로모터의 상류 활성화 서열(UAS: upstream activating sequence)이 또 다른 효모 프로모터의 전사 활성화 영역과 결합되어, 합성 혼성 프로모터를 생산할 수 있다. 이러한 혼성 프로모터의 예는 GAP 전사 활성화 영역에 결합된 ADH 조절 서열을 포함한다. 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제4,880,734호 및 제4,876,197호를 참조한다. 혼성 프로모터의 다른 예는 해당 효소 유전자의 전사 활성화 영역, 예를 들어 GAP 또는 PyK와 조합된 ADH2, GAL4, GAL10 또는 PH05 유전자로 된 조절 서열로 구성된 프로모터를 포함한다. EP 0 164 556을 참조한다. 또한, 효모 프로모터는 효모 RNA 중합효소에 결합하고 전사를 개시할 수 있는 능력을 가지는 비효모 기원의 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다.

효모 발현 벡터의 일부를 포함할 수 있는 다른 조절 요소는 예를 들어, GAPDH 또는 에놀라제 유전자로부터의 종결부위를 포함한다(문헌[Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385]). 또한, 2 μ 플라스미드 기원으로부터의 복제 기점은 효모에 적합하다. 효모에 사용하기에 적합한 선택 유전자로는 효모 플라스미드에 존재하는 trp1 유전자가 있다. 문헌[Tschemper et al., GENE (1980) 10:157; Kingsman et al., GENE (1979) 7:141]을 참조한다. 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주에 선별 마커를 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 가지는 공지된 플라스미드에 의해 보충된다.

외인성 DNA를 효모 숙주에 도입시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 전형적으로 구상 원시 세포(spheroplast)의 형질전환 또는 알칼리 양이온으로 처리된 본래의 효모 숙주 세포의 형질전환을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 효모의 형질전환은 문헌[Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829], 및 [Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러나, 예를 들어 핵 주사, 전기천공법 또는 원형질체 융합에 의해 DNA를 세포에 도입시키는 다른 방법도 또한 일반적으로 문헌[SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 이어서, 효모 숙주 세포를 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 배양할 수 있다.

효모 숙주 세포에서 이종 단백질을 발현시키는 다른 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 미국 특허 공보 20020055169, 미국 특허 제6,361,969호, 제6,312,923호, 제6,183,985호, 제6,083,723호, 제6,017,731호, 제5,674,706호, 제5,629,203호, 제5,602,034호 및 제5,089,398호; 재심사된 미국 특허 제RE37,343호 및 제RE35,749호; PCT 공개 특허 출원 WO 99/078621, WO 98/37208, 및 WO 98/26080; 유럽 특허 출원 EP 0 946 736, EP 0 732 403, EP 0480 480, EP 0 460 071, EP 0 340 986, EP 0 329 203, EP 0 324 274, 및 EP 0 164 556을 참조한다. 또한, 문헌[Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62 (1-2):79-93]; [Romanes et al., YEAST (1992) 8 (6):423-488]; [Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7](각각 본원에 참조 인용됨))을 참조한다.

효모 숙주 균주는 당업자에게 공지되어 있는 표준 공급물 배치 발효 방법을 사용하여 증폭 단계 동안 발효기에서 성장할 수 있다. 발효 방법은 특별한 효모 숙주의 탄소 이용 경로 또는 발현 조절 방식에서의 차이를 유발하도록 적합될 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효는 단일 글루코스 공급물, 복합체 질소 공급원(예를 들어, 카세인 가수분해물) 및 복합 비타민 보충물을 필요로 할 수 있다. 대조적으로, 메틸요구성 효모 P. 파스토리스는 글리세롤, 메탄올 및 미량의 무기질 공급물을 필요로 할 수 있지만, 최적의 성장 및 발현을 위해서는 오직 단순한 암모늄(질소) 염만을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, (미국 특허 제5,324,639호; 문헌[Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95]; 및 [Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113](본원에서 참조 인용됨))을 참조한다.

그러나, 이러한 발효 방법은 사용되는 효모 숙주 균주와는 독립적인 특정한 공통된 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 성장 제한 영양소, 전형적으로 탄소를 증폭기 동안 발효기에 첨가하여 최대 성장을 유발시킬 수 있다. 또한, 발효 방법은 일반적으로 적합한 양의 탄소, 질소, 기저 염, 인, 및 다른 소수의 영양분(비타민, 미량의 무기질 및 염 등)을 함유하도록 설계된 발효 배지를 사용한다. 피치아를 사용하는데 적합한 발효 배지의 예는 미국 특허 제5,324,639호 및 제5,231,178호(본원에서 참조 인용됨)에 기재되어 있다.

바큘로바이러스 ( Baculovirus ) 감염 곤충 세포 용어 "곤충 숙주 " 또는 "곤충 숙주 세포"는 재조합벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수혜자로 사용될 수 있거나 사용된 곤충을 지칭한다. 이러한 용어는 형질감염된 원래의 곤충 숙주 세포의 후손을 포함한다. 단일 모세포의 후손이 우발적 돌연변이화 또는 의도적 돌연변이화로 인해 원래의 모체와 형상, 또는 게놈 또는 총 DNA 보체가 완전히 동일하지 않을 수 있을 것으로 이해된다. 관련 성질, 예를 들어 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 존재에 의해 특성화되는 모체와 충분히 유사한 모세포의 후손은 이러한 정의에 의해 의도되는 후손에 포함된다.

관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 발현에 적합한 곤충 세포의 선택은 당업자에게 공지되어 있다. 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 트리초플루시아 니(Trichoplusia ni)를 비롯한 수개의 곤충종은 당 분야에서 잘 기재되어 있고, 상업적으로 입수가능하다. 발현을 위해 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주는 그 중에서도, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질분해 활성 및 전체적인 강인성을 가지는 것으로 보이는 것들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 곤충은 캘리포니아 대학(미국 캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터(Insect Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션("ATCC")(미국 버지니아주 만나사스 소재)을 포함하나 이에 한정되지 않은 각종 공급원으로부터 입수가능하다.

일반적으로, 바큘로바이러스 감염 곤충 발현 시스템의 성분은 전이 벡터, 통상 바큘로바이러스 게놈의 단편 및 발현될 이종 유전자의 삽입에 편리한 제한 부위 양자 모두를 함유하는 박테리아 플라스미드; 전이 벡터 중에서 바큘로바이러스 특이적 단편에 대해 상동성인 서열을 가지는 야생형 바큘로바이러스(이는 바큘로바이러스 게놈으로 이러한 종 유전자의 동족 재조합을 가능케 함); 및 적합한 곤충 숙주 세포 및 성장 배지를 포함한다. 벡터를 구성하고, 세포를 형질감염시키고, 플라크를 선택하고, 배양물 중에서 세포를 성장시키는 것 등에 사용되는 물질, 방법 및 기술은 당업계에 공지되어 있고, 이러한 기술들을 기재하는 편람도 입수가능하다.

이종 유전자를 전이 벡터에 삽입시킨 후, 벡터 및 야생형 바이러스 게놈을 곤충 숙주 세포로 형질감염시키며, 여기에서 벡터 및 바이러스 게놈은 재조합된다. 팩키징된 재조합 바이러스를 발현시키고, 재조합 플라크를 동정하고 정제한다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템용 물질 및 방법은 예를 들어, 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.)(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)으로부터 키트 형태로 상업적으로 입수가능하다. 이러한 기술들은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있고, 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)](본원에 참조 인용됨)에 충분히 기재되어 있다. 또한, 문헌[RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995)]; [AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BLOLOGY 16.9-16.11 (1994)]; [KLNG AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992)]; 및 [O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조한다.

실제로, 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 사용한 각종 이종 단백질의 생산이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,368,825호, 제6,342,216호, 제6,338,846호, 제6,261,805호, 제6,245,528호, 제6,225,060호, 제6,183,987호, 제6,168,932호, 제6,126,944호, 제6,096,304호, 제6,013,433호, 제5,965,393호, 제5,939,285호, 제5,891,676호, 제5,871,986호, 제5,861,279호, 제5,858,368호, 제5,843,733호, 제5,762,939호, 제5,753,220호, 제5,605,827호, 제5,583,023호, 제5,571,709호, 제5,516,657호, 제5,290,686호; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082(본원에 참조 인용됨)를 참조한다.

바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 유용한 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 헬퍼-독립적 바이러스 발현 벡터인 바큘로바이러스 오토그라파칼리포르니카( Autographacalifornica ) 핵 다각체병(polyhedrosis) 바이러스(AcNPV: Autographacalifornica nuclear polyhidrosis 바이러스)로부터 유래된 곤충 발현 및 전이 벡터를 포함한다. 통상, 이러한 시스템으로부터 유래된 바이러스 발현 벡터는 강한 바이러스 다각체 유전자 프로모터를 사용하여 이종 유전자를 발현시킨다. 일반적으로, 문헌[O'Reilly ET AL., EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조한다.

외래 유전자를 바큘로바이러스 게놈에 삽입시키기 전에, 프로모터, 리더(필요에 따라), 관심의 대상이 되는 코딩 서열 및 전사 종결 서열을 포함하는 상기한 성분을 전형적으로 중간 전도 작제물(전이 벡터)로 조립시킨다. 종종, 중간 전도 작제물은 숙주, 예를 들어 박테리아에서 안정하게 유지될 수 있는 레플리콘, 예를 들어 염색체 외부 요소(예를 들어, 플라스미드)에서 유지된다. 레플리콘은 복제 시스템을 갖기 때문에, 이를 클로닝 및 증폭에 적합한 숙주에서 유지되게 한다. 더욱 구체적으로, 플라스미드는 다각체 폴리아데닐화 신호(문헌[Miller et al., ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42: 177] 참조) 및 E. 콜라이 중에서의 선택 및 증식을 위한 원핵생물 암피실린-내성(amp) 유전자 및 복제 기점을 함유할 수 있다.

외래 유전자를 AcNPV로 도입시키는데 통상 사용되는 한 전이 벡터는 pAc373이다. 또한, 예를 들어 다각체 출발 코돈을 ATG로부터 ATT로 변경시키고, ATT로부터의 하류에 BamHI 클로닝 부위 32 염기쌍을 도입하는 pVL985를 비롯한 당업자에게 공지된 다수의 다른 벡터들이 설계되었다. 문헌[Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989)]을 참조할 수 있다. 다른 상업적으로 입수가능한 벡터는 예를 들어, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; 및 pBlueBac4.5(인비트로겐 코포레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)를 포함한다.

이종 유전자의 삽입 후, 전이 벡터 및 야생형 바큘로바이러스 게놈은 곤충 세포 숙주로 함께 형질감염된다. 바큘로바이러스 바이러스에서 이종 DNA를 원하는 부위로 도입시키는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]; [Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156]; [Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31]을 참조한다. 예를 들어, 동종 이중 교차 재조합에 의해 유전자, 예를 들어 다각체 유전자로 삽입될 수 있고, 또한 원하는 바큘로바이러스 유전자로 유전 조작되는 제한 효소 부위로 삽입될 수 있다. 문헌[Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11(4):91]을 참조한다.

형질감염은 전기천공법에 의해 달성될 수 있다. 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)]; [Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501])을 참조한다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터 및 바큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포를 형질감염시키는데 리포좀을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26 (1):36]; [Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050]; [Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273 (22):13570]; [Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323]; [Siffert et al., Nature GENETICS (1998) 18:45]; [TILKINS ET AL., CELL BIOLOGY:A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998)]; [Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263]; [Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17:491]; [Kost et al., GENE (1997) 190:139]; [Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203]; [Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (37):22376]; [Reversey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (39):23607-10]; [Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121]; [Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68 (2):766]; 및 [Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2); 274]을 참조한다. 상업적으로 입수가능한 리포좀은 예를 들어, 셀펙틴(Cellfectin)

및 리포펙틴(Lipofectin)

인비트로겐 코포레이션(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재))을 포함한다. 또한, 인산칼슘 형질감염도 사용할 수 있다. 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)]; [Kitts, NAR (1990) 18 (19):5667]; 및 [Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501]을 참조한다.

바큘로바이러스 발현 벡터는 통상 바큘로바이러스 프로모터를 포함한다. 바큘로바이러스 프로모터는 바큘로바이러스 RNA 중합효소를 결합시킬 수 있고, 코딩 서열(예를 들어, 구조적 유전자)의 mRNA로의 하류(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 갖게 된다. 전형적으로, 이러한 전사 개시 영역은 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 바큘로바이러스 프로모터는 존재하는 경우, 통상 구조적 유전자와 멀리 떨어져 위치하는 인핸서로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 더욱이, 발현은 조절되거나, 구성적일 수 있다.

감염 주기의 후기에서 풍부하게 전사되는 구조적 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예는 바이러스 다각체 단백질을 코딩하는 유전자(문헌[FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)]; EP 0 127 839 및 0 155 476) 및 p10 단백질을 코딩하는 유전자[Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69:765]로부터 유래된 서열을 포함한다.

새로이 형성된 바큘로바이러스 발현 벡터를 감염성 재조합 바큘로바이러스로 팩키징하고, 후속하여 성장한 플라크를 당업자에게 공지되어 있는 기술에 의해 정제한다. 문헌[Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11(4):91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]을 참조한다.

재조합 바큘로바이러스 발현 벡터는 수개의 곤충 세포의 감염을 위해 개발되었다. 예를 들어, 그 중에서도, 아에데스 아에깁티(ATCC 번호 CCL-125), 봄빅스 모리(ATCC 번호 CRL-8910), 드로소필라 멜라노가스터(ATCC 번호 1963), 스포도프테라 프루기페르다 및 트리초플루시아 니에 대한 재조합 바큘로바이러스가 개발되었다. 문헌[Wright, NATURE (1986) 321:718]; [Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56:153]; [Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156]을 참조한다. 일반적으로, 문헌[Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225]을 참조한다. 더욱 구체적으로, 통상적으로 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 사용되는 세포주는 Sf9(스포도프테라 프루기페르다)(ATCC 번호 CRL-1711), Sf21(스포도프테라 프루기페르다)(인비트로겐 코포레이션, 분류 번호 11497-013(미국 캘리포니아주 칼스버드 소재)), Tri-368(트리초플루시아 니) 및 하이-파이브(High-Five)™ BTI-TN-5B1-4(트리초플루시아 니)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

바큘로바이러스/발현 중에서 이종 폴리펩티드의 직접 및 융합 발현 모두를 위한 세포 및 배양 배지가 상업적으로 입수가능하고, 세포 배양 기술이 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.

E. 콜라이 , 슈도모나스 종, 및 기타 원핵생물 박테리아 발현 기술은 당업자에 공지되어 있다. 박테리아 숙주에 사용하기 위해 매우 다양한 벡터들이 이용가능하다. 벡터는 단일 카피. 또는 낮거나 높은 다중카피 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및/또는 발현에 작용할 수 있다. 벡터, 다수의 벡터들의 상업적 이용가능성, 및 심지어 벡터 및 이들의 제한 지도 및 특징을 기재하는 편람에 관한 충분한 문헌이 존재한다는 점을 고려할 때, 본원에서 광범위한 논의는 불필요하다. 공지된 바와 같이, 벡터는 정상적으로 선택을 가능케 하는 마커를 포함하며, 여기에서 마커는 세포독성제 내성, 자가영양성 또는 면역성을 제공할 수 있다. 빈번하게는, 상이한 특성들을 제공하는 복수개의 마커가 존재한다.

박테리아 프로모터는 박테리아 RNA 중합효소를 결합시킬 수 있고 코딩 서열(예를 들어, 구조적 유전자)의 mRNA로의 하류 (3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 갖게 된다. 이 전사 개시 영역은 전형적으로 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시부위를 포함한다. 또한, 박테리아 프로모터는 RNA 합성이 시작되는 인접 RNA 중합효소 결합 부위와 중첩될 수 있는 작동자로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 유전자 억제자 단백질이 작동자에 결합함으로써 특이적 유전자의 전사를 억제할 수 있음에 따라 작동자는 음성 조절된 (유도성) 전사를 일으킨다. 구성적 발현은 음성 조절 요소, 예를 들어 작동자의 부재 하에서 발생할 수 있다. 또한, 양성 조절은 존재하는 경우, 통상 RNA 중합효소 결합 서열에 근접(5')한 유전자 활성제 단백질 결합 서열에 의해 수행될 수 있다. 유전자 활성자 단백질은 에쉐리키아 콜라이(E. 콜라이)에서 lac 오페론의 초기 전사를 돕는 이화 산물 활성제 단백질(CAP)이다(문헌[Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173]). 따라서, 조절된 발현은 양성 또는 음성일 수 있으며, 이로써 전사를 증진시키거나 감소시킬 수 있다.

대사 경로 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예는 당 대사 효소, 예를 들어 갈락토스, 락토스(lac)(문헌[Chang et al., NATURE (1977) 198:1056]) 및 말토스로부터 유래된 프로모터 서열을 포함한다. 추가적인 예는 생합성효소, 예를 들어 트립토판(trp)으로부터 유래된 프로모터 서열을 포함한다(문헌[Goeddel et al., Nuc. ACIDSRES. (1980) 8:4057]; [Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731]; 미국 특허 제4,738,921호; EP 공보 036 776 및 121 775)(본원에 참조 인용됨)를 참조한다). 또한, β-갈락토시다제(bla) 프로모터 시스템(문헌[Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3(Ed. I. Gresser)](본원에 참조 인용됨)), 박테리오파지 람다 PL(문헌[Shimatake et al., NATURE (1981) 292:128](본원에 참조 인용됨)을 참조한다), 및 T5(미국 특허 제4,689,406호(본원에 참조 인용됨)를 참조한다) 프로모터 시스템도 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 강한 프로모터, 예컨대 T7 프로모터를 사용하여, 높은 수준으로 관심 폴리펩티드를 유도할 수 있다. 이러한 벡터의 예는 당업계에 공지되어 있고, 이는 노바겐(Novagen)으로부터의 pET29 계열, 및 본원에 참조 인용되는 WO 99/05297에 기재된 pPOP 벡터를 포함한다. 이러한 발현 시스템은 숙주 세포 생존 능력 또는 성장 매개변수를 약화시키지 않으면서, 숙주내 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 높은 수준으로 생성시킨다. pET19(노바겐)가 당업계에 공지된 또 다른 벡터이다.

또한, 자연계에서 발생하지 않는 합성 프로모터도 박테리아 프로모터로서 기능한다. 예를 들어, 한 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열을 또 다른 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합시켜, 합성 혼성 프로모터를 생산시킬 수 있다[미국 특허 제4,551,433호(본원에 참조 인용됨) 참조]. 예를 들어, tac 프로모터는 trp 프로모터 및 lac 억제자에 의해 조절되는 lac 오페론 서열 양자 모두를 포함하는 하이브리드 trp-lac 프로모터이다(문헌[Amaml et al., GENE (1983) 25:167]; [de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]을 참조한다). 또한, 박테리아 프로모터는 박테리아 RNA 중합효소를 결합시킬 수 있고 전사를 개시할 수 있는 능력을 가지는 박테리아외 기원의 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 박테리아외 기원의 천연 발생 프로모터를 상용가능한 RNA 중합효소와 결합하여, 원핵생물에서 일부 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 박테리오파지 T7 RNA 중합효소/프로모터 시스템은 커플링된 프로모터 시스템의 일례이다(문헌[Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189:113]; [Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074]). 게다가, 혼성 프로모터는 또한 박테리오파지 프로모터 및 E. 콜라이 작동자 영역을 포함할 수 있다(유럽 특허 공보 제267 851호 참조한다).

