KR100349331B1 - 비(b)군연쇄상구균에대한접합백신 - Google Patents

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더 제너럴 하스피털 코포레이션
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Abstract

본 발명은 비(B)군 연쇄상구균에 의해 초래되는 감염으로부터 수용체를 방어할 수 있는 백신에 관한 것이다. 상기 백신은 다당류-단백질 부분을 제공하고, (a) 비(B)군 연쇄상구균 다당류를 포함하며, 이때 상기 다당류가 (b) 비(B)군 연쇄상구균에 대한 방어 항체를 유도할 수 있는 능력을 보유하는 비(B)군 연쇄상구균 C 단백질 알파 항원의 기능적 유도체에 접합된다. 상기 백신은 이러한 다당류-단백질 유니트와 한가지 유형만을 포함할 수 있거나 유니트의 한가지 이상 유형의 혼합물을 포함할 수 있다.

Description

비(B)군 연쇄상구균에 대한 접합 백신{CONJUGATE VACCINE AGAINST GROUP B STREPTOCOCCUS}
발명의 배경
본 발명의 개발 중에 실시된 작업의 일부에는 미국 정부의 기금을 이용하였다. 미국 정부는 본 발명에 특정의 권리를 가진다.
본원은 1989년 9월 15일에 출원된 미국 출원 제07/408,036호의 CIP 출원이다.
발명의 분야
본 발명은 미생물학 및 백신 기술 분야에 관한 것이며, 비(B)군 연쇄상구균의 감염에 대한 면역성을 부여할 수 있는 백신 개발에 관한 것이다.
관련 기술
인간 및 동물에서 연쇄상구균속의 박테리아는 질병의 원인체로서 생각되어 왔다. 연쇄상구균은 그들의 세포 표면에 특정 탄수화물 항원의 존재에 기초하여 면역학적 군들로 분할되어 왔다. 현재, A군부터 O군까지 확인되었다[참조: Davis, B. D. 등, Microbiology, 3판, p. 609(Harper ＆ Row, 1980)]. 연쇄상구균은 인간의 질병을 야기하는 가장 흔하고 중요한 박테리아중 하나이다. B군의 연쇄상구균이 동물질병(예를 들어, 소의 유선염)에 관련됨에도 불구하고, 스트렙토콕쿠스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae) (비(B)군 연쇄상구균)는 미국에서 인간 신생아 패혈증의 가장 통상적인 원인으로 나타났으며, 이로 인해 연간 6000명 이상이 사망하였다[참고: Hill, H. R. 등, Sexually Transmitted Disease, McGraw Hill, pp. 397-407]. 또한, 비(B)군 연쇄상구균은 태아의 후발성 수막염, 분만후 자궁내막염 및 면역 타협된 성인의 감염에서 중요한 병원체이다[참조: Patterson, M. J. 등, Bact. Rev. 40 : 774-792(1976)] 상기한 유기체가 항생제에 민감함에도 불구하고, 신생아의 패혈증 및 유아의 수막염의 높은 공격 속도 및 신속한 발병은 높은 발병률(50%) 및 사망률(50%) 모두로 귀결된다[참조: Baker, C. J. 등, New Eng. J. Med. (Editorial) 314(26) : 1702-1704(1986); Baker, C. J. 등, J. Infect. Dis. 136 : 137-152(1977)].
B군 연쇄상구균은 보통 인간의 질 및 결장 균상의 통상적인 성분이다. 가장 일반적인 신생아 감염의 경로는 질 전이증식으로부터의 분만시이나, 신생아 육아실내의 병원 분포 또한 기술되어 왔다[참조: Patterson, M. J. 등, Bact. Rev. 50 : 774-792(1976)]. 그러나, B군 연쇄상구균으로 전이증식된 유아의 단지 적은 비율이 심각한 감염으로 진전된다. 전이증식으로부터 감염까지의 전이 중 숙주 인자 및 박테리아 독성 결정인자 모두의 역할은 잘 이해되지 않고 있다.
B군 연쇄상구균의 몇몇 단백질은 독성 및 면역성을 갖는 것으로 생각된다[참조: Ferrieri, P. Sev. Infect. Dis. 10 : S363(1988)]. 1975년에 랜스필드는 보호성 면역(protective immunity)을 유도하는 능력에 의해 B군 연쇄상구균의 C 단백질을 정의하였다[참조: Lancefield, R. C. 등, J. Exp. Med. 142 : 165-179(1975)]. 이 단백질군은 몇몇 다른 폴리펩티드 및 항원 결정인자를 포함하는 것으로 생각된다. 이들 발견의 관점에서, B군 연쇄상구균의 감염을 예방하기 위한 노력은 예방용 항생제의 사용 및 B군 연쇄상구균에 대한 백신의 개발을 지향하였다[참조: Baker, C. J. 등, Rev. of Infec. Dis. 7 : 458-467(1985), Baker. C. J. 등, New Eng. J. Med. (Editorial) 314(26) : 1702-1704(1986)]. B군 연쇄상구균에 대한 다당류 백신은 Kasper, D. L.(미국 특허 제4,207,414호 및 미국 재등록 특허 제RE31672호 및 미국 특허 제4,324,887호, 제4,356,263호, 제4,367,221호, 제4,367,222호 및 제4,367,223호), Carlo. D. J.(미국 특허 제4,413,035호, 유럽 특허 제38,265호) 및 Yavordios, D. 등(유럽 특허 제71,515호)에 의해 기술되었으며, 참고로 본 명세서에 인용하였다.
B군 연쇄상구균에 의한 모계 전이증식 및 기타 주산기 위험 인자를 동정할 수 있는 유아의 작은 소군을 제외하고, 예방용 항생제의 사용은 대부분의 환자를 예방하는데 비실용적이거나 비효과적이었다[참조: Boyer, K. M. 등, New Eng. J. Med. 314(26) : 1665-1669(1986)]. 분만시 화학적 예방법은 하기하는 이유때문에 광범위하게 사용될 수 없다. (1) 그것은 신속하고, 믿을만하며, 저렴한 방법으로 B군 연쇄상구균에 의한 모계 전이증식을 확인할 수 없음; (2) 신생아 환자의 약 40%는 위험이 낮은 환경에서 발생함; (3) 잠재적으로 위험한 모든 산모 또는 유아를 스크린 및/또는 치료하기에 비실용적인 것으로 생각됨; 및 (4) 항생제 예방법은 후발성 수막염(미국에서 연간 7200명의 환자) 또는 출산후 자궁내막염(연간 45,000명의 환자)을 보호할 수 없다[참조: Baker, C. J. 등, New Eng. J. Med.(Editorial) 314 : 1702-1704(1986)].
미생물의 기탁
플라즈미드 pJMS1 및 pJMS23은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 항원성 연쇄상구균 단백질을 암호화 할 수 있는 DNA를 함유하는 플라즈미드 pUX12의 유도체이다. 플라즈미드 pUX12는 플라즈미드 pUC12의 유도체이다. 플라즈미드 pJMS1 및 pJMS23은 미국, 메릴랜드주, 록빌에 소재하는 American Type Culture Collection에 1989년 9월 15일자로 기탁되었으며, 각각 ATCC 40659 및 ATCC 40660으로 명명되었다.
발명의 요약
스트렙토콕쿠스 아갈락티아는 미국에서 신생아 패혈증의 가장 일반적인 원인이며, 그로 인해 년간 6,000 내지 10,000명이 사망한다. B군 연쇄상구균의 유형-특이성 다당류 캡슐은 면역원성이 있으며 중요한 보호성 항원을 보유하는 반면, 다당류 백신의 임상적 시도는 불량한 응답속도를 나타내왔다[참조: Baker, C. J. 등, New Eng. J. Med. 319 : 1180(1980); Insel. R. A. 등, New Emg. J. Med.(Editorial) 319(18) : 1219-1220(1988)].
본 발명은 B군 연쇄상구균으로부터 클로닝된 유전자로부터 발현된 보호성 단백질 항원을 이용하는, B군 연쇄상구균(즉, 스트렙토콕쿠스 아갈락티아)에 대한 접합 백신의 개발에 관한 것이다. 이 신규의 접합 백신은 캐리어 단백질의 면역보강제 작용에 의한 T-세포 의존성 방어를 유도하고, 또한 클로닝된 B군 연쇄상구균 단백질상에 존재하는 추가의 보호성 에피토프를 제공하는 장점을 가진다[참조: Insel. R. A. 등, New Eng. J. Med.(편집) 319(18) : 1219-1220(1988); Baker, C.J. 등, Rev. of Infec. Dis. 7 : 458-467(1958)].
구체적으로, 본 발명은 B군 연쇄상구균에 의한 감염에 대해 숙주 면역성을 부여할 수 있는 접합 백신에 있어서 (a) 다당류 및 (b) 다당류에 접합된 단백질을 포함하되, 다당류 및 단백질은 B군 연쇄상구균의 특징적인 분자이며, 단백질은 B군 연쇄상구균에 대한 보호성 항체를 유도하는 능력을 보유한 C 단백질 알파 항원의 유도체인 것을 특징으로 하는 접합 백신을 제공한다.
또한, 본 발명은 B군 연쇄상구균에 의해 야기되는 감염을 예방 또는 감약화하는 방법에 있어서 상기 감염 위험에 직면하고 있는 것으로 예상되는 개체에게 본 발명의 접합 백신 유효량을 투여하여 상기 감염에 대한 숙주 면역성을 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 B군 연쇄상구균에 의한 감염을 예방 또는 감약화하는 방법에 있어서 임산부에게 본 발명의 접합 백신 유효량을 투여하여 임산부의 태아에게 감염에 대해 면역성을 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 B군 연쇄상구균에 의한 감염을 예방 또는 감약화하는 방법에 있어서 상기 감염 위험에 직면하고 있는 것으로 예상되는 제1 개체에게 본 발명의 접합 백신에 노출된 제2 개체로부터 유래되는 항혈청 유효량을 투여하여 상기 감염에 대한 숙주 면역성을 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
제1도는 플라즈미드 pUX12를 제조하기 위한 pUC12의 수정 과정을 도시하고 있다.
제2도는 플라즈미드 pUX12의 제한지도 및 전사지도를 도시하고 있다.
제3도는 +1 해독틀 플라즈미드 pUX12+1(A)을 제공하고 -1 해독틀 플라즈미드 pUX12-1(C)를 제공하기 위해 pUX12에 행한 수정 과정을 도시하고 있다. (B)는 -1 해독틀 플라즈미드를 추가로 형성할 수 있는 구성을 도시하고 있다.
제4도는 S1 및 S23에 대한 토끼 항혈청을 사용하는 마우스 보호 연구의 결과를 보여주고 있다. 항-S1 항혈청(P〈0.002) 또는 항-S23 항혈청(P〈0.022)으로 접종된 마우스들이 보호된다는 것이 관찰되었다. 사용한 샘플크기 때문에, S1 및 S23 실험 사이에서 관찰된 통계적 의미의 차이는 중요하지 않다. 도면에서, 검사한 전체 마우스중 살아남은 마우스는 각 막대 상단에 분수로 기록하였다.
제5도는bca의 서열화 전략 및 제한 엔도뉴클레아제 지도를 도시하고 있다. 부분적인 제한 엔도뉴클레아제 지도는bca및 인접 영역의 뉴클레오티드 서열이 결정된 뉴클레오티드 3594에 위치하는NdeI 위치부터StyI 위치까지의 pJMS23 영역을 포함한다. 개방형 해독틀은 빈 상자로 도시하였다. 트랜스포존 Tn5seq1 돌연변이(삼각형)는 각 삽입위치에서 양방향으로 뉴클레오티드 서열화를 개시시킨다. 올리고뉴클레오티드 프라이머들(개방 화살표) 및 중복된(nested) 결실들(폐쇄 화살표)로부터 수득한 서열 영역들도 나타내고 있다. 제한 엔도뉴클레아제 절단위치는 하기와 같이 축약하였다; A,AluI; B,BsmI; F,FokI; H,HincII; N,NdeI; S,StyI; bp, 염기쌍.
제6도는bca및 인접영역들의 뉴클레오티드 서열[서열번호 : 14] 및 추론된 아미노산 서열[서열번호 : 15]을 도시하고 있다. DNA 가닥은 5'에서 3'으로 도시되어 있으며, 뉴클레오티드는 개방형 해독틀로부터 78 염기쌍 상류에서 시작하는 상선상에 나열되어 있다. 개방형 해독틀에 대한 추론된 아미노산 서열은 핵산 서열 아래에 표시되어 있다. G+C 함량은 40%이며, 코돈 사용법은 다른 연쇄상구균 유전자와 유사하다[참조: Hollingshead, S. K. 등, J. Biol. Chem. 261 : 1677-1686(1986)]. 가장 중요한 특징은 -10(TATAAT) 프로모터 공통위치, 리보좀 결합위치(RBS), 시그날 서열, 반복 부위 1, 위치 3161에 종결 코돈(TAA)을 가진 C 말단, 2개 부위로 된 다이애드 대칭의 가능성 있는 전사 종결인자를 포함한다.
제7도는 추정적인 시그날 서열 및 C 단백질 알파 항원의 C-말단 세포막 앵커 각각에 대해 상동성을 나타내는 2개의 패널(A 및 B)을 나타내고 있다. 패널 7A: 가장 상단에 있는 C 단백질 알파 항원의 N 말단(서열 1)[서열번호 : 16]이 도시되어 있으며, 그 밑에 있는 그람-양성 시그날 서열(승인 코드는 각각의 서열번호에 대해 기재되어 있음)과 비교되어 있다: 서열 2[서열번호 : 17], C 단백질 베타 항원(S15330 ; STRBAGBA) 및 A군 연쇄상구균의 4가지 M 단백질: 서열 3[서열번호 : 18], ennX (STRENNX); 서열 4[서열번호 : 19], emm24(STREMM24); 서열 5 [서열번호 : 20], M1(S00767); 서열 6[서열번호 : 21], S01260. 가능성 있는 시그날 절단위치에 선행하는 세린(S) 및 트레오닌(T) 잔기처럼 밑줄친 소수성 단편에 선행하는 리신(K) 및 아르기닌(R) 잔기는 볼드체이다. 알파시그날에 대한 가능성 있는 절단위치는 위치 41의 발린 다음에 온다. 그러나, 선택적인 절단위치는 위치 53-56에 존재한다. 패널 B: 가장 상단에는 C 단백질 알파 항원의 C 말단(서열 1)[서열번호 : 22]이 도시되어 있으며, 그 밑에 있는 그람-양성 세포막 앵커 펩티드와 비교되어 있다 : 서열 2[서열번호 : 23], M5(A28616), M6(A26297) 및 M24 (A28549); 서열 3[서열번호 : 24], ennX(STREENX); 서열 4[서열번호 : 25], S00128, STRPROTG, 및 A26314: 서열 5[서열번호 : 26], spg(A24496); 서열 6[서열번호 : 27], arp4(S05568) 및 emm49(STRM49NX, STRMM24); 및 서열 7[서열번호 : 28], emm12(STR12M), M5, M6, M24, emm12, emm49 및 ennX는 모두 M 단백질임; arp4는 A군 연쇄상구균의 결합 단백질이다. S00128, STRPROTG, spg, 및 A26314는 G군 연쇄상구균의 IgG 결합 단백질이다. 서열 8[서열번호 : 29]는 PPFFXXAA[서열번호 : 1] 모티프가 결여된, 베타 항원에 대한 세포막 앵커를 나타낸다. 가장 중요한 부위는 LPXTGE [서열번호 : 2] 모티프(박스로 표시되어 있음) 보다 선행하는 리신잔기(K), PPFFXXAA [서열번호: 1] 공통 서열(박스 및 밑줄로 표시되어 있음)을 갖는 소수성 부위(밑줄) 및 말단 아미노산 아스파라긴산(D) 또는 아스파라긴(N)을 포함한다.
제8도는bac의 클로닝된 유전자 산물 및 천연 유전자 산물의 비교를 도시한다. B군 연쇄상구균의 A909 균주의 표면 단백질(1a/C 형) 및 C 단백질 알파 항원 클론 pJMS23-1을 SDS/PAGE 및 웨스턴 블로팅으로 분석하고, 알파 항원-특이성 단일 클론 항체 4G8을 프로브로 사용하였다. 화살표는 단백질들 사이의 차이의 예를 예시한다. 분자량 마커(kDa)는 좌측에 도시되어 있다.
제9도는bca의 개방형 해독틀을 도식적으로 표현한 것이다. 아미노산 서열분석에 기초한 C 단백질 알파 항원의 개방형 해독틀의 구조 특성 요약은 bca의 뉴클레오티드 서열로부터 유추하였다. 상자 위의 숫자들은 뉴클레오티드 위치를 나타내며, 상자 아래의 숫자들은 개방형 해독틀내의 성숙한 단백질의 아미노산 잔기이다.
바람직한 양태의 상세한 설명
중요성 및 임상적 전망
B군 연쇄상구균에 대한 백신을 사용하는 모계 면역 예방법은 항체의 분만기 주위 전이를 통해 산모 및 어린 유아 모두의 감염을 예방하기 위한 가능성 있는 경로로서 제안되어 왔다[참조: Baker, C. J. 등, New Eng. J. Med. (Editorial) 314(26) : 1702-1704(1986); Baker, C. J. 등, New Eng. J. Med. 319 : 1180(1988); Baker, C. J. 등, J. Infect. Dis. 7 : 458(1985)] 기타 피막형성된 박테리아의 경우와 같이, 감염에 대한 감수성은 유형-특이성 항체의 부재와 관련이 있다[참조: Kasper, D. L. 등, J. Clin. Invest, 72 : 260-269(1983), Kasper, D. L. 등, Antibiot, Chemother, 35 : 90-100(1985)]. B군 연쇄상구균에 대하여 옵소닌적으로 활성이 있는 유형-특이성 항-피막 항체가 결여되는 것은 B군 연쇄상구균의 전이증식에 의해 수반되는 질병으로 전개되는 위험 인자이다[참조: Kasper, D. L. 등, J. Infec. Dis. 153 : 407-415(1986)].
정제된 유형-특이성 피막 다당류를 백신으로 사용하여 예방 접종하고자 하는 시도가 있어왔다. 이러한 백신을 제조하는 방법 및 B군 연쇄상구균에 대해 면역화하기 위한 이러한 백신의 용도는 Kasper, D. L.(미국 특허 제4,207,414호 및 미국 재등록 특허 제RE31672호, 및 미국 특허 제4,324,887호, 4,356,263호, 4,367,221호, 4,367,222호 및 제4, 367,223호), Carlo, D. J. (미국 특허 제4,413,057호, 유럽 특허 공개 제38,265호) 및 Yavordios, D. 등(유럽 특허 공개 제71,515호)에 의해 기술되었으며, 이들 문헌을 본 명세서에 참고로 인용하였다.
B군 연쇄상구균의 다당류 피막은 잘 특성화되어 있고 독성 및 면역성 모두에서의 역할이 밝혀져 있음에도 불구하고[참조: Kasper, D. L. J. Infect. Dis. 153 : 407(1986)], 이들 피막 성분은 특정 피막 유형 및 숙주 면역계의 인자 모두에 따라 그들의 면역원성이 변하는 것으로 알려져 왔다[참조: Baker, C. J. 등, Rev. of Infec. Dis. 7 : 458-467 (1985)]. B군 연쇄상구균의 피막성 다당류 백신을 평가하는 최근 완성된 임상실험에서 총 응답률이 63%으로 나타났으며, 이러한 백신이 최적 면역원성을 갖지 아니함을 지적하였다[참조: Baker, C. J. 등, New Eng. J. Med. 319(18) : 1180-1185(1988)].
또한, 기타 박테리아의 피막 다당류와 면역원성에 있어서 차이가 있는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, C형 수막염균의 피막에 대한 백신은 매우 활성이 있는 반면, B군 수막염균의 다당류 백신은 면역원성이 없다[참조: Kasper, D. L. 등, J. Infec. Dis. 153 : 407-415(1986)]. 숙주 면역계의 T-세포 비의존성 반응이 다당류 항원에 대한 항체 응답을 개시하기 위해 종종 필요하다. 다당류 항원에 대한 T-세포 비의존성 응답이 결여되면, 엄마에게 B군 연쇄상구균에 대한 항체가 저수준으로 존재하는 원인이 되어 이어서 그 아이에게 B군 연쇄상구균이 감염될 수 있다. 게다가, 18개월 또는 24개월 이전의 아동은 T-세포 비의존성 항원들에 대하여 미성숙하게 발달된 면역반응을 나타낸다.
B군 연쇄상구균의 독성 및 면역성의 결정기
공통 그룹 특이성 다당류 항원을 공유하는 B군 연쇄상구균은 5가지 혈청형이 있다. 그러나, 상기 그룹 항원의 항체는 동물 모델에서 보호용이 아니다. Lancefield는 최초로 침강 항체기법을 사용하여 B군 연쇄상구균을 4가지 혈청형(Ia, Ib, II 및 III)으로 분류하였다. 상기 각 혈청형에 대해 유일한 유형-특이성 피막 다당류의 조성 및 구조는 연속적으로 결정되었다[참조: Jennings, H. J. 등, Biochem. 22 : 1258-1264(1983), Kasper, D. L. 등, J. Infec. Dis. 153 : 407-415(1986), Wessels, M. R 등, Trans. Assoc. Amer. Phys. 98 : 384-391(1985)]. Wilkinson은 혈청형 Ib를 갖는 모든 균주 및 Ia 형 피막을 갖는 일부 균주 상에 존재하는 단백질 항원(원래 Ibc 단백질이라 칭함)을 동정함으로써 제5 혈청형 Ic를 정의하였다[참조: Wilkinson, H. W. 등, J. Bacteriol. 97 : 627-634(1969), Wilkinson, H. W. 등, Infec. and Immun. 4 : 596-604(1971)]. 나중에 이 단백질은 다른 혈청형들의 B군 연쇄상구균 사이 보급정도가 다양하다고 밝혀졌으나 혈청형 Ia에는 없었다[참조: Johnson, D. R. 등, J. Clin. Microbiol. 19 : 506-510(1984)].
최근에 피막 유형-특이성 다당류만으로 B군 연쇄상구균의 혈청형을 분류하기 위해 명명법이 변화되었으며, 제5 피막 유형 또한 기술되었다(유형 IV)[참조: Pritchard, D. G. 등, Rev. Infec. Dis. 10(8) : 5367-5371(1988)]. 그러므로 B군 연쇄상구균의 유형 분류는 현재 C 단백질이라 칭하는 항원성 Ibc 단백질에 더이상 기초하지 않는다. Ic형 균주는 그가 C 단백질을 보유한다는 추가 정보와 함께 그의 피막 다당류 조성에 기초하여 혈청형 Ia로 재분류하였다.
