PL186728B1

PL186728B1 - Szczepionka do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej i sposób wytwarzania szczepionki do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej

Info

Publication number: PL186728B1
Application number: PL97330863A
Authority: PL
Inventors: Thomas J. Inzana; Christine Ward
Original assignee: Virginia Tech Intell Prop
Priority date: 1996-06-27
Filing date: 1997-06-17
Publication date: 2004-02-27
Also published as: NZ333387A; TR199802716T2; CA2258168A1; PL330863A1; AR008615A1; NO986099D0; NO986099L; SK177198A3; CZ418998A3; SK284610B6; CN1223586A; CZ295438B6; BR9710986A; EP0964689A1; HK1020004A1; EP0964689A4; US6326001B1; UA70287C2; AU3390497A; CN1092069C

Abstract

1. Szczepionka do im m unizacji sw in przeciw ko zapaleniu pluc i oplucnej, znam ienna tym , ze zawiera niezjadliwy, nie majacy otoczki, organizm taki jak A cti nobacillus pleuropneum oniae, Pasteurella m ultocida, Pasteurella haem olytica Iub Pseudomanas aeruginosa, który jest pozbawiony sekwencji DNA kodujacych synteze otoczki zlokalizowanych zgodnie z kierunkiem transkrypcji za m iejscem hybrydyzacji fragmentu Bam H I-Xbal pCW -1C albo za genem eksportu otoczki bakterii. 2. Szczepionka wedlug zastrz. 1, znam ienna tym , ze organizm jest bakteria A c- tinobacillus pleuropneumoniae. 3. Szczepionka wedlug zastrz. 2, znam ienna tym , ze genem eksportu otoczki jest gen cpxD. 4. Szczepionka wedlug zastrz. 1, znam ienna tym , ze organizm jest pozbawiony czynników zjadliwosci obejmujacych polisacharydy otoczki, endotoksyny Iub egzotok syny bialkowe. 5. Sposób wytwarzania szczepionki do zapobiegania chorobom spowodowanym przez Actinobacillus pleuropneumoniae, znam ienny tym , ze identyfikuje sie sekwen- cje DNA syntezy otoczki u tej bakterii, które sa zlokalizowane za miejscem hybrydy- zacji fragmentu Bam H I-Xbal CW-1C, a nastepnie usuwa sie sekwencje DNA syntezy otoczki otrzymujac nie majace otoczki mutanty tej bakterii. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są szczepionki stosowane na ogół w weterynarii, do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej i sposób wytwarzania szczepionki do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej.

Szczepionki są preparatami stosowanymi do zapobiegania szczególnym chorobom zwierząt i ludzi poprzez indukowanie odporności. Dokonuje się tego przez wystawienie pacjenta na działanie antygenu danej choroby, co powoduje, że układ odpornościowy pacjenta wytwarza duże ilości przeciwciał. Obecność przeciwciał w krwi pacjenta chroni go przed późniejszym atakiem czynnika powodującego chorobę. Szczepionki mogą być złożone albo z podjednostek czynnika, albo z samego czynnika, żywego lub zabitego. Na przykład w zapaleniu istoty szarej rdzenia, nazywanego powszechnie „polio”, zapobiega się typowo przez doustne podawanie żywej, atenuowanej szczepionki wirusa polio, co jest powszechną praktyką przy leczeniu dzieci, albo przez podawanie zabitej, dezaktywowanej szczepionki wirusa polio, co jest powszechnie stosowane przy leczeniu dorosłych, ponieważ u dorosłych jest wyższe ryzyko nabycia polio od żywej szczepionki. Jeżeli ma być stosowana żywa szczepionka, to jej zjadliwość musi być w jakiś sposób atenuowana, gdyż w przeciwnym razie wirus w szczepionce spowoduje chorobę zamiast chronić pacjenta przed chorobą.

Szereg chorób jest spowodowanych przez bakterie mające otoczkę, w których otoczka bakteryjna, będąca warstewką polisacharydu lub polipeptydu podobną do gumy, na zewnątrz ściany komórki bakterii, jest konieczna do patogenezy. Świńskie zapalenie płuc i opłucnej jest jednym z przykładów, a do czynników zjadliwości Actinobacillus pleuropneumoniae, bakterii, które powodują chorobę, należy polisacharyd otoczki, endotoksyna i egzotoksyny białkowe. Świńskie zapalenie płuc i opłucnej jest jedną z głównych chorób oddechowych wpływających na produkcję świń na świecie i jest odpowiedzialne za miliony dolarów strat rocznie w przemyśle w samych tylko Stanach Zjednoczonych..

186 728

Z amerykańskiego opisu patentowego Nr US 5429818 Inzany, włączonego jako odnośnik, znane są nie mające otoczki mutanty Actinobacillus pleuropneumoniae, które sąniezjadliwe i zdolne do zapewnienia doskonałej ochrony przed wystawieniem na atak bakterii zjadliwych. Niemające otoczki mutanty opisane u Inzany przygotowano drogą mutagenezy etylometanosulfonianowej. Jednakże takie postępowanie ma niedogodności polegające na tym, że niektóre samorzutne albo chemicznie indukowane mutanty mogą być nietrwałe, a natura mutacji jest nieznana.

Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie bezpiecznej i skutecznej, żywej, atenuowanej, rekombinacyjnej szczepionki przeciw chorobom spowodowanym przez bakterie i grzyby, które normalnie mają otoczkę, i w których otoczka bakteryjna jest konieczna dla zjadliwości, ale nie ochrony immunologicznej.

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej. Szczepionka ta zawiera niezjadliwy, nie mający otoczki, organizm taki jak Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica lub Pseudomanas aeruginosa, który jest pozbawiony sekwencji DNA kodujących syntezę otoczki zlokalizowanych zgodnie z kierunkiem transkrypcji za miejscem hybrydyzacji fragmentu BamHI-X?fl/pCW-1C albo za genem eksportu otoczki bakterii.

Korzystnie organizm jest bakterią Actinobacillus pleuropneumoniae, korzystnie genem eksportu otoczki jest gen cpxD. W innym rozwiązaniu korzystnie organizm jest pozbawiony czynników zjadliwości obejmujących polisacharydy otoczki, endotoksyny lub egzotoksyny białkowe.

W innej odmianie przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki do zapobiegania chorobom spowodowanym przez Actinobacillus pleuropneumoniae, w którym identyfikuje się sekwencje DNA syntezy otoczki u tej bakterii, które są zlokalizowane za miejscem hybrydyzacji fragmentu BamHI-XbaI CW-1C, a następnie usuwa się sekwencje DNA syntezy otoczki otrzymując nie mające otoczki mutanty tej bakterii.

Zgodnie z wynalazkiem wytworzono rekombinacyjny, żywy i atenuowany szczep Actinobacillus pleuropneumoniae, który poddano modyfikacji genetycznej w kierunku pozbawienia komórek otoczki bakteryjnej. Ponieważ otoczka jest konieczna do zjadliwości, lecz nie ochrony immunologicznej, to szczep będzie użyteczny jako szczepionka przeciw świńskiemu zapaleniu płuc i opłucnej. Szczepionkę wytworzono za pomocą sklonowanego wektora plazmidowego, który nie może ulegać replikacji w A. pleuropneumoniae. Poddano sekwencjonowaniu geny eksportu i syntezy otoczki A. pleuropneumoniae serotypu 5. W klonowanych genach syntezy otoczki wprowadzono dużądelecję, a następnie do poddanego delecji miejsca wklonowano geny kodujące odporność na kabamycynę i wrażliwość na sacharozę w celu posłużenia się nimi jako genami znacznikowymi. Taki samobójczy wektor wprowadzano stosując elektroporację do zjadliwego szczepu A. pleuropneumoniae serotyp 5, w celu uzyskania rekombinacji homologicznej przez podwójne krzyżowanie pomiędzy obszarami homologicznymi chromosomu i plazmidu. Uzyskano cztery izolaty, z których każdemu brakowało irydescencji, co sugeruje brak otoczki. Brak otoczki i obszary delecji genów otoczki potwierdzono w jednym szczepie odpowiednio metodą biotu punktowego i blotingu Southerna. Potwierdzono także obecność genów znacznikowych w szczepie rekombinacyjnym. Nie można było zidentyfikować żadnych innych zmian właściwości fenotypowych, a genów znacznikowych nie znaleziono w innych obszarach chromosomu. Szczep rekombinacyjny, oznaczony jako J45-100, był bardzo wrażliwy na surowice, miał zmniejszoną zjadliwość u świń przy 10 czasach 50% dawki śmiertelnej dla szczepu macierzystego i powinien zapewniać ochronę świń przed zapaleniem płuc i opłucnej.

Niniejszy wynalazek będzie użyteczny przy wytwarzaniu szczepionek przeciw ustrojowi mającemu otoczkę, który wytwarza toksyny albo inne czynniki zjadliwości, a otoczka jest konieczna do zjadliwości, ale nie do ochrony immunologicznej. Wszystko, co będzie konieczne, to klonowanie genów kodujących syntezę otoczki ustroju, delecja i zastąpienie odcinaka klonowanego genu genem znacznikowym na wektorze samobójczym, a następnie wprowadzenie wektora do żądanego organizmu i wybranie genetycznie zmodyfikowanego organizmu, który jest pozbawiony otoczki. Wynalazek powinien być uzyteczny przy wytwarzaniu szczepionek dla innych bakteryjnych organizmów zakażających, takich jak, między innymi,

186 728

Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica i Pseudomonas aeruginosa, jak również grzybów, takich jak Cryptococcus neoformans, który jest patogenicznie związany z zespołem nabytego niedoboru odpornościowego (AIDS) u kotów i ludzi.

