CN102224238B - 非天然氨基酸复制依赖性微生物和疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过使用非天然或非天然编码氨基酸制造疫苗的组合物和方法，包括提供全生物体疫苗的方法，所述全生物体疫苗具有有限的复制能力，由此增加疫苗的安全性和功效。

Description

非天然氨基酸复制依赖性微生物和疫苗
技术领域
本发明涉及疫苗。在一些实施例中，本发明涉及通过使用非天然或非天然编码氨基酸来制造具有有限的或无复制能力的疫苗(包括全生物体疫苗)的组合物和方法。
背景技术
迄今为止，相关技术进展相对较慢，甚至在路易·巴斯德(Louis Pasteur)去世后超过100年，他的“III”(分离、灭活、注射)方案仍在继续应用。然而，随着分子生物学和重组蛋白质技术的出现，人们已经开始开发亚单位疫苗和遗传工程化类全生物体(whole-organism-like)疫苗。近来，随着免疫学的发展，已经制造出数类可用的免疫增强剂，包括Toll样受体(Toll-Like Receptor，TLR)配体。一般说来，新生代疫苗和其佐剂在化学和遗传学上已经得到越来越明确的定义。
针对例如病毒、细菌、原生动物、真菌等病原体的治疗剂，尤其是疫苗的开发正在进行中。已证实，此类研究在预防动物(包括人类)疾病传播方面起到的作用是无法估量的。事实上，在现代医学中，包括疫苗接种在内的免疫疗法已经根除了天花，并且几乎根除了例如脊髓灰质炎、破伤风、结核病、水痘和麻疹等疾病。
总的说来，理想的疫苗应具有长保存期；能够诱导针对预先选择的病原体和所有表型变异体的长期免疫性；不会引起疫苗所针对的疾病；能够有效进行治疗和预防；使用经济的标准方法容易制备，并且在相关领域中容易投予。
市售疫苗主要存在4个主要类别。其包括去活性全生物体疫苗、减毒活疫苗、载体疫苗和亚单位疫苗。利用非活材料(例如蛋白质)进行疫苗接种一般会引起抗体反应或CD4+辅助T细胞反应，而利用活材料(例如感染性病毒)进行疫苗接种一般会引起CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte，CTL)反应。CTL反应对于抵抗如感染性病毒和细菌等病原体极为重要。由于获得CTL反应的唯一确定方式是使用本身具有致病性的活试剂，故此法会带来实际问题。一般通过使用减毒病毒和细菌株，或通过杀死可用于疫苗接种的完整细胞，来避免这一问题的发生。这些策略已经得到顺利执行，但使用减毒株始终带有一定风险，即减毒试剂可能会在宿主中遗传重组并变成毒力株。因此，需要能够通过用非活材料(例如蛋白质)以特定方式进行疫苗接种来产生CD8+CTL反应的治疗剂和方法。
亚单位疫苗提供了一种处理某些所述问题的方式。此类疫苗一般包含来源于相关病原体的亚细胞组分。亚单位组分可由病原体的确定亚细胞部分产生，可以是纯化的蛋白质、核酸或多糖。所有这些成分都具有能够刺激针对相关病原体的免疫反应的抗原决定簇。一般说来，通过纯化已破坏病原体的制剂，或使用众所周知的程序合成，可获得亚单位疫苗的亚细胞组分。
然而，亚单位疫苗具有几个局限性。第一，制造此类疫苗的一个要求是，必须表征和鉴别抗原决定簇。这一点限制了其应用，尤其是针对高度可变的抗原决定簇。第二，亚单位疫苗一般不能有效刺激细胞毒性T细胞反应。第三，亚单位疫苗所赋予的免疫性通常很短暂，因此需要连续的加强注射。据显示，只有极少数重组表达的亚单位疫苗可在接种疫苗的动物(包括人)中诱导强烈而持久的免疫性。一个值得注意的特例是用于人的重组表面抗原乙型肝炎疫苗。使用这些疫苗引起的一个问题似乎出现在将抗原准确地呈递到免疫系统，由此诱导强烈的体液免疫性和强烈的细胞介导免疫性之中。具体点说，现有的重组(亚单位)疫苗似乎不能引起强烈的“记忆性(memory)”反应，以致接种疫苗的动物在暴露于由病原体引起的自然感染时，不能很快速地反应。
举个例子，当前由如牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)等瘟病毒制备的亚单位疫苗的不足之处已经广为报导。这些研究显示，即使在疫苗中使用大量的重组蛋白，观察到的不良保护率仍表明，这些疫苗无法抵抗活BVDV分离株的攻毒(同源性保护或异源性保护)。
针对许多感染性疾病的有效疫苗仍未开发出来，而且当前可用的许多疫苗只能提供针对疾病的部分保护。此外，在疫苗领域还存在诸多缺口。活疫苗产生的免疫性比其它类型疫苗更强烈、更广泛且更持久。需要一种更为安全的活疫苗载体，其甚至在免疫受抑制的个体中也不会引起疾病。还需要可诱导细胞介导的免疫性，而不仅仅是基于抗体的免疫性的疫苗。另外，还需要直接在身体的粘膜表面(大多数病原体进入的地方)诱导保护性免疫反应。因此，需要改良的疫苗。本发明旨在提供一种改进现有技术至少某些缺点的改良型治疗性疫苗。
发明内容
本发明提供化学调节的复制依赖性全生物体。在一些实施例中，本发明提供一种具有某种修饰的化学调节全生物体，这种修饰使得其复制能力取决于非天然氨基酸的存在。在一些实施例中，本发明提供一种具有一个或一个以上修饰的全生物体，所述修饰使得生物体的复制能力取决于其在非天然氨基酸存在下进行的培养。在一些实施例中， 本发明提供一种具有一个或一个以上修饰的全生物体，所述修饰使得生物体的复制能力取决于其在一个或一个以上非天然氨基酸存在下进行的培养。在一些实施例中，本发明提供一种具有两个或两个以上修饰的全生物体，所述修饰使得生物体的复制能力取决于其在一个或一个以上非天然氨基酸存在下进行的培养。在本发明一些实施例中，全生物体是一种变形疫苗(mitigated vaccine)，即通过位点特异性并入一个或一个以上非天然氨基酸调节的疫苗，其中免疫剂的复制或表达通过非天然氨基酸的存在或不存在来调节。
在本发明一些实施例中，全生物体的复制或表达是通过经单一遗传修饰实现的非天然氨基酸的存在或不存在来调节。在本发明一些实施例中，全生物体的复制或表达是通过经一个或一个以上遗传修饰实现的非天然氨基酸的存在或不存在来调节。在本发明一些实施例中，全生物体的复制或表达是通过经两个遗传修饰实现的非天然氨基酸的存在或不存在来调节。在本发明一些实施例中，全生物体的复制或表达是通过经三个遗传修饰实现的非天然氨基酸的存在或不存在来调节。在本发明一些实施例中，全生物体的复制或表达是通过经四个遗传修饰实现的非天然氨基酸的存在或不存在来调节。在本发明一些实施例中，全生物体的复制或表达是通过经五个遗传修饰实现的非天然氨基酸的存在或不存在来调节。在本发明一些实施例中，全生物体的复制或表达是通过经四个或四个以上遗传修饰实现的非天然氨基酸的存在或不存在来调节。
选择性诱导针对生物体、抗原、蛋白质或自体蛋白的免疫反应，或增加外来抗原特定表位的免疫原性的能力，对于制造针对多种病状(包括(但不限于)癌症和蛋白质折叠疾病)和感染性疾病(例如细菌或病毒感染)的疫苗意义重大。本发明通过将非天然氨基酸并入生物体中来制造复制依赖性和/或复制缺陷性免疫原以用于全生物体疫苗接种，或制造抗体以用于被动免疫。本发明还通过将非天然氨基酸并入蛋白质、抗原和/或多肽中来制造免疫原以用于疫苗接种，或制造抗体以用于被动免疫。在本发明中，添加有非天然氨基酸的免疫原对应于欲接种疫苗/进行免疫的个体体内的目标部分(例如，疾病相关部分)，或对应于能够出现在个体体内的目标部分(例如，疾病相关部分)。在对个体投予具有非天然氨基酸的免疫原的实施例中，非天然氨基酸的存在引发针对可与目标(例如疾病相关)部分交叉反应的免疫原的免疫反应。
在第一方面中，本发明提供在个体体内产生或增强针对目标部分(例如多肽、碳水化合物或二者的组合)的免疫反应(例如B细胞介导的反应和/或T细胞介导的反应)的方法，所述目标部分在个体体内或能够出现在个体体内。所述方法包括提供遗传修饰的非天然氨基酸依赖性生物体，和投予个体所述生物体。所述方法还包括提供包含一个 或一个以上非天然氨基酸的遗传修饰非天然免疫原，和投予个体所述非天然免疫原。所述个体(例如人、猴、小鼠、大鼠、家畜、猪、奶牛、鸡、笼鸟、禽鸟、家养宠物、狗、猫、爬行动物和/或两栖动物)产生一个或一个以上针对非天然免疫原的抗体，所述抗体可与目标部分交叉反应(由此产生或增强针对目标的免疫原性反应)。
在某些实施例中，遗传修饰的全生物体可以是需要使个体免疫所针对的任何全生物体，例如细菌、病毒、真菌、支原体、原生动物、蠕虫或朊病毒。全生物体疫苗可任选包括以下一者或一者以上：细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、支原体抗原、原生动物抗原、蠕虫抗原、朊病毒抗原、HIV抗原、HIVgp120、HIV gp41、HIV gag、HIV pol、HIV env、HTV tat、HIV nef、HIV rev、杯状病毒(caliciviius)衣壳抗原、乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎表面抗原、丁型肝炎试剂、单纯疱疹病毒糖蛋白、水痘-带状疱疹病毒糖蛋白、流感病毒血球凝集素、流感病毒神经氨酸酶、流感病毒核蛋白、HPV衣壳蛋白、副流感病毒血球凝集素/神经氨酸酶、脊髓灰质炎病毒衣壳多肽、Hep A抗原、痘苗病毒多肽、狂犬病病毒糖蛋白G、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)OspA、乙型流感嗜血桿菌(H.influenzae type b)外膜蛋白、分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(Mycobacterium lipoarabinomannan)、分枝杆菌mAPG、化脓性链球菌(S.pyogenes)M蛋白、肺炎链球菌(S.pneumoniae)荚膜多糖、鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)F1、鼠疫耶尔森菌V抗原、恶性疟原虫环子孢子蛋白(P.falciparum circumsporozoite，PfCSP)、恶性疟原虫子孢子表面蛋白2(P.falciparum sporozoite surface protein，PfSSP2)、恶性疟原虫肝期抗原1羧基末端(P.falciparum carboxyl terminus of liver state antigen 1，PfLSA1 c-term)、恶性疟原虫输出蛋白1(P.falciparum exported protein，PfExp-1)、Pfs 48/45、Pfs 28、Pfs 25或Pfs 230。
遗传修饰的非天然氨基酸复制依赖性生物体可以是以下一者或一者以上：细菌、病毒、真菌、支原体、原生动物、蠕虫、朊病毒、放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类杆菌属(Bacteroides)、包特氏菌属(Bordetella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布氏杆菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、衣原体属(Chlamydia)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、柯克斯氏体属(Coxiella)、嗜皮菌属(Dermatophilus)、肠球菌属(Enterococcus)、埃利希氏体属(Ehrlichia)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西丝菌属(Francisella)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、血巴尔通氏体属(Haemobartonella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、L型细菌(L-form bacteria)、钩端螺旋体属(Leptospira)、李斯特菌属(Listeria)、分枝杆 菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、奈瑟菌属(Neisseria)、新立克次氏体属(Neorickettsia)、诺卡菌属(Nocardia)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、变形菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、罗克利马体属(Rochalimaea)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、密螺旋体属(Treponema)、耶尔森菌属(Yersinia)、腺病毒(adenovirus)、甲病毒(alphavirus)、杯状病毒(calicivirus)、冠状病毒(coronavirus)、CMV、瘟热病毒(distemper virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、肠病毒(enterovirus)、EBV、黄病毒(fiavivirus)、Hep C、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)、Hep B、丁型肝炎试剂(hepititus delta agent)、Hep E或F病毒、GBV-C、疱疹病毒(herpesvirus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus)、免疫缺陷病毒(immunodeficiency virus)、HIV、感染性腹膜炎病毒(infectious peritonitis virus)、流感病毒(influenza virus)、A型流感病毒(influenza A virus)、白血病病毒(leukemia virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、正粘病毒(orthomyxovirus)、乳头瘤病毒(papilloma virus)、HPV、副流感病毒(parainfluenza virus)、副粘病毒(paramyxovirus)、RSV、细小病毒(parvovirus)、瘟病毒(pestivirus)、细小核糖核酸病毒(picorna virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovims)、痘病毒(pox virus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、狂犬病病毒(rabies virus)、呼肠孤病毒(reovirus)、反转录病毒(retrovirus)、轮状病毒(rotavirus)、犁头霉属(Absidia)、枝顶孢霉属(Acremonium)、交链孢霉属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、蛙粪霉属(Basidiobolus)、平脐蠕孢属(Bipolaris)、芽生菌属(Blastomyces)、念珠菌属(Candida)、球孢子菌属(Coccidioides)、耳霉属(Conidiobolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、弯孢霉属(Curvalaria)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、外瓶霉属(Exophiala)、地丝菌属(Geotrichum)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、马杜拉分支菌属(Madurella)、马拉色菌属(Malassezia)、小孢子菌属(Microsporum)、小丛梗孢属(Moniliella)、被包霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、单胞瓶霉属(Phialemonium)、瓶霉属(Phialophora)、原壁菌属(Prototheca)、假埃希氏菌属(Pseudallescheria)、假小托菌属(Pseudomicrodochium)、腐霉属(Pythium)、鼻孢子虫属(Rhinosporidium)、根霉属(Rhizopus)、线状担子菌属(Scolecobasidium)、孢子丝菌属(Sporothrix)、匍柄霉属(Stemphylium)、毛癣菌属(Trichophyton)、毛孢子菌属(Trichosporon)、木丝霉属(Xylohypha)、巴倍虫属(Babesia)、肠袋虫属(Balantidium)、贝诺孢子虫属(Besnoitia)、 隐孢子虫属(Cryptosporidium)、艾美虫属(Eimeria)、脑胞内原虫属(Encephalitozoon)、内阿米巴属(Entamoeba)、贾弟虫属(Giardia)、哈蒙德虫属(Hammondia)、肝簇虫属(Hepatozoon)、等孢属(Isospora)、利什曼原虫属(Leishmania)、微孢子虫属(Microsporidia)、新孢子虫属(Neospora)、龙船草属(Nosema)、五鞭毛滴虫属(Pentatrichomonas)、疟原虫属(Plasmodium)、恶性疟原虫(P.falciparum)、肺孢子虫属(Pneumocystis)、肉孢子虫属(Sarcocystis)、裂体吸虫属(Schistosoma)、泰累尔犁浆虫属(Theileria)、弓形体属(Toxoplasma)、锥体虫属(Trypanosoma)、棘唇属(Acanthocheilonema)、圆线虫属(Aelurostrongylus)、钩虫属(Ancylostoma)、管圆线虫属(Angiostrongylus)、蛔虫属(Ascaris)、布鲁格氏丝虫属(Brugia)、仰口属(Bunostomum)、毛细线虫属(Capillaria)、夏氏线虫子属(Chabertia)、古柏属(Cooperia)、环体属(Crenosoma)、网尾属(Dictyocaulus)、膨结属(Dioctophyme)、盖头属(Dipetalonema)、裂头属(Diphyllobothrium)、复孔虫属(Diplydium)、恶丝虫属(Dirofilaria)、龙线属(Dracunculus)、蛲虫属(Enterobius)、类丝虫属(Filaroides)、血矛线虫属(Haemonchus)、兔唇蛔属(Lagochilascaris)、Loa多肽(Loa polypeptide)、曼森氏线虫属(Mansonella)、缪勒属(Muellerius)、侏形吸虫属(Nanophyetus)、板口线虫属(Necator)、细颈属(Nematodirus)、结节线虫属(Oesophagostomum)、盘尾属(Onchocerca)、后睾吸虫属(Opisthorchis)、胃线虫属(Ostertagia)、副丝虫属(Parafilaria)、并殖吸虫属(Paragonimus)、副蛔虫属(Parascaris)、泡翼线虫属(Physaloptera)、原圆线虫属(Protostrongylus)、狗尾草属(Setaria)、旋尾线虫属(Spirocerca)、迭宫绦虫属(Spirometra)、冠丝虫属(Stephanofilaria)、类圆线虫属(Strongyloides)、圆线虫属(Strongylus)、吸吮线虫属(Thelazia)、弓蛔线虫属(Toxascaris)、弓首蛔属(Toxocara)、毛线虫属(Trichinella)、毛圆线虫属(Trichostrongylus)、鞭虫属(Trichuris)、钩虫属(Uncinaria)或吴策线虫属(Wuchereria)。
在另一方面中，本发明提供例如通过在个体体内产生B细胞介导的反应和/或T细胞介导的反应来预防性或治疗性治疗个体病状的方法。在各种实施例中，所述病状可以是(但不限于)以下一者或一者以上：细菌感染、病毒感染、真菌感染、支原体感染、朊病毒感染、原生动物感染或蠕虫感染。这一方面的一组方法包括对个体，例如人、猴、小鼠、大鼠、猪、奶牛、鸡、笼鸟、禽鸟、爬行动物或两栖动物，投予遗传修饰的全生物体。由此，遗传修饰的全生物体刺激个体体内产生抗体。在这一方面的另一组方法中，本发明包含通过产生针对一种或一种以上疾病、病况或涉及产生抗体反应的生物体的抗体，和分离一种或一种以上所述抗体，随后将其投予个体，来预防性或治疗性治疗个体 的病状。
利用终极的蛋白质工程化工具Ambrx公司的技术，位点特异性并入非天然氨基酸为疫苗开发提供了广阔的前景。其可通过将抗原与免疫增强剂组合而产生化学上明确确定的纳米结构。这些纳米结构具有抗原信息和免疫增强功能，可用于开发亚单位疫苗。
此外，也可以使用Ambrx技术产生新颖的减毒类全生物体疫苗，其中非天然氨基酸将充当在致病性生物体中表达必需基因的开关，从而代替媒剂，将非天然官能团引入蛋白质中。所得生物体将模仿野生型生物体，但只能够在自然界中不存在的Ambrx非天然氨基酸存在下复制。
亚单位疫苗：
由于亚单位疫苗的功效较低，使得需要佐剂来刺激免疫反应。常见的做法是，将佐剂与抗原调配成混合物。投药后，抗原将被树突状细胞(dendritic cell，DC)吸收，并呈递给T细胞。佐剂将刺激树突状细胞释放细胞因子、增强抗原呈递和使树突状细胞成熟。当抗原呈递和免疫活化这两个独立的过程集中于同一DC上时，将获得有效的抗原特异性免疫反应。所需剂量相对较大。然而，较大剂量的佐剂会引起抗原非依赖性免疫活化，这是一种不希望的副反应。因此，这种方法必然是不理想的，并且会使疫苗具有低功效和高毒性。
与例如明矾等传统佐剂不同，许多新发现的佐剂的分子组成是明确确定的。Ambrx技术独特的位点特异性非天然氨基酸并入和位点特异性结合能力，使得我们具备了产生具有高效力和低毒性的新生代疫苗的必需工具。Ambrx亚单位疫苗的关键特征是，将抗原与免疫增强剂组合于一个化学上确定的纳米结构中。当其被DC吸收时，抗原呈递和免疫活化两个过程集中于同一DC上。
位点特异性并入非天然氨基酸是一种能够将具有高免疫原性部分(例如单硝基苯基、二硝基苯基)的非天然氨基酸直接并入蛋白质抗原中的技术。近来，例如Toll样受体7(TLR7)配体咪唑并喹啉等小分子免疫增强剂变得可用。利用这些小分子免疫增强剂作为侧链来设计非天然氨基酸，并将其并入到蛋白质抗原上，是可行的。
Ambrx的位点特异性结合技术提供甚至更高的灵活性。此项技术不仅能够将上文提到的小分子与蛋白质抗原表面结合，而且还能将多种其它免疫增强剂(例如脂质、脂肽、多糖、DNA、RNA和纳米粒子)与蛋白质抗原表面结合。
将单链DNA位点特异性结合到蛋白质表面上，为疫苗设计提供了另一个自由发挥的空间。带有未甲基化CpG的DNA是TLR-9配体，有趣的是，其不是存在于细胞表面上，而是存在于细胞内部。结合于抗原的DNA不仅可以充当免疫增强剂，而且还能充 当构造单元(building block)，以通过序列特异性杂交过程建立一维到三维的多价抗原(multi-antigen valent)纳米结构。这个一般性方案也可用于组合抗原与其它元件，例如APC靶向试剂和其它TLR配体。已经显示，APC靶向(抗体或肽)可增强疫苗功效，并促进交叉呈递。组合两种不同的TLR配体将具有较高的协同作用。
Ambrx位点特异性结合允许进行疫苗的精确设计和优化。如果不利用Ambrx技术，那么非特异性结合过程对于蛋白质抗原上的修饰位点仅具有有限或无控制作用。非特异性结合可能会改变T和B表位。也可能会修饰对于抗体识别至关重要的抗原3维构象。此外，一些修饰也可能会妨碍抗原加工。所有这些因素使得非特异性结合的疫苗具有较低有效性。
全生物体疫苗：
疫苗学是从全生物体疫苗开始的，并且直到现在，这些疫苗也是最成功的疫苗，可归为活减毒疫苗或死疫苗。全生物体疫苗的本质在于，这种疫苗应尽可能接近于致病性生物体本身，以便激发保护性免疫反应，但在宿主中具有极其有限的复制能力或无复制能力。
因此，如果需要有限的复制，或不需要复制，那么是否有可能使用小分子来控制微生物的生命周期，从而产生更好、更安全的疫苗？使用了Ambrx技术，这个问题的答案现在是肯定的。如果将非天然氨基酸并入细菌、病毒或甚至寄生虫中对于微生物复制不可或缺的基因中，那么这些生物体的生命将取决于非天然氨基酸的存在。由于并入的非天然氨基酸在自然界中不存在，那么结果将是，例如病毒和细菌等生物体具有几乎精确的病毒和细胞组分与结构，但没有在宿主中复制的能力。此外，经Ambrx技术修饰过的病毒或细菌不仅可充当疫苗本身，而且还可充当基因和抗原传递的载体。
Ambrx亚单位疫苗平台可广泛应用于感染性疾病和治疗性癌症疫苗领域。当前的癌症疫苗一般是无效的。人们已经提出了系统性T细胞活化和负调控路径抑制的方法，并且其中一些正处于临床试验中。T细胞活化与抗原识别的解耦(decoupling)会引起严重的副作用。癌症疫苗无效是因为缺乏诱导强烈的肿瘤特异性免疫反应，而不会引起严重副作用的技术。Ambrx提供的技术可产生能够引起强烈的癌症特异性免疫反应(包括T细胞和B细胞反应)的纳米结构，并由此开创了在治疗与预防两方面都具有有益可能性的新领域。
全生物体疫苗平台可广泛应用于感染性疾病领域。可以培养并且具有能够突变的基因组的病毒、细菌或者甚至是寄生虫，都是良好的候选物。本发明疫苗将改善疫苗开发的风险管理，并且这些疫苗在化学和遗传学上都得到了较为明确的确定，可提供前所未有的功效。
为了扩充遗传密码，本发明提供制造正交tRNA的组合物和方法。氨酰基-tRNA合成酶利用非天然编码氨基酸使本发明的tRNA氨酰基化。可使用这些翻译组件对tRNA所识别的选择密码子反应，而将所选氨基酸并入正在生长的多肽链(在核酸翻译的过程中)的特定位置中。
在细胞中产生在特定位置具有所选氨基酸的蛋白质的方法也为本发明的特征。举例来说，一种方法包括在适当的培养基中使细胞生长，其中所述细胞包含一种核酸，这种核酸包含至少一个选择密码子并且编码蛋白质；以及提供所选氨基酸。所述细胞进一步包含：正交tRNA(O-tRNA)，其在细胞中起作用并识别选择密码子；和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)，其优先利用所选氨基酸使O-tRNA氨酰基化。通常，O-tRNA在同源合成酶(cognate synthetase)存在下包含抑制活性。由本方法制造的蛋白质也为本发明的特征。
附图说明
图1—绘示具有TψC茎突变位点的J17 tRNA的三叶草结构。SEQ ID NO:8是所绘示野生性J17 tRNA的相对应DNA序列。
图2—绘示使用J17或J17突变体(F12、F13、F14)抑制人生长激素中的琥珀突变。借助SDS PAGE分析各样品的总细胞溶解产物。
图3—绘示在不同细胞系中使用F13抑制人生长激素中的琥珀突变。
图4—绘示含有Ambrx抑制系统的pVK10-camR载体的图。
图5—绘示含有λRed组件(bet、gam、核酸外切酶)的pKD46载体的图。
图6—绘示重叠引物和实例5中所用方法的方案。引物由箭头和数字标识符指示，举例来说，Y31和N51克隆体的引物1分别为SEQ ID NO:18和26；Y31和N51克隆体的引物2分别为SEQ ID NO:19和27；Y31和N51克隆体的引物3分别为SEQ ID NO:20和28；Y31和N51克隆体的引物4分别为SEQ ID NO:21和29；Y31和N51克隆体的引物5分别为SEQ ID NO:22和30；Y31和N51克隆体的引物6分别为SEQ ID NO:23和31；Y31和N51克隆体的引物7分别为SEQ ID NO:24和32；Y31和N51克隆体的引物8分别为SEQ ID NO:25和33。PCR产物由字母标识。含有琥珀位点的甲硫氨酸氨基肽酶是通过在琥珀突变(A和B)上重叠PCR而产生，这使得其对于大肠杆菌全生物体是条件致死的。随后将突变体甲硫氨酸氨基肽酶融合到完整基因(C)中，并与选择性标记物(D)和一部分突变体甲硫氨酸氨基肽酶(E)组合，以供下游选择。
图7—绘示针对人工氨基酸依赖性进行筛选的方案。显示的三个步骤为：1)通过处理板来挑取转化株，例如KanR、AmpR阳性转化株；2)培养在KanR、AmpR+非天然氨基酸中存活者；和3)在非天然氨基酸存在和不存在下，使个别集落在板上长出，并选出在非天然氨基酸存在下生长且在无非天然氨基酸情况下培养时死亡的那些集落。
图8-绘示两个大肠杆菌细胞培养板，其用于针对Y31处的甲硫氨酸氨基肽酶基因琥珀突变的筛选，各自涂有LB琼脂和含有50μg/mL氨苄青霉素(Ampicilin)和50μg/mL卡那霉素(Kannamycin)的培养基，左侧的板另外含有2mM对乙酰基苯丙氨酸，而右侧的板不含。A12、C5和E3是化学调节的复制依赖性大肠杆菌的实例。
图9-绘示两个大肠杆菌细胞培养板，其用于针对N51处的甲硫氨酸氨基肽酶基因琥珀突变的筛选，各自涂有LB琼脂和含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的培养基，左侧的板另外含有2mM对乙酰基苯丙氨酸，而右侧的板不含。A12、C5和E3是化学调节的复制依赖性大肠杆菌的实例。
图10A和10B-绘示在许可(permissive)和不许可(nonpermissive)培养基中的生长。将过夜培养物以每图右上角中所示的最佳稀释比接种到葡萄糖(菱形)或阿拉伯糖(圆形)培养基中。37℃下，在振荡的Spectramax读板器中，通过定期取出样品进行显微镜检查，并接种到阿拉伯糖板上，来监测96孔板的OD600。使用CFU浓度除以OD600进行归一化，由此计算出成活力的改变，提供于右轴上(三角形)。对于每个时间点，将所述值除以T＝0时的值，并在此处提供所述值的对数。由饱和接种物测量并针对稀释度校正的T＝0时每OD单位每毫升CFU的数量如下：野生型(WT)，4.6×109；frr突变体，3.2×109；gcpE突变体，3.4×109；lpxC突变体，2.2×109；map突变体，2.9×109；murA突变体，8.7×108；ppa突变体，1.5×109；rpsA突变体，1.2×109。OD以线性而非对数标度显示，以便更好地显示摇晃中培养物的动力学，而lpxC右轴的标度不同并绘制成防止趋势线发生重叠。对于murA测量的最后两个时间点，没有集落生长。参见赫林格(Herring)和伯特纳(Blattner)细菌学杂志(JOURNAL OF BACTERIOLOGY)，2004，第2673-2681页，以引用的方式并入本文中。
图11-绘示表征回复率(reversion rate)的示意图，其中遗传修饰的非天然氨基酸复制依赖性细胞在加有非天然氨基酸的培养基中生长到1.0光学密度，随后将这些细胞的连续稀释液接种到加有非天然氨基酸的培养基中，以计算集落形成单位，并且在不存在非天然氨基酸情况下培养剩余细胞以检测回复突变体(revertant)。
图12-绘示诱变策略的示意图。线性DNA片段是借助于重叠延伸PCR由野生型模板基因组DNA产生。引物的位置由单侧箭头指示。通过电穿孔将PCR融合产物引入细胞中，并选择由双重重组事件得到的整合体(integration)。在鉴别出带有后续(tagalong) 琥珀终止密码子的克隆体后，诱导I-SceI基因，由此去除编码Camr的基因。在短复制区(duplicated region)内的重组引起产生另外不留痕迹的(scarless)琥珀突变体。
图13-绘示后续(tagalong)诱变中所用的质粒。
图14-绘示在大肠杆菌中产生条件致死性突变体的步骤的示意图，从上面开始，包括1)产生条件突变体模板；2)转化到λRED重组体(琥珀抑制型感受态株)中；和3)诱导λRED重组。
图15-绘示在大肠杆菌中表征条件致死性突变体的示意图，从上面开始，包括1)表征在成功转化的生物体所依赖的非天然氨基酸存在或不存在下进行的生长；2)将突变表征为杀菌性的或抑菌性的；和3)表征回复突变体的频率。
图16-绘示MAP残基挑取的结构图。
图17-绘示MAP残基挑取的结构图。
具体实施方式
定义
在详细描述本发明之前，应了解，本发明不局限于特定生物系统，这当然可以变化。还应了解，本文中使用的术语只是出于描述特定实施例的目的，而不是打算限制本发明的范围，本发明的范围应仅受随附权利要求书限制。除非上下文另作明确指出，否则如本文和随附权利要求中使用的单数形式“一”和“所述”包括多个参考物。因此，例如提到“一细胞”包括两个或两个以上细胞的组合，并且包括所属一般领域技术人员已知的其等效物等。提到的“细菌”包括细菌的混合物等。
除非本文和下文说明书的剩余部分中另作定义，否则本文中使用的所有科技术语的含义与本发明所属领域技术人员通常所了解的含义相同。
本文中提到的所有出版物和专利都以引用的方式并入本文中，以达到描述和揭示例如出版物中所述的可能与当前所述的发明结合使用的构造和方法学的目的。本文中所讨论的出版物只提供处在本申请案的申请日期之前的揭示内容。本文决不应解释为承认本发明者无权由于先前发明或任何其它原因而使所述揭示案的日期提前。
当蛋白质和/或蛋白质序列是天然地或以人工方式从共同的祖先蛋白质或蛋白质序列得到时，其为“同源”的。类似地，当核酸和/或核酸序列是天然地或以人工方式从共同的祖先核酸或核酸序列得到时，其为同源的。举例来说，可借助任何可用的诱变方法来修饰任何天然存在的核酸，以使其包括一个或一个以上选择密码子。当得到表达时，这一诱变的核酸编码包含一个或一个以上所选氨基酸(例如，非天然氨基酸)的多肽。 当然，突变过程可另外改变一个或一个以上标准密码子，从而也使所得突变蛋白中的一个或一个以上标准氨基酸改变。所述一个或一个以上标准氨基酸可变为非天然氨基酸或天然氨基酸。同源性一般是由两个或两个以上核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列相似性推定。可用于确定同源性的序列之间相似性的确切百分比随所讨论核酸和蛋白质而变化，但通常使用仅25％的序列相似性来确定同源性。更高的序列相似性水平(例如，30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或99％以上)也可用于确定同源性。本文中将描述测定序列相似性百分比的方法(例如，使用默认参数的BLASTP和BLASTN)并且一般可用。
本文中使用的术语“正交”是指分子(例如，正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS))是以较低效率被相关系统(例如，翻译系统，例如细胞)所使用。正交是指正交tRNA和/或正交RS无能力或以较低效率(例如，低于20％的效率、低于10％的效率、低于5％的效率，或例如低于1％的效率)在相关翻译系统中起作用。举例来说，当与通过内源性RS将内源性tRNA氨酰基化相比较时，相关翻译系统中的任何内源性RS以较低效率或甚至为零的效率将相关翻译系统中的正交tRNA氨酰基化。在另一实例中，当与通过内源性RS将内源性tRNA氨酰基化相比较时，正交RS以较低效率或甚至为零的效率将相关翻译系统中的任何内源性tRNA氨酰基化。可将第二正交分子引入细胞中，从而与第一正交分子一起起作用。举例来说，正交tRNA/RS对包括所引入的在细胞中相对于相应内源性tRNA/RS对以一定效率(例如，约50％效率、约60％效率、约70％效率、约75％效率、约80％效率、约85％效率、约90％效率、约95％效率，或者约99％或更高效率)一起起作用的互补组件。“正交性的改良”是指正交性相比原料或天然存在的tRNA或RS有所增强。
术语“同源物(cognate)”是指一起起作用的组件，例如tRNA和氨酰基-tRNA合成酶。这些组件也可称为互补的。
术语“优先氨酰基化”是指与O-RS将天然存在的tRNA或用于产生O-tRNA的原料氨酰基化相比较，O-RS利用所选氨基酸(例如，非天然氨基酸)将O-tRNA氨酰基化的效率，例如约70％效率、约75％效率、约80％效率、约85％效率、约90％效率、约95％效率，或者约99％或更高效率。随后，将非天然氨基酸以高保真度，例如以对指定选择密码子大于约70％的效率、对指定选择密码子大于约75％的效率、对指定选择密码子大于约80％的效率、对指定选择密码子大于约85％的效率、对指定选择密码子大于约90％的效率、对指定选择密码子大于约95％的效率或对指定选择密码子大于约99％的效 率，并入正在生长的多肽链中。
“预防性治疗”是对未展现疾病、病理或医学病症的病征或症状，或者只展现疾病、病理或病症的早期病征或症状的个体投予的治疗，投予这种治疗将达到减轻、防止或降低发展疾病、病理或医学病症的风险的目的。预防性治疗起到防止性治疗疾病或病症的作用。“预防活性”是某种试剂(例如，非天然免疫原和/或抗体，或其组合物)在投予未展现病理、疾病或病症的病征或症状(或只展现病理、疾病或病症的早期病征或症状)的个体时减轻、防止或降低个体发展病理、疾病或病症的风险的活性。本发明的“适用于预防的”试剂或化合物(例如非天然免疫原和/或抗体)是指可用于减轻、防止、治疗或减少病理、疾病或病症的发展的试剂或化合物。
治疗、疫苗和/或预防性治疗可投予有需要的患者。治疗、疫苗和/或预防性治疗也可以投予各种各样的动物，包括(但不限于)家畜，例如奶牛、猪、山羊、绵羊、鸡，和/或其它常见的农场动物和常见的家养宠物，例如猫、狗、鹦鹉、长尾鹦鹉等。
术语“选择密码子”是指在翻译过程中由O-tRNA识别且不被内源性tRNA识别的密码子。O-tRNA反密码子环识别mRNA上的选择密码子，并且在多肽中的这一位点并入其氨基酸，例如所选氨基酸，如非天然氨基酸。选择密码子可例如包括(但不限于)无义密码子，例如终止密码子，包括(但不限于)琥珀密码子、赭石密码子和蛋白石密码子；四个或四个以上碱基密码子；稀有密码子；从天然或非天然碱基对获得的密码子等。对于指定系统，选择密码子也可以包括一个天然三碱基密码子，其中内源性系统不使用(或极少使用)这一天然三碱基密码子。举例来说，这一内源性系统包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统，和/或天然三碱基密码子是稀有密码子的系统。
抑制性tRNA(suppressor tRNA)是例如通过提供对选择密码子反应而将氨基酸并入多肽链中的机制，来改变指定翻译系统中信使RNA(mRNA)的阅读的tRNA。举例来说，抑制性tRNA可通读包括(但不限于)终止密码子、四碱基密码子或稀有密码子在内的密码子。
术语“抑制活性”是指tRNA(例如，抑制性tRNA)通读选择密码子的能力。活性可以表示为观察到的活性相对于对照组(例如缺乏同源合成酶)活性的百分比。
术语“翻译系统”是指将天然存在的氨基酸并入正在生长的多肽链(蛋白质)所需的组件。翻译系统的组件可包括例如核糖体、tRNA、合成酶、mRNA等。本发明组件可加到体外或体内翻译系统中。翻译系统的实例包括(但不限于)非真核细胞，例如细菌(例如大肠杆菌)；真核细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞、昆虫细胞；无细胞翻译系统，例如细胞溶解产物，等。
翻译系统可为细胞翻译系统或无细胞翻译系统，并且可以是原核或真核翻译系统。细胞翻译系统包括(但不限于)全细胞制剂，例如可将所需核酸序列转录成mRNA并且翻译mRNA的渗透化细胞或细胞培养物。无细胞翻译系统在市面上有售，并且众所周知许多不同类型和系统。无细胞系统的实例包括(但不限于)原核细胞溶解产物，例如大肠杆菌溶解产物；和真核细胞溶解产物，例如麦胚提取物、昆虫细胞溶解产物、兔网织红细胞溶解产物、兔卵母细胞溶解产物和人细胞溶解产物。当将所得蛋白质糖基化、磷酸化，或以其它方式进行修饰时，由于许多此类修饰只可能在真核系统中发生，故优选真核提取物或溶解产物。这些提取物和溶解产物中有一些在市面上有售(普洛麦格公司(Promega)，位于威斯康星州麦迪逊(Madison，Wis.)；赛特杰公司(Stratagene)，位于加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla，Calif.)；安玛西亚生物技术公司(Amersham)，位于伊利诺伊州阿灵顿海茨(Arlington Heights，Ill.)；GIBCO/BRL公司，位于纽约州格兰德岛(Grand Island，N.Y.))。也有膜提取物(例如含有微粒体膜的犬胰腺提取物)可用，其适用于翻译分泌蛋白质。
还可使用重构的翻译系统。已经成功地使用纯化的翻译因子混合物，以及溶解产物或补充有纯化翻译因子(例如起始因子-1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延伸因子T(elongation factor T，EF-Tu)或终止因子)的溶解产物的组合，将mRNA翻译成蛋白质。无细胞系统也可为偶联的转录/翻译系统，其中如现代分子生物学技术(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.奥斯贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，威立出版公司(Wiley Interscience)，1993)(以引用的方式清楚地并入本文中)中所述，将DNA引入所述系统中，转录成mRNA并翻译mRNA。在真核转录系统中转录的RNA可为异核RNA(hnRNA)或者5′端戴帽(7-甲基鸟苷)且3′端加多聚腺苷酸尾的成熟mRNA形式，这在某些翻译系统中可为有利条件。举例来说，在网织红细胞溶解产物系统中，以高效率翻译戴帽的mRNA。
