PL177302B1 - Szczepionka sprzężona zdolna do nadania gospodarzowi odporności na infekcje Streptococcus grupy B, cząsteczka rekombinanta, wektor rekombinanta i komórka gospodarza - Google Patents

Abstract

1. Szczepionka sprzezona zdolna do nadania gospodarzowi odpornosci na infekcje Streptococcus grupy B, zn a m ien n a tym , ze zawiera (a) polisacharyd specyficzny wobec grupy lub specyficzny wobec typu Streptococcus grupy B sprzezony z (b) funkcyjna pochod- na antygenu alfa bialka C Streptococcus grupy B, przy czym wymieniona pochodna jest zdolna do wytwarzania przeciwcial ochronnych przeciw Streptococcus grupy B i wyselekcjo- nowana jest z grupy obejmujacej sekwencje N, C, N-C, R 1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R 8, R9, R9', Rx, N-R1, N-R2, N -R 3 , N -R 4, N-R5, N-R6 , N-R7, N-R8 , N-R9 , N-R9 ', N-Rx, R 1 -C, R2-C, R3 -C, R4 -C, R5 -C, R6 -C, R 7-C, R 8 -C, R9 -C, R9 '-C, Rx -C, N-R1-C, N-R2 -C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-R6 -C, N-R7-C, N -R8-C, N-R9-C, N-R9'-C, N-Rx -C, w których "N" oznacza flankujaca od strony 5' sekwencje aminokwasowa, okreslona sekwencja przedstawiona na fig. 6 , z lub bez sekwencji sygnalnej, "C" oznacza 45 aminokwasowa sekwencje kotwiczaca przedstawiona na fig. 6 , "R" oznacza pojedyncza kopie 82 aminokwasowego powtórzenia, rozpoczynajacego sie na 679 aminokwasie sekwencji D N A przedstawionej na fig. 6 , R9' oznacza sekwencje aminokwasów 227 - 975 przedstawiona na fig. 6 , a w "Rx" "x" oznacza liczbe tandemowych kopii tego powtórzenia, polaczonych tandemowo koncem karboksylowym jednej jednostki R z aminowym koncem nastepnej jednostki R. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka sprzężona zdolna do nadania gospodarzowi odporności na infekcje Streptococcus grupy B, cząsteczka rekombinanta, wektor rekombinanta i komórka gospodarza przekształconego cząsteczką rekombinanta. Ogólnie wynalazek związany jest z dziedziną mikrobiologii i technologią szczepionek i dotyczy opracowania szczepionki zdolnej do nadawania odporności na infekcje paciorkowcami grupy B.

Bakterie rodzaju Streptococcus uznawane są za czynniki przyczynowe chorób ludzi i zwierząt. Streptococci dzieli się na dwie grupy immunologiczne na podstawie obecności określonych antygenów węglowadanowych na powierzchni ich komórek. Obecnie rozpoznane są grupy od A do O (Davis,B.D. i wsp., Mikrobiology, wyd. 3, str. 609, (Harper & Row, 1980). Streptococci należą do najpowszechniejszych i najważniejszych bakterii powodujących choroby u ludzi. Chociaż Streptococci grupy B związane są z chorobami zwierząt (takimi jak zapalenie wymion u bydła), Streptococcusagalactiae (grupa B paciorkowców) jest w Stanach Zjednoczonych najpowszechniejszą przyczyną posocznicy noworodków ludzkich i przypuszcza się, że jest odpowiedzialny za ponad 6000 zgonów rocznie (Hill, H.R. i wsp., Sexually Transmitted Diseases, McGraw Hill, str. 397-407). Streptococcus grupy B jest również poważnym czynnikiem chorobotwórczym w zapaleniu opon z opóźnionymi objawami początkowymi u niemowląt, w poporodowym zapaleniu śluzówki macicy i w infekcjach dorosłych mających obniżoną odporność (Patterson, M.J. i wsp., Bac.Rev. 40:774-792 (1976)). Mimo, że organizm jest wrażliwy na antybiotyki, wysoki stopień zaatakowania i gwałtowny początek posocznicy u noworotków oraz zapalenia opon u niemowląt powodują zarówno wysoką zachowalność (50%) jak i śmiertelność (20%) (Baker, C.J. i wsp., New Eng.J.Med. (Editorial) 314(26): 1702-1704 (1986); Baker. C.J. i wsp., J.Infect.Dis. 136:137-152 1977)).

Streptococcus grupy B jest zwykłym składnikiem normalnej bakteryjnej flory pochwowej i okrężnicy. Chociaż najpowszechniejsze jest zakażenie noworodków podczas porodu z kolonizacji pochwowych, opisano również szpitalne szerzenie się ich w oddziałach dla noworodków (Patterson,M.J. i wsp., Bact.Rev. 40:774-792 (1976)). Jednakże, tylko u niewielkiego odsetka niemowląt, u których stwierdzono kolonie Streptococcus grupy B, dochodzi do poważnych infekcji. Zarówno rola czynnika gospodarza jak i determinantów wirulencji bakteryjnej w przejściu od kolonizacji do zakażenia nie jest całkowicie wyjaśniona.

Uważa się, że kilka białek Streptococcus grupy B odgrywa rolę w wirulencji i odporności (Ferrieri, P., Rev. Infect. Dis. 10:S363 (1988)). W 1975 Lancefield zdefiniował białka C ze Streptococcus grupy B ich zdolnością do wytwarzania odporności ochronnej (Lancefield, R.C. i wsp., J.Exp.Med. 142:165-179 (1975)). Uważa się, że ta grupa białek zawiera kilka różnych polipeptydów i determinantów antygenowych. W świetle tego odkrycia, wysiłki, aby zapobiegać infekcjom Streptococcus grupy B, zostały skierowane na zastosowanie antybiotyków profilaktycznych i opracowanie szczepionki przeciw Streptococcus grupy B (Baker, C.J. i wsp. Rev. of Infec.Dis. 7:458-467 (1985)), Baker, C.J. i wsp., New Eng.J.Med. (Editorial) 314(26): 1702-1704 (1986)). Szczepionki polisacharydowe przeciw Streptococcus grupy B zostały opisane w publikacjach: Kasper, D.L. (opis patentowy US 4.207.414 i ponownie wydany patent US RE31672 oraz opisy patentowe nr nr US 3.324.887, 4.356.263, 4.367.221, 4.367.222 i 4.367.223), Carlo,D.J. (opis patentowy US 4.413.057, publikacja patentu europejskiego 38.265) oraz Yavordios,D. i wsp. (publikacja patentu europejskiego 71.515 podanych tutaj jako odnośniki

ΠΊ 302 literaturowe). Za wyjątkiem małej podpopulacji niemowląt, u której zidentyfikowano zarówno matczyną kolonizację Streptococcus gmpy B oraz inne czynniki ryzyka okołoporodowego, profilaktyczne zastosowanie antybiotyków nie było praktykowane lub skuteczne w zapobieganiu większości przypadków (Boyer,K.M. i wsp., New Eng.J.Med. 314(26): 1665-1669 (1986)). Chemioprofilaktyka śródporodowa nie zyskała akceptacji z następujących powodów (1) nie było możliwe zidentyfikowanie matczynej kolonizacji Streptococcus grupy B w sposób szybki pewny i niedrogi; (2) około 40% przypadków u noworodków występuje w grupie niskiego ryzyka; (3) uważano za niepraktyczne przeprowadzanie skriningu i/lub traktowania wszystkich matek i niemowląt, które potencjalnie znajdują się w grupie ryzyka; oraz (4) profilaktyka antybiotykami okazała się niewykonalna w zapobieganiu zapaleniu opon z późnymi objawami początkowymi (7200 przypadków rocznie w Stanach Zjednoczonych) lub poporodowym zapaleniu śluzówki macicy (45.000 przypadków rocznie) (Baker,C.J. i wsp., New Eng.J.Med. (Wydawniczy) 314:1702-1704 (1986)).

Streptococcus agalactiae jest najpowszechniejszą przyczyną posocznicy noworodków ludzkich i jest odpowiedzialny za 6000 do 10.000 zejść śmiertelnych rocznie w Stanach Zjednoczonych. Mimo, że specyficznego typu otoczka polisacharydowa Streptococcus grupy B jest immunogenna i niesie ważne antygeny ochronne, próby kliniczne szczepionki polisacharydowej wykazały słabą szybkość reakcji (Baker,C.J. i wsp., New Eng.J.Med. 319:1180 (1980); Insel,R.A. i wsp., New Eng.J.Med. (Editorial) 319(18):1219-1220 (1988)).

Obecny wynalazek obejmuje sprzężoną szczepionkę przeciw Streptococcus grupy B (t.j. Streptococcus agalactiae), która wykorzystuje ochronny antygen białkowy z ekspresji klonowanego genu Streptococcus grupy B. Ta nowa sprzężona szczepionka ma wyższość zarówno przez wywoływanie ochrony zależnej od komórki T poprzez wspomagające działanie białka nośnika, a także przez zapewnienie dodatkowych ochronnych determinantantygenowych, które są obecne na klonowanym białku Streptococcus grupy B (Insel,R.A. i wsp., New Eng.J.Med. (Editorial) 319(18): 1219-1220 (1988); Baker,C.J. i wsp., Rev.ofInfec.Dis. 7:458-467 (1985)).

Według wynalazku szczepionka sprzężona zdolna do nadania gospodarzowi odporności na infekcje Streptococcus grupy B zawiera (a) polisacharyd specyficzny wobec grupy lub specyficzny wobec typu Streptococcus grupy B sprzężony z (b) funkcyjną pochodną antygenu alfa białka C Streptococcus grupy B, przy czym wymieniona pochodna jest zdolna do wytwarzania przeciwciał ochronnych przeciw Streptococcus grupy B, zaś wymieniona pochodna antygenu alfa białka C wyselekcjonowana jest z jednego lub większej liczby członków grupy obejmującej N, C, N-C, R1, R2, R3, R4, R5, Ró, R7, Re, R9, R9', Rx, N-RąN-Ra, N-R3, N-Ry, N-R5, N-R6, N-R7, N-Rg, N-R9, N-R9', N-Rx, Ri-C, R2-C, R3-C, Ry-C, R5-C, R_ć-C, R7-C, Rg-C, R9-C, Ry-C, Rx-C, N-Ri-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-R6-C, N-R7-C, N-Rg-C, N-Ry-C, N-Ry-C i N-Rx-C, w których N oznacza flankującą od strony 5' sekwencję aminokwasową, określoną sekwencją przedstawioną na fig. 6, z lub bez sekwencji sygnalnej, C oznacza 45 aminokwasową sekwencję kotwiczącą przedstawioną na fig. 6, R oznacza pojedynczą kopię 82 aminokwasowego powtórzenia, rozpoczynającego się na 679 aminokwasie sekwencji DNA przedstawionej na fig. 6, R9 oznacza sekwencję aminokwasów 227-975 przedstawioną na fig. 6, a w Rx x oznacza liczbę tandemowych kopii tego powtórzenia, połączonych tandemowo końcem karboksylowym jednej jednostki R z aminowym końcem następnej jednostki R.

Szczepionka według wynalazku jako polisacharyd zawiera polisacharyd otoczkowy.

Korzystnie szczepionka zawiera pochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej sekwencje N, C, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Re, R9, R9' i Rx, zwłaszcza zawiera więcej niż jedną pochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej N, C, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R9 i Rx, w którym x jest równe co najmniej 10, oraz z ich kombinacje.

Również korzystna szczepiona zawiera pochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej N-C, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R6, N-R7, N-Rg, N-Ry, N-R9' i N-Rx, zwłaszcza zawiera więcej niż jedną pochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej N-C, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R6, N-R7, N-Rg, N-Ry, R9' i N-Rx, w którym x jest równe co najmniej 10, oraz ich kombinacje.

Dalej korzystnie szczepionka zawiera pochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej Ri-C, R2-C, R3-C, Ry-C, R5-C, Ró-C, R7-C, Rg-C, Ry-C, Ry-C i Rx-C, zwłaszcza zawiera więcej

177 302 niżjednąpochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej Ri-C, R₂-C, R3-C, R4-C, R5-C, R6-C, R7-C, Re-C, R9-C, R9'-C i Rx-C, w którym x jest równe co najmniej 10, oraz ich kombinacje.

W szczepionce sprzężonej według wynalazku pochodna białka zawiera więcej niż 10 powtórzonych jednostek R.

Wynalazek obejmuje również cząsteczkę rekombinanta DNA zawierającą sekwencję DNA kodującą antygen alfa Streptococcus grupy B lub przeciwciało stanowiące jego fragment, w której wymieniony antygen lub fragment zawiera sekwencję co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej sekwencje Rx, N-R_x, R_x-C i N-R_x-C, w której x jest większe lub równe 1, w której N oznacza sekwencję flankującą, która poprzedza początek sekwencji powtarzających się jednostek antygenu alfa zawartych w sekwencji przedstawionej na załączonym rysunku na fig. 6A-6C (Sek. ID Nr 15) z lub bez sekwencji sygnalnej; C oznacza 45 aminokwasową C-terminalną sekwencję kotwiczącą przedstawioną na fig. 6A-6C (Sek.lD Nr 15); R oznacza jedną kopię sekwencji 82 aminokwasów 227-308 z fig. 6A- 6C (Sek:. ID Nr 15); a w Rx x oznacza liczbę tandemowych kopii tego powtórzenia, połączonych tandemowo z końcem karboksylowym jednej jednostki R aminowego końca następnej jednostki R, w której rekombinant DNA zawiera sekwencję nukleotydów pokazaną na fig. 6A- 6C (Sek:. ID Nr 14), która koduje antygen alfa Streptococcus grupy B lub przeciwciało zawierające jego fragment i cząsteczka ta jest zdolna do ekspresji pochodnej białka C antygenu alfa w bakterii.

Wymieniona cząsteczka jako wymieniony antygen lub fragment zawiera sekwencję co najmniej jednego członka wybranego z grupy obejmującej sekwencje N-C, R1, R₂, R3, R4, R5, Ró, R7, Re, R9, R9', Rx, N-Ri, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-Ró, N-R7, N-R8, N-R9, N-R9', N-R_x, Ri-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, R6-C, R7-C, R8-C, R9-C, R9-C, Rx-C, N-Ri-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-Ró-C, N-R7-C, N-R8-C, N-R9-C, N-Ry-C i N-Rx-C, w którym x jest równe 10 lub jest większe, w którym N oznacza N-terminalną sekwencję, która poprzedza rozpoczęcie sekwencji powtarzających się jednostek antygenu alfa znajdujących się w sekwencji przedstawionej na fig. 6A- 6C (Sek:. ID Nr 15) z lub bez sekwencji sygnalnej, C oznacza 45 aminokwasową C-terminalną sekwencję kotwiczącą przedstawioną na fig. 6A- 6C (Sek.ID Nr 15), R oznacza jedną kopię sekwencji 82 aminokwasów 227-308 z sekwencji fig. 6A- 6C (Sek:. ID Nr 15), Ry przedstawia sekwencję aminokwasów 227-975 przedstawioną na fig. 6 (Sek.lD Nr 15), a w Rx x oznacza liczbę tandemowych kopii tego powtórzenia, połączonych tandemowo przy końcu karboksylowym jednej jednostki R z aminowym końcem sąsiedniej jednostki R.

Korzystnie cząsteczka jako fragment zawiera sekwencję co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej R1, R2, R3, R4, R5, Re, R7, R8, R9, R9' i Rx, bądź sekwencję co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej N-C, N-Ri, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-Ró, N-R7, N-R8, N-R9, N-R9' i N-Rx, bądź sekwencję co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej Ri-C, R2-C, R.3-C, R4-C, R5-C, Ró-C, R7-C, R8-C, R9-C, R9'-C i Rx-C, bądź sekwencję co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej N-Ri-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-Ró-C, N-R7-C, N-R8-C, N-R9-C, N-R9-C i N-R_x-C.

Korzystnie cząsteczka rekombinanta zawiera sekwencję DNA dającą się przyłączyć do promotora.

Wyżej wymieniona cząsteczka rekombinanta DNA w wymienionym fragmencie zawiera sekwencję co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej N, C i N-C, która daje się przyłączyć do promotora.

Cząsteczkę rekombinanta jest zdolna do ekspresji pochodnej białka C antygenu alfa w bakterii. Wektor rekombinanta zawiera tę cząsteczkę rekombinanta DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 6A-6C (Sek:. ID nr 14), która koduje antygen alfa Streptococcus grupy B lub przeciwciało zawierające jego fragment, operacyjnie połączoną z promotorem. Korzystnie wektor jest dobrany z grupy obejmującej plazmid, kosmid, transpozon i fag.

Wynalazek obejmuje również komórkę gospodarza przekształconego cząsteczką wyżej wymienionego rekombinanta DNA. Komórka gospodarza dobrana jest z grupy obejmującej komórkę bakteryjną lub komórkę drożdży, korzystnie jest to komórka bakterii należąca do Streptococcus grupy B lub do Escherichia coli.

Szczepionka według wynalazku służy do zapobiegania lub osłabiania infekcji spowodowanej Streptococcus grupy B, przez podawanie osobnikowi podejrzanemu o przynależność do

177 302 grupy ryzyka, narażonemu na taką infekcję, skutecznej ilości · sprzężonej szczepionki według wynalazku, zapewniającej gospodarzowi odporność na tą infekcję.

Zapobieganie lub osłabianie infekcji spowodowanej Streptococcus grupy B, który polega na podawaniu kobiecie ciężarnej skutecznej ilości sprzężonej szczepionki według wynalazku, zapewniającej odporność na infekcję nienarodzonemu potomkowi kobiety, a także polega na podawaniu osobnikowi podejrzanemu o przynależność do grupy ryzyka, narażonemu na taką infekcję, skutecznej ilości przeciwciał wytworzonych u drugiego osobnika, przez poddanie go działaniu sprzężonej szczepionki według wynalazku, zapewniającej odporność gospodarza na infekcję.

Zdeponowanie mikroorganizmów. Plazmidy pJMS 1 i pJMS23 są pochodnymi plazmidu pUX12, który zawiera DNA zdolne do kodowania antygenowych białek Streptococci, które mogą być stosowane zgodnie z wynalazkiem. Plazmid pUX12 jest pochodną plazmidu pUC12. Plazmidy pJMS1 i pJMS23 zostały zdeponowane 15 września 1989 w American Type Culture Collection, Rockville, MD. i otrzymały oznaczenia ATCC 40659 i ATCC 40660, odpowiednio.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia modyfikacje plazmidu pUC12 tworzącą plazmid pUX12.

Figura 2 przedstawia mapę restrykcyjną i transkrypcyjną plazmidu pUX12.

Figura 3 przedstawia modyfikacje wprowadzone do plazmidu pUX12, w celu utworzenia plazmidu pUX,12+1 (część A) z ramką odczytu + 1 oraz plazmidu pUX12-1 (część C) z ramką odczytu - 1. Część B· przedstawia możliwy schemat konstrukcji plazmidu z ramką odczytu - 1.

Figura 4 przedstawia wynik badań nad ochroną myszy przy zastosowaniu surowicy odpornościowej królika przeciw S1 i S23. Ochronę obserwuje się u myszy zaszczepionych surowicami odpornościowymi przeciw-S1 (p>0,002) lub surowicami odpornościowymi przeciw-S23 (p<0,022). Z uwagi na wielkość stosowanej próbki, obserwowana różnica w znaczeniu statystycznym pomiędzy eksperymentami S1 i S23 jest nieznacząca. Na tej figurze, myszy, które przeżyły cały test pokazano jako ułamek nad słupkiem.

Figura 5 przedstawia strategię sekwencjonowania i mapę restrykcyjną endonukleazy bca. Częściowa mapa restrykcyjna endonukleazy obejmuje region plazmidu pjMS23 od miejsca Ndel do miejsca Styl, rozpoczynający się nukleotydem 3594 dla którego oznaczono sekwencję nukleotydową bca i region flankujący. Otwarta ramka odczytu zilustrowana jest otwartym prostokątem. Mutacje transpozonowe Tn5seq1 (oznaczone trójkątami) służą do przyłączania starterów do sekwencjonowania nukleotydu w obu kierunkach z każdej insercji. Pokazano również regiony sekwencjonowane ze starterów oligonukleotydowych (otwarte strzałki) oraz wewnętrzne delecje (zamknięte strzałki). Miejsca restrykcyjne oznaczono następującymi skrótami: A, Alu I; B, Bsm I; F, FOK I; H, HincU; N, Nde I; S, Sty I. bp, pary zasad.

Figura 6 przedstawia nukleotyd [Sek.Id. nr: 14] i wywiedzione z niego sekwencje aminokwasowe [Sek.Id. nr: 15] bca oraz regionów flankujących. Nici DNA przedstawiono w kierunku od 5' do 3' a nukleotydy przedstawiono na górnej linii począwszy od 78 bp, w górę od otwartej ramki odczytu. Wywiedziona sekwencja aminokwasowa dla otwartej ramki odczytu jest poniżej sekwencji kwasu nukleinowego. Zawartość G + C równa 40% i sposób użycia kodonów są podobne jak w przypadku innych genów paciorkowcowych (Hollingshead, S. K. i wsp., J. Biol. Chem. 261:1677-1686 (1986)). Podkreślenia obejmują: miejsca konsensusowe promotora-10(TATAAT), miejsce wiązania rybosomu (RBS), sekwencję sygnalną, region powtarzalny 1, koniec C, wraz z kodonem terminacyjnym (TAA) w pozycji 3161 i dwie sekwencje palindromowe, które są potencjalnymi terminatorami transkrypcji.