Opis rysunku

Powyższe i inne cele, aspekty i zalety będą lepiej zrozumiałe z następującego szczegółowego opisu korzystnych rozwiązań wynalazku w odniesieniu do rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia mapę fizyczną DNA wklonowanego w pCW-11E, z obszaru syntezy otoczki A. pleuropneumonia J45. Przedstawiono lokalizację i kierunek transkrypcji dwóch pełnych ORFów (cpsA i cpsB, wypełnienie stałe), zidentyfikowanych drogą sekwencjonowania didezoksy. Pokazano lokalizację częściowego, trzeciego potencjalnego ORF-u (cpsC). Pokazano także lokalizację i kierunek transkrypcji niepełnego genu cpxD exportu otoczki, umiejscowionego w tym fragmencie DNA. Pokazano fragment Bg/II-Stul o długości 2,1 kb, stosowany jako sonda DNA. Wypełnienie kreskowe pokazuje niepełne ORF-y; na fig. 2 przedstawiono analizę blotingu Southerna genomowego DNA z A. pleuropneumoniae, hybrydyzowanego ze znakowanym digoksygeninąfragmentem Bg/II-StuI o długości 2,1 kb z pCW-11E. Trawiony BamHI genomowy DNA ze szczepu 4074 o serotypie 1 (tor 1), ze szczepu 1536 o serotypie 2 (ścieżka 2), szczepu J45 o serotypie 5a (ścieżka 3), szczepu K17 o serotypie 5a, szczepu 178 o serotypie 5 (ścieżka 3), szczepu 29628 o serotypie 7 (ścieżka 6) i szczepu 13261 o serotypie 9 (ścieżka 7) hybrydyzowano za pomocą sondy, jak opisano niżej. Pokazano ciężar cząsteczkowy hybrydyżujacych pasm (w kb); fig. 3a i 3b przedstawiają sekwencję nukleotydową fragmentu HindIII-EcoRV o długości 3,2 kb z pCW-11E, zawierającego serotypowo specyficzny DNA z A. pleuropneumoniae J45 (Seq. ID Nr 1). Wywnioskowane sekwencje aminokwasowe dwóch pełnych ORF-ów wykrytych w tej sekwencji, cpsA (Seq. ID Nr 2) i cpsB (Seq. ID Nr 3) i wydedukowaną sekwencję N-terminalną trzeciego niepełnego PRF, cpsC (Seq. ID Nr 4) pokazano poniżej sekwencji nukleotydów. Domniemane miejsca wiązania rybosomów, poprzedzające każdy ORF, są przedstawione tłustym drukiem oraz przedstawione są domniemane 10- i 35-promotorowe sekwencje za cpsA; na fig. 3 opisano strukturę wektora samobójczego, zawierającego DNA syntezy otoczek z delecją pCW11 E Δ1 KS1, oraz wytwarzanie nie mających otoczki mutantów A., pleuropmeumoniae drogą wymiany allelicznej. Wektor plazmidu pCWUEΔ1 KSl skonstruowano trawiąc pCW-11E Bg/II-Stul, wytwarzając ślepe końce i poddając ligacji duży fragment o długości 6,4 m kb z fragmentem BamHI o długości 3,8 kb z pKS (także ze ślepymi końcami), zawierającego wstawkę nptl-sacRB (Kan^rSuc^s). Miejsca restrykcyjne w nawiasach wskazują na wyjściowe końce fragmentów poddanych ligacji i w pCWUEΔΐ KS1. Wektor pCWUEA1 KS1 poddawano elektrotransformacji do A pleuropneumoniae, a niemające otoczki transforrnanty Kanr odsiano korzystając z braku irydescencji na pożywce zawierającej 85 (ug/ml kanamycyny; na fig. 5 przedstawiono analizę blotingu Southema genomowego DNA wydzielonego z A. pleuropneumoniae J45 (ścieżka 1) albo J45-100 (ścieżka 2) ze znakowanymi za pomocą digoksygeniny sondami specyficznymi wobec nptl albo części lokus genu otoczki A. pleuropneumoniae. Genomowy DNA z A. pleuropneumoniae J45 (ścieżka 1) albo J45-100 (ścieżka 2) trawiono Xbal (panele A i C) albo BamHI (panel B) i hybrydyzowano z fragmentem Pstl o długości 1,24 kb z pKS (specyficzny wobec nptl), panel A; fragmentem Bg/II-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E (cpsABC-specyficzny, patrz fig. 1), Panel B, albo fragmentem C/al o długości 2,1 kb z pCW-1C (cpxCBA specyficzny, patrz fig. 3.2), panel C; na fig. 6 przedstawiono immunoblot kolonii A. pleuropneumoniae J45 i J45-100, poddanej reakcji ze świńską surowicą odpornościową specyficzną dla polisachrydu otoczki. Na nitrocelulozową błonę nakładano w przybliżeniu 5 x 10⁵ (ścieżka 1) lub 5 x 10⁴ CFU na wgłębienie płytki. Błonę poddano Clal w chloroformie i poddano inkubacji ze świńską surowicą odpornośc1ową, która zawierała przeciwciała polisacharydu otoczki o serotypie 5a, lecz nie zawierała innych antygenów powierzchmowych A. pleuropneumoniae; na fig. 7 przedstawiono immunobloty zatężonej pożywki znad hodowli A pleuropneumoniae J45 (ścieżka 1) i J45-100 (ścieżka 2) zawierających głównie egzotoksyny Apxl i ApxII. Panel A poddano reakcji z specyficznym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko Apxl, a panel B poddano reakcji ze specyficznym antyciałem monoklonalnym ApxII. W panelu A zatężonej, pożywki znad hodowli szczepu 1536 A pleuropneumoniae o serotypie 2 (ścieżka 3) była

186 728 włączona jako kontrola negatywna, ponieważ ten serotyp nie syntetyzuje Apxl. Blot panelu A podano reakcji z A/zU-specyficznym przeciwciałem monoklonalnym; na fig. 8 przedstawiono profile elektroforetyczne LPS wydzielonego z A. pleuropneumoniae J45 (ścieżka 1), a rekombinacyjny, nie mający otoczki mutant J45-100 (ścieżka 1) poddano elekroforezie w 15% żelu rozdzielającym i barwiono srebrem amoniakalnym; na fig. 9 przedstawiono aktywność bakteriobójczą przedsiarowego osocza krwi cielęcej względem A. pleuropneumoniae J45 i J45-100. Stopień żywotności szczepów bakteryjnych oceniano po 45 minutach inkubacji w temperaturze 37°C. Każdy punkt danych oznacza średnią z trzech ostatnich doświadczeń przeprowadzonych dwukrotnie. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe od każdej średniej. Maksymalna żywotność procentowa zarejestrowana dla J45 wynosiła 100%, chociaż te wartości były typowo wyzsze ponieważ bakterie zwykle rozwijały się w czasie doświadczenia. Wartości większych niż 100% nie rejestrowano ponieważ nie mogły one być dokładnie określone; na fig. 10a i 10b przedstawiono sekwencję nukleotydową fragmentu Xbal-Clal o długości 3,2 kb z pCW-1C, genu kodującego eksport otoczki w A. pleuropneumoniae J45 DNA (Seq. ED Nr 5). Przedstawiono proponowane sekwencje aminokwasowe (Seq. ID Nr 6-8) białek biorących udział w eksporcie polisacharydów otoczki A. pleuropneumoniae o serotypie 5a; na fig. 11 przedstawiono mapę fizyczną DNA pCW-1C z A. pleuropneumoniae J45.

Wynalazek dotyczy stosowania żywego, wytwarzanego rekombinacyjnie, niezjadliwego szczepu drobnoustroju (to jest bakterii lub grzyba), który poddano modyfikacji genetycznej w kierunku pozbawienia otoczki, jako szczepionki przed chorobami spowodowanymi przez ten drobnoustrój. Wynalazek będzie miał zastosowanie przy zapobieganiu chorób, w których do zjadliwości, lecz nie do ochrony immunologicznej, jest konieczna otoczka, i w których choroba jest spowodowana przez toksyny lub inne czynniki zjadliwe. Jako szczególny przykład wynalazku został wytworzony nie mający otoczki szczep Actinobacillus pleuropneumoniae , który powinien być użyteczny jako szczepionka przed zapaleniem płuc i opłucnej u świń. Główną cechą wynalazku jest modyfikacja genetyczna drobnoustroju, którym w szczególnym rozwiązaniu jest Actinobacillus pleuropneumoniae, polegająca na wprowadzeniu delecji do kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) w obszar kodujący syntezę otoczki. Tylko tytułem przykładu ujawnia się syntezę przekształconej bakterii Actinobacillus pleuropneumoniae, mutanta o serotypie 5, jakkolwiek rozumie się, że inne serotypy można otrzymać w sposób podobny do tego, który opisuje się niżej i byłyby użyteczne w szczepionce samodzielnie lub w połączeniu z jednym lub więcej niż jednym mutantem rekombinacyjnym różnego serotypu.

Szczep opisany niżej, wraz z innymi szczepami nie mającymi otoczki, toksygennych bakterii lub innych drobnoustrojów wytworzonych według opisanych niżej procedur, daje doskonałe szczepionki, ponieważ są one niezjadliwe, lecz wytwarzają wszystkie antygeny konieczne do reakcji ochrony immunologicznej gospodarza. Szczepionki można podawać w różny sposób, z tym, że zalecany jest zastrzyk domięśniowy lub podskórny. Zaleta takich żywych szczepionek polega na tym, że toksyny, które są przede wszystkim odpowiedzialne za chorobę, i inne składniki wytworzone tylko przez żywe organizmy albo in vivo, będą wytworzone w miejscu immunizacji, a gospodarz wywołuje reakcję immunologiczną, która zabezpiecza go przed obrażeniami spowodowanymi przez toksyny. Stąd me występuje choroba (ostra lub chroniczna). Organizmy nie mogąjednak rozprzestrzeniać się, ponieważ bez otoczki są one nadzwyczaj wrażliwe na osocze i są oczyszczane bezpośrednio w strumieniu krwi lub drogach oddechowych. Poza tym, ponieważ szczepionka zawiera atenuowane drobnoustroje, to odpowiedź immunologiczna z udziałem komórek będzie większa, a ochrona będzie trwała dłużej niż w przypadku szczepionek zawierających zabite drobnoustroje.

