CN102317439B

CN102317439B - 减毒活疫苗

Info

Publication number: CN102317439B
Application number: CN201080007679.7A
Authority: CN
Inventors: 格伦·弗朗西斯·布朗宁; 菲利普·弗朗西斯·马卡姆; 曾启文
Original assignee: Australian Poultry CRC Pty Ltd
Current assignee: Australian Poultry CRC Pty Ltd
Priority date: 2009-02-20
Filing date: 2010-02-17
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2030-02-17
Also published as: JP5753098B2; EP2398892A1; US20120045475A1; JP2012518388A; WO2010094064A1; RU2556813C2; MX2011007606A; CN102317439A; AU2010215065A1; BRPI1008561A2; CA2750136A1; RU2011138410A; EP2398892A4; AU2010215065B2

Abstract

本发明涉及通过至少一种ABC转运蛋白基因的突变而被减毒的细菌，其中所述突变使得相应的ABC转运蛋白没有功能，并且其中所述减毒细菌在个体中维持。

Description

减毒活疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年2月20日提交的澳大利亚临时专利申请第2009900736号的优先权，通过引用将该申请全文并入本文。

技术领域

本发明涉及可用在疫苗组合物中的在个体中维持的减毒活细菌的产生，具体而言，本发明涉及去除细菌的至少一种ABC-转运蛋白的功能，从而产生在个体中维持并可用在疫苗组合物中的减毒细菌。

背景技术

细菌感染由于导致发病和大量死亡而对畜牧业造成巨大的经济损失，并且对人类健康具有显著影响。具体而言，呼吸道感染和败血病是常见的感染性疾病，其可在整个动物群或人(个体)群中蔓延并对那些个体的健康产生不利影响。这可导致生产率显著下降，并最终导致个体的死亡。例如病原菌，尤其是支原体属属(Mycoplasma)的病原菌是呼吸道疾病的主要诱因。败血病通常由大肠杆菌(E.coli)引起。

据了解，包含经减毒的诸如细菌或病毒的病原微生物的疫苗组合物可在被接种的动物和人体中有效产生保护性的免疫应答。这种减毒活疫苗是有利的，因为免疫后，由疫苗所依赖的病原有机体所产生的后续激发导致最初由接种所诱导的免疫应答的快速再次激发。该作用为抑制病原体增殖并防止临床相关疾病的发展。

通常，通过完全或部分去除一种或多种毒力因子使得有机体不再是病原性的来实现用在疫苗中的病原有机体的减毒。所公知的毒力因子具有直接致病和/或允许有机体在宿主中维持的那些特性。促进有害宿主应答的那些特性也是公知的毒力因子。通常的毒力因子包括例如，毒素、附着胞器(attachmentorganelle)和免疫逃避机制。这提出的问题在于多种毒力因子参与诱导免疫，并且因此毒力因子的缺失使得以这种方式被减毒的有机体的免疫原性减弱。减毒活疫苗优选仍是抗原性的，并且因此能诱导充足水平的宿主免疫，同时是非病原性的。通常，减毒活疫苗不在个体中维持，并且这可归于疫苗所依赖的减毒活有机体的免疫原性的降低。

尽管诸如毒素的某些毒力因子是用于减毒的明显靶标，但是不被认为是毒力因子的因子不是用于减毒的明显靶标。那些因子对有机体毒力的减毒效应不明显或不容易预测。ABC(ATP-结合盒)转运蛋白超家族的成员通常不被认为是毒力因子。ABC转运蛋白包含功能是穿过细胞内膜和细胞外膜转送底物的膜蛋白。由ABC转运蛋白运送的物质包括肽、寡肽、蛋白质、代谢产物、脂质、固醇和药物。ABC转运蛋白的序列比较表明，该超家族的基因和蛋白质在远源相关的门类中是保守的。

本发明基于这个出人意料的发现：如在在宿主-疾病模型系统中所评价的，病原有机体中ABC-转运蛋白基因的功能突变缺失使该病原有机体减毒，但是该减毒有机体保持免疫原性，且在个体中维持。

发明概述

第一方面，提供了通过至少一种ABC转运蛋白基因的突变而被减毒的细菌，其中所述突变使得相应的ABC转运蛋白没有功能，并且其中所述减毒细菌在个体中维持。

第二方面，提供了使细菌减毒的方法，所述方法包括使至少一种ABC转运蛋白基因突变，并且其中所述减毒细菌在个体中维持。

第三方面，提供了包含至少一种第一方面的减毒细菌的免疫原性组合物。

第四方面，提供了疫苗组合物，包含免疫原性有效量的至少一种第一方面的减毒细菌和药理学上可接受的载体。

第五方面，提供了用于治疗或预防疾病的疫苗组合物的用途，其中所述疫苗组合物包含至少一种第一方面的减毒细菌。

第六方面，提供了预防或改善个体疾病的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效剂量的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物或免疫原性组合物包含至少一种第一方面的减毒细菌。

第七方面，提供了预防疾病的方法，所述方法包括给予需要预防的个体治疗有效剂量的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物或免疫原性组合物包含至少一种第一方面的减毒细菌。

在一个实施方案中，可以通过插入、缺失、取代或以上的任意组合来产生突变，所述插入突变例如可以通过同源重组、转座子诱变和序列标签诱变来产生。

在一个实施方案中，所述ABC转运蛋白基因可以是编码ABC-肽转运蛋白的基因。例如CvaB、CylB、SpaB、NisT、EpiT、ComA、PedD、LcnC、McbEF、OppD和DppD以及它们的同源物，并且特别是ABC转运蛋白基因可以编码OppD。

在一个实施方案中，所述细菌可以选自禽杆菌属(Avibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、布鲁氏菌属(Brucella)、巴尔通氏体菌属(Bartonella)、博德特氏菌属(Bordetella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、弧菌属(Vibrio)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、梭菌属(Clostridium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chalmydia)、考克斯氏体属(Coxiella)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、李斯特氏菌属(Listeria)、放线杆菌属(Actinobacillus)、嗜血菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、支原体属(Mycoplasma)、分支杆菌属(Mycobacterium)、曼海姆氏菌属(Mannheimia)、鸟杆菌属(Ornithobacterium)、立克次氏体属(Rickettsia)、尿支原体属(Ureaplasma)和巴斯德氏菌属(Pasteurella)。减毒细菌尤其可以是副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum)、鸟博德特氏菌(Bordetellaavium)、鼻腔鸟杆菌(Ornithobacteriumrhinotracheale)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、溶血曼海姆氏菌(Mannheimiahaemolytica)、大肠杆菌、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、无乳支原体(Mycoplasmaagalactiae)、鸭支原体(Mycoplasmaanatis)、鹅支原体(Mycoplasmaanseris)、模仿支原体(Mycoplasmaimitans)、产碱支原体(Mycoplasmaalkalescens)、精氨酸支原体(Mycoplasmaarginini)、微小脲原体(Ureaplasmaparvum)、关节炎支原体(Mycoplasmaarthritidis)、牛生殖道支原体(Mycoplasmabovigenitalium)、牛鼻支原体(Mycoplasmabovirhinis)、牛支原体(Mycoplasmabovis)、牛眼支原体(Mycoplasmabovoculi)、加利福尼亚支原体(Mycoplasmacalifornicum)、山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)、殊异支原体(Mycoplasmadispar)、狸猫支原体(Mycoplasmafelis)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、生殖道支原体(Mycoplasmagenitalium)、人型支原体(Mycoplasmahominis)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis)、猪关节液支原体(Mycoplasmahyosynoviae)、衣阿华支原体(Mycoplasmaiowae)、蕈状支原体蕈状亚种(Mycoplasmamycoidessubspmycoides)大集落和小集落、鸡败血支原体(Mycoplasmagallisepticum)、关节液支原体(Mycoplasmasynoviae)、口腔支原体(Mycoplasmaorale)、穿透支原体(Mycoplasmapenetrans)、羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae)、鸡气管支原体(Mycoplasmapullorum)、Mycoplasmaalligatorus、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、Mycoplasmamaleagridis、猫血支原体(Mycoplasmahaemofelis)、Mycoplasmahaemominutum、Mycoplasmahaematoparvum。

在一个实施方案中，细菌可以是禽病原性大肠杆菌菌株E956或鸡败血支原体菌株Ap3AS。

在一个实施方案中，所述减毒活细菌可以表达异源抗原。所述异源抗原可以由另一种病原有机体的核酸编码。编码异源抗原的核酸可从以下属中分离：禽杆菌属、芽孢杆菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体菌、博德特氏菌属、伯克氏菌属、弧菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、梭菌属、弯曲杆菌属、衣原体属、考克斯氏体属、丹毒丝菌属、弗朗西丝氏菌属、李斯特氏菌属、放线杆菌属、嗜血菌属、螺杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、链球菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、支原体属、分支杆菌属、曼海姆氏菌属、鸟杆菌属、立克次氏体属、葡萄球菌(Staphylococci)、尿支原体属和巴斯德氏菌属。编码异源抗原的核酸尤其可来源于副鸡禽杆菌、鸟博德特氏菌、鼻腔鸟杆菌、肠炎沙门氏菌、出血败血性巴斯德氏菌、溶血曼海姆氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、猪肺炎支原体、鸡败血支原体或关节液支原体、副鸡禽杆菌、鸟博德特氏菌、鼻腔鸟杆菌、无乳支原体、产碱支原体、鸭支原体、鹅支原体、模仿支原体、精氨酸支原体、微小脲原体、关节炎支原体、牛生殖道支原体、牛鼻支原体、牛支原体、牛眼支原体、加利福尼亚支原体、山羊支原体、殊异支原体、狸猫支原体、发酵支原体、生殖道支原体、人型支原体、猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪关节液支原体、衣阿华支原体、蕈状枝原体蕈状亚种大集落和小集落、鸡败血支原体、关节液支原体、口腔支原体、穿透支原体、羊肺炎支原体、鸡气管支原体、Mycoplasmaalligatorus、肺炎支原体、支原体属、Mycoplasmamaleagridis、猫血支原体、Mycoplasmahaemominutum、Mycoplasmahaematoparvum。编码异源抗原的核酸可从选自以下的病毒分离：新城疫病毒(NewcastleDiseasevirus)、传染性支气管炎病毒、禽肺病毒、鸟痘病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、雏鸡传染性贫血病毒、马立克氏病病毒。

所述个体为脊椎动物，包括人类、牛类、犬类、猫类、山羊类、绵羊类、猪类、骆驼类(camelid)、马类和禽类。所述牛类个体可以是母牛、公牛、野牛或水牛。所述犬类个体可以是狗。所述猫类个体可以是猫。所述山羊类个体可以是山羊。所述绵羊类个体可以是绵羊。所述猪类个体可以是猪。所述骆驼类个体可以是骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼、瘦驼或骆马。所述马类个体可以是马、驴、斑马或骡。所述禽类个体可以是任何商购的或驯养的禽类。特别是，所述禽类可以是雏鸡(包括矮脚鸡)、火鸡、鸭、鹅、雉、鹌鹑、山鹑、鸽、珍珠鸡、鸵鸟、鸸鹋或孔雀。

所述疫苗组合物和免疫原性组合物还可以包含至少一种药学上可接受的载体或稀释剂，例如水、盐水、培养液、稳定剂、碳水化合物、蛋白质、诸如牛血清或脱脂乳的含蛋白质的试剂和缓冲液或以上的任意组合。

所述稳定剂可以是SPGA。所述碳水化合物包括例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖或以上的组合。此外，诸如白蛋白或酪蛋白的蛋白质或诸如牛血清或脱脂乳的含蛋白质的试剂可用作药学上可接受的载体或稀释剂。

用作药学上可接受的载体或稀释剂的缓冲液包括马来酸盐、磷酸盐、CABS、哌啶、甘氨酸、柠檬酸盐、苹果酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、丙酸盐、哌嗪、嘧啶、甲次砷酸盐、琥珀酸盐、MES、组氨酸、双-tris(bis-tris)、磷酸盐、乙醇胺、ADA、碳酸盐、ACES、PIPES、咪唑、双三羟基甲氨基丙烷、BES、MOPS、HEPES、TES、MOPSO、MOBS、DIPSO、TAPSO、TEA、焦磷酸盐、HEPPSO、POPSO、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、肼、双甘氨肽、TRIS、EPPS、二(羟乙基)甘氨酸、HEPBS、TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、牛磺酸、硼酸盐、CHES、甘氨酸、氢氧化铵、CAPSO、碳酸盐、甲胺、哌嗪、CAPS或以上的任意组合。

