JP3447713B2 - Ｂ群連鎖球菌に対する複合ワクチンを製造するための防御的タンパク質抗原をコードする遺伝子配列からなる組換え分子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は微生物学およびワク
チン技術の分野に関連し、Ｂ群連鎖球菌による感染に対
する免疫を付与し得るワクチンの開発に関する。

【０００２】

【従来の技術】連鎖球菌(ストレプトコッカス)属の細菌
はヒトおよび動物の疾患の原因物であると考えられてき
た。連鎖球菌は、その細胞表面上の特異的炭水化物抗原
の存在に基づいて、免疫学的な群に分類されている。現
在、Ａ群からＯ群まで認識されている（Daivs,B.D.等,"
Microbiology",第3版,609頁,(Harper & Row,1980)）。
連鎖球菌はヒトの疾患を引き起こす最も一般的で最も重
要な細菌の１種である。Ｂ群の連鎖球菌は動物の疾患
（例えばウシの乳腺炎）を伴うが、ストレプトコッカス
・アガラクチェ（Ｂ群連鎖球菌の１種）は、米国におけ
るヒト新生児の敗血症の最も一般的な原因として問題に
なっており、年間６０００人以上の死亡をもたらしてい
ると考えられている（Hill,H.R.等,Sexually Transmitt
ed Diseases,McGraw Hill,397-407頁）。またＢ群連鎖球
菌は、乳児の後発発症(late-onset)髄膜炎、分娩後の子
宮内膜炎、および免疫的に弱体化した成人の感染の重要
な病原体でもある(Patterson,M.J.等,Bact.Rev. 40:774
-792(1976)）。この生物は抗生物質感受性であるが、新
生児敗血症および乳児髄膜炎の高い攻撃率と迅速な発症
が、高い罹患率（５０％）と高い死亡率（２０％）をも
たらしている(Baker,C,J.等,New Eng.J.Med.(Editoria
l）314(26):1702-1704(1986)；Baker,C,J.等,J.Infect.
Dis. 136:137-152(1977)）。

【０００３】Ｂ群連鎖球菌は、正常なヒトの膣内(vagin
al)および結腸内細菌叢の一般的な成分である。新生児
感染の最も一般的な経路は分娩時膣からの転移増殖であ
るが、新生児育児室における病院内感染も記述されてい
る(Patterson,M.J.等,Bact.Rev. 40:774-792(1976)）。
しかしながら、Ｂ群連鎖球菌が転移増殖した乳児のうち
重度の感染に進行する率は僅かでしかない。転移増殖か
ら感染への遷移において、宿主の因子と細菌のビルレン
ス（菌力）決定要素の両方が果す役割はよく分かってい
ない。Ｂ群連鎖球菌のいくつかのタンパク質はビルレン
スおよび免疫性に関する役割を有していると考えられて
いる（Frrieri,P.,Rev.Infect.Dis. 10:S363(1988)）。
１９７５年、ランセフィールド（Lancefield）は、防御
的免疫を引き出すその能力によって、Ｂ群連鎖球菌のＣ
タンパク質群を定義した（Lancefield,R.C.,等,J.Exp.M
ed. 142:165-179(1975)）。このタンパク質群は幾つか
の異なるポリペプチドおよび抗原決定基を含んでいると
考えられている。これらの発見を考慮して、Ｂ群連鎖球
菌による感染を防ぐための努力が、予防的抗生物質の使
用とＢ群連鎖球菌に対するワクチンの開発に注がれてき
た（Baker,C.J.等,Rev.of.Infec.Dis. 7:458-467(198
5)，Baker,C.J.等，New Eng.J.Med.(Editorial) 314(2
6):1702-1704（1986)）。Ｂ群連鎖球菌に対する多糖ワ
クチンは、カスパー（Kasper,D.L.：米国特許第４２０
７４１４号および米国再発行特許ＲＥ３１６７２号、並
びに米国特許第４３２４８８７号、同第４３５６２６３
号、同第４３６７２２１号、同第４３６７２２２号、同
第４３６７２２３号）、カルロ（Carlo,D.J.：米国特許
第４４１３０５７号、欧州特許公開番号第３８２６５
号）、並びにヤボルディオス等（Yavordios,D.等：欧州
特許公開番号第７１５１５号）らによって記述されてお
り、上記の文献はすべて本明細書の一部を構成する。

【０００４】Ｂ群連鎖球菌による母系の転移増殖および
分娩期の他の危険因子を共に同定し得る乳児の小さな副
集団を除いて、予防的抗生物質の使用は、大多数のケー
スを防ぐには実践的あるいは有効ではなかった（Boyer,
K.M.等,New Eng.J.Med.314(26):1665-1669(1986)）。分
娩時の予防的化学療法は次の理由から広範囲には受け入
れられなかった：（１）Ｂ群連鎖球菌による母系の転移
増殖を、費用効率が高く迅速で信頼のおける方法で同定
することができなかった；（２）新生児のケースの約４
０％が危険率の低い状況でおこる；（３）すべての母親
または潜在的に危険にさらされている新生児を防御およ
び／または処置することが実践的であるとは考えられな
かった；（４）抗生物質予防療法は後発発症髄膜炎（米
国において年間７２００例）または分娩後の子宮内膜炎
（年間４５０００例）の予防には適さないと思われた
（Baker,C.J.等,New Eng.J.Med.(Editorial) 314:1702-
1704(1986)）。

【０００５】微生物の寄託：プラスミドｐＪＭＳ１およ
びｐＪＭＳ２３は、本発明に従って使用し得る抗原性連
鎖球菌タンパク質をコードできるＤＮＡを含有している
プラスミドｐＵＸ１２の誘導体である。プラスミドｐＵ
Ｘ１２はプラスミドｐＵＣ１２の誘導体である。プラス
ミドｐＪＭＳ１およびｐＪＭS２３はアメリカンタイプ
カルチャーコレクション(Rockvill,MD）に１９８９年９
月１５日に寄託され、それぞれＡＴＣＣ４０６５９およ
びＡＴＣＣ４０６６０との命名を受けた。

【０００６】発明の要約：ストレプトコッカス・アガラ
クチェは米国における新生児敗血症の最も一般的な原因
であり、年間６０００〜１００００人の死亡の原因とな
っている。Ｂ群連鎖球菌の型特異的多糖莢膜は免疫原性
であり、重要な防御的抗原を持っているが、多糖ワクチ
ンの臨床的試験は低い応答率を示している（Baker,C.J.
等,New Engl.J.Med.319:1180(1980)；Insel,R.A.,等,Ne
w Eng.J.Med.(Editorial) 319(18):1219-1220(198
8)）。本発明は、Ｂ群連鎖球菌からクローニングした遺
伝子から発現した防御的タンパク質抗原を使用する、Ｂ
群連鎖球菌（即ちストレプトコッカス・アガラクチェ）
に対する複合ワクチン（conjugate vaccine）に関す
る。この新規複合ワクチンは、その担体タンパク質のア
ジュバント（佐剤）作用によってＴ細胞依存性の防御を
引き出すと共に、クローニングしたＢ群連鎖球菌タンパ
ク質上に存在する追加の防御的エピトープを提供すると
いう利点を有している（Insel,R.A.等,NewEng.J.Med.(E
ditorial) 319(18):1219-1220(1988)；Baker,C.J.等,Re
v.of Infec.Dis.7:458-467(1985)）。

【０００７】具体的には、本発明は、Ｂ群連鎖球菌によ
る感染に対する宿主免疫を付与し得る複合ワクチンであ
って、（ｂ）あるタンパク質；に結合した（ａ）多糖；
からなり、その多糖およびタンパク質の両方がＢ群連鎖
球菌特有の分子である複合ワクチンを提供する。また本
発明は、Ｂ群連鎖球菌がもたらす感染を防ぐか、もしく
はそれを緩和する方法であって、そのような感染の危険
にあると推測される個体に、その感染に対する宿主免疫
を付与し得る混合ワクチンの有効量を投与することから
なり、そのワクチンが（ｂ）あるタンパク質；に結合し
た（ａ）多糖；からなっていて、その多糖およびタンパ
ク質の両方がＢ群連鎖球菌特有の分子であるワクチンで
ある方法に関する。

【０００８】さらに本発明は、Ｂ群連鎖球菌がもたらす
感染を防ぐか、もしくはそれを緩和する方法であって、
妊娠中の女性（雌）に、その女性（雌）の胎児にその感
染に対する免疫を付与し得る複合ワクチンの有効量を投
与することからなり、そのワクチンが（ｂ）あるタンパ
ク質；に結合した（ａ）多糖；からなっていて、その多
糖およびタンパク質の両方がＢ群連鎖球菌特有の分子で
あるワクチンである方法に関する。また本発明は、Ｂ群
連鎖球菌がもたらす感染を防ぐか、もしくはそれを緩和
する方法であって、そのような感染の危険にあると思わ
れる個体に、その感染に対する宿主免疫を付与し得る複
合ワクチンに別の個体をさらすことによって引き出され
た抗血清の有効量を投与することからなり、該ワクチン
が（ｂ）あるタンパク質；に結合した（ａ）多糖；から
なっていて、その多糖およびタンパク質の両方がＢ群連
鎖球菌特有の分子であるワクチンである方法に関する。

【０００９】好ましい態様の説明：意義および臨床的見通し Ｂ群連鎖球菌に対するワクチンによる母系免疫予防療法
は、抗体の分娩期（peripartum）転移によって、母親お
よびその若い幼児を感染から防御するための潜在的方法
として提唱されている（Baker,C.J.等,New Eng.J.Med.
(Editorial) 314(26):1702-1704(1986)；Baker,C.J.等,
New Eng.J.Med.319:1180(1988)；Baker,C.J.等,J.Infec
t.Dis.7:458(1985)）。他の被包性細菌によるケースと
同様に、感染に対する感受性は型特異的抗体の欠如に相
関している（Kasper,D.L.等,J.Clin,Invest.72:260-269
(1983)，Kasper,D.L.等,Antibiot.Chemother.35:90-100
(1985)）。Ｂ群連鎖球菌に対するオプソニン作用的に活
性な型特異的抗莢膜抗体の欠如は、Ｂ群連鎖球菌の転移
増殖に続く疾患の進行にとって危険因子の１つである
（Kasper,D.L.等,J.Infec.Dis.153:407-415(1986)）。
精製した型特異的莢膜多糖を用いたワクチンの試みがあ
った。そのようなワクチンの製造法と、Ｂ群連鎖球菌に
対して免疫化するためのそのようなワクチンの使用は、
カスパー（Kasper,D.L.:米国特許第４２０７４１４号お
よび米国再発行特許ＲＥ３１６７２号、並びに米国特許
番号第４３２４８８７号、同第４３５６２６３号、同第
４３６７２２１号、同第４３６７２２２号、同第４３６
７２２３号）、カルロ（Carlo,D.J.：米国特許第４４１
３０５７号、欧州特許公開番号第３８２６５号）、並び
にヤボルディオス等（Yavordios,D.等：欧州許公開番号
第７１５１５号）らによって開示されており、上記の文
献はすべて本明細書の一部を構成する。

【００１０】Ｂ群連鎖球菌の多糖莢膜はよく特徴づけら
れており、ビルレンスと免疫性の両方について役割を果
していることが示されているが（Kasper,D.L.J.Infect.
Dis.153:407(1986)）、特異的莢膜型と宿主免疫系の因
子の両者に依存して、これらの莢膜成分の免疫原性が多
様であることがわかっている（Baker,C.J.等,Rev.ofInf
ec.Dis.7:458-467(1985)）。最近完結したＢ群連鎖球菌
の莢膜多糖ワクチンを評価するための臨床試験は、全体
として６３％の応答率を示し、そのようなワクチンが最
適な免疫原ではなかったことを示した（Baker,C.J.等,N
ew Eng.J.Med.319(18):1180-1185(1988)）。免疫原性の
相違は他の細菌の莢膜多糖にも観測されている。例え
ば、Ｃ型髄膜炎菌莢膜に対するワクチンは高度に活性で
あるが、Ｂ群髄膜炎菌多糖ワクチンは非免疫原性である
（Kasper,D.L.等,J.Infect.Dis.153:407-415(1986)）。
宿主免疫系のＴ細胞非依存性機能は、多糖抗原に対する
抗体応答を起こすためにしばしば必要とされる。多糖抗
原に対するＴ細胞非依存性応答の欠如は、Ｂ群連鎖球菌
による感染が進行する子供の母親中に存在するＢ群連鎖
球菌に対する抗体レベルが低いことによるものであろ
う。さらに１８または２４月齢より前の子供はＴ細胞非
依存性抗原への免疫応答がよく発達していない。

【００１１】Ｂ群連鎖球菌におけるビルレンスと免疫性
の決定因子 Ｂ群連鎖球菌には、共通の群特異的多糖抗原を有してい
る５種の抗原型がある。しかしながら、この群抗原の抗
体は動物モデル中では防御的ではない。ランセフィール
ドは最初、沈降素技術を用いて、Ｂ群連鎖球菌を４種の
抗原型（Ia，Ib，II，およびIII）に分類した。続い
て、それぞれの抗原型に特有の型特異的莢膜多糖の組成
および構造が決定された（Jennings,H.J.等,Biochem.2
2:1258-1264(1983)，Kasper,D.L.等,J.Infec.Dis.153:4
07-415(1986)，Wessels,M.R.等,Trans.Assoc.Amer.Phy
s.98:384-391(1985)）。ウィルキンソン（Wilkinson）
は、Ib抗原型株のすべてとIa型莢膜を有するいくつかの
株上に存在するタンパク質抗原（最初はIbcタンパク質
と呼ばれた）を同定することにより、第５の抗原型（I
c）を定義した（Wilkinson,H.W.等,J.Bacteriol.97:629
-634(1969)，Wilkinson,H.W.等,Infec.and Immun.4:596
-604(1971)）。後にこのタンパク質は、抗原型の異なる
Ｂ群連鎖球菌の間でそのビルレンスが異なり、Ia抗原型
には無いことが明らかになった(Johnson,D.R.等,J.Cli
n.Microbiol.19:506-510(1984))。 最近、Ｂ群連鎖球菌の抗原型をその莢膜型特異的多糖の
みによって分類するためにこの命名法が変更を受け、第
５の莢膜型もIV型と記述されるようになった（Pritchar
d,D.G.等,Rev.Infec.Dis.10(8):5367-5371(1988)）。し
たがって、もはやＢ群連鎖球菌株の分類は、現在Ｃタン
パク質と呼ばれている抗原性Ibcタンパク質には基づい
ていない。Ic型株は、その莢膜多糖組成、並びにそれが
Ｃタンパク質をも有しているという追加情報に基づき、
Ia抗原型と再分類されている。