면역학적, 유행병학적 및 유전학적 자료는 유형-특이성 피막이 B군 연쇄상구균 감염에 대한 면역성에 중요한 역할을 수행함을 제안한다. 유형-특이성 피막 다당류의 조성 및 구조와 독성 및 면역성에서의 그들의 역할은 집중적인 연구 주제였다[참조: Ferrieri. P. 등, Infec. Immun, 27 : 1023-1032(1980), Karuse, R. M. 등, J. Exp. Med. 142 : 165-179(1975), Levy, N. J. 등, J. Infec. Dis. 149 : 851-860(1984), Wagner, B. 등, J. Gen. Microbiol. 118 : 95-105(1980), Wessels, M. R. 등, Trans. Assoc. Amer. Phys. 98 : 384-391(1985)].
세포 표면상의 유형-특이성 다당류 및 B군 연쇄상구균의 다당류의 구조적 정열과 관련하여, 유형-특이성 다당류내의 면역학적으로 중요한 결정인자에 관련하여 그리고 B군 연쇄상구균의 피막에 의해 결정되는 독성의 메카리즘에 관련하여 논쟁이 있어 왔다[참조: Kasper, D. L. 등, J. Infec. Dis. 153 : 407-415(1986)]. 독성에 대한 피막의 역할을 연구하기 위해, Rubens 등은 트랜스포존 돌연변이 유발법을 사용하여 피막이 형성되지 않은 유형 III B군 연쇄상구균의 동질 유전자형 균주를 생성하였다[참조: Rubens, C. E. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 7208-7212(1987)]. 그들은 피막 발현 결여가 신생아기의 마우스 모델에서 독성의 상당한 손실을 초래했음을 입증하였다. 그러나, 유사한 피막 조성을 가진 임상적 분리체의 독성은 광범위하게 변화한다. 이는 피막외에도 기타 박테리아 독성 인자가 B군 연쇄상구균의 병인에서 일정 역할을 수행한다는 것을 암시하는 것이다.
독성 및 면역성에서의 역할이 확립되지 않은 B군 연쇄상구글내에서 다수의 단백질 및 기타 박테리아 생성물, 즉 CAMP(크리스틴 아트킨스-머치 피터슨) 인자,색소(카로티노이드로 추정됨), R 항원, X 항원, 항-식세포성 인자 및 불완전하게 정의된 "폐독소"가 기술되었다[참조: Ferrieri, P. 등, J, Exp. Med. 151 : 56-68(1980); Ferrieri, P. 등, Rev. Inf. Dis. 10(2): 1004-1071(1988); Hill, H. R. 등, Sexually Transmitted Diseases, McGraw-Hill, pp. 397-407), C 단백질은 하기에 논의되어 있다.
헤모리신이 결핍된 B군 연쇄상구균의 동질 유전자형 균주는 신생아기의 마우스 모델에서 독성을 감소시키지 않는다(참조: Weiser, J. N. 등, Infec. and Immun, 55 : 2314-2316(1987)]. 헤모리신 및 뉴라미니다제 모두는 감염과 관련된 임상적 분리체내에 항상 존재하는 것은 아니다. CAMP 인자는 포도상 구균 베타-독소(스핑고미엘리나제)의 존재하에서 적혈구 세포막의 분해를 유도하고 분자량이 23,500 Da인 B군 연쇄상구균의 세포외 단백질이다. B군 연쇄상구균내에서 CAMP 인자에 대한 유전자는 최근에 이. 콜리에서 클로닝되고 발현되었다[참조: Schneewind, O. 등, Infec. and Immun. 56 : 2174-2179(1988)]. 상기 B군 연쇄상구균의 병인에 있어서의 상기에 열거한 CAMP 인자, X 및 R 항원 및 기타 인자의 역할은 종래 기술에 개시되지 않았다[참조: Fehrenbach, F. J. 등, In : Bacterial Protein Toxins, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart(1988); Hill, H. R. 등, Sexually Transmitted Diseases, McGraw-Hill, NY, pp. 397-407(1984)].
C 단백질(들)은 Wilkinson 등에 의해 B군 연쇄상구균으로부터 최초로 추출된 일군의 B군 연쇄상구균의 세포 표면 관련 단백질 항원이다(참조: Wilkinson, H. W. 등, J. Bacteriol. 97 : 629-634(1969), Wilkinson, H. W. 등, Infec. and Immun.4 : 596-604(1971)]. 그들은 고온의 염산(HCI)을 사용하여 세포벽을 추출하고 트리클로로아세트산(TCA)을 사용하여 단백질 항원들을 침전시켰다. 항원학적으로 구별되는 2개의 C 단백질 군을 기술하였다: (1) 한 그룹의 단백질은 펩신 분해에는 민감하나 트립신 분해에는 민감하지 않아 TR(트립신 내성) 또는 알파(α)라 칭하였다. (2) B군 연쇄상구균 단백질의 다른 군은 펩신 및 트립신 모두의 분해에 대해 민감하여 TS(트립신 민감성) 또는 베타(β)라 칭하였다[참조: Bevanger, L. 등, Acta Path, Microbiol. Scand. Sect. B. 87 : 51-54(1979), Bevanger, L. 등, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B. 89 : 205-209(1981), Bevanger. L. 등, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B. 91 : 231-234(1983), Bevanger, L. 등, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B. 93 : 113-119(1985), Bevanger, L. 등, Acta Path, Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B. 93 : 121-124(1985), Johnson, D. R. 등, J. Clin. Microbiol, 19 : 506-510(1984), Russell-Jones, G. J. 등, J. Exp. Med. 160 : 1476-1484(1984)].
1975년 Lancefield 등은 토끼에서 형성한 항혈청을 사용하는 마우스 보호 연구를 사용하여 유사한 단백질 항원을 보유하는 B군 연쇄상구균속 균주에 대한 보호성 면역을 부여하는 능력으로 C 단백질을 기능적으로 정의하였다 [참조: Lancefield, R. C. 등, J. Exp. Med. 142 : 165-179(1975)]. 수많은 연구자들은 HCl 또는 세제들을 사용하여 세포벽으로부터 화학적 추출을 함으로써, B군 연쇄상구균로부터 C 단백질이라 칭하는 항원성 단백질의 조(組)제조물을 수득하여 왔다[참조: Bevanger, L. 등, Acta, Path. Micrbiol. Scand. Sect. B. 89 : 205-209(1981), Bevanger, L. 등, Acta, Path. Micrbiol. Scand. Sect. B. 93 : 113-119(1985), Russell-Jones, G. J. 등, J. Exp. Med. 160 : 1476 -1484(1984), Valtonen, M. V. 등, Microb. Path. 1 : 191-204(1986), Wilkinson, H. W 등, Infec. and Immun. 4 : 596-604(1971)]. 이들 항원에 대해 보고된 크기는 10 kda 내지 190 kda이며, 단일 단백질 종은 분리되거나 특성이 규명된 바 없다(참조: Ferrieri, P. 등, Rev. Inf. Dis. 10(2) : 1004-1071(1988)].
보호성 항혈청을 사용하여 스크리닝함으로써 C 단백질은 B군 연쇄상구균의 임상적 분리체의 약 60%에서 검출될 수 있으며, 모든 혈청 유형에서 발견되나 그 빈도는 다르다[참조: Johnson, D. R. 등, J. Clin. Microbiol, 19 : 506-510(1984)]. 개별적인 B군 연쇄상구균 분리체는 TR 및 TS 항원 모두를 갖거나, 이 중 하나만 가질 수 있고, 모두 없을 수도 있다. 부분적으로 정제된 항원이 보호성 면역을 유도하는 능력을 제외하고, 병인에 대한 이들 항원의 역할은 시험관내에서 연구된 바 없다. C 단백질을 보유하는 B군 연쇄상구균속 균주에 대한 생체내 연구는 C 단백질이 옵소닌화에 대한 내성을 유도할 수 있으며[참조: Payne, N. R. 등, J. Infec. Dis. 151 : 672-681(1985)] C 단백질이 식세포 분해에 뒤따르는 B군 연쇄상구균의 세포내 사멸을 억제할 수 있다는[참조: Payne, N. R. 등, Infect. and Immun. 55 : 1243-1251(1987)] 몇몇 증거들을 제공한다. C 단백질을 보유하는 B군 연쇄상구균의 유형 II 균주는 신생아기의 래트 패혈증 모델에서 더 강한 독성을 나타내는 것으로 밝혀졌다[참조: Ferrieri, P. 등, Infect. Immun. 27 : 1023-1032(1980), Ferrieri, P. 등, Rev. Inf. Dis, 10(2) : 1004-1071(1988)]. C 단백질에 대한 유전적 자료가 없기 때문에, C 단백질이 결여된 동질유전자형 균주는 이전에 연구된 바 없다. TS 또는 β의 C 단백질중 하나가 IgA에 결합함이 입증되었다[참조: Russell-Jones, G. J. 등, J. Exp. Med. 160 : 1476-1484(1984)]. 그러나, C 단백질과 IgA의 결합이 독성을 나타낸다는 역할은 개시된 바 없다.
1986년에 Valtonen 등은 배양 상청액으로부터 마우스 모델에서 보호를 유도하는 B군 연쇄상구균 단백질을 분리하였다[참조: Valtonen, M. V. 등, Microb. Path. 1 : 191-204(1986)]. 그들은 분자량이 14,000 Da인 트립신 내성 B군 연쇄상구균 단백질을 동정하고 부분적으로 정제하였다. 토끼에서 이 단백질에 대해 형성된 항혈청은 후속적으로 일어나는 유형 Ib의 B군 연쇄상구균에 의한 공격으로부터 마우스를 보호하였다(89% 보호). 이 단백질은 Lancefield의 정의에 의하면 C 단백질이다. 그러나, 이 단백질에 대해 형성된 항혈청을 B군 연쇄상구균 항원들의 추출물을 면역 침전시키기 위해 사용하는 경우, 다수의 고분자량 단백질은 반응성이 있다고 밝혀졌다. 이는 14,000MW 단백질이 몇몇 B군 연쇄상구균 단백질의 공통의 에피토프를 나타내거나 B군 연쇄상구균 배양물의 상청액내에서 발견되는 분해 생산물이라는 것을 암시하는 것이다. 박테리아 세포 및 상청액 모두로부터 분리된 C 단백질 크기의 다양성은 C 단백질들이 하나의 유전자 패밀리임을 나타낼 수 있으며, 면역계에 대한 보호를 위한 메카니즘으로서 항원 다양성을 유지한다는 것을 암시한다.
보고된 분자량의 범위와 개별적인 C 단백질의 정제에서 직면하는 어려움은많은 연구자들이 A군 연쇄상구균의 M 단백질 분리에서 직면한 문제와 유사하다[참조: Dale, J. B. 등, Infec. and Immun. 46(1) : 267-269(1984), Fischetti, V. A. 등, J. Exp. Med. 144 : 32-53(1976), Fischetti, V. A. 등, J. Exp. Med. 146 : 1108-1123(1977)]. M 단백질에 대한 유전자는 현재 클로닝 및 서열 결정되었고, 다수의 반복성 DNA 서열을 함유하는 것으로 밝혀졌다[참조: Hollingshead, S. K. 등, J. Biol. Chem. 261 : 1677-1686(1986), Scott, J. R 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82 : 1822-1826(1986), Scott, J. R. 등, Infec, and Immun. 52 : 609-612(1986)]. 이들 반복 서열은 전사후 변형을 담당하여, 생성되는 M 단백질의 크기는 다양하게 된다. 이것이 일어나는 메카니즘은 이해되지 않고 있다. B군 연쇄상구균의 C 단백질에 대해 기술한 분자량 범위는 유사 과정에 기인할 수 있다.
Cleat 등은 이. 콜리에서 B군 연쇄상구균의 DNA 라이브러리를 스크린하기 위해 Bevanger로부터 수득한 B군 연쇄상구균에 대한 항혈청의 2가지 제조물 (α 및 β)을 사용함으로써 C 단백질을 클로닝하려 하였다[참조: Bevanger, L. 등, Acta. Path. Microbiol. Immun. Scand. Sect. B. 93 : 113-119(1985), Cleat, P. H. 등, Infec. and Immun. 55(5) : 1151-1155(1987), 참고로 본 명세서에 인용함]. 이들 연구자들은 항-연쇄상구균 항체들에 결합하는 단백질들을 제조하는 2개의 클론을 기술하였다. 그러나, 그들은 클로닝된 단백질중 어느 것이 보호성 항체를 유도할 수 있는 능력을 보유하는가의 여부, 또는 이들 유전자의 보급이 C 단백질을 보유하는 것으로 알려진 B군 연쇄상구균속 균주와 연관이 있는지 여부를 결정하지 못했다. B군 연쇄상구균의 독성에 대한 클로닝된 유전자서열들의 역할은 조사되지 않았다. C 단백질은 보호성 항체를 유도하는 능력에 의해 정의되었기 때문에, 이 작업은 어느 클론이 C 단백질을 암호화하는가에 대한 증거를 제공하지 못했다.
본 발명의 접합 백신
본 발명은 단백질 백본에 피막 다당류가 공유적으로 연결된 접합 백신의 개발을 통해 B군 연쇄상구균에 대한 종래의 백신의 상기한 결점을 극복한다. 이 방법은 피막 다당류 항원에 대한 T-세포 의존성 항체 응답의 발달을 도와주고 항체 생성을 위한 T-세포 비의존성 필요 조건을 회피한다[참조: Baker, G. J. 등, Rev. of Infec. Dis. 7 : 458-467(1985), Kasper, D. L. 등, J. Infec. Dis. 153 : 407-415(1986), 참고로 본 명세서에 인용함].
접합 백신에서, B군 연쇄상구균의 피막 다당류(상기함) 같은 항원성 분자는 "캐리어" 단백질 또는 폴리펩티드에 공유결합된다. 이 결합은 접합된 분자의 항원성을 증가시킨다. 항원성 분자와 "캐리어" 단백질 또는 폴리펩티드로부터 접합 백신을 형성하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다[참조: Jacob, C, O 등, Eur. J. Immunol. 16 : 1057-1062(1986); Parker, J. M. R. 등, In : Modern Approaches to Vaccines, Chanock, R. M. 등, eds, pp. 133-138, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1983); Zurawski, V. R 등, J. Immunol. 121 : 122-129(1978); Klipstein, F. A. 등, Infect. Immun. 37 : 550-557(1982); Bessler, W. G, Immunobiol. 170 : 239-244(1985): Posnett, D. N. 등, J. Biol. Chem. 263 : 1719-1725(1988); Ghose, A. C 등, Molec. Immunol. 25 : 223-230(1988); 모든 참고 문헌은 참고로 본 명세서에 인용하였다].
접합 백신의 표준 모델은 헤모필러스 인플루엔자(Hemophilus influenzae)에 대해 개발되었다[참조: Anderson, P, Infec. and Immun. 39 : 223-238(1983); Chu. C 등, Infect, Immun. 40 : 245-256(1983); Lepow, M, Pediat, Infect. Dis. J. 6 : 804-807(1987); 참고로 본 명세서에 인용함]. 이 모델은 본 발명의 신규의 백신을 구성하는데 사용될 수 있다. 이러한 접합 백신을 제조하는 추가의 방법은 Anderson, P.W 등의 유럽 특허 공보 제245,045호; Anderson, P. W 등의 미국 특허 제4,673,574호 및 제4,761,283호; Frank, R. 등의 미국 특허 제4,789,735호; 유럽 특허 공보 제206,852호; Gordon, L. k의 미국 특허 제4,619,828호; 및 Beachey, E. H의 미국 특허 제4,284,537호에 기술되어 있으며, 참고로 본 명세서에 인용하였다.
헤모필러스 인플루엔자 백신 같은 접합 백신을 위한 단백질 백본은 박테리아 피막 다당류가 수득되는 표적 생물체와 항원성 성질들을 공유하지 않는 단백질을 이용해 왔다[Ward, J. 등, In : Vaccines, Plotkin, S.A 등, eds, Saunders, Philadelphia, p. 300(1988)].
대조적으로, 본 발명의 접합 백신은 접합 백신을 위한 백본으로서 B군 연쇄상구균의 면역원성 단백질을 사용한다. 이러한 방법은 더 효과적인 백신을 유도하는 것으로 생각된다[참조: Insel. R. A 등, New. Eng. J. Med. (편집) 319(18) : 129-1220(1988)]. 본 발명의 단백질-다당류 접합 백신은 접합 백신에 사용될 수 있는 B군 연쇄상구균 단백질을 최초로 특이적으로 특성 규명한 것이다. B군 연쇄상구균에 특유한 임의의 단백질을 본 발명의 접합 백신의 단백질로서 사용할 수 있다. 그러나, 본 목적을 위해 B군 연쇄상구균의 C 단백질을 사용함이 바람직하다. 하기에 더 상세히 논의되는 바와 같이, 플라즈미드 pJMS1 및 pJHS23은 연쇄상구균 C 단백질을 암호화하는 DNA를 함유한다. 가장 바람직한 C 단백질들은 박테리아에서 상기 DNA을 발현시켜 수득한 것이다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 보호성 B군 연쇄상구균 단백질 항원들을 암호화하는 유전자들의 클로닝 및 발현에 관한 것이다. 이러한 단백질들은 이들 박테리아에 대한 접합 백신을 형성하기 위해 1개 이상의 B군 연쇄상구균 다당류가 접합될 수 있는 단백질 백본으로 사용함이 바람직하다. 대안으로, 본 명세서에 기술한 바와 같이, 1개 이상의 단백질은 B군 연쇄상구균의 다당류 구조에 접합될 수 있다.
B군 연쇄상구균의 독성 및 면역성에 있어서 이들 단백질의 역할은 B군 연쇄상구균 간염에 대한 추가의 치료법을 개발하기 위해 탐구될 수 있다. 박테리아기원의 이들 유전자의 분리 및 특성 분석을 통해 유전자 생성물을 조작하여 접합 백신의 폴리펩티드 백본/캐리어의 면역보강 및 항원성 성질 모두를 최적화할 수 있다.
C 단백질에 대한 유전적 연구
따라서, 본 발명은 B군 연쇄상구균의 C 단백질의 클로닝, 독성 및 면역성에 대한 그들의 역할 및 B군 연쇄상구균에 대한 접합 백신의 면역원으로 기여하는 능력에 관한 것이다.
수많은 그룹의 연쇄상구균들의 클로닝에 관한 광범위한 문헌이 입수 가능함에도 불구하고, 단지 제한된 유전적 조작이 B군 연쇄상구균에서 수행되어 왔다[참조: Macrina, F. L. Ann. Rev. Microbiol. 38 : 193-219(1984), Wanger, A.R 등, Infec. and Immun. 55 : 1170-1175(1987)]. B군 연쇄상구균에서 가장 광범위하게사용되는 기법은 Tn916의 개발 및 트랜스포존 돌연변이 유발에서 그의 사용이었다[참조: Rubens, C.E 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 7208-7212(1987), Wanger, A.R 등, Res. Vet. Sci. 38 : 202-208(1985)]. 그러나, C 단백질에 대한 1개 이상의 유전자가 존재하고, 보호성 항혈청이 수개의 단백질에 결합하는 것으로 보이기 때문에, 트랜스포존 돌연변이 유발에 의해 C 단백질 유전자를 스크리닝하는 것은 비실용적이다.
본 발명은 신규의 플라즈미드 벡터를 사용함으로써 C 단백질(및 B군 연쇄상구균의 독성에 관여하거나 B군 연쇄상구균에 대한 숙주 면역성에 영향을 미치는 기타 임의의 단백질)의 클로닝을 수행한다. 이 목적을 위해, B군 연쇄상구균에 대해 자연적으로 유도된 항체에 결합하는 단백질의 발현을 위해 신속하게 스크린될 수 있는 클로닝 벡터를 사용함이 바람직하다. 이러한 항체들은 이종 다클론 항체들이고 단일클론 항체들이 아니기 때문에, 수많은 양성클론에서 용이하게 스크린될 수 있는 벡터를 사용하여 소정의 유전자를 동정하는 것이 필요하다.
특정 항혈청에 결합하는 항원들의 발현에 대해 클론을 스크리닝하는데 유용한 다수의 기법이 존재한다[참조: Aruffo, A 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8573-8577(1987)]. 가장 광범위하게 사용되는 시스템인 λgt11은 Young과 Davis에 의해 개발되었다[참조: Huynh, T.V. 등, In: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol.1(Glover, D.H Ed)IRL Press, Washington pp. 49-78 (1985); Wong, W.W 등, J. Immunol, Methods 82 : 303-313(1985): 참고로 본 명세서에 인용함]. 이 기법은 그 생성물이 파아지분해에 의해 방출되는 용원성 파아지내에서 발현되는 클론의 신속한 스크리닝을 가능케한다. 이 시스템의 사용시 통상 직면하는 문제는 상세한 엔도뉴클레아제 제한 지도화, 프로브 제조 및 DNA 서열결정을 위해 플라즈미드 벡터내로 DNA 단편을 서브클로닝해야 하는 점이다. 추가로, 파아지 저장액으로부터 DNA의 제조는 귀찮은 일이며, 효과적으로 연구할 수 있는 잠재적으로 양성인 클론의 수를 제한한다. 최종적으로, 클로닝된 유전자들로부터 조 단백질 추출물의 제조는 파아지 벡터 숙주에서 문제점이 많다.
이들 문제점을 극복하기 위해, 본 발명은 독성 및/또는 면역성에 관련된 단백질 발현용의 클로닝된 박테리아 염색체 DNA를 스크리닝하기 위해 개발된 플라즈미드 벡터를 제공한다. 따라서, 본 발명은 추가로 B군 연쇄상구균에 대해 자연적으로 유도된 항체에 결합하는 단백질들의 발현을 위해 신속하게 스크린될 수 있는 효율적인 클로닝 벡터의 개발 및 사용방법에 관한 것이다. 상기 벡터는 통상 사용되는 플라즈미드 클로닝 벡터인 pUC12를 변형함으로써 제조하였다[참조: Messing, J등, Gene 19 : 269-276(1982); Norrander, J 등, Gene 26 : 101-106(1983), Vieira, J 등, Gene 19 : 259-268(1982); 참고로 본 명세서에 인용하였다]. 본 발명은 하기하는 벡터 및 그의 기능적 등가물에 관한 것이다.
