WO2013091040A2

WO2013091040A2 - Cepa atenuada de brucella ovis, composição vacinal e uso

Info

Publication number: WO2013091040A2
Application number: PCT/BR2011/000514
Authority: WO
Inventors: Renato de Lima SANTOS; Teane Milagres Augusto da Silva SILVA; Tatiana Alves da PAIXÃO; Renee Mary TSOLIS
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais - Ufmg
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2011-12-23
Publication date: 2013-06-27
Also published as: WO2013091040A3

Abstract

A presente invenção descreve uma cepa atenuada de Brucella ovis, caracterizada por compreender uma mutação do gene que codifica para o transportador ABC (TMS3) e seu uso como vacina viva contra brucelose. Mais especificamente, a presente invenção trata da construção, por mutagênese dirigida, de uma cepa mutante de Brucella ovis (TMS3), através da deleção de duas ORFs (open reading frames), BOVA0500 e BOVA0501 (GenBank), que codificam para proteínas que compõem um sistema transportador do tipo ABC.

Description

"CEPA ATENUADA DE BRUCELLA OVIS, COMPOSIÇÃO VACINAL e USO"

A Brucella ovis é considerada uma das principais causas de infertilidade em ovinos, com ampla distribuição mundial. A doença é caracterizada por epididimite, orquite e infertilidade em carneiros e, ocasionalmente, aborto em ovelhas, o que resulta em significativa perda económica para a ovinocultura, devido a problemas reprodutivos e descarte precoce dos animais. A infecção por B. ovis pode atingir até 46% dos rebanhos ovinos em regiões de criação intensiva (BURGUESS, G.W. Ovine contagious epididymitis: a review. Vet. Microbiol., v.7, p.551-575, 1982; BLASCO, J.M. Brucella ov/s. In: NIELSEN, K., DUNCAN, J.R. (Eds), Animal Brucellosis. CRC Press, Boca Raton, FL,p.351- 378, 1990; CARPENTER, T.E.; BERRY, S.L.; GLENN, J.S. Economics of Brucella ovis control in sheep: computerized decision-tree analysis. J. Am. Vet. Med. Assoe, v.190, n.8, p.983-987, 1987; SERGEANT, E.S.G. Seroprevalence of Brucella ovis infection in commercial RAM flocks in the Tamworth area. New Zealand Vet. J., v.42, p.97-100, 1994.).

No Brasil, os dados epidemiológicos ainda são incompletos, mas foram descritas prevalências de rebanhos positivos de 8,59% e 29,4% em propriedades dos estados da Paraíba e de Minas Gerais, respectivamente (CLEMENTINO, I.J.; ALVES, C.J.; AZEVEDO, S.S.; et al. Inquérito soroepidemiológico e fatores de risco associados a infecção por Brucella ovis em carneiros deslanados do semi-árido da Paraíba. Pesq. Vet. Bras. v.27, n.4, p.137-143, 2007; MARQUES, A.P.R. Caracterização soroepidemiológica da infecção por vírus Maedi-Visna e Brucella ovis em ovinos no estado de Minas Gerais. Belo Horizonte: Escola de Veterinária da UFMG, 2006; Dissertação de Mestrado). Contudo, ainda faltam métodos eficientes para o diagnóstico e prevenção da infecção por B. ovis no País. A proibição de vacinas produzidas a partir de Brucella melitensis, considerada exótica no Brasil, e a ausência de amostras vacinais eficazes e seguras têm sido um grande entrave para o amplo controle da doença nos rebanhos ovinos brasileiros.