术语“所选氨基酸”是指任何所需的天然存在氨基酸或非天然氨基酸。本文中使用的术语“非天然氨基酸”或“非天然编码氨基酸”是指不为20种常见的天然存在氨基酸中的一种或者硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸的任何氨基酸、经修饰氨基酸和/或氨基酸类似物。可与术语“非天然编码氨基酸”和“非天然氨基酸(unnatural amino acid)”同义使用的其它术语为“非天然氨基酸(non-natural amino acid)”、“非天然存在氨基酸”以及其各种带连字符和不带连字符的型式。术语“非天然编码氨基酸”也包括(但不限于)通过修饰(例如，翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸，或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而产生，但本身未通过翻译复合物天然地并入到正 在生长的多肽链中的氨基酸。所述非天然存在氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
非天然氨基酸：本文中使用的非天然氨基酸是指除硒代半胱氨酸和/或吡咯赖氨酸和以下20种正规的遗传编码α-氨基酸外的任何氨基酸、经修饰氨基酸或氨基酸类似物：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。在本发明各种实施例中，并入非天然免疫原中的一个或一个以上非天然氨基酸可以是任何非天然氨基酸。因此，应理解，本文中陈述的特定非天然氨基酸当然不应视作对本发明的限制。已经通过例如使用包含正交元件的翻译系统，在体内编码多种非天然氨基酸，来将其并入蛋白质中。相关综述，例如参见刘(Liu)等人(2007)“在哺乳动物细胞中将非天然氨基酸遗传并入蛋白质中(Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells)”自然方法(Nat Methods)4：239-244；王(Wang)等人(2006)“扩充遗传密码(Expanding the genetic code)”生物物理学与生物分子结构年评(Annu Rev Biophys Biomol Struct)35：225-249；谢(Xie)和查鲁兹(Schultz)(2006)“蛋白质的化学工具箱—扩充的遗传密码(A chemical toolkit for proteins-an expanded genetic code)”自然评论：分子细胞生物学(Nat Rev Mol Cell Biol)7：775-782；王和查鲁兹“扩充遗传密码(Expanding the Genetic Code)，”德国应用化学杂志(Angewandte Chemie Int.Ed)，44(1)：34-66(2005)；和秦(Chin)等人(2003)“扩充的真核遗传密码(An expanded eukaryotic genetic code)”科学(Science)301：964-967。
在本发明一些实施例中，需要使用的非天然氨基酸不是20种常见的天然存在氨基酸中的任一种或稀有的天然存在氨基酸，例如硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸。举例来说，在本文中各种实施例中可以使用非天然氨基酸对硝基苯丙氨酸、对磺基酪氨酸和对羧基苯丙氨酸。在一些实施例中，非天然氨基酸可包括(但不限于)：对硝基苯丙氨酸；邻硝基苯丙氨酸；间硝基苯丙氨酸；对硼羰基苯丙氨酸(p-boronyl phenylalanine)；邻硼羰基苯丙氨酸；间硼羰基苯丙氨酸；对氨基苯丙氨酸；邻氨基苯丙氨酸；间氨基苯丙氨酸；对酰基苯丙氨酸；邻酰基苯丙氨酸；间酰基苯丙氨酸；对OMe苯丙氨酸；邻OMe苯丙氨酸；间OMe苯丙氨酸；对磺基苯丙氨酸；邻磺基苯丙氨酸；间磺基苯丙氨酸；5-硝基His；3-硝基Tyr；2-硝基Tyr；硝基取代的Leu；硝基取代的His；硝基取代的De；硝基取代的Trp；2-硝基Trp；4-硝基Trp；5-硝基Trp；6-硝基Trp；7-硝基Trp；3-氨基酪氨酸、2-氨基酪氨酸、O-磺基酪氨酸、2-磺基氧基苯丙氨酸、3-磺基氧基苯丙氨酸或对羧 基苯丙氨酸、邻羧基苯丙氨酸和间羧基苯丙氨酸。另外，应理解，本发明不限于特定非天然氨基酸。
此外，在本发明各种实施例中，可例如使用生物合成方法，在体外将非天然氨基酸并入免疫原中，在所述方法中利用所需非天然氨基酸将抑制性tRNA化学酰基化，并添加到能够支持免疫原生物合成的体外提取物中。有关所述体外合成方法的描述，例如参见V.W.柯尼西(V.W.Cornish)，D.孟德尔(D.Mendel)和P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)，德国应用化学(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)1995，34：621(1995)；C.J.诺伦(C.J.Noren)，S.J.安托尼-卡黑尔(S.J.Anthony-Cahill)，M.C.格雷夫斯(M.C.Griffith)，P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)，“用于将非天然氨基酸位点特异性并入蛋白质中的一般方法(A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins)，”科学(Science)244 182-188(1989)；和J.D.贝恩(J.D.Bain)，C.G.格雷布(C.G.Glabe)，T.A.迪克斯(T.A.Dix)，A.R.查柏林(A.R.Chamberlin)，E.S.迪阿拉(E.S.Diala)，“用于将非天然氨基酸位点特异性并入多肽中的生物合成方法(Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide)”，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)111：8013-8014(1989)。也可以借助可用的合成肽化学(此类方法也可将天然氨基酸转化成非天然氨基酸)或翻译后加工，将非天然氨基酸添加到天然或合成产生的蛋白质中。然而，也应理解，所述翻译后和化学修饰通常是与在分子合成期间并入一个或一个以上非天然氨基酸(例如直接并入，如正交翻译、固相合成等)结合进行或另外进行。因此，氨基酸的翻译后添加或化学修饰通常只是(如果进行的话)对在分子合成期间已经添加了非天然氨基酸的分子进行。下文将提供有关将非天然氨基酸非正交并入免疫原中的其它信息。
本文中使用的术语“源自”是指从特定分子或生物体分离或者使用来自特定分子或生物体的信息制造的组件。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源多聚核苷酸的细胞，不管用于插入的方法如何，例如直接摄取、转导、f配对，或此项技术中已知用于产生重组宿主细胞的其它方法。外源多聚核苷酸可以保持为非整合载体(例如质粒)的形式，或者可被整合到宿主基因组中。
本文中使用的术语“培养基”包括任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物，其可支撑或含有任何宿主细胞，包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核生物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核生物宿主细胞、大肠杆菌或假单胞菌属宿主细胞和细胞内容物。因此，这一术语涵盖已经生长了宿主细 胞的培养基，例如正在生长培养物或者全生物体或细胞的培养基，并且所述培养基中可包括非天然氨基酸以支持复制缺陷型生物体或细胞的生长，包括增殖步骤之前或之后的培养基。这一术语还可涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲液或试剂，例如抗原是在细胞内产生并且宿主细胞溶解或破裂而释放所述抗原或重组抗原的情形。
本文中提到蛋白质再折叠时使用的“还原剂”定义为使硫氢基保持还原态，并且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或材料。适当还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。所属领域技术人员易于了解，多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。
本文中提到蛋白质再折叠时使用的“氧化剂”定义为能够从所氧化的化合物中去除电子的任何化合物或材料。适当氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化的二硫苏糖醇、氧化的赤藓醇和氧。所属领域技术人员易于了解，多种氧化剂适用于本发明的方法中。
本文中使用的“再折叠”是关于二硫键，其描述将含有二硫键的多肽从未适当折叠或展开状态转变成天然或适当折叠的构象的任何过程、反应或方法。
本文中使用的“共折叠”是指使用至少两个多肽的再折叠过程、反应或方法，这些多肽彼此相互作用，并且使展开或不恰当折叠的多肽转变成天然的适当折叠的多肽。
“氨基末端修饰基团”是指可与多肽的氨基末端连接的任何分子。类似地，“羧基末端修饰基团”是指可与多肽的羧基末端连接的任何分子。末端修饰基团包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质(例如血清白蛋白)，或者增加肽的血清半衰期的其它部分。
此项技术中和本文中使用的术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应位点”、“化学反应性基团”和“化学反应性部分”是指分子中截然不同、可定义的部分或单元。这些术语在某种程度上与在化学技术中的含义同义，且在本文中用于指示分子中执行某种功能或活性并与其它分子反应的部分。
本文中使用的术语“键”或“连接子”是指通常由化学反应形成的基团或键结，且通常为共价键。水解稳定性键是指，这些键在水中实质上稳定，并且在有用的pH值下(包括(但不限于)在生理条件下)可在一段较长时间内(可能甚至无限期)不与水反应。水解不稳定或可降解性键意思是指，这些键可在水或水溶液(包括例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解性键是指，这些键可经一种或一种以上酶降解。此项技术中应了解，PEG和相关聚合物可在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接基团中包括可降解的键。举例来说，由PEG羧酸或活性PEG 羧酸与生物活性剂上的醇基反应而形成的酯键一般会在生理条件下水解，释放出所述试剂。其它水解可降解键包括(但不限于)碳酸酯键；由胺与醛反应产生的亚胺键；通过醇与磷酸基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸盐与醇的反应产物的原酸酯键；由(包括(但不限于))聚合物(诸如PEG)末端的胺基与肽的羧基形成的肽键；和由(包括(但不限于))聚合物末端的亚磷酰胺(phosphoramidite)基与寡核苷酸的5′羟基形成的寡核苷酸键。
用于本文中时，术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”是指可影响与生物体有关的生物系统、路径、分子或相互作用的任何物理或生物化学特性的任何物质，所述生物体包括(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人。具体说来，本文中使用的生物活性分子包括(但不限于)打算用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防人或其它动物的疾病，或以其它方式增强人或动物的身体或精神良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、疫苗、免疫原、硬药(hard drug)、软药、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、类毒素、毒素、原核生物和真核生物细胞、病毒、多糖、核酸和其得自或来源于病毒、细菌、昆虫、动物或任何其它细胞或细胞类型的部分，脂质体、微粒和胶束。适用于本发明的生物活性剂的种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显像剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管药、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇药、微生物来源的毒素等。
除非另作规定，否则术语“芳基”是指可为单环或者为稠合在一起或共价连接的多个环(包括(但不限于)1到3个环)的多不饱和、芳香烃取代基。术语“杂芳基”是指含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选经氧化，且氮原子任选经季铵化。杂芳基可经由杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述每一芳基和杂芳基环系统的取代基都选自下文所述的可接受取代基的群组。
为简洁起见，术语“芳基”当与其它术语(包括(但不限于)芳氧基、芳硫氧基、 芳烷基)组合使用时，将包括上文所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”拟包括芳基与烷基连接的那些基团(包括(但不限于)苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亚甲基)已经被例如氧原子置换的烷基(包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
上述每一术语(包括(但不限于)“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)都打算包括所述基团的经取代和未取代形式。下文将提供各类基团的例示性取代基。
烷基和杂烷基(包括常常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可为选自包括(但不限于)以下各基团的多个基团中的一个或一个以上基团：-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2，其数量在0到(2m′+1)的范围内，其中m′为所述基团中碳原子的总数。R′、R″、R″′和R″″各独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)经1到3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基，或芳基烷基。举例来说，当本发明化合物包括一个以上R基团时，各R基团是如各R′、R″、R″′和R″″基团在存在超过一个时那样独立地选择。当R′与R″连接到同一氮原子时，其可与所述氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″拟包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。所属领域技术人员从上文有关取代基的论述将了解到，术语“烷基”拟包括碳原子与除氢基外的基团结合的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
与针对烷基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基可变化，并且选自(但不限于)：卤素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其数量在0到芳香族环系统上开放价态的总数的范围内；且其中R′、R″、R″′和″″独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例来说，当本发明化合物包括一个以上R基团时，各R基团是如各R′、R″、R″′和R″″基团在存在超过一个时那样独立地选择。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸，以及其聚合物。除非特别限制，否则这一术语涵盖含有天然核苷酸的已知 类似物的核酸，这些核酸的结合特性与参考核酸类似，并且代谢方式也与天然存在的核苷酸类似。除非另作明确限制，否则所述术语还指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽基核酸(peptidonucleic acid))、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另作指示，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体来说，可通过产生一个或一个以上所选(或所有)密码子的第三位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(拜特泽(Batzer)等人，核酸研究(Nucleic Acid Res.)19：5081(1991)；大冢(Ohtsuka)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)260：2605-2608(1985)；罗斯里尼(Rossolini)等人，分子与细胞探针(Mol.Cell.Probes)8：91-98(1994))。
当用从左向右书写的常规化学式说明取代基时，这些取代基同样涵盖由从右向左书写结构所得到的化学上一致的取代基，例如，结构CH2O与结构-OCH2等同。
术语“取代基”包括(但不限于)“非干扰性取代基”。“非干扰性取代基”是得到稳定化合物的那些基团。适当的非干扰性取代基或基团包括(但不限于)卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C2-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中m为1到8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、--NO2、--CN、--NRC(O)--(C1-C10烷基)、--C(O)--(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫烷基、--C(O)O--(C1-C10烷基)、--OH、--SO2、＝S、--COOH、--NR2、羰基、--C(O)--(C1-C10烷基)-CF3、--C(O)-CF3、--C(O)NR2、--(C1-C10芳基)-S--(C6-C10芳基)、-C(O)--(C1-C10芳基)、--(CH2)m--O--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中各m为1到8)、--C(O)NR2、--C(S)NR2、--SO2NR2、--NRC(O)NR2、--NRC(S)NR2，其盐等。本文中使用的各R为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
除非另作规定，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“烷基”意思是具有指定碳原子数(即，C1-C10意思是1到10个碳)的直链或支链或者环状烃基或其组合，其可为完全饱和、单或多不饱和的，并且可包括二价和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)例如以下基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体，等。不饱和烷基是具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和 烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基(crotyl)、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，以及高级同系物和异构体。除非另作说明，否则术语“烷基”还打算包括下文更为详细地定义的那些烷基衍生物，例如“杂烷基”。局限于烃基的烷基称为“同系烷基(homoalkyl)”。
单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚烷基”是指衍生自烷烃的二价基团，例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，且另外包括下文描述为“亚杂烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)将具有1到24个碳原子，其中具有10个或更少碳原子的那些基团为本文所述方法和组合物的特定实施例。“低碳数烷基”或“低碳数亚烷基”是一般具有8个或更少碳原子的短链烷基或亚烷基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫烷氧基)是以其常规含义使用，并且指分别经由氧原子、氨基或硫原子与分子剩余部分连接的那些烷基。
除非另作规定，否则单独或与另一术语组合的术语“杂烷基”是指稳定的直链或支链或者环状烃基，或其组合，其是由规定数量的碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可任选经氧化，且氮杂原子可任选经季铵化。杂原子O、N以及S和Si可位于杂烷基的任一内部位置或在烷基与分子其余部分连接的位置。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-OCH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可为连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚杂烷基”是指衍生自杂烷基的二价基团，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基，相同或不同杂原子也可占据任一个或两个链末端(包括(但不限于)亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等)。另外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团，连接基团的化学式的书写方向并不表示连接基团的定向。举例来说，式-C(O)2R′表示-C(O)2R′和-R′C(O)2。
除非另作说明，否则单独或与其它术语组合时术语“环烷基”和“杂环烷基”分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和、部分不饱和与完全不饱和的环键。此外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、 四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。此外，这一术语还涵盖双环和三环结构。类似地，单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚杂环烷基”是指衍生自杂环烷基的二价基团，并且单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚环烷基”是指衍生自环烷基的二价基团。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在氨基酸，以及作用方式与天然存在氨基酸类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指基础化学结构与天然存在氨基酸相同的化合物，即，α碳与氢、羧基、氨基和R基团结合，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但仍保留与天然存在氨基酸相同的基础化学结构。提到氨基酸包括例如天然存在的成蛋白质性(proteogenic)L-氨基酸；D-氨基酸，化学修饰的氨基酸，例如氨基酸变异体和衍生物；天然存在的非成蛋白质性(non-proteogenic)氨基酸，例如α-丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有此项技术中已知为氨基酸特征的特性的化学合成化合物。非天然存在氨基酸的实例包括(但不限于)α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如2-氨基-组氨酸、α-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸)、侧链中具有额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)，以及侧链中的羧酸官能团经磺酸基置换的氨基酸(例如磺基丙氨酸(cysteic acid))。
氨基酸在本文中可以利用其普遍已知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号提及。同样，核苷酸也可以利用其普遍认可的单字母代码提及。
“保守修饰变异体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，“保守修饰变异体”是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上一致的序列。由于遗传密码具有简并性，使得大量功能一致的核酸可编码任何指定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定丙氨酸的每一位置，所述密码子可变成任一所述的相应密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异为“沉默变异(silent variation)”，是保守修饰变异的一种。本文中编码一种多肽的每一核酸序列也描述这一核酸的每一可能的沉默变异。所属领域一般技术人员将认识到，核酸中的每一密码子(通常为甲硫氨酸唯 一密码子的AUG，和通常为色氨酸唯一密码子的TGG除外)可经修饰而得到功能一致的分子。因此，编码多肽的核酸的各个沉默变异暗含于每一所述序列中。
对于氨基酸序列，所属领域一般技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码序列中的单一氨基酸或小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列个别取代、缺失或添加为“保守修饰变异体”，其中所述改变引起氨基酸的缺失、氨基酸的添加或者化学上类似的氨基酸对某一氨基酸的取代。此项技术中众所周知提供功能类似的氨基酸的保守取代表。所述保守修饰变异体除为多形态变异体外且不排除多形态变异体，还为本发明的种间同系物和等位基因。
所属领域一般技术人员已知可提供功能相似氨基酸的保守取代表。以下八个群组各自含有彼此互为保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)，
(例如参见科雷敦(Creighton)，蛋白质：结构和分子特性(Proteins：Structures and Molecular Properties)(W H弗雷曼出版社(W H Freeman & Co.)；第2版(1993年12月))。
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或“一致性”百分比是指两个或两个以上序列或子序列相同。当使用以下序列比较算法(或所属领域一般技术人员可用的其它算法)中的一者或通过手工比对和目测来测量，在比较窗或指定区域上比较和比对最大对应性时，如果各序列具有一定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域内约60％一致、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％一致)，那么所述序列“实质上一致”。此定义也指测试序列的互补性。一致性可存在于长至少约50个氨基酸或核苷酸的区域，或长75到100个氨基酸或核苷酸的区域，或者(未指定时)跨越整个多聚核苷酸或多肽序列。可获得编码本发明多肽(包括来自除人外的物种的同系物)的多聚核苷酸的方法包含以下步骤：在严格杂交条件下，用具有本发明多聚核苷酸序列或其片段的经标记探针筛选文库，以及分离含有所述多聚核苷 酸序列的全长cDNA和基因组克隆体。所属领域技术人员众所周知所述杂交技术。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，供与测试序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机内，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或者可指定替代参数。随后序列比较算法基于这些程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
本文中使用的“比较窗”包括具有选自由20到600，通常约50到约200，更通常约100到约150组成的群组的相邻位置数量中的任一者的区段，其中在最佳比对两个序列后，序列可与相邻位置数量相同的参考序列相比较。所属领域一般技术人员已知供比较的序列比对方法。可利用(包括(但不限于))史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)(1970)应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2：482c的局部同源性算法；尼德尔曼(Needleman)和伍思奇(Wunsch)(1970)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443的同源性比对算法；皮尔森(Pearson)和利普曼(Lipman)(1988)美国国家科学院院刊(Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA)85：2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，575位理学博士，威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))；或者手工比对和目测(例如参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，现代分子生物学技术(Current Protocols in Molecular Biology)(1995增补版))，来进行供比较序列的最佳比对。
适用于测定序列一致性和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于奥特查尔(Altschul)等人(1997)核酸研究(Nuc.Acids Res.)25：3389-3402；和奥特查尔等人(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410中。进行BLAST分析的软件可通过万维网ncbi.nlm.nih.gov可见的美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公共可用。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用如下默认参数：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，和比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用如下默认参数：字长为3且期望值(E)为10，和BLOSUM62计分矩阵(参见赫尼霍夫(Henikoff)和赫尼霍夫(1992)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：10915)，比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。在进行BLAST算法时通常关闭“低复杂度”过滤器。
BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(例如参见卡尔琳(Karlin)和奥特查尔(Altschul)(1993)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：5873-5787)。BLAST算法所提供的一种相似性度量为最小和概率(smallest sum  probability，P(N))，其可指示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然出现的匹配的概率。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总和概率小于约0.2，或小于约0.01，或小于约0.001，那么认为所述核酸与参考序列类似。
短语“与……选择性(或特异性)杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(包括(但不限于)全细胞或者DNA或RNA文库)中时，分子只与所述序列在严格杂交条件下结合、形成双链体或杂交。
短语“严格杂交条件”是指DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列在此项技术中已知的低离子强度和高温条件下杂交。通常，在严格条件下，探针将与其在复杂核酸混合物(包括(但不限于)全细胞或者DNA或RNA文库)中的目标子序列杂交，而不与在这一复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件与序列相关，并且会随环境不同而不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的详尽指导可见于迪杰森(Tijssen)，生物化学和分子生物学实验技术--核酸探针杂交(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes)，“杂交原理和核酸分析策略综述(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays)”(1993)中。通常，在指定离子强度pH值下，选择的严格条件比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm为平衡时有50％与目标互补的探针与目标序列杂交的温度(在指定离子强度、pH值和核酸浓度下)(当目标序列过量存在时，在Tm下，平衡时有50％探针被占据)。严格条件可为在pH 7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)为至少约30℃而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)为至少约60℃的条件。严格条件也可通过添加例如甲酰胺等去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号可为背景杂交的至少两倍，任选为背景杂交的10倍。例示性严格杂交条件如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下培育；或5×SSC、1％SDS，在65℃下培育，且在65℃下于0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
本文中使用的术语“真核生物”是指属于真核系统发生域的有机体，例如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、小孢子虫、原生生物等。
本文中使用的术语“非真核生物”是指非真核生物体。举例来说，非真核有机体可属于真细菌系统发生域，包括(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、极端嗜热细菌 (Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluoresceins)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等；或古菌系统发生域，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜盐菌(Halobacterium)(例如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和嗜盐菌属NRC-1(Halobacterium species NRC-1))、超嗜热古菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈嗜热球菌(Pyrococcus furiosus)、堀越火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)等)。
本文中使用的术语“个体”是指作为治疗、观察或实验的对象的动物，在一些实施例中为哺乳动物，而在其它实施例中为人。动物可为伴侣动物(例如狗、猫等)、家畜(例如奶牛、绵羊、猪、马等)或实验动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
本文中使用的术语“有效量”是指投予的经修饰非天然氨基酸多肽的量，将在一定程度上缓解所治疗的疾病、病况或病症的一种或一种以上症状。可投予含有本文中所述的经修饰非天然氨基酸多肽的组合物，以实现预防、增强和/或治疗性治疗。
术语“增强”是指增加或延长所需作用的效力或持续时间。因此，就增强治疗剂的作用来说，术语“增强”是指增加或延长其它治疗剂对系统的作用效力或持续时间的能力。本文中使用的“增强有效量”是指足以增强所需系统中另一治疗剂作用的量。用于患者时，适于此用途的有效量将取决于疾病、病症或病况的严重程度和病程、先前疗法、患者的健康状态和对药物的反应，以及治疗医师的判断。
本文中使用的术语“阳性选择”或“筛选标记物”是指当存在(例如，经表达、经活化等)时使得将具有阳性选择标记物的细胞从不具有阳性选择标记物的细胞中鉴别出来的标记物。
本文中使用的术语“阴性选择”或“筛选标记物”是指当存在(例如，经表达、经活化等)时使得鉴别出不具有所需特性(例如，与具有所需特性的细胞相比较)的细胞的标记物。
本文中使用的术语“报告基因”是指可用于选择相关系统中的目标组件的组件。举例来说，报告基因可包括赋予抗生素抗性或敏感性的蛋白质，例如酶(包括(但不限于)β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)等)；荧光筛选标记物(包括(但不限于)绿色荧光蛋白质，例如GPP)；YFP；EGFP；RFP；发光标记物(包括(但不限于)萤火虫荧光素酶蛋白)；基于亲和力的筛选标记物；或阳性或阴性选择性标记基因，例如lacZ、β-gal/lacZ(β-半乳糖苷酶)、ADH(醇脱氢酶)、his3、 ura3、leu2、lys2等。
本文中使用的术语“真核生物”是指属于真核系统发生域的生物体，例如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、小孢子虫、原生生物等。
本文中使用的术语“非真核生物”是指非真核生物体。非真核有机体可属于真细菌系统发生域，包括(但不限于)大肠杆菌、极端嗜热细菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌等；或古菌系统发生域，例如詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌(如沃氏嗜盐富饶菌和嗜盐菌属NRC-1)、超嗜热古菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌等。