이 시스템을 사용함으로써, 플라즈미드 클론들은 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 용이하게 조작 및 지도화할 수 있으며, 서브클로닝할 필요없이 그들의 DNA 삽입 서열들, 제조된 프로브 및 유전자 생성물들을 연구할 수 있다. pUC12는 ColEl 복제 원점, 앰피실린 내성 및lacZ 유전자내의 폴리링커를 보유하는 2.73 kb의 고 복제수 플라즈미드이다(참조: Ausubel, F.M 등, Current Topics in MolecularBiology; Greene Publ. Assn,/Wiley Interscience, NY(1987), 본 명세서에 참고로 인용함].
pUC12의 폴리링커내에 몇몇 변형을 수행하였다[참조: Aruffo, A 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8573-8577(1987), 본 명세서에 참고로 인용함]. pUC12를 변경시키는 전체적인 계획은 클로닝을 위해 동일하나 비-접착성인BstXI 위치를 제공하고, "스터퍼(stuffer)" 단편을 첨가하여 선형 숙주 플라즈미드로 분리를 용이하게 하고, 3개의 모든 해독틀안에서lac프로모터로부터 발현시키기 위해 폴리링커를 변형하는 것이다.
고 효율로 외래 DNA 삽입 위치를 제공하고 플라즈미드의 자가-연결 가능성을 최소화하기 위해, 역전된, 비-접착성BstXI 말단들을 폴리링커에 첨가하였다. 제1도에 나타난 바와 같이, pUC12를 먼저 BamHI로 절단(1단계)하고, 플라즈미드를 하기하는 부분적으로 상보적인 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터와 혼합하였다 : 15 량체(GATCCATTGTGCTGG)[서열번호 : 3] 및 11량체(GTAACACGACC)[서열번호 4](2 단계). 어댑터가 pUC12 내로 연결되는 경우, 새로운 2개의BstI 위치가 생성되나 원래의 BamHI 위치도 보존된다(3 단계). 이어서, 플라즈미드를 폴리뉴클레오티드 키나제로 처리한 후, 연결하여 폐쇄 환형 플라즈미드를 형성한다(4 단계). 이 플라즈미드를BstXI으로 처리하는 경우, 결과로 생성되는 말단은 동일하며 비접착성이다(모두 GTGT 돌출부를 보유한다)(5 단계).
폴리링커내의 두번째 변형은 자가연결할 수 있는 부분적으로 절단된 플라즈미드로부터 오염되지 않고 클로닝하기 위한 선형 플라즈미드를 정제하기 위해 수행하였다. 블런트 말단이고 365개의 염기쌍(bp)인 FunD2 단편을 플라즈미드 pCDM으로부터 수득하였다.BstXI 위치를 포함하지 않는 이러한 카세트 또는 "스터퍼" 단편의 블런트 말단을 부분적으로 상보적인 2개의 합성 올리고뉴클레오티드, 즉 12량체(ACACGAGATTTC)[서열번호 : 5] 및 8량체(CTCTAAAG)에 연결하였다(6 단계). 어댑터를 보유하는 생성된 단편은 5 단계에서 나타낸 변형된 pUC12 플라즈미드의 말단에 상보적인 4bp의 돌출부(ACAG)를 보유한다. 변형된 pUC12 플라즈미드를 어댑터를 가진 pCDM 삽입물에 연결하였다; pUC12라 명명된 생성된 구성체를 제2도에 도시한다. pUX12 플라즈미드는 도입된 연쇄상구균 DNA 서열의 절단에 의해 플라즈미드 pJMS1 또는 pJMS23으로부터 재생할 수 있다. 대안으로, 플라즈미드 pUC12를 사용하는 재조합 방법(또는 상동 재조합)에 의해 형성될 수 있다.
pUX12는 발현 벡터로서 사용되기 때문에, lac 프로모터에 대해 3 개의 가능한 해독틀 모두를 포함하도록 하기 위해 폴리링커를 추가로 변형하는 것이 바람직하다. 이들 변화는 6 중 1의 빈도로 클로닝된 유전자 단편에 정확한 해독틀을 허용한다. 예를 들어, 클로닝된 단편은 2개의 방향중 한 방향으로 그리고 3개 중 1개의 해독틀내로 상기 벡터에 삽입할 수 있다. +1 해독틀을 구성하기 위해, 폴리링커내의 유일한 위치를 절단하는 제한효소EcoRI을 사용하여 pUC12 플라즈미드를 절단하였다. 1본쇄의 5' 접착성 말단들을 T4 DNA 폴리머라제의 5'-3' 활성을 사용하여 채우고, 2개의 블런트 말단들을 연결하였다. 그 결과EcoRI 위치는 잃게되고 새로운XmnI 위치가 생성된다(제3A도). 이 구조물은 폴리링커내에EcoRI 위치의 손실 및 새로운XmnI 위치의 존재를 입증함으로써 확인하였다. 추가로, +1 변형된 pUX12 플라즈미드 상에서 표준 서열결정 프라이머를 사용하여 2본쇄 DNA 서열결정을 수행하였다[참조: Ausubel, F.M 등, Current Topics in Molecular Biology ; Greene Publ. Assn./Wiley Interscience, NY(1987)]. DNA 서열은 폴리링커에 4개의 염기쌍의 첨가를 나타내며 +1 해독틀에 대한 pUX12의 변형을 확인시켜 주었다. 이 플라즈미드를 pUX12+1이라 칭한다.
-1 해독틀을 구성하기 위해, pUX12의 폴리링커내에서 유일한 위치를 절단하는 제한효소 SacI을 사용하여 pUX12 벡터를 절단하였다. T4 폴리머라제의 3'-5' 엑소뉴클라제 활성을 사용하여 1본쇄 3' 접착성 말단들을 쳐내어 블런트 말단들을 만들고, 이어서 블런트 말단들을 연결하였다. 그 결과 나온 서열은SacI 위치를 제거하지만 새로운 FnuD2 위치를 생성하였다(제3B도). 그러나, pUX12-1 플라즈미드의 제한 지도화는SacI 위치가 부재하고, FnuD2 위치가 존재하지 않음을 나타냈다. 추가로, 폴리링커상에SmaI/XmaI 위치는 더이상 존재하지 않았다. 몇몇 가능한 pUX12-1 구성물을 미니-프렙, 2본쇄 DNA로부터 서열결정하였다. 서열 결정된 6개의 변형된 플라즈미드중 하나는 10 개의 뉴클레오티드가 부재함으로써 -1 해독틀을 생성함을 발견하였다(제3C도). 이는 T4 DNA 폴리머라제가 부가적인 엑소뉴클레아제 활성을 가지며 폴리링커의 부가적인 2본쇄 부분들을 쳐낸다는 것을 암시한다. 그럼에도 불구하고, 생성된 플라즈미드는 -1 해독틀을 보유하였다. 상기 플라즈미드를 pUX12-1이라 명명하였다.
B군 연쇄상구균의 항원성 단백질들의 클로닝에서 pUX12 벡터의 사용방법은 하기하는 실시예에 상세히 기술하였다. 간단히 언급하면, B군 연쇄상구균 유래의DNA, 또는 이러한 DNA에 상조적인 DNA를 pUX12, pUX12+1, pUX12-1 벡터내로 도입하고 에스케리치아 콜리안으로 형질전환시켰다. 클로닝된 DNA는 이. 콜리 내에서 발현되고, 세포성 용해물을 검사하여 세포성 용해물이 B군 연쇄상구균에 대한 항혈청에 결합할 수 있는 임의의 단백질 포함 여부를 결정하였다.
pUX12의 유용성을 증가시킬 수 있는 PUX12의 잠재적으로 흥미로운 다수의 변형이 존재한다. 예를 들어,lac프로모터는 다른 프로모터로 대체할 수 있으며, 복제 원점은 복제수가 더 낮은 벡터를 제조하기 위해 변형될 수 있으며, 약제 내성 마커도 변형될 수 있다.
숙주 세포에 대한 본 발명의 알파 항원 유도체를 암호화하는 유전자 서열을 제공하기 위해, 목적하는 숙주 세포에 목적하는 유전 정보를 제공할 수 있는 임의의 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라즈미드외에도 이러한 벡터로는 선형 DNA, 코스미트, 트랜스포존 및 파아지가 있다.
숙주 세포는 이.콜리로 제한되지 않는다. 본 발명의 유도체를 발현할 수 있는 임의의 박테리아 또는 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비제(S. Cerevisiae))가 적합한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(B. Subtilis) 및 B군 연쇄상구균이 숙주로서 사용될 수 있다. 이러한 숙주내로 클로닝하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 그람-양성 숙주의 경우, 배양 방법, 유전적 분석 플라즈미드, 유전자 클로닝 기법, 트랜스포존, 파아지 및 돌연변이 유발용 통합성 벡터의 사용 방법 및 유전자 융합체의 구성, 및 유전자 발현 측정 방법이 문헌[참조: Harwood, C.R. 등, eds, "Molecular BiologicalMethods for Bacillus, "Wiley-Inter Science, New York(1991)]에 기술되어 있다. 적합한 숙주는 American Type Culture Collection(미국, 메릴랜드, 록빌) 및 바실러스 유전자 저장 센타(미국, 오하이오, 콜럼부스, 오하이오 스테이트 유니버시티)같은 저장 센터로부터 획득할 수 있다.
본 발명은 B군 연쇄상구균에 특유한 단백질에 접합되는 B군 연쇄상구균에 특유한 다당류(예를 들어, 피막 다당류)를 포함하는 백신에 관한 것이다. 이러한 접합 백신의 "다당류" 및 "단백질"은 B군 연쇄상구균에 특유한 분자와 동일하거나 이러한 분자의 기능적 유도체일 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, B군 연쇄상구균 다당류는 임의의 B군-특이성 또는 유형-특이성 다당류이다. 포유동물(동물 또는 인간)내에 도입되는 경우, B군 연쇄상구균과 반응할 수 있는 항체를 유도하는 다당류를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 다당류의 예로는 B군 연쇄상구균의 피막 다당류 또는 그들의 등가물이 있다. 본 발명의 목적을 위해, 포유동물(동물 또는 인간)에 도입되는 경우, B군 연쇄상구균에 의해 발현된 단백질과 반응할 수 있는 항체를 유도하거나, B군 연쇄상구균의 다당류에 대한 항체를 유도하는 다당류의 면역원성을 증가시키는 임의의 단백질을 사용함이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 단백질의 예로는 B군 연쇄상구균의 C 단백질 또는 그들의 등가물이 있다.
펩티드 항원의 기능적 유도체의 예로는 B군 연쇄상구균에 대한 보호성 항체를 유도할 수 있는 능력을 보유하는, B군 연쇄상구균 C 단백질 알파 항원의 N-말단 단편, C-말단 단편 또는 내부서열 단편 같은 천연 단백질 단편이 있다. 용어 "기능적 유도체"는 천연 단백질의 변이체(예를 들어, 아미노산 서열이 변화되나 천연 분자에 의해 나타나는 바와 같이 면역원성, 독성 또는 항원 특성을 유도할 수 있는 능력을 보유하는 단백질), 예를 들어 천연 알파 항원보다 더 소수의 내부반복 서열 및/또는 변경된 측부 서열을 갖는 하기 인용된 알파 항원의 변이체를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 백신내의 다당류에 접합되는 펩티드 항원은 플라즈미드 pJMS23(시그날 펩티드 서열의 존재 또는 부재)상에서 암호화된 바와 같이, 알파 항원의 천연 아미노산 서열을 암호화하는 펩티드일 수 있거나 천연 서열의 기능적 유도체일 수 있다. pJMS23 상에서 암호화된 바와 같이, 천연 B군 연쇄상구균 C 단백질 알파 항원은 3060 뉴클레오티드의 개방형 해독틀을 포함하며 108,705 Da인 전구체 단백질을 암호화한다. 41개의 아미노산인 추정적인 시그날 서열이 절단되면 104,106 Da인 성숙한 단백질이 생성된다. 알파 항원의 20,417 Da인 N-말단 부위는 이전에 기술한 단백질 서열과 상동성을 나타내지 않았으며, 성숙한 단백질의 74%를 구성하는 9개의 일련의 직렬 반복 단위체에 선행한다. 각각의 반복 단위체("R"로 표시함)는 동일하며, 246개 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 분자량이 8665 Da인 82개의 아미노산으로 구성된다. 반복 단위체의 크기는 B군 연쇄상구균에 의해 자연적으로 발현되는 알파 C 단백질의 비균질한 래더(ladder) 모양상의 관찰된 크기 차이에 상응한다. 알파 항원의 C-말단 영역은 다수의 그람-양성 표면 단백질에 의해 공유되는 세포막 앵커 도메인 모티프를 포함한다. 이 유전자내(B군 연쇄상구균, C 단백질, 알파(alpha)항원에 대해bca유전자로 명명함)에 있는 큰 범위의 동일한 반복 단위체들은 보호성 에퍼토프를 정의하여 본 발명의 백신에 유용한 다양한 알파 항원 기능적 유도체를 생성하기 위해 사용할 수 있다.
이러한 기능적 알파 항원 유도체의 서열은 제6도의 DNA 서열의 679 번째 아미노산에서 시작하는 82개 아미노산 반복 서열(246개 뉴클레오티드)의 1-9개 사본을 포함한다(본 명세서에서 사용한 바와 같이, 그 내부의 반복 서열 9'으로 고안된 부분 반복 서열 또한 이점에서 유용하다). 기능적 유도체는 천연 단백질에서 반복 서열 이전에 발견되는 185개 아미노산 5' 측부서열(555개 뉴클레오티드)이 결여되거나 또는 그 서열을 보유할 수 있고/있거나, 상기 유도체는 48 개 아미노산(246개 뉴클레오티드)의 C-말단 앵커 서열이 결여되거나 또는 그 서열을 보유할 수 있다. 기능적 유도체는 알파 항원 반복 단위체(들)의 출발점보다 선행하는 N-말단 단편일 수 있거나, 알파 항원 반복 단위체(들)의 말단뒤에 위치하는 C-말단 단편만일 수 있거나, 또는 하기 정의하는 바와 같이 "R" 단위체의 사본이 없는 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 혼성일 수 있다. 천연 알파 항원의 아미노 말단 서열은 시그날 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 상기 알파 항원의 아미노 말단 서열 또는 카르복시 말단 서열 중 어느 하나는, 천연 알파 항원 단백질의 중심에서 반복되는 서열의 1개 이상의 사본을 갖거나 갖지 않으면서 본 발명의 접합백신에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 바와 같이, "R"은 제6도의 알파 항원 DNA 서열 중 679 번째 아미노산에서 시작하는 82개 아미노산 반복서열의 1개의 사본을 나타내며, "Rx"는 인접하는 R 단위체의 아미노 말단에 대한 1개의 R 단위체의카르복시 말단이직렬로 연결된, 상기 반복 서열의 직렬 사본의 "X" 수를 나타내며, "N"은 시그날 서열의 존재 또는 부재하에서 제6도에 나타낸 서열내에서 발견되는 5' 아미노산 측부 서열을 나타낸다; 시그날 서열이 부재하는 경우, "N"은 제6도에 도시한 바와 같이 천연 단백질내에서 발견되는 185개 아미노산 5' 측부 서열이며; 시그날 서열이 존재하는 경우, "N"은 제6도에 도시한 바와 같이, 226개 아미노산 5' 측부서열이다. "C"는 제6도에 도시한 바와 같이, 48개 아미노산 C-말단 앵커 서열을 나타낸다. 이 정의를 사용하면, 하기하는 종들은 본 발명에 따라 구성될 수 있는 고유 단백질의 유도체의 예이다 :
예를 들어, 11,12,13,14,15,16,17,18,19 또는 20R 단위체를 포함하는 10개 이상의 반복 R 단위체는 동일한 방법으로 구성될 수 있다. 추가로, R, N 또는 C 단편은 이러한 단편들이 B군 연쇄상구균에 대한 보호성 항체를 유도할 수 있는 유도체의 기능적 능력을 증강시키는 경우, 또는 이러한 단편들이 분비 시그날 또는 세포막 배치 시그날 같은 구성물에 다른 바람직한 특성을 제공하는 경우 사용될 수 있다.
B군 연쇄상구균의 기타 균주에서 유래한 알파 항원은 N 말단 또는 C 말단 또는 R 반복 서열내에서와 같이, 단백질의 서열내 약간의 변이성이 생물학적 특성 및 보호성 항체를 유도할 수 있는 그들의 기능적 능력을 변경시키지 않는 것과 유사한 방법으로 제조 및 사용될 수 있다. 예를 들어, B군 연쇄상구균의 다른 균주로부터 분리되고 동일한 반복 단위체를 가지나 상이한 N-말단 아미노산 서열을 갖는 B군 연쇄상구균 알파 항원은 본 발명의 범위내에 포함된다.
천연 단백질 또는 이의 기능적 유도체를 암호화하는 본 발명의 펩티드는 이들 단백질이 B군 연쇄상구균에 대한 보호성 항체를 유도하는 능력을 유지하는 임의의 방법에 의해 B군 연쇄상구균 탄수화물 부분에 접합된다.
백신내의 이질성은 특정 접합종들을 혼합함으로써 제공될 수 있다. 예를 들어, 백신 제제는 상기 탄수화물에 접합된 한 펩티드 유형을 1개 이상의 사본으로 함유하거나, 백신 제제는 그 안에 사용된 다당류에 각각 접합된 상기 기능적 유도체 및/또는 천연 서열의 유형을 1개 이상으로 함유하도록 제조될 수 있다. 하나의 펩티드(예를 들어, 그룹 1-43에 예시한 펩티드중 1개)를 제공하는 접합체는 임의의기타 펩티드(예를 들어, 그룹 1-43의 두번째 예)를 제공하는 접합체와 혼합하여 "화합물" 접합체 백신을 구성할 수 있다. 또한, 다가 백신은 당해 기술분야에 공지된 기법을 사용하여 상기한 바와 같이 제조한 B군-특이성 접합체를 디프테리아 독소 또는 파상풍 독소 같은 기타 단백질 및/또는 기타 다당류와 혼합함으로써 제조할 수 있다.
또한, 연쇄상구균 숙주가 알파 항원 단백질 또는 이의 기능적 유도체를 발현하도록 하기 위한 본 발명의 재조합 구성체로 형질전환된 B군 연쇄상구균 숙주(특히, 스트렙토콕쿠스 아갈락티네 (Streptococcus agalactine)내로)로부터 B군 연쇄상구균 제제를 이용함으로써 백신의 이질성이 제공될 수 있다. 이러한 경우, 반복 R 단위체들을 암호화하는 유전자 서열들 사이의 상동성 재조합으로 인해 그 결과 숙주의 자발적 돌연변이가 초래됨으로써, 숙주 군집이 용이하게 생성되고 이러한 숙주는 본 발명의 백신에 유용한 광범위한 항원성 알파 항원의 기능적 유도체를 발현할 것이다. 이러한 자발적 돌연변이는 알파 항원의 기타 영역들에 돌연변이가 일어날 수 있음에도 불구하고 통상 R 단위체 또는 이의 부분의 결실을 초래한다.
본 명세서에서 사용한 바와 같이, 다당류 또는 단백질은 박테리아와 자연적으로 관련된 분자와 구조 또는 서열이 실질적으로 유사한 경우, 박테리아에 "특유한" 것이다. 이 용어는 유기체에 특이적인 다당류 및 단백질 분자 모두뿐 아니라, 기타 유기체 상에 존재함에도 불구하고 인간 또는 동물 숙주에서 박테리아의 독성 또는 항원성에 관련된 분자들을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 백신은 수동 면역법 또는 능동 면역법에 의해 B군 연쇄상구균에대한 내성을 부여할 수 있다. 수동 면역법의 한 양태에서, 숙주(즉, 인간 또는 포유동물) 지원자에게 상기 백신을 제공하고, 유도된 항혈청을 회수하고, B군 연쇄상구균에 의해 감염된 것으로 의심되는 수용자에게 직접 제공한다.
독소 표지를 사용하여 항체 또는 항체 단편을 표지하는 능력은 이 유형의 수동 면역법이 수행되는 경우 B군 연쇄상구균 감염을 치료하기 위한 추가의 방법을 제공한다. 이 양태에서, B군 연쇄상구균 항원을 인식할 수 있는 항체 또는 그 항체 단편을 독소분자로 표지한 다음 환자에게 투여한다. 이러한 독소 유도체 분자가 B군 연쇄상구균 세포에 결합하는 경우, 독소 부분은 세포를 사멸시킬 것이다.
제2 양태에서, 여성 및 태아 또는 신생아(태반을 통과하는 항체의 수동 혼입에 의함) 모두를 보호하는 항혈청의 생성을 초래하기에 충분한 시간 및 투여량의 조건으로 여성(임신 또는 분만중이거나 그 이전)에게 백신을 제공한다.
따라서, 본 발명은 B군 연쇄상구균에 의한, 또는 접합 백신의 다당류 및/또는 단백질에 대한 항혈청에 의해 인식 및 결합될 수 있는 항원을 보유한 유기체에 의한 감염을 예방 또는 감약화하기 위한 수단을 제공한다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이, 개체에 대한 백신 투여가 질병의 징후 또는 증상을 총체적 또는 부분적으로 감약화(즉, 억제)시키거나 질병에 대한 개체의 총체적 또는 부분적인 면역성을 초래하는 경우 백신은 질병을 예방 또는 감약화하는 것으로 언급된다.
백신(또는 백신이 유도한 항혈청)의 투여는 "예방" 또는 "치료" 목적일 수 있다. 예방적으로 제공되는 경우, 화합물(들)은 B군 연쇄상구균 감염의 임의의 징후가 나타나기에 앞서 제공된다. 상기 화합물(들)의 예방적 투여는 임의의 후속 감염을 예방 또는 감약화한다. 치료적으로 제공되는 경우, 상기 화합물(들)은 실질적인 감염의 징후 검출시 제공된다. 상기 화합물(들)의 치료적 투여는 임의의 실질적인 감염을 감약화한다.
따라서, 본 발명의 항-염증제는 감염의 개시전(예상되는 감염의 예방 또는 감약화를 위해) 또는 실질적인 감염의 개시후에 제공될 수 있다.