기능 프로모터 서열에 부가하여, 효과적인 리보솜 결합 부위도 또한 원핵생물에서의 외래 유전자의 발현에 유용하다. E. 콜라이에서, 리보솜 결합 부위는 샤인-달가노(SD: Shine-Dalgarno) 서열로 불리고, 개시 코돈(ATG) 및 개시 코돈의 3-11 뉴클레오티드 상류에 위치한 길이가 3-9개의 뉴클레오티드인 서열을 포함한다(문헌[Shine et al., NATURE (1975) 254:34]). 이러한 SD 서열은 E. 콜라이 16S rRNA의 3' 말단과 SD 서열 사이의 염기 쌍형성에 의해 mRNA의 리보솜에 대한 결합을 촉진시키는 것으로 사료된다(문헌[Steitz et al. "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression(Ed. R. F. Goldberger, 1979)]). 약한 리보솜 결합 부위를 사용하여 진핵생물 유전자 및 원핵생물 유전자를 발현시키는 것에 대해서는, 문헌[Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989]을 참조한다.

용어 "박테리아 숙주" 또는 "박테리아 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수혜자에 사용될 수 있거나 사용된 박테리아를 지칭한다. 이러한 용어는 형질감염된 원래의 박테리아 숙주 세포의 후손을 포함한다. 단일 모세포의 후손이 우발적 돌연변이화 또는 의도적 돌연변이화로 인해 원래의 모체와 형상, 또는 게놈 또는 총 DNA 보체가 완전히 동일하지 않을 수 있을 것으로 이해된다. 관련 성질, 예를 들어 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 존재에 의해 특성화되는 모체와 충분히 유사한 모세포의 후손은 이러한 정의에 의해 의도되는 후손에 포함된다.

폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 박테리아의 선택은 당업자에게 공지되어 있다. 발현을 위해 박테리아 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주는 그 중에서도, 우수한 내포체, 낮은 단백질분해 활성 및 전체적인 강인성을 가지는 것으로 보이는 것들을 포함할 수 있다. 박테리아 숙주는 일반적으로 캘리포니아 대학(미국 캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터(Bacterial Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션("ATCC")(미국 버지니아주 만나사스 소재)을 포함하나 이에 한정되지 않은 각종 공급원으로부터 입수가능하다. 공업적/제약상 발효는 일반적으로 K 균주(예를 들어, W3110)로부터 유래된 박테리아 또는 B 균주(예를 들어, BL21)로부터 유래된 박테리아를 사용한다. 이러한 균주들은 이들의 성장 매개변수가 널리 공지되어 있고 강건하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 이러한 균주는 비병원성이며, 이러한 점은 안정성 및 환경상의 이유로 상업적으로 중요하다. 적합한 E. 콜라이 숙주의 다른 예는 BL21, DH10B 또는 이들의 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시양태에서, E. 콜라이 숙주는 OMP- 및 LON-를 포함하나 이에 한정되지 않은 프로테아제 마이너스 균주이다. 숙주 세포 균주는 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 아에루기노사 및 슈도모나스 푸티다 종을 포함하나 이에 한정되지 않은 슈도모나스이다. 균주 MB101로 지정된 슈도모나스 플루오레센스 생물 변이형 1은 재조합 생성에 유용한 것으로 공지되어 있고, 치료적 단백질의 생산 공정에 이용가능하다. 슈도모나스 발현 시스템의 예는 숙주 균주로서 다우 케미칼 컴퍼니(Dow Chemical Company)(미국 미시간주 미드랜드 소재, 월드 와이드 웹 dow.com 상에서 입수가능)에 의해 입수가능한 시스템을 포함한다. 미국 특허 제4,755,465호 및 제4,859,600호(본원에 참조 인용된다)는 hGH 생산을 위한 숙주 세포로서 슈도모나스 균주를 사용하는 것을 기재하고 있다.

일단 재조합 숙주 세포 균주를 확립하면(즉, 발현 작제물은 숙주 세포로 도입되었고, 적합한 발현 작제물을 가지는 숙주 세포가 단리되면), 재조합 숙주 세포 균주를 관심의 대상이 되는 폴리펩티드 생산에 적합한 조건 하에서 배양한다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 사용되는 발현 작제물의 성질 및 숙주 세포의 실체에 따라 좌우되게 된다. 재조합 숙주 균주는 정상적으로 당업계에 공지된 방법을 사용하여 배양된다. 재조합 숙주 세포는 전형적으로 탄소, 질소 및 무기 염의 동화가능한 공급원, 및 임의적으로는 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 당업계에 공지된 다른 단백질 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양된다. 임의적으로, 숙주 세포 배양용 액체 배지는 바람직하지 못한 미생물의 성장을 방지하는 항생제 또는 항진균제, 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 위한 항생제를 포함하나 이에 한정되지 않는 화합물을 함유할 수 있다.

표적 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 수가지 공지 방법이 이용가능하며, 이들 중 임의의 방법이 본 발명에 이용될 수 있다. 이 방법에는 수여자 세포의 DNA 포함 박테리아 원형질과의 융합, 전기천공법, 발사 포격(projectile bombardment), 및 (이하에 다시 논의되는) 바이러스 벡터 등이 포함된다. 박테리아 세포는 본 발명의 DNA 구축물을 포함하는 플라스미드의 수를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 박테리아는 로그 상태로까지 성장하고, 박테리아 내의 플라스미드는 당업계에 공지된 각종 방법들에 의해 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook] 참조). 또한, 박테리아로부터 플라스미드를 정제하기 위한 키트의 다혈증이 시중 입수가능하다(예를 들어, 이지프렙(EasyPrep)™, 플렉시프렙(FlexiPrep)™(양자 모두 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech) 제품); 스트라타클린(StrataClean)™(스트라타겐(Stratagene) 제조); 및 키아프렙(QIAprep)™(키아겐(Qiagen) 제조). 이어서, 단리되고 정제된 플라스미드를 다른 플라스미드를 생성하도록 더욱 조작하고, 세포를 형질감염시키기 위해 사용하거나 관련 벡터에 도입되어 유기체를 감염시킬 수 있다. 전형적 벡터는 전사 및 번역 종결부위, 전사 및 번역 개시 서열, 및 특별한 표적 핵산의 발현의 제어에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 임의적으로 하나 이상의 독립적 종결부위 서열을 함유하는 포괄적 발현 카세트, (셔틀 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않음) 진핵생물, 또는 원핵생물, 또는 양자 모두 내의 카세트의 복제를 허용하는 서열, 및 원핵생물 및 진핵생물 시스템 모두를 위한 선택 마커를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물, 또는 바람직하게는 양자 모두에서의 복제 및 일체화에 적당하다. 문헌[Gillam & Smith, Gene 8:81(1979)]; [Roberts et al., Nature, 328:731(1987)]; 문헌[Schneider, E. et al., Protein Expr. Purif. 6(1)10-14(1995)]; 문헌[Ausubel, Sambrook, Berger](모두 이하 동일)]을 참조한다. 클로닝에 유용한 박테리아 및 박테리오파지의 카달로그가 예컨대, ATCC에 의해 제공되며, 예를 들어 ATCC에 의해 발행되는 문헌[The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992) Gherna 등(편저)]이 있다, 예컨대 분자 생물학의 시퀀싱, 클로닝 및 기타 측면, 및 이론적 고려사항의 기초가 되는 부가적 기본 절차가 또한 문헌[Watson et al.(1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에 나와 있다. 또한, 본질적으로 임의의 핵산 (및 표준 또는 비표준 불문의 실질적으로 임의의 표지된 핵산)은 더 미들렌드 서티파이드 리에이전트 컴퍼니(The Midland Certified Reagent Company(미국 텍사스주 미들랜드 소재, mcrc.com의 웹사이트 상에 이용가능함), 더 그레잇 아메리칸 젠 컴퍼니(The Great American Gene Company(미국 캘리포니아주 라모나 소재, genco.com의 웹사이트 상에 이용가능함), ExpressGen Inc.(미국 일리노이즈주 시카고 소재, expressgen.com의 웹사이트 상에 이용가능함), 오페론 테크놀로지즈 인코포레이티드(Operon Technologies Inc.)(미국 캘리포니아주 알라메다 소재), 및 기타 많은 회사들과 같은 각종 상업적 출처들 중 임의의 출처로부터 고객 주문되거나 표준 주문될 수 있다.

재조합 숙주 세포는 배치 형식 또는 연속 형식으로 배양될 수 있으며, 배치 형식 또는 연속 형식으로 세포를 회수하거나(관심의 대상이 되는 폴리펩티드가 세포내 축적되는 경우), 배양 상등액을 회수한다. 원핵생물 숙주 세포에서 생산하는 경우, 배치 배양 및 세포 회수가 바람직하다.

셀렉터 코돈

본 발명의 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 세포 기작의 유전자 코돈 골격을 확장시킨다. 예를 들어, 셀렉터 코돈은 특유의 3개의 염기 코돈, 넌센스 코돈, 예컨대 앰버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈(UGA)을 포함하나 이에 한정되지 않는 종결 코돈, 비천연 코돈, 4개(또는 그 이상 개수)의 염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함한다. 다수의 셀렉터 코돈은 원하는 유전자, 또는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 등에 도입될 수 있다.

본 발명의 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기작의 유전 코돈 골격을 확장시킨다. 예를 들어, 셀렉터 코돈에는 특유의 3개의 염기 코돈, 넌센스 코돈, 예컨대 앰버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈(UGA)을 포함하나 이에 한정되지 않는 종결 코돈, 비천연 코돈, 4개 이상의 염기 코돈, 희소 코돈 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명을 이용하는 유전적으로 변형된 전 유기체, MAP, 및 E. 콜라이의 비제한적 예로서, 항원 또는 전 유기체를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드 내에 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 즉 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상 개수를 포함하는 수의, 원하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있는 셀렉터 코돈의 수가 매우 폭넓음이 당업자에게 자명하다.

한 실시양태에서, 상기 방법은 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산을 생체내 도입시키기 위해 종결 코돈인 셀렉터 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 종결 코돈을 인지하는 O-tRNA가 생산되고, 선택된 아미노산을 사용하여 O-RS에 의해 아미노아실화된다. 이러한 O-tRNA는 천연 발생 숙주의 tRNA에 의해 인식되지 않는다. 통상적인 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 관심의 대상이 되는 부위에 종결 코돈을 도입할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sayers, J. R., et al. (1988), 5'-3' Exonuclease in a phosphorothioate -based oligonucleotide - directed mutagenesis. Nucleic Acids Res ., 16:791-802]을 참조한다. 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 O-RS, O-tRNA 및 핵산이 예컨대, 생체내에서 조합되는 경우, 선택된 아미노산은 종결 코돈에 대한 반응으로, 도입되어 특정된 위치에서 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 셀렉터 코돈으로 사용되는 종결 코돈은 앰버 코돈, UAG 및/또는 오팔 코돈, UGA이다. 예를 들어, 앰버 코돈을 인식하는 O-tRNA의 한 예에 대해 서열 번호 6을 참조하고, 오팔 코돈을 인식하는 O-tRNA의 한 예에 대해 서열 번호 7을 참조한다. UAG 및 UGA의 양자 모두가 셀렉터 코돈으로 사용되는 유전 암호는 가장 풍부한 말단 신호인 오커 넌센스 코돈, UAA를 보존하면서 22개 아미노산을 코딩할 수 있다.

생체내 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산의 도입은 숙주 세포의 큰 혼란없이 수행될 수 있다. 예를 들어, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 앰버 억제자 tRNA를 포함하나 이에 한정되지 않은 O-tRNA와 UAG 코돈에 결합하여, 리보솜으로부터 성장 펩티드의 방출을 개시하는 방출 인자(RF1) 사이의 경쟁에 의존하기 때문에, 억제 효율은 O-tRNA, 예컨대 억제자 tRNA의 발현 수준을 증가시키거나, RF1 결핍 균주를 이용함으로써 조절될 수 있다. 진핵생물 세포에서, UAG 코돈에 대한 억제 효율이 O-tRNA, 예컨대 앰버 억제자 tRNA와 (종결 코돈에 결합하고, 리보솜으로부터 성장 펩티드의 방출을 개시하는) 진핵생물 방출 인자(예를 들어, eRF) 사이의 경쟁에 의존하기 때문에, 억제 효율은 예를 들어, O-tRNA, 예컨대 억제자 tRNA의 발현 수준을 증가시킴으로써 조절될 수 있다.

비천연 아미노산은 또한 희귀 코돈으로 코딩될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 단백질 합성 반응에서의 아르기닌 농도가 감소하면, 희귀 아르기닌 코돈인 AGG가 알라닌으로 아실화된 합성 tRNA에 의해 Ala가 삽입되는데 효율적인 것으로 입증되었다. 예를 들어, 문헌[Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993)]을 참조한다. 이러한 경우, 합성 tRNA는 에쉐리키아 콜라이 내 소수 종으로 존재하는 천연 발생 tRNAArg와 경쟁한다. 일부 유기체는 모든 삼중 코돈을 이용하지 않는다. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 내의 비지정 코돈 AGA는 시험관내 전사/번역 추출물내 아미노산의 삽입을 위해 이용되었다. 예를 들어, 문헌[Kowal and Oliver, Nucl. Acid . Res ., 25:4685 (1997)]을 참조한다. 생체내 이러한 희귀 코돈을 이용하는 본 발명의 성분들이 생성될 수 있다.

셀렉터 코돈은 또한 4개 이상의 염기 코돈, 예를 들어 4개, 5개, 6개 이상의 염기 코돈을 포함하나 이에 한정되지 않은 연장된 코돈을 포함한다. 4개의 염기 코돈의 예는 AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 5개의 염기 코돈의 예는 AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 특성은 프레임쉬프트 억제를 기초로 하여 연장된 코돈을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 4개 이상의 염기 코돈은 비천연 아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않은 하나 또는 다수의 선택된 아미노산을 동일한 단백질에 삽입시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이화된 O-tRNA, 예컨대 안티코돈 루프, 예를 들어 CU(X)_n XXXAA 서열(여기에서, n=1)을 가지는 특수 프레임쉬프트 억제자 tRNA의 존재 하에서, 4개 이상의 염기 코돈을 단일 아미노산으로서 판독한다. 4개 염기 코돈을 인식하는 O-tRNA에 대해 예를 들어, PCT/US04/22061의 서열 번호 6 및 12를 참조한다. 다른 실시양태에서, 안티코돈 루프는 4개 이상의 염기 코돈, 5개 이상의 염기 코돈, 또는 6개 이상의 염기 코돈 또는 그 이상을 포함하나 이에 한정되지 않은 것들을 디코딩(decoding)할 수 있다. 256개의 가능한 4개 염기 코돈이 존재하기 때문에, 다수의 비천연 아미노산은 4개 이상의 염기 코돈을 사용하여 동일한 세포에서 코딩될 수 있다. 문헌[Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size , Chemistry and Biology, 9:237-244]; [Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four - base Codons and Identification of " Shifty " Four - base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol . Biol . 307:755-769]을 참조한다.

예를 들어, 4 염기 코돈은 시험관내 생합성 방법을 사용하여 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는 데 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Ma et al. (1993) Biochemistry, 32:7939]; 및 [Hohsaka et al. (1999) J . Am . Chem . Soc . 121:34]을 참조한다. CGGG 및 AGGU는 2-나프틸알라닌 및 리신의 NBD 유도체를 2개의 화학적으로 아실화된 프레임쉬프트 억제자 tRNA를 사용하여 동시에 스트렙타비딘에 시험관내 도입시키는 데 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Hohsaka et al. (1999) J. Am . Chem. Soc ., 121:12194]을 참조한다. 생체내 연구에서, (Moore) 등은 UAGN 코돈(N은 U, A, G 또는 C일 수 있다)을 억제하는 NCUA 안티코돈을 가지는 tRNALeu 유도체의 능력을 조사하였고, 4중체 UAGA가 UCUA 안티코돈을 가지는 tRNALeu에 의해, 0 또는 -1 프레임에서 약간 디코딩하면서 13 내지 26%의 효율로 디코딩될 수 있다는 것을 발견하였다. 문헌[Moore et al., (2000) J. Mol . Biol ., 298:195]을 참조한다. 한 실시양태에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 기초로 하는 연장된 코돈이 본 발명에 사용될 수 있으며, 이는 다른 원치 않는 부위에서의 미스센스 리드쓰루(missense readthrough) 및 프레임쉬프트 억제를 감소시킬 수 있다.

소정의 시스템에 대해, 셀렉터 코돈은 또한 3개의 천연 염기 코돈 중 하나를 포함할 수 있으며, 여기에서 내인성 시스템은 천연 염기 코돈을 전혀 (또는 거의) 사용하지 않는다. 예를 들어, 이는 3개의 천연 염기 코돈을 인식하는 tRNA가 결여된 시스템 및/또는 3개의 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.

셀렉터 코돈은 임의적으로 비천연 염기쌍을 포함한다. 이러한 비천연 염기쌍은 기존의 유전자 알파벳을 추가로 연장시킨다. 하나의 여분의 염기쌍은 64 내지 125의 3중 코돈의 수를 증가시킨다. 세 번째 염기쌍의 성질은 안정한 선택적 염기쌍화, 중합효소에 의해 고도한 적합도로의 DNA로의 효과적인 효소 도입, 및 초기 비천연 염기쌍의 합성 후 효과적인 연속되는 프라이머 연장을 포함한다. 본 방법 및 조성물에 적합될 수 있는 비천연 염기쌍의 설명은 예를 들어, 문헌[Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20:177-182]을 포함한다. 또한, 문헌[Wu, Y., et al., (2002) J. Am . Chem . Soc . 124:14626-14630]을 참조한다. 다른 관련 공보는 하기에 열거된다.

생체내 용도에 대해, 비천연 뉴클레오시드는 막 투과성을 갖고, 인산화되어 상응하는 삼인산염을 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정하고, 세포 효소에 의해 파괴되지 않는다. 베터(Benner) 등에 의해 이루어진 기존 노력에서, 정규 와트슨-크릭(Watson-Crick) 쌍의 경우와 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였고, 이러한 중 가장 주목할만한 예가 이소-C:이소-G 쌍이다. 예를 들어, 문헌[Switzer et al. (1989) J. Am . Chem . Soc ., 111:8322]; 및 [Piccirilli et al. (1990) Nature , 343:33; Kool, (2000) Curr . Opin . Chem . Biol ., 4:602]을 참조한다. 일반적으로, 이들 염기는 어는 정도 천연 염기와 잘못 쌍을 이루고, 효소에 의해 복제될 수 없다. (Kool) 및 이의 동료들은 염기들 사이의 소수성 패킹(packing) 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기쌍의 형성을 유도할 수 있다는 점을 입증하였다. 문헌[Kool, (2000) Curr . Opin . Chem . Biol., 4:602]; 및 [Guckian and Kool (1998) Angew. Chem . Int . Ed . Engl., 36, 2825]을 참조한다. 모든 상기 요건을 만족시키는 비천연 염기쌍을 개발하려는 노력으로, 슐츠(Schultz), 로메스버그(Romesberg) 및 동료들은 일련의 비천연 소수성 염기들을 체계적으로 합성하고, 연구하였다. PICS:PICS 자가 쌍(자가 pair)은 천연 염기쌍보다 안정한 것으로 발견되었으며, 에쉐리키아 콜라이 DNA 중합효소 I(KF)의 클레노우(Klenow) 단편에 의해 DNA로 효율적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌[McMinn et al. (1999) J. Am . Chem. Soc., 121:11586]; 및 [Ogawa et al., (2000) J. Am . Chem . Soc ., 122:3274]을 참조한다. 3MN:3MN 자가 쌍은 생물학적 기능에 충분한 효율 및 선택도를 사용하여 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem . Soc. 122:8803]을 참조한다. 그러나, 양자 모두의 염기는 추가 복제시 사슬 종결부위로 작용한다. 최근, 돌연변이 DNA 중합효소는 PICS 자가쌍을 복제하는 데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 7AI 자가 쌍도 복제될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tae et al., (2001) J. Am . Chem . Soc ., 123:7439]을 참조한다. 또한, 신규한 금속성 염기쌍, Dipic:Py도 개발되었으며, 이는 Cu(II) 결합시 안정한 쌍을 형성한다. 문헌[Meggers et al., (2000) J. Am . Chem . Soc ., 122:10714]을 참조한다. 연장된 코돈 및 비천연 코돈은 본질적으로 천연 코돈에 오르소고날이기 때문에, 본 발명의 방법은 이러한 성질을 이용하여 이들에 대하여 오르소고날인 tRNA를 생성할 수 있다.