【００１２】免疫学的データ、疫学的データおよび遺伝
子データは、型特異的莢膜がＢ群連鎖球菌感染に対する
免疫に重要な役割を果していることを示唆している。型
特異的莢膜多糖の組成および構造、並びにビルレンスお
よび免疫性に関するそれらの役割は、集中的な研究の対
象となってきた（Ferrieri,P.等,Infec.Immun.27:1023-
1032(1980)，Krause,R.M.等,J.Exp.Med.142:165-179(19
75)，Levy,N.J.等,J.Infec.Dis.149:851-860(1984)，Wa
gner,B.等,J.Gen.Microbiol.118:95-105(1980)，Wessel
s,M.R.等,Trans.Assoc.Amer.Phys.98:384-391(198
5)）。細胞表面上の型特異的およびＢ群連鎖球菌多糖の
構造的配置、型特異的多糖内の免疫学的に重要な決定因
子、および莢膜が決定するＢ群連鎖球菌のビルレンスの
機構に関して論争があった(Kasper,D.L.等,J.Infec.Di
s.153:407-415(1986)）。莢膜がビルレンスに果す役割
を研究するために、ルーベンス（Rubens）等はトランス
ポゾン変異処理法を用いて、III型Ｂ群連鎖球菌の非被
包性の同遺伝子型株を作成した（Rubens,C.E.等,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 84:7208-7212(1987))。 彼らは、莢膜発現の欠如によって、新生ラットモデルに
おけるビルレンスが有意に欠如することを立証した。し
かしながら、同様の莢膜組成を有する臨床的な単離物の
ビルレンスは広範囲にわたって多様である。このこと
は、莢膜に加えて他の細菌ビルレンス因子がＢ群連鎖球
菌の発生病理に役割を担っていることを示唆している。

【００１３】ビルレンスと免疫性に果す役割が明確にな
っていないＢ群連鎖球菌中のいくつかのタンパク質と他
の細菌性産物として、ＣＡＭＰ（クリスチン・アトキン
ス−マッチ・ピーターソン(Christin Atkins-Much Pete
rson)因子、色素（おそらくカロテノイド）、Ｒ抗原、
Ｘ抗原、抗食細胞因子、およびよく定義されていない
“肺毒素”が記述されている（Ferrieri,P.等,J.Exp.Me
d.151:56-68(1980)，Ferrieri,P.等,Rev.Inf.Dis.10
(2):1004-1071(1988)，Hill,H.R.等,Sexually Transmit
ted Diseases,McGraw-Hill,397-407頁）。以下に、Ｃタ
ンパク質について議論する。

【００１４】溶血毒が欠失したＢ群連鎖球菌同遺伝子型
株は新生ラットモデルにおいてビルレンスの減少を示さ
なかった（Weiser,J.N.等,Infec.and Immun.55:2314-23
16(1987)）。溶血毒とノイラミニダーゼ（neuraminidas
e）は共に、感染を伴う臨床的単離物中に常に存在する
訳ではない。ＣＡＭＰ因子は、Ｂ群連鎖球菌の分子量２
３５００ダルトンの細胞外タンパク質であって、ブドウ
球菌ベータ毒素（スフィンゴミエリナーゼ）の存在下で
赤血球膜の溶解を導く。Ｂ群連鎖球菌中のＣＡＭＰ因子
の遺伝子は最近クローニングされ、大腸菌内で発現した
（Schneewind,O.等，Infec.and Immun.56:2174-2179（1
988)）。Ｂ群連鎖球菌の発生病理に関する、ＣＡＭＰ因
子、ＸおよびＲ抗原および上記の他の因子の役割は、仮
にあったとしても、先行技術には開示されていない（Fe
hrenbach,F.J.等,"Bacterial Protein Toxins",Gustav
Fischer Verlag,Stuttgart(1988)；Hill,H.R.等,Sexual
lyTransmitted Diseases,McGraw-Hill,NY,397-407頁(19
84)）。

【００１５】Ｃタンパク質はＢ群連鎖球菌の細胞表面結
合性タンパク質抗原の一群であって、ウィルキンソン等
によって初めてＢ群連鎖球菌から抽出された（Wilkinso
n,H.W.等,J.Bacteriol.97:629-634(1969)，Wilkinson,
H.W.等,Infec.and Immun.4:596-604(1971)）。彼らは熱
塩酸（ＨＣｌ）を用いて細胞壁を抽出し、トリクロロ酢
酸（ＴＣＡ）を用いてタンパク質抗原を沈殿させた。抗
原性の異なる２種類のＣタンパク質集団が記述されてい
る：（１）ペプシンによる減成には感受性であるが、ト
リプシンによる減成には感受性でなく、ＴＲ（トリプシ
ン耐性）またはαと呼ばれるタンパク質群、（２）ペプ
シンおよびトリプシンによる減成に共に感受性であり、
ＴＳ（トリプシン感受性）またはβと呼ばれるもう１つ
のタンパク質群（Bevanger,L.等，Acta Path.Microbio.
Scand Sect.B.87:51-54(1979)，Bevanger,L.等，Acta P
ath.Microbio.Scand.Sect.B.89:205-209(1981)，Bevang
er,L.等，Acta Path.Microbio.Scand.Sect.B.91:231-23
4(1983)，Bevanger,L.等，Acta Path.Microbio.Scand.S
ect.B.93:113-119(1985)，Bevanger,L.等，Acta Path.M
icrobio.Immunol.Scnad.Sect.B.93:121-124(1985)，Joh
nson,D.R.等，J.Clin.Microbiol.19:506-510(1984)，Ru
ssell-Jones,G.J.等，J.Exp.Med.160:1476-1484(198
4)）。

【００１６】１９７５年、ランセフィールド等はウサギ
中に生じた抗血清によるマウスの防御研究を用いて、同
様のタンパク質抗原を保持するＢ群連鎖球菌株に対する
防御的免疫性を付与する能力について、Ｃタンパク質を
機能的に定義した（Lancefield,R.C.等，J.Exp.Med.14
2:165-179(1975)）。数多くの研究者が、ＨＣｌまたは
界面活性剤を用いるＢ群連鎖球菌細胞壁からの抽出によ
って、Ｃタンパク質と呼ばれているＢ群連鎖球菌の抗原
性タンパク質の粗調製物を得ている（Bevanger,L.等,Ac
ta Path.Microbio.Scand.Sect.B.89:205-209(1981)，Be
vanger,L.等,ActaPath.Microbio.Scand.Sect.B.93:113-
119(1985),Russell-Jones,G.J.等,J.ExpMed.160:1476-1
484(1984)，Valtonen,M.V.等,Microb.Path.1:191-204(1
986)，Wilkinson,H.W.等,Infec.and Immun.4:596-604(1
971)）。これらの抗原について報告されたサイズは、１
０〜１９０キロダルトンの間で多様であり、単一タンパ
ク質種は単離または特徴づけがなされていない（Ferrie
ri,P.等,Rev.Inf.Dis.10(2):1004-1071(1988)）。

【００１７】防御的抗血清を用いるスクリーニングによ
って、Ｃタンパク質は臨床的Ｂ群連鎖球菌単離物の約６
０％に検出することができ、すべての抗原型にＣタンパ
ク質が認められるが、その頻度は異なっている（Johnso
n,D.R.等,J.Clin Microbiol.19:506-510(1984)）。個々
のＢ群連鎖球菌単離物はＴＲおよびＴＳ抗原を共に有し
ていることもあるし、またはこれらの抗原１つだけを含
むか、あるいはどちらをも含まないこともある。部分精
製した抗原が防御的免疫を引き出す能力以外には、これ
らの抗原の発生病理に関する役割はインビトロで研究さ
れていなかった。Ｃタンパク質を保持するＢ群連鎖球菌
株を用いたインビボ研究は、Ｃタンパク質がオプソニン
作用に対する耐性に寄与しており（Payne,N.R.等,J.Inf
ec.Dis.151:672-681(1985)）、Ｃタンパク質が食菌作用
に続くＢ群連鎖球菌の細胞内殺菌を阻害しているのであ
ろう（Payne,N.R.等,Infect.and Immun.55:1243-1251(1
987)）、という幾つかの証拠を提供している。Ｃタンパ
ク質を保持しているＢ群連鎖球菌のII型株は、新生ラッ
ト敗血症モデルにおいてビルレンスがより強いことが示
されている（Ferrieri,P.等,Infect.Immun.27:1023-103
2(1980)，Ferrieri,P.等,Rev.Inf.Dis.10(2):1004-1071
(1988)）。Ｃタンパク質に関する遺伝子データが無いの
で、Ｃタンパク質が欠如した同遺伝子型株は過去におい
て研究されていなかった。ＴＳ（またはβ）Ｃタンパク
質の１つがＩｇＡに結合するという証拠がある（Russel
l-Jones,G.J.等,J.Exp Med.160:1476-1484(1984)）。し
かしながら、Ｃタンパク質によるＩｇＡの結合がビルレ
ンスに関して有している役割は、仮にあるとしても、開
示されていない。

【００１８】１９８６年、バルトネン（Valtonen）等
は、マウスモデルの防御を引き出した培養上清からＢ群
連鎖球菌タンパク質を単離した（Valtonen,M.V.等,Micr
ob.Path.1:191-204(1986)）。彼らは、１４０００ダル
トンの分子量を有するトリプシン耐性Ｂ群連鎖球菌タン
パク質を同定し、部分精製した。ウサギ中でこのタンパ
ク質に対して生じた抗血清は、これに続くIb型Ｂ群連鎖
球菌を用いた抗原投与に対してマウスを防御した（８９
％防御）。このタンパク質は、ランセフィールドの定義
によると、Ｃタンパク質である。しかしながら、このタ
ンパク質に対して生じた抗血清をＢ群連鎖球菌抗原抽出
物の免疫沈降に使用した時、より高分子量のタンパク質
のいくつかが反応性であることがわかった。このこと
は、分子量１４０００のこのタンパク質がいくつかのＢ
群連鎖球菌タンパク質に共通なエピトープを表している
か、もしくはこのタンパク質がＢ群連鎖球菌培養物の上
清中に発見された減成生成物であることを示唆し得る。
細胞壁および上清から単離されたＣタンパク質のサイズ
の多様性は、これらのＣタンパク質が一遺伝子族（ファ
ミリー）を表現しており、免疫系に対する防御機構とし
ての抗原性の多様性を維持していることを示唆し得る。

【００１９】報告された分子量の範囲と個々のＣタンパ
ク質を精製する際に直面する困難は、Ａ群連鎖球菌のＭ
タンパク質を単離する際に多くの研究者が直面した問題
と類似している（Dale,J.B.等,Infec.and Immun.46(1):
267-269(1984)，Fischetti,V.A.等,J.Exp.Med.144:32-5
3(1976)，Fischetti,V.A.等,J.Exp.Med 146:1108-1123
(1977)）。Ｍタンパク質の遺伝子は現在クローニングさ
れ、配列決定されており、いくつかの繰り返しＤＮＡ配
列を含んでいることがわかっている（Hollingshead,S.
K.等,J.Biol.Chem.261:1677-1686(1986)，Scott,J.R.
等,Proc.Natl.Acad.Sci USA 82:1822-1826(1986)，Scot
t,J.R.等,Infec.and Immun.52:609-912(1986)）。これ
らの繰り返し配列は、生産されたＭタンパク質のサイズ
の多様性をもたらす転写後のプロセッシングによるもの
であろう。これが起こる機構は理解されていない。Ｂ群
連鎖球菌のＣタンパク質について記述された分子量の範
囲は、同様のプロセスからもたらされるのかもしれな
い。

【００２０】クリート（Cleat）等は、ベバンガー（Bev
anger）から得たＢ群連鎖球菌に対する２種類の抗血清
調製物（αおよびβ）を使用して大腸菌中のＢ群連鎖球
菌ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっ
て、Ｃタンパク質のクローンニングを試みた（Bevange
r,L.等,Acta Path.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.B.9
3:113-119(1985)，Cleat,P.H.等,Infec.and Immun.55
(5):1151-1155(1987)；これらの文献は本明細書の一部
を構成する）。これらの研究者達は、抗連鎖球菌抗体に
結合するタンパク質を産生する２つのクローンについて
記述した。しかしながら彼らは、クローニングしたその
タンパク質が防御的抗体を引き出す能力を有するか否
か、あるいはこれらの遺伝子の優勢が、Ｃタンパク質を
保持することがわかっているＢ群連鎖球菌株と相関して
いるか否かを決定することができなかった。クローニン
グされた遺伝子配列の、Ｂ群連鎖球菌のビルレンスに関
する役割は研究されなかった。Ｃタンパク質は防御的抗
体を引き出すその能力によって定義されているので、こ
の研究は、そのクローンがＣタンパク質をコードしてい
るか否かの証拠を提供し得なかった。

【００２１】本発明の複合ワクチン(conjugated vacci
n) 本発明は、莢膜多糖がタンパク質骨格に共有結合してい
る複合ワクチンの開発によって、上に議論したＢ群連鎖
球菌に対する先行ワクチンの欠如を克服する。この方法
は、莢膜多糖抗原に対するＴ細胞依存性抗体応答の発生
を支援し、抗体生産のためのＴ細胞非依存性の必要条件
を回避する（Baker,C.J.等,Rev.of Infec.Dis.7:458-46
7(1985),Kasper,D.L.等,J.Infec.Dis.153:407-415(198
6)；これらの文献は本明細書の一部を構成する）。複合
ワクチンでは、Ｂ群連鎖球菌の莢膜多糖（上述）などの
抗原性分子が“担体”タンパク質またはポリペプチドに
共役結合的に結合している。この結合は結合した分子の
抗原性を増大させるよう作用する。抗原性分子および
“担体”タンパク質またはポリペプチドから複合ワクチ
ンを形成する方法は、当該技術分野において知られてい
る（Jacob,C.O.等,Eur.J.Immunol.16:1057-1062(198
6)；Parker,J.M.R.等,"Modern Approaches to Vaccine
s",Chanock,R.M.等編,133-138頁,Cold Spring Harbor L
aboratory,Cold Spring Harbor,NY(1983)；Zurawski,V.
R.等,J.Immunol.121:122-129(1978)；Klipstein,F.A.
等,Infect.Immun.37:550-557(1982)；Bessler,W.G.,Imm
unobiol.170:239-244(1985)；Posnett,D.N.等,J.Biol.C
hem.263:1719-1725(1988)；Ghose,A.C.等,Molec.Immuno
l.25:223-230(1980)；上記の文献はすべて本明細書の一
部を構成する）。