Przykład

Zidentyfikowano i scharakteryzowano obszar DNA biorący udział w biosyntezie polisacharydu otoczki A. pleuropneumoniae. Sondę specyficzną dla genu cpxD biorącego udział w eksporcie polisacharydu otoczki A. pleuropneumoniae J45 serotypu 5a wykorzystano do identyfikacji i klonowania przyległego fragmentu BamHI o długości 5,8 kilo zasad z genomowego DNA J45. Analiza blotingu Southerna wykazała, ze cześć obszaru zawierała DNA, który był serotypowo-specyficzny. Analiza sekwencji DNA wykazała, ze ten obszar zawierał dwie

186 728 kompletne, otwarte ramki odczytu, cpsA i cpsB, oraz niekompletną potencjalną trzecią otwartą ramkę odczytu, przy czym cpsC, cpsA i cpsB podzielały pewną niską homologię z glikozylotransferazami biorącymi udział w biosyntezie odpowiednio liposacharydu Escherichia coli i polisacharydu otoczki Haemophilus influenzae, typ b. Delecję o długości 2,1 kb, która rozciągała się od wklonowanych otwartych ramek odczytu cpsABC, skonstruowano i zrekombinowano z chromosomem J45 drogą wymiany allelowej z utworzeniem mutanta J45-100. Ten mutant nie wytwarzał wewnątrzkomórkowo lub pozakomórkowo polisacharydu otoczki, co wskazuje, że cpsA, cpsB i ewentualnie cpsC brały udział w biosyntezie polisacharydu otoczki A. pleuropneumoniae. Profile toksyny Apx i liposacharydu J-45-100 były identyczne dla mającego otoczkę szczepu macierzystego J45. Jednak J45-W0 rozwijał się szybciej in vitro niż J45. J45-100 był wrażliwy na zabijanie w przedsiarowym surowicy cieląt, w przeciwieństwie do J45. J45-100 był niezjadliwy, gdy stosowano do indukowania u prosiąt trzy razy 50% dawką śmiertelną szczepu J45. Za szóstym razem 50% dawka śmiertelna J45, J45-100 spowodowała łagodne do umiarkowanych obrażenia płuc, lecz nie śmierć. Te wyniki wykazały, że polisacharyd otoczki jest głównym wyznacznikiem odporności na osocze i zjadliwości A. pleuropneumoniae.

Materiały i metody

Szczepy bakteryjne, plazmidy i czynniki wzrostu.

Szczepy bakteryjne i plazmidy stosowane w tych badaniach są takie, jak przedstawiono w tabeli 1. Do ekstrakcji genomowego DNA i prób bakteryjnych szczepy A. pleuropneumoniae hodowano ze wstrząsaniem w temperaturze 37°C w sercowo-mózgowym bulionie infuzyjnym (Difco Laboratories, Detroit, Mich.}, zawierającym 5 ug/ml dinukleotydu nikotynoamidu adeniny (NAD) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). Do elektroporacji szczepy A. pleuropneumoniae hodowano ze wstrząsaniem w temperaturze 37°C w potrójnym bulionie sojowym (Difco Laboratories), zawierającym -06% wyciągu drożdżowego (Difco Laboratories) i 5 ng/ml NAD (TSY-N). Do doświadczeń nad wywoływaniem odpowiedzi u prosiąt szczepy A. pleuropneumoniae hodowano ze wstrząsaniem w temperaturze 37°C w bulionie Columbia (Difco Laboratories), zawierającym 5 pg/ml NAD. Szczepy Escherichia coli hodowano w bulionie Luria-Bertani (Sambrook i in., 1989) celem hodowli rutynowej albo w bulionie Terrific (Tartof and Hobbes, 1987) celem ekstrakcji plazmidów. Antybiotyki w pożywkach hodowlanych stosowano w celu utrzymania plazmidów w E. coli w następujących stężeniach: ampicylina (Amp) 100 pg/ml i kanamycyna (Kan) 50 pg/ml. Kanamycynę stosowano przy stężeniu 85 pg/ml w celu selekcji rekombinacyjnych mutantów A. pleuropneumoniae.

Tabela 1

Stosowane szczepy bakteryjne i plazmidy
1	2
Szczepy 4074 A. pleuropneumoniae	serotyp 1; (ATCC 27088)
MCC 1536	serotyp 2, (ATCC 27089)
ATCCa J45	serotyp 5a
Fenwick i wsp , 1986a Kl7	serotyp 5a
Nielsen, 1986a 178	serotyp 5
M. Mulks 29628	seiotyp 7
L Hoffman 13261	serotyp 9
J. Nicolet J45-C	nie mający otoczki mutant wydzielony po metanosulfonia nowej mutagenezie

186 728

c.d. tabeli 1

1	2
J-45 Inzana i in., pochodzący od 1993aJ-	rekombinacyjny nie mający otoczki mutant ze szczepu J45
Szczep E coli XLl-Blue	recAl endA\ gyrA96 thi-l hsdR17-supE44 relAl lac(F +proABlaclqZ AM 15Tn10), gospodarz
Stratagene, La Jolla, Calif Plazmidy pGEM-3Z	Wektor do klonowania, długość 1,74 kb, AmpT
Promega pCW-1C	Fragment Xbal o długości 5,3 kb z J45 klonowanego do pGEM-32
pCW-11E	Fragment BamHI o długości 5,8 kb z J45 klonowanego do PGEM-3Z
pKS	Fragment BamHI o długości 3,8 kb, zawierający wstawkę^cnpt^h -sacRS klonowany w miejsca BamHI w pGEM-
S M. Boyle pCWl 1EA1KS1	pCW-IIE z fragmentem Bg/II-Stul o długości 1,1 kb, poddanym delecji i wstawką BamHI nptl-sacRB z pKS
^aAmerican Type Culture Collection, Rockville, MD
^b Ten znacznik pochodził oryginalnie z genu Tn903 nptl z pUC4K (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)
^c Wstawkę opisano poprzednio (Ried i Collmer, 1987)

Obliczenie czasu generowania. Czas generowania fazy logarytmicznej szczepów A. pleuropneumomae w TSY-N obliczono korzystając z równania R = 1/g, gdzie R jest średnią szybkością wzrostu bakterii, a g jest czasem generowania populacji bakteryjnej (Pelczar i in., 1993). Średnią szybkość wzrostu R obliczono korzystając z następującego równania: R = 3,32 (log^N-log1)No)/t, gdzie t jest czasem zaniku, N jest liczbą bakterii w czasie t, a N_o jest początkową liczbą bakterii w czasie 0 (Pelczar i in., 1993).

Analiza hybrydyzacji DNA. Restrykcyjny, trawiony endonukleazą DNA (w przyblizemu 5 pg na ścieżkę) poddano elektroforezie w 0,7% żelu agarozowym i przenies1ono drogą kapilarną na błony nylonowe MagnaGraph (Micron Separations Inc., Westboro, Mass.) korzystając z cytrynianu sodu w solance 20X (20X SSC jest 3M NaCl, 300 mM cytrynian sodowy) jak opisano przedtem (Sambrook i in., 1989; Southern, 1975). DNA wiązał się kowalencyjnie z błonami nylonowymi drogą napromieniania korzystając z aparatu UV Stratalinker (Stratagene, La Jolla, Calif.). Znaczone digoksygeniną sondy do hybrydyzacji DNA syntezowano metodą losowego startera stosując zestaw do niepromieniotwórczego znakowania i detekcji układem Genius System (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) zgodnie z instrukcjami producenta. Hybrydyzację DNA prowadzono w temperaturze 68°C w roztworach zawierających 5X SSC. Błony przemywano i wywoływano według instrukcji Genius System do wykrywania kolorymetrycznego.

Metody rekombinacji DNA i odczynniki. Genomowy DNA wydzielano z komórek A. pleuropneumomae wyhodowanych w bulionie, stosując sposób opisany przez S. Spinola. W skrócie, bakterie zawieszono ponownie w 10 mM Tris-1/mM EDTA (pH 8) i poddawano inkubacji w dodecylo-siarczanie sodowym (0,66%) i RNA-zie (100 pg/ml) w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C. Następnie dodawano proteinazę K do stężenia końcowego 100 pg/ml i poddawano mieszaninę inkubacji w temperaturze 56°C w ciągu 1 godziny. Mieszaninę ekstrahowano jeden raz za pomocą buforowanego fenolu i cztery razy za pomocą buforowanego fenolu/chloroformu (Amresco. Inc., Solon, Ohio), a genomowy GNA strącono etanolem

186 728 i ponownie zawieszono w 10 mM Tris-1 mM EDTA (pH 8). Plazmid DNA wydzielano drogą szybkiej lizy alkalicznej (Ish-Horowicz i Burkę, 1981). Fragmenty restrykcyjne wymagane do klonowania i syntezy sondy eluowano z żelów agarozowych, jak opisano przez Zhena i Swanka, 1993. Trawienia restrykcyjne, elektroforezę w żelu agarozowym i ligację DNA prowadzono w sposób opisany wcześniej (Sambrook i in., 1989). Końce fragmentów restrykcyjnych przygotowano jako końce ślepe drogą wypełnienia występów w położeniu 5' nukleotydami (dNTP-y) korzystając z fragmentu Klenowa polimerazy 1 DNA, jak opisano poprzednio (Sambrook i in., 1989). Plazmidem DNA transformowano szczepy E. coli drogą elektroporacji (Dower i in., 1988) korzystając z elektroporatora ΒΤΧ ECM 600 (ΒΤΧ, Inc., San Diego, Cahf.).