Recentemente, a amostra de referência B. ovis ATCC25840 (também conhecida como 63/290 ou NCTC10512), isolada originalmente na Austrália, foi submetida ao sequenciamento completo do genoma, o que resultou na identificação do cromossomo I, com 2,1 Mb (Genbank, NC_009505), e do cromossomo II, com 1 ,1 Mb (Genbank, NC_009504). A análise genômica de B. ovis permitiu estudos comparativos com as espécies patogênicas de Brucella previamente sequenciadas, incluindo B. melitensis, B. suis e as cepas 9-941 e 2308 de B. abortus, o que confirmou a elevada conservação genômica do género Brucella. Além disso, com o sequenciamento completo do genoma da B. ovis, foi identificada uma ilha no cromossomo II com 28 ORFs (open reading frames) exclusivas desta espécie, não sendo encontradas em outras espécies clássicas de Brucella (DELVECCHIO, V.G.; KAPATRAL, V.; REDKAR, R.J.; et al. The genome sequence of the facultative intracellular pathogen Brucella melitensis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, v.99, p.443-^48, 2002; PAULSEN, I.; SESHADRI, R.; NELSON, K.; et al. The Brucella suis genome reveals fundamental similarities between animal and plant pathogens and symbionts. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, v.99, p.13148-13153, 2002; HALLING, S.M.; PETERSON-BURCH, B.D.; BRICKER, B.J.; et al. Completion of the genome sequence of Brucella abortus and comparison to the highly similar genomes of Brucella melitensis and Brucella suis. J. Bacteriol., v.187, p.2715-2726, 2005; CHAIN, P.S.; COMERCI, D. J.; TOLMASKY, M.E.; et al. Whole-genome analyses of speciation events in pathogenic Brucellae. Infect. Immun., v.73, p.8353-8361 , 2005; TSOLIS, R.M.; SECHADRI, R.; SANTOS, R.L.; et al. Genome degradation in Brucella ovis corresponde with narrowing of its host 63 range and tissue tropism. PIoS One, v.4, n.5, p.1-9. 2009.). Estas ORFs específicas de B. ovis podem, presuntivamente, codificar proteínas que, possivelmente estão envolvidas em mecanismos patogênicos da bactéria e que são determinantes para a sua sobrevivência no hospedeiro. O papel de proteínas transportadoras do sistema ABC em espécies clássicas de Brucella spp tem sido avaliado em camundongos. Com o completo sequenciamento genômico de B. ovis, foi identificada uma ilha no cromossomo II que possivelmente codifica fatores patogênicos específicos de B. ovis, inclusive um transportador do sistema ABC (KO, J.; SPLITTER, GA Molecular Host- Pathogen Interaction in Brucellosis: Current Understanding and Future Approaches to Vaccine Development for Mice and Humans. Clin. Microbiol. Review, v.16, p.65-78, 2003; ROSINHA, G.M.S.; FREITAS, D.A.; MIYOSHI, A.; et al. Identification and characterization of a Brucella abortus ATPbinding cassette transporter homolog to Rhizobium meliloti ExsA and its role in virulence and protection in mice. Infect. Immun. v.70, p.5036-5044, 2002; DANESE, I.; HAINE, V.; DELRUE R.M.; et al. The Ton system, an ABC transporter, and a universally conserved GTPase are involved in iron utilization by Brucella melitensis 16M. Infect. Immun., v.72, n.10, p.5783-5790, 2004; TSOLIS, R.M.; SECHADRI, R.; SANTOS, R.L.; et al. Genome degradation in Brucella ovis corresponde with narrowing of its host 63 range and tissue tropism. PIoS One, v.4, n.5, p.1-9. 2009).

Na B. ovis, a deleção de dois ORFs (BOVA0500 e BOVA0501 , Genbank, Seq ID N°10) que codificam o ABC transportador resultou na atenuação da amostra mutante no baço e fígado de camundongos machos a partir de 1 dia após a infecção, o que sugere um papel importante para o sistema ABC na patogênese de B. ovis e no estabelecimento da infecção em modelo murino. O sistema ABC é responsável pelo transporte transmembrana ativo de aminoácidos, íons, peptídeos, entre outros, sendo que a maioria dos transportadores ABC codificados pela Brucella spp estão envolvidos na importação desses substratos para o interior da bactéria (TAM, R., SAIER JR, M.H. Structural, functional, and evolutionary relationships among extracellular solute-binding receptors of bactéria. Microbiol. Rev., v.57, p.320-346, 1993; JENNER, D.C.; DASSA, E.; WHATMORE, A.M.; et al. ATP-Binding Cassette Systems of Brucella. Comp. Funct. Genomics, v. 2009, p.1-16, 2009).

