HU220198B - Konjugált vakcina B csoportba tartozó Streptococcus ellen - Google Patents

Description

A találmány területe a mikrobiológia és a vakcinatechnológia, és tárgya B csoportba tartozó Streptococcus elleni immunitást biztosítani képes vakcina kifejlesztése.

A Streptococcus nemzetségbe tartozó baktériumokat emberi és állati betegségek okozóiként tartják számon. A Streptococcusokat (sejtfelületükön specifikus szénhidrát-antigének jelenléte alapján) immunológiai csoportokba sorolják. Jelenleg az A-tól O-ig terjedő csoportok az elfogadottak (Davis, B. D. és munkatársai, Microbiology, Harper & Row, 3. kiadás, 609. oldal, 1980). A Streptococcusok az emberi betegségeket okozó legelterjedtebb és legfontosabb baktériumok közé tartoznak. Bár a B csoportba tartozó Streptococcusok állati betegségekkel (mint a szarvasmarhák emlőgyulladása) kapcsolatosak, a Streptococcus agalactiae-TŐi (egy B csoportba tartozó Streptococcus) kiderült, hogy az Egyesült Államokban az újszülöttkori vérmérgezés leggyakoribb okozója, s úgy tartják, évente több mint 6000 halálesetért felelős (Hill, H. R. és munkatársai, Sexually Transmitted Diseases, McGraw Hill, pp. 397-407). A B csoportos Streptococcus a csecsemők késői megjelenésű agyhártyagyulladásában, a szülés utáni méhnyálkahártya-gyulladásban és az immunológiailag veszélyeztetett felnőttek fertőzéseiben is fontos patogén (Patterson, M. J. és munkatársai, Bact. Rév., 40, 774-792,1976). Bár az organizmus érzékeny az antibiotikumokra, a nagy arányú fertőzés és az újszülöttekben a vérmérgezés, illetve csecsemőkben az agyhártyagyulladás gyors előretörése azonban magas megbetegedési (50%), illetve halálozási arányt (20%) okoz (Baker, C. J. és munkatársai, New Engl. J. Med., (szerkesztői), 374(26), 1702-1704, 1986; Baker C. J. és munkatársai, J. Infect. Dis., 136, 137-152,1977).

A Streptococcus B csoport a normális emberi hüvely- és vastagbélflóra általános tagja. Míg az újszülöttkori fertőzés leggyakrabban a szülés alatt a hüvelyflóra által történik, újszülöttosztályokon kórházi fertőzést is leírtak (Patterson, M. J. és munkatársai, Bact. Rév., 40, 774-792, 1976). Azon csecsemők között azonban, akiken a Streptococcus B csoport megtelepedett, csak kis százalékban fordulnak elő súlyos fertőzések. A megtelepedéstől a fertőzésig tartó átterjedésben sem a gazdafaktorok, sem a bakteriális virulenciafaktorok szerepe nem tisztázott.

A Streptococcus B csoportból származó több proteinről úgy gondolják, hogy szerepet játszhatnak a virulenciában és az immunitásban (Ferrieri, P., Rév. Infect. Dis., 10, S363, 1988). Lancefield 1975-ben a Streptococcus B csoport C proteinjeit védőimmunitást kiváltó képességük alapján határozta meg (Lancefield, R. C. és munkatársai, J. Exp. Med., 142, 165-179,1975). A proteinek e csoportjáról úgy vélik, hogy több különböző polipeptidet és antigéndeterminánst tartalmaz. Az eddigi felfedezések következtében a Streptococcus B csoport fertőzések megakadályozására tett erőfeszítések profilaktikus antibiotikumok alkalmazására és a Streptococcus B csoport elleni vakcina kifejlesztésére irányultak [Baker, C. J. és munkatársai, Rév. of Infec. Dis., 7, 458-467, 1985; Baker, C. J. és munkatársai, New Engl. J. Med. (szerkesztői), 374(26), 1702-1704,

1986], Streptococcus B csoport elleni poliszacharid vakcinákat Kasper, D. L. (4 207 414 számú egyesült államokbeli szabadalom, és az RE31672 számú egyesült államokbeli újra kiadott szabadalom, valamint a 4 324 887, 4 356 263, 4 367 221, 4 367 222 és 4 367 223 számú egyesült államokbeli szabadalom), Carlo, D. J. (4 413 057 számú egyesült államokbeli szabadalom és 38265 számú európai közrebocsátási irat) és Yavordios, D. és munkatársai (71515 számú európai közrebocsátási irat) írtak le, melyek mindegyikét hivatkozásul említjük.

Azon csecsemők kis csoportját kivéve, akikben a Streptococcus B csoport anyai eredetű megtelepedése és egyéb, születés körüli kockázati faktorok egyaránt megfigyelhetők, a profilaktikus antibiotikumok alkalmazása az esetek többségében a megelőzést illetően nem praktikus, illetve nem hatásos (Boyer, K. M. és munkatársai, New Eng. J. Med., 374(26), 1665-1669, 1986). A szülés ideje alatti kemoterápiás megelőzés széles körben nem elfogadott, mivel (1) a Streptococcus B csoport anyai eredetű megtelepedésének gyors, megbízható és gazdaságos azonosítása nem lehetséges; (2) az újszülötti esetek körülbelül 40%-a kis kockázatú; (3) nem tartják praktikusnak valamennyi olyan anya vagy csecsemő szűrését és/vagy kezelését, akik potenciálisan veszélyeztetettek; és (4) az antibiotikumos profilaxis nem tűnik kielégítőnek a késői megjelenésű agyhártyagyulladás (az Egyesült Államokban évente 7200 eset), illetve a szülés utáni méhnyálkahártya-gyulladás (évente 45 000 eset) megelőzésében [Baker C. J. és munkatársai, New Eng. J. Med. (szerkesztői), 374(26), 1702-1704,1986],

A pJMSl és pJMS23 plazmid a pUX12 plazmid származékai, melyek a találmány értelmében alkalmazható antigén tulajdonságú Streptococcus proteinek kódolására képes DNS-t tartalmaznak. A pUX12 plazmid a pUC12 plazmid származéka. A pJMSl és pJMS23 plazmidot 1989. szeptember 15-én ATCC 40 659, illetve ATCC 40 660 deponálási számon helyeztük letétbe az American Culture Type Collectionnél (Rockville, MD).

A Streptococcus agalactiae az Egyesült Államokban az újszülöttkori vérmérgezés leggyakoribb okozója, s évente 6000-10 000 halálesetért felelős. Bár a Streptococcus B csoport típusspecifikus poliszacharid tokja immunogén, és fontos védőantigéneket hordoz, poliszacharid vakcinával végzett klinikai kísérletek gyenge reagálási arányt mutattak (Baker, C. J. és munkatársai, New Engl. J. Med., 319, 1180, 1980; Insel, R. A. és munkatársai, New Eng. J. Med., (szerkesztői), 379(18), 1219-1220,1988).

Jelen találmány olyan B csoportba tartozó Streptococcus (azaz Streptococcus agalactiae) elleni konjugált vakcina kifejlesztésére vonatkozik, amelyben B csoportba tartozó StreptococcusbóX klónozott gén által expresszált védő hatású (protektív) protein antigént alkalmazunk. Az új konjugált vakcina előnye egyrészt, hogy a hordozó protein adjuváns működése folytán T-sejtfuggő védelmet vált ki, másrészt, hogy a klónozott Streptococcus B csoport proteinen jelen levő további védő hatású epitópokat biztosít (Insel, R. A. és munkatársai, New Eng. J. Med., (szerkesztői), 379(18),

HU 220 198 Β

1219-1220,1988; Baker, C. J. és munkatársai, Rév. of Infec. Dis., 7., 458-467,1985).

Részletesen, a találmány tárgya B csoportba tartozó Streptococcus által okozott fertőzéssel szembeni gazdaimmunitás biztosítására képes konjugált vakcina, amely (a) egy poliszacharidot (b) egy proteinhez konjugálva tartalmaz, amelyben mind a poliszacharid, mind a protein jellemző molekulái a B csoportba tartozó Streptococcusnak, és amelyben a protein a C protein alfaantigén származéka, amely fenntartja a Streptococcus B csoport elleni védő hatású antitestek termelődése kiváltásának képességét.

A találmány további tárgya eljárás B csoportba tartozó Streptococcus által okozott fertőzés megelőzésére vagy csökkentésére, melynek során ilyen fertőzéssel feltételezhetően veszélyeztetett személynek a találmány szerinti konjugált vakcina hatásos mennyiségét adjuk be, hogy az a fertőzéssel szemben gazdaimmunitást biztosítson.

A találmány további tárgya eljárás B csoportba tartozó Streptococcus által okozott fertőzés megelőzésére vagy csillapítására, melynek során terhes nőnek a találmány szerinti konjugált vakcina hatásos mennyiségét adjuk be, hogy az a nő születendő utódjának fertőzés elleni immunitást biztosítson.

A találmány további tárgya eljárás B csoportba tartozó Streptococcus által okozott fertőzés megelőzésére vagy csökkentésére, melynek során ilyen fertőzéssel feltételezhetően veszélyeztetett személynek egy második személy találmány szerinti konjugált vakcinával való kezelésével nyert antiszérum hatásos mennyiségét adjuk be, hogy az a fertőzéssel szemben gazdaimmunitást biztosítson.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán a pUC12 plazmid pUX12 plazmid kialakításához vezető módosításait mutatjuk be.

A 2. ábrán a pUX12 plazmid restrikciós és transzkripciós térképét mutatjuk be.

A 3. ábrán a pUX12 plazmid módosításait mutatjuk be, melyeket a pUX12+l +1 leolvasásikeret-plazmid (A) kialakítása érdekében végeztünk, és amelyek pUX12-l -1 leolvasásikeret-plazmid (C) kialakulását eredményezik. A (B) rész olyan konstrukciót ábrázol, amely szintén lehetőséget nyújt -1 leolvasásikeret-plazmid kialakítására.

A 4. ábrán az Sl és S23 elleni nyúlantiszérum alkalmazásával, egérrel végzett védővizsgálat eredményeit mutatjuk be. Az anti-Sl antiszérummal (p<0,002), illetve az anti-S23 antiszérummal (p< 0,022) beoltott egerek esetében tapasztaltunk védőhatást. Az alkalmazott minta méretének köszönhetően az Sl és S23 kísérletek között tapasztalt statisztikai szignifikancia különbsége nem jelentős. Az ábrán az egyes oszlopok felett a túlélő egerek számának az összes tesztelt egér számához viszonyított arányát tüntettük fel.

Az 5. ábrán a bca szekvenálási stratégiáját és restrikciós endonukleázos térképét mutatjuk be. A részleges restrikciós endonukleázos térkép a pJMS23 plazmid Ndel helyétől Síyl helyéig terjedő, 3594. nukleotidnál elhelyezkedő régióját foglalja magában, melyre meghatároztuk a bca nukleotidszekvenciáját és a szegélyezőszekvenciát. A nyitott leolvasási keretet nyitott kerettel jelöljük. A Tn5seql transzpozon mutációk (háromszögek) az inszerciók mindegyikétől mindkét irányba a nukleotidszekvenálás elindításához szolgálnak. A szekvencia oiigonukleotid primerekből nyert régióit (nyitott nyilak), és az egymásba ágyazott deléciókat (zárt nyilak) szintén bemutatjuk. A restrikciós endonukleázos hasítási helyek rövidítése a következő: A - Alul; B Bsml; F - Foki; H - Hindi; N - Ndel; S - Styl. bp jelentése bázispár.

A 6. ábrán a bca és a szegélyezőrégiók nukleotidszekvenciáját (14. számú szekvencia), és az abból levezetett aminosavszekvenciáját (15. számú szekvencia) mutatjuk be. A DNS-szálat 5’-3’ irányban mutatjuk be, s a nukleotidokat a felső sorban, a nyitott leolvasási kerettől upstream irányban 78 bázispár távolságra kezdődően soroljuk fel. A következtetett aminosavszekvenciát a nyitott leolvasási keretben a nukleinsavszekvencia alatt mutatjuk be. A 40%-os G+C-tartalom és a kodonalkalmazás hasonló a más Streptococcus gének esetében tapasztalhatóhoz (Hollingshead, S. K. és munkatársai, J. Bioi. Chem., 261, 1677-1686, 1986). A kiemelt jellemzőket aláhúzással jelöltük; ezek a -10 (TATAAT) promoter konszenzus hely, a riboszómakötési hely (RBS), a jelzőszekvencia, az 1. ismétlődő régió, a C-terminális (3161 helyen TAA terminációs kodonnal), és a diád-szimmetriával rendelkező két régió, melyek potenciális transzkripciós terminátorok.

A 7. ábra A és B részén a C protein alfa-antigén feltételezett jelzőszekvenciáinak, illetve C-terminális membránkihorgonyzójának (anchor) homológiáit mutatjuk be.

7/A. ábra: a C protein alfa-antigén N-terminális szekvenciáját (felső sor, 1. szekvencia) (16. számú szekvencia) az alábbi Gram-pozitív jelzőszekvenciákkal hasonlítjuk össze (valamennyi szekvenciánál feltüntetjük az azonosító kódokat): 2. szekvencia (17. számú szekvencia), a C protein béta-antigén (515330; STRBAGBA) és a Streptococcus A csoport négy M proteinje; 3. szekvencia (18. számú szekvencia), ennX (STRENNX); 4. szekvencia (19. számú szekvencia), emm24 (STREMM24); 5. szekvencia (20. számú szekvencia), Ml (S00767); 6. szekvencia (21. számú szekvencia), S01260. Az aláhúzott hidrofób szakasz előtt álló lizin- (L) és arginin- (A) gyököket, valamint a feltételezhető jelző hasítási helyek előtt álló szerin- (S) és treonin- (T) gyököket vastag betűvel szedtük. Az alfa-jelzőszekvencia feltételezhető hasítási helye a 41-es helyen a valin után található, az 53-56 helyen azonban léteznek más hasítási helyek is.

7/B. ábra: a C protein alfa-antigén C-terminális szekvenciáját (felső sor, 1. szekvencia) (22. számú szekvencia) az alábbi Gram-pozitív membránkihorgonyzó (anchor) peptidekkel hasonlítjuk össze: 2. szekvencia (23. számú szekvencia), M5 (A28616, M6 (A26297) és M24 (A28549); 3. szekvencia (24. számú szekvencia), ennX (STREENX), 4. szekvencia (25. számú szekvencia), S00128, STRPROTG és A26314; 5. szekvencia (26. számú szekvencia), spg (A24496); 6. szekvencia (27. számú szekvencia) arp4 (S05568) és emm49 (STRM49NX, STRMM24); és 7. szekvencia (28. számú

HU 220 198 Β szekvencia), emml2 (STR12M), M5, M6, M24, emml2, emm49 és ennX (valamennyi M protein); arp4 a Streptococcus A csoport kötőproteinje. Az S00128, STRPROTG, spg, és A26314 a Streptococcus G csoport IgG-kötő proteinjei. A 8. szekvencia (29. számú szekvencia) a béta-antigén membránkihorgonyzó szakaszát ábrázolja, melyből hiányzik a PPFFXXAA (1. számú szekvencia) motívum. A kiemelt területek közé tartoznak a bekeretezett LPXTGE (2. számú szekvencia) motívum előtt álló lizin- (K) gyökök, a hidrofób régió (aláhúzva) a PPFFXXAA (1. számú szekvencia) konszenzus szekvenciával (aláhúzva és bekeretezve) együtt, és az aszparaginsav (D) vagy aszparagin (N) terminális aminosav.

A 8. ábrán a bca klónozott és eredeti géntermékeit mutatjuk be. A B csoportba tartozó Streptococcus A909 törzsének felületi proteinjeit (la/C típus) és a pJMS23-l C protein alfa-antigén kiónt SDS-PAGE és Westem-blot módszerrel analizáltuk, s próbaként az alfa-antigén-specifikus 4G8 monoklonális antigént alkalmaztuk. A nyilak a proteinek közötti különbség példáját mutatják. A molekulatömeg-markereket (kDaban) a jobb oldalon tüntetjük fel.

A 9. ábrán a bca nyitott leolvasási keretének sematikus rajzát mutatjuk be. A C protein alfa-antigén nyitott leolvasási kerete szerkezeti sajátosságainak összefoglalása a bca nukleotidszekvenciából levezetett aminosavszekvencia-analízisen alapul. A téglalapok feletti számok a nukleotid helyét, az alsó számok pedig az érett protein aminosavgyökeinek nyitott leolvasási kereten belüli elhelyezkedését jelzik.

Jelentőség és klinikai távlatok

A B csoportba tartozó Streptococcusők elleni vakcinával végzett anyai immunmegelőzésről feltételezték, hogy az antitestek szülés alatti átvitelével hatásos út lehet a fertőzés elleni védelemben mind az anyában, mind a fiatal csecsemőben [Baker C. J. és munkatársai, New Eng. J. Med. (szerkesztői), 374(26), 1702-1704, 1986; Baker, C. J. és munkatársai, New Engl. J. Med., 319, 1180, 1988; Baker, C. J. és munkatársai, J. Infect. Dis., 7, 458, 1985]. Más, tokos baktériumokhoz hasonlóan a fertőzésre való hajlam a típusspecifikus antitestek hiányával áll összefiiggésben (Kasper, D. L. és munkatársai, J. Clin. Invest., 72, 260-269,1983; Kasper, D. L. és munkatársai, Antibiot. Chemother., 35, 90-100, 1985). A fagocitózis elősegítésében aktív, Streptococcus B csoport elleni típusspecifikus antitok antitestek hiánya a Streptococcus B csoport megtelepedését követő betegség kifejlődésének rizikófaktorát képezi (Kasper, D. L. és munkatársai, J. Infec. Dis., 153, 407-415,1986).

Az egyik megközelítés a tisztított tokpoliszacharidokkal végzett vakcinálás. Az ilyen vakcinák előállítási eljárásai, és az ilyen vakcinák Streptococcus B csoport elleni immunizáláshoz való alkalmazását Kasper, D. L. (4 207 414 számú egyesült államokbeli szabadalom, és RE31672 számú egyesült államokbeli újra kiadott szabadalom, valamint a 4 324 887, 4 356 263, 4 367 221,4 367 222 és 4 367 223 számú egyesült államokbeli szabadalom), Carlo, D. J. (4 413 057 számú egyesült államokbeli szabadalom és 38265 számú európai közrebocsátási irat) és Yavordios, D. és munkatársai (71515 számú európai közrebocsátási irat) írtak le, melyek mindegyikét hivatkozásul említjük.

Annak ellenére, hogy a Streptococcus B csoport poliszacharidtokját részletesen jellemezték, és kimutatták, hogy mind a virulenciában, mind az immunitásban szerepet játszanak (Kasper, D. L. és munkatársai, J. Infec. Dis., 153, 407-415,1986), ezekről a tokkomponensekről azt állapították meg, hogy immunogenitásuk a specifikus toktípustól és a gazda immunrendszerétől függően változik (Baker, C. J. és munkatársai, J. Infect. Dis., 7, 458-467,1985). A Streptococcus B csoport tokpoliszacharid vakcináját értékelő, utóbbi időben elvégzett klinikai kísérlet 63%-os általános reagálási arányt mutatott ki, s az jelezte, hogy az ilyen vakcina nem optimális immunogenitású (Baker, C. J. és munkatársai, New Eng. J. Med., 319(18), 1180-1185,1988).

Az immunogenitás különbségeit más baktériumok tokpoliszacharidjai esetében is megfigyelték. A C típusú meningococcus tok elleni vakcina például igen aktív, míg a B csoportos meningococcus poliszacharid vakcina nem immunogén (Kasper, D. L. és munkatársai, J. Infec. Dis., 753, 407-415, 1986). A gazda immunrendszerének T-sejttől független funkciói gyakran szükségesek a poliszacharidantigének elleni antitestreakció fokozásához. A poliszacharidantigének elleni, T-sejttől független reakció hiánya felelős lehet a Streptococcus B csoport elleni antitestek anyában jelen lévő alacsony szintjéért, melynek eredményeként ezen anyák gyermekeiben Streptococcus B csoport által okozott fertőzés alakul ki. A 18-24 hónaposnál fiatalabb gyermekekben ráadásul gyengén fejlett a T-sejttől független antigének elleni immunreakció.

Virulencia és immunitás determinánsok a Streptococcus B csoportban

A Streptococcus B csoportnak öt szerotípusa van, melyek közös, csoportspecifikus poliszacharidantigénnel rendelkeznek. A csoport antigén antitestje azonban állatmodellekben nem védő hatású. Lancefield a Streptococcus B csoportot precipitintechnikák alkalmazásával eredetileg négy szerotípusra osztotta (I.a, I.b, II. és

III.). Később valamennyi szerotípus esetében meghatározták az egyedi, típusspecifikus tokpoliszacharidok összetételét és szerkezetét (Jennings, H. J. és munkatársai, Biochem., 22, 1258-1264, 1983; Kasper, D. L. és munkatársai, J. Infec. Dis., 753, 407-415, 1986; Wessels, M. R. és munkatársai, Trans. Assoc. Amer. Phys., 98, 384-391,1985). Wilkinson a valamennyi, Lb szerotípusú törzsön, és néhány La típusú kapszulával rendelkező törzsön jelen lévő protein antigén (melyet eredetileg Ibc proteinnek neveztek) azonosítása alapján meghatározott egy ötödik szerotípust, az Ic-t (Wilkinson, H. W. és munkatársai, J. Bacteriol., 97, 629-634, 1969), Wilkinson, H. W. és munkatársai, Infec. and Immun., 4, 596-604, 1971). Erről a proteinről később azt találták, hogy gyakorisága a különböző Streptococcus B csoport szerotipusokban változó, az la szerotípusból azonban hiányzik (Johnson, D. R. és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 19, 506-510,1984).

A fenti nevezéktant az utóbbi időben megváltoztatták annak érdekében, hogy a Streptococcus B csoport

HU 220 198 Β szerotípusait kizárólag típusspecifikus tokpoliszacharidjaik alapján osztályozhassák, és leírtak egy ötödik toktípust is (IV. típus) (Pritchard, D. G. és munkatársai, Rév. Infec. Dis., 70(8), 5367-5371, 1988). Ennek megfelelően, a Streptococcus B csoport törzseinek tipizálása a továbbiakban nem az antigén hatású Ibc proteinen (melyet most C proteinnek neveznek) alapul. Az Ic típusú törzset tokpoliszacharid összetétele és azon további információ alapján, hogy C proteint is hordoz, la szerotípusba sorolták át.

Immunológiai, járványtani és genetikai adatok azt sugallják, hogy a típusspecifikus tok fontos szerepet játszik a Streptococcus B csoport elleni immunitásban. A típusspecifikus tokpoliszacharidok összetétele és szerkezete, valamint a virulenciában és az immunitásban betöltött szerepe intenzív vizsgálatok tárgyát képezték (Ferrieri, P. és munkatársai, Infec. Immun., 27, 1023-1032, 1980; Krause, R. M. és munkatársai, J. Exp. Med., 142, 165-179,1975; Levy, N. J. és munkatársai, J. Infec. Dis., 149, 851-860, 1984; Wagner, B. és munkatársai, J. Gén. Microbiol., 118, 95-105,1980; Wessels, M. R. és munkatársai, Trans. Assoc. Amer. Phys., 98, 384-391,1985.

A típusspecifikus és Streptococcus B csoport poliszacharidok sejtfelületi elrendeződését a típusspecifikus poliszacharidokon belüli, immunológiailag fontos determinánsokat és a Streptococcus B csoport tok által meghatározott virulenciáját illetően különböző nézetek alakultak ki (Kasper, D. L. és munkatársai, J. Infec. Dis., 753, 407-415, 1986). A tok virulenciában betöltött szerepének vizsgálata érdekében Rubens és munkatársai transzpozon mutagenezist alkalmaztak, hogy III. típusba tartozó Streptococcus B csoport izogén törzset hozzanak létre, amely tok nélküli (Rubens C. E. és munkatársai Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7208-7212, 1987). Kimutatták, hogy a tok expressziójának megszűnése újszülöttpatkány-modellben a virulencia jelentős csökkenését eredményezi. A hasonló tok összetételű klinikai izolátumok virulenciája azonban széles skálán változik. Ez azt sugallja, hogy a Streptococcus B csoport patogenezisében a tokon kívül más bakteriális virulenciafaktorok is szerepet játszanak.

A Streptococcus B csoportban számos proteint és egyéb bakteriális terméket leírtak, melyek virulenciában és immunitásban betöltött szerepét nem állapították meg; ilyenek a CAMP- (Christine Atkins-Much Peterson) faktor, pigment (feltehetően karotinoid), R antigén, X antigén, antifagocita faktorok, és a kevéssé meghatározott „tüdőtoxinok” (Ferrieri, P. és munkatársai, J. Exp. Med., 757, 56-68, 1980; Ferrieri, P. és munkatársai, Rév. Inf. Dis., 70(2), 1004-1071, 1988; Hill, H. R. és munkatársai, Sexually Transmitted Diseases, McGraw-Hill, pp. 397-407). A C proteineket a későbbiekben tárgyaljuk.