还包括以下病毒包膜蛋白非限制性实例：来自线状病毒(filoviruses)(例如埃博拉病毒)、正粘病毒(orthomyxoviruses)(例如流感病毒)、VSV-G、α病毒(例如塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)和辛德毕斯病毒(Sindbis virus))、沙粒病毒(arena virus)(例如淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus))、黄病毒(flaviviruses)(例如蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus)和登革病毒(Dengue virus))、弹状病毒(rhabdoviruses)(例如水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)和狂犬病病毒)、莫洛尼氏白血病病毒(Moloney leukemia virus)、HSV、VZV、腮腺炎病毒(Mumps virus)、鼻病毒(Rhinovirus)、麻疹(Measles)、风疹病毒(Rubella)、虫媒病毒(Arbovirus)、肠病毒(Enteroviruses)(例如脊髓灰质炎(Polio)、柯萨奇病毒(Coxsackie)、埃可病毒(Echovirus))、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒B、A和埃可病毒、鼻病毒、肝炎病毒、诺沃克病毒(Norwalk virus)、星状病毒(Astroviruses)、披衣病毒(Togavirus)、甲病毒属(Alphaviruses)、瘟病毒(Pestiviruses)、冠状病毒(Coronavirus)、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)、布尼亚病毒(Bunyaviridae)、呼肠弧病毒(Reoviridue)、呼肠孤病毒(Reoviruse)、轮状病毒(Rotaviruses)、HTLV、多瘤病毒(Polyomaviruses)、乳头瘤病毒(Papillomaviruses)、腺病毒(Adenoviruses)、细小病毒(Adenoviruses)、EBV、CMV、水痘-带状疱疹病毒、疱疹病毒和痘病毒的包膜蛋白。
保守变异体：术语“保守变异体”是指功能与得到保守变异体的组件(例如O-tRNA或O-RS)类似但序列发生变异的翻译组件，例如保守变异体O-tRNA或保守变异体O-RS。举例来说，O-RS将利用例如非天然氨基酸等所选氨基酸将互补O-tRNA或保守变异体O-tRNA氨酰基化，但所述O-tRNA和所述保守变异体O-tRNA不具有相同序列。 举例来说，互补O-RS或保守变异体O-RS将利用例如非天然氨基酸等所选氨基酸将tRNA氨酰基化，但所述O-RS和所述保守变异体O-RS不具有相同序列。保守变异体的序列可具有例如一处变异、两处变异、三处变异、四处变异或者五处或五处以上变异，只要保守变异体与相应O-tRNA或O-RS互补即可。
选择或筛选剂：本文中使用的术语“选择或筛选剂”是指当存在时允许从群体中选择/筛选出某些组件的试剂。举例来说，选择或筛选剂例如包括(但不限于)养分、抗生素、光波长、抗体、表达的多聚核苷酸等。可例如通过浓度、强度等来改变选择剂。
术语“未有效识别”是指一种生物体的RS将O-tRNA氨酰基化的效率，例如低于约10％、低于约5％或低于约1％。
详细说明
到目前为止，疫苗只限于利用死生物体或减毒生物体产生的疫苗。通过热、UV、甲醛处理来杀死微生物将减少天然表位，并且减毒的病毒通常是通过基因缺失和截短所产生，而这引起极低但非零点复制，为免疫系统削弱的患者，尤其是年幼患者、年老患者带来风险。
在一个实施例中，本发明提供全生物体修饰的疫苗。在另一实施例中，本发明提供复制依赖于一个或一个以上非天然氨基酸的遗传修饰全生物体疫苗。本发明提供并有天然微生物的疫苗，其中可使用或不使用佐剂。这些另外可提供高密度的天然表位，而这些表位具有高免疫原性，并且会触发体液和T细胞介导的反应，由此提供更为有效的疫苗。本发明提供在病毒或细菌上的一个或一个以上位点中并有一个或一个以上非天然或非天然编码氨基酸的疫苗。在本发明一些实施例中，在一部分微生物上包括复制所需的非天然编码氨基酸，由此消除了与减毒病毒有关的风险，并且消除了对于杀死病毒/细菌的需求。并有非天然编码氨基酸的疫苗将提供一种微生物，其结构与天然微生物极其类似，但不能够复制，或只能够在自然环境中进行有限的复制。对于微生物复制的绝对控制可使用位点特异性并入氨基酸(下文将作详细描述)，以便使用终止密码子抑制来控制必需基因表达(功能)来实现。对于病毒，宿主产生细胞系位点特异性地并入发育所需的非天然氨基酸。对于细菌，基因组经工程改造以包括一个或一个以上位点特异性并入的非天然氨基酸。
必需基因功能的控制可在遗传和结构功能水平上实现。举例来说，表2，在遗传水平上，全长必需基因在非天然并入的氨基酸存在下得到表达。在结构功能水平上，必需基因经工程改造，以致只在特定位点的非天然氨基酸存在下才起作用。在此位点并入任何天然氨基酸将废除其天然功能。非天然氨基酸的选择自由度使得所属领域技术人员能 够调节所需疫苗的免疫原性和过量或过度控制复制的自由度，其中按照惯例，需要在复制衰减与产量之间达到平衡，非天然氨基酸的位点特异性并入提供了在不存在非天然氨基酸的情况下具有零复制能力的疫苗的开发工具。
可使用此技术用于开发疫苗的细菌和病毒包括已知病毒。在非限制性实例中，所述病毒包括影响上呼吸道的病毒，例如人鼻病毒(HRV)、腺病毒、柯萨奇病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)和细胞巨化病毒(CMV)；影响胃肠(GI)道的病毒，例如轮状病毒、诺沃克病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、脊髓灰质炎病毒和其它细小核糖核酸病毒；性传播病毒，包括(但不限于)人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)1、HSV-2、VZV、CMV、EBV、HHV-6、HHV-7和HHV-8；CMV、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)。细菌的非限制性实例包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，包括葡萄球菌属、链球菌属、分枝杆菌属(例如鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)和鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌(paratuberculosis))、肠球菌属、棒杆菌属、疏螺旋体属、芽孢杆菌属、衣原体属、支原体属等。
适于制备包括一个或一个以上所选氨基酸(例如非天然氨基酸)的蛋白质的翻译系统描述于以下文献中：美国专利申请案10/126,931，标题为“用于产生正交tRNA-氨酰基tRNA合成酶对的方法和组合物(METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL tRNA SYNTHETASE PAIRS)”；和10/126,927，标题为“非天然氨基酸的体内并入(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)”。此外，还参见USSN 10/825,867，标题为“扩充真核遗传密码(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)”。这些申请案各以全文引用的方式并入本文中。这些翻译系统一般包含包括正交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)，以及所选氨基酸(例如非天然氨基酸)的细胞，其中O-RS利用所选氨基酸将O-tRNA氨酰基化。本发明的正交对是由例如抑制性tRNA、移框tRNA等O-tRNA和O-RS构成。O-tRNA识别第一个选择密码子，并且在同源合成酶存在下对选择密码子反应而具有抑制活性。细胞使用这些组件来将所选氨基酸并入正在生长的多肽链中。举例来说，也可存在包含编码相关多肽的多聚核苷酸的核酸，其中所述多聚核苷酸包含可被O-tRNA识别的选择密码子。翻译系统也可以是体外系统。本发明的tRNA分子适用于任何翻译系统中，包括在翻译过程中利用核糖体的系统。
翻译系统也可以是无细胞(体外)翻译系统。在这些可包括mRNA作为模板(体外 翻译)或DNA作为模板(组合的体外转录与翻译)的系统中，体外合成是由核糖体所引导。曾进行过相当多的尝试来开发无细胞蛋白质表达系统。例如参见，肯姆D.M.(Kim，D.M.)和J.R.斯沃兹(J.R.Swartz)，生物技术与生物工程(Biotechnology and Bioengineering)，74：309-316(2001)；肯姆D.M.和J.R.斯沃兹，生物技术通讯(Biotechnology Letters)，22，1537-1542，(2000)；肯姆D.M.和J.R.斯沃兹，生物技术进展(Biotechnology Progress)，16，385-390，(2000)；肯姆D.M.和J.R.斯沃兹，生物技术与生物工程，66，180-188，(1999)；以及帕特耐克R.(Patnaik，R.)和J.R.斯沃兹，生物技术(Biotechniques)24，862-868，(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO 00/55353；WO 90/05785，都是以引用的方式并入本文中。另一种可用的方法包括mRNA-肽融合技术。例如参见R.罗伯特(R.Roberts)和J.斯佐塔克(J.Szostak)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))94：12297-12302(1997)；A.弗兰克尔(A.Frankel)等人，化学与生物学(Chemistry & Biology)10：1043-1050(2003)。在本方法中，在核糖体上将连接嘌呤霉素(puromycin)的mRNA模板翻译成肽。如果已对一个或一个以上tRNA分子进行修饰，那么也可将非天然氨基酸并入肽中。在读取了最后一个mRNA密码子后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽结合物在体外分析中具有引人关注的特性，那么可容易地由mRNA序列揭示其身份。以此方式，可筛选出包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的多肽文库，以鉴别具有所需特性的多肽。最近，已报导利用纯化组分进行的体外核糖体翻译，其允许合成经非天然编码氨基酸取代的肽。例如参见A.福斯特(A.Forster)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))100：6353(2003)。
在某些实施例中，本发明提供一种细胞，在这种细胞中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对细胞进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种细菌，在这种细菌中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对细菌进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种病毒，在这种病毒中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对病毒进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌细胞，在这种细胞中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌细胞进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种脑膜炎细胞，在这种细胞中， 已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对脑膜炎细胞进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种狂犬病细胞，在这种细胞中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对狂犬病细胞进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种藻类细胞，在这种细胞中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对藻类细胞进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种病毒细胞，在这种细胞中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对病毒细胞进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种细菌细胞，在这种细胞中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对细菌细胞进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种真菌细胞，在这种细胞中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对真菌细胞进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。
在某些实施实例中，本发明提供一种脊髓灰质炎细胞，在这种细胞中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对脊髓灰质炎细胞进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种大肠杆菌细胞，在这种细胞中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对大肠杆菌细胞进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种分枝杆菌细胞，在这种细胞中，已经将非天然氨基酸并入必需基因产物中。在本发明其它实施例中，已经对分枝杆菌细胞进行遗传修饰，以使其在基因产物中包括复制所需的非天然氨基酸。
在某些实施例中，本发明的遗传修饰非天然氨基酸依赖性细胞可用来制造疫苗。在某些实施例中，本发明的遗传修饰非天然氨基酸依赖性细胞可用来制造可作为疫苗投予的抗体。在某些实施例中，本发明的遗传修饰非天然氨基酸依赖性细胞可用于接种。
在某些实施例中，本发明包含tRNA的大肠杆菌细胞包括所述翻译系统。举例来说，本发明大肠杆菌细胞包括正交tRNA(O-tRNA)，其中O-tRNA在同源合成酶存在下对选择密码子反应而发挥抑制活性；正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；所选氨基酸；和包含编码相关多肽的多聚核苷酸的核酸，其中所述多聚核苷酸包含可由O-tRNA识别的选择密码子。
本发明还提供处于细胞中的多个O-tRNA/O-RS对，其允许并入一个以上所选氨基酸。在某些实施例中，细胞可进一步包括另一不同的O-tRNA/O-RS对和第二所选氨基酸，其中O-tRNA识别第二选择密码子，且O-RS优先利用第二所选氨基酸将O-tRNA氨酰基化。举例来说，细胞可进一步包含例如来源于詹氏甲烷球菌的酪氨酰基-tRNA合成酶的琥珀抑制性tRNA-氨酰基tRNA合成酶对。
O-tRNA和/或O-RS可为天然存在的，或者可通过使来自多种生物体的天然存在tRNA和/或RS突变得到，例如，由此可产生tRNA文库和/或RS文库。举例来说，产生正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的一个策略涉及将来自例如除宿主细胞外的一个来源或多种来源的异源tRNA/合成酶对引入宿主细胞中。异源合成酶候选物的特性包括例如，其不会加载于任何宿主细胞tRNA，而异源tRNA候选物的特性包括例如，其不会被任何宿主细胞合成酶氨酰基化。此外，异源tRNA对于所有宿主细胞合成酶来说是正交的。
另一产生正交对的策略涉及产生突变体文库以便筛选和/或选择O-tRNA或O-RS。这些策略也可以组合起来。
在各个实施例中，O-tRNA和O-RS是源自至少一种生物体。在另一实施例中，O-tRNA源自第一物种的天然存在或突变的天然存在tRNA，而O-RS源自第二物种的天然存在或突变的天然存在RS。在一个实施例中，第一生物体与第二生物体不同。举例来说，正交对可包括源自嗜热自养甲烷杆菌的tRNA合成酶，和源自古细菌(archael)tRNA(例如源自嗜盐菌属NRC-1)的tRNA。或者，第一生物体与第二生物体相同。更多信息参见本文中标题为“来源和宿主生物体”的部分。
在本发明某些实施例中，本发明O-tRNA包含SEQ ID NO.：1、2或3所述的多聚核苷酸序列，或其互补多聚核苷酸序列，或其保守变异体，或者是由其编码。也参见本文中标题为“核酸以及多肽序列和变异体”的部分。
正交tRNA(O-tRNA)
正交tRNA(O-tRNA)介导(例如在体内或体外)将所选氨基酸并入蛋白质中，这一蛋白质是由包含O-tRNA所识别的选择密码子的多聚核苷酸编码。可借助任何方法或技术，包括(但不限于)化学或酶促氨酰基化，利用所需氨基酸将本发明的O-tRNA氨酰基化。本发明的氨酰基化O-tRNA可直接加到翻译系统中。RS可以在体外或体内利用所选氨基酸将本发明O-tRNA氨酰基化。此外，RS可以是O-RS。本发明的O-tRNA可直接提供给翻译系统(例如，体外翻译组件，或细胞)，或者通过提供编码O-tRNA或其部分的多聚核苷酸提供给翻译系统。举例来说，O-tRNA或其部分是由如SEQ ID NO.： 1、2或3所述的多聚核苷酸序列或其互补多聚核苷酸序列，或其保守变异体编码。
本发明的O-tRNA包含在同源合成酶存在下对选择密码子反应而产生的抑制活性。抑制活性可由此项技术中已知的多种分析中的任一种测定。举例来说，可以使用β-半乳糖苷酶报告基因分析。可以使用在启动子控制下表达lacZ基因的质粒衍生物，例如其中lacZ的肽VVLQRRDWEN中的Leu-25经选择密码子(例如TAG、TGA、AGGA等密码子)或者(对酪氨酸、丝氨酸、亮氨酸来说)有义密码子(作为对照)置换。将衍生化lacZ质粒连同包含本发明O-tRNA的质粒一起引入适合生物体(例如，可以使用正交组件的生物体)的细胞中。也可以引入同源合成酶(呈多肽形式，或在表达时可编码同源合成酶的多聚核苷酸形式)。使细胞在培养基中生长到所需密度，例如达到OD600为约0.5，并例如使用BetaFluorTM β-半乳糖苷酶分析试剂盒(诺杰公司(Novagen))，进行β-半乳糖苷酶分析。抑制百分比计算为样品活性相对于相当的对照值的百分比，所述对照值为例如观察衍生化lacZ构建体得到的值，其中所述构建体在所需位置具有相应的有义密码子而非选择密码子。
在tRNA分子中，胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)置换。此外，也可能存在其它碱基修饰。本发明还包括O-tRNA的保守变异体。举例来说，O-tRNA的保守变异体包括功能与所述O-tRNA类似且保持tRNA的L形结构，但序列不同的那些分子(且不是野生型tRNA分子)。也参见本文中标题为“核酸以及多肽序列和变异体”的部分。
包含O-tRNA的组合物可进一步包括正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS优先利用所选氨基酸(例如非天然氨基酸)将O-tRNA氨酰基化。在某些实施例中，包括O-tRNA的组合物可进一步包括翻译系统(例如体外或体内翻译系统)。在细胞或其它翻译系统中也可存在包含编码相关多肽的多聚核苷酸的核酸，其中所述多聚核苷酸包含一个或一个以上由O-tRNA识别的选择密码子，或者一个或一个以上所述密码子的组合。也参见本文中标题为“正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)”的部分。
产生正交tRNA(O-tRNA；例如O-tRNA)的方法也是本发明的特征。由所述方法产生的tRNA，例如O-tRNA，也是本发明的特征。
产生正交tRNA的方法包括使tRNA池中每一tRNA的反密码子环突变，以允许识别选择密码子(例如琥珀密码子、蛋白石密码子、四碱基密码子等)，由此提供多个潜在的O-tRNA；和分析所述多个潜在O-tRNA的成员的二级结构，以鉴别出所述二级结构中的非正规碱基对，以及任选使这些非正规碱基对突变(例如使非正规碱基对突变成正规碱基对)。非正规碱基对可位于二级结构的茎区。O-tRNA可具有一种或一种以上改良的特征或活性，例如与原料(例如多个tRNA序列)相比较，对所需生物体的正交性 有所改良，同时仍保留对所需RS的亲和力。
另外，可通过使已知tRNA突变，以调节其与一个或一个以上影响翻译或作为翻译机器的组件的分子的相互作用或结合亲和力，来开发O-tRNA。所述组件包括(但不限于)延伸因子。细菌延伸因子EF-Tu在蛋白质合成的延伸步骤中起到关键作用。在tRNA合成酶将tRNA氨酰基化后，EF-Tu结合氨酰基化的tRNA，并将其运送到核糖体A位点。所加载的氨基酸与tRNA之间的酯键因EF-Tu与氨酰基化tRNA之间结合而受到保护，免于发生自发水解。斯图奇维(Stortchevoi)等人研究了大肠杆菌TΨC茎中起始tRNAfMet U50:G64摇摆碱基对(wobble base pair)的突变体，因为发现这一碱基对是二级负性决定因素(secondary negative determinant)，将阻断在延伸过程中tRNA的活性，这可能是由EF-Tu.GTP与氨酰基化tRNA间的弱相互作用引起(JBC 2003 278(20)：17672-17679)。拉瑞文(LaRiviere)等人也在科学(Science)(2001年10月5日；294(5540)：165-8)中描述了氨基酸和tRNA体(tRNA body)对于针对EF-Tu的总体结合亲和力在热力学上的贡献。他们指出，tRNA体与氨基酸的贡献相互独立，并且当tRNA被正确氨酰基化时，两者相互补偿。EF-Tu.GTP与经非天然氨基酸氨酰基化的tRNA之间相互作用的改变可能影响tRNA装载到核糖体A位点的效率。通过分析tRNA与翻译机器其它组件(例如EF-Tu)之间的复合物的晶体结构，也可能发现潜在的突变位点。举例来说，尼森(Nissen)等人已经指出，EF-Tu.GTP直接结合于酵母苯丙氨酰基-转移RNA(Phe-tRNA)的TΨC茎的磷酸酯主链(科学(Science)1995270(5241)：1464-1472)。
这些方法任选包括分析tRNA和/或氨酰基-tRNA合成酶的序列同源性，以便确定看起来对特定生物体来说是正交的O-tRNA、O-RS和/或其对的潜在候选物。此项技术中已知和本文中描述的计算机程序都可用于此项分析中。在一个实例中，为了选择用于原核生物体中的潜在正交翻译组件，选出的合成酶和/或tRNA不会呈现与原核生物体不寻常的同源性。
也可借助共有性策略(consensus strategy)产生tRNA池。举例来说，通过比对多个tRNA序列；确定共有序列(consensus sequence)；并使用至少一部分、大部分或完整共有序列产生tRNA文库，来产生tRNA池。举例来说，可以用计算机程序，例如GCG程序pileup，编制共有序列。任选将由这一程序测定的简并位置变为在这些位置最频繁出现的碱基。借助此项技术中已知的技术，使用共有序列合成文库。举例来说，可以通过重叠延伸寡核苷酸，基于共有序列来提供文库，其中合成的tRNA基因的每一位点都为90％共有序列与10％其它3个碱基混合物的掺杂混合物。也可以使用其它混合物，例如75％共有序列与25％其它3个碱基混合物、80％共有序列与20％其它3个碱基混合物、 95％共有序列与5％其它3个碱基混合物等。
突变tRNA文库可以使用此项技术中已知的各种诱变技术产生。举例来说，可通过位点特异性突变、随机点突变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构建或其任何组合，产生突变型tRNA。
其它突变可引入到所需tRNA环或区域(例如反密码子环、接受茎、D臂或环、可变环、TΨC臂或环、tRNA分子的其它区域或其组合)中的特定位置，例如非保守性位置或保守性位置、随机位置或其组合。突变可包括茎区中相配的碱基对。
通常，通过使第一物种细胞群(其中所述细胞包含多个潜在O-tRNA的成员)经历阴性选择来获得O-tRNA。阴性选择除去包含多个潜在O-tRNA的成员的细胞，所述O-tRNA成员由细胞内源性氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化。这将提供与第一物种细胞正交的tRNA池。
在阴性选择的某些实施例中，将选择密码子引入编码阴性选择标记物的多聚核苷酸中的非必需位置，所述阴性选择标记物为例如赋予抗生素抗性的酶，例如β-内酰胺酶；赋予可检测产物的酶，例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)，例如有毒产物，例如芽孢杆菌RNA酶(barnase)等。筛选/选择可通过使细胞群在选择剂(例如抗生素，如氨苄青霉素)存在下生长来进行。在一个实施例中，选择剂的浓度不同。
举例来说，为了测量抑制性tRNA的活性，所用选择系统是基于选择密码子的体内抑制，例如将无义或移码突变引入编码阴性选择标记物的多聚核苷酸(例如β-内酰胺酶基因，bla)中。举个例子，构建在某一位置具有例如TAG、AGGA和TGA的多聚核苷酸变异体，例如bla变异体。用这些多聚核苷酸转化细胞，例如细菌。在内源性大肠杆菌合成酶无法有效加载的正交tRNA的情况下，抗生素抗性，例如氨苄青霉素抗性，应接近或低于未用质粒转化的细菌。如果tRNA不是正交tRNA，或者如果在所述系统中共表达能够加载于tRNA的异源合成酶，那么将观察到较高的抗生素(例如氨苄青霉素)抗性水平。选择的细胞(例如细菌)在抗生素浓度与未用质粒转化的细胞大致相同的情况下，不能在LB琼脂板上生长。
对于有毒产物(例如核糖核酸酶芽孢杆菌RNA酶)，当内源宿主(例如大肠杆菌)合成酶(即，其不与宿主正交，例如大肠杆菌合成酶)将多个潜在tRNA的成员氨酰基化时，选择密码子受到抑制，且产生的有毒多聚核苷酸产物导致细胞死亡。带有正交tRNA或非功能性tRNA的细胞存活。
在一个实施例中，随后使对所需生物体正交的tRNA池经历阳性选择，其中将选择密码子放入例如由药物抗性基因(如β-内酰胺酶基因)编码的阳性选择标记物中。对包 含编码或包含tRNA池的成员的多聚核苷酸、编码阳性选择标记物的多聚核苷酸和编码同源RS的多聚核苷酸的细胞执行阳性选择。这些多聚核苷酸在细胞中表达，并且细胞在选择剂(例如氨苄青霉素)存在下生长。随后，针对tRNA被共表达的同源合成酶氨酰基化以及对选择密码子反应而插入氨基酸的能力来选择tRNA。通常，这些细胞的抑制效率相比带有非功能性tRNA或不能被相关合成酶有效识别的tRNA的细胞有所增强。带有非功能性或不能被相关合成酶有效识别的tRNA的细胞对抗生素敏感。因此，满足以下条件的tRNA将在两个选择中存活：(1)不是内源宿主(例如大肠杆菌)合成酶的底物；(ii)可被相关合成酶氨酰基化；和(iii)在翻译过程中起作用。
在上文描述的方法中，选择(例如阳性选择、阴性选择，或阳性选择和阴性选择二者)的严格度任选可变化。举例来说，由于芽孢杆菌RNA酶是一种毒性极高的蛋白质，故通过将不同数量的选择密码子引入芽孢杆菌RNA酶基因中和/或通过使用可诱导启动子，来控制阴性选择的严格度。在另一个实例中，选择剂或筛选剂的浓度不同(例如氨苄青霉素)。在一方面中，由于在前几轮选择期间所需活性较低，以致严格度有所变化。因此，在前几轮选择中应用不太严格的选择标准，而在稍后几轮选择中应用较严格的标准。在某些实施例中，阴性选择、阳性选择或阴性选择与阳性选择二者可重复多次。可以使用多种不同的阴性选择标记物、阳性选择标记物或阴性和阳性选择标记物。在某些实施例中，阳性选择标记物与阴性选择标记物可相同。
本发明中可以使用其它类型的选择/筛选来产生正交翻译组件，例如O-tRNA、O-RS和O-tRNA/O-RS对。举例来说，阴性选择标记物、阳性选择标记物或阳性和阴性选择标记物可包括在适合反应物存在下发荧光或催化发光反应的标记物。在另一实施例中，通过荧光活化的细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)或通过发光来检测标记物的产物。所述标记物任选包括基于亲和力的筛选标记物。参见弗朗西斯科J.A.(Francisco，J.A.)等人(1993)在外表面上表达功能性抗体片段的大肠杆菌的产生和荧光活化细胞分选(Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface).美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.)90：10444-8。
其它产生重组正交tRNA的方法可见于例如以下文献中：美国专利申请案10/126,931，标题为“用于产生正交tRNA-氨酰基tRNA合成酶对的方法和组合物(Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs)”；和10/126,127，标题为“体内并入非天然氨基酸(In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids)”；和USSN 10/825,867，标题为“扩充真核遗 传密码(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)”。也参见福斯特(Forster)等人，(2003)通过翻译从头设计的遗传密码来设计模拟肽合成酶。(Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo.)美国国家科学院院刊(PNAS)100(11)：6353-6357；和冯(Feng)等人，(2003)，借助单氨基酸改变来扩充tRNA合成酶对tRNA的识别(Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change)，美国国家科学院院刊100(10)：5676-5681。
可借助任何方法或技术，包括(但不限于)化学或酶促氨酰基化，利用所需氨基酸将本发明的tRNA氨酰基化。
氨酰基化可利用氨酰基tRNA合成酶或其它酶分子(包括(但不限于)核糖酶)实现。术语“核糖酶”可与“催化性RNA”互换。克奇(Cech)和同事(克奇，1987，科学(Science).236：1532-1539；麦克科勒(McCorkle)等人，1987，生物化学概念(Concepts Biochem.)64：221-226)证实存在可充当催化剂的天然存在RNA(核糖酶)。不过，尽管仅显示这些天然RNA催化剂对核糖核酸底物作用而实现裂解和剪接，但近来核糖酶人为进化的发展已将催化谱系扩充到各种化学反应。多项研究已鉴别出可催化自身(2′)3′末端上氨酰基-RNA键的RNA分子(爱兰克卡尔(Illangakekare)等人，1995，科学(Science)267：643-647)，以及可将氨基酸从一个RNA分子转移到另一者的RNA分子(罗斯(Lohse)等人，1996，自然(Nature)381：442-444)。
美国专利申请公开案2003/0228593(以引用的方式并入本文中)描述了构建核糖酶的方法和其于利用天然编码和非天然编码氨基酸将tRNA氨酰基化中的用途。可使tRNA氨酰基化的酶分子(包括(但不限于)核糖酶)的基质固定形式(Substrate-immobilized forms)能够有效亲和纯化氨酰基化的产物。适合基质的实例包括琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。用于氨酰基化的基质固定形式核糖酶的制备和使用描述于化学与生物学(Chemistry and Biology)2003，10：1077-1084和美国专利申请公开案2003/0228593中，其以引用的方式并入本文中。
化学氨酰基化方法包括(但不限于)以下文献中介绍的避免在氨酰基化过程中使用合成酶的方法：海奇特(Hecht)和同事(海奇特S.M.(Hecht，S.M.)化学研究述评(Ace.Chem.Res.)1992，25，545；海克勒T.G.(Heckler，T.G.)；罗塞尔J.R.(Roesser，J.R.)；徐C(Xu，C)；常P.(Chang，P.)；海奇特S.M.，生物化学(Biochemistry)1988，27，7254；海奇特S.M.；阿尔福德B.L.(Alford，B.L.)；黑田Y.(Kuroda，Y.)；北野S.(Kitano，S.)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1978，253，4517)；和查鲁兹(Schultz)，查柏林(Chamberlin)，道赫提(Dougherty)等人(柯尼西V.W.(Cornish，V.W.)；孟德尔D.(Mendel，D.)；查 鲁兹P.G.(Schultz，P.G.)德国应用化学(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)1995，34，621；罗宾森S.A.(Robertson，S.A.)；埃尔曼J.A.(Ellman，J.A.)；查鲁兹P.G.，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)1991，113，2722；诺伦C.J.(Noren，C.J.)；安托尼-卡黑尔S.J.(Anthony-Cahill，S.J.)；格雷夫斯M.C.(Griffith，M.C.)；查鲁兹P.G.，科学(Science)1989，244，182；贝恩J.D.(Bain，J.D.)；格雷布C.G.(Glabe，C.G.)；迪克斯T.A.(Dix，T.A.)；查柏林A.R.(Chamberlin，A.R.)，美国化学协会杂志1989，111，8013；贝恩J.D.等人，自然(Nature)1992，356，537；盖里梵J.P.(Gallivan，J.P.)；莱斯特H.A.(Lester，H.A.)；道赫提D.A(Dougherty，D.A)化学与生物学(Chem.Biol.)1997，4，740；特卡提(Turcatti)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1996，271，19991；诺瓦克M.W.(Nowak，M.W.)等人科学，1995，268，439；萨克斯M.E.(Saks，M.E.)等人生物化学杂志1996，271，23169；村上T.(Hohsaka，T.)等人美国化学协会杂志1999，121，34)。这些方法或其它化学氨酰基化方法都可用于将本发明的tRNA分子氨酰基化。
采用化学修饰的氨酰基-tRNA的生物合成方法已被用于将数种生物物理探针并入在体外合成的蛋白质中。参见以下出版物和其中引用的参考文献：布伦纳J.(Brunner，J.)新的光标记和交联方法(New Photolabeling and crosslinking methods)，生物化学年评(Annu.Rev Biochem)，62：483-514(1993)；和克雷格U.C.(Krieg，U.C.)，沃特P.(Walter，P.)，霍恩森A.E.(Hohnson，A.E.)信号识别粒子的54kDa多肽新生催乳激素前体的信号序列的光交联(Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci)，83(22)：8604-8608(1986)。
先前已证实，在体外通过将以化学方式氨酰基化的抑制性tRNA添加到经含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中，可将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，可使用对于特定氨基酸来说为营养缺陷型的菌株，用密切结构同源物取代20种常见氨基酸中的多种氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如参见诺伦C.J.(Noren，C.J.)，安托尼-卡黑尔(Anthony-Cahill)，格雷夫斯M.C.(Griffith，M.C.)，查鲁兹P.G.(Schultz，P.G.)用于将非天然氨基酸位点特异性并入蛋白质中的一般方法(A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins)，科学(Science)，244：182-188(1989)；M.W.诺瓦克(M.W.Nowak)等人，科学，268：439-42(1995)；贝恩J.D.(Bain，J.D.)，格雷布C.G.(Glabe，C.G.)，迪克斯T.A.(Dix，T.A.)，查柏林A.R.(Chamberlin，A.R.)，迪阿拉E.S.(Diala，E.S.)将非天然氨 基酸位点特异性并入多肽中的生物合成方法(Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide)，美国化学协会杂志(J.Am Chem Soc)，111：8013-8014(1989)；N.鲍里斯(N.Budisa)等人，美国实验生物学联合会会刊(FASEB J.)13：41-51(1999)；埃尔曼J.A.(Ellman，J.A.)，孟德尔D.(Mendel，D.)，安托尼-卡黑尔S.(Anthony-Cahill，S.)，诺伦C.J.，查鲁兹P.G.，用于将非天然氨基酸位点特异性引入蛋白质中的生物合成方法(Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins)，酶学方法(Methods in Enz.)第202卷，301-336(1992)；以及孟德尔D.，柯尼西V.W.(Cornish，V.W.)和查鲁兹P.G.，利用扩充的遗传密码进行定点诱变(Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code)，生物物理与生物大分子结构评述(Annu Rev Biophys.Biomol Struct.)24，435-62(1995)。
举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制性tRNA，并用非天然氨基酸以化学方式氨酰基化。使用常规定点诱变在蛋白质基因中的相关位点处引入终止密码子TAG。例如参见赛尔J.R.(Sayers，J.R.)，斯奇米特W.(Schmidt，W.)，艾克斯坦F.(Eckstein，F.)5′-3′核酸外切酶在基于硫代磷酸酯的寡核苷酸引导的诱变中的应用(5′-3′Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis)，核酸研究(Nucleic Acids Res)，16(3)：791-802(1988)。当将酰基化抑制性tRNA和突变基因组合于体外转录/翻译系统中时，对UAG密码子反应而并入非天然氨基酸，得到在指定位置含有所述氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe进行的实验和使用α-羟基酸进行的实验证实，仅在UAG密码子指定的位置处并入所需氨基酸，并且未在蛋白质中的任何其它位点并入此氨基酸。例如参见，诺伦(Noren)等人，同上文；小林(Kobayashi)等人，(2003)自然结构生物学(Nature Structural Biology)10(6)：425-432；和埃尔曼J.A.(Ellman，J.A.)，孟德尔D.(Mendel，D.)，查鲁兹P.G.(Schultz，P.G.)将新颖主链结构位点特异性并入蛋白质中(Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins)，科学(Science)，255(5041)：197-200(1992)。
产生催化性RNA的方法可涉及产生随机化核糖酶序列的单独池；对这些池进行定向进化；针对所需氨酰基化活性筛选所述池；和选择展现所需氨酰基化活性的那些核糖酶的序列。
核糖酶可包含促进酰基化活性的基序和/或区域，例如GGU基序和富集U的区域。举例来说，已报导富集U的区域可促进氨基酸底物的识别，而GGU基序可与tRNA的3′末端形成碱基对。GGU基序与富集U区域组合起来可促进同时识别氨基酸与tRNA，并因此促进tRNA 3′末端的氨酰基化。
可通过使用与tRNAAsn CCCG结合的部分随机化r24mini进行体外选择，随后系统地工程改造活性克隆体中所见的共有序列，来产生核糖酶。利用此方法获得的示范性核糖酶称为“Fx3核糖酶”，并且描述于美国公开申请案第2003/0228593号(其内容以引用的方式并入本文中)中，所述核糖酶充当合成载有同源非天然氨基酸的各种氨酰基-tRNA的通用催化剂。