A recente classificação dos sistemas ABC da Brucella spp e o sequenciamento de B. ovis permitiu identificar o ABC transportador avaliado neste estudo como uma proteína supostamente envolvida na importação de dipeptídeos na B. ovis (TSOLIS, R.M.; SECHADRI, R.; SANTOS, R.L.; et al. Genome degradation in Brucella ovis corresponds with narrowing of its host 63 range and tissue tropism. PIoS One, v.4, n.5, p.1-9. 2009). Interessantemente, foi observada pseudogenese na deleção de genes na B. ovis em regiões que potencialmente codificam outros sistemas ABC para o transporte de peptídeos nas demais espécies clássicas de Brucella spp. Isto justifica o papel patogenico específico do ABC transportador na B. ovis, uma vez que nesta espécie, provavelmente, não há vias alternativas para a importação de peptídeos, o que resulta na perda completa da virulência de B. ovis, com a deleção de uma única proteína transportadora. Este estudo evidenciou que a proteína ABC transportadora é um importante fator patogênico da B. ovis, sendo essencial para a sobrevivência in vivo e infecção persistente do patógeno no modelo murino.

O estudo através de mutagênese de determinadas ORFs da ilha no cromossomo II de Brucella ovis identificou genes espécie-específicos que desempenham papel na patogênese da infecção por Brucella ovis e que favorece a criação de novas cepas vacinais para o controle eficiente da infecção nos ovinos.

Algumas patentes descrevem o uso de bactérias do género Brucella atenuadas em composições vacinais:

O documento WO0077213 A2- Avirulent Brucella and Use Thereof- descreve um novo método de atenuar bactérias e o uso destas como vacina. A atenuação se dá pela mutação do gene bac A. O documento ainda descreve métodos de importar compostos para dentro das células por transporte mediado pela proteína Bac A e métodos de identificar ligantes da mesma.

O documento WO9937783- Live Vaccine Against Brucellosis- descreve uma vacina viva de Brucella e o método de preparar a mesma para conferir proteção contra brucelose. A vacina é preparada através de uma deleção no gene ríbil em uma cepa de Brucella. Essa deleção resulta na atenuação da cepa, retendo sua imunogenicidade e permitindo desenvolver uma resposta imunogênica.

O documento WO2010094064 A1- Live Attenuated Vaccines- descreve uma bactéria atenuada pela mutação de pelo menos um gene transportador ABC, o que gera uma proteína não funcional, permitindo que a bactéria seja mantida em um indivíduo. Neste documento, o gene transportador ABC- peptídeo é selecionado de um grupo consistindo dos gens CvaB, CylB, SpaB, NisT, EpiT, ComA, PedD, LcnC, McbEF, OppD e DppD e análogos deles.

DECRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1 : A Figura 1 mostra os resultados da colonização bacteriana de amostra virulenta de referência (ATCC 25840) e amostras mutantes de B. ovis no baço (A) e no fígado (B) de camundongos BALB/c a 1 , 7, 30 e 90 dpi. Grupos de camundongos (n=4) foram inoculados com 1x10⁶ UFC/animal de Ahemaglutinina, AvirB2, AABC transportador ou da amostra de referência de B. ovis. A diferença significativa entre a amostra parental e as amostras mutantes está indicada por asterisco (^*p<0,001). A diferença significativa (p<0,05) entre os tempos avaliados dentro de uma mesma amostra mutante está indicada por letras distintas (letra maiúscula-WT; letra minúscula-Ahemaglutinina; letra maiúscula itálica- AvirB2; letra minúscula itálica-AABC transportador). A linha horizontal indica o limite de detecção de UFC em cada órgão.