A Streptococcus B csoport hemolizin nélküli izogén törzsei az újszülöttpatkány-modellben nem mutatták a virulencia csökkenését (Weiser, J. N. és munkatársai, Infec. and Immun., 55, 2314-2316,1987). A hemolizin és a neuraminidáz nincs mindig jelen a fertőzéssel kapcsolatos klinikai izolátumokban. A CAMP-faktor a

Streptococcus B csoport 23500 Da molekulatömegű extracelluláris proteinje, amely Staphylococcus béta-toxin (egy szfingomielináz) jelenlétében a vörösvértestmembránok lízisét eredményezi. A Streptococcus B csoportban a CAMP-faktor génjét az utóbbi időben klónozták, és E. coliban expresszálták (Schneewind, O. és munkatársai, Infec. and Immun., 56, 2174-2179, 1988). A CAMP-faktor, az X és R antigén és más faktorok Streptococcus B csoport patogenezisében betöltött szerepéről (ha van egyáltalán) korábban nem számoltak be (Fehrenbach, F. J. és munkatársai, Bacterial Protein Toxins, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1988; Hill, H. R. és munkatársai, Sexually Transmitted Diseases, McGraw-Hill, N. Y. pp. 397-407,1984).

A C protein(ek) a Streptococcus B csoport sejtfelületen asszociált protein antigénjeinek csoportját képezek), melyet eredetileg Wilkinson és munkatársai vontak ki Streptococcus B csoportból (Wilkinson, H. W. és munkatársai, J. Bacteriol., 97, 629-634, 1969; Wilkinson, H. W. és munkatársai, Infec. and Immun., 4, 596-604,1971). A sejtfal extrahálásához forró sósavat, a protein antigének kicsapásához pedig triklór-ecetsavat (TCA) használtak. A C proteinek antigén tulajdonságokban eltérő két populációját írták le; (1) a pepszines lebontásra érzékeny, tripszines lebontásra azonban nem érzékeny proteinek csoportja, melyet tripszinrezisztensnek (TR) vagy alfának neveznek, és (2) a Streptococcus B csoport pepszines és tripszines lebontásra egyaránt érzékeny proteinjeinek csoportja, melyet tripszinszenzitívnek (TS) vagy bétának neveznek (Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 87, 51-54, 1979; Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 89, 205-209, 1981; Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 97, 231-234,1983; Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 93, 113-119, 1985; Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 93,121-124,1985; Johnson, D. R. és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 79, 506-510, 1984; Russel-Jones, G. J. és munkatársai, J. Exp. Med., 160, 1476-1484, 1984).

1975-ben Lancefield és munkatársai nyulakban termelődött antiszérum alkalmazásával egér-védelmivizsgálatokat végeztek, hogy funkcionálisan határozzák meg a hasonló protein antigéneket hordozó Streptococcus B csoport elleni védőimmunitást biztosító képességüket (Lancefield, R. C. és munkatársai, J. Exp. Med. J., 142, 165-179,1975). A Streptococcus B csoportban hidrogén-klorid vagy detergens alkalmazásával végzett kémiai extrakcióval a sejtfalból számos kutató nyert C proteinnek nevezett nyers, antigén hatású proteinkészítményeket (Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 89, 205-209, 1981; Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 93,113-119,1985; Russel-Jones, G. J. és munkatársai, J. Exp. Med., 160, 1476-1484, 1984; Valtonen, M. V. és munkatársai, Microb. Path., 7, 191-204, 1986; Wilkinson, H. W. és munkatársai, Infec. and Immun., 4, 596-604, 1971). Ezen antigének közölt mérete 10 és 190 kDa között változik, s egyedüli proteinfajtát nem

HU 220 198 Β izoláltak, illetve nem karakterizáltak (Ferrieri, P. és munkatársai, Rév. Inf. Dis., /0(2), 1004-1071, 1988).

A védő hatású antiszérum screenelésével a Streptococcus B csoport klinikai izolátumaiban a C proteinek körülbelül 60%-os arányban mutathatók ki, s valamennyi szerotípusban (ha különböző gyakorisággal is) megtalálhatók (Johnson, D. R. és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 19, 506-510, 1984). Az egyes Streptococcus B csoport izolátumokban előfordulhat mind a TR, mind a TS antigén vagy csak az egyik, vagy egyik sem. A részlegesen tisztított antigének védő hatású immunitást kiváltó képességének kivételével ezen antigének patogenezisben betöltött szerepét in vitro nem vizsgálták. A C proteineket hordozó B csoportos Streptococcus törzsekkel végzett in vivő vizsgálatok némi bizonyítékot nyújtanak arra, hogy a C proteinek felelősek lehetnek az opszonifikálás (fagocitózis előkészítése) elleni rezisztenciáért (Payne, N. R. és munkatársai, J. Infec. Dis., 672-681,1985), és hogy a C proteinek gátolhatják a B csoportba tartozó Streptococcus fagocitózist követő intracelluláris pusztulását (Payne, N. R. és munkatársai, Infect. and Immun., 55, 1243-1251,1987). Kimutatták, hogy a Streptococcus B csoport C proteint hordozó, II. típusú törzse az újszülött patkány vérfertőzés modellben virulensebb (Ferrieri, P. és munkatársai, Infect. Immun., 27, 1-23-1032, 1980; Ferreiri, P. és munkatársai, Rév. Inf. Dis., /0(2), 1004-1071, 1988). Mivel a C proteinekről genetikai adatok nem állnak rendelkezésre, a C proteineket nem tartalmazó izogén törzseket korábban nem vizsgálták. Bizonyított, hogy a TS vagy béta-C proteinek egyike kötődik az IgA-hoz (Russel-Jones, G. J. és munkatársai, J. Exp. Med., 160, 1476-1484,1984). Az IgA C proteinek által történő kötésének virulenciában betöltött szerepét azonban (ha van egyáltalán), nem közölték.

1986-ban Valtonen és munkatársai tenyészet-felülúszókból Streptococcus B csoport proteineket izoláltak, melyek egérmodellben védelmet biztosítanak (Valtonen, Μ. V. és munkatársai, Microb. Path., /, 191-204, 1986). 14 000 Da molekulatömegű, tripszinrezisztens Streptococcus B csoport proteint azonosítottak és tisztítottak részlegesen. E protein ellen nyulakban termelt antiszérum védte az egereket az Ib típusú Streptococcus B csoporttal végzett fertőzéssel szemben (89%-os védelem). Ez a protein - Lancefield meghatározása szerint - C protein. Ha azonban e protein ellen termelt antiszérumot használták a Streptococcus B csoport antigének extraktumainak immunprecipitálásához, számos nagyobb molekulatömegű proteint találtak aktívnak. Ez azt sugallja, hogy a 14 000 Da molekulatömegű protein több Streptococcus B csoport protein közös epitópját képviselheti, vagy hogy ez a protein a Streptococcus B csoport tenyészetek felülúszóiban található bomlástermék. A baktériumsejtekból és a felülúszókból izolált C proteinek méretbeli megoszlása azt sugallja, hogy a C proteinek egy géncsaládot képviselnek, és az antigéndiverzitást az immunrendszerrel szembeni védelem mechanizmusaként tartják fenn.

A közölt molekulatömeg-tartomány és az egyes C proteinek tisztítása során adódó nehézségek hasonlóak azokhoz a problémákhoz, melyekkel sok kutató a Streptococcus A csoport M proteinjeinek izolálásakor került szembe (Dalé, J. B. és munkatársai, Infec. and Immun., 46(1); 267-269, 1984; Fischetti, V. A. és munkatársai, J. Exp. Med., 144, 32-53, 1976; Fischetti, V. A. és munkatársai, J. Exp. Med., 146, 1108-1123,1977). Az M protein génjét az utóbbi időben klónozták és szekvenálták, s azt találták, hogy számos ismétlődő DNSszekvenciát tartalmaz (Hollingshead, S. K. és munkatársai, J. Bioi. Chem., 261, 1677-1686, 1986; Scott, J. R. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1822-1826, 1986; Scott, J. R. és munkatársai, Infec. and Immun., 52, 609-612, 1986). Ezek az ismétlődő szekvenciák lehetnek felelősek a poszttranszkripciós folyamatokért, melyek a termelődött M proteinek méretének sokféleségét okozzák. E folyamat mechanizmusa nem tisztázott. A Streptococcus B csoport C proteinjeivel kapcsolatban leírt molakulatömeg-tartomány hasonló folyamat eredménye lehet.

A Bevangertől kapott, Streptococcus B csoport elleni két antiszérumkészítmény (alfa és béta) alkalmazásával Cleat és munkatársai C proteineket próbáltak klónozni, hogy E. coliban Streptococcus B csoport DNSkönyvtárat screeneljenek (Bevanger, L. és munkatársai., Acta Path. Microbiol. Immunoi. Scand. Sect. B., 93, 113-119, 1985; Cleat, P. H. és munkatársai, Infec. and Immun., 55(5), 1151-1155, 1987; melyeket hivatkozásul említünk). E kutatók két olyan kiónt írtak le, melyek antistreptococcus antitestekhez kötődő proteineket termelnek, azonban nem sikerült meghatározniuk, hogy a klónozott proteinek valamelyike képes-e védő hatású antitestek termelődésének kiváltására, vagy hogy ezen gének előfordulása összefüggésben áll-e azokkal a B csoportba tartozó Streptococcus törzsekkel, melyekről ismert, hogy hordozzák a C proteineket. A klónozott génszekvenciák Streptococcus B csoport virulenciájában betöltött szerepét nem vizsgálták. Mivel a C proteineket védő hatású antitestek termelődésének kiváltása alapján definiálják, e munkával nem sikerült bizonyítékot szolgáltatni arra, hogy a kiónok valamelyike C proteint kódolna.

A találmány szerinti konjugált vakcina

Találmányunkban egy olyan konjugált vakcina kifejlesztésével, melyben a tokpoliszacharidok kovalensen kötődnek egy proteingerinchez, kiküszöböljük a Streptococcus B csoport elleni korábbi vakcinák hiányosságait. Ez a megközelítés elősegíti a tokpoliszacharidantigének elleni T-sejtfüggő antitest-reakció kialakulását, és megszünteti az antitesttermelődés T-sejttől független követelményeit (Baker, C. J. és munkatársai, Rév. of Infec. Dis., 7, 458-467, 1985; Kasper, D. L. és munkatársai, J. Infec. Dis., 153, 407-415, 1986; melyeket hivatkozásul említünk).

Konjugált vakcinában egy antigén tulajdonságú anyag, mint a Streptococcus B csoport fentebb leírt tokpoliszacharidjai, kovalensen kapcsolódik egy „hordozó” proteinhez vagy polipeptidhez. Ez a kapcsolódás a konjugált molekula antigén hatásának fokozását szolgálja. A konjugált vakcinák antigén tulajdonságú molekulából és „hordozó” proteinből vagy polipeptidből tör6

HU 220 198 Β ténő előállításának módjai a tudományban ismertek (Jacob, C. O. és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 16, 1057-1062,1986; Parker, J. M. R. és munkatársai, Modem Approaches to Vaccines, szerkesztő: Chanock, R. M. és munkatársai, pp. 133-138, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1983; Zurawski, V. R. és munkatársai, J. Immunoi., 121, 122-129,1978; Klipstein, F. A. és munkatársai, Infect. Immun., 37, 550-557, 1982; Bessler, W. G., Immunobioi., 170, 239-244, 1985; Posnett, D. N. és munkatársai, J. Bioi. Chem., 263, 1719-1725,1988; Ghose, A. C. és munkatársai, Molec. Immunoi., 25, 223-230, 1988; melyek mindegyikét hivatkozásul említjük).

A konjugált vakcinák egy prototípusmodelljét Hemophilus influenzáé ellen fejlesztették ki (Anderson, P., Infec. and Immun., 39, 223-238, 1983; Chu, C. és munkatársai, Infect. Immun., 40, 245-256, 1983; Lepow, M., Pediat. Infect. Dis. J., 6, 804-807, 1987; melyeket hivatkozásul említünk), és ez a modell alkalmazható a találmányunk szerinti új vakcina előállításához is. Az ilyen konjugált vakcinák előállításának további eljárásait Anderson, P. W. és munkatársai, (245 045 számú európai közrebocsátási irat), Anderson P. W. és munkatársai (4 673 574 és 4 671 283 számú egyesült államokbeli szabadalom), Frank, R. és munkatársai. (4 789 735 számú egyesült államokbeli szabadalom; 206852 számú európai közrebocsátási irat), Gordon L.

K. (4 619 828 számú egyesült államokbeli szabadalom) és Beachey, Ε. H. (4 289 537 számú egyesült államokbeli szabadalom) írtak le (mely leírások mindegyikét hivatkozásul említjük).

A konjugált vakcinák (mint a Hemophilus influenzáé vakcina) proteingerincéhez olyan proteineket alkalmaztak, amelyek nem rendelkeznek olyan antigén tulajdonságokkal, mint a célorganizmus, melyből a baktérium-tokpoliszacharidot nyerték (Ward, J. és munkatársai, Vaccines, szerkesztő: Plotkin, S. A., Saunders, Philadelphia, 300. oldal, 1988).

Ezzel szemben a találmányunk szerinti konjugált vakcinában proteingerincként a Streptococcus B csoport immunogén proteinjeit alkalmazzuk. Az ilyen megközelítésről azt tartják, hogy hatásosabb vakcinákat eredményez [Insel, R. A. és munkatársai, New Eng. J. Med., (szerkesztői), 379(18), 1219-1220, 1988]. A találmány szerinti konjugált proteinpoliszacharid vakcina az első, mellyel specifikusan karakterizáljuk a konjugált vakcinához alkalmazható Streptococcus B csoport proteineket. A találmány szerinti konjugált vakcinákban proteinként bármely olyan protein alkalmazható, amely a Streptococcus B csoportra jellemző, azonban e célra előnyben részesített a Streptococcus B csoport C proteinjének alkalmazása. Amint azt az alábbiakban részletesebben leírjuk, a pJMSl és pJMS23 plazmid Streptococcus C proteint kódoló DNS-t tartalmaz. A leginkább előnyben részesített C proteinek azok, amelyek az ilyen DNS baktériumban történő expresszálásával állíthatók elő.

Amint fentebb jeleztük, a találmány tárgya a Streptococcus B csoport védő hatású protein antigénjeit kódoló gének klónozása és expresszálása. Az ilyen proteinek előnyösen proteingerincként alkalmazhatók, melyhez a Streptococcus B csoport egy vagy több poliszacharidja konjugálható annak érdekében, hogy ezen baktériumok ellen konjugált vakcinát hozzunk létre. Más lehetőség szerint a találmányban leírt egy vagy több protein kapcsolható a Streptococcus B csoport egy poliszacharidjához.

Ezen proteinek Streptococcus B csoport virulenciájában és immunitásában betöltött szerepe a Streptococcus B csoport fertőzés elleni újabb gyógykezeléskifejlesztéshez használható fel. A baktérium eredetű gének izolálása és karakterizálása lehetővé teszi a géntermékek oly módon való manipulálását, hogy a konjugált vakcina polipeptidgerincének (hordozójának) adjuváns és antigén tulajdonságait egyaránt optimálissá tegyük.

A Cproteinek genetikai vizsgálatai

A találmány ilyenformán a Streptococcus B csoport C proteinjei kódoló gének klónozására, e proteinek virulenciában és immunitásban betöltött szerepére, valamint azon képességükre vonatkozik, hogy immunogénként szolgálnak a Streptococcus B csoport elleni konjugált vakcinához.

Annak ellenére, hogy a Streptococcusok sok csoportjában végzett klónozásról nagy mennyiségű irodalmi adat áll rendelkezésre, a Streptococcus B csoportban csak korlátozott mennyiségű genetikai manipulációt végeztek (Macrina, F. L., Ann. Rév. Microbiol., 38, 193-219,1984; Wanger, A. R. és munkatársai, Infec. and Immun., 55, 1170-1175, 1987). A Streptococcus B csoportban a legszélesebb körben alkalmazott technika a Tn916 kifejlesztése és transzpozonmutagenezisben való alkalmazása volt (Rubens, C. E. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7208-7212, 1987; Wanger, A. R. és munkatársai, Rés. Vet. Sci., 38, 202-208, 1985). Mivel azonban úgy tűnik, hogy a C proteinekhez egynél több gén létezik, és hogy a védő anti szérum több proteinhez kötődik, a C proteingénekre transzpozonmutagenezissel végzett screenelés nem praktikus.

A találmány tárgya a C proteineket (és a Streptococcus B csoport virulenciájában szerepet játszó, vagy a Streptococcus B csoport elleni gazdaimmunitást befolyásoló bármely más proteint) kódoló gén klónozása új plazmidvektor alkalmazásával. E célból kívánatos olyan új klónozóvektor alkalmazása, amely a Streptococcus B csoport ellen természetesen termelődő antitestekhez kötődő proteinek expressziójára gyorsan screenelhető. Mivel az ilyen antitestek heterológ poliklonális, és nem monoklonális antitestek, olyan vektor alkalmazására volt szükség, amely az adott gének azonosításához sok pozitív kiónon keresztül könnyen screenelhető.

A kiónok specifikus antiszérumhoz kötődő antigének expresszálására történő screenelésére számos technika áll rendelkezésre (Aruffo, A. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8573-8577,1987). A legszélesebb körben alkalmazott rendszert, a lambda-gtl 1-et Young és Davis fejlesztette ki (Huynh. T. V. és munkatársai, DNA Cloning, A Practical Approach, 1. kötet (szerző: Glover, D. M.), IRL Press, Washington,

HU 220 198 Β

49-78. oldal, 1985; Wong, W. W. és munkatársai, J. Immunoi. Methods, 82, 303-313, 1985; melyeket hivatkozásul említünk). Ez a technika lehetővé teszi a lizogén fágokban (melyek termékei fág lízissel szabadulnak fel) expresszálódott kiónok gyors screenelését. Az e rendszerrel általánosan felmerülő problémák közé tartozik, hogy a részletes endonukleázos restrikciós térképezéshez, a próbák készítéséhez és a DNS-szekvenáláshoz a DNS-fragmensek plazmidvektorokba történő szubklónozására van szükség. Ráadásul a DNS fágtörzsekből való előállítása fáradságos, és ez korlátozza a hatékonyan tanulmányozható, potenciálisan pozitív kiónok számát. Végül, a nyers proteinkivonatok fág vektorgazdákban klónozott génekből való előállítása nehézségekbe ütközik.

A fenti problémák leküzdéséhez találmányunkban olyan plazmidvektort írunk le, amelyet a klónozott baktérium kromoszomális DNS-virulenciában és/vagy immunitásban szerepet játszó proteinek expresszálására végzett screeneléséhez fejlesztettünk ki. Ilyenformán a találmány további tárgya hatékony klónozóvektor kifejlesztése és alkalmazása, amely a Streptococcus B csoport ellen természetesen kiváltott antitestekhez kötődő proteinek expresszálására gyorsan screenelhető. A vektort az általánosan alkalmazott pUC12 plazmidklónozóvektor (Messing, J. és munkatársai, Gene, 19, 269-276, 1982; Norrander, J. és munkatársai, Gene, 26, 101-106, 1983; Vieira; J. és munkatársai, Gene, 19, 259-268, 1982; melyeket hivatkozásul említünk) módosításával készítettük. A találmány tárgya az alábbiakban leírt vektor és funkcionális megfelelői.

E rendszer alkalmazásával a plazmidklónok könynyen manipulálhatók, restrikciós endonukleázokkal térképezhetők, és DNS-inszert szekvenciái, próbái készíthetők, valamint a géntermékek vizsgálhatók anélkül, hogy szubklónozásra lenne szükség. A pUC12 2,73 kbos, nagy példányszámú plazmid, amely ColEl replikációs kezdőhelyet, ampicillinrezisztenciát és a lacZ génben egy polilinkert hordoz (Ausubel, F. M. és munkatársai, Current Topics in Molecular Biology, Greene Publ. Assn./Wiley Interscience, NY, 1987; melyet hivatkozásul említünk).

A pUC12 polilinkerében számos módosítást végeztek (Aruffo, A. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8573-8577,1987; melyet itt hivatkozásul említünk). A pUC12 változtatásának általános terve az volt, hogy a polilinkert azonos, de nem ragadós BstXI helyek jelenlétével módosítsuk, hogy a lineáris gazdaplazmid könnyű elkülönítése érdekében „töltelék” fragmenst adjunk hozzá, és hogy a lac promotérből kiinduló expressziót mindhárom transzlációs leolvasási keretben biztosítsuk.

Annak érdekében, hogy az idegen DNS inszerciójához hatékonyan helyet biztosítsunk, és hogy a plazmid önligálódásának lehetőségét minimálisra csökkentsük, a polilinkerhez invertált, nem ragadós BstXI végeket adtunk. Amint az 1. ábrán látható, a pUC12-t először BamHl-gyel hasítottuk (1. lépés), és a plazmidot két, részlegesen komplementer szintetikus oligonukleotid adapterral, egy 15-merrel (GATCCATTGTGCTGG) (3. számú szekvencia), és egy 11-merrel (GTAACACGACC) (4. számú szekvencia) kevertük össze (2. lépés). Mikor az adapterokat a pUC12 plazmidba ligáltuk, két új Bstl helyet alakítottunk ki, de az eredeti BamHI helyeket is megtartottuk (3. lépés). A plazmidot ezután polinukleotidkinázzal kezeltük és ligáltuk, hogy zárt, cirkuláris plazmidot alakítsunk ki (4. lépés). Ha ezt a plazmidot BstXI enzimmel kezeljük, a kialakuló végek azonosak, és nem ragadósak (mindkettő GTGT túlnyúló szállal rendelkezik) (5. lépés).

A polilinker második módosítását annak érdekében végeztük, hogy lehetővé tegyük a lineáris plazmid klónozáshoz való tisztítását anélkül, hogy önligálódásra képes, részlegesen vágott plazmidszennyezés lenne jelen. A pCDM plazmidból tompa végű, 365 bázisbár (bp) hosszú FnuD2 fragmenst nyertünk. Ezt a kazettát vagy „töltelék” fragmenst, amely nem tartalmaz BstXI helyet, tompa végligálással két, részlegesen komplementer oligonukleotidhoz, egy 12-merhez (ACACGAGATTTC) (5. számú szekvencia) és egy 8-merhez (CTCTAAAG) ligáltuk (6. lépés). Az adapterokat tartalmazó, kapott fragmens 4 bp hosszú túlnyúló szálakkal rendelkezik (ACAC), amelyek komplementerek az 5. lépésben látható módosított pUC12 plazmid végeivel. A módosított pUC12 plazmidot az adapterokat tartalmazó pCDM szakaszhoz ligáltuk. A kapott konstrukciót, amit pUX12nek nevezünk, a 2. ábrán mutatjuk be. A pUX12 plazmid a pJMSl és pJMS23 plazmidból a bevitt Streptococcus DNS-szekvenciák kivágásával is előállítható, vagy más módon, a pUC12 plazmid alkalmazásával rekombináns módszerekkel (vagy homológ rekombinációval) alakítható ki.

Mivel a pUX12-t szándékozzuk expressziós vektorként alkalmazni, előnyös a polilinkert úgy tovább módosítani, hogy az a lac promoterhez mindhárom lehetséges leolvasási keretet tartalmazza. Ezek a változtatások a klónozott génfragmensek számára egyhatod gyakorisággal teszik lehetővé, hogy helyes transzlációs leolvasási keretbe kerüljenek. Például a klónozott fragmens a vektorba két orientációból egyféleképpen inszertálódhat, és a három leolvasási keret közül egyben. +1 leolvasási keret létrehozásához a pUX12 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel vágtuk, amely a polilinkert egy helyen hasítja. Az egyszálú 5’ ragadós végeket a T4 DNSpolimeráz 5’-3’ polimerázaktivitásának kihasználásával feltöltöttük, és a két tompa véget ligáltuk. Ez az EcoRI hely megszűnését, és egy új Xmnl hely kialakulását eredményezte (3/A. ábra). E konstrukciót a polilinkerben az EcoRI hely megszűnésének, és az új Xmnl hely jelenlétének bizonyításával igazoltuk. Ezenkívül a + 1 módosított pUX12 plazmiddal, standard szekvenáló primerek alkalmazásával kétszálú DNS-szekvenálást végeztünk (Ausubel, F. M. és munkatársai, Current Topics in Molecular Biology; Greene Publ. Assn./Wiley Interscience, NY, 1987). A DNS-szekvenálás kimutatta a 4 bázispár polilinkerhez való hozzáadását, és igazolta a pUX12 +1 leolvasási keretté történő módosítását. Ezt a plazmidot pUX12 + 1-nek nevezzük.

-1 leolvasási keret létrehozása érdekében a pUX12 vektort SacI restrikciós enzimmel vágtuk, amely a

HU 220 198 Β pUX12 polilinkerét egy helyen hasítja. Az egyszálú 3’ ragadós végeket a T4 polimeráz 3’-5’ aktivitásának kihasználásával tompa végűvé vágtuk vissza, s a kialakult tompa végeket ligáltuk. A kapott szekvenciából a SacI helynek hiányoznia kellene, miközben új FnuD2 helynek kellene kialakulni (3/B ábra). A pUX12-l plazmidok restrikciós térképezése azonban azt mutatta, hogy bár a SacI hely hiányzott, FnuD2 hely nem volt jelen. Ráadásul a polilinker Smal/Xmal helyei sem voltak már jelen. Minipreparatív, kétszálú DNS-ből több lehetséges pUX12-l konstrukciót szekvenáltunk. A hat módosított plazmid közül egyet találtunk, melyből 10 nukleotid hiányzott, létrehozva ezáltal egy -1 leolvasási keretet (3/C. ábra). Ez azt sugallja, hogy a T4 DNS-polimeráz további exonukleázaktivitással is rendelkezik, és a polilinker további kétszálú szakaszait is visszavágja (visszaemészti). Mindazonáltal a kapott plazmid -1 leolvasási kerettel rendelkezett. A plazmidot pUX12-lnek neveztük el.