Figura 7 jest przedstawiona z dwoma panelami (A i B), które pokazują podobieństwa przypuszczalnych sekwencji sygnalnych i C-końcowej kotwicy błonowej antygenu alfa białka C, odpowiednio. Panel 7A: N koniec antygenu alfa białka C na górnej linii (sekwencja 1) [Sek. Id. nr: 16] porównano z następnymi sekwencjami sygnalnymi bakterii Gram-dodatnich (podano numery kodowe każdej sekwencji): sekwencja2 [Sek.Id. nr: 17], antygenu beta białka C (15330; STRBAGBA) i cztery białkaM należące do Streptococcus grupy A; sekwencja 3 [Sek.Id nr: 18], ennX (STRENNX); sekwencja 4 [Sek. Id nr: 19], emm24 (STREMM24); sekwencja 5 [Sek. id. nr: 20], M1 (SOO767); sekwencja 6 [Sek. Id. nr: 21], SO1260. Reszty lizyny (K) i argininy (R) poprzedzające podkreślony rejon hydrofobowy oznaczono pogrubionymi literami tak jak reszty

177 302 seryny (S) i treoniny (T) poprzedzające przypuszczalne miejsce odcinania peptydu sygnalnego. Przypuszczalne miejsce odcinania peptydu sygnalnego alfa następuje za waliną w pozycji 41; istnieje również alternatywne miejsce odcinania peptydu sygnalnego w pozycji 53-56. Panel B: koniec C antygenu alfa białka C pokazano na górnej linii (sekwencja 1) [Sek;. Id. nr: 22] i porównano z następującymi membranowymi peptydami kotwiczącymi bakterii Gram-dodatnich: sekwencja 2 [Sek. Id. nr: 23], M5 (A28616, M6(A26297) i M24 (A28549); sekwencja 3 [Sek.Id. nr: 24], ennX (STREENX); sekwencja 4 [Sek.Id. nr: 25], S00128, STRPROTG i A26314; sekwencja 5 [Sek;. Id. nr: 26], spg (A24496); sekwencja 6 [Sek. Id. nr: 27], arp4 (S05568) i emm49 (STRM49NX, STRMM24); i sekwencja 7 [Sek;. Id. nr: 28], emm12 (STR12M), M5, M 6, M24, emm12, emm49 i ennX wszystkie są białkami M; arp4 jest białkiem wiążącym Streptococcus grupy A. S00128, STRpRoTG, spg i A26314 są IgG łączącymi białkami z Streptococcus grupy G. Sekwencja 8 [Sek;. Id. nr: 29] ilustruje kotwicę membranową antygenu beta, któremu brakuje motywu PPFFXXAA [Sek;. Id. nr: 1], Podkreślone regiony obejmują reszty lizynowe (K) poprzedzające motyw LPXTGE [Sek.Id. nr. 2] (w prostokącie), region hydrofobowy (podkreślony) z sekwencją konsensusową PPFFXXAA [Sek;. Id. nr: 1] (prostokąt i podkreślenie) oraz aminokwas terminalny jakim jest kwas asparaginowy (D) lub asparagina (N).

Figura 8 przedstawia porównanie produktów klonowanych i natywnych genów bca. Białka powierzchniowe szczepu A909 Streptococcus grupy B (typ 1a/C) i klonu pJMS23-1 antygenu alfa białka C analizowano metodą SDS/PAGE i Western blotting, sondując przeciwciałem monoklonalnym4G8, specyficznym wobec antygenu alfa. Groty strzałek ilustrują przykładowe różnice pomiędzy białkami. Markery mas cząsteczkowych (w kDa) podano po stronie prawej.

Figura 9 przedstawia schemat otwartej ramki odczytu bca.. Zestawienie cech strukturalnych otwartej ramki odczytu antygenu alfa białka C oparto na analizie sekwencji aminokwasowej wywiedzionej z nukleotydowej sekencji bca. Liczby ponad prostokątami wskazują pozycje nukleotydów, a liczby poniżej reszty aminokwasowe dojrzałego białka w obrębie otwartej ramki odczytu.

Szczegółowy opis korzystnych wykonań

Znaczenie i perspektywy kliniczne

Przyjęto immunoprofilaktykę matczyną za pomocą szczepionki Streptococcus grupy B jako potencjalną drogę ochrony przeciw zakażeniu zarówno matki jak i noworodka przez okołoporodowy transfer przeciwciał (Baker, C.J. i wsp., New Eng.J.Med. (Editorial. 314(26): 1702-1704 (1986); Baker, C. J. i wsp. New Eng.J.Med. 319:1180 (1988); Baker, C. J. i wsp., J.Infect.Dis. 7:458 (1985)). Tak jak w przypadku innych otoczkowych bakterii, podatność na infekcje skorelowana jest z brakiem przeciwciał specyficznych względem typu (Kasper, D. L. i wsp., J.Clin.Invest. 72:260-269 (1983), Kasper, D. L. i wsp., Antibiot.Chemolher. 35:90-100 (1985)). Brak opsoninowo aktywnych przeciwciał przeciwotoczkowych, skierowanych przeciw określonemu serotypowi Streptococcus grupy B stanwi czynnik ryzyka rozwinięcia się choroby w następstwie kolonizacji Streptococcus grupy B (Kasper, D. L. i wsp., J.Infec.Dis. 753:407-415 (1986)).

Jednym z podejść było szczepienie oczyszczonymi polisacharydami otoczkowymi specyficznymi względem serotypu. Sposoby produkcji takich szczepionek i zastosowanie takich szczepionek w celu uodpornienia przeciw Streptococcus grupy B ujawnił Kasper, D. L. (patent US 4 207 414 i powtórnie wydany patent Stanów Zjednoczonych RE31672 oraz patenty US 4 324 887,4 356 263,4 367 221,4 367 222 i 4 367 223), Carlo, D. J. (patent US 4 413 057, opublikowany opis europejski 38 265) i Yavordios, D. i wsp. (opublikowany opis europejski 71 515) podane tu jako odnośniki literaturowe).

Chociaż otoczka polisacharydowa Streptococcus grupy B jest dobrze scharakteryzowana i wykazano, że odgrywa rolę zarówno w wirulencji jak i odporności (Kasper, D. L. J.Infect.Dis. 153:407 (1986) stwierdzono, że te składniki otoczkowe różnią się pod względem immunogenności w zależności od konkretnego typu otoczki i od czynników zależnych od układu odpornościowego gospodarza (Baker, C. J. i wsp., Rev.of infec.Dis. 7:458-467 (1985)). Ostatnio przeprowadzona próba kliniczna oceniająca otoczkową szczepionkę polisacharydową przeciw Streptococcus grupy B wykazała istnienie ogólnej odpowiedzi immunologicznej rzędu 63% i

177 302 wskazuje, że taka szczepionka nie była optymalnie immunogenna (Baker C. J. i wsp., New Eng.J.Med. 319(18):1180-1185 (1988)).

Różnice w zdolności wzbudzania odpowiedzi immunologicznej obserwowano również w przypadku polisacharydów otoczkowych innych bakterii. Na przykład, szczepionka przeciw otoczce meningokoków typu C jest wysoce aktywna podczas, gdy szczepionka przeciw grupie B polisacharydów meningokokowych nie jest immunogenna (Kasper, D. L. i wsp. J.Infec.Dis. 755:407-415 (1986)). Do wywołania odpowiedzi immunologicznej na antygeny polisacharydowe, konieczne są niekiedy funkcje systemu immunologicznego gospodarza niezależnie od komórki T. Brak odpowiedzi niezależnej od komórki Tna antygeny polisacharydowe może być odpowiedzialny za niskie poziomy przeciwciała przeciw Streptococcus grupy B obecne u matek, u których dzieci w następstwie rozwija się infekcja Streptococcus grupy B. Dodatkowo, dzieci przed 18 lub 24 miesiącem życia mają słabo rozwiniętą odpowiedź immunologiczną na antygeny niezależnie od komórki T.

Determinanty wirulencji i odporności na zakażenia Streptococcus grupy B

Istnieje pięć serotypów Streptococcus grupy B, które mają wspólną grupę specyficznego antygenu polisacharydowego. Jednakowoż, przeciwciała skierowane przeciw antygenom grupowym nie posiadają działania ochronnego w modelach zwierzęcych. Lancefield pierwotnie zaklasyfikował Streptococcus grupy B do czterech serotypów IIa, Ib, II i III) stosując technikę przeciwciała precypitującego. Z kolei dokładnie określono skład i strukturę polisacharydów otoczkowych wymienionego typu dla każdego z serotypów (Jennings, H. L. i wsp., Błochem., 22:1258-1264 (1983), Kasper, D. L. i wsp., J.Infec.Dis. 755:407-415 (1986), Wessels, R. M. i wsp., Trans.Assoc.Amer.Phys. 98:384-391 (1985)). Wilkinson zdefiniował piąty serotyp, Ic, przez zidentyfikowanie antygenu białkowego (pierwotnie nazywanego białkiem Ibc), obecny na wszystkich szczepach serotypu Ib i niektórych szczepach posiadających otoczkę typu Ia (Wilkinson, H. W. i wsp., J.Bacteriol. 97:629-634 (1969), Wilkinson, H. W. i wsp., Infec.andImmun.. 4:596-604 (1971)). Później stwierdzono, że białko to różni się pod względem chorobotwórczości, pomiędzy różnymi serotypami Streptococcus grupy B, ale było nieobecne w serotypie Ia (Johnson, D. R. i wsp., J. Clin.Microbiol. 79:506-510 (1984)).

Ostatnio zmieniono nazewnictwo w celu sklasyfikowania serotypów Streptococcus grupy B jedynie pod względem typu polisacharydów otoczkowych; i opisano również piąty typ otoczkowy (typ IV) (Pritchard, D. G. i wsp., Rev.Infec.Dis. 70(8):5367-5371 (1988)). Odtąd podział szczepów Streptococcus grupy B nie jest oparty na antygenowym białku Ibc, które jest obecnie nazywane białkiem C. Szczep typu Ic sklasyfikowano ponownie jako serotyp Ia na podstawie jego składu polisacharydu otoczkowego, z dodatkową informacją, że zawiera on również białko C.

Dane immunologiczne, epidemiologiczne i genetyczne sugerują, że otoczki specyficzne względem typu pełnią ważną rolę w odporności na infekcje Streptococcus grupy B. Skład i struktura polisacharydów otoczkowych specyficznych wobec typu i ich rola w wirulencji i odporności stały się przedmiotem intensywnych badań (Ferrieri, P. i wsp., Infec.Immun. 27:1023-1032 (1980), Krause, R. M. i wsp., J.Exp.Med. 742:165-179 (1975), Levy,N. J. i wsp., J.Infec.Dis. 749:851-860 (1984), Wgner, B. i wsp., J.Gen.Microbiol. 778:95-105 (1980), Wessels, M. R. i wsp., Trans.Assoc.Amer.Phys. 95:384-391 (1985)).

Istnieje kontrowersja co do strukturalnego rozmieszczenia polisacharydów specyficznych wobec typu i paciorkowcowej grupy B na powierzchni komórki, co do immunologicznie ważnych determinantów w obrębie polisacharydu specyficznego wobec typu i mechanizmów wirulencji zależnych od otoczki Streptococcus grupy B (Kasper, D. L. i wsp., J.Infec.Dis. 753:407-415 (1986)). W celu określenia roli otoczki w procesie wirulencji, Rubens i wsp., zastosowali metodę mutagenezy transpozonowej tworząc izogeniczny szczep typu III Streptococcus grupy B, który nie ma otoczki (Rubens, C. E. i wsp., Proc.Natl. Acad.Sci. USA 84:7208-7212(1987)). Wykazali oni, na noworodkowym modelu szczurzym, że utrata zdolności do tworzenia otoczki powoduje znaczący ubytek wirulencji. Jednakowoż, wirulencja izolatów klinicznych o podobnym składzie otoczki jest bardzo różna. Sugeruje to, że inne czynniki wirulencji bakterii, poza otoczką, grają rolę w chorobotwórczości powodowanej Streptococcus grupy B.

177 302

W Streptococcus grupy B opisano szereg białek i innych produktów bakteryjnych o nieustalonej dotąd roli w wirulencji i odporności. Można tu wymienić czynnik CAMP (Christine Atkins-Much Peterson), pigment (prawdopodobnie karotenoid), antygen R, antygen X, czynniki antyfagocytarne i bliżej nieokreślone toksyny płucne (Ferrieri, P. i wsp., J.Exp.Med. 151:5668 (1980); Ferrieri, P. i wsp., Rev.Inf.Dis. 70(2):1004-1071 (1988); Hill, H. R. i wsp., Sexually Transmitted Diseases. McGraw-Hill, str. 397-407). Poniżej omówiono białka C.

Izogeniczne szczepy Streptococcus grupy B, nie syntezujące hemolizyny nie wykazują spadku wirulencji w noworodkowym modelu szczurzym (Weiser, J. N. i wsp., Infec.and Immun. 55:2314-2316 (1987)). Zarówno hemolizyna jak i neuraminidaza nie zawsze są obecne w izolatach klinicznych związanych z infekcją. Czynnik CAMP jest zewnątrzkomórkowym białkiem Streptococcus grupy B o ciężarze cząsteczkowym 23.500 daltonów, który w obecności gronkowcowej beta toksyny (sfingomielinazy) prowadzi do lizy błon erytrocytów. Gen kodujący czynnik CAMP w Streptococcus grupy B został ostatnio sklonowany i eksprymowany w komórkach E. coli (Schneewind, O. i wsp., Infec.and Immun. 5(5:2174-2179 (1988)). Rola, o ile występuje, czynnik CAMP, antygenów X i R oraz innych czynników wyszczególnionych powyżej w chorobotwórczości Streptococcus grupy B nie została ujawniona w stanie techniki (Fehrenbach, F. J. i wsp., Bacterial Protein Toxins, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1988); Hill, H. R. i wsp., Sexually Transmited Diseases, McGraw-Hill, NY, str. 397-407 (1984)).

Białko(a) C stanowią grupę antygenów białkowych związanych z powierzchnią komórki Streptococcus grupy B i zostały początkowo wyizolowane z Streptococcus grupy B przez Wilkinsona i wsp. (Wilkinson, H. W. i wsp., J. Bacteriol, 97:620-34 (1969), Wilkinson, W. H. i wsp., Infec.and Immun. 4:596-604 (1971)). Do wyekstrahowania ścianki komórkowej stosowali oni gorący kwas solny (HCl) a do wytrącenia antygenów białkowych kwas trichlorooctowy (TCA). Opisano dwie antygenowo odrębne populacje białek C: (1) grupę białek, które są wrażliwe na degradację pepsyną ale nie trypsyną i nazywanych alternatywnie bądź TR (odporne na trypsynę) bądź alfa (α). (2) Inną grupę białek z białek Streptococcus grupy B, które są wrażliwe na degradację zarówno pesyną jak i trypsyną nazywaną TS (wrażliwe na trypsynę) lub beta (β) (Bevanger, L. i wsp., Acta Path.Microbiol.Scand Sect.B. 57:51-54 (1979), Bevanger, L. i wsp., Acta Path.Microbiol.Scand Sect.B. 89:205-209 (1981), Bevanger, L. i wsp., Acta Path.Microbiol.Scand Sect.B. 91:231-234 (1983), Bevanger, L. i wsp., Acta Path.Microbiol.Scand Sect.B. 93:113-119 (1985), Bevanger, L. i wsp., Acta Path.Microbiol.Immunol.Scand Sect.B. 93:121-124 (1985), Johnson, D. R. i wsp., J.Clin.Microbiol. 19:506-510 (1984), Russell-Jones, G. L. i wsp., J.Exp.Med. 760:1476-1484 (1984)).

W1975 roku Lancefield i wsp. zastosowali mysi test ochronny do przetestowania surowicy króliczej w celu zdefiniowania funkcji białek C pod względem ich zdolności do wytworzenia odporności przeciw szczepom Streptococcus grupy B niosącym podobne antygeny białkowe (Lancefield, R. C. i wsp., J.Exp.Med. 142:165-179 (1975)). Wielu badających otrzymało surowe preparaty białek o własnościach antygenowych z Streptococcus grupy B, które zostały nazwane białkami C, za pomocą ekstrakcji chemicznej ścianek komórkowych przy użyciu bądź HCl bądź detergentów (Bevanger, L. i wsp., Acta Path.Microbiol.Scand Sect.B. 89:205-209 (1981), Bevanger,. i wsp., Acta Path.Microbiol.Scand Sect.B. 93:113-119 (1985), Russell-Jones, G. L. i wsp., J.Exp.Med. 76501476-1484 (1984)), Valtonen, M. V i wsp., Microb.Path. 7:191-204 (1986), Wilkinson, H. W. i wsp., Infec.and Immun.. 4:596-604 (1971)). Podawane wielkości tych antygenów wahały się pomiędzy 10 a 190 kilodaltonów i nie wyodrębniono ani nie scharakteryzowano pojedynczego rodzaju białka (Ferrieri, P. i wsp., Rev.lnf.Dis. 10(2): 1004-1071 (1988)).

Stosując metodę przeszukiwania próbek z wykorzystaniem surowic odpornościowych, wykryto białka C w około 60% klinicznych izolatach Streptococcus grupy B i we wszystkich serotypach, choć z różną częstością (Johnson, D. R. i wsp., J.Clin.Microbiol.. 79:506-510 (1984)). Poszczególne izotaty Streptococcus grupy B mogą posiadać oba antygeny TR i TS, lub tylko jeden, lub nie posiadać zadanego z tych antygenów. Za wyjątkiem zdolności częściowo oczyszczonych antygenów do wywoływania odporności, rola tych antygenów w chorobotwórczości nie była badana in vivo. Badania in vivo szczepów Streptococcus grupy B niosących białka C dostarczyły pewnych danych, świadczących o roli białek C w możliwej oporności na epsonizację .177 302 (Payne, N. R. i wsp., J.Infec.Dis. 757:672-681 (1985)), i możliwości inhibitowania wewnątrzkomórkowego fagocytarnego zabijania Streptococcus grupy B (Payne, N. R. i wsp., Infec.and Immun. 55:1243-1251 (1987)). Wykazano, że szczepy typu II Streptococcus grupy B niosące białka C są bardziej wirulentne w posocznicy noworodkowego modelu szczurzego (Ferrieri, P. i wsp., Infec.Immun.27:1023-1032 (1980), Ferrieri, P. i wsp., Rev.Inf.Dis. 70(2): 1004-1071 (1988). Ponieważ nie ma danych genetycznych dotyczących białek C, szczepy izogeniczne nie syntetyzujące białka C nie były dotychczas badane. Istnieją dane wskazujące, że jeden z antygenów TS lub β białek C przyłącza się do IgA (Russell-Jones, G. L. i wsp., J.Exp.Med. 160:1476-1484 (1984)). Rola, o ile istnieje, że wiązanie białka C z IgA ma wpływ na wirulencję, nie została jednak ujawniona.

W 1986 roku Valtonen i wsp. wyodrębnili białka Streptococcus grupy B z hodowli supernatantów, które wywołują ochronę w modelu mysim (Valtonen, M. V. i wsp., Microb.Path. 7:191-204 (1986)). Zidentyfikowali oni i częściowo oczyścili białko Streptococcus grupy B odporne na trypsynę o ciężarze cząsteczkowym 14.000 daltonów. Surowice królicze skierowane przeciw temu białku chroniły myszy przed infekcją typem Ib Streptococcus grupy B (ochrona 89%). Białko to, według definicji Lancefielda jest białkiem C. Jednakowoż, gdy surowice odpornościowe wyhodowane przeciw temu białku zastosowano do immunaprecypitacji ekstraktów z antygenów Streptococcus grupy B, stwierdzono, że wiele białek o wyższym ciężarze cząsteczkowym jest reaktywnych. To zasugerowało, że białko o ciężarze cząsteczkowym 14.000 może reprezentować wspólny epitop kilku grup białek Streptococcus grupy B lub, że jest to produkt degradacji znajdowany w supernatantach hodowli Streptococcus grupy B. Ta różnorodność wielkości białek C izolowanych zarówno z komórek bakteryjnych jak i supernatantów, sugeruje, że białka C mogą stanowić produkty białkowe rodziny genowej i utrzymywać antygenową różnorodność jako mechanizm ochrony przed układem immunizacyjnym.

Zakres podawanych ciężarów cząsteczkowych i trudności związane z oczyszczaniem poszczególnych białek C podobne są problemom, które napotkało wielu badających przy wyodrębnianiu białka M ze Streptococcus grupy A (Dale, J. B. i wsp., Infec.and Immun. 46(1):261-269 (1984), Fischetti, V. A. i wsp., J.Exp.Med. 144:32-53 (1976), Fischetti, V. A. i wsp., J.Exp.Med. 146:1108-1123 (1977)). Gen kodujący białko M został obecnie sklonowany i określono jego sekwencję, i stwierdzono, że zawiera wiele powtórzonych sekwencji DNA (Hollingshead, S. K. i wsp. J.Biol.Chem. 267:1677-1686 (1986), Scott, J. R. i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci USA 82:1822-1826 (1986), Scott, J. R. i wsp. Infec.and Immun. 52:609-612 (1986)). Te powtórzone sekwencje mogą być odpowiedzialne za potranskrypcyjną obróbkę, która powoduje różnorodność wielkości produkowanych białek M. Mechanizm występowania tego zjawiska nie jest jednak jasny. Zakres ciężarów cząsteczkowych opisanych dla białek C Streptococcus grupy B może być rezultatem podobnego procesu.