在基质上固定可用于促成氨酰基化tRNA的有效亲和纯化。适合基质的实例包括(但不限于)琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。可利用RNA的化学结构将核糖酶固定于树脂上，例如，RNA核糖上的3′-顺-二醇可经高碘酸盐氧化得到相应的二醛，从而便利将RNA固定于树脂上。可使用各种类型的树脂，包括廉价的酰肼树脂，其中还原胺化使得树脂与核糖酶之间相互作用而形成不可逆键。借助于此种柱上氨酰基化技术(on-column aminoacylation technique)可显著促进氨酰基-tRNA的合成。卡罗利斯(Kourouklis)等人，方法(Methods)2005；36：239-4中描述了一种基于柱的氨酰基化系统。
氨酰基化tRNA的分离可借助多种方式实现。一种适合的方法是利用缓冲液(例如含有10mM EDTA的乙酸钠溶液；含有50mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(3-丙烷磺酸)、12.5mM KCl(pH 7.0)、10mM EDTA的缓冲液；或者简单的EDTA缓冲的水(pH 7.0))从柱中洗脱出氨酰基化tRNA。
可将本发明的氨酰基化tRNA加到翻译反应中，以便将使tRNA氨酰基化的氨基酸并入翻译反应所产生的多肽中的所选位置中。可使用本发明的氨酰基化tRNA的翻译系统的实例包括(但不限于)细胞溶解产物。细胞溶解产物提供由输入mRNA体外翻译多肽必需的反应组件。所述反应组件的实例包括(但不限于)核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始因子和延伸因子以及其它与翻译有关的因子。此外，翻译系统也可为批量翻译(batch translation)或区室化翻译(compartmentalized translation)。批量翻译系统组合了单一区室中的反应组件，而区室化翻译系统使翻译反应组件与可能会抑制翻译效率的反应产物分开。这些翻译系统在市面上都有销售。
此外，可使用偶联的转录/翻译系统。偶联的转录/翻译系统允许将输入DNA转录成相应的mRNA，而mRNA又由反应组件翻译。市售的偶联转录/翻译的实例为Rapid Translation System(RTS，罗氏公司(Roche Inc.))。这一系统包括含有大肠杆菌溶解产物的混合物，用于提供例如核糖体和翻译因子等翻译组件。此外，还包括RNA聚合酶，用于将输入DNA转录成mRNA模板，供翻译使用。RTS可经由插入反应区室(包括供料/废料区室和转录/翻译区室)之间的膜来将反应组件区室化。
可利用包括(但不限于)转移酶、聚合酶、催化性抗体、多功能蛋白等其它试剂将 tRNA氨酰基化。
正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)
O-RS在体外或体内优先利用所选氨基酸将本发明O-tRNA氨酰基化。本发明的O-RS可通过包括O-RS的多肽和/或编码O-RS或其部分的多聚核苷酸提供给翻译系统(例如，体外翻译组件，或细胞)。O-RS或其部分是由多聚核苷酸序列或其互补多聚核苷酸序列，或其保守变异体编码。本发明的O-tRNA可由多种不同的O-RS分子(包括(但不限于)本文中揭示者)氨酰基化。
用于鉴别正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS，例如O-RS)供用于O-tRNA(例如O-tRNA)的方法也是本发明的特征。举例来说，一种方法包括使第一物种的细胞群经历阳性选择，其中所述细胞各包含：1)多个氨酰基-tRNA合成酶(RS)的成员，其中所述多个RS包含突变RS、源自除第一物种外的物种的RS，或突变RS和源自除第一物种外的物种的RS二者；2)来自第二物种的正交tRNA(O-tRNA)；和3)编码阳性选择标记物且包含至少一个选择密码子的多聚核苷酸。选择或筛选出细胞中抑制效率应相比缺乏所述多个RS的成员或具有少量所述多个RS的成员的细胞有所增强的细胞。抑制效率增强的细胞包含可将O-tRNA氨酰基化的活性RS。将活性RS使来自第一物种的第一组tRNA氨酰基化(体外或体内)的水平与活性RS使来自第二物种的第二组tRNA氨酰基化(体外或体内)的水平相比较。可借助于可检测物质(例如加标记的氨基酸或非天然氨基酸)测定氨酰基化水平。选出与第一组tRNA相比较，将第二组tRNA氨酰基化的效率较高的活性RS，由此提供正交氨酰基-tRNA合成酶供用于O-tRNA。由所述方法鉴别的O-RS，例如O-RS，也是本发明的特征。
可以使用多种分析中的任一种来测定氨酰基化。这些分析可在体外或体内进行。举例来说，体外氨酰基化分析描述于例如霍本P.(Hoben，P.)和索伊尔D.(Soil，D.)(1985) 酶学方法(Methods Enzymol.)，113：55-59；以及美国专利申请公开案第2003/0228593号中。也可以通过使用报告基因和正交翻译组件，并在表达包含至少一个选择密码子且编码蛋白质的多聚核苷酸的细胞中检测这一报告基因，来测定氨酰基化。也参见美国专利申请案10/126,927，标题为“体内并入非天然氨基酸(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)”；和USSN 10/825,867，标题为扩充真核遗传密码“EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。
可进一步操作鉴别的O-RS，以改变合成酶的底物特异性，由此只将所需非天然氨基酸，而非常见20种氨基酸中的任一者加载到O-tRNA上。产生对非天然氨基酸具有底物特异性的正交氨酰基tRNA合成酶的方法包括通过组合合成酶的不同结构域来使合 成酶的不同位点突变，例如合成酶中的活性位点、合成酶中的编辑机制位点等；和应用选择过程。所用策略是基于阳性选择随后阴性选择的组合。在阳性选择中，抑制在阳性标记物非必需位置引入的选择密码子，允许细胞在阳性选择压力下存活。因此，在天然和非天然氨基酸存在下，存活细胞编码将天然或非天然氨基酸加载到正交抑制性tRNA的活性合成酶。在阴性选择中，抑制在阴性标记物非必需位置引入的选择密码子，将去除具有天然氨基酸特异性的合成酶。经历阴性选择和阳性选择而存活的细胞编码只利用非天然氨基酸将正交抑制性tRNA氨酰基化(将非天然氨基酸加载到正交抑制性tRNA)的合成酶。接着，这些合成酶可再经历诱变，例如DNA改组或其它递归诱变方法。
突变O-RS文库可以使用此项技术中已知的各种诱变技术产生。举例来说，可通过位点特异性突变、随机点突变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构建或其任何组合，产生突变型RS。举例来说，可由两个或两个以上其它(例如)较小、多样性较低的“子文库”产生突变型RS文库。本发明中也包括嵌合RS文库。应注意，可任选构建来自各种生物体(例如微生物，如真细菌或古细菌)的tRNA合成酶文库，例如包含天然多样性的文库(例如参见肖特(Short)等人的美国专利第6,238,884号；斯查伦伯格(Schallenberger)等人的美国专利第5,756,316号；皮特森(Petersen)等人的美国专利第5,783,431号；汤姆森(Thompson)等人的美国专利第5,824,485号；肖特等人的美国专利第5,958,672号)，并针对正交对进行筛选。
在合成酶经历阳性和阴性选择/筛选策略后，随后即可使这些合成酶再经历诱变。举例来说，可分离出编码O-RS的核酸；可由所述核酸产生一组编码突变型O-RS的多聚核苷酸(例如，通过随机诱变、位点特异性诱变、重组或其任何组合)；并且可重复所述个别步骤或这些步骤的组合，直到获得优先利用非天然氨基酸将O-tRNA氨酰基化的突变型O-RS。在本发明一方面中，这些步骤进行多次，例如至少2次。
本发明方法中也可使用其它选择/筛选严格度水平，以用于产生O-tRNA、O-RS或其对。在产生O-RS的方法的一个或两个步骤中可改变选择或筛选严格度。例如，这可包括改变选择/筛选剂的用量等。还可再进行数轮阳性和/或阴性选择。选择或筛选也可包含一次或一次以上阳性或阴性选择或筛选，这些选择或筛选包括例如氨基酸渗透性的改变、翻译效率的改变、翻译保真度的改变等。通常，这一种或一种以上改变是建立在使用正交tRNA-tRNA合成酶对产生蛋白质的生物体中一个或一个以上基因突变的基础上。
在本发明中可以使用针对例如O-RS、O-tRNA和O-tRNA/O-RS对的其它类型选择。阳性选择标记物可以是多种分子中的任一者，包括(但不限于)为生长提供养分补充的 产品，并且所述选择可在缺乏所述养分补充的培养基上进行。编码阳性选择标记物的多聚核苷酸的实例包括(但不限于)例如基于补充细胞的氨基酸营养缺陷的报告基因、his3基因(例如，his3基因编码咪唑甘油磷酸酯脱水酶的情形，可通过提供3-氨基三唑(3-AT)来检测)、ura3基因、leu2基因、lys2基因、lacZ基因、adh基因等。例如参见G.M.卡斯霍(G.M.Kishore)和D.M.夏尔(D.M.Shah)，(1988)，用作除草剂的氨基酸生物合成抑制剂(Amino acid biosynthesis inhibitors as herbicides)，生物化学年评(Annual Review of Biochemistry)57：627-663。在一个实施例中，通过邻硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)水解来检测lacZ产生。例如参见I.G.塞雷布斯基(I.G.Serebriiskii)和E.A.格雷米斯(E.A.Golemis)，(2000)，使用lacZ研究基因功能：评估酵母双杂交系统中所用的β-半乳糖苷酶分析(Uses of lacZ to study gene function：evaluation of beta-galactosidase assays employed in the yeast two-hybrid system)，分析生物化学(Analytical Biochemistry)285：1-15。其它阳性选择标记物包括例如荧光素酶、绿色荧光蛋白质(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因的产物(例如，氯霉素乙酰转移酶(CAT))、转录调节蛋白(例如GAL4)等。编码阳性选择标记物的多聚核苷酸任选包含选择密码子。
可将编码阳性选择标记物的多聚核苷酸可操作性地连接到反应元件。还可存在另一多聚核苷酸，其编码调节由反应元件进行的转录的转录调节蛋白，并且包含至少一个选择密码子。通过经非天然氨基酸氨酰基化的O-tRNA将非天然氨基酸并入转录调节蛋白中，将引起编码阳性选择标记物的多聚核苷酸(例如报告基因)的转录。选择密码子任选位于编码转录调节蛋白的DNA结合结构域的多聚核苷酸的一部分中或实质上在其附近。
还可将编码阴性选择标记物的多聚核苷酸可操作性地连接到反应元件，转录调节蛋白将通过这一反应元件介导转录。例如参见A.J.德马格(A.J.DeMaggio)等人，(2000)，酵母分裂杂交系统(The yeast split-hybrid system)，酶学方法(Method Enzymol.)328：128-137；H.M.夏尔(H.M.Shih)等人，(1996)，用于破坏蛋白质-蛋白质相互作用的阳性遗传选择：鉴别阻止与共活化剂CBP缔合的CREB突变(A positive genetic selection for disrupting protein-protein interactions：identification of CREB mutations that prevent association with the coactivator CBP)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)93：13896-13901；M.维达(M.Vidal)等人，(1996)，通过使用酵母逆向双杂交系统对哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用结构域的遗传表征(Genetic characterization of a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid system.)，美国国家科学院院刊，93：10321-10326；和M.维达等人，(1996)，用于检测蛋白质-蛋白质 和DNA-蛋白质相互作用解离的逆向双杂交和单杂交系统(Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.)，美国国家科学院院刊，93：10315-10320。通过经天然氨基酸氨酰基化的O-tRNA将天然氨基酸并入转录调节蛋白中，将引起阴性选择标记物的转录。阴性选择标记物任选包含选择密码子。本发明的阳性选择标记物和/或阴性选择标记物可包含至少两个选择密码子，其各自或都可包含至少两个不同的选择密码子或至少两个相同的选择密码子。
转录调节蛋白是结合于(直接或间接)核酸序列(例如，反应元件)并调节可操作性地连接到反应元件的序列转录的分子。转录调节蛋白可为转录活化蛋白(例如，GAL4、核激素受体、AP1、CREB、LEF/tcf家族成员、SMAD、VP16、SP1等)、转录阻遏蛋白(例如，核激素受体、Groucho/tle家族、Engrailed家族等)或可视环境而具有两种活性的蛋白质(例如LEF/tcf、同源异型盒(homobox)蛋白等)。反应元件通常为由转录调节蛋白所识别的核酸序列或与转录调节蛋白协力作用的另一试剂。
转录调节蛋白的另一实例为转录活化蛋白GAL4。例如参见A.朗顿(A.Laughon)等人，(1984)，由酿酒酵母GAL4基因编码的两个蛋白质的鉴别(Identification of two proteins encoded by the Saccharomyces cerevisiae GAL4 gene)，分子与细胞生物学(Molecular & Cellular Biology)4：268-275；A.朗顿和R.F.盖斯特兰(R.F.Gesteland)，(1984)，酿酒酵母GAL4基因的一级结构(Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae GAL4 gene)，分子与细胞生物学，4：260-267；L.克格(L.Keegan)等人(1986)，真核调控蛋白质的DNA结合与转录活化功能的分离(Separation of DNA binding from the transcription-activating function of a eukaryotic regulatory protein)，科学(Science)231：699-704；和M.帕塔西(M.Ptashne)，(1988)，真核转录活化子如何工作(How eukaryotic transcriptional activators work)，自然(Nature)335：683-689。这一具有881个氨基酸的蛋白质的N末端147个氨基酸形成特异性结合DNA序列的DNA结合结构域(DBD)。例如参见M.卡雷(M.Carey)等人，(1989)，GAL4的氨基末端片段结合DNA成为二聚体(An ammo-terminal fragment of GAL4 binds DNA as a dimer)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)209：423-432；和E.格尼格(E.Giniger)等人，(1985)，酵母阳性调控蛋白质GAL4的特异性DNA结合(Specific DNA binding of GAL4，a positive regulatory protein of yeast)，细胞(Cell)40：767-774。DBD通过插入蛋白质序列(intervening protein sequence)连接到当结合DNA时可活化转录的C末端113个氨基酸的活化结构域(AD)。例如参见J.马(J.Ma)和M.帕塔西(M.Ptashne)，(1987)，GAL4缺失分析界定两个转录活化区段(Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptional activating segments)， 细胞(Cell)48：847-853；和J.马和M.帕塔西，(1987)，GAL80识别GAL4基因的羧基末端30个氨基酸(The carboxy-terminal 30 amino acids of GAL4 are recognized by GAL80)，细胞，50：137-142。通过将琥珀密码子朝向例如含有GAL4的N末端DBD和其C末端AD的单一多肽的N末端DBD放置，可将O-tRNA/O-RS对的琥珀抑制作用与GAL4的转录活化作用联系起来。可使用GAL4活化的报告基因来进行利用所述基因的阳性选择和阴性选择。
用于阴性选择的培养基可包含在阴性选择标记物作用下转化成可检测物质的选择或筛选剂。在本发明一方面中，可检测物质为有毒物质。编码阴性选择标记物的多聚核苷酸可例如为ura3基因。举例来说，可将URA3报告基因置于含有GAL4 DNA结合位点的启动子控制之下。当例如通过翻译具有选择密码子的编码GAL4的多聚核苷酸来产生阴性选择标记物时，GAL4将活化URA3的转录。在包含5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基上实现阴性选择，所述5-FOA在ura3基因的基因产物作用下被转化成可检测物质(例如，杀死细胞的有毒物质)。例如参见J.D.鲍可(J.D.Boeke)等人，(1984)，酵母中缺乏乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶活性的突变体的阳性选择：5-氟乳清酸抗性(A positive selection for mutants lacking orotidine-5′-phosphate decarboxylase activity in yeast：5-fluoroorotic acid resistance)，分子与普通遗传学(Molecular & General Genetics)197：345-346)；M.维达(M.Vidal)等人(1996)，通过使用酵母逆向双杂交系统对哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用结构域的遗传表征(Genetic characterization of a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid system.)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)93：10321-10326；和M.维达等人(1996)，用于检测蛋白质-蛋白质和DNA-蛋白质相互作用的逆向双杂交和单杂交系统(Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.)，美国国家科学院院刊，93：10315-10320。
与阳性选择标记物相同，阴性选择标记物也可为多种分子中的任一个。阳性选择标记物和/或阴性选择标记物可以是在适当反应物存在下发荧光或催化发光反应的多肽。举例来说，阴性选择标记物包括(但不限于)例如荧光素酶、绿色荧光蛋白质(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因的产物(例如，氯霉素乙酰转移酶(CAT))、lacZ基因的产物、转录调节蛋白等。阳性选择标记物和/或阴性选择标记物可借助荧光活化的细胞分选(FACS)或通过发光来检测。阳性选择标记物和/或阴性选择标记物可包含基于亲和力的筛选标记物。同一多聚核苷酸可编码阳性选择标记物和阴性选择标记物二者。举例来说，阳性选择步骤、阴性选择步骤或阳性和阴性选择步骤二者可包括使用报 告基因，其中所述报告基因可借助荧光活化的细胞分选(FACS)来检测。举例来说，阳性选择可首先用阳性选择标记物进行，例如用氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，其中CAT基因在CAT基因中包含选择密码子，例如琥珀终止密码子，随后进行阴性选择筛选，这一步骤是基于不能抑制阴性选择标记物(例如T7RNA聚合酶基因)内各个位置的选择密码子(例如两个或两个以上)。阳性选择标记物和阴性选择标记物可出现在同一载体(例如质粒)上。阴性标记物的表达驱动报告基因(例如绿色荧光蛋白，GFP)的表达。选择和筛选的严格度可发生变化，例如可以改变使报告基因发荧光所需的光强度。阳性选择可以利用报告基因作为阳性选择标记物(可借助FACS筛选)来进行，随后进行阴性选择筛选，这一步骤是基于不能抑制阴性标记物(例如芽孢杆菌RNA酶基因)内各个位置的选择密码子(例如两个或两个以上)。
报告基因任选展示于细胞表面上，例如展示于噬菌体上等。细胞表面展示，例如基于OmpA的细胞表面展示系统，依赖于特定表位(例如，与外膜孔蛋白OmpA融合的脊髓灰质炎病毒C3肽)在大肠杆菌细胞表面上的表达。只有当蛋白质信使中的选择密码子在翻译期间受到抑制时，表位才展示于细胞表面上。随后，展示的肽含有由文库中的一种突变氨酰基-tRNA合成酶所识别的氨基酸，并且可以用针对含有特定非天然氨基酸的肽产生的抗体分离出含有相应合成酶基因的细胞。作为噬菌体展示的替代技术，乔治欧(Georgiou)等人开发和优化了基于OmpA的细胞表面展示系统。参见弗朗西斯科J.A.(Francisco，J.A.)，坎贝尔R.(Campbell，R.)，艾维森B.L.(Iverson，B.L.)和乔治欧G.(Georgoiu，G.)在外表面上表达功能性抗体片段的大肠杆菌的产生和荧光活化细胞分选(Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：10444-8(1993)。
本发明其它实施例包括在体外执行一个或一个以上选择步骤。随后可将所选组件，例如合成酶和/或tRNA，引入细胞中以用于在体内并入非天然氨基酸。
有关产生O-RS和改变合成酶的底物特异性的其它细节可见于：美国专利申请案10/126,931，标题为“用于产生正交tRNA-氨酰基tRNA合成酶对的方法和组合物(Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs)”；和USSN 10/825,867，标题为“扩充真核遗传密码(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)”，都以引用的方式并入本文中。有关产生O-RS的其它细节可见于：滨野高久(Hamano-Takaku)等人，(2000)突变型大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶利用非天然氨基酸氮杂酪氨酸的效率比酪氨酸高(A mutant Escherichia coli  Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyro sine More Efficiently than Tyrosine)，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)，275(51)：40324-40328；气贺(Kiga)等人(2002)，用于在真核翻译中将非天然氨基酸位点特异性并入蛋白质中的工程化大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶以及其在小麦胚芽无细胞系统中的应用(An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translation and its application in a wheat germ cell-free system)，美国国家科学院院刊(PNAS)99(15)：9715-9723；和富兰克林(Francklyn)等人(2002)，氨酰基-tRNA合成酶：改变翻译过程的通用参与者(Aminoacyl-tRNA synthetases：Versatile players in the changing theater of translation)；RNA，8：1363-1372，各自以引用的方式并入本文中。
来源和宿主生物体
本发明的翻译组件通常是源自非真核生物体。举例来说，正交O-tRNA可源自非真核生物体，例如古细菌，例如詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐古菌(例如沃氏嗜盐富饶菌和嗜盐古菌NRC-1)、闪烁古生球菌、强烈火球菌、掘越氏热球菌、嗜热泉生古细菌等；或真细菌，例如大肠杆菌、极端嗜热细菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等，而正交O-RS可源自非真核生物体，例如嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐古菌(例如沃氏嗜盐富饶菌和嗜盐古菌NRC-1)、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌等；或真细菌，例如大肠杆菌、极端嗜热细菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等。在一个实施例中，也可使用真核来源，包括(但不限于)植物、藻类、原生生物、真菌、酵母、动物(例如哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。
O-tRNA/O-RS对的个别组件可源自相同生物体或不同生物体。在一个实施例中，O-tRNA/O-RS对是来自相同生物体。或者，O-tRNA/O-RS对的O-tRNA和O-RS是来自不同生物体。举例来说，O-tRNA可源自例如嗜盐菌属NRC-1，而O-RS可源自例如嗜热自养甲烷杆菌。
O-tRNA、O-RS或O-tRNA/O-RS对可在体内或体外选择或筛选和/或用于细胞中(例如非真核细胞，如大肠杆菌细胞；或真核细胞)以产生具有所选氨基酸(例如非天然氨基酸)的多肽。非真核细胞可来自多种来源，例如古菌系统发生域，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌(例如沃氏嗜盐富饶菌和嗜盐菌属NRC-1)、超嗜热古菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌等；或者可属于真细菌系统发生域(包括(但不限于)大肠杆菌、极端嗜热细菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌等)等。真核细胞可来自多种来源，包括(但不限 于)植物(例如复杂植物，如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌、酵母(包括(但不限于)酿酒酵母)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。具有本发明翻译组件的细胞的组合物也为本发明的特征。有关从一种物种中筛选O-tRNA和/或O-RS用于另一物种中的内容，也参见USSN 10/825,867，标题为“扩充真核遗传密码(Expanding the Eukaryotic Genetic Code)”。
为了在宿主细胞中表达具有所选氨基酸的相关多肽，可以将编码相关多肽的多聚核苷酸亚克隆到表达载体中，这一表达载体含有引导转录的启动子、转录/翻译终止子，并且如果对于编码蛋白质的核酸，还含有供起始翻译的核糖体结合位点。此项技术中众所周知适合的细菌启动子，并且例如描述于萨姆布鲁克(Sambrook)等人和奥斯贝尔(Ausubel)等人中。
用于表达相关多肽的细菌表达系统可从(包括(但不限于))大肠杆菌、芽孢杆菌属、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和沙门氏菌获得(帕尔瓦(Palva)等人，基因(Gene)22：229-235(1983)；莫斯贝奇(Mosbach)等人，自然(Nature)302：543-545(1983))。这些表达系统的试剂盒在市面上有售。此项技术众所周知哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统，并且在市面上也有销售。
可以在多种适合的表达系统(例如包括酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌)中利用和/或在其中表达本发明的tRNA和/或RS和/或相关多肽。下文将描述例示性表达系统。
酵母本文中使用的术语“酵母”包括能够表达相关多肽的各种酵母中的任一种。这些酵母包括(但不限于)产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌(Fungi imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。产子囊酵母分为两个科：蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。酵母菌科是由四个亚科组成：裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母亚科(Lipomycoideae)和酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如，毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。担孢子酵母包括白冬孢酵母属(Leucosporidium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、线黑粉酵母属(Filobasidium)和香灰拟锁担菌属(Filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两个科：掷孢酵母科(Sporobolomycelaceae)(例如，掷孢酵母属(Sporoholomyces)和布勒掷孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假丝酵母属(Candida))。
供本发明使用的特别值得关注的为毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属内的物种，其包括(但不限于)巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克鲁维酵母(S.kluyveri)、诺本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白色念珠菌(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和汉森酵母(H.polymorpha)。酵母通常可从多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系酵母基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(Yeast Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California (Berkeley，CA))和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯)(American Type Culture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA))。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的酵母。这一术语包括已接收重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于意外或故意突变，单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。在此定义所指的后代中包括与欲借助相关特性(例如存在编码相关多肽的核苷酸序列)表征的母体足够类似的母体细胞后代。
已经开发出包括染色体外复制子或整合载体在内的表达和转化载体，用于转化到许多酵母宿主中。举例来说，已经开发出用于以下各有机体的表达载体：酿酒酵母(希寇斯基(Sikorski)等人，遗传学(GENETICS)(1989)122：19；埃托(Ito)等人，应用细菌学杂志(J.BACTERIOL.)(1983)153：163；海因伦(Hinnen)等人，美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)(1978)75：1929)；白色念珠菌(科特兹(Kurtz)等人，分子细胞生物学(MOL.CELL.BIOL.)(1986)6：142)；麦芽糖假丝酵母(库尼则(Kunze)等人，基础微生物学杂志(J.BASIC MICROBIOL.)(1985)25：141)；汉森酵母(格林森(Gleeson)等人，普通与应用微生物学杂志(J.GEN.MICROBIOL.)(1986)132：3459；罗格坎普(Roggenkamp)等人，分子遗传学和基因组(MOL，GENETICS AND GENOMICS)(1986)202：302)；脆壁克鲁维酵母(达斯(Das)等人，应用细菌学杂志(1984)158：1165)；乳酸克鲁维酵母(德拉文科特(De Louvencourt)等人，应用细菌学杂志(1983)154：737；范登伯格(Van den Berg)等人，生物技术(纽约)(BIOTECHNOLOGY(NY))(1990)8：135)；谷勒氏酵母(库尼则等人，基础微生物学杂志(1985)25：141)；巴斯德毕赤酵母(美国专利第5,324,639号；第4,929,555号和第4,837,148号；克雷格(Cregg)等人，分子细 胞生物学(1985)5：3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(比奇(Beach)等人，自然(NATURE)(1982)300：706)；和解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)；构巢曲霉(A.nidulans)(伯伦斯(Ballance)等人，生物化学与生物物理研究通讯(BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN)(1983)112：284-89；迪尔伯恩(Tilburn)等人，基因(GENE)(1983)26：205-221；和耶尔敦(Yelton)等人，美国国家科学院院刊(1984)81：1470-74)；黑曲霉(A.niger)(凯里(Kelly)和海因斯(Hynes)，欧洲分子生物学会杂志(EMBO J.)(1982)4：475-479)；里氏木霉(T.reesia)(EP 0 244 234)；和丝状真菌，例如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)(WO 91/00357)，各文献以引用的方式并入本文中。
所属领域技术人员众所周知用于酵母载体的控制序列，所述包括(但不限于)以下基因的启动子区：例如醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284 044)；烯醇化酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可提供有用的启动子序列(宫之原(Miyanohara)等人，美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)(1983)80：1)。适用于酵母宿主的其它启动子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(海泽曼(Hitzeman)等人，生物化学杂志(J.BIOL.CHEM)(1980)255：12073)；和其它糖解酶(例如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶(霍兰德(Holland)等人，生物化学(BIOCHEMISTRY)(1978)17：4900；海斯(Hess)等人，酶调控进展杂志(J.ADV.ENZYME REG.)(1969)7：149))的启动子。具有由生长条件控制的额外转录优点的诱导性酵母启动子可包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、氮代谢相关性降解酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达中的载体和启动子进一步描述于EP 0 073 657中。
酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游活化序列(upstream activating sequence，UAS)可与另一酵母启动子的转录活化区连接，产生合成杂合启动子。所述杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区连接的ADH调控序列。参见美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其以引用的方式并入本文中。杂合启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列结合糖解酶基因(例如GAP或PyK)的转录活化区所组成的启动子。参见EP 0 164 556。此外，酵母启动子可包括能够结合酵母RNA聚合酶并起始转录的非酵母来源的天然存在启动子。
可构成酵母表达载体一部分的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子(霍兰德(Holland)等人，生物化学杂志(J.BIOL.CHEM.)(1981)256：1385)。另外，来自2μ质粒来源的复制起点也适用于酵母。适用于酵母中的选择基因为酵母质粒中存在的trp1基因。参见迪斯查普(Tschumper)等人，基因(GENE)(1980)10：157；金戈斯曼(Kingsman)等人，基因(1979)7：141。trp1基因可为不能在色氨酸中生长的酵母突变株提供选择标记物。类似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)是由带有Leu2基因的已知质粒补充。
所属领域技术人员众所周知将外源DNA引入酵母宿主中的方法，这些方法通常包括(但不限于)转化原生质球状体或转化经碱金属阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，可根据萧(Hsiao)等人，美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)(1979)76：3829和范索里格(Van Solingen)等人，应用细菌学杂志(J.BACT.)(1977)130：946中所述的方法来转化酵母。然而，也可如萨姆布鲁克(SAMBROOK)等人，分子克隆实验手册(MOLECULAR CLONING：ALAB.MANUAL)(2001)中一般性描述，使用其它方法将DNA引入细胞中，例如核注射法、电穿孔法或原生质体融合法。随后，可使用所属领域技术人员已知的标准技术来培养酵母宿主细胞。
所属领域技术人员众所周知在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其它方法。一般参见美国专利公开案第20020055169号；美国专利第6,361,969号、第6,312,923号、第6,183,985号、第6,083,723号、第6,017,731号、第5,674,706号、第5,629,203号、第5,602,034号和第5,089,398号；美国复审专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO 99/07862、WO 98/37208和WO 98/26080；欧洲专利申请案EP 0 946 736、EP 0 732 403、EP 0 480 480、WO 90/10277、EP 0 340 986、EP 0 329 203、EP 0 324 274和EP 0 164 556中。还参见格里森(Gellissen)等人，列文虎克(ANTONIE VAN LEEUWENHOEK)(1992)62(1-2)：79-93；罗曼诺斯(Romanos)等人，酵母(YEAST)(1992)8(6)：423-488；格利德尔(Goeddel)，酶学方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)(1990)185：3-7，各自以引用的方式并入本文中。