Endonukleazy restrykcyjne i fragment Klenowa polimerazy I DNA otrzymano z Promega Corporation (Madison, Wiś.). Ligazę T4 DNA otrzymano z Gibco BRL (Gaithersburg, Md.). Nukleotydy (dNTPs) do reakcji wypełnienia otrzymano z Boehringer-Mannheim Corporation (Indianapolis, Ind.).

Sekwencjonowanie i analiza DNA. Sekwencję nukleotydową obydwu nici fragmentu DNA A7?a/-EcoRV o długości 2,6 kilozasad (kb) z pCW-ΠΕ oznaczono metodą temnnacji didezoksy łańcucha (Sanger i in., 1977) korzystając z zestawu do sekwencjonowania DNA w wersji 2 0 Seąuenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) z a³⁵[S]dATP (duPont/NEN Research Products, Boston, Mass.). Matryce dwuniciowego DNA poddano sekwencj ono waniu korzystając ze zwykłych starterów polinukleotydowych (DNAgency, Inc., Malveme, Pa.) celem kontynuowania odczytu wzdłuż każdej nici.

Uzyskaną sekwencję nukleotydów połączono z sekwencją nukleotydową fragmentu Xbal-Clal DNA o długości 4,6 kb z pCW-lC, kodującego geny strukturalne otoczki (fig. 10) i analizowano korzystając z oprogramowania analitycznego DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wis). Przeszukiwanie podobieństwa sekwencji baz danych EMBUGenBANK/DDBJ przeprowadzono korzystając z oprogramowania BLAST (Altschul i in., 1990) w National Center for Biotechnology Information (Bethesda, Md.).

Konserwowane obszary lokusa cap (capb) H. influenzae 2/1 typu b, biorącego udział w eksporcie polisacharydu otoczki, wykorzystano do identyfikacji, klonowania i charakteryzowania części lokusa otoczki serotypu 5a A. pleuropneumoniae, biorącego udział w eksporcie polisacharydu otoczki. Przeprowadzono analizy blotingiem Southema genomowego DNA szczepu J45 serotypu 5a A. pleuropneumoniae za pomocą sond specyficznych dla przyległych obszarów lokusa {capb) otoczki II. influenzae typu b. Sondy te nie hybrydyzowały z genomowym DNA A. pleuropneumoniae w ostrych warunkach (68°C, 5 x SSC), lecz hybrydyzowały w łagodnych i umiarkowanych warunkach (55°C, 5xSSC). Fragment EcoRI o długości 4,4 kb lokusa capb z H. influenzae z plazmidu pSKHI zawierającego obszar 1 genu bexD biorący udział w eksporcie sacharydu otoczki i dwie otwarte ramki odczytu (ORFy) obszaru 2, biorące udział w biosyntezie polisacharydu otoczki, hybrydyzował z fragmentami Hindlll o długości

1.2 kb i Xbal o długości 5,3 kb genomowego DNA z J45. Fragment EcoRI o długości 9,0 kb lokusa capb H. influenzae z plazmidu pSKH2, zawierającego obszar 1 genu Z?exCBA, biorące udział w eksporcie polisacharydu otoczki, pewien niescharakteryzowany obszar 3 DNA wspólny dla kilku serotypów H. influenzae i pewien obszar 2 DNA biorący udział w biosyntezie polisacharydu otoczki, hybrydyzowały z fragmentem Hindlll o długości 1,5 kb, Xbal o długości 5,3 kb i Xhol o długości 2,4 kb genomowego DNA z J45. Te dane wskazywały, ze lokusy genów otoczki H. influenzae typu b i A. pleuropneumoniae serotypu 5a podzielały obszary homologiczne. Obydwie sondy specyficzne dla capb H influenzae zawierały obszar 1 DNA biorący udział w eksporcie polisacharydu otoczki, co sugeruje, ze fragment Xbal o długości

5.3 kb genomowego DNA z J45, który hybrydyzował z obydwoma sondami capb H influenzae, może zawierać geny, które kodują białka biorące udział w eksporcie polisacharydu otoczki A. pleuropneumoniae serotyp 5a. Fragment Xbal genomowego DNA o długości 5,3 kb z J45, który hybrydyzował z obydwoma sondami capJb H. influenzae, był klonowany w miejsce Xbal plazmidu pGEM-3Z (w obydwu orientacjach) z fragmentów genomowego DNA z J45, trawionego Xbal, w przedziale długości od 4,8 do 6,0 kb, który poddano elektroelucji (po rozdzielaniu elektroforetycznym) z żelu agarozowego. Jeden z otrzymanych plazmidów oznaczono jako pCW-lC. Wykonano biot Southema w celu określenia, czy bexD, bexC, bexB

186 728 i bexA H influenzae typu b hybrydyzowały z przyległymi fragmentami pCW-1C w takiej samej kolejności (bexDCBA), w jakiej te geny występują w H. influenzae. Wyniki sugerowały, ze obszar DNA A. pleuropneumoniae serotypu 5a, wymagany do eksportu polisacharydu otoczki, został z powodzeniem sklonowany oraz że ten obszar był uorganizowany w podobny sposób, jak lokus bex H. influenzae typu b.

Oznaczono sekwencję nukleotydów restrykcyjnego fragmentu Xbal-Clal o długości 4,6 kb z pCW-1C, i fragment restrykcyjny Xbal-Clal o długości 3,2 kb przedstawiono na fig. 10a-b (Seq. ID Nr 5). Cztery ORF-y (pokazane na fig. 10a-b i fig. 11), oznaczone jako cpxDCBA (cpx stosuje się do oznaczenia eksportu polisacharydu otoczki), wykryto w bliskim sąsiedztwie na tej samej nici DNA. Kodon inicjacyjny AUG cpxC (Seq. ID Nr 7) znajdował się 26 nukleotydów przed kodonem terminacyjnym UAA cpxD (Seq. ID Nr 6), a kodon inicjacyjny AUD cpxB (Seq. ID Nr 8) nakładał się na kodon terminacyjny UAA cpxC (Seq. Id Nr 7), a kodon inicjacyjny AUG cpxA nakładał się na częściowo obecny kodon terminacyjny z cpxB (Seq. ID Nr 8). Sekwencje konsensusowe Shina-Dalgamo wiążące rybosomy zidentyfikowano w obrębie 17 zasad powyżej każdego kodonu inicjacyjnego AUG, a domniemany promotor zawierający sekwencje podobne do konsensusowych sekwencji E. coli σ^7θ-10 (TATAAT) i -35 (TTGACA) zidentyfikowano za cpxD (Seq. ID Nr 6). Sekwencja palidromowa, która może funkcjonować jako niezależny od rho sygnał terminacji transkrypcji, zidentyfikowano przed cpxA (nie pokazany). Organizacja genetyczna sugeruje, ze cpxDCBA ulegają transkrypcji w pojedynczy, policistronowy DNA.

Elektrotransformacja A. pleuropneumoniae. A. pleuropneumoniae hodowano do osiągnięcia środka fazy logarytmicznej w TSY-N, osadzano drogą wirowania przy 7000 x g w temperaturze 4°C i przemywano cztery razy schłodzonym (4°C), sterylizowanym przez filtr buforem, zawierającym 272 mM manitolu, 2,43 mM K2HPO4, 0,57 mM KH2PO4, 15% gliceryny, pH 7,5. Ten bufor zmodyfikowano (manitol zamiast sacharozy) w porównaniu z poprzednio opisanym buforem stosowanym do przemywania komórek A. pleuropneumoniae przed elektroporacją (Lalonde i in., 1989b). Komórki przemyto następnie jeden raz schłodzoną, sterylizowaną przez filtr 15% gliceryną i ponownie zawieszono w 15% glicerynie do stężenia w przybliżeniu 10¹⁰ CFU/ml. Równe ilości tej zawiesiny (90 pl) zmieszano z 1,5-2,0 pg DNA plazmidowego (w 1,5 pl destylowanej wody), który oczyszczono drogą ultrawirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu (Sambrook i in., 1989), umieszczono w ochłodzonych kuwetach elektroporacyjnych ze szczeliną 2 mm (BTX, Inc.) i poddano elektroporacji korzystając z elektroporatora BTX ECM 600 (BTX, Inc.) nastawionego na napięcie ładowania 2,5 kV i do oporności R7 (246 omów). Generowany impuls rzeczywisty wynosił 2,39 kV w ciągu 10,7 milisekundy. Po elektroporacji komórki przywrócono do normalnego stanu w 1 ml TSY-N, zawierającym 5 mM MgCh z ostrożnym wstrząsaniem w ciągu 3,5 godziny w temperaturze 37°C. Następnie komórki hodowano w agarze TSY-N zawierającym 85 ng kanamycyny na ml i inkubowano w temperaturze 37°C.