번역 우회(translational bypassing) 시스템을 사용하여, 원하는 폴리펩티드에서 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산을 도입시킬 수 있다. 번역 우회 시스템에서, 대형 서열은 유전자로 도입되지만, 단백질로 번역되지 않는다. 이러한 서열은 리보솜을 유도하여 서열을 뛰어넘고(hop over), 삽입의 번역 하류를 재개하는 계기로서 작용하는 구조를 가진다.

선택된 아미노산 및 비천연 아미노산

본원에 사용되는 선택된 아미노산은 임의의 원하는 천연 발생 아미노산 또는 비천연 아미노산을 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 20종의 유전적으로 코딩된 알파-아미노산들, 즉 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린 중 임의의 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 선택된 아미노산은 고도한 적합도로, 예컨대 소정의 셀렉터 코돈에 대해서는 약 70% 초과의 효율, 소정의 셀렉터 코돈에 대해서는 75% 초과의 효율, 소정의 셀렉터 코돈에 대해서는 약 80% 초과의 효율, 소정의 셀렉터 코돈에 대해서는 약 85% 초과의 효율, 소정의 셀렉터 코돈에 대해서는 약 90% 초과의 효율, 소정의 셀렉터 코돈에 대해서는 약 95% 초과의 효율, 또는 소정의 셀렉터 코돈에 대해서는 약 99% 초과, 또는 그 이상의 효율로 성장 폴리펩티드 사슬에 도입된다.

본원에 사용되는 비천연 아미노산은 셀레노시스테인 및/또는 피롤리신, 및 하기 20종의 유전적으로 코딩된 알파-아미노산들 이외의 임의의 아미노산, 변형 아미노산, 또는 아미노산 유사체를 지칭한다: 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린. 알파-아미노산의 일반 구조는 화학식 I로 도시된다:

[화학식 I]

비천연 아미노산은 전형적으로 R 기가 20종의 천연 아미노산에 사용된 치환기 이외의 임의의 치환기인 화학식 I을 가지는 임의의 구조이다. 20종의 천연 아미노산의 구조에 대해, 예컨대 문헌[Biochemistry by L. Stryer, 3^rd ed. 1988, Freeman and Company, New York]을 참조한다. 본 발명의 비천연 아미노산은 상기 20종의 알파-아미노산 이외의 상기 천연 발생 화합물일 수 있음을 주목한다.

본 발명의 비천연 아미노산은 전형적으로 측쇄의 구조에서만 천연 아미노산과 상이하고, 비천연 아미노산은 천연 발생 단백질에서 형성되게 되는 동일한 방식으로, 천연 또는 비천연(이를 포함하나 이에 한정되지는 않는다)의 다른 아미노산과 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비천연 아미노산은 천연 아미노산과 구분되도록 하는 측쇄기를 가진다. 예를 들어, 화학식 I 내의 R은 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 히드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 술포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 아민 등, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 다른 비천연 발생 아미노산은 광활성화가능한 가교제를 포함하는 아미노산, 스핀-표지된 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속-함유 아미노산, 방사능 아미노산, 신규한 작용기를 가지는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 포토케이징되고/되거나 광이성화가능한 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예컨대 당 치환 세린, 기타 탄수화물 변형 아미노산, 케토 함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중 원자로 치환된 아미노산, 화학 분절성 및/또는 광분절성 아미노산, 약 5개 초과 또는 약 10개 초과 탄소를 포함하나 이에 한정되지 않은 장쇄 탄화수소 또는 폴리에테르를 포함하나 이에 한정되지 않은 천연 아미노산에 비해 연장된 측쇄를 가지는 아미노산, 탄소가 연결된 당 함유 아미노산, 산화환원 활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 미국 특허 출원 공보 제2003/0082575호 및 제2003/0108885호(본원에 참조 인용됨)를 참조한다. 비천연 아미노산은 예컨대, 고체 지지체에 단백질을 연결시키기 위해 사용되는 광활성화가능한 가교제를 가질 수 있다. 비천연 아미노산은 아미노산 측쇄에 부착된 당질 부분을 가질 수 있다.

신규 측쇄를 함유하는 비천연 아미노산 외에도, 비천연 아미노산은 또한 변형된 골격 구조로서, 예를 들어 하기 화학식 II 및 화학식 III의 구조에 의해 도시되는 구조를 포함한다:

[화학식 II]

[화학식 III]

(여기에서, Z는 전형적으로 OH, NH₂, SH, NH-R' 또는 S-R'를 포함하고, 동일하거나 상이할 수 있는 X 및 Y는 전형적으로 S 또는 O를 포함하고, 임의적으로 동일하거나 상이할 수 있는 R 및 R'는 전형적으로 화학식 I을 가지는 비천연 아미노산에 대해 상기한 R 기에 대한 구성성분으로 된 동일한 열거 성분들, 및 수소로부터 선택된다). 예를 들어, 비천연 아미노산은 화학식 II 및 화학식 III에 도시되는 바와 같이 아미노 또는 카르복실기에서의 치환을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 비천연 아미노산은 예컨대, 공통의 20개의 천연 아미노산에 상응하는 측쇄 또는 비천연 측쇄를 갖는, α-히드록시 산, α-티오산, α-아미노티오카르복실레이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, α-탄소에서의 치환은 임의적으로 L, D 또는 α-α-이치환 아미노산, 예를 들어 D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 구조적 대체물은 시클릭 아미노산, 예를 들어, 프롤린 유사체, 및 3, 4, 6, 7, 8 및 9 원 환 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산, 예를 들어 치환 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산을 포함한다.

다수의 비천연 아미노산은 천연 아미노산, 예를 들어 티로신, 글루타민, 페닐알라닌 등을 기초로 한다. 티로신 유사체는 파라-치환 티로신, 오르소-치환 티로신 및 메타 치환된 티로신을 포함하고, 여기에서 치환된 티로신은 케토기(아세틸기를 포함하나 이에 한정되지 않음), 벤조일기, 아미노기, 히드라진, 히드록시아민, 티올기, 카르복시기, 이소프로필기, 메틸기, C₆-C₂₀ 직쇄형 사슬 또는 분지형 탄화수소, 포화된 또는 불포화된 탄화수소, O-메틸기, 폴리에테르기, 니트로기, 알키닐기 등을 포함한다. 또한, 다중 치환된 아릴 환도 고려된다. 글루타민 유사체는 α-히드록시 유도체, γ-치환 유도체, 시클릭 유도체 및 아미드 치환된 글루타민 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 페닐알라닌 유사체의 예는 파라-치환 페닐알라닌, 오르소-치환 페닐알라닌, 및 메타 치환 페닐알라닌을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 여기에서 치환기는 히드록시기, 메톡시기, 메틸기, 알릴기, 알데히드, 아지도, 요오도, 브로모, 케토기(아세틸기를 포함하나 이에 한정되지 않음) 등을 포함하나 이에 한정되지 않은 것들을 포함한다. 본 발명에 사용하기 적합할 수 있는 비천연 아미노산의 구체적인 예는 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-프로파르길-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-도파(L-Dopa), 불소화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌및 p-프로파르길옥시-페닐알라닌 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 각종 비천연 아미노산의 구조의 예는 예를 들어, WO 2002/085923(발명의 명칭: "In vivo incorporation of unnatural amino acids")에 제공되어 있다. 또한, 추가적인 메티오닌 유사체에 대해서는 [Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudifzger ligation, PNAS 99:19-24](본원에 참조 인용됨)을 참조한다.

아미노 말단에서 폴리펩티드로 도입되는 비천연 아미노산은 α-아미노산 중에 정상적으로 존재하는 NH₂ 기와 상이한 제2 반응성 기 및 20개의 천연 아미노산에서 사용된 것 이외의 임의의 치환기인 R 기로 구성될 수 있다(화학식 I을 참조한다). 유사한 비천연 아미노산은 α-아미노산 중에 정상적으로 존재하는 COOH 기와 상이한 제2 반응성 기를 가지는 카르복실 말단에서 도입될 수 있다(화학식 I 참조).

본 발명의 비천연 아미노산은 20종의 천연 아미노산에서 이용불가능한 추가의 특성을 제공하도록 선택되거나 디자인될 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산은 예를 들어, 그 아미노산이 도입되게 되는 단백질의 생물학적 성질을 변형하도록 임의적으로 디자인되거나 선택될 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 단백질에 포함시킴으로써 하기 성질들이 임의적으로 변형될 수 있다: 독성, 생체내 분포, 용해도, 안정성, 예를 들어 열, 가수분해, 산화, 효소 분해에 대한 내성, 화학적 및/또는 광화학적 성질, 산화환원 전위, 반감기, 다른 분자와 예를 들어, 공유적으로 또는 비공유적으로 반응할 수 있는 능력 등.

각종 비천연 아미노산들의 구조가 예를 들어, 본원에 참조 인용되는 WO 2002/085923(발명의 명칭: "In vivo incorporation of unnatural amino acids")의 도 16, 17, 18, 19, 26 및 29에 제공되어 있다. 그 예는 본 발명의 tRNA에 부착될 수 있는 아미노산에 결코 제한되는 것을 의미하지는 않는다.

비천연 아미노산의 한 이점은, 그것이 추가의 분자를 첨가하기 위해 사용될 수 있는 추가의 화학적 부분을 제공한다는 것이다. 이러한 변형은 진핵생물 또는 비진핵생물 세포에서 생체내, 또는 시험관내 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 번역후 변형은 비천연 아미노산을 통해 이루어진다. 폴리펩티드 내의 비천연 아미노산은, 특정 반응성 기에 적합한 것으로 당업자에게 공지되어 있는 화학 방법론을 사용하여 제1 반응성 기를 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산에 대해 제2 반응기를 포함하는, 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 당질, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생물소재, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사능 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 부분, 화학선 복사 여기성 부분, 광이성화가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 중 원자가 도입된 부분, 화학 분절성 기, 광분절성 기, 신장된 측쇄, 탄소-연결 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위 원소로 표지된 부분, 생체물리학적 프로브, 형광기, 화학발광기, 전자 밀집기, 자성기, 층간 삽입성기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노트랜스미터, 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 폴리펩티드에 또 다른 분자를 부착시키는 것을 포함한다.

예를 들어, 번역후 변형은 친핵성-친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 현재 단백질의 선택적 변형에 사용되는 대부분의 반응은 α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄와의 반응을 포함하나 이에 한정되지 않는 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 사이의 공유 결합 형성을 포함한다. 이러한 경우에서의 선택도는 단백질 중의 친핵성 잔기의 접근성 및 수에 의해 결정된다. 본 발명의 단백질에서, 다른 더욱 선택적인 반응들, 예를 들어 시험관내 및 생체내 비천연 케토-아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 반응을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cornish, et al. (1996) J. Am . Chem . Soc ., 118:8150-8151]; [Mahal, et al. (1997) Science, 276:1125-1128]; [Wang, et al., (2001) Science 292:498-500]; [Chin, et al., (2002) J. Am . Chem . Soc . 124:9026-9027]; [Chin, et al., (2002) Proc . Natl . Acad . Sci . 99:11020-11024]; [Wang, et al., (2003) Proc . Natl. Acad . Sci . 100:56-61]; [Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:6735-6746]; 및 [Chin, et al., (2003) Science, 301:964-7](이들 모두는 본원에 참조 인용됨)를 참조할 수 있다. 이는 형광 발색단, 가교제, 당질 유도체 및 세포독성 분자를 비롯한 시약으로 된 숙주를 사용하여 거의 모든 단백질을 선택적으로 표지화할 수 있게 한다. 또한, 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제6,927,042호(발명의 명칭: "Glycoprotein synthesis")를 참조한다. 또한, 아지도 아미노산을 통헌(단, 이에 한정되지 않듬) 번역후 변형은 스타우딘저 결찰(Staudinger ligation)(트리아릴포스핀 시약을 사용하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24]을 참조한다.

비천연 아미노산의 화학적 합성

다수의 비천연 아미노산들이, 예컨대 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)(미국 미조리주 세인트루이스 소재), 노바바이오켐(Novabiochem)(독일 담슈타트 소재의 EMD 바이오사이언스사 지사) 또는 펩테크(Peptech)(미국 메사츄세츠주 버링톤 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다. 시중 입수가능하지 않은 것들은 임의적으로 본원에서 제공되는 바와 같이 합성되거나, 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 합성된다. 유기 합성 기법에 대해, 예컨대 문헌[Organic Chemistry, Fessendon and Fessendon(1982)(Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass)]; [Advanced Organic Chemistry, March(Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]; 및 [Advanced Organic Chemistry, Carey and Sundberg(Third Edition, Part A and B, 1990, Plenum Press, New York)])을 참조한다. 비천연 아미노산의 합성을 기술하는 추가의 공보는 예컨대, (WO 2002/085923(발명의 명칭: "In vivo incorporation of unnatural amino acids"; [Matsoukas et al. (1995) J. Med . Chem., 38, 4660-4669]; [King, F. E. & Kidd, D. A. A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ- Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem . Soc, 3315-3319]; [Friedman, O. M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti -Tumor Agents . J. Am . Chem . Soc . 81, 3750-3752]; [Craig, J. C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7- Chloro -4 [[4-( diethylamino )-1-methylbutyl]amino]quinoline ( Chloroquine ). J. Org . Chem . 53, 1167-1170]; [Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur . J. Med . Chem . 26, 201-5]; [Koskinen, A. M. P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4- Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org . Chem. 54, 1859-1866]; [Christie, B. D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)- Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org . Chem . 50:1239-1246]; [Barton et al. (1987) Synthesis of Novel alpha - Amino - Acids and Derivatives Using Radical Chemistry : Synthesis of L- and Dalpha - Amino - Adipic Acids, L- alpha - aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives . Tetrahedron 43:4297-4308]; 및 [Subasinghe et al. (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta - heterocyclic 2- aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate - sensitized site. J. Med . Chem . 35:4602-7])을 포함한다. 또한, 미국 특허 공보 US 제2004/0198637호(발명의 명칭: "Protein Arrays")(본원에 참조 인용됨)를 참조한다.

비천연 아미노산의 세포내 흡수

세포에 의한 비천연 아미노산 흡수는, 예컨대 단백질로의 도입을 위해 비천연 아미노산을 디자인하고 선택할 때 전형적으로 고려되는 하나의 관건이다. 예를 들어, α-아미노산의 고전하 밀도는 이러한 화합물이 세포 투과가 어려울 수 있음을 제시한다. 천연 아미노산은 단백질-기재 수송 시스템의 수집을 통해 세포로 흡수된다. 비천연 아미노산이 있는 경우, 그것이 세포에 의해 흡수되는지를 평가하는 급속 스크린이 행해질 수 있다. 예를 들어, 독성 검정에 대해서는 예컨대, (US 제2004/0198637호(발명의 명칭: "Protein Arrays"); 및 [Liu, D. R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785]을 참조한다. 흡수가 각종 검정법을 이용하여 용이하게 분석되나, 세포내 흡수 경로에 수용적인 비천연 아미노산을 디자인함에 있어 대안법은, 생체내 아미노산을 생산하는 생합성 경로를 제공하는 것이다.

비천연 아미노산의 생합성

다수의 생합성 경로가 아미노산 및 기타 화합물의 제조를 위해 세포내에 이미 존재한다. 특별한 비천연 아미노산을 위한 생합성 방법이 세포내를 포함하나 이에 한정되지 않는 자연에 존재하지 않을 수 있으나, 본 발명은 그러한 방법을 제공한다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 위한 생합성 경로는 임의적으로 새 효소를 첨가하거나, 기존의 숙주 세포 경로를 변형시킴으로써 숙주 세포내에 생성될 수 있다. 추가의 새 효소는 임의적으로 천연 발생 효소 또는 인공 진화 효소이다. (예를 들어, WO 2002/085923(발명의 명칭: "In vivo incorporation of unnatural amino acids")에서 한 예로 제시된) p-아미노페닐알라닌의 생합성은 다른 유기체로부터의 공지 효소들의 조합을 첨가하는 것에 의존한다. 이러한 효소들을 위한 유전자는 유전자를 포함하는 플라스미드를 이용하여 세포를 형질 변환시킴으로써 세포에 도입될 수 있다. 유전자는 세포내에 발현될 때, 원하는 화합물을 합성하기 위한 효소 경로를 제공한다. 임의적으로 첨가되는 효소의 유형의 예가 이하의 예들에서 제공된다. 추가의 효소 서열이 예를 들어, 유전자은행(Genbank)에 나와 있다. 인공 진화된 효소는 또한 동일한 방식으로 세포에 임의적으로 첨가된다. 이러한 방식으로, 세포 기작 및 세포의 공급원을 조작하여, 비천연 아미노산을 생산한다.

생합성 경로에서의 사용, 또는 기존의 경로의 진화를 위한 신규 효소를 생산하기 위해 각종 방법들이 이용가능하다. 예를 들어, 맥시겐 인코포레이티드(Maxygen, Inc.)(월드 와이드 웹 maxygen. com에서 이용가능함)에 의해 개발된(단, 이에 한정되지 않는다) 재귀적 재조합을 임의적으로 이용하여, 신규 효소 및 경로를 개발한다. 예를 들어, 문헌[Stemmer(1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389391]; 및 [Stemmer(1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly : In vitro recombination for molecular evolution, Proc . Natl . Acad . Sci . USA ., 91:10747-10751]를 참조한다. 유사하게, 지넨코어(Genencor)(월드 와이드 웹 genencor.com에서 이용가능함)에 의해 개발된 디자인패쓰(DesignPath)™ 를 임의적으로 대사 경로로 조작하기 위해, 세포내 O-메틸-L-티로신을 생성시키기 위한 경로를 조작한다(단, 이에 한정되지 않는다). 이러한 기술은 작용적 유전체학, 및 분자 진화 및 디자인을 통해 확인된 유전자들(단, 이에 한정되지 않는다)을 포함하나 이에 한정되지 않는 새 유전자들의 조합을 이용하여 숙주 유기체 내의 기존 경로를 재작제한다. 다이벌사 코포레이션(Diversa Corporation)(월드 와이드 웹 diversa.com에서 이용가능함)은 또한 새 경로를 발생시키기 위한 (단, 이에 한정되지 않는다) 유전자의 라이브러리 및 유전자 경로를 급속히 선별하는 기술을 제공한다.