所述疫苗组合物和免疫原性组合物可以是低压冻干的或冷冻干燥的。

在某些实施方案中，所述疫苗组合物或免疫原性组合物海可以包含至少一种佐剂。佐剂的实例包括弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂、维生素E、非离子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油、卡波姆氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、油乳剂(例如BayolF或Marcol52中的)、皂苷或维生素-E增溶剂或以上的任意组合。在某些实施方案中，所述疫苗组合物可以包含尤其可应用于粘膜的佐剂，例如大肠杆菌不耐热毒素或霍乱毒素。

所述疫苗组合物或免疫原性组合物可以经鼻内给药、眼科给药、皮内给药、腹膜内给药、静脉内给药、皮下给药、口服给药、气雾剂(喷雾接种)给药、经泄殖腔或肌内给药。当个体是禽类时，优选滴眼剂和气雾剂给药。当将疫苗组合物或免疫原性组合物给予大量的个体而言，尤其优选喷雾给药。

所述免疫原性组合物或疫苗组合物每剂量可以包含至少约10³-约10⁵个减毒细菌、或者约10⁵-约10⁷个减毒细菌、或者约10⁷-约10⁹个减毒细菌、或者约10⁹-约10¹¹个减毒细菌、或者约10¹¹-约10¹³个减毒细菌、或者约10¹³-约10¹⁵个减毒细菌、或者约10¹⁵-约10¹⁷个减毒细菌、或者约10¹⁷-约10¹⁹、或者至少约10¹⁹个减毒细菌。

定义

如在本申请中所用，单数形式“a(一个)”、“an(一个)”和“the(这个)”包括复数形式，除非文中明确指出不是复数。例如术语“anABC转运蛋白”也包括多个ABC转运蛋白。

在本说明书的背景下，术语“包含(comprising)”表示“主要包括，而不是必需只包含”。此外，该词“包含(comprising)”的变体，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”具有相应变化的含义。

本文所用的术语“免疫原性有效的”表示接种时或给予免疫原性组合物时，给予的减毒活细菌的量足以在个体中诱导针对毒力形式的细菌的有效免疫应答。

本文所用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指的是治疗疾病状况或症状、预防疾病状况或疾病建立或无论以任何方式预防、阻止、延迟或逆转疾病状况或疾病的进程或其它不需要的症状的任何或全部用途。

本文所用的术语“维持(persist)”和“维持(persistent)”指的是建立和/或维持至少一部分个体的感染或建群。维持包括有机体在组织中存活的状态，无论复制与否。维持可与临床相关疾病有关或无关。

附图简要说明

图1是成分和实验方案的示意性设计。A.信号标记的转座子(signature-taggedtransposon)的基本结构。B.信号标记的诱变(signature-taggedmutagenesis，STM)实验的设计

图2是对特定标签的检测。利用P2/P4引物对通过PCR筛查显示出色变的肉汤培养物(brothculture)，以检测各自的信号标签。每一样品与DNA大小标志物(用HaeIII消化的pUC18)一起在2％的琼脂糖凝胶中电泳。泳道1，携带标签02的ST突变体；泳道2，携带标签03的ST突变体；泳道3，携带标签04的ST突变体；泳道4，携带标签06的ST突变体；泳道5，携带标签07的ST突变体；泳道6，阴性对照。泳道7，含有携带标签02的转座子的质粒作为模板的阳性对照。

图3是对STM转化体的证实。利用P2/P4引物对通过PCR筛查显示出色变的转化体，以证实个体信号标签的存在。每一样品(ample)与用HaeIII消化的pUC18d的DNA大小标志物一起在2％的琼脂糖凝胶中电泳。泳道1，含有标签02的重组Mg；泳道2，标签03转化体；泳道3，标签04克隆；泳道4，标签06转化体；泳道5，携带标签07的转化体；+，用标签02质粒作为模板的阳性对照。-，未添加模板的阴性对照。

图4是确证筛选的实验设计。

图5是ST突变体的序列和Southern印迹分析。

A.直接测序所获得的电色图谱。(I).携带单转座子的ST突变体26-2，具有的可读序列并入基因组。在ST突变体15-1(II)和25-1(III)中，在转座子和宿主菌株基因组的连接点处能观察到混合的序列信号。

B.通过Southern印迹所检测的多重插入。泳道1，ST突变体15-1；泳道2，ST突变体15-2；泳道3，ST突变体15-3；泳道4，ST突变体25-1；泳道5，ST突变体25-2；泳道6，ST突变体25-3。DNA大小标准品是用HindIII消化的噬菌体λDNA。

图6是毒力和感染力研究中鸟的RSA的分布和气囊损伤评分。A.感染2周后的RSA评分。B.气囊损伤评分。组1，阴性对照；组2，经ST突变体04-1感染；组3，经ST突变体33-1感染；组4，经ST突变体03-1感染；组5，经ST突变体26-1感染；组6，经ST突变体18-1感染；组7，经ST突变体20-1感染；组8，经ST突变体22-1感染；组9，阳性对照(经野生型Ap3AS感染)。

图7是鸟的RSA分布和气囊损伤评分。A.第28天时的RSA评分。B.气囊损伤评分。6个不同气囊评分的总和。组1，阴性对照；组2，阳性对照(经野生型Ap3AS感染)；组3，接种对照(接种ST突变体26-1)；组4，经接种(ST突变体26-1)和激发(经野生型Ap3AS感染)。

图8.用于同源重组的PCR构建体的示意图。用所述的寡核苷酸引物产生PCR产物。利用引物对TX/TY扩增卡那霉素基因，用于oppA和dppD基因构建体。对于oppD，通过利用WS/WU和WY/WT的其它PCR产物或对于dppD，通过在PCR中利用60个核苷酸的引物WE/WF来产生和添加构建体臂。

图9.利用PCR对同源重组的检测。dppD(A面)和oppD(B面)基因的寡核苷酸引物用在PCR中，以利用oppD的引物对WS/WT和dppD的引物对TZ/UA在大肠杆菌菌株中扩增各自的区：E956(A和B面的泳道1)、ΔdppD(A面的泳道1)和ΔoppD(B面的泳道1)。

图10.大肠杆菌E956dppD和oppD敲除体的Southern印迹。对卡那霉素、dppD和oppD探针进行放射性标记，并用来探测Pst1限制性的大肠杆菌E956、ΔdppD和ΔoppD的基因组DNA，分别为泳道1、2和3。

详细描述

本发明涉及在个体中维持的减毒活细菌及其在疫苗组合物中的用途。所述减毒细菌由于编码ABC转运蛋白的核酸发生突变而缺少至少一种功能性的ABC转运蛋白。可以借助任何手段使得ABC转运蛋白没有功能，但是这通常通过编码ABC转运蛋白的核酸的突变来实现。通常，所述突变是插入、缺失或移码突变或以上的任何组合。在某些实施方案中，所述减毒活细菌还可以表达异源抗原。

任何类型的细菌均可以按本发明被减毒，但是脊椎动物病原菌且尤其是禽病原菌的减毒是优选的。

细菌

在一个实施方案中，本发明涉及用在疫苗组合物中的减毒活细菌但不限于放线杆菌属、气单胞菌属、禽杆菌属、杆菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体菌、博德特氏菌属、伯克氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、梭菌属、弯曲杆菌属、衣原体属、考克斯氏体属丹毒丝菌属、弗朗西丝氏菌属、李斯特氏菌属、放线杆菌属、嗜血菌属、螺杆菌属、李斯特氏菌属、气单胞菌属、巴斯德氏菌属、链球菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、支原体属、分支杆菌属、鸟杆菌属、曼海姆氏菌属、弧菌属、立克次氏体属、假单胞菌属、葡萄球菌、尿支原体属和巴斯德氏菌属。这些菌属包括对禽和各种不同的动物包括人是病原性的大多数物种。

特别是，减毒细菌可以是但不限于副鸡禽杆菌、鸟博德特氏菌、鼻腔鸟杆菌、肠炎沙门氏菌、出血败血性巴斯德氏菌、溶血曼海姆氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、猪肺炎支原体、鸡败血支原体、关节液支原体、无乳支原体、产碱支原体、鸭支原体、鹅支原体、模仿支原体、精氨酸支原体、微小脲原体、关节炎支原体、牛生殖道支原体、牛鼻支原体、牛支原体、牛眼支原体、加利福尼亚支原体、山羊支原体、殊异支原体、狸猫支原体、发酵支原体、生殖道支原体、人型支原体、猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪关节液支原体、衣阿华支原体、蕈状枝原体蕈状亚种大集落和小集落、鸡败血支原体、关节液支原体、口腔支原体、穿透支原体、羊肺炎支原体、鸡气管支原体、Mycoplasmaalligatorus、肺炎支原体、支原体属、Mycoplasmamaleagridis、猫血支原体、Mycoplasmahaemominutum、Mycoplasmahaematoparvum。

在一个实施方案中，所述减毒活细菌可以选自大肠杆菌或鸡败血支原体。

所述大肠杆菌可以是禽病原性大肠杆菌E956，以及所述鸡败血支原体可以是鸡败血支原体Ap3AS。

在个体中维持

所述减毒活细菌在个体中维持。减毒细菌的维持优选在个体-疾病模型系统中评价，但是也可以在已经给予了本文描述的疫苗组合物或免疫原性组合物的个体中维持。可以通过观察临床体征和/或症状来评价减毒细菌的维持。可选地或此外，可以通过测定采自个体的样品中减毒细菌的存在来评价维持。所述样品可以是组织样品(例如血液、皮肤毛发、口腔拭子(buccalscraping))或者身体分泌物或排泄物样品，例如粘液、尿、粪便、泪液。可以在个体活着时或者在尸检或验尸时采集样品。可以通过培养、诸如ELISA或PCR的分子方法或本领域内已知的任何方法来评估样品中减毒细菌的存在。此外，在尸检或验尸时观察个体的受影响的部位也可以确定减毒细菌在个体中的维持。

ABC转运蛋白

ATP-结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)形成了最大的蛋白质和基因超家族之一，在从原核生物到人类的所有门类中均有代表。ABC转运蛋白是利用ATP来运送物质穿过细胞膜的跨膜蛋白。这些物质包括代谢物、肽、寡肽、脂质和固醇和药物。

在细菌中，根据每种ABC转运蛋白转送底物的类型，将ABC转运蛋白细分成三个主要的组。这些组是蛋白质转运蛋白、肽转运蛋白和运送非蛋白质底物的系统。

按照本发明，可以通过使任何这些类别中的至少一种ABC转运蛋白基因发生突变，使得细菌缺少至少一种功能性的ABC转运蛋白来产生减毒活细菌。

特别感兴趣的是ABC-肽转运蛋白，其包括例如，CvaB(大肠杆菌)、CylB(粪肠球菌(Enterococcusfaecalis))、SpaB(枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、NisT(乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)6F3)、EpiT(表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis))、ComA(肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae))，PedD(乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici))、LcnC(乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.Lactis))、McbEF(大肠杆菌)、OppD和DppD(大肠杆菌和鸡败血支原体(M.gallisepticum))以及它们在其它物种中的同源物。

个体

预期被给予所述减毒活细菌的个体可以是任何脊椎动物，包括人类、牛类、犬类、猫类、山羊类、绵羊类、猪类、骆驼类、马类和禽类。所述牛类个体可以是母牛、公牛、野牛或水牛。所述犬类个体可以是狗。所述猫类个体可以是猫。所述山羊类个体可以是山羊。所述绵羊类个体可以是绵羊。所述猪类个体可以是猪。所述骆驼类个体可以是骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼、瘦驼或骆马。所述马类个体可以是马、驴、斑马或骡。所述禽类个体可以是任何商购的或驯养的禽类。特别是，所述禽类可以是雏鸡(包括矮脚鸡)、火鸡、鸭、鹅、雉、鹌鹑、山鹑、鸽、珍珠鸡、鸵鸟、鸸鹋或孔雀。

突变

用于产生非功能性的ABC转运蛋白的突变可以是插入、缺失或取代突变或以上的组合，只要所述突变导致不能表达功能性的ABC转运蛋白。ABC转运蛋白可具有多种功能，例如ATP-结合或寡肽结合功能。非功能性的ABC转运蛋白包括至少一种功能是缺陷的ABC转运蛋白。

这类突变可以是插入、缺失、取代突变或以上的任意组合，只要所述突变导致不能表达功能性的ABC转运蛋白。在优选的实施方案中，所述突变是敲除突变，其中编码ABC转运蛋白的核酸的至少实质性部分是缺失的。例如可以通过同源重组、转座子诱变或序列标签诱变来产生插入突变。

可以通过多种方式来获得用于本发明的减毒活细菌。例如可以通过用诱变剂处理野生型细菌来制备减毒活细菌，所述诱变剂例如嘌呤或嘧啶类似物、紫外线、电离辐射、DNA嵌入剂、温度处理、转座子诱变。这些方法不会将突变靶向特定的基因，因此需要通过本领域内已知的方法来筛查处理过的减毒的细菌，例如通过对靶基因的DNA序列分析并联合病原性研究。