Immunoblot. Celem wykonania immunoblotów kolonii, całe komórki A. pleuropneumoniae hodowane przez noc na szalkach pokrytych agarem TSY-N zdrapano do solanki buforowanej fosforanem (PBS) i ustalono stężenie 10⁹ CFU/ml, oznaczone spektrofotometryczme. Następnie nakładano w przybliżeniu 5 x 104 aj^ 5 χ 10⁵ CFU na błonę nitrocelulozową (NitroBind, Micron Separations Inc.) korzystając z urządzenia Bio-Dot (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Całif.). Błonę umieszczono w chloroformie na 15 minut w temperaturze pokojowej celem lizy komórek bakteryjnych. Następnie błonę wysuszono całkowicie na powietrzu i poddawano inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej w solance buforowanej Tris, pH 7,5 (TBS), zawierającej 2% chudego mleka w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania w błonie. Błonę poddawano inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej przy rozcieńczeniu 1:200 (w 2% mleku/TBS) zaadsorbowanej świńskiej surowicy odpornościowej, która zawierała przeciwciała przeciwko polisacharydowi otoczki serotypu 5a, lecz nie innych antygenów powierzchniowych A. pleuropneumoniae. Surowicę odpornościową wzbogaconą w przeciwciała przeciwko polisacharydowi otoczki przygotowano drogą adsorpcji hiperimmunologicznego świńskiej surowicy odpornościowej przeciw K17 A. pleuropneumoniae z samorzutnym mutantem nie mający otoczki, K17-C (Inzana i Mathison, 1987), jak opisano

186 728 wcześniej (Inzana, 1995). Błonę przemyto w TMS zawierającym 0,05% Tween 20, a następnie poddawano inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej w rozcieńczeniu 1:1000 króliczej antyświńskiej IgG sprzężonej z peroksydazą chrzanową (ciężkie i lekkie łańcuchy, Capel, Durham, N.C.). Błonę przemyto w TBS, a następnie wywołano za pomocą

4-chloro-1-naftolu (Bio-Rad Laboratories) w TBS zawierającym 0,02% H2O2.

Immunobloting zatężonej pożywki znad hodowli prowadzono w sposób opisany poprzednio (Ma i Inzana, 1990). Krótko mówiąc, w przybliżeniu 15 pg całkowitej ilości białek z całej pożywki znad hodowli oddzielono za pomocą nieciągłej SDS-PAGE (Laemmli, 1970) w 8% żelu oddzielającym. Białka przeniesiono na błony nitrocelulozowe (NitroBind, Micron Separations Inc.) metodą Towbina i in. (1979). Błonę inkubowano w TBS zawierającym 2% albuminy surowicy krwi bydlęcej celem zablokowania niespecyficznego wiązania i pocięto na paski. Paski poddawano inkubacji przez noc w temperaturze 4°C albo z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla toksyny ApxII (Ma and Inzana, 1990) albo z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla toksyny Apxl (Devendish i in., 1989, Frey i in., 1992). Blot reagujący z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla ApxII poddawano inkubacji z kozią antymysiąlgG sprzężoną z peroksydazą chrzanową (Cappel), w rozcieńczeniu 1:2000, przemyto w TBS i wywołano w sposób opisany wyżej. Blot reagujący z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla Apxl poddawano inkubacji z kozią antymysiąlgG sprzężoną z fosfatazą alkaliczną w rozcieńczeniu 1:2000 i wywoływano w sposób opisany uprzednio (Frey i in., 1992).

Ekstrakcja i elektroforeza LPS. LPS wydzielano z A. pleuropneumoniae korzystając z metody mikroekstrakcji za pomocą gorącego fenolu/wody, jak opisano uprzednio (Inzana, 1983). Oczyszczony LPS poddawano elektroforezie w 15% rozdzielającym żelu poliakryloamidowym, zawierającym mocznik, jak już opisano (Inzana i in., 1988). Profile elektroforetyczne LPS wizualizowano drogą barwienia żelu za pomocą srebra amoniakalnego (Tsai i Frasch, 1982).

Bakteriobójcza próba surowicy. Oznaczano wrażliwość A. pleuropneumoniae na aktywność bakteriobójczą surowicy krwi cieląt przedsiarowych. Procent przezycia szczepów bakteryjnych w 5, 10, 15, 20, 30, 40 i 50% surowicy krwi cieląt przedsiarowych oceniano po 60 minutach inkubacji w temperaturze 37°C.

Badania zjadliwości. Prosięta w wieku 7 do 9 tygodni otrzymywano z dwóch lokalnych stad wolnych od infekcji A. pleuropneumoniae i rozdzielono losowo na grupy. Grupy zwierząt trzymano w oddzielnych małych ogrodzeniach bez żadnego bezpośredniego fizycznego kontaktu pomiędzy grupami. Zwierzętarnie w Virginia Polytechnic Institute and State University działały i były zarządzane zgodnie z wymaganiami American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. Celem wywołania odpowiedzi szczepy A. pleuropneumoniae hodowano z wytrząsaniem w bulionie Columbia (Difco Laboratories), uzupełnione 5 pg/ml NAD, do środka fazy logarytmicznej (10⁹ CFU/ml). Bakterie zebrano przez wirowanie przy prędkości wirowania 7000 x g i ponownie zawieszano do stężenia 10⁹ CFU/ml w PBS. U prosiąt wywoływano odpowiedź dotchawicowo za pomocą 10 ml rozcieńczenia tej zawiesiny po łagodnym uspokojeniu za pomocą Stresnilu (Pittman-Moore, Inc. Washington Crossing, N.J.). Zwierzęta poddano sekcji możliwie szybko po śmierci albo natychmiast po eutanazji za pomocą pentobarbitalu sodowego. Obrażenia płuc były oceniane w punktach przez patologa weterynaryjnego zgodnie z następującymi kryteriami: 0 - niewidoczne zmiany w płucach (brak zaobserwowanych większych obrażeń), 1+ oznacza 1-10% tkanki płuc dotknięte łącznie w pewnym stopniu przekrwieniem, obrzękiem, krwotokiem, zagęszczeniem tkanki i ewentualnie zapaleniem opłucnej, 2+ oznacza dotknięte 11-49% tkanki płucnej, 4+ oznacza dotknięte więcej niż 75% tkanki płucnej. Próbki płuc pobierano przy sekcji z prawego czaszkowogrzbietowego płata ogonowego i hodowano w pożywce infuzyjnym mózgowo-sercowym, zawierającym NAD celem wykrycia obecności A. pleuropneumoniae.

Wyniki

Identyfikacja i klonowanie specyficznego serotypowo obszaru DNA z A pleuropneumoniae. Celem zidentyfikowania i sklonowania DNA z A. pleuropneumoniae J45, biorącego udział w biosyntezie polisacharydów otoczki, przeprowadzono analizy blotów Southerna

186 728 celem zidentyfikowania przyległego obszaru DNA powyżej (w kierunku 5') grupy genomów cpxDCBA biorącej udział w opisanym wyżej eksporcie polisacharydów otoczki (fig. 10a-b i 11). Spodziewano się, ze ten obszar DNA będzie kodować geny serotypowo specyficzne, biorące udział w biosyntezie polisacharydów otoczki, ponieważ lokus otoczki (cap) A. pleuropneumoniae wydaje się być zorganizowany w sposób podobny do lokusów otoczki Haemophilus influenzae typu b i grupy B Neisseria meningitidis. Genomowy DNA z A. pleuro-pneumoniaie, trawiony BamHI poddano sondowaniu za pomocą znaczonego digoksygeniną fragmentu BamHI-Xbal o długości 1,2 kb z pCW-1C, który zawierał część genu cpxD. Ta sonda specyficzna wobec cpxD hybrydyzowała z pojedynczym fragmentem BamHI o długości w przybliżeniu 5,8 genomowego DNA z J45 (dane nie pokazane). Ten fragment BamHI o długości 5,8 kb klonowano w miejsce BamHI pGEM-3Z z fragmentów genomowego DNA z J45, trawionych BamHI w przedziale 5,0-6,5 kb, który poddawano elektroelucji (po rozdzielaniu elektroforetycznym) z żelu agarozowego. Otrzymany plazmid oznaczono jako pCW-11E i został zmapowany restrykcyjnie (fig. 1). Część DNA z insertem pCW-11E DNA (fragment BamHI-Zbal o długości 1,2 kb) nakładała się z DNA obecnym w insercie pCW-1C.

Trawiony BamHI genomowy DNA z kilku różnych serotypów A. pleuropneumoniae, hybrydyzowano z fragmentem Bg/ll-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E (fig. 1) w celu oznaczenia specyficzności serotypowej tego obszaru DNA (fig. 2). Fragment DNA Bg/II-Stul o długości 2,1 kb, hybrydyzował z fragmentem BamHI o długości 5,8 kb genomowego DNA z testowanych trzech szczepów A. pleuropneumoniae serotypu 5, lecz nie z genomowym DNA z serotypów 1, 2, 7 i 9 (fig. 2). Zatem DNA z A. pleuropmeumoniae w pCW-11E zawierał DNA, który był specyficzny dla szczepów o serotypie 5. Ponieważ ten DNA był serotypowo specyficzny, to prawdopodobnie bierze on udział w biosyntezie polisacharydów otoczki.