전형적으로, 본 발명의 조작된 생합성 경로를 이용하여 생산된 비천연 아미노산은, 천연 세포내 양을 포함하나 이에 한정되지 않는, 효율적인 단백질 생합성을 위해 충분한 농도로, 다만 다른 아미노산의 농도에 영향을 주거나, 세포 공급원을 소진하는 정도로는 아닌 농도로 생산된다. 이러한 식으로 생체내 생산된 전형적 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 일단 세포가 특정 경로 및 비천연 아미노산에 원하는 효소를 생산하기 위해 사용되는 유전자를 포함하는 플라스미드를 이용하여 형질전환되면, 생체내 선택을 임의적으로 사용하여, 리보솜내 단백질 합성 및 세포 성장 모두를 위한 비천연 아미노산의 생산을 더욱 최적화한다.

핵산 및 폴리펩티드 서열 및 변이체

상기 및 하기에 기재된 바와 같이, 본 발명은 핵산 폴리뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드 아미노산 서열, 예를 들어 tRNA 및 RS, 및 예컨대, 상기 서열을 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 서열, 예컨대 tRNA 및 RS의 예가 본원에 개시된다. 그러나, 당업자는 본 발명이 본원, 예컨대 실시예에 개시된 서열에 한정되지 않음을 인식할 것이다. 당업자는 본 발명이 또한 본원에 기재된 기능을 갖는, 예를 들어 O-tRNA 또는 O-RS를 코딩하는 다수의 관련 및 비관련 서열을 제공함을 인식할 것이다.

본 발명은 폴리펩티드(O-RS) 및 폴리뉴클레오티드, 예컨대 O-tRNA, O-RS 또는 이의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 아미노아실-tRNA 합성효소 클론을 단리하는 데 사용되는 올리고뉴클레오티드 등을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 가지는 본 발명의 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 것들을 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 서열 번호 1, 2, 3에 나와 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 이의 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적이거나 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 보존적 변이를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 유사하게, 핵산의 실질적으로 전체 길이에서 고도로 엄격한 조건 하에서 상기 나타낸 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드이다.

특정 실시양태에서, 벡터(예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지, 박테리아, 바이러스, 나형(naked) 폴리뉴클레오티드, 접합된 폴리뉴클레오티드 등)는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드들 중 하나 이상에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.

당업자는 또한 개시된 서열의 다수의 변이체들이 본 발명에 포함됨을 인식할 것이다. 예를 들어, 작용적으로 동일한 서열을 산출하는 개시된 서열의 보존적 변이체는 본 발명에 포함된다. 핵산 폴리뉴클레오티드 서열의 변이체로서, 하나 이상의 개시된 서열에 혼성화하는 변이체는 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다. 예를 들어, 표준 서열 비교 기법에 의해 결정되는, 본원에 개시된 서열의 특유의 부분서열도 또한 본 발명에 포함된다.

보존적 변이체

유전 암호의 퇴화로 인해, "침묵 치환"(즉, 코딩된 폴리펩티드에서의 변형을 초래하지 않는 핵산 서열에서의 치환)은 아미노산을 코딩하는 모든 핵산 서열의 함축된 특성이다. 유사하게, 아미노산 서열내 하나 또는 몇 개의 아미노산에서의 매우 유사한 성질을 가지는 다른 아미노산으로의 "보존적 아미노산 치환"은 또한 개시된 작제물과 매우 유사한 것으로 용이하게 확인된다. 각 개시된 서열의 그러한 보존적 변이체는 본 발명의 한 특성이다.

특별한 핵산 서열의 "보존적 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 당업자는 코딩된 서열에서의 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는 개별적 치환, 결실 또는 첨가가 "보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적으로 변형된 변이체"임을 인식할 것이며, 여기에서 변경은 아미노산의 결실, 아미노산의 첨가, 또는 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 초래한다. 따라서, 본 발명의 열거된 폴리펩티드 서열의 "보존적 변이체"는, 폴리펩티드 서열내 아미노산의 동일한 보존적 치환기의 보존적으로 선택된 아미노산으로의, 적은 백분율, 전형적으로는 5% 미만, 더욱 전형적으로는 4%, 2% 또는 1% 미만의 치환을 포함한다. 핵산 분자의 코딩된 활성을 변경시키지 않는 서열의 첨가, 예컨대 비작용성 서열의 첨가는 기본 핵산의 보존적 변이체이다.

기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 당업자에게 공지되어 있다. 하기 8개 기는 상호 보존적 치환기인 아미노산을 각기 함유한다:

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소루이신(I), 루이신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)

(예를 들어, 문헌 [Creighton , Proteins : Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2^nd Edition (December 1993)] 참조)

핵산 혼성화

비교 혼성화를 이용하여, 본 발명의 핵산의 보존적 변이체를 포함하는, 본 발명의 핵산, 예컨대 서열 번호 1-3을 동정할 수 있고, 이러한 비교 혼성화 방법은 본 발명의 핵산을 구별하는 한 바람직한 방법이다. 또한, 고도, 초고도, 및/또는 초-초고도 엄격성 조건 하에서 서열 번호 1-3으로 표시되는 핵산에 혼성화되는 표적 핵산은 본 발명의 한 특성이다. 그러한 핵산의 예에는 소정의 핵산 서열에 비해 1개 또는 몇 개의 침묵 또는 보존적 핵산 치환을 가지는 것들이 포함된다.

시험 핵산은, 완전히 매칭되는 상보적 표적에 대한 혼성화 대비, 프로브에 대해 ½ 이상으로 혼성화할 때, 즉 매칭되지 않는 표적 핵산 중 임의의 것에 대한 혼성화에서 관찰되는 비의 약 5x 내지 10x 이상인 신호 대 잡음비로 완전히 매칭되는 프로브가 완전히 매칭되는 상보적 표적에 결합하도록 하는 조건 하에서, 표적에 대한 프로브의 혼성화의 1/2 이상인 신호 대 잡음비를 가질 때, 프로브 핵산에 특이적으로 혼성화한다고 일컬어진다.

핵산은 그것이 전형적으로 용매 중 연합할 때, "혼성화"한다. 핵산은 각종 잘 특징분석된 물리화학적 힘, 예컨대 수소 결합, 용매 배제, 염기 적층 등으로 인해 혼성화한다. 어구 "엄격한 혼성화 조건"은 당업계에 공지된 바와 같은 저이온성 강도 및 고온의 조건을 가리킨다. 전형적으로, 엄격한 조건 하에 프로브는 핵산(전 세포내 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나 이들에 한정되지 않음)의 착 혼합물 내의 그것의 표적 부분서열에 혼성화하나, 착 혼합물 내의 다른 서열에는 혼성화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 서열이 길수록, 특이적으로 혼성화하는 온도가 더 높다. 핵산의 혼성화에 대한 광대한 지침이 문헌[Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," (Elsevier, New York)]; 및 [Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995)]에 나와 있다. 문헌[Hames and Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England, (Hames and Higgins 1)] 및 [Hames and Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (Hames and Higgins 2)]는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 DNA 및 RNA의 합성, 표지화, 검출 및 정량화에 대한 상세 내용을 제공한다 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점(T_m)보다 약 5 내지 10℃가 더 낮도록 선택된다. T_m은 표적에 대해 상보적인 프로브의 50%가 평형 하에 표적 서열에 혼성화하는 (한정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서의) 온도이다(T_m에서 표적 서열이 과량으로 존재할 때, 프로브의 50%가 평형 하에 놓이게 된다). 엄격한 조건은, 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 통상적으로는 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도(또는 기타 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예를 들어, 약 10 내지 50개 뉴클레오티드)에서 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브(예를 들어, 약 50개 초과의 뉴클레오티드)에서 약 60℃ 이상인 조건이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 통상적으로 2배 이상의 백그라운드, 바람직하게는 10배 이상의 백그라운드 혼성화일 수 있다. 예시적 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5× SSC, 및 1% SDS, 42℃에서의 항온배양, 또는 5× SSC, 1% SDS, 0.2× SSC에서의 세척과 함께 65℃에서의 항온배양, 및 65℃의 0.1% SDS. 상기 세정은 5 세척은 5분, 15분, 30분, 60분, 120분 또는 그 이상 동안 수행될 수 있다.

써던(southern) 및 노던(northern) 블로트 내 필터 상에 100개 초과의 상보적 잔기를 가지는 상보적 핵산의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 한 예는, 42℃에서의 1 mg의 헤파린을 가지는 50% 포르말린이고, 여기에서 혼성화는 하룻밤 동안 수행된다. 엄격한 세정 조건은 15분 동안 65℃에서 0.2× SSC 세정하는 것이다(SSC 완충액의 대한 설명을 위해 [Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual (3rd, 2001)]를 참조한다). 종종 고 엄격성 세정 전에, 저 엄격성 세정이 선행되어, 배경 프로브 신호를 제거한다. 한 예로서의 저 엄격성 세정은 15분 동안 40℃에서 2× SSC를 이용하여 세정하는 것이다. 일반적으로, 특별한 혼성화 검정에서 비관련 프로브에 대해 관찰되는 것보다 5×(또는 그 이상) 더 높은 신호 대 잡음비는 특정 혼성화의 검출을 가리킨다.

써던 또는 노던 혼성화와 같은 핵산 혼성화 실험의 맥락에서의 "엄격한 혼성화 세정 조건"은 서열 의존적이고, 상이한 환경 매개변수 하에서 상이하다. 보다 긴 서열은 특별히 보다 높은 온도에서 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 자세한 지침이 [Tijssen (1993), 상기 동일] 및 [Hames and Higgins, 1 및 2]에 나와 있다. 엄격한 혼성화 및 세정 조건은 임의의 시험 핵산에 대해 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 매우 엄격한 혼성화 및 세정 조건을 결정할 때, 선택된 기준 세트가 충족될 때까지, 혼성화 및 세정 조건을 (예를 들어, 혼성화 또는 세정 시에 온도 증가, 염 농도 감소, 세제 농도 증가, 및/또는 포르말린과 같은 유기 용매의 농도 증가에 의해) 점차적으로 증가시킨다. 예를 들어, 매칭되지 않은 표적에 대한 프로브의 혼성화에서 관찰되는 것의 5× 이상인 신호 대 잡음비로 프로브가 완전히 매칭되는 상표적 표적에 결합할 때까지, 혼성화 및 세정 조건을 점차적으로 증가시킨다.

"매우 엄격한" 조건은 특별한 프로브에 대한 열 융점 온도(T_m)과 동등하도록 선택된다. T_m은 시험 서열의 50%가 완전히 매칭되는 표적에 혼성화하는 (한정된 이온 강도 및 pH 하에서의) 온도이다. 본 발명의 목적상, 일반적으로, "매우 엄격한"혼성화 및 세정 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 T_m보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다.

"초고도 엄격성" 혼성화 및 세정 조건은, 혼성화 및 세정 조건의 엄격성이 완전히 매칭되는 상보적 표적 핵산에 대한 프로브의 결합을 위한 신호 대 잡음비가 매칭되지 않은 표적 핵산들 중 임의의 것에 대한 혼성화에서 관찰되는 비의 10x 이상이 될 때까지 증가되는 조건이다. 완전히 매칭되는 상보적 표적 핵산의 비의 1/2 이상인 신호대 잡음비로 상기 조건 하에서 프로브에 혼성화하는 표적 핵산은 초고도 엄격성 조건 하에서 프로브에 결합한다고 일컬어진다.

유사하게, 더 높은 엄격성 수준은 관련 혼성화 검정의 혼성화 및/또는 세정 조건을 점차적으로 증가시킴으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 완전히 매칭되는 상보적 표적 핵산에 대한 프로브의 결합을 위한 신호 대 잡음비가, 매칭되지 않은 표적 핵산들 중 임의의 것에 대한 혼성화에서 관찰되는 비의 적어도 10×, 20×, 50×, 100× 또는 500× 또는 그 이상일 때까지, 혼성화 및 세정 조건의 엄격성을 증가시키는 조건이다. 완전히 매칭되는 상보적 표적 핵산의 비의 ½ 이상인 신호 대 잡음비로 상기 조건 하에서 프로브에 혼성화하는 표적 핵산은, 초-초고도 엄격성 조건 하에서 프로브에 결합한다고 일컬어진다.

엄격한 조건 하에서 상호에 대해 혼성화하지 않는 핵산은, 그것이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 경우, 여전히 실질적으로 동일하다. 이는, 예컨대 유전 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 퇴화를 이용하여 핵산의 카피가 생산될 때 일어난다.

특유의 부분서열

하나의 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 O-tRNA 및 O-RS의 서열로부터 선택되는 핵산내 특유의 부분서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 특유의 부분서열은 임의의 공지된 O-tRNA 또는 O-RS 핵산 서열에 상응하는 핵산에 비해 독특하다. 매개변수의 디폴트를 위해 예컨대, BLAST 세트를 이용하여 정렬을 수행할 수 있다. 임의의 독특한 부분서열은, 예컨대 본 발명의 핵산을 동정하기 위한 프로브로서 유용하다.

유사하게, 본 발명은 본원에 개시된 O-RS의 서열로부터 선택되는 폴리펩티드 내 특유의 부분서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 여기에서, 특유의 부분서열은 공지된 폴리펩티드 서열들 중 임의의 것에 상응하는 폴리펩티드에 비해 독특하다.

본 발명은 또한 O-RS의 서열로부터 선택되는 폴리펩티드 내 특유의 부분서열을 코딩하는 특유의 코딩 올리고뉴클레오티드에 대해, 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 표적 핵산을 제공하며, 여기에서 특유의 부분서열은 조절 폴리펩티드(예를 들어, 본 발명의 합성효소가 예컨대, 돌연변이화에 의해 유도되도록 하는 모 서열) 중 임의의 것에 상응하는 폴리펩티드에 비해 독특하다. 특유의 서열은 상기 방식으로 결정된다.

서열 비교, 동일성 및 상동성

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일도 %"는 하기 서열 비교 알고리즘(또는 당업자가 이용가능한 기타 알고리즘) 중 하나를 사용하거나, 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해 측정시에, 비교 창 또는 지정된 영역에 대한 최대 상응에 대해 비교하고 정렬할 때, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 %를 가지거나, 동일한 2개 이상의 서열 또는 부분서열을 지칭한다.

2개의 핵산 또는 폴리펩티드(예를 들어, O-tRNA 또는 O-RS를 코딩하는 DNA, 또는 O-RS의 아미노산 서열)와 관련하여 어구 "실질적으로 동일한"은 서열 비교 알고리즘(또는 당업자에 의해 이용가능한 기타 알고리즘)을 사용하거나, 수동 정렬 및 시각적 조사에 의해 측정시에, 비교 창 또는 지정된 영역에 대한 최대 상응에 대해 비교하고 정렬할 때, 적어도 약 60%, 약 80%, 약 90 내지 95%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가지는 2개 이상의 서열 또는 부분서열을 지칭한다. 그러한 "실질적으로 동일한" 서열은 전형적으로 실제 조상과 무관하게 "상동"인 것으로 간주된다. "실질적 동일성"은 약 50개 이상의 잔기 길이인 서열 영역, 약 100개 이상 잔기의 영역, 또는 약 150개 이상 잔기의 영역, 또는 비교하는 2개 서열의 전체 길이에서 존재할 수 있다.

서열 비교 및 상동성 결정을 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열을 비교하기 위한 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 부분 서열 좌표를 지정하며, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기초로 하여 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성 %을 계산한다.

비교를 위한 서열의 정렬 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예컨대, 문헌[Smith and Waterman Adv . Appl . Math. 2:482c (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch J. Mol . Biol . 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman Proc . Nat'l . Acad. Sci . USA 85; 2444 (1988)]의 유사성 방법 탐색, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(문헌[Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 시각적 조사(예를 들어, 문헌[Ausubelet al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 부록)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.

서열 동일성(%) 및 서열 유사성을 결정하는데 적당한 알고리즘의 한 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이는 문헌[Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res . 25:3389-3402] 및 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol . 215:403-410]에 각기 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어가 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개 입수가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열내 동일한 길이의 단어로 정렬될 때, 일부 양의 값 역치 스코어 T를 매칭시키거나 만족시키는, 질의 서열내 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 하이 스코어링 서열 쌍(HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 스코어 역치(neighborhood word score threshold)로 칭해진다 [Altschul et al., 상기 동일]. 이러한 초기 이웃 단어 일치(word hit)는 그것을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하는 종(seed)으로서 작용한다. 이어서, 단어 일치를 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 연장시킨다. 뉴클레오티드 서열에 대해 매개변수 M(매칭하는 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 > 0) 및 N(매칭하지 않는 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0)을 이용하여 누적 스코어를 계산한다. 아미노산 서열에 대해, 스코어링 행렬을 이용하여, 누적 스코어를 계산한다. 누적 정렬 스코어가 최대 달성된 값에서 양 X만큼 떨어질 때; 1 이상의 음의 스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 스코어가 0 이하로 떨어질 때; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달할 때, 각 방향으로의 단어 일치 연장을 중단한다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열을 위한) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. BLASTP 프로그램은 아미노산 서열에 대해, 디폴트로서 3의 단어 길이, 및 10의 기대치(E), 및 50의 BLOSUM62 스코어링 행렬(문헌[Henikoff and Henikoff(1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915] 참조) 정렬(B), 10의 기대치(E), M=5, N=-4, 및 양 나선의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘은 전형적으로 "저착화성" 필터를 작동시키지 않고 수행된다.

서열 동일성 %의 계산에 부가하여, BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul Proc . Nat'l . Acad. Sci . USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 척도는 최소 총 확률(P(N))이며, 이는 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 일어날 수 있는 확률을 가리킨다. 예를 들어, 핵산은 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소의 합 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우, 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.

돌연변이유발 및 기타 분자 생물학적 기법

본 발명에 사용되는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 분자 생물학적 기법을 이용하여 조작될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 통상적인 방법에 따라 부위-지정 돌연변이유발에 의해 편리하게 변형될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않은 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기에서 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 디자인되며, 바람직하게는, 재조합 폴리펩티드가 생산되는 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택한다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 부분에 대한 수개의 소형 올리고뉴클레오티드 코딩은 PCR, 결찰 또는 결찰 연쇄 반응에 의해 합성되고, 조립될 수 있다. 예를 들어, (문헌[Barany, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . 88:189-193(1991)]; 및 미국 특허 제6,521,427호(본원에 참조 인용됨))를 참조한다.

본 발명은 재조합 유전학 분야의 통상의 기법을 사용한다. 본 발명에 사용되는 일반적 방법을 개시하는 기본서는 (문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual (3rd 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]을 포함한다.

분자 생물학적 기술을 설명하는 일반 문헌은 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques . Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)]; [Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual (2 nd Ed .), Vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook")]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1999년 부록)("Ausubel")] 포함한다. 이러한 문헌들은, 예컨대 선택된 아미노산(예를 들어, 비천연 아미노산), 오르소고날 tRNA, 오르소고날 합성효소 및 이들의 쌍을 포함하는 단백질을 생산하기 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 발생과 관련된 돌연변이유발, 벡터의 사용, 프로모터 및 다수의 다른 관련 주제를 기재하고 있다.