【００２２】複合ワクチンの原型は、インフルエンザ菌
に対して開発され（Anderson,P.,Infec.and Immun.39:2
23-238(1983)；Chu,C.等,Infect.Immun.40:245-256(198
3)；Lepow,M.,Pediat.Infect.Dis.J.6:804-807(1987)；
上記の文献は本明細書の一部を構成する）、このモデル
を本発明の新規ワクチンの構築に使用することができ
る。このような複合ワクチン製造の別法は、アンダーソ
ン等（Anderson,P.W.等，欧州特許公開番号第２４５０
４５号；Anderson,P.等，米国特許番号第４６７３５７
４号および同第７６５１２８３号）、フランク等（Fran
k,R.等，米国特許番号第４７８９７３５号；欧州特許公
開番号第２０６８５２号）、ゴードン（Gordon,L.K.，
米国特許番号第４６１９８２８号）、ビーチェイ（Beac
hey,E.H.，米国特許番号第４３８４５３７号）(上記の
文献はすべて本明細書の一部を構成する）によって開示
されている。

【００２３】インフルエンザ菌ワクチンなどの複合ワク
チンのためのタンパク質骨格には、細菌性莢膜多糖の供
給源である標的生物と抗原性を共有しないタンパク質が
利用されてきた（Ward,J.等,"Vaccines",Plotkin,S.A.
等編,Saunders,Philadelphia,300頁(1988)）。これとは
対照的に、本発明の複合ワクチンは、Ｂ群連鎖球菌の免
疫原性タンパク質を複合ワクチンの骨格として使用す
る。このような方法はより効果的なワクチンを導くと確
信される（Insel,R.A.等,New Eng.J.Med.(Editorial) 3
19(18):1219-1220(1988)）。本発明の複合（タンパク質
−多糖）ワクチンは、まず、複合ワクチン中に使用し得
るＢ群連鎖球菌タンパク質を特異的に特徴づける。Ｂ群
連鎖球菌特有のタンパク質はいずれも本発明の複合ワク
チンにおけるタンパク質として使用し得る。しかしなが
ら、この目的のためにはＢ群連鎖球菌のＣタンパク質を
使用することが好ましい。以下により詳細に議論するよ
うに、プラスミドｐＪＭＳ１およびｐＪＭＳ２３は連鎖
球菌Ｃタンパク質をコードするＤＮＡを含有している。
最も好ましいＣタンパク質は、このようなＤＮＡの細菌
内での発現によって得られたものである。

【００２４】前述のように、本発明は防御的Ｂ群連鎖球
菌タンパク質抗原をコードする遺伝子のクローニングと
発現に関する。これらの細菌に対する複合タンパク質を
形成するためにＢ群連鎖球菌の莢膜多糖を結合し得るタ
ンパク質骨格として、このようなタンパク質を使用する
ことが好ましい。加えて、これらのタンパク質がＢ群連
鎖球菌のビルレンスおよび免疫性に果す役割を、Ｂ群連
鎖球菌感染に対する追加の療法を開発するために利用す
ることができる。細菌由来のこれらの遺伝子の単離およ
び特徴づけによって、複合ワクチンのポリペプチド骨格
／担体のアジュバント性および抗原性を共に最適化する
ためにその遺伝子産物を操作することが可能になる。

【００２５】Ｃタンパク質の遺伝子的研究 したがって本発明は、Ｂ群連鎖球菌のＣタンパク質のク
ローニング、ビルレンスおよび免疫性に関するそれらの
役割、およびＢ群連鎖球菌に対する複合ワクチンの免疫
原として作用するそれらの能力に関する。連鎖球菌の多
くの群のクローニングについて数多くの文献が利用可能
であるにもかかわらず、Ｂ群連鎖球菌については限られ
た遺伝子操作しか達成されていない（Macrina,F.L.,An
n.Rev.Microbiol.38:193-219(1984)，Wanger,A.R.等,In
fec.and Immun.55:1170-1175(1987)）。Ｂ群連鎖球菌に
ついて最も広く使用されてきた技術は、Ｔｎ９１６の開
発およびトランスポゾン変異処理法におけるその使用で
あった（Rubens,C.E.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:72
08-7212(1987)，Wanger,A.R.等,Res.Vet.Sci.38:202-20
8(1985)）。しかしながら、Ｃタンパク質の遺伝子は複
数あり、防御的抗血清は幾つかのタンパク質に結合する
ように思われるので、トランスポゾン変異処理法による
Ｃタンパク質遺伝子のスクリーニングは非現実的であ
る。

【００２６】本発明は、新規プラスミドベクターを使用
することによって、Ｃタンパク質（およびＢ群連鎖球菌
のビルレンスに関与するか、もしくはＢ群連鎖球菌に対
する宿主免疫に影響を及ぼす他のタンパク質）のクロー
ニングを達成する。この目的のためには、天然に誘導さ
れたＢ群連鎖球菌に対する抗体に結合するタンパク質の
発現を迅速にスクリーニングできるクローニングベクタ
ーを使用することが望ましい。このような抗体は異種の
ポリクローン抗体であって、単クローン抗体ではないの
で、目的の遺伝子を同定するためには、多くの陽性クロ
ーンから容易にスクリーニングされ得るベクターを使用
する必要があった。特異的抗血清に結合する抗原の発現
に関してクローンをスクリーニングするために、いくつ
かの技術が使用可能であった（Aruffo,A.等,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 84:8573-7577(1987)）。最も広く使用さ
れた系であるλＧＴ１１はヤング（Young）とデイビス
（Davis）によって開発された（Huynh,T.V.等,"DNA Clo
ning,APractical Approach",第1巻(Glover,D.M.編),IRL
Press,Washington,49-78頁(1985)；Wong,W.W.等,J.Imm
unol.Methods.82:303-313(1985)；これらの文献は本明
細書の一部を構成する）。この技術は、ファージ溶解に
よってその産物が放出されるこの溶原性ファージ中に発
現したクローンの迅速なスクリーニングを可能にする。
この系で一般的に直面する諸問題の１つは、詳細なエン
ドヌクレアーゼ制限マッピング（地図化）、プローブの
調製およびＤＮＡ配列決定用のプラスミドベクター中に
ＤＮＡ断片をサブクローニングする必要性である。加え
て、ファージ保存液からのＤＮＡ調製は面倒であり、効
率良く研究し得る潜在的に陽性なクローンの数を制限す
る。最後に、クローニングした遺伝子からの粗タンパク
質抽出物の調製はファージベクター宿主においては問題
が多い。

【００２７】これらの問題を克服するために、本発明
は、ビルレンスおよび／または免疫性に関与するタンパ
ク質を発現させるために、クローン化細菌染色体ＤＮＡ
のスクリーニング用に開発したプラスミドベクターを提
供する。したがって本発明はさらに、Ｂ群連鎖球菌に対
して天然に産出した抗体に結合するタンパク質の発現に
ついて迅速にスクリーニングできるクローニングベクタ
ーの開発とその使用に関する。このベクターを、一般に
使用されているプラスミドクローニングベクターｐＵＣ
１２（Messing,J.等,Gene 19:269-276(1982)；Norrande
r,J.等,Gene 26:101-106(1983)；Viera,J.等,Gene 19:2
59-268(1982)；これらの文献は本明細書の一部を構成す
る）を改変することによって調製した。本発明は、以下
に記述するベクターおよびその機能的等価物に関する。
この系を使用すれば、プラスミドクローンの操作、制限
エンドヌクレアーゼによるマッピングおよびそのＤＮＡ
挿入物の配列決定、プローブの調製、および遺伝子産物
の研究が、サブクローニングの必要無く、容易にでき
る。ｐＵＣ１２は２．７３キロ塩基（kb）の高コピー数
プラスミドであり、ＣｏｌＥ１複製起源、アンピシリン
耐性およびｌａｃＺ遺伝子中のポリリンカーを有してい
る（Ausubel,F.M.等,Current Topics in Molecular Bio
logy；Greene Publ.Assn./Wiley Interscience,NY(198
7)；この文献は本明細書の一部を構成する）。

【００２８】ｐＵＣ１２のポリリンカー中に幾つかの改
変が加えられた（Aruffo,A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
84:8573-8577(1987)；この文献は本明細書の一部を構
成する）。ｐＵＣ１２改変の全体計画は、同一であるが
非付着性の複数のＢｓｔＸ１クローニング部位が存在す
るようにポリリンカーを改変すること、直鎖状宿主プラ
スミドの容易な分離を可能にする“スタッファー(stuff
er)”断片を加えること、並びに、３つの翻訳読み枠の
すべてについてｌａｃプロモーターからの発現を提供す
ること、であった。

【００２９】外来ＤＮＡを高効率で挿入するための部位
を提供するため、およびプラスミドの自己連結の可能性
を最小限にするために、反転した非付着性ＢｓｔＸ１末
端（複数）をポリリンカーに加えた。図１に示すよう
に、ｐＵＣ１２をまずＢａｍＨＩで切断し（操作１）、
そのプラスミドを、部分的に相補的な２つの合成オリゴ
ヌクレオチドアダプター：１５マー（ＧＡＴＣＣＡＴＴ
ＧＴＧＣＴＧＧ）および１１マー（ＧＴＡＡＣＡＣＧＡ
ＣＣ）と混合した（操作２）。上記のアダプターをｐＵ
Ｃ１２中に連結するとき２つの新しいＢｓｔＸ１部位が
生成するが、元来のＢａｍＨＩ部位も復元する（操作
３）。次にこのプラスミドをポリヌクレオチドキナーゼ
で処理し、連結することによって閉環状プラスミドを形
成する（操作４）。このプラスミドをＢｓｔＸ１で処理
した時に得られる末端は同一であり、かつ非付着性（ど
ちらもＧＴＧＴ突出部を有している）である（操作
５）。自己連結し得る部分的に切断されたプラスミドに
よって汚染されることなく、クローニングのための直鎖
状プラスミドが精製できるようにするために、ポリリン
カー中に第２の改変を加えた。平滑末端の３６５塩基対
（bp）のＦｎｕＤ２断片をプラスミドｐＣＤＭから得
た。ＢｓｔＸ１部位を含んでいないこのカセットまたは
“スタッファー”断片を、部分的に相補的な２つの合成
オリゴヌクレオチド：１２マー（ＡＣＡＣＧＡＧＡＴＴ
ＴＣ）および８マー（ＣＴＣＴＡＡＡＧ）に平滑末端連
結した（操作６）。アダプターを伴う得られた断片は４
ｂｐの突出部（ＡＣＡＣ）を有しており、これは操作５
に示した改変ｐＵＣ１２プラスミドの末端と相補的であ
る。この改変ｐＵＣ１２プラスミドを、アダプターを伴
ったｐＣＤＭ挿入物に連結した。得られた構築物（ｐＵ
Ｘ１２と命名した）を図２に示す。プラスミドｐＪＭＳ
１またはｐＪＭＳ２３から、導入した連鎖球菌ＤＮＡ配
列を削除することによって、ｐＵＸ１２プラスミドを再
生することができる。別法として、プラスミドｐＵＣ１
２を用いて、組換え法（または相同性（ホモロガス）組
換え）によってｐＵＸ１２作成することもできる。

【００３０】ＰＵＸ１２は発現ベクターとして使用され
るべきであるので、そのポリリンカーがｌａｃプロモー
ターに関する３つの潜在的な読み枠のすべてを含むよう
に、さらに改変することが好ましい。これらの変化は、
クローニングした遺伝子断片についての正しい読み枠を
１／６の頻度で可能にする。例えばクローニングした断
片は、２種類の配向のうちの１つの配向で、また３種類
の読み枠のうちの１つの読み枠でベクター中に挿入され
得る。＋１読み枠型を構築するために、ｐＵＸ１２プラ
スミドをそのポリリンカー中のユニーク（唯一の）部位
で切断する制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した。Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼの５’−３’ポリメラーゼ活性を用い
て、一本鎖５’付着末端を補充した。これによりＥｃｏ
ＲＩ部位の欠失がもたらされ、新しいＸｍｎＩ部位が生
成した（図３Ａ）。ＥｃｏＲＩ部位の欠失を立証し、ポ
リリンカー中に新しいＸｍｎＩ部位が存在することを確
認することによって、この構築を確認した。さらに、標
準的配列決定プライマー（Ausubel,F.M.等,Current Top
ics in Molecular Biology;Greene Publ.Assn./WileyIn
terscience,NY(1987)）を用いて、この＋１改変ｐＵＸ
１２プラスミドの二本鎖ＤＮＡ配列決定を実行した。こ
のＤＮＡ配列決定によって、ポリリンカーに４塩基対が
付与されたことが示され、ｐＵＸ１２の＋１読み枠型へ
の改変が確認された。このプラスミドをｐＵＸ１２＋１
と呼ぶ。

【００３１】−１読み枠型を構築するために、ｐＵＸ１
２ベクターを、そのポリリンカー中のユニーク部位で切
断する制限酵素ＳａｃＩで切断した。Ｔ４ポリメラーゼ
の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を用いて、その一
本鎖３’付着末端を削除して平滑末端にし、得られた平
滑末端を連結した。得られた配列は、Ｓａｃ１部位が排
除されているはずであり、また新しいＦｎｕＤ２部位が
生成しているはずである（図３Ｂ）。しかしながらｐＵ
Ｘ１２−１プラスミドの制限マッピングによると、Ｓａ
ｃ１部位が存在せず、ＦｎｕＤ２部位も存在しないこと
が示された。さらに、このポリリンカー上のＳｍａ１／
Ｘｍａ１部位がもはや存在しなかった。幾つかの潜在的
なｐＵＸ１２−１構築物をミニプレップ（微量調製）二
本鎖ＤＮＡから配列決定した。配列決定した６種の改変
プラスミドのうち、１つには１０ヌクレオチドが存在せ
ず、それゆえに−１読み枠型が生成したことがわかった
（図３Ｃ）。このことは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼが
追加のエキソヌクレアーゼ活性を有しており、ポリリン
カーの二本鎖部分をさらに削除することを示唆してい
る。それにもかかわらず、得られたプラスミドは−１読
み枠を有していた。このプラスミドをｐＵＸ１２−１と
命名した。