Sekwencja nukleotydów i analiza serotypowo specyficznego obszaru DNA A. pleuropneumoniae. Oznaczono sekwencję nukleotydów we fragmencie DNA Xbal-EcoRV o długości 2,7 kb z pCW-11E. Tę sekwencję nukleotydów połączono z sekwencją nukleotydów fragmentu Clal-Xbal o długości 4,6 kb z pCW-1C i badano obecność otwartych ramek odczytu (ORF-y) jeszcze nie zidentyfikowanych poprzednio. Na fig. 3 przedstawiono sekwencję nukleotydów fragmentu HindlH-EcoRV o długości 3,2 kb z pCW-11E, zawierającego nowo zidentyfikowane ORF-y. Dwa pełne ORF-y, oznaczone jako cpsA i cpsB (cps oznacza syntezę polisacharydów otoczki) zidentyfikowano powyżej i na przeciwnej nici względem genu cpxD biorącego udział w eksporcie polisacharydów otoczki A. pleuropneumoniae (fig 1 i fig. 3) Kodon inicjacyjny AUG cpsB miał 3 nukleotydy przed kodonem terminalnym cpsA. Kodon inicjacyjny AUG trzeciego potencjalnego ORF, cpsC, zidentyfikowano jako mający 15 zasad przed kodonem terminacyjnym UAA cpsB. Konsensusowe sekwencje Shine-Dalgamo, wiążące rybosomy (Shine i Dalgamo, 1974) zidentyfikowano w 13 zasadach za kodonami inicjacyjnymi cpsA, cpsB i cpsC (fig. 3). Domniemany promotor, zawierający sekwencje podobne do konsensusowych sekwencji E. coli™ -10 (TATAAT) i -35 (TTGACA) (Hawley i McClure, 1983) zidentyfikowano za cpsA (fig. 3). Ścisła bliskość cpsABC i identyfikacja domniemanego promotora sugerowały, że te ORF-y mogą ulegać wspólnej transkrypcji. Zawartość G+C obszaru DNA kodującego cpsABC wynosiła 28%.

Przewidywane polipeptydy na podstawie cpsA i cpsB składały się z 321 (CpsA) i 526 (CpsB) aminokwasów (fig. 3). Przewidywane masy cząsteczkowe CpsA i CpsB wynosiły odpowiednio 36,9 i 61,7 kilodaltonów (kDa). Wykresy hydropatyczne wykazały, że CpsA i CpsB były białkami stosunkowo hydrofilowymi, co sugeruje, że te białka mogą być związane z przestrzenią cytoplazmatyczną (nie pokazane) A. pleuropneumoniae. Badania BLAST (Altschul i in., 1990) połączonych zredukowanych nienadmiarowych nukleotydów i białek w National Center for Biotechnology Information nie ujawniły żadnej istotnej homologii pomiędzy cpsABC na poziomie nukleotydowym i aminokwasowym z innymi sekwencjami w bazach danych (dane nie pokazane), jednak niski poziom homologii (15% podobieństwa) obserwowano pomiędzy CpsaA i białkiem Rfb z E coli, a antygenową Q glikozylotransferazą biorącą udział w biosyntezie LPS (Cheah i Manning, 1993). Niski poziom homologii (w przybliżeniu 14% podobieństwa) wykryto pomiędzy CpsB a produktem białkowym przewidywanym w obszarze 2 ORF 3 lokusa otoczki H influenzae typu b. Białko przewidywane na podstawie ORF 3 bierze

186 728 udział w biosyntezie fosforanu polirybozylorybitolu polisacharydów otoczki H. influenzae typu b (Van Eldere i in., 1995). Nie obserwowano żadnej znaczącej homologii pomiędzy 83 aminokwasami końca N CpsC i jakimikolwiek białkami w bazach danych.

Wytwarzanie odpornych na kanamycynę, nie mających otoczki transformantów A pleuropneumoniae serotypu 5a. Na fig. 4 przedstawiono schematycznie procedury stosowane do wytwarzania rekombinacyjnych, nie mających otoczki mutantów A. pleuropneumoniae J45 drogą rekombinacji homologicznej i wymiany allelowej. Wektor pCWUEA1 KS1 skonstruowano najpierw do wykorzystania jako niereplikujący wektor samobójczy do zapoczątkowania wymiany DNA otoczki A. pleuropneumoniae typu dzikiego z genetycznie zmienionym DNA otoczki A.. pleuropneumoniae, drogą podwójnego, homologicznego krzyżowania rekombinacyjnego. Wektor pCWUEA1 KS1 skonstruowano najpierw przez trawienie pCW-11E Bg/II i Stul wytwarzając dużą delecję w DNA otoczki serotypowo specyficznego A. pleuropneumoniae. Końce tego trawionego DNA zostały przeprowadzone w końce ślepe, a duży fragment o długości 6,4 kb poddano ligacji z fragmentem BamHI o długości 3,8 kb z pKS (także o ślepych końcach), zawierającym wstawkę nptl-sacR-sacB. Wstawka ta zawiera przedtem gen nptl Tn903, znany jako nadający odporność A pleuropneumoniae na kanamycynę (Kań')/ oraz sekwencje sacRB, które nadają wielu gram-ujemnym bakteriom wrażliwość na sacharozę (Suc^s) (Gray i in., 1983; Ried i Collmer, 1987). Delecja wytworzona w pCWUEA1 KS1 obejmowała cpsABC (fig. 1, fig. 4) i powinna zatem w podobny sposób wpływać na białkowe produkty tych ORF-ów.

Wektor pCWUEA1 KS1 nie ulegał replikacji w A. pleuropneumoniae, a zatem funkcjonował jako wektor samobójczy. Po elektroporacji A. pleuropneumoniae J45 pCWUEA1 KS1 uzyskano siedem transformantów odpornych na kanamycynę po inkubacji mieszanin do przywrócenia stanu normalnego w temperaturze 37°C w ciągu 2 dni. Cztery z tych odpornych na kanamycynę transformantów J45 nie wykazywało irydyzacji po wizualizacji na płytkach z ukośnie przekazywanym źródłem światła, co sugeruje, ze te transformanty nie miały otoczki (dane nie pokazane). Pożywka stosowana do hodowli A. pleuropneumoniae przed elektroporacją pCWUEA1 KS1 była odczynnikiem, ponieważ nigdy nie uzyskano nie mający otoczki, odpornych na kanamycynę transformantów, gdy A. pleuropneumoniae hodowano w pożywce infuzyjnej mózgowo-sercowej, uzupełnionej NAD.

Charakteryzacja genotypowa transformantów A. pleuropneumoniae, odpornych na kanamycynę. Wstępne analizy hybrydyzacji kolonii siedmiu transformantów odpornych na kanamycynę ujawniły, ze cztery transformanty, które jak się okazało nie miały otoczki (drogą badania wizualnego), hybrydyzowały z sondą DNA specyficzną dla nptl (fragment Pstl o długości 1,24 kb z pKS), lecz nie z sondami specyficznymi dla pGEM-3Z (fragment Bgll z pGEM-3Z) albo serotypowo specyficznym fragmentem Bg/II-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E (dane nie pokazane). Te wyniki wskazują, że podwójna rekombinacja ma miejsce w każdym z tych czterech, odpornych na kanamycynę transformantów. l odwrotnie, kolonie pozostałych trzech transformantów odpornych na kanamycynę hybrydyzowały z sondami specyficznymi dla genu nptl, pGEM-3Z i fragmentem Bg/II-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E, co sugeruje, ze ma miejsce pojedyncze krzyżowanie, a cały wektor samobójczy pCWUEA1 KS1 zintegrował się z chromosomem tych transformantów (dane nie pokazane). Analizy blotów Southema oczyszczonego genomowego DNA z czterech transformantów odpornych na kanamycynę, potecjalnie nie mający otoczki (stosując opisane wyżej sondy), były identyczne, co wskazuje, ze taka sama podwójna rekombinacja miała miejsce w każdym z tych, transformantów. Jeden tych transformantów był losowo wybrany do dalszych badań i oznaczono go jako J45-100.

Przeprowadzono analizy blotów Southema genomowego DNA wydzielonego z J45 i J45-100 z sondami DNA specyficznymi dla genu nptl, fragmentu Bg/II-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E i fragmentu Clal o długości 2,1 kb pCW-1C (fig. 5). Sonda DNA specyficzna dla nptl hybrydyzowała z fragmentem o długości 5,0 kb z DNA J45-100 trawionym Xbal, lecz nie z DNA z J45, co oznacza, że znacznik nptl znajdował się w chromosomie J45-100 (fig. 5A). Hybrydyzacja sondy nptl Z fragmentem Xbal o długości 5,0 kb genomowego DNA z J45-100 była zgodna z wielkością tego fragmentu w wektorze samobójczym pCWUEA1 KS1 stosowanym do

186 728 wytwarzania J45-100. Fragmenty Bglll-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E hybrydyzowały z fragmentem o długości 5,8 kb J45 trawionym BamHII lecz nie do DNA J45-100, co znaczy że ten fragment uległ delecji w J45-100 (fig. 5B). Sonda specyficzna dla genów cpxCBA (fragment Clal o długości 2,1 kb z pCW-1C), biorących udział w eksporcie polisacharydów otoczki, hybrydyzowała z fragmentem Xbal o długości 5,3 kb zarówno z J45, jak i z J45-100 (fig. 5C). Ten wynik oznacza, że na tę cześć lokusa otoczki A. pleuropneumoniae nie wpływały podwójne rekombinacje, które miały miejsce w przyległym obszarze DNA. Sonda specyficzna dla pGEM-3Z nie hybrydyzowała z genomowym DNA z J45 lub J45-100, co oznacza, ze żaden wektor DNA nie znajdował się w genomowym J45-100. Podsumowując, takie wyniki hybrydyzacji DNA wskazywały, ze pożądana podwójna rekombinacja i wymiana allelowa miały miejsce w J45-100.