A pUX12 vektorok Streptococcus B csoport antigén tulajdonságú proteinjeit kódoló gének klónozásában való alkalmazását az alábbi példákban írjuk le részletesen. Röviden: a Streptococcus B csoportból származó DNS-t vagy azzal komplementer DNS-t pUX12, pUX12+l vagy pUX12-l vektorba vittünk be, és azokat Escherichia coliba transzformáltuk. A klónozott DNS-t E. coliban expresszáltuk, és a celluláris lizátumot arra teszteltük, hogy tartalmaz-e a Streptococcus B csoport elleni antiszérumhoz kötődni képes proteint.

A pUX12 számos potenciális jelentőségű módosítása létezik, melyek fokozhatják alkalmazhatóságát. Például a lac promoter másik promoterrel helyettesíthető, a replikációs kezdőhely úgy módosítható, hogy alacsonyabb példányszámú vektor termelődjön, és az antibiotikum-rezisztencia marker megváltoztatható.

A találmány szerinti alfa-antigénszármazékokat gazdasejtben kódoló génszekvenciák biztosításához bármely olyan vektor alkalmazható, amely képes a kívánt genetikai információt a kívánt gazdasejtbe juttatni. Például a plazmidokon kívül az ilyen vektorok közé tartoznak a lineáris DNS-ek, kozmidok, transzpozonok és fágok.

A gazdasejt nem korlátozódik az E. colira. Gazdasejtként bármely olyan baktérium vagy élesztő (mint például S. cerevisiae) gazda alkalmazható, amely képes a találmány szerinti származékok expresszálására. Például a B. subtilis és a Streptococcus B csoport alkalmazható gazdaként. A klónozás, és a kiónok említett gazdákba történő bevitelének módszerei ismertek. Például Gram-pozitív gazdák esetében a tenyésztési módszerek, genetikai analízis plazmidok, génklónozási technikák, a mutagenezishez és génfüziók kialakításához transzpozonok, fágok és integrációs vektorok alkalmazása, és a génexpresszió mérésének leírását illetően lásd Harwood, C. R. és munkatársai, (szerkesztők), „Molecular Biological Methods fór Bacillus”, Wiley-Interscience, New York (1991). Az alkalmas gazdák a törzsközpontokból szerezhetők be, mint az American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA) és a Bacillus Genetic Stock Center (Ohio State Univ., Columbus, OH, USA).

A találmány tárgya olyan vakcina, amely a Streptococcus B csoportra jellemző proteinhez konjugált, Streptococcus B csoportra jellemző poliszacharidot (mint például tokpoliszacharid) tartalmaz. Az ilyen konjugált vakcina „poliszacharid”-ja vagy „protein”-je azonos lehet a Streptococcus B csoportra jellemző molekulával, vagy az ilyen molekulák funkcionális származéka lehet.

A találmány céljaihoz Streptococcus B csoport poliszacharidként bármilyen B csoportspecifikus vagy típusspecifikus poliszacharid alkalmas. E proteinekként lehetőleg olyanokat alkalmazunk, amelyek emlősnek (állatnak vagy embernek) adva olyan antitestek termelődését váltják ki, melyek képesek a Streptococcus B csoporttal reagálni. A találmány szerinti, előnyben részesített poliszacharidok példái közé tartoznak a Streptococcus B csoport tokpoliszacharidjai, illetve azok egyenértékű megfelelői. A találmány céljaihoz bármely protein alkalmazható, amely emlősbe (állatba vagy emberbe) juttatva a Streptococcus B csoport által expreszszált proteinnel reagálni képes antitestek termelődését váltja ki, vagy amely a Streptococcus B csoport poliszacharidja elleni antitestek termelődésének kiváltásához fokozza a poliszacharid immunogenitását. A találmány szerinti előnyben részesített proteinek közé tartoznak a Streptococcus B csoport C proteinjei, valamint azok egyenértékű megfelelői.

A peptid antigének funkcionális származékainak példái közé természetes proteinszakaszai tartoznak, mint a Streptococcus B csoport C protein alfa-antigénjének Nterminális, C-terminális vagy belső szekvenciaszakaszai, melyek rendelkeznek a Streptococcus B csoport elleni védőantitestek termelődését kiváltó képességgel. A „funkcionális származékok” kifejezés magában foglalja a természetes protein változatait is, azaz olyan proteineket, melyeknek aminosavszekvenciájában változások vannak jelen, de megtartják a természetes molekula immunogén, virulencia vagy antigén tulajdonságot kiváltó képességét. Ilyenek például az alfa-antigén alábbiakban felsorolt változatai, amelyek a belső ismétlődő szekvenciából kevesebbet tartalmaznak, mint az eredeti alfa-antigén, és/vagy megváltoztatott szegélyezőszekvenciával rendelkeznek.

A találmány szerinti vakcinában a poliszacharidhoz kapcsolt peptid antigén lehet az alfa-antigén eredeti aminosavszekvenciáját kódoló peptid, amit a pJMS23 plazmid kódol (a jelző peptidszekvenciával vagy a nélkül), vagy lehet az eredeti szekvencia funkcionális származéka. Az eredeti Streptococcus B csoport C protein alfaantigént kódoló pJMS23 3060 nukleotid hosszúságú nyitott leolvasási keretet tartalmaz, s 108 705 Da molekulatömegű prekurzor proteint kódol. A 41 aminosavas feltételezett jelzőszekvencia hasítása 104 106 Da molekulatömegű érett proteint eredményez. Az alfa-antigén 20 417 Da-os N-terminális régiója nem mutat homológiát a korábban leírt proteinszekvenciákkal, s kilenc tandem ismétlődő egységből álló sorozat követi, amely az érett protein maximálisan 74%-át teheti ki. Valamennyi ismétlődő egység (melyeket „R”-rel jelölünk) azonos méretű; 82 aminosavból áll, molekulatömege 8665 Da,

HU 220 198 Β és 246 nukleotid kódolja. Az ismétlődő egységek mérete megfelel a Streptococcus B csoport által természetesen expresszált alfa-C proteinek heterogén létrájában megfigyelt méretbeli eltéréseknek. Az alfa-antigén Cterminális régiója tartalmaz egy membránanchor (kihorgonyzó) doménmotívumot, amely számos Gram-pozitív felületi protein esetében megtalálható. A bca génben (Streptococcus B csoport, C protein, alfa-antigén) az azonos ismétlődő egységek nagy régiója protektív epitópokat határoz meg, s felhasználhatók a találmány szerinti vakcinákban alkalmazható, többféle alfa-antigén funkcionális származék kialakításához.

Az ilyen funkcionális alfa-antigén származék szekvenciája a 82 aminosavas (246 nukleotid) ismétlődésből előnyösen 1-9 kópiát tartalmaz, amely a 6. ábrán bemutatott DNS-szekvencia 679. nukleotidjánál kezdődik (amint itt használjuk, a 9’ ismétlődésként elnevezett részleges ismétlődés e tekintetben szintén alkalmas). A funkcionális származékból hiányozhat az 5’ szegélyezőszekvencia (555 nukleotid) által kódolt 185 aminosavas szekvencia, amely a természetes proteinben az ismétlődő szekvencia előtt található, vagy más lehetőség szerint, ez a szekvencia jelen lehet, és/vagy a származékból hiányozhat a 48 aminosavból álló (246 nukleotid által kódolt) C-terminális kihorgonyzó (anchor) szekvencia, illetve tartalmazhatja is azt. A funkcionális származék lehet az alfa-antigén ismétlődő egységei kezdőhelye előtt álló N-terminális szakasz, lehet az alfa-antigén ismétlődő egysége© után elhelyezkedő C-terminális szakasz, illetve állhat az N-terminális és C-terminális szakasz alkotta hibridből is, melyben „R” egység nem található. Ezeket a változatokat a későbbiekben mutatjuk be. A természetes alfa-antigén N-terminális szekvenciája tartalmazhatja a jelzőszekvenciát, de az hiányozhat is belőle. Az alfa-antigének N-terminális és C-terminális szekvenciája (a természetes alfa-antigén protein core-jában ismétlődő szekvenciák kópiáival együtt vagy azok nélkül) egyaránt alkalmazható a találmány szerinti konjugált vakcinákban.

Amint a leírásban használjuk, az „R” a 82 aminosavból álló ismétlődő szekvencia egy kópiáját (példányát) jelenti, amely a 6. ábrán bemutatott DNS-szekvencia 679. nukleotidjánál kezdődik; „R_x” jelentése az ismétlődés X számú tandem példánya, mely esetben az egyik R egység C-terminális végén tandem kapcsolódik a szomszédos R egység N-terminálisához; „N” az 5” szegélyezőszekvencia által kódolt aminosavszekvenciát jelenti (lásd 6. ábra), a jelzőszekvenciával vagy a nélkül - amennyiben a jelzőszekvencia hiányzik, „N” jelentése az 5” szegélyezőszekvencia által kódolt 185 aminosavból álló szekvencia, míg ha a jelzőszekvencia jelen van, „N” jelentése 226 aminosavból álló 5” szegélyezőszekvencia által kódolt szekvencia (lásd 6. ábra). „C” jelentése a 48 aminosavból álló C-terminális kihorgonyzó szekvencia, amint az a 6. ábrán látható. E megjegyzésekkel az alábbi változatok a természetes protein származékainak példáit képezik, melyek a találmány szerint alakíthatók ki.

1. R, 4.N-C 8. R₂ 12. R₃

2. N 5.N-R, 9. N-R₂ 13. N-R₃

3.C	6. R-C 7. N-RrC	10. R2-C 11. n-r2-c	14. R3-C 15. N-R3-C
16. R4	20. R5	24. Ré	28. R7
17. N-R4	21.N-R5	25. N-R6	29. N-R7
18. R4-C	22. R5-C	26. R6-C	30. R7-C
19. N-R4-C	23.N-R5-C	27. N-R6-C	31.N-R7-C
32. R8	36. R9	40. R10
33. N-R8	37. N-R9	41.N-R10
34. R8-C	38. Rg-C	42. Rl0-C
35. N-R8-C	39. N-Rc,-C	43. N-R10-C

Tíz ismétlődő R egységnél többet, például 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 vagy 20 R egységet tartalmazó szekvenciák hasonló módon készíthetők. Ráadásul az R, N vagy C szakaszai is alkalmazhatók olyan esetekben, ha az ilyen szakaszok fokozzák a származék Streptococcus B csoport elleni antitestek termelődését kiváltó funkcionális képességét, vagy ha az ilyen szakaszok valamilyen más, kívánatos tulajdonságot biztosítanak a konstrukciónak, például szekréciós jelet vagy membránlokalizációs jelet.

A Streptococcus B csoport egyéb törzseiből származó alfa-antigének hasonló módon állíthatók elő és alkalmazhatók, hiszen a protein szekvenciájának csekély módosulása (az N-terminálisban, C-terminálisban vagy az R ismétlődésben) nem változtatja meg biológiai tulajdonságait és a védő hatású antitestek termelődését kiváltó funkcionális képességét. Például egy másik Streptococcus B csoport törzsből izolált Streptococcus B csoport alfa-antigént, amely azonos ismétlődő egységet, de eltérő N-terminális aminosavszekvenciát tartalmaz, szintén a találmány területébe tartozónak tekintünk.

A találmány szerinti peptideket - akár természetes proteint, akár annak funkcionális származékát alkotják - olyan eljárással konjugáljuk egy Streptococcus B csoport szénhidrátrészhez, amely fenntartja ezen proteinek Streptococcus B csoport elleni protektív antitesteket indukáló képességét.

A vakcina heterogenitása specifikus konjugált fajták elegyítésével biztosítható. Például a vakcinakészítmény a szénhidráthoz konjugált valamelyik peptidalak egy vagy több példányát tartalmazhatja, vagy úgy állítható elő, hogy a fenti funkcionális származékok és/vagy a természetes szekvencia egynél több alakját tartalmazzák, melyek mindegyike a vakcinában alkalmazott poliszacharidhoz konjugált. Az egy bizonyos peptidet (például az 1-43. csoportban felsoroltak valamelyikét) tartalmazó konjugátumok „összetett” konjugált vakcina kialakítása érdekében bármilyen más peptidet (mint például az 1-43. csoport másik tagját) tartalmazó konjugátumokkal elegyíthetők. Multivalens (sokértékű) vakcina is előállítható oly módon, hogy a fentiek szerint előállított Bcsoport-specifikus konjugátumokat a tudományban ismert módszerek alkalmazásával más proteinekkel, mint például diftériatoxinnal vagy tetanusztoxinnal és/vagy más poliszacharidokkal keverjük.

A vakcina heterogenitása úgy is elérhető, hogy olyan Streptococcus B csoport készítményeket alkalma10

HU 220 198 Β zunk, amelyek a találmány szerinti rekombináns konstrukciókkal transzformált Streptococcus B csoport gazdákból (mellyel expresszálják az alfa-antigént vagy funkcionális származékát) származnak (különösen Streptococcus agalactiae ellen). Ilyen esetekben az ismétlődő R egységeket kódoló génszekvenciák közötti homológ rekombináció a gazdában spontán mutációt eredményez, miáltal a gazdasejt-populáció könnyen létrehozható, és a gazdasejtek a találmány szerinti vakcinákban alkalmazható alfa-antigén funkcionális származékok széles választékát expresszálják. Az említett spontán mutáció rendszerint az R egységek vagy azok részleteinek delécióját eredményezi, bár az alfa-antigén más régióinak mutációja is előfordulhat.

Amint a leírásban használjuk, egy poliszacharid vagy protein akkor Jellemző” egy baktériumra, ha az szerkezetében vagy szekvenciájában lényegében hasonló a baktériummal természetes körülmények között kapcsolatban álló molekulához. Ez a kifejezés szándékunk szerint magában foglalja az organizmusra specifikus molekulákat, valamint azokat a molekulákat, amelyek annak ellenére, hogy más organizmusokon is előfordulnak, szerepet játszanak a baktérium ember- vagy állatgazdában tapasztalható virulenciájában és antigenitásában.

A találmány szerinti vakcina a Streptococcus B csoport ellen passzív vagy aktív immunizálással egyaránt rezisztenciát biztosíthat. A passzív immunizálás egyik megvalósítási módjában a vakcinát önkéntes embernek, vagy állatnak adjuk be, s a termelődött antiszérumot összegyűjtjük, és közvetlenül a feltételezhetően Streptococcus B csoport által okozott fertőzéstől szenvedő betegnek adjuk be.

Az antitestek vagy antitestffagmensek toxinjelzésekkel való jelölésének lehetősége a Streptococcus B csoport kezelésének további módszerét biztosítja, ha a passzív immunizálás e típusát végezzük. E megvalósítási mód esetében a Streptococcus B csoport antigének felismerésére képes antitesteket vagy antitestfragmenseket a páciensnek való beadás előtt toxinmolekulákkal jelöljük. Ha az ilyen toxinnal ellátott molekula Streptococcus B csoport sejthez kötődik, a toxinrész a sejt pusztulását okozza.

Egy másik megvalósítási módban a vakcinát a terhesség vagy a szülés ideje alatt, vagy azt megelőzően adjuk be a nőnek vagy nőstény állatnak, annyi ideig és olyan mennyiségben, amely elégséges az antiszérum termelődésének biztosításához, ami védi mind az anyát, mind a magzatot vagy újszülöttet (az antitestek méhlepényen keresztül történő passzív beépülése útján).

Ennek megfelelően, a találmány tárgya eljárások Streptococcus B csoport vagy olyan organizmusok által okozott fertőzések megakadályozására vagy csökkentésére, amelyek olyan antigénekkel rendelkeznek, melyeket az antiszérum felismer, és a konjugált vakcina poliszacharidjához és/vagy proteinjéhez köt. Amint a leírásban használjuk, a vakcináról akkor mondjuk, hogy megakadályozza vagy csillapítja a betegséget, ha a páciensnek való beadása a betegség tüneteinek vagy előrehaladásának teljes vagy részleges csökkentését (azaz visszaszorítását), vagy a páciens betegséggel szembeni teljes vagy részleges immunitását eredményezi.

A vakcina (vagy az általa termelődött antiszérum) beadása történhet megelőzési (profilaktikus) vagy gyógykezelési céllal. Megelőzésszerű alkalmazás esetén a vegyülete(ke)t a Streptococcus B csoport fertőzés tüneteinek megjelenése előtt adjuk be. A vegyület(ek) megelőzés céljából való beadása a későbbi fertőzés megakadályozását vagy csökkentését szolgálja. Gyógykezelésszerű alkalmazás esetében a vegyülete(ke)t az adott fertőzés tüneteinek kimutatása után adjuk be. A vegyületek) gyógykezelésszerű beadása az adott fertőzés csökkentését szolgálja.

Ilyenformán a találmány szerinti gyulladáscsökkentő szerek a fertőzés kialakulása előtt (az előre látott fertőzés megakadályozása vagy csökkentése érdekében), valamint a tényleges fertőzés kezdete után egyaránt alkalmazhatók.

Egy készítményről akkor mondjuk, hogy „gyógyszerészetileg megfelelő”, ha beadása a kezelt páciens számára tolerálható.

Az ilyen szerről akkor mondjuk, hogy beadása „gyógyászatilag hatásos mennyiségben” történik, ha a beadott mennyiség fiziológiailag szignifikáns. A szer akkor fiziológiailag szignifikáns, ha jelenléte a páciens fiziológiai állapotában kimutatható változást eredményez.

A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy amennyiben a találmány szerinti vakcinát páciens esetében alkalmazzuk, azt sókat, puffereket, adjuvánsokat vagy más, a készítmény hatásosságát fokozó anyagokat tartalmazó készítmény formájában kell elkészíteni. Az adjuvánsok olyan anyagok, amelyek specifikusan fokoznak egy adott immunreakciót. Normális esetben az adjuvánst és a készítményt az immunrendszernek való prezentálás előtt keverjük össze; vagy más módon, külön-külön, de az immunizálni kívánt állat testének azonos helyén adjuk be. Az adjuvánsok összetételük alapján több, lazán összefüggő csoportra oszthatók. E csoportok az olaj adjuvánsok (például Freund-féle komplett és nem komplett adjuváns), az ásványi sók (például A1K(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂, A1NH₄(SO₄), szilícium-dioxid, kaolin és szén), a polinukleotidok (például poli-IC és poli-AU savak) és bizonyos természetes anyagok (például a Mycobacterium tuberculosisból származó D viasz, valamint a Corynebacterium parvumban vagy a Bordetella pertussisban és a Brucella nemzetség tagjaiban található anyagok). Ezen anyagok közül adjuvánsokként különösen alkalmasak a szaponinok, például a Quil A (Superfos A/S, Dánia). A vakcinakészítményekben alkalmazható anyagok példáit illetően lásd: Remington’s Pharmaceutical Sciences (szerkesztő: Osol, A., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1324-1341. oldal, 1980; melyet hivatkozásul említünk).

A találmány szerinti gyógyászati készítmények parenterálisan injekcióval, gyors infúzióval, orr-garati abszorpcióval (intranazofaringeálisan), bőrabszorpcióval, valamint orálisan adhatók be. A készítmények más módon intramuszkulárisan vagy intravénásán is beadhatók. A parenterális beadáshoz való készítmények steril vizes vagy nemvizes alapú oldatok, szuszpenziók vagy

HU 220 198 Β emulziók. A nemvizes oldószerek példái a propilénglikol, polietilénglikol, növényi olajok, mint az olívaolaj, és injektálható szerves észterek, mint az etil-oleát. A bőráteresztő-képesség és az antigénabszorpció fokozásához vivőanyagok vagy zárókötések alkalmazhatók. Az orális beadáshoz való folyékony dózisalakok általában a folyékony dózisalakot tartalmazó liposzómaoldatból állnak. A liposzómák szuszpendálásához alkalmas formák a tudományban általánosan alkalmazott diluenseket, mint például tisztított vizet tartalmazó emulziók, szuszpenziók, oldatok, szirupok és elixírek. Az ilyen készítmények az inért diluens mellett adjuvánsokat, nedvesítő-, emulgeáló- és szuszpendálószereket, vagy édesítő-, ízesítő- vagy illatosítószereket is tartalmazhatnak.

Többszöri beadási rendszer alkalmazása esetén az immunizálások időbeosztásához több különböző technika létezik. Az immunizált állat által expresszált immunglobulinrepertoár expressziójának szintjének és diverzitásának fokozásához a találmány szerinti készítmények egynél több alkalommal alkalmazhatók. Ha többszöri immunizálást alkalmazunk, az egyes immunizálásokat egy-két hónap időközzel kell végezni.

A találmány értelmében egy gyógyászati készítmény „hatásos mennyisége” olyan mennyiséget jelent, amely elégséges a kívánt biológiai hatás eléréséhez. A készítmény hatásos mennyiségének biztosításához szükséges adagolás több tényezőtől függ, úgymint az állat vagy ember korától, állapotától, nemétől, a betegség (ha van egyáltalán) súlyosságától, és egyéb változóktól, melyek alapján az adagolást a szakembernek kell meghatározni.

A találmány szerinti antigénkészítmények a hatásos mennyiség egyszeri vagy többszöri dózisával adhatók be. A találmány szerinti készítmények hatásos mennyisége dózisonként 0,01 pg/ml és 1000 pg/ml között, előnyösebben dózisonként 0,1 pg/ml és 500 pg/ml között, legelőnyösebben dózisonként 10 pg/ml és 300 pg/ml között változhat.

A találmány általános leírása után az eddigiek a következő példák segítségével könnyebben érthetőek lesznek. A példákat szemléltetésként és nem a találmány korlátozásaként írjuk le.

1. példa

A pUX12 vektorok klónozási hatékonysága

A pUX12 vektorok klónozási hatékonyságának teszteléséhez, és annak meghatározásához, hogy a módosított leolvasási keretek helyesen transzkriptálódnak-e, több kísérletet terveztünk. E kísérletek eredményeit az alábbiakban összegezzük.

1. DNS-fragmens pUX12-be való klónozásához a három konstrukciót, a pUX12-t (az eredeti „zéró” leolvasásikeret-konstrukció), a pUX12+l-et és a pUX12-l-et ekvimoláris koncentrációban kevertük össze. A plazmidokat ezután a polilinkeren belüli töltelék fragmens kivágása érdekében BstXi enzimmel hasítottuk. A töltelék fragmenst alacsony olvadáspontú agaróz vagy káliumacetát gradiens alkalmazásával választottuk el a plazmidtól (Aruffo, A. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8573-8577, 1987; Ausubel, F. M. és munkatársai, Current Topics in Molecular Biology; Greene

Publ. Assn./Wiley Interscience, NY, 1987). A klónozni kívánt DNS-t tompa végeket eredményező restrikciós enzimmel hasítottuk (bármely ilyen enzim alkalmazható). A tompa végeket szükség esetén jelző szál végződésű, kétszálú DNS módosításával is kialakíthatók. A tompa végű DNS-ffagmenseket a két szintetikus oligonukleotid adapterral elegyítettük, melyek megegyeznek a töltelék fragmens előállításához alkalmazott 12-menrel és 8-merrel. A módosított DNS-ffagmenseket a be nem épült szintetikus oligonukleotidoktól kálium-acetát gradienssel választottuk el. Ezeket a fragmenseket azután a lineáris pUX12 plazmidcsaládba ligáltuk, és E. coli transzformálásához használtuk.

Annak igazolása érdekében, hogy a pUX12 vektorok az inszertek adapterokkal való klónozáshoz optimális feltételek mellett kis gyakorisággal „önligálódnak”, a pUX 12-be egy második antibiotikumrezisztencia-markert klónoztunk. Amint az 1. ábrán látható, a pUX12 βlaktamáz génnel rendelkezik és ampicillinrezisztenciát (amp®) hordoz. A második marker klónozásának logikai alapja az volt, hogy meghatározzuk a mindkét rezisztenciamarkert tartalmazó kiónok azon pUX12 plazmidokhoz viszonyított arányát, amelyek tipikus klónozási feltételek mellett önligálódnak, s ezáltal csak ampicillinrezisztenciát expresszálnak. A pBR322 plazmidból származó tetraciklinrezisztencia (tét®) gént a fentebb leírt adapterokkal a pUX12 polilinkerébe klónoztuk. Az oligonukleotid adapter fragmensvégekhez megfelelő optimális koncentrációjának, és a módosított inszert lineáris pUX12 plazmidhoz viszonyított, ligáláshoz és transzformáláshoz megfelelő arányának megállapítása érdekében tesztligálásokat végeztünk. Markerként tét® gén alkalmazásával képesek voltunk a klónozási paramétereket úgy meghatározni, hogy az ampicillint tartalmazó lemezeken szelektált transzformánsok több mint 99%-a a tét® markert is hordozta. Ilyenformán az önligálódás gyakorisága ebben a rendszerben nagyon alacsony, s a pUX 12-ben a könyvtár-screenelést megelőzően nincs szükség a polilinkerben valamilyen inszert jelenlétére végzett screenelésre.