利用诸如定点诱变的已知方法的重组DNA技术可用来在特定基因(例如oppD)的预定位点引入突变。定点诱变可用来引入诸如一个或多个核苷酸的插入、缺失、替代的突变，使得该突变的基因不再表达功能性的ABC转运蛋白。这类突变例如可通过若干核酸的缺失来产生。

少至单个碱基，进而产生移码的缺失能使得ABC蛋白没有功能。在某些实施方案中，缺失更多的碱基。在其它实施方案中，可以缺失大多数或全部编码ABC转运蛋白的基因。引入终止密码子或移码的突变适于获得非功能性的ABC转运蛋白。

编码ABC转运蛋白的基因不仅包含编码序列，还包含调控序列，例如启动子。基因还包含用于纠正mRNA翻译所必需的区域，例如核糖体结合位点。因此，减毒活细菌所包含的突变不仅可以在编码区中，还可以或可选择地在转录和翻译所必需的序列中，例如在启动子和核糖体结合位点中。

与自发突变所产生的减毒细菌相反，由诸如缺失ABC转运蛋白基因片段或缺失全部ABC转运蛋白基因或插入异源DNA片段或以上的组合的突变所产生的减毒细菌具有不能恢复为野生型病原菌的优势。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了其中至少一种ABC转运蛋白基因包含插入和/或缺失的减毒活细菌。

表达异源抗原的减毒细菌

在一个实施方案中，所述减毒活细菌可以用作编码其它病原菌或病毒抗原的异源基因的载体。这允许减毒活细菌用来激发对多种疾病的免疫应答。

编码ABC转运蛋白的基因可用作异源基因的插入位点。使用ABC转运蛋白基因作为插入点是有利的，因为编码异源抗原的序列的插入既失活了ABC转运蛋白又引入了编码一种或多种异源抗原的序列。可以利用本领域内已知的标准技术常规地进行这类重组细菌的构建。

另一个实施方案涉及选自禽杆菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、埃希氏菌属、布鲁氏菌属、沙门氏菌属、博德特氏菌属、伯克氏菌属、弧菌属、嗜血菌属、鸟杆菌属、曼海姆氏菌属、巴斯德氏菌属、梭菌属、弯曲杆菌属、衣原体属、考克斯氏体属、丹毒丝菌属、弗朗西丝氏菌属、李斯特氏菌属、放线杆菌属、嗜血菌属、螺杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、支原体属、分支杆菌属、立克次氏体属、尿支原体属和链球菌属的减毒活重组细菌，其不能产生功能性的ABC转运蛋白并且在其中插入了异源核酸。异源核酸可以编码选自另一种病原微生物或病毒的抗原。核酸可以编码选自以下病原有机体的抗原：副鸡禽杆菌、鸟博德特氏菌、鼻腔鸟杆菌、肠炎沙门氏菌、出血败血性巴斯德氏菌、溶血曼海姆氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、猪肺炎支原体、鸡败血支原体或关节液支原体、无乳支原体、产碱支原体、鸭支原体、鹅支原体、模仿支原体、精氨酸支原体、微小脲原体、关节炎支原体、牛生殖道支原体、牛鼻支原体、牛支原体、牛眼支原体、加利福尼亚支原体、山羊支原体、殊异支原体、狸猫支原体、发酵支原体、生殖道支原体、人型支原体、猪鼻支原体、猪关节液支原体、衣阿华支原体、蕈状枝原体蕈状亚种大集落和小集落、口腔支原体、穿透支原体、羊肺炎支原体、鸡气管支原体、Mycoplasmaalligatorus、肺炎支原体、支原体属、Mycoplasmamaleagridis、猫血支原体、Mycoplasmahaemominutum、Mycoplasmahaematoparvum，或可以编码选自以下但不限于以下病毒的抗原：新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽肺病毒、鸟痘病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、雏鸡传染性贫血病毒和马立克氏病病毒。

在另一个实施方案中，ABC转运蛋白基因可以完全或部分由编码功能为引发或提高免疫应答的蛋白质的核酸替代，所述蛋白质例如白细胞介素或干扰素。

疫苗组合物

所述减毒活细菌适于用在疫苗组合物中。所述疫苗组合物可以包含能在个体中维持的免疫原性有效量的减毒活细菌和药学上可接受的载体或稀释剂。本文所述的疫苗组合物或免疫原性组合物可经鼻内给药、眼科给药、皮内给药、腹膜内给药、静脉内给药、皮下给药、口服给药、经泄殖腔给药、气雾剂(喷雾接种)或肌内给药。特别是，当个体是禽类时，优选滴眼剂和气雾剂给药。当将疫苗组合物或免疫原性组合物给予大量的个体而言，尤其优选喷雾给药。

在一种形式中，本发明提供了用于预防或治疗动物和人抗其非减毒形式包含ABC转运蛋白基因的细菌感染的减毒活疫苗组合物。

药学上可接受的载体或稀释剂可以选自水、盐水、培养液、稳定剂、碳水化合物、蛋白质、诸如牛血清或脱脂乳的含蛋白质的试剂和缓冲液或以上的任意组合。

所述稳定剂可以是SPGA(每升SPGA含74.62g蔗糖、0.52gKH₂PO₄、1.25gK₂HPO₄、0.912g谷氨酸钾和10g血清白蛋白)。用作药学上可接受的载体或稀释剂的碳水化合物例如是山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖或以上的组合。此外，诸如白蛋白或酪蛋白的蛋白质或诸如牛血清或脱脂乳的含蛋白质的试剂可用作药学上可接受的载体或稀释剂。

同药学上可接受的载体或稀释剂磷酸缓冲液一样的缓冲液可以选自马来酸盐、磷酸盐、CABS(4-(环己胺基)-1-丁磺酸)、哌啶、甘氨酸、柠檬酸盐、双甘氨肽、苹果酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、丙酸盐、哌嗪、嘧啶、甲次砷酸盐、琥珀酸盐、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸水合物、4-吗啉乙磺酸)、组氨酸、双-tris(2，2-双(羟甲基)-2，2′，2″-三乙醇胺)、磷酸盐、乙醇胺、ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸、N-(氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸)、碳酸盐、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、PIPES(1，4-哌嗪二乙磺酸)、咪唑、双三羟基甲氨基丙烷(1，3-双[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)、BES(N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、TES(2-[(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基]乙磺酸)、MOPSO(3-吗啉-2-羟基丙磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)、DIPSO(3-(N，N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸)、TAPSO(2-羟基-3-[三(羟甲基)甲氨基]-1-丙磺酸)、TEA(三乙醇胺)、焦磷酸盐、HEPPSO(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)水合物)、POPSO(无水哌嗪-1，4-双(2-羟基丙磺酸))、三羟甲基甲基甘氨酸、肼、双甘氨肽、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)、EPPS(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、二(羟乙基)甘氨酸、HEPBS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸))、TAPS([(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸)、AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、TABS(N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸)、AMPSO(N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)、牛磺酸、硼酸盐、CHES(2-(环己胺基)乙磺酸)、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、甘氨酸、氢氧化铵、CAPSO(3-(环己胺基)-2-羟基-1-丙磺酸)、碳酸盐、甲胺、哌嗪、CAPS(3-(环己胺基)-1-丙磺酸)或以上的任意组合。

通过添加稳定剂，所述疫苗组合物适于按照本领域内已知的方法低压干燥或冷冻干燥。因此，在实施方案中，所述疫苗组合物是冷冻干燥的或低压冻干的。

在某些实施方案中，所述疫苗组合物可以包含至少一种具有佐剂活性的化合物。适于用在疫苗组合物中的佐剂的实例可以选自弗氏完全或弗氏不完全佐剂、维生素E、非离子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油、卡波姆氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、油乳剂(例如BayolF或Marcol52中的)、皂苷或维生素-E增溶剂或以上的任意组合。在某些实施方案中，所述疫苗组合物可以包含尤其可应用于粘膜的佐剂，例如大肠杆菌不耐热毒素或霍乱毒素。

可以将本发明的疫苗组合物配制成气雾剂(喷雾疫苗)使用。

可以针对眼科用途配制本发明的疫苗组合物，例如以滴眼剂的形式配制。例如滴眼剂可以是水性滴眼剂、非水性滴眼剂、悬浮液滴眼剂或乳化滴眼剂。通过将减毒活细菌悬浮在水性溶剂或非水性溶剂中来制备滴眼剂，所述水性溶剂例如无菌蒸馏水、生理盐水溶液等，所述非水性溶剂例如包括棉籽油、大豆油、芝麻油、花生油的植物油、矿物油等。任选地，可以添加等渗剂、pH调节剂、增稠剂、悬浮剂、乳化剂和防腐剂。

等渗剂包括例如氯化钠、硼酸、硝酸钠、硝酸钾、D-甘露醇、葡萄糖。pH调节剂包括硼酸、无水亚硫酸钠、盐酸、柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸、醋酸钾、碳酸钠、硼砂和本文列出的任何缓冲液。增稠剂可以选自甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、硫酸软骨素钠、聚乙烯吡咯烷酮或以上的任意组合。

悬浮剂可以选自聚山梨醇酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧蓖麻油或以上的组合。此外，乳化剂的实例包括蛋黄卵磷脂和聚山梨醇酯80。此外可以使用的防腐剂例如苯扎氯胺、苄索氯铵、氯代丁醇、苯基乙醇、对羟基苯甲酸或以上的组合。

剂量

除了给药方式和接种所针对的病原体类型之外，给药剂量通常随年龄、体重和待接种的动物而改变。

所述疫苗组合物可以包含足以激发免疫应答的任何剂量的细菌。例如剂量可以包含至少约10³-约10⁵个减毒细菌、或者约10⁵-约10⁷个减毒细菌、或者约10⁷-约10⁹个减毒细菌、或者约10⁹-约10¹¹个减毒细菌、或者约10¹¹-约10¹³个减毒细菌、或者约10¹³-约10¹⁵个减毒细菌、或者约10¹⁵-约10¹⁷个减毒细菌、或者约10¹⁷-约10¹⁹、或者至少约10¹⁹个减毒细菌。

在一个实施方案中，所述疫苗组合物可以作为气雾剂给药。治疗1立方米的剂量可以包含至少10⁶-约10⁸个减毒细菌或约10⁸-约10¹⁰个减毒细菌、或约10¹⁰-约10¹²、或约10¹²-约10¹⁴个减毒细菌、或约10¹⁶-约10¹⁸个减毒细菌、或约10⁸-约10²⁰个减毒细菌、或至少约10²⁰个减毒细菌。

给药方式

本发明的疫苗组合物可以经鼻内给药、皮内给药、经泄殖腔给药、静脉内给药、腹膜内给药、皮下给药、口服给药、气雾剂(喷雾接种)给药、于饮用水中给药、于食物中给药或肌内给药。为了应用于家禽，优选借助气雾剂和滴眼剂给药来给予。

在存在待接种的多个个体的情况下，喷雾接种是特别优选的，因为其允许通过简单地使疫苗组合物雾化或产生疫苗组合物的气雾剂来接种大量的个体。疫苗组合物的雾化产生该疫苗组合物(减毒活细菌)的气雾剂，当该气雾剂被动物吸入时，减毒活病毒便被递送至动物，并侵入呼吸道，从而以呼吸道疾病的形象呈现。该接种方法特别有效，因为不需要对动物进行耗时的单独处理。

现在通过参考以下具体的实施例来进一步更详细地描述本发明，不应以任何方式将这些实施例解释成对范围的限制。

实施例

实施例1：鸡败血支原体突变体文库的创建和鉴定

利用信号标记的诱变(STM)来产生并鉴定鸡败血支原体突变体文库。STM策略显示在图1中。将特有的DNA标签并入用来转化病原体的转座子，从而使该信号标签随机插入基因组中。偶尔，该信号标签(图1A)可以整合进基因并使其失活，产生插入突变。然后利用阴性选择过程在合适的动物模型中筛查ST突变体库。利用个体标签的PCR扩增，随后通过杂交，对输入库和从所述动物回收的ST突变体进行比较。该技术鉴定在输入库(预筛)中存在，但在动物个体传代后回收的库中丢失的个体突变体(图1B)。这些丢失的突变体最可能在负责在个体中建群和生长的基因中含有突变，因此这些基因最可能编码毒力相关的决定因子。

材料和方法

细菌菌株和培养条件

鸡败血支原体(Mg)Ap3AS最初从澳大利亚肉用仔雏鸡的气囊分离得到，并且是高度病原性的。使它于37℃在含10％猪血清的改良Frey肉汤(modifiedFrey’sbroth，MB)中生长，直到对数晚期(pH约6.8)。