Cleat i wsp. próbowali klonować białka C przy użyciu dwóch preparatów surowic odpornościowych przeciw Streptococcus grupy B otrzymanych od Bevangera (α i β do skriningu zbiorów DNA Streptococcus grupy B w E.coli (Bevanger, L. i wsp., Infec.and Immun. 55(5): 1151-1155 (1987), co podano tu jako odnośnik literaturowy). Badający ci opisali dwa klony produkujące białka, które wiążą przeciwciała antypaciorkawcawa. Jednak, nie określili oni czy klonowane białka mają zdolność wytwarzania przeciwciał ochronnych lub czy prewalencja tych genów skorelowana jest ze szczepami Streptococcus grupy B znanymi z tego, że niosą białka C. Rola klonowanych sekwencji genów w wirulencji Streptococcus grupy B nie była badana. Ponieważ białka C definiowane są ich zdolnością do wytwarzania przeciwciał ochronnych, w pracy tej brakuje dostarczenia dowodów, że któryś z klonów koduje białko C.

Sprzężona szczepionka według wynalazku

Obecny wynalazek przezwycięża wyżej omówione trudności związane z wcześniejszymi szczepionkami przeciw Streptococcus grupy B poprzez opracowanie sprzężonej szczepionki, w której polisacharydy otoczkowe połączone są kowalencyjnie ze szkieletem białkowym. Takie podejście poparte jest rozwinięciem reakcji przeciwciała zależnego od komórki T w stosunku do otoczkowych antygenów polisacharydowych i od podejścia do niezależnych od komórki T wymagań dla produkcji przeciwciała (Baker, C. J. i wsp. Rev.ofInfec.Dis. 7:458-467 (1985), Kasper, D. L. i wsp., J.Infec.Dis. 755:407-415 (1986), podanymi tu jako odnośniki literaturowe).

177 302

W sprzężonej szczepionce, cząsteczki antygenowe takie jak polisacharydy otoczkowe Streptococcus grupy B (omówione powyżej) przyłączone są kowalencyjnie do białka lub polipeptydu nośnika. To łączenie służy do zwiększenia antygenności sprzężonej cząsteczki. Sposoby tworzenia sprzężonych szczepionek z cząsteczki antygenowej i nośnika białkowego lub polipeptydowego sąznane (Jacob, C. O. i wsp. Eur.J.Immunol. 16:1057-1062 (1986); Parker, J. M. R. i wsp. Modern Approaches to Vaccines, Chanock, R. M. i wsp. wyd. str. 133-138, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983), Żurowski, V. R. i wsp., J.Immunol. 727:122-129 (1978); Klipstein, F. A. i wsp., Infec.lmmun. 37:550-557 (1982); Bessler, W. G. Immunobiol. 770:239-244 (1985); Posnett, D. N. i wsp. J.Biol.Chem. 263:1719-1725 (1988); Ghose, A. C. i wsp. Molec.Immunokl. 25:223-230 (1988); podanymi tu jako odnośniki literaturowe).

Prototypowy model sprzężonych szczepionek został opracowany przeciw Hemophilus influenzae (Anderson, P. Infec.and Immun. 39:223-238 (1983); Chui, C. i wsp. Infect. Immun. 40:245-256 (1983); Lepow. M. Pediat.lnfect.Dis.J. 6:804-807 (1987), podanymi jako odnośniki literaturowe) i model ten może być wykorzystany do sporządzania nowych szczepionek według wynalazku. Dodatkowe metody wytwarzania takiej sprzężonej szczepionki ujawnili Anderson, P. W. i wsp., w publikacji patentu europejskiego 245.045; Anderson, P. W. i wsp., w patentach Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4.673.574 i 4.761.283; Frank, R. i wsp., w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.789.735; w publikacji patentu europejskiego nr 206 852; Gordon, L. K. w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.619.828 i Beachey, E. H. w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.284.537 podanymi tu jako odnośniki literaturowe).

Szkielet białkowy dla szczepionek sprzężonych takich jak Hemophilus influenzae wykorzystywał białka, które nie miały wspólnych własności antygenowych z organizmem docelowym, z którego otrzymywano bakteryjne polisacharydy otoczkowe (Ward, J. i wsp., Vaccines, Plotkin, S. A. i wsp. wyd. Saunders, Philadelphia, str. 300 (1988)).

W przeciwieństwie do tego, sprzężona szczepionka według obecnego wynalazku wykorzystuje białka immunogenne Streptococcus grupy B jako szkielet dla sprzężonej szczepionki. Przypuszcza się, że dzięki takiemu podejściu otrzymuje się bardziej skuteczne szczepionki (Insel, R. A. i wsp., New Eng.J.Med.. (Editorial) 319(18):12,19-1220 (1988) . Sprzężona, białkowo-polisacharydowa szczepionka według wynalazku jest najpierw charakteryzowana względem specyficznych białek Streptococcus grupy B, które mogą być stosowane w sprzężonej szczepionce. Każde białko, które jest charakterystyczne dla Streptococcus grupy B może być stosowane jako białko w sprzężonych szczepionkach według wynalazku. Do tego celu korzystne jest jednak zastosowanie białka C Streptococcus grupy B. Jak omówiono bardziej dokładnie poniżej, plazmidy pJMS1 i pJMS23 zawierają DNA, które koduje białko C Streptococcus grupy B. Najkorzystniejszymi białkami C są białka otrzymane po ekspresji takiego DNA w bakteriach.

Jak podano powyżej, obecny wynalazek dotyczy klonowania i ekspresji genów, które kodują ochronne antygeny białkowe Streptococcus grupy B. Białka takie korzystnie stosowane są jako szkielet białkowy, z którym sprzężony jest jeden lub więcej polisacharydów Streptococcus grupy B w celu utworzenia sprzężonej szczepionki przeciw tej bakterii. Alternatywnie, jedno lub więcej opisanych tu białek może być sprzężonych w strukturę z polisacharydem Streptococcus grupy B.

Rola tych białek w wirulencji i odporności Streptococcus grupy B może być wykorzystana jako dodatkowa terapia przeciw infekcji Streptococcus grupy B. Wyodrębnienie i scharakteryzowanie tych genów pochodzenia bakteryjnego pozwala na manipulowanie produktami genowymi w celu zoptymalizowania obu własności adjuwantowych i antygenowych szkieletu polipeptydowego/nośnika sprzężonej szczepionki.

Badania genetyczne białek C

Tak więc, obecny wynalazek dotyczy klonowania białek C Streptococcus grupy B, ich roli w wirulencji i odporności i ich zdolności do służeniajako immunogen dla sprzężonej szczepionki przeciw Streptococcus grupy B.

Mimo szerokiej dostępnej literatury na temat klonowania wielu grup Streptococci, przeprowadzono tylko ograniczone manipulacje genetyczne w Streptococcus grupy B (Macrina, F. L. Ann.Rev.Microbiol. 38:193-219 (1984), Wanger, A. R. i wsp., Infec.and Immun. 55:1170-1175 (1987)). Najszerzej stosowaną techniką w Streptococcus grupy B jest technika opracowania z

1ΊΊ 302

Tn916 i jej zastosowanie w mutagenezie transpozonu (Rubens, C. E. i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci., USA 84:7208-7212 (1987), Wanger, A. R. i wsp., Res.Vet.Sci.. 38:202-208 (1985)). Jednak, ponieważ może się okazać, że jest więcej niż jeden gen dla białek C i ochronne surowice odpornościowe przyłączają kilka białek, skrining genów białka C przez mutagenezę transpozonu jest niepraktyczny.

W obecnym wynalazku przeprowadza się klonowanie białek C (i każdego innego białka, które związane jest z wirulencją Streptococcus grupy B lub które wywiera wpływ na odporność gospodarza na Streptococcus grupy B) poprzez zastosowanie nowego wektora plazmidowego. W tym celu, pożądane jest stosowanie wektora klonowania, który mógłby być szybko przeszukany dla ekspresji białek, które przyłączają się do naturalnie wytworzonych przeciwciał przeciw Streptococcus grupy B. Ponieważ takie przeciwciała są heterologami przeciwciał poliklonalnych, nie zaś przeciwciał monoklonalnych, konieczne było zastosowanie wektora, który mógłby być łatwo przeszukany wieloma pozytywnymi klonami w celu identyfikacji interesujących genów.

Dostępnych jest wiele technik do przeszukiwania klonów dla ekspresji antygenów, które przyłączają się do specyficznych surowic odpornościowych (Aruffo, A. i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:8573-8577 (1987). Najszerzej stosowany układ Xgt11, został opracowany przez Younga i Davisa (Huynh, T. V. i wsp., DNA Cloning, A Practical Approach, tom I (wyd. Glover, D. M.) IRL Press, Washington str. 49-78 (1985); Wong, W. W. i wsp., J.lmmunol.Methods. 82:303-313 (1985), które podano jako odnośniki literaturowe). Techniki te pozwalają na szybki skrining klonów poddawanych ekspresji w fagu lizogenowym, którego produkty są uwalniane podczas fagolizy. Powszechnie występującymi problemami związanymi z tym układem jest konieczność subklonowania fragmentów dNa do wektorów plazmidowych w celu szczegółowego mapowania endonukleazy restrykcyjnej, przygotowania prób i sekwencjonowania DNA. W dodatku, wytwarzanie DNA ze stoku fagowego jest nieporęczne i ogranicza liczbę sprawnie przebadanych potencjalnie pozytywnych klonów. W końcu, wytwarzanie ekstraktów surowych białek z klonowanych genów jest problematyczne w gospodarzach wektora fagowego.

W celu obejścia tych problemów, obecny wynalazek zapewnia wektor plazmidowy, który opracowano w celu skriningu klonowanego bakteryjnego chromosomowego DNA do ekspresji białek związanych z wirulencją i/lub odpornością. Zatem obecny wynalazek dotyczy opracowania i zastosowania sprawnego wektora klonowania, który może być szybko przeszukiwany dla ekspresji białek, które przyłączają się do naturalnie wytworzonych przeciwciał Streptococcus grupy B. Wektor ten został otrzymany przez modyfikację powszechnie stosowanego plazmidowego wektora klonowania, pUC12 (Messing, J. i wsp., Gene 19:269-276 (1982); Norrander, J. i wsp., Gene 26:101-106 (1983); Vieira, J. i wsp., Gene 19:259-268 (1982), podanych jako odnośniki literaturowe). Wynalazek obejmuje wektor opisany poniżej i jego funkcjonalne ekwiwalenty.

Stosując ten układ, można łatwo manipulować klonami plazmidowymi, mapować endonukleazy restrykcyjne i sekwencje wstawek ich DNA, sporządzonymi sondami oraz badać produkty genowe bez konieczności subklonowania. Plazmid pUC12 jest wysokokopiowym plazmidem o 2,73 kilozasadach (kb), który posiada miejsce początku replikacji Co1W1, gen oporności na ampicylinę i polilinker w genie lacZ (Ausubel, F. M. i wsp., Current Topics in Molecular Biology; Greene Publ. Assn./Wiley Interscience, NY (1987) podany tu jako odnośnik literaturowy).

Przeprowadzono kilka modyfikacji w polilinkerze plazmidu pUC12 (Aruffo, A. i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:8573-8577 (1987) podanym tu jako odnośnik literaturowy). Ogólnym zamiarem w zmianach plazmidu pUC12 była modyfikacja polilinkera do obecnie identycznych, ale nie kohezywnych miejsc BstXI klonowania w celu dodania fragmentu stuffera pozwalającego na łatwe oddzielenie liniowego plazmidu gospodarza, i zapewnienia ekspresji od promotora lac we wszystkich trzech translacyjnych ramkach odczytu.

Dla zapewnienia miejsca insercji obcego DNA z dużą wydajnością i zmniejszenia do minimum możliwości samoligacji plazmidu dodaje się do polilinkera zinwertowane, niekohezywne końcówki BstXI. Jak pokazano na fig. 1, plazmid pUC12 najpierw tnie się za pomocą BamHI (etap I) i miesza się z dwoma syntetycznymi adaptorami oligonukleotydu, które są

177 302 częściowo komplementarne: 15-mer (GATCCATTGTGCTGG) [Sek;. Id. ne:3] i 11-mer (GTAACACGACC) [Sek.Id. nr:4] (etap 2). Gdy adaptory są ligowane do pUC12, zostają utworzone dwa nowe miejsca BstI, ale pierwotne miejsca BAMHI zostają również odnowione (etap 3). Plazmid traktuje się następnie kinazą polinukleotydową i liguje tworząc okrągły plazmid zamknięty (etap 4). Gdy plazmid ten zadaje się BstXI, otrzymane w rezultacie końcówki są identyczne i nie kohezywne (oba mają GTGt wystające poza brzeg) (etap 5).

Drugą modyfikację polilinkera przeprowadza się w celu pozwolenia na oczyszczanie plazmidu liniowego do klonowania bez zanieczyszczeń częściowo ciętym plazmidem, który może samoligować. Tępy koniec fragmentu FnuD2,365 par zasad (bp) otrzymuje się z plazmidu pCDM. Kaseta lub fragment stuffera, który nie zawiera miejsca BstXI był tępym końcem ligowanym do dwóch syntetycznych oligonukleotydów, które są częściowo komplementarne: 12-mer (ACACGAGATTTC) [Sek. Id. nr:5] i 8-mer (CTCTAaAg) (etap 6). Otrzymany fragment z adaptorami ma 4 bp wystające poza brzeg (ACAC), które są komplementarne z końcami zmodyfikowanego plazmidu pUC12 przedstawionymi w etapie 5. Zmodyfikowany plazmid pUC12 liguje się do insertu pCDM za pomocą adaptorów; otrzymany konstrukt, nazywany pUX12, pokazany jest na fig. 2. Plazmid pUX12 może być ponownie tworzony z plazmidów pJMS 1 lub pJMS23 przez wycięcie wprowadzonej sekwencji DNA Streptococcus. Alternatywnie może być utworzony metodą rekombinantową (lub rekombinacją homologiczną), przy użyciu plazmidu pUC12.

Ponieważ pUC12 ma być stosowany jako wektor ekspresji, korzystne jest dalsze modyfikowanie polilinkera, tak, żeby zawierał wszystkie trzy potencjalne ramki odczytu dla promotora lac. Zmiany te pozwalają na prawidłową translacyjną ramkę odczytu dla klonowanych fragmentów genów z częstotliwością jeden do sześciu. Na przykład, klonowany fragment może wstawić do wektora jedną z dwóch orientacji i jedną z trzech ramek odczytu. W celu skonstruowania ramki odczytu +1, plazmid pUX12 tnie się enzymem restrykcyjnym EcoRI, który odszczepia się w nietypowym miejscu w polilinkerze. Lepkie końce z wystającym fragmentem 5' uzupełnia się przy użyciu aktywności 5'-3' polimerazy T4 DNA polimerazy i dwa tępe końce zostają zligowane. Powoduje to utratę miejsca EcoRI i stworzenie nowego miejsca XmnI (fig. 3A). Konstrukcja ta została potwierdzona poprzez wykazanie utraty miejsca EcoRI i potwierdzenie nowego miejsca XmnI w polilinkerze. W dodatku, sekwencjonowanie dwuniciowego DNA na +1 modyfikowanym plazmidzie pUX12 przeprowadzono stosując standardowe sekwencje starterów (Ausubel, F. M. i wsp., Current Topics in Molecular Biology; Greene Publ. Assn./Wiley Interscience, NY (1987)). Sekwencja DNA wykazała, że zostały dodane 4 pary zasad do polilinkera i potwierdziła modyfikację plazmidu pUX12 z ramką odczytu +1. Plazmid ten nazwano plazmidem pUX12+1.

W celu skonstruowania ramki odczytu -1, wektor pUX12 tnie się enzymem restiykcyjnym Sacl, który tnie nietypowe miejsce w polilinkerze pUX12. Lepkie końce 3' jednoniciowego dNa z powrotem tnie się do tępych końców za pomocą aktywności 3'-5' egzonukleazy z T4 polimerazy i otrzymane tępe końce liguje. Otrzymana sekwencja powinna wyeliminować miejsce Scal podczas, gdy otrzymuje się nowe miejsce FnuD2 (fig. 3B). Jednakże mapowanie restrykcyjne plazmidów pUX12-1 pokazało, że mimo nieobecności miejsca Sacl, nie stwierdzono obecności żadnego miejsca FnuD2. Ponadto, na polilinkerze nie były więcej obecne miejsca Smal/Xmal. Kilka potencjalnych konstruktów plazmidu pUX12-1 sekwencjonowano z miniprep dwuniciowego DNA. Z sześciu modyfikowanych sekwencji plazmidów, w jednym stwierdzono nieobecność dziesięciu nukleotydów, z utworzeniem tym sposobem ramki odczytu -1 (fig. 3C). Sugeruje to, że polimeraza T4 DNA ma dodatkową aktywność egzonukleazy i z powrotem tnie dodatkowe dwuniciowe porcje polilinkera. Tym niemniej otrzymany w rezultacie plazmid miał ramkę odczytu -1. Plazmid ten nazwano pUX12-1.

Zastosowanie wektorów pUX 12 do klonowania antygenowych białek Streptococcus grupy B omówiono szczegółowo poniżej w przykładach. W skrócie, DNA pochodzące z Streptococcus grupy B lub komplementarne do takiego DNA wprowadza się do wektorów pUX12, pUX12+1 lub pUX12-1 i poddaje transformacji w Escherichia coli. Klonowane DNA poddaje się ekspresji w E.coli i lizat komórkowy bada się w celu oznaczenia na zawartość jakiekolwiek białka zdolnego do przyłączenia się do surowicy odpornościowej Streptococcus grupy B.

177 302

Istnieje wiele potencjalnie interesujących modyfikacji pUX12, które mogą zwiększyć jego wykorzystanie. Na przykład, promotor lac mógłby być zastąpiony drugim promotorem, pochodzenie replikacji mogłoby być modyfikowane w celu wytworzenia wektora o mniejszej liczbie kopii i mogłaby być zmieniona oporność markera na leki.

Każdy wektor zapewniający pożądaną informację genetyczną dla pożądanej komórki gospodarza może być stosowany do zapewnienia genetycznych sekwencji kodujących pochodne antygenu alfa według wynalazku do komórki gospodarza. Na przykład, poza plazmidami, wektory takie obejmują liniowy DNA, kosmidy, transpozony i fagi.

Komórka gospodarza nie ogranicza się do E.coli. Każdy gospodarza bakteryjny lub drożdżowy (taki jak C.cerevisiae), który jest zdolny do ekspresji pochodnych według wynalazku może być odpowiednim gospodarzem. Na przykład, jako gospodarz może być stosowany B.subtilis i Streptococcus grupy B. Metody klonowania do takich gospodarzy są znane. Na przykład, dla gospodarzy Gram-dodatnich opis metod hodowlanych, genetyczną analizę plazmidów, techniki klonowania genów, zastosowanie transpozonów, fagów i wektorów integracyjnych dla mutagenezy i konstrukcji fuzji genowych oraz metody pomiaru ekspresji genów podano w Harwood, C. R. i wsp., wyd. Molecular Biological Methods for Bacillus, Wiley-Interscience, New York, 1991. Odpowiedni gospodarze są dostępni z ośrodków kolekcji takich jak American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA) i Ośrodek Muzeum Genetycznego Bacillus (Ohio State Univ., Columbus, OH, USA).

Obecny wynalazek obejmuje szczepionkę zawierającą polisacharyd (taki jak polisacharyd otoczkowy), charakterystyczny dla Streptococcus grupy B sprzężony z białkiem, które również jest charakterystyczne dla Streptococcus grupy B. Polisacharyd i białko w takiej sprzężonej szczepionce mogą być identyczne z cząsteczką, która jest charakterystyczna dla Streptococcus grupy B lub mogą być funkcyjnymi pochodnymi takiej cząsteczki.

Dla celu obecnego wynalazku, jako polisacharyd Streptococcus grupy B może być zastosowany dowolny polisacharyd B-specyficzny lub specyficzny wobec serotypu. Korzystnie, można stosować polisacharyd, który wprowadzony do ssaka (zwierzęcia lub człowieka) wytwarza przeciwciała zdolne do reagowania z Streptococcus grupy B. Przykłady korzystnych polisacharydów według wynalazku obejmują otoczkowe polisacharydy Streptococcus grupy B lub ich równoważniki.

Dla celu obecnego wynalazku może być stosowane każde białko, które wprowadzone do ssaka (zwierzęcia lub człowieka) bądź wytwarza przeciwciała zdolne do reagowania z białkiem eksprymowanym przez Streptococcus grupy B lub które zwiększa immunogenność polisacharydu dla wytwarzania przeciwciał wobec polisacharydu Streptococcus grupy B. Przykładem korzystnego białka według wynalazku jest białko C Streptococcus grupy B lub jego ekwiwalenty.

Przykłady funkcyjnych pochodnych antygenów peptydowych obejmują fragmenty naturalnych białek, takie jak fragment N-terminalny, fragment C-terminalny lub wewnętrzną sekwencję fragmentów Streptococcus grupy B białka antygenu alfa, który zachowuje swoją zdolność do wytwarzania ochronnych przeciwciał Streptococcus grupy B. Zgodnie z intencją, określenie pochodne funkcyjne obejmuje warianty naturalnego białka (takie jak białka mające zmienioną sekwencję aminokwasową, ale zachowały zdolność wytwarzania immunogennej, wirulencyjnej lub antygenowej własności jaką wykazuje naturalna cząsteczka), na przykład, warianty antygenu białka wymienione poniżej, które posiadają mniej wewnętrznych powtórzeń niż ma natywny antygen alfa i/lub zmienioną sekwencję flankującą.