2. A pUX12 polilinkerében a transzlációs leolvasási keret elhelyezkedésének igazolásához olyan strukturális gént klónoztunk, melynek szekvenciája és terméke ismert, és amelyből hiányzik a saját promotere.

Erre acélra a plazmidban jelen levő mutáns tox strukturális gént (Costa, J. J. és munkatársai, J. Bacteriol., 748(1), 124-130, 1981; Michel, J. L. és munkatársai, J. Virol., 42, 510-518,1982; melyeket hivatkozásul említünk) választottuk. A pABC402 plazmidot az Apai és Hindiii restrikciós endonukleázzal (Bishai, W. R. és munkatársai, J. Bacteriol., 169, 1554-1563, 1987; Bishai, W. R. és munkatársai, J. Bacteriol., 169, 5140-5151, 1987; melyeket hivatkozásul említünk) egyszerre kezeltük. Az Apai hely a strukturális génen belül az N-terminális közelében, a Hindiii hely pedig a tox gén C-terminálisán kívül helyezkedik el. A kapott 1,2 kb-os restrikciós fragmenst a pABC402 vektor megmaradt 4,1 kb-os részétől alacsony olvadáspontú agaróz alkalmazásával választottuk el.

Hogy a klónozáshoz tompa végeket alakítsunk ki, a tox fragmenst T4 DNS-polimerázzal kezeltük. A poli12

HU 220 198 Β meráz exonukleáz aktivitása az Apai 3’ végeket visszaemésztette, a polimeráz aktivitása pedig Hindlll helynél feltöltötte az 5’ túlnyúló véget (Maniatis, T. és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982). 5 Ezt a tompa végű, tisztított fragmenst a mindhárom leolvasási keretet tartalmazó pUX12 elegybe ligáltuk. Az egyes transzformánsokat véletlenszerűen választottuk ki és screeneltük (restrikciós térképezéssel), hogy meghatározzuk az inszertek orientációját és leolvasási keretét. 10 Ezenfelül meghatároztuk a polilinker/adaptor/ inszert régiók nukleotidszekvenciáját is. Azonosítottuk a két orientáció és a három leolvasási keret kombinációjából adódó mind a hat lehetőséget. A kiónokból származó extraktumokat végül diftériatoxin elleni antiszérumpró- 15 ba alkalmazásával, Westem-blot technikával screeneltük (Blake, M. S. és munkatársai, Anal. Biochem., 136,

175-179, 1984; Murphy, J. R. és munkatársai, Curr.

Topics Microbiol. and Immun., 118, 235-251,1985).

A reaktív, toxinnal kapcsolatos proteineket csak azokban a kiónokban mutattuk ki, melyek a strukturális gént helyes orientációban és leolvasási keretben tartalmazták. Ezt a plazmidot pUDTAH-l-nek nevezzük; a polilinker és a tox strukturális gén DNS-szekvenciáját az 1. táblázatban mutatjuk be. A bemutatott szekvencia a pUDTAH-l-ben a tox’ strukturális gén elejének DNSszekvenciája. Az ATG a transzkripciós startjel (lacZ), a GAT a pUX12 módosított polilinkerének kezdete, GCC pedig a tox' gén helyes leolvasási keretének startjele.

1. táblázat

A pUDTAH plazmid szekvenciái

ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGCCCGGG

Polilinker (ATG=LacZ transzlációs kezdőkodon)

GATCCATTGTGCTGGAAAG CCACC Oligonukleotid adaptorok (6. számú szekvencia) Diftéria tox’ gén

2. példa

Kromoszomális DNS tisztítása Streptococcus B csoportból

Kromoszomális DNS Streptococcus B csoportból történő tisztításához a Streptococcus B csoport A909 törzséből Hull és munkatársai módszerének (Lancefield, R. C. és munkatársai, J. Exp. Med., 142, 165-179, 1975) Rubens és munkatársai által leírt módosításával (Rubens, C. E. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7208-7212,1987) (mindkét leírást hivatkozásul említjük) kromoszomális DNS-t izoláltunk. Röviden, a Streptococcus B csoport A909 (Ia/c) törzsének protoplaszttá alakításához mutanolizint alkalmaztunk. A kapott felületi extraktumban számos olyan proteint találtunk, melyek az intakt baktérium ellen termelődött protektív antiszérummal immunreakcióba lépnek. Hagyományos oszlopkromatográfia alkalmazásával egy oldhatatlan proteinfrakciót részlegesen tisztítottunk. Két frakciót, melyek közül az egyik nagy koncentrációban egy 14 kDa-os fajtából állt, nyulak immunizálásához alkalmaztunk. A részlegesen tisztított Streptococcus B csoport proteinek ellen termelődött antiszérumról azt találtuk, hogy egér-virulenciavizsgálatban passzív védelmet biztosít a Streptococcus B csoport heterológ tok típusa ellen, amely a C proteineket hordozza.

A Streptococcus B csoport DNS-t kis sűrűségű cézium-klorid (CsCl) gradiensben végzett centrifugálással tisztítottuk, s a kromoszomális DNS-t TAE pufferrel szemben (pH=8,0) alaposan dializáltuk (Maniatis, T. és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982). A Streptococcus B csoport A909 törzse 1. típusú tokkal rendelkezik, C proteineket expreszszál, s korábban a C proteinek vizsgálatához alkalmazták (Valtonen, Μ. V. és munkatársai, Microb. Path., 1, 191-204, 1986). A screeneléshez való protektív antiszérum előállításához szintén ezt a Streptococcus B csoport törzset alkalmaztuk.

A Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-hozama a Streptococcus B csoport egyéjszakás tenyészetének minden egyes 500 ml-éből átlagosan 3-5 mg volt. A tisztított DNS-t külön-külön 24 általánosan használt restrikciós endonukleázzal emésztettük, s a kapott fragmenseket 1,0%-os agarózgélen futtattuk. Sokféle enzimet választottunk ki, köztük olyanokat, melyek a vektorok klónozásához általánosan használt polilinkereket egy helyen hasítják. A gél etidium-bromiddal (EtBr) végzett festése azt mutatta, hogy valamennyi restrikciós enzim a Streptococcus B csoport DNS meghatározott fragmensméret-megoszlását eredményezte. Ez azt sugallja, hogy a Streptococcus B csoport DNS egyik tesztelt restrikciós enzim szempontjából sem módosult.

Hogy meghatározzuk, jelen voltak-e a DNS blokkligálásának inhibitorai, a fenti restrikciós enzimes emésztési termékeket etanolban kicsaptuk, ligáló pufferbe helyeztük, és egy éjszakán keresztül 14 °C-on DNS-ligázzal inkubáltuk. A mintákat ismét 1,0%-os agarózgélen futtattuk, és EtBr-dal festettük. A kapott restrikciós mintázatok nagyobb molekulatömeg-megoszlást mutattak. Ennek megfelelően a Streptococcus B csoport DNS-ligálása nem volt gátolva

3. példa

A Streptococcus B csoport kromoszomális DNSkönyvtár elkészítése

A Streptococcus B csoport kromoszomális DNSkönyvtár pUX12-ben való elkészítését és E. cotíba történő transzformálását az alábbiak szerint végeztük. A klónozáshoz a Streptococcus B csoport kromoszomális DNS hasítása érdekében négy olyan restrikciós enzimet választottunk ki, amelyek a restrikciós fragmensméretek széles megoszlását eredményezik. A pUX12 vektor és az adaptorok hatékonyabbak voltak, ha tompa végű fragmenseket klónoztunk. A kiválasztott enzimek négy bázispáros helyeket ismernek fel, és tompa végeket hoz13

HU 220 198 Β nak létre. A Streptococcus B csoport DNS-t egyenként ri/«I, Fm«D2, HaellI és Rsal enzimmel részlegesen emésztettük.

A kapott ffagmenseket összekevertük, fenol/kloroform eleggyel tisztítottuk, etanollal kicsaptuk, és ligáló pufferben reszuszpendáltuk (Maniatis, T. és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982). A Streptococcus B csoport DNS-ffagmensek 1 pg-ját a 12-mer és 8-mer oligonukleotid adapterok 3 pg-jával kevertük össze, s a keverékhez 3 μΐ T4 DNS-ligázt (600 egység, New England Biolabs) adtunk, majd a reakcióelegyet egy éjszakán keresztül 14 °C-on tartottuk. A Streptococcus B csoport DNS-ffagmensektől a szabad linkereket kálium-acetát sebesség (velocity)-gradiensen választottuk el (Aruffo, A. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8573-8577, 1987).

A mindhárom leolvasási keretet tartalmazó pUX12 plazmidot BstXi enzimmel emésztettük, s a töltelék ffagmenseket alacsony olvadáspontú agaróz alkalmazásával eltávolítottuk. A Streptococcus B csoport DNSkönyvtárat úgy készítettük, hogy az összeillesztett Streptococcus B csoport DNS-ffagmensek 10 ng-ját 100 ul ligáló pufferben (melyhez 0,1%-os T4 DNS-ligázt adtunk) 100 ng pUX12 lineáris vektorral kevertük össze. A ligálási reakcióelegyet egy éjszakán át 14 °C-on tartottuk, majd ampicillint tartalmazó lemezeken MCI061

E. coli törzs transzformálásához alkalmaztuk (Ausubel,

F. M. és munkatársai, Current Topics in Molecular Biology, 1987).

A kapott transzformánsok közül tizenhatot izoláltunk, melyeket egy éjszakán keresztül ligáló pufferben növesztettünk, s a plazmid-DNS-t miniprep. méretben izoláltuk. A plazmid-DNS-t BamHl-gyel emésztettük, s a ffagmenseket 1,0%-os agarózgélen futtattuk. A screenelt plazmidok mindegyike tartalmazott pUX12 vektorinszertet, s az inszertek átlagos mérete 1,4 kb volt. E pillanatig több mint 200 kiónból nyert plazmid-DNS-t screeneltünk, s csak egy kiónt találtunk, amelyből hiányzott egy inszert a polilinkerben.

4. példa

A könyvtár screeneléséhez használni kívánt protektív antiszérum karakterizálása

Amint korábban említettük, a C proteineket sokféle technikával részlegesen tisztították, s számos kutató előállított védő hatású antiszérumot (Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 93, 113-119, 1985; Russel-Jones, G. J. és munkatársai, J. Exp. Med., 160, 1476-1484, 1984; Wilkinson, H. W. és munkatársai, Infec. and Immun., 4, 596-604, 1971).

Valtonen, Kasper és Levy munkájának megismétléseként (akik Streptococcus B csoport felülúszókból védő hatású antitestek termelődését kiváltó, 14 000-es molakulatömegű proteint izoláltak; Valtonen, Μ. V. és munkatársai, Microb. Path., 1, 191-204, 1982; melyet hivatkozásul említünk) kísérletsorozatot végeztünk. A kísérletek azt mutatták, hogy ha B csoportba tartozó StreptococcusAexvyészeXek felülúszóihoz a C proteinek bekoncentrálása és tisztítása (Wong, W. W. és munkatársai, J. Immunoi. Methods., 82, 303-313, 1985) előtt proteolitikus inhibitorokat adunk, a felülúszóban nem a 14 000-es molekulatömegű protein lesz túlsúlyban. Ez azt jelzi, hogy ez a protein a B csoportba tartozó Strepíococcws-tenyészetek felülúszóiban jelen levő nagyobb molekulatömegű C proteinek proteolíziséből származik.

5. példa

A körülmények optimalizálása a plazmidalapú vektorban lejátszódó expresszió screeneléséhez Amint korábban említettük, az expresszió detektálásához legáltalánosabban alkalmazott vektorok a lambda-gtll-en alapulnak (Young, R. A. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1194-1198,1983). A baktériumtelepek antitestes screeneléséhez két korábban leírt eljárás kombinálásával képesek voltunk fokozni a pUX12 plazmidból történő expresszió detektálásának érzékenységét. A könyvtárból származó transzformánsokat egy éjszakára szélesztettük, s a kapott telepeket nitrocellulóz filterekre (Bio-Rad) vittük át. A telepeket úgy lizáltuk, hogy a filtereket zárt edényben 30 percre kloroformmal (CHC1₃) telített atmoszférába helyeztük. A filtereket ezután lízispufferbe helyeztük, és egy éjszakán keresztül inkubáltuk (lásd Helfman, D. M. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. USA, 80, 31-35, 1983 leírták). Az antitestscreenelést kereskedelmi forgalom számára előállított E. coli lizátum (1:200 arányú) és torma-peroxidázzal konjugált, affinitástisztított kecske antinyúl IgG (1:3000 arányú) alkalmazásával a BioRad Laboratories által gyártott Express-Blot Assay Kitben végeztük. A telepek kloroformos előkezelésével és a DNázzal és lizozimmal fentebb leírtak szerint végzett egyéjszakás inkubálásával lehetővé vált, hogy a szükséges primer antitest arányt 1:500-ról 1:5000-re csökkentsük.

6. példa

A pozitív kiónok és proteintermékeik kezdeti analízise

A pUX12 vektorban a Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-könyvtárat a fentebb tárgyalt védő hatású, C proteinek elleni antiszérummal screeneltük. A Streptococcus B csoport DNS-könyvtár átlagos ffagmensmérete 1,4 körülbelül A transzformánsokat a fentebb leírtak szerint screeneltük, majd szubklónoztuk, és az antiszérummal háromszor újra screeneltük. A 20 000 screenelt klón közül 35 függetlenül izolált klón volt, melyek reagáltak a védő hatású antiszérummal. A kiónokat S1-S35 jelzésekkel azonosítottuk, s a kiónokat tartalmazó plazmidok elnevezése pJMSl-pJMS35. A kiónok mérete 0,9 kb-tól 13,7 kb-ig terjed, s az átlagos méret 4,5 körülbelül

A kiónokból miniprep. méretben plazmid-DNS-t izoláltunk, s az inszerteket négy restrikciós endonukleázzal vizsgáltuk át. A kiónok közül 14 azonos inszertmérete és közös restrikciós endonukleázos térképezési mintázata alapján három csoportba sorolható. A következőkben leírt SÍ és S23 kiónok különböző csoportba tartoznak.

Az egyes kiónok restrikciós mintázatának további összehasonlításával 24 olyan kiónt azonosíthattunk, me14

HU 220 198 Β lyek közös restrikciós fragmensekkel rendelkeztek. Az Sl és S23 klónról azt állapítottuk meg, hogy nem tartalmaztak egy restrikciós fragmenst sem.

A kiónokból extraktumokat készítettünk, melyeket Westem-blottal futtattunk, próbaként a könyvtár scree- 5 neléséhez alkalmazott antiszérumot alkalmazva. A protein antigének hat méretosztályát (A-F) azonosítottuk.

A restrikciós endonukleázos térképezésből és a Westem-blot analízisből származó adatok értékelésével a klón közül 24-et hat különböző protein antigén mintázatba tudtunk sorolni (2. táblázat). Ezt a kezdeti osztályozást csupán annak érdekében végeztük, hogy a szóban forgó gének lehetséges számáról durva áttekintést kapjunk. Az S 1-ről azt találtuk, hogy 3,5 kDa molekulatömegű, s hogy az A protein antigén mintázathoz tartozik, míg az S23 molekulatömege 13,7 kDa volt, s a D protein antigén mintázathoz tartozott.

2. táblázat

A Streptococcus B csoport C proteinklónok előzetes osztályozása

Proteinprofil	Kiónok száma	Az inszert molekulatömege (kb)	A DNS-inszert kódolókapacitása	Antigén mérete (kDa)
A	6	3,5	136 000	115 000
B	3	1,9	76 000	50 000
C	7	4,4	174 000	130 000
D	6	13,7	>50 0000	11000
E	1	1,7	67 000	50 00
F	1	0,9	36 000	15 000

Ha a kiónok extraktumaihoz C proteineket nem expresszáló Streptococcus B csoport elleni antiszérumpró- 25 bát alkalmaztunk, a kiónok csak egy csoportja (B proteinprofil) volt pozitív. Ez azt jelzi, hogy a pozitív kiónok többsége a C proteineket hordozó törzsekre egyedien jellemző proteineket expresszál; ezek a proteinek a Streptococcus B csoport nem minden törzsére jellem- 30 zőek.

7. példa

A klónozott génszekvenciák karakterizálása

A B csoportú Streptococcus által expresszált C pro- 35 teinek tényleges száma nincs meghatározva. Brady és munkatársai a C. D. C.-től származó, C proteinre típusos antiszérum karakterizálására végzett immunológiai vizsgálatokkal négy külön antigént mutattak ki (Brady,

L. J. és munkatársai, J. Infect. Dis., 158(5), 965-972, 40 1988). A Streptococcus B csoport feltételezett C protein kiónjainak előzetes genetikai és immunológiai karakterizálása azt sugallja, hogy öt gén közül négy kódol olyan proteint, melyek jelen vannak azokban a Streptococcus B csoport törzsekben, amelyekről ismert, 45 hogy C proteieneket hordoznak. Két kísérleti csoportot hoztunk létre, hogy meghatározzuk, vajon a klónozott gének termékei C proteineket reprezentálnak-e.

Amint fentebb említettük, a C proteinek vizsgálata két fenotípust határozott meg; az egyik csoport a pepszi- 50 nes lebontásra érzékeny volt, a tripszinesre azonban nem (TR vagy alfa-csoport), míg a másik proteincsoport a pepszines és tripszines lebontásra egyaránt érzékeny volt (TS vagy béta-csoport) (Johnson, D. R. és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 19, 506-510, 1984; 55 Russel-Jones, G. J. és munkatársai, J. Exp. Med., 160, 1476-1484,1984).

A klónozott gének termékeinek Westem-blot technikával való screeneléséhez alfa- és béta-tipizáló antiszérumot alkalmaztunk (Bevanger, L. és munkatársai, 60

Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 87, 51-54, 1979; Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 89, 205-209, 1981; Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 91, 231-234, 1983; Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 93, 113-119, 1985; Bevanger, L. és munkatársai, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B., 93, 121-124, 1985; melyeket hivatkozásul említünk).

Az alfa-tipizáló szérum a D proteinprofilt, a béta-tipizáló szérum pedig az A proteinprofilt azonosította. Ezeket a proteineket pepszines és tripszines emésztésnek vetettük alá. A D proteinprofil a pepszinre érzékeny, a tripszinre nem, míg az A proteinprofil a pepszinre és a tripszinre egyaránt érzékeny. Ezek az eredmények összhangban állnak a korábbi vizsgálatok eredményeivel, s alátámasztják, hogy legalább két C proteingént klónoztunk.

A C proteinek legfontosabb és legjellemzőbb tulajdonsága, hogy a C proteineket expresszáló Streptococcus B csoport törzsek ellen védő hatású antitestek termelődését váltják ki. A klónozott gének termékei elleni antiszérum előállításához több módszer alkalmazható. Például az E. coli kiónok lizátumai közvetlenül nyulakba injektálhatók, hogy meghatározzuk, vajon a lizátumok tartalmaznak-e olyan proteineket, amelyek képesek a bejuttatott E. coli vagy Streptococcus B csoport proteinek elleni antitestek termelődésének kiváltására. A kapott antiszérum (tesztelése előtt) a keresztreagáló antitestek számának csökkentése érdekében preabszorbeálható az E. coli lizátummal. Az ilyen lizátum a kiónok expresszióra való screenelésében alkalmazott teleplenyomatokban, valamint a B csoportú Streptococcus celluláris extraktumainak és a részlegesen tisztított Streptococcus B csoport proteinek vizsgálatához alkalmazott Westem-blotokban egyaránt alkalmazhatók a keresztreagáló antitestek számának csökkentéséhez.

HU 220 198 Β

Az A, B és D proteinprofilba tartozó, jellemző kiónokat hangkezeltük és nyulakba injektáltuk, hogy a klónozott Streptococcus B csoport protein antigének ellen antitesteket hozzunk létre (Lancefield, R. C. és munkatársai, J. Exp. Med., 142, 165-179,1975; Valtonen, M. V. és munkatársai, Microb. Path., 1, 191-204, 1986). A kontrollnyulakat a polilinkerben inszert nélküli pUX12-t hordozó E. colival oltottuk. Az antiszérumot

E. coli lizátummal preadszorbeáltuk, s először a könyvtár kiónjainak extraktumai ellen Westem-blotokon screeneltük. Ilyenformán lehetőség van annak meghatározására, hogy a kiónok között léteznek-e keresztreaktív epitópok, illetve annak igazolására, hogy ez az antiszérum az előzetes screenelés során azonosított, klónozott proteinek ellen irányul.

A preadszorbeált antiszérum más módon egér-védelmimodellben tesztelhető. E klasszikus modellben az egereket intraperitoneálisan nyúlantiszérummal oltjuk (Lancefield, R. C. és munkatársai, J. Exp. Med., 142, 165-179, 1975). A következő napon az egereket ismét intraperitoneálisan, LD_S0 értékkel olyan életképes, B csoportba tartozó Streptococcusszal injektáltuk, amelyről ismert, hogy C proteineket hordoz. A teszt végpontja az egerek 48 órás időtartam alatt bekövetkező pusztulása.

A klónozott génszekvenciák által expresszált proteinek immunogenitásának teszteléséhez pJMSl és pJMS23 plazmidokat tartalmazó Escherichia coli sejteket tenyésztettünk, s ezeket celluláris extraktumok készítéséhez használtuk, melyeket aztán nyulak immunizálásához alkalmaztunk. Az Sl és S23 extraktumokkal végzett immunizálás hatására termelődött antiszérumot az egér-védelmimodell alkalmazásával teszteltük.

Az egér-védelmimodell kísérletben az A és D proteinprofilt (Sl, illetve S23) reprezentáló klónokból származó antiszérumot egyaránt védő hatásúnak találtuk. A C proteinprofilt reprezentáló klónból származó antiszérum és a kontrollantiszérum nem volt védő hatású. A C proteinprofilt expresszáló kiónok ellen termelődött antiszérum a C proteint nem hordozó, Streptococcus B csoportba tartozó törzsekből kivont proteineket is köti. Ennek megfelelően, az ebbe a csoportba tartozó kiónok nem kódolnak C proteineket. Összefoglalva: a hat klóncsoportból öt nem kódol olyan proteint, amely kizárólag a C proteint expresszáló Streptococcus B csoport törzsekre jellemző.

A kiónok két csoportjának kezdeti biokémiai, immunológiai és funkcionális analízise azt bizonyítja, hogy legalább két C proteingént (Sl és S23) sikerült klónozni. Ez az első bizonyítéka annak, hogy a Streptococcus B csoportból klónozott gén polipeptidterméke képes védoimmunitást kiváltani. Az Sl elleni antitestekről azt állapítottuk meg, hogy képesek az A909 extraktum 50 kDa-os és 60 kDa-os sávjához kötődni. Az S23 elleni antitestek a B csoportú Streptococcus felületi extraktuma sávjainak szabályosan ismétlődő mintázatához képesek kötődni, melyek molekulatömege >180 kDa-tól 40 kDa-ig teljed. Az A909 extraktumból származó monoklonális antitest az immunreaktivitás ugyanezen ismétlődő mintázatát mutatta. Ez azt jelenti, hogy a különböző molekulatömegű proteinek esetében az antitestek egy epitópot ismernek fel, s ez szabályosan ismétlődő szerkezetre utal. Az Sl antiszérum által felismert proteinek érzékenyek voltak a pepszines és tripszines lebontásra, míg az S23 antiszérum által felismert proteinek csak a pepszinre voltak érzékenyek. Ez a kísérlet azt mutatja, hogy ezek a Streptococcus B csoportból részlegesen tisztított, és a Streptococcus B csoport klónozott génjei által expresszált proteinek a Streptococcus B csoport C proteinjének alfa- és bétaantigénjeit képviselik.

A jelen levő gének számának meghatározásához a fentebb leírt 35 lehetséges C proteinklón genetikailag és immunológiailag értékelhető. Ráadásul ezen kiónok izolálása lehetővé teszi a Streptococcus B csoport fertőzés elleni védőimmunitást biztosító gének azonosítását. Valószínű, hogy a kezdeti kiónok kinyeréséhez alkalmazott védő hatású antiszérum C proteinektől eltérő proteineket is kimutatott. A Streptococcus B csoport fertőzés elleni kezelésben az ilyen egyéb proteinek alkalmazása szintén a találmány tárgyát képezi. Mivel a találmány fő célja az immunitásban szerepet játszó proteinek azonosítása és izolálása, az e kiónok által expresszált proteinek ellen készült antiszérum az egér-védelmimodellben vizsgálható. A konjugált vakcina szempontjából azok a gének az előnyben részesítettek, amelyek védő hatású proteineket expresszálnak.

Amint fentebb részleteztük, a Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-ének E. co/z/pUX12 vektor könyvtárban védő hatású antiszérummal végzett kezdeti screenelése 35 függetlenül izolált kiónt eredményezett. A klónozott ffagmensek restrikciós endonukleázos térképezéséből és a kiónokból származó proteinkivonatok Westem-blot analíziséből származó eredmények összevetésével lehetőség nyílt arra, hogy a 35 klón közül 24et próbaképpen hat különböző proteinantigén-mintába soroljunk (2. táblázat). Ez az áttekintés elősegítette az izolált gének lehetséges számának meghatározását.