信号标记的转座子

利用携带转座子Tn4001mod的质粒pISM2062.2来制备ST突变体文库，该质粒含有庆大霉素抗性基因。每个信号标签由特有的40bp的寡核苷酸DNA序列([NK]20；N＝A、C、G或T，K＝G或T)组成，该DNA序列的侧翼是两个20bp的恒定臂，其能通过利用引物对P2/P4或P3/P5的PCR来扩增和标记该特有区。将信号标签克隆入pISM2062.2的KpnI限制性位点(图1A)。各个信号标签的序列列于表1中。

表1本研究所用的信号标签的DNA序列

^*没有恒定臂的特有寡核苷酸的DNA序列

#P2/P4引物组从信号标签的恒定臂生成。指出了PCR扩增后产物的预期大小(bp)。

信号标记的诱变

利用信号标签的转化

使MgAp3AS稀释物于37℃在1.5ml的MB中过夜生长。合并表现出色变的稀释物，并于室温16,000g离心5分钟来沉淀细胞。将该细胞重悬浮于200μl的冷HEPES-蔗糖缓冲液(8mMHEPES、272mM蔗糖(pH7.4))中。室温16,000g离心5分钟来沉淀该细胞，并用冷HEPES-蔗糖缓冲液再洗涤两次，然后最后重悬浮于400μlHEPES-蔗糖缓冲液中，冷却至4℃。

将100μl等份的细胞放置在冰上，并添加10μg的质粒DNA。然后将细胞-质粒DNA混合物转移至冰上的冷0.2cm间隙杯(gapcuvette，Bio-Rad)，并立即用设置为2.5kV、100Ω电阻和25μF电容的GenePulser^TM(Bio-Rad)进行电穿孔。然后将电穿孔的细胞轻轻地重悬浮于1ml的冷(4℃)MB中，并于室温孵育10分钟，随后于37℃孵育2-3小时，这取决于颜色是否有所改变。通过略微倾斜并用巴斯德吸管移除多余的培养物将500μl的电穿孔培养物样品涂布在含160μg/ml庆大霉素的MA平板上。然后使该平板干燥，并将其在37℃的密闭罐中孵育7-10天。

ST突变体的证实

用巴斯德吸管挑选生长在平板上的Mg集落，置于含庆大霉素(160μg/ml)的1mlMB中，孵育该培养物直到培养基表现出色变。通过在微量离心管中于室温16,000g下离心5分钟来沉淀200μl培养物体积的细胞，并将该细胞团重悬浮于十分之一初始体积的蒸馏水中。然后将该细胞于100℃加热5分钟，并取2μl用作PCR的模板。为了证实存在ST转座子，利用寡核苷酸引物P2和P4(表2)来扩增恒定臂中含特有序列的区域(图3)。在20μl反应体积中进行PCR，并且该20μl反应体积含有2μl的10×反应缓冲液、1μM的每种引物、200μM的每种dNTP、1.5mM的MgCl₂、1.5U的TaqDNA聚合酶(Promega)和2μl的模板DNA。在热循环仪(Omnigene，Hybaid)中进行反应，程序为98℃2分钟1个循环，随后94℃30秒、50℃30秒和72℃40秒共35个循环，以及最后72℃孵育7分钟。将PCR产物与大小标准品(用HaeIII消化的pUC18)一起于2％的琼脂糖凝胶中电泳。

表2STM研究中用到的寡核苷酸

小写字母表示核苷酸修饰，从而产生限制性内切核酸酶切割位点

转座子插入点的证实

从ST突变体分离DNA

使每个ST转化体于37℃在补充有160μg庆大霉素/ml的40mlMB中生长，直到对数晚期(pH约6.8)。于20,000g离心30分钟来收获细胞，并用冷PBS洗涤两次，添加SDS以裂解该细胞，然后使溶液通过26号的针以切断基因组DNA。用HighPurePCR试剂盒(Roche)按照生产商的说明书(有较小的改动)进行基因组DNA的提取。省略最开始的溶菌酶处理，并将DNA从柱洗脱进50μl，而不是200μl的10mMTris缓冲液(pH8.0)中。通过使1μl样品与已知浓度的分子量标准品(用HindIII消化的噬菌体λDNA)一起在0.7％的琼脂糖凝胶中电泳来估计纯化DNA的量。

基因组DNA测序

对Wada(2000)的基因组DNA测序步骤进行了修改和改进。与Tn4001结合的引物IGstmGenmeF3(表2)用于穿过转座子-基因组DNA连接点并进入Ap3AS基因组DNA进行测序。利用ABIPRISMBigDye3.1Terminatorchemistry(AppliedBiosystemsIncorporated)来确定该序列。每个反应由2-3μg纯化的基因组DNA、10μM引物和4μlBigDye3.1酶混合物组成，并在iCycler^TM(Bio-Rad)中进行循环测序，程序为95℃5分钟1个循环，随后95℃30秒、55℃30秒和60℃4分钟共60个循环。然后按照生产商的推荐来纯化产物，然后用ABI3100毛细管测序仪和相关软件(AppliedBiosystemsIncorporated)进行分析。利用BLAST程序(国家有机体技术信息中心，NCBI)或FASTA版本3.3t07(PearsonandLipman，1988)通过将该DNA序列与鸡败血支原体菌株Rlow基因组的DNA序列进行比较来确定每个ST转座子的插入位点。

MgST突变体的检测

合成与37个信号标签中每一个标签互补的寡核苷酸。将该寡核苷酸重悬浮于TE缓冲液中，至100μM的浓度。利用Bio-DotSFMicrofiltrationApparatus(Bio-Rad)按照生产商的说明书将10μl体积的每种寡核苷酸溶液(含3皮摩尔)点到Hybond-N+尼龙膜(AmershamPharmaciaBiotech)上，然后通过UV交联3分钟，使该寡核苷酸固定到膜上。利用上述的PCR反应合成与每个信号标签对应的DNA探针，除了带有地高辛(DIG)(Roche)标记的寡核苷酸引物P2和P4是购买的。在震荡的水浴中40℃下，使DIG标记的探针与该膜在DIGEasyHyb缓冲液(Roche)中杂交16-18小时，然后按照生产商的说明书对该膜进行洗涤，除了第2次洗涤是在45℃下进行的。用DIG发光检测试剂盒(Roche)检测结合的探针，并用Biomax膜(Kodak)记录检测。还要进行PCR，以证实庆大霉素抗性基因的存在以及证实支原体转化体的种类。利用1.5UTaqDNA聚合酶在25μl的反应混合物进行每个PCR反应，该25μl的反应混合物中含有、1.5mMMgCl₂、200μM的每种dNTP和1μM的每种引物。通过95℃孵育5分钟，然后通过95℃1秒、58℃10秒和72℃25秒共35个循环来扩增Mg16SrRNA基因的区域。预计产物大小为219bp。通过95℃孵育2分钟，然后通过95℃30秒、60℃30秒和72℃15秒共28个循环，最后于72℃孵育5分钟来扩增庆大霉素抗性基因片段。预计产物大小为278bp。

利用DIG检测系统的信号标签之间的交叉杂交

将DIG标记的信号标签库与含有上述的37种信号标签寡核苷酸的单个膜杂交。预期DIG标记的标签只与相应的特有寡核苷酸结合，除非在标签和探针之间有交叉杂交。例如，含有标记标签02、03和04的库预期只与斑点印迹上的寡核苷酸标签02、03、04结合，任何其它阳性反应均应被认为是交叉反应。用13种不同的标记信号标签库来评价交叉杂交反应。

初步的动物实验

ST突变体活细胞数的计算

利用以下步骤来测定每种ST突变体培养物的活细胞计数，测定为每ml的颜色改变单位(CCU/ml)。向无菌的96孔微量滴定板(Nunculon，Nunc)的每个孔添加225μl含庆大霉素(160μg/ml)的无菌MB。向第一栏的8个孔的每孔添加25μl突变体培养物，通过吸打混合数次，并从每孔转移25μl至下一栏，并用新组枪尖混合。重复该连续的10倍稀释顺序直到第10栏，弃掉第10栏的25μl。第11和12栏用作阴性对照。然后用Linbro封板(ICNBiochemicals)密封该平板，并于37℃孵育长达2周。培养基pH的下降反映出培养物的生长，通过培养基中酚红指示剂的颜色从红色变成黄色来指示pH的下降。第1栏被认为是1/10稀释，并且在校正该培养物的初始稀释后，用最大概率数表计算CCU/ml数。接种雏鸡所需的每种转化体的剂量是1×10⁷CCU/ml。

实验设计

将16只4周龄的无特异病原体(SPF)的白来亨(WhiteLeghorn)雏鸡圈养在正压玻璃纤维隔离装置中。使一系列10种ST突变体的稀释物在微量滴定板的含160μg/ml庆大霉素的MB中过夜生长(表3)。第二天来评估每个克隆的生长，从估计在对数期的稀释物取100μl加至库中。然后将合并的ST突变体在MB中再稀释10倍，并将该稀释的库用作接种体。通过作为气雾剂给药用该合并的ST突变体感染16只雏鸡中的12只。余下的4只鸟作为接触对照，并在气雾剂感染3天后放在隔离装置中。在感染14天后，对气雾剂感染的鸟中的6只实施安乐死并取样，并且其余的，包括所有接触的鸟，均在感染28天后进行。

表3检测的转座子

对样品的收集与分析

在气雾剂感染之前和安乐死之前收集所有鸟的血液样品，室温静置3小时至凝固。然后通过将样品在室温下10,000g离心5分钟来收获血清，然后利用RSA检验进行检验，来确定抗鸡败血支原体的抗体应答。通过将25μl未稀释的血清与25μl着色的商业MgRSA抗原(IntervetInternational)在玻璃板上混合并摇动1分钟来进行RSA检验。用从0(没有凝集)到4(大块的抗原)的级别对该检验评分。每组检验包括阴性血清和阳性血清作为对照。雏鸡通过二氧化碳吸入被处以安乐死。检查总气囊损伤，并按下述用0-3的级别对严重度进行评分：

0＝无损伤，气囊为清晰的薄膜

1＝小絮状干酪性纤维蛋白附于气囊

2＝气囊出现浑浊并增厚，有中等数量的干酪状纤维蛋白附于气囊

3＝气囊增厚，且表面覆盖厚的干酪状纤维蛋白

对位于这些说明之间的损伤给予半分。记录左和右前胸部气囊、左和右后胸部气囊以及左和右腹部气囊的评分。将6个评分的总和作为每只个体鸟的最终评分。从每只鸟的气囊、气管、肺、脾、肝、肾和脑采集拭样(swab)。用该拭样接种含160μg庆大霉素/ml的MA平板和无庆大霉素的MA平板，然后将该拭样置于补充有160μg/ml的庆大霉素的3mlMB中。将MA平板于37℃孵育，并在7-10天后，用双筒解剖显微镜进行检查。以前的研究检测出接种14天后，Tn4001转座子从体内实验过程中的某些突变体丢失。这些突变体恢复野生型表型，但不能在庆大霉素的选择压力下存活。当不含庆大霉素的板上的集落数是含庆大霉素的板上的集落数的10倍或更高时，怀疑是转座子丢失了。将MB培养物于37℃孵育，并从显示出色变的那些肉汤提取DNA，并将该DNA用作上述PCR中的模板，从而用P2/P4引物对扩增特有的标签区。

结果

ST突变体的证实

利用P2/P4引物对从信号标签产生的PCR产物的预期大小为79-81bp，除了从标签25产生的PCR产物的的预期大小为67bp。将含有信号标签的每种质粒导入Mg菌株Ap3AS中，并随机选择转化体，并将其培养在补充有庆大霉素的培养基中。对显示出生长的所有MB培养物进行PCR，以检测含有特有信号标签的ST突变体的存在(图2)。用从每个信号标签产生的至少9个转化体来建立ST突变体文库，用于进一步的实验。

转座子插入位点的证实

通过基因组DNA的直接测序来确定本节所描述的本研究中用到的10个MgST克隆中每一克隆的转座子插入位点(表3)。在5个ST突变体中，转座子插入了编码特有或保守假定蛋白的区域。

ST突变体检测的优化

信号标签之间的交叉杂交

大多数标签是特异的，仅有几个与与其它标签互补的寡核苷酸发生交叉杂交。标签02和37之间有强列的交叉反应(库A、E、G和H中)。在标签15和30之间也检测到了一些交叉杂交(库D、I和J中)，但是用库B没有检测到交叉杂交。当库中存在标签13时，标签13和标签28之间有单向杂交。这也可以用标签29和23(库D和H)，以及标签29和24(库D和H)时观察到。