조성물은 그의 투여를 수용체 환자가 견딜 수 있을 경우 "약학적으로 허용가능하다"고 한다. 이러한 약제는 투여되는 양이 생리적으로 상당한 양인 경우 "치료적으로 유효한 양"으로 투여된다고 한다. 약제의 존재로 인해 수용체 환자의 생리 상태에 검출 가능한 변화가 일어날 경우, 상기 약제는 생리적으로 중요하다.
당해 기술분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 백신이 개체에게 제공되는 경우, 백신은 상기 조성물의 효과를 개선시키기에 바람직한 염, 완충액, 면역보강제 또는 기타 물질을 함유할 수 있는 조성물내에 존재할 수 있다. 면역보강제는 특정 면역반응을 특이적으로 증가시키기 위해 사용될 수 있는 물질이다. 보통 면역보강제와 조성물은 면역계에 투여하기 전에 혼합하거나, 분리 투여하되 예방접종된 동물의 동일한 위치내로 투여한다. 면역보강제는 그들의 조성에 따라 몇개의 그룹으로 분류할 수 있다. 이들 그룹은 오일면역보강제(예를 들어, 프로인트의 완전 및 불완전 면역보강제), 광물성염(예를 들어, AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4), 실리카, 카올린 및 탄소), 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 폴리IC 및 폴리AU 산) 및 임의의 천연 물질(예를 들어, 미코박테리움투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 왁스 D, 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum) 또는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 및 브루셀라 속의 구성원에서 발견되는 물질)을 포함한다. 이들 물질 중에서 면역보강제로서 특히 유용한 것은 사포닌, 예를 들어 퀼A(덴마크, Superfos A/S)이다. 백신 조성물에 사용하기 적당한 물질의 예는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Science(Osol, A, Ed, Mack Publishing Co, Easton, PA, pp. 1324-1341(1980)), 본 명세서에 참고로 인용함]에 기술되어 있다.
본 발명의 치료용 조성물은 주사, 고속주입, 비인두 흡수(비인두내로) 피부 흡수에 의해 비경구로 또는 경구로 투여될 수 있다. 선택적으로 상기 조성물은 근육내 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 비경구 투여용 조성물들은 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 유탁액을 포함한다. 비-수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유 같은 식물유, 및 에틸올레에이트 같은 주사용 유기 에테르가 있다. 캐리어 또는 차단 드레싱은 피부 투과성을 증가시키고 항원 흡수를 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 경구 투여용 액체 조제 형태는 일반적으로 액체 조제 형태를 함유하는 리포좀 용액을 포함한다. 현탁 리포좀을 위한 적합한 형태로는 유탁액, 현탁액, 용액, 시럽 및 당업계에서 통상 사용되는 정제수 같은 불활성 희석제를 함유하는 엘릭시르가 있다. 불활성 희석제 이외에 이러한 조성물은 면역보강제, 습윤제, 유화제 및 현탁제, 또는 감미제, 향미제, 또는 향료를 포함할 수 있다.
다회 투여법이 사용되는 경우, 예방접종의 시기 선택을 위한 다수의 다른 기법이 존재한다. 예방접종된 동물에 의해 발현되는 면역 글로불린 레퍼토리의 발현 수준 및 다양성을 증가시키기 위해 본 발명의 조성물을 1회 이상 사용하는 것이 가능하다. 전형적으로, 다중 예방접종이 행해지는 경우, 그들은 1 내지 2개월 간격으로 투여될 것이다.
본 발명에 따라, 치료용 조성물의 "유효량"은 목적하는 생물학적 효과를 획득하기에 충분한 양이다. 일반적으로, 조성물의 유효량을 제공하기 위해 필요한 투여량은 동물 또는 인간의 연령, 증상, 성별 및 질병의 정도 같은 인자 및 당해 기술분야의 당업자에 의해 조정될 수 있는 기타 변수에 의존한다.
본 발명의 항원성 제제는 유효량의 단일 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 유효량은 1회 투여당 0.01-1,000이고, 더 바람직하게는 1회 투여당 0.1-500이고, 가장 바람직하게는 1회 투여당 10-300이다.
지금까지 일반적으로 기술한 본 발명은 예시를 위해 제공되는 하기하는 실시예에 의해 더 용이하게 이해될 것이며, 이는 특별한 언급이 없는한 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
pUX12 벡터의 클로닝 효율
pUX12 벡터의 클로닝 효율을 시험하고, 변형된 해독틀이 정확히 전사되는 지의 여부를 측정하기 위해 몇 가지 실험을 계획하였다. 이들 실험의 결과를 하기에간략히 요약한다 :
1. DNA 단편을 pUX12 내로 클로닝하기 위해, 3개의 구성체, 즉 pUX12 (본래의 "제로" 해독틀 구성), pUX12+1 및 pUX12-1을 동일몰 농도로 혼합하였다. 이 후 이 플라즈미드들을BstXI로 절단하여 폴리링커내의 스터퍼(stuffer) 단편을 절단하였다. 스터퍼 단편은 저융점의 아가로즈 또는 아세트산칼륨 구배를 사용하여 플라즈미드로부터 분리하였다[참조: Aruffo. A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 84:8573-8577 (1987), Ausubel, F. M. 등, Current Topics in Molecular Biology:Greene Publ. Assn./Wilely Interscience, 뉴욕(1987)]. 클로닝할 DNA는 블런트 말단을 생성하는 제한 효소로 절단하였다(이러한 제한 효소는 어느 것이라도 이용할 수 있다). 필요하면, 1본쇄의 말단들을 갖는 2본쇄 DNA를 변형시켜 블런트 말단을 생성시킬 수 있다. 블런트 말단의 DNA 단편들을 2종의 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터와 혼합하였다. 이들은 스터퍼 단편을 만드는데 사용된 12 량체 및 8 량체와 동일하다. 변형된 DNA 단편은 아세트산 칼륨 구배상에서 비통합된 합성 올리고뉴클레오티드로부터 분리하였다. 그 후 상기 단편들을 선형 pUX12 플라즈미드군 속으로 연결시켜 이.콜리를 형질전환 시키는데 사용하였다.
어댑터를 사용한 삽입체의 클로닝을 최적화하는 조건하에 낮은 빈도수로 pUX12 벡터가 자가-연결됨을 확인하기 위해, 제2의 약제 내성 마커를 pUX12속으로 클로닝하였다. 제1도에 도시한 바와 같이, pUX12는-락타마제 유전자 및 암피실린 내성(ampR) 운반체를 가진다. 제2 마커를 클로닝하는 원리는 통상의 클로닝 조건하에 자가-연결되어 암피실린 내성만을 발현시킨 pUX12 플라즈미드 클론에 대한 두 약제 내성 마커를 모두 함유한 클론의 비를 비교하는 것이있다. 플라즈미드 pBR322에서 유래한 테트라사이클린 내성 유전자(tetR)를 전술한 어댑터를 사용하여 pUX12의 폴리링커의 속으로 클로닝하였다. 일군의 시험 연결을 수행하여 단편 말단들에 대한 올리고뉴클레오티드 어댑터의 최적 농도 및, 연결과 형질전환에 있어서 선형 pUX12 플라즈미드에 대한 변형된 삽입체의 비율을 설정하였다.tet R유전자를 마커로서 사용함으로써, 본원 발명자들은 클로닝 매개 변수를 결정하여 암피실린 함유 평판상에서 선별된 99% 이상의 형질전환체 역시tet R마커를 보유하게 할 수 있었다. 따라서, 이 시스템에서 자가-연결 빈도수는 매우 낮으며, pUX12에 있는 라이브러리를 스크리닝하기 전에 폴리링커내의 삽입체의 존재를 스크리닝할 필요는 없다.
2. pUX12의 폴리링커내 해독틀의 위치를 확인하기 위해, 그 서열과 생성물을 알고 있으며 그 자체의 프로모터가 없는 구조 유전자를 클로닝하였다.
상기 목적으로, 플라즈미드 상에 보유된tox구조 유전자의 돌연변이체[참조: Costa, J. J 등, J. Bacteriol. 148(1): 124-130(1981), Michel, J. L등, J. Virol. 42:510-518(1982), 본원에 참고로 인용함]를 선택하였다. 플라즈미드 pABC402를 제한 엘도뉴클레아제Apa1 및HindIII[참조: Bishai, W. R 등, J. Bacteriol. 169:1554-1563(1987), Bishai W. R 등, J. Bacteriol, 169: 5140-5151(1987), 본원에 참고로 인용함]로 동시에 처리하였다.ApaI 부위는 N-말단 근처의 구조 유전자내에 있고,HindIII 부위는tox유전자의 C-말단 바로 외부에 있다. 이 1.2 kb 제한 단편을 저융점 아가로스를 사용하여 나머지 4.1 kb의 pABC402 벡터로부터 분리하였다.
클로닝을 위한 블런트 말단을 생성시키기 위해,tox단편을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하였다. 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성은ApaI 3' 말단들을 잘라내며, 폴리머라제 활성은HindIII 부위에서 5' 단일 가닥 부분을 합성으로 채웠다[참조: Maniatis, T. 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 뉴욕, 콜드 스프링 하버 소재의 콜드 스프링 하버 프레스(1982)]. 블런트 말단을 가진 이 정제 단편을 3개의 해독틀을 모두 가지는 pUX12의 혼합체 속으로 연결하였다. 각각의 형질전환체를 무작위로 취하고, 제한 지도 작성으로 스크린하여 삽입체의 방향과 해독틀을 결정하였다. 또한, 폴리링커/어댑터/삽입체 영역들의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 6가지의 모든 가능한 방향 및 해독틀의 조합을 동정하였다. 최종적으로, 디프테리아 독소에 대한 항혈청을 프로브로 한 웨스턴 블롯을 사용하여 이들 클론으로부터의 추출물을 스크린하였다[참조: Blake, M. S. 등, Anal, Biochem. 136:175-179 (1984), Murphy, J. R. 등, Curr. Topics Microbiol. and Immun. 118:235- 251(1985)].
반응성 있는 독소 관련 단백질은 정확한 방향 및 해독틀내에 구조 유전자를 가진 클론들에서 검출되었다. 이 플라즈미드를 pUDTAH-1이라고 한다;tox구조 유전자의 폴리링커 및 개시부의 DNA 서열을 표 1에 도시한다. 도시된 서열은 pUDTAH-1 내tox'구조 유전자의 개시부의 DNA 서열이다. ATG는 전사체(lacZ')의 개시 신호이고, CAT는 pUX12의 변형된 폴리링커를 개시하며, GCC는tox'유전자의 정확한해독틀을 개시한다.
실시예 2
B군 연쇄상구균으로부터 염색체 DNA의 정제
B군 연쇄상구균으로부터 염색체 DNA를 정제하기 위해서, B군 연쇄상구균의 A909 균주[참조: Lancefield, R. C. 등, J. Exp. Med. 142 : 165-179 (1975)]로부터 루벤스등의 방법[참조: Rubens, C. E. 등, Proc. Natl. Acad. Sci 미국 84 : 7208-7212 (1987)]에 의해 변형된 바와 같이 헐등의 방법[참조: Hull, R. A. 등, Infect. and Immun. 33 : 933-938 (1981)]으로 염색체 DNA를 분리하였다(상기 두 문헌은 본원에 참고로 인용하였다). 간단히 언급하면, 뮤타노라이신을 사용하여 B군 연쇄상구균 A909(Ia/c) 균주를 원형질체로 전환시켰다. 생성된 표면 추출물은 온전한 박테리아에 대해 형성된 보호성 항혈청과 면역 반응하는 다수의 단백질을 함유하는 것으로 확인되었다. 통상의 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 불용성 단백질 분획을 부분적으로 정제하였다. 단일의 14 킬로달턴(kd)종으로 고도로 농축된 분획을 포함하는, 두 분획을 토끼의 면역화에 사용했다. 이들 부분 정제된 B군 연쇄상구균 단백질에 대해 형성된 항혈청은 C 단백질을 보유하는 이종성 피막형의 B군 연쇄상구균에 대한 마우스의 독성 분석에서 수동적인 보호를 부여할 수 있는 것으로 확인되었다.
B군 연쇄상구균 DNA는 부력 밀도 염화세슘(CsCl) 구배에서 원심분리하여 정제하고, 염색체 DNA를 TAE 완충액(pH 8.0)[참조: Maniatis, T 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 뉴욕 콜드 스프링 소재의 콜드 스프링 하버 프레스(1982)]에 대해 완전히 투석하였다. B군 연쇄상구균의 A909 균주는 제1 유형 피막을 가지며, C 단백질을 발현하며, C 단백질의 연구에서 이미 사용되어 왔다[참조: Valtonen, M. V. 등, Microb. Path. 1 : 191-204 (1986)]. 스크린용 보호성 항혈청을 만드는데 사용된 것 역시 B군 연쇄상구균 균주이다.
B군 연쇄상구균 염색체 DNA의 수율은 B군 연쇄상구균의 하루밤 배양물 500 ml 마다 평균 3 mg 내지 5 mg이었다. 정제된 DNA를 일반적으로 사용되는 24개의 제한 엔도뉴클레아제를 개별적으로 처리하고, 생성된 단편을 1.0% 아가로즈겔 상에서 전개시켰다. 클로닝 벡터에서 일반적으로 사용되는 폴리링커상의 유일한 부위들을 갖는 제한효소를 포함하여 넓은 범위의 효소를 선택하였다. 겔의 에티듐브로마이드(EtBr) 염색은 제한 효소 모두가 B군 연쇄상구균 DNA의 구별되는 단편 크기의 분포를 나타냄을 보여 주었다. 이것은 B군 연쇄상구균 DNA가 시험한 제한 효소 어느 것에 대해서도 변형되지 않음을 암시한다.
DNA의 연결을 차단하는 억제인자의 존재 여부를 측정하기 위해, 전술한 제한 엔도뉴클레아제 처리물을 에탄올 침전시키고, 연결 완충액에 넣고, 14℃에서 하루밤 동안 DNA 리가제로 항온처리 하였다. 이들 샘플을 1.0% 아가로스겔 상에서 다시전개시키고, EtBr로 염색하였다. 생성된 제한 패턴은 보다 고분자량의 분포를 보였다. 그러므로, B군 연쇄상구균 DNA의 연결의 억제 현상은 없었다.
실시예 3
B군 연쇄상구균 염색체 DNA의 라이브러리의 제조
pUX12에 있는 B군 연쇄상구균 염색체 DNA의 라이브러리의 제조 및 이.콜리내로의 형질전환을 다음과 같이 실시하였다. 클로닝을 위한 B군 연쇄상구균의 염색체 DNA를 절단하기 위해, 광범위한 분포의 제한 단편 크기를 생성시키는 4종의 제한 효소를 선택하였다. pUX12 벡터 및 어댑터는 블런트 말단의 단편을 클로닝할 경우 가장 효과적이다. 선택된 효소는 4개의 염기쌍 부위를 인식하며 블런트 말단을 남긴다. B군 연쇄상구균 DNA는AluI,FunD2,HaeIII 및RsaI으로 각각 부분적으로 처리하였다.
생성된 단편을 혼합하고, 페놀/클로로포름으로 정제하고, 에탄올 침전시키고, 연결 완충액에 재현탁시켰다[참조: Maniatis, T. 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 뉴욕 콜드 스프링 하버 소재의 콜드 스프링 하버 프레스(1982)]. 1 ㎍의 B군 연쇄상구균 DNA 단편을 3 ㎍의 12량체 및 2 ㎍의 8량체 올리고뉴클레오티드 어댑터와 혼합하였다. 3의 T4 DNA 리가제(600 유니트, 뉴 잉글랜드 바이오랩)를 첨가하고, 반응은 14℃에서 하루밤 동안 유지하였다. 유리 링커를 아세트산 칼륨 속도 구배상에서 B군 연쇄상구균 DNA 단편으로부터 분리하였다[참조: Aruffo, A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 84 : 8573-8577 (1987)].
3개의 해독틀 모두를 포함하는 pUX12 플라즈미드를BstXI로 처리하고, 저융점 아가로즈겔을 사응하여 스터퍼 단편을 제거하였다. B군 연쇄상구균 라이브러리는 0.1% T4 DNA 리가제가 첨가된 100의 연결 완충액에서 어댑터가 부가된 10ng의 B군 연쇄상구균 단편을 100ng의 선형 pUX12 벡터와 혼합함으로써 제조하였다. 연결 반응물은 14℃에서 하루밤 동안 유지한 후, 암피실린을 함유하는 평판상에서 이.콜리의 MC 1061 균주를 형질전환시키는데 사용하였다[참조: Ausubel, F. M. 등, Current Topics in Molecular Biology(1987)].
생성된 형질전환체 16개를 분리하고, LB에서 하루함 동안 성장시키고, 플라즈미드 DNA를 미니프렙으로 분리하였다. 플라즈미드 DNA를BamHI으로 처리하고, 1.0% 아가로즈겔 상에서 전개시켰다. 스크린한 모든 플라즈미드는 pUX12 벡터내 삽입체를 포함하고, 평균 삽입체 크기는 1.4 kb였다. 현재까지, 200개 이상의 클론으로부터 수득한 플라즈미드 DNA를 스크린하고, 폴리링커내 삽입체가 없는 것으로 나타난 클론은 오직 하나가 확인되었다.
실시예 4
라이브러리의 스크린에 사용할 보호성 항체의 특성 분석
상기 논의한 바와 같이, C 단백질은 다양한 기술로 부분적으로 정제되었고, 보호성 항혈청은 다수의 연구자들에 의해 제조되었다[참조: Bevanger, L. 등, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B. 93 : 113-119 (1985), Russell-Jones, G. J. 등, J. Exp. Med. 160 : 1476-1484 (1984), Wilkinson, H. W. 등, Infec. and Immun. 4 : 596-604 (1971)].
보호성 항체를 유도하는 B군 연쇄상구균의 상청액으로부터 14,000mW의 단백질을 분리한 발토넨, 캐스퍼 및 레비의 연구에 따라 한 세트의 실험을 수행하였다[참조: Valtonen, M. V. 등, Microb. Path. 1 : 191-204 (1982), 본원에 참고로 인용함]. 이 실험은 B군 연쇄상구균 배양물의 상청액에 대한 단백질 분해 억제인자를 C 단백질의 농축 및 정제 전에 첨가할 경우[참조: Wong, W. W. 등, J. Immunol. Methods. 82 : 303-313 (1985)], 14,000mW의 단백질은 더 이상 상청액에 현저한 단백질이 아님을 보여주었다. 이것은 상기 단백질이 B군 연쇄상구균 배양물의 상청액에 보다 고분자량의 C 단백질이 단백질 분해됨으로써 생성된 것임을 나타낸 것이다.
실시예 5
플라즈미드계 벡터에서 발현을 스크린하는 조건의 최적화
상기 논의한 바와 같이, 발현의 검출에 가장 흔히 사용되는 벡터는gt11에 근거한 것이다[참조: Young, R. A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 80 : 1194-1198 (1983)]. 본원 발명자들은 박테리아 콜로니의 항체 스크리닝을 위한 두개의 전술한 방법을 합쳐서 pUX12 플라즈미드 벡터로부터의 발현의 검출 민감도를 증가시킬 수 있었다. 라이브러리로부터의 형질전환체를 하루밤 동안 평판 배양하고, 생성된 콜로니를 니트로셀룰로스 필터(비이오-라드)에 옮겼다. 밀폐된 용기에서 30분동안 클로로포름(CHCl3)으로 포화된 대기에 필터를 놓음으로써 콜로니를 용균시켰다. 그 후 필터를 용균화 완충액에 넣고, 헬프먼등의 문헌[Helfman, D. M. 등,Proc. Natl. Acad. 미국 80 : 31-35 (1983)]에 기술된 대로 하루밤 동안 항온처리하였다. 바이오-라드 래버러토리즈에서 제조된 고속-블롯 분석 키트에서 호스래디쉬 페록시다제 접합된 친화도 정제된 염소 항-토끼 IgG(비 1:3000) 및 상업적으로 제조된 이.콜리 용균물(비 1:200)을 이용하여 항체 스크리닝을 실시하였다. 콜로니를 클로로포름으로 전처리하고, 전술한 DNase 및 라이소자임과 하루밤 항온처리함으로써, 1:500 에서 1:5000 로 요구되는 1차 항체의 비를 감소시킬 수 있었다.
실시예 6
양성 클론과 그 단백질 생성물의 초기 분석
pUX12 벡터내 B군 연쇄상구균 염색체 DNA의 라이브러리를 상기 논의한 보호성 항-C 단백질 항혈청으로 스크리닝하였다. B군 연쇄상구균 라이브러리는 평균 단편 크기가 1.4 kb였다. 전술한 바와 같이, 형질전환체를 스크리닝한 후, 서브클로닝하고, 항혈청으로 3회 재스크리닝 하였다. 스크리닝한 20,000 클론중에서, 보호성 항혈청과 반응한 35개의 독립적으로 분리된 클론이 있었다. 그 클론들을 S1-S35로 명명하고, 그 클론들을 함유하는 플라즈미드를 pJMS1-pJMS35로 명명하였다. 클론들은 0.9 kb 내지 13.7 kb의 크기를 가졌고, 4.5 kb의 평균 크기를 가졌다.
플라즈미드 DNA를 미니프렙에 의해 클론들로부터 분리하고, 삽입체를 4개의 제한 엔도뉴클레아제로 조사하였다. 14개의 클론은 각 군내 동일한 삽입체 크기와 공통의 제한 엔도뉴클레아제 지도 패턴을 공유하는 것을 기초로 하여 3개의 군으로 나누었다. 하기 논의한 클론 S1 및 S23은 상이한 군의 일원으로 확인하였다.
각각의 클론의 제한 패턴을 추가로 비교함으로써, 공통의 제한 단편을 공유하는 24개 클론을 동정할 수 있었다. 클론 S1 및 S23은 어떠한 제한 단편도 공통으로 가지고 있지 않은 것으로 확인되었다.
클론들의 추출물을 제조하여 웨스턴 블롯상에 전개시키고, 라이브러리 스크리닝에 사용된 항혈청을 프로브로 사용하였다. 6가지 크기 부류의 단백질 항원은 (A-F)로 동정되었다. 제한 엔도뉴클레아제 지도와 웨스턴 블롯의 데이타를 결합시킴으로써 35개 클론중 24개를 6가지 상이한 단백질 항원 패턴(표2)으로 분류할 수 있었다. 이 초기 분류는 단지 관련된 유전자의 잠재적 숫자를 대략적으로 조사하기 위해서 이루어졌다. S1은 크기가 3.5 kd인 것으로 항원 단백질 패턴 A에 속하는 것으로 확인되었다. S23은 크기가 13.7 kd이고, 항원 단백질 패턴 D에 속하는 것으로 확인되었다.