在使用所属领域技术人员已知的标准分批进料发酵方法的扩增阶段期间，酵母宿主菌株可在发酵罐中生长。发酵方法可适合用于解释特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制模式的差异。举例来说，酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复合氮源(例如，酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。相比之下，甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和微量矿物进料，而只需要简单铵(氮)盐以达最佳生长和表达。参见例如美国专利第5,324,639号；埃利奥特(Elliott)等人，蛋白质化学杂志(J. PROTEIN CHEM.)(1990)9：95；和菲斯查克(Fieschko)等人，生物技术与生物工程(BIOTECH.BIOENG.)(1987)29：1113，以引用的方式并入本文中。
然而，这些发酵方法可能具有某些与所用酵母宿主菌株无关的常见特征。举例来说，在扩增期间，可将限制生长的养分(通常为碳)添加到发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵方法一般使用的发酵培养基是设计成含有足量碳、氮、基本盐、磷和其它微量养分(维生素、微量矿物和盐等)。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其以引用的方式并入本文中。
感染杆状病毒的昆虫细胞 术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的昆虫。这一术语包括经过转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解，由于意外或故意突变，单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。在此定义所指的后代中包括与欲借助相关特性(例如存在编码相关多肽的核苷酸序列)表征的母体足够类似的母体细胞后代。
所属领域技术人员众所周知适用于表达相关多肽的昆虫细胞的选择。此项技术中充分描述了数种昆虫种类，并且可在市面上购得，包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桑蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择供表达的昆虫宿主时，合适的宿主可包括显示(尤其)良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的宿主。昆虫一般可从多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系昆虫基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(Insect Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA))；和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯)(American Type Culture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA))。
一般说来，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组件包括：转移载体，通常为细菌质粒，其含有杆状病毒基因组的片段和供插入欲表达的异源基因的适宜限制性位点；序列与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的野生型杆状病毒(这使得异源基因能同源重组到杆状病毒基因组中)；以及适当昆虫宿主细胞，和生长培养基。此项技术中已知用于构建载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等的材料、方法和技术，并且可以使用描述这些技术的手册。
在将异源基因插入转移载体中后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，在宿主细胞中，载体和病毒基因组重组。表达经包装的重组病毒，并且鉴别和纯化重组体斑块。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自例如英杰公司(Invitrogen Corp.)(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))。所属领域技术 人员一般已知这些技术，且其完整描述于萨姆斯(SUMMERS)和史密斯(SMITH)，德克萨斯农业实验站会刊(TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN)第1555期(1987)中，此文献以引用的方式并入本文中。还参见理查德森(RICHARDSON)，39分子生物学方法：杆状病毒表达技术(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY：BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS)(1995)；奥斯贝尔(AUSUBEL)等人，现代分子生物学技术(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)16.9-16.11(1994)；金(KING)和普斯伊(POSSEE)，杆状病毒系统实验指南(THE BACULOVIRUS SYSTEM：A LABORATORY GUIDE)(1992)；和奥雷利(O′REILLY)等人，杆状病毒表达载体实验手册(BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL)(1992)。
事实上，所属领域中众所周知使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来制备各种异源蛋白质的方法。例如参见，美国专利第6,368,825号；第6,342,216号；第6,338,846号；第6,261,805号；第6,245,528号；第6,225,060号；第6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939号；第5,753,220号；第5,605,827号；第5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO 00/55345；WO 00/20032；WO 99/51721；WO 99/45130；WO 99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400；WO 96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO 92/02628；WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO 90/02186；WO 90/01556；WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082，其以引用的方式并入本文中。
此项技术中已知可用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的载体且其包括例如从杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)获得的昆虫表达和转移载体，这是一种不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。来源于此系统的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子来驱动异源基因的表达。一般参见奥雷利(O′Reilly)等人，杆状病毒表达载体实验手册(BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL)(1992)。
在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包含启动子、前导序列(必要时)、相关编码序列和转录终止序列的上述组件组装到中间错位构建体(intermediate transplacement construct)(转移载体)中。中间错位构建体通常保持在能够稳定保持在宿主(例如细菌)中的复制子(例如染色体外元件，例如质粒)中。复制子将具有复制 系统，由此使其能保持在适于克隆和扩增的宿主中。更具体来说，质粒可含有多角体蛋白多聚腺苷酸化信号(米勒(Miller)，微生物学年鉴(ANN.REV.MICROBIOL.)(1988)42：177)和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核氨苄青霉素抗性(amp)基因和复制起点。
一种将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。也已经设计出所属领域技术人员已知的许多其它载体，包括例如pVL985，其中将多角体蛋白的起始密码子由ATG变为ATT，并将BamHI克隆位点引入ATT下游32个碱基对处。参见鲁克诺(Luckow)和萨姆斯(Summers)，病毒学(VIROLOGY)170：31(1989)。其它市售载体包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(英杰公司(Invitrogen Corp.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))。
在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。此项技术中已知将异源DNA引入杆状病毒中的所需位点中的方法。参见萨姆斯(SUMMERS)和史密斯(SMITH)，德克萨斯农业实验站会刊(TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN)第1555期(1987)；史密斯(Smith)等人，分子细胞生物学(MOL.CELL.BIOL.)(1983)3：2156；鲁克诺(Luckow)和萨姆斯(Summers)，病毒学(VIROLOGY)(1989)17：31中。举例来说，可通过同源双交叉重组来插入例如多角体蛋白基因等基因中；也可插入所需杆状病毒基因中经工程改造的限制酶位点中。参见米勒(Miller)等人，生物学论文集(BIOESSAYS)(1989)4：91。
可利用电穿孔法来实现转染。参见托特(TROTTER)和伍德(WOOD)，39分子生物学方法(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)(1995)；曼恩(Mann)和金(King)，普通病毒学杂志(J.GEN.VIROL.)(1989)70：3501。或者，可以使用脂质体，利用重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。例如参见，利伯曼(Liebman)等人，生物技术(BIOTECHNIQUES)(1999)26(1)：36；格拉芙斯(Graves)等人，生物化学(BIOCHEMISTRY)(1998)37：6050；野村(Nomura)等人，生物化学杂志(J.BIOL.CHEM.)(1998)273(22)：13570；斯奇米特(Schmidt)等人，蛋白质表达和纯化(PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION)(1998)12：323；西弗特(Siffert)等人，自然·遗传(NATURE GENETICS)(1998)18：45；迪尔金斯(TILKINS)等人，细胞生物学实验手册(CELLBIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK)145-154(1998)；蔡(Cai)等人，蛋白质表达和纯化(PROTEIN EXPRESSIONAND PURIFICATION)(1997)10：263；多夫林(Dolphin)等人，自然·遗传(1997)17：491；科斯特(Kost)等人，基因(GENE)(1997)190：139；杰克博森(Jakobsson)等人，生物化学杂志(1996)271：22203；洛韦思(Rowles)等人，生物化学杂志(1996)271(37)：22376； 雷沃瑞(Reverey)等人，生物化学杂志(1996)271(39)：23607-10；斯坦利(Stanley)等人，生物化学杂志(1995)270：4121；西斯科(Sisk)等人，病毒学杂志(J.VIROL.)(1994)68(2)：766；以及彭(Peng)等人，生物技术(BIOTECHNIQUES)(1993)14(2)：274。市售脂质体包括例如Cellfectin 和Lipofectin (英杰公司(Invitrogen Corp.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))。另外，也可使用磷酸钙转染。参见托特(TROTTER)和伍德(WOOD)，39分子生物学方法(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)(1995)；凯特(Kitts)，NAR(1990)18(19)：5667；以及曼恩(Mann)和金(King)，普通病毒学杂志(J.GEN.VIROL.)(1989)70：3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够结合杆状病毒RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)下游(3′)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有转录起始区，其通常接近编码序列的5′端。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有称作增强子的第二区域，当存在时，其通常在结构基因的末梢。此外，表达可为受调控或组成性的。
在感染周期末期大量转录的结构基因将提供特别有用的启动子序列。实例包括来源于编码病毒多面体蛋白的基因(弗雷森(FRIESEN)等人，杆状病毒基因表达的调控(The Regulation of Baculovirus Gene Expression)，杆状病毒分子生物学(THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES)(1986)；EP 0 127 839和0 155 476)和编码p10蛋白的基因(沃拉克(Vlak)等人，普通病毒学杂志(J.GEN.VIROL.)(1988)69：765)的序列。
将新近形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中，随后可利用所属领域技术人员已知的技术来纯化生长的斑块。参见米勒(Miller)等人，生物学论文集(BIOESSAYS)(1989)11(4)：91；萨姆斯(SUMMERS)和史密斯(SMITH)，德克萨斯农业实验站会刊(TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN)第1555期(1987)。
已经开发出了用于感染到数种昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说，已开发尤其用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参见怀特(Wright)，自然(NATURE)(1986)321：718；卡博耐尔(Carbonell)等人，病毒学杂志(J.VIROL.)(1985)56：153；史密斯(Smith)等人，分子细胞生物学(MOL.CELL.BIOL.)(1983)3：2156。一般参见弗雷瑟(Fraser)等人，体外细胞和发育生物学(IN VITRO CELL.DEV.BIOL.)(1989)25：225。更具体来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC第CRL-1711号)、Sf21(草地贪夜蛾)(Invitrogen Corp.，目录号11497-013(Carlsbad，CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉纹夜 蛾)。
可在市面上购得用于在杆状病毒表达载体中直接和融合表达异源多肽的细胞和培养基，且所属领域技术人员一般已知细胞培养技术。
大肠杆菌、假单胞菌属和其它原核生物 此项技术中已知细菌表达技术。有多种载体可用于细菌宿主中。这些载体可以是单拷贝或者低或高多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于存在丰富的有关载体的文献、许多载体在市面上有售以及甚至存在描述载体和其限制性图谱及特征的手册，故无需在这里深入讨论。众所周知，载体通常涉及允许选择的标记物，这些标记物可提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。常常会存在多个标记物，其提供不同的特征。
细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶且起始编码序列(例如结构基因)下游(3′)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有转录起始区，其通常接近编码序列的5′端。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有称作操纵基因的第二区域，其可与开始RNA合成的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵基因允许负调控(诱导性)转录，这是因为基因抑制蛋白可结合操纵基因，并由此抑制特定基因的转录。在不存在负调控元件(例如操纵基因)的情况下，可发生组成性表达。另外，通过基因活化蛋白结合序列可实现正调控，当存在这一序列时，其通常接近RNA聚合酶结合序列的(5′)。基因活化蛋白的实例为代谢物活化蛋白(catabolite activator protein，CAP)，其有助于起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[雷波德(Raibaud)等人，遗传学年鉴(ANNU.REV.GENET.)(1984)18：173]。因此，表达的调控可为正调控或负调控，由此增强或减弱转录。
编码代谢路径酶的序列提供特别有用的启动子序列。实例包括来源于糖代谢酶(例如半乳糖、乳糖(lac)[常(Chang)等人，自然(NATURE)(1977)198：1056]和麦芽糖)的启动子序列。其它实例包括来源于生物合成酶(例如色氨酸(trp))的启动子序列[古德尔(Goeddel)等人，核酸研究(Nuc.ACIDS RES.)(1980)8：4057；耶尔弗顿(Yelverton)等人，核酸研究(NUCL.ACIDS RES.)(1981)9：731；美国专利第4,738,921号；欧洲公开案第036776号和第121775号，其以引用的方式并入本文中]。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[威瑟曼(Weissmann)(1981)“干扰素和其它错误的克隆(The cloning of interferon and other mistakes.)”，干扰素(Interferon)3(I.格雷瑟(I.Gresser)编)]、噬菌体 [施马塔克(Shimatake)等人，自然(NATURE)(1981)292：128]和T5[美国专利第4,689,406号，以引用的方式并入本文中]启动子系统也可提供有用的启动子序列。可以使用强启动子(例如T7启动子)来诱导高水平的相关多肽。所属领域技术人员已知这些载体的实 例，且其包括来自诺杰公司(Novagen)的pET29系列，以及WO99/05297(以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高水平多肽，同时不会损害宿主细胞生存能力或生长参数。pET19(诺杰公司(Novagen))是此项技术中已知的另一载体。
另外，自然界中不存在的合成启动子也可充当细菌启动子。举例来说，可将一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，从而产生合成的杂合启动子[美国专利第4,551,433号，以引用的方式并入本文中]。举例来说，tac启动子是由trp启动子与lac操纵子序列构成的杂合trp-lac启动子，其受lac阻遏物调控[阿曼恩(Amann)等人，基因(GENE)(1983)25：167；德波尔(de Boer)等人，美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI).(1983)80：21]。此外，细菌启动子可包括非细菌来源的天然存在启动子，其能够与细菌RNA聚合酶结合并起始转录。也可将非细菌来源的天然存在启动子与相容性RNA聚合酶偶联以便在原核生物中高水平表达一些基因。噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子系统为偶联启动子系统的一个实例[斯蒂尔(Studier)等人，分子生物学杂志(J.MOL.BIOL.)(1986)189：113；塔波(Tabor)等人，美国国家科学院院刊(Proc Natl.Acad.Sci.)(1985)82：1074]。另外，杂合启动子也可由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区组成(欧洲公开案第267 851号)。
除功能性启动子序列之外，有效核糖体结合位点也可用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称作沙恩-达尔加诺(Shine-Dalgarno，SD)序列，且包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的3-9个核苷酸长的序列[沙恩(Shine)等人，自然(NATURE)(1975)254：34]。据悉，SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3′端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[斯特兹(Steitz)等人，“信使RNA中的基因信号和核苷酸序列(Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA)”，生物调控和发育：基因表达(Biological Regulation and Development：Gene Expression)(R.F.古德伯格(R.F.Goldberger)编，1979)]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[萨姆布鲁克(Sambrook)等人，“在大肠杆菌中表达克隆的基因(Expression of cloned genes in Escherichia coli)”，分子克隆实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的细菌。这一术语包括经过转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于意外或故意突变，单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。在此定义所指的后代中包括与欲借助相关特性(例如存在编码相关多 肽的核苷酸序列)表征的母体足够类似的母体细胞后代。
所属领域技术人员已知适用于表达多肽的宿主细菌的选择。在选择供表达的细菌宿主时，合适宿主可包括显示(尤其)具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的宿主。细菌宿主一般可从多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系细菌基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(Bacterial Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA))和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯)(American Type Culture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA))。工业/医药发酵一般使用来源于K菌株(例如W3110)的细菌或来源于B菌株(例如BL21)的细菌。这些菌株因其生长参数众所周知且稳定而特别有用。另外，这些菌株为非病原性的，而出于安全性和环境原因，其在商业上相当重要。适当大肠杆菌宿主的其它实例包括(但不限于)菌株BL21、DH10B或其衍生物。在本发明方法的另一个实施例中，大肠杆菌宿主为缺乏蛋白酶的菌株(protease minus strain)，包括(但不限于)OMP-和LON-。宿主细胞株可为假单胞菌属细胞株，包括(但不限于)荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。已知荧光假单胞菌生物型1(命名为菌株MB101)适用于重组制备，并且可用于治疗性蛋白质的制备工艺中。假单胞菌表达系统的实例包括从陶氏化学公司(Dow Chemical Company)得到的呈宿主菌株的系统(密歇根州米德兰(Midland，MI)，可见于万维网dow.com)。美国专利第4,755,465号和第4,859,600号(以引用的方式并入本文中)描述了假单胞菌菌株作为用于产生hGH的宿主细胞的用途。
一旦建立了重组宿主细胞株(即，已将表达构建体引入宿主细胞中，并分离出具有合适表达构建体的宿主细胞)，就在适于产生相关多肽的条件下培养这一重组宿主细胞株。所属领域技术人员将了解，培养重组宿主细胞株的方法将取决于所用表达构建体的性质和宿主细胞的身份。通常使用此项技术中众所周知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是在含有可吸收的(assimilatable)碳源、氮源和无机盐源并任选含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域技术人员已知的其它蛋白质培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可任选含有抗生素或抗真菌剂以防止不需要的微生物和/或化合物生长(包括(但不限于)用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素)。
可使用将目标核酸引入细胞中的数种众所周知的方法，其中任一种都可用于本发明中。这些方法包括：受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法和经病毒载体(在下文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA 构建体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期且可通过所属领域中已知的多种方法分离细菌中的质粒(例如参见萨姆布鲁克(Sambrook))。另外，也可购买许多试剂盒来从细菌中纯化质粒(例如参见EasyPrepTM、FlexiPrepTM，都来自法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech)；StrataCleanTM，来自赛特杰公司(Stratagene)；和QIAprepTM，来自凯杰公司(Qiagen))。随后进一步操作经分离和纯化的质粒以产生其它质粒，来用于转染细胞，或并入相关载体中以感染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定目标核酸表达的启动子。载体任选包含普通表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列、允许表达盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(包括(但不限于)穿梭载体)，以及用于原核系统与真核系统的选择标记物。载体适于在原核细胞、真核细胞或两者中复制和整合。参见盖里姆(Gillam)和史密斯(Smith)，基因(Gene)8：81(1979)；罗伯茨(Roberts)等人，自然(Nature.)328：731(1987)；斯奇尼德尔E.(Schneider，E.)等人，蛋白质表达和纯化(Protein Expr.Purif.)6(1)：10-14(1995)；奥斯贝尔(Ausubel)，萨姆布鲁克(Sambrook)，伯格(Berger)(都同上文)。举例来说，ATCC(例如由ATCC出版的细菌和噬菌体的ATCC目录(The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage)(1992)吉赫纳(Gherna)等人(编))提供了可用于克隆的细菌和噬菌体的目录。用于测序、克隆和分子生物学其它方面的其它基本程序以及基础理论考虑也见于沃特森(Watson)等人(1992)重组DNA(Recombinant DNA)第2版，科学美国人(Scientific American Books)，纽约(NY)中。另外，基本上任何核酸(和几乎任何带标记的核酸，无论标准或非标准)都可从多种商业来源中的任一者定制或标准定购，这些商业来源例如米德兰标准试剂公司(Midland Certified Reagent Company)(德克萨斯州米德兰(Midland，TX)，mcrc.com)、美国基因公司(The Great American Gene Company)(加利福尼亚州雷蒙钠(Ramona，CA)，可在万维网genco.com上获得)、艾普斯基因公司(ExpressGen Inc.)(伊利诺伊州芝加哥(Chicago，IL)，可在万维网expressgen.com上获得)、欧普隆技术公司(Operon Technologies Inc.)(加利福尼亚州阿拉米达(Alameda，CA))和许多其它来源。
重组宿主细胞可按分批或连续模式培养，其中细胞采集(在相关多肽于细胞内积聚的情况下)或培养物上清液的采集为分批或连续模式。对于在原核宿主细胞中制备，优选分批培养和细胞采集。
选择密码子
本发明的选择密码子可扩充蛋白质生物合成机器的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括例如独特的三碱基密码子；无义密码子，例如终止密码子，包括(但不限 于)琥珀密码子(UAG)、赭石密码子或蛋白石密码子(UGA)；非天然密码子；四个或四个以上碱基的密码子；稀有密码子等。可将多个(例如一个或一个以上、两个或两个以上、三个或三个以上等)选择密码子引入所需基因或多聚核苷酸中。
本发明的选择密码子可扩充蛋白质生物合成机器的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括(但不限于)独特的三碱基密码子；无义密码子，例如终止密码子，包括(但不限于)琥珀密码子(UAG)、赭石密码子或蛋白石密码子(UGA)；非天然密码子；四个或四个以上碱基的密码子；稀有密码子等。所属领域技术人员易于了解，可引入所需基因或多聚核苷酸中的选择密码子的数目范围很广，包括(但不限于)在编码抗原或全生物体(如使用本发明的遗传修饰全生物体的非限制性实例MAP和大肠杆菌)的单一多聚核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、三个或三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上。
在一个实施例中，所述方法涉及使用作为终止密码子的选择密码子，用于在体内并入所选氨基酸，例如非天然氨基酸。举例来说，产生识别终止密码子的O-tRNA，并通过O-RS利用所选氨基酸将其氨酰基化。天然存在的宿主氨酰基-tRNA合成酶不识别这一O-tRNA。可使用常规定点诱变将终止密码子引入相关多肽中的相关位点。例如参见赛尔斯J.R.(Sayers，J.R.)等人，(1988)，用于基于硫代磷酸酯的寡聚核苷酸定向诱变中的5′-3′外切核酸酶(5′-3′Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis.)核酸研究(Nucleic Acids Res)，16：791-802。当例如在体内组合O-RS、O-tRNA和编码相关多肽的核酸时，对终止密码子反应而并入所选氨基酸，从而得到在特定位置含有所选氨基酸(例如非天然氨基酸)的多肽。在本发明一个实施例中，用作选择密码子的终止密码子是琥珀密码子UAG和/或蛋白石密码子UGA。举例来说，有关识别琥珀密码子的O-tRNA的实例，参见SEQ ID NO.：6；且有关识别蛋白石密码子的O-tRNA的实例，参见SEQ ID NO.：7。将UAG和UGA都用作选择密码子的遗传密码可编码22个氨基酸，同时保留赭石无义密码子UAA，这是最丰富的终止信号。
可在不显著干扰宿主细胞的情况下在体内并入所选氨基酸，例如非天然氨基酸。举例来说，在非真核细胞(例如大肠杆菌)中，由于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(例如，琥珀抑制性tRNA)与释放因子1(RF1)(其与UAG密码子结合并起始核糖体释放生长肽)之间的竞争，故可例如通过增加O-tRNA(例如，抑制性tRNA)的表达水平，或使用RF1缺陷型细胞株来调节抑制效率。在真核细胞中，由于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(例如，琥珀抑制性tRNA)与真核释放因子(例如，eRF)(其与终止密码子结合并起始核糖体释放生长肽)之间的竞争，故可例如通过增加O-tRNA (例如，抑制性tRNA)的表达水平来调节抑制效率。
也可用稀有密码子编码非天然氨基酸。举例来说，当降低体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度时，已证实，稀有精氨酸密码子AGG可有效地利用经丙氨酸酰基化的合成tRNA插入Ala。例如参见马(Ma)等人，生物化学(Biochemistry.)32：7939(1993)。在此情况下，合成tRNA将与作为大肠杆菌中的次要物质存在的天然存在tRNAArg竞争。一些生物体不使用所有三联体密码子。已经利用藤黄微球菌(Micrococcus luteus)中的未指定密码子AGA在体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。例如参见科瓦尔(Kowal)和奥利弗(Oliver)，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)25：4685(1997)。可产生本发明的组分以在体内使用这些稀有密码子。
选择密码子还包含延长的密码子，例如四个或四个以上碱基的密码子，例如四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子。四碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。一个特征可包括使用基于移码抑制的延长密码子。四个或四个以上碱基的密码子可将例如一个或多个所选氨基酸(包括(但不限于)非天然氨基酸)插入同一蛋白质中。举例来说，在突变O-tRNA存在下，例如具有反密码子环(例如，具有CU(X)n XXXAA序列，其中n＝1)的特定移码抑制性tRNA，四个或四个以上碱基的密码子被读成单一氨基酸。举例来说，有关识别四碱基密码子的O-tRNA，参见PCT/US04/22061的SEQ ID NOs.：6、12。在其它实施例中，反密码子环可解码例如至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基的密码子。由于存在256个可能的四碱基密码子，故可在同一细胞中使用四个或四个以上碱基的密码子编码多个非天然氨基酸。参见安德森(Anderson)等人，(2002)探究密码子和反密码子尺寸的极限(Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size)， 化学与生物学(Chemistry and Biology.)9：237-244；麦格赖瑞(Magliery)，(2001)扩充遗传密码：大肠杆菌中四碱基密码子的有效抑制剂的选择和利用文库方法鉴别“移码”四碱基密码子(Expanding the Genetic Code：Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of″Shifty″Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli.)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)307：755-769。
举例来说，已使用四碱基密码子，使用体外生物合成方法将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参见马(Ma)等人，(1993)生物化学(Biochemistry)，32：7939；和阳司(Hohsaka)等人，(1999)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc)，121：34。曾使用CGGG和AGGU，在体外利用两个以化学方式酰基化的移码抑制性tRNA将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD 衍生物同时并入抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)中。例如参见阳司(Hohsaka)等人，(1999)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc)，121：12194。在体内研究中，莫尔(Moore)等人检查了具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA可以由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13％到26％的效率解码，其中在0或-1框内极少解码。参见莫尔(Moore)等人，(2000)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，298：195。在一个实施例中，可将基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子用于本发明中，这样可减少错义通读(missense readthrough)和其它不想要位点的移码抑制。
对于给定系统，选择密码子也可包括天然三碱基密码子中的一种，其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子任选包括非天然碱基对。这些非天然碱基对可进一步扩充现有的遗传密码。一个额外的碱基对使三联体密码子的数量从64增加到125。第三碱基对的特性包括稳定且具选择性的碱基配对、利用聚合酶以高保真度有效酶促并入DNA中，以及在合成新的非天然碱基对之后有效的持续引物延伸。可经修改而适用于诸方法和诸组合物的非天然碱基对的描述包括例如海奥(Hirao)等人，(2002)用于将氨基酸类似物并入蛋白中的非天然碱基对(An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein)，自然生物技术(Nature Biotechnology)，20：177-182。也参见吴Y.(Wu，Y.)等人(2002)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)124：14626-14630。其它相关出版物列于下文中。