【００３２】Ｂ群連鎖球菌の抗原性タンパク質のクロー
ニングにおけるｐＵＸ−１２ベクターの使用を、以下の
実施例に詳述する。要約すると、Ｂ群連鎖球菌由来のＤ
ＮＡまたはそのようなＤＮＡに相補性のＤＮＡをｐＵＸ
１２、ｐＵＸ１２＋１またはｐＵＸ１２−１ベクターに
導入し、これを用いて大腸菌を形質転換する。クローニ
ングしたＤＮＡを大腸菌中で発現させ、その細胞溶解液
を試験することによって、それがＢ群連鎖球菌に対する
抗血清に結合し得るタンパク質を含むか否かを決定す
る。ｐＵＸ１２の有用性を増大させ得る潜在的に興味深
いｐＵＸ１２の改変が幾つかある。例えば、ｌａｃプロ
モーターを別のプロモーターに置換することができる
し、低コピー数ベクターを作成するために複製起源を改
変することもでき、またその薬剤耐性マーカー（標識）
を変更してもよい。

【００３３】本発明は、Ｂ群連鎖球菌特有のタンパク質
に結合したＢ群連鎖球菌特有の多糖（例えば莢膜多糖）
からなるワクチンに関する。このような複合ワクチンの
“多糖”および“タンパク質”は、Ｂ群連鎖球菌に特有
の分子と同一であってもよいし、あるいはそのような分
子の機能性誘導体であってもよい。機能性誘導体の例に
は、天然タンパク質の断片および／または天然タンパク
質の変種（例えばアミノ酸配列に変化を有するが、天然
分子が示すものと本質的に同じ免疫原性、ビルレンスま
たは抗原性を保持しているタンパク質）が含まれる。本
発明の目的のためには、哺乳類（動物またはヒト）中に
導入されたときに、Ｂ群連鎖球菌と反応し得る抗体を引
き出すあらゆる多糖が使用できる。本発明の好ましい多
糖の例には、Ｂ群連鎖球菌の多糖またはその等価物が含
まれる。本発明の目的のためには、哺乳類（動物または
ヒト）中に導入されたときに、Ｂ群連鎖球菌によって発
現されるタンパク質と反応し得る抗体を引き出すか、も
しくはＢ群連鎖球菌の多糖に対する抗体を引き出すため
に多糖の免疫原性を増大させる、あらゆるタンパク質が
使用できる。本発明の好ましいタンパク質の例には、Ｂ
群連鎖球菌のＣタンパク質またはその等価物が含まれ
る。

【００３４】本明細書の記述においては、ある細菌に天
然に伴う分子に構造または配列が本質的に類似している
場合、その多糖またはタンパク質がその細菌に“特有”
である、という。この用語は、その生物に特異な分子、
並びに、他の生物に存在するが、ヒトまたは動物宿主に
おけるその細菌のビルレンスまたは抗原性に関与する分
子、を共に包含することを意図している。本発明のワク
チンは、受動免疫化または能動免疫化のいずれかによっ
てＢ群連鎖球菌に対する耐性を付与し得る。受動免疫化
の一態様として、本ワクチンを宿主（すなわちヒトまた
は動物）ボランティア（志願者）に与え、引き出された
抗血清を回収し、これをＢ群連鎖球菌がもたらす感染を
有すると推測されるレシピエント（受血者）に直接与え
る。

【００３５】抗体または抗体断片を毒素ラベル（標識）
で標識し得ることは、この型の受動免疫化を行う際に、
もう１つのＢ群連鎖球菌感染治療法を提供する。この態
様として、Ｂ群連鎖球菌抗原を認識し得る抗体または抗
体断片を患者に投与する前に、これらを毒素分子で標識
する。このように毒素で誘導体化した分子がＢ群連鎖球
菌細胞に結合した場合、この毒素部分はその細胞の死を
もたらすであろう。第２の態様として、本発明のワクチ
ンを（妊娠または分娩中またはそれ以前の）女性（雌）
に、その女性と、（胎盤を通しての抗体の受動的取り込
みによって）その胎児または新生児の両者を防御するよ
うに作用する抗血清の産生を引き起こすのに充分な時間
と量の条件下で与える。したがって本発明は、Ｂ群連鎖
球菌による感染、または本複合ワクチンの多糖および／
またはタンパク質に対する抗血清によって認識され結合
され得る抗原を有する生物による感染、を防ぐか、また
は緩和する方法に関し、これらを提供するものである。
本明細書の記述においては、個体への投与が、ある疾患
の症状または状態の全体的または部分的な緩和（即ち抑
制）をもたらすか、あるいはその疾患に対する全体的ま
たは部分的な個体の免疫をもたらす場合に、ワクチンが
その疾患を防ぐ、または緩和するという。

【００３６】本ワクチン（またはそれが引き出す抗血
清）の投与は“予防的”にも、あるいは“治療的”にも
使用し得る。予防的に与える場合、Ｂ群連鎖球菌感染の
あらゆる症状に先んじて本化合物を与える。本化合物の
予防的投与は、これに続くあらゆる感染を防ぐか、もし
くは緩和するように作用する。治療的に与える場合、実
際の感染の症状が検出された時に本化合物を与える。本
化合物の治療的投与は実際の感染を緩和するよう作用す
る。したがって、本発明の抗炎症薬を（予期される感染
を防ぐか、もしくは緩和するために）感染の発症に先立
って与えてもよいし、あるいは実際の感染の開始後に与
えてもよい。

【００３７】レシピエント（受容者）患者がある組成物
の投与に耐え得る場合、その組成物が“医薬的に許容さ
れる”、という。そのような薬剤の投与量が生理学的に
有意である場合、その薬剤が“治療的に有効な量”で投
与された、という。ある薬剤の存在がレシピエント患者
の生理学に検出し得る変化をもたらす場合、その薬剤が
生理学的に有意である、という。当業者には理解される
であろうが、本発明のワクチンをある個体に与える場
合、それは、塩類、緩衝液類、アジュバント類、または
その組成物の有効性を改良するために望ましい他の物質
を含有し得る組成物の形態であり得る。アジュバント
は、特異的免疫応答を特異的に増大するために使用し得
る物質である。通常は、免疫系に与える前にアジュバン
トと組成物を混合するか、もしくはこれらを別個に、し
かし免疫化する動物の同じ部位に与える。アジュバント
はその組成に基づいて、おおざっぱにいくつかの群に分
類できる。これらの群には、油アジュバント（例えば、
フロインド完全および不完全アジュバント）、鉱塩類
（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＫ（ＳＯ_４）_２、
ＡｌＮＨ_４（ＳＯ_４）、シリカ、カオリン、および炭
素）、ポリヌクレオチド類（例えば、ポリＩＣおよびポ
リＡＵ酸）、およびある種の天然物質（例えば、結核菌
のワックスＤ、コリネバクテリウム・パルバム（Coryne
bacterium parvum）または百日咳菌、およびブルセラ属
の一員に存在する物質）が含まれる。これらの物質のう
ちアジュバントとして特に有用な物質は、例えばクイル
Ａ（Quil A;Superfos A/S,Denmark）などのサポニン類
である。ワクチン組成物中で使用するのに適した物質の
例は、Remengton's Pharmaceutical Sciences（Osol,A.
編,Mack Publishing Co.Easton,PA,1324-1341頁(198
0)）に記載されており、この文献は本明細書の一部を構
成する。

【００３８】本発明の治療用組成物は、注射、迅速な注
入、鼻咽頭吸収（鼻咽頭内）、経皮吸収によって非経口
的に、あるいは経口的に投与することができる。あるい
は、本組成物を筋肉内あるいは静脈内に投与してもよ
い。非経口投与用組成物には、滅菌した水性または非水
性溶液剤、懸濁剤、および乳剤が含まれる。非水性溶媒
の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチル
など注射可能な有機エステルである。皮膚透過性を増大
させ、抗原吸収を促進するために、担体または密封包帯
を使用することができる。経口投与用の液体剤形は一般
的に、その液体剤形を含有するリポソーム溶液剤を含み
得る。懸濁化リポソームの適切な形態には、当該技術分
野で通常に使用される精製水などの不活性希釈剤を含有
するエリキシル剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、およびシロ
ップ剤が含まれる。不活性希釈剤に加えて、このような
組成物に、アジュバント、湿潤剤、乳化剤および懸濁化
剤、または甘味料、香料、あるいは芳香剤を含有させて
もよい。

【００３９】多重投与法を用いる場合、免疫化のタイミ
ングには多くの異なる技術が存在する。免疫化された動
物が発現する免疫グロブリン種（レパートリー）の多様
性とレベルを増大させるために、本発明の組成物を複数
回使用することができる。典型的には、多重免疫化を行
う場合、１〜２カ月置きに行う。本発明によれば、治療
用組成物の“有効量”とは、望ましい生物学的効果を達
成するのに充分な量のことである。一般的には、本組成
物の有効量を提供するのに必要な投与量は、動物または
ヒトの年令、状態、性別、および疾患の程度、また他に
も存在する場合には、当業者によって調節され得る他の
変数、などの因子に応じて変化するであろう。

【００４０】本発明の抗原性調製物は、有効量の単一投
与または複数投与によって投与され得る。本発明の組成
物の有効量は０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ／投与、よ
り好ましくは０．１〜５００μｇ／ｍｌ／投与、最も好
ましくは１０〜３００μｇ／ｍｌ／投与の範囲で変化し
得る。 以上で本発明の一般的記述を終えたので、以下
の実施例を参照することによって本発明をより容易に理
解できるであろう。例示のために以下の実施例を提供す
るが、指定しない限り、以下の実施例は本発明の制限を
意図するものではない。

【００４１】微 生 物 Ａ．寄託の同定 別紙の別の寄託が同定されている。 （寄託機関の名称） アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （寄託機関の住所） アメリカ合衆国２０８５２メリーランド ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１番 （寄託日） （受託番号） １９８９年 ９月１５日 ４０６５９ Ｂ．追加表示 プラスミドＤＮＡ、ｐＪＭＳ１ デンマークの指定のために、本出願人は、本出願が受諾
されるか、もしくは最終的に受諾されることなく決定を
うけるまで、本微生物試料のみが専門家に対して供給さ
れることを要求する。(第２２(７)項)。

【００４２】微 生 物 Ｂ(続き)．追加表示 欧州特許が求められている指定国に関しては、欧州特許
の付与の告示が公表されるまで、または出願が拒絶され
もしくは取り下げられ、または取り下げられたとみなさ
れる日まで、寄託された微生物の試料は、その試料を要
求する人により指定された専門家に対して前記の試料を
支給する場合にのみ利用可能である(規則２８(４)ＥＰ
Ｃ)。

【００４３】微 生 物 Ａ．寄託の同定 別紙の別の寄託が同定されている。 （寄託機関の名称） アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （寄託機関の住所） アメリカ合衆国２０８５２メリーランド ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１番 （寄託日） （受託番号） １９８９年 ９月１５日 ４０６６０ Ｂ．追加表示 プラスミドＤＮＡ、ｐＪＭＳ２３ デンマークの指定のために、本出願人は、本発明出願が
受諾されるか、もしくは最終的に受諾されることなく決
定をうけるまで、本微生物試料のみが専門家に対して供
給されることを要求する。(第２２(７)項)。

【００４４】微 生 物 Ｂ(続き)．追加表示 欧州特許が求められている指定国に関しては、欧州特許
の付与の告示が公表されるまで、または出願が拒絶され
もしくは取り下げられ、または取り下げられたとみなさ
れる日まで、寄託された微生物の試料は、その試料を要
求する人により指定された専門家に対して前記の試料を
支給する場合にのみ利用可能である(規則２８(４)ＥＰ
Ｃ)。

【００４５】

【実施例】実施例１ ｐＵＸ１２ベクターのクローニング効率 ｐＵＸ１２ベクターのクローニング効率を試験するた
め、並びに改変した読み枠が正しく転写されるか否かを
決定するために、いくつかの実験を計画した。これらの
実験の結果を以下に簡単に要約する：

【００４６】１．ＤＮＡ断片をｐＵＸ１２中にクローニ
ングするために、３種類の構築物、即ちｐＵＸ１２（元
来の“ゼロ”読み枠構築物）、ｐＵＸ１２＋１およびｐ
ＵＸ１２−１を等モル濃度で混合した。次にこれらのプ
ラスミドをＢｓｔＸ１で切断しすることにより、ポリリ
ンカー内のスタッファー断片を切断した。低融点アガロ
ースまたは酢酸カリウム勾配（Aruffo,A.等,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 84:8573-8577(1987)，Ausubel,F.M.等,Cu
rrent Topics in Molecular Biology;Greene Publ.Ass
n./Wiley Interscience,NY(1987)）を用いて、スタッフ
ァー断片をプラスミドから分離した。クローニングされ
るべきＤＮＡを、平滑末端を与える制限酵素（平滑末端
を与える制限酵素はどれでも使用できる）で切断した。
必要ならば、シグナル鎖末端（signal stranded ends）
を伴っている二本鎖ＤＮＡを、平滑末端が生成するよう
に改変することができる。これらのＤＮＡ断片の平滑末
端を２種類の合成オリゴヌクレオチドアダプターと混合
した。これらはスタッファー断片を調製する際に使用し
た１２マーおよび８マーと同一である。改変したＤＮＡ
断片を、取り込まれなかった合成オリゴヌクレオチドか
ら、酢酸カリウム勾配上で分離した。次にこれらの断片
を直鎖状ｐＵＸ１２族プラスミド中に連結し、これらを
大腸菌の形質転換に使用した。

【００４７】ｐＵＸ１２ベクターが、アダプターを伴う
挿入物のクローニングにとって最適な条件下では低頻度
で自己連結することを立証するために、第２の薬剤耐性
マーカーをｐＵＸ１２中にクローニングした。図１に示
すように、ｐＵＸ１２はβ−ラクタマーゼ遺伝子を有し
ており、アンピシリンに対する耐性（ａｍｐ^Ｒ）を保持
している。第２のマーカーのクローニングの論理的根拠
は、両薬剤耐性マーカーを含有するクローンと、典型的
なクローニング条件下で自己連結したためにアンピシリ
ン耐性のみが発現するｐＵＸ１２プラスミドとの比を比
較することにある。プラスミドｐＢＲ３２２由来のテト
ラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ^Ｒ）をｐＵＸ１２のポ
リリンカー中に上述のアダプターと共にクローニングし
た。一連の試験的連結を行うことによって、断片末端に
対するオリゴヌクレオチドアダプターの至適濃度、並び
に、連結および形質転換のための直鎖状ｐＵＸ１２プラ
スミドに対する改変挿入物の比を確立した。ｔｅｔ^Ｒ遺
伝子をマーカーとして使用することにより、アンピシリ
ン含有プレート上で選択した形質転換体の９９％以上が
ｔｅｔ^Ｒマーカーをも保持するようなクローニングパラ
メーターを決定することができた。したがってこの系に
おける自己連結の頻度は極めて低く、ｐＵＸ１２中のラ
イブラリーをスクリーニングする前に、ポリリンカー中
の挿入物の存在についてスクリーニングする必要はな
い。