각종 유형의 돌연변이유발은 신규 합성효소 또는 tRNA의 생산, tRNA 분자의 돌연변이화, tRNA의 라이브러리 생산, RS 분자의 돌연변이화, 합성효소의 라이브러리 생산, 셀렉터 코돈 생산, 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드에서 선택된 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈 삽입을 포함하나 이에 한정되지 않은 각종 목적을 위해 본 발명에 사용된다. 이들은 부위지정, 무작위 점 돌연변이유발, 동족 재조합, DNA 셔플링 또는 다른 재귀적 돌연변이유발, 키메라 구성, 주형을 함유하는 우라실을 사용한 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 포스포로티오에이트변형 DNA 돌연변이유발, 갭이 있는 이중체 DNA를 사용한 돌연변이유발 등 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가적인 적합한 방법은 점 미스매치 수복, 수복-결핍 숙주 균주를 사용한 돌연변이유발, 제한-선택 및 제한-정제, 결실 돌연변이유발, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이유발, 이중 가닥 파괴 수복 등을 포함한다. 키메라 작제물의 이용을 포함하나 이에 한정되지 않은 돌연변이유발도 본 발명에 포함된다. 한 실시양태에서, 서열, 서열 비교, 물리적 성질, 2차, 3차 또는 4차 구조, 결정 구조 등을 포함하나 이에 한정되지 않은 천연 발생 분자, 또는 변형 또는 돌연변이화된 천연 발생 분자의 공지된 정보에 의해 돌연변이유발을 주도할 수 있다.

본원에서 발견되는 문헌 및 일례들은 이러한 절차를 기재한다. 하기 발행물 및 그 안에 언급된 참조문헌에 추가적 정보가 나와 있다: 문헌[Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem . 254(2):157-178 (1997)]; [Dale et al., Oligonucleotide - directed random mutagenesis using the phosphor Othioate method , Methods Mol . Biol . 57:369-374 (1996)]; [Smith, In vitro mutagenesis, Ann . Rev . Genet. 19:423-462 (1985)]; [Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis , Science 229:1193-1201 (1985)]; [Carter, Site - directed mutagenesis, Biochem . J. 237:1-7 (1986)]; [Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.MJ. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)]; [Kunkel, Rapid and efficient site - specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:488-492 (1985)]; [Kunkel et al., Rapid and efficient site - specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol, 154, 367-382 (1987)]; [Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA - binding specificities, Science 242:240-245 (1988)]; [Zoller & Smith, Oligonucleotide - directed mutagenesis using M13' - derived vectors : an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)]; [Zoller & Smith, Oligonucleotide - directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol . 100:468-500 (1983)]; [Zoller & Smith, Oligonucleotide - directed mutagenesis : a simple method using two oligonucleotide primers and a single - stranded DNA template, Methods in Enzymol . 154:329- 350 (1987)]; [Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, NucL Acids Res . 13:8749-8764 (1985)]; [Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide - directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl . Acids Res . 13:8765-8785 (1985)]; [Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide - directed mutagenesis, Nucl . Acids Res . 14:9679-9698 (1986)]; [Sayers et al., 5'-3' Exonucleases in phosphor othioate - based oligonucleotide - directed mutagenesis , Nucl. Acids Res . 16:791-802 (1988)]; [Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate - containing DNA by reaction with restriction endonuchases in the presence ofethidium bromide , (1988) Nucl . Acids Res . 16:803-814]; [Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide - directed mutation construction, Nucl . Acids Res . 12:9441-9456 (1984)]; [Kramer & Fritz, Oligonucleotide - directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol . 154:350-367 (1987)]; [Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations , Nucl . Acids Res . 16:7207 (1988)]; [Fritz et al., Oligonucleotide - directed construction of mutations ]; [a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro , Nucl . Acids Res . 16:6987-6999 (1988)]; [Kramer et al., Different base / base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl - directed DNA mismatch - repair system of E. colt, Cell 38:879-887 (1984)]; [Carter et al., Improved oligonucleotide site - directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res . 13:4431-4443 (1985)]; [Carter, Improved oligonucleotide -directed mutagenesis using M13 vectors , Methods in Enzymol. 154:382-403 (1987)]; [Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl . Acids Res . 14:5115 (1986)]; [Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin , Phil. Trans . R. Soc . Lond. A 317:415-423 (1986)]; [Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223:1299-1301 (1984)]; [Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha - subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide - binding protein ( transducin ), Nucl . Acids Res . 14:6361-6372 (1988)]; [Wells et al., Cassette mutagenesis : an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites , Gene 34:315-323 (1985)]; [Grundstrom et al., Oligonucleotide - directed mutagenesis by microscale ' shot -gun' gene synthesis, Nucl . Acids Res . 13:3305-3316 (1985)]; [Mandecki, Oligonucleotide-directed double - strand break repair in plasmids of Escherichia coli : a method for site - specific mutagenesis, Proc . Natl . Acad . Sci. USA , 83:7177-7181 (1986)]; [Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993)]; [Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001)]; [W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994)]; 및 [I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)]). 상기 방법들 중 다수의 방법에 대한 추가적인 상세 내용을, 각종 돌연변이유발을 이용한 타결 문제점에 대한 유용한 조절을 또한 기재하고 있는 문헌[Methods in Enzymology Volume 154]에서 찾아볼 수 있다.

예를 들어, 합성효소를 돌연변이화하거나, tRNA를 변경시키는, 예를 들어 본 발명의 돌연변이유발에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 예를 들어, 문헌[Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)]에 기재된 바와 같은 자동화 합성장치를 이용하여, 문헌[Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862 (1981)]에 기재된 고체상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성된다.

또한, 본질적으로 임의의 핵산을 각종 상업적 공급원, 예컨대 더 미들랜드 써티파이드 리에이전트 컴퍼니(The Midland Certified Reagent Company)(mcrc@oligos.com), 더 그레이트 어메리칸 진 컴퍼니(The Great American Gene Company)(www.genco.com), 익스프레스젠 인코포레이티드(ExpressGen Inc.)(www.expressgen.com), 오페론 테크놀로지스 인코포레이티드(Operon Technologies Inc.)(미국 캘리포니아주 알라메다 소재) 및 기타 다수의 회사들 중 임의의 회사로부터 고객 주문하거나 표준 주문할 수 있다.

본 발명은 또한 오르소고날 tRNA/RS 쌍을 통한 비천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 진핵생물 숙주 세포, 비진핵생물 숙주 세포 및 유기체에 관한 것이다. 숙주 세포는, 예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 작제물을 사용하여 유전조작(형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 포함하나 이에 한정되지 않음)된다. 예를 들어, 오르소고날 tRNA, 오르소고날 tRNA 합성효소, 및 유도체화되는 단백질에 대한 코딩 영역은 원하는 수죽 세포내에서 작용성인 유전자 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지, 박테리아, 바이러스, 나형 폴리뉴클레오티드 또는 접합된 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 전기천공법(문헌[From et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 82, 5824 (1985)]), 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비드 또는 입자의 매트릭스내 또는 표면 상에서 핵산을 사용하여 작은 입자에 의한 고속 탄동 침투(문헌[Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)] )등을 비롯한 표준 방법에 의해 벡터를 세포 및/또는 미생물에 도입시킨다.

표적 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 수가지 공지 방법이 이용가능하며, 이들 중 임의의 방법이 본 발명에 이용될 수 있다. 이 방법에는 수여자 세포의 DNA 포함 박테리아 원형질과의 융합, 전기천공법, 발사 포격 및 (이하에 다시 논의되는) 바이러스 벡터 등이 포함된다. 박테리아 세포는 본 발명의 DNA 구축물을 포함하는 플라스미드의 수를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 박테리아는 로그 상태로까지 성장하고, 박테리아 내의 플라스미드는 당업계에 공지된 각종 방법들에 의해 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook] 참조). 또한, 박테리아로부터 플라스미드를 정제하기 위한 키트의 다혈증이 시중 입수가능하다(예를 들어, 이지프렙™, 플렉시프렙™(양자 모두 파마시아 바이오테크 제품); 스트라타클린™(스트라타젠 제조); 및 키아프렙™(키아겐 제조). 이어서, 단리되고 정제된 플라스미드를 다른 플라스미드를 생성하도록 더욱 조작하고, 세포를 형질감염시키기 위해 사용하거나 관련 벡터에 도입되어 유기체를 감염시킬 수 있다. 전형적 벡터는 전사 및 번역 종결부위, 전사 및 번역 개시 서열, 및 특별한 표적 핵산의 발현의 제어에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 임의적으로 하나 이상의 독립적 종결부위 서열을 함유하는 포괄적 발현 카세트, (셔틀 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않음) 진핵생물, 또는 원핵생물, 또는 양자 모두 내의 카세트의 복제를 허용하는 서열, 및 원핵생물 및 진핵생물 시스템 모두를 위한 선택 마커를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물, 또는 바람직하게는 양자 모두에서의 복제 및 일체화에 적당하다. 문헌[Gillam & Smith, Gene 8:81(1979)]; [Roberts et al., Nature, 328:731(1987)]; 문헌[Schneider, E. et al., Protein Expr . Purif . 6(1)10-14(1995)]; 문헌[Ausubel, Sambrook, Berger](모두 이하 동일)]을 참조한다. 클로닝에 유용한 박테리아 및 박테리오파지의 카달로그가 예컨대, ATCC에 의해 제공되며, 예를 들어 ATCC에 의해 발행되는 문헌[The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992) Gherna 등(편저)]이 있다, 예컨대 분자 생물학의 시퀀싱, 클로닝 및 기타 측면, 및 이론적 고려사항의 기초가 되는 부가적 기본 절차가 또한 문헌[Watson et al.(1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에 나와 있다. 또한, 본질적으로 임의의 핵산 (및 표준 또는 비표준 불문의 실질적으로 임의의 표지된 핵산)은 더 미들렌드 서티파이드 리에이전트 컴퍼니(The Midland Certified Reagent Company(미국 텍사스주 미들랜드 소재, mcrc.com의 웹사이트 상에 이용가능함), 더 그레잇 아메리칸 젠 컴퍼니(The Great American Gene Company(미국 캘리포니아주 라모나 소재, genco.com의 웹사이트 상에 이용가능함), ExpressGen Inc.(미국 일리노이즈주 시카고 소재, expressgen.com의 웹사이트 상에 이용가능함), 오페론 테크놀로지즈 인코포레이티드(Operon Technologies Inc.)(미국 캘리포니아주 알라메다 소재), 및 기타 많은 회사들과 같은 각종 상업적 출처들 중 임의의 출처로부터 고객 주문되거나 표준 주문될 수 있다.

조작된 숙주 세포는 예를 들어, 선별 단계, 프로모터 활성화 단계 또는 형질 전환체 선택 단계와 같은 활동들에 적당하도록 개질된 통상적 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 이러한 세포는 유전자도입 유기체내에서 배양될 수도 있다. 예를 들어, 세포 분리 및 배양(예를 들어, 후속 핵산 분리)에 관한 기타 유용한 참조 문헌으로서는 다음의 문헌들을 포함한다(문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3rd, Wiley-Liss, New York] 및 여기에 인용된 참조 문헌들; [Payne et al., (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY]; [Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell , Tissue and Organ Culture]; [Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)], 및 [Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]).

생체내 비천연 아미노산을 단백질에 직접 도입시키는 능력은 돌연변이 단백질의 고수율 수득, 기술적 용이성, 돌연변이 단백질의 세포내 또는 생 유기체내 연구 가능성 및 치유적 치료법에서의 돌연변이 단백질의 사용과 같은 매우 다양한 이점들을 제공한다. 각종 크기, 산성도, 친핵성, 소수성 및 기타 특성을 가지는 비천연 아미노산을 단백질에 도입하는 능력은, 단백질 기능을 탐침하고 새로운 성질을 가지는 신규의 단백질 또는 유기체를 생성시키기 위하여, 단백질 구조를 합리적으로, 또한 체계적으로 조작하는 능력을 크게 확장할 수 있다.

관심의 대상이 되는 단백질 및 폴리펩티드

비천연 아미노산의 도입은 단백질 구조 및/또는 기능의 변화를 조정하거나, 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 프로테아제 표적 부위의 접근성, 부분(단백질 어레이에 대한 경우를 포함하나 이에 한정되지 않음)에 대한 표적화, 생물학적 활성 분자의 첨가, 중합체의 부착, 방사성 핵종의 부착, 혈청 반감기의 조절, 조직 투과(예를 들어, 종양)의 조절, 활성 수송의 조절, 조직, 세포 또는 기관 특이성 또는 분포의 조절, 면역원성의 조절, 프로테아제 내성의 조절 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 목적을 위해 수행될 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 증진되거나 심지어 완전히 신규한 촉매적 성질 또는 생체물리적 성질을 가질 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 단백질에 포함시킴으로써 하기 성질들이 임의적으로 변형된다: 독성, 생체 분포, 구조적 성질, 분광학적 성질, 화학적 및/또는 광화학적 성질, 촉매적 능력, 반감기(혈청 반감기를 포함하나, 이러한 에 한정되지 않는다), 공유적으로 또는 비공유적으로(단, 이에 한정되지 않는다) 반응할 수 있는 다른 분자와 반응할 수 있는 능력 등. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 신규한 치료제, 진단제, 촉매 작용 효소, 산업용 효소, 결합 단백질 (항체를 포함하나 이에 한정되지 않음), 및 단백질 구조 및 기능의 연구(단, 이에 한정되지 않는다)에 유용하다. 예를 들어, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4:645-652]을 참조한다.

단백질은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는, 1개 이상의 개수의 비천연 아미노산을 가질 수 있다. 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개, 또는 그 이상 개수의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개, 또는 그 이상 개수의 상이한 부위가 존재할 수 있는 경우를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 단백질은, 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중 하나 이상, 단, 그보다 적은 수가 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 1개 초과의 비천연 아미노산을 가지는 소정의 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다(단백질은 2개 이상의 상이한 유형의 비천연 아미노산을 포함하거나, 2개의 동일한 비천연 아미노산을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다). 2개 초과의 비천연 아미노산을 가지는 소정의 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나 상이하거나, 또는 하나 이상의 상이한 비천연 아미노산과 동일한 종류로 된 다수의 비천연 아미노산의 조합일 수 있다.

하나 이상의 비천연 아미노산을 가지는 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 진핵세포에서 생산함으로써, 단백질 또는 폴리펩티드는 전형적으로 번역후 진핵세포 변형을 포함하게 된다. 특정 실시양태에서, 단백질은 하나 이상의 비천연 아미노산, 및 진핵세포에 의해 생체내 생성된 하나 이상의 번역후 변형을 포함하며, 여기에서 번역후 변형은 원핵세포에 의해서는 이루어지지 않는다. 예를 들어, 번역 후 변형은 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질-연결 변형, 글리코실화 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 것들을 포함한다. 또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 전구체(칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 전구체, 전전구부갑상선 호르몬, 전전구인슐린(preproinsulin), 전구인슐린(proinsulin), 전전구-오피오멜라코르틴(preproopiomelanocortin), 전구-오피오멜라코르틴(pro-opiomelanocortin) 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)의 단백질분해 처리, 다중 서브유닛 단백질 또는 거대분자 어셈블리로의 조립, 세포 중의 또 다른 부위로(소기관, 예를 들어 소포체, 골지체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등으로, 또는 분비성 경로를 통하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음) 번역시키는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질은 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합체 등을 포함한다.

특정 위치에서의 선택된 아미노산으로 세포내 단백질을 생산하는 방법도 또한 본 발명의 한 특성이다. 예를 들어, 방법은 한 적절한 매질 내에서, 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하고 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 성장시키고; 선택된 아미노산을 제공하는 것(여기에서, 세포는 세포내에서 작용하고 셀렉터 코돈을 인식하는 오르소고날 tRNA(O-tRNA); 및 선택된 아미노산으로 O-tRNA를 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 추가로 포함한다)을 포함한다. 전형적으로, O-tRNA는 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 동족 합성효소의 존재 하에 억제 활성을 포함한다. 이러한 방법에 의해 생산된 단백질도 또한 본 발명의 한 특성이다.

본 발명의 조성물, 및 본 발명의 방법에 의해 제조된 조성물은 임의적으로 세포내에 있다. 본 발명의 O-tRNA/ORS 쌍 또는 개별 성분을 숙주 시스템의 번역 기구에 사용될 수 있고, 이에 따라 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산이 단백질 내로 도입되게 된다. 특허 출원 USSN 제10/825,867호(발명의 명칭: "Expanding the Eukaryotic Genetic Code") 및 제10/126,927호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS")는 상기 공정을 기재하고 있고, 본원에 참조 인용된다. 예를 들어, O-tRNA/O-RS 쌍이 숙주, 예컨대 에쉐리키아 콜라이 에 도입될 때, 쌍은 셀렉터 코돈에 대한 반응으로, 성장 매질에 외인적으로 첨가될 수 있는, 선택된 아미노산, 예를 들어 비천연 아미노산, 예컨대 합성 아미노산, 예컨대 루이신 아미노산의 유도체가 단백질로 생체내 도입되도록 한다. 임의적으로, 본 발명의 조성물은 시험관내 번역 시스템, 또는 생체내 시스템(들) 내에 있을 수 있다.

선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산(및 예컨대, 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는, 임의의 상응하는 코딩 핵산)을 포함하는 임의의 단백질(또는 이의 부분)을 본원의 조성물 및 방법을 이용하여 생산할 수 있다. 임의의 폴리펩티드가 하나 이상의 선택된 아미노산을 도입하는데 적당하다. 예를 들어, 임의의 이용가능한 돌연변이 방법을 조정하여 관련 번역 시스템에 하나 이상의 적절한 셀렉터 코돈을 포함하도록 함으로써, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있는 수천만 가지의 공지 단백질을 동정하기 위한 시도는 없었다. 공지된 단백질을 위한 통상의 서열 정보저장소는 유전자은행 EMBL, DDBJ 및 NCBI를 포함한다. 인터넷 검색에 의해 기타 정보저장소도 용이하게 확인할 수 있다.

전형적으로, 단백질은 임의의 이용가능한 단백질(예를 들어, 치료 단백질, 진단 단백질, 산업적 효소 또는 이의 일부분 등) 에 대해, 예컨대 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상, 또는 그 이상의 동일성을 가지고, 하나 이상의 선택된 아미노산을 포함한다. 하나 이상의 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있는 치료, 진단 및 기타 단백질의 예는 USSN 제10/825,867호(발명의 명칭: "Expanding the Eukaryotic Genetic Code") 및 미국 특허 출원 일련 번호 제10/126,927호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS")에서 찾아볼 수 있으나, 이들 문헌에 한정되지 않는다.

특정 실시양태들에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물에서의 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드(또는 이의 일부분)는 핵산에 의해 코딩된다. 전형적으로, 핵산은 하나 이상의 셀렉터 코돈, 2개 이상의 셀렉터 코돈, 3개 이상의 셀렉터 코돈, 4개 이상의 셀렉터 코돈, 5개 이상의 셀렉터 코돈, 6개 이상의 셀렉터 코돈, 7개 이상의 셀렉터 코돈, 8개 이상의 셀렉터 코돈, 9개 이상의 셀렉터 코돈, 또는 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.

관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 당업자에게 공지되고, "돌연변이유발 및 기타 분자 생물학적 기법" 하에 기재된 방법을 이용하여, 예컨대 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산을 도입하기 위한 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이유발될 수 있다. 예를 들어, 관심의 대상이 되는 단백질을 위한 핵산은 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이유발되어, 하나 이상의 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산이 삽입되도록 한다. 본 발명은 예컨대, 하나 이상의 선택된 아미노산을 포함하는, 임의의 그러한 변이체, 예컨대 돌연변이체, 임의의 단백질의 양태를 포함한다. 유사하게, 본 발명은 상응하는 핵산, 즉 하나 이상의 선택된 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 가지는 임의의 핵산을 포함한다.