Figura 2: A Figura 2 mostra os resultados do teste de sobrevivência de camundongos machos IRF-1-/- infectados com a amostra mutante AABC transportador ou a cepa selvagem (WT) de Brucella ovis. Grupos de camundongos (n=5) foram inoculados com 2,3x106 UFC/animal de mutante AABC transportador ou amostra de referência de B. ovis (ATCC 25840) e monitorados diariamente até 21 dpi. Os camundongos IRF-1-/- infectados com AABC transportador apresentaram maior porcentagem de sobrevivência, quando comparados aos camundongos infectados com a cepa selvagem (WT) de B. ovis (p=0,0079). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve uma cepa atenuada de Brucella ovis, caracterizada por compreender uma mutação de genes que codifica para o transportador ABC e seu uso como vacina viva contra brucelose em ovinos. Mais especificamente, a presente invenção trata da construção, por mutagênese dirigida, de uma cepa mutante de Brucella ovis (TMS3) através da deleção de duas ORFs (open reading frame), BOVA0500 e BOVA0501 (GenBank, Seq ID N°10), que codificam para proteínas que compõem um sistema transportador do tipo ABC. Estas ORFs estão localizadas em uma ilha genética específica para a espécie de Brucella ovis, que causa doença em ovinos, quando comparada a outras espécies clássicas de Brucella, que infectam animais domésticos. A TMS3 mostrou-se atenuada em camundongos in vivo, indicando um potencial para ser uma amostra vacinai contra infecção por Brucella ovis, ainda não descrita.

A composição vacinai poderá apresentar como excipientes preferencialmente água, solução salina, solução tampão, solução de dextrose, soluções de açúcares, solução de polietileno glicol, um óleo, etiloleato, triglicerídeo, carboximetilcelulose, sorbitol, dextrana, timerosal, m-or o-cresol, formalina, álcool benzílico e/ou albumina.

A invenção será melhor compreendida, de forma não limitante, através dos seguintes exemplos:

Exemplo 1- Mutagênese da amostra mutante TMS3

Para a geração do mutante AABC transportador (TMS3), os fragmentos anterior (961 pb, Seq ID N° 1) e posterior (981 pb, Seq ID N° 2) a duas ORFs BOVA0500 e BOVA0501 (Seq ID N°10) de B. ovis foram amplificados por PCR, utilizando os pares de iniciadores BOVA0500FW (Seq ID N° 3), BOVA0500RV (Seq ID N° 4), BOVA0501 FW (Seq ID N° 5) e BOVA0501 RV (Seq ID N° 6). Cada produto foi clonado no plasmídeo pCR2.1 TOPO-TA. O fragmento anterior foi cortado do TOPO-TA utilizando as enzimas Xba\ e Hind\\\ e clonado no pBluescript KS. O fragmento posterior foi cortado através de dupla digestão com Hind\\\ e Xhol e inserido no mesmo vetor. Posteriormente, o cassete de canamicina KIXX foi cortado do pUC-KIXX com a enzima Hindlll e inserido no pBluescript KS, entre os fragmentos anterior e posterior. O plasmídeo final, com a deleção de dois genes que codificam a proteína ABC transportadora e substituição pelo cassete de canamicina, foi denominado pB04 (Seq ID N° 7). A sequência e direção 5'- 3' correta do inserto dos plasmídeos gerados, pB04 e pB06, foram confirmados por sequenciamento. Para a mutagênese de B. ovis, cada plasmídeo foi extraído de E. coli utilizando o kit de extração Midi- prep (Plasmid Midi Kit, QIAGEN, EUA) e inserido em B. ovis por eletroporação.