对于体内使用，非天然核苷可透过膜，并且经磷酸化形成相应的三磷酸酯。此外，增加的遗传信息也很稳定，不会被细胞酶破坏。本纳(Benner)和其它人先前的尝试利用了不同于标准沃特森-克里克(Watson-Crick)对的氢键模式，其中最值得关注的实例为iso-C:iso-G对。例如参见斯维泽(Switzer)等人，(1989)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，111：8322；和皮克瑞利(Piccirilli)等人，(1990)自然(Nature)，343：33；库尔(Kool)，(2000)现代化学生物学观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)，4：602。一般说来，这些碱基在某种程度上与天然碱基错配，并且无法酶促复制。库尔(Kool)和同事证实，碱基之间的疏水堆积相互作用可替代氢键来驱动碱基对的形成。参见库尔(Kool)，(2000) 现代化学生物学观点(Curr.Opin.Chem.Biol)，4：602；和库克安(Guckian)及库尔，(1998) 德国应用化学杂志(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，36，2825。在致力于开发满足所有上述需求的非天然碱基对的过程中，查鲁兹(Schultz)、罗姆斯伯格(Romesberg) 和同事已经系统地合成和研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身对比天然碱基对稳定，并且能够利用大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺(Klenow)片段(KF)有效地并入DNA中。例如参见麦克米恩(McMinn)等人，(1999)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，121：11585-6；以及小川(Ogawa)等人，(2000)美国化学协会杂志，122：3274。3MN:3MN自身对可通过KF以足以获得生物功能的效率和选择性合成。例如参见小川等人，(2000)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，122：8803。然而，这两种碱基都充当进一步复制的链终止子。近来已开发出可用于复制PICS自身对的突变DNA聚合酶。此外，还可复制7AI自身对。例如参见泰厄(Tae)等人，(2001)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，123：7439。也已开发出新颖的金属碱基对Dipic：Py，其在结合Cu(II)后形成稳定对。参见麦格斯(Meggers)等人，(2000)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc)，122：10714。由于延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，故本发明方法可利用这一特性产生其正交tRNA。
翻译旁路系统(translational bypassing system)也可用于在所需多肽中并入所选氨基酸，例如非天然氨基酸。在翻译旁路系统中，将大序列插入基因中，但并不翻译成蛋白质。所述序列含有的结构可充当诱导核糖体越过所述序列并继续在插入序列下游翻译的提示(cue)。
所选和非天然氨基酸
本文中使用的所选氨基酸是指任何所需的天然存在氨基酸或非天然氨基酸。天然存在氨基酸包括20种遗传编码的α-氨基酸中的任一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。在一个实施例中，将所选氨基酸以高保真度，例如以对指定选择密码子大于约70％的效率、对指定选择密码子大于75％的效率、对指定选择密码子大于约80％的效率、对指定选择密码子大于约85％的效率、对指定选择密码子大于约90％的效率、对指定选择密码子大于约95％的效率或对指定选择密码子大于约99％或更高的效率，并入正在生长的多肽链中。
本文中使用的非天然氨基酸是指不为硒代半胱氨酸和/或吡咯赖氨酸以及以下20种遗传编码的α-氨基酸的任何氨基酸、经修饰氨基酸或氨基酸类似物：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。由式I说明α-氨基酸的一般结构：
非天然氨基酸通常是具有式I的任何结构，其中R基团是除20种天然氨基酸中所用基团外的任何取代基。有关二十种天然氨基酸的结构，例如参见L.斯太尔(L.Stryer)，生物化学(Biochemistry)，第3版1988，弗雷曼出版公司(Freeman and Company)，纽约(New York)。应注意，本发明的非天然氨基酸可为除上述二十种α-氨基酸外的天然存在化合物。
由于本发明的非天然编码氨基酸通常只是侧链结构不同于天然氨基酸，故非天然氨基酸与其它氨基酸(包括(但不限于)天然或非天然氨基酸)形成酰胺键的方式与其在天然存在蛋白质中形成的方式相同。然而，非天然氨基酸的侧链基团使其与天然氨基酸相区别。举例来说，式I中的R可包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸酯基(borate)、硼酸酯基(boronate)、磷酸基、膦酸基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、胺等，或其任何组合。其它非天然存在氨基酸包括(但不限于)包含可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼蔽(photocaged)和/或可光异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(例如糖取代的丝氨酸)、其它碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解氨基酸、侧链比天然氨基酸长的氨基酸(包括(但不限于)聚醚或长链烃，包括(但不限于)大于约5或大于约10个碳)、含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含有氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或一个以上有毒部分的氨基酸。还参见美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885，都以引用的方式并入本文中。非天然氨基酸可具有可光活化交联剂，例如用于将蛋白质与固体支撑物相连接。非天然氨基酸的氨基酸侧链上可连接有糖部分。
除含有新颖侧链的非天然氨基酸外，非天然氨基酸还任选包含经修饰的主链结构，例如，如式II和III的结构所说明：
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′；X和Y可相同或不同，通常包含S或O；且R和R′任选相同或不同，通常选自与上文关于具有式I的非天然氨基酸所述的R基相同的组分清单以及氢。举例来说，如式II和III所示，非天然氨基酸可在氨基或羧基中包含取代。此类非天然氨基酸包括(但不限于)例如具有与常见二十种天然氨基酸相对应的侧链或非天然侧链的α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯。此外，α-碳处的取代任选包括L、D或α-α双取代氨基酸，例如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸，例如脯氨酸类似物，以及3元、4元、6元、7元、8元和9元环脯氨酸类似物；β和γ氨基酸，例如经取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
许多非天然氨基酸都是基于天然氨基酸，例如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等。酪氨酸类似物包括对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中所述经取代酪氨酸包含酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基等。此外，也涵盖多取代的芳基环。谷氨酰胺类似物包括(但不限于)α-羟基衍生物、γ取代的衍生物、环状衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。苯丙氨酸类似物的实例包括(但不限于)对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘基、溴基、酮基(包括(但不限于)乙酰基)等。非天然氨基酸的具体实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴、氟化 苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对炔丙氧基-苯丙氨酸等。多种非天然氨基酸结构的实例提供于例如WO 2002/085923，标题为“体内并入非天然氨基酸(In vivo incorporation ofunnatural amino acids)”(以引用的方式并入本文中)中。关于其它甲硫氨酸类似物，也参见柯克(Kiick)等人，(2002)利用施陶丁格尔接合将叠氮基并入重组蛋白中以进行化学选择性修饰(Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligtation)，PNAS 99：19-24，以引用的方式并入本文中。
并入多肽氨基末端的非天然氨基酸可由以下各物构成：R基团，其为除20种天然氨基酸中所用基团外的任何取代基；和第二反应性基团，其不同于通常存在于α-氨基酸中的NH2基团(参见式I)。可并入羧基末端的类似非天然氨基酸中的第二反应性基团不同于通常存在于α-氨基酸中的COOH基团(参见式I)。
本发明的非天然氨基酸可经选择或设计，从而提供在20种天然氨基酸中不可得到的其它特征。举例来说，可任选对非天然氨基酸进行设计或选择，从而改变例如并有这些非天然氨基酸的蛋白质的生物特性。举例来说，任选通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来改变以下特性：毒性、生物分布、溶解性、稳定性(例如热稳定性、水解稳定性、氧化稳定性、对酶降解的抗性等)、纯化和加工的便利性、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化活性、氧化还原电位、半衰期、与其它分子反应(例如共价或非共价)的能力等。
多种非天然氨基酸的结构提供于例如标题为“体内并入非天然氨基酸(In vivo incorporation of unnatural amino acids)”的WO 2002/085923的图16、17、18、19、26和29中，所述专利以引用的方式并入本文中。这些实例不打算以任何方式限制可与本发明tRNA连接的氨基酸。
非天然氨基酸的一个优势在于，其提供可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在真核或非真核细胞体内进行或在体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。可以使用多肽中的非天然氨基酸将另一分子与多肽连接，所述分子包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或者多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、糖、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化辐射可激发部分、可光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、延长的侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米递质，或者上述或任何其它所需化合物或物质的任何组合，包含利用所属领域技术人员已知适用于特定反应性基团的化学方法学，针对至少一个包含第一反应性基团的非天然氨基酸的第二反应性基团。
举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电反应进行。当前用于选择性修饰蛋白质的大部分反应涉及亲核与亲电反应搭配物之间的共价键形成，包括(但不限于)α-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况中，选择性是由蛋白质中亲核残基的数量和可接近性决定。在本发明的蛋白质中，可在体外和体内使用其它更具选择性的反应，例如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的反应。例如参见柯尼西(Cornish)等人(1996)，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)118：8150-8151；马赫尔(Mahal)等人(1997)，科学(Science)276：1125-1128；，王(Wang)等人(2001)，科学(Science)292：498-500；秦(Chin)等人(2002)，美国化学协会杂志124：9026-9027；秦等人(2002)， 美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，99：11020-11024；王等人(2003)，美国国家科学院院刊，100：56-61；张(Zhang)等人(2003)，生物化学(Biochemistry)，42：6735-6746；和秦等人(2003)，科学，301：964-7，所有这些文献都以引用的方式并入本文中。这使得能够用包括荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子在内的多种试剂选择性标记几乎任何蛋白质。也参见美国专利第6,927,042号，标题为“糖蛋白的合成(Glycoprotein synthesis)”，以引用的方式并入本文中。翻译后修饰(包括(但不限于)经由叠氮基氨基酸修饰)也可通过施陶丁格尔接合(Staudinger ligation)(包括(但不限于)用三芳基膦试剂)进行。例如参见柯克(Kiick)等人，(2002)利用施陶丁格尔接合将叠氮基并入重组蛋白中以进行化学选择性修饰(Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligtation)，PNAS 99：19-24。
非天然氨基酸的化学合成
许多非天然编码氨基酸可从市面上购得，例如购自西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO，USA))、诺瓦生物科技公司(Novabiochem)(EMD生物科技公司(EMD Biosciences)的分公司，位于德国达姆施塔 特(Darmstadt，Germany))或派普科技公司(Peptech)(美国马萨诸塞州伯灵顿(Burlington，MA，USA))。非市售的非天然氨基酸可任选根据本文中提供或使用所属领域技术人员已知的标准方法合成。有关有机合成技术，参见例如弗雷斯敦(Fessendon)和弗雷斯敦的有机化学(Organic Chemistry)，(1982，第2版，维拉德格兰特出版社(Willard Grant Press)，马萨诸塞州波士顿(Boston Mass.))；玛驰(March)的高等有机化学(Advanced Organic Chemistry)(第3版，1985，威立父子出版公司(Wiley and Sons)，纽约(New York)；以及卡雷(Carey)和萨德伯格(Sundberg)的高等有机化学(第3版，第A和B部分，1990，派拉蒙出版社(Plenum Press)，纽约)。描述非天然氨基酸的合成的其它出版物例如包括：WO 2002/085923，标题为“体内并入非天然氨基酸(In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids)”；马托索卡斯(Matsoukas)等人，(1995)药物化学杂志(J.Med.Chem.)，38，4660-4669；金F.E.(King，F.E.)和凯德D.A.A.(Kidd，D.A.A.)(1949)由邻苯二甲酰化中间物合成谷氨酰胺以及谷氨酸γ-二肽的新方法。(A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates.)化学协会杂志(J.Chem.Soc.)3315-3319；弗雷德曼O.M.(Friedman，O.M.)和查特瑞提R.(Chatterrji，R.)(1959)作为抗肿瘤剂的模型基质的谷氨酰胺衍生物的合成。(Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)81，3750-3752；克莱格J.C.(Craig，J.C.)等人(1988)7-氯-4[[4-(二乙基氨基)-1-甲基丁基]氨基]喹啉(氯喹)的绝对构型。(Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).)有机化学杂志(J.Org.Chem.)53，1167-1170；阿佐雷M.(Azoulay，M.)，维尔蒙特M.(Vilmont，M.)和弗莱皮尔F.(Frappier，F.)(1991)作为潜在抗疟药的谷氨酰胺类似物(Glutamine analogues as Potential Antimalarials)，欧洲药物化学杂志(Eur.J.Med.Chem.)26，201-5；库斯基宁A.M.P.(Koskinen，A.M.P.)和雷珀特H.(Rapoport，H.)(1989)作为构象受限氨基酸类似物的4-取代脯氨酸的合成。(Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues.)有机化学杂志54，1859-1866；克雷斯廷B.D.(Christie，B.D.)和雷珀特H.，(1985)由L-天冬酰胺合成光学纯六氢吡啶的方法。(Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine.)经由氨基酸脱羰基和亚胺离子环化全合成(+)阿扑长春胺的应用(Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.)有机化学杂志50：1239-1246；巴顿(Barton)等人，(1987)使用自由基化学合成新颖的α-氨基酸和衍生物：合成L-和 D-α-氨基-己二酸、L-α-氨基庚二酸和适合的不饱和衍生物(Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry：Synthesis of L-and D-alhpa-Amino-Adipic Acids，L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives.)四面体通讯(Tetrahedron Lett.)43：4297-4308；和萨贝辛赫(Subasinghe)等人，(1992)使君子氨酸类似物：合成β-杂环2-氨基丙酸衍生物和其在新颖的使君子氨酸敏感性位点的活性。(Quisqualic acid analogues：synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site.) 药物化学杂志35：4602-7。也参见美国专利公开案第US 2004/0198637号，标题为“蛋白质阵列(Protein Arrays)”，以引用的方式并入本文中。
非天然氨基酸的细胞摄取
细胞对非天然氨基酸的摄取是在设计和选择例如并入蛋白质中的非天然氨基酸时常常考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度表明，这些化合物不太可能渗透细胞。天然氨基酸是经由一系列基于蛋白质的转运系统而吸收到细胞中。可进行快速筛选来评估哪些非天然氨基酸(如果存在)被细胞吸收。例如参见，例如美国专利公开案第US 2004/0198637号，标题为“蛋白质阵列(Protein Arrays)”(以引用的方式并入本文中)；以及林D.R.(Liu，D.R.)和查鲁兹P.G.(Schultz，P.G.)(1999)朝向具有扩充遗传密码的生物体的进化发展(Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code.)美国国家科学院院刊(PNAS United States)96：4780-4785中的毒性分析。尽管易于利用各种分析法来分析摄取，但设计适用于细胞摄取路径的非天然氨基酸的替代方法是提供在体内产生氨基酸的生物合成路径。
非天然氨基酸的生物合成
细胞中已存在许多生物合成路径来产生氨基酸和其它化合物。特定非天然氨基酸的生物合成方法可能不存在于自然界(包括(但不限于)细胞)中，而本发明提供了此类方法。举例来说，在宿主细胞中，通过添加新颖酶，或改变现存的宿主细胞路径，来任选产生非天然氨基酸的生物合成路径。其它新颖酶任选为天然存在酶或人工开发酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如标题为“体内并入非天然氨基酸(In vivo incorporation of unnatural amino acids)”的WO 2002/085923中的实例所提供)依赖于添加来自其它生物体的已知酶组合。可通过用包含这些酶的基因的质粒转化细胞来将所述基因引入细胞中。当在细胞中表达时，这些基因提供合成所需化合物的酶促路径。任选添加的酶类型的实例提供于下文的实例中。其它酶序列可见于例如基因库(Genbank)中。也任选以相同方式将人工开发酶添加到细胞中。以此方式，利用细胞机器和细胞资 源产生非天然氨基酸。
多种方法可用来产生用于生物合成路径中或用于发展现存路径中的新颖酶。举例来说，任选使用例如麦克西根公司(Maxygen，Inc.)开发的递归重组法(recursive recombination)(可见于万维网maxygen.com)来开发新颖酶和路径。例如参见斯蒂姆(Stemmer)(1994)，在体外利用DNA改组的蛋白质快速进化(Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling)，自然(Nature)370(4)：389-391；和斯蒂姆，(1994)，通过随机断裂和再组装进行DNA改组：体外重组以供分子进化(DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination for molecular evolution)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)91：10747-10751。类似地，任选使用杰能科公司(Genencor)(可见于万维网genencor.com)开发的DesignPathTM进行代谢路径的工程改造，包括(但不限于)工程改造某条路径以在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸。这项技术使用新基因(包括(但不限于)利用功能性基因组学以及分子进化和设计鉴别的基因)的组合在宿主生物体中重建现存路径。迪文萨公司(Diversa Corporation)(可见于万维网diversa.com)也提供有关迅速筛选基因和基因路径文库的技术(包括(但不限于)来建立新路径。
通常，利用本发明的工程改造的生物合成路径所产生的非天然氨基酸的浓度足以进行有效蛋白质生物合成(例如天然细胞量)，但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度。在体内以此方式产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。在用包含用于产生特定路径所需的酶的基因的质粒转化细胞，并产生非天然氨基酸后，任选使用体内选择，以针对核糖体蛋白质合成和细胞生长进一步优化非天然氨基酸的产生。
核酸以及多肽序列和变异体
如上文和下文所述，本发明提供核酸多聚核苷酸序列和多肽氨基酸序列(例如，tRNA和RS)，以及例如包含所述序列的组合物和方法。本文中揭示了所述序列(例如tRNA和RS)的实例。然而，所属领域技术人员应理解，本发明不限于本文(例如，实例)中所揭示的这些序列。所属领域技术人员应理解，本发明还提供具有本文中所述的功能(例如，编码O-tRNA或O-RS)的许多相关和不相关序列。
本发明提供多肽(O-RS)；和多聚核苷酸，例如O-tRNA、编码O-RS或其部分的多聚核苷酸、用于分离氨酰基-tRNA合成酶克隆体的寡核苷酸等。本发明的多聚核苷酸包括具有一个或一个以上选择密码子的编码本发明相关蛋白质或多肽的多聚核苷酸。此外，本发明的多聚核苷酸包括例如包含SEQ ID NO.：1、2、3中任一者所述的核苷酸序列的多聚核苷酸、其互补多聚核苷酸，或其保守变异体。类似地，在高严格度条件下在 实质上整个核酸长度上与上文所述的多聚核苷酸杂交的核酸也是本发明的多聚核苷酸。
在某些实施例中，载体(例如，质粒、柯斯质粒、噬菌体、细菌、病毒、裸多聚核苷酸、结合的多聚核苷酸等)包含本发明的多聚核苷酸。在一个实施例中，载体为表达载体。在另一实施例中，表达载体包括可操作性地连接到一个或一个以上本发明多聚核苷酸的启动子。在另一实施例中，细胞包含包括本发明多聚核苷酸的载体。
所属领域技术人员还应了解，所揭示序列的许多变异体都包括在本发明中。举例来说，本发明中包括得到功能相同序列的所揭示序列的保守变异体。核酸多聚核苷酸序列的变异体(其中这些变异体与至少一个所揭示序列杂交)被认为包括在本发明中。本发明中还包括例如通过标准序列比较技术所确定的本文所揭示序列的独特子序列。
保守变异体
归因于遗传密码的简并性，“沉默取代(silent substitution)”(即，不会引起所编码多肽改变的核酸序列取代)为编码氨基酸的每个核酸序列的暗含特征。类似地，“保守氨基酸取代”(即，氨基酸序列中一个或几个氨基酸经特性高度相似的不同氨基酸取代)也易于鉴别为与所揭示的构建体高度相似。所述各所揭示序列的保守变异体为本发明的特征。
特定核酸序列的“保守变异体”是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或当所述核酸不编码氨基酸序列时是指基本上一致的序列。所属领域技术人员将认识到，在编码序列中改变、添加或缺失单一氨基酸或少量氨基酸的个别取代、缺失或添加是“保守性修饰变异”或“保守性修饰变异体”，其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或化学上类似的氨基酸对氨基酸的取代。因此，本发明所列多肽序列的“保守变异”包括少量、通常小于5％、更通常小于4％、2％或1％的多肽序列氨基酸经具有相同保守取代基团的保守选择氨基酸取代。不改变核酸分子的编码活性的序列的添加(例如非功能性序列的添加)是基本核酸的保守变异。
所属领技术人员已知可提供功能相似的氨基酸的保守取代表。以下八个群组各自含有彼此互为保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)，
(例如参见科雷敦(Creighton)，蛋白质：结构和分子特性(Proteins：Structures and Molecular Properties)(W H弗雷曼出版社(W H Freeman & Co.)；第2版(1993年12月))。
核酸杂交
可使用比较杂交来鉴别本发明的核酸，例如SEQ ID NO.：1-3，包括本发明核酸的保守变异体，并且这一比较杂交方法是区别本发明核酸的优选方法。此外，与SEQ ID NO：1-3所示的核酸在高、超高和/或超超高严格度条件下杂交的目标核酸为本发明的特征。这些核酸的实例包括与指定核酸序列相比具有一个或几个沉默或保守核酸取代的核酸。
当测试核酸以其与完全匹配互补目标杂交的至少1/2水平与探针核酸杂交时，即，信噪比是探针与目标在一定条件下(其中完全匹配探针与完全匹配互补目标结合时的信噪比是与任何不匹配目标核酸杂交所观察到的信噪比的至少约5倍到10倍)杂交的至少1/2，认为所述测试核酸与探针核酸特异性杂交。
当几个核酸通常在溶液中缔合时，其“杂交”。核酸因存在例如氢键、溶剂排斥、碱基堆叠等多种充分表征的物理化学力而杂交。短语“严格杂交条件”是指此项技术中已知的低离子强度和高温条件。通常，在严格条件下，探针将与其在复杂核酸混合物(包括(但不限于)全细胞或者DNA或RNA文库)中的目标子序列杂交，而不与这一复杂混合物中的其它序列杂交。核酸杂交的详尽指导见于迪杰森(Tijssen)(1993)生物化学和分子生物学实验技术—与核酸探针的杂交(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes)第2章第I部分，“杂交原理和核酸分析策略综述(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays)，”(纽约爱思唯尔出版社(Elsevier，New York))，以及奥斯贝尔(Ausubel)，分子生物学现代技术(Current Protocols in Molecular Biology)(1995)。赫姆斯(Hames)和海金斯(Higgins)(1995)基因探针1(Gene Probes 1)IRL出版公司，牛津大学出版社(Oxford University Press)，英国牛津(Oxford，England)，(赫姆斯和海金斯1)，以及赫姆斯和海金斯(1995)基因探针2IRL出版公司，牛津大学出版社，英国牛津(赫姆斯和海金斯2)中提供了有关合成、标记、检测和定量DNA和RNA(包括寡核苷酸)的细节。通常，在指定离子强度pH值下，选择的严格条件比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm为平衡时有50％与目标互补的探针与目标序列杂交的温度(在指定离子强度、pH值和核酸浓度下)(当目标序列过量存在时，在Tm下，平衡时有50％ 探针被占据)。严格条件可为在pH 7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)为至少约30℃而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)为至少约60℃的条件。严格条件也可通过添加例如甲酰胺等去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号可为背景杂交的至少两倍，任选为背景杂交的10倍。例示性严格杂交条件如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下培育；或5×SSC、1％SDS，在65℃下培育，且在65℃下在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
在DNA印迹(Southern)或RNA印迹(Northern blot)中于过滤器上具有超过100个互补残基的互补核酸杂交的严格杂交条件的实例为42℃，50％福尔马林和1mg肝素，其中杂交过夜进行。严格洗涤条件的实例为65℃下0.2×SSC洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的描述，参见萨姆布鲁克(Sambrook)，分子克隆实验手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第3版，2001))。通常，在高严格度洗涤之前进行低严格度洗涤，去除背景探针信号。例示性低严格度洗涤是在40℃下以2×SSC洗涤15分钟。一般来说，达到在特定杂交分析中关于不相关探针所观察到的信噪比5倍(或更高)的信噪比表明检测到特异性杂交。
在例如DNA印迹和RNA印迹杂交等核酸杂交实验的情形中，“严格杂交洗涤条件”与序列相关，并且在不同环境参数下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的详尽指导见于迪杰森(Tijssen)(1993)，同上文以及赫姆斯(Hames)和海金斯(Higgins)，1和2，同上文。任何测试核酸的严格杂交和洗涤条件都可根据经验容易地确定。举例来说，在确定高严格性杂交和洗涤条件时，将杂交和洗涤条件逐渐提高(例如，通过增加温度、降低盐浓度、增加清洁剂浓度和/或增加杂交或洗涤中例如福尔马林等有机溶剂的浓度)，直到满足一组所选标准。举例来说，逐渐提高杂交和洗涤条件，直到探针与完全匹配互补目标结合时的信噪比是对于探针与不匹配目标杂交所观察到的至少5倍。
将“极严格”条件选择为与特定探针的热熔点(Tm)相等。Tm为50％测试序列与完全匹配探针杂交的温度(在指定离子强度和pH值下)。出于本发明的目的，一般地说，将“高严格度”杂交和洗涤条件选择为在指定离子强度和pH值下比特定序列的Tm低约5℃。
“超高严格度”杂交和洗涤条件为提高杂交和洗涤条件的严格度，直到探针与完全匹配互补目标核酸结合的信噪比是对于杂交到任何不匹配目标核酸所观察的至少10倍 高的条件。将在所述条件下以与完全匹配互补目标核酸至少1/2的信噪比与探针杂交的目标核酸称为在超高严格度条件下与探针结合。
类似地，可通过逐渐提高相关杂交分析的杂交和/或洗涤条件来确定甚至更高的严格度。举例来说，提高杂交和洗涤条件的严格度，直到探针与完全匹配互补目标核酸结合的信噪比为对于杂交到任何不匹配目标核酸所观察到的至少10倍、20倍、50倍、100倍或500倍或更高倍数。将在所述条件下以与完全匹配互补目标核酸至少1/2的信噪比与探针杂交的目标核酸称为在超超高严格度条件下与探针结合。
如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的多肽实质上相同，那么所述核酸也实质上相同。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，会出现此情形。
独特子序列
在一方面中，本发明提供一种核酸，其包含选自本文中所揭示O-tRNA和O-RS序列的核酸中的独特子序列。独特子序列与对应于任何已知的O-tRNA或O-RS核酸序列的核酸相比是独特的。可使用例如设置为默认参数的BLAST进行比对。任何独特子序列都是有用的，例如作为鉴别本发明核酸的探针。
类似地，本发明包括一种多肽，其包含选自本文中所揭示O-RS序列的多肽中的独特子序列。此处，独特子序列与对应于任何已知多肽序列的多肽相比是独特的。
本发明还提供目标核酸，其在严格条件下与编码选自O-RS序列的多肽中的独特子序列的独特编码寡核苷酸杂交，其中所述独特子序列与对应于任何对照多肽的多肽(例如，通过突变得到本发明合成酶的亲本序列)相比是独特的。独特序列如上文所述进行确定。
序列比较、一致性和同源性
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情形中，术语“一致”或“一致性”百分比是指当使用下文所述的序列比较算法中的一种(或所属领域技术人员可用的其它算法)或通过手工比对和目测来测量，在比较窗或指定区域内比较和比对最大对应性时，两个或两个以上序列或子序列相同或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同。
在两个核酸或多肽(例如，编码O-tRNA或O-RS的DNA，或O-RS的氨基酸序列)的情形中，短语“实质上一致”是指当使用序列比较算法(或所属领域技术人员可用的其它算法)或通过手工比对和目测来测量，在比较窗或指定区域内比较和比对最大对应性时，两个或两个以上序列或子序列具有至少约60％、约80％、约90-95％、约98％、约99％或更高百分比的核苷酸或氨基酸残基一致性。在不提到实际祖先的情况下，通常 认为所述“实质上一致”的序列是“同源的”。“实质一致性”可存在于至少约50个残基长的序列区、至少约100个残基的区域，或至少约150个残基区，或者欲比较的两个序列的全长范围内。
为进行序列比较和同源性测定，通常将一个序列充当参考序列，供与测试序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机内，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。随后序列比较算法基于指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
所属领域技术人员已知供比较序列的比对方法。可利用(包括(但不限于))史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2：482c(1981)的局部同源性算法；尼德尔曼(Needleman)和伍思奇(Wunsch)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443(1970)的同源性比对算法；皮尔森(Pearson)和利普曼(Lipman)美国国家科学院院刊(Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA)85：2444(1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，575位理学博士，威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))；或者手工比对和目测(例如参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，现代分子生物学技术(Current Protocols in Molecular Biology)(1995增补版))，来进行供比较序列的最佳比对。
适用于测定序列一致性和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST2.0算法，其描述于奥特查尔(Altschul)等人(1997)核酸研究(Nuc.Acids Res.)25：3389-3402；和奥特查尔等人 分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410(1990)中。进行BLAST分析的软件可通过万维网ncbi.nlm.nih.gov可得的美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公共可用。这种算法涉及首先通过鉴别询问序列中长度W的短字来鉴别高得分的序列对(high scoring sequence pair，HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，所述HSP匹配或满足某一正值阈值得分T(some positive-valued threshold score T)。T是指邻近字的得分阈值(neighborhood word score threshold)(奥特查尔(Altschul)等人，同上文)。这些初始邻近字匹配(initial neighborhood word hit)充当起始搜索的种子来发现含有它们的较长HSP。随后使字匹配沿各序列的两个方向延伸直到可增加累积比对得分。对核苷酸序列使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；通常＞0)和N(错配残基的处罚得分，通常＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用计分矩阵计算累积得分。当：累积比对得分比其所达到的最大值低数量X；累积得分因一个或多个负得分残基比对的积累而为零或更低值；或到达各序 列的末端时，在各个方向上的字匹配延伸停止。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用11的字长(W)、10的期望值(expectation，E)、100的截止值、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用如下默认参数：字长为3，期望值(E)为10，和BLOSUM62计分矩阵(参见赫尼霍夫(Henikoff)和赫尼霍夫(1992)美国国家科学院院刊(Proc.Natl，Acad.Sci.USA)89：10915)，比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。在进行BLAST算法时通常关闭“低复杂度”过滤器。