Antygen peptydowy, który w szczepionce według wynalazku jest sprzężony z polisacharydem może być peptydem kodującym naturalną sekwencję aminokwasów antygenu alfa, jak kodowana na plazmidzie pJMS23 (z lub bez sygnalnej sekwencji peptydowej) lub może być funkcyjną pochodną sekwencji natywnej. Natywne białko C antygenu alfa Streptococcus grupy B jak kodowane na plazmidzie pJMS23 zawiera otwartą ramkę odczytu 3060 nukleotydów i koduje prekursor białka o 108.705 daltonach. Odszczepienie przypuszczalnej sekwencji sygnalnej 41 aminokwasów daje dojrzałe białko o 104.106 daltonach. N-terminalny region antygenu alfa o 204.417 daltonach nie wykazuje homologii z uprzednio opisaną sekwencją białkową i następuje po nim szereg dziewięciu tandemowo powtarzających się jednostek, które uzupełniają 74% dojrzałego białka. Każda powtarzająca się jednostka (oznaczona tutaj jako R) jest identyczna

177 302 i składa się z 82 aminokwasów o ciężarze cząsteczkowym 8665 daltonów, która jest kodowana przez 246 nukleotydów. Wielkość powtarzających się jednostek koresponduje z obserwowanymi wielkościami różnic w heterogenicznej drabinie alfa białka C naturalnie eksprymowanego w Streptococcus grupy B. C-terminlany region antygenu alfa zawiera motyw obszaru zakotwiczenia błony, który jest dzielony przez wiele Gram dodatnich białek powierzchniowych. Duży region jednakowych powtarzających się jednostek w tym genie (oznaczony gen bca białka C antygenu alfa Streptococcus grupy B) definiuje eoptopy i może być stosowany do generowania różnorodności funkcyjnych pochodnych antygenu alfa przydatnych w szczepionkach według wynalazku.

Korzystnie, sekwencja takiej funkcyjnej pochodnej antygenu alfa zawiera 1-9 kopii powtórzonych 82 aminokwasów (242 nukleotydów), których początek znajduje się przy 679 aminokwasie sekwencji DNA z fig. 6 (w związku z tym przydatne jest tutaj oznaczenie częściowego powtórzenia jako powtórzenie 9'). Pochodnej funkcyjnej może brakować 185 aminokwasowej 5' sekwencji flankującej (555 nukleotydów, które stwierdzono w białku natywnym przed powtarzającą się sekwencją i/lub pochodnej tej może brakować 48 aminokwasów (246 nukleotydów zakotwiczającej sekwencji końca C lub może zachować tę sekwencję. Funkcyjna pochodna może być fragmentem końca, który poprzedza początek powtarzaj ącej(ych) jednostki(ek) antygenu alfa lub pochodna funkcyjna może być tylko fragmentem końca C, który następuje za końcem powtarzających się jednostek antygenu alfa lub pochodna funkcyjna może być hybrydą fragmentu końca N i końca C bez kopii jednostek R jak podano poniżej. Aminowa sekwencja końca natywnego antygenu alfa może lub może nie zawierać sekwencji sygnalnej. W sprzężonej szczepionce według wynalazku może być stosowana jedna z dwóch sekwencji, terminalna sekwencja aminowa lub terminalna sekwencja karboksylowa antygenu alfa, z lub bez jednej lub więcej kopii sekwencji, która jest powtórzona w rdzeniu natywnego białka antygenu alfa.

Stosowane tu określenie R oznacza jedną kopię powtarzanych 82 aminokwasów, która rozpoczyna się przy 679 aminokwasie sekwencji DNA antygenu alfa z fig. 6, R_x oznacza liczbę X tandemowo powtarzanych kopii tego powtórzenia połączonych tandemowo przy końcu karboksylowym jednej z jednostek R z amino terminalnym końcem przyłączanej jednostki R, N oznacza 5' aminokwasową sekwencję flankującą, stwierdzoną w sekwencji przedstawionej na fig. 6 z lub bez sekwencji sygnalnej; gdy nie ma sekwencji sygnalnej, N oznacza 185 aminokwasową 5' sekwencję flankującą, która została znaleziona w białku natywnym pokazanym na fig. 6; gdy sygnalna sekwencja jest obecna, N oznacza 226 aminokwasową 5' sekwencję flankującą jak pokazano na fig. 6. C oznacza 48 aminokwasową C-terminalną sekwencję kotwiczącą jak pokazano na fig. 6. Stosując te oznaczenia, następujące rodzaje są przykładami pochodnych białka natywnego, które może być skonstruowane według wynalazku:

l.Ri	12. R3	23. N-Rs-C	34. Rs-C
2. N	13. N-R3	24. Ró	35. N-Rs-C
3. C	14. R3-C	25. N-Ró	36. R9
4. N-C	15. N-R3-C	26. Ró-C	37. N-R9
5. N-Ri	16. R4	27. N-Ró-C	38. R9-C
6. R-C	17. N-R4	28. R7	39. N-R9-C
7. N-Ri-C	18. R4-C	29. N-R7	40. R10
8.R2	19. N-R4-C	30. R7-C	41 .N-R10
9. N-R2	20. R5	31. N-R7-C	42. Rio-C
10. R2-C	21 .N-R 5	32. Rs	43. N-Rio-C
II.N-R2-C	22. R5-C	33. N-Rs

W podobny sposób może być skonstruowanych więcej niż 10 powtarzających się jednostek, w tym na przykład 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 jednostek R. Ponadto, można stosować fragmenty R, N lub C, jeżeli takie fragmenty zwiększą funkcyjną zdolność tej pochodnej do wytworzenia przeciwciał ochronnych przeciw Streptococcus grupy B, lub jeżeli taki fragment zapewni inną pożądaną właściwość konstruktu, taką jak sekrecja sygnalna lub membranowe zlokalizowanie sygnału.

177 302

Antygeny alfa z innych szczepów Streptococcus grupy B mogą być sporządzone i stosowane w podobny sposób, ponieważ niewielka zmiana w sekwencji takiego białka, na przykład w zakończeniu N lub zakończeniu C lub powtórzeniu R nie zmieniałaby biologicznych własności i ich funkcyjnej zdolności do wytwarzania przeciwciał ochronnych. Jest intencją, aby zakresem wynalazku objęty był, na przykład, antygen alfa Streptococcus grupy B wyodrębniony z różnych szczepów Streptococcus grupy B i mający tę samą jednostkę powtarzaną, ale różną N-terminalną sekwencję aminokwasową.

Heterogeniczność szczepionki można uzyskać przez zmieszanie specyficznych sprzężonych rodzajów. Na przykład, preparat szczepionkowy może zawierać jedną lub więcej kopii z jednej z peptydowych postaci sprzężonych z węglowodanem, lub preparat szczepionkowy może być sporządzony tak, by zawierał więcej niż jedną postać powyższych pochodnych funkcyjnych i/lub sekwencję natywną, z których każda sprzężona jest z użytym w niej polisacharydem. Koniugaty dostarczające peptyd (taki jak jeden z peptydów wyszczególnionych przykładowo w grupie 1-43 pozycji) mogą być zmieszane z koniugatami dostarczającymi dowolny inny peptyd (taki jak drugi przykład z grupy 1-43 pozycji), dochodząc do związku stanowiącego sprzężoną szczepionkę. Szczepionka multiwalentna może również być wytworzona przez zmieszanie B-specyficznych konjugatów takich jak sporządzone powyżej z innymi białkami, takimi jak toksyny błonicy, toksyny tężca i/lub z innymi polisacharydami, za pomocą znanych sposobów.

Heterogeniczność szczepionki zapewnia również zastosowanie preparatów paciorkowcowych grupy B z gospodarzy Streptococcus grupy B (zwłaszcza Streptococcus agalactine), które zostały przekształcone z rekombinantowymi konstmktami według wynalazku, tak, że paciorkowocowy gospodarz eksprymuje białko antygenu alfa lub jego funkcyjną pochodną. W takich przypadkach, homologowa rekombinacja między sekwencjami genowymi kodującymi powtarzające się jednostki R, da w rezultacie spontaniczną mutację gospodarza, w rezultacie populacja gospodarzy jest z łatwością generowana i tacy gospodarze eksprymują szeroki zakres antygenicznej pochodnej funkcyjnej antygenu alfa przydatnej dla szczepionki według wynalazku. Taka spontaniczna mutacja zwykle powoduje delecję jednostek R, lub ich części, chociaż może pojawić się mutacja innych regionów antygenu alfa.

Stosowane tu określenie, polisacharyd lub białko są charakterystyczne dla bakterii, jeśli jest ona zasadniczo podobna pod względem budowy lub sekwencji do cząsteczki naturalnie związanej z tą bakterią. Intencją było, aby to określenie obejmowało zarówno cząsteczki, które są specyficzne dla organizmu, jak również cząsteczki, które chociaż obecne w innych organizmach, związane są z wirulencją lub antygennością bakterii u człowieka lub gospodarza zwierzęcego.

Szczepionka według wynalazku może nadawać oporność na Streptococcus grupy B bądź poprzez immunizację pasywną bądź poprzez immunizację aktywną. W jednym wykonaniu immunizacji pasywnej, szczepionkę dostarcza się do gospodarza wolontariusza (np. człowieka lub zwierzęcia) i wytworzoną surowicę odpornościową pobiera się i bezpośrednio dostarcza biorcy podejrzanemu o infekcję spowodowaną Streptococcus grupy B.

Możliwość znakowania przeciwciał lub fragmentów przeciwciał znaczącymi toksynami zapewnia dodatkową metodę traktowania infekcji Streptococcus grupy B, podczas przeprowadzania tego typu immunizacji pasywnej. W tym wykonaniu, przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, które są zdolne do rozpoznawania antygenów Streptococcus grupy B oznakowane są cząsteczkami toksyn przed ich podaniem pacjentowi. Gdy taka cząsteczka derywatyzowana toksyną przyłączy się do komórki Streptococcus grupy B, część toksynowa spowoduje śmierć komórki.

W drugim wykonaniu, szczepionkę podaje się kobiecie (w czasie lub przed ciążą lub porodem), w czasokresach i w ilości wystarczającej do spowodowania wytworzenia surowicy odpornościowej, która służy do ochrony zarówno kobiety jak i płodu lub noworodka (poprzez pasywne wprowadzenie przeciwciał przez łożysko).

Obecny wynalazek obejmuje zatem i dostarcza środki do zapobiegania lub osłabiania infekcji wywołanych Streptococcus grupy B lub przez organizmy o antygenach, które mogą być rozpoznawane i wiązane przez surowice odpornościowe sprzężonej szczepionki polisacharyd i/lub białko. Stosowane tutaj, określenie szczepionka oznacza szczepionkę, która zapobiega lub

177 302 osłabia chorobę, jeśli podana osobnikowi spowoduje bądź całkowite bądź częściowe osłabienie (tj. stłumienie) objawów lub stanu chorobowego albo całkowite lub częściowe uodpornienie osobnika na tę chorobę.

Podawanie szczepionki (lub produkowanej przez nią surowicy odpornościowej) może być realizowane zarówno w celu profilaktycznym jak i terapeutycznym. Przy podawaniu profilaktycznym, kompozycję dostarcza się z wyprzedzeniem przadjakimOalwiak objawem infekcji Streptococcus grupy B. Podawanie profilaktyczne kompozycji służy zapobieganiu lub osłabianiu każdej następnej infekcji. Przy podawaniu terapeutycznym, kompozycję dostarcza się po wykryciu objawów aktualnej infekcji. Podawanie terapeutyczne kompozycji służy osłabieniu eaniejkalwiek aktualnej infekcji.

Środki przeciwzapalne według wynalazku mogą zatem być dostarczane bądź przed wystąpieniem infekcji w celu jej zapobieżenia lub w celu osłabienia antycypowanej infekcji lub na początku aktualnej infekcji.

Kompozycja jest farmaceutycznie dopuszczalna, jeśli jej podawanie jest tolerowane przez pacjenta biorcę. Taki środek podawany jest w terapeutycznie skutecznej ilości, jeżli podana ilość jest fizjologicznie znacząca. Środek jest fizjologicznie znaczący, jeśli jego obecność powoduje wykrywalną zmianę w fizjologii pacjenta biorcy.

Szczepionka według wynalazku podawana poszczególnemu pacjentowi może mieć postać kompozycji, która może zawierać sole, bufory, substancje pomocnicze lub inne substancje, które sąpożądane dla poprawienia skuteczności kompozycji. Substancje pomocnicze są substancjami, które mogą być stosowane w celu specyficznego wzmocnienia specyficznej reakcji odpornościowej. Normalnie, substancję pomocniczą i kompozycję miesza się przed wprowadzeniem do układu immunologicznego lub wprowadza oddzielnie, ale do tego samego miejsca immunonizowanego zwierzęcia. Substancje pomocnicze mogą być z grubsza podzielone na kilka grup na podstawie ich składu. Grupy te obejmują adjuwanty olejowe (na przykład kompletny lub niekompletny adjuwant Freunda), sole mineralne (na przykład AIK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH 4(SO4), krzemionka, kaolin i węgiel), polinukleotydy (na przykład kwasy poli IC i poli AU) i niektóre substancje naturalne (na przykład wosk D z Mycobacterium tuberculosis jak również substancje znalezione w Corynebacterium parvum lub Bordetella pertussis i grupie należącej do rodzaju Brucella. Wśród tych substancji szczególnie przydatnymi jako adjuwanty są saponiny takie jak Quil A. (Superfos A/S, Dania). Przykłady materiałów odpowiednich do stosowania w kompozycjach szczepionek podane są w Remington’s Pharmaceutical Sciences (Osol, A., Ed, Mack Publishing Co, Easton, PA, str. 1324-1341 (1980) - podanym tu jako odnośnik literaturowy).

Kompozycja terapeutyczna według wynalazku może być podawana pozajelitowo przez iniekcje, szybką infuzję, absorpcję nosowo-gardłową ^nosowo-gardłową), dermosorpceę lub doustnie. Alternatywnie, kompozycje mogą być podawane domięśniowo lub dożylnie. Kompozycje do podawania pozajelitowego obejmują sterylne roztwory, zawiesiny i emulsje wodne i niewodne. Przykładowymi rozpuszczalnikami niewodnymi są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, aleea roślinne takie jak olej z oliwek i nadające się do iniekcji estry organiczne takie jak oleinian etylu. W celu zwiększenia przepuszczalności przez skórę i wzmożenia absorpcji antygenu można stosować nośniki i opatrunki okluzyjne. Ciekle postacie do podawania doustnego ogólnie mogą stanowić roztwór liposomowy zawierający ciekłą postać dawki. Do zawieszania liposomów odpowiednie są emulsje, zawiesiny, roztwory, syropy i eliksiry zawierające obojętne rozcieńczalniki powszechnie stosowane w tej dziedzinie, takie jak oczyszczona woda. Poza obojętnymi rozcieńczalnikami, kompozycje takie mogą również zawierać substancje pomocnicze, środki zwilżające, środki emulgujące i zawieszające lub środki słodzące, aromatyzujące lub perfumujące.

Istnieje wiele różnych technik ustalających czasokresy immunizacji, w przypadku stosowania reżimu wielokrotnego podawania. Możliwe jest stosowanie kompozycji według wynalazku więcej niż raz w celu zwiększenia poziomów i różnorodności ekspresji i repertuaru eksprymowanej immunoglobuliny przez immunizowane zwierzę. Zwykle, jeśli przeprowadza się wielokrotną immunizację, robi się to w odstępie jedno lub dwu miesięcznym.

177 302

Według wynalazku skuteczna ilość kompozycji terapeutycznej oznacza ilość wystarczającą do uzyskania pożądanego efektu biologicznego. Zwykle dawkowanie zapewniające skuteczną ilość kompozycji będzie różne w zależności od takich czynników jak wiek, płeć i zakres choroby zwierzęcia lub człowieka i ewentualnie inne zmienne, które mogą być ustalone przez znawcę.

Preparaty antygenowe według wynalazku mogą być podawane bądź w pojedynczej dawce, bądź w dawkach wielokrotnych w skutecznej ilości. Skuteczne ilości kompozycji według wynalazku mogą być zawarte w zakresie od 0,01-1,^000 μg/ml na dawkę, korzystniej 0,1-500 μg/ml i najkorzystniej 10-300 μg/ml na dawkę.

Dla łatwiejszego zrozumienia wynalazku opisanego powyżej przedstawiono następujące przykłady jego wykonania, które podano w celu zilustrowania wynalazku, nie zaś w celu ograniczenia jego zakresu, chyba, że zaznaczono to specjalnie.

Przykład 1. Skuteczność klonowania wektorów pUX12

Przeprowadzono szereg doświadczeń, aby zbadać skuteczność klonowania wektorów pUX12 i aby określić, czy zmodyfikowane ramki odczytu zostały prawidłowo transkrybowane. Wyniki tych doświadczeń krótko podsumowano poniżej:

1. W celu klonowania fragmentu DNA w pUX12, wymieszano trzy układy o równomolarnych stężeniach: pUX12 (układ oryginalnej zerowej ramki czytającej), pUX12+1 i pUX12-1. Następnie przecięto plazmidy za pomocą BstXI w celu rozszczepienia wymiennego fragmentu we wnętrzu polilinkera. Fragment wymienny został oddzielony od plazmidu, przy zastosowaniu albo agarozy o niskiej temperaturze topnienia, albo gradientu octanu potasowego (Aruffo, A. i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci, USA 84:8573-8577 (1987), Ausubel,F. M. i wsp. Current Topics in Molecular Biology; Greene Publ. Assn./Wiley Interscience, NY (1987)). W celu klonowania DNA został on przecięty za pomocą enzymu restrykcyjnego, co pozwoliło uzyskać tępe końce (można w tym celu zastosować dowolny enzym restrykcyjny). Gdy potrzeba, można modyfikować dwuniciowy DNA z sygnalnymi końcami nici w celu utworzenia tępych końców. Tępe końce fragmentów DNA zmieszano z dwoma syntetycznymi oligonukleotydowymi adapterami. Tymi samymi 12-mer i 8-mer, które zostały zastosowane przy przygotowywaniu fragmentu wymiennego. Zmodyfikowane fragmenty DNA zostały oddzielone od połączonych ze sobą w jedno syntetycznych nukleotydów na gradiencie octanu potasowego. Fragmenty te zostały następnie połączone w obecności ligazy w liniową pUX12 rodzinę plazmidów i zastosowane do transformacji E. coli.

W celu sprawdzenia, czy wektory pUX12 samoligują przy niskich częstotliwościach w warunkach optymalnych dla klonowania insertów z adaptorami, klonowano drugi odporny na leki marker w pUX 12. Jak pokazano na fig;, 1, pUX 12 posiada gen β-laktamazy i nośnik odporny na ampicilinę (amp^R). Uzasadnieniem klonowania drugiego markera było porównanie stosunku klonów, które zawierały oba odporne na leki markery do tych plazmidów pUX12, które samoligowały w warunkach typowych dla klonowania, i dlategoż wykazywały tylko odporność na ampicilinę. Gen odporności na tetracyklinę (tefR) z plazmidu pBR322 został klonowany w polilinkerze pUX12 za pomocą adaptorów opisanych powyżej. Przeprowadzono grupę testowych ligacji w celu oznaczenia optymalnego stężenia oligonukleotydowego adaptora do końcówek fragmentu, oraz stosunku modyfikowanej wstawki do liniowego plazmidu pUX12, dla ligacji i transformacji. Poprzez zastosowanie genu te7 jako markera, można określić parametry klonowania tak, aby więcej niż 99% transformantów rozdzielonych na płytkach zawierających ampicilinę również przenosiło markery tetR Zatem, frekwencja samoligacji jest bardzo niska w tym układzie, i zbędnym jest przeszukiwanie dla zapewnienia obecności inserta w polilinkerze przed przeszukiwaniem biblioteki w pUX12.

2. W celu potwierdzenia znaczenia translacyjnej ramki odczytu w polilinkerze pUX12, klonowano gen strukturalny, którego sekwencja i produkt są znane, i który nie posiada własnego promotora.

W tym celu, wybrano mutant strukturalnego genu tox noszony na plazmidzie (Costa, J. J. i wsp. J.Bacteriol. 148( 1):124-130 (1981), Michel, J. L. i wsp. J. Vltroi. 42:510-518(1982), które podano jako odnośniki literaturowe). Plazmid pABC402 został potraktowany jednocześnie restrykcyjnymi endonukleazami Apall i Hindlll (Bishai, W. R. i wsp. J.Bacteriol.

177 302

169:1554-1563 (1987), Bishai, W. R. i wsp. J.Bacteriol. 769:51^40-5151 (1987), które podano jako odnośniki literaturowe). Miejsce Apal znajduje się we wnętrzu genu strukturalnego w pobliżu pozycji końca N, a miejsce HindKI leży tuż na zewnątrz końca C genu tox. Ten fragment restrykcyjny 1,2 kb oddzielono od pozostałych 4,1 kb wektora pABC402 za pomocą agarozy o niskiej temperaturze topnienia.