A eletroporação de B. ovis foi realizada com adaptação do protocolo descrito por Tatum et al. (1992). Inicialmente, para tornar B. ovis ATCC25840 eletrocompetente, a amostra foi plaqueada em meio TSA com 10% de hemoglobina e mantida por 48 horas em estufa a 37° C e 5% de CO₂. As placas foram raspadas, a amostra foi suspensa em 40 ml meio líquido TSB (Trypticase Soy Broth) e dividida em dois tubos falcons de 50 ml, que foram mantidos no gelo. Após centrifugação a 4.000 x g por 20 minutos em centrífuga refrigerada a 4°C, o sobrenadante foi descartado e cada "pellet" de bactéria foi ressuspendido em 20 ml de água estéril gelada, utilizando pipetas de 25 ml geladas. As amostras foram novamente centrifugadas e a lavagem do "pellet" foi repetida por três vezes. Na última lavagem, a suspensão de bactéria foi transferida para um único tubo, seguida de centrifugação, descarte do sobrenadante e ressuspensão do único pellet formado em 1 ml de água estéril. A B. ovis eletrocompetente foi mantida no gelo até o momento da eletroporação. Para a eletroporação, foram adicionados 10 μΙ de plasmídeos pB04, em 50 μΙ de suspensão de B. ovis eletrocompetente. Cada solução de 60 μΙ foi transferida para uma cubeta estéril de 0,1 cm (BioRad Laboratories, CA, EUA) e submetida a um choque de 2,2 KV e 5,4 ms, utilizando o equipamento eletroporador da BioRad (BioRad Laboratories, CA, EUA). Imediatamente após a eletroporação, foi adicionado 1 ml de meio SOCB (2% tryptona, 0,5% extrato levedura, 10 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCI2, 10 mM MgS04 e 20 mM glicose) e, em seguida, 100 μΙ de cada amostra foram plaqueados em meio TSA sem antibiótico. As placas foram incubadas a 37°C por 16 horas. As colónias crescidas em placa foram raspadas, suspensas em 100 μΙ de PBS estéril e plaqueadas em meio TSA com hemoglobina e canamicina a 100 g/ml (Gibco^®, Invitrogen, Brasil). Adicionalmente, o restante da suspensão foi incubado em agitador a 37°C por 16 horas e, em seguida, plaqueados 100 μΙ e 900 μΙ de cada amostra em meio TSA com canamicina. Após incubar as placas por 4 a 7 dias em estufa a 37°C e 5% de CO2, as colónias crescidas foram plaqueadas em linha em meio TSA com canamicina e em meio TSA com ampicilina a 200 pg/ml (Gibco^®, Invitrogen, Brasil). Após 4 a 7 dias, foram selecionadas colónias de cada mutante que eram resistentes à canamicina e sensíveis à ampicilina. Para a confirmação dos mutantes gerados, além da seleção pela resistência ao antibiótico, cada mutante foi analisado pela PCR, utilizando pares dos iniciadores específicos B04FW (Seq ID N° 8) e B04RV (Seq ID N°9) de B. ovis para a confirmação da deleção dos genes de interesse. Exemplo 2- Infecção de camundongos

Para comparar a cinética de infecção, in vivo, da amostra mutante com a da amostra virulenta (cepa selvagem - WT) de B. ovis, grupos de quatro ou oito camundongos machos BALB/c, de 7 a 9 semanas de idade, foram inoculados com 100 μΙ de solução contendo aproximadamente 1x10⁷ UFC/ml de amostras AABC transportador (TMS3) ou amostras virulentas (WT) de B. ovis. Nos tempos 1 , 7, 30 e 90 dias pós-infecção, um grupo de cada amostra foi sacrificado, sendo coletados fragmentos de baço e fígado para avaliação bacteriológica, histopatológica e imunohistoquímica. Para a bacteriologia, os tecidos de animais infectados com a amostra mutante foram plaqueados em meio TSA com hemoglobina e 100 pg/ml de canamicina. Tecidos de animais infectados com a amostra virulenta foram plaqueados em meio TSA com hemoglobina sem antibiótico.