Az ilyen kiónok további karakterizálása érdekében előnyösen teleplenyomatokat alkalmazunk, hogy meghatározzuk, mely kiónok rendelkeznek közös DNS-szekvenciával. Az ilyen lenyomatok készítéséhez mikrotiterlemez LB tápközeget tartalmazó üregeibe a kiónok egy-egy telepét tesszük, és 37 °C-on egy éjszakán át növesztjük. A kontrolltelepek a gazda E. coli törzs és a pUX12-t tartalmazó E. coli törzs. Az egyéjszakás tenyészeteket az előbbivel azonos tápközeget tartalmazó agarlemezen nitrocellulóz filterre visszük, és a lemezeket 37 °C-on 8 órán keresztül inkubáljuk, s a frissen nőtt telepeket tartalmazó nitrocellulóz filtert DNS-DNS hibridizációra végzett screeneléshez készítjük elő. A próbákat a pUX12 könyvtár Streptococcus B csoport DNSinszertjeiből készítjük. A klónokból plazmid-DNS kinyeréséhez minipreparatív módszert alkalmazunk. A pUX 12-ben a polilinker az inszert mindkét oldalán rendelkezik BamHI és BstXi. hellyel, s így a Streptococcus B csoport inszert BamHI és BstXi enzimmel egyaránt kivágható a plazmidból. A Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-e szerencsére kevés BamHI helyet tartalmaz, s a ZtamHI-gyel végzett emésztés ered16

HU 220 198 Β ményeként a vektorból sok inszert egy fragmensben távolítható el. A plazmidvektor és az inszertek elválasztásához alacsony olvadáspontú agarózt alkalmazunk. Az inszerteket levágjuk az agarózgélről, és random prime jelöléssel közvetlenül jelöljük. A jelölt inszerteket ezután a teleplenyomatok próbájaként alkalmazzuk, ami lehetővé teszi a közös DNS-szekvenciával rendelkező ki ónok azonosítását. A fentebb leírt teleplenyomatokból nyert információk alapján a 35 kiónt közös DNS-szekvenciával rendelkező csoportokba soroljuk. Hogy meghatározzuk az egyes kiónok ugyanazon DNS-régióban más Hónokkal mutatott rokonságát, a csoportokat több restrikciós endonuHeázzal térképezzük. Mivel a pUX12 gazda plazmid sok egyedi restrikciós endonukleáz helyet tartalmaz, melyek csak a polilinkerben vannak jelen, a restrikciós térképezés nagy része a plazmid minipreparatív DNS alkalmazásával végezhető anélkül, hogy szükség lenne az inszertek egyenkénti tisztítására. A teleplenyomatok adatainak a részletes restrikciós térképezési adatokkal való összevetésével megállapíthatjuk a számunkra lényeges génlokuszok számát. Ha a Hónok valamely csoportja a szóban forgó gént nem teljes egészében reprezentálja, szükség lehet arra, hogy ezeket a Hónokat a gének teljesebb példányainak kromoszómakönyvtárból történő izolálásához használjuk. Az eredetileg izolált 35 klón átlagos méretmegoszlásának nagysága miatt azonban valószínű, hogy valamelyik teljes nyitott leolvasási keretet reprezentál.

A genetikai analízis folytatása előtt a klónozott géntermékek ellen antiszérumot készítünk, amit az egér-védelmimodellben annak meghatározása érdekében alkalmazunk, hogy képes-e védelmet biztosítani a Streptococcus B csoport által okozott fertőzés ellen (Lancefield, R. C. és munkatársai, J. Exp. Med., 142, 165-179, 1975; Valtonen, Μ. V. és munkatársai, Microb. Path., 1, 191-204,1986).

Az a Hón, amelynek expresszált proteinje képes védő hatású antitestek termelődésének kiváltására, a konjugált vakcinában való alkalmazás szempontjából előnyben részesített jelölt. Azok a kiónok, melyek expresszált proteinje nem váltja H védő hatású antitestek termelődését, tovább vizsgálhatók, hogy meghatározzuk, vajon a vakcinát illetően ezek is jelölteknek teHnthetők-e. Mivel a C proteinek membránasszociáltak, a Hón által expresszált protein azon hiányossága, hogy nem váltja ki védő hatású antitestek termelődését, azt jelentheti, hogy a protein nem stabil az E. coliban és a nagy példányszámú vektorban. Ez a probléma a Streptococcus A és B csoportból származó egyéb membránproteineket kódoló gének klónozása esetén is előfordult (Kehoe, M. és munkatársai, Infect. and Immun., 43, 804-810, 1984; Schneewind, 0. és munkatársai, Infect. and Immun., 56, 2174-2179,1988). Az előzetes vizsgálatok során izolált 35 klón közül több kis telepmorfológiát mutat. Ráadásul ezen Hónok közül néhány nem stabil, s azt találtuk, hogy a pUX12 polilinkerből kiejtik a Streptococcus B csoport DNS-inszert egy részét. E kiónok stabilizálására több módszer létezik, mint például kis példányszámú vektorba vagy alulszabályozható promoter mögé történő klónozás, a kiónok 37 °C helyett 30 °C-on történő növesztése, illetve a membránproteinek akkumulálására alkalmas vektorba történő Hónozás. Ezenfelül lehetőség van a plazmidok pcnB E. coli gazdába való transzformálására, amely korlátozza a pBR322-ből származó plazmidok (mint a pUX12) példányszámát (Lopilato, J. és munkatársai, Mól. Gén. Génét., 205, 285-290,1986; melyet hivatkozásul említünk).

Az a tény, hogy egy klón nem expresszál védő hatású antitestek termelődését kiváltani képes proteint, azt is jelentheti, hogy az expresszált proteinből hiányzik a védelemhez fontos epitóp. Ez akkor fordulhat elő, ha nem a teljes gént klónoztuk, vagy ha az nem expresszálódik E. coliban. Az is problémát jelenthet, ha a Streptococcus B csoportban a C proteinek esetében van poszttranszkripciós érési folyamat, míg az E. coliban klónozott C proteingének esetében nincs. Ilyen esetben a teljes gén szubklónozására és/vagy más gazda háttérbe (ahol expresszálódhat) való átvitelére lehet szükség.

Az a tény, hogy egy klón nem expresszál védő hatású antitestek termelődését kiváltani képes proteint, azt is jelezheti, hogy az Escherichia coliban termelt antigének által Hváltott antitestek különböznek a Streptococcus B csoport C proteinjei által állatban kiváltott antitestektől. A nyulak immunizálásához alkalmazott lizált baktériumkivonatok ráadásul számos E. coli proteinantigént tartalmaznak. Ilyenformán állatmodellben való teszteléshez az antiszérumot inkább részlegesen tisztított géntermékekből, mint teljes organizmusból kell kinyerni.

A védő hatású antitestek termelődésének kiváltására képes bármely klónozott Streptococcus B csoport protein C proteinnek nevezhető. A kísérletek e csoportjához készített antiszérumot szintén ezen proteinek lokalizálásához alkalmazzuk.

8. példa

A C proteingének térképezése, karakterizálása és szekvenálása

A C proteingének további karakterizálásához a fentebb leírt C proteingénklónok finomszerkezetű genetikai térképét készítjük el, s meghatározzuk DNS-szekvenciájukat. Az ilyen térképezést előnyösen genom Southern biotok alkalmazásával végezzük. A C proteingének DNS-szekvenciáinak meghatározásával meghatározható a gének szerkezete, beleértve riboszómakötési helyeiket, potenciális promotereiket, jelzőszekvenciáikat és mindenféle, nem általános, ismétlődő szekvenciáikat. A DNS-szekvenciákat lehetőleg ismert DNS-szekvenciakönyvtárral hasonlítjuk össze, hogy megállapítsuk, mutatnak-e homológiát a már karakterizált egyéb génekkel. A C proteinek aminosavszekvenciái az őket kódoló gének DNS-szekvenciáiból határozhatók meg. Az aminosavszekvencia vizsgálatából gyakran következtetni lehet a protein szerkezetére, funkciójára és sejtben való elhelyezkedésére.

A genom Southern biotokat így előnyösen annak meghatározására használjuk, hogy a gének között vannak-e kapcsoltak. E módszerhez a Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-t egyenként több különbö17

HU 220 198 Β ző restrikciós endonukleázzal emésztjük, melyek hat vagy több bázispárból álló szekvenciákat ismernek fel. Célunk, hogy olyan nagyobb kromoszomális DNS-szakaszokat nyeljünk, amelyek egynél több gént hordoznak. Az egyes emésztett mintákat ezután agarózgélen futtatjuk, és nitrocellulózra visszük. A Southern biotokhoz próbaként a fentebb leírt könyvtárból származó jelölt inszerteket alkalmazzuk. Ha két klón, amely a teleplenyomatok vagy az endonukleázos térképezés alapján nem tűnt rokonságban állónak, azonos kromoszomális sávokhoz kötődik, azt jelenti, hogy vagy ugyanazon gén részét képezik, vagy hogy két, a kromoszómán közeli kapcsoltságú génről van szó. A további vizsgálathoz ezen nagyobb génfragmensek klónozására mindkét esetben több lehetőség kínálkozik. Az egyik eljárás Streptococcus B csoport kozmidkönyvtár készítése, és a szóban forgó egyik próbával való hibridizálása. Ha olyan kiónt kapunk, amely két vagy több érdekelt gént tartalmaz, endonukleázokkal térképezhetjük, és a korábban említett kiónok esetében leírtak szerint védő hatású antigének expressziójára tanulmányozhatjuk.

A fentebb leírt kiónok azonosítása lehetővé teszi DNS-szekvenciáik meghatározását. Ha a kiónok a pUX12 plazmidban vannak, a polilinkerhez készített oligonukleotid primerekből kiinduló szekvenáláshoz reverz transzkriptázzal végzett kétszálú DNS-szekvenálást végezhetünk. Ezt a technikát korábban a pUX12 plazmid karakterizáláshoz alkalmaztuk, s a 600 bázispárnál nagyobb gén szekvenálásához több további oligonukleotid primer gyors szekvenálását teszi lehetővé. Ennek megfelelően a C proteingének DNS-szekvenálását előnyösen Ml3-ba történő szubklónozással, egyszálú DNS-szekvenáló rendszerrel végezzük (Ausubel,

F. M. és munkatársai, Current Topics in Molecular Biology, 1987).

A C proteinek DNS-szekvenciáinak ismerete a gének és géntermékek szerkezetét, funkcióját és szabályozását illetően alapvető információkat nyújt. Amint korábban leírtuk, a több kutató által izolált C proteinek méretének heterogenitása, és e proteinek antigén tulajdonságainak nyilvánvaló különbözősége egy géncsalád létezésének, vagy a C proteingének proteintermékeit módosító poszttranszkripciós mechanizmus létezésének lehetőségét veti fel (Ferrieri, P. és munkatársai, Infect. Immun., 27, 1023-1032, 1980). A Streptococcus A csoport M proteinjét korábban e jelenség példájaként írták le (Scott, J. R. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1822-1826, 1985). Annak ellenére, hogy az M proteinek DNS-szekvenciája hibridizációt tekintve nem mutat homológiát a Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-ével, a két DNS-szekvencia között létezhetnek szerkezeti homológiák (Hollingshead, S. K. és munkatársai, J. Bioi. Chem., 261, 1677-1686, 1986; Scott, J. R. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1822-1826, 1985; Scott, J. R. és munkatársai, Infect. and Immun., 52, 609-612, 1986). A C proteinek DNS-szekvenciáit lehetőleg ismert DNS-szekvenciák könyvtárával, a DNS-szekvenciákból leszármaztatott aminosavszekvenciákat pedig ismert aminosavszekvenciák könyvtárával hasonlítjuk össze.

9. példa

A C proteingének elterjedtsége

A C proteingének elterjedtségének meghatározásához különböző Streptococcus B csoport szerotípusok klinikai és laboratóriumi izolátumaiból származó kromoszomális DNS-t próbaként C proteingének alkalmazásával genom Southern biot technikával tesztelünk. Ezenfelül a C proteingének expressziójának szabályozására vonatkozó információk érdekében a precipitintechnikákkal meghatározott fenotípusos expressziót összehasonlítjuk a DNS-DNS hibridizációval kimutatott genetikai összetétellel. A C proteingének próbáit egyéb Streptococcus típusokból és egyéb baktériumpatogénekből származó kromoszomális DNS-ek screeneléséhez használjuk.

A próbákat a Lancefield által használt eredeti tipizáló törzsek legtöbbjét magában foglaló Streptococcus B csoport izolátumaiból származó C proteingénekből készítjük és jelöljük (Lancefield, R. C. és munkatársai, J. Exp. Med., 142, 165-179, 1975). A Streptococcus B csoport 24 klinikai és laboratóriumi izolátumának teleplenyomatát a fentebb leírt mikrotitertechnikával screeneljük. A különböző törzsek C proteingénekhez való hibridizálásának képességét azután összehasonlítjuk ezen organizmusok C proteinek ellen irányuló tipizáló anti szérumhoz való kötődésében megmutatkozó fenotípusos jellemzőivel. Ezzel a módszerrel meghatározhatjuk, hogy mely törzsek hordozzák a C proteingének valamelyikét vagy mindegyikét, s hogy léteznek-e ezen gének csendes vagy rejtett kópiáit hordozó törzsek.

Azokat a törzseket, amelyek a teleplenyomatokon hibridizálnak a C proteingénpróbákkal, C proteingénjeik méretének, szerkezetének és elhelyezkedésének meghatározása érdekében genom Southern biotok alkalmazásával screeneljük. A teleplenyomatokon kötődő Streptococcus B csoport törzsekből izolált kromoszomális DNS-t restrikciós endonukleázokkal emésztjük, agarózgélen futtatjuk, s nitrocellulózon lenyomatokat (biot) készítünk. E Southern biotokhoz próbaként C proteingének próbáit alkalmazzuk. Ezzel a módszerrel meghatározhatjuk, hogy a különböző Streptococcus B csoport szerotípusokban ezen gének elhelyezkedése és mérete között vannak-e különbségek, és a klinikai (azaz potenciálisan virulens) izolátumok összehasonlíthatók a laboratóriumi törzsekkel (és azokkal, amelyek klinikailag megtelepednek, de fertőzéssel nem állnak kapcsolatban).

A C proteingénpróbákat előnyösen használjuk más Streptococcus törzsek és különböző patogén baktériumok screeneléséhez is. A Streptococcus törzsekről ismert, hogy más, virulenciával kapcsolatos proteineket (köztük az M és G proteineket) is tartalmaznak (Fahnestock, S. R. és munkatársai, J. Bact., 767(3), 870-880, 1986; Heath, D. G. és munkatársai, Infec. and Immun., 55, 1233-1238, 1987; Scott, J. R. és munkatársai, Infec. and Immun., 52, 609-612, 1986; Walker, J. A. és munkatársai Infec. and Immun., 55, 1184-1189, 1987; melyeket hivatkozásul említünk). A tesztelni kívánt törzseket először annak meghatározása érdekében, hogy rendelkeznek-e a C proteingénpróbákkal homológ szek18

HU 220 198 Β venciákkal, teleplenyomatok alkalmazásával screeneljük. A teleplenyomat-analízis során pozitívnak bizonyult baktériumtörzsek kromoszomális DNS-ével ezután genom Southem-blotolást végzünk. A kapott biotokhoz próbaként C proteingéneket alkalmazunk, hogy lokalizáljuk és definiáljuk a homológ területeket, mint például a C protein membrán kihorgonyzó szakaszaként szolgáló régiót, az immunglobulinok Fc régiójához kötődő régiót vagy más baktériumok hasonló funkciójú génjeivel homológ régiókat.

10. példa

A Cproteingének módosítása a Streptococcus B csoportban

Számos, potenciálisan virulenciával kapcsolatos tulajdonságot a C proteineknek tulajdonítanak, mint az opszonifikálási (fagocitózis serkentése) rezisztenciát és a fagocitózist követő intracelluláris pusztulás gátlását (Payne, N. R. és munkatársai, J. Infec. Dis., 151, 672-681, 1985; Payne, N. R. és munkatársai, Infect. and Immun., 55,1243-1251,1987). A C proteinek virulenciában betöltött szerepének jobb megértése érdekében izogén törzseket hozunk létre, melyekben a C proteinek egyedien mutáltak. E törzseket az újszülöttpatkány-modellben (Zeligs, B. J. és munkatársai, Infec. and Immun., 37, 255-263, 1982) teszteljük a virulenciára. A C proteinek Streptococcus B csoport virulenciájában betöltött szerepének értékeléséhez használható izogén törzsek előállításához két eljárás alkalmazható. Előnyösen a Tn916 önkonjugálódó transzpozonnal végzett transzpozon mutagenezis alkalmazható. Más lehetőség szerint helyre irányuló (site-directed) mutagenezist is alkalmazhatunk. A Streptococcus B csoport genetikai manipulációjának hatásos módszerei hiányában a Streptococcus B csoport génjeinek módosításához és a virulencia vizsgálatában alkalmazható izogén törzsek létrehozásához új genetikai technikák kifejlesztésére van szükség (Lopilato, J. és munkatársai, Mól. Gén. Génét., 205, 285-290,1986; melyet hivatkozásul említünk).

A transzpozon inszerciós mutagenezis a virulenciával kapcsolatos antigének expressziójában eltérő izogén törzsek létrehozásának általánosan használt technikája, s Streptococcus B csoportban való alkalmazását részletesen leírták (Caparon, M. G. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8677-8681,1987; Rubens, C. E. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7208-7212, 1987; Wanger, A. R., Rés. Vet. Sci., 38, 202-208, 1985; Weiser, J. N., Trans Assoc. Amer. Phys., 98, 384-391,1985; melyeket hivatkozásul említünk). Rubens és munkatársai a Tn916 transzpozon Streptococcus B csoport tokvizsgálataiban való alkalmazhatóságát mutatták be (Rubens, C. E. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7208-7212,1987). A TN916 önkonjugálódó transzpozon Streptococcus faecalisbóX Streptococcus B csoportba korábbi leírás szerint állítható elő (Wanger, A. R., Rés. Vet. Sci., 38, 202-208, 1985; melyet hivatkozásul említünk). A törzseket antibiotikumrezisztencia-marker jelenlétére szelektáljuk, s teleplenyomatokon a C proteinek expreszsziójának hiányára screeneljük (amit a fentebb leírt módon specifikus antiszérummal mutatunk ki). Azok az izolátumok, melyekről úgy tűnik, hogy nem expreszszálják a C proteineket, a C proteingéneken belüli inszerció lokalizálása érdekében genom Southern biotok alkalmazásával tovább térképezhetők. Az eredeti Tn916 törzs tetraciklinrezisztenciát hordozott, azonban az utóbbi időben a Tn916-ba eritromicinrezisztenciát klónoztak (Rubens, C. E. és munkatársai, Plasmid, 20, 137-142, 1988). Ki kell mutatnunk, hogy a Tn916-tal végzett mutagenezis után a mutáns törzs a transzpozon csak egy példányát hordozza, s a transzpozon a C proteingénen belül helyezkedik el.

A Streptococcus B csoportban a C proteinek deléciójához ezen technikák nehézség nélkül alkalmazhatók, kivéve, ha a C proteingén nélkülözhetetlen a B csoportba tartozó Streptococcus életben maradásához. Leírtak azonban olyan Streptococcus B csoport törzseket, melyekből hiányzik mindenféle kimutatható C protein, s nem általános, hogy egy baktérium virulencia determináns az életben maradáshoz in vitro esszenciális gén lenne. A Tn916 további alkalmazási lehetősége a C proteingének potenciális szabályozó elemeinek azonosításában rejlik.

Abban az esetben, ha specifikus, definiált mutációkra van szükség, vagy ha a C proteingén a Streptococcus B csoport életképességéhez nélkülözhetetlen, helyre irányuló mutagenezistechnikák alkalmazhatók (például kondicionális mutánsok létrehozásához), A helyre irányuló mutagenezis így a Streptococcus B csoport proteinek genetikai analíziséhez alkalmazható. Az egyik probléma, ami késleltette ezen technikák Streptococcus B csoportban való kifejlesztését, a Streptococcus B csoport transzformálásában előálló nehézség. Az elektroporációról kimutatták, hogy alkalmazásával DNS juttatható olyan baktériumokba, melyeket egyébként nehéz transzformálni (Shigekawa, K. és munkatársai, BioTech., 6, 742-751,1988; melyet hivatkozásul említünk). Ezen akadály leküzdése érdekében a Streptococcus B csoport transzformálásához elektroporációs technikát alkalmazunk, miáltal lehetővé válik a helyre irányuló mutagenezis kivitelezése, a komplementáció értékelése és a C proteingének C proteint nem expresszáló, Streptococcus B csoport törzsekbe juttatása. A természetes vagy mutáns C proteingének Streptococcus B csoport törzsekbe történő inszertálásához a több lehetőség közül bármelyik alkalmazható. Például a pUX 12-ben a C proteingénklónokba antibiotikumrezisztencia-marker inszertálható. Előnyben részesített az olyan antibiotikumrezisztencia-marker, amely Streptococcus B csoportban expresszálható, de normális esetben nincs jelen. A módosított pUX12 proteinklónt elektroporációval Streptococcus B csoportba transzformáljuk (Shigekawa, K. és munkatársai, BioTech., 6, 742-751, 1988; melyet hivatkozásul említünk). Mivel a pUX12 plazmid a Streptococcus B csoportban nem tud replikálódni, az antibiotikumrezisztens fenotípussal rendelkező törzsekben ez a fenotípus valószínűleg a B csoportos gazdakromoszómán lévő C proteingén és a pUX12 plazmidban lévő mutált C proteingén közötti homológ rekombináció következtében alakul ki. A mutánsokat a fentiekben leírt módon screeneljük. Ha a

HU 220 198 Β recipiens törzsben nincsenek homológ szekvenciák, egy ismert Streptococcus génbe (azaz a B csoportba tartozó Streptococcusbói származó, természetes antibiotikumrezisztencia-marker génbe) inszertált C proteingénnel vektort hozhatunk létre. Az elektroporációt követően az ilyen plazmidkonstrukció homológ rekombináció útján a kromoszómába integrálódik.

Más módon, a módosított C proteingének úgy vihetők be Streptococcus B csoport kromoszómába, hogy a géneket a Tn916 önkonjugálódó transzpozonba inszertáljuk, s a módosított transzpozonokat Streptococcus faecalisból párosítás útján visszük be a Streptococcus B csoport kromoszómába. Ezt a technikát eredményesen alkalmazták a Tn916 eritromicin génnel való sikeres módosításához, és e gén B csoportba tartozó Streptococcus kromoszómába inszertálásához (Rubens, C. E., Plasmid, 20, 137-142, 1988). Ki kell mutatni, hogy a Tn916-tal végzett mutagenezis után a mutáns törzs a transzpozon csak egy példányát hordozza, és ez a transzpozon a C proteingénen belül helyezkedik el.

11. példa

A Cproteinek Streptococcus B csoport virulenciájában betöltött szerepének értékelése A C proteineket hordozó és nem hordozó Streptococcus B csoport törzseket összehasonlító korábbi vizsgálatokban olyan izolátumokat alkalmaztak, melyekről nem volt ismert, hogy izogének lennének (Ferrieri, P. és munkatársai, Rév. Inf. Dis., 70(2), 1004-1071, 1988). Emiatt nem lehetett megállapítani, hogy a virulenciát illetően megfigyelt különbségek a C proteinekkel vagy valamilyen más virulenciadeterminánssal állnak-e kapcsolatban. Olyan izogén törzsek létrehozásával, melyek intakt C proteingénekkel vagy C proteingén-deléciókkal rendelkeznek, lehetővé teszi a C proteinek virulenciában betöltött szerepének karakterizálását. A törzseket a virulenciára lehetőleg újszülöttpatkány-modellben, az immunológiai tulajdonságokra pedig az egér-védelmimodellben teszteljük. A virulencia egy másik fontos tesztje a gén azon képességének megállapítása, hogy mutáns törzsben alléláthelyeződéses reverzió során fenntartja-e a virulenciát. A C proteingének olyan Streptococcus B csoport törzsekbe inszertálásával, melyek vagy nem hordozzák ezt a gént, vagy inaktivált C proteingéneket hordoznak, meghatározható a C protein virulenciára gyakorolt hatása, oly módon, hogy a kapott konstrukció virulenciáját a fentebb említett állatmodellekben vizsgáljuk.

A Streptococcus B csoport izogén törzsei, melyekben a C proteingének egyedi módon mutáltak, transzpozon mutagenezissel vagy helyre irányuló mutagenezissel egyaránt előállíthatók. Az ilyen törzseket lehetőleg Southern biot technikával karakterizáljuk, annak meghatározása érdekében, hogy a kromoszómán csak egy inszerció van jelen. Az inszerciók elhelyezkedése a fentebb leírt finomszerkezetű genetikai térképezési technikák alkalmazásával határozható meg. Az izogén törzseket ezután az újszülöttpatkány-modellben (Zeligs, B. J. és munkatársai, Infec. and Immun., 37, 255-263, 1982) teszteljük a virulenciára.

A transzpozon mutagenezis lehetővé teszi a C proteinek expressziójának szabályozásában szerepet játszó gének azonosítását. Például a C proteingéneket hordozó törzsek, melyek a transzpozon mutagenezis után nem expresszálnak C proteineket, s amelyekben a transzpozon nem a C protein strukturális génben helyezkedik el, a C proteinek expressziója szabályozásában szerepet játszó szekvenciákban hordoznak mutációkat. Ezt a megközelítési módot sikeresen alkalmazták a Streptococcus A csoport mry lokuszának karakterizálásához, amely az M protein szabályozásában játszik szerepet (Caparon,

M. G. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8677-8681, 1987; Robbins, J. C. és munkatársai, J. Bacteriol., 769, 5633-5640,1987; melyeket hivatkozásul említünk). Ezek a módszerek olyan törzsek előállításához is alkalmazhatók, melyek túlexpresszálják a C proteineket, vagy amelyek megváltoztatott virulenciájú vagy immunitású C proteineket termelnek.