对ST突变体感染雏鸡进行初步评价

血清学检验和总的气囊检查

在感染前和感染后，利用RSA来测定抗鸡败血支原体的抗体应答(表4)。感染前，没有在鸟中检测到鸡败血支原体特异的抗体。在气雾剂感染的雏鸡中，感染后第2周时，三分之二的RSA评分大于1，感染4周后，所有的均为阳性，RSA评分为1-4。接触对照中只有1只的RSA评分为1。感染2周后，在2/6的鸟中看到轻度气囊损伤(评分0.5)，并且在感染后第4周时，在3/6的雏鸡中看到轻度气囊损伤，而1只鸟的腹部气囊为重度损伤(评分2.5)。接触对照中只有1只为轻度损伤(评分0.5)。详细结果显示在表4中。

表4.在初步实验中从鸟不同部位回收的ST突变体

RSA：快速血清凝集，contam：污染的培养物

^*通过杂交所检测到的标签ID和通过存在庆大霉素基因和Mg16srRNA基因的PCR为阳性

+：表示生长在MA上的Mg集落或在MB中观察到色变

-：在MA平板上或MB中未观察到生长

回收的ST突变体的逆转和鉴定

在存在和不存在庆大霉素的条件下，为鸡败血支原体的生长检查MA平板。在体内传代后，没有证据显示转座子从ST突变体丢失。仅在这样的MA平板上分离到鸡败血支原体：该平板用接种2周后一只鸟的气囊拭样和两只鸟的气管拭样接种，以及用感染4周后四只雏鸡的气管拭样接种。还从感染14天后一只鸟的心脏所采集的拭样分离到鸡败血支原体。在接触对照的任何器官的拭样中均未分离到鸡败血支原体(表4)。感染2周后采集的气囊拭样的一种肉汤培养物和气管的四种肉汤培养物显示出色变，同时，通过这些样品的DIG杂交检测出10个特有标签中的3个。显示出色变的肉汤培养物获自感染28天后两只鸟的气囊拭样和三只鸟的气管拭样，以及获自其它器官的拭样，包括五只鸟的肺、四只鸟的心脏、两只鸟的肝、三只鸟的肾、四只鸟的脾和一只鸟的脑。显示出色变的肉汤培养物还获自接触鸟中一只鸟的气管拭样、两只鸟的肾拭样和两只鸟的脑拭样。然而，为检测接种21天后显示出色变的培养物中庆大霉素抗性基因和Mg16SrRNA基因的存在而进行的PCR全部都是阴性的，这提示这些培养物中所观察到的色变不是由鸡败血支原体的生长引起。携带标签02、32、35和37的突变体确实是从鸟的气囊、气管和从一只鸟的脑回收的，同时最常检测到的标签是32和37(表4)。几种肉汤培养物在接种7天内显示出色变，但是通过DIG杂交检测不到标签(数据未显示)。

实施例2：鸡败血支原体ST突变体的体内分析

介绍

STM技术由两个主要步骤组成：体外产生标记的突变体文库和在动物体内进行阴性选择。利用上述实施例1中所描述的改进的杂交检测系统，输入库仅含有源自的彼此不会交叉杂交，并且还会产生清晰的检测信号的标签的突变体。利用37种不同的标记转座子来产生实施例1的ST突变体文库。本实施例描述了利用感染的雏鸡的阴性选择筛查含有34种不同标签的102种ST突变体，以鉴定与毒力有关或体内存活所必需的基因。

材料和方法

ST突变体插入位点的确定

利用特异引物(表2)对来自每种ST突变体的基因组DNA进行直接的测序。对于不能获得序列数据或在转座子的末端生成混合测序信号的那些ST突变体，利用Southern印迹来确定转座子插入的数量。然后从进一步鉴定转座子插入点的尝试中忽略具有多于一个转座子插入的ST突变体。利用扩增标签区(表2)的DIG标记的引物(P2和P4)来制备Southern印迹的探针。用20U限制性内切核酸酶BglII(NewEnglandBiolabs)于37℃过夜消化ST突变体的基因组DNA，并将得到的片段于2.5V/cm在0.7％琼脂糖凝胶中过夜分离。然后将分离的片段转移到HybondN+尼龙膜上，与DIG标记的探针杂交，并用DIG发光检测试剂盒(Roche)按照生产商的说明书检测杂交，并用Biomax胶片(Kodak)记录荧光。

在感染的鸟中筛查ST突变体

ST突变体的制备

对于三组接种体(组A、B和C)(3个实验组共102种突变体)的每一组，在微量滴定板的补充有庆大霉素(160μg/ml)的MB中，制备34种ST突变体中每一种的10倍稀释系列，所述34种ST突变体中的每一种均含有不同的标签，并于37℃过夜孵育(表5)。将产生合适色变的每种突变体的稀释物用于接种。取0.1ml的每种突变体的合适培养物的样品，并与其它突变体的培养物混合，从而产生合并的接种体。然后立即用合并的ST突变体进行雏鸡的气雾剂接种。

表5.本研究产生的ST突变体的转座子插入位点(接种体A)

初筛

实验设计

将总共90只4周龄的SPF雏鸡随机分成3组，每组(每组30只鸟)被单独圈养在正压玻璃纤维隔离装置中。用ST突变体库通过气雾剂来接种每组中的20只鸟，余下的10只雏鸡作为接触对照，在暴露于气雾剂3天后，将该10只雏鸡与被接种的鸟放置在一起。接触对照用来研究ST突变体的传播能力。感染14天后，从10只被接种的雏鸡收集血液样品，并对它们实施安乐死以检查损伤。如下文所述，利用RSA检验来检测血液样品抗鸡败血支原体的抗体。检查所有鸟的总气囊损伤，并按下述用0-3的级别对严重度进行评价。按下述培养每只鸟的气囊和气管拭样以回收支原体。从变色的每个肉汤培养物提取DNA，用作PCR的模板，以扩增特有标签区。然后如上述将PCR产物用在Southern印迹中，来鉴定存在的ST突变体。接种10天后，按下述检查MA平板。接种28天后，利用相同的步骤对剩下的鸟实施安乐死、检查并取样。

确证筛选

鸡败血支原体ST突变体的制备

使在初筛实验中没有重新分离到的ST突变体的稀释物在含有160μg庆大霉素/ml的MB中于37℃过夜生长。引起适度色变的每种ST突变体的稀释物被用来接种。将0.1ml的每种突变体的培养物样品与其它突变体的样品混合，然后将该混合体在MB中稀释10倍，用作新的合并的接种体，该合并的接种体用来通过气雾剂接种雏鸡。

实验设计

进行确证实验以缩减用于最终检验的候选ST突变体的数量。实验设计和方法与图4中所显示的初筛实验相似。将总共40只4周龄的SPF雏鸡分成两组。将在初筛实验在接种的鸟中无法检测到的ST突变体分配到两组接种体中的一组，每一组都用来通过气雾剂接种两组鸟中的一组。本实验中不包括接触对照。然而，将所有40只鸟放置在同一个正压玻璃纤维隔离装置中，因此每一组都能用作另一组的接触对照。在下文，利用与之前所述相同的程序，在接种14天后进行样品收集。简单而言，在接种之前和正要安乐死之前收集血液样品。在死后检查收集气囊和气管的拭样，用于分离支原体。检查所有鸟的总气囊损伤。用RSA测定检测血清。从变色的每个肉汤培养物提取DNA，用作PCR的模板以扩增特有标签区，然后将该扩增的产物用作斑点印迹杂交测定中的探针。在下文，于37℃孵育10天后，如前述检查MA平板。从MA平板收集几个集落，并于37℃培养在补充有庆大霉素的MB中，直到观察到色变。如前面的实施例1所述，提取DNA并用作PCR测定中的模板，以便通过扩增Mg16SrRNA基因的219bp的片段来证实支原体的类别(图4)。

从感染的鸟回收的特定ST突变体的PCR证实

基于测序结果，设计对每种ST突变体特异的PCR引物(表2)。它们与引物IGstmGenmeF3一起用在PCR测定中，以检测被接种的鸟的培养物中的每一种ST突变体。在20μl体积中进行PCR，该20μl体积含有2μl提取的作为模板的DNA、2μl10×反应缓冲液、1μM的每种引物、200μM的每种dNTP和1.5UTaqDNA聚合酶(Promega)。在热循环仪(Omnigene，Hybaid)中进行PCR，程序为95℃2分钟，1个循环，随后94℃45秒、52℃45秒和72℃1分钟，35个循环，以及最后2℃孵育7分钟。

结果

对ST突变体中插入点的作图

利用直接的基因组测序技术确定91种ST突变体中转座子的插入位点。没能获得11种突变体的可靠的序列数据(表5)。在大多数情况下，组A、B和C中的插入位点是相同的，除了ST突变体01-1、02-2、02-3、04-3、09-3和17-3之外。

将不能直接测序的那些ST突变体进行Southern印迹，以便确定转座子插入的数量。测序图谱显示与转座子对应的前100bp的数据的质量较好，但是达到转座子和基因组序列的连接点后，获得了混合信号(图5A)。由于预测限制性内切核酸酶BglII不能在转座子序列中进行切割，因此探针结合的条带数应该能反映转座子在ST突变体基因组中存在的次数。通过Southern印迹证实ST突变体15-1、15-2、15-3、25-1、25-2、25-3、34-1、34-2、34-3、09-3和17-3中有多重转座子插入，并且携带相同信号标签的突变体似乎具有相同的插入(表5和6，图5B)。

初筛实验

病理学和血清学结果

每个实验组的RSA结果显示在表7中。在接种时，在任何鸟的血清中均未检测到抗支原体的抗体。通常，接种4周后的阳性血清多于接种2周后，并且在任何组的接触鸟中均未检测到抗体应答。接种2周后具有气囊损伤的鸟(组A、B和C分别为2、2和4)多于接种4周后(组A、B和C分别为0、1和2)。接种2周后观察到更严重的气囊损伤(组A的评分为0.5、组B的评分为1.0-2.0和组C为0.5-2.5)，除了在组C中有一只雏鸡在接种4周后的损伤评分为3.0。发现组C中的气囊损伤更多。损伤的严重度与RSA结果没有很好的相关性，一些鸟具有高RSA评分，但无可检测的气囊损伤。

表6.本研究ST突变体中的转座子插入位点的分类

表7.RSA结果、气囊损伤评分和在初筛的每个实验组中检测到的标签

^*阳性数/检测数。全部RSA和气囊损伤评分数据显示在附录C中。

#死后检查之前，组A中死了一只接种的鸟和两只对照鸟，且组C中死了两只接触鸟。

^三组中未检测到信号标签的总结。

可回收的ST突变体的鉴定

从接种14天和28天后的鸟采集的肉汤培养物的结果总结在表7中。鸡败血支原体的回收模式与初级实验中所看到的相似，从气管得到的分离物多于气囊。通常，接种2周后得到的分离物多于接种4周后。从组B的接触鸟中没有重新分离到ST突变体，但是从组A的接触鸟重新分离到5种不同的ST突变体和从组C的接触鸟重新分离到2种。携带标签20的ST突变体被从气囊和气管回收是最常见的，并且在所有三个组中均有高的检测率。下一个最常分离到的突变体是携带标签28的突变体。由12个不同标签表示的16种ST突变体不能被重新分离到，包括ST突变体02-1(-2)、03-1(-2/-3)、04-1(-2)、04-3、06-1(-2/-3)、09-1(-2)、09-3、10-1(-2/-3)、15-1(-2/-3)、17-1(-2)、17-3、22-1(-2/-3)、23-1(-2/-3)、25-1(-2/-3)、33-1(-2/-3)和34-1(-2/-3)。

在用任何接触雏鸡的气囊或气管拭样接种的MA平板上均未分离到鸡败血支原体。在用接种2周后分别从组A、B和C中的3只、1只和5只鸟的气囊收集的拭样接种的MA平板上分离到鸡败血支原体。它们也在用组C中5只雏鸡的气管拭样接种的MA平板上分离到，但是没有从组A或B的任何鸟分离到。在接种4周后，用分别从组A、B和C的4只、2只和6只鸟的气囊和1只、2只和7只鸟的气管拭样接种的MA平板上分离到鸡败血支原体。在几乎通过琼脂培养物分离到支原体的每种情况下，也通过肉汤培养物分离到它们。在任何ST突变体中均未检测到转座子丢失。

确证筛选实验

将在初筛实验中未能检测出的16种ST突变体分成2组。转座子插入位点的序列数据和Southern印迹表明，ST突变体04-1和04-2中的转座子具有相同的插入位点，但是与04-3的插入位点不同。ST突变体09-1和09-2中的转座子插入位点相同，而突变体09-3具有多重插入。在ST突变体17-1、17-2和17-3中也发现了同样的情况。这些突变体中没有一个能在初筛实验中检测到，所以将它们分成两种不同的接种体，以便区别它们。如果组之间存在潜在的传播，并且这三种信号标签均可通过斑点印迹杂交检测，则能用PCR鉴定从鸟重新分离到的突变体。