클론들의 추출물의 웨스턴 블롯에서 C 단백질을 발현시키지 않는 B군 연쇄상구균 균주에 대한 항혈청을 프로브로 사용하였을 때, 단 하나의 클론군이 양성이었다(단백질 프로필 B), 이것은 대부분의 양성 클론이 C 단백질을 보유하는 균주에독특한 단백질을 발현시킨다는 것을 암시한다; 이들 단백질은 B 군 연쇄상구균의 모든 균주에 공통하는 것은 아니다.
실시예 7
클로닝된 유전자 서열의 특성 분석
B군 연쇄상구균에 의해 발현되는 C 단백질의 실제 숫자는 측정되지 않았다. C.D.C.로부터 C 단백질 유형 항혈청을 특성분석한 브래디등에 의한 최근의 면역학적 연구는 4개의 상이한 항원을 동정하였다[참조: Brady, L. J. 등, J. Infect. Dis. 158(5) : 965-972 (188)] B군 연쇄상구균의 추정 C 단백질 클론의 유전적 및 면역학적 예비 특성 분석은 4개 또는 5개의 유전자가 C 단백질을 보유한 것으로 알려진 B군 연쇄상구균의 균주상에 존재하는 단백질을 암호화한다는 것을 암시한다. 2개의 군의 실험을 수행하여 클로닝된 유전자 생성물이 C 단백질을 나타내는지 여부를 측정하였다.
상기 논의한 바와 같이, C 단백질의 연구는 2가지 표현형을 규명하였다 : 펩신에 의한 분해에는 민감하나 트립신에 의한 분해에는 민감하지 않은 단백질군(TR 또는라 칭함), 및 펩신과 트립신 모두에 의한 분해에 민감한 단백질군(TS 또는라 칭함) [참조, Johnson, D. R. 등, J. Clin. Microbiol. 19 : 506-510 (1984), Russell-Jones, G. J. 등, J. Exp. Med. 160 : 1476-1484 (1984)].
항혈청및의 유형 분류법을 사용하여 웨스턴 블롯상에서 클로닝된 유전자 생성물을 스크리닝하였다 [참조: Bevanger, L. 등, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B. 87 : 51-54 (1979); Bevanger, L. 등, Acta. Path. Microbiol.Scand. Sect. B. 89 : 205-209 (1981): Sevanger, L. 등, Acta. Path. Microbiol. Scand. Sec. B. 91 : 231-234 (1983); Bevanger, L. 등, Acta. Path. Microbiol. Scand. Sect. B. 93 . 113-119 (1981), Bevanger, L. 등, Acta, Path. Microbiol. Immunol. Scand. Secd. B. 93 : 121-124 (1985), 모두 본 명세서에 참고로 인용되어 있음].
분류형 혈청은 단백질 프로필 D를 동정하고,분류형 항혈청은 단백질 프로필 A를 동정하였다. 이들 단백질은 펩신과 트립신으로 처리하였다. 단백질 프로필 D는 펩신에 민감하지만 트립신에는 민감하지 않으며, 단백질 프로필 A는 펩신과 트립신 모두에 민감하다. 이들 결과는 전술한 연구와 일치하며, 2개 이상의 C 단백질 유전자가 클로닝되었음을 확인한다.
C 단백질의 가장 중요하고 특징적인 성질은 이들이 C 단백질을 발현시키는 B군 연쇄상구균 균주에 대한 보호성 항체를 유도할 수 있다는 점이다. 클로닝된 유전자 생성물에 대한 항혈청을 제조하는데는 여러가지 방법을 사용할 수 있다. 예를들면, 이.콜리 클론들의 용균물을 토끼내로 직접 주사하여 이.콜리 또는 도입된 B군 연쇄상구균 단백질들 중 어느 것에 대한 항체들을 유도할 수 있는 단백질을 상기 용균물이 함유하는지 여부를 측정할 수 있다. 생성된 항혈청은 항혈청을 시험하기 전에 이.콜리의 용균물을 사전 흡수시켜 교차 반응성 항체수를 감소시킬 수 있다. 이러한 용균물을 사용하여, 클론의 발현을 스크리닝하는데 사용된 두 콜로니 블롯에서, 그리고 B군 연쇄상구균의 세포 추출물 및 부분 정제된 B군 연쇄상구균 단백질을 연구하는데 사용된 웨스런 블롯에서 교차 반응성 항체수를 감소시킬 수있다.
단백질 프로필 A, B 및 D로부터의 대표적인 클론들을 초음파 처리하고, 토끼속으로 주사하여, 클로닝된 B군 연쇄상구균 단백질 항원에 대한 항혈청을 생성시킨다[참조: Lancefield, R.C. 등, J. Exp. Med. 142 : 165-179 (1975), Valtonen, M. V. 등, Microb. Path. 1 : 191-204 (1986)]. 대조군 토끼에게는 폴리링커내에 삽입체가 없는 pUX12를 보유하는 이.콜리를 주사하였다, 항혈청에 이 콜리 용군물을 사전 흡착시키고, 라이브러리중 클론의 추출물에 대해 웨스턴 블롯상에서 먼저 스크리닝하였다. 그러므로, 클론들 사이에 교차-반응성 에피토프가 있는지를 측정할 수 있고, 이들 항혈청이 스크리닝 과정의 예비 단계중 동정된 클로닝된 단백질에 대응하는 것인지를 확인할 수 있다.
대안으로, 사전 흡착된 항혈청은 마우스 보호 모델에서 시험할 수 있다. 이 고전적 모델에서, 마우스에게는 토끼 항혈청을 복강내로 주사하였다[Lancefield, R. C. 등, J. Exp. Med. 142 : 165-179 (1975)]. 다음날, 상기 마우스에게 C 단백질을 보유하는 것으로 알려진 생존성 B군 연쇄상구균의 LD90을 다시 복강내로 주사하였다. 종말점은 48시간 지나 마우스가 사망한 시점이다.
클로닝된 유전자 서열에 의해 발현된 단백질의 면역원성을 시험하기 위해, pJMS1 및 pJMS23을 함유하는 에스케리치아 콜리 세포를 증식시키고, 세포 추출물을 제조하는데 사용하였다. 그 후 이들 추출물을 사용하여 토끼를 면역화하였다. S1 및 S23 추출물에 의한 면역화에 반응하여 생성된 항혈청을 마우스 보호 모델을 사용하여 시험하였다.
마우스 보호 모델 실험을 수행했을 때, 단백질 프로필 A 및 D를 나타내는 클론(각각 S1 및 S23)으로부터 생성된 항혈청은 각각 보호성인 것으로 확인하였다. 단백질 프로필 C를 나타내는 클론으로부터의 항혈청은 보호성이 아니고, 대조군 항혈청 역시 보호를 나타내지 않았다. 단백질 프로필 C를 발현시키는 클론에 대해 생성된 항혈청 역시 C 단백질을 보유하지 않은 B군 연쇄상구균의 균주로부터 추출된 단백질에 결합한다. 그러므로, 이 군의 클론들은 C 단백질을 암호화하지 않는다. 요약하면, 6개 군의 클론중 5개군은 C 단백질을 발현시키는 B군 연쇄상구균의 균주에 특이적인 단백질을 암호화하지 않는다.
클론군중 2개의 초기 생화학적, 면역학적 및 기능적 분석은 2개 이상의 C 단백질 유전자(S1 및 S23)가 성공적으로 클로닝되었음을 입증한다. 이것은 B군 연쇄상구균으로부터 클로닝된 단일의 폴리펩티드 유전자 생성물이 보호성 면역을 유도할 수 있다는 첫번째 증명이다. S1에 대한 항체는 A909 추출물의 50 kd 및 60 kd의 두 개의 밴드에 결합할 수 있는 것으로 확인되었다. S23에 대한 항체는 40 kd 내지 180 kd 이하의 MW를 갖는 B군 연쇄상구균 표면 추출물에서 규칙적으로 반복하는 패턴에 결합할 수 있는 것으로 확인되었다. A909 추출물에서 유래한 단일클론 항체는 상기와 동일한 반복 패턴의 면역 반응성을 나타내었다. 이것은 단일의 에피토프가 상이한 분자량의 단백질에서 인지됨을 나타내며, 규칙적으로 반복되는 구조를 암시한다. S1 항혈청에 의해 인지된 단백질은 펩신 및 트립신 분해에 민감한 반면, S23 항혈청에 의해 인지된 단백질은 펩신에는 민감하나 트립신에는 민감하지 않았다.이 실험은 B군 연쇄상구균으로부터 부분정제되고 B군 연쇄상구균 클로닝된 유전자로부터 발현된 상기 단백질이 B군 연쇄상구균의 C 단백질의 알파 및 베타 항원을 의미함을 보여준다.
전술한 35개의 잠재적인 C 단백질 클론을 유전학적으로 및 면역학적으로 평가하여 존재하는 유전자수를 측정할 수 있다. 또한, 이들 클론의 분리를 통해 B군 연쇄상구균 감염에 대해 보호성 면역을 부여하는 유전자를 동정할 수 있다. 초기 클론을 얻는데 사용된 보호성 항혈청 역시 C 단백질 이외의 단백질을 검출한 것 같다. 본 발명은 연쇄상구균 B 감염에 대한 치료에서 이러한 다른 단백질의 사용을 고려한다. 본 발명의 주요 목표가 면역에 관계된 단백질의 분리 및 동정이기 때문에, 이들 클론에 의해 발현된 단백질에 대해 제조된 항혈청을 마우스 보호 모텔에서 연구할 수 있다. 보호성인 단백질을 발현하는 유전자들은 접합 백신으로 바람직한 단백질이다.
상기 논급한 바와 같이, 보호성 항혈청을 사용하여 이.콜리/pUX12 벡터 라이브러리에서 B군 연쇄상구균 염색체 DNA를 초기 스크리닝한 결과 35개의 독립적으로 분리된 클론을 얻었다. 클로닝된 단편의 제한 엔도뉴클레아제 지도로부터 나온 데이타 및 클론들로부터 얻은 단백질 추출물의 웨스턴 블롯으로부터 나온 데이타를 결합시킴으로써, 35개 클론중 24개를 6개 상이한 단백질 항원 패턴(표2)으로 임시로 분류할 수 있었다. 이 연구를 통해 분리된 유전자의 잠재적 숫자를 결정하였다.
그러한 클론들의 특성을 더 자세히 분석하기 위해서는, 콜로니 블롯을 사용하여 어느 클론들이 공통의 DNA 서열을 갖는지를 측정하는 것이 바람직하다. 그러한 블롯의 경우, 클론들 각각의 단일 콜로니는 LB 브로쓰를 함유하는 미량역가 접시의 웰에 놓고 37℃에서 하루함 동안 성장시킨다. 대조군 콜로니는 숙주 이.콜리 균주, 및 pUX12 함유 이.콜리 균주를 포함한다. 하루밤 배양물을 동일한 배양 배지를 함유하는 아가 평판상의 니트로셀룰로즈 필터상으로 옮겼다. 이들 평판을 37℃에서 8시간에 걸쳐 성장시키고, 새로이 성장한 콜로니를 함유하는 니트로셀룰로스 필터를 제조하여 DNA-DNA 하이브리드화에 의해 스크리닝하였다. 프로브는 pUX12 라이브러리내 B군 연쇄상구균 DNA 삽입체로부터 제조된다. 미니-프렙을 사용하여 클론들로부터 플라즈미드 DNA를 수득하였다. pUX12 내 폴리링커는 삽입체의 어느 한쪽에BamHI 및BstXI 부위를 모두 가지므로, B군 연쇄상구균 삽입체는BamHI 또는BstXI을 사용하여 플라즈미드로부터 절개된다. 운좋게도, B군 연쇄상구균의 염색체 DNA는BamHI 부위를 거의 갖지 않으며, 삽입체의 다수는BamHI으로 처리한 결과 하나의 단편으로 벡터로부터 제거된다. 저융점의 아가로즈를 사용하여 삽입체로부터 플라즈미드 벡터를 분리한다. 삽입체는 아가로즈 겔로부터 절단되며, 무작위 프라임(prime) 표지법으로 직접 표지한다. 그 후 표지된 삽입체를 콜로니 블롯의 프로브로 사용하였다. 이렇게 하여 DNA 서열이 공통되는 클론들이 동정된다.
따라서, 상기 콜로니 블롯에서 얻은 정보를 근거로, 35개 클론을 DNA 서열이 공통인 군으로 분류하였다. 이들 군을 다중 제한 엔도뉴클레아제로 지도를 작성하여 DNA의 그 영역에서 각 클론과 다른 클론의 관계를 결정하였다. 숙주 플라즈미드 pUX12는 폴리링커에만 존재하는 다수의 유일한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하기 때문에, 삽입체들을 분리하여 정제할 필요없이 플라즈미드 미니-프렙을 이용하여 다수의 제한 지도를 작성할 수 있다. 콜로니 블롯 데이타를 상세한 제한 지도와 연관시켜, 관련된 유전자좌의 수를 합리적으로 산정할 수 있다. 클론의 일부군이 관심있는 유전자를 완전한 형태로 나타내지 않으면, 상기 클론을 사용하여 염색체 라이브러리로부터 보다 완전한 다른 유전자 사본을 분리할 필요가 있다. 그러나, 분리된 초기의 35개 클론의 평균 크기 분포가 크다면, 일부는 완전한 개방형 해독틀을 나타낼 수 있는 것 같다.
유전자 분석을 진행하기 전에, 클로닝된 유전자 생성물에 대한 항혈청을 만들어 마우스 보호 모델에 이용함으로써 이들 항혈청이 B군 연쇄상구균에 의한 감염에 대해 보호하는 능력을 측정하는 것이 바람직하다[참조: Lancefield, R. C. 등, J. Exp. Med. 142 : 165-179 (1979), Valtonen. M. V. 등, Microb. Path. 1 : 191-204 (1986)].
발현된 단백질이 보호성 항체를 유도할 수 있는 클론이 접합 백신에 사용하기에 바람직한 후보이다. 발현된 단백질이 보호성 항체를 유도하지 못하는 클론을 더 분석하여 그들이 백신으로 적합한지를 결정할 수 있다. C 단백질은 세포막에 연계되어 있으므로, 클론에 의해 발현된 단백질이 보호성 항체를 유도하지 못한다는 것은 그 단백질이 이.콜리, 및 고사본수의 벡터에서 안전하지 못하다는 사실을 반영한다. 이 문제는 A군 및 B군 연쇄상구균 모두에서 다른 막 단백질을 클로닝할 때도 발생하였다[참조: Kehoe, M. 등, Infect. and Immun. 43 : 804-810 (1984), Schneewind, O. 등, Infect. and Immun. 56 : 2174-2179 (1988)]. 예비 연구에서 분리된 35개 클론중 몇개는 소형의 콜로니 형상을 나타낸다. 또한, 이들 클론중 일부는 불안정하며, pUX12 폴리링커로부터 B군 연쇄상구균 DNA 삽입체의 일부를 결실하고 있는 것으로 확인되었다. 상기 클론들을 안정화시키는데 사용될 수 있는 몇가지 기술이 있는데, 예를들면 저사본수의 벡터내로 또는 하류-조절(down-regulated)될 수 있는 프로모터 뒤에 클로닝하는 방법, 클론을 37℃ 대신에 30℃에서 성장시키는 방법, 막 단백질을 축적시키기에 적합한 벡터내로 클로닝하는 방법이 있다. 또한 플라즈미드를 이.콜리 숙주pcnB 내로 형질전환시킬 수 있는데, 이 숙주는 pUX12와 같은 pBR322 유래 플라즈미드의 사본수를 제한한다[참조: Lopilato J. 등, Mol. Gen. Genet. 205 : 285-290 (1986), 상기 문헌을 본 명세서에 참고로 인용하였다].
어떤 클론이 보호성 항체를 유도하는 단백질을 발현시키지 못한다는 사실은 발현된 단백질이 보호에 중요한 에피토프가 결핍되어 있다는 것을 암시한다. 이 사실은 전체 유전자가 클로닝되지 않거나 또는 이.콜리에서 발현될 수 없는 경우에 적용된다. 이것은 이.콜리내 클로닝된 C 단백질 유전자의 경우가 아니라 B군 연쇄상구균중 C 단백질의 전사후 프로세싱의 경우에 문제가 있을 수도 있다. 완전한 유전자로부터 서브클로닝하고/하거나 그 유전자를 그것이 발현될 수 있도록 교대로 사용할 숙주내로 옮길 필요가 있을 수 있다.
또한, 어떤 클론이 보호성 항체를 유도하는 단백질을 발현시키지 못한다는 것은 에스케리치아 콜리에서 생성된 항원으로부터 유도된 항체가 B군 연쇄상구균상의 천연 C 단백질에 의해 동물로부터 유도된 것과 다를 수도 있음을 암시한다. 또한, 토끼의 면역화에 사용된 용균된 박테리아 추출물은 다수의 이.콜리 단백질 항원을 함유한다. 그러므로, 전체 유기체로부터 얻는 대신에 부분적으로 정제된 유전자 생성물로부터 동물 모델에서의 시험용 항혈청을 얻어야할 필요가 있을 수 있다.
보호성 항체를 유도할 수 있는 임의의 클로닝된 B군 연쇄상구균 단백질은 C 단백질로 부를 수 있다. 이 실험군용으로 제조된 항혈청은 또한 이들 단백질의 위치 탐지에 사용할 수 있다.
실시예 8
C 단백질 유전자의 지도 작성, 특성 분석 및 서열분석
C 단백질 유전자의 특성을 더 자세히 분석하기 위해서는, 전술한 C 단백질 유전자 클론의 미세 구조 유전자 지도를 작성할 수 있으며, 그 DNA 서열(들)을 결정할 수 있다. 상기 지도 작성은 게놈의 서던 블롯을 이용하여 수행하는 것이 바람직하다. C 단백질 유전자의 DNA 서열을 결정함으로써, 그 리보좀 결합 부위, 잠재성 프로모터, 시그날 서열 및 임의의 특이한 반복 서열을 포함하는 유전자 구조를 결정할 수 있다. DNA 서열을 알려진 DNA 서열의 라이브러리와 비교하여 특성 분석된 다른 유전자와 상동성이 있는지를 알아보는 것이 바람직하다. 또한, C 단백질의 단백질 서열은 그 유전자의 DNA 서열로부터 결정할 수 있다. 자주 그 단백질 서열을 분석함으로써 단백질의 구조, 기능 및 세포내 위치를 예측할 수 있다.
따라서, 임의의 유전자가 연관되어 있는지를 측정하는데는 게놈의 서던 블롯을 사용하는 것이 바람직하다. 이 기술의 경우, 6개 이상의 염기쌍을 포함하는 서열을 동정하는 몇가지 상이한 제한 엔도뉴클레아제로 각각 B군 연쇄상구균 염색체 DNA를 처리한다. 하나 이상의 유전자를 보유할 수 있는 염색체 DNA의 보다 큰 단편을 얻는 것이 목적이다. 그 후 각각의 엔도뉴클레아제 처리물을 아가로즈 겔 상에서 전개시키고, 니트로셀룰로스 상에 옮겼다. 그 후 전술한 라이브러리에서 유래한 표지된 삽입체를 프로브로 사용하여 서던 블롯하였다. 콜로니 블롯 또는 엔도뉴클레아제 지도 작성과 관련되지 않은 것으로 나타난 두 클론이 유사한 염색체 밴드에 결합할 경우, 이것은 그들이 동일한 유전자의 일부이거나, 아니면 염색체상에 가까이 연관된 두 유전자임을 암시한다. 어느 경우에도, 추가 연구를 위해 이들 큰 유전자 분절을 클로닝하는 방법이 몇가지 있다. 한 가지 수단은 B군 연쇄상구균의 코스미드 라이브러리를 제조하고, 관심있는 프로브들 중의 하나와의 하이브리드화에 대해 스크리닝하는 것이다. 2개 이상의 관심있는 유전자를 함유하는 클론을 얻은 경우, 그것을 엔도뉴클레아제에 의해 지도 작성하고, 전술한 클론들에 대해 기술한 보호성 항원의 발현에 대해 연구할 수 있다.
전술한 클론을 동정하여 그 DNA 서열을 결정할 수 있다. 클론이 pUX12 플라즈미드상에 있으면, 역전사 효소를 사용한 2본쇄 DNA 서열 분석법을 사용하여 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머들로부터 폴리링커까지의 서열을 분석할 수 있다. 이 기술은 pUX12 플라즈미드의 특성 분석에 이미 사용되었으며, 600개 염기쌍 이상의 유전자를 서열 분석하기 위한 다수의 추가 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열을 분석하는 신속한 방법이다. 그러므로, C 단백질 유전자의 DNA 서열 분석은 M13 1본쇄 DNA 서열 분석 시스템내로 서브클로닝하여 수행하는 것이 바람직하다[참조: Ausubel, F. M. 등, Current Topics in Molecular Biology (1987)].
C 단백질의 DNA 서열의 규명은 유전자와 그 유전자 생성물의 구조, 기능 및조절과 관련한 실질적인 정보를 제공한다. 상기 논의한 바와 같이, 많은 연구자에 의해 분리된 C 단백질의 크기에 있어서의 이질성, 및 그들의 외관상 항원 다양성은 유전자 패밀리, 또는 C 단백질 유전자의 단백질 생성물을 변형시키는 전사후 변형 메카니즘의 가능성을 암시한다[참조: Ferrieri, P. 등, Infect. Imrnun. 27 : 1023-1032 (1980)]. A군 연쇄상구균의 M 단백질을 이 현상의 실례로서 논의하였다[참조: Scott, J. S. 등., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 82 : 1822-1826 (1985)]. M 단백질의 DNA 서열은 하이브리드화에 의해 B군 연쇄상구균 염색체 DNA와의 상동성을 나타내지 않지만, 그 DNA 서열들 사이에 구조적 상동성이 있을 수 있다[참조: Hollingshead, S. K. 등, J. Biol. Chem. 261 : 1677-1686 (1986), Scott, J. S. 등. Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 82 : 1822-1826 (1985), Scott. J. S. 등, Infect. and Immun. 52 : 609-612 (1986)]. C 단백질의 DNA 서열을, 알고 있는 DNA 서열의 라이브러리와 비교하는 것이 바람직하다. 또한, DNA 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 공지된 아미노산 서열과 비교한다.