72. példa

A C proteinek lokalizálása B csoportba tartozó

Streptococcuson, és immunglobulinokhoz kötődő képességük értékelése

Lancefield és mások kimutatták, hogy a C proteinek elleni antitestek a B csoportba tartozó Streptococcusők külső membránjához kötődnek (Lancefield, R. C. és munkatársai, J. Exp. Med., 142, 165-179, 1975; Wagner; B. és munkatársai, J. Gén. Microbiol., 118, 95-105, 1980). Ez azt sugallja, hogy a C protein külső membránprotein. A C proteinek B csoportba tartozó Streptococcus tenyészetek felülúszóiból is izolálhatok, ami azt jelzi, hogy ezeket a proteineket a B csoportos Streptococcus szekretálja, vagy a sejtfelületről nagy arányban válnak le. A C proteingénekről származó DNS- és proteinszekvenciák értékesek a C proteinek szerkezetének és funkciójának meghatározásában. A C proteinekről általánosan leírt egyik virulenciadetermináns az IgA immunglobulinhoz való kötődési képesség (Ferrieri, P. és munkatársai, Rév. Inf. Dis., 70(2), 1004-1071, 1988; Russel-Jones, G. J. és munkatársai, J. Exp. Med., 760, 1467-1475,1984).

A specifikus antitestekkel detektált sejtfelületi determinánsok lokalizálásához immun-elektronmikroszkópos technikát alkalmaztunk. A Streptococcus B csoport C proteinklónjai ellen termelt antiszérumot C proteineket hordozó Streptococcus B törzsekkel inkubáljuk. A sejtfelületi antigén detektálásához ferritinkonjugált kecske antinyúl IgG-t alkalmaztunk, amint azt korábban leírták (Rubens, C. E. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7208-7212, 1987; Wagner, B. és munkatársai, J. Gén. Microbiol., 118, 95-105, 1980).

A C proteinek immunglobulinokhoz kötődő képességének egyszerű meghatározása Westem-blotokkal végezhető. A C proteingéneket tartalmazó E. coli kiónok és a C proteineket hordozó Streptococcus B csoportba tartozó törzsek celluláris kivonatait SDS-PAGE módszerrel futtatjuk, és nitrocellulózon lenyomatokat készítünk. Kontrollként vad típusú pUX12 plazmidot hordozó E. coli kivonatokat, C proteineket nem hordozó

HU 220 198 Β

Streptococcus B csoport törzseket, és inaktivált C proteingéneket tartalmazó, Streptococcus B csoportba tartozó izogén törzseket alkalmazunk. A Westem-blotokhoz próbaként jelölt immunglobulinok (például IgG, IgM, IgA és komponenseik, például Fc vagy F(ab)a fragmensek) alkalmazhatók (Heath, D. G. és munkatársai, Infect. and Immun., 55, 1233-1238, 1987; Russel-Jones,

G. J. és munkatársai, J. Exp. Med., 160, 1467-1475, 1984). Az immunglobulinokat előnyösen jódozzuk, jodogén anyag vagy klóramin T alkalmazásával.

A C proteinek immunglobulinokhoz vagy azok komponenseihez való kötődésének specifikusabb módja a C proteinek tisztításából és kötési vizsgálatban való közvetlen alkalmazásukból áll (Fahnestock, S. R. és munkatársai, J. Bact., 767(3), 870-880,1986; Heath, D. G. és munkatársai, Infect. and Immun., 55, 1233-1238, 1987). A proteinszekvencia alkalmazásával C protein tisztítható, sőt, mivel a C proteingének expresszálhatók E. coliban, C proteineket túltermelő E. coli törzsek hozhatók létre, s így a tisztításhoz nagyobb mennyiségű C protein nyerhető.

13. példa

A Streptococcus B csoport klónozott Cprotein antigénjeinek alkalmazása konjugált vakcinában A Streptococcus B csoport fentebb leírt, védő hatású proteinantigénjeit konjugált vakcinában való alkalmazásuk lehetőségére teszteltük. Ennek megvalósításához a fentebb leírtak szerint pJMSl és pJMS23 plazmidokat tartalmazó E. coli celluláris kivonatokat készítettünk, s ezeket nyulak immunizálásához használtuk. A kapott antiszérumot egér-letalitásmodellben az egereket Streptococcus B csoport H36B törzse által okozott fertőzéstől való védési képességére teszteltük. A H36B törzs hordozza a Streptococcus B csoport C proteinjét. Kontrollként az antiszérumegereket 515-ös Streptococcus törzs (amely nem hordozza a C proteint) fertőzésétől védő képességét határoztuk meg. E kísérlet eredményeit a 4. ábrán mutatjuk be.

14. példa

A C protein alfa-antigén és ismétlődő egységeinek szekvenciája

Amint fentebb leírtuk, a Streptococcus B csoportba (GBS) tartozó Streptococcus agalactiae az újszülöttkori vérmérgezésben és agyhártyagyulladásban, a szülés utáni méhnyálkahártya-gyulladásban és felnőttek fertőzéseiben, különösen cukorbetegekben és immunveszélyeztetett egyéneknél fontos patogén (Baker, C. J. és munkatársai, Infectious Diseases of the Fetus and Newbom Infant, Remington, J. S. és munkatársai, Saunders, Philadelphia, pp. 742-811.1990). A legjobban tanulmányozott GBS virulenciadeterminánsok a típusspecifikus tokpoliszacharidok, melyek a patogenezishez nélkülözhetetlenek (Rubens, C. E. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7208-7212,1987; Wessels, M. R. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8983-8987, 1989). A GBS felületi proteinek fertőzésben betöltött szerepe kevésbé ismert (Ferrieri, P., Rév. Infect. Dis., S363-S366, 1988; Michel, J. L. és munkatársai, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, Dunny, G. M. és munkatársai (szerkesztő), Am. Soc. Microbiol., Washington, pp. 214-218,1991). A C proteinek a legtöbb toktípusba tartozó klinikai izolátum által expresszált, felületen asszociált antigének. Az I.a, l.b és II. típusokról úgy tartják, hogy a virulenciában és az immunitásban egyaránt szerepet játszanak (Johnson, D. R. és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 19, 506-510, 1984; Madoff, L. C. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2638-2644, 1991). A két C proteinantigént, az alfát és a bétát biokémiailag és immunológiailag is leírták (Michel, J. L. és munkatársai, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, Dunny, G. M. és munkatársai (szerkesztő), Am. Soc. Microbiol., Washington, pp. 214-218,1991).

1975-ben Lancefield és munkatársai kimutatták, hogy a C proteinek ellen nyulakban termelt antitestek megvédték a C proteineket hordozó GBS-sel fertőzött egereket (Lancefield, R. C. és munkatársai, J. Exp. Med., 142, 165-179, 1975). Leírtak egy olyan, alfaantigén elleni monoklonális antitestet (4G8), amely a GBS fagocitózisos pusztulását indukálja, s megvédi az egereket a letális GBS fertőzéstől (Madoff, L. C. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 204-210, 1991; melyet hivatkozásul említünk). Amint fentebb leírtuk, az alfa- és béta-antigéneket kódoló gént Escherichia coliban klónoztuk és expresszáltuk. Kimutattuk, hogy az alfa- és béta-klónok ellen termelt antitestek különböző C proteineket ismernek fel, melyek egyedi protektív epitópokat definiálnak (Michel, J. L. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2023-2028, 1991). Az alfa- és béta-antigének függetlenül expresszálódnak, s antigén jellemzőiket tekintve különálló proteinek.

A humán szérum-IgA-hoz specifikusan kötődő C protein-béta-antigént klónozták (Michel, J. L. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2023-2028, 1991; Cleat, P. H. és munkatársai, Infect. Immun., 55, 1151-1155, 1987) és szekvenálták (Heden, L.-O. és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 21, 1481-1490, 1991; Jerlstrom, P. G. és munkatársai, Mól. Microbiol., 5, 843-849, 1991). A béta-antigén és az IgA-kötődés virulenciában betöltött szerepe azonban nem ismert. Ferrieri és munkatársai vizsgálatai (Payne, N. R. és munkatársai, J. Infect. Dis., 151, 672-681, 1985; Payne, N. R. és munkatársai, Infect. Immun., 55, 1243-1251, 1987) kimutatták, hogy a GBS C proteint hordozó törzsei rezisztensek a fagocitózisra, és gátolják az intracelluláris sejtpusztulást. Alfa-antigén-specifikus monoklonális antitest (4G8) jelenlétében a fagocitózisos sejtpusztulás egyenes arányban változik az alfa-antigén molekulatömegének növekedésével és a baktérium sejtfelületén expresszált alfa-antigén mennyiségével (Madoff, L. C. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2638-2644,1991). Az alfa-antigént expresszáló GBS törzsek specifikus antitestek hiányában rezisztensek voltak a polimorf magvú leukociták általi pusztítására, ez a rezisztencia azonban nem függ az alfa-antigén méretétől.

A bca gén itt leírt kiegészített nukleotidszekvenciája és szegélyezőszekvenciái információkat nyújtanak az

HU 220 198 Β alfa-antigén génméretéről, szerkezetéről és összetételéről. A természetes és klónozott alfa-antigén géntermékek érdekes jellemzője, hogy az egymástól hozzávetőleg 8000 Da-nal eltérő, szabályosan ismétlődő proteinlétrák expresszálása folytán proteinheterogenitást mutatnak (Madoff, L. C. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2638-2644, 1991; Michel, J. L. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2023-2028, 1991). Mivel a védő hatású 4G8 monoklonális antitest az ismétlődő régióhoz kötődik, ez a régió protektív epitópot határoz meg (Madoff, L. C., Infect. Immun., 59, 2023-2028, 1991). Számos patogénben leírtak immundomináns epitópokat kódoló, kisebb tandem ismétlődésű szekvenciákat, melyek nincsenek kapcsolatban az alfa-antigének esetében tapasztalható proteinheterogenitással (Enes, V. és munkatársai, Science, 225, 628-630, 1984; Fischetti, V. A. és munkatársai, Rév. Infect. Dis., 10 (2. függelék), S356-S359, 1988; Pereira, Μ. E. és munkatársai, J. Exp. Med., 174, 179-191,1991; Fischetti, V. A. és munkatársai, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, Dunny, G. M. és munkatársai (szerkesztő), Am. Soc. Microbiol., Washington, pp. 290-294,1991; Dailey, D. C. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2083-2088, 1991; vonEichelStreiber, C. és munkatársai, Gene, 96, 107-113, 1990). Bár az alfa-antigének maximális molekulamérete eltérő a különböző GBS törzsek esetében, ez a proteinheterogenitás állandó jellemző (Madoff, L. C. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2638-2644,1991).

A bca nukleotidszekvenciája kilenc azonos, 246 nukleotidos tandem ismétlődésű egységet tartalmaz. Ezen ismétlődő egységek által kódolt peptidek becsült mérete 8665 Da, s összefüggést mutat az alfa-antigén heterogén létrázott mintázatával. A DNS-szekvenciából leszármaztatott aminosavszekvencia az alfa-antigén és más Streptococcus proteinek között jelentős homológiákat és fontos különbségeket egyaránt mutatott (Heden, L.-O. és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 21, 1481-1490, 1991; Jerlstrom, P. G. és munkatársai, Mól, Microbiol., 5, 843-849, 1991; Fischetti, V. A. és munkatársai, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, Dunny, G. M. és munkatársai (szerkesztő), Am. Soc. Microbiol., Washington, pp. 290-294, 1991). Az alfa-antigén ismétlődő egységei a fenotípusos és genotípusos változékonyság lehetséges mechanizmusát vetik fel, s természetes helyeket biztosítanak a génátrendeződések számára, melyek az antigének diverzitását hozhatják létre.

Anyagok és módszerek

Baktériumtörzsek, plazmidok, transzpozonok és tápközeg

Az alkalmazott törzsek: A909 GBS (Streptococcus B csoport) törzs (la/C_a>p típus) (Lancefield, R. C. és munkatársai, J. Exp. Med., 142, 165-179,1975); E. coli törzsek: MC1061 és DK1 (Ausubel, F. M. és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, 1990), pCNB (Lopilato, J. és munkatársai, Mól. Gén. Génét., 205, 285-290, 1986), alfa-DH5 (a DH1 származéka; GIBCO/BRL), és NK-8032; E. coli plazmidok és kiónok: pUC12, pUX12 és pJMS23; és

Tn5seql transzpozon (Michel, J. L. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2023-2028, 1991). A pGEM7Zf(-) plazmidot a Promegától (Madison, WI, USA) vásároltuk. A pJMS23 további szubklónjait (pJMS23-l, -7, -9 és -10) az alábbiakban írjuk le. A GBS-hez és E. colihoz használt növesztő tápközeget és a szelekcióhoz alkalmazott antibiotikumokat Michel, J. L. és munkatársai. (Infect. Immun., 59, 2023-2028,1991) írták le.

DNS-manipuláció és nukleotidszekvenálási módszer

A plazmid-DNS előállításához, az oligonukleotidok szintetizálásához és tisztításához, a restrikciós endonukleázos térképezéshez, agarózgél-elektroforézishez és Southern biot hibridizációhoz alkalmazott standard eljárások leírását lásd: Ausubel F. M. és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York (1990). A DNS-manipulációhoz alkalmazott restrikciós endonukleázokat és más enzimeket (például DN-áz, RN-áz és ligáz) a New England Biolabstól és a Boehringer Mannheimtől kaptuk. A transzpozon mutagenezishez lambda-Tn5seql-et alkalmaztunk (Nag, D. K. és munkatársai, Gene, 64, 135-145,1988).

A kétszálú DNS nukleotidszekvenálásához Tn5seql transzpozon inszerciókat tartalmazó plazmidokat, a kétirányú szekvenáláshoz az Sp6 és T7 promoterek primereit, és Erasea-Base alkalmazásával egymásba ágyazott deléciókat alkalmaztunk (Promega, Madison, Wl, USA; Henikoff, S. Gene, 28, 351,1984). A gén ismétlődő régióját mindkét irányban szegélyező szekvencia meghatározásához összesen 12 prímért készítettünk. Az ismétlődő DNS-régió szekvenálását exonukleáz III-mal létrehozott, egymásba ágyazott deléciókkal egészítettük ki. A szekvenálásokhoz Sequenase kitet (version 2) alkalmaztunk, melyet a gyártó kétszálú szekvenáláshoz előírt útmutatása szerint használtunk (United States Biochemical). Adenozin-5’-(a-[³⁵S]tio)-trifoszfátot az Amershamtól kaptunk. A GenAmp PCR kitet AmpliTaq polimerázzal a gyártó útmutatásai szerint használtuk (Perkin-Elmer/Cetus).

A pJMS23-l, pJMS23-7 és pJMS23-10 szubklónokat a bca génen belüli kisebb régiók megcélzása érdekében végzett transzpozon mutagenezishez készítettük (Michel, J. L. és munkatársai Infect. Immun., 59, 2023-2028, 1991). A pJMS23-l a pUX12-ben egy 5,9 kb-os HindlII fragmenst tartalmaz. A pJMS23-7 a pJMS23-l szubklónból származó 2,8 kb-os Alul fragmenst a pUC12 polilinkerének Hincll helyére ligáivá tartalmazza. A pJMS23-10 a pJMS23-7 AkzBI/StwűI kettős restrikciós endonukleázos emésztési terméke, amely ismétlődő régiót tartalmazó 2,3 kb-os inszertet tartalmaz. Az egymásba ágyazott deléciókhoz a pJMS23-l Alul fragmensét a pGEM-7Zf(-) Smal helyére ligáltuk, miáltal a pJMS23-9-et hoztuk létre. Az egymásba ágyazott deléciókat a HindlII és Nsil helytől előre, és az EcoRI és Sphl helytől visszafelé alakítottuk ki. A szekvenáláshoz alkalmazott szubklónok, mutánsok és deléciók méretét restrikciós endonukleázos térképezéssel és/vagy a pUC12 polilinker vagy a Tn5seql (Sp6 és T7) primerei alkalmazásával PCR-rel igazoltuk.

HU 220 198 Β

Az adatok elemzéséhez Genetics Computer Group (Madison, WI) version 7 software és a National Center fór Biotechnology Information of the National Institutes of Health (Bethesda, MD) BLAST hálózatának alkalmazásával a Massachusetts General Hospital (Boston) Department of Molecular Biology számítógépét használtuk.

Monoklonális antitestek. SDS-PAGE és Western immunbiot analízis

A GBS és E. coli proteinek kivonását, az SDS-PAGE és immunbiot analízist, és a 4G8 monoklonális alfaantigén antitest próbaként való alkalmazását Madoff, L. C. és munkatársai, (Infect. Immun., 59, 2638-2644, 1991; és Infect. Immun., 59, 204-210, 1991), valamint Michel, J. L. és munkatársai. (Infect. Immun., 59, 2023-2028,1991) leírása szerint végeztük.

Eredmények

A bca nukleotidszekvenciája

A bca szekvenciájának meghatározásához az A909 GBS törzs (Ia/C típus) bca lokuszát kódoló és E. co/zban alfa-antigént expresszáló pJMS23 szubklónokat alkalmaztuk (Michel, J. L. és munkatársai. Infect. Immun., 59, 2023-2028, 1991). Ami az E. coliba klónozott Gram-pozitív gének esetében gyakran előfordul, a szubklónok közül sok nem volt stabil (Schneewind, O. és munkatársai, Infect. Immun., 56, 2174-2179, 1988). Ez a probléma a bca-ban a nagy ismétlődő DNS-régió miatt (amely több rögzített helyet biztosít a homológ rekombinációhoz) tovább bonyolódik.

A homológ rekombináció a különböző alfa-antigén funkcionális származékokat expresszáló rekombináns gazdapopuláció kialakításához használható fel előnyösen. Az ilyen populáció alfa-antigének és funkcionális származékaik elegyét expresszálhatja, s a találmány szerinti vakcina előállításában az alfa-antigén szekvenciák széles választékának biztosításához alkalmazható, melyek ellen a gazda immunreakciója irányulhat.

Annak igazolása érdekében, hogy a pJMS23 a teljes eredeti gént deléciók nélkül kódolja, az A909 törzsből származó genom-DNS Southern blotjait próbaként a klónból származó génffagmensekkel hibridizáltuk. A bca A909-ből és pJMS23-ból származó restrikciós térképében nem találtunk eltéréseket. A bca teljes nukleotidszekvenciáját mindkét szálon három különböző módszerrel határoztuk meg: Tn5seql-gyel végzett transzpozon mutagenezissel, szintetikus oligonukleotid primerekkel, és exonukleáz III egymásba ágyazott deléciókkal (5. ábra).

A bca lokusz teljes nukleotidszekvenciáját és a nagy nyitott leolvasási keretben leszármaztatott aminosavszekvenciát a 6. ábrán mutatjuk be. A strukturális gén 3063 nukleotidból áll, 1020 aminosavat kódol, s számított molekulatömege 108 705 Da. A kezdő kodontól upstream irányban (-10-nél) prokarióta konszenzusszekvencia (TATAAT) található (Dói, R. H. és munkatársai, Microbiol. Rév., 50, 227-243, 1986). A -10 régiótól upstream irányban 5-19 bázisos köztes szakaszt feltételezve a -35 régióban nincs világos homológia (Hawley, D. K. és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 11, 2237-2255,1983). A bca 5’ végén elhelyezkedő feltételezett riboszómakötési hely az AGGAGA (Shine, J. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1342-1346,1974; Gold, L. és munkatársai, Annu. Rév. Microbiol., 38, 365-403, 1981). A TAA terminációs kodontól downstream irányban két, diádszimmetriával rendelkező régió található, melyek transzkripciós terminátorként funkcionálhatnak (Brendel, V. és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 12, 4411-4127,1984).

A bca érett peptidjének leszármaztatott aminosavszekvenciájára számított pIC, érték 4,49, ami közel áll mind a természetes, mind a klónozott C protein alfaantigén kísérletesen mért értékéhez. Az alfa-antigén nem tartalmaz ciszteint, s az iniciációs kodonnál csak egy metionin található, ugyanakkor prolinban gazdag (az érett protein 11%-a), de a GBS C proteinjében azonosított XPZ motívumot (Heden, L.-O. és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 21, 1481-1490, 1991; Jerlstrom, P. G. és munkatársai, Mól. Microbiol., 5, 843-849,1991), illetve a Streptococcus A csoport M proteinjében leírt, ismétlődő prolinmotívumot (Fischetti, V. A. és munkatársai, Mól. Microbiol., 4, 1603-1605,1990) nem mutatja.

A bca leszármaztatott jelzőszekvenciája és homológiák

Az alfa-antigén sejtfelületen asszociált proteinként a citoplazmából való kijutáshoz jelzőszekvenciát tartalmaz. BLAST-vizsgálattal öt Gram-pozitív felületi proteint azonosítottunk, melyek homológiát mutatnak az alfa-antigén első 41 aminosavával (7/A. ábra). Egyéb Gram-pozitív jelzőszekvenciákkal kapcsolatban leírt minta alapján valószínű, hogy az alfa-antigén első 41 aminosava jelzőszekvenciát tartalmaz (vonHeijne, G., Eur. J. Biochem., 133, 17-21, 1983; vonHeijne, G. és munkatársai, FEBS Lett., 244, 439-446, 1989). Az Nterminális közelében nagy arányban vannak jelen arginin- és lizingyökök, melyeket hidrofób régió, a 36. helyen szerin, és a 41. helyen valin követ. A hasítási hely más lehetőségei az 54. helyen lévő valin után vagy az 52. helyen lévő szerint követő, 55. és 56. helyen elhelyezkedő alaningyököknél találhatók. Feltételezve, hogy a jelzőszekvencia a 41. aminosav után hasad le, az érett protein 979 aminosavat tartalmaz, s így molekulatömege 104 106 Da. Ez azt jelenti, hogy a jelzőszekvenciát 123 nukleotid kódolja, ami a gén 4%-át teszi ki, s molekulatömege 4616 Da. A jelzőszekvencia e méretét alátámasztó további bizonyíték a Westem-blot analízisből származik, mellyel (próbaként 4G8 monoklonális antitest alkalmazásával) a természetes és klónozott alfa-antigének méretét hasonlítottuk össze. Amint a 8. ábrán látható, a pJMS23 klónból származó alfa-antigén protein létra valamennyi hézaga némiképp nagyobb, mint a GBS A909 törzsből származó természetes proteiné, amiből arra következtethetünk, hogy a jelzőszekvencia a GBS-től eltérően az E. coliban nem hasad le. A méretkülönbség körülbelül 4 kDa, ami a bca-ban inkább a rövidebb (41 aminosavas), mint a hosszabb (53-55 aminosavas) jelzőszekvenciának felel meg.

A bca N-terminálisának analízise

A feltételezett jelzőszekvenciát követően az ismétlődő szekvenciák előtt 185 aminosav hosszúságú régió he23

HU 220 198 Β lyezkedik el. Az N-terminális régió 555 nukleotidot tartalmaz, s így a gén 18%-át teszi ki, amely 20 417 Da feltételezett molakulatömegű polipeptidet kódol. A primer nukleotidszekvenciát és a leszármaztatott aminosavszekvenciát (a bca N-terminálisának mind a hat leolvasási keretében) a GenBank és Swiss-Prot szekvenciáival BLAST programhálózat alkalmazásával összehasonlító számítógépes kereséssel nem találtunk homológiákat, ami arra utal, hogy a gén e régiója valószínűleg nem egy korábban szekvenált vagy leírt nukleinsav- vagy aminosavszekvenciának felel meg.

A bca ismétlődő egységeket tartalmazó régiója

A DNS-szekvencia 679. nukleotidjával kezdődően kilenc nagy, azonos nukleinsav- (illetve aminosav-) szekvenciával rendelkező tandem ismétlődésű egység található, melyek a gén 74%-át teszik ki. A bca e régiójának méretét és ismétlődő természetét a 9. ábrán mutatjuk be. Valamennyi ismétlődő egység 246 nukleotidból áll, melyek 8665 Da számított molekulatömegű, 82 aminosavas szakaszokat kódolnak. A teljes ismétlődő régió 749 aminosavat tartalmaz, s a 9 azonosan ismétlődő egységből, és egy 9’ jelzésű, részlegesen ismétlődő egységből áll. E régió számított molekulatömege 79 053 Da.

Az ismétlődő régió kezdetének és végének meghatározása némileg önkényes. Esetünkben a meghatározás az N-terminálison indul, a nyitott leolvasási keret első kodonjától kezdődően. Kívánság szerint az ismétlődő egységek kezdete a kereten kívül vagy a C-terminális oldalról indulva is definiálható. A nukleinsav- és leszármaztatottaminosav-homológiákra végzett BLAST számítógépes keresés az ismétlődő egységek esetében jelentős egyezést mutatott. Ennek megfelelően ezek az ismétlődő egységek az alfa-antigénre egyedülállóan jellemzőnek tűnnek, s méretben és szerkezetben eltérnek az egyéb Streptococcus proteinek esetében leírtaktól (Heden, L.-O. és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 21, 1481-1490, 1991; Jerlstrom, P. G. és munkatársai, Mól. Microbiol., 5, 843-849, 1991; Fischetti, V. A. és munkatársai, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, Dunny, G. M. és munkatársai (szerkesztő), Am. Soc. Microbiol., Washington, pp. 290-294, 1991; Yother, J. és munkatársai, J. Bacteriol., 174, 601-609,1992).