病理学和血清学评价

实验过程中，组A中的1只鸟和组B中的1只鸟死亡。在组A中观察到1只鸟为严重气囊损伤(评分2.5)，另2只雏鸡为轻度损伤(0.5和1.0)。组B中1只鸟为轻度气囊损伤(1.0)。接种之前没有检测到抗鸡败血支原体的抗体。接种2周后，组A中15/19只雏鸡是RSA阳性的，而组B中14/19只鸟是阳性的。详细结果显示在表8中。

表8.RSA结果、气囊损伤评分和确证筛选的每个实验组中检测到的突变体

^*阳性数/检测数。全部RSA和气囊损伤评分数据显示在附录D中。

#用含ST突变体02-2、03-1、04-1、06-1、09-1、10-1、15-1和17-2的库接种组A中的鸟；用含ST突变体04-3、09-3、17-3、22-1、23-1、25-1、33-1和34-1的库接种组B中的鸟。死后检查前组A和B中各死亡一只鸟

^两组中未检测到的ST突变体的总结

ST突变体的重新分离

两组中，相对于用气囊拭样接种的MA平板，鸡败血支原体更通常从用气管拭接接种的MA平板上分离到。在用两组中两只鸟的气囊拭接和用组B中18/19只雏鸡的拭接接种的MA平板上分离到鸡败血支原体。

从组A中3只雏鸡的气囊回收了5种ST突变体，从组B中1只鸟的气囊回收了3种ST突变体。在用从气管采集的拭样接种的MB中回收的ST突变体多于用从气囊采集的拭样接种的MB。总共从组A的雏鸡中重新分离到11种ST突变体，和从组B的18只鸟中重新分离到10种ST突变体。

重新分离到的最常见的突变体是携带标签23的突变体。该突变体从17只鸟的气管和从2只雏鸡的气囊分离。第二最常见的分离到的突变体是17-2，其是从12只鸟的气管分离的(表8)。用来接种组A中的鸟的ST突变体02-2、03-1、10-1和15-1从组B重新分离到，而用来接种组B中的鸟的ST突变体04-3、23-1、25-1和34-1从组A重新分离到(表8)。从两组的任何鸟均未重新分离到ST突变体04-1和33-1(表8)。在任何ST突变体中均未检测到转座子丢失。

实施例3：所选的鸡败血支原体ST突变体的感染力和毒力

ST突变体的制备

将在初筛或确证筛选实验中均未被检测到的2种ST突变体04-1和33-1和很少被检测到的5种突变体(ST突变体03、18、20、22和26)于37℃培养在补充有160μg/ml庆大霉素的MB中，直到对数晚期。将野生型Ap3AS于37℃培养在不含庆大霉素的MB中。用上述方法将每种菌株的浓度调至约1×10⁷CCU/ml。

毒力和感染力分析

实验设计

将8组(每组20只鸟)4周龄的SPF雏鸡分别圈养在正压玻璃纤维隔离装置中。用不同的ST突变体通过气雾剂暴露接种6组中的每一组。将阴性对照鸟暴露于MB，且将阳性对照鸟暴露于野生型Ap3AS。感染14天后对鸟实施安乐死，并按上述进行死后检查。从每只鸟收集血清和拭样，并按上述进行抗支原体抗体检测和支原体分离，除了将从Ap3AS感染组采集的拭样接种到MA平板，并然后置于无庆大霉素的MB中。从显示出色变的每个肉汤培养物分离DNA，用作PCR的模板，以利用P2/P4引物对(表2)扩增特有标签区。如上文之前所述，将PCR产物用作斑点印迹杂交中的探针，以检测特定标签的存在。还利用IGstmGenmeF3引物和每种ST突变体的特异性引物进行PCR，作为鉴定被接种的鸟中的ST突变体(表2)的另一个工具。采集每只鸟的上部、中部和下部气管，进行组织病理学检查和粘膜厚度检测。

重新分离的ST突变体的检测

用斑点印迹杂交和PCR扩增检测肉汤培养物中的每种ST突变体。斑点印迹杂交不能用于阳性对照组的培养物，因为野生型Ap3AS不含信号标签。上文详细描述了斑点印迹杂交技术。简单而言，利用DIG标记的引物组，扩增从显示出色变的培养物提取的DNA中的标签区。将与鉴定本实验所用的突变体的7个信号标签对应的寡核苷酸点到尼龙膜上，随后用于杂交。用DIG发光检测试剂盒(Roche)按照生产商的说明书检测杂交。利用每种突变体的测序数据设计每种ST突变体特异性PCR引物。用来证实野生型菌株Ap3AS重新分离的引物对(STM13-KE-C’-1-Rev和STM13-KF-C’)靶向于对ST突变体13-1、13-2和13-3(表2)进行测序时所鉴定的区域。

在20μl反应中利用2μl提取的DNA作为模板进行PCR反应，该20μl反应含有2μl10×反应缓冲液、1μM的每种引物、200μM的每种dNTP和1.5U的TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR于95℃孵育2分钟，随后于94℃45秒、52℃45秒和72℃1分钟进行35个循环，最后于72℃孵育7分钟。

组织学检查

气管切片的制备

收集上部、中部和下部气管样品，浸入10％的中性缓冲的福尔马林(每升10％福尔马林、4gNaH₂PO₄和6.5gNa₂HPO₄)中固定至少24小时。然后通过真空包埋将组织加工成固体石蜡。切成2μm厚的切片，并收集在载玻片上。脱蜡和复水之后，用苏木精和曙红对该切片进行染色，并通过光学显微镜检查损伤，用于测量粘膜厚度。

检查气管损伤并测量粘膜厚度

按下述在0-3的级别上对气管的上部、中部和下部切片组织损伤的严重度进行评分：

0＝没有显著变化；

0.5＝淋巴细胞发生非常小的聚集(小于2处病灶)或淋巴细胞发生非常少、分散的浸润；

1＝淋巴细胞发生小的聚集(多于2处病灶)或由淋巴细胞的分散浸润引起粘膜有较小的增厚；

2＝由于异嗜白细胞和淋巴细胞的浸润使得粘膜发生中等增厚，以及水肿并伴随带或不带腔渗出物的上皮细胞变性；

3＝由异嗜白细胞和淋巴细胞的浸润引起相当大的增厚，以及水肿并伴随有鳞状细胞化生或上皮细胞变性和腔渗出无物。

通过测量每只鸟的上部、中部和下部气管的每个切片上的6个点的厚度来确定每只鸟的气管的粘膜厚度。然后以微米计算出三个区域中每一个的平均厚度。

统计学分析

利用Mann-WhitneyU检验(Windows的Minitabversion14.2)来比较每个实验组的气管组织损伤评分的中位数。用斯氏t-检验和单因素方差分析(ANOVA)来比较平均气管粘膜厚度。概率(P值)≤0.05被认为是显著的。

SDS-PAGE电泳

通过在16,000g离心5分钟来收集ST突变体以及Ap3AS和ts-11菌株中每一种的1ml对数中期样品中的细胞，然后重悬浮于1×SDS-PAGE裂解缓冲液中，并在冰上快速冷却之前，在100℃孵育5分钟。总细胞蛋白质与分子量标准品(标志物12^TM宽度范围的蛋白质标准品(Marker12^TMWideRangeProteinStandard)，Novex)一起在12.5％的聚丙烯酰胺凝胶中分离，然后用考马斯亮蓝染色。

结果

ST突变体的毒力和感染力

临床体征死后检查

在暴露于ST突变体04-1(组2)、33-1(组3)或22-1(组8)气雾剂的鸟中或者在阴性对照鸟(组1)中没有观察到气囊损伤。在用ST突变体03-1接种的1只鸟(组4)中观察到轻度损伤(评分0.25)。在用ST突变体26-1感染的20只鸟(组5)中，4只有轻度损伤(0.50-1.00)，而仅在暴露于ST突变体18-1的4只鸟(组6)的腹部气囊中观察到损伤。在用ST突变体20-1感染的组中(组7)，20只鸟中有6只为轻度至重度损伤(0.50-2.50)，而在有毒的Ap3AS菌株感染的18只鸟(组9)中，观察到有11只为轻度至重度损伤(0.50-3.00)。结果总结在表9中并通过图表显示在图6中。

表9.来自毒力和感染力研究的鸟中的RSA结果、气囊损伤评分和鸡败血支原体的重新分离率

^*结果被表示成阳性应答数/检验数。全部RSA和气囊损伤评分数据显示在附录E中。

死后检查之前，组8死了1只鸟和组9死了2只鸟

#结果被表示成阳性样品数/收集数。

^结果被表示成变色样品数/收集数。仅检测到了感染组2-8中鸟的ST突变体所携带的信号标签

抗体应答和ST突变体的重新分离

利用RSA检验，在感染时，在任何实验鸟的血清中均未检测到抗支原体的抗体。感染2周后，在组2、3、5和8的任何鸟中均未检测到抗体应答，而仅在组4的1只鸟中应答是可检测的。相反，在组6和7的所有鸟中，抗鸡败血支原体的强RSA应当都是可检测的。阴性对照鸟(组1)没有在RSA检验中表现出抗Mg的反应性，而所有的阳性对照鸟(组9)均有抗Mg的强RSA反应(表9，图6)。在用组2(经ST突变体04-1感染)或组3(经ST突变体33-1感染)中任何鸟的气囊或气管拭样接种的MA平板上均未分离到鸡败血支原体(表9)。在用组4(经ST突变体03-1感染)或8(经ST突变体22-1感染)中任何鸟的气囊拭样接种的MA平板上均未分离到鸡败血支原体，但是从组4中2只鸟的气管和组8中1只鸟的气管中分离到鸡败血支原体。在组5(经ST突变体26-1感染)中，从1只鸟的气囊和6只鸟的气管中分离到鸡败血支原体。还从组6(经ST突变体18-1感染)17/20只鸟的气管和组7(经ST突变体20-1感染)的所有鸟中分离到鸡败血支原体，并且还从组6中5/20只鸟和组7中7/20只鸟的气囊拭样中分离到鸡败血支原体。在阳性对照组(组9)中，从9/18只鸟的气囊和17/18只鸟的气管中分离到鸡败血支原体。与MA平板相比，鸡败血支原体更通常从在MB中孵育的拭样中分离到。在用暴露于ST突变体04-1的任何鸟(组2)的气囊或气管拭样接种的MB中均未分离到鸡败血支原体(表9)。在其它突变体感染组中，在用组5(ST突变体26-1)中1只鸟、组6(ST突变体18-1)中7只鸟和组7(ST突变体20-1)中8只鸟的气囊拭样接种的MB中，回收到Mg。从暴露于ST突变体的组中的6组鸟的气管中回收到Mg，感染鸟的数量范围为从组3(经ST突变体33-1感染)中的2只到组7(经ST突变体20-1感染)中的20只。利用它们携带的特有信号标签来证实回收的鸡败血支原体ST突变体的特征(表9)。

气管损伤和粘膜厚度

气管损伤评分的中位数显示在表10中。所有突变体感染的组中鸟的评分都显著不同于阳性对照组(组9)中鸟的评分(P＜0.0001)。在阴性对照组(组1)和组5(经ST突变体26-1感染)或7(经T突变体20-1感染)之间没有显著性差异。用ST突变体18-1感染的鸟(组6)中下部气管损伤评分并未不同于组2、3、4、5和7中鸟的下部气管损伤评分，但是显著不同于组8(经ST突变体22-1感染)和阴性对照组(组1)中鸟的下部气管损伤评分，而阳性对照组中只有鸟中部气管的损伤评分不同于任何其它组中鸟中部气管的损伤评分。平均气管粘膜厚度显示在表10中。中部气管的平均粘膜厚度在任何突变体感染的组(组2-8)之间均没有显著不同。然而，它们均显著大于阴性对照组(组1)的中部气管的平均粘膜厚度，除了组2和7之外，并且它们均显著小于阳性对照组(组9)的中部气管的平均粘膜厚度。在阴性对照和组7(经ST突变体20-1感染)之间，上部和中部气管的粘膜厚度均没有显著差异，但是在下部气管中有差异(P＝0.004)。

总之，如通过组织损伤评分或粘膜厚度所评价，阳性对照的气管损伤显然比用ST突变体感染的任何组都严重。在用ST突变体感染的组中，组4(经ST突变体03-1感染)受到的影响是最严重的。

表10.毒力和感染力研究中鸟的气管损伤评分和粘膜厚度

^*SD：标准偏差

在相同栏中具有相同上标的数据没有显著差异。

全部数据显示在附录F中

实施例4：对用所选的鸡败血支原体ST突变体接种所提供的保护的评价

ST突变体疫苗的制备

ST突变体26-1于37℃在补充有160μg庆大霉素/ml的MB中生长。用来测定培养物中有机体浓度的方法如上述。将ST突变体26-1的浓度调整至约1×10⁷CCU/滴(22.5μl)，用于接种，然后用1滴培养物通过眼内接种鸟。