실시예 9
C 단백질 유전자의 보편성
C 단백질 유전자의 보편성을 측정하기 위해, C 단백질 유전자를 프로브로 사용하여 B군 연쇄상구균의 다양한 혈청형의 임상 및 실험실 분리체로부터의 염색체 DNA를 게놈성 서던 블롯하였다. 또한, 침전 기술로 측정한 표현형 발현을 DNA-DNA 하이브리드화에 의해 나타나는 유전자 조성과 비교하여 C 단백질 유전자의 발현 조절과 관련한 정보를 제공한다. C 단백질 유전자를 프로브로 사용하여, 연쇄상구균의 다른 유형 및 다른 박테리아 병원체로부터의 염색체 DNA를 스크리닝하였다.
랜스필드[참조: Lancefield, R. C. 등, J. Exp. Med. 142 : 165-179 (1975)]에 의해 사용된 본래의 분류형 균주의 대부분을 포함하는 B군 연쇄상구균 분리체의 C 단백질 유전자로부터 프로브를 제조하고 표지화하였다. 전술한 미랑역가 기술을 사용하여 B군 연쇄상구균의 24개 임상 및 실험실 분리체의 콜로니 블롯을 스크리닝하였다. 그 후 다양한 균주가 C 단백질 유전자에 하이브리드화하는 능력을 이들 유기체가 C 단백질에 대해 형성된 분류형 항혈청에 결합하는 표현형적 특성과 비교하였다. 이 방법으로, 어느 균주가 C 단백질 유전자의 일부 또는 전부를 보유하는지 여부, 및 일부 균주가 상기 유전자의 침묵성 Tn916으로 돌연변이를 유발시킨 후, 트랜스포존의 단하나의 사본만이 돌연변이체 균주에 의해 보유되고, C 단백질 유전자내에 트랜스포존이 위치한다는 것을 나타낼 필요가 있다.
B군 연쇄상구균에서 C 단백질 유전자를 결실시키는 상기 기술의 이용은 C 단백질 유전자가 B군 연쇄장구군의 생존에 필수적이지 않은 한 간단한 일이다. 그러나, B군 연쇄상구균의 균주는 검출할 수 있는 C 단백질이 결핍되어 있다고 개시되어 있으며, 박테리아 독성 결정인자가 생체외 생존에 필수 유전자라는 것이 특이하다. 탐구될 Tn916의 추가적 사용 분야는 C 단백질 유전자의 잠재적 조절 요소의 동정이다.
특이적으로 한정된 돌연변이를 요망하는 경우 또는 C 단백질 유전자가 B군 연쇄상구균의 생존에 필수적인 경우, 지정부위 돌연변이 유발 기술을 이용할 수 있다(예를들면, 조건 돌연변이체를 생산하도록), 따라서 지정부위 돌연변이 유발을 B군 연쇄상구균 단백질의 유전자 분석에 사용할 수 있다. B군 연쇄상구균에 대한 상기 기술의 개발을 지연시켰던 한가지 문제점은 B군 연쇄상구균을 형질전환시키는데 있어서 발생되는 난점이다. 달리는 형질전환시키기가 어려운 박테리아 속으로 DNA를 도입시키는데 전기천공법(electroporation)이 유용할 것으로 입증되었다[참조: Shigekawa, K. 등, BioTech. 6 : 742-751 (1988), 이 문헌을 본 명세서에 참고로 인용함]. 전기천공법을 이용한 B군 연쇄상구균을 형질전환시키는 조건을 이용하여 상기 문제점을 극복할 수 있다. 따라서 지정부위 돌연변이를 유발시킬 수 있고, 상보관계를 평가할 수 있으며, C 단백질을 발현시키지 못하는 B군 연쇄상구균 균주속으로 C 단백질 유전자를 도입시킬 수 있다. 여러가지 방법중 하나를 이용하여 천연 또는 돌연변이된 C 단백질 유전자를 B군 연쇄상구균 균주속으로 삽입시킬 수 있다. 예를 들면, 약제 내성 마커를 pUX12내 C 단백질 유전자 클론내에 삽입시킬 수 있다. B군 연쇄상구균에서 발현될 수 있으나, 정상적으로는 존재하지 않는 약제 내성 마커가 바람직하다. 이 변형된 pUX12 단백질 클론을 전기천공법을 사용하여 B군 연쇄상구균 내로 형질전환시켰다 [Shiekawa, K. 등, BioTech 6 : 742-751 (1988), 이 문헌을 본 명세서에 참고로 인용함]. pUX12 플라즈미드는 B군 연쇄상구균에서 복제할 수 없기 때문에, 약제 내성 표현형을 획득한 그들 균주는 숙주 GB 염색체상의 C 단백질 유전자와 pUX12 플라즈미드상에 보유된 돌연변이된 C 단백질 유전자 사이에 상동성 재조합에 의해 상기 표현형을 획득한다. 이 돌연변이체는 전술한 대로 스크리닝하였다. 수용균주에 상동 서열이 없으면, 공지된 연쇄상구균 유전자내에, 즉 B군 연쇄상구균 유래의 천연 약제 내성 마커 유전자내에 삽입된 C 단백질 유전자를가진 벡터를 제작할 수 있다. 전기천공시킨 후, 이러한 플라즈미드 구성체는 상동 재조합을 통해 염색체내로 통합된다.
대안으로, 변형된 C 단백질 유전자는 그 유전자를 자가-접합성 트랜스포존 Tn916 속으로 삽입하고, 연쇄상구균 피칼리스로부터 교배를 통해 변형된 트랜스포존을 도입시킴으로써 B군 연쇄상구균 염색체내로 도입할 수 있다. 이 기술을 사용하여 에리트로마이신 유전자를 가진 Tn916을 성공적으로 변형시키고, 이 유전자를 B군 연쇄상구균의 염색체내로 삽입시켰다[참조: Rubens, C. E. 등, Plasmid 20 : 137-142 (1988)]. Tn916을 사용하여 돌연변이시킨 후, 트랜스포존의 단 하나의 사본만이 그 돌연변이체 균주에 보유되며 트랜스포존이 C 단백질 유전자내에 위치한다는 것을 나타낼 필요가 있다.
실시예 11
B군 연쇄상구균의 독성에 대한 C 단백질의 역할의 평가
C 단백질을 보유하는 B군 연쇄상구균 균주와 그것을 보유하지 않는 균주를 비교한 종래의 연구는 동질 유전자형인 것으로 알려지지 않은 분리체와 관련된 것이다[참조: Ferrieri, P. 등, Rev. Inf. Dis. 10(2) : 1004-1071(1988)]. 그러므로, 관찰된 독성에서의 차이가 C 단백질과 관련되는지 또는 몇가지 다른 독성 결정인자와 관련되는지를 측정할 수가 없다. 완전한 C 단백질 유전자 또는 C 단백질 유전자 결실을 갖는 동질 유전자형의 균주를 제작함으로써 독성에 있어 C 단백질의 역할을 특성 분석할 수 있다. 이 균주는 독성에 대해서는 신생 쥐 모델에서 그리고 그 면역학적 성질에 대해서는 마우스 보호 모델에서 시험하는 것이 바람직하다. 독성의 두 번째 중요한 시험은 돌연변이 균주에서 대립 유전자 치환의 역전을 통해 유전자가 독성을 회복하는 능력이다. C 단백질 유전자를 그 유전자를 보유하지 않는 B군 연쇄상구균 균주 또는 불활성화된 C 단백질 유전자를 보유하는 B군 연쇄상구균 균주 속으로 삽입시킴으로써, 상기 동물 모델에서 생성된 구성체의 독성을 검사하여 C 단백질의 영향을 측정할 수 있다.
C 단백질 유전자가 개별적으로 돌연변이된 B군 연쇄상구균의 동질 유전자형 균주들은 트랜스포존 돌연변이 유발 또는 지정부위 돌연변이 유발 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 그러한 균주는 게놈의 서던 블롯상에서 특성 분석하여 염색체상에 단 하나의 삽입이 존재하는지를 측정하는 것이 바람직하다. 전술한 미세 구조 유전자 지도 작성 기술을 사용하여 상기 삽입의 위치를 확인할 수 있다. 그 후 동질 유전자형 균주는 신생 쥐 모델에서 독성에 대해 시험하였다[참조: Zeligs, B.J. 등, Infec. and Immun. 37. 255-263(1982)].
트랜스포존 돌연변이 유발을 통해 C 단백질의 발현을 조절하는데 관계하는 유전자를 동정할 수 있다. 예를 들면, 야생형 C 단백질을 보유하되 트랜스포존 돌연변이 유발 이후 더 이상 C 단백질을 발현시키지 않는 것으로 확인되고 트랜스포존이 C 단백질 구조 유전자내에 위치하지 않는 균주는 C 단백질 유전자의 발현의 조절에 관계된 서열에 돌연 변이를 보유한다. 이 방법은 M 단백질의 조절에 관계되는 A군 연쇄상구균의mry좌를 특성 분석하는데 성공적으로 사용되었다[참조: Caparon, M. G. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 84:8677-8681(1987), Robbins, J. C. 등, J. Bacteriol. 169:5633-5640(1987), 이 문헌들을 본 명세서에 참고로인용함]. 상기 방법은 또한 C 단백질을 과다 발현시키거나 변형된 독성 또는 면역성의 C 단백질을 생성시키는 균주를 생산하는데 사용될 수 있다.
실시예 12
B군 연쇄상구균상의 C 단백질의 위치결정 및 이 단백질이 면역글로불린에 결합하는 능력의 평가
랜스필드등은 C 단백질에 대한 항체가 B군 연쇄상구균의 외막에 결합함을 보여주었다[참조: Lancefield, R. C. 등, J. Exp. Med. 142:165-179(1975), Wagner, B. 등, J. Gen. Microbiol. 118:95-105(1980)]. 이 사실은 C 단백질이 외막 단백질임을 암시한다. C 단백질은 또한 B군 연쇄상구균 배양물의 상청액으로부터 분리할 수도 있는데, 이 사실은 이들 단백질이 B군 연쇄상구균에 의해 분비되거나 또는 세포 표면으로부터 고비율로 상실될 수 있음을 암시하는 것이다. C 단백질 유전자로부터 유래한 DNA 및 단백질 서열은 C 단백질의 구조 및 기능을 결정하는데에 유용하다. C 단백질에 대해 통상 기술되는 하나의 잠재적인 독성은 면역글로불린 IgA에 결합하는 능력이다[참조: Ferrieri, P. 등, Rev. Inf. Dis. 10(2): 1004-1071(1988), Russell-Jones, G. J. 등, J. Exp. Med. 160:1467-1475(1984)].
면역-전자 현미경 분석법을 이용하여 특이 항체에 의해 검출되는 세포 표면 결정인자의 위치결정을 하였다. B군 연쇄상구균의 C 단백질 클론에 대해 형성된 항혈청을 C 단백질을 보유하는 B군 연쇄상구균 균주와 함께 항온 처리하였다. 페리틴-접합된 염소의 항-토끼 IgC를 사용하여 전술한 바와 같이 세포 표면에서 항원을 검출하였다[참조: Rubens, C. E. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 84:7208-7212(1987), Wagner B. 등, J. Gen. Microbiol. 118:95-105 (1980)].
C 단백질이 면역글로불린에 결합하는 능력의 간단한 측정은 웨스턴 블롯을 사용하여 이루어질 수 있다. C 단백질 유전자를 포함하는 이. 콜리 클론, 및 C 단백질을 보유하는 B군 연쇄상구균 균주의 세포 추출물을 SDS-PAGE상에서 전개시키고, 니트로겔룰로스상에서 블로팅할 수 있다. 대조군은 야생형 pUX12 플라스미드를 보유하는 이.콜리, C 단백질 유전자를 보유하지 않는 B군 연쇄상구균 균주, 및 C 단백질 유전자가 불활성화된 동질 유전자형의 B군 연쇄상구균의 추출물을 포함한다. 웨스턴 블롯을 개별적으로 표지된 면역글로불린, 예를들면 IgG, IgM, IgA 및 이들의 구성요소(예 : Fc 또는 F(ab)2단편)로 프로브 처리하였다 [참조: Heath, D.C.등, Infect. and Immun. 55:1233-1238(1987), Russell-Jones, C. J. 등, J. Exp. Med. 160: 1467-1475(1984)]. 면역 글로불린은 요오도젠 또는 클로르아민 T를 사용하여 요오드화하는 것이 바람직하다.
C 단백질이 면역글로불린 및 그 구성 요소에 결합하는 능력을 측정하는 보다 특이적인 방법은 C 단백질을 정제하고, 그들을 결합 분석에 직접 사용하는 것을 포함한다[참조: Fahnestock, S. R. 등, J. Bact. 167(3): 870-880(1986), Heath, D. G. 등, Infect. and Immun. 55:1233-1238(1987)]. 이 단백질 서열을 이용하여, C 단백질을 정제할 수 있다. 또한, 이. 콜리에서 C 단백질 유전자를 발현시킬 수 있으므로, C 단백질을 대량 생산하는 균주를 제조할 수 있고 따라서 정제를 위해 보다 다량의 C 단백질을 얻을 수 있다.
실시예 13
접합 백신에 B군 연쇄상구균의 클로닝된 C 단백질 항원을 사용하는 방법
접합 백신내에서 효력이 있는지 여부에 대해 B군 연쇄상구균의 상기 보호성 C 단백질 항원을 시험하였다. 이 효력을 평가하기 위해, pJMS1 또는 pJMS23을 함유하는 이. 콜리의 세포 추출물을 상기와 같이 제조하고, 토끼의 면역화에 사용하였다. 생성된 항혈청은 마우스 치사 모델에서 그것이 B군 연쇄상구균 균주 H36B 에 의한 감염으로부터 마우스를 보호하는 능력에 대해 시험하였다. 균주 H36B는 B군 연쇄상구균의 C 단백질을 보유한다. 대조군으로서, 연쇄상구균 균주 515(C 단백질을 보유하지 않음)에 의한 감염으로부터 마우스를 보호하는 능력을 측정하였다. 이 실험의 결과를 제4도에 도시하였다.
실시예 14
C 단백질 알파 항원 서열 및 그 반복 단위
상기한 바와 같이, 연쇄상구균 아갈락틴[Streptococcus agalactine: B군 연쇄상구균(GBS)]은 신생아 패혈증 및 수막염, 분만후 자궁내막염, 및 성인의 감염, 특히 당뇨병 및 면역타협 숙주에서 중요한 병원체이다[참조: Baker, C. J. 등, Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant, Remington, J. S. 등, 필라델피아 손더스, (1990), 742-811면]. 잘-연구된 GBS 독성 결정 인자는 병원론에 필수적인 유형-특이적 피막 다당류이다[참조: Rubens, C. E. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 84:7208-7212(1987); Wessels, M.R. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 86:8983-8987(1989)]. 감염에서 GBS 표면 단백질의 역할은 다소 덜 이해되어있다[참조: Ferrieri, P. Rev, Infect, Dis, S363-S366(1988); Michel. J. L. 등, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, Dunny, G. M. 등, 편집 Am. Soc. Microbiol., 워싱턴, 214-218면]. C 단백질은 피막형의 대부분의 임상 분리체에 의해 발현된 표면-관련 항원이다. Ia, Ib 및 II는 독성 및 면역화에서 역할을 하는 것으로 생각된다[참조: Johnson. D.R. 등, J. Clin. Microbiol. 19:506-510(1984); Madoff, L. C. 등, Infect. Immun. 59: 2638-2644 (1991)]. 두개의 C 단백질 항원, 즉 α 및 β는 생화학적으로 및 면역학적으로 개시되어 있다[참조: Michel, J. L. 등, Cenetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci, Dunny, G. M. 등 편집, Am. Soc. Microbiol., 워싱턴(1991). 214-218면].
1975년에 랜스필드등[참조: Lancefield. R. C. 등, J. Exp. Med. 142:165-179(1975)]은 토끼에서 C 단백질에 대해 형성된 항체가 C 단백질을 보유하는 GBS의 공격으로부터 마우스를 보호하였음을 보여주었다. GBS의 옵소닌 사멸을 유도하고 GBS에 의한 치사성 공격으로부터 마우스를 보호하는 알파 항원(4G8)에 대한 단일 클론 항체가 개시되어 있다[참조: Madoff, L. C. 등, Infect. Immun, 59:204-210(1991), 이 문헌을 본 명세서에 참고로 인용하였다.]. 상기에 나타낸 바와 같이, α및 β항원을 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 에스케리치아 콜리에서 발현시켰다. α및 β클론 모두에 대해 형성된 항체들은 특이적 보호성 에피토프를 규명하는 상이한 C 단백질을 암호화한다는 것이 나타나 있다[참조: Michel, J. L. 등, Infect. Immun. 59:2023-2028(1991)]. α및 β항원은 독립적으로 발현되고 항원적으로 구별되는 단백질이다.
인간 혈청 IgA에 특이적으로 결합하는 C 단백질 β항원은 클로닝되었고 [Michel, J. L. 등, Infect. Immun. 59:2023-2028(1991); Cleat, P. H. 등, Infect. Immun. 55:1151-1155(1987)], 서열 분석되었다[Heden, L. O. 등, Eur. J. Immunol. 21:1481-1490(1991): Jerlstrom, P. G. 등, Mol. Microbiol, 5:843-849(1991)]. 그러나, 독성에 대한 β항원 및 IgA 결합의 역할은 알려져 있지 않다. 페리에리등[참조: Payne, N. R. 등, J. Infect. Dis. 151: 672-681(1985); Payne, N. R. 등, Infect. Immun. 55:1243-1251(1987)]에 의한 연구는 GBS의 C 단백질-보유 균주가 식작용에 내성을 가지며 세포내 사멸을 억제하는 것을 보여 주었다. α항원-특이적 단일 클론 항체(4G8)의 존재하에서의 옵소닌에 의한 사멸은 α항원의 분자 질량의 증가, 및 박테리아 세포 표면상에서 발현되는 α항원의 양과 직접적으로 상관 관계가 있었다[참조: Modoff, L. C. 등, Infect. Immun. 59:2638-2644(1991)]. α항원을 발현시키는 GBS 균주는 특이 항체의 부재시에 다형핵 백혈구에 의한 사멸에 내성이 있었으나; 이 내성은 α항원의 크기에 의존하는 것은 아니었다.
본원에 보고된bca및 인접 영역의 완성된 뉴클레오티드 서열은 α항원 유전자의 크기, 구조 및 조성에 관한 정보를 제공한다. α항원의 천연 및 클로닝된 유전자 생성물의 흥미로운 특징은 이들이 약 8000 Da 만큼 상이한 규칙적 반복성 래더(ladder)의 단백질들을 발현시킴으로써 단백질 이질성을 나타낸다는 것이다[Madoff, L. C. 등, Infect. Immun. 59:2638-2644(1991); Michel, J. L. 등,Infect, Immun. 59: 2023-2028(1991)]. 보호성 단일 클론 항체 4G8이 상기 반복 영역에 결합하기 때문에, 이 영역은 보호성 에피토프를 규명한다[참조: Madoff, L.C.,Infect. Immun. 59:2023-2028(1991)]. 면역우성 에피토프를 암호화하는 보다 작은 직렬 반복 서열이 다수의 병원체에서 보고되었으나, α항원에서 나타나는 단백질 이질성과는 관련되지 않았다[참조:Enes, V. 등, Science 225 : 628-630(1984) : Fischetti. V. A. 등, Rev. Infect. Dis. 10(Supp.2) : S356-S359(1988) : Pereira, M.E. 등, J.Exp. Med. 174:179-191(1991) ; Fischetti. V.A.등. Genetics and Moleculan Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci, Dunny등 편집. Am. Soc. Microbiol,, 워싱턴(1991), 290-294면 ; Dailey, D.C.등, Infect. Immun. 59:2083-2088(1991) : vonEichel-Streiber, C. 등, Gene 96: 107-113(1990)]. α항원의 최대 분자 크기가 GBS 균주 사이에서 상이하지만, 이 단백질 이질성은 일정한 특성이다[참조:Madoff, L.C.등,Infect. Immun. 59:2638-2644(1991)].
bca의 뉴클레오티드 서열은 9개의 동일한 246-뉴클레오티드 직렬 반복 단 위체를 포함한다. 이들 반복 단위체 각각이 암호화하는 펩티드의 산정된 크기는 8665 Da이며, 알파 항원의 이질성 래더화(laddering)에서 발견되는 간격과 상관관계가 있다. DNA 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 상당한 상동성과, 알파 항원과 기타 연쇄상구균 단백질 사이의 중요한 차이를 모두 나타내었다[참조: Heden, L. -O. 등, Eur. J. Immunol. 21:1481-1490(1991) ; Jerlstrom, P.G. 등, Mol. Microbiol 5:843-849(1991) ; Fichetti, V.A. 등, Genetics and Molecular Biology ofStreptococci, Lactococci, and Enterococci, Dunny 등 편집. Am. Soc. Microbiol. 워싱턴(1991) 290-294면)]. α항원의 반복 단위체는 표현형 및 유전자형 변이의 가능한 메카니즘을 제시하며, 항원 다양성을 생성시킬 수 있는 유전자 재배치의 천연 부위를 제공한다.
재료 및 방법
박테리아 균주. 플라스미드, 트랜스포존 및 배지
GBS균주 A909(1a/Cα,β형)[참조:Lancefield, R.C. 등, J. Exp. Med. 142:165-179 (1975)], 이. 콜리 균주 MC 1061 및 DK 1[참조:Ausubel, F.M. 등, Current Protocols in Molecular Biology, 뉴욕 와일리(1990)], pCNB[참조:Lopilato, J. 등, Mol. Gen. Genet. 205:285-290(1986)], DH5α(DH1의 유도체 : GIBCO/ BRL) 및 NK-8032 ; 이. 콜리 플라스미드 및 클론 pUC12, pUX12 및 pJMS23 ; 트랜스포존 Tn5seq1은 개시되어 있다[참조: Michel, J.L. 등, Infect. Immun. 59:2023-2028 (1991)]. 플라스미드 pGEM-7Zf(-)는 미국 위스콘신 매디슨 소재의 프로메가에서 구입하였다. pJMS23의 추가 서브클론들(pJMS23-1, -7, -9 및 -10)을 하기에 기술한다. GBS 및 이. 콜리용 성장 배지 및 선별용 항생물질이 개시되어 있다[참조:Michel, J.L. 등, Infect. Immun. 59:2023-2028 (1991).