A bca C-terminális kihorgonyzó (anchor) szakasza és homológiák

Az ismétlődő egységek után egy 148 nukleotidból álló, rövid C-terminális régió található, mely a gén 4,4%-át teszi ki. Ez a régió 45 aminosavat kódol, melyek számított molekulatömege 4672 Da. Az aminosavhomológiák BLAST keresésével Gram-pozitív felületi proteinek osztályát azonosítottuk, melyek közös membránkihorgonyzó motívumot tartalmaznak; ezek közé tartoznak a Streptococcus A csoport M proteinjei, és a Streptococcus A és G csoportból származó IgG-kötő proteinek (Wren, B. W., Mól. Microbiol., 5, 797-803, 1991). A C-terminális aminosav összetétele jellemző a peptid membránkihorgonyzó szekvenciájára, amely az LPXTGE motívum (2. számú szekvencia) előtt lizint tartalmazó hidrofil szakaszt tartalmaz (7/B. ábra) (Fischetti, V. A. és munkatársai, Mól. Microbiol., 4, 1603-1605,1990). Ezt a PPFFXXAA konszenzusszekvenciát (1. számú szekvencia) tartalmazó hidrofób régió követi (ahol X hidrofób aminosavat jelent). A peptid végén aszparaginsavval végződő hidrofil farok található, amely feltehetően benyúlik a sejt citoplazmájába.

A nukleotidszekvencia és a leszármaztatott alfa-antigén protein analízise

A 9. ábrán a bca nyitott leolvasási keretén belüli négy különböző régiót mutatjuk be, melyeket a nukleotid- és az abból származtatott aminosavszekvenciák alapján határoztunk meg. Az aminosavszekvencia hidrofobitási görbéje azt mutatja, hogy a feltételezett jelzőszekvencia egy rövid, hidrofil N-terminálissal rendelkezik, amelyet egy hidrofób szakasz követ, s hidrofil régióban végződik, míg a C-peptid membránkihorgonyzó (anchor) szekvencia egy sejtfalat átérő, hidrofób domént és egy rövid hidrofób farkat tartalmaz (Engelman, D. M. és munkatársai, Annu. Rév. Biophys. Chem., 75, 321-353, 1986; Kyte, J. és munkatársai, J. Mól. Bioi., 157, 105-132, 1982).

A természetes antigént futtatva szabályosan ismétlődő intervallumokkal polipeptidlétrát kapunk, amely a klónozott géntermék esetében is megfigyelhető (8. ábra). A óca-ban az egyes ismétlődések 8665 Da molekulatömegű polipeptidet kódolnak, ami megfelel a proteinlétrában tapasztalható méretbeli különbségeknek. A proteinheterogenitás lehetséges mechanizmusának kiderítése érdekében bca nulkeotidszekvenciákat, és az abból leszármaztatott RNS- és proteinszekvenciákat tanulmányoztunk. A bca nukleotidszekvencia analízisével az ismétlődő régiókon belül nem sikerült olyan kodonokat kimutatni, amelyek a transzláció korai befejeződését (terminációját) okozhatnák. Ezenkívül, az ismétlődő régiók aminosavszekvenciáját potenciális proteolitikus hasítási helyek keresése érdekében Genetics Computer Group programmal vizsgáltuk át. Valamennyi ismétlődő egységben egy hely volt érzékeny a 2,5-ös pH-ra, s ez aszparaginsavból és az utána következő prolinból állt. Ezek a helyek azonban megtalálhatók az N-terminálisban is. Bár az alfa-antigén viszonylag rezisztens a tripszinnel szemben, a szekvenciában számos potenciális tripszinhasítási helyet találtunk. Az RNS-szekvencia és a harmadlagos szerkezet modellezésével az ismétlődéseken belül nem sikerült olyan régiókat azonosítani, melyek szerepet játszhatnak az RNS-közvetített önhasításban.

Diszkusszió

A Streptococcus B csoport (GBS) alfa-antigénjével kapcsolatban két biológiai tulajdonságot azonosítottak; az egyik, hogy specifikus antitestek hiányában rezisztensek a fagocitózisra, a másik pedig a védő hatású antitesteket kiváltó epitópok expressziója (Madoff, L. C. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2638-2644, 1991; Lancefield, R. C. és munkatársai, J. Exp. Med., 142, 165-179, 1975; Payne, N. R. és munkatársai, J. Infect. Dis., 151, 672-681, 1985; Payne, N. R. és munkatársai, Infect. Immun., 55, 1243-1251, 1987). Az alfaantigén szekvenciájának analízise négy különböző szerkezeti domént eredményez. A feltételezett N-terminális

HU 220 198 Β jelzőszekvencia és a C-terminális membránkihorgonyzó szekvencia alátámasztja azt a feltételezést, hogy az alfa-antigén felületen asszociált membránprotein. Ezek a tulajdonságok az ismétlődő egységmotívummal együtt számos Gram-pozitív baktériumproteinre jellemzők, melyekről úgy tartják, hogy szerepet játszanak a bakteriális fertőzések patogenezisében (Fischetti, V. A. és munkatársai, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, Dunny, G. M. és munkatársai (szerkesztő), Am. Soc. Microbiol., Washington, pp. 290-294, 1991).

Az alfa-antigén szekvenciájában egy tandem ismétlődésű egységekből álló nagy régió azonosítható, amely a gén 74%-át teszi ki, s amely nem mutat homológiát a korábban leírt protein- vagy nukleinsavszekvenciákkal. Ennek ellenére számos virulenciával kapcsolatos protein tartalmaz sokszorosan ismétlődő elemeket. A Streptococcus A csoport M proteinje, amely fagocitózist gátló hatású, protektív epitópokat hordoz, és az antigén méretét és prezentálását illetően változékonyságot mutat, két kiterjedt tandem ismétlodésű régiót, és egy nem tandem ismétlődésű régiót tartalmaz, melyek nukleotidszekvenciái a gén majdnem 2/3-át foglalják el (Fischetti, V. A. és munkatársai, Rév. Infect. Dis., S356-S359, 1988; Hollingshead, S. K. és munkatársai, J. Bioi. Chem., 261, 1677-1686,1986; Haanes, E. J. és munkatársai, J. Bacteriol., 171, 6397-6408, 1989). Az M proteinben az egyes ismétlődések kisebbek, mint az alfa-antigénben; méretük 21 bázispártól 81 bázispárig terjed. Az ismétlődő egységek között az ismétlődő régiók végénél ráadásul eltérés tapasztalható, míg a középső régiók közel azonosak. Az A Pneumococcus felületi protein maximálisan 10, egyenként 20 aminosavas ismétlődő szakaszt tartalmaz (Yother, J. és munkatársai, J. Bacteriol., 174, 601-609, 1992). Az M protein és az A Pneumococcus felületi protein az antigén tulajdonságokat illetően egyaránt változékonyságot mutat, s úgy tartják, hogy a protein és a gén méretének változásait a strukturális génjeikben ismétlődő DNS-szekvenciák közvetítik (Fischetti, V. A. és munkatársai, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, Dunny, G. M. és munkatársai (szerkesztő), Am. Soc. Microbiol., Washington, pp. 290-294, 1991; Yother, J. és munkatársai, J. Bacteriol., 174, 601-609, 1992; Haanes, E. J. és munkatársai, J. Bacteriol., 171, 6397-6408, 1989). Egyéb ismétlődő motívumokat tartalmazó Gram-pozitív baktériumgének közé tartoznak a Streptococcus sobrinusból és a Streptococcus mutánsból származó glikotranszferáz gének (Ferretti, J. J. és munkatársai, J. Bacteriol., 169, 4271-4278, 1987; Shiroza, T. és munkatársai, J. Bacteriol., 170, 810-816,1988). Ismétlődő szekvenciákkal kapcsolatos immundomináns epitópokat számos más patogén organizmus esetében azonosítottak, köztük a Rickettsia rickettsiiben, a Trichomonas vaginalisban és a Clostridium difficileben (Dailey, D. C. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2083-2088,1991; Anderson, Β. E. és munkatársai, Infect. Immun., 58, 2760-2769, 1990; vonEichel-Streiber, C. és munkatársai, Gene, 96, 107-113, 1990). Az alfa-antigénekben található ismétlődések három okból is egyedülállóak: (i) a más Grampozitív felületi proteinekben találhatóknál nagyobbak; (ii) nukleinsavszinten azonosak; (iii) az ismétlődő egységek által kódolt protein mérete megfelel a természetes és klónozott alfa-antigének futtatásával kapott létrázottságnak.

A nagy, tandem ismétlodésű egységek felfedezése az alfa-antigén genotípusos és fenotípusos változékonyságával kapcsolatban sok kérdést vet fel. Western immunbiotokon 4G8 monoklonális antitestpróbával végzett hibridizálással a természetes és klónozott alfa-antigén egyaránt szabályos, körülbelül 8 kDa-nal eltérő proteinlétrát mutatnak, és az alfa-antigén mérete az egyes törzsek esetében változik (Madoff, L. C. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2638-2644, 1991). Az eredeti pJMS23 alfa-antigén klón restrikciós térképezése több, körülbelül 270 bázispár nagyságú 5íyl ffagmenst eredményezett (Michel, J. L. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2023-2028, 1991). Mivel az A909 törzs a bca csak egy példányát tartalmazza, feltételeztük, hogy ezek a ffagmensek lehetnek felelősek a protein heterogenitásáért. A nukleotidszekvencia megerősíti a gén ismétlődő jellegét, de nem határozza meg a proteinlétra kialakulásának mechanizmusát.

Mivel mind a természetes, mind a klónozott háttér esetén több proteinméret tapasztalható, s géncsalád létezésére nincs bizonyíték, feltételezzük, hogy a proteinlétra az E. coliban és a GBS-ben közös mechanizmus eredménye, amit az alfa-antigénre specifikus tulajdonság közvetít. Az ismétlődő régión belüli Tn5 transzpozon inszerciós mutációkkal végzett Western biot analízis eredménye szintén létrázottságot mutat, bizonyítva ezzel, hogy a C-terminális nem szükséges a heterogenitáshoz, ami azt sugallja, hogy az N-terminális vagy az ismétlődő régió is meghatározhatja a proteinlétrázottságot.

Az alfa-antigén GBS izolátumokban monoklonális antitest alkalmazásával végzett vizsgálatai azt mutatták, hogy az alfa-antigén maximális molekulamérete egy adott izolátumban állandó, de a különböző izolátumok esetében tág határok között változik (Madoff, L. C. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2638-2644, 1991). A tandem ismétlődő egységek alkalmas rögzített helyeket biztosítanak az ismétlődő régió deléciójához vagy duplikációjához. A deléció csökkentheti a gén méretét, és a DNS-replikáció során egyenlőtlen crossover vagy hibás párosítást eredményező templátcsúszás következtében fordulhat elő (Harayama, S. és munkatársai, J. Bacteriol., 173, 7540-7548, 1991). A DNS duplikációja lehet az ismétlődésen belüli mutációk sokszorozásának mechanizmusa, ami antigéndiverzitást eredményez. Arról azonban nincs bizonyítékunk, hogy az alfa-antigén protein méretének változása az antigén tulajdonság változékonyságát és különböző protektív vagy fagocitózist elősegítő epitópok expresszióját vonná maga után.

Az A909 törzsből származó alfa-antigénben található kilenc teljes tandem ismétlődés nukleinsavszinten azonos, ami nagy mértékben konzervált szerkezetet bizonyít. Ez azt sugallja, hogy az ismétlődéseket eredmé25

HU 220 198 Β nyező duplikáció az utóbbi időben bekövetkezett esemény; léteznek az ismétlődésekre jellemző belső tulajdonságok, melyek fenntartják integritásukat; vagy szerkezetük nélkülözhetetlen a gén számára. Az alfa-antigént hordozó GBS törzsekből származó genom-DNS Southern blotjai, melyekhez próbaként alfa-antigénspecifikus DNS-t alkalmaztunk, az egyes törzsek között méretbeli változékonyságot mutatnak. A törzsek közötti genotípusos diverzitás mechanizmusának megértése érdekében más fenotípusvariánsokból származó bca klónozására és szekvenálására, valamint a C proteint hordozó GBS törzsek közötti filogenetikai kapcsolat meghatározására lesz szükség (Michel, J. L. és munkatársai, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, Dunny, G. M. és munkatársai (szerkesztő), Am. Soc. Microbiol., Washington, pp. 214-218, 1991; Michel, J. L. és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2023-2028, 1991; Cleat, P. H. és munkatársai, Infect. Immun., 55, 1151-1155, 1987; Heden, L.-O. és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 21, 1481-1490,1991; Lindahl, G. és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 20, 2241-2247,1990).

Összegzésül: mind a természetes alfa-antigén, mind a klónozott géntermék Western biot analízise heterogén polipeptidek szabályos létrázott mintázatát eredményezte. A bca lokusz nukleotidszekvenciája 108 705 Da molekulatömegű prekurzor proteint kódoló, 3060 nukleotid hosszúságú nyitott leolvasási keretet tartalmaz. A 41 aminosavas, feltételezett jelzőszekvencia hasítása 104 106 Da molekulatömegű érett proteint eredményez. A 20 417 Da molekulatömegű N-terminális régió nem mutat homológiát a korábban leírt proteinszekvenciákkal, s kilenc tandem ismétlődésű egységből álló sorozat követi, amely az érett protein 74%-át teszi ki. Valamennyi ismétlődő egység azonos; az egyes egységek 82 aminosavból állnak, melyeket 246 nukleotid kódol, s 8665 Da molekulatömegűek. Az ismétlődő egységek mérete megfelel a GBS által expresszált alfa C proteinek heterogén létrájában megfigyelt különbségeknek. Az alfa-antigén C-terminális régiója membránkihorgonyzó dómén motívumot tartalmaz, amely számos Gram-pozitív felületi proteinre jellemző. A bca-ban az azonos ismétlődő egységekből álló nagy régió protektív epitopokat határoz meg, s szerkezete az alfa-antigén fenotípusos és genotípusos diverzitására irányulóan védő hatású vakcinák előállítása érdekében manipulálható.

15. példa

Legalább egy eredeti ismétlődő egységgel rendelkező C protein alfa-antigén funkcionális származékot tartalmazó vakcina

A C protein alfa-antigén fentebb leírt funkcionális származékai (úgymint az N, C, N-C, R_b R₂, R₃, R4, R₅, Rg, R7, Rg, R₉, N-R_b N-R₂, N-R₃, N-R₄, N-R_5j N-R₆, N-R7, N-Rg, N-R9, R|-C, R₂-C, R₃-C, R₄-C, R5-C, R5C, R₇-C, Rg-C, R9-C, N-R_rC, N-R₂-C, N-R₃-C, N-R₄C, N-Rj-C, N-R₆-C, N-R₇-C, N-Rg-C, N-R9-C proteinrészek) a természetes Streptococcus B csoport alfa- és béta-antigén gazdákban (mint például E. coliban) történő klónozásához és expresszálásához fentebb leírt módszerekhez hasonló rekombináns eljárásokkal állíthatók elő. Az alfa-antigén kívánt funkcionális származéka szekvenciájának szintetizálásához bármely technika alkalmazható, beleértve az e proteinek rekombináns előállításához fentebb leírtakat, valamint a Williams, J. I. és munkatársai (5 089 406 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; „Method of Producing a Gene Casette Coding fór Polypeptides with Repeating Amino Acid Sequences”, melyet hivatkozásul említünk) és McPherson, M. J. (szerkesztő) („Directed Mutagenesis, A Practical Approach”, IRL Press, New York, 1991) által leírtakat.

A fentebb leírt, rekombináns módszerekkel expresszált, protektív C protein alfa-antigén funkcionális származékok (úgymint az N, C, N-C, R_b R₂, R₃, R4, R₅, R*, R₇, Rg, Rg, N-R_b N-R₂, N-R₃, N-R* N-R_s, NR^, N-R₇, N-Rg, N-R9, R|-C, R₂-C, R₃-C, R₄-C, R5-C, R^-C, R₇-C, R₈-C, R₉-C, N-R,-C, N-R₂-C, N-R₃-C, NR₄-C, N-Rj-C, N-Ro-C, N-R₇-C, N-Rg-C, N-R9-C proteinrészek) szükség esetén a rekombináns gazdából vagy a tápközegből, a tudományban ismert technikák alkalmazásával tisztíthatok, majd konjugált vakcinában való alkalmazási lehetőségükre (potenciáljukra) tesztelhetők. Az egyes peptideket önmagukban vagy más peptidekkel együtt tesztelhetjük. E potenciál értékeléséhez a fentebb leírtak szerint rekombináns plazmidokat tartalmazó E. coli kivonatokat készítünk, melyeket nyulak immunizálásához alkalmazunk. A kapott antiszérumot egér-letalitásmodellben arra teszteljük, hogy képes-e az egereket a Streptococcus B csoportba tartozó H36B törzs által okozott fertőzéstől megvédeni. Kontrollként az antiszérum azon képességét határozzuk meg, hogy képes-e az egereket az 515-ös Streptococcus törzs (amely nem hordoz C proteint) által okozott fertőzés ellen megvédeni.

A konjugált vakcinaalak (melyben a peptidet a tudományban ismert, fentebb leírt eljárások alkalmazásával Streptococcus B csoport poliszacharidhoz konjugáljuk) teszteléséhez hasonló vizsgálatot alkalmazunk. A konjugált vakcinához lehetőleg Streptococcus B csoport tokpoliszacharidot alkalmazunk. A konjugált vakcinákat nyulak immunizálásához használjuk. A kapott antiszérumot egér-letalitásmodellben arra teszteljük, hogy képes-e az egereket a Streptococcus B csoportba tartozó H36B törzs által okozott fertőzéstől megvédeni. A H36B törzs Streptococcus B csoport C proteint hordoz. Kontrollként az antiszérum azon képességét határozzuk meg, hogy képes-e az egereket az 515-ös Streptococcus törzs (amely nem hordoz C proteint) által okozott fertőzés ellen megvédeni.

Bár az eddigi leírás a különösen előnyben részesített megvalósítási módokra vonatkozik, tudni kell, hogy a találmány nem korlátozódik csupán ezekre. A szakemberek számára nyilvánvaló lesz, hogy a leírt megvalósítási módokban különféle módosítások hajthatók végre, melyeket a találmány területébe tartozónak tekintünk.

HU 220 198 Β

Szekvencialista Szekvenciák száma: 29

TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA Pro Pro Phe Phe Xaa Xaa Alá Alá 1 5

TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSSÁG: 6 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA Leu Pro Xaa Thr Gly Glu 1 5

TUDNIVALÓK A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: mindkettő (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA GATCCATTGT GCTGG 1 5

TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 11 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: mindkettő (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA GTAACACGAC C 11

TUDNIVALÓK AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: mindkettő (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ACACGAGATT TC 1 2

TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSSÁG: 57 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: mindkettő (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA

ATGACCATGA TTACGAATTC GAGCTCGCCC GGGGATCCAT TGTGCTGGAA AGCCACC 57

HU 220 198 Β

TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 16 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: mindkettő (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA GGATCCATTG TGCTGG 1 6

TUDNIVALÓK A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 32 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: mindkettő (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA GGATCCATTG TGCTGGCCAG CACAATGGAT CC

TUDNIVALÓK A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: mindkettő (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA GGATCCATTG TG 1 2

TUDNIVALÓK A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: mindkettő (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA GGATCCATTG TGCTCTAAAG 20

TUDNIVALÓK All. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: mindkettő (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA CGAATTAATT CG 12

TUDNIVALÓK A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 13 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: mindkettő (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA TCGAGCGGGC CCC 13

TUDNIVALÓK A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: mindkettő

HU 220 198 Β (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA AATTCGCGCC CGGGG 15

TUDNIVALÓK A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 1380 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KÓD: kódolórégió/CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 79... 1173 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KÓD: különböző sajátosságok (B) ELHELYEZKEDÉS: 1004 (D) EGYÉB TUDNIVALÓ: megjegyzés: „Ez a sajátosság azt jelenti, hogy a 757. helytől az 1003. helyig terjedő nukleotidszekvencia az 1004. helyre inszertálva maximálisan nyolcszor ismétlődhet (a polinukleotidon belül e szekvenciákból összesen kilenc ismétlődő kópia lehet jelen.)” (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA AGCATAGATA TTCTAATATT TGTTGTTTAA GCCTATAATT TACTCTGTAT AGAGTTATAC 60

AGAGTAAAGG AGAATATT ATG Me t

TTT Phe

AGA Arg

AGG TCT

AAA Ly s

AAT Asn

AAC Asn

AGT Ser

TAT Tyr 10

GAT Asp

111

Arg

Ser 5

1

ACT

TCA CAG ACG AAA CAA

CGG

TTT

TCA

ATT

AAG

AAG

TTC

AAG

TTT

GGT

159

Thr

Ser Gin Thr Lys Gin 15

Arg

Phe

Ser 20

Ile

Ly s

Ly s

Phe

Lys 25

Phe

Gly

GCA

GCT TCT GTA CTA ATT

GGT

CTT

AGT

TTT

TTG

GGT

GGG

GTT

ACA

CAA

207

Al a

Alá Ser Val Leu Ile 30

Gly

Leu 35

Ser

Phe

Le u

Gly

Gly 40

Val

Thr

Gin

GGT

AAT CTT AAT ATT TTT

GAA

GAG

TCA

ATA

GTT

GCT

GCA

TCT

ACA

ATT

255

Gly

Asn Leu Asn Ile Phe 45

Glu 50

Glu

Ser

Ile

Va 1

Al a 55

Al a

Ser

Thr

Ile

CCA

GGG AGT GCA GCG ACC

TTA

AAT

ACA

AGC

ATC

ACT

AAA

AAT

ATA

CAA

303

Pro 60

Gly Ser Alá Alá Thr 65

Leu

As n

Thr

Ser

Ile 70

Thr

Ly s

Asn

Ile

Gin 75

AAC

GGA AAT GCT TAC ATA

GAT

TTA

TAT

GAT

GTA

AAA

TTA

GGT

AAA

ATA

351

Asn

Gly Asn Alá Tyr Ile 80

Asp

Leu

Tyr

Asp 85

Va 1

Ly s

Leu

Gly

Lys 90

Ile

GAT

CCA TTA CAA TTA ATT

GTT

TTA

GAA

CAA

GGT

TTT

ACA

GCA

AAG

TAT

399

Asp

Pro Leu Gin Leu Ile 95

Val

Leu

Glu 100

Gin

Gly

Phe

Thr

Al a 105

Lys

Tyr

GTT

TTT AGA CAA GGT ACT

AAA

TAC

TAT

GGG

GAT

GTT

TCT

CAG

TTG

CAG

447

Val

Phe Arg Gin Gly Thr 110

Ly s

Tyr 115

Tyr

Gly

As p

Val

Ser 120

Gin

Leu

Gin

AGT

ACA GGA AGG GCT AGT

CTT

ACC

TAT

AAT

ATA

TTT

GGT

GAA

GAT

GGA

495

Ser

Thr Gly Arg Alá Ser 125

Leu 130

Thr

Tyr

Asn

Ile

Phe 135

Gly

Glu

Asp

Gly

CTA

CCA CAT GTA AAG ACT

GAT

GGA

CAA

ATT

GAT

ATA

GTT

AGT

GTT

GCT

543

Leu 140

Pro His Val Lys Thr 145

As p

Gly

Gin

Ile

As p 150

Ile

Val

Se r

Val

Al a 155

TTA

ACT ATT TAT GAT TCA

ACA

ACC

TTG

AGG

GAT

AAG

ATT

GAA

GAA

GTT

591

Leu

Thr Ile Tyr Asp Ser 160

Thr

Thr

Leu

Arg 165

Asp

Ly s

Ile

Glu

Glu 170

Val

AGA

ACG AAT GCA AAC GAT

CCT

AAG

TGG

ACG

GAA

GAA

AGT

CGT

ACT

GAG

639

Arg

Thr Asn Alá Asn Asp 175

Pro

Lys

Trp 180

Thr

Glu

Glu

Ser

Arg 185

Thr

Glu

GTT

TTA ACA GGA TTA GAT

ACA

ATT

AAG

ACA

GAT

ATT

GAT

AAT

AAT

CCT

687

Va 1

Leu Thr Gly Leu Asp 190

Thr

Ile 195

Ly s

Thr

As p

Ile

Asp 200

Asn

Asn

Pro

HU 220 198 Β

AAG ACG CAA ACA	GAT ATT GAT AGT AAA ATT GTT GAG GTT AAT GAA TTA	735
Lys Thr Gin Thr 205	Asp Ile Asp Ser Lys Ile Val Glu Val Asn Glu Leu 210 215
GAG AAA TTG TTA	GTA TTG TCA GTA CCG GAT AAA GAT AAA TAT GAT CCA	783
Glu Lys Leu Leu 220	Val Leu Ser Val Pro Asp Lys Asp Lys Túr Asp Pro 225 230 235
ACA GGA GGG GAA	ACA ACA GTA CCC CAA GGG ACA CCA GTT TCA GAT AAA	831
Thr Gly Gly Glu	Thr Thr Val Pro Gin Gly Thr Pro Val Ser Asp Lys 240 245 250
GAA ATC ACA GAC	TTA GTT AAG ATT CCA GAT GGC TCA AAA GGG GTT CCG	879
Glu Ile Thr Asp 255	Leu Val Lys Ile Pro Asp Gly Ser Lys Gly Val Pro 260 265
ACA GTT GTT GGT	GAT CGT CCA GAT ACT AAC GTT CCT GGA GAT CAT AAA	927
Thr Val Val Gly 270	Asp Arg Pro Asp Thr Asn Val Pro Gly Asp His Lys 275 280
GTA ACG GTA GAA	GTA ACG TAT CCA GAT GGA ACA AAG GAT ACA GTA GAA	975
Val Thr Val Glu 285	Val Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Lys Asp Thr Val Glu 290 295
GTA ACG GTT CAT	GTG ACA CCA AAA CCA GTA CCG GAT AAA GAT AAA TAT	1023
Val Thr Val His 300	Val Thr Pro Lys Pro Val Pro Asp Lys Asp Lys Tyr 305 310 315
GAT CCA ACA GGT	AAA GCT CAG CAA GTC AAC GGT AAA GGA AAT AAA CTA	1071
Asp Pro Thr Gly	Lys Alá Gin Gin Val Asn Gly Lys Gly Asn Lys Leu 320 325 330
CCA GCA ACA GGT	GAG AAT GCA ACT CCA TTC TTT AAT GTT GCA GCT TTG	1119
Pro Alá Thr Gly 335	Glu Asn Alá Thr Pro Phe Phe Asn Val Alá Alá Leu 340 345
ACA ATT ATA TCA	TCA GTT GGT TTA TTA TCT GTT TCT AAG AAA AAA GAG	1167
Thr Ile Ile Ser 350	Ser Val Gly Leu Leu Ser Val Ser Lys Lys Lys Glu 355 360
GAT TAATCTTTTG ACCTAAAATG TCACTAAATT TTTCACCATT TATTGGTGTG Asp	12