实验设计

将总共80只5周龄的SPF雏鸡随机分成4组，圈养在正压玻璃纤维隔离装置中。在第0天时，通过滴眼剂给予ST突变体26-1。免疫2周后，通过气雾剂给予野生型Ap3AS来激发鸟。组1中的鸟充当阴性对照。在第0天时，用MB通过滴眼剂来接种这些鸟，并且在第14天时，用MB通过气雾剂来激发。组2中的鸟充当阳性对照。在第0天时，用MB通过滴眼剂来免疫它们，并且在第14天时，用野生型Ap3AS通过气雾剂来激发。组3中的鸟充当接种对照。在第0天时，通过滴眼剂向这些鸟给予ST突变体26-1。然后在接种14天后，通过气雾剂给予MB。组4中的鸟充当接种和激发组。在第0天时，用ST突变体26-1通过滴眼剂免疫雏鸡，并且在第14天时，用野生型Ap3AS通过气雾剂来激发。

从实验雏鸡收集样品

在接种、激发和安乐死之前，从所有的雏鸡收集血液样品。然后收获血清，并通过RSA进行检验来确定抗支原体抗体浓度的水平。在免疫之前、激发时和死后检查时还测量每只鸟的体重。在第28天时(激发14天后)，对雏鸡实施安乐死并进行死后检查，采集样品用于培养鸡败血支原体。视觉评价6处气囊的损伤，并按上述0-3进行评分。从鸟的气囊和气管采集拭样，并划线培养在未添加庆大霉素的MA上，然后转移至不含庆大霉素的MB中，以分离鸡败血支原体。将MA平板于37℃孵育10天，并于37℃孵育MB培养物，直到观察到色变。通过离心从显示出色变的肉汤沉淀有机体，并进行PCR扩增以鉴定ST突变体26-1和野生型Ap3AS(上文)。收集每只鸟气管的上部、中部和下部区域的样品，并在10％中性缓冲的福尔马林中固定至少24小时。加工和染色之后，通过光学显微镜检查切片。如上述在0-3的级别上对损伤严重度进行评分。在每个气管区域的6个不同的点处测量粘膜厚度，然后计算出三个区域中每一区域的平均厚度。

鸡败血支原体的重新分离

用对ST突变体26-1特异的PCR引物对(IGstmGenmeF3和扩增特有标签区的STM26-Rev)和P2/P4引物组来证实ST突变体26-1的重新分离。引物对STM26-基因组和STM26-Rev与ST突变体26-1中的转座子插入位点的两端结合，用来证实野生型Ap3AS的重新分离。该PCR能轻易地将Ap3AS亲本菌株和ST突变体26-1(表2)区别开来。在20μl反应中利用2μl提取的DNA作为模板进行PCR，该20μl反应含有2μl10×反应缓冲液、1μM的每种引物、200μM的每种dNTP和1.5U的TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR于95℃孵育2分钟，随后于94℃45秒、52℃45秒和72℃1分钟进行35个循环，最后于72℃孵育7分钟。将得到的产物与DNA分子量标志物一起在2％的琼脂糖凝胶中分离。

统计学分析

利用单因素ANOVA和斯氏t-检验(Windows的Minitabsv14.2)来分析每组平均百分比体重增益的差异。利用Mann-WhitneyU检验来比较气管损伤评分的中位数。利用斯氏t-检验和单因素ANOVA来比较上部、中部和下部气管中的平均粘膜厚度。P值≤0.05被认为是显著的。

结果

总损伤

仅在阳性对照组(组2)的鸟中观察到总气囊损伤。在该组中，5只鸟有气囊损伤，总气囊损伤评分范围为0.5-2.5。结果总结在表10中并通过图表显示在图7中。

表10.在免疫保护研究中，所有组的RSA检验、气囊损伤评分和鸡败血支原体的重新分离的结果

^*野生型Ap3AS

#全部RSA和气囊损伤评分数据显示在附录G中。

^在MA平板上表现为鸡败血支原体集落生长的样品数/所收集的样品总数。

&进行PCR来确定ST突变体26-1和菌株Ap3AS的存在。

血清学检验和鸡败血支原体的重新分离

从接种和激发时的鸟收集的血清不含可检测到的抗支原体的抗体。在死后检查时，阴性对照组(组1)的雏鸡中没有一只具有任何可检测到的抗鸡败血支原体的血清抗体。相反，其它3组中有大部分的鸟在死后检查时具有可检测到的抗鸡败血支原体的抗体。阳性对照组(组2)中的每只鸟都产生抗鸡败血支原体的中到强的RSA抗体应答。在组3的16/20的血清样品中检测到抗支原体的抗体，RSA评分范围为从低到高。在组4(用ST突变体26-1接种并用野生型菌株感染)的所有鸟中均检测到中等抗支原体的抗体滴度。结果总结在表10中。与组2、3和4中的气囊拭样相比，鸡败血支原体更频繁地从组2、3和4中的气管拭样中分离到，并且未从从组1(阴性对照)的任何鸟的气囊或气管中分离到。从组2(只激发)和3(只接种)中每一只鸟的气囊拭样使Mg集落生长，而分别在两组的19只和2只鸟的气管实现重新分离。在给予ST突变体26-1作为疫苗，然后用菌株Ap3AS感染的组4中，在1只鸟的气囊和7只鸟的气管的MA平板上回收到Mg(表10)。同以前的实验一样，MB中的重新分离率高于MA平板。PCR扩增证实，只有从组2和3重新分离的支原体是给予该组的菌株。利用菌株特异性引物对进行PCR扩增之后，只有从组4重新分离的支原体是野生型Ap3AS。结果显示在表10中。

雏鸡的体重增益

在接种14天后的任何组之间的体重增益上没有显著差异。第4周时(激发14天后)，阳性对照鸟(组2)的平均体重增益低于组1(阴性对照)或3中的鸟(接种对照)(分别为P＝0.006和0.027)，但是不低于组4中的鸟(经免疫和激发)(P＝0.332)(表11)。在激发和死后检查之间的时间段内(第14天到第28天)，组2(只激发)中雏鸡的体重增益显著低于其它组中每一只鸟的体重增益。组3中鸟(接种，未激发)的平均体重增益不大于阴性对照的体重增益，但是显著大于组4中鸟(经免疫和激发)的平均体重增益(P＝0.016)。然而，组4中鸟的平均体重增益没有显著不同于组1中鸟的平均体重增益(P＝0.580)。结果显示在表11中。

气管损伤和粘膜厚度

气管损伤评分的中位数显示在表12中。组2中的鸟为重度损伤(只激发)。组2中鸟(阳性对照)的气管损伤评分的中位数显著不同于其它三组的气管损伤评分的中位数(P＜0.0001)。其它组中鸟的损伤评分彼此没有显著差异。组2中鸟(只激发)的上部、中部和下部气管的平均粘膜厚度显著大于其它三组中鸟的平均粘膜厚度(P＜0.0001)，但是这些其它三组中鸟的平均粘膜厚度间没有显著差异(表12)。然而，组4中鸟的中部和下部气管的平均粘膜厚度小于组1(P＝0.028)或3中鸟(P＝0.036)的中部和下部气管的平均粘膜厚度。

表11.在免疫保护研究中所有实验组中雏鸡的体重增益

将结果表示成平均值±标准偏差。

在同一栏中具有相同上标的数据没有显著差异。

全部数据显示在附录H中

表12.免疫保护研究中鸟的气管损伤评分和粘膜厚度

^*野生型菌株Ap3AS

#SD：标准偏差

在同一栏中具有相同上标的数据没有显著差异。

全部数据显示在附录I中。

实施例5：禽病原性大肠杆菌菌株E956(APECE956)中dppD和oppD寡肽转运基因的敲除突变体

体内安全性研究表明，与dppD敲除体或亲本E956相比，就鸟的损伤评分和重新分离率而言，oppD敲除体在统计学上显著减毒了。体内效力研究表明，在用APECE956激发后，接种oppD敲除体的鸟在统计学上受到显著的保护。

实施例1和2说明了包括dppD和oppD基因在内的许多减毒基因突变，所述dppD和oppD基因与参与将寡肽转运进细胞中的其它细菌基因同源。

由于所有的细菌均具有几乎相同的转运系统，因此可以通过产生dppD敲除体来开发出抗其它禽病原体以及其它动物病原体的新的疫苗。

本实施例示例了禽病原性大肠杆菌菌株E956(APECE956)中dppD和oppD基因的敲除。利用激发系统检验每种突变体的安全性和效力。

方法

大肠杆菌菌株、培养基和质粒

禽病原性大肠杆菌菌株E956(APECE956)最初从肉种鸡场(broilerbreederfarm)的1天龄雏鸡分离得到，并且发现对抗生素氨苄青霉素、磺胺异恶唑、三甲氧苄二氨嘧啶、氯霉素、四环素和卡那霉素敏感。除非另有说明，使有机体在具有合适的抗生素选择(50μg/ml的氨苄青霉素；100μg/ml的卡那霉素)的Luria-Bertani肉汤(LB)中或LB琼脂上于30℃或37℃过夜增殖，。将大肠杆菌DH5α菌株用于标准克隆和质粒产生。

利用携带氨苄青霉素抗性基因、分别编码Gam、Bet和Exo的三个“Red系统”基因γ、λ和exo的温度敏感型pKD46质粒，用Red重组酶系统来促进敲除构建体和基因敲除靶标之间的同源重组。通过PCR组装敲除构建体，并连进pGEM-T载体(Promega)。含有每种构建体的质粒用作PCR的模板，以产生线性DNA用于转化。

基因敲除构建体的制备

利用寡核苷酸引物TXkanFor和TYkanRev(表13)从转座子TnphoA扩增卡那霉素基因。利用UltraCleanPCR纯化试剂盒(MoBio，CaliforniaUSA)按照生产商的说明书来纯化得到的1.064kbp的PCR产物，并按照生产商的方案连进pGEM-T载体(Promega)。利用设置为2,500V、200Ω、250μF的GenePulser(BioRad)通过电穿孔用连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并在含有25μg/ml卡那霉素的LB琼脂上选择重组体。使转化体在含有25μg/ml卡那霉素的LB肉汤中过夜生长，并用试剂盒(Promega)按照生产商的说明书提取质粒。通过限制性内切核酸酶分析来证实卡那霉素抗性基因的克隆。线性DNA用来转化：对于敲除dppD，利用引物对WE和WF通过PCR制备DNA，该引物对的每条均含有分别与GenBank登录号L08399的dppD基因中的区域4384-4423bp和4829-4868bp互补的40bp的5′区。WE和WF寡核苷酸引物含有与卡那霉素基因互补的20bp的3′区，当在PCR中使用时，扩增出的卡那霉素基因具有与dppDDNA互补的40bp的末端。

表13.本研究中用到的寡核苷酸

基因敲除体的产生

利用在2,500V、200Ω、250μF处设置的Bio-RadGenePulser(Bio-Rad)用pKD46通过电穿孔转化APEC菌株E956。于30℃过夜孵育后，在含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani琼脂上选择重组体。我们利用已知方法通过同源重组产生基因敲除体。将APECE956/pKD46的单个新鲜的集落置于含100μg/ml氨苄青霉素的5mlLB中，并于30℃震荡(200rpm)孵育16小时。第二天，将过夜培养物1∶50稀释于含100μg/ml氨苄青霉素的20mlLB中，并将该培养物于30℃在125ml圆锥烧瓶中震荡(200rpm)。在10⁷细胞/ml的浓度时，添加L阿拉伯糖(Sigma)至1mM的终浓度。于30℃诱导培养物约1小时，然后将细胞于42℃热激15分钟，并立即转移到冰水浴中持续10分钟，然后通过在于4℃、10,000×g下离心10分钟来收集。将该细胞重悬浮于含20％甘油的1ml冰冷的1mMMOPS中，转移到1.5ml的离心管中，并在台式离心机中在于4℃、16,000×g下离心30秒。弃掉上清液，并将细胞重悬浮于含20％甘油的1ml的1mMMOPS中，并按上述进行离心。再重复该步骤一次，并将该细胞最终重悬浮于含20％甘油的100μl的1mMMOPS中。将该细胞添加进预冷的电穿孔杯(2mm间隙，Bio-Rad)种，利用以前的设置用300ngDpnI消化的DNA转化50μl细胞。电穿孔后，立即通过细胞悬浮在0.3ml的LB中回收，稀释进2.7mlLB中，并于37℃震荡孵育1.5小时。将该培养物5倍浓缩在LB中，并将0.2ml接种到含20μg/ml卡那霉素的LB平板上，且于37℃过夜孵育。挑选转化体，并使其于含40μg/ml卡那霉素的LB中生长，通过PCR和Southern印迹来证实基因敲除体。

dppD和oppD基因敲除菌株的证实

为了证明卡那霉素抗性基因插入dppD或oppD中，利用dppD(TZIUA)和oppD(WSIWT)的引物对进行PCR，以扩增各自的基因区。对于APECE956亲本，dppD和oppD的PCR产物的预期大小分别为0.89kbp和0.951kbp。卡那霉素基因(1.064kbp)的插入，对于dppD和oppD而言，预期的大小增加分别为1.774kbp和1.924kbp。