【００４８】２．ｐＵＸ１２のポリリンカー中の翻訳読
み枠の位置を確認するために、配列と産物がわかってお
り、それ自身のプロモーターが欠如している構造遺伝子
をクローニングした。この目的のために、プラスミド上
に保持されたｔｏｘ構造遺伝子の変異体（Costa,J.J.
等、J.Bacteriol.148(1):124-130(1981)，Michel,J.L.
等,J.Virol.42:510-518(1982)；これらの文献は本明細
書の一部を構成する）を選択した。このプラスミドｐＡ
ＢＣ４０２を制限エンドヌクレアーゼＡｐＡＩおよびＨ
ｉｎｄIIIで同時に処理した（Bishai,W.R.等,J.Bacteri
ol.169:1554-1563(1987)，Bishai,W.R.等,J.Bacteriol.
169:5140-5151(1987)；これらの文献は本明細書の一部
を構成する）。ＡｐａＩ部位は構造遺伝子内のＮ末端付
近にあり、ＨｉｎｄIII部位はｔｏｘ遺伝子のＣ末端の
すぐ外側に存在する。低融点アガロースを用いて、この
１．２ｋｂの制限断片をｐＡＢＣ４０２ベクターの残り
の４．１ｋｂから分離した。

【００４９】クローニングのための平滑末端を作成する
ために、このｔｏｘ断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで
処理した。このポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性
によってＡｐａＩの３’末端が削除され、ポリメラーゼ
活性によってＨｉｎｄIII部位の突出部が補充された（M
aniatis,T.等,Molecular Cloning,A Laboratory Manua
l,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(1
982)）。平滑末端を有するこの精製断片を３種類の読み
枠すべてを含むｐＵＸ１２の混合物中に連結した。個々
の形質転換体を任意に選択し、制限マッピングでスクリ
ーニングすることによって、その挿入物の配向と読み枠
を決定した。さらに、ポリリンカー／アダプター／挿入
物領域のヌクレオチド配列を決定した。６種類の潜在的
な配向と読み枠の組み合わせのすべてが同定された。最
後に、これらのクローンからの抽出物を、ジフテリア毒
素に対する抗血清でプローブするウエスタンブロットを
用いてスクリーニングした（Blake,M.S.等,Analyt.Bioc
hem.136:175-179(1984)，Murphy,J.R.等,Curr.Topics M
icrobiol.and Immun.118:235-251(1985)）。反応性毒素
に関与するタンパク質は、正しい配向および読み枠にあ
る構造遺伝子を含むクローンからのみ検出された。この
プラスミドをｐＵＤＴＡＨ−１と命名した。そのポリリ
ンカーのＤＮＡ配列およびｔｏｘ構造遺伝子の始まりを
表１に示す。記載した配列は、ｐＵＤＴＡＨ−１中のｔ
ｏｘ’構造遺伝子の始まりのＤＮＡ配列である。ＡＴＧ
は転写物（ｌａｃＺ’）の開始シグナルであり、ＧＡＴ
はｐＵＸ１２の改変ポリリンカーの始まりであり、ＧＣ
Ｃはｔｏｘ’遺伝子の正しい翻訳読み枠の始まりであ
る。

【００５０】

【表１】

【００５１】実施例２ Ｂ群連鎖球菌からの染色体ＤＮＡの精製 Ｂ群連鎖球菌からの染色体ＤＮＡの精製を達成するため
に、Ｂ群連鎖球菌のＡ９０９株（Lancefield,R.C.等,J.
Exp.Med.142:165-179(1975)）から、ルーベンス等（Rub
ens,C.E.等,Proc.Natl.Acad.Sci USA 84:7208-7212(198
7)）によって改良されたハル（Hull）等の方法（Hull,
R.A.等,Infect.and Immun.33:933-938(1981)；上記の両
文献は本明細書の一部を構成する）によって染色体ＤＮ
Ａを単離した。。要約すると、ムタノリシン（mutanoly
sin）を用いて、Ｂ群連鎖球菌Ａ９０９株（Ia/c）をプ
ロトプラストに変換した。得られた表面抽出物が、無傷
の該細菌に対して生じた防御的抗血清と免疫反応する数
多くのタンパク質を含有することがわかった。不溶性タ
ンパク質画分を、従来のカラムクロマトグラフィーを用
いて部分精製した。単一の１４キロダルトン（kd）種が
高度に濃縮された分画を含む２つの分画を使用してウサ
ギを免疫化した。これらの部分精製Ｂ群連鎖球菌タンパ
ク質に対して生じた抗血清は、マウスビルレンス検定に
おいて、Ｃタンパク質を保持するＢ群連鎖球菌の異種の
（ヘテロロガス）莢膜型に対して受動的防御を付与し得
ることがわかった。

【００５２】Ｂ群連鎖球菌ＤＮＡを、浮揚性密度塩化セ
シウム（CsCl）勾配中で遠心分離することによって精製
し、その染色体ＤＮＡをＴＡＥ緩衝液（ｐＨ８.０）(Ma
niatis,T.等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(198
2)）に対して徹底的に透析した。Ｂ群連鎖球菌のＡ９０
９株は１型莢膜を有しており、Ｃタンパク質を発現し、
過去においてＣタンパク質の研究に使用されている（Va
ltones,M.V.等,Microb.Path.1:191-204(1986)）。ま
た、スクリーニング用の防御的抗血清の調製に使用した
のもＢ群連鎖球菌のこの株である。Ｂ群連鎖球菌染色体
ＤＮＡの収量は平均して、Ｂ群連鎖球菌の終夜培養物各
５００ｍｌあたり３〜５ｍｇである。精製したこのＤＮ
Ａを、一般に使用される２４種類の制限エンドヌクレア
ーゼで個別に消化し、得られた断片を１．０％アガロー
スゲルにかけた。クローニングベクターで通常使用され
るポリリンカー上にユニーク部位を有するものを含め
て、広範囲の酵素を選択した。ゲルの臭化エチジウム
（EtBr）染色は、すべての制限酵素がＢ群連鎖球菌ＤＮ
Ａの非連続な断片サイズ分布を与えることを明らかにし
た。このことは、Ｂ群連鎖球菌ＤＮＡが試験した制限酵
素のいずれに対しても修飾されないことを示唆してい
る。

【００５３】このＤＮＡのブロック連結に対する阻害剤
が存在するか否かを決定するために、上述の制限エンド
ヌクレアーゼ消化物をエタノール沈殿し、連結緩衝液中
に入れ、ＤＮＡリガーゼと共に１４℃で終夜インキュベ
ートした。これらの試料を再度１．０％アガロースゲル
にかけ、ＥｔＢｒで染色した。得られた制限様式（パタ
ーン）はより高分子量の分布を示した。したがってＢ群
連鎖球菌ＤＮＡの連結の阻害はなかった。

【００５４】実施例３ Ｂ群連鎖球菌染色体ＤＮＡのライブラリーの調製 Ｂ群連鎖球菌染色体ＤＮＡのライブラリーのｐＵＸ１２
中での調製、およびそれによる大腸菌の形質転換を以下
のように行った。Ｂ群連鎖球菌染色体ＤＮＡをクローニ
ング用に切断するために、広範囲にわたる制限断片サイ
ズの分布を与える４種類の制限酵素を選択した。ｐＵＸ
１２ベクターとアダプターは平滑末端断片をクローニン
グする場合に最も有効である。選択した酵素は４塩基対
部位を認識し、平滑末端を残す。Ｂ群連鎖球菌ＤＮＡ
を、Ａｌｕ１、ＦｕｎＤ２、ＨａｅIIIおよびＲｓａＩ
で個別に部分消化した。得られた断片を混合し、フェノ
ール／クロロホルムで精製し、エタノール沈殿し、連結
緩衝液中に再懸濁した（Maniatis,T.等,Molecular Clon
ing,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,C
old Spring Harbor,NY(1982)）。Ｂ群連鎖球菌ＤＮＡ断
片 １μｇを、１２マーのオリゴヌクレオチドアダプタ
ー ３μｇおよび８マーのオリゴヌクレオチドアダプタ
ー ２μｇと混合した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ ３μｌ
（６００単位；New England Biolabs）を加え、その反
応液を終夜１４℃に維持した。遊離のリンカーをＢ群連
鎖球菌ＤＮＡ断片から酢酸カリウム速度勾配上で分離し
た（Aruffo,A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:8573-857
7(1987)）。

【００５５】３種類の翻訳読み枠すべてを含むｐＵＸ１
２プラスミドをＢｓｔＸ１で消化し、そのスタッファー
断片を低融点アガロースゲルを用いて除去した。アダプ
ターを付加したＢ群連鎖球菌断片 １０ｎｇを、連結緩
衝液 １００μｌ中の直鎖状ｐＵＸ１２ベクター １００
ｎｇと混合し、これに０．１％ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを
加えることによって、Ｂ群連鎖球菌ライブラリーを調製
した。この連結反応液を終夜１４℃に維持した後、これ
を用いて、アンピシリンを含有するプレート上の大腸菌
ＭＣ１０６１株を形質転換した（Ausubel,F.M.等,Curre
nt Topics in Molecular Biology(1987)）。得られた形
質転換体のうち１６種を単離し、ＬＢ中で終夜成育し、
ミニプレップによってプラスミドＤＮＡを単離した。こ
のプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、１．０％ア
ガロースゲルにかけた。スクリーニングしたすべてのプ
ラスミドがｐＵＸ１２ベクター中に挿入物を含んでお
り、挿入物の平均サイズは１．４ｋｂであった。現在ま
でのところ、２００以上のクローンから得られたプラス
ミドＤＮＡをスクリーニングし、ポリリンカー中に挿入
物を欠くと思われたクローンは１つだけであった。

【００５６】実施例４ ライブラリーのスクリーニングに使用する防御的抗血清
の特徴づけ 既に議論したように、Ｃタンパク質は種々の技術によっ
て部分精製されており、種々の技術によって防御的抗血
清が部分精製されており、幾人かの研究者によって防御
的抗血清が調製されている（Bevanger,L.等,Acta Path.
Microbio.Scand.Sect.B.93:113-119(1985)，Russell-Jo
nes,G.J.等,J.Exp.Med.160:1476-1484(1984)，Wilkinso
n,H.W.等,Infec.and Immun.4:596-604(1971)）。防御的
抗体を引き出すＢ群連鎖球菌の上清から分子量１４００
０のタンパク質を単離したバルトネン（Valtonen）、カ
スパーおよびレビー（Levy）の実験を再現するために、
一連の実験を実行した（Valatonen,M.V.等,Microb.Pat
h.1:191-204(1982);この文献は本明細書の一部を構成す
る）。この実験によって、Ｃタンパク質の濃縮および精
製に先立ってＢ群連鎖球菌培養物の上清にタンパク質加
水分解阻害剤を添加すると（Wong,W.W.等,J.Immunol.Me
thods.82:303-313(1985))、分子量１４０００のタンパ
ク質が上清中の主要タンパク質ではなくなってしまうこ
とが明らかになった。このことは、このタンパク質が、
Ｂ群連鎖球菌培養物の上清中のより高分子量のＣタンパ
ク質のタンパク質加水分解によってもたらされることを
示している。

【００５７】実施例５ プラスミドに基づくベクター中での発現について スクリーニングするための条件の最適化 上述のように、発現を検出するために最も一般的に使用
されるベクターはλＧＴ１１に基づいている（Young,R.
A.等,Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:1194-1198(1983)）。
本発明者らは、細菌コロニーの抗体スクリーニングに関
して過去に記述された２つの方法を組み合わせることに
よって、ｐＵＸ１２プラスミドベクターからの発現の検
出感度を増大させることができた。上述のライブラリー
から得た形質転換体を終夜プレートに置き、得られたコ
ロニーをニトロセルロースフィルター（Bio-Rad）に移
した。このフィルターを密閉容器中のクロロホルム（Ｃ
ＨＣＬ_３）で飽和した雰囲気下に置くことによって、こ
れらのコロニーを溶解した。次に、ヘルフマン（Helfma
n）等が記述したように（Helfman,D.M.等，Proc.Natl.A
cad.USA 80:31-35（1983)）、このフィルターを溶解_３
緩衝液（lysis_３ buffer）中に入れ、終夜インキュベー
トした。バイオラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Labora
tories）によって調製されたエクスプレス−ブロットア
ッセイキット（Express-Blot Assay Kit）中の西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ複合アフィニティー精製ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ（Horseradish Peroxidase Conjugated,Affini
ty Purified Goat Anti-Rabbit IgG)（比１：３００
０）および市販の大腸菌溶解液（比１：２００）を用い
て、抗体スクリーニングを行った。上述のようにコロニ
ーをクロロホルムで予備処理し、ＤＮａｓｅおよびリゾ
チームと共に終夜インキュベートすることにより、必要
な一次抗体の比を１：５００から１：５０００に減少さ
せることができた。

【００５８】実施例６ 陽性クローンおよびそのタンパク質産物の初期分析 Ｂ群連鎖球菌染色体ＤＮＡのｐＵＸ１２ベクター中のラ
イブラリーを上述の防御的抗Ｃタンパク質抗血清でスク
リーニングした。Ｂ群連鎖球菌ライブラリーは１．４ｋ
ｂの平均断片サイズを有していた。形質転換体を上述の
ようにスクリーニングした後、サブクローニングし、抗
血清を用いて３回再スクリーニングした。スクリーニン
グした２００００クローンのうち、防御的抗血清と反応
するクローンが３５種類独立に単離された。これらのク
ローンをＳ１〜Ｓ３５と命名し、それぞれのクローンに
含まれるプラスミドをｐＪＭＳ１〜ｐＪＭＳ３５と命名
した。これらのクローンのサイズは０．９〜１３．７ｋ
ｂの範囲にあり、４．５ｋｂの平均サイズを有する。 プラスミドＤＮＡをこれらのクローンからミニプレップ
によって単離し、その挿入物を４種類の制限エンドヌク
レアーゼで調査した。それぞれの群内で同一の挿入物サ
イズおよび共通の制限エンドヌクレアーゼマッピング様
式を共有することに基づいて、１４のクローンを３つの
群に分類することができる。以下に議論するクローンＳ
１およびＳ２３は異なる群に属することがわかった。個
々のクローンの制限様式をさらに比較することによっ
て、共通の制限断片を共有する２４クローンを同定する
ことができた。クローンＳ１およびＳ２３は共通の制限
断片を全く有さないことがわかった。