선택된 아미노산을 포함하는 단백질을 제조하기 위해, 오르소고날 tRNA/RS 쌍을 통해 선택된 아미노산을 생체내 도입하기 위해 적합화된 숙주 세포 및 유기체를 사용할 수 있다. 숙주 세포는 오르소고날 tRNA, 오르소고날 tRNA 합성효소, 및 유도체화되는 단백질을 코딩하는 벡터를 발현하는 하나 이상의 벡터로 유전적으로 조작(예를 들어, 형질전환, 신호전달 또는 형질감염)된다. 각각의 이러한 성분은 동일한 벡터 상에 있을 수 있거나, 각각은 분리된 벡터 상에 있을 수 있으며, 양 성분은 한 벡터 상에 있고, 제3 성분이 제2 성분 상에 있을 수 있다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지, 박테리아, 바이러스, 나형 폴리뉴클레오티드, 또는 접합된 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다.

교대 시스템

비재조합 숙주 세포, 돌연변이유발된 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는데 수개의 기법들이 사용되었다. 반응성 측쇄, 예를 들어 Lys, Cys 및 Tyr을 사용한 아미노산의 유도체화는 리신을 N²-아세틸-리신으로 전환시켰다. 화학적 합성은 또한 비천연 아미노산을 도입하는 직접적 방법을 제공한다. 펩티드 단편의 효소적 결찰, 및 본래의 화학적 결찰의 최근 개발로, 더 큰 단백질을 제조하는 것이 가능하다. 예를 들어, 문헌[P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu . Rev . Biochem., 69:923(2000)]을 참조한다. 화학적 펩티드 결찰 및 본래의 화학적 결찰이 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제6,184,344호, 미국 특허 공보 제2004/0138412호, 미국 특허 공보 제2003/0208046호, WO 02/098902, 및 WO 03/042235에 기재되어 있다. 원하는 비천연 아미노산으로 화학적으로 아실화된 억제제 tRNA를 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 첨가하는 일반적 시험관내 생합성 방법을 사용하여, 100개 초과의 비천연 아미노산을 실질적으로 임의의 크기의 각종 단백질에 부위 특이적으로 도입시켰다. 예를 들어, 문헌[V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew . Chem . Int . Ed . Engl ., 1995, 34; 621(1995)]; [C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz, A general method for site - specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188(1989)]; 및 [J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E. S. Diala, Biosynthetic site - specific incorporation of a non - natural amino acid into a polypeptide, J. Am . Chem . Soc. 111:8013-8014(1989)]을 참조한다. 단백질 안정성, 단백질 폴딩, 효소 기작 및 신호 전달의 연구를 위해 광범위한 범위의 작용기들을 단백질에 도입해왔다.

선택적 압력 도입으로 불리는 생체내 방법을 개발하여 야생형 합성효소의 무차별 혼합(promiscuity)을 이용하였다. 예를 들어, 문헌[N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13:41(1999)]을 참조한다. 세포에 특정 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 비작동(switched off) 영양요구성 균주는 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지에서 성장하고, 한편 표적 유전자의 전사는 억제된다. 정체 성장기의 개시 시에, 천연 아미노산은 고갈되고, 비천연 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질의 발현 유도는 비천연 유사체를 함유하는 단백질을 축적시키게 된다. 예를 들어, 이러한 기법을 사용하여, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌은 단백질로 도입되고, 용이하게 확인될 수 있는 UV 스펙트럼 중의 2개의 특징적인 숄더를 나타내며(예를 들어, 문헌[C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal . Biochem., 284:29(2000)] 참조), 트리플루오로메티오닌을 박테리오파지 T4 리소자임에서 메티오닌을 대체하는 데 사용하여 19F NMR에 의해 이의 키토-이당류 리간드와의 상호작용을 연구하였고(예를 들어, 문헌[H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404(1997)] 참조), 트리플루오로루이신을 루이신 대신 도입한 결과, 루이신-지퍼 단백질의 열 안정성 및 화학적 안정성이 증가되었다. 예를 들어, 문헌[Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew . Chem . Int . Ed . Engl ., 40:1494(2001)]을 참조한다. 더욱이, 셀레노메티오닌 및 텔루로메티오닌을 각종 재조합 단백질에 도입하여 X선 결정학에서의 위상의 해석을 용이하게 한다. 예를 들어, 문헌[W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665(1990)]; [J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat . Struct . Biol ., 1:283(1994)]; [N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur . J. Biochem ., 230:788(1995)]; 및 [N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol . Biol . 270; 616(1997)])을 참조한다. 또한, 알켄 또는 알킨 작용기를 가지는 메티오닌 유사체를 유효하게 도입함으로써, 화학적 수단에 의해 단백질을 추가적으로 변형시켰다. 예를 들어, 문헌[J. C. M. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett ., 428:68(1998)]; [J. C. M. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am . Chem . Soc ., 122:1282(2000)]; 및 [K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487(2000)]; 미국 특허 제6,586,207호; 및 미국 특허 공보 제2002/0042097호(본원에 참조 인용됨)를 참조한다.

이 방법의 성공은 아미노아실-tRNA 합성효소에 의한 비천연 아미노산 유사체의 인식에 따라 좌우되며, 이는 일반적으로 단백질 번역의 적합도를 보증하는 높은 선택성을 필요로 한다. 이러한 방법의 범위를 확장하는 한 방법은 아미노아실-tRNA 합성효소의 기질 특이성을 완화시키는 것이며, 이는 제한된 수의 경우들에서 달성되었다. 예를 들어, 에쉐리키아 콜라이 페닐알라닐-tRNA 합성효소(PheRS)에서 Gly에 의해 Ala²⁹⁴를 대체하는 경우, 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜 p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의해 tRNAPhe를 아실화시킨다. 문헌[M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107(1994)]을 참조한다. 이러한 돌연변이체 PheRS를 정박시키는 에쉐리키아 콜라이 균주는 페닐알라닌 대신 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 도입시킨다. 예를 들어, 문헌[M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272(1995)]; 및 [N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett ., 467:37(2000)])을 참조한다. 유사하게, 에쉐리키아 콜라이 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 결합 부위 근처의 점 돌연변이 Phe130Ser는 아자티로신을 티로신보다 유효하게 도입시키는 것으로 밝혀졌다. 문헌[F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil and S. Nishimura, J. Biol . Chem ., 275:40324(2000)]을 참조한다.

비천연 아미노산을 생체내에서 단백질에 도입시키는 또 다른 기법은 교정(proofreading) 기작을 가지는 합성효소를 변형시키는 것이다. 이러한 합성효소는 식별할 수 없기 때문에 동족 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이러한 오류는 별도의 부위에서 정정되며, tRNA로부터 잘못 충전된 아미노산을 탈아실화하여 단백질 번역의 적합도를 유지시킨다. 상기 합성효소의 교정 활성이 불능인 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 편집 기능을 벗어나 도입될 수 있다. 최근, 이러한 접근은 발릴-tRNA 합성효소(VaIRS)를 사용하여 입증되었다. 문헌[V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501(2001)]을 참조한다. VaIRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)를 사용하여 tRNAVal을 잘못 아미노아실화할 수 있고, 이러한 비동족 아미노산들은 추후 수정 도메인에 의해 가수분해된다. 에쉐리키아 콜라이 염색체의 무작위 돌연변이유발 후, ValRS의 수정 부위에서 돌연변이를 가지는 돌연변이체 에쉐리키아 콜라이 균주를 선택하였다. 이러한 수정-결손 ValRS는 tRNAVal을 Cys로 잘못 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys와 유사하게 때문에(Cys의 -SH 기는 Abu 중에서 -CH3로 대체됨), 돌연변이체 VaIRS는 또한 이러한 돌연변이체 에쉐리키아 콜라이 균주가 Abu의 존재 하에서 성장하는 경우 Abu를 단백질에 도입시킨다. 질량 분광 분석은 본래의 단백질의 각각의 발린 위치에서 발린 중 약 24%가 Abu로 대체됨을 나타내고 있다.

또한, 고체상 합성 및 반합성 방법도 신규한 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있게 하였다. 예를 들어, 하기와 같은 공보 및 여기에 인용된 참조 문헌을 참조한다: 문헌[Crick, F. J. C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232(1961)]; [Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides . XXXVI . The effect of pyrazole - imidazole replacements on the S- protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am . Chem, 88(24):5914-5919(1966)]; [Kaiser, E. T. Synthetic approaches to Biologically Active peptides and proteins including enzymes, Acc Chem Res , 22:47-54(1989)]; [Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E. T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 3808-3810(1987)]; [Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides : backbone -engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225(1992)]; [Chaiken, I. M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3):255-301(1981)]; [Offord, R. E. Protein engineering by chemical means ? Protein Eng., 1(3):151-157(1987)]; 및 [Jackson, D. Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243(1994)]).

보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 비롯한 각종 비천연 측쇄를 시험관내에서 단백질에 도입시키는 데 화학적 변형을 사용하였다. 예를 들어, 문헌[Corey, D. R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence - specific single-stranded deoxyribonuclease, Science. 238(4832):1401-1403 (1987)]; [Kaiser, E. T., Lawrence D. S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985)]; [Kaiser, E. T., Lawrence, D. S. Chemical mutation ofenyzme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984)]; [Neet, K. E., Nanci A, Koshland, D. E. Properties of thiol - subtilisin, J Biol . Chem . 243(24):6392-6401 (1968)]; [Polgar, L. et MX. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site . Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc . 88:3153-3154 (1966)]; 및 [Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science. 242(4881):1038-1040 (1988)])을 참조한다.

면역반응성에 의한 폴리펩티드 정의

본 발명의 폴리펩티드가 (예를 들어, 본원의 번역 시스템에서 합성된 단백질의 경우에는, 선택된 아미노산(예를 들어, 비천연 아미노산)을 포함하고, 예컨대 신규 합성효소, 표준 아미노산의 신규 서열을 포함하는 각종 신규 폴리펩티드 서열을 제공하기 때문에, 폴리펩티드는 또한 예컨대, 면역학적 검정으로 인식될 수 있는 신규 구조적 특성을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항혈청, 및 그러한 항혈청에 의해 결합되는 폴리펩티드의 생산은 본 발명의 한 특성이다. 본원에 사용되는 용어 "항체"는 분석물(항원)에 특이적으로 결합하고 인식하는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편에 의해 실질적으로 코딩되는 폴리펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 그 예는 다클론성, 단클론성, 키메라 및 단일 사슬 항체 등을 포함한다. Fab 단편, 및 파지 디스플레이를 포함하는 발현 라이브러리에 의해 생산되는 단편을 포함한, 면역글로불린의 단편 또한 본원에 사용되는 용어 "항체"에 포함된다. 항체 구조 및 용어에 대해, 예를 들어, 문헌[Paul, Fundamental Immunology , 4th Ed., 1999, Raven Press, New York]를 참조한다. 비천연 아미노산 및 면역학적 기법의 사용예가 WO/2009/099672(The Scripps Research Institute entitled Breaking Immunological Tolerance With a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid)에 제시되고, 전문이 본원에 참조 인용된다.

예를 들어, 본 발명은 아미노산 서열을 포함하는 면역원에 대해 생산된 항체 또는 항혈청에 특이적으로 면역반응성이거나 그것에 특이적으로 결합하는 본 발명의 tRNA 및/또는 RS를 이용하여 제조된 단백질 및 RS를 포함한다. 다른 동족과의 교차 반응성을 제거하기 위해, 항체 또는 항혈청을 이용가능한 단백질, 예컨대 야생형 폴리펩티드, 예컨대 "조절" 폴리펩티드 차감한다. 야생형 단백질이 핵산에 상응하는 경우, 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 생산되고, 항체/항혈청 차감 목적을 위해 사용된다.

한 전형적인 형태로, 면역검정법은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이의 실질적 부분서열(즉, 제공된 전장 서열의 약 30% 이상)에 대해 상승된 다클론성 항혈청을 사용한다. 단백질 유래의 잠재적 폴리펩티드 면역원의 세트는 이하 "면역원성 폴리펩티드"로 집합적으로 지칭된다. 수득되는 항혈청은 임의적으로 조절 합성효소 동족에 대한 낮은 교차 반응성을 가지도록 선택되고, 임의의 그러한 교차 반응성은 면역검정법에 다클론성 항혈청을 사용하기 전에, 조절 동족들 중 하나 이상을 사용하여, 예컨대 면역흡수에 의해 제거된다.

면역검정법에 사용하기 위한 항혈청을 생산하기 위해, 본원에 기재된 바대로 면역원성 폴리펩티드들 중 하나 이상을 생산하여 정제한다. 예를 들어, 재조합 단백질은 재조합 세포에서 생산된다. (마우스의 실제 유전적 동일성으로 인해 결과가 더욱 재현가능하기 때문에 본 검정법에 사용되는) 마우스의 교배 균주를, 표준 애주번트, 예컨대 프로인트 애주번트, 및 표준 마우스 면역화 프로토콜과 조합하여 면역원성 단백질(들)로 면역화한다(예를 들어, 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 항체 생산, 면역검정법 형태 및 조건의 표준 기재에 대해, 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York]을 참조한다.

항체에 대한 추가의 참조 및 논의가 또한 본원에 나와 있고, 이는 면역반응성에 의해 폴리펩티드를 한정하기 위해 여기에 적용될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 서열로부터 유래된 하나 이상의 합성 또는 재조합 폴리펩티드는 운반체 단백질에 접합되어, 면역원으로 사용된다.

다클론성 혈청을 수집하여, 면역검정법, 예를 들어 고체 지지체 상에 고정화된 면역원성 단백질 중 하나 이상을 이용한 고체상 면역검정법에 대해 적정한다. 10⁶ 이상의 역가를 가지는 다클론성 항혈청을 선택하고, 풀링하여, 조절 합성효소 폴리펩티드를 차감함으로써, 차감되고 풀링되며 적정된 다클론성 항혈청을 생산한다.

차감되고 풀링되며 적정된 다클론성 항혈청을 비교 면역검정법에서 조절 동족에 대한 교차 반응성에 대해 시험한다. 이러한 비교 검정에서, 조절 합성효소 동족에 대한 결합에 비해, 면역원성 단백질에 대한 적정된 다클론성 항혈청의 결합에 대해 적어도 약 5배 내지 10배 더 높은 신호 대 잡음비를 초래하는, 차감되고 적정된 다클론성 항혈청에 대한 차별적 결합 조건을 결정한다. 즉, 결합 반응의 엄격성은 알부민 또는 탈지분유와 같은 비특이적 경쟁자의 첨가, 및/또는 염 조건, 온도 등의 조정에 의해 조정될 수 있다. 이러한 결합 조건은, 시험 폴리펩티드(폴리펩티드는 면역원성 폴리펩티드 및/또는 조절 폴리펩티드와 비교됨)이, 풀링되고 차감된 다클론성 항혈청에 의해 특이적으로 결합되는지의 여부를 결정하기 위한 후속 검정법에 사용된다.

또 다른 예에서, 경쟁적 결합 형태에서 면역검정법을 시험 폴리펩티드의 검출에 사용한다. 예를 들어, 나와 있는 바와 같이, 조절 폴리펩티드를 이용한 면역흡수에 의해, 교차 반응 항체를 풀링된 항혈청 혼합물에서 제거한다. 이어서, 면역원성 폴리펩티드(들)를, 차감되고 풀링된 항혈청에 노출된 고체 지지체에 고정화한다. 시험 단백질을 차감되고 풀링된 항혈청에 결합하기 위해 경쟁하도록 검정에 첨가한다. 고정화된 단백질(들) 대비, 차감되고 풀링된 항혈청에 대해 경쟁하는 시험 단백질(들)의 능력을, 결합을 위해 경쟁하도록 검정에 첨가된 면역원성 폴리펩티드(들)(면역원성 폴리펩티드는 풀링된 항혈청에 결합하기 위해 고정화된 면역원성 폴리펩티드와 효과적으로 경쟁함)의 능력과 비교한다. 표준 계산법을 이용하여, 시험 단백질에 대한 교차 반응도 %를 계산한다.

병행 검정법에서, 풀링되고 차감된 항혈청에 결합하기 위해 경쟁하는 조절 단백질의 능력을, 임의적으로 항혈청에 결합하기 위해 경쟁하는 면역원성 폴리펩티드(들)의 능력과 비교하여 결정한다. 이에 다시, 표준 계산법을 이용하여, 조절 폴리펩티드에 대한 교차 반응도 %를 계산한다. 교차 반응도 %가 조절 폴리펩티드에 비해 시험 폴리펩티드의 교차 반응도 %의 적어도 5 내지 10x인 경우, 및/또는 시험 폴리펩티드의 결합이 면역원성 폴리펩티드의 결합 범위 내인 경우, 시험 폴리펩티드는 풀링되고 차감된 항혈청에 특이적으로 결합하는 것으로 일컬어진다.

일반적으로, 면역흡수되고 풀링된 항혈청을 본원에 기재된 경쟁적 결합 면역검정법에 사용하여, 임의의 시험 폴리펩티드를 면역원성 및/또는 조절 폴리펩티드(들)와 비교한다. 이러한 비교를 행하기 위해, 면역원성, 시험 및 조절 폴리펩티드는 광범위한 농도 범위에서 각기 검정되고, 예컨대 면역화된 대조, 시험 단백질 또는 면역원성 단백질에 대한 차감된 항혈청의 결합을 50% 억제하는데 필요한 각 폴리펩티드의 양은 표준 기법을 이용하여 결정된다. 경쟁 검정에서 결합을 위해 필요한 시험 폴리펩티드의 양이, 필요한 면역원성 폴리펩티드의 양의 2배 미만인 경우, 시험 폴리펩티드는 생산된 항체 면역원성 단백질에 대해 발생된 항체에 특이적으로 결합하는 것으로 일컬어지고, 단 그 양은 조절 폴리펩티드에서의 양의 약 5× 내지 10×로 높다.

하나의 추가의 특이성 결정법으로서, 풀링된 항혈청은, 면역흡수에 사용되는 면역원성 폴리펩티드(들)에 대한 생산된 면역원성 폴리펩티드 차감의 풀링된 항혈청의 결합이 검출가능하지 않거나 거의 검출가능하지 않을 때까지, (조절 폴리펩티드보다는) 면역원성 폴리펩티드(들)로 임의적으로 완전히 면역흡수된다. 이러한 완전 면역흡수된 항혈청을 시험 폴리펩티드와의 반응성에 대해 시험한다. 반응성이 관찰되지 않거나 거의 관찰되지 않을 경우(즉, 면역원성 폴리펩티드에 대한 완전 면역흡수된 항혈청의 결합에 대해 관찰되는 신호 대 잡음비의 2× 이하인 경우), 시험 폴리펩티드는 면역원성 단백질에 의해 도출되는 항혈청에 의해 특이적으로 결합된다.

단백질, 항체, 항혈청 등에 대한 추가의 상세 내용을 USSN 제10/825,867호(발명의 명칭: " Expanding the Eukaryotic Genetic Code"), WO 2002/085923(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"); 미국 특허 제6,927,042호(발명의 명칭: "Glycoprotein synthesis"); 및 미국 특허 출원 공보 제2004/0198637호(발명의 명칭: "Protein Arrays")(본원에 참조 인용됨)에서 찾아볼 수 있다.

키트

키트도 또한 본 발명의 한 특성이다. 예를 들어, 세포에서 하나 이상의 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 생산하기 위한 키트로서, O-tRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 OtRNA, 및/또는 O-RS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 O-RS를 함유하는 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 키트는 적어도 선택된 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 본 발명의 아미노아실화된 tRNA를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 단백질을 생산하기 위한 지시 물질을 추가로 포함한다.