DNA 처리 절차 및 뉴클레오티드 서열 분석 계획
플라스미드 DNA의 제조, 올리고뉴클레오티드의 합성 및 정제, 제한 엔도뉴클레아제 지도 작성, 아가로즈겔 전기 영동 및 서던 블롯 하이브리드화를 위한 표준절차는 오슈벨 등의 문헌[Ausubel, F.M. 등, Current Protocols in Molecular Biology, 뉴욕 와일리(1990)]에 개시되어 있다. 제한 엔도뉴클레아제 및 DNA 조작을 위한 기타 효소(예: DNase, RNase 및 리가제)는 뉴 잉글랜드 바이오랩 및 베링거 만하임에서 입수하였다. 트랜스포존 돌연변이 유발에는 람다 Tn5seq1을 이용하였다[참조: Nag. D.K. 등, Gene 64:135-145(1988)].
2본쇄 DNA의 뉴클레오티드 서열 분석은 양방향 서열 분석을 위해 Sp6 또는 T7 프로모터를 프라이머로 사용하는 트랜스포존 Tn5seq1 삽입체들, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 이레이즈-어-베이스[참조: 미국 위스콘신 매디슨 소재의 프로메가]를 사용한 중복된 결실들(nested deletions)을 포함하는 플라즈미드를 사용하였다. 총 12 개 프라이머를 제조하여 반복 영역에 인접한 유전자 영역에 대해 양 방향의 서열을 수득하였다. 반복 DNA 영역의 서열 분석은 엑소뉴클레아제 III에 의해 생성된 중복된 결실들에 의해 완결되었다. 모든 서열 분석은 2본쇄 서열 분석용으로 제조자의 지시에 따라 사용되는 시쿼나제 키트 버젼 2(유나이티드 스테이츠 바이오케미컬)를 이용하였다. 아데노신 5'-[α-[35S]티오]트리포스페이트를 아머샴으로부터 입수하였다. 앰플리태크(AmpliTaq) 폴리머라제를 구비한 젠앰프(GenAmp) PCR 키트는 제조자의 지시(퍼킨-엘머/세터스)에 따라 사용하였다.
서브클론 pJMS23-1, pJMS23-7 및 pJMS23-10을bca내 보다 작은 영역을 목표로 하는 트랜스포존 돌연변이 유발용으로 제조하였다[참조:Michel, J.L. 등, Infect. Immun. 59:2023-2028(1991)]. 서브 클론 pJMS23-1은 pUX12 내에 5.9-킬로베이스의HindIII 단편을 포함하고 ; pJMS23-7은 pUC12의 폴리링커내의HindII 부위내로 연결된 pJMS23-1 유래의 2,8-킬로베이스의AluI 단편을 포함하며 ; pJMS23-10은 반복 영역을 포함하는 2.3 킬로베이스의 삽입체를 산출한 pJMS23-7의BsaB1/SmaI 이중 제한 엔도뉴클레아제 처리물이다. 중복된 결실의 경우, pJMS23-1 유래의AluI은 pGEM-7Zf(-) 상의SmaI 부위내로 연결시켜 pJMS23-9를 생성시켰다. 중복된 결실은HindIII 및NsiI 부위로부터 전방으로 그리고EcoRI 및SphI 부위로부터 역방향으로 구성되었다. 서열 분석에 사용된 서브클론, 돌연변이체 및 결실의 크기는 제한 엔도뉴클레아제 지도 작성, 및/또는 pUC12 폴리링커 및 Tn5seq1(Sp6 및 T7)에 대한 프라이머에 대한 PCR로 확인하였다.
데이타 분석은 제네틱스 컴퓨터 그룹(위스콘신 매디슨) 버젼 7 소프트웨어 및 국립 보건원(매릴랜드 베데스다)의 국립 생물공학 센터의 BLAST 네트워크와 함께 매사츄세츠 제너럴 하스피틀(보스톤)의 분자 생물학 컴퓨터부를 이용하였다.
단일 클론 항체, SDS/PAGE 및 웨스턴 면역 블롯
GBS 및 이. 콜리 단백질의 추출, SDS/PAGE, 면역블로팅 및 α항원 단일 클론 항체 4G8에 의한 프로브 처리는 문헌[Madoff, L.C. 등, Infect. Immun. 59: 2638-2644(1991), Madoff, L.C. 등, Infect. Immun.59:204-210(1991) 및 Michel, J.L. 등, Infect. Immun. 59:2023-20238(1991)]에 기술된 대로 실시하였다.
결과
bca의 뉴클레오티드 서열
GBS 균주 A909(Ia/C 형)에서 유래한bca좌를 암호화하고, 이. 콜리에서 α항원을 발현시키는 pJMS23의 서브클론을 사용하여bca의 서열을 결정하였다[참조: Michel, J.L. 등, Infect. Immun. 59:2023-2028(1991)]. 이. 콜리내로 클로닝된 그람-양성 유전자와 마찬가지로, 서브클론중 다수는 불안정하였다 [참조: Schneewind, O. 등, Infect. Immun. 56:2174-2179(1988)]. 이 문제는 상동 재조합을 위한 다수의 고정 부위를 제공하는 넓은 영역의 반복성 DNA에 의해bca에서 해결된다.
이와 같은 상동 재조합을 의도적으로 이용하여 다양한 α항원의 기능적 유도체를 발현시키는 재조합 숙주 군집을 생성시킬 수 있다. 이러한 군집은 α항원과 그들의 기능적 유도체의 혼합물일 것이며, 본 발명의 백신에 이용하여 숙주가 면역 반응을 유도하도록 하는 광범위한 α항원 서열들을 제공할 수 있다.
pJMS23이 결실 없는 완전한 천연 유전자를 암호화한다는 것을 입증하기 위해, A909 유래 게놈 DNA의 서던 블롯을 클론에서 유래한 유전자 단편들로 프로브 처리하였다.bca의 제한 지도에서는 A909와 pJMS 사이에 아무런 차이도 없었다.bca의 완전한 뉴클레오티드 서열은 3 가지 수단, 즉 Tn5seq1에 의한 트랜스포존 돌연변이 유발, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 엑소뉴클레아제 III 의한 중복된 결실을 이용하여 양쪽 가닥에서 독립적으로 수득하였다 (제5도).
단일의 큰 개방형 해독틀로서bca좌의 완전한 뉴클레오티드 서열 및 유도된 아미노산 서열은 제6도에 도시하였다. 구조 유전자는 3063개의 뉴클레오티드로 구성되고, 1020개의 아미노산을 암호화하며, 108,705Da의 계산된 분자 질량을 가진다. 개시 코돈의 상류(-10에)에 원핵 세포 프로모터 공통 서열(TATAAT)이 있다[참조: Doi, R.H. 등, Microbiol, Rev. 50:227-243(1986)]. -10 영역의 상류에 5 내지 19개 염기의 간격으로 가정되는 -35 영역에는 뚜렷한 상동성이 없다[참조: Hawley, D.K. 등, Nucleic Acids Res. 11:2237-2255(1983)].bca의 5' 말단에 인접한 추정의 리보좀 결합 부위는 AGGAGA이다[참조:Shine, J. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 71:1342-1346(1974) ; Gold, L. 등, Annu. Rev. Microbiol. 38:365-403(1981)]. TAA 종결 코돈의 하류에 전사 종결 인자로 기능할 수 있는 다이애드 구조를 가진 2개의 영역이 있다[참조:Brendel, V. 등, Nucleic Acids Res. 12:4411-4127(1984)].
bca의 성숙한 펩티드의 유도된 아미노산 서열은 4.49의 pKa 값이 예상되는데, 이 값은 천연 및 클로닝된 C 단백질 α항원에 대해 실험적으로 측정된 값과 근사하다. α항원은 개시 코돈에 시스테인을 포함하지 않고 하나의 메티오닌만을 포함한다. α항원은 프롤린이 풍부(성숙한 단백질의 11%)하지만, GBS의 C 단백질 β항원에서 확인되는 XPZ 모티프[참조: Heden, L. -O. 등, Eur. J. Immunol. 21:1481-1490(1991); Jerlstrom, P.G. 등, Mol. Microbiol. 5:843-849(1991)] 또는 A군 연쇄상구균의 M 단백질에서 나타나는 프롤린 반복 모티프 [참조:Fischetti, V.A. 등, Mol. Microhiol. 4:1603-1604(1990)]를 나타내지 않는다.
bca의 추론된 신호 서열 및 상동성
세포 표면-연계된 단백질로서, α항원은 세포질로부터 배출될 시그날 서열을 사용할 수 있다. 블라스트(BLAST) 조사에 의해 α항원의 처음 41개 아미노산과 상동성이 있는 5개의 그람-양성 표면 단백질이 동정되었다. 기타 그람-양성 시그날 서열에 나타나는 패턴을 근거로 할 때, α항원의 처음 41개 아미노산은 시그날 서열을 포함하는 것 같다[참조:vonHeijne, G., Eur. J. Biochem. 133:17-21(1983); vonHeijne, G. 등, FEBS Lett. 244:439-446(1989)]. N 말단 근처에는 높은 비율의 아르기닌 및 라이신 잔기가 있고, 그 다음에 소수성 영역이 따르고, 36 위치에는 세린, 41 위치에는 발린이 있다. 다른 가능성은 54 위치에서 발린, 또는 위치 52의 세린 다음에 위치 55 및 56의 알라닌 잔기중 어느 것 다음에서 절단이 일어난다는 것이다. 시그날 서열이 아미노산 41 다음에서 절단된다고 가정하면, 성숙한 단백질은 104,106 Da의 분자 질량을 가진 979개의 아미노산을 포함할 것이다. 이것은 시그날 서열이 123개의 뉴클레오티드에 의해 암호화되어 유전자의 4%를 구성하며, 분자 질량이 4616 Da 임을 제시한다. 이 크기의 시그날 서열을 추가로 지지하는 것은 단일 클론 항체 4G8로 프로브 처리한 천연 및 클로닝된 α항원의 크기를 비교하는 웨스턴 블롯이다. 제8도에 도시한 바와 같이, 클론 pJMS23에서 유래한 α항원 단백질 래더의 각각의 계단은 GBS A909에서 유래한 천연 단백질의 것보다 약간 더 크며, 이것은 신호 서열이 GBS 에서와 마찬가지로 이. 콜리에서는 프로세싱될 수 없음을 제시하는 것이다. 크기차는 약 4 kda인 데, 이것은bca에서의 보다 큰(53 내지 55개 아미노산) 시그날 서열보다는 더 짧은(41개 아미노산) 시그날 서열에 해당하는 것이다.
bca의 N 말단의 분석
추정의 시그날 서열 다음에는, 반복 서열 앞에 185개 아미노산의 영역이 있다. N-말단 영역은 555개 뉴클레오티드를 포함하는데, 이것은 유전자의 18%를 차지하는 것이며, 20,417 Da의 예측된 분자 질량을 가진 폴리펩티드를 암호화한다. 블라스트 네트워크의 프로그램를 사용하여 젠뱅크 및 스위스 프롯에서의 서열과,bca의 N 말단의 6개 모든 해독틀의 1 차 뉴클레오티드 서열 및 유도된 아미노산 서열을 비교하는 컴퓨터 조사에 의하면 상동성이 없는 것으로 확인되었으며, 이 사실은 그 유전자의 이 영역이 이미 서열 분석되거나 또는 개시된 핵산 또는 아미노산 서열과는 같지 않음을 암시한다.
bca의 반복 단위체 영역
DNA 서열의 아미노산 679에서 시작하여, 그 유전자의 74%를 차지하는 동일한 핵산 및 아미노산 구조를 가진 9개의 큰 병렬 반복 단위체가 있다.bca의 이 영역의 크기 및 반복성은 제9도에 예시하였다. 각각의 반복 단위체는 8665 Da의 계산된 분자 질량을 갖는 82개 아미노산을 암호화하는 246개 뉴클레오티드로 구성된다. 전체 반복 영역은 749개 아미노산을 포함하며, 9개의 동일한 반복 단위체 및 9'으로 표시된 부분 반복 단위체로 구성된다. 이 영역의 계산된 분자 질량은 79,053 Da이다.
반복 서열의 처음과 끝의 측정은 다소 임의적이다. 여기서 측정은 개방형 해독틀에서의 첫번째 코돈으로 시작하는 N 말단으로부터 개시한다. 의도에 따라, 반복 단위는 또한 해독틀로부터 시작하거나 또는 C-말단쪽으로 개시하는 것으로 정의될 수 있다. 핵산 및 유도된 아미노산 상동성에 대한 블라스트 컴퓨터 조사는 반복 단위에 대해 상당한 일치성을 나타냈다. 그러므로, 이들 반복 단위는 α항원에 특이적인 것으로 보이며, 다른 연쇄상구균 단백질에 대해 기술한 것과 상이한 크기 및 구조를 가진다[참조: Heden, L.-O 등, Eur. J. Immunol. 21 : 1481-1490(1991);Jerlstrom, P.G.등, Mol. Microbiol. 5:843-849(1991); Fischett:, V.A.등, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci; and Enterococci, Dunny등 편집, Am. Soc. Microbiol, 워싱턴, 290-294면; Yother,J. 등, J.Bacteriol. 174 : 601-609(1992)].
bca의 C-말단 앵커 및 상동성
반복 단위 다음에 148개 뉴클레오티드를 포함하고 유전자의 4.4%를 구성하는 작은 C-말단 영역이 있다. 이 영역은 계산된 분자 질량이 4672 Da 인 45개의 아미노산을 암호화한다. 아미노산 상동성에 대한 블라스트 조사에서 A군 연쇄상구균의 M 단백질 및 A군과 G군의 연쇄상구균에서 유래한 IgG 결합 단백질을 포함하여 공통의 막 앵커 모티프(제7B도)를 가진 그람-양성 표면 단백질 클래스를 동정하였다[참조: Wren,B.W. 등, Mol. Microbiol. 5 : 797-803(1991)]. C말단의 아미노산 조성은 LPXTGE[서열번호: 2]모티프(제7B도) 앞의 리신을 가진 친수성 신장체를 포함하는 펩티드 막 앵커에 그 특징이 있다[참조: Fischetti, V.A.등, Mol. Microbiol. 4 : 1603-1605(1990)]. 이 다음에는 공통 서열 PPFFXXAA[서열번호 : 1]을 가진 소수성 영역이 따르는데, 여기서, X는 소수성 아미노산을 나타낸다. 마지막으로, 세포의 세포질 속으로 연장되는 것으로 보이는 아스파라긴산의 친수성 꼬리 단부가 있다.
뉴클레오티드 서열 및 추론된 α항원 단백질의 분석
제9도는 뉴클레오티드 및 유도된 아미노산 서열로부터 결정되는bca의 개방형 해독틀내에 4개의 구별되는 영역을 예시한 것이다. 아미노산 서열의 소수성 도면은 추정의 시그날 서열이 짧은 친수성 N 말단을 가지며, 그 다음에 소수성 신장체 및 친수성 영역의 단부를 가지는 반면, C-펩티드 막 앵커는 소수성 벽에 걸치는 도메인 및 작은 친수성 꼬리를 가진다는 것을 보여준다[참조: Engelman, D. M. 등, Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15 : 321-353(1986); Kyte, J. 등, J. Mol. Biol. 157 : 105-132(1982)].
천연 α 항원은 클로닝된 유전자 생성물에 나타나는 규칙 반복 간격의 폴리펩티드의 래더를 입증한다(제8도).bca의 각각의 반복 단위체의 크기는 8665 Da의 폴리펩티드를 암호화하는데 이것은 단백질 래더에서의 크기 차이에 해당한다. 단백질 이질성을 생성시키는 가능한 메카니즘을 살펴보기 위해,bca뉴클레오티드 및 유도된 RNA 및 단백질 서열을 조사하였다.bca의 뉴클레오티드 서열의 분석은 번역의 조기 종결을 일으킬 수 있는 반복 영역내의 코튼을 나타내지 못했다. 또한, 반복 영역의 아미노산 서열을 단백질 분해의 잠재 부위에 대해 제네틱스 컴퓨터 그룹 프로그램으로 스크리닝했다. 각각의 반복 단위체내의 특이 부위는 pH 2.5에 민감하며, 아스파라긴산 다음에 프롤린이 나타난다. 그러나, 이들 부위는 N-말단에서도 발견되었다. α 항원이 트립신에 상대적으로 내성이 있지만, 상기 서열에서는 다수의 잠재 트립신 절단 부위가 발견된다 마지막으로, RNA 서열 및 3차 구조를 모형화하였으나, RNA-매개 자가 절단과 관련될 수 있는 반복 서열내의 영역을 동정하지는 못하였다
논점
GBS의 α항원에 대해 동정된 2가지 생물학적 성질은 특이 항체의 부재시에 옵소닌 식작용에 저항하는 능력, 및 보호 항체를 유도하는 에피토프의 발현이다[참조: Madoff, L. C. 등, Infect. Immun. 59 : 2638-2644(1991) Lancerield, R. C. 등, J. Exp. Med. 142 : 165-179(1975): Payne, N. R. 등, J. Infect. Dis. 151 : 672-681(1985); Payne, N. R. 등, Infect. Immun. 55 : 1243-1251(1987)]. α 항원의 서열 분석은 4개의 구별된 구조 도메인을 보여준다. 추정의 N-말단 신호 서열 및 C-말단 막 앵커는 α 항원이 표면-연계 세포막 단백질이라는 가설을 지지한다. 반복 단위체 모티프와 함께 상기 성질은 박테리아 감염이 병원성 유발에 관계되는 것으로 생각되는 다수의 그람-양성 단백질과 공유된다[참조: Fischetti, V. A. 등, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci, Dunny 등 편집 Am. Soc. Microbiol 워싱턴(1991), 290-294면].
α항원 서열은 유전자의 74%를 이루는 크고 동일한 직렬 반복 서열 영역을 동정하였고, 전술한 단백질 또는 핵산 서열과 상동성이 없음을 입증하였다. 그러나, 다수의 독성-관련 단백질은 다수의 반복 요소를 포함한다. 항식작용성인 A군 연쇄상구균의 M 단백질은 보호 에피토프를 보유하며, 항원의 크기 및 제시(presentation)에 있어 다양성을 나타내며, 유전자의 거의 2/3를 차지하는 2개의 연장된 직렬 반복 영역 및 1개의 비직렬 반복 영역을 포함한다[참조: Fischetti, V. A. 등, Rev. Infect. Dis. S356-S359(1988); Hollingshead, S. K. 등, J. Biol. Chem. 261 : 1677-1686(1986); Haanes, E. J. 등, J. Bacteriol. 171 : 6397-6408(1989)]. 각각의 반복 단위체는 α항원에서보다 M 단백질에서 보다 더 작고, 21개 내지 81개 염기쌍의 범위를 가진다. 또한, 반복 영역의 말단에 있는 반복 단위체들 사이에는 차이가 있는 반면, 중간의 반복 단위체들은 거의 동일하다.뉴모콕쿠스의 표면 단백질 A는 20개 아미노산 각각의 10개 이하의 반복 분절을 포함하는 영역을 함유한다[참조: Yother, J. 등, J. Bacteriol. 174 : 601-609(1992)]. M 단백질 및 뉴모콕쿠스 표면 단백질 A는 그 구조 유전자에 있는 반복 DNA 서열에 의해 매개되는 것으로 생각되는 단백질/유전자 크기의 변화 및 항원성의 다양성을 입증한다(참조: Fischetti, V. A. 등, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci, Dunny 등 편집. Am. Soc. Microbiol. 워싱턴(1991), 290-294면; Yother, J. 등, J. Bacteriol, 174 : 601-609(1992);Haanes, E. J. 등, J. bacteriol. 171 : 6397-6408(1989)]. 반복 모티프를 갖는 기타 그람-양성 유전자는 스트렙토콕쿠스 소브리너스(S. sobrinus) 및 스트렙토콕쿠스 뮤탄스(S. mutans)에서 유래한 글리코트랜스퍼라제 유전자를 포함한다[참조: Ferretti, J. J. 등, J. Bacteriol, 169 : 4271-4278 (1987); Shiroza, T. 등, J. Bacteriol(170 : 810-816(1988)]. 반복 서열과 연계된 면역우성 에피토프는 리케챠 리케치이(Rickettsia richettsii), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis) 및 클로스트리듐 디피사일 (Clostridium difficile)을 포함하여 다수의 기타 병원체에서 동정되었다[Dailey, D. C. 등, Infect. Immun. 59 : 2083-2088(1991); Anderson, B. E. 등, Infect. Immun. 58 : 2760-2769(1990); vonEichel-Streiber, C. 등, Gene 96 : 107-113(1990)]. 알파 항원에서 발견되는 반복 단위체는 3가지 이유에서 특이성이 있다: (i) 기타 그람-양성 표면 단백질에서 발견되는 것보다 더 크다. (ii) 핵산 수준에서는 동일하여 차이를 나타내지 않는다. (iii) 반복 단위체에 의해 암호화된 단백질의 크기는 천연및 클로닝된 α항원에서 나타나는 래더화 부분에 해당한다.
큰 직렬 반복 단위체의 발견은 α항원의 유전자형 및 표현형의 변이성에 대해 많은 의문점을 불러 일으킨다. 4G8 단일 클론 항체로 웨스턴 면역 블롯상에서 프로브 처리할 때 천연 및 클로닝된 α 항원은 모두 약 8 kda 만큼 변화하는 규칙적인 래더의 단백질들을 나타내며, α 항원의 크기는 균주들 사이에서 다양하다[참조: Madoff, L. C. 등, Infect. Immun. 59 : 2638-2644(1991)]. 본래의 α항원 클론 pJMS23의 제한 엔도뉴클레아제 지도는 약 270개 염기쌍의 다수의StyI 단편을 보여 주었다[참조: Michel, J. L. 등, Infect. Immun. 59 : 2023-2028(1991)]. 균주 A909 가bca의 사본을 단 하나 함유하기 때문에, 이들 단편이 단백질의 이질성의 원인이 되는 것으로 제안되었다. 뉴클레오티드 서열은 유전자의 반복성을 확인시키지만, 단백질 래더화의 메카니즘을 규명하지는 못한다.