W celu utworzenia tępych końcy niezbędnych do klonowania, fragmenty tox potraktowano T4 DNA polimerazą. Aktywność egzonukleotyczna polimerazy wycięła końce 3' ApalI, a jej aktywność polimerazy wypełniła lepkie 5' końce w miejscu HindKI (Maniatis, T. i wsp. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Ten oczyszczony fragment z tępymi końcami zligowano w mieszaninie pUX12, która zawierała wszystkie trzy ramki odczytu. Poszczególne transformanty zostały przypadkowo wybrane i przeszukane za pomocą restrykcyjnego mapowania w celu określenia orientacji i ramek odczytu insertów. Dodatkowo określono nukleotydowe sekwencje regionów polilinker/adaptor/insert. Zidentyfikowano kombinacje wszystkich trzech potencjalnych orientacji i ramek odczytu. W końcu, osłonięto ekstrakty z tych klonów przy zastosowaniu metody Western blotting sondując surowicą odpornościową skierowaną przeciwko toksynie błonicy (Blake, M.

S. i wsp. Anal.Biochem. 136:115-119 (1984), Murphy, J, R. i wsp. Curr.Topics Microbiol.and Immun. 118:235-251 (1985)).

Tylko reaktywną toksynę pokrewną proteinom wykryto w klonach, które zawierały gen strukturalny o poprawnej orientacji i ramce odczytu. Plazmid ten nazywa się pUDTAH-1; sekwencja DNA polilinkera i początku genu strukturalnego tox przedstawiona jest w tabeli 1. Opisaną sekwencją jest sekwencja DNA początku genu strukturalnego tox w pUDTAH-1. ATG jest sygnałem rozpoczęcia transkrypcji (lacZ'), GAT zapoczątkowuje modyfikowany polilinker pUX12, a GCC rozpoczyna prawidłową ramkę odczytu translacji dla genu tox'.

Tabela 1

Sekwencje plazmidu pUDTAH

ATGACCATGTTACGAATTCGAGCTCGCCCGGG	GATCCATTGTGCTGGAAAG	CCACC [SEQ ID NO: 6]
Polilinker (ATG = LacZ Kodon	Adaptory	Gen Toksyny
Rozpoczęcia Translacji)	Oligonukleotydu	Błonicy

Przykład 2. Oczyszczanie chromosomowego DNA z grupy B Streptococcus

W celu oczyszczenia chromosomowego DNA z grupy B Streptococcus (Lancefield, R. C. i wsp. J.Exp.Med. 142:165-119 (1975)) według sposobu Hulla i wsp.(Hull, R. A. i wsp. Infect.Immun. 55:933-938 (1981) zmodyfikowanego przez Rubensa i wsp. (Rubens, C. E. i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci USA 84:7208-7212 (1987), obie pozycje podano jako odnośniki literaturowe). W skrócie, zastosowano mutanolizynę do konwersji szczepu Streptococcus grupy B szczepu A909 (Ia/c) w protoplastach. Odkryto, że powstały w ten sposób ekstrakt zewnętrzny zawiera dużą ilość białek, które immunoreagują z ochronną surowicą odpornościową wyhodowaną na nieuszkodzonych bakteriach. Frakcję nierozpuszczalnych białek częściowo oczyszczono używając konwencjonalnej kolumny chromatograficznej. Do immunizowania królików zastosowano dwie frakcje, w tym jedną o wysokim stężeniu 14 kilodaltonów (kd) pojedynczych gatunków. Odkryto, że surowice odpornościowe hodowane przeciwko białkom częściowo oczyszczonej grupy B Streptococcus, są zdolne do udzielania pasywnej ochrony w przeprowadzonym mysim teście zjadliwości przeciwko typowi wytwarzającemu heterologiczną otoczkę bakteryjną Streptococcus grupy B niosącym białka C.

Streptococcus grupy B zostały oczyszczone na drodze wirowania w gradiencie chlorku cezowego (CsCl) o gęstości wyporowej, a chromosomowy DNA oddzielono na drodze dializy wyczerpującej z buforu TAE, a pH 8,0 (Maniatis, T. i współ., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Szczep A909 Streptococcus grupy B posiada otoczki typu 1, które ekprymują białka C, i które uprzednio były stosowane

177 302 w badaniach białek C (Valtonen, M.V. i wspól., Microb.Path. 7:191-204 (1986)). Jest to również ten szczep Streptococcus grupy B, który stosowano przy wytwarzaniu ochronnej surowicy odpornościowej używanej do osłaniania.

Wydajność chromosomowego DNA Streptococcus grupy B osiąga przeciętnie od 3 do 5 mg na każde 500 ml całonocnej kultury Streptococcus grupy B. Oczyszczony DNA osobno poddano trawieniu za pomocą 24 restrykcyjnych endonukleaz równocześnie, a powstałe fragmenty hodowano na 1,0% żelu agarozowym. Wybrano szeroki zakres enzymów, włączając te, które mają nietypowe miejsca na polilinkerach wspólnie stosowanych do klonowania wektorów. Zabarwienie żelu bromkiem etylu (EtBr) wykazało, że wszystkie te enzymy restrykcyjne wykazały rozkład ziarnistych fragmentów o rozmiarach odpowiadających DNA grupy B Streptococcus. Wynik ten sugeruje, że DNA Streptococcus grupy B nie jest modyfikowany przez żaden z tych testowanych enzymów restrykcyjnych.

W celu określenia, czy były obecne jakieś inhibitory blokujące ligację DNA, wytrącono etanolem restrykcyjną endonukleazę stosowaną w wyżej opisanych trawieniach, umieszczono ją w buforze ligacji i inkubowano przez noc w temperaturze 14°C z ligazą DNA. Próbki te zostały ponownie hodowane na 1,0% żelu agarozowym i zabarwione EtBr. Powstałe wzory restrykcyjne wykazują rozkład wyższych mas cząsteczkowych. Stąd wynika, że nie nastąpiła inhibicja ligacji DNA Streptococcus grupy B.

Przykład 3. Przygotowanie biblioteki chromosomowego DNA grupy B Streptococcus

Przygotowanie biblioteki chromosomowego DNA w pUX12 i jego transformacji w E. coli przeprowadzono w następujący sposób. Aby rozszczepić chromosomowy DNA Streptococcus grupy B - dla klonowania, wybrano cztery enzymy restrykcyjne, które dają szeroki rozkład rozmiarów fragmentów restrykcyjnych. WektorpUX12 i adaptory sąnajbardziej wydajne wtedy, gdy klonuje się fragmenty o tępych końcach. Wybrane enzymy rozpoznają cztery podstawowe pary pozycji i pozostawiają tępe końce. DNA Streptococcus grupy B poddano częściowemu trawieniu indywidualnie za pomocą Alul, FunD2, Haelll i Rsal.

Powstałe w ten sposób fragmenty wymieszano, oczyszczono za pomocą mieszaniny fenol/chloroform, wytrącono etanolem i ponownie zawieszono w buforze ligacji (Maniatis, T. i wsp. Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Jeden gg fragmentów DNA Streptococcus grupy B wymieszano z 3 gg 12-mer i z 2 gg 8-mer oligonukleotydowymi adaptorami. Dodano 3 mikrolitry T4 DNA ligazy (600 jednostek, New England Biolabs) i prowadzono reakcję przez całą noc w temperaturze 14°C. Wydzielono wolne linkery z fragmentów DNA grupy B Streptococcus na prędkościowym gradiencie octanu potasowego (Aruffo, A. i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci.. USA 84:8573-8577 (1987)).

Plazmid pUX12 zawierający wszystkie trzy ramki odczytu translacji poddano trawieniu za pomocą BstXI, a fragmenty wymienne usunięto za pomocą żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia. Przygotowano bibliotekę Streptococcus grupy B poprzez wymieszanie 10 ng fragmentów adaptowanych Streptococcus grupy B z 100 ng wektorów liniowych pUX12 w 100 gl buforu ligacji, do którego dodano 0,1% T4 DNA ligazy. Prowadzono reakcję ligacji przez całą noc w temperaturze 14°C, a następnie transformowano szczep MC1061 E. coli na płytki zawierające ampicilinę (Ausubel, F. M. i wsp. Curreny Topics in Molecular Biology (1987)).

Wyizolowano szesnaście powstałych w wyniku tej reakcji transformantów, hodowano je przez całą noc w LB, a plazmid DNA wyizolowano za pomocą minipreparacji. Plazmid DNA poddano trawieniu za pomocą BamHI, i hodowano na 1,0% żelu agarozowym. Wszystkie z wyszukanych plazmidów zawierały inserty w wektorach pUX 12, a średni rozmiar insertu wynosił 1,4 kb. Podsumowując, plazmid DNA uzyskany z ponad 200 klonów został wyszukany, i znaleziono tylko jeden klon, który wykazywał brak insertu w polilinkerze.

Przykład 4. Charakterystyka ochronnej surowicy odpornościowej stosowanej do przeszukiwania biblioteki

Jak to omówiono wcześniej, białka C zostały częściowo oczyszczone za pomocą różnych technik, a ochronne surowice odpornościowe zostały też już wcześniej otrzymane przez wielu badaczy (Bevanger, L. i wsp. Acta Path.Microbiol.Scand. Sect.B. 93:113-119 (1985); Russel22

177 302

Jones, G. J. i wsp. J.Exp.Med. 760:1476-1484 (1984); Wilkinson, H. W. i wsp. Infec.Immun. 4:596-604(1971)).

Przeprowadzono serię doświadczeń w celu powtórzenia pracy Valtonena, Kasper’a i Levy’ego, którzy wyizolowali białko o 14000 mw z supernatantu Streptococcus grupy B, które wytwarzają przeciwciało ochronne (Valtonen, M. V. i wsp. Microb.Path. 7:191-204 (1982), który podano jako odnośnik literaturowy). Doświadczenie to wykazało, że gdy dodano inhibitory proteolityczne do supernatantów kultur Streptococcus grupy B przed zatężaniem i oczyszczaniem białek C (Wong, W. W. i wsp. J.Immunol.Methods. 82:303-313 (1985)), białko 14000 mw nie było już białkiem głównym w supernatancie. Wynik ten wskazuje na to, że białko to powstaje na skutek proteolizy białek C o większej masie cząsteczkowej w supernatantach kultur Streotococcus grupy B.

Przykład 5. Optymalizacja warunków przeszukiwania dla ekspresji w wektorach na bazie plazmidu

Jak opisano powyżej, wektory najczęściej stosowane do detekcji ekspresji bazują na λgtl 1 (Young, R. A. i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:1194-1198 (1983)). Byliśmy zdolni do podwyższenia czujności detekcji ekspresji z wektora pUX12 plazmidu poprzez połączenie dwóch uprzednio opisanych procedur przeszukiwania przeciwciał kolonii bakteryjnych. Transformanty z biblioteki hodowano na płytce przez noc, i powstałe w ten sposób kolonie przeniesiono na filtry nitrocelulozowe (Bio-Rad). Kolonie te lizowano poprzez umieszczenie tych filtrów w atmosferze nasyconej chloroformem (CHCf) w zamkniętym pojemniku przez 30 min. Następnie filtry umieszczono w buforze lizy i inkubowano przez całą noc jak to opisano przez Helfmana i wsp. (Helfman, D. M. i wsp. Proc.Natl.Acad. USA 80:31-35 (1983)). Dokonano przeszukania przeciwciała wykorzystując będący w sprzedaży E. coli lizat (w stosunku 1:200) i Horseradish Peroxidase Conjugated, Affinity Purified Goat Anti-Rabbit IgG (w stosunku 1:3000) w zestawie Express-Blot Assay Kit sporządzonym przez Bio-Rad Laboratories. Poprzez uprzednie potraktowanie kolonii chloroformem i całonocne inkubowane z DNazą i lisozymą opisanymi powyżej, możliwym było zredukowanie wymaganego stosunku początkowych przeciwciał z 1:500 do 1:5000.

Przykład 6. Początkowa analiza klonów pozytywnych i ich produktów białkowych

Bibliotekę chromosomowego DNA Streptococcus grupy B w wektorach pUX12 przeszukano za pomocą wyżej opisanej ochronnej dla anty-C białek surowicy odpornościowej. Biblioteka Streptococcus grupy B posiadała średni wymiar fragmentów 1,4 kb. Transformanty przeszukano tak, jak to opisano powyżej, a następnie trzykrotnie subklonowano i ponownie przeszukano za pomocą surowicy odpornościowej. Spośród 20.000 osłoniętych klonów, 35 było klonami niezależnie wyizolowanymi, które reagowały z ochronną surowicą odpornościową. Klony te oznaczono S1-S35, a plazmidy zawierające te klony oznaczono jako pJMS1-pJMS35. Rozmiar tych klonów wahał się od 0,9 do 13,7 kb, a średni rozmiar wynosił 4,5 kb.

Plazmid DNA wyizolowano na drodze mini-preparatyki, a następnie inserty przetestowano za pomocą czterech endonukleaz restrykcyjnych. Czternaście z tych klonów rozdzielono na trzy grupy bazując na tym, że posiadały one identyczne rozmiary insertów oraz wspólny wzór mapowania endonukleazy restrykcyjnej wewnątrz każdej grupy. Odkryto, że opisane powyżej klony S1 i S23 należały do innych grup.

Na drodze dalszego porównywania wzorów restrykcyjnych poszczególnych klonów, możliwym okazało się zidentyfikowanie 24 klonów, które posiadały wspólne dowolne fragmenty restrykcyjne.

Przygotowano ekstrakt z klonów, wyhodowanych metodą Western blotting sondując surowicą odpornościową stosowaną do osłaniania biblioteki. Rozpoznano sześć klas rozmiarów białkowych antygenów (A-F). Na drodze połączenia danych uzyskanych z mapowania endonukleazy restrykcyjnej i z Western biotów, możliwym okazało się zaklasyfikowanie 24 spośród 35 klonów na 6 różnych wzorów białkowych antygenów (tabela 2). Tej wstępnej klasyfikacji dokonano tylko w celu uzyskania pobieżnego przeglądu potencjalnej liczby interesujących nas genów. Odkryto, że rozmiar S1 wynosi 3,5 kb, i że należy on do białkowego antygenu o wzorze A. Rozmiar S23 wynosi 13,7 kb, i należy on do białkowego antygenu o wzorze D.

177 302

Tabela 2

Wstępna klasyfikacja białka C klonów Streptococcus grupy B

Profil Białkowy	Liczba klonów	Masa cząsteczkowa wstawki (kb)	Objętość kodująca wstawki DNA	Rozmiar antygenu (w .daltonach)
A	6	3,5	136 000	115 000
B	3	1,9	76 000	50 000
C	7	4,4	174 000	130 000
D	6	13,7	>500 000	110 000
E	1	1,7	67 000	50 000
F	1	0,9	36 000	15 000

Podczas gdy Western bioty z ekstraktem z klonów sondowano w surowicy odpornościowej przeciwko szczepowi Streptococcus grupy B, który nie eksprymował białka C, tylko jedna grupa klonów była pozytywna (Białkowy Profil B). Wyniki ten wskazuje na to, że większość klonów pozytywnych eksprymuje białka nietypowe dla szczepów niosących białka C; białka te nie są wspólne dla wszystkich szczepów Streptococcus grupy B.

Przykład 7. Charakterystyka sekwencji klonowanego genu

Nie oznaczono jeszcze aktualnej liczby białek C eksprymowanych przez Streptococcus grupy B. Ostatnie badania immunologiczne prowadzone przez Brady'ego i wsp. charakteryzujące określające typ białka C surowice odpornościowe z C.D.C. zidentyfikowały cztery oddzielne antygeny (Brady, L.J. i wsp. J.Infect. Dis. 758(5):965-972 (1988)). Wstępna genetyczna i immunologiczna charakterystyka domniemanych C białkowych klonów Streptococcus grupy B sugeruje, że cztery lub pięć genów koduje białka, które są obecne w szczepach Streptococcus grupy B, o których wiadomo, że niosą białka C. Przeprowadzono dwie grupy doświadczeń w celu określenia, czy klonowany gen wytwarza reprezentacyjne białka C.

Jak opisano powyżej, badania białek C określiły dwa fenotypy: jedną grupę białek wrażliwych na degradację przez pepsynę, lecz nie trypsynę (nazwane Tr lub a) oraz inną grupę białek wrażliwych na degradację zarówno przez pepsynę jak i przez trypsynę (nazwane TS lub P) (Johnson, D.R. i wsp. J.Clin.Microbiol. 19:506-510 (1984); Russel-Jones, G.J., i wsp. J.Exp.Med. 160:1^416-1484 (1984)).

Zastosowano określające typ surowice odpornościowe, α i β, do osłonienia produktów genowych klonowanych na Western biotach (Bevanger, L. i wsp. Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.B.87:51-54 (1979); Bevanger, L. i wsp. Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.B. 89:205-209 (1981); Bevanger, L. i wsp. Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.B. 97:231-234 (1983); Bevanger, L. i wsp. Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.B. 93:113-119 (1985); Bevanger, L. i wsp. Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.B. 93:121-124 (1985), które podano jako odnośniki literaturowe).

Określające typ surowice odpornościowe a zidentyfikowały Profil Białkowy D, a określające typ surowice odpornościowe β zidentyfikowały Profil Białkowy A. Białka te poddano trawieniu za pomocą pepsyny i trypsyny. Profil Białkowy D jest wrażliwy na pepsynę, lecz nie na trypsynę, natomiast Profil Białkowy A jest wrażliwy zarówno na pepsynę, jak i na trypsynę. Wyniki te są takie same jak z uprzednich badań, i potwierdzają, że przynajmniej dwa z genów białka C zostały sklonowane.

Najważniejszą i najbardziej charakterystyczną właściwością białek C jest ich zdolność do wytwarzania ochronnych przeciwciał przeciwko szczepom Streptococcus grupy B eksprymujących białka C. Można zastosować kilka sposobów w celu uzyskania surowic odpornościowych przeciwko klonowanym produktom genowym. Np., lizaty klonów Streptococcus grupy B mogą być bezpośrednio zaszczepione królikom w celu określenia, czy lizaty te zawierają białka zdolne do wytwarzania przeciwciał E. coli lub przeciwko wprowadzonym białkom Streptococcus grupy B. Powstajwca juco wira edp^omościowc mwae być tez uprżednio zaab sorbowana przaz lizaty £. coli przed testem surowicy odpornościowej na zmniejszenie ilości krzyżowo reagujących

177 302 przeciwciał. Taki lizat może być zastosowany do zmniejszania liczby krzyżowo reagujących przeciwciał zarówno w plamkach kolonii stosowanych do osłaniania kolonii dla ekspresji, jak i w Western biotach stosowanych do badania zarówno ekstraktów komórkowych Streptococcus grupy B, jak i częściowo oczyszczonych białek Streptococcus grupy B.

Reprezentatywne klony z Profilów Białkowych A, B i D poddano działaniu dźwięku, a następnie zaszczepiono królikom w celu wytworzenia surowicy odpornościowej przeciwko białkowym antygenom klonowanej Streptococcus grupy B (Lancefield, R.C. i wsp. J.Exp.Med. 742:165-179 (1975), Valtonen, M.V. i wsp. Microb.Path.. 7:191-204 (1986)). Króliki kontrolne zaszczepiono E. coli, która niesie pUZ12 bez insertu w polilinkerze. Surowice odpornościowe zostały uprzednio zaabsorbowane przez lizat E. coli, i przeszukiwano je Western biotach przeciwko ekstraktom z klonów z biblioteki. Zatem, możliwe jest określenie, czy istnieją wśród klonów reagujące krzyżowo epitopy, oraz potwierdzenie, że te surowice odpornościowe są skierowane przeciwko klonowanym białkom zidentyfikowanym podczas wstępnego etapu osłaniania.

Alternatywnie, uprzednio zaabsorbowane surowice odpornościowe mogą być testowane na mysim modelu ochrony. W tej klasycznej wersji, myszy szczepi się dootrzewnie surowicą odpornościową królika (Lancefield, R.C. i wsp. J.Exp.Med. 742:165-179 (1975)). Następnego dnia szczepi się je ponownie dootrzewnie za pomocą żywej LD90 Streptococcus grupy B, o której wiadomo, że niesie białka C. Punktem końcowym jest śmierć myszy po ponad 48 godzinach.

W celu sprawdzenia immunogenetyczności białek eksprymowanych przez sekwencje klonowanych genów, hodowano komórki Escherichia coli i zawierające pJMS1 i pJMS23, i zastosowano je do przygotowania ekstraktów komórkowych. Ekstrakty te następnie zastosowano do immunizacji królików. Surowicę odpornościową powstałą w odpowiedzi na immunizację za pomocą wyciągów S1 i S23 testowano na mysim modelu ochrony.

Podczas przeprowadzania mysiego testu ochrony, wszystkie surowice odpornościowe powstałe z klonów reprezentujących Profil Białkowy A i D (S1 i S23 odpowiednio) okazały się być ochronnymi. Surowica odpornościowa powstała z klonu reprezentującego Profil Białkowy C nie była ochronną; kontrolne surowice odpornościowe również nie wykazały właściwości ochronnych. Surowice odpornościowe powstałe przeciwko klonom eksprymującym Profil Białkowy C również wytwarzały białka wyekstrahowane ze szczepów Streptococcus grupy B, które nie niosą białka C. Zatem, ta grupa klonów nie koduje białek C. Podsumowując, pięć z sześciu grup klonów nie koduje białek, które są nietypowe dla szczepów Streptococcus grupy B, które eksprymują białka C.