하나의 추가의 예는, 무세포 번역 시스템에서 하나 이상의 선택된 아미노산, 예컨대 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 생산하기 위한 키트로서, O-tRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 O-tRNA, 및/또는 ORS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 O-RS를 함유하는 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 키트는 선택된 아미노산을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 본 발명의 아미노아실화된 tRNA를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 단백질을 생산하기 위한 지시 물질을 추가로 포함한다.

실시예

하기 실시예는 청구하는 발명을 예시하기 위해 제공되는 것으로서, 청구 발명을 제한하려는 것이 아니다. 당업자는 청구된 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있는, 각종 비결정적 매개변수들을 인식할 것이다.

실시예 1:

파라- 아세틸페닐알라닌에 대한 아미노아실 - tRNA 합성효소 선택

2개의 DNA 라이브러리를 비천연적으로 코딩된 아미노산인 파라-아세틸 페닐알라닌에 대한 아미노아실화-tRNA 합성효소에 대해 선별하였다. 이 라이브러리는 pBK 플라스미드에서 메타노코커스 잔나쉬이로부터의 티로실 tRNA 합성효소 유전자내 6개 돌연변이로 구성되었다.

5회 교대 실행의 선택, 즉 3회 양성, 2회 음성 선택으로 구성된 선택 절차를 수행하였다. 라이브러리를 1:1 비로 조합하였고, 양성 선택 세포주(양성 선택 플라스미드를 가지는 GeneHog, pREP)로 전기천공하였고, 적절한 항생제 및 비천연적으로 코딩된 아미노산 파라-아세틸페닐알라닌(pAF)을 가지는 최소 배지 플레이트(GMML) 상에 도말하였다. 플레이트를 약 40시간 동안 37℃에서 항온배양하였고, 이러한 시점에서 세포를 찰과도말(scraping)에 의해 회수하였다. DNA를 키아겐 미니-프렙(Mini-Prep) 절차를 이용하여 추출한 후, 아가로스 겔로 정제하여, 라이브러리 플라스미드 DNA를 단리하였다.

이어서, 이러한 DNA를 음성 선택 세포주(음성 선택 플라스미드 pBAD 유도체를 가지는 GeneHog)에 전기천공하였다. 이러한 형질전환체를 비천연적으로 코딩된 아미노산(pAF)없이 적절한 항생제가 있는 LB 플레이트 상에 도말하였다. 약 17시간 후에, 이러한 세포를 찰과도말에 의해 회수하였고, 플라스미드 DNA를 키아겐 미니-프렙 절차 및 아가로스 겔 정제를 이용하여 정제하였다.

후속 실행들의 선택 실행을 전기천공, 도말, 회수 및 DNA 정제의 동일한 방법을 이용하여 수행하였다. 마지막(제5회) 선택 실행에서, 최소 배지 플레이트 상에 도말된, 형질전환된 양성 선택 세포의 일련의 희석을 수행하였다. 이어서, 개별 콜로니를 선택하여, 밤새도록 96 웰에서 성장시켰다. 이어서, 이러한 블록을 비천연 아미노산 pAF가 존재 또는 부재하는, 다양한 농도의 클로람페니콜(양성 선택 항생제)이 있는 최소 배지 상에 반복 도말하였다. 37℃에서 약 40시간 동안 성장시킨 후, 플레이트를 시각적으로 비교하여, 어떤 콜로니가 최대의 클로람페니콜 농도에서 성장하였는지를 결정하였으나, 비천연적으로 코딩된 아미노산 pAF의 부재 하에서는 성장하지 않았거나 잘 성장하지 않았다. 이러한 기준을 충족하는 콜로니를 밤새도록 성장시켰다. DNA를 미니-프렙 및 아가로스 겔 정제에 의해 배양물로부터 단리하였고, 시퀀싱하였다.

pAF에 대한 이러한 선택으로부터, 13개의 클론이 특유의 아미노산 서열을 가지는 것으로 나타났고, 후속하여 특징분석하여, pAF-tRNA 합성효소의 적합도 및 가공성을 결정하였다.

이 합성효소를 특징분석하기 위해, 작은 스케일의 앰버 억제를 수행하였고, 이에 비천연적으로 코딩된 아미노산 pAF이 폴리펩티드에 도입된 것으로 나타났으며, 결과를 SDS-PAGE에 의해 가시화하였다. 단일 콜로니를 선택하여 LB 브로쓰에서 밤새도록 성장시켰고, 이를 이어서 50 mL의 LB를 접종하기 위해 사용하였다. 세포를 0.3 내지 0.4의 OD로 성장시켰고, 이러한 시점에서 1.5 mL 분취량을 유도전 시점으로 하였고, 배양물을 2개 플라스크로 나누었다. 1 mM pAF를 한 분량(split)에 첨가하였고, 양자 모두를 30분 동안 성장시켰다. 30분 동안 성장시킨 후, 양 배양물(+/-pAF)를 0.2% L-아라비노스로 유도하였고, 4.5시간 동안 성장시켰으며, OD₆₀₀을 기록하였다. 이어서, 1.5 mL 분취량을 SDS-PAGE 분석용 +/-pAF 플라스크에 취했다.

1.5 mL 분취량(유도전, +pAF, -pAF)을 10분 동안 10,000×g으로 원심분리하여, 세포를 펠렛화하였다. 이어서, 세포를, 회수 시에 그의 OD₆₀₀에 대한 상대량으로 비례적 박테리아 단백질 추출 시약(BPER, 피어스(Pierce))에 현탁시켰다. DNase I를 용해된 세포에 첨가하여, 20분 동안 4℃에서 항온배양하였다. 이어서, 샘플을 환원제 및 로딩 염색과 조합하여, 30분 동안 MES 완충액에서 4 내지 12% 비스-트리스 상에 실행시켰다. 겔을 10분 동안 2회 DI H2O로 세정하였고, 쿠마씨 블루 염료로 염색하였다. +/-pAF 밴드를 AF의 도입을 초래하는 pAF-tRNA RS의 적합도에 대해 비교하였고, +pAF 밴드를 이전 선택된 pAF-tRNA RS와 비교하였다.

RS의 가공성을 확인하기 위해, C-H6 S4am 미오글로빈(S4am-Myo)을 함유하는 플라스미드를 이용하여 동일한 절차를 수행하였다. 이어서, S4am Myo를 IMAC에 의해 정제하고, 단백질 시퀀싱하여, pAF 도입량을 결정하였다.

이 선택으로부터 동정된 pAF-tRNA RS중, 하나의 합성효소(E9)가 pAF를 효율적으로 도입한 것으로 나타났고, 95% 초과의 효율로 pAF를 S4am-Myo에 도입시켰다. 아미노산 시퀀싱하여 도입을 결정하였고, 한편 SDS-PAGE 겔 상의 단백질 밴드를 비교함으로써 가공성을 나타냈다. E9에 대한 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 4에 나와 있고, E9의 아미노산 서열이 서열 번호 5에 나와 있다.

E9와 유사한 활성을 가지는 추가의 돌연변이를 동정하였고, 서열 번호 17에 나와 있는 아미노산 서열을 가진다.

실시예 2:

tRNA 돌연변이유발

tRNA J17의 3개 돌연변이체를 생성하였다. 야생형 J17의 DNA 서열이 서열 번호 8로 나와 있고, 미국 특허출원 공보 제2003/0108885호에서는 서열 번호 1로, 또한 US 제2003/0082575호에서는 서열 번호 1(각각 미국 특허 출원 일련 번호 제10/126,931호 및 제10/126,927호(이들 모두는 본원에 참조 인용됨))로 나와 있다. J17 tRNA는 도 1에 나와 있는 TΨC 줄기에서 U51:G63 동요 쌍을 가진다.

3개 J17 돌연변이체(F12, F13 및 F14)를 발생시켜, TΨC 줄기의 51번 및 63번 위치에서 와트슨-크리크 염기쌍을 발생시켰다. 중첩 PCR에 의해 돌연변이유발을 수행하였고, 최종 작제물을, 아미노아실 tRNA 합성효소 E9을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 4) 및 앰버 코돈 치환을 가지는 인간 성장 호르몬(hGH: human growth hormone)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 16)을 포함하는 pET19 플라스미드내 EcoRI 및 NdeI 부위에 클로닝하였다. hGH의 발현은 T7 프로모터의 조절을 받는다.

중첩 PCR에 대해 2개 단편을 생성하였다. 프라이머 연장에 의해 제1 단편을 수득하였다. 3개 돌연변이 각각을 생성하는 데 사용된 전향 프라이머의 서열은 하기와 같았다:

GTAACGCTGAATTCCCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTCTAAATCCGCATGGCGC(FTam11; 서열 번호 9).

F12 돌연변이체(51C:63G)를 생성하기 위해, 하기 역향 프라이머를 사용하였다:

GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCCGGATTTGAACCGGCGCCATGCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTGC(FTam12; 서열 번호 10).

F13 돌연변이체(51U:63A)를 생성하기 위해, 하기 역향 프라이머를 사용하였다:

GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCTGGATTTGAACCAGCGCCATGCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTGC(FTam13; 서열 번호 11).

F14 돌연변이체(51A:63U)를 생성하기 위해, 하기 역향 프라이머를 사용하였다:

GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCAGGATTTGAACCTGCGCCATGCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTGC(FTam14; 서열 번호 12).

제2 단편을 생성하기 위해, J17 tRNA에 대한 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 8), tRNA 합성효소 E9를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 4), 및 앰버 코돈 치환을 가지는 인간 성장 호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 16)을 포함하는 플라스미드 pET19 J17 합성효소 E9 hGH를 하기 프라이머 세트를 이용한 증폭용 주형으로 사용하였다:

CGCCGGACCACTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTAAGC(전향 프라이머; FTam15; 서열 번호 13) 및 CAAATTCGTCCATATGGGATTCC(FTam16; 서열 번호 14). 전향 프라이머를 사용하여, 서열을 tRNA의 3' 말단에서 플라스미드의 Nde I 부위로 연장시켰다. 수득된 산물을 겔 정제하였다.

중첩 PCR의 최종 단계는 전향 프라이머 GTAACGCTGAATTCCCGGCG(FTam17, 서열 번호 15), 역향 프라이머 FTam16(서열 번호 14), 제1 단편 및 제2 단편을 포함하였다. 조립된 산물을 EcoR I 및 Nde I로 소화시켜, EcoR I 및 Nde I로 소화된 플라스미드 pET19 J17 E9 hGH에 결찰시켰다. 각 작제물의 서열을 시퀀싱하여 확인하였고, 각각의 J17 돌연변이체 tRNA의 DNA 서열이 서열 번호 1(F12), 서열 번호 2(F13), 및 서열 번호 3(F14)으로 나와 있다. 상응하는 역향 프라이머를 따라 tRNA를 명명하였다.

단백질 발현

tRNA를 코딩하는 플라스미드(J17, F12, F13 또는 F14)를 화학적 수단에 의해 E. 콜라이 균주 1 및 균주 2의 박테리아 숙주 세포로 형질전환하여, 50 ug/ml 카르베니실린을 가지는 LB 아가 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 밤새도록 37℃에서 항온배양하였다. 각 tRNA에 대해, 단일 콜로니를 선택하여, 50 ug/ml 카르베니실린을 가지는 1 ml 2× YT내 37℃에서 하룻밤 배양을 시작하였다. 이러한 1 ml 배양을 이용하여, 37℃에서 50 ug/ml 카르베니실린을 가지는 2개 10 ml 2× YT 배양액을 접종하였다. 1개 10 ml 배양액에 4 mM 파라-아세틸페닐알라닌을 보충하였다. OD₆₀₀ =0.7에서, 0.4 mM IPTG로 hGH 발현을 유도하였다. 250 rpm으로 4시간 동안 37℃에서 세포를 배양한 후, 세포를 5분 동안 5000×g에서 원심분리하여 회수하였다. 세포를 5 ug/ml DNAse I가 보충된 BPER 시약(미국 일리노이즈주 로크포스 소재의 피어스)으로 용해시켰다. 4 내지 12% SDS PAGE에 의해 총 세포 용해물을 분석하였다.

도 2는 SDS PAGE에 의한 E. 콜라이 균주 1의 총 세포 용해물의 분석을 나타낸다. J17 또는 J17 돌연변이체(F12, F13, F14) tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소 E9를 이용하여, 인간 성장 호르몬내 셀렉터 코돈의 억제를 수행하였다. J17 돌연변이체를 보유한 세포는 J17를 보유한 세포보다 약간 더 늦게 성장하였다. 4 mM 파라-아세틸페닐알라닌의 부재 하에 tRNA 돌연변이체에 대해 SDS-PAGE에 의해 전장 hGH 산물이 관찰되지 않았다. 4 mM 파라아세틸페닐알라닌의 존재 하에, 각각의 tRNA 돌연변이체를 가지는 전장 산물을 생산하였고, 이는 이러한 tRNA 돌연변이체-RS E9 쌍이 E. 콜라이 기작에 대해 오르소고날임을 나타낸다. SDS-PAGE에 기초하여, J17 돌연변이체의 억제된 hGH 수율은 E. 콜라이 균주 1에서의 J17의 그 수율보다 대략 1.5 내지 2배 더 높았다.

1개의 J17 돌연변이체인 F13를 도 3에 나와 있는 앰버 억제에 대해 E. 콜라이 균주 2의 박테리아 세포주에서 더욱 시험하였다. E. 콜라이 균주 2에서, 앰버 억제 및 발현 수율은 E. 콜라이 균주 1에서의 수율에 비해 감소되었다. 파라-아세틸페닐알라닌의 부재 하에, SDS-PAGE에 의해 전장 hGH 산물이 관찰되지 않았다. 4 mM 파라-아세틸페닐알라닌의 존재 하에, 양 tRNA에 대해 전장 hGH가 관찰되었다. SDS-PAGE에 기초하여, F13의 억제된 hGH 수율은 J17의 수율보다 약 3배 더 높았다.

J17 및 F13를 비교하는 발효 실행을 대략 1.5 L의 최종 체적으로 수행하였다. J17 tRNA를 코딩하는 플라스미드 및 F13 tRNA를 코딩하는 플라스미드를 각각 E. 콜라이 균주 1로 형질전환하였다. 각각에 대한 최종 세포 밀도는 대략 19O g 습한 세포/L였다. hGH 역가는 J17 클론의 경우 347 mg/L이었고, F13 클론의 경우에는 542 mg/L이었다.

[표 1]

실시예 3: 마이코박테리움 아비움 아종 파라튜버쿨로시스에 대한 생 암브룩스 백신

마이코박테리움 아비움 아종 파라튜버쿨로시스(MAP)는 소 및 기타 반추 동물에서 요네병을 유발하는 절대 병원성 박테리아다. 최근 연구에 따르면, 미국 낙동 축산 동물 중 21%가 감염되었고, 이에 따라 연간 총 2억불 초과의 낙농 산업에 상당한 경제 손실을 초래하고 있는 것으로 평가되었다. 요네병은 리파부틴(Rifabutin)과 같은 항생제와 클라리트로마이신(Clarithromycin)과 같은 마크롤라이드의 조합물로만 치료될 수 있다. 치료 요법은 수년 지속될 수 있다. 파라튜버쿨로시스에 대한 백신이 상업적으로 입수가능하였으나 불행히도 질환 예방에는 완전히 효과적이지 않기 때문에, 효과적인 MAP 백신이 중요하다.

MAP 와 인간 크론씨병 간의 연관성

크론씨병은 북미의 400,000명 내지 600,000명 사람들에게 영향을 미친다. 북유럽에서의 유병율 평가치는 100,000명당 27명 내지 48명의 범위였다. MAP는 인간에 있어 크론씨병의 요인 작용제로서 의심되어 왔고; 이러한 연관성은 논쟁적이었다. MAP가 크론씨병에 있어 요인 작용제라는 가정 하에, 기아콘다(Giaconda)는 크론씨병의 잠정적 약물 치료제로서 리파부틴, 클라리트로마이신 및 클로파지민(마이콘다(Myoconda))의 조합물을 상용화하고자 모색하였다. 제II상 임상 시험 중 거의 95%의 임상적 반응과 함께, 제IIIa상 시험은 통상적 요법에 비해 16주째에 경감을 달성함에 있어서의 통계학적으로 유의한 개선을 입증하였다. 그러나, 마이콘다

는 본 시험에서 치료가 완수된 후 경감을 유지함에 있어 통계학적으로 유의한 결과를 달성하지 못했다.

현재, 제공되는 입수가능한 백신은 생 약독화(균주 316 F), 사멸 전 세포 기재 백신(균주 18)이고, 진행 중인 서브유닛 백신 시험도 있으나, 현 백신은 단지 분변 및 임상적 질환으로의 진전을 지연시킬 뿐이고, 감염으로부터 보호하지 않는다(문헌[Expert Rev. Vaccines 7(6) 2008]). 이 분야는 이상적으로는, 합리적으로 약독화된 백신을 찾고 있다.

MAP의 완전 게놈 서열이 공개되었고(PNAS 2005 12344-12349), MAP 내 외래 유전자 발현이 구현되기 때문에, 유전자 특이적 결실 및 부위 특이적 돌연변이가 이제 MAP에 대해 이용가능한 툴이다(문헌[Applied and Environmental Microbiology 2008 1687-1695]). 암브룩스 백신은 동물에서 MAP 감염을 예방하는 백신으로서 투여되게 되는, 유전적으로 변형된 전 유기체 비천연 아미노산 의존성 MAP이다. 필수 유전자가 선택된 후, 하나 이상의 부위 특이적 앰버 돌연변이를 포함하도록 형질전환된다. MAP는 배지 내에 존재하는 비천연 아미노산의 존재 및 부재 하에서의 세포 배양을 통해 특징분석되고, 복귀율이 특징분석되며, 전 유기체.

실시예 4: 억제 적격/ 람다 Red 세포의 생성

E. 콜라이 균주를 제작하였다. E. 콜라이 균주는 앰버 억제 및 람다 재조합 모두가 가능하다. 도 5에 도시된 pKD46n을 포함하는 W3110 E. 콜라이를 제작한 후, 도 4에 도시된 플라스미드 pVK10/camR을 이용하여 전기천공법으로 형질전환하였다. 양성 형질전환체를 30℃에서 48시간 동안 성장시킨 50 ㎍/mL 암피실린 및 34 ㎍/mL 클로르암페니콜 함유의 LB 아가 플레이트 상에서 선택하였다.

50 ㎍/mL 암피실린, 34 ㎍/mL 클로르암페니콜 및 0.2% 아라비노스 함유의 LB 매질 중에서 양 플라스미드를 모두 포함하는 500 mL 배양물을 0.5의 최종 OD₆₀₀으로 성장시킴으로써, 양 플라스미드를 모두 포함하는 전기적격 세포를 제작하였다. 이어서, 세포를 10% 글리세롤 중 3회 세정하고, 500 μL의 10% 글리세롤 중에 재현탁시켰다. 분취량의 60 μL를 향후 사용을 위해 -80℃에서 저장하였다.