基因组DNA提取和Southern印迹

按之前的描述(Sambrooketal.，2001)，利用酚/氯仿制备APECE956、ΔdppD和ΔoppD菌株的基因组DNA。用PstI消化来自大肠杆菌菌株的基因组DNA，并将片段与分子量标志物一起通过琼脂糖凝胶电泳分离。琼脂糖凝胶电泳之后，通过毛细管转移将基因组DNA片段从凝胶转移到尼龙膜(Hybond-N⁺，GEHealthcare)上。利用随机引物DNA标记试剂盒(Roche)用[γ³²P]dATP标记DNA探针。于54℃在Church缓冲液(0.5MNa₂HPO₄[pH7.4]、7％十二烷基硫酸钠、1mMEDTA、1％牛血清白蛋白BSA)(Church&Gilbert，1984)中过夜进行预杂交和杂交。将膜于54℃在2×SSC(1×SSC是0.15MNaCl加0.015M柠檬酸钠)-0.1％十二烷基硫酸钠中洗涤两次，每次5分钟，然后于65℃在0.5×SSC、0.1％SDS中洗涤一次，持续15分钟，并用KodakBioMaxMS胶片于-70℃进行放射自显影。

APECE956dppD和oppD敲除体的安全性

用APECE956ΔdppD和ΔoppD菌株感染一天龄的雏鸡，进而与未感染和经APECE956感染的雏鸡相比来评价每种突变体的病原性。购买总共95只一天龄的雏鸡(SPAFAS，WoodendVic)，并分成4组，其中3组为每组20只，1组为35只。将鸟圈养在正压隔离装置中，并随意喂食照射过的商用雏鸡全料(starterfeed)。从两只雏鸡一组一只采集泄殖腔拭样，划线接种于MacConkey琼脂上，以评价共生的大肠杆菌。在具有40μg/ml卡那霉素的营养培养液中制备E956ΔdppD、ΔoppD的过夜培养物以及制备无卡那霉素的E956过夜培养物，产生1E+10集落形成单位/ml(cfu/ml)的浓度，用10倍于正常免疫剂量的商用传染性支气管炎病毒疫苗VicS(Websters，Australia)通过滴眼剂接种所有的组。组2和3的20只雏鸡中的每只接受分别含1E+10cfu/ml的ΔdppD和ΔoppD的20ml气雾剂，而组4的35只鸟接受20ml的1E+10cfu/mlE956。组1中的雏鸡保持不处理，并充当阴性对照。在3天龄和5天龄时，将组2、3和4的雏鸡再分两次暴露于相同的APEC菌株。在10天龄时，对所有的鸟进行死后检查。通过总病症评价疾病，按照之前的标准对气囊损伤进行评分。拭样采自左和右后部气囊和左和右前部气囊、气管和无菌的肝。将该拭样接种到含和不含卡那霉素(40μg/ml)的MacConkey琼脂上，并于37℃过夜孵育。第二天，观察平板“砖红色”集落的存在(典型的大肠杆菌表型)，对它们的数量进行计数并记录。如果集落数少于30个，则进行PCR以鉴定大肠杆菌菌株。用以下引物对鉴定APEC菌株：对于dppD为WA/UA、对于oppD为WA/WT、对于E956为扩增存在于pVM01上的iucA基因的Sidfwdseq/bwdsiderophore(表13)，对于共生大肠杆菌，用16Sfwd/16Srev扩增16srDNA。

APECdppD和oppD敲除体的效力

为了评价大肠杆菌疫苗候选者的效力，将60只一天龄的鸟分成3组，每组20只鸟。第1天时，按上述用E956ΔdppD、ΔoppD对组2和3进行气雾剂接种，而组1保持不接种作为对照，并按上述分别圈养在隔离装置中。在接种后12天时，用含有1E+10cfu/mlAPECE956的20ml气雾剂按上述分别激发所有的组，并将它们重新放回其隔离装置中。4天后，通过吸入氟烷对所有的鸟实施安乐死，并进行死后检查。按上述评价气囊损伤评分，并将用于重新分离感染有机体而采集的拭样培养在含和不含卡那霉素(40μg/ml)的MacConkey琼脂上。

结果分析

对气囊损伤评分的比率和程度、有机体的分离率和鸟的体重增益进行统计学分析。所用的检验，对于重新分离率而言为Fisher精确检验(Fisher′sExactTest)，对于于损伤评分和体重变化而言，是Mann-WhitneyU检验。

结果

APECE956ΔdppD和ΔoppD的发展和证实

通过PCR产生的用于特定基因敲除的线性DNA构建体用来转化APECE956/pKD46。在含有40μg/ml卡那霉素的LB琼脂上选择转化体，然后进行PCR以证实克隆携带卡那霉素基因。利用寡核苷酸引物对TZ/UA的E956ΔdppD的扩增子的大小预计为1.774kbp，这是由于与E956亲本菌株(0.89kbp)相比，卡那霉素DNA(1.064kbp)的插入造成的，分别如图8A和图9A面的泳道1和2。同样，利用寡核苷酸引物对WS/WT的E956ΔoppD的扩增子的大小接近预期大小1.924kbp，E956亲本菌株产生0.951kbp的扩增子，分别如图8B和图9B面的泳道1和2。

用PstI限制性酶消化APEC菌株E956、ΔdppD和ΔoppD的基因组DNA，选择该酶是因为卡那霉素抗性基因在基因中部有单个PstI位点。dppD和oppD放射性标记的探针检测APECE956、ΔdppD和ΔoppD菌株中的条带(图10)。dppD探针与E956和ΔoppD菌株中相似大小的片段结合(图10，泳道1和3)，但是与分子量略小一点的条带和另一个2kbp的条带结合。oppD探针与E956和ΔdppD菌株中相似大小的片段结合(图10，泳道1和2)，并且与ΔdppD中9.8和7kbp的条带结合(图10，泳道3)。卡那霉素基因探针不与E956结合，但是结合的条带与dppD和oppD探针在ΔdppD和ΔoppD菌株中所结合的条带相同(图10，泳道1和2)。

利用E956ΔdppD和ΔoppD菌株进行毒力研究

在死后检查时，检查雏鸡的大肠杆菌病体征，检查6处气囊损伤并从每只鸟的左和右前部气囊、气管和肝采集样品拭样用于疫苗、亲本或共生有机体的重新分离。将该拭子接种于含或未不含卡那霉素的MacConkey琼脂上。

下文讨论了这些研究的结果，并总结在表14、16和19中，同时组中每一组间所作的统计学比较总结在表15、17、18、20和21中。

表14.在病原性和效力实验中雏鸡的体重增益

^病原性实验.^*效力实验.在同一栏中具有相同上标的数据没有显著差异(P≥0.05，斯氏双尾t检验(Student’sT-Test2-tailed))

表15.对表14的体重增益进行统计学分析的概率(P)值

鸟的体重增益

在病原学实验中，E956(143％)、ΔdppD(143％)和未接种的雏鸡(174％)的体重增益百分比之间差异接近显著，同时观察到ΔoppD(155％)与未接种的鸟的体重百增益分比没有显著差异(表14和15)。在效力实验中，在激发之前或死后检查时，任何鸟组的体重增益百分比在统计学上均没有显著差异(表14和15)。

MacConkey琼脂上有机体的重新分离率

在病原学实验中，从对照和ΔoppD接种的鸟的气囊或气管重新分离的有机体的中位数之间没有显著性差异(表16)。从用E956或ΔdppD接种的那些鸟分离的有机体数高于从未接种的鸟分离的有机体数(表16)。效力实验的结果(表19)表明，在E956激发的鸟和ΔoppD接种的鸟之间没有差异。在用ΔdppD或ΔoppD接种的鸟中，从气管与气囊所进行的分离率没有显著性差异，但是观察到在用E956接种的鸟中，与气囊相比，从气管分离的有机体显著增加(P＜0.05)。

气囊损伤率

死后检查时对气囊和器官的检查表明，观察到某些鸟的大肠杆菌病病症伴随肝周炎和心包炎。在病原学实验中，在用ΔdppD或ΔoppD接种的鸟间，气囊的损伤率和损伤评分在统计学上均没有显著差异，观察到ΔoppD和E956之间有较小的损伤，但是在ΔdppD和E956接种的鸟间没有统计学差异(表16和18)。在保护实验中，对ΔoppD接种的鸟和E956激发的鸟的损伤率和评分的比较表明，之前用ΔoppD接种在统计学上具有显著的保护性效应，对于接种组，损伤率的中位数为0.0，对于未接种的组和激发的组，损伤率的中位数为1.25(表19和21)。

Claims

1.通过ABC-肽转运蛋白突变而被减毒的细菌在制备用于预防或改善个体疾病的疫苗组合物或免疫原性组合物中的用途，其中：

所述突变使得编码的ABC-肽转运蛋白没有功能，

所述减毒细菌能在个体中维持，并且

所述ABC-肽转运蛋白是OppD。

2.通过至少一种ABC-肽转运蛋白基因的突变而被减毒的细菌在制备用于治疗或预防个体疾病的疫苗组合物或免疫原性组合物中的用途，其中：

所述突变使得编码的ABC-肽转运蛋白没有功能，

所述减毒细菌能在个体中维持，并且

所述ABC-肽转运蛋白是OppD。

3.疫苗组合物，包含免疫原性有效量的通过至少一种ABC-肽转运蛋白基因的突变而被减毒的细菌和药理学上可接受的载体，其中：

所述突变使得编码的ABC-肽转运蛋白没有功能，

所述减毒细菌能在个体中维持，并且

所述ABC-肽转运蛋白是OppD。

4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物还包含至少一种药学上可接受的载体或稀释剂，所述药学上可接受的载体或稀释剂选自水、盐水、培养液、稳定剂、碳水化合物、蛋白质、含蛋白质的试剂、缓冲液和以上的任意组合。

5.如权利要求4所述的疫苗组合物，其中所述稳定剂包括SPGA。

6.如权利要求4所述的疫苗组合物，其中所述碳水化合物选自山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖和以上的组合。

7.如权利要求4所述的疫苗组合物，其中所述蛋白质是白蛋白或酪蛋白。

8.如权利要求4所述的疫苗组合物，其中所述含蛋白质的试剂是牛血清或脱脂乳。

9.如权利要求4所述的疫苗组合物，其中所述缓冲液选自马来酸盐、磷酸盐、CABS、哌啶、甘氨酸、柠檬酸盐、苹果酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、丙酸盐、哌嗪、嘧啶、甲次砷酸盐、琥珀酸盐、MES、组氨酸、双-tris、磷酸盐、乙醇胺、ADA、碳酸盐、ACES、PIPES、咪唑、双三羟基甲氨基丙烷、BES、MOPS、HEPES、TES、MOPSO、MOBS、DIPSO、TAPSO、TEA、焦磷酸盐、HEPPSO、POPSO、三羟甲基甲基甘氨酸、肼、双甘氨肽、TRIS、EPPS、二(羟乙基)甘氨酸、HEPBS、TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、牛磺酸、硼酸盐、CHES、氢氧化铵、CAPSO、甲胺、CAPS和以上的任意组合。

10.如权利要求3所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是低压冻干的或冷冻干燥的。

11.如权利要求3所述的疫苗组合物，还包含至少一种佐剂。

12.如权利要求11所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、维生素E、非离子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油、卡波姆氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、油乳剂皂苷、维生素-E增溶剂或以上的任意组合。

13.如权利要求11所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是大肠杆菌不耐热毒素或霍乱毒素。

14.如权利要求3-13中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物经配制用于经鼻内给药、眼科给药、皮内给药、腹膜内给药、静脉内给药、皮下给药、口服给药、泄殖腔给药、气雾剂或肌内给药。

15.如权利要求14所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物经配制用于喷雾接种。

16.如权利要求3-13中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物经配制用于经翼网或滴眼剂给药。

17.如权利要求3-13中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物每剂量包含10³-10⁵个减毒细菌、或者10⁵-10⁷个减毒细菌、或者10⁷-10⁹个减毒细菌、或者10⁹-10¹¹个减毒细菌、或者10¹¹-10¹³个减毒细菌、或者10¹³-10¹⁵个减毒细菌、或者10¹⁵-10¹⁷个减毒细菌、或者10¹⁷-10¹⁹、或者10¹⁹个减毒细菌。