Wstępna biochemiczna, immunologiczna i funkcjonalna analiza dwóch grup klonów wykazuje, że przynajmniej dwa geny białek C (S1 i S23) zostały z powodzeniem sklonowane. Jest to pierwszy wynik, gdzie pojedyncze polipeptydowe produkty genowe klonowane ze Streptococcus grupy B mogą wytwarzać ochronną odporność na infekcje. Odkryto, że przeciwciała dla S1 są zdolne do wiązania dwóch pasm ekstraktów A909: o 50 i o 60 kd. Odkryto, że przeciwciała do S23 są zdolne do wiązania w sposób regularnie powtarzający się pasm w zewnętrznym ekstrakcie Streptococcus grupy B, które osiągnęły w MW od >180 kd do 40 kd. Przeciwciało z pojedynczego klonu pochodzące z wyciągu A909 wykazuje ten sam powtarzający się wzór immunorraktywności. To powoduje, że pojedynczy epitop został rozpoznany w białkach o różnych masach cząsteczkowych, oraz sugeruje regularnie powtarzającą się strukturę. Białka rozpoznane przez surowicę odpornościową S1 były podatne na degradację za pomocą pepsyny o trypsyny, podczas gdy białka rozpoznawane przez surowicę odpornościową S23 były podatne na działanie pepsyny, lecz nie trypsyny. Doświadczenie to pokazuje, że białka te częściowo oczyszczone ze Streptococcus grupy B i eksprymowane przez klonowane geny Streptococcus grupy B reprezentują alfa i beta antygeny C białkowe Streptococcus grupy B.

potencjalnych klonów białek C opisanych powyżej mogą być szacowane zarówno genetycznie, jak i immunologicznie dla określenia liczby obecnych w nich genów. W dodatku, wyizolowanie tych klonów pozwala na identyfikację genów, które nadają ochronną obronność przeciwko infekcjom powodowanym przez Streptococcus grupy B. Jest to podobne do sytuacji, gdzie ochronna surowica odpornościowa stosowana do uzyskania początkowych klonów również rozpoznaje białka inne od białek C. W niniejszym wynalazku rozważono również zastoso177 302 wanie takich innych białek w leczeniu infekcji spowodowanych przez Streptococcus grupy B. Podczas gdy główną myślą tego wynalazku jest wyizolowanie i identyfikacja białek biorących udział w odporności na infekcje, surowice odpornościowe przygotowane przeciwko białkom eksprymowanym przez te kolonie mogą być badane na mysim teście ochrony. Te geny, które eOsprymueą białka ochronne, są białkami preferowanymi dla sprzężonej szczepionki.

Jak napisano powyżej, początkowe osłanianie chromosomowego DNA Streptococcus grupy B w bibliotece wektora E. coli/pUX12 za pomocą ochronnych surowic odpornościowych zastosowano w 35 niezależnie wyizolowanych klonach. Poprzez połączenie danych z mapowania klonowanych fragmentów za pomocą restrykcyjnej endonukleazy, oraz z Western biotów z sondowaniem w białkowym ekstrakcie z klonów, możliwym okazało się próbne sklasyfikowanie 24 z 35 klonów na 6 różnych wzorów białkowego antygenu (tabela 2). Ten przegląd pozwolił na określenie potencjalnej liczby wyizolowanych genów.

W celu dalszego scharakteryzowania takich klonów, plamki kolonii korzystnie użyto do określenia, które klony posiadają podobne sekwencje DNA. Dla uzyskania takich plamek, pojedynczą kolonię każdego z klonów umieszcza się we wgłębieniach płytki do mikramiαreczkowania zawierających bulion LB, i hoduje się ją przez całą noc w temperaturze 37°C. Kontrolne kolonie obejmują szczep gospodarza E. coli oraz szczep E. coli zawierający pUX12. Po całonocnym hodowaniu, kultury przenosi się na nitrocelulozowym filtrze na płytkę agaru zawierającą to samo środowisko kulturowe. Płytki te hoduje się przez ponad 8 godzin w temperaturze 37°C, a nitrocelulozowy filtr zawierający świeżo wyhodowane kolonie przygotowywuea się dla osłaniania hybrydyzacji DNA-DNA. Próbki przygotowywaje się z interesów DNA Streptococcus grupy B w bibliotece pUX12. Do uzyskania plazmidów DNA z klonów stosuje się minipreparatykę. Polilinker w pUX12 posiada obie pozycje BamHI i BstX! na obu stronach insertu; zatem insert Streptococcus grupy B jest usuwany z plazmidu przy użyciu BamHI, lub BstXI. Na szczęście, chromosomowy DNA Streptococcus grupy B zawiera kilka miejsc BamHl, i w wyniku trawienia za pomocą BamHl w jednym fragmencie wiele insertów jest usuwanych z wektora. W celu oddzielenia wektora plazmidu od insertów stosuje się agarozę o niskiej temperetnn/.e tounimia. ieserty te eostaez odcięte od aga^za^»^ /wlu i bezpo średnio oznaczane za pomocą etykiet na drodze przypadkowego wyboru. Następnie oznaczone inserty stosowane są do badania plamek kolonii. Z identyfikacji kolonii wynika, że wspólnie posiadają one sekwencje DNA.

Zatem, na podstawie informacji uzyskanych z wyżej opisanych badań prowadzonych na plamkach kolonii, 35 kolonii umieszczono w grupach, które wspólnie posiadają sekwencje DNA. Grupy te są mapowane za pomocą multiplacyjnych restrykcyjnych enOonpkleαd w celu określenia pokrewieństwa pomiędzy każdym klonem we wnętrzu tego regionu DNA. Ponieważ plazmid gospodarza, pUX12, zawiera wiele nietypowych miejsc enOanuklaad restrykcyjnych, tych które są obecne jedynie w aolilinkerze, wiele z tych restrykcyjnych mapowań może być dokonanych przy wykorzystaniu plazmidowej miniaraparacji DNA, bez potrzeby oddzielnego oczyszczania insertu. Poprzez połączenie danych o plamce kolonii z wyszczególnionym mapowaniem, możliwe jest uzyskanie rozsądnych wyników dotyczących liczby zawartych w nich genetycznych loci. Gdy kilka z tych grup klonów nie reprezentuje odpowiednich genów, może okazać się niezbędnym zastosowanie tych klonów do izolacji innych, bardziej kompletnych kopii tych genów z biblioteki chromosomowej. Jakkolwiek, uzyskanie dużego rozkładu średniego rozmiaru wyizolowanych wyjściowych 35 klonów wskazuje na to, że kilka z nich może reprezentować całkowicie otwartą ramkę odczytu.

Przed przeprowadzeniem analizy genetycznej, surowice odpornościowe korzystnie przygotowywane są przeciwko klonowanym produktem genowym, i wykorzystane w mysim teście ochrony w celu określenia zdolności tych surowic odpornościowych do ochrony przeciwko infekcjom spowodowanym przez Streptococcus grupy B (Lancefield, R.C. i wsp. J.Exp.Med. 742:165-179 (1975), Valtonen, M.V. i wsp. Microb.Path.. 7:191-204 (1986)).

Klon, który eOsprymował białko zdolne do wytwarzania przeciwciał, jest preferowanym kandydatem do zastosowania w sprzężonej szczepionce. Klony, które aksprymawały białko nie wydzielające ochronnych przeciwciał, mogą być dalej analizowane w celu określenia, czy są one również kandydatami do zastosowania w szczepionce. Ponieważ białka C są połączone błoną,

1ΊΊ 302 brak białek eksprymowanych przez klon w celu wytworzenia ochronnych przeciwciał może odzwierciedlać fakt, że białko nie było stabilne w E. coli, i może nie było dużej ilości kopii wektora. Problem ten powstał przy klonowaniu innych błonowych białek, zarówno z grupy A, jak i z grupy B Streptococcus (Kehoe, M. i wsp. lnfect.lmmun. 43:804-810 (1984), Schneewind, O. i wsp. lnfect.lmmun. 55:2174-2179 (1988)). Kilka z 35 wyizolowanych klonów we wstępnych badaniach wykazało niską morfologię kolonii. W dodatku kolonie te są niestabilne, oraz odkryto, że niszczą one część insertu DNA Streptococcus grupy B z polilinkera pUX12. Istnieje kilka technik, które mogą być zastosowane do stabilizacji tych klonów, włączając w to: klonowanie wektorów występujących w małej ilości kopii lub za promotorem, który może być down-regulowany, hodowanie klonów w temperaturze 30°C, zamiast w temperaturze 37°C, oraz klonowanie na wektorze, który został przystosowany do akumulowania białek błonowych. W dodatku, możliwe jest transformowanie plazmidów w gospodarzu E. coli. pcnB, który kontroluje ilość kopii pBR322 plazmidów, takich jak pUX12 (Lopilato, J. i wsp. Mol.Gen.Genet. 205:285-290 (1986), który podano jako odnośnik literaturowy).

Niewydolność klonu w eksprymowaniu białka wytwarzającego przeciwciała ochronne, może również powodować to, że eksprymowane białko nie posiada epitopu, który jest bardzo ważny dla ochrony. To mogłoby zachodzić w przypadku, gdy cały gen nie został sklonowany lub nie został eksprymowany w E. coli. Może to stanowić problem i wówczas, gdy zachodzi po-tanskrypcyjne przetwarzanie białek C w Streptococcus grupy B, lecz nie dla klonowanego białka C powstającego w E. coli. Niezbędnym może okazać się również subklonowanie kompletnego genu na zewnątrz i/lub przeniesienie go do organizmu kolejnego gospodarza, gdzie może być ono eksprymowane.

Niewydolność klonu w eksprymowaniu białka, które wytwarza przeciwciała może również powodować to, że przeciwciała utworzone z antygenów wyprodukowanych w E. coli mogą się różnić od tych, wytworzonych przez zwierzęta za pomocą własnych białek C na Streptococcus grupy B. W dodatku, lizowane ekstrakty bakteryjne stosowane do immunizacji królików zawierają dużą ilość antygenów białkowych E coli. Zatem, dla testów na modelu zwierzęcym, może okazać się niezbędnym uzyskanie surowicy odpornościowej z częściowo oczyszczonych produktów genowych, zamiast z całego organizmu.

Każde klonowane białka Streptococcus grupy B, które są zdolne do wytwarzania ochronnych przeciwciał mogą być nazywane białkami C. Surowice odpornościowe przygotowane dla tej grupy doświadczeń będą również zastosowane do lokalizacji tych białek.

Przykład 8. Mapowanie, charakterystyka i sekwencjonowanie genów białka C

W celu dalszej charakteryzacji genów białka C, można przygotować o precyzyjnej strukturze mapę genetyczną opisanych powyżej klonów genu białka C, oraz określić sekwencję (sekwencje) ich dNa. Mapowanie takie jest korzystnie uzupełnione wykorzystaniem metody hybrydyzacji genomowej Southern blotting. Poprzez określenie sekwencji dNa genów białka C, można określić strukturę genów, łącznie z miejscami wiązań rybosomów, potencjalnymi promotorami, sygnalnymi sekwencjami, i wszystkimi nietypowymi powtarzającymi się sekwencjami. Sekwencje DNA korzystnie porównywane są z biblioteką znanych sekwencji DNA, w celu sprawdzenia, czy istnieje homologia z innymi genami, które zostały już scharakteryzowane. W dodatku, białkowe sekwencje białek C mogą być określone na podstawie sekwencji DNA ich genów. Często na podstawie analizy białkowej sekwencji białka możliwe jest wstępne oszacowanie struktury, funkcji i jego rozmieszczenia w komórce.

Metoda hybrydyzacji genomowej Southern blotting jest zatem korzystnie stosowana do określania, czy któreś z tych genów są połączone w jednej linii. W tej technice chromosomowe DNA Streptococcus grupy B jest trawione indywidualnie za pomocą kilku różnych restrykcyjnych endonukleaz, które identyfikują sekwencje zawierające sześć lub więcej podstawowych par. Celem jest uzyskanie większych segmentów chromosomowego DNA, które mogą nieść więcej niż jeden gen. Poszczególne trawienia za pomocą endonukleaz są zatem przeprowadzane na żelu agarozowym i kontynuowane po przeniesieniu na nitrocelulozę. Następnie Southern bioty są badane za pomocą oznaczonych etykietami insertów pochodzących z wyżej opisanej biblioteki. Gdy dwa klony nie wykazały powinowactwa w stosunku do plamek kolonii, lub podczas mapowania endonukleazą wiążą z podobnymi chromosomowymi wstęgami, to mogłoby

177 302 wskazywać, że albo są one częścią tego samego genu, albo są to dwa geny blisko umiejscowione na jednym chromosomie. W każdym z tych przypadków, istnieje kilka dróg prowadzenia dalej klonowania tych większych segmentów genu dla dalszych badań. Jedną z technik jest przygotowanie kosmidowej biblioteki Streptococcus grupy B i przeszukanie jej dla hybrydyzacji za pomocą jednej spośród wchodzących w grę sondy. Gdy uzyska się klon zawierający dwa lub więcej genów insertów, może on być mapowany endonukleazą i badany w celu dokonania ekspresji ochronnych antygenów, jak to już omówiono dla wcześniej wymienionych klonów.

identyfikacja wyżej wymienionych klonów pozwala na określenie sekwencji ich DNA. Gdy klony znajdują się na plazmidzie pUX12, możliwe jest zastosowanie sekwencjonowania podwójnej nici dNa za pomocą odwrotnej transkryptazy w celu uporządkowania sekwencji od przygotowanych starterów oligonukleotydowych do polilinkera. Technika ta była stosowanajuż wcześniej przy charakteryzowaniu plazmidu pUX12, i jest szybki sposób sekwencjonowania dodatkowych multiplowych oligonukleotydowych starterów w celu sekwencjonowania genu, który jest większy niż 600 podstawowych par. Stąd, sekwencjonowanie DNA dla genów białka C korzystnie jest przeprowadzane poprzez subklonowanie w M13, w układzie sekwencjonowania jednoniciowego DNA (Ausubel, F.M. i wsp. Current Topics in Molecular Biology (1987).

Wyjaśnienie sekwencji DNA białek C umożliwia uzyskanie szczegółowych informacji dotyczących struktury, funkcjonowania oraz regulacji genów i ich produktów białkowych. Jak to opisano powyżej, heterogeniczność w rozmiarach białek C wyizolowanych przez wielu badaczy i ich jawna antygenowa różnorodność sugerują możliwość zarówno istnienia genowej rodziny, jak i posttranskrypcyjnego mechanizmu mody modyfikowania produktów w białkowych genów białka C (Ferrieri, P. i wsp. Infect.Immun. 27: 1023-1032 (1980)). Białko M Streptococcus grupy A omówiono wcześniej jako przykład tego fenomenu (Scott, J.R. i współ. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82: 1822-1826 (1985)). Chociaż sekwencja DNA białka M nie wykazuje homologii z chromosomowym DNA Streptococcus grupy B poprzez hybrydyzację, możliwe jest występowanie strukturalnych homologii pomiędzy ich sekwencjami DNA (Hollingshead, S.K. i wsp. J.Biol.Chem. 267:1677-1686 (1986), Scott, J.R. i wsp. Proc.Natl.Acaid.Sci. USA 82:1822-1826 (1985), Scott, J.R. i wsp. Infect.Immum.. 52:609-612 (1986)). Sekwencje DNA białek C korzystnie są porównywane z biblioteką znanych sekwencji DNA. W dodatku, sekwencje aminokwasów pochodzące od sekwencji DNA są porównywane z biblioteką znanych sekwencji aminokwasów.

Przykład 9. Rozpowszechnienie genów białka C

W celu określenia rozpowszechnienia genów białka C, zbadano chromosomowy DNA z klinicznych i laboratoryjnych szczepów różnych serotypów Streptococcus grupy B metodą hybrydyzacji genomowej Southern blotting za pomocą genów białka C. Dodatkowo dokonano zestawienia fenotypowej ekspresji określonej technikami strąceniowymi za pomocą kompozycji genetycznej uzyskanej na drodze hybrydyzacji DNA-DNA, aby uzyskać informacje dotyczące regulacji ekspresji genów białka C. Sondy genów białka C stosuje się do osłaniania chromosomowego DNA z innych typów Streptococcus oraz z innych typów bakteryjnych patogenów.

Sondy przygotowuje się i oznacza za pomocą etykiet z genów białka C szczepów Streptococcus grupy B, które obejmują większość z oryginalnych określających typ szczepów stosowanych przez Lancefielda (Lancefield, R.C. i wsp. J.Exp.Med. 742:165-179 (1975)). Plamki kolonii 24 klinicznych i laboratoryjnych szczepów Streptococcus grupy B przeszukuje się za pomocą opisanej powyżej techniki mikrooznaczania miana roztworu. Zdolność różnych szczepów do hybrydyzacji do genów białka C jest zatem zestawiana z fenotypowymi charakterystykami tych organizmów w powiązaniu z określającymi typ surowicami odpornościowymi skierowanymi przeciwko białkom C. W ten sposób, możliwe jest określenie, który szczep niesie jakieś lub wszystkie geny białka C, i czy niektóre szczepy niosą ciche lub ukryte kopie tych genów.

Następnie szczepy, które hybrydyzują do sond genu białka C na plamkach kolonii, przeszukuje się metodą hybrydyzacji genomowej Southern blotting dla określenia rozmiaru, struktury i rozmieszczenia ich genów białka C. Chromosomowy DNA wyizolowany ze szczepów Streptococcus grupy B, które wykazują wiązania na plamkach kolonii, trawi się restrykcyjnymi endonukleazami, hoduje na żelu agarozowym i osusza na nitrocelulozie. Southern bloty bada się

177 302 za pomocą sond genów białka C. W ten sposób, możliwe jest określenie, czy istnieją jakieś różnice w rozmieszczeniu i rozmiarze tych genów dla różnych serotypów Streptococcus grupy B, oraz porównanie adinikznych (tj. potenojelme wirulentnech) scczepów ze szczepcmi Οώοratoryjnymi (i z tymi, które kolonizują kliniczne, lecz nie powodują infekcji).

Sondy genu białka C również korzystnie stosuje się do przeszukiwania innych szczepów strephocoócus i różnych bakterii patogenicznych. Wiadomo, że szczepy ehreptoóocóus posiadają wspólnie inne białka połączone z wirulencją, w tym białka M i G (FaCnestock, S.R. i wsp. J. Bact. 167(3):870-880 (1986), Heath, D.G. i wsp. infec.lmmum. 55:1233-1238 (1987), Scott, J.R. i wsp. Infec.Immun. 52:609-612 (1986), Walker, A.J. i wsp. Infec.Immun. 55:1184-1189 (1987), które podano jako odnośniki literaturowe). Szczepy przeznaczone do badania najpierw przeszukuje się za pomocą plamek kolonii dla określenia, czy mają one jakieś homologiczne sekwencje z sondami genów białka C. Następnie przygotowyw^e się gnncmown Southem bloty za pomocą chromosomowego DNA szczepów bakteryjnych, które dają wynik pozytywny w teście na plamkach kolonii. Plamki te następnie bada się za pomocą genów białka C w celu zlokalizowania i określenia obszarów Comolcgióznośói, takich jak region białka C, który służy jako kotwica błonowa, wiąże region Fc immueoglcbiny, lub posiada wspólne regiony Comclogiózdośói z innymi genami o podobnych funkcjach innych bakterii.

Przykład 10. Modyfikacja genów białka C w grupie B Streptococcus

Dużą ilość potencjatych połączonych wii-ulemnych właściwości przypisuje się białkom C, w tym oporność na cpeoeizację i hamowanie wewnątrzkomórkowego tłumienia następujące po fagocytcpie (Payne, N.R. i wsp. J.lnfec.Dis. 151:672-681 (1985), Payne, N.R. i wsp. Infec.Immun,. 55:1243-1251 (1987)). Aby lepiej zrozumieć rolę białek C w wirulencji, konstruuje się ipcgeeióPdn szczepy, w których indywidualnie zmutowano geny białka C. Szczepy te zostaną przebadane na wirulencję za pomocą noworodkowego modelu szczurzego (Zeligs, B.J. i wsp. Infec.Immun.. 37:255-263 (1982)). Można zastosować dwie metody w celu utworzenia izogeeiópeycC szczepów dla oznaczania roli białek C w wirulencji Streptococcus grupy B. Korzystnie, można zastosować traespczonową mutagenezę z samo-sprzęgaleym traespozcnem td916. Alternatywnie, można zastosować kierowaną mutagen^ę. Mała wydajność metod genetycznego manipulowania w Streptococcus grupy B czyli niezbędnym rozwój nowych technik genetycznych przeznaczonych do modyfikowania genów Streptococcus grupy B i tworzenia ίzogeniópnych szczepów dla badań wirulencji (Lopilato. J. i wsp. Mol.Gen.Genet. 205:285-290 (1986), które podano jako odnośniki literaturowej

Traespozceowa mutageeeza iesercyjdajest powszechnie stosowaną techniką do konstruowania ipogneiópeych szczepów, które różnią się w ekspresji antygenów połączonych z wirulencją, a jej zastosowanie w Streptococcus grupy B jest dobrze opisane (Caparon, M.G. i wsp. Proc.Natl.Sci. USA 84:8677-8681 (1987), Rubens, C.E. i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci.. USA 84:7208-7212 (1987), Wagner, A.R. i wsp. Res.Vet.Sci. 38:202-208 (1985), Weiser, J.N. Trans.Assoc.Amer.Phys. 98:384-391 (1985), które podano jako odnośniki literaturowe). Rubens i wsp. zademonstrowali wykorzystanie Tn916 w badaniach otoczki Streptococcus grupy B (Rubens, C.E. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:7208-7212 (1987)). Samcsprzęgatąóy hranspozom TN916 można wytworzyć z Streptococcusfaecalis na Streptococcus grupy B jak to już uprzednio opisano (Wagner, A.R. i wsp. Res.Vet.Sci.38:202-208 (1985), który podano jako odnośnik literaturowy). Szczepy wyselekcjonowano w celu uzyskania markera odpornego na antybiotyki, i przeszukano na plamkach kolonii dla uniknięcia ekspresji białek C, jakie wykryto przy pomocy specyficznej surowicy odpornościowej przygotowanej tak, jak to opisano powyżej. Szczepy, które nie przejawiają nksprymowaeia białek C mogą byc dalej mapowane metodą hybrydyzacji genomowi Southern blottingw celu zlokalizowania insercj wewnątrz genów białka C. Oryginalny szczep Tn916 niesie tetR chociaż marker odporny na ampicilinę został już sklonowany na Tc916 (Rubens, C.E. i wsp. Plasmid 20:137-142 (1988)). Niezbędne jest wskazanie, że po mutageeezie z Tc916, tylko jedna kopia transpozonu jest przenoszona przez zmutowany szczep, i że traespozon jest zlokalizowany wewnątrz genu białka C.