실시예 5: 조건부 치사 메티온 아미노 펩티다제의 생성

조건부 치사 메티온 아미노 펩티다제를 가지는 E. 콜라이 균주를 생성시켰다. 앰버 돌연변이를 메티온 아미노 펩티다제 유전자 내의 2개 부위, 즉 Y31 또는 N51에 도입하였다. 이 돌연변이체들을 E. 콜라이 염색체 상에 일체화하기 위해, 도 6의 다이어그램에 도시된 바와 같이, 재조합 DNA의 선형 조각을 중첩 PCR에 의해 생성시켰다. 먼저, 프라이머 1 및 2(서열 번호 18 또는 26)를 이용하여, 본래의 코돈에서 앰버 코돈으로 전환된 선택된 아미노산(Y31 또는 N51)을 마지막으로 하여, 메티온 아미노 펩티다제 유전자의 5' 말단을 클로닝하였다. 프라이머 3(서열 번호 20 또는 28) 및 프라이머 4(서열 번호 21 또는 29)(PCR 산물 B)를 이용하여, 앰버 돌연변이로부터 시작하여, 메티온 아미노 펩티다제 유전자의 3' 말단을 클로닝하였다. 2개의 반응 산물이 앰버 돌연변이 플랭킹 서열에서 중첩하고, 이 산물들을 프라이머 1(서열 번호 18 또는 26) 및 프라이머 4(서열 번호 21 또는 29)로 증폭시켜, 위치 31 또는 51에 앰버 코돈 치환을 가지는 완전 메티온 아미노 펩티다제 유전자가 있는 산물 C를 수득하였다.

완전 돌연변이유발 주형을 생성시키기 위해, 사전 생성된 E. 콜라이 균주(PCR 산물 D)로부터의 DNA 상에서 프라이머 5(서열 번호 22 또는 30) 및 프라이머 6(서열 번호 23 또는 31을 이용하여, I-scel 호밍 엔도뉴클레아제 인식 부위에 의해 플랭킹되는 카나마이신 내성 마커를 증폭시켰다. 프라이머 7(서열 번호 24 또는 32) 및 프라이머 8(서열 번호 25 또는 33)을 사용하여 메티온 아미노 펩티다제의 게놈 서열 업스트림 및 메티온 아미노 펩티다제의 5' 말단을 증폭시켰고, 이로써 카나마이신 내성 마커 및 상동성 재조합(PCR 산물 E)이 제거된다. 프라이머 7(서열 번호 24 또는 32) 및 프라이머 4(서열 번호 21 또는 29)를 이용하여 단편 E, D 및 C를 증폭시킴으로써, 형질전환을 위한 최종 DNA 주형을 생성시켰다.

실시예 7: 조건부 치사 메티온 아미노 펩티다제 클론의 형질전환 및 선택

중첩 PCR에 의해 생성된 형질변환 주형을 사용하여, 전기적격 pKD46, pVK10-camR 양성 세포를 형질전환하였다. 30℃에서 48 내지 72시간 동안 50 ㎍/mL 암피실린, 50 ㎍/mL 카나마이신 및 2 mM pAF 함유의 LB 아가 플레이트 상에서 콜로니를 성장시킴으로써, 양성 형질전환체를 선택하였다. pAF 의존성 성장에 대해 시험하기 위해, 도 7, 도 8 및 도 9에 또한 도시된 바와 같이, 각 부위에 대한 96개 콜로니를 30℃에서 72시간 동안 50 ㎍/mL 암피실린, 50 ㎍/mL 카나마이신, 및 1 mM pAF 함유의 1 mL의 LB 중에서 성장시켰다. 이어서, 이 클론들을 50 ㎍/mL 암피실린, 50 ㎍/mL 카나마이신 및 2 mM pAF 함유의 LB 아가, 및 50 ㎍/mL 암피실린 및 50 ㎍/mL 카나마이신 함유 및 pAF 비함유의 LB 아가 상에 반복 플레이팅하였다. 이 반복 플레이트들을 30℃에서 72시간 동안 성장시킨 후, 성장에 대해 점수를 판정하였다. 추가 분석을 위해 2 mM pAF의 존재 하에서만 성장을 나타낸 클론을 선택하였다.

실시예 8: 클론 선택 및 성숙

추가연구를 위해 pAF 의존성에 대해 양성인 클론을 선택하였다. 이 클론들은 Y31 A12, Y31 C5, Y31 E3, N51 D2 및 N51 H9이었다. 클론들을 개별 재선별하고, 이들 모두는 pAF 함유의 매질 상에서만 성장하였다. 모든 클론들을 적절한 부위, 즉 Y31 또는 N51에서 앰버 코돈(tag)의 존재에 대해 시퀀싱하였다. 5개 모두는 적절한 위치에 앰버 코돈을 가졌다. 이어서, 클론 Y31 Al2 및 N51 D2를 단리하였고, pKD46 플라스미드를 37℃에서의 반복 열처리에 의해 제거하였다.

일단 pKD46 및 암피실린 내성이 소실되면, 세포를 I-S 뱀장어 효소 함유의 플라스미드로 형질전환하였다. 이 효소로 처리한 후, 수개의 클론을 선택하여 카나마이신 내성에 대해 시험하였다. 카나마이신에 대해 내성이 없는 클론을 다시 시퀀싱하고, 10% 글리세롤 스톡 내에서 냉동시켰다. 이 클론이 마지막 pAF 의존성 메티온 아미노 펩티다제 클론이 된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 도 11에 개략적으로 구상된, 요망되는 복귀율은 단일 스위치에서의 10^-9 복귀 빈도보다 작다. Y31 및 N51 클론을 시험하였고, 복귀율이 표 2에 나와 있다.

[표 2]

[표 3]

실시예 9:

소아마비 백신(경구용)을 위해 사용되는 동일 유형의 씨드 균주 및 계통, 1개 초과의 필수 유전자 내에 앰버 돌연변이를 포함시키기 위한 형질전환, 및 배양

세포 배양:

i) 바이러스 증식을 위한 상이한 세포 기질은 인간 이배수체 세포주, 원숭이 신장 세포, 베로(Vero) 세포주 또는 기타 임의의 적당한 세포 배양물을 포함하고, ii) 세포의 대규모 생산: 1. 제조자의 작업용 세포 은행(Manufacturer's working cell bank: MWCB)의 제작: 일차 세포 배양물의 경우의 MWCB(정상 조직에서 유래되어 -70℃에서 동결 보존되는 세포) 또는 임의의 다른 허용된 연속 세포주로부터의 MWCB를, 세포, 및 특정화된 수의 세포 배양물 내 일련의 계대배양 후 풀링된 세포로부터 제조한다. 2. 세포의 단계적 부피 증가에 적당한, 하기 시스템들 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 롤러 병: 롤러 병 내에서의 성장은 유리 표면 상의 세포 분포 및 최대의 달성가능한 세포 밀도에 있어 정치 배양물에서의 성장과 상이하다. 롤러 병 배양물은 정치 배양물의 밀도보다 거의 2배 더 높은 밀도를 견딜 수 있기 때문에, 덜 급속히 열화되지 않는다. 단층 배양물 내에서 성장한 포유동물 세포는 롤러 병 기법에 최적으로 순응화할 것이다. 세포 팩토리: 이는 공통된 유입구 및 유출구를 공유하는 배양 트레이들이 적층된 것이다. 이는 세포에 롤러 병 내부만큼 큰 성장 표면을 제공하나, 항온배양기 내 공간을 덜 차지한다. 이는 고착된 세포 배양물에 대해 이상적이고, 덜 오염되며, 덜 위험하고, 집약적(compact)이다. 루(Roux) 플라스크 마이크로-캐리어 시스템 3. 대조군 세포 배양물을 위한 샘플을 2주 이상 동안 분리하여 항온배양하고, 이를 세포변성 변화의 증거에 대해 조사한다.

세포 배양물 내 소아마비 바이러스의 증식:

i) 씨드 로트 시스템: a) 경구용 소아마비 백신에 준하는 계대 수준, 또는 b) 경구용 소아마비 백신 제조에 사용될 수 있는 일가 벌크 현탁액에 대해 유도되는 자체의 차순위 계대 수준. 1. 바이러스 씨드 로트 시스템을 기초로 하여 백신을 제조한다. 바이러스 씨드 로트는 일정량의, 함께 처리되는 바이러스 또는 씨드 로트로부터 제조되는 균일 조성물이다. 2. 씨드 바이러스의 계대배양물은 원래의 실험실 시험 및 필드 시험을 행한 백신의 생산에 사용되는 씨드 로트로부터 계수하여 10회 초과로 행해지지 않아야 한다.

단일 회수 및 일가 풀(monovalent pool):

바이러스를 세포 배양물로부터 증식시켜, 단일 회분(batch)의 세포로부터 유래된 세포 배양물에서 회수하여 함께 처리한다. 이는 단일 회수(single harvest)로 알려져 있다. 한 유형의 바이러스 현탁액의 단일 회수를 동시에 처리하여, 조질(crude) 형태의 일가 풀을 수득한다.

일가 풀의 여과 또는 정화:

각 일가 풀의 조질의 바이러스 현탁액을 다공도가 감소하는 필터들을 통해 단계별로 정제한다. 여과 단계의 목적은 입상 물질, 및 불활성화 공정에 영향을 미칠 수 있는 기타 물질(이러한 응집물들은 정치 시에 증가하는 경향이 있음)을 제거하는 것이다.

일가 풀의 농축:

각각의 여과된 일가 풀을 한외여과에 의해 농축한다.

일가 풀의 정제:

DEAE 세파로스/고정화 DNA-ase 칼럼/면역흡착 칼럼을 사용한 크로마토그래피를 이용하여, 일가 풀을 정제한다. 정제 과정은 세포내 DNA 수준을 초기 바이러스 회수로부터의 세포내 DNA 수준에서 10⁸ 이상의 인자만큼 일관되게 감소시킨다. D-항원 농도는 ELISA 및 래트에서의 필적하는 면역원성 표시에 의해 결정된다. 따라서, 효능(potency)이 조정된다. 소아마비 바이러스의 일가 풀을 배합하여, 최종의 삼가 벌크 산물을 형성한다.

백신의 제형 및 제조:

정제된 벌크를 바람직하게는 0.22 마이크론 또는 0.45 마이크론 필터를 통해, 여과한다. 일가 형질전환 바이러스는 비천연 아미노산의 존재 하에 계속되고, 임의적으로 안정화제 및/또는 보존제와 혼합되어, 일가, 이가, 삼가 또는 다가 백신을 제조한다.

백신의 효능에 대한 시험:

상기와 같이 제조된 백신의 효능은 확립된 기준 백신과 비교하여, 시험관내 및/또는 생체내 방법에 있어 유사한 것으로 밝혀져 있다.

pH 결정, 무균성 시험, 효과적 형질변환에 대한 시험(예를 들어, 비천연 아미노산의 부재 하의 사멸에 대한 분열 및 입증), 이상 독성 연구, 부피 측정, 시험관내 효능 결정, 내독소 시험, 동일성 시험, 단백질 질소 함량 평가, 및 자체 효능, 및 안전성 및 효능 보증을 위한 안정화제 함량 및 포름알데히드 함량의 결정과 같은 표준의 수용 방법에 기초한 각종의 기타 시험들을 상기와 같이 제조된 백신에 대해 수행하였다.

상기 제조된 SIPV의 시험관내 효능을 샌드위치(Sandwich) ELISA를 이용하여 결정하였다. 소아마비 바이러스에 대한 상이한 종들 내에 제기된 2개의 일차 항체를 동일한 것에 사용하였고, HRP와 접합된 제2의 항체를 다시 제2의 일차 항체에 다시 사용한다. 결과를 기준의 표준물질과 비교하여 분석하였다.

직접적 ELISA를 이용하여 백신에 대한 동일성 시험을 수행하였다. 항원을 96개 ELISA 플레이트에 잘 코팅시키고, 형 특이적 항소아마비 혈청을 이용하여, 백신 내 3개 모든 유형의 소아마비 바이러스의 존재를 결정한다.

상기 발명은 발명의 내용을 보다 명료히 하고 이해시키기 위해 다소 상세히 기재되었으나, 본 개시내용을 읽음으로써 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 한, 형태 및 상세내용에 있어 각종 변화가 가해질 수 있음이 명백해질 것이다. 예를 들어, 상기 모든 기법 및 장치들은 각종 조합들로 사용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허, 특허 출원, 및/또는 기타 문헌들은, 마치 각 개별 공보, 특허, 특허 출원, 및/또는 기타 문헌이 모든 목적을 위해 인용되는 것으로 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전문이 참조 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> Tian, Feng Hehli, Brad <120> Non-Natural Amino Acid Replication-Dependent Microorganisms And Vaccines <130> AMBX-0157.00PCT <150> 61/100,688 <151> 2008-09-26 <160> 35 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant tRNA derived from Methanococcus jannaschii tRNA <400> 1 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ccggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 2 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant tRNA derived from Methanococcus jannaschii tRNA <400> 2 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccagcccgc cggacca 77 <210> 3 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant tRNA derived from Methanococcus jannaschii tRNA <400> 3 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg caggttcaaa 60 tcctgcccgc cggacca 77 <210> 4 <211> 921 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii synthetase <400> 4 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gctgttatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tatatttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300 aaatatgttt atggaagtga acatggtctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tgggattcat 480 tatgagggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagattata a 921 <210> 5 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii synthetase <400> 5 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Val 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Tyr Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu His Gly Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Ile His 145 150 155 160 Tyr Glu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 6 <211> 88 <212> DNA <213> Halobacterium sp. NRC-1 <400> 6 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 7 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Orthogonal tRNA that recognizes an opal codon <400> 7 gcgggggttg ccgagcctgg ccaaaggcgc cggacttcaa atccggtccc gtaggggttc 60 cggggttcaa atccccgccc ccgcacca 88 <210> 8 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 8 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 9 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 9 gtaacgctga attcccggcg gtagttcagc agggcagaac ggcggactct aaatccgcat 60 ggcgc 65 <210> 10 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 10 gatctgcagt ggtccggcgg gccggatttg aaccggcgcc atgcggattt agagtccgcc 60 gttctgc 67 <210> 11 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 11 gatctgcagt ggtccggcgg gctggatttg aaccagcgcc atgcggattt agagtccgcc 60 gttctgc 67 <210> 12 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 12 gatctgcagt ggtccggcgg gcaggatttg aacctgcgcc atgcggattt agagtccgcc 60 gttctgc 67 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 13 cgccggacca ctgcagatcc ttagcgaaag ctaaggattt tttttaagc 49 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 14 caaattcgtc catatgggat tcc 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 15 gtaacgctga attcccggcg 20 <210> 16 <211> 600 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atgggccacc accaccacca ccacttccca accattccct tatccaggct ttttgacaac 60 gctatgctcc gcgcccatcg tctgcaccag ctggcctttg acacctacca ggagtttgaa 120 gaagcctaga tcccaaagga acagaagtat tcattcctgc agaaccccca gacctccctc 180 tgtttctcag agtctattcc gacaccctcc aacagggagg 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Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu His Gly Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Ile His 145 150 155 160 Tyr Glu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Arg Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 18 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Y31 Primer 1 <400> 18 gtattaccct gttatcccta tggcgaaatt cagaatgatt ctc 43 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Y31 Primer 2 <400> 19 cagaaaccgc gtgttgttcc taaacaatgt aatcattac 39 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Y31 Primer 3 <400> 20 gtaatgatta cattgtttag gaacaacacg cggtttctg 39 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Y31 Primer 4 <400> 21 gagagcggtg tttgcgtact g 21 <210> 22 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Y31 Primer 5 <400> 22 attaccctgt tatccctaga cgctcagtgg aacgaaaact cacg 44 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Y31 Primer 6 <400> 23 tagggataac agggtaatac aatttcaggt g 31 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Y31 Primer 7 <400> 24 ggtcagcttg tcgaaagtac cg 22 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Y31 Primer 8 <400> 25 ctacggttcg atcatctcca gctagggata 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Artificial <220> <223> MAP Y31 Amber Mutant A12 <400> 34 atggctatct caatcaagac cccagaagat atcgaaaaaa tgcgcgtcgc tggccgactg 60 gctgccgaag tgctggagat gatcgaaccg taggttaaac cgggcgtcag caccggcgag 120 ctggatcgca tctgtaatga ttacattgtt aatgaacaac acgcggtttc tgcctgcctc 180 ggctatcacg gctatccgaa atccgtttgc atctctatta atgaagtggt gtgccacggt 240 atcccggacg atgctaagct gctgaaagat ggcgatatcg ttaacattga tgtcaccgta 300 atcaaagatg gtttccacgg cgatacctcg aaaatgttta tcgtcggtaa gccgaccatc 360 atgggcgaac gtctgtgccg catcacgcaa gaaagcctgt acctggcgct acgcatggta 420 aaaccaggca ttaatctgcg cgaaatcggt gcggcgattc agaaatttgt cgaagcagaa 480 ggcttctccg tcgttcgtga atattgcgga cacggtattg gtcgcggctt ccatgaagaa 540 ccgcaggtgc tgcactatga ctcccgtgaa accaacgtcg tactgaaacc tgggatgacg 600 ttcaccatcg agccaatggt caacgcgggt aaaaaagaga tccgcaccat gaaagatggc 660 tggacggtaa aaaccaaaga tcgcagcttg tctgcacaat atgagcatac tattgtggtg 720 actgataacg gctgcgaaat tctgacgcta cgcaaggatg acaccatccc ggcgataatc 780 tcgcacgacg aataa 795 <210> 35 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MAP N51 Amber Mutant D2 <400> 35 atggctatct caatcaagac cccagaagat atcgaaaaaa tgcgcgtcgc tggccgactg 60 gctgccgaag tgctggagat gatcgaaccg tatgttaaac cgggcgtcag caccggcgag 120 ctggatcgca tctgtaatga ttacattgtt taggaacaac acgcggtttc tgcctgcctc 180 ggctatcacg gctatccgaa atccgtttgc atctctatta atgaagtggt gtgccacggt 240 atcccggacg atgctaagct gctgaaagat ggcgatatcg ttaacattga tgtcaccgta 300 atcaaagatg gtttccacgg cgatacctcg aaaatgttta tcgtcggtaa gccgaccatc 360 atgggcgaac gtctgtgccg catcacgcaa gaaagcctgt acctggcgct acgcatggta 420 aaaccaggca ttaatctgcg cgaaatcggt gcggcgattc agaaatttgt cgaagcagaa 480 ggcttctccg tcgttcgtga atattgcgga cacggtattg gtcgcggctt ccatgaagaa 540 ccgcaggtgc tgcactatga ctcccgtgaa accaacgtcg tactgaaacc tgggatgacg 600 ttcaccatcg agccaatggt caacgcgggt aaaaaagaga tccgcaccat gaaagatggc 660 tggacggtaa aaaccaaaga tcgcagcttg tctgcacaat atgagcatac tattgtggtg 720 actgataacg gctgcgaaat tctgacgcta cgcaaggatg acaccatccc ggcgataatc 780 tcgcacgacg aataa 795

Claims (6)

1. 비천연 아미노산이 필수 유전자 산물의 아미노산 서열 내로 도입된 마이코박테리움 아비움(mycobacterium avium) 아종 파라튜버쿨로시스(paratuberculosis)(MAP) 세포로서, MAP 세포는 복제에 필요한 필수 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열은, MAP 세포가 상기 비천연 아미노산이 존재할 때만 복제되고, 비천연 아미노산이 없으면 복제 능력이 제한되거나 없도록, 비천연 아미노산의 필수 유전자 산물 내로의 부위 특이적 도입을 코딩하는 셀렉터 코돈을 포함하는 것인 MAP 세포.
2. 제1항에 있어서, 비천연 아미노산이 복제에 필요한 MAP 유전자 산물 내로 도입되는 것인 MAP 세포.
3. 제1항에 있어서, 1개 초과의 비천연 아미노산이 1개 초과의 필수 유전자 산물 내로 도입되는 것인 MAP 세포.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제

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