Charakterystyka fenotypowa odpornego na kanamycyne transformanta J45-100 A. pleuropneumoniae. J45-100 oceniano pod względem wytwarzania polisacharydów otoczki drogą immunoblotingu kolonii i aglutynacji lateksu. Surowica odpornościowa zawierająca przeciwciała specyficzne dla polisacharydów otoczki A. pleuropneumoniae serotypu 5a, lecz nie zawierające innych bakteryjnych składników powierzchniowych, reagowała z J45, lecz nie reagowała z J45-100 (fig. 6). Ponieważ kolonie bakteryjne na błonie ulegały lizie w chloroformie, to te wyniki wskazują że J45-100 nie wytwarzał wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych polisacharydów otoczki. Wszystkie lub sonikowane J45-100 nie powodowały zlepiania się perełek lateksowych, które były kowalencyjnie sprzężone z oczyszczonym przeciwciałem polisacharydu otoczki A. pleuropneumoniae serotypu 5a (lnzana, 1995), natomiast całe komórki J45 i poddane sonifikacji komórki J45 powodowały silną aglutynację reagenta z perełkami lateksowymi (dane nie pokazane). Wyniki te wskazują, ze delecja w lokus cap A. pleuropneumoniae J45-100 dała w wyniku utratę biosyntezy polisacharydów otoczki. Co więcej, wyniki te wskazują na to, że nie mający otoczki mutant J45 wydzielony po mutagenezie metasulfonianem etylu (lnzana i in., 1993 a), J45-C, wytwarzał wewnątrzkomórkowy, lecz nie zewnątrzkomórkowy polisacharyd otoczki.

Ekspresje toksyny Apx i profile elektroforetyczne LPS dla J45 i J45-100 porównywano celem określenia, czy mutacja wprowadzona drogą inżynierii genetycznej lokusa cap J45-100 miała wpływ na te ważne determinanty zjadliwości. Przy wydzielaniu białek toksynowych Apxl i ApxII o ciężarze cząsteczkowym 105 kDa do klarownej pożywki znad hodowli nie wykryto żadnej różnicy pomiędzy J45 a J45-100 (fig. 7). Ponadto nie wykryto żadnej różnicy w profilach elektroforetycznych LPS dla J45 i J45-100 (fig. 8).

Badano wzrost J45 i J45-100 w TSY-N i wrażliwość J45 i J45-100 na aktywność bakteriobójczą przedsiarowego osocza z krwi cieląt w celu oznaczenia wpływu braku otoczki na te właściwości fenotypowe. Krzywe wzrostu J45 i J45-100 w TSY-N były podobne, lecz nie identyczne (dane nie pokazane). Jednakże zliczenia przeżywalności na płytkach wykazały, ze w logarytmicznej fazie wzrostu J45-100 wzrastał szybciej (czas generowania około 23 minuty) niż macierzysty szczep nie mający otoczki, J45 (czas generowania około 28 minut) (dane nie pokazane). Nie mający otoczki mutant rekombinacyjny J45-100 był skutecznie zabijany w ciągu 60 minut w 10 do 50% przedsiarowej surowicy z krwi cielęcej, jako źródle dodatkowym, natomiast mający otoczkę szczep macierzysty J45, nie był zabijany (fig. 9).

Wrażliwość J45-100 na sacharozę badano w celu określenia, czy sekwencje sacRB mogłyby funkcjonować jako przeciwselektywny znacznik w A. Pleuropneumoniae, a następnie indukować usunięcie wstawki nptl-sacRB z chromosomu J45-100. J45-100 hodowany w bulionie wzrastał bardzo powoli, gdy był wysiany na szalce bezpośrednio lub rozcieńczany, a następnie wysiany na szalki albo w pożywce TSY-N lub Luria-Bertani (do której dodano 5 pg/ml NAD), zawierającym 5% lub 8% sacharozy. Obecność sekwencji sacRB w chromosomie J45-100 zweryfikowano drogą b1otu Southema. Te wyniki sugerują, że albo znacznik sacRB nie dawał ekspresji w A. pleuropneumoniae, albo możliwie, że produkt lewanowy utworzony przez lewanosacharozę sacRB w obecności sacharozy nie był toksyczny dla J45-100.

Wewnątrztchawicowe wywoływanie reakcji u prosiąt przez rekombinacyjnego, niemającego otoczki mutanta A. pleuropneumoniae, J45-100. Rekombinacyjny, nie mający otoczki mutant J45-100 nie powodował żadnej śmiertelności u prosiąt, gdy podawano go w dawkach 3 i 6 razy

186 728 (odpowiednio 1,45 x 10⁷ CFU i 2,95 x 10⁷ CFU) 50% dawka śmiertelna (LD50) mającego otoczkę szczepu macierzystego J45 (5 x 106 CFU) (Inzana i in., 1993a) (tabela 2). I odwrotnie, u wszystkich trzech prosiąt prowokowanych za pomocą 6,5-krotnej LD50 J45 rozwinęły się ostre obrażenia płuc, wskutek czego prosięta padły (tabela 2).

Tabela 2

Zjadliwość A pleuropneumoniae J45 i J45-100 dla prosiąt
	Ilość pozytywnie/całkowita ilość testowana
Szczep prowokujący	Dawka prowokująca	Średnia liczba punktów uszkodzenia płuc	Śmiertelność	Odzyskanie zdrowia³
J45	1/6- 3,30X10⁷CFUb	4+	3/4^c	4/4
J45-100	1,5X10⁷CFU	0	0/5	0/5
J45-100	3,OX107CFU	1+	0/5	2/5d
J45-100	8,4X107CFU	1 +	1/4°	4/4d
J45-100	1, 8X10⁸CFU	2+	0/4	-U —- Ω.
J45-C^f	1,7X10^b CFU	1+	0/2	2/2d

^a Powrót do normalności szczepu wywołującego odpowiedź, z próbki płuc pobranej przy sekcji

Prosięta prowokowane za pomocą J45-100 poddano sekcji 4 dni po teście prowokacji b Ta dawka jest 6,6 razy większa niż 50% dawka śmiertelna (5X10⁶ CFU) podana w poprzednich badaniach (Inzana i in , 993a) ^c Wszystkie prosięta w tej grupie zginęły w ciągu 36 godzin po teście prowokacji.

^d A pleuropneumomae odzyskiwano z płuc i potwierdzono, ze nie miały otoczki drogą braku irydescencji i braku aglutynacji wrażliwych cząstek serotypowo-5 specyficznych e Sekcja jednego prosięcia, które zginęło, wskazywała, że śmierć była spowodowana brakiem podawania dawki prowokującej ^fJ45-C jest chemicznie indukowanym, nie mającym otoczki mutantem, który scharakteryzowano poprzednio

Pięć prosiąt prowokowanych niższą dawką J45-100 (1,45 x 107 CFU) nie przejawiało żadnych klinicznych objawów charakterystycznych dla świńskiego zapalenia płuc i opłucnej, i nie rozwinęły się u nich żadne obrażenia płuc. Co więcej, nie wyhodowano A. pleuropneumomae z próbek płuc pobranych przy sekcji po czterech dniach po teście prowokacji. Dwa lub trzy prosięta prowokowane wyższą dawką J45-100 (2,95 x 107 CFU) były klinicznie normalne i przy sekcji nie zaobserwowano żadnych obrażeń płuc. Jedno prosię w tej grupie, prowokowane wyższą dawką J45-100, przejawiało umiarkowaną duszność, a przy sekcji obserwowano pewne przekrwienie płuc i nieznaczny krwotok (punkty obrażenia płuc = 1+). Pozostałe dwa prosięta w tej grupie przejawiały umiarkowaną duszność, a przy sekcji zaobserwowano pewne zapalenie opłucnej i zagęszczenie tkanek (punkty obrażenia płuc = 2+). A pleuropneumomae J45-100 wyhodowano tylko z tych dwóch prosiąt z najostrzejszymi obrażeniami płuc. Bakterie odzyskane z tych prosiąt nie powodowały aglutynacji reagenta aglutynacyjnego z perełkami lateksowymi serotypu 5a. Zatem odzyskane bakterie wciąż nie miały otoczki, co wskazuje, ze J45-100 nie powracał do mającego otoczkę fenotypu in vivo.

Gdy geny nptl (nadaje odporność przeciw kanamycynie) i SacB/sacR (nadaje wrażliwość na sacharozę) klonowano w miejsce delecji, to geny te były przeznaczone tylko do

186 728 wykorzystania jako geny znacznikowe, przy czym można stosować także inne geny znacznikowe. Ze względu na zdrowie i przyczyny związane z bezpieczeństwem korzystne może okazać się unikanie stosowania znacznika odpornego na antybiotyki, takiego jak nptl, albo dostarczenie mechanizmu leczenia lub inaktywacji znacznika antybiotykowego. Odpowiednie znaczniki nieantybiotykowe mogą obejmować odporność na rtęć.

Nie mający otoczki szczep Actinobacillus pleuropneumoniae typu 5, otrzymany według powyższych procedur produkuje tylko dwie lub trzy toksyny wytwarzane przez Actinobacillus pleuropneumoniae. Podczas gdy zmodyfikowane Actinobacillus pleuropneumoniae może zabezpieczać i jest immunogenne, to może być także użyteczne do klonowania trzeciego genu toksyny RTX w miejsce delecji. Można tego dokonać przez klonowanie genu toksyny RTX do kasety genu kanamycyny szczepu J45-100, a zatem inaktywując gen kanamycyny.

Szczepionkę powinno się dostarczać w postaci podobnej do innych szczepionek dobrze znanych w tej dziedzinie. Korzystne jest, aby szczepionka była umieszczona w butelce jako mieszanina liofilizowana i mogła zawierać jeden lub więcej serotypów szczepów mutantów. W celu zachowania żywotności powinna ona zawierać taką substancję, jak bulion Columbia, trehalozę lub albuminę, glicerynę albo inny środek. Zawartość liofilizowanej mieszaniny wymagałaby tylko ponownego uwodnienia sterylną wodą lub solanką i wstrzyknięcia (domięśniowo, dożylnie, dootrzewnowo, podskórnie, itp.). Szczepionkę można także dostosować do innych sposobów podawania (na przykład doustnie, poprzezskómie, podjęzykowo, itp.), stosując odpowiednie nośniki (na przykład skrobię, polisacharydy, oleje, liposomy, gumy, itp.)