Zastosowanie tych technik do delecji genów białka C w Streptococcus grupy B jest łatwe, o ile geny białka C nie są niezbędne do przetrwania Streptococcus grupy B. Jakkolwiek, szczepy Streptococcus grupy B zostały już opisane jako einwykazujące możliwej do wykrycia obecności

177 302 białka C, i jest to niezwykłe aby determinant wirulencji bakteryjnej był niezbędny do przetrwania in vitro. Dodatkowym zastosowaniem Tn916, które będzie dalej badane, jest identyfikacja potencjalnych elementów regulatoryjnych genów białka C.

W takim przypadku pożądane są specyficznie określone mutacje, albo gdy gen białka C jest niezbędny dla przeżywalności Streptococcus grupy B, mogą być zastosowane techniki mutagenezy kierowanej (np. do wytwarzania uzależnionych mutantów). Zatem mutageneza kierowana może być stosowana do genetycznej analizy białek Streptococcus grupy B. Elektroporacja udowodniła swą przydatność podczas wprowadzania DNA do bakterii, które są w innym przypadku trudne do transformowania (Shigekawa, K. i wsp., Bio Tech.. 6:742-751 (1988), który podano jako odnośnik literaturowy). Warunki do transformowania Streptococcus grupy B przy wykorzystaniu elektroporacji mogą być wykorzystane do przezwyciężenia tych przeszkód. Zatem możliwe jest przeprowadzenie mutagenezy kierowanej w celu pomiaru komplementacji, i w celu wprowadzenia genów białka C do szczepów Streptococcus grupy B, które nie eksprymują białek C. Można wykorzystać dowolny z kilku sposobów do wstawienia natywnych lub mutowanych genów białka C do szczepów Streptococcus grupy B. Np., marker odporności na leki można wstawić do klonów genu białka C w pUX12. Perforowany jest marker odporności na leki, który może być eksprymowany w Streptococcus grupy B, lecz który nie jest w nich normalnie obecny. Ten zmodyfikowany białkowy klon pUX12 transformuje się do Streptococcus grupy B przy użyciu elektroporacji (Shigekawa, K. i wsp. Bio 'Tech.. 6:742-751 (1988), który podano jako odnośnik literaturowy). Ponieważ plazmid pUx12 nie może replikować w Streptococcus grupy B, te szczepy, które nabywają fenotyp odporności na leki, mogłyby podobnie zachowywać się po homologicznej rekombinacji pomiędzy genem białka C na chromozomie GB gospodarza a zmutowanym białkiem C niesionym na plazmidzie pUX12. Mutanty przeszukuje się, jak to opisano powyżej. Gdy nie ma homologicznych sekwencji w szczepie będącym biorcą, możliwe jest konstruowanie wektora za pomocą genu białka C wstawionego wewnątrz znanego streptococcus genu, czyli natywny gen markera odporności na leki ze Streptococcus grupy B. Po elektroporacji, taki konstrukt plazmidowy, integrowałaby wewnątrz chromosomu poprzez homologiczną rekombinację.

Alternatywnie, zmodyfikowane geny białka C możnaby wprowadzić do chromosomu Streptococcus grupy B poprzez wstawienie genów do samosprzęgającego transpozonu Tn916 i wprowadzenie zmodyfikowanych transpozonów na drodze kojarzenie ze Streptococcusfaecalis. Technikę tą z powodzeniem zastosowano do zmodyfikowania Tn916 za pomocą genu erytromyciny i wstawienia tego genu do chromosomu Streptococcus grupy B (Rubens, C.E. i wsp. Plasmid 20:137-142 (1988)). Niezbędnym jest wskazanie, że po mutagenezie z Tn916, tylko jedna kopia transpozonu niesiona jest przez zmutowany szczep, i że transpozon jest zlokalizowany wewnątrz genu białka C.

P,r z y k ł a d 11. Ocena roli białek C w wirulencji Streptococcus grupy B

Poprzednie badania porównywały szczepy Streptococcus grupy B niosące i nie niosące białek C, włączając w to izolaty, o którym nie wiadomo było czy są izogeniczne (Ferrieri, P. i wsp. Rew.Inf.Dis. 10(2): 1004-1071 (1988)). Stąd, nie możliwym było określenie, c^^y zatobserwowane różnice w wirulencji odnoszą się do białek C, czy do innych determinantów wirulencji. Konstrukcja izogenicznych szczepów mających zarówno nie uszkodzone geny białka C jak i delety genu białka C pozwala na dokonanie charakterystyki roli białka C w wirulencji. Korzystnie testuje się wirulencję tych szczepów na noworodkowym modelu szczurzym, a ich właściwości immunogenetyczne na mysim modelu ochrony. Drugim ważnym testem wirulencji jest zdolność genu do odtwarzania wirulencji poprzez rewersję allelowego przemieszczenia w zmutowanym szczepie. Poprzez insercję genów białka C do Streptococcus grupy B, które nie niosą genu, i które niosą zdezaktywowane geny białka C, możliwe jest określenie działania białka C poprzez badanie wirulencji konstrukcji powstałej w wyżej wymienionych modelach zwierzęcych.

Izogeniczne szczepy Streptococcus grupy B, w których geny białka C są indywidualnie mutowane, mogą być tworzone przy zastosowaniu albo transpozonowej mutagenezy, albo mutagenezy kierowanej. Szczepy takie są korzystnie charakteryzowane przy zastosowaniu metody hybrydyzacji genomowej Southern blotting w celu określenia, że tylko pojedynczy insert obecny jest na tym chromosomie. Lokalizacja tych insertów może być stwierdzona po zastoso30

177 302 waniu omówionych powyżej technik genetycznego mapowania struktur subtelnych. Testuje się zatem wirulencję izogenicznych szczepów na noworodkowym modelu szczurzym (Zeligs, B.J. i wsp. Infec.and Immun.37:255-263 (1982)).

Mutageneza transpozonowa pozwala na identyfikację genów biorących udział w regulowaniu ekspresji białek C. Na przykład, szczepy niosące dzikiego typu geny białka C, o których wiadomo, że po transpozomowej mutagenezie nie eksprymują już dłużej białek C, i w których transpozon nie znajduje się wewnątrz strukturalnego genu białka C, noszą mutacje w sekwencjach biorących udział w regulacji ekspresji genów białka C. Takie podejście do zagadnienia pomyślnie zastosowano do charakteryzacji locus mry w Streptococcus grupy A, który bierze udział w regulacji białka M (Caparon, M.G. i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci.. USA 84:8677-8681 (1987), Robbins, J.C. i wsp. J.Bacteriol. 169:5633-5640 (1987), które podano jako odnośniki literaturowe). Metody takie mogą być również stosowane do wytwarzania szczepów, które nadeksprymują białko C, lub które produkują białka C o zmienionej wirulencji lub odporności.

Przykład 12. Lokalizacja białek C na Streptococcus grupy B i ocena ich zdolności do wiązania immunoglobulin

Lancefield i inni wykazali, że przeciwciała białek C wiążą zewnętrzną błonę Streptococcus grupy B (Lancefield, R.C. i wsp. J.Exp.Med. 742:165-179 (1975), Wagner, B. i wsp. J.Gm.Microbiol. 778:95-105 (1980)). Sugeruje to, że białko C jest białkiem zewnętrznej błony. Białko C może również być wyizolowane z supernatantów kultur Streptococcus grupy B, wskazując na to, że białka te mogą być zarówno ukryte przez Streptococcus grupy B, albo w dużej ilości utracone z powierzchni komórki. Sekwencje DNA i białkowe uzyskane z genów białka C oznacza się na drodze określania struktury i funkcji białek C. Jednym potencjalnym determinantem wirulencji opisanym już dla białek C jest zdolność do wiązania immunoglobuliny, IgA (Ferrieri, P. i wsp. Rew. Inf.Dis. 70(2):1004-1071 (1988), Russel-Jones, G.J i wsp. J.Exp.Med. 760:1467-1475 (1984)).

Aby zlokalizować determinanty powierzchni komórkowych, które są wykrywane przez specyficzne przeciwciała, wykorzystano mikroskopię immunoelektronową. Surowice odpornościowe powstałe przeciwko klonom białka C Streptococcus grupy B inkubuje się ze szczepami Streptococcus grupy B, które niosą białka C. Do wykrycia obecności antygenu na powierzchni komórki stosuje się sprzężone z ferrytyną pobudzone przeciwciała IgG skierowane przeciwko antygenom królika, jak to opisano wcześniej (Rubens, C.E. i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:7208-7212 (1987), Wagner, B. i wsp. J.Gen.Microbiol. 778:95-105 (1980)).

Stosując Western bloty można łatwo zapewnić określenie zdolności białek C do wiązania immunoglobuliny. Ekstrakt komórkowy klonów E. coli zawierający geny białka C oraz wyciąg komórkowy szczepów Streptococcus grupy B, które niosą białka C, można hodować na SDSPAGE i osuszyć na nitrocelulozie. Kontrole obejmują ekstrakty E. coli niosących dzikiego typu plazmidy pUX12, szczepów Streptococcus grupy B, które nie niosą genów białka C, oraz izogenicznych szczepów Streptococcus grupy B, w których białka C zostały zdezaktywowane. Western bloty można sondować indywidualnie w oznaczonych etykietami immunoglobulinach, tj., IgG, IgM, IgA, i ich składnikach, tj., we fragmentach Fc lub F(ab)2 (Heath, D.G. i wsp. Infect.andImmun. 55:1233-1238 (1987), Russel-Jones, G.J. i wspól. J.Exp.Med. 760:1467-1475 (1984)). Immunoglobuliny korzystnie joduje się za pomocą albo jodu, albo chloraminy T.

Bardziej specyficzny sposób pomiaru zdolności białek C do wiązania immunoglobulin i ich składników dotyczy oczyszczania białek C i poddanie ich bezpośrednio próbie próbie wiązania (Fahnestock, S.R. i wsp. J. Bact. 767(3):870-880 (1986), Heath, D.G. i wsp. Infec.and Immun. 55:1233-1238 (1987)). Wykorzystując sekwencję białkową można oczyszczać białko

C. W dodatku, ponieważ możliwe jest eksprymowanie genów białka C w E. coli, można konstruować szczepy E. coli, które nadprodukują białka C, i w ten sposób uzyskać większe ilości białek do oczyszczania.

Przykład 13. Zastosowanie klonowanych antygenów białka C Streptococcus grupy B w sprzężonej szczepionce

Testowano potencjał wyżej opisanych ochronnych antygenów białka C Streptococcus grupy B w sprzężonej szczepionce. Aby określić ten potencjał, przygotowano ekstrakty komórkowe E. coli zawierające pJMS1 lub pJMS23 w sposób opisany powyżej, i użyto ich do

177 302 immunizacji królików. Testowano zdolność wytworzonych surowic odpornościowych do ochrony myszy przed infekcją spowodowaną szczepem H36B Streptococcus grupy B, stosując mysi model śmiertelności. Szczep H36B niesie białko C Streptococcus grupy B. Jako kontrol, oznaczono zdolność surowic odpornościowych do ochrony myszy przed infekcją spowodowaną szczepem 515 Streptococcus, który nie niesie białka C. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na fig. 4.

Przykład 14. Sekwencja alfa antygenu białka C i powtarzające się w niej jednostki

Jak ustalono powyżej, Streptococcus agalactine [Streptococcus grupy B (GBS)] jest ważnym patogenem w noworodkowej posocznicy i zapaleniu opon, poporodowym zapaleniu śluzówki macicy oraz przy infekcjach u dorosłych, w szczególności u diabetyków i u dorosłych o obniżonee oddomosci .Bakk^ C.J. i wwp. InnectiousDiseases ofthe Fetus andNewbom Infant, Remington, J.S. i wsp. Sa^de^, Philadelphia, (1990)pp. 742-811)). Najlepiej zbadanymi determinantami wirulencji GBS są polisacharydy otoczkowe specyficznego typu, które są niezbędne dla patogenezy (Rubens, C.E. i wsp. Prtc.Nail.Acad.Sci. USA 84-7208-7212 (1987), Wessels, M.R. i wspól. Prfc.Naial.Acad.Sci. USA 86:8983-8987 (1989)). Role powierzchniowych białek GBS przy infekcji sąmaiee dobrze rozumiane (Ferrieri, P. Rev.IafeC;Dis. S363-S366 (1988), Michel, J.L. i wsp. w Genetics and Molecular Biology of Strepiocfcci, Lacifco)ct:i., and Enterococci, Dunny, G.M. i wsp. wyd. Am. Soc. Micrabial., Washington (1991), pp. 214-218). Białka C są pawielzchniowa-przyłączanymi antygenami eksprymowaaymi przez większość klinicznych szczepów typu otoczkowego. Uważa się, że Ia, Ib, i II odgrywają rolę zarówno w wirulenci, jak i w odporności na infekcje (Johnson, E.R., i wsp. J.Clin.Microbifl. 19-506-510 (1984); Madoff, L.C. i wsp. Iffect.andImmun. 59:2638-2644 (1991)). Dwa antygeny białkowe C, alfa i beta, zostały opisane biochemicznie i immunologicznie (Michel, J.L. i wsp. w Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci,, Dunny, G.M. i wsp. wyd. Am. Soc. Miceabiol., Washington (1991), pp. 214-218).

W 1975 Lancefield i wsp. (Lancefield, R.C. i wsp. J.Exp.Med. 742:165-179 (1975)) przedstawili, że myszy były chronione przez wyhodowane w królikach przeciwciała skierowane przeciwko białkom C, które były prowokowane przez GBS niosącym białka C. Opisane zostało monoklonalne przeciwciało alfa antygenu (4G8), które powoduje apsoninowe zabijanie GBS, i które chroni myszy od śmiertelnej prowokacji przez GBS (Madoff, L.C. i wsp. Inftci.afd.Immsn. 59:204-210 (1991), który podano jako odnośnik literaturowy). Jak pezedstawiaaa powyżej, gen kodujący kodujące antygeny alfa i beta klonowano i eksprymowaao w Escherichia coli.. Wykazano, że przeciwciała hodowane na klonach, zarówno alfa, jak i beta, kodują inne białka C, które mctynowe aehronne anitopy (Micheli UL. t wsp. bifeci.fmtnun. 5&>:2023-2028 (1991)). Antygeny alfa i beta są Lksprymowαne niezależnie, również pod względem aatygLaiczności są one odmienne niż białka.

Klonowano beta antygen C białkowy, który specyficznie wiąże IgA surowicy ludzkiej (Michael, J.L. i wsp. Infect.Immun. 59:2023-2028 (1991); Cleat, P.H. i wsp. Infeci.Immsn. 55:1151-1155 (1987)) oraz go sekwLncjaaawaao ^eden, L.-O. i wsp. Eur. J.Immuffl. 27:14811490 (1991); JLrlsaeam, P.G. i wsp. MoLMicrobiol. 5:843-849 (1991)). Jakkolwiek, nieeesa znana rola beta antygenu i wiązania IgA w wirulencji. Badania prowadzone przez Fermi i wsp. (PayaL,

N.R. i wsp. J.Infect.Dis. 757:672-681 (1985); Payne, N.R. i wsp. Iffect.Immuf. 55:1243-1251 (1987)) wykazały, że szczepy GBS niosące białko C powstrzymują fagocytozę i hamują wewnątrzkomórkowe zabijanie. Opsoaofagocyaalnr zabijanie w obecności maaoklonαlnega przeciwciała (4G8) wyspecyfikowanego przeciwko antygenowi alfa bezpośrednio współzależy że wzrastającą masą cząsteczkową antygenu alfa arrz z ilością antygenu alfa eksprymawαnega na powierzchni komórki bakteryjnej (Madoff, L.C. i wsp. Infect.Immun. 59:2638-2644 (1991)). Szczepy GBS rksprymujące antygen alfa były odporne na zabijanie przez polimaefoauklLarae leukocyty przy braku specyficznego antyciała; chociaż, odporność ta nie była zależna od rozmiaru antygenu alfa.

Przedstawiona w niniejszym raporcie skompletowana sekwencja aukleotyZowa bca i regionów flankujących dostarcza informacji dotyczących rozmiaru, struktury, i kompozycji genu antygenu alfa. Interesującą cechą zarówno natywnych, jak i klonowanych produktów genowych antygenu alfa jest to, że przedstawiają one heaLrograiczaaść białek poprzez ekspeymawαaie

177 302 regularnie powtarzającej się drabinki białek różniących się o około 8000 Da (Madoff, L.C. i wsp. Infect.Immun. 59:2638-2644 (1991); Michel, J.L. i wsp. Infect.Immun. 59:2023-2028 (1991)). Ponieważ, monoklanalne przeciwko ochronne wiąże region powtarzania, region ten definuje ochronny epitop (Madoff, L.C. i wsp. Infect.Immun. 59:2023-2028 (1991)). Mniejsze powtarzane tandemowo sekwencje kodujące ejDitopy immunodominantowe znaleziono w -dużej liczbie patogenów, lecz nie zostały one skojarzone z białkową heteroganicdnaścią obserwowaną w antygenach alfa (Enes, V. i wsp. Science 225:628-630 (1984); Fischetti, V.A. i wsp. Rev.Infect.Dis. 10(Dod.):S356-S359 (1988); Pereira, M.E. i wsp. J.Exp.Med. 174:179-191 (1991); Fischetti, V.A. i wsp. w Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci, Dunny i wsp. wyd. Am.Soc.Micrabiol., Washington(1991), pp. 290-294; Dailey,

D.C. i wsp. Infec.Immun. 59:2083-2088 (1991); vonEichal-Streiber, C. i wsp. Gene 96:107-113 (1990)). Chociaż maksymalny rozmiar cząsteczkowy antygenu alfa różni się wśród szczepów GBS, to ta białkowa haOarogenicznaść jest cechą stałą (Madoff, L.C. i wsp. Infect.Immun. 59:2638-2644^1991)).

Nukleatydawa sekwencja bca obejmuje dziewięć identycznych 246-npnleotydowych jednostek powtarzających się tandemowo. Oszacowany rozmiar białka kodowanego przez każdy z tych powtarzających się elementów wynosi 8665 Da i współzależny od interwałów znalezionych w heterogenicznej drabince antygenu alfa. Sekwencja aminokwasów pochodząca od sekwencji DNA udowodniła zarówno znaczne homologie, jak i ważne różnice pomiędzy antygenem alfa i innymi białkami Straatadaccus (Heden, L.-O. i wsp. Eur.J.Immunol 21: 14811490 (1991): Jerlstrom, P.G. i wsp. Mol.Microb. 5:843-849 (1991); Fischetti, V.A. i wsp. w Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci, Dunny i wsp. wyd. Am.Sac.Microbial., Washingtonem), pp. 290-294). Te powtarzające się jednostki antygenu alfa sugerują możliwość istnienia mechanizmów fenaOynowaj i genotypowej zmienności i dostarczają naturalnych miejsc dla genowych przemieszczeń, które mogłyby generować różnorodność antygenową.

Materiały i metody

Szczepy bakteryjne, plazmidy, Oranspadamy, i pożywki. Szczep A909 GBS (typ 10/©^) (LancafialO, R.C. i wsp. J.Exp.Med. 142:165-π9 (1975)), szczepy E. coli: MC1061 i DK1(Ausubel, F.M. i wsp. Curr.Protoc.Mol.Biol, Wiley, NY (1990)), pCNB (Lopilato, J. i wsp. Mol.Gen.Genet. 205:285-290 (1986)), DH5a (pochodna szczepu DH1; Gibco/BRL) oraz NK8032; plazmidy E. coli i klony pUC12, pUX12 i pJMS23; oraz tranapadan Tn5seq1, zostały uprzednio opisane (Michel, J.L. i wsp. Infect.Immunol. 59:2023-2028 (1991)). Plazmid pGEM7Zf(-) zakupiono w firmie Promega, Madison, WI, USA. Dodatkowe subklony pJMS23 (pJMS23-1, -7, -9 i -10) przedstawiono poniżej. Pożywki dla GBS i E. coli oraz antybiotyki niezbędne do selekcji szczepów zostały uprzednio opisane (Michel, J.L. i wsp. Infect.Immunol. 59: 2023-2028 (1991)).