Camundongos infectados com a amostra mutante AABC transportador de B. ovis apresentaram colonização bacteriana no baço e no fígado significativamente menor (p<0,001) do que os grupos infectados com a amostra de referência de B. ovis (WT) em todos os tempos avaliados (Figura 1A,B). No baço, o mutante AABC transportador foi aos 30 dpi somente em um animal. Os valores de UFC do mutante recuperados do fígado foram muito reduzidos a partir de 7 dpi. Os dados bacteriológicos evidenciam que a amostra mutante AABC transportador de β. ovis é atenuada no baço e fígado de camundongos a partir de 1 dpi, o que demonstra a menor patogenicidade desta amostra mutante durante a infecção in vivo em camundongos.

O baço e o fígado de camundongos infectados com a amostra mutante também foram avaliados histologicamente e através de imunohistoquímica. Nenhuma alteração histopatológica significativa foi observada no baço e no fígado de camundongos infectados com a amostra mutante AABC transportador de B. ovis. Além disso, não foi observada imunomarcação em nenhum dos órgãos avaliados de camundongos infectados com a amostra mutante. O resultado histopatológico e da imunohistoquímica de baço e fígado estão em concordância com os baixos valores de colonização bacteriana descritos anteriormente para o mutante. Estes resultados confirmam a menor patogenicidade da amostra mutante AABC transportador de B. ovis (TMS3) em comparação à amostra virulenta de B. ovis no modelo murino de infecção.

Para confirmar a atenuação do mutante AABC transportador de B. ovis, foram utilizados camundongos machos IRF-1^"7", que apresentam resposta imunológica via IFN-γ alterada, além de deficiente indução de IL-12 e ativação de células CD8⁺ e "natural killers" (Ko, J., A. Gendron-Fitzpatrick, T. A. Ficht, and G. A. Splitter. 2002. Virulence criteria for Brucella abortus strains as determined by interferon regulatory factor 1-deficient mice. Infect. Immun. 70:7004-7012). Camundongos IRF-1^"7" foram inoculados com 2,3x10⁶ UFC/animal da cepa mutante AABC transportador (n=5) ou da amostra de referência de B. ovis (n=5) e avaliados, por 21 dias, quanto ao índice de letalidade de cada grupo (Figura 2). Camundongos infectados com a amostra parental de referência de B. ovis morreram a partir de 11 dpi, sendo que 60% dos animais morreram aos 13 dpi. Os dados demonstram que camundongos machos IRF-1^{_ "} não são capazes de controlar a infecção pela amostra virulenta de B. ovis, o que resultou em 100% de letalidade até 14 dpi. Entretanto, todos os animais infectados com a amostra mutante AABC transportador de B. ovis sobreviveram até 21 dpi, o que foi significativamente diferente (p=0.0079) do grupo infectado com a amostra virulenta de B. ovis. Portanto, a amostra mutante AABC transportador é atenuada em camundongos IRF-1 ^", uma vez que a infecção não é letal para os animais imunocomprometidos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1- Cepa atenuada de Brucella ovis, caracterizada por compreender mutação do gene que codifica para o transportador ABC (TMS3).

2- Cepa atenuada de Brucella ovis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela mutação ser realizada através da deleção das porções anterior (Seq ID N° 1) e posterior (Seq ID N° 2) a duas ORFs (open reading frames), BOVA0500 e BOVA0501 (Seq ID N°10), que codificam para proteínas que compõem um sistema transportador do tipo ABC.

3- Cepa atenuada de Brucella ovis, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada por ser utilizada na prevenção e tratamento de Brucelose.

4- Composição vacinai, caracterizada por compreender, como componente ativo, uma cepa viva atenuada de Brucella ovis, de acordo com as reivindicações 1 a 3, e excipiente farmacológica e farmaceuticamente aceitável.

5- Uso da composição vacinai, de acordo com as reivindicações 4, caracterizado por ser na prevenção e tratamento de Brucelose.