다수의 단백질 크기가 천연 및 클로닝된 배경에서 나타나기 때문에, 그리고, 유전자 패밀리에 대한 증거가 없기 때문에, 래더화가 이. 콜리 및 GBS 모두에 공통적인 메카니즘으로부터 야기되고/되거나 α 항원에 특이적인 성질에 의해 매개되는 것으로 가정하였다. 반복 영역 내의 Tn5 트랜스포존 삽입 돌연변이 상에서 웨스턴 블롯은 여전히 래더화를 나타내는데, 이것은 C 말단이 이질성에 필수적이 아님을 입증하며, 이 사실은 N-말단 또는 반복 영역중 어느 하나가 래더화를 결정한다는 것을 암시한다.
단일 클론 항체를 사용하여 GBS 분리체 사이에서 α항원을 연구한 결과, α항원의 최대 분자 크기는 주어진 분리체에 대해서는 일정하지만, 상이한 분리체 사이에서는 광범위하게 변하는 것으로 나타났다[참조: Madoff, L.C.등, Infect. Immumn. 59:2638-2644(1991)]. 직렬 반복 단위체는 반복 영역의 결실 또는 배수화를 위한 편리하고 고정된 재조합 부위를 제공한다. 결실은 유전자의 크기를 감소시키며, DNA 복제중 부등 교차, 또는 잘못 염기쌍이 형성된 주형이 미끄러짐에 의해 일어날 수 있는데, 이것은 해독틀내에서 일어난다[참조: Harayama. S, 등, J. Bacteriol. 173:7540-7548(1991)]. DNA의 배수화는 반복체내에서 돌연변이를 증폭하고 항원 다양성을 생성시키는 메카니즘일 수 있다. 그러나, α 항원의 단백질 크기의 변화가 항원 다양성 및 상이한 보호성 또는 옵소닌성 에피토프의 발현을 수반한다는 증거는 없다.
A909에서 유래한 α 항원의 9개 완전한 직렬 반복은 핵산 수준에서는 동일한데, 이것은 고도로 보존된 구조임을 입증한다. 이 사실은 반복 서열을 생기게하는 배수화가 최근의 상태이며, 그 완전성을 유지하는 반복서열에 내재하는 성질이 존재하거나 또는 그 구조가 유전자의 필수 구조임을 암시한다. α 항원-특이적인 DNA를 프로브로 하여 GBS의 α항원-보유 균주에서 유래한 게놈 DNA을 서던 플롯하여 균주사이에서 유전자 크기의 변이를 보여준다. 균주 사이에서 유전자형의 다양성의 메카니즘을 살펴보기 위해서는, 기타 표현형 변이체의bca를 클로닝하여 서열 분석하고, GBS의 C 단백질-보유 균주들 사이의 계통 발생 관계를 결정할 필요가 있다[참조: Michel, J.L.등, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci, Dunny, G. M. 등 편집. Am. Soc. Microbiol. 워싱턴(1991), 214-218 면; Michel, J.L.등, Infect. Immun. 59:2023-2028(1991);Cleat, P.H. 등, Infect. Immun. 55:1151-1155(1987); Heden, L.-O. 등, Eur. J. Immunol. 21:1481-1490(1991); Lindahl, G 등, Eur.J. Immunmol. 20:2241-2247(1990)].
그러므로, 요약하면, 천연 α 항원과 클로닝된 유전자 생성물의 웨스턴 블롯은 규칙적인 래더 패턴을 갖는 이질성 폴리펩티드들을 입증한다.bca좌의 뉴클레오티드 서열은 108,705 Da의 전구 단백질을 암호화하는 3060개 뉴클레오티드의 해독틀을 나타낸다. 41개 아미노산의 추정 시그날 서열을 절단하여 104,106 Da의 성숙한 단백질을 생성시킨다. α 항원의 20,417-Da의 N-말단 영역은 전술한 단백질 서열과 상동성을 나타내지 않으며, 성숙한 단백질의 74%를 구성하는 일련의 9개 직렬 반복 단위체가 뒤따른다. 각각의 반복 단위는 동일하며, 8665 Da의 분자 질량을 가진 82개 아미노산으로 구성되며, 이 아미노산은 246개 뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 반복 단위체의 크기는 GBS 에 의해 발현되는 α C 단백질의 이질성 래더에서 관찰된 크기에 해당한다. α항원의 C-말단 영역은 다수의 그람-양성 표면 단백질에 의해 공유되는 막 앵커 도메인 모티프를 포함한다.bca에서 동일한 반복 단위체의 더 큰 영역은 보호성 에피토프를 정의하여, 그 구조는 α항원의 표현형 및 유전자형 다양성에 관한 보호성 백신의 제작을 위해 조작될 수 있다.
실시예 15
하나 이상의 천연 반복 단위체를 가진 C 단백질 α항원 기능적 유도체를 함유하는 백신
상기 보호성 C 단백질 α 항원 기능적 유도체(예 : N,C,N-C,R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R9,N-R1,N-R2,N-R3,N-R4,N-R5,N-R6,N-R7,N-R8,N-R9,R1-C,R2-C,R3-C,R4-C,R5-C,R6-C,R7-C,R8-C,R9-C,N-R1-C,N-R2-C,N-R3-C,N-R4-C,N-R5-C,N-R6-C,N-R7-C,N-R8-C 또는 N-R9-C의 단백질 부분)는 이. 콜리와 같은 숙주에서 천연 B군 연쇄상구균 α 항원 및 β 항원을 클로닝하고 발현시키기 위해 상기한 것과 유사한 재조합 방법을 사용하여 재조합에 의해 제조할 수 있다. 임의의 기술을 이용하여 목적하는 α 항원 기능적 유도체 서열을 합성할 수 있는데, 예를 들면, 상기 단백질의 재조합 생산에 대해 상기에 기술한 기술, 및 문헌[Williams, J.I.등, 미국 5,089,406 호(Method of Producing a Gene Cassette Coding for Polypeptides with Repeating Amino Acid Sequences), 이 문헌을 본 명세서에 참고로 인용함], 및 문헌[Mcpherson, M.J.편집, Directed Mutagenesis, A Practical Approach, IRL 프레스, 뉴욕, 1991]에 기술된 방법을 이용할 수 있다.
필요에 따라 상기한 재조합으로 발현되는 보호성 C 단백질 알파 항원 기능적 유도체 (예를 들어, N,C,N-C,R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R9,N-R1,N-R2,N-R3,N-R4,N-R5,N-R6,N-R7,N-R8,N-R9,R1-C,R2-C,R3-C,R4-C,R5-C,R6-C,R7-C,R8-C,R9-C,N-R1-C,N-R2-C,N-R3-C,N-R4-C,N-R5-C,N-R6-C,N-R7-C,N-R8-C 또는 N-R9-C의 단백질 부분)는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 재조합 숙주 또는 배지로부터 정제한 후, 접합 백신내에서 그들의 능력을 검사할 수 있다. 각각의 펩티드 종은 단독 또는 기타 펩티드와 연합하여 검사될 수 있다. 이 능력을 평가하기 위해, 재조합 플라즈미드를 함유하는 이.콜리의 세포성 추출물을 상기와 같이 제조하고, 토끼를 면역화하기 위해 사용하였다. 이어서 생성되는 항혈청은 B군 연쇄상구균 H36B 균주에 의한 감염으로부터 마우스를 보호하는 능력을 위한 마우스치사 모델에 사용하였다. 균주 H36B는 B군 연쇄상구균의 C 단백질을 보유한다. 대조용으로, 연쇄상구균 515 균주(C 단백질을 보유하지 않음)에 의한 감염에 대해 마우스를 보호하기 위한 항혈청의 능력을 결정하였다.
상기한 당해 기술분야의 공지된 기법을 사용하여 상기 펩티드가 B군 연쇄상구균 다당류에 접합된 접합형을 평가하기 위해 유사한 분석을 사용할 수 있다. 이는 B군 연쇄상구균의 캡시드 다당류가 바람직하다. 접합체는 토끼를 면역화하기 위해 사용하였다. 이어서 생성되는 항혈청은 B군 연쇄상구균 H36B 균주에 의한 감염으로부터 마우스를 보호하는 그들의 능력에 대해 마우스 치사 모델에서 검사하였다. H36B 균주는 B군 연쇄상구균의 C 단백질을 보유한다. 대조용으로서, 연쇄상구균 515 균주(C 단백질을 보유하지 않음)에 의한 감염에 대해 마우스를 보호하는 항혈청의 능력을 결정하였다.
특히, 바람직한 양태를 언급한 상기한 설명은 본 발명을 제한하지 않는 것으로 이해해야 할 것이다. 당해 기술분야의 당업자들은 본 발명의 범위내에서 본 발명의 다양한 변형 실시가 가능할 것이다.
서열 목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인: 미첼, 제임스, 엘.
카스퍼, 데니스
오수벨, 프레드릭, 엠.
마도프, 로렌스, 씨.
(ii) 발명의 명칭: 비(B)군 연쇄상구균에 대한 접합 백신
(iii) 서열의 수: 29
(iv) 서신 연락 주소:
(A) 수신인: 스턴, 케슬러, 골드스테인 앤드 폭스
(B) 거리: 뉴욕 애비뉴 1100 엔. 더블유.; 수이트 600
(C) 도시: 워싱톤
(D) 주: 디. 씨.
(E) 나라: 미국
(F) 우편번호: 20005-3934
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체형: 플로피디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리즈 #1.0, 버젼 #1.25
(vi) 현 출원 자료
(A) 출원 번호: PCT(양도됨)
(B) 출원일: 1993. 11. 2
(C) 분류:
(vii) 전 출원 자료:
(A) 출원 번호: 미국 제07/968,866호
(B) 출원일: 1992. 11. 2
(C) 분류:
(viii) 대리인 정보:
(A) 이름: 심발라, 미필 에이.
(B) 등록 번호: 33,851
(C) 참조 번호: 0609.237PC01
(ix) 원거리 통신 정보:
(A) 전화: (202) 371-2600
(B) 텔레팩스: (202) 371-2540
(C) 텔렉스: 248636 SSK
(2) 서열번호: 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 8개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 1:
(2) 서열번호: 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 6개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 2:
(2) 서열번호: 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 15개의 염기쌍
(B) 서열형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 양형태
(xi) 서열: 서열번호: 3:
(2) 서열번호: 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11개의 염기쌍
(B) 서열형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 양형태
(xi) 서열: 서열번호: 4:
(2) 서열번호: 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 12개의 염기쌍
(B) 서열형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 양형태
(xi) 서열: 서열번호: 5:
(2) 서열번호: 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 57개의 염기쌍
(B) 서열형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 양형태
(xi) 서열: 서열번호: 6:
(2) 서열번호: 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 16개의 염기쌍
(B) 서열형 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 형태: 양형태
(xi) 서열: 서열번호: 7:
(2) 서열번호: 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 32개의 염기쌍
(B) 서열형: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 형태: 양형태
(xi) 서열: 서열번호: 8:
(2) 서열번호: 9에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 12개의 염기쌍
(B) 서열형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 양형태
(xi) 서열: 서열번호: 9:
(2) 서열번호: 10에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20개의 염기쌍
(B) 서열형: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 형태: 양형태
(xi) 서열: 서열번호: 10:
(2) 서열번호: 11에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 12개의 염기쌍
(B) 서열형: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 형태: 양형태
(xi) 서열: 서열번호: 11:
(2) 서열번호: 12에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 13개의 염기쌍
(B) 서열형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 양형태
(xi) 서열: 서열번호: 12:
(2) 서열번호: 13에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 15개의 염기쌍
(B) 서열형: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 형태: 양형태
(xi) 서열: 서열번호: 13:
(2) 서열번호: 14에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1380개의 염기쌍
(B) 서열형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태:
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 79..1173
(ix) 특징:
(A) 이름/키: 미스크_피쳐
(B) 위치: 1004
(D) 그외의 정보:/주="이 특징은 위치 757부터 1003까지의 뉴클레오티드 서열이 1004 위치에 삽입되고 8회 이하로 반복될 수 있음(폴리뉴클레오티드내 이들 서열의 총 9회 반복 사본에 대해)"을 의미하는 것이다.
(xi) 서열: 서열번호: 14:
(2) 서열번호: 15에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 364개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(ix) 특징:
(A) 이름/키: 미스크_피쳐
(B) 위치: 310
(D) 그외의 정보:/주="이 특정은 위치 227부터 309의 아미노산 서열이 310위치에 삽입되고 8회 이하로 반복될 수 있음(폴리펩티드내 이들 서열의 총 9개의 반복 사본에 대해)"을 나타낸다.
(xi) 서열: 서열번호: 15:
(2) 서열번호: 16에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 56개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 16:
(2) 서열번호: 17에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 37개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 17:
(2) 서열번호: 18에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 41개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 18:
(2) 서열번호: 19에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 42개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 19:
(2) 서열번호: 20에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 41개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 20:
(2) 서열번호: 21에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 50개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 21:
(2) 서열번호: 22에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 45개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 22:
(2) 서열번호: 23에 대한 정보.
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 46개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 23:
(2) 서열번호: 24에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 45개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 24:
(2) 서열번호: 25에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 46개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 25:
(2) 서열번호: 26에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 46개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 26:
(2) 서열번호: 27에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 45개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 27:
(2) 서열번호: 28에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 34개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 28:
(2) 서열번호: 29에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 44개의 아미노산
(B) 서열형: 아미노산
(D) 형태: 양형태
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열: 서열번호: 29

Claims (24)

  1. 비(B)군 연쇄상구균에 의한 감염에 대해 숙주 면역성을 부여할 수 있는 접합 백신에 있어서, (a) 군-특이성 또는 유형-특이성 비(B)군 연쇄상구균(Streptococcus) 다당류 및 (b) 이 다당류가 접합되는 비(B)군 연쇄상구근 C 단백질 알파 항원의 유도체를 포함하되, 상기 유도체는 상기 비(B)군 연쇄상구균에 대한 보호성 항체들을 유도할 수 있고, 상기 C 단백질 알파 항원 유도체는 N, C, N-C, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R9',RX, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R6, N-R7, N-R8, N-R9, N-R9', N-RX, R1-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, R6-C, R7-C, R8-C, R9-C, RX-C, N-R1-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-R6-C, N-R7-C, N-R8-C 및 N-R9-C, N-R9'-C, N-RX-C로 구성된 군에서 선택되며, 여기서, "X"는 10이상이고, "N"은 시그날 서열의 존재 또는 분재하에 제6도에 도시한 서열 내에서 발견되는 알파 항원 반복 단위 서열의 시작점에 선행하는 N-말단 서열이고, "C"는 제6도에 도시한 바와 같이 48개 아미노산 C-말단 앵커 서열이고, "R"은 제6도의 서열 중 82개 아미노산 227-308의 1개의 사본이며, "RX"는 하나의 R 단위체의 카르복실 말단에서 인접하는 R 단위체의 아미노 말단에 직렬로 연결된, 상기 반복 서열의 직렬 사본 수가 "X"이며, 9'은 제6도에 도시한 아미노산 227-975의 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 접합 백신.
  2. 제1항에 있어서, 다당류가 피막 다당류인 것을 특징으로 하는 접합 백신.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유도체는 N, C, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8및 R9로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합 백신.
  4. 제3항에 있어서, 하나 이상의 유도체는 N, C, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8및 R9로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합 백신.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유도체는 N-C, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R6, N-R7, N-R8및 N-R9로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합 백신.
  6. 제5항에 있어서, 하나 이상의 유도체는 N-C, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R6, N-R7, N-R8및 N-R9로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합 백신.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유도체는 R1-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, R6-C, R7-C,R8-C 및 R9-C로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합 백신.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 유도체는 R1-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, R6-C, R7-C, R8-C 및 R9-C로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합 백신.
  9. 비(B)군 연쇄상구균 알파 항원의 유도체를 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 분자로서, 상기 유도체는 비(B)군 연쇄상구균에 대한 보호성 항체들을 유도할 수 있으며, 상기 유도체는 N, C, N-C, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R9',RX, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R6, N-R7, N-R8, N-R9, N-R9', N-RX, R1-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, R6-C, R7-C, R8-C 및 R9-C, RX-C, N-R1-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-R6-C, N-R7-C, N-R8-C 및 N-R9-C, N-R9'-C, N-RX-C로 구성된 군에서 선택되며, 여기서, "X"는 10이상이고, "N"은 시그날 서열의 존재 또는 부재하에 제6도에 도시한 서열 내에서 발견되는 알파 항원 반복 단위 서열의 시작점에 선행하는 N-말단 서열이고, "C"는 제6도에 도시한 바와 같이 48개 아미노산 C-말단 앵커 서열이고, "R"은 제6도의 서열 중 82개 아미노산 227-308의 1개의 사본이며, "RX"는 하나의 R 단위체의 카르복실 말단에서 인접하는 R 단위체의 아미노 말단에 직렬로 연결된, 상기 반복 서열의 직렬 사본 수가 "X"이며, 9'은 제6도에 도시한아미노산 227-975의 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 유도체는 N, C, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8및 R9로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
  11. 제9항에 있어서, 상기 유도체는 N-C, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R6, N-R7, N-R8및 N-R9로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
  12. 제9항에 있어서, 상기 유도체는 R1-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, R6-C, R7-C, R8-C 및 R9-C로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
  13. 제9항 또는 제10항 내지 제12항 중 어는 하나의 항에 있어서, 상기 분자는 박테리아내에서 상기 C 단백질 알파 항원을 발현시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
  14. 제13항의 재조합 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  15. 제19항에 있어서, 상기 벡터는 플라즈미드, 코스미드, 트랜스포존 및 파아지로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  16. 제13항의 재조합 분자를 사용하여 형질전환시킨 숙주 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포 및 효모 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 비(B)군 연쇄상구균인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  19. 제17항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 에스케리치아 콜리인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  20. 비(B)군 연쇄상구균에 의해 초래되는 감염의 예방 또는 감약화 방법에 있어서, 상기 감염의 위험에 처한 것이라 여겨지는 비인간 개체에 상기 감염에 대한 숙주 면역성을 부여할 수 있는 접합 백신의 유효량을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 백신은 (a) 비(B)군 연쇄상구균 다당류 및 (b) 이 다당류가 접합되는 C 단백질 알파 항원 유도체를 포함하고, 상기 C 단백질 알파 항원 유도체는 N, C, N-C, R1,R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R9',RX, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R6, N-R7, N-R8, N-R9, N-R9', N-RX, R1-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, R6-C, R7-C, R8-C 및 R9-C, RX-C, N-R1-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-R6-C, N-R7-C, N-R8-C 및 N-R9-C, N-R9'-C, N-RX-C로 구성된 군에서 선택되며, 여기서, "X"는 10이상이고, "N"은 시그날 서열의 존재 또는 부재하에 제6도에 도시한 서열 내에서 발견되는 알파 항원 반복 단위 서열의 시작점에 선행하는 N-말단 서열이고, "C"는 제6도에 도시한 바와 같이 48개 아미노산 C-말단 앵커 서열이고, "R"은 제6도의 서열 중 82개 아미노산 227-308의 1개의 사본이며, "RX"는 하나의 R 단위체의 카르복실 말단에서 인접하는 R 단위체의 아미노 말단에 직렬로 연결된, 상기 반복 서열의 직렬 사본 수가 "X"이며, 9'은 제6도에 도시한 아미노산 227-975의 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 비(B)군 연쇄상구균에 의해 초래되는 감염의 예방 또는 감약화 방법에 있어서, 비인간 암컷의 태아(an unborn offspring)에게 상기 감염에 대한 면역성을 부여할 수 있는 접합 백신의 유효량을 비인간 암컷에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 백신은 (a) 비(B)군 연쇄상구균 다당류 및 (b) 이 다당류가 접합되는 C 단백질 알파 항원 유도체를 포함하고, 상기 C 단백질 알파 항원 유도체는 N, C, N-C, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R9',RX, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R6, N-R7, N-R8, N-R9, N-R9', N-RX, R1-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, R6-C, R7-C, R8-C 및 R9-C, RX-C, N-R1-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-R6-C, N-R7-C, N-R8-C 및 N-R9-C, N-R9'-C, N-RX-C로 구성된 군에서 선택되며, 여기서, "X"는 10이상이고, "N"은 시그날 서열의 존재 또는 부재하에 제6도에 도시한 서열 내에서 발견되는 알파 항원 반복 단위 서열의 시작점에 선행하는 N-말단 서열이고, "C"는 제6도에 도시한 바와 같이 48개 아미노산 C-말단 앵커 서열이고, "R"은 제6도의 서열 중 82개 아미노산 227-308의 1개의 사본이며, "RX"는 하나의 R 단위체의 카르복실 말단에서 인접하는 R 단위체의 아미노 말단에 직렬로 연결된, 상기 반복 서열의 직렬 사본 수가 "X"이며, 9'은 제6도에 도시한 아미노산 227-975의 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법 .
  22. 비(B)군 연쇄상구균에 의해 초래되는 감염의 예방 또는 감약화 방법에 있어서, 상기 감염의 위험에 처한 것이라 여겨지는 비인간 제1 개체에게, 상기 감염에 대한 숙주 면역성을 부여할 수 있는 접합 백신을 비인간 제2 개체에 노출시킴으로써 유도된 항혈청의 유효량을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 백신은 (a) 비(B)군 연쇄상구균 다당류 및 (b) 이 다당류가 접합되는 C 단백질 알파 항원 유도체를 포함하고, 상기 C 단백질 알파 항원 유도체는 N, C, N-C, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R9',RX, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R6, N-R7, N-R8, N-R9, N-R9', N-RX,R1-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, R6-C, R7-C, R8-C 및 R9-C, RX-C, N-R1-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-R6-C, N-R7-C, N-R8-C 및 N-R9-C, N-R9'-C, N-RX-C로 구성된 군에서 선택되며, 여기서, "X"는 10이상이고, "N"은 시그날 서열의 존재 또는 부재하에 제6도에 도시한 서열 내에서 발견되는 알파 항원 반복 단위 서열의 시작점에 선행하는 N-말단 서열이고, "C"는 제6도에 도시한 바와 같이 48개 아미노산 C-말단 앵커 서열이고, "R"은 제6도의 서열 중 82개 아미노산 227-308의 1개의 사본이며, "RX"는 하나의 R 단위체의 카르복실 말단에서 인접하는 R 단위체의 아미노 말단에 직렬로 연결된, 상기 반복 서열의 직렬 사본 수가 "X"이며, 9'은 제6도에 도시한 아미노산 227-975의 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제2항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 C 단백질 유도체는 10개 이상의 반복하는 R 단위체를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합 백신.
  24. 제10항 내지 12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유도체는 10개 이상의 반하는 R 단위체를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
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