【００５９】クローンの抽出物を調製し、ウエスタンブ
ロットにかけ、ライブラリーのスクリーニングに使用し
た抗血清でプローブした。６種類のタンパク質抗原のサ
イズ群（Ａ〜Ｆ）を同定した。制限エンドヌクレアーゼ
マッピングおよびウエスタンブロットから得たデータを
組み合わせることによって、３５クローンのうちの２４
クローンを６種類の異なるタンパク質抗原様式に分類す
ることができた(表２)。この初期分類は、単に関連する
遺伝子の潜在的な数を粗く調査するために行っただけで
ある。Ｓ１は３．５ｋｂのサイズであって、抗原タンパ
ク質様式Ａに属することがわかった。Ｓ２３は１３．７
ｋｂのサイズであって、抗原タンパク質様式Ｄに属する
ことがわかった。

【００６０】

【表２】 クローンの抽出物のウエスタンブロットを、Ｃタンパク
質を発現しないＢ群連鎖球菌株に対する抗血清でプロー
ブした場合、１つのクローン群のみが陽性であった（タ
ンパク質プロフィールＢ）。このことは陽性クローンの
大半がＣタンパク質を保持する株に特有なタンパク質を
発現するが、これらのタンパク質はＢ群連鎖球菌のすべ
ての株に共通ではないことを示している。

【００６１】実施例７ クローニングした遺伝子配列の特徴づけ Ｂ群連鎖球菌が発現するＣタンパク質の実際の数は決定
されていない。Ｃ．Ｄ．ＣからのＣタンパク質分類化抗
血清（typing antisera）を特徴づけたブラディ（Brad
y）等による最近の免疫学的研究は、４種類の別個の抗
原を同定した（Brady,L.J.等,J.Infect.Dis.158(5):965
-972(1988)）。Ｂ群連鎖球菌の推定上のＣタンパク質ク
ローンを予備的に遺伝子的および免疫学的に特徴づける
ことによって、４ないし５遺伝子が、Ｃタンパク質を保
持することがわかっているＢ群連鎖球菌株上に存在する
タンパク質をコードしていることが示唆される。クロー
ニングした遺伝子産物がＣタンパク質を表現しているか
否かを決定するために、２群の実験を実行した。上述の
ように、Ｃタンパク質の研究は２つの表現型：ペプシン
による減成には感受性であるが、トリプシンに対しては
感受性でない一群のタンパク質（ＴＲまたはαと呼ばれ
ている）、並びに、ペプシンおよびトリプシンによる減
成のどちらに対しても感受性であるもう１つのタンパク
質群（ＴＳまたはβと呼ばれている)、を定義していた
（Johnson,D.R.等,J.Clin.Microbiol.19:506-510(198
4)，Russell-Jones,G.J.等,J.Exp.Med.160:1476-1484(1
984)）。

【００６２】分類化抗血清、αおよびβ、を用いて、ク
ローニングした遺伝子産物をウエスタンブロット上でス
クリーニングした（Bevanger,L.等,Acta Path.Microbi
o.Scand.Sect.B.87:51-54(1979)；Bevanger,L.等,Acta
Path.Microbio.Scand.Sect.B.89:205-209(1981)；Bevan
ger,L.等,Acta Path.Microbio.Scand.Sec.B.91:231-234
(1983)；Bevanger,L.等,Acta Path.Microbio.Scand.Sec
t.B.93:113-119(1985)；Bevanger,L.等,Acta Path.Micr
obio.Immmunol.Scand.Sec.B.93:121-124(1985)；これら
の文献は本明細書の一部を構成する）。 α分類化血清はタンパク質プロフィールＤを同定し、β
分類化抗血清はタンパク質プロフィールＡを同定した。
これらのタンパク質をペプシンおよびトリプシン消化に
かけた。タンパク質プロフィールＤはペプシンに対して
感受性であるが、トリプシンに対しては非感受性であ
り、タンパク質プロフィールＡはペプシンおよびトリプ
シンの両者に対して感受性である。これらの結果は過去
の研究と一致しており、少なくとも２つのＣタンパク質
遺伝子がクローニングされたことを裏付けている。

【００６３】最も重要で特徴的なＣタンパク質の性質
は、それらがＣタンパク質を発現するＢ群連鎖球菌株に
対する防御的抗体を引き出し得るということである。ク
ローニングした遺伝子産物に対する抗血清を調製するた
めには、幾つかの方法が使用できる。例えば大腸菌クロ
ーンの溶解液が、導入したＢ群連鎖球菌タンパク質また
は大腸菌タンパク質に対する抗体を引き出し得るタンパ
ク質を含むか否かを決定するために、その大腸菌クロー
ンの溶解液をウサギに直接注射することできる。交差反
応性抗体の数を減らすために、得られた抗血清を試験す
る前に、得られた抗血清を大腸菌の溶解液で予備吸収さ
せることができる。このような溶解液は、交差反応性抗
体の数を減少させるために、発現についてクローンをス
クリーニングするために使用するコロニーブロットにお
いても、またＢ群連鎖球菌の細胞抽出物および部分精製
したＢ群連鎖球菌タンパク質の両者を研究するために使
用するウエスタンブロットにおいても、使用することが
できる。クローニングしたＢ群連鎖球菌タンパク質抗原
に対する抗血清を生じさせるために、タンパク質プロフ
ィールＡ、ＢおよびＤの代表的クローンを超音波処理
し、ウサギに注射する（Lancefield,R.C.等,J.Exp.Med.
142:165-179(1975)，Valtonen,M.V.等,Microb.Path.1:1
91-204(1986)）。対照ウサギにはポリリンカー中に挿入
物を含まないｐＵＸ１２を保持する大腸菌を注射する。
この抗血清を大腸菌溶解液で予備吸着させ、まずウエス
タンブロット中でライブラリー中のクローンの抽出物に
対してスクリーニングする。したがって、クローン間の
交差反応性エピトープが存在するか否かを決定すること
ができ、これらの抗血清が予備的なスクリーニング中に
同定したクローン化タンパク質に対して注がれることを
確認することができる。

【００６４】別法として、予備吸着させた抗血清をマウ
ス防御モデル中で試験することもできる。この古典的モ
デルでは、ウサギの抗血清をマウスに腹腔内注射する
（Lancefield,R.C.等,J.Exp.Med.142:165-179(197
5)）。翌日、Ｃタンパク質を保持することがわかってい
る生育可能なＢ群連鎖球菌のＬＤ_９０を腹腔内に再度注
射する。終了点は、４８時間後のマウスの死亡である。
クローニングした遺伝子配列によって発現するタンパク
質の免疫原性を試験するために、ｐＪＭＳ１およびｐＪ
ＭＳ２３を含有する大腸菌細胞を成育し、これを用いて
細胞抽出物を調製した。次にこれらの抽出物を用いてウ
サギを免疫化した。Ｓ１およびＳ２３抽出物による免疫
化に応答して生じた抗血清を、マウス防御モデルを用い
て試験した。マウス防御モデル実験を行った時、タンパ
ク質プロフィールＡおよびＤを代表するクローン（それ
ぞれＳ１およびＳ２３）から生じた抗血清が、それぞれ
防御的であることがわかった。タンパク質プロフィール
Ｃを代表するクローンから得た抗血清は防御的ではな
く、対照抗血清も防御を示さなかった。またタンパク質
プロフィールＣを発現するクローンに対して生じた抗血
清は、Ｃタンパク質を保持しないＢ群連鎖球菌株から抽
出したタンパク質を結合した。したがってこの群のクロ
ーンはＣタンパク質をコードしていない。要約すると、
６群のクローンのうち５群が、Ｃタンパク質を発現する
Ｂ群連鎖球菌株に特有の（ユニークな）タンパク質をコ
ードしていない。

【００６５】２つのクローン群の生化学的、免疫学的お
よび機能的な初期分析によって、少なくとも２つのＣタ
ンパク質遺伝子（Ｓ１およびＳ２３）のクローニングが
成功していることが立証された。これは、Ｂ群連鎖球菌
からクローニングされた単一ポリペプチド遺伝子産物が
防御的免疫を引き出し得るという最初の証明である。Ｓ
１に対する抗体が、Ａ９０９抽出物の５０ｋｄおよび６
０ｋｄのバンドを結合し得ることがわかった。Ｓ２３に
対する抗体が、Ｂ群連鎖球菌表面抽出物中の分子量＞１
８０ｋｄ〜４０ｋｄの範囲のバンドの定期的な繰り返し
様式に結合し得ることがわかった。Ａ９０９抽出物から
誘導した単クローン抗体は、これと同じ免疫反応性の繰
り返し様式を示す。このことは異なる分子量のタンパク
質中で単一のエピトープが認識されたことを示してお
り、規則的な繰り返し構造を示唆している。Ｓ１抗血清
によって認識されるタンパク質はペプシンおよびトリプ
シン減成に対して感受性であり、一方、Ｓ２３抗血清に
よって認識されるタンパク質はペプシンに対しては感受
性であるが、トリプシンに対しては非感受性であった。
この実験は、Ｂ群連鎖球菌から部分精製され、Ｂ群連鎖
球菌クローン化遺伝子から発現したこれらのタンパク質
が、Ｂ群連鎖球菌のＣタンパク質のαおよびβ抗原を表
現していることを示している。上述の３５の潜在的Ｃタ
ンパク質クローンを遺伝子的および免疫学的に評価する
ことによって、存在する遺伝子の数を決定することがで
きる。さらにこれらのクローンの単離は、Ｂ群連鎖球菌
感染に対する防御的免疫を付与する遺伝子の同定を可能
にする。初期クローンを得るために使用した防御的抗血
清は、Ｃタンパク質以外のタンパク質をも検出したよう
である。このような他のタンパク質を連鎖球菌Ｂ感染に
対する治療において使用することも、本発明に包含され
る。本発明の主たる目的は免疫性に関与するタンパク質
の単離および同定であるので、これらのクローンによっ
て発現したタンパク質に対して調製した抗血清を、マウ
ス防御モデルで研究することができる。防御的なタンパ
ク質を発現するこれらの遺伝子は複合ワクチン用のタン
パク質として好ましい。

【００６６】上述のように、大腸菌／ｐＵＸ１２ベクタ
ーライブラリー中のＢ群連鎖球菌染色体ＤＮＡを、防御
的抗血清で初期スクリーニングすることによって、３５
クローンが独立に単離された。これらのクローン化断片
の制限エンドヌクレーゼマッピング、並びに、これらの
クローンから得たタンパク質抽出物のウエスタンブロッ
トのデータを組み合わせることによって、３５クローン
のうちの２４クローンを６種の異なるタンパク質抗原様
式（表２）に仮分類することができた。この調査は、単
離された遺伝子の潜在的な数を決定することを可能にし
た。このようなクローンをさらに特徴づけるために、コ
ロニーブロットを用いて、どのクローンが共通のＤＮＡ
配列を共有しているかを決定することが好ましい。この
ようなブロットのためには、それぞれのクローンの単一
コロニーをＬＢブロスの入った微量滴定皿のウェルに入
れ、３７℃で終夜生育させる。対照コロニーには宿主大
腸菌株およびｐＵＸ１２を含有する大腸菌株が含まれ
る。この終夜培養物を、同一培養培地を含む寒天プレー
ト上のニトロセルロースフィルター上に移す。これらの
プレートを３７℃で８時間以上生育させ、新鮮に生育し
たコロニーを含有するニトロセルロースフィルターを調
製し、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成についてスクリ
ーニングする。プローブを、ｐＵＸ１２ライブラリー中
のＢ群連鎖球菌ＤＮＡ挿入物から調製する。ミニプレッ
プを用いてそれらのクローンからプラスミドＤＮＡを得
る。ｐＵＸ１２中のポリリンカーはＢａｍＨ１およびＢ
ｓｔＸ１部位の両者を挿入物の両側に有している。した
がって、ＢａｍＨ１かＢｓｔＨ１のいずれかを用いて、
プラスミドからＢ群連鎖球菌挿入物を切り出す。幸運な
ことに、Ｂ群連鎖球菌の染色体ＤＮＡにはＢａｍＨ１部
位がほとんど無く、挿入物の多くはＢａｍＨＩ消化の結
果、一断片としてベクターから取り出される。低融点ア
ガロースを用いてこれらの挿入物からプラスミドベクタ
ーを分離する。これらの挿入物をアガロースゲルから切
り出し、ランダムプライム標識化（random prime label
ling）によって直接標識する。次に、標識したこれらの
挿入物を用いてコロニーブロットをプローブする。これ
により、ＤＮＡ配列を共有するクローンを同定すること
ができる。

【００６７】このように上述のコロニーブロットから得
た情報に基づいて、３５クローンを、ＤＮＡ配列を共有
する群に分類する。これらの群を複数の制限エンドヌク
レアーゼでマッピングすることにより、それぞれのクロ
ーンと他のクローンとのそのＤＮＡ領域内での関係を決
定する。宿主プラスミドｐＵＸ１２はポリリンカー中に
のみ存在する多くのユニーク制限エンドヌクレアーゼ部
位を有しているので、プラスミドミリプレップＤＮＡを
用いて、挿入物を別個に精製する必要なく、制限マッピ
ングの多くを実行できる。コロニーブロットのデータを
詳細な制限マッピングと組み合わせることによって、含
まれている遺伝子座の数を合理的に評価することができ
る。クローン群のいくつかが興味ある遺伝子をどこにも
表していない場合、これらのクローンを用いて、より完
全な他の遺伝子コピーを染色体ライブラリーから単離す
る必要があるかも知れない。しかしながら、最初に単離
した３５クローンの平均サイズ分布が大きいことを考慮
すると、いくつかは完全な読み取り枠を表しているであ
ろうと思われる。