365

AACACATTAA TAAAGTTATG CATCTCTCTC CAACAAAATT AATTAAAGTG TTTCAATTTT 1280 TCGAGATTAA TTCTTGAAAA AAGCCTATCG AGATTATTAA TTTCGATAGG CTTTTGATTT 1340 TGTGTAAGCG TCCAATATAC CTTGTTATTG GACGCTTACT 1380

TUDNIVALÓK A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 364 aminosav (B) TÍPUS aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KÓD: különböző sajátosságok (B) ELHELYEZKEDÉS : 310 (D) EGYÉB TUDNIVALÓ: megjegyzés: „Ez a sajátosság azt jelenti, hogy a 227. helytől a 310. helyig terjedő aminosavszekvencia a 310. helyre inszertálva maximálisan nyolcszor ismétlődhet (hogy a polipeptiden belül a szekvenciákból összesen kilenc példány legyen.)” (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Me t 1

Phe

Arg

Arg

Ser 5

Ly s

Asn

Asn

Ser

Tyr 10

Asp

Thr

Ser

Gin

Thr

Ly s

Gin

Arg

Phe

Ser

Ile

Ly s

Ly s

Phe

Lys

Phe

Gly

15

20

25

Al a

Al a

Ser

Val

Leu

Ile

Gly

Leu

Ser

Phe

Leu

Gly

Gly

Val

Thr

Gin

30

35

40

Gly

Asn

Leu

Asn

I le

Phe

Glu

Glu

Ser

Ile

Val

Al a

Al a

Ser

Thr

Ile

45

50

55

HU 220 198 Β

Pro

Gly

Ser

Al a

Al a

Thr

Leu

Asn

Thr

Ser

Ile

Thr

Ly s

As n

Ile

Gin

60

65

70

75

Asn

Gly

Asn

Alá

Tyr

Ile

Asp

Leu

Tyr

As p

Va 1

Lys

Leu

Gly

Lys

Ile

80

85

90

Asp

Pro

Leu

Gin

Leu

Ile

Val

Leu

Glu

Gin

Gly

Phe

Thr

Al a

Ly s

Tyr

95

100

105

Val

Phe

Arg

Gin

Gly

Thr

Ly s

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Val

Ser

Gin

Leu

Gin

110

115

120

Ser

Thr

Gly

Arg

Al a

Ser

Leu

Thr

Tyr

Asn

Ile

Phe

Gly

Glu

As p

Gly

125

130

135

Leu

Pro

Hi s

Val

Ly s

Thr

Asp

Gly

Gin

Ile

As p

Ile

Val

Ser

Val

Al a

140

145

150

155

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asp

Ser

Thr

Thr

Leu

Arg

As p

Ly s

Ile

Glu

Glu

Val

160

165

170

Arg

Thr

Asn

Al a

Asn

As p

Pro

Ly s

Trp

Thr

Glu

Glu

Ser

Arg

Thr

Glu

175

180

185

Val

Leu

Thr

Gly

Leu

Asp

Thr

Ile

Ly s

Thr

Asp

Ile

Asp

As n

Asn

Pro

190

195

200

Lys

Thr

Gin

Thr

Asp

Ile

Asp

Ser

Lys

Ile

Val

Glu

Val

Asn

Glu

Leu

205

210

215

Glu

Lys

Leu

Leu

Val

Leu

Ser

Val

Pro

Asp

Lys

Asp

Lys

Túr

Asp

Pro

220

225

230

235

Thr

Gly

Gly

Glu

Thr

Thr

Val

Pro

Gin

Gly

Thr

Pro

Val

Ser

Asp

Lys

240

245

250

Glu

Ile

Thr

As p

Leu

Val

Ly s

Ile

Pro

Asp

Gly

Ser

Lys

Gly

Val

Pro

255

260

265

Thr

Va 1

Va 1

Gly

Asp

Arg

Pro

As p

Thr

Asn

Va 1

Pro

Gly

As p

Hi s

Ly s

270

275

280

Val

Thr

Val

Glu

Val

Thr

Tyr

Pro

Asp

Gly

Thr

Ly s

As p

Thr

Val

Glu

285

290

295

Val

Thr

Val

Hi s

Val

Thr

Pro

Ly s

Pro

Va 1

Pro

As p

Ly s

As p

Lys

Tyr

300

305

310

315

As p

Pro

Thr

Gly

Lys

Alá

Gin

Gin

Va 1

Asn

Gly

Ly s

Gly

Asn

Lys

Leu

320

325

330

Pro

Al a

Thr

Gly

Glu

Asn

Al a

Thr

Pro

Phe

Phe

Asn

Val

Al a

Al a

Leu

335

340

345

Thr

Ile

Ile

Ser

Ser

Val

Gly

Leu

Leu

Ser

Val

Ser

Ly s

Ly s

Lys

Glu

350 355 360

Asp

TUDNIVALÓK A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 56 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Me t 1

Phe

Arg

Arg

Ser 5

Ly s

Asn

Asn

Ser

Tyr 10

Asp

Thr

Ser

Gin

Thr 15

Lys

Gin

Arg

Phe

Ser

Ile

Lys

Lys

Phe

Lys

Phe

Gly

Al a

Al a

Ser

Va 1

Leu

20

25

30

Ile

Gly

Leu

Ser

Phe

Leu

Gly

Gly

Va 1

Thr

Gin

Gly

Asn

Leu

Asn

Ile

35

40

45

Phe

Glu

Glu

Ser

Ile

Val

Al a

Al a

50

55

TUDNIVALÓK A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 37aminosav (B) TÍPUS: aminosav

HU 220 198 Β (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Me t 1

Phe

Lys

Ser

Asn 5

Tyr

Glu

Arg

Lys

Me t 10

Arg

Tyr

Ser

Ile

Arg 15

Ly s

Phe

Ser

Val

Gly

Val

Al a

Ser

Va 1

Al a

Val

Arg

Ser

Leu

Phe

Me t

Gly

20

25

30

Ser

Va 1

Al a

Hi s

Al a

TUDNIVALÓK A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 41 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Me t 1

Al a

Arg

Gin

Gin 5

Thr

Ly s

Ly s

As n

Tyr 10

Ser

Leu

Arg

Ly s

Le u 15

Ly s

Thr

Gly

Thr

Al a

Ser

Va 1

Al a

Val

Al a

Leu

Thr

Val

Leu

Gl y

Al a

Gly

20

25

30

Phe

Al a

Asn

Gin

Thr

Glu

Va 1

Arg

Al a

35

40

TUDNIVALÓK A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 42 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Me t 1

Thr

Lys

Asn

Asn 5

Thr

Asn

Arg

Hi s

Tyr 10

Ser

Leu

Arg

Ly s

Leu 15

Lys

Thr

Gly

Thr

Alá

Ser

Val

Al a

Val

Alá

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Al a

Gly

20

25

30

Leu

Va 1

Val

Asn

Thr

Asn

Glu

Va 1

Ser

Al a

35

40

TUDNIVALÓK A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 41 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Me t 1

Al a

Lys

Asn

Asn 5

Thr

Asn

Arg

Hi s

Tyr 10

Ser

Leu

Arg

Ly s

Leu 15

Ly s

Thr

Gly

Thr

Al a

Ser

Va 1

Al a

Va 1

Al a

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Al a

Gly

20

25

30

Phe

Al a

Asn

Gin

Thr

Glu

Val

Ly s

Al a

35

40

TUDNIVALÓK A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 50 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS.· 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA Met Alá Lys Asn Asn Thr Asn Arg His Tyr Ser Leu Arg Lys Leu Lys 15 10 15

HU 220 198 Β

Thr

Gly

Thr

Al a 20

Ser

Val

Al a

Va 1

Al a 25

Leu

Thr

Val

Leu

Gly 30

Al a

Gly

Phe

Al a

Asn

Gin

Thr

Glu

Val

Ly s

Al a

Asn

Gly

Asp

Gly

As n

Pro

Arg

35

40

45

Glu

Va 1

50

TUDNIVALÓK A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 45 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS ·. 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Ly s

Alá

Gin

Gin

Val

Asn

Gly

Lys

Gly

Asn

Ly s

Leu

Pro

Al a

Thr

Gly

1

5

10

15

Glu

Asn

Al a

Thr

Pro

Phe

Phe

Asn

Val

Al a

Al a

Leu

Thr

Ile

I 1 e

Ser

20

25

30

Ser

Va 1

Gly

Leu

Leu

Ser

Va 1

Ser

Lys

Ly s

Ly s

Glu

Asp

35

40

45

TUDNIVALÓK A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 46 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Asn 1

Ly s

Al a

Pro

Me t 5

Ly s

Glu

Thr

Ly s

Arg 10

Gin

Leu

Pro

Tyr

Thr 15

Gly

Val

Thr

Al a

Asn

Pro

Phe

Phe

Thr

Al a

Al a

Al a

Leu

Thr

Va 1

Me t

Al a

20

25

30

Thr

Al a

Gly

Va 1

Alá

Al a

Val

Va 1

Ly s

Arg

Ly s

Glu

Glu

As n

35

40

45

TUDNIVALÓK A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 45 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Arg 1

Pro

Ser

Gin

Asn 5

Ly s

Gly

Me t

Arg

Ser 10

Gin

Leu

Pro

Ser

Thr 15

Gly

Glu

Alá

Al a

Asn

Pro

Phe

Phe

Thr

Al a

Al a

Al a

Al a

Thr

Val

Me t

Val

20

25

30

Ser

Al a

Gly

Me t

Leu

Al a

Leu

Ly s

Arg

Lys

Glu

Glu

Asn

35

40

45

TUDNIVALÓK A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 46 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Al a 1

Ly s

Lys

Glu

As p 5

Al a

Lys

Ly s

Al a

Gl u 10

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr 15

Gly

Glu

Gly

Ser

Asn 20

Pro

Phe

Phe

Thr

Al a 25

Al a

Al a

Leu

Al a

Va 1 30

Me t

Alá

HU 220 198 Β

Gly Alá Gly Alá Leu Alá Val Alá Ser Lys Arg Lys Glu Asp 35 40 45

TUDNIVALÓK A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 46 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Alá 1

Ly s

Lys

As p

As p 5

Al a

Lys

Lys

Al a

Glu 10

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr 15

Gly

Glu

Gly

Ser

Asn

Pro

Phe

Phe

Thr

Al a

Al a

Al a

Leu

Al a

Val

Me t

Alá

20

25

30

Gly

Al a

Gly

Al a

Leu

Al a

Val

Al a

Ser

Lys

Arg

Lys

Glu

As p

35

40

45

TUDNIVALÓK A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 45 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Ser 1

Arg

Ser

Al a

Me t 5

Thr

Gin

Gin

Ly s

Arg 10

Thr

Leu

Pro

Ser

Thr 15

Gly

Glu

Thr

Al a

Asn

Pro

Phe

Phe

Thr

Al a

Al a

Al a

Al a

Thr

Va 1

Me t

Val

20

25

30

Ser

Al a

Gly

Me t

Leu

Al a

Leu

Lys

Arg

Lys

Glu

Glu

Asn

35

40

45

TUDNIVALÓK A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 34 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Asn 1

Ly s

Al a

Pro

Me t 5

Ly s

Glu

Thr

Ly s

Arg 10

Gin

Leu

Pro

Ser

Thr 15

Gly

Glu

Thr

Al a

Asn 20

Pro

Phe

Phe

Thr

Al a 25

Al a

Al a

Leu

Thr

Va 1 30

Me t

Al a

Alá Alá

TUDNIVALÓK A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 44 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: mindkettő (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA

Ly s 1

Gly

Asn

Pro

Thr 5

Ser

Thr

Thr

Glu

Lys 10

Ly s

Leu

Pro

Tyr

Thr 15

Gly

Val

Al a

Ser

Asn

Leu

Val

Leu

Glu

Ile

Me t

Gly

Leu

Leu

Gly

Leu

Ile

20

25

30

Gly

Thr

Ser

Phe

Ile

Al a

Me t

Ly s

Arg

Arg

Ly s

Ser

35

40

Claims (26)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Konjugált vakcina, amely Streptococcus B csoport által okozott fertőzés ellen gazdaimmunitás kialakítására képes, azzal jellemezve, hogy terápiásán hatékony mennyiségben tartalmazza a következő komponensekből álló konjugátumot:

   (a) egy csoportspecifikus vagy típusspecifikus Streptococcus B csoport poliszacharid, amely antitest termelődését váltja ki Streptococcus B csoport ellen, (b) Streptococcus B csoport C proteinjének funkcionális származéka, ahol a C protein lehet alfa-antigén, béta-antigén, ezek ftagmensei vagy ezek kombinációi, ahol az alfa-antigén egy legalább 40 000 Da móltömegű, Streptococcus B csoport protein, amelyet a pJMS23 plazmid által kódolt C protein elleni antiszérum felismer, és a béta-antigén egy legalább 50 000 Da móltömegű, Streptococcus B csoport protein, amelyet a pJMSl plazmid által kódolt protein elleni antiszérum felismer, ahol a funkcionális származék védőantitestek termelődését váltja ki Streptococcus B csoport ellen, és a vakcina lényegében mentes C protein alfa-antigéntől, valamint C protein béta-antigéntől eltérő Streptococcus proteinektől, és farmakológiailag elfogadható kompozíció formájában van.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti konjugált vakcina, azzal jellemezve, hogy poliszacharidként tokpoliszacharidot tartalmaz.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti konjugált vakcina, azzal jellemezve, hogy a C protein alfa-antigén-származékakent az N, C, N-C, Rj R₂, R₃, R4, Rg, R^, R7, Rg, R9, Rg., R_x, N-R,, N-R₂, N-R₃, N-R4, N-Rj, N-R₆, N-R₇, NRg, N-Rg, N-Rg., N-R_x, Rj-C, R₂-C, R₃-C, R4-C, Rg-C, R^-C, R₇-C, Rg-C, R₉-C, Rg-C, R_x-C, N-R_rC, N-R₂-C, N-R₃-C, N-R4-C, N-Rg-C, N-R6-C, N-R₇-C, N-R₈-C, N-Rg-C, N-Rg-C és N-R_x-C alkotta csoportból kiválasztott egy vagy több származékot tartalmaz, amelyekben „x” értéke legalább 10; „N” jelentése a 6. ábrán bemutatott szekvenciában (15. szekvencia) közvetlenül az ismétlődő egységek kezdőhelye előtt elhelyezkedő Nterminális szakasz a jelzőszekvenciával együtt vagy a nélkül; „C” jelentése a 6. ábrán bemutatott 48 aminosavas C-terminális kihorgonyzó szekvencia; „R” jelentése a 6. ábrán látható szekvencia 227-308. aminosavát tartalmazó 82 aminosavas ismétlődés egy példánya; és „R_x” jelentése az előbbi ismétlődés „x” számú tandem példánya, amelyek az egyik R egység C-terminális végén tandem kapcsolódnak a szomszédos R egység Nterminális végéhez, és 9’ a teljes 749 aminosavból álló régiót jelöli, amely a 6. ábrán bemutatott kilenc azonos ismétlődő egységet és egy részleges ismétlődő egységet tartalmaz.
4. 4. A 3. igénypont szerinti konjugált vakcina, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az N, C, N-C, R_b R₂, R₃, R4, R₅, R^, R₇, Rg, Rg, Rg·, R_x alkotta csoportból kiválasztott egy vagy több származékot tartalmaz.
5. 5. A 4. igénypont szerinti konjugált vakcina, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az N, C, NC, R|, R₂, R₃, R₄, Rg, R₆, R₇, Rg, Rg, R9’, R_x alkotta csoportból kiválasztott egy származékot tartalmaz.
6. 6. A 3. igénypont szerinti konjugált vakcina, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az N-R_b N-R₂, N-R₃, N-R₄, N-Rj, N-R^, N-R₇, N-Rg, N-Rg, NRg. és N-R_x alkotta csoportból kiválasztott egy vagy több származékot tartalmaz.
7. 7. A 6. igénypont szerinti konjugált vakcina, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az N-Rj, N-R₂, N-R₃, N-R,, N-R₅, N-R^, N-R₇, N-Rg, N-Rg, NRg- és N-R_x alkotta csoportból kiválasztott egy származékot tartalmaz.
8. 8. A 3. igénypont szerinti konjugált vakcina, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az R_rC, Rj-C, R₃-C, R₄-C, Rg-C, R^-C, R₇-C, Rg-C, Rg-C, Rg— C és R_x-C alkotta csoportból kiválasztott egy vagy több származékot tartalmaz.
9. 9. A 8. igénypont szerinti konjugált vakcina, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az Rj-C, R₂-C, R₃-C, R₄~C, Rg-C, Rg-C, R₇-C, Rg-C, Rg-C, Rg— C és R_x-C alkotta csoportból kiválasztott egy származékot tartalmaz.
10. 10. A 3. igénypont szerinti konjugált vakcina, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az NRj-C, N-R₂-C, N-R₃-C, N-R₄-C, N-Rj-C, N-Rg-C, NR₇-C, N-Rg-C, N-Rg-C, N-Rg-C és N-R_x-C alkotta csoportból kiválasztott egy vagy több származékot tartalmaz.
11. 11. A 10. igénypont szerinti konjugált vakcina, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az NR,-C, N-R₂-C, N-R₃-C, N-Rg-C, N-R₅-C, N-Rg-C, NR₇-C, N-Rg-C, N-Rg-C, N-Rg-C és N-R_x-C alkotta csoportból kiválasztott egy származékot tartalmaz.
12. 12. Tisztított DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy Streptococcus B csoport C proteinje alfa-antigén-származékát kódoló génszekvenciát tartalmaz, ahol az alfaantigén-származék az N, C, N-C, R_b R₂, R₃, R,, R₅, Rg, R₇, Rg, Rg, Rg*, R_x, N-Rj, N-R₂, N-R₃, N-R₄, N-Rg, NR₆, N-R₇, N-Rg, N-Rg, N-Rg·, N-R_x, R,-C, R₂-C, R₃-C, R₄-C, Rg-C, Rg-C, R₇-C, Rg-C, Rg-C, Rg—C, R_x-C, NRj-C, N-R₂-C, N-R₃-C, N-R₄-C, N-Rg-C, N-Rg-C, NR₇-C, N-Rg-C, N-Rg-C, N-Rg-C és N-R_x-C alkotta csoportból kiválasztott egy vagy több származékot tartalmaz, amelyekben „x” értéke legalább 10; „N” jelentése a 6. ábrán bemutatott szekvenciában (15. szekvencia) közvetlenül az ismétlődő egységek kezdőhelye előtt elhelyezkedő N-terminális szakasz a jelzőszekvenciával együtt vagy a nélkül; „C” jelentése a 6. ábrán bemutatott 48 aminosavas C-terminális kihorgonyzó szekvencia; „R” jelentése a 6. ábrán látható szekvencia 227-308. aminosavát tartalmazó 82 aminosavas ismétlődés egy példánya; és „R_x” jelentése az előbbi ismétlődés „x” számú tandem példánya, amelyek az egyik R egység C-terminális végén tandem kapcsolódnak a szomszédos R egység N-terminális végéhez, és 9’ a teljes 749 aminosavból álló régiót jelöli, amely a 6. ábrán bemutatott kilenc azonos ismétlődő egységet és egy részleges ismétlődő egységet tartalmaz.
13. 13. A 12. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az N, C, NC, Rj, R₂, R₃, R₄, Rg, Rg, R₇, Rg, R9, Rg·, R_x, N-Rj, NR₂, N-R₃, N-R₄, N-Rg, N-R₆, N-R₇, N-Rg, N-Rg, N-Rg.,

    HU 220 198 Β

    N-R_x, Rj-C, R₂-C, R₃-C, R₄-C, R5-C, R5-C, R7-C, RgC, Rg-C, Rg-C, R_x-C, N-Rj-C, N-R₂-C, N-R₃-C, N-RgC, N-R₅-C, n-r₆-c, n-r₇-c, N-Rg-C, N-R₉-C, N-RgC és N-R_x-C alkotta csoportból kiválasztott származékot tartalmaz.
14. 14. A 13. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az N, C, NC, Rj, R₂, R₃, Rg, R5, R^, R₇, Rg, R^, R9’ es R_x alkotta csoportból kiválasztott származékot tartalmaz.
15. 15. A 13. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az N-C, NR_b N-R₂, N-R₃, N-R₄, N-R_s, N-R₆, N-R₇, N-Rg, N-R₉, N-Rg, és N-R_x alkotta csoportból kiválasztott származékot tartalmaz.
16. 16. A 13. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az Rj-C, R₂-C, R₃-C, R4-C, Rj-C, R₆-C, R₇-C, R_g-C, Rg-C, R₉C és R_x-C alkotta csoportból kiválasztott származékot tartalmaz.
17. 17. A 13. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az említett származékként az N-Rj-C, N-R₂-C, N-R₃-C, N-R₄-C, N-Rj-C, N-R^-C, n-r₇-c, N-Rg-C, N-Rg-C, N-Rg-C és N-R_x-C alkotta csoportból kiválasztott származékot tartalmaz.
18. 18. A 12-17. igénypontok bármelyike szerinti DNSmolekula, azzal jellemezve, hogy baktériumban az említett C protein alfa-antigén-származék expresszálására képes.
19. 19. Rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy egy, a 18. igénypont szerinti DNS-molekulát tartalmaz.
20. 20. A 19. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy plazmid, kozmid, transzpozon vagy fág.
21. 21. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy egy, a 18. igénypont szerinti DNS-molekulával van transzformálva.
22. 22. A 21. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy baktérium- vagy élesztősejt.
23. 23. A 22. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az említett baktériumsejt B csoportba tartozó Streptococcus.
24. 24. Eljárás hatóanyagként a következő komponensekből álló konjugátumot tartalmazó olyan vakcina előállítására, amely lényegében mentes C protein alfa-antigéntől és C protein béta-antigéntől eltérő streptococcusproteinektől:

    (a) egy csoportspecifikus vagy típusspecifikus Streptococcus B csoport poliszacharid, amely antitest termelődését váltja ki Streptococcus B csoport ellen, (b) Streptococcus B csoport C proteinjének funkcionális származéka, ahol a C protein lehet alfa-antigén, béta-antigén, ezek ffagmensei vagy ezek kombinációi, ahol az alfa-antigén egy legalább 40 000 Da móltömegű, Streptococcus B csoport protein, amelyet a pJMS23 plazmid által kódolt C protein elleni antiszérum felismer, és a béta-antigén egy legalább 50 000 Da móltömegű, Streptococcus B csoport protein, amelyet a pJMSl plazmid által kódolt protein elleni antiszérum felismer, ahol a funkcionális származék védőantitestek termelődését váltja ki Streptococcus B csoport ellen, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított hatóanyagot a vakcinagyártásban szokásos módon adott esetben megfelelő vivőanyaggal összekeverve B csoportba tartozó Streptococcus által okozott fertőzés megakadályozására vagy csökkentésére szolgáló vakcinává alakítjuk.
25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nőknek vagy nőstény állatoknak beadandó, a születendő utódnak immunitást biztosító vakcinát állítunk elő.
26. 26. Eljárás B csoportba tartozó Streptococcus által okozott fertőzés megakadályozására szolgáló antiszérum előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely emlősben az 1. igénypont szerinti vakcinával történő kezeléssel gazdaimmunitást váltunk ki, és az antiszérumot kinyeijük.