除计算序列一致性百分比外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析(例如参见卡林(Karlin)和奥特查尔(Altschul)，美国国家科学院院刊(Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA)90：5873-5787(1993))。BLAST算法所提供的一种相似性度量为最小和概率(smallest sum probability，P(N))，其可指示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然出现的匹配的概率。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总和概率小于约0.2、小于约0.01，或小于约0.001，那么认为所述核酸与参考序列类似。
诱变和其它分子生物学技术
可以使用分子生物学技术操作本发明的和用于本发明中的多聚核苷酸和多肽。宜根据常规方法，利用定点诱变来修饰核苷酸序列。或者，可利用化学合成来制备核苷酸序列，所述化学合成包括(但不限于)使用寡核苷酸合成仪(其中寡核苷酸是根据所需多肽的氨基酸序列来设计)且优选选择产生重组多肽的宿主细胞偏好的那些密码子。举例来说，可通过PCR、接合或接合链式反应来合成和组装数个编码所需多肽多个部分的小寡核苷酸。例如参见布兰妮(Barany)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)88：189-193(1991)；美国专利6,521,427，以引用方式并入本文中。
本发明利用重组基因学领域中的常规技术。揭示本发明的一般使用方法的基础教材包括萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第3版，2001)；克林格(Kriegler)，基因转移和表达实验手册(Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual)(1990)；和现代分子生物学技术(Current Protocols in Molecular Biology)(奥斯贝尔(Ausubel)等人编，1994)。
描述分子生物技术的一般教材包括伯格(Berger)和吉米尔(Kimmel)，分子克隆技术指南。酶学方法(Guide to Molecular Cloning Techniques.Methods in Enzymology)第152卷，学术出版公司(Academic Press，Inc.)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego，CA)(伯格)；萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第2版)第1-3卷，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)， 纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor，New York)，1989(“萨姆布鲁克”)；和现代分子生物学技术(Current Protocols in Molecular Biology.)，F.M.奥斯贝尔(F.M.Ausubel)等人编，现代技术(Current Protocols)，格里尼出版公司(Greene Publishing Associates，Inc.)与约翰威立父子出版公司(John Wiley & Sons，Inc.)的合资公司，(1999增刊)(“奥斯贝尔”)。这些教材描述了诱变、载体的使用、启动子和许多其它相关课题，这些相关课题涉及例如包括用于产生包括所选氨基酸(例如非天然氨基酸)的蛋白质的选择密码子、正交tRNA、正交合成酶和其对在内的基因或多聚核苷酸的产生。
多类诱变方法可用于本发明中以实现多种目的，包括(但不限于)产生新颖合成酶或tRNA、使tRNA分子突变、产生tRNA文库、使RS分子突变、产生合成酶文库、产生选择密码子、插入编码相关蛋白质或多肽中的所选氨基酸的选择密码子。所述诱变方法包括(但不限于)定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构建、使用含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰DNA诱变、使用带缺口双链DNA的诱变等，或其任何组合。其它适合的方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主株的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、通过总基因合成诱变、双链断裂修复等。本发明中也包括(包括(但不限于))涉及嵌合构建体的诱变。在一个实施例中，可利用有关天然存在的分子或者改变或突变的天然存在的分子的已知信息，包括(但不限于)序列、序列比较、物理特性、二级、三级或四级结构、晶体结构等，来指导诱变。
本文中所见的教材和实例描述了这些程序。其它信息可见于文中所引用的以下公开案和参考文献：林(Ling)等人，DNA诱变方法综述(Approaches to DNA mutagenesis：an overview)，分析生物化学(Anal Biochem.)254(2)：157-178(1997)；戴勒(Dale)等人，使用硫代磷酸酯的寡聚核苷酸定向随机诱变法(Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method)，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)57：369-374(1996)；史密斯(Smith)，体外诱变(In vitro mutagenesis)，遗传学评述(Ann.Rev.Genet.)19：423-462(1985)；博思汀(Botstein)和肖特勒(Shortle)，体外诱变策略和应用(Strategies and applications of in vitro mutagenesis)，科学(Science)229：1193-1201(1985)；卡特(Carter)，定点诱变(Site-directed mutagenesis)，生物化学杂志(Biochem.J.)237：1-7(1986)；库克尔(Kunkel)，寡聚核苷酸定向诱变效率(The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis)，核酸与分子生物学(Nucleic Acids & Molecular Biology)(艾克斯廷F.(Eckstein，F.)和李磊D.M.J.(Lilley，D.M.J.)编，柏林施普林格出版社(Springer Verlag，Berlin))(1987)；库克尔，在无表型选择情况下快速而高效地 定点诱变(Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：488-492(1985)；库克尔等人，在无表型选择情况下快速而高效地定点诱变，酶学方法(Methods in Enzymol.)154，367-382(1987)；贝斯(Bass)等人，具有新DNA结合特异性的突变Trp阻遏子(Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities)；科学(Science)242：240-245(1988)；佐勒(Zoller)和史密斯(Smith)，使用M13源性载体的寡聚核苷酸定向诱变：一种在任何DNA片段中产生点突变通用有效程序(Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment)，核酸研究(Nucleic Acids Res)，10：6487-6500(1982)；佐勒和史密斯，克隆到M13载体中的DNA片段的寡聚核苷酸定向诱变(Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors)，酶学方法(Methods in Enzymol.)100：468-500(1983)；佐勒和史密斯，寡聚核苷酸定向诱变：一种使用两个寡聚核苷酸引物和单链DNA模板的简单方法(Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template)，酶学方法 154：329-350(1987)；泰勒(Taylor)等人，在限制性酶反应中使用硫代磷酸酯修饰的DNA来制备带切口DNA(The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA)，核酸研究 13：8749-8764(1985)；泰勒等人，使用硫代磷酸酯修饰的DNA以高频率快速产生寡聚核苷酸定向突变(The rapid generation o oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA)，核酸研究 13：8765-8785(1985)；纳卡玛(Nakamaye)和艾克斯廷(Eckstein)，硫代磷酸酯基团的限制性内切核酸酶Nci I裂解抑制以及其在寡聚核苷酸定向诱变中的应用(Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis)，核酸研究 14：9679-9698(1986)；塞尔斯(Sayers)等人，用于基于硫代磷酸酯的寡聚核苷酸定向诱变中的5′-3′外切核酸酶(5′-3′Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis)，核酸研究 16：791-802(1988)；塞尔斯等人，含硫代磷酸酯的DNA通过在溴化乙锭存在下与限制性内切核酸酶反应来进行链特异性裂解(Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide)，(1988)核酸研究16：803-814；克拉莫(Kramer)等人，用于构建寡聚核苷酸定向突变的缺口双链DNA方法(The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction)，核酸研究 12： 9441-9456(1984)；克拉莫和菲特兹(Fritz)，经由带缺口双链DNA的寡聚核苷酸定向突变构建(Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA)，酶学方法154：350-367(1987)；克拉莫等人，在寡聚核苷酸定向突变构建的带缺口双链DNA方法中酶促体外反应的改进(Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations)，核酸研究 16：7207(1988)；菲特兹等人，寡聚核苷酸定向突变构建：无体外酶促反应的缺口双链DNA程序(Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro)，核酸研究16：6987-6999(1988)；克拉莫等人，利用大肠杆菌的甲基定向DNA错配修复系统以不同效率校正不同的碱基/碱基错配(Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E.coli)，细胞(Cell)38：879-887(1984)；卡特(Carter)等人，使用M13载体改进寡聚核苷酸定点诱变(Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors)，核酸研究 13：4431-4443(1985)；卡特，使用M13载体改进寡聚核苷酸定向诱变(Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors)，酶学方法 154：382-403(1987)；艾格达乍德赫(Eghtedarzadeh)和汉尼科夫(Henikoff)，使用寡聚核苷酸产生大缺失(Use of oligonucleotides to generate large deletions)，核酸研究 14：5115(1986)；威尔斯(Wells)等人，形成氢键对于稳定枯草杆菌蛋白酶的过渡态的重要性(Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin)，英国皇家化学协会期刊(Phil Trans.R.Soc.Lond.)A 317：415-423(1986)；纳姆拜耳(Nambiar)等人，编码核糖核酸酶S蛋白的基因的总合成和克隆(Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein)，科学223：1299-1301(1984)；萨克玛(Sakmar)和克拉那(Khorana)，牛视杆外节鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(转导蛋白)α亚基的基因的总合成和表达(Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin))，核酸研究 14：6361-6372(1988)；威尔斯等人，盒式诱变：一种在指定位点产生多个突变的有效方法(Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites)，基因(Gene)34：315-323(1985)；格拉托姆 等人，利用小规模“鸟枪”基因合成法进行寡聚核苷酸定向诱变(Olionucleotide-directed mutagenesis by microscale′shot-gun′gene synthesis)，核酸研究13：3305-3316(1985)；曼德克(Mandecki)，大肠杆菌质粒中寡聚核苷酸定向双链破裂修复“一种位点特异性诱变方法(Oligonucleotide-directed double-strand break repair in  plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad，Sci.USA)，83：7177-7181(1986)；阿诺德(Arnold)，针对不常见环境的蛋白质工程改造(Protein engineering for unusual environments)，现代生物技术观点(Current Opinion in Biotechnology)4：450-455(1993)；塞尔波(Sieber)等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)，19：456-460(2001)；W.P，C.斯蒂姆(W.P，C.Stemmer)，自然(Nature)370，389-91(1994)；和I.A.罗瑞莫(I.A.Lorimer)，I.帕斯坦(I.Pastan)，核酸研究 23，3067-8(1995)。关于上述众多方法的其它细节可见于酶学方法第154卷中，其中也描述了对于与各种诱变方法有关的故障检修问题的有效控制。
通常根据布克吉(Beaucage)和卡鲁斯(Caruthers)，四面体通讯(Tetrahedron Letts.)22(20)：1859-1862，(1981)中所述的固相氨基磷酸三酯法，例如使用尼德尔曼-范德瓦特(Needham-VanDevanter)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)12：6159-6168(1984)所述的自动合成仪，以化学方式合成寡核苷酸，例如用于本发明的诱变过程中，例如使合成酶文库突变，或改变tRNA。
此外，基本上任何核酸都可从多种商业来源中的任一者定制或标准定购，这些商业来源例如米德兰标准试剂公司(Midland Certified Reagent Company)(mcrcoligos.com)、美国基因公司(The Great American Gene Company)(www.genco.com)、艾普斯基因公司(ExpressGen Inc.)(www.expressgen.com)、欧普隆技术公司(Operon Technologies Inc.)(加利福尼亚州阿拉米达(Alameda，CA))和许多其它来源。
本发明还涉及经由正交tRNA/RS对在体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。利用本发明的多聚核苷酸或包括本发明多聚核苷酸的构建体，包括(但不限于)本发明的载体(其可为例如克隆载体或表达载体)，对宿主细胞进行基因工程改造(包括(但不限于)转化、转导或转染)。举例来说，将正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生化的蛋白质的编码区可操作性地连接到在所需宿主细胞中起作用的基因表达控制元件。载体可为例如质粒、柯斯质粒、噬菌体、细菌、病毒、裸多聚核苷酸或经结合多聚核苷酸的形式。可利用标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述方法包括电穿孔(弗洛姆(Fromm)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82，5824(1985)))、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上用具有核酸的小粒子高速弹道穿透(科莱恩(Klein)等人，自然(Nature)327，70-73(1987))等。
可使用将目标核酸引入细胞中的数种众所周知的方法，其中任一种都可用于本发明中。这些方法包括：受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法和 经病毒载体(在下文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构建体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期，且可利用此项技术中已知的多种方法来分离细菌中的质粒(例如参见萨姆布鲁克(Sambrook))。另外，也可购买许多试剂盒来从细菌中纯化质粒(例如参见EasyPrepTM、FlexiPrepTM，都来自法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech)；StrataCleanTM，来自赛特杰公司(Stratagene)；和QIAprepTM，来自凯杰公司(Qiagen))。随后进一步操作经分离和纯化的质粒以产生其它质粒，来用于转染细胞，或并入相关载体中以感染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定目标核酸表达的启动子。载体任选包含普通表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列、允许表达盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(包括(但不限于)穿梭载体)，以及用于原核系统与真核系统的选择标记物。载体适用于在原核细胞、真核细胞或两者中复制和/或整合。参见盖里姆(Gillam)和史密斯(Smith)，基因(Gene)8：81(1979)；罗伯茨(Roberts)等人，自然(Nature.)328：731(1987)；斯奇尼德尔E.(Schneider，E.)等人，蛋白质表达和纯化(Protein Expr.Purif.)6(1)10-14(1995)；奥斯贝尔(Ausubel)，萨姆布鲁克(Sambrook)，伯格(Berger)(都同上文)。举例来说，ATCC(例如由ATCC出版的细菌和噬菌体的ATCC目录(The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage)(1992)吉赫纳(Gherna)等人(编))提供了可用于克隆的细菌和噬菌体的目录。用于测序、克隆和分子生物学其它方面的其它基本程序以及基础理论讨论也见于沃特森(Watson)等人(1992)重组DNA(Recombinant DNA)第2版，科学美国人(Scientific American Books)，纽约(NY)。另外，基本上任何核酸(和几乎任何带标记的核酸，无论标准或非标准)都可从多种商业来源中的任一者定制或标准定购，这些商业来源例如米德兰标准试剂公司(Midland Certified Reagent Company)(德克萨斯州米德兰(Midland，TX)，mcrc.com)、美国基因公司(The Great American Gene Company)(加利福尼亚州雷蒙钠(Ramona，CA)，可在万维网genco.com上获得)、艾普斯基因公司(ExpressGen Inc.)(伊利诺伊州芝加哥(Chicago，IL)，可在万维网expressgen.com上获得)、欧普隆技术公司(Operon Technologies Inc.)(加利福尼亚州阿拉米达(Alameda，CA))和许多其它来源。
可在经改变而适用于例如筛选步骤、活化启动子或选择转化株等活动的常规营养培养基中培养经工程改造的宿主细胞。这些细胞可任选培养入转基因生物体中。关于例如细胞分离和培养(例如用于随后核酸分离)的其它有用参考文献包括弗莱希利(Freshney)(1994)动物细胞培养基础技术手册(Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique)，第3版，纽约威立-利斯出版公司(Wiley-Liss，New York)，及其中所引用 的参考文献；佩尼(Payne)等人(1992)在液体系统中的植物细胞和组织培养(Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems)，约翰威立父子公司(John Wiley & Sons，Inc.)，纽约州纽约市(New York，NY)；盖姆伯格(Gamborg)和菲利普斯(Phillips)(编)(1995) 植物细胞、组织和器官培养(Plant Cell，Tissue and Organ Culture)；基本方法施普林格实验手册(Fundamental Methods Springer Lab Manual)，施普林格-维拉格(Springer-Verlag)(柏林，海德堡纽约(Berlin Heidelberg New York)，以及奥特拉斯(Atlas)和帕克斯(Parks)(编)微生物培养基手册(The Handbook of Microbiological Media)(1993)CRC出版社，佛罗里达州伯克莱屯(Boca Raton，FL)。
在体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力具有多种益处，包括(但不限于)突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活生物体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白于治疗性治疗和诊断应用的用途。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性和其它特性的非天然氨基酸包括在蛋白质中的能力可极大地扩展理性且系统地操纵蛋白质结构的能力，从而探查蛋白质功能并且产生具有新颖特性的新蛋白质或有机体。
相关蛋白质和多肽
并入非天然氨基酸可实现多个目的，包括(但不限于)定制蛋白质结构和/或功能的改变；改变尺寸、酸度、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶目标位点的可接近性；靶向某一部分(包括(但不限于)用于蛋白质分析)；添加生物活性分子；连接聚合物；连接放射性核素；调节血清半衰期；调节组织渗透(例如肿瘤)；调节主动输送；调节组织、细胞或器官特异性或分布；调节免疫原性；调节蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白质可具有较强的或甚至全新的催化或生物物理特性。举例来说，任选通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来改变以下特性：毒性、生物分布、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子反应(包括(但不限于)共价或非共价)的能力等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物适用于(包括(但不限于))新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白质(包括(但不限于)抗体)以及(包括(但不限于))蛋白质结构和功能研究。例如参见道格悌(Dougherty)，(2000)作为蛋白质结构和功能探针的非天然氨基酸(Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function)，现代化学生物学观点(Current Opinion in Chemical Biology.)4：645-652。
蛋白质可具有至少一个，包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个，或者至少十个或十个以上非天然氨 基酸。这些非天然氨基酸可相同或不同，包括(但不限于)在蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同位点可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的非天然氨基酸。蛋白质可具有至少一个(但少于全部)存在于蛋白质中的特定氨基酸经非天然氨基酸取代。对于具有一个以上非天然氨基酸的指定蛋白质，非天然氨基酸可相同或不同(包括(但不限于)，所述蛋白质可包括两种或两种以上不同类型的非天然氨基酸，或者可包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的指定蛋白质，非天然氨基酸可相同、不同，或为多个相同种类的非天然氨基酸与至少一个不同非天然氨基酸的组合。
通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的相关蛋白质或多肽，蛋白质或多肽通常会包括真核翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰不是由原核细胞进行的。举例来说，翻译后修饰包括(包括(但不限于))乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等。在另一方面中，翻译后修饰包括前体(包括(但不限于)降钙素前体、降钙素基因相关的肽前体、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、前胰岛素、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工；组装成多亚基蛋白质或大分子组装物；翻译到细胞中另一位点(包括(但不限于)细胞器，例如内质网、高尔基体(golgi apparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等，或通过分泌途径)。在某些实施例中，蛋白质包含分泌或定位序列、表位标签、FLAG标签、多聚组氨酸标签、GST融合体等。
在细胞中产生在特定位置具有所选氨基酸的蛋白质的方法也为本发明的特征。举例来说，一种方法包括在适当的培养基中使细胞生长，其中所述细胞包含一种核酸，这种核酸包含至少一个选择密码子并且编码蛋白质；以及提供所选氨基酸；其中所述细胞进一步包含：正交tRNA(O-tRNA)，其在细胞中起作用并识别选择密码子；和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)，其优先利用所选氨基酸将O-tRNA氨酰基化。通常，O-tRNA包含在同源合成酶存在下对选择密码子反应而产生抑制活性。由本方法制造的蛋白质也为本发明的特征。
本发明组合物和利用本发明方法制备的组合物任选是在细胞中。随后，可将本发明的O-tRNA/O-RS对或个别组件用于宿主系统的翻译机器中，由此将所选氨基酸，例如非天然氨基酸，并入蛋白质中。专利申请案USSN 10/825,867，标题为“扩充真核遗传密码(Expanding the Eukaryotic Genetic Code)”；和10/126,927，标题为“体内并入非天然氨基酸(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)”，描述 了这一方法，以引用的方式并入本文中。举例来说，当将O-tRNA/O-RS对引入宿主(例如大肠杆菌)中时，所述对使得在体内对选择密码子反应而将所选氨基酸并入蛋白质中，所述所选氨基酸为例如非天然氨基酸，如合成氨基酸，例如亮氨酸氨基酸的衍生物，其可外源添加到生长培养基中。本发明组合物可任选是在体外翻译系统或体内系统中。
使用本文中的组合物和方法可以产生任何包括所选氨基酸(例如非天然氨基酸)(以及任何相应编码核酸，例如包括一个或一个以上选择密码子的核酸)的蛋白质(或其部分)。任何多肽都适于并有一个或一个以上所选氨基酸。尚未尝试鉴别成千上万种已知蛋白质，这些蛋白质中任一者都可例如通过定制任何可用突变方法以在相关翻译系统中包括一个或一个以上适当选择密码子来修饰，从而包括一个或一个以上非天然氨基酸。已知蛋白质的常见序列谱系包括GenBank EMBL、DDBJ和NCBI。通过搜索互联网可容易地鉴别其它谱系。
通常，所述蛋白质与任何可用蛋白质(例如，治疗性蛋白质、诊断性蛋白质、工业酶或其部分等)例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％或更高一致，且其包含一个或一个以上所选氨基酸。经修饰以包含一个或一个以上所选氨基酸(例如非天然氨基酸)的治疗性、诊断性和其它蛋白质的实例可见于(但不限于)USSN 10/825,867，标题为“扩充真核遗传密码(Expanding the Eukaryotic Genetic Code)”；和美国专利申请案第10/126,927号，标题为“体内并入非天然氨基酸(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)”中者。
在某些实施例中，本发明方法和/或组合物中的相关蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常，核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或更多个选择密码子。
可使用所属领域技术人员众所周知且本文中在“诱变和其它分子生物学技术”下描述的方法，来诱变编码相关蛋白质或多肽的基因，以使其包括例如一个或一个以上选择密码子，以供并入所选氨基酸，例如非天然氨基酸。举例来说，诱变相关蛋白质的核酸，以使其包括一个或一个以上选择密码子，以供插入一个或一个以上所选氨基酸，例如非天然氨基酸。本发明包括例如包括至少一个所选氨基酸的任何蛋白质的任何此种变异体(例如，突变体)形式。类似地，本发明还包括相应核酸，即，具有一个或一个以上编码一个或一个以上所选氨基酸的选择密码子的任何核酸。
为了制备包括所选氨基酸的蛋白质，可以使用适用于经由正交tRNA/RS对在体内并入所选氨基酸的宿主细胞和生物体。利用一种或一种以上表达正交tRNA、正交tRNA 合成酶的载体以及编码待衍生化的蛋白质的载体对宿主细胞进行遗传工程改造(例如转化、转导或转染)。这些组件可都在同一载体上，或各自可在独立载体上，两个组件可在一个载体上而第三个组件在另一载体上。载体可为例如质粒、柯斯质粒、噬菌体、细菌、病毒、裸多聚核苷酸或经结合多聚核苷酸的形式。
替代性系统
已使用数种策略在非重组宿主细胞、诱变的宿主细胞或无细胞系统中将非天然氨基酸引入蛋白质中。具有反应性侧链的氨基酸(例如Lys、Cys和Tyr)的衍生化会使得赖氨酸转化为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也是一种并入非天然氨基酸的直截了当的方法。随着近来肽片段的酶促接合和天然化学接合的发展，有可能制造出更大的蛋白质。例如参见P.E.达沃森(P.E.Dawson)和S.B.H.肯特(S.B.H.Kent)，生物化学年评(Annu.Rev.Biochem.)，69：923(2000)。化学肽接合和天然化学接合方法描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO 02/098902和WO 03/04223中，这些专利都是以引用的方式并入本文中。已使用将利用所需非天然氨基酸以化学方式酰化的抑制性tRNA加到能够支持蛋白质生物合成的体外提取物中的一般体外生物合成方法，将超过100个非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。例如参见V.W.柯尼西(V.W.Cornish)，D.孟德尔(D.Mendel)和P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)，德国应用化学(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)1995，34：621(1995)；C.J.诺伦(C.J.Noren)，S.J.安托尼-卡黑尔(S.J.Anthony-Cahill)，M.C.格雷夫斯(M.C.Griffith)，P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)，用于将非天然氨基酸位点特异性并入蛋白质中的一般方法(A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins)，科学(Science)244：182-188(1989)；和J.D.贝恩(J.D.Bain)，C.G.格雷布(C.G.Glabe)，T.A.迪克斯(T.A.Dix)，A.R.查柏林(A.R.Chamberlin)，E.S.迪阿拉(E.S.Diala)，用于将非天然氨基酸位点特异性并入多肽中的生物合成方法(Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide)， 美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)111：8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入蛋白质中以供蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机理和信号转导的研究。
已开发出一种称作选择性压力并入(selective pressure incorporation)的体内方法，来研究野生型合成酶的杂乱性(promiscuity)。例如参见N.鲍里斯(N.Budisa)，C.明克斯(C.Minks)，S.阿尔弗雷德(S.Alefelder)，W.温格尔(W.Wenger)，F.M.董(F.M.Dong)，L.莫罗德(L.Moroder)和R.胡波(R.Huber)，美国实验生物学联合会会刊(FASEB J.)，13：41(1999)。使向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株生长 于含有有限浓度天然氨基酸的基本培养基中，而目标基因的转录受到阻遏。在稳定生长期开始时，天然氨基酸被耗尽，并且被非天然氨基酸类似物置换。诱导重组蛋白表达将使含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，曾使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，所述苯丙氨酸在UV光谱中显示两个易于鉴别的特征性肩峰，例如参见C.明克斯(C.Minks)，R.胡波(R.Huber)，L.莫罗德(L.Moroder)和N.鲍里斯(N.Budisa)，分析生物化学(Anal.Biochem.)，284：29(2000)；曾使用三氟甲硫氨酸代替噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸，以利用19F NMR研究其与低聚壳聚糖配体的相互作用，例如参见H.杜威尔(H.Duewel)，E.道博(E.Daub)，V.罗宾逊(V.Robinson)和J.F.霍尼克(J.F.Honek)，生物化学(Biochemistry)，36：3404(1997)；以及已并入三氟亮氨酸代替亮氨酸，从而使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参见Y.杨(Y.Tang)，G.格瑞兰达(G.Ghirlanda)，W.A.派特塔(W.A.Petka)，T.中岛(T.Nakajima)，W.F.德格雷多(W.F.DeGrado)和D.A.斯瑞尔(D.A.Tirrell)， 德国应用化学(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.).40：1494(2001)。此外，还将硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各种重组蛋白中以促进X射线结晶学中的相溶解。例如参见W.A.汉迪克森(W.A.Hendrickson)，J.R.霍顿(J.R.Horton)和D.M.雷玛斯特(D.M.Lemaster)，欧洲分子生物学组织期刊(EMBO J.)，9：1665(1990)；J.O.波利斯(J.O.Boles)，K.莱文斯基(K.Lewinski)，M.坤克(M.Kunkle)，J.D.奥多姆(J.D.Odom)，B.顿雷普(B.Dunlap)，L.勒博达(L.Lebioda)和M.哈塔达(M.Hatada)，自然结构生物学(Nat.Struct.Biol.).1：283(1994)；N.布迪萨(N.Budisa)，B.斯特普(B.Steipe)，P.德曼基(P.Demange)，C.艾克斯柯恩(C.Eckerskorn)，J.科勒曼(J.Kellermann)和R.胡波(R.Huber)，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.).230：788(1995)；和N.布迪萨(N.Budisa)，W.卡恩博克(W.Karnbrock)，S.斯坦恩布奇(S.Steinbacher)，A.汉姆(A.Humm)，L.普雷德(L.Prade)，T.纽费恩德(T.Neuefeind)，L.莫罗德(L.Moroder)和R.胡波(R.Huber)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，270：616(1997)。也已有效地并入具有烯或炔官能团的甲硫氨酸类似物，由此允许借助化学方式对蛋白质进行其它修饰。例如参见J.C.M.范海斯特(J.C.M.vanHest)和D.A.特瑞尔(D.A.Tirrell)，欧洲生物学化学会联盟通讯(FEBS Lett.)，428：68(1998)；J.C.范海斯特(J.C.van Hest)，K.L.奇科(K.L.Kiick)和D.A.特瑞尔，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)122：1282(2000)；以及K.L.奇科和D.A.特瑞尔，四面体通讯(Tetrahedron)，56：9487(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开案第2002/0042097号，都以引用的方式并入本文中。