【００６８】遺伝子分析を続行する前に、クローニング
した遺伝子産物に対する抗血清を調製し、これをマウス
防御モデルで使用することによって、Ｂ群連鎖球菌によ
る感染を防御するこれらの抗血清の能力を決定すること
が好ましい（Lancefield,R.C.等,J.Exp.Med.142:165-17
9(1975)，Valtonen,M.V.等,Microb.Path.1:191-204(198
6)）。防御的抗体を引き出し得るタンパク質を発現する
クローンは、複合ワクチンに用いるための好ましい候補
である。防御的抗体を引き出し得ないクローンをさらに
分析することによって、それらもワクチンのための候補
で有るか否を決定してもよい。Ｃタンパク質は膜結合性
であるので、あるクローンによって発現したタンパク質
が防御的抗体を引き出し得ないことは、そのタンパク質
が大腸菌および高コピー数ベクター中で安定でないとい
う事実を反映しているのかも知れない。この問題は、Ａ
群およびＢ群連鎖球菌から他の膜タンパク質をクローニ
ングする際に起こった（Kehoe,M.等,Kehoe,M.等,Infec
t.and Immun.43:804-810(1984)，Schneewind,O.等,Infe
c.and Immun.56:2174-2179(1988)）。予備研究で単離し
た３５クローンのうちのいくつかは、小コロニー形態学
を示す。さらに、これらのクローンのいくつかは不安定
であり、Ｂ群連鎖球菌ＤＮＡ挿入物部分がｐＵＸ１２ポ
リリンカーから脱落することがわかった。これらのクロ
ーンを安定化するために使用できる技術はいくつかあ
り、それらには、低コピー数ベクター中か、もしくは減
弱化への調節が可能なプロモーターの後に入れるか、３
７℃ではなく３０℃でクローンを生育させるか、膜タン
パク質を蓄積するように適応させたベクター中にクロー
ニングすること、が含まれる。さらに、ｐＵＸ１２のよ
うなｐＢＲ３２２由来のプラスミドのコピー数を制限す
る大腸菌宿主、ｐｃｎＢ、中にこれらのプラスミドを導
入することができる（Lopilato J.等,Mol.Gen.Genet.20
5:285-290（1986）；この文献は本明細書の一部を構成
する）。

【００６９】また、あるクローンが防御的抗体を引き出
すタンパク質を発現し得ないことは、発現したタンパク
質が防御に重要なエピトープを欠いていることを示して
いるのかも知れない。これは、全遺伝子がクローニング
されていないか、もしくは大腸菌中で発現し得なかった
場合である。Ｂ群連鎖球菌中ではＣタンパク質の翻訳後
プロセッシングが行われ、大腸菌中にクローニングした
Ｃタンパク質遺伝子については行われないのかどうかも
問題であろう。完全な遺伝子のサブクローニング抽出お
よび／またはそれが発現し得る代替宿主環境へのその転
移の必要があるかも知れない。また、あるクローンが防
御的抗体を引き出すタンパク質を発現し得ないことは、
大腸菌内で生産された抗原から引き出される抗体が、Ｂ
群連鎖球菌上の天然Ｃタンパク質によって動物から引き
出されるものとは異なっていることを示しているのかも
知れない。さらに、ウサギの免疫化に使用した溶解細菌
抽出物は、いくつかの大腸菌タンパク質抗原を含んでい
る。したがって、動物モデルでの試験に用いる抗血清
は、生物全体からではなく、部分精製した遺伝子産物か
ら得る必要があるであろう。

【００７０】防御的抗体を引き出し得るクローン化Ｂ群
連鎖球菌タンパク質はいずれもＣタンパク質と呼ぶこと
ができる。この実験群のために調製した抗血清は、これ
らのタンパク質の位置を特定するためにも使用されるで
あろう。

【００７１】実施例８ Ｃタンパク質遺伝子のマッピング、特徴づけ、および配
列決定 Ｃタンパク質遺伝子をさらに特徴づけるために、上述の
Ｃタンパク質遺伝子クローンの微細構造遺伝子地図を調
製し、そのＤＮＡ配列を決定することができる。このよ
うなマッピングはゲノムのサザンブロットを使用して達
成することが好ましい。Ｃタンパク質遺伝子のＤＮＡ配
列を決定することによって、そのリボソーム結合部位、
潜在的プロモーター、シグナル配列、および独特の反復
配列を含む遺伝子構造を決定することができる。これら
のＤＮＡ配列を既知のＤＮＡ配列ライブラリーと比較す
ることによって、既に特徴づけられている他の遺伝子と
相同性があるか否かを調べることが好ましい。さらに、
Ｃタンパク質のタンパク質配列をそれらの遺伝子のＤＮ
Ａ配列から決定することができる。しばしば、タンパク
質配列の分析によって、そのタンパク質の構造、機能お
よび細胞内位置について予測することができる。

【００７２】したがって、ゲノムのサザンブロットを用
いて、これらの遺伝子が連結しているか否かを決定する
ことが好ましい。この技術のためには、Ｂ群連鎖球菌染
色体ＤＮＡを、６塩基対以上を含む配列を同定するいく
つかの異なる制限エンドヌクレアーゼで個別に消化す
る。この目的は、複数遺伝子を保持し得る染色体ＤＮＡ
のより大きな断片を得ることにある。次に個々のエンド
ヌクレーゼ消化物をアガロースゲルにかけ、ニトロセル
ロース上に移す。次にこのサザンブロットを、上述のラ
イブラリーから誘導した標識挿入物でプローブする。コ
ロニーブロットまたはエンドヌクレアーゼマッピングで
関連すると思われなかった２つのクローンが、同様の染
色体バンドに結合した場合、それは、それらが同じ遺伝
子の一部であるか、もしくはそれらが染色体上で近くに
連結している２つの遺伝子であることを示しているであ
ろう。どちらも場合にも、次の研究のために、これらの
より大きな遺伝子断片クローニングして取り出す方法が
いくつかある。１つの技術は、Ｂ群連鎖球菌のコスミド
ライブラリーを調製し、興味あるプローブの１つとのハ
イブリッド形成についてスクリーニングすることであ
る。２以上の興味ある遺伝子を含むクローンが得られた
ら、既に記述したクローンについて記述したように、エ
ンドヌクレアーゼでマッピングし、防御的抗原の発現に
ついて研究することができる。

【００７３】上述のクローンの同定はそれらのＤＮＡ配
列決定を可能にする。クローンがｐＵＸ１２プラスミド
上にある場合、逆転写酵素による二本鎖ＤＮＡ配列決定
を用いて、ポリリンカーに対して調製したオリゴヌクレ
オチドプライマーからの配列決定を行うことができる。
この技術はｐＵＸ１２プラスミドの特徴づけにおいて既
に使用しており、６００塩基対以上の遺伝子の配列を決
定するための複数の追加オリゴヌクレオチドプライマー
を配列決定するための迅速な方法である。したがって、
Ｍ１３一本鎖ＤＮＡ配列決定系中にサブクローニングす
ることによって、Ｃタンパク質遺伝子のＤＮＡ配列を決
定することが好ましい（Ausubel,F.M.等,Current Topic
s in Molecular Biology(1987)）。

【００７４】Ｃタンパク質のＤＮＡ配列の解明は、その
遺伝子の構造、機能および調節並びにそのタンパク質産
物に関する本質的な情報を提供する。前述のように、多
くの研究者らによって単離されたＣタンパク質のサイズ
の異種性およびそれらの見かけ上の抗原性の多様性は、
遺伝子族（ファミリー）あるいはＣタンパク質遺伝子の
タンパク質産物を修飾するための翻訳後の機構の可能性
を示唆している（Ferrieri,P.等,Infect.Immun.27:1023
-1032(1980)）。Ａ群連鎖球菌のＭタンパク質がこの現
象の一例として既に議論されている(Scott,J.R.等,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 82:1822-1826(1985)）。ハイブリ
ッド形成法ではＭタンパク質のＤＮＡ配列はＢ群連鎖球
菌染色体ＤＮＡとの相同性を示さないが、これらのＤＮ
Ａ配列の間には構造的相同性が存在し得る（Hollingshe
ad,S.K.等,J.Biol.Chem.261:1677-1686(1986)，Scott,
J.R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:1822-1826(1985)，
Scott,J.R.等,Infec.and Immun.52:609-612(1986)）。
Ｃタンパク質のＤＮＡ配列を既知のＤＮＡ配列のライブ
ラリーと比較することが好ましい。さらに、そのＤＮＡ
配列から得られるアミノ酸配列も既知のアミノ酸配列の
ライブラリーと比較する。

【００７５】実施例９ Ｃタンパク質遺伝子の優勢 Ｃタンパク質遺伝子の優勢（prevalence）を決定するた
めに、臨床的に得た染色体ＤＮＡおよび研究室で得たＢ
群連鎖球菌の種々の抗原型の単離物を、ゲノムサザンブ
ロット上で、Ｃタンパク質遺伝子でプローブする。さら
に、Ｃタンパク質遺伝子の発現の調節に関する情報を得
るために、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成によって示
された遺伝子組成物を用いる沈降素技術によって決定し
た表現型発現の比較を行った。Ｃタンパク質遺伝子のプ
ローブを用いて、他の型の連鎖球菌および他の細菌病原
体から得た染色体ＤＮＡをスクリーニングした。ランセ
フィールドが使用した最初の分類化株のほとんどを含む
Ｂ群連鎖球菌の単離物のＣタンパク質遺伝子からプロー
ブを調製し、標識した（Lancefield,R.C.等,J.Exp.Med.
142:165-179(1975)）。臨床的に得たＢ群連鎖球菌およ
び研究室で得たＢ群連鎖球菌の２４の単離物のコロニー
ブロットを、上述の微量滴定技術を用いてスクリーニン
グした。次に、種々の株がＣタンパク質遺伝子にハイブ
リッド形成する能力を、Ｃタンパク質に対して注がれる
分類化抗血清に結合しているこれらの生物の表現型特徴
と比較する。この方法では、どの株がＣタンパク質のい
ずれか、またはすべてを保持しているかを決定すること
ができ、また、いくつかの株がこれらの遺伝子の非活性
なあるいは潜在的なコピーを保持しているか否かを決定
することができる。

【００７６】次に、Ｃタンパク質遺伝子のサイズ、構造
および位置を決定するために、コロニーブロット上でＣ
タンパク質遺伝子プローブとハイブリッドを形成する株
を、ゲノムのサザンブロットを用いてスクリーニングす
る。コロニーブロット上で結合を示したＢ群連鎖球菌株
から単離した染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで
消化し、アガロースゲルにかけ、ニトロセルロース上に
ブロットする。これらのサザンブロットをＣタンパク質
遺伝子のプローブでプローブする。この方法では、異な
るＢ群連鎖球菌抗原型において、これらの遺伝子の位置
およびサイズに相違があるか否かを決定することがで
き、また臨床的に単離した（即ち潜在的に毒性の）単離
物と研究室の株（および臨床的にコロニー化したが、感
染を伴わないもの）との比較が可能である。

【００７７】Ｃタンパク質遺伝子プローブを用いて、他
の連鎖球菌株および種々の病原性細菌をスクリーニング
することも好ましい。連鎖球菌株は、ビルレンスを伴う
他のタンパク質（ＭおよびＧタンパク質を含む）を共有
することがわかっている（Fahnestock,S.R.等,J.Bact.1
67(3):870-880(1986)，Heath,D.G.等,Infec.and Immun.
55:1233-1238(1987)，Scott,J.R.等,Infec.and Immun.5
2:609-612(1986)，Walker,J.A.等,Infec.and Immun.55:
1184-1189(1987)；これらの文献は本明細書の一部を構
成する）。まず、試験する株がＣタンパク質遺伝子プロ
ーブと相同な配列を有するか否かを決定するために、コ
ロニーブロットを用いてこれらの株をスクリーニングす
る。次に、コロニーブロット上での陽性を試験する細菌
株の染色体ＤＮＡで、ゲノムのサザンブロットを調製す
る。次に、Ｃタンパク質において例えば膜アンカーとし
て作用する領域、免疫グロブリンのＦ_Ｃ領域に結合する
領域、あるいは他の細菌中で同様の機能を有する他の遺
伝子との相同領域を共有する領域などの相同領域の位置
を特定し定義するために、これらのブロットをＣタンパ
ク質遺伝子でプローブする。

【００７８】実施例１０ Ｂ群連鎖球菌中のＣタンパク質遺伝子の改変 潜在的なビルレンスを伴う性質のいくつかがＣタンパク
質にあると考えられており、これらには耐性オプロニン
作用および食菌作用に続く細胞内での殺菌の阻害が含ま
れる（Payne,N.R.等,J.Infec.Dis.151:672-681(1985)，
Payne,N.R.等,Infec.and Immun.55:1243-1251(198
7)）。ビルレンスに関するＣタンパク質の役割をより良
く理解するために、Ｃタンパク質遺伝子が個別に変異し
ている同遺伝子型株を構築する。これらの株を新生ラッ
トモデルでビルレンスについて試験するであろう（Zeli
gs,B.J.等,Infec.and Immun.37:255-263(1982)）。２つ
の方法が、Ｂ群連鎖球菌のビルレンスに関するＣタンパ
ク質の役割を評価するための同遺伝子型株を作成するた
めに使用できる。好ましくは、自己複合化（self-conju
gative）トランスポゾンｔｎ９１６を用いるトランスポ
ゾン変異処理法が使用できる。別法として、部位特異的
変異導入法も使用できる。Ｂ群連鎖球菌における遺伝子
操作には有効な方法がないので、Ｂ群連鎖球菌中の遺伝
子を改変し、ビルレンスを研究するための同遺伝子型株
を作成するための新しい遺伝子技術を開発する必要があ
る（Lopilato,J.等,Mol.Gen.Genet.205:285-290(198
6)；この文献は本明細書の一部を構成する）。

【００７９】トランスポゾン挿入変異処理法は、ビルレ
ンスを伴う抗原の発現が異なる同遺伝子型株を構築する
ために一般に使用される技術であり、Ｂ群連鎖球菌での
その使用は十分記述されている（Caparon.M.G.等,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 84:8677-8681(1987)，Rubens,C.E.
等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7208-7212(1987)，Wang
er,A.R.,Res.Vet.Sci.38:202-208(1985)，Weiser,J.N.,
Trans Assoc.Amer.Phys.98:384-391(1985)；これらの文
献は本明細書の一部を構成する）。ルーベンスらは、Ｂ
群連鎖球菌莢膜の研究におけるＴｎ９１６の有用性を立
証している（Rubens,C.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:
7208-7212(1987)）。自己複合化トランスポゾンＴＮ９
１６は、既に記述されているように、大便連鎖球菌から
Ｂ群連鎖球菌中に作成できる（Wanger,A.R.,Res.Vet.Sc
i.38:202-208(1985)；この文献は本明細書の一部を構成
する）。抗生物質耐性マーカーの取得について株を選択
し、上述のように調製した特異的抗血清によって検出さ
れるＣタンパク質発現の欠失について、コロニーブロッ
ト上でスクリーニングする。Ｃタンパク質遺伝子内での
挿入位置を特定するために、Ｃタンパク質を発現しない
と思われる単離物を、ゲノムのサザンブロットを用いて
さらにマッピングすることができる。元来のＴｎ９１６
株はｔｅｔ^Ｒを保持していたが、エリスロマイシン耐性
マーカーが最近Ｔｎ９１６中にクローン化された（Rube
ns,C.E.等,Plasmid 20:137-142(1988)）。Ｔｎ９１６に
よる変異処理に続いて、変異株がこのトランスポゾンの
１コピーだけを保持しており、このトランスポゾンがＣ
タンパク質遺伝子内に局在していることを示す必要があ
る。