Dawka szczepionki dostarczona zwierzęciu zależy od takich czynników, jak wiek lub płeć zwierzęcia i sposób podawania. We wszystkich przypadkach powinna być podana wystarczająca ilość żywych, niezjadliwych, nie mających otoczki Actinobacillus pleuropneumoniae celem wywołania immunogennej reakcji u szczepionego zwierzęcia. Owocne wyniki uzyskano z 2 immunizacjami po 2 do 3 tygodni z jednostek tworzących kolonię 10⁹.

Wynalazek został opisany w jego korzystnych rozwiązaniach, zatem dla specjalistów w tej dziedzinie jest oczywiste, ze wynalazek można przeprowadzić z modyfikacjami w ramach idei i zakresu załączonych zastrzeżeń.

186 728

5.S kb

2 3 4 5 6 7 ,

FIG.2

186 728 mgcmggcot τπτιμμορμ^^

ΜΠΠΚΕΑΜΤΠΧΜΕΜ^^

CpsA - I U I 1 I I ramoow™ ? i I B H ϊ B S I B 1 0 S C ! F 5 S i L E T r T 0 F ε S Β E F o a I Ϊ /mmwm

Β $ P I P E Π Η B 1 B8 P Β l f E ί l l P B$ U I Ϊ R li 5 l B IMCWIEGMCTg^

I P 8 P ł ί I ϊ T I F I P ί I B F ł f ł I I C l Β ϊ I 8 Β E I l I S II GOnTCCEMAOT^ l P E H 8 l F ϊ I P fl Ϊ 7 I ί l H f P ( 8 I 8 E I 5 S F 8 8 I I L (WCCTOGM^^

I* 5 ! I F C I Η i S 0 I ϊ l f [ l i I i l 8 P 8 0 F 8 F I f 8 6

I 0 I β I S U E I u l C f E i u JE i l P I Β I F 0 5 F T I I I

8 L.l ϊ C S 5 Β E C S P 15 I P E i L i i 5 I P I F S S I I 5 I P I i 8 8 1 B 1 8 I i L I l I l 0 P I 1 I i E 8 I I f I C L F 8 P S 1 F E

I I l 8 F S l I 8 S P S L A I 5 I [ 8 C I 8 8 I I l 8 8 I 8 I I 8 5

W0OT«

CpsB *♦ a s i s ι i a p a s i h t a a a a f s s f f s i i e a a a ι 111 f MMMwmmwmwoe

E U I I a 8 ί I 5 l T t F ί 8 $ I l t | ι Ϊ F 8 I Β I l I 1 E E E Ε

FIG.3A

186 728

ϊ ϊ ΐ * I U I t C I I P 5 1 P S l P I

FIG.3B

186 728

BamHi

Trawienie Bb/ll i Stul Oczyszczony na żelu fragment 6,44 kb

T4 DNA LłGASE

BamHf

Trawienie BamHi i Oczyszczony na żelu fragment 3,8 kb (I (Bg/H/SamHf

(Stul/BamHI)

FIG.4

Oczyszczanie w gradiencie CsCI i elektrotransformacja A PLEUROPNEUMONIAE 145

Rekombinacja

I Szalka tryptynizowana soja/ekstrakt

Ϊ drożdżowy/NAD/kanamycyna (85ug/ml) cporni v__T TO*iicrnDii4nrrc rno. ·

Transformanty przeszukiwane pod kątem Kan^r

1. brak produkqi polisacharydowej otoczki (immunoblot)

2. obecność znaczników nptl i sac-RB (biot Southema)

3. brak fragmentu DNA BG/ll-Stul (biot Southerna)

4. brak sekwencji wektora pGEM-3Z (biot Southerna)

186 728

A B

A.rr *' C-m·· * - ’ *· ·>

12 i 1 2

SC k

SSrt

,.,L -

FIG.5

186 728

105 kDa —

Reactetf

YY,th

ApyL-spec

MAb c ApKikspectfic

MAb

FIG.8

FIG.7

186 728

CTAGACATiACAIGATTAATFATAGGACGAGK^TTATGCTAGACAnAAAAATACTCCTGAAATACGAAT^GTiATGGAGTTACCCTA

GATAMWWCATCOTnCATAAATATMATGAmTnATCAACTATCTAGGGWACTCCGTATnTATATGGCn nAAAHATAATGTTTATCTGTATAACGCCCCTCKGAmACITTTTTnAAAAAAAATACATnmAAnWGTAAATfTCnA -35 -10

TAmAAmCTCHGAHAGCTAACnAnAAMTCAATCTnATGTGGAmrAAGACATACCTATATAGTTGTTAKCCnAATATA

TlGAAGAGMAnAGATGAAACrCATCAAACHAGAnACTCCnTCTfTGGGGCTGGiTGCrAGTITGGCTGCCTGCTCAAGCTTACCC

CpxD -* Η K L 1 I l R L L L S L G t V A S L A aVc S S L P ACnCAGGCCClAGCCATAGTGCGArrfTAGAGGCTAATTCCCAGAACrCAGATAAACCnTACCGGAAGITAArnAGTGGAGrFAGAT

T$6PSHSAJIEANSGIISDKPLPEVIIIY£LD

AAT(%mAGrCAGCAGRCTArCjmTCAGCAAA<nCAC(^KH(XGG(nKnAGGCA(XXIGGCGGTGCTGGATArgCC6GT

270

360 ♦50

540

630

Ν δ l Y <) Q l Y 0 Ϊ C 0 S 0 Q F S C F l G J A G G A δ Y A G GanCAATGTGGGGGATCTTCnGAOCAATnGGGAAGCGCCACCGGCAGTGTTGTITGGCGGTACTrrTAGTTCTtMGGCM

AY«VCDYLE!SliEAPPAYLFCGTFSSEGQ

GGTAGCGGGCAWCGCMnA(XG(XGCAAATGGnAAC(MACGGTACGGRACTGlGCCGWGGGlAATAnCGTCTTGCA

G $ G Η L i C l P A 0 U V H C H G I V T V P F Y G H I R Y A

GGFAMACACCGGAAGCGAnCAGTCrCAAATlGTiTOCATrGCAACGiAAAGCGAAlGAGCCACMGFAnAGIAAAAATTGCGAAT

G R T P Ε A I Q S Q I Y G A l Q R K A H C P Q Y L Y K I A «

AAmTOGTOFTO

R R S A 0 Y I Y I i Q G N S I R Β P L S A Ν Ν E R Y l 0 A Y GCAGCAGTAGGCGGTACAAtHGAAAATATIGAAGAOACCGTAAAAlTAACTCGFGGCTCGCWGTCAAAAGATiAGCGTITGAAACT

FIG. 10A

186 728

t R Υ I E A L L B R Ε I I I R ϊ Ε Β K H ί E F I ϊ l f Υ Ε Ρ

CTATTACTCACTnAWCGnTFGATGTGGAAATTTATCCGAGCGGATCGCGnTCCGATITAAATATrAKGCTrrTGTGATIACC ~.....................— 2970

I I ί I L F I Υ L Β ϊ K F I R Μ R Υ 5 0 ί Η I Α Γ V I I

GGTOTCOWTGGCCATWTGTGGC^TCCGTCAAACCGCACTATiXGTG(^mCC£^AACHGAG7CTTCTnATWTCCTAAT

-—-—-------- -----3060

Ε Υ Ρ Β * Β V I R 1 Α $ S R I I δ A I S Ε Η ί S L ί Υ H R 8

GTFEGCGTAKAWTACCnACTGGCTCCTGTCAT/CTGAAGTAGCAGC^GCMCGAHGCCCMkTCAKArrATGGCAnAGTCAn

Υ R Υ ί 0 ί L I A R Υ I ί Ε Υ A G ί Γ I A 0 I I I Β A Ε Υ I

FIG. 10B

186 728 żywotność w %

FIG.9

BamKl

EcoR!

Hindlll

Xbal Hindlll I > i	Hindlll _M . ... . Hindlll ^{Clal Mlul} III. I L	Sphl I Ndel EcoRV Li i ......	Clal Ndel Xbal 1 1 1
1h J—	¹ 1 [ 1 \|	• 1	T*-
1.0	2.0 3.0	4.0	5.0 kb

cpxD cpxC cpx8 cpxA

PROBE

FIG. 11

186 728

Hindlll

Xbfll

Spili

Ns3

I, M

I ' 1

1.0 2.0

Sphl

Xbol

Stul

EcoRV

Xbol

Smal

BamHI i ¹ i |

3.0 4.0 5.0 kb ~~~~j c?xD cpsA cpsB cpsC

Sonda

FIG.1

2

JAS — ®

3*5-100 —

FIG.6

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczepionka do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej, znamienna tym, że zawiera niezjadliwy, nie mający otoczki, organizm taki jak Actino-bacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica lub Pseudomonas aeruginosa, który jest pozbawiony sekwencji DNA kodujących syntezę otoczki zlokalizowanych zgodnie z kierunkiem transkrypcji za miejscem hybrydyzacji fragmentu BamH!-Xbal pCW-1C albo za genem eksportu otoczki bakterii.
2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, ze organizm jest bakterią Actinobacillus pleuropneumoniae.
3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że genem eksportu otoczki jest gen cpxD.
4. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że organizm jest pozbawiony czynników zjadliwości obejmujących polisacharydy otoczki, endotoksyny Iub egzotoksyny białkowe.
5. Sposób wytwarzania szczepionki do zapobiegania chorobom spowodowanym przez Actinobacillus pleuropneumoniae, znamienny tym, ze identyfikuje się sekwencje DNA syntezy otoczki u tej bakterii, które są zlokalizowane za miejscem hybrydyzacji fragmentu BamHI-XbaI CW-1C, a następnie usuwa się sekwencje DNA syntezy otoczki otrzymując nie mające otoczki mutanty tej bakterii.