这种方法的成功取决于氨酰基-tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，而这种合成酶一般需要高选择性来确保蛋白质翻译的保真度。扩展这种方法的范围的一种方式是放宽氨酰基-tRNA合成酶的底物特异性，这已在少数情况下实现。举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基tRNA合成酶(PheRS)中用Gly置换Ala294可增加底物结合口袋的尺寸，并引起对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)对tRNAPhe的酰化。参见M.爱博(M.Ibba)，P.卡斯特(P.Kast)和H.汉尼克(H.Hennecke)，生物化学(Biochemistry)，33：7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸来替代苯丙氨酸。例如参见M.爱博(M.Ibba)和H.汉尼克(H.Hennecke)，欧洲生物学化学会联盟通讯(FEBS Lett.).364：272(1995)；以及N.夏尔玛(N.Sharma)，R.福特(R.Furter)，P.卡斯特(P.Kast)和D.A.特瑞尔(D.A.Tirrell)，欧洲生物学化学会联盟通讯，467：37(2000)。类似地，已显示位于大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点附近的点突变Phe130Ser允许重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。参见F.滨野高久(F.Hamano-Takaku)，T.岩间(T.Iwama)，S.齐藤矢野(S.Saito-Yano)，K.高久(K.Takaku)，Y.门田(Y.Monden)，M.北田(M.Kitabatake)，D.索尔(D.Soll)和S.西村(S.Nishimura)， 生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，275：40324(2000)。
在体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一策略为修饰具有校对机制(proofreading mechanism)的合成酶。这些合成酶不能区分结构与同源天然氨基酸类似的氨基酸，并因此将其活化。此错误在单独位点上得到校正，使得来自tRNA的错配(mischarged)氨基酸去酰基化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能，并被并入。近来已利用缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证实了这种方法。参见V.道宁(V.Doring)，H.D.磨兹(H.D.Mootz)，L.A.南格(L.A.Nangle)，T.L.汉迪克森(T.L.Hendrickson)，范德克雷兹拉格德(V.de Crecy-Lagard)，P.斯奇迈尔(P.Schimmel)和P.玛丽尔(P.Marliere)，科学(Science)，292：501(2001)。ValRS可使带有Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)的tRNAVal错误氨酰基化；随后经由编辑结构域水解这些非同源氨基酸。在大肠杆菌染色体的随机诱变之后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地使tRNAVal装有Cys。由于Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团经Abu中的-CH3置换)，以致当这种突变大肠杆菌菌株在Abu存在下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示，在天然蛋白质的各缬氨酸位置处约24％的缬氨酸经Abu置换。
固相合成和半合成方法也已能够合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说，参见以下出版物和其中引用的参考文献：克里克F.H.C.(Crick，F.H.C.)，巴雷特L.(Barrett， L.)，布雷纳S.(Brenner，S.)，沃特托比R.(Watts-Tobin，R.)蛋白质遗传密码的一般性质(General nature of the genetic code for proteins.)自然(Nature)，192：1227-1232(1961)；霍夫曼K.(Hofmann，K.)，伯恩H.(Bonn，H.)有关多肽的研究。XXXVI.吡唑-咪唑置换对S-肽片段的S-蛋白质活化效力的影响(Studies on polypeptides.XXXVI.The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment)，美国化学杂志(J.Am Chem)，88(24)：5914-5919(1966)；卡瑟E.T.(Kaiser，E.T.)生物活性肽和包括酶在内的蛋白质的合成方法(Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes)，化学研究述评(Ace Chem Res)，22：47-54(1989)；中塚T.(Nakatsuka，T.)，佐佐木T.(Sasaki，T.)，卡瑟E.T.(Kaiser，E.T.)由半合成酶硫代枯草杆菌蛋白酶催化的肽片段偶合(Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin)，美国化学协会杂志(J Am Chem Soc)，109：3808-3810(1987)；斯奇诺泽M.(Schnolzer，M.)，肯特S B H.(Kent，S B H.)通过接合未受保护的合成肽构建蛋白质：主链经工程改造的HIV蛋白酶(Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides：backbone-engineered HIV protease)，科学(Science)，256(5054)：221-225(1992)；查肯I.M.(Chaiken，I.M.)半合成肽和蛋白质(Semisynthetic peptides and proteins)，生物化学学报(CRC Crit Rev Biochem)，11(3)：255-301(1981)；奥夫德R.E.(Offord，R.E.)如何借助化学方式进行蛋白质工程改造？(Protein engineering by chemical means？)蛋白质工程(Protein Eng.)，1(3)：151-157(1987)；和杰克森D.Y.(Jackson，D.Y.)，伯尼尔J.(Burnier，J.)，权C(Quan，C)，斯坦利M.(Stanley，M.)，汤姆J.(Tom，J.)，威尔斯J.A.(Wells，J.A.)用于总体合成带有非天然催化残基的核糖核酸酶A的设计肽连接酶(A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues)，科学(Science)，266(5183)：243(1994)。
已使用化学修饰在体外将包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸在内的多种非天然侧链引入蛋白质中。例如参见，克雷D.R.(Corey，D.R.)，查鲁兹P.G.(Schultz，P.G.)杂交序列特异性单链脱氧核糖核酸酶的产生(Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease)，科学(Science)，238(4832)：1401-1403(1987)；卡瑟E.T.(Kaiser，E.T.)，劳伦斯D.S.(Lawrence D.S.)，洛克塔S.E.(Rokita，S.E.)酶特异性的化学修饰(The chemical modification of enzymatic specificity)，生物化学年评(Annu Rev Biochem)，54：565-595(1985)；卡瑟E.T.，劳伦斯D.S.，酶活性位点的化学突变(Chemical mutation of enyzme active sites)，科学，226(4674)：505-511(1984)；尼特K.E. (Neet，K.E.)，南西A(Nanci A)，柯西兰德D.E.(Koshland，D.E.)硫醇-枯草杆菌蛋白酶的特性(Properties of thiol-subtilisin)，生物化学杂志(J Biol.Chem.)243(24)：6392-6401(1968)；博拉格L.(Polgar，L.)，M.L.本德尔(M.L.Bender).含有合成形成的活性位点的新酶。硫醇-枯草杆菌蛋白酶(A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.)美国化学协会杂志(J.Am Chem Soc)，88：3153-3154(1966)；和波拉克S.J.(Pollack，S.J.)，中山G.(Nakayama，G.)，查鲁兹P.G.(Schultz，P.G.)将亲核基团和光谱探针引入抗体结合位点中(Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites)，科学，242(4881)：1038-1040(1988)。
通过免疫反应性定义多肽
由于本发明的多肽提供多种新的多肽序列(例如，在本文中的翻译系统中合成的蛋白质的情况下包含所选氨基酸(例如非天然氨基酸)；或例如在本文中新颖合成酶的情况下，包含新颖标准氨基酸序列)，故所述多肽还提供可例如在免疫学分析中识别的新结构特征。特异性结合本发明多肽的抗血清的产生以及所述抗血清所结合的多肽是本发明的特征。本文中使用的术语“抗体”包括(但不限于)实质上由一个或一个以上特异性结合并识别分析物(抗原)的免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽。实例包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和单链抗体等。本文中使用的术语“抗体”中也包括免疫球蛋白的片段，包括Fab片段和由表达文库(包括噬菌体展示)所产生的片段。有关抗体结构和术语学，例如参见保罗(Paul)，基础免疫学(Fundamental Immunology)，第4版，1999，瑞文出版社(Raven Press)，纽约(New York)。非天然氨基酸和免疫技术的应用实例提供于颁予斯克里普斯研究所(Scripps Research Institute)的WO/2009/099672中，标题为用遗传编码的非天然氨基酸破坏免疫耐受性(Breaking Immunological Tolerance With a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid)，并且所述专利的全文以引用的方式并入本文中。
举例来说，本发明包括利用本发明tRNA和/或RS产生的蛋白质，这些蛋白质与针对包含氨基酸序列的免疫原所产生的抗体或抗血清特异性结合或特异性免疫反应。为了消除与其它同源物的交叉反应性，用可用蛋白质，例如野生型多肽，例如“对照”多肽，来消减抗体或抗血清。在野生型蛋白质对应于核酸的情况下，产生由所述核酸编码的多肽，并用于实现消减抗体/抗血清的目的。
在一种典型形式中，免疫分析使用一种多克隆抗血清，其是针对一种或一种以上多肽或其实质性子序列(即，至少约30％所提供的全长序列)而产生。由所述蛋白质得到的潜在多肽免疫原组在下文中通称为“免疫原性多肽”。任选选择所得抗血清使其对于 对照合成酶同源物具有低交叉反应性，并且在免疫分析中使用多克隆抗血清之前，利用一种或一种以上对照同源物，例如通过免疫吸附，去除任何此类交叉反应性。
为了产生用于免疫分析中的抗血清，可如本文中所述产生一种或一种以上免疫原性多肽并加以纯化。举例来说，可在重组细胞中产生重组蛋白。利用免疫原性蛋白与标准佐剂(例如夫罗因德佐剂(Freund′s adiuvant))相组合以及标准小鼠免疫方案，对近交系小鼠(由于结果因小鼠的虚拟遗传一致性(virtual genetic identity)而具有较高可再现性，从而用于此分析中)进行免疫。有关抗体产生、可用于测定特异性免疫反应性的免疫分析形式和条件，例如参见哈罗(Harlow)和莱恩(Lane)(1988)抗体实验手册(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Publications)，纽约(New York))。
有关抗体的其它参考文献和论述也见于本文中，并且可在此用于借助免疫反应性来定义多肽。另外，可将源自本文中所揭示序列的一种或一种以上合成或重组多肽与载体蛋白结合，并用作免疫原。
收集多克隆血清，并且在免疫分析，例如，利用一种或一种以上固定于固体支撑物上的免疫原性蛋白的固相免疫分析中，针对免疫原性多肽进行滴定。选择具有106或更高滴度的多克隆抗血清，汇集并利用对照合成酶多肽消减，以产生消减的汇集的经滴定多克隆抗血清。
在比较免疫分析中，测试消减的汇集的经滴定多克隆抗血清对于对照同源物的交叉反应性。在这一比较分析中，测定所述消减的经滴定多克隆抗血清的差别结合条件，这引起经滴定多克隆抗血清结合于免疫原性蛋白质的信噪比是结合于对照合成酶同源物的至少约5-10倍。也就是说，通过添加例如白蛋白或脱脂奶粉等非特异性竞争剂，和/或通过调节盐条件、温度等，来调整结合反应的严格度。将这些结合条件用于后续分析中，以测定所汇集的消减的多克隆抗血清是否特异性结合测试多肽(与免疫原性多肽和/或对照多肽相比较的多肽)。
在另一实例中，使用竞争性结合形式的免疫分析来检测测试多肽。举例来说，如所述，通过利用对照多肽的免疫吸附将交叉反应的抗体从汇集的抗血清混合物中去除。随后，将免疫原性多肽固定于暴露给所汇集的消减抗血清的固体支撑物上。将测试蛋白质添加到所述分析中以竞争结合所汇集的消减抗血清。将与固定蛋白质相比，测试蛋白质竞争结合所汇集的消减抗血清的能力与添加到所述分析中的免疫原性多肽竞争结合的能力(所述免疫原性多肽有效地与固定的免疫原性多肽竞争结合所汇集的抗血清)相比较。使用标准计算法计算测试蛋白质的交叉反应性百分比。
在平行分析中，任选与免疫原性多肽竞争结合抗血清的能力相比较，测定对照蛋白质竞争结合所汇集的消减抗血清的能力。再次，使用标准计算法计算对照多肽的交叉反应性百分比。当测试多肽的交叉反应性百分比是对照多肽的至少5倍到10倍时，和或当测试多肽的结合大致在免疫原性多肽结合的范围内时，认为测试多肽特异性结合所汇集的消减抗血清。
一般说来，可将经免疫吸附的汇集抗血清用于如本文所述的竞争性结合免疫分析中，以将任何测试多肽与免疫原性和/或对照多肽相比较。为进行这个比较，分别分析多种浓度的免疫原性、测试和对照多肽，并且使用标准技术测定抑制50％的消减抗血清与例如经固定对照、测试或免疫原性蛋白质结合所需的各多肽的量。如果在竞争性分析中结合所需的测试多肽的量小于所需免疫原性多肽量的2倍，那么只要所述量是对照多肽的至少约5倍到10倍，即认为测试多肽特异性结合针对免疫原性蛋白质所产生的抗体。
作为特异性的另一测定法，任选利用免疫原性多肽(而非对照多肽)完全免疫吸附所汇集的抗血清，直到可检测到极少或检测不到所得免疫原性多肽—经汇集的消减抗血清与免疫吸附中所使用的免疫原性多肽的结合。随后测试所述完全免疫吸附的抗血清与测试多肽的反应性。如果观察到极少或未观察到反应性(即，不超过关于完全免疫吸附的抗血清与免疫原性多肽结合所观察到的信噪比的2倍)，那么免疫原性蛋白质引起的抗血清与测试多肽特异性结合。
有关蛋白质、抗体、抗血清等等其它细节可见于USSN 10/825,867，标题为“扩充真核遗传密码(Expanding the Eukaryotic Genetic Code)”；WO 2002/085923，标题为“体内并入非天然氨基酸(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)”；美国专利第6,927,042号，标题为“糖蛋白的合成(Glycoprotein synthesis)”；和美国专利公开案第US 2004/0198637号，标题为“蛋白质阵列(Protein Arrays)”，以引用的方式并入本文中。
试剂盒
试剂盒也为本发明的特征。举例来说，提供在细胞中产生包含至少一个所选氨基酸(例如非天然氨基酸)的蛋白质的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有编码O-tRNA的多聚核苷酸序列和/或O-tRNA和/或编码O-RS的多聚核苷酸序列和/或O-RS的容器。在一个实施例中，试剂盒进一步包括至少一个所选氨基酸。在另一实施例中，试剂盒包括本发明的氨酰基化tRNA。在另一实施例中，试剂盒进一步包含用于产生蛋白质的说明材料。
另一实例是一种用于在无细胞翻译系统中产生包含至少一个所选氨基酸(例如非天 然氨基酸)的蛋白质的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有编码O-tRNA的多聚核苷酸序列和/或O-tRNA和/或编码O-RS的多聚核苷酸序列和/或O-RS的容器。在一个实施例中，试剂盒进一步包括所选氨基酸。在另一实施例中，试剂盒包括本发明的氨酰基化tRNA。在另一实施例中，试剂盒进一步包含用于产生蛋白质的说明材料。
实例
提供的以下实例将说明而非限制本发明。所属领域技术人员将认识到，在不背离本发明范围的情况下，可改变各种非关键性参数。
实例1：
针对对乙酰基苯丙氨酸的氨酰基-tRNA合成酶的选择 
筛选两个DNA文库中针对对乙酰基苯丙氨酸(一种非天然编码氨基酸)的氨酰基-tRNA合成酶。这些文库由pBK质粒中来自詹氏甲烷球菌的酪氨酰基tRNA合成酶基因的6个突变组成。 
进行的选择程序由5轮交替选择(3个阳性选择、2个阴性选择)组成。以1∶1比率组合文库，并通过电穿孔引入阳性选择细胞系(带有阳性选择质粒pREP的GeneHog)中，并接种到含有适合抗生素和非天然编码氨基酸对乙酰基苯丙氨酸(pAF)的基本培养基板(GMML)上。在37℃下培育板约40小时，此时，通过刮擦采集细胞。使用Qiagen Mini-Prep程序提取DNA，随后进行琼脂糖凝胶纯化，以分离出文库质粒DNA。
接着，通过电穿孔将这一DNA引入阴性选择细胞系(带有阴性选择质粒pBAD衍生物的GeneHog)中。将这些转化株接种到含有适合抗生素但不含非天然编码氨基酸(pAF)的LB板上。约17小时后，通过刮擦采集这些细胞，并使用Qiagen Mini-Prep程序和琼脂糖凝胶纯化来纯化质粒DNA。
利用相同电穿孔、平板接种、采集和DNA纯化方法进行接下来数轮选择。在最后一轮(第五轮)选择中，制成转化的阳性选择细胞的连续稀释液，接种到基本培养基板上。接着挑取个别集落，并使其在96孔盘中生长过夜。随后将这一96孔盘影印接种到含有不同浓度氯霉素(阳性选择抗生素)且含有和不含有非天然氨基酸pAF的基本培养基板上。在37℃下生长约40小时后，目测比较各板，以确定哪些集落在最高氯霉素浓度下生长，但在不存在非天然编码氨基酸pAF的情况下不生长或生长不良。使满足这些标准的集落生长过夜。借助Mini-Prep和琼脂糖凝胶纯化从培养物中分离出DNA，并进行测序。
从这一针对pAF的选择，发现13个克隆体具有独特的氨基酸序列，并对其进行进一步表征，以确定pAF-tRNA合成酶的保真度和加工能力。
为了表征这些合成酶，进行小范围的琥珀抑制，以显示非天然编码氨基酸pAF已经并入多肽中，并且借助SDS-PAGE观察结果。挑取单个集落，在LB培养液中生长过夜，接着用以接种到50mL LB中。使细胞生长到OD为0.3到0.4，此时，取得1.5mL等分试样作为前诱导点(pre-induction point)，并将培养物分到两个烧瓶中。将1mM pAF添加到其中一个分股，并使两个分股生长30分钟。生长30分钟后，用0.2％L-阿拉伯糖诱导两种培养物(+/-pAF)，生长4.5小时，并记录下OD600值。接着从+/-pAF烧瓶中取出1.5mL等分试样以供SDS-PAGE分析。
以10,000x g离心所述1.5mL等分试样(前诱导，+pAF、-pAF)10分钟，以使细胞聚集成团。随后，在采集时，将细胞相对于其OD600按比例悬浮于一定量细菌蛋白提取试剂(Bacterial Protein Extraction Reagent，BPER；皮尔斯公司(Pierce))中。添加脱氧核糖核酸酶I(DNase I)到溶解细胞，并在4℃下培育20分钟。随后，将样品与还原剂和上样染料(loading dye)组合，并在MES缓冲液中的4-12％Bis-TRIS凝胶上跑胶30分钟。在去离子水中洗涤凝胶2次，历时10分钟，并用考马斯蓝染料(coommassie blue dye)染色。比较+/-pAF谱带中pAF-tRNA RS引起pAF并入的保真度，并将+pAF谱带与预先选择的pAF-tRNA RS相比较。
为了检查RS的加工能力，利用含有C-H6 S4am肌红蛋白(S4am-Myo)的质粒进行相同程序。随后借助IMAC纯化所述S4am Myo，并进行蛋白质测序，以测定pAF的并入量。
在利用此选择鉴别的pAF-tRNA RS中，发现一种合成酶(E9)可有效并入pAF，其将pAF并入S4am-Myo中的效率超过95％。通过氨基酸测序确定并入，同时通过比较SDS-PAGE凝胶上的蛋白质谱带来显示加工能力。E9的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：4中，且E9的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：5中。
鉴别出活性类似于E9的另一突变体，且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：17中。
实例2：tRNA诱变
产生tRNA J17的三种突变体。野生性J17的DNA序列显示于SEQ ID NO：8中以及美国专利公开案第2003/0108885号的SEQ ID NO：1和US 2003/0082575的SEQ ID NO：1(分别为美国专利申请案第10/126,931号和第10/126,927号)中，所述专利都以引用的方式并入本文中。如图1中所示，J17 tRNA在TΨC茎中具有U51:G63摇摆对。
产生三种J17突变体(F12、F13和F14)以在TΨC茎的51位和63位形成沃特森-克里克碱基对。利用重叠PCR法进行诱变，并将最终构建体克隆到pET19质粒中的EcoRI和NdeI位点中，所述pET19质粒包含编码氨酰基tRNA合成酶E9的多聚核苷酸序列 (SEQ ID NO：4)以及具有琥珀密码子取代的编码人生长激素(hGH)的多聚核苷酸序列(SEQ ID NO：16)。hGH的表达受T7启动子控制。
产生两个片段以进行重叠PCR。第一个片段是通过引物延伸得到。用于产生三种突变体中每一者的正向引物序列为：
GTAACGCTGAATTCCCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTCTAAATCCGCATGGCGC(FTam11；SEQ ID NO：9)。
为了产生F12突变体(51C:63G)，使用以下反向引物：
GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCCGGATTTGAACCGGCGCCATGCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTGC(FTam12；SEQ ID NO：10)。
为了产生F13突变体(51U:63A)，使用以下反向引物：
GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCTGGATTTGAACCAGCGCCATGCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTGC(FTam13；SEQ ID NO：11)。
为了产生F14突变体(51A:63U)，使用以下反向引物：
GATCTGCAGTGGTCCGGCGGGCAGGATTTGAACCTGCGCCATGCGGATTTAGAGTCCGCCGTTCTGC(FTam14；SEQ ID NO：12)。
为了产生第二个片段，使用质粒pET19 J17 E9 hGH作为扩增模板，所述质粒pET19 J17 E9 hGH包含J17 tRNA的多聚核苷酸序列(SEQ ID NO：8)、编码tRNA合成酶E9的多聚核苷酸序列(SEQ ID NO：4)和具有琥珀密码子取代的编码人生长激素的多聚核苷酸序列(SEQ ID NO：16)，扩增过程使用以下引物组：CGCCGGACCACTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTAAGC(正向引物；FTam15；SEQ ID NO：13)和CAAATTCGTCCATATGGGATTCC(FTam 16；SEQ ID NO：14)。正向引物用于将序列由tRNA的3′端延伸到质粒的Nde I位点。对所得产物进行凝胶纯化。
重叠PCR的最后一个步骤涉及正向引物GTAACGCTGAATTCCCGGCG(FTam17，SEQ ID NO：15)、反向引物FTam16(SEQ ID NO：14)、第一个片段和第二个片段。用EcoR I和Nde I消化组装的产物，并接合到用EcoR I和Nde I消化的质粒pET19 J17 E9 hGH中。通过测序确定每个构建体的序列，且每个所述J17突变体tRNA的DNA序列显示为SEQ ID NO：1(F12)、SEQ ID NO：2(F13)和SEQ ID NO：3(F14)。各tRNA按其相应反向引物命名。
蛋白质表达 
借助化学方式分别将编码各tRNA(J17、F12、F13或F14)的质粒转化到大肠杆菌 菌株1和菌株2细菌宿主细胞中，并接种到含50μg/ml羧苄青霉素(carbenicillin)的LB琼脂板上。在37℃下培育各板过夜。对于每个tRNA，挑取单个集落，在37℃下于含有50μg/ml羧苄青霉素的1ml 2倍YT中开始过夜培育。在37℃下，使用此1ml培养物接种两份含有50μg/ml羧苄青霉素的10ml 2倍YT培养物。1份10ml培养物补充有4mM对乙酰基苯丙氨酸。在OD600＝0.7时，用0.4mM IPTG诱导hGH表达。在37℃下以250rpm培养细胞4小时后，通过以5000x g离心5分钟来采集细胞。用补充有5μg/ml脱氧核糖核酸酶I的B-PER试剂(皮尔斯公司(Pierce)，伊利诺伊州罗克福德(Rockford，IL))溶解细胞。借助4-12％SDS PAGE分析总细胞溶解产物。
图2显示了大肠杆菌菌株1总细胞溶解产物的SDS PAGE分析。使用J17或J17突变体(F12、F13、F14)tRNA和氨酰基tRNA合成酶E9来进行对人生长激素中选择密码子的抑制。带有J17突变体的细胞生长得比带有J17的细胞略慢。对于tRNA变异体，在不存在4mM对乙酰基苯丙氨酸情况下，利用SDS-PAGE未观察到全长hGH产物。在4mM对乙酰基苯丙氨酸存在下，各tRNA突变体产生全长产物，表明这些tRNA突变体-RS E9对对于大肠杆菌机器来说是正交的。根据SDS-PAGE，在大肠杆菌菌株1中，J17突变体的受抑制hGH产率约为J17的1.5到2倍。
如图3中所示，进一步在大肠杆菌菌株2细菌细胞系中测试一种J17突变体F13的琥珀抑制情况。在大肠杆菌菌株2中，表达以及琥珀抑制产率相对于大肠杆菌菌株1有所降低。在不存在对乙酰基苯丙氨酸的情况下，利用SDS-PAGE未观察到全长hGH产物。在4mM对乙酰基苯丙氨酸存在下，两种tRNA都观察到全长hGH。根据SDS-PAGE，F13的受抑制hGH产率约为J17的3倍。
利用约1.5L的最终体积来进行发酵，以比较J17和F13。将编码J17 tRNA的质粒和编码F13 tRNA的质粒分别转化到大肠杆菌菌株1中。其各自的最终细胞密度为约190g湿细胞/l。对于J17克隆体，hGH滴度为347mg/L，而对于F13克隆体为542mg/L。
表1
实例3：鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌的活Ambrx疫苗
鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌(MAP)是一种专性致病性细菌，会在牛和其它反刍动物中引起约尼氏病(Johne′s disease)。近期的一项研究估计，有21％的美国乳畜群受到感染，对乳品工业造成重大经济损失，总计每年超过两亿美元。约尼氏病只能用例如利福布丁(Rifabutin)等抗生素与例如克拉霉素(Clarithromycin)等大环内酯类药物组合加以治疗。治疗方案可持续数年。由于副结核分枝杆菌疫苗市面上有售，但不幸的是不能完全有效地预防疾病，故一种有效的MAP疫苗是非常重要的。
MAP与人克罗恩氏病(Crohn′s Disease)之间的联系
克罗恩氏病影响了北美400,000到600,000的人。北欧的患病率估计为每100,000人中有27到48个人患此疾病。长期以来，怀疑MAP是人克罗恩氏病的致病因素；这一联系仍存在争议。假定MAP是克罗恩氏病的致病因素，乔康达公司(Giaconda)正在设法使利福布丁、克拉霉素和氨苯吩嗪(clofazimine)(Myoconda)的组合商业化，作为克罗恩氏病的潜在药物疗法。在II期临床试验中，获得将近95％的临床反应。IIIa期试验显示相比常规疗法得到统计学显著的改良，在16周达到疾病的缓解。然而，在这一试验中的疗法完成后，Myoconda 在维持疾病缓解方面没有达到统计学显著的结果。
目前，提供的可用疫苗是活减毒疫苗(菌株316F)、死的全细胞疫苗(菌株18)，而且亚单位疫苗试验也正在进行中，然而，目前的疫苗只能延迟粪便排毒(fecal shedding)和进展到临床疾病，但是不能防止感染(疫苗专家述评(Expert Rev.Vaccines)7(6)2008)。从理想上来说，这一领域正在寻求一种合理减毒疫苗。
由于已经公开了MAP的完整基因组序列(PNAS 2005 12344-12349)，并且实现了MAP中外来基因的表达，使得MAP的基因特异性缺失和位点特异性突变现成为可用工 具(应用和环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)2008 1687-1695)。Ambrx疫苗是经遗传修饰的全生物体非天然氨基酸依赖性MAP，其可作为疫苗投予来预防动物感染MAP。选出必需基因，随后进行转化以使其包括一个或一个以上位点特异姓琥珀突变。通过在培养基中存在和不存在非天然氨基酸情况下进行细胞培养来表征MAP，表征回复率，和全生物体
实例4：抑制感受态/λRed细胞的产生
制备大肠杆菌菌株。大肠杆菌菌株能够进行琥珀抑制和λRed重组。制备含有图5中所示的pKD46n的W3110大肠杆菌，随后借助电穿孔法，用图4中所示的质粒pVK10/camR转化。在30℃下，于含有50μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB琼脂板上生长48小时，由此选出阳性转化株。
通过使500mL含有两种质粒的培养物在含有50μg/mL氨苄青霉素、34μg/mL氯霉素和0.2％阿拉伯糖的LB培养基中生长到最终OD600为0.5，来制备含有两种质粒的电穿孔感受态细胞(Electrocompetent cell)。随后在10％甘油中洗涤细胞三次，并再悬浮于500μL 10％甘油中。分成60μL的等分试样，在-80℃下储存待用。
实例5：条件致死性甲硫氨酸氨基肽酶的产生
产生带有条件致死性甲硫氨酸氨基肽酶的大肠杆菌菌株。在甲硫氨酸氨基肽酶基因内两个位点Y31或N51中的一个中引入琥珀突变。为了将这些突变体整合到大肠杆菌染色体上，如图6的图中所示，借助重叠PCR法产生一段线性重组DNA。首先，使用引物1和2(SEQ ID NO：18或26)，克隆甲硫氨酸氨基肽酶基因的5′端(PCR产物A)，在所选氨基酸(Y31或N51)处结束，此处的天然密码子转换成了琥珀密码子。使用引物3(SEQ ID NO：20或28)和4(SEQ ID NO：21或29)，从琥珀突变开始，克隆甲硫氨酸氨基肽酶基因的3′端(PCR产物B)。两个反应产物的侧接琥珀突变的序列重叠，并利用引物1(SEQ ID NO：18或26)和4(SEQ ID NO：21或29)扩增这些产物，得到产物C，即，在31位或51位具有琥珀密码子取代的完整甲硫氨酸氨基肽酶基因。
为了产生完整的诱变模板，使用引物5(SEQ ID NO：22或30)和6(SEQ ID NO：23或31)，扩增先前产生的大肠杆菌菌株的DNA上由I-sceI归巢内切核酸酶(homing endonuclease)识别位点所侧接的卡那霉素抗性标记物(PCR产物D)。使用引物7(SEQ ID NO：24或32)和8(SEQ ID NO：25或33)扩增甲硫氨酸氨基肽酶上游和甲硫氨酸氨基肽酶5′端的基因组序列，以便去除卡那霉素抗性标记物和进行同源重组(PCR产物E)。通过使用引物7(SEQ ID NO：24或32)和4(SEQ ID NO：21或29)扩增片段E、D和C，产生供转化的最终DNA模板。
实例7：条件致死性甲硫氨酸氨基肽酶克隆体的转化和选择
使用借助重叠PCR法产生的转化模板来转化电穿孔感受性pKD46、pVKlO-camR阳性细胞。通过在30℃下，使集落在含有50μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和2mM pAF的LB琼脂板上生长48到72小时，选出阳性转化株。为了测试pAF依赖性生长，在30℃下使每一位点的96个集落在含有50μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和1mM pAF的1mL LB琼脂板上生长72小时，也如图7、图8和图9中所示。随后，将这些克隆体影印接种到含有50μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和2mM pAF的LB琼脂以及含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素但不含pAF的LB琼脂上。使这些影印板在30℃下生长72小时，随后对生长评分。选出只在2mM pAF存在下呈现生长的克隆体以供进一步分析。
实例8：克隆体的选择和成熟
选出对pAF依赖性呈阳性的克隆体，进行进一步研究。这些克隆体为Y31 A12、Y31 C5、Y31 E3、N51 D2和N51 H9。再个别筛选克隆体，并使其都只在含pAF的培养基上生长。对所有克隆体进行测序，以确定适合位置处琥珀密码子(标签)的存在：Y31或N51。全部5个克隆体都在适合位置具有琥珀密码子。随后分离出克隆体Y31 A12和N51 D2，并通过在37℃下反复热处理来去除pKD46质粒。
一旦消除了pKD46和氨苄青霉素抗性，就用含有I-SceI酶的质粒转化细胞。在用这种酶处理后，选出数个克隆体，并测试卡那霉素抗性。对无卡那霉素抗性的克隆体进行再测序，并冷冻于10％甘油储备液中。这些克隆体将是最终的pAF依赖性甲硫氨酸氨基肽酶克隆体。
在本发明一些实施例中，图11中示意性描述的所需回复率将是在单次转变(single switch)下小于10-9的回复频率。测试Y31和N51克隆体，且回复率显示于表2中。
表2：
  克隆体   测试1  测试2
  Y31   2.78×10-8  ＜3×10-8(未检测)
  N51   6.82×10-8  ＜2×10-8(未检测)
表3：
实例9：
将相同类型和同一代的种源菌株用于脊髓灰质炎疫苗(口服)，转化以使其在一个 以上必需基因中包括琥珀突变，并培养。
细胞培养： 
i)供繁殖病毒的不同细胞基质包括人二倍体细胞系、猴肾细胞、Vero细胞系或任何其它适合的细胞培养物。ii)大规模产生细胞：1.制备制造商的工作细胞库(Manufacturer′s working cell bank，MWCB)：在原代细胞培养物(源自正常组织并冷冻储存于-70℃的细胞)的情况下或者任何其它允许连续细胞系的MWCB是由在指定数量的细胞培养物内连续传代培养后汇集的细胞制备。2.可以使用以下曾适合的任何一个系统，以逐步增加细胞的体积。转瓶：转瓶中生长与固定培养物中生长的不同之处是细胞在玻璃表面上的分布和可达到的最大细胞密度。转瓶培养物不会像固定培养物一般迅速变坏，因为其可承受接近固定培养物约2倍的密度。呈单层培养物生长的哺乳动物细胞特别适合转瓶技术。细胞工厂：其为培养盘的堆叠，共用共同的进口和出口端。这些细胞工厂为细胞提供与转瓶内部一般大的生长表面，但在恒温培养箱中占据较小空间。这些细胞工厂对于粘附细胞培养是理想的，具有低污染和风险，并且结构紧凑。Roux烧瓶微载体系统(Roux flasks Micro-carrier system)3.对照细胞培养物的样品单独培育至少2周，并且检查这些细胞的细胞病变迹象。
在细胞培养物中繁殖脊髓灰质炎病毒：
i)种源批次系统(Seed lot system)：a)传代水平与口服脊髓灰质炎疫苗相同或b)其接下来的传代水平如可用于制造口服脊髓灰质炎疫苗的单价本体悬浮液所得到。1.疫苗是在病毒种源批次系统的基础上制造。病毒的种源批次是一些加工在一起的病毒和一些由种源批次制备的均匀组合物。2.由用于制造疫苗(对其进行原始实验室和现场测试)的种源批次计算，种源病毒的传代培养不应超过10次。
单次采集和单价池：
在细胞培养物中繁殖病毒，并从来源于单批细胞的细胞培养物中采集病毒，且加工在一起。这一过程称为单次采集。同时加工一类病毒悬浮液的单次采集物，得到单价池的粗品形式。
单价池的过滤或澄清化：
经由孔隙度递减的过滤器逐步纯化每一单价池的粗病毒悬浮液。过滤步骤的目的是去除颗粒状物质以及静置时聚集物倾向于增加的可能影响灭活过程的其它物质。
单价池的浓缩：
借助超滤法(Ultra-filtration)浓缩每一过滤的单价池。
单价池的纯化：
使用DEAE琼脂糖凝胶/固定脱氧核糖核酸酶柱/免疫吸附柱的色谱法可用来纯化单价池。纯化过程使初始病毒采集物中细胞DNA的含量一致降低到至少1/108。通过ELISA以及在大鼠中相当的免疫原性的表现来测定D抗原的浓度。相应地调整效力。掺合脊髓灰质炎病毒的单价池，形成最终的三价本体产物。
疫苗的调配和制造：
优选经由0.22微米或0.45微米过滤器来过滤纯化的本体。单价转化病毒在非天然氨基酸存在下继续，并任选与稳定剂和/或防腐剂混合，制备单价、二价、三价或多价疫苗。
疫苗的功效测试：
将如上述制造的疫苗的功效与确定的参考疫苗相比较，发现二者在体外和/或体内方法中相似。
对上文制造的疫苗进行各种基于标准认可方法的其它测试，例如pH值测定、无菌性测试、有效转化的测试(例如分裂和验证在不存在非天然氨基酸情况下的死亡)、异常毒性研究、体积测量、体外效力测定、内毒素测试、身份测试、蛋白质含氮量估计以及确保其有效性、安全性和效力的稳定剂含量和甲醛含量的测定。
使用夹层ELISA(Sandwich ELISA)测定上文制造的SIPV的体外效力。在不同物种中针对脊髓灰质炎病毒产生的两种一级抗体以原样使用，并且在第二个一级抗体时，再使用与HRP结合的第二抗体。通过与参考标准品相比较来分析结果。
疫苗的身份测试是使用直接ELISA进行。将抗原涂到96孔ELISA板的孔中。并使用类型特异性抗脊髓灰质炎血清来确定疫苗中全部三类脊髓灰质炎病毒的存在。
尽管出于清楚和便于理解的目的相当详细地描述了前述发明，但所属领域技术人员在阅读了本文内容后将很明白，可在不偏离本发明真实范围的情况下对形式和细节作出各种修改。举例来说，上述所有技术和设备都可呈各种组合使用。本申请案中引用的所有出版物、专利、专利申请案和/或其它文献都以全文引用的方式并入本文中用于所有目的，引用的程度就如同将各个别出版物、专利、专利申请案和/或其它文献个别地以引用的方式并入本文中用于所有目的一样。

Claims (5)

1.一种鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌(mycobacterium avium subspeciesparatuberculosis，MAP)细胞，其中，一个非天然氨基酸是位点特异性地并入一复制所需的必需基因产物的氨基酸序列中，所述细胞于存在有前述非天然氨基酸的情形下为可进行复制者，且于没有前述非天然氨基酸的情形下具有有限的复制能力或不具有复制能力。
2.根据权利要求1所述的MAP细胞，其中一个以上的非天然氨基酸是并入一个以上的必需基因产物中。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其特征在于，所述非天然氨基酸是选自于由下列所组成之群组：对乙酰基苯丙氨酸、对硝基苯丙氨酸、对磺基酪氨酸、对羧基苯丙氨酸、邻硝基苯丙氨酸、间硝基苯丙氨酸、对硼羰基苯丙氨酸、邻硼羰基苯丙氨酸、间硼羰基苯丙氨酸、对氨基苯丙氨酸、邻氨基苯丙氨酸、间氨基苯丙氨酸、对酰基苯丙氨酸、邻酰基苯丙氨酸、间酰基苯丙氨酸、对OMe苯丙氨酸、邻OMe苯丙氨酸、间OMe苯丙氨酸、对磺基苯丙氨酸、邻磺基苯丙氨酸、间磺基苯丙氨酸、5-硝基His、3-硝基Tyr、2-硝基Tyr、硝基取代的Leu、硝基取代的His、硝基取代的De、硝基取代的Trp、2-硝基Trp、4-硝基Trp、5-硝基Trp、6-硝基Trp、7-硝基Trp、3-氨基酪氨酸、2-氨基酪氨酸、O-磺基酪氨酸、2-磺基氧基苯丙氨酸、3-磺基氧基苯丙氨酸、邻羧基苯丙氨酸、间羧基苯丙氨酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对炔丙氧基-苯丙氨酸。
4.根据权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。
5.一种疫苗，包括根据权利要求1至4项中任一项所述的细胞，且可选择地包括佐剂。
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