【００８０】これらの技術は、Ｃタンパク質遺伝子がＢ
群連鎖球菌の生存に必須でない限り、Ｂ群連鎖球菌中の
Ｃタンパク質遺伝子を欠失させるために直接適用でき
る。しかし、検出可能なＣタンパク質が全く欠如してい
るＢ群連鎖球菌株が記述されており、また、細菌のビル
レンス決定因子がインビトロでの生存に必須の遺伝子で
あることは珍しい。調査されるであろうＴｎ９１６の別
の使用法は、Ｃタンパク質遺伝子の潜在的な調節要素の
同定である。特異的に定義された変異が望ましい場合、
あるいはＣタンパク質遺伝子がＢ群連鎖球菌の生育に必
須である場合は、例えば条件付の変異体（conditional
mutant）を作成するために、部位特異的変異導入法を使
用することができる。このように部位特異的変異導入法
はＢ群連鎖球菌タンパク質の遺伝子分析に使用できる。
Ｂ群連鎖球菌におけるこの技術の開発を遅らせている問
題は、Ｂ群連鎖球菌を形質転換する際に直面する困難性
である。電気穿孔法は、他の方法では形質転換が困難な
細菌中にＤＮＡを導入する際に役立つことが立証されて
いる（Shigekawa,K.等,Biotech 6:742-751(1988)；この
文献は本明細書の一部を構成する）。電気穿孔法を用い
てＢ群連鎖球菌を形質転換するための条件を使用するこ
とによって、この障害を克服できる。したがって、相補
性を評価し、Ｃタンパク質を発現しないＢ群連鎖球菌中
にＣタンパク質遺伝子を導入するために、部位特異的変
異導入を行うことができる。天然または変異Ｃタンパク
質遺伝子をＢ群連鎖球菌株中に挿入するためにはいくつ
かの方法のうちのいずれを使用してもよい。例えば、薬
剤耐性マーカーをｐＵＸ１２中のＣタンパク質遺伝子ク
ローン内に挿入することができる。Ｂ群連鎖球菌中で発
現し得るが、通常には存在しない薬剤耐性マーカーが好
ましい。この改変ｐＵＸ１２タンパク質クローンを、電
気穿孔法を用いてＢ群連鎖球菌中に導入する（Shigekaw
a,K.等,Biotech 6:742-751(1988)；この文献は本明細書
の一部を構成する）。ｐＵＸ１２プラスミドはＢ群連鎖
球菌内では複製できないので、その薬剤耐性表現型を獲
得した株は、宿主ＧＢ染色体上のＣタンパク質遺伝子と
ｐＵＸ１２プラスミド上に保持されている変異Ｃタンパ
ク質との相同性組換えによって、それを行うと思われ
る。これらの変異体を上述のようにスクリーニングす
る。受容株中に相同性配列が無い場合には、既知の連鎖
球菌遺伝子、即ちＢ群連鎖球菌由来の天然の薬剤耐性マ
ーカー遺伝子内に挿入されたＣタンパク質遺伝子でベク
ターを構築することができる。電気穿孔法に続いて、こ
のようなプラスミド構築物は相同性組換えによって染色
体中に組み込まれるであろう。

【００８１】別法として、改変したＣタンパク質遺伝子
を自己複合化トランスポゾンＴｎ９１６中に挿入し、大
便連鎖球菌からの交配を通してこの改変トランスポゾン
を導入することによって、改変したＣタンパク質遺伝子
をＢ群連鎖球菌中に導入することもできる。この技術を
使用することによって、Ｔｎ９１６をエリスロマイシン
遺伝子で改変し、この遺伝子をＢ群連鎖球菌の染色体中
に挿入することに成功た（Rubens,C.E.等,Plasmid 20:1
37-142(1988)）。Ｔｎ９１６による変異処理に続いて、
その変異株が該トランスポゾンを１つだけ保持してお
り、そのトランスポゾンがＣタンパク質遺伝子内に局在
していることを示す必要がある。

【００８２】実施例１１ Ｂ群連鎖球菌のビルレンスにおけるＣタンパク質の役割
の評価 Ｃタンパク質を保持するＢ群連鎖球菌株とＣタンパク質
を保持しないＢ群連鎖球菌株を比較した過去の研究に
は、同遺伝子型であることが分かっていなかった単離物
が含まれていた（Ferrieri,P.等,Rev.Inf.Dis.10(2):10
04-1071(1988)）。したがって、観測されたビルレンス
の相違がＣタンパク質に関連するものか、あるいは何か
他のビルレンス決定因子に関連するものかを決定するこ
とができなかった。無傷のＣタンパク質遺伝子またはＣ
タンパク質遺伝子欠失のいずれかを有する同遺伝子型株
の構築は、ビルレンスにおけるＣタンパク質の役割の特
徴づけを可能にする。これらの株を、ビルレンスについ
ては新生ラットモデルで、その免疫原性についてはマウ
ス防御モデルで試験することが好ましい。第２の重要な
ビルレンス試験は、変異株中でのアレル置換の反転によ
ってビルレンスを回復する遺伝子の能力である。Ｃタン
パク質遺伝子を保持しないか、もしくは不活化したＣタ
ンパク質遺伝子を保持するＢ群連鎖球菌株中に、Ｃタン
パク質遺伝子を挿入すれば、得られた構築物のビルレン
スを上記の動物モデルで試験することによって、Ｃタン
パク質の効果を決定することができる。Ｃタンパク質遺
伝子が個別に変異したＢ群連鎖球菌の同遺伝子型株を、
トランスポゾン変異処理法または部位特異的変異導入法
のいずれかを用いて作成することができる。染色体上の
挿入が１つだけであることを決定するために、このよう
な株をゲノムのサザンブロットで特徴づけることが好ま
しい。上述の微細構造遺伝子マッピング技術を用いて、
これらの挿入位置を確定することができる。次にこれら
の同遺伝子型株を、新生ラットモデル中でビルレンスに
ついて試験する（Zeligs,B.J.等,Infec.and Immun.37:2
55-263(1982)）。

【００８３】トランスポゾン変異処理法は、Ｃタンパク
質の発現の調節に関与する遺伝子の同定を可能にする。
例えば野生型Ｃタンパク質遺伝子を保持している株であ
って、トランスポゾン変異処理の後にＣタンパク質を発
現しなくなったことがわかり、しかもトランスポゾンが
そのＣタンパク質構造遺伝子内に位置しない株は、Ｃタ
ンパク質遺伝子の発現の調節に関与する配列中に変異を
保持している。この方法を用いて、Ｍタンパク質の調節
に関与するＡ群連鎖球菌中のｍｒｙ遺伝子座の特徴づけ
が成功した（Caparon,M.G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
84:8677-8681(1987),Robbins,J.C.等,J.Bacteriol 169:
5633-5640(1987)；これらの文献は本明細書の一部を構
成する）。これらの方法は、Ｃタンパク質を過剰発現す
る株、あるいはビルレンスまたは免疫性の異なるＣタン
パク質を産出する株を作成するためにも使用できる。

【００８４】実施例１２ Ｃタンパク質のＢ群連鎖球菌上での位置の特定および免
疫グロブリンに対するそれらの結合能の評価 ランセフィールドおよび他の研究者らは、Ｃタンパク質
に対する抗体がＢ群連鎖球菌の外膜に結合することを明
らかにしている（Lancefield,R.C.等,J.Exp.Med.142:16
5-179(1975)，Wagner,B.等,J.Gen Microbiol.118:95-10
5(1980)）。このことはＣタンパク質が外膜タンパク質
であることを示唆している。また、Ｃタンパク質はＢ群
連鎖球菌の培養上清から単離でき、このことは、これら
のタンパク質がＢ群連鎖球菌によって分泌されるか、も
しくは細胞表面から高速度で失われることを示してい
る。Ｃタンパク質遺伝子から誘導されたＤＮＡおよびタ
ンパク質配列は、Ｃタンパク質の構造と機能を決定する
際に役立つ。Ｃタンパク質に関して一般に記述されてい
る潜在的なビルレンス決定因子は、免疫グロブリンＩｇ
Ａに結合する能力である（Ferrieri,P.等,Rev.Inf.Dis.
10(2):1004-1071(1988)，Russel-Jones,G.J.等,J.Exp.M
ed.160:1467-1475(1984)）。

【００８５】免疫電子顕微鏡を使用して、特異的抗体に
よって検出される細胞表面決定因子の位置を特定した。
Ｂ群連鎖球菌のＣタンパク質クローンに対して生じた抗
血清を、Ｃタンパク質を保持するＢ群連鎖球菌株と共に
インキュベートする。フェリチン結合ヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇを用い、既に記述されているようにして細胞表面上の
抗原を検出する（Rubens,C.E.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 84:7208-7212(1987)，Wagner B.等,J.Gen.Microbio
l.118:95-105(1980)）。免疫グロブリンに対するＣタン
パク質の結合能の簡便な決定は、ウエスタンブロットを
用いて評価できる。Ｃタンパク質遺伝子を含有する大腸
菌クローンおよびＣタンパク質を保持するＢ群連鎖球菌
の両方の細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ニト
ロセルロース上にブロットすることができる。対照に
は、野生型ｐＵＸ１２プラスミドを保持する大腸菌、Ｃ
タンパク質遺伝子を保持しないＢ群連鎖球菌株、および
Ｃタンパク質遺伝子が不活化されている同遺伝子型Ｂ群
連鎖球菌株の抽出物が含まれる。このウエスタンブロッ
トを、標識した免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＡ、およびそれらの成分、例えばＦ_ＣまたはＦ
(ab)_２断片で、個別にプローブすることができる（Heat
h,D.G.等,Infect.and Immun.55:1233-1238(1987)，Russ
ell-Jones,G.J.等,J.Exp.Med.160:1467-1475(1984)）。
これらの免疫グロブリンを、ヨードゲン（iodogen）ま
たはクロラミンＴを用いてヨウ素化することが好まし
い。

【００８６】免疫グロブリンおよびその成分に対するＣ
タンパク質の結合能を測定するための、より特異的な方
法には、Ｃタンパク質を精製し、それらを結合検定に直
接用いることが含まれる（Fahnestock,S.R.等,J Bact.1
67(3):870-880(1986)，Heath,D.G.等,Infect.and Immu
n.55:1233-1238(1987)）。タンパク質配列を用いれば、
Ｃタンパク質を精製することができる。加えて、Ｃタン
パク質遺伝子は大腸菌中で発現し得るので、Ｃタンパク
質を過剰生産する大腸菌株を構築することができ、それ
ゆえに精製用のＣタンパク質を大量に得ることができ
る。上述の記述は特定の好ましい態様について言及して
いるが、本発明がこれらに限定されないことは理解され
るであろう。開示した態様に種々の改変を加え得るこ
と、並びに、そのような改変が本発明の範囲に包含され
ると考えられていることに、当業者は気付くであろう。

【００８７】実施例１３ Ｂ群連鎖球菌のクローン化Ｃタンパク質抗原の複合ワク
チンにおける使用 Ｂ群連鎖球菌の上述の防御的Ｃタンパク質抗原を、複合
ワクチン中でのその能力について試験した。この能力を
評価するために、ｐＪＭＳ１またはｐＪＭＳ２３を含有
する大腸菌の細胞抽出物を上述のように調製し、これを
ウサギの免疫化に使用した。得られた抗血清を、マウス
の致死率モデルにおいて、マウスをＢ群連鎖球菌Ｈ３６
Ｂ株による感染から防御するその能力について試験し
た。Ｈ３６Ｂ株はＢ群連鎖球菌のＣタンパク質を保持し
ている。対照として、Ｃタンパク質を保持しない連鎖球
菌５１５株による感染に対してマウスを防御するこの抗
血清の能力を決定した。これらの実験の結果を図４に示
す。上述の記述は特定の好ましい態様について言及して
いるが、本発明がこれらに限定されないことは理解され
るであろう。開示した態様に種々の改変を加え得るこ
と、並びに、そのような改変が本発明の範囲に包含され
ると考えられていることに、当業者は気付くであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドｐＵＸ１２を作成するためのｐＵ
Ｃ１２の改変を表す図である。

【図２】 プラスミドｐＵＸ１２の制限地図および転写
地図を示す図である。

【図３】 ＋１読み枠プラスミドｐＵＸ12＋１を作成す
るため(Ａ)、および−１読み枠プラスミドｐＵＸ12−１
を作成するため(Ｃ)、にｐＵＸ１２に施した改変を示す
図である。（Ｂ）は、−１読み枠プラスミドを付加的に
もたらし得る構築を示している。

【図４】 Ｓ１およびＳ２３に対するウサギの抗血清を
使用したマウスの防御研究の結果を示すグラフである。
抗Ｓ１抗血清（ｐ＜０．００２）または抗Ｓ２３抗血清
（ｐ＜０．０２２）を移植したマウスに防御が認められ
た。使用した試料数のために、観測された統計的有意性
に関するＳ１およびＳ２３実験間のこの相違は有意では
ない。この図では、試験総数あたりのマウス生存数がそ
れぞれの棒グラフ上に示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 596041021 ブリガム・アンド・ウイメンズ・ホスピ タル ＢＲＩＧＨＡＭ ＡＮＤ ＷＯＭＥＮ′ Ｓ ＨＯＳＰＩＴＡＬ アメリカ合衆国マサチユーセツツ州 02115．ボストン．フランシスストリー ト75 (72)発明者 ジェームス・エル・マイケル アメリカ合衆国マサチューセッツ02168、 ワバン、ウインスロー・ロード196番 (72)発明者 デニス・エル・カスパー アメリカ合衆国マサチューセッツ02159、 ニュートン・センター、ワード・ストリ ート544番 (72)発明者 フレデリック・エム・オースベル アメリカ合衆国マサチューセッツ02161、 ニュートン、レーク・アベニュー271番 (56)参考文献 Ａｃｔａ Ｐａｔｈ．ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ．ｉｍｍｕｎｏｌ．ｓｃａｎｄ．Ｓ ｅｃｔ．Ｂ，93（1985），ｐ．113−119

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プラスミドｐＪＭＳ２３（寄託番号ＡＴ
   ＣＣ４０６６０）である、Ｂ群連鎖球菌のＣタンパク質
   をコードする遺伝子配列を含む組換え分子。
2. 【請求項２】 プラスミドｐＪＭＳ２３（寄託番号ＡＴ
   ＣＣ４０６６０）によってコードされるものと同一な、
   １１０，０００ダルトンの分子サイズを有する単一のタ
   ンパク質であるＢ群連鎖球菌のＣタンパク質。