Procedury analizy DNA i strategia ackwcnceanawania DNA. Do uzyskania plazmidowego DNA, syntezy i oczyszczania oligonu0laaOydów, mapowania restrykcyjnego, elektroforezy agarozowej i hybrydyzacji Sapoharna, stosowano metody przedstawione przez Apspbala i wsp. (Ausubel, F.M. i wsp. Curr.Protoc.Mol.Bio., Wiley, NY (1990)). Enzymy restrykcyjne i inne enzymy wykorzystywane w analizie DNA (np. DNazę, RNazę, ligazę) zakupiono w New England BtoLab.s i Boehringer (Mannheim). W mutagenedia trcnspazonawae wykorzystywano lambda-Tn5seq1 (Nag, D.K. i wsp. Gene 64: 33544- 11988)).

Do se0wancjonawcnia dwutomowego DNA wykorzystywano plazmidy zawierające insercję tranapodonp Tn5seq1 oraz startery, specyficzne do promotorów SP6 i T7 (do sekwencjonowania w dwu 0ierpnkcdh), syntetyczne startery oligonpkleaty0owa oraz stosowano technikę wewnętrznych delecji (systemem Erasa5a5Baae firmy Promega (Promega, Madison WI, USA; HeniOoff, S. Gene 28:351 (1984)). Przygotowano 12 starterów pokrywających (w obu kierunkach) sekwencję, flankującego gen, regionu powtórzeń. Sa0wandjanawania DNA regionu powtórzeń dokonano stosując metodę wewnętrznych Oeladji, z wykorzystcniem egzanpklaαdy IR. Do sekwencjanawania wykorzystano zestaw Sequenαae, wersja 2.0, stosując się do wskazań producenta, dotyczących sa0wendjonawania dwutomowego DNA (zestaw firmy USB). Adeno1ΊΊ 302 zyno 5'-[a-³5S]trifosforan zakupiono w firmie Amersham. Zestaw GenAmp do PCR, wraz z polimerazą AmpliTaq stosowano zgodnie z zaleceniami producenta (Perkin-Elmer/Cetus).

Subklony pJMS23-1, pJMS23-7 i pJMS23-10 przygotowano w celu mutagenezy transpozonowej, wyznaczającej małe regiony w obrębie bca (Michel, J.L. i wsp. lnfect.lmmunol. 59:2023-2028 (1991)). Subklon pJMS23-1 zawiera fragment HindIII długości 5.9 kb, sklonowany w plazmidzie pUX12; pJMS23-7 zawiera fragment Aluł o długości 2.8 kb, z plazmidu pJMS23-1, sklonowany w miejscu HincII, w polilinkerze pUC12; plazmid pJMS23-10 pochodzi z plazmidu pJMS23-7, strawionego restryktazami BsaB1 i Smal, w wyniku którego otrzymano wstawkę o długości 2.3 kb, zawierającą region powtórzeń. Do konstruowania delecji wewnętrznych stosowano fragment Alu1 z pJMS23-1 wprowadzony w miejsce Smal pGEM-7Zf(-), tworząc plazmid pJMS23-9. Delecje wewnętrzne tworzono w kierunku 5'—>3' (w przód), oraz w kierunku przeciwnym, z miejsc EcoRI i Sph1. Wielkość subklonów, mutantów i delecji wykorzystywanych do sekwencjonowania potwierdzono metodą mapowania restrykcyjnego i/lub PCR ze starterami specyficznymi względem polilinkera pUC12 i Tn5seql (SP6 i t&).

Analizę danych przeprowadzano wykorzystując komputer Wydziału Biologii Molekularnej Szpitala Ogólnego w Massachusetts (Boston, USA) z oprogramowaniem Genetics Computer Group (Madison, WI) wersja 7 oraz sieć Natonal Center for Biotechnology Information Narodowego Instytutu Zdrowia (Bethesda, MD).

Przeciwciała monoklonalne elektroforeza w układzie SDS/PAGE, metoda Western immunoblotów. Otrzymywanie ekstraktów białkowych GBS i E. coli, elektroforezę SDS/PAGE, immunobloty i sondowanie przeciwciałami monoklonalnymi 4G8 skierowanymi przeciw antygenowi alfa wykonywano wg. Madoff, L.C. i wsp. lnfect.lmmunol.. 59:2638-2644 (1991;

Madoff, L.C. i wsp. lnfect.lmmunol. 59:204-210 (1991) oraz Michel, J.L. i wsp. lnfect.lmmunol. 59:2023-2028 (1991)).

Wyniki

Sekwencja nukleotydowa bcu. Do określenia sekwencji bcu wykorzystano subklony pJMS23, kodujące miejsce bcu ze szczepu A909 GBS (typ Ia/C) i eksprymujące antygen alfa w komórkach E. coli (Michel, J.L. i wsp. lnfect.lmmunol 59:2023-2028 (1991)). Tak, jak ma to miejsce w przypadku wielu genów bakterii Gram-dodatnich, klonowanych w komórkach

E. coli-0 wiele z tych subklonów było niestabilnych (Schneewind, O. i wsp. lnfect.lmmunol, 56:2174-2179 (1988)). Problem ten był nasilony w przypadku bca, ze względu na duży odcinek powtarzalnego DNA, dostarczający wielu miejsc odpowiednich do rekombinacji homologicznej.

Tego typu homologiczna rekombinacja może być korzystna, jako że w jej rezultacie powstaje populacja zrekombinowanych klonów w komórkach E coli, produkujących wiele funkcjonalnych pochodnych antygenu alfa. Populacja taka byłaby mieszaniną antygenu alfa i jego funkcjonalnych pochodnych i może być wykorzystana do przygotowania szczepionek według wynalazku, dostarczających szerokiego zakresu sekwencji antygenu alfa, powodujących odporność zaszczepionego gospodarza.

W celu sprawdzenia, że plazmid pJMS23 koduje kompletny gen, bez delecji, stosowano hybrydyzację genomową Southerna, sondując DNA pochodzących ze szczepu A909, fragmentem genu z klonu. Nie wykryto różnic w uzyskanej mapie restrykcyjnej bca z A909 i pJMS23. Pełną sekwencję nukleotydową bca uzyskano niezależnie, z obu nici, wykorzystując trzy podejścia: mutagenezę transpozonowązTn5seqł, startery oligonukleotydowe i metodę wewnętrznych delecji (egzonukleazę III) fig. 5).

Pełną sekwencję nukleotydową locus bca i wyprowadzoną sekwencję aminokwasową pojedynczej, długiej ramki odczytu, przedstawiono na fig. 6. Gen strukturalny składa się z 3036 nukleotydów, koduje 1020 aminokwasów, i koduje białko o wyliczonej masie cząsteczkowej 108.705 D. 10 nukleotydów powyżej kodonu inicjatorowego znajduje prokariotyczne, promotorowe miejsce konsensusowe (tAtAAT) (Doi, R.H. i wsp. Microbiol.Rev. 50:227-243 (1986)). Nie ma wyraźnych podobieństw w regionie -35, zakładając rozdzielenie tych sekwencji 5-19 zasadami, w górę od regionu -10 (Howley, D.K. i wsp. NAR 77:2237-2255 (1983)). Przypuszczalne miejsce wiązania rybosomów, flankujące 5' koniec bca, ma sekwencję AGGAGA (Shine, J. i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci. 71:1342-1346(1974); Gold.L. i wsp. Ann.Rev.Microbiol.38:365-403 (1981)). W dół od kodonu terminacyjnego TAA wykryto dwa regiony o sekwencji palindromo34

177 302 wej, mogące pełnić rolę terminatorów transkrypcji (Brendel, V. i wsp. NAR 72:4411-4127 (1984)).

Z wyprowadzonej sekwencji aminokwasowej dojrzałego peptydubca można wnioskować, że pKa tego białka wynosi 4.49, wartość zbliżona do wyznaczonych doświadczalnie wartości, zarówno dla natywnego, jak sklonowanego antygenu alfa białka C. Antygen alfa nie zawiera cysteiny i tylko jedną metioninę w kodonie inicjatorowym. Antygen alfa jest bogaty w prolinę (11 % dojrzałego białka) lecz nie wykazuje obecności motywu XPZ, który to motyw znaleziono w antygenie beta białka C GBS (Heden.L.-O. i wsp. Eur.J.Immunol. 27:1481-1490 (1991); Jerlstrom, P.G. i wsp. Mol.Microbiol. 5:843-849 (1991)) czy też powtarzalnych motywów prolinowych, opisanych w białk M streptokoków grupy (Fischetti, V.A. i wsp. Mol.. Microbiol. 4:1603-1605(1990)).

Wyprowadzona sekwencja sygnalna bca i sekwencje jej podobne. Ponieważ antygen alfajest białkiem związanym z powierzchniąkomórkową, może posiadać sekwencję sygnalną, potrzebną do eksportu z cytoplazmy. Stosując program BLAST zidentyfikowano pięć Gram-dodatnich białek, posiadających podobieństwa sekwencyjne do pierwszych 41 aminokwasów antygenu alfa (fig. 7A). Podobnie jak w przypadku schematu przedstawionego dla innych Gram-dodatnich sekwencji sygnalnych, jest możliwe że pierwszych 41 aminokwasów antygenu alfa obejmuje sekwencję sygnalną (von Heijne, G. Eur. J.Biochem. 133-11-21 (1993); von Heijne, G. i wsp. FEBS Lett. 244:439-446 (1989)). W pobliżu N końca występuje dużo arginin i lizyn, a po nich następuje region hydrofobowy, z seryną w pozycji 36 i waliną w pozycji 41. Inne możliwości przecinania peptydu sygnalnego to: za waliną w pozycji 54 lub za alininą w pozycji 55 i 56, następujących za seryną w pozycji 52. Zakładając, że peptyd sygnalny odcinany jest w miejscu następującym za aminikwasem w pozycji 41, dojrzałe białko obejmuje 979 aminokwasów, i posiada masę cząsteczkową 104:106D. Sugeruje to, że sekwencja sygnalna kodowana jest przez 123 neuklotydy, co czyni 4% całego genu, i posiada masę cząsteczkową 4616 D. Dalsze wskazówki popierające tę sugestię pochodzą z doświadczeń metodą Western blotting, gdzie porównano wielkości naturalnego i sklonowanego antygenu alfa, sondowanego przeciwciałem monoklonalnym 4G8. Jak przedstawiono na fig. 8, każdy z prążków drabinki antygenu alfa z klonu pJM.S23 jest nieco większy niż odpowiadający mu prążek drabinki antygenu ze szczepu A909 GBS, co sugeruje że sekwencja sygnalna nie jest odcinana w komórkach E. coli, w przeciwieństwie do GBS. Różnica wynosi około 4 kD, co może odpowiadać krótszej (41 aminokwasów) raczej niż dłuższej (53-55 aminokwasów) możliwej sekwencji sygnalnej bca.

Analiza N końca bca. Za przypuszczalnym peptydem sygnalnym znajduje się region o długości 185 aminokwasów, położony przed sekwencjami powtarzalnymi. Koniec N obejmuje 555 nukleotydów, stanowiących 18% genu, kodujących polipeptyd o przewidywanej masie cząsteczkowej 20,417 D. Analiza komputerowa z wykorzystaniem programu BLAST i porównanie z sekwencjami zgromadzonymi w GeneBank i Swiss-Prot, pierwszorzędowej sekwencji nukleotydowej i wprowadzonej sekwencji aminokwasowej we wszystkich sześciu ramkach odczytu końca N bca, nie wykazała podobieństw sekwencyjnych, sugerując tym samym, że ten region genu nie jest podobny do wcześniej zsekwencjonowanych lub opisanych sekwencji nukleinowych czy sekwencji aminokwasowych.

Powtarzalna jednostka podstawowa bca. Poczynając od aminokwasów 679 sekwencji DNA, wykryto dziewięć dużych jednostek, powtórzonych tandemowo, posiadających identyczną sekwencję nukleotydową i aminokwasową, obejmujących 74% genu. Wielkość i powtarzalna natura tego regionu bca przedstawiona została na fig. 9. Każda jednostka powtarzalna obejmuje 246 nuukleotydów, kodujących 82 aminokwasy, i posiada wyliczoną masę cząsteczkową 8665 D. Cały region powtórzeń obejmuje 749 aminokwasów i składa się z dziewięciu identycznych powtórzeń i jednego częściowego powtórzenia, oznaczonego 9'. Wyliczona masa cząsteczkowa kodowanego przezeń białka wynosi 79,053 D.

Określenie początku i końca jednostki powtarzalnej jest nieco arbitralne. Tutaj oznaczenie rozpoczyna się od końca N, pierwszym kodonem dla otwartej ramki odczytu. Jeżeli jest to konieczne, jednostka powtarzalna może być zdefiniowana jako rozpoczynająca się poza ramką lub rozpoczynająca się od strony C końca. Przeszukiwanie komputerowe z wykorzystaniem programu bLaST nie wykazało podobieństw sekwencyjnych (ani na poziomie nukleotydowym,

177 302 ani aminokwasowym) dla jednostki powtarzalnej. Tak więc, jednosta powtarzalna wydaje się być charakterystyczna i unikatowa dla antygenu alfa i jest różna, pod względem wielkości i struktury, od sekwencji powtarzalnych opisanych w innych białkach streptokoków (Hoden,

L.-O. i wsp. Eur. J.Immunol. 27: 1481-1490 (1991); Jerlstrom, P.G. i wsp. Mol.Microbiol, 5:834-849 (1991); Fischetti, V.A. w wsp. w: Genetics andMolecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci, wyd. Dunny i wsp. Am.Soc.Microbiol, Washington (1991) str. 290-294; Yother, J. i wsp. J.Bacteriol, 774-601-609 (1992)).

C Końcowa sekwencja kotwicząca bca i sekwencje jej podobne. Za regionem powtórzeń leży krótki C końcowy region, zawierający 148 aminokwasów i stanowiący 4.4% genu. Region ten koduje 45 aminokwasów i posiada wyliczoną masę cząsteczkową 4672 D. Przeszukiwanie komputerowe z wykorzystaniem programu BLAST wykazało podobieństwo sekwencyjne z klasą białek powierzchniowych bakterii Gram-dodatnich, ze wspólnym motywem kotwicy błonowej (fig. 7B). Podobieństwo to odejmuje białka M Streptpococcus grupy A oraz białka wiążące IgG z grupy A i B Streptococcus (Wren, B.W. Mol.Microbiol. 5:797-803 (1991). Skład aminokwasowy C końca jest charakterystyczny dla peptydów kotwic błonowych, z charakterystycznym odcinkiem hydrofilowym oraz z lizyną przed motywem LPXTGE (Sek .Id .Nr. 2) (fig. 7B). (Fischetti, V.A. i wsp. Mol.Microbiol 4:1603-1605 (1990)). Dalej położony jest region hydrofobowy, z sekwencją konsensusową PPFFXXAA (sek., Id.Nr'. 1), gdzie X oznacza dowolny aminokwas hydrofobowy. Ostatecznie, występuje ogon hydrofilowy, zakończony kwasem asparaginowym, skierowanym prawdopodobnie w kierunku cytoplazmy.

Analiza sekwencji nukleotydowej i wyprowadzona sekwencja aminokwasowa antygenu alfa. Figura 9 przedstawia cztery odrębne regiony, wewnątrz otwartej ramki odczytu bca, jak to podano z sekwencji nukleotydowej i wprowadzoną sekwencję aminokwasową. Krzywa hydrofobowości sekwencji aminokwasowej wykazuje, że przepuszczalna sekwencja sygnalna posiada krótki, hydrofilowy N koniec, po nim następuje odcinek hydrofobowy, zakończona jest zaś odcinkiem hydrofilowym, podczas gdy C koniec z kotwicą błonową posiada hydrofobową domenę transmembranową i mały hydrofilowy ogon (Engelmann, D.M. i wsp. Ann.Rev.Bioph.Chem. 75:321-353 (1986); Kyte, J. i wsp. J.Mol.Biol. 157:105-132 (1982)).

Natywny antygen alfa wykazuje polimorfizm wielkości peptydów, różniących się wielkościami, ze stałymi, powtarzalnymi interwałami, co można obserwować również dla sklonowanego produktu genu (fig. 8). Wielkość poszczególnych powtórzeń, wskazuje że mogą one pochodzić z jednostki polipeptydowej o wielkości 8665 D. Rozważono sekwencję nukleodydową bca oraz sekwencję RNHA i wyprowadzoną sekwencję aminokwasową, w celu możliwego zrozumienia molekularnego mechanizmu tworzącego heterogenność białka bca. Analiza sekwencji nukleotydowej bca nie wykazała kondonów w obrębie sekwencji powtarzalnej, mogących służyć za alternatywne sygnały terminacyjne. Ponadto sekwencja aminokwasowa regionu powtarzalnego została sprawdzona z zastosowaniem programu komputerowego Genetics Computer Group, pod względem możliwego występowania potencjalnych miejsc cięcia proteolitycznego. W obrębie każdego powtórzenia znaleziono pojedyncze, unikatowe miejsce, wrażliwe na pH 2.5 (prolina poprzedzona kwasem asparaginowym). Jednak takie miejsca znaleziono również na N końcu. Jakkolwiek antygen alfa jest stosunkowo odporny na trypsynę, istnieje w jego obrębie wiele miejsc przecinających potencjalnie przez trypsynę. Metodami analizy sekwencji RNA i poszukiwania możliwych struktur trzeciorzędowych nie wykazano również istnienia regionów w obrębie odcinków powtarzalnych, mogących służyć za miejsca samoprzecinania się RNA.

Dyskusja

Dwie cechy biologiczne antygenu alfa z GBS to: zdolność do przeciwstawiania się fagocytozie zależnej od opsonin w nieobecności specyficznego przeciwciała i ekspresja epitopów wyzwalających przeciwciała ochronne (Madoff, L.C. i wsp. Infect.Immunol. 59:2638-2644 (1991); Lancefield, R.C. i wsp. J.Exp.Med. 742:165-179 (1975); Payne, N.R. i wsp. J..Infect.Dis. 7^7:672-681 (1985); Payne, R.N. i wsp. Infect.Immunol.. 55:1343-1251 (1987)). Analiza sekwencji antygenu alfa wykazała obecność czterech odrębnych domen strukturalnych. Przypuszczalna N końcowa sekwencja sygnalria i C końcowa błonowa sekwencja kotwicząca sugerują, że antygen alfa jest białkiem związanym z błoną komórkową. Cechy te, wraz z istnieniem

177 302 motywu składającego się z powtórzonych jednostek, występują w wielu białkach bakterii Gram-dodatnich, o których przypuszcza się, że zaangażowane są w patogenezę infekcji bakteryjnej (Fischetti, V.A. i wsp. Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci w: Dunny i wsp. red. Am.Soc.Microbiol., Washington (1991) str. 290-294).

W sekwencji antygenu alfa występuje region dużych, identycznych, tendemowych powtórzeń, obejmujących 74% genu i nie wykazujący podobieństwa do wcześniej opisanych sekwencji białkowych i nukleinowych. Jednakże wiele wcześniej opisanych białek związanych z wirulencją, zawiera powtórzone wielokrotnie elementy. Białko M Streptoccus grupy A, o własnościach antyfagocytarnych, niesie ochronne epitopy i wykazuje zmienność, zarówno w wielkości antygenu, jak i jego prezencji. Zawiera ono dwa wydłużone regiony tandemowo powtórzone i jeden region nietandemowych powtórzeń, zajmujący prawie 2/3 genu (Fischetti, V.A. i wsp. Rev.Infect.Dis. S356-S369 (1988); Hollingshead, S.K. i wsp. J.BiolChem. 261:1677-1687 (1986); Haanes, EJ. i wsp. J.Bacteriol. 777:6397-6408 (1989)). Poszczególne jednostki są mniejsze w przypadku białka M, niż ma to miejsce w przypadku antygenu alfa, mieszcząc się w granicach od 21 do 81 pz (par zasad). Ponadto, istnieje zmienność pomiędzy jednostkami powtórzenia na jego końcach, podczas gdy jednostki wewnętrzne są prawie identyczne. Pneumokokalne białko powierzchniowe A zawiera dwa regiony, obejmujące do 10 powtórzonych segmentów, składających się 20 aminokwasów każde (Yother, J. i wsp. J.Bacteriol. 774:601-609 (1992)). Zarówno białko M, jako pneumokokalne białko powierzchniowe A wykazuje zmienność antygenową i zmienność w wielkości białka/genu - co jest najprawdopodobniej wynikiem istnienia sekwencji powtórzonych w DNA genów je kodujących (Fischetti, V.A, i wsp. Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococii and Enterococci w: Dunny i wsp. red. Am.Soc.Microbiol., Washington (1991) str. 290-294; Yother, J. i wsp. J.Bacteriol.. 774:601-609 (1992);Haanes,E.J. i wsp. J.Bacteriol. 171:631-6408 (1989)). Inne geny bakterii Gram-ciodatnich z motywami powtarzalnymi, obejmują geny glikotransferazy ze Streptococcus sobrinus i S.mutans (Ferretti, J.J. i wsp. J.Bacteriol. 769:4271-4278 (1987); Shiroza, T. i wsp. J.Ba,cterioL 770:810-816 (1988)). Epitopy immunodominant, związane z sekwencjami repetytywnymi, zidentyfikowano u wielu innych patogenów, włączając w to Rickettsia rickettsii, Trichomonas vaginalis i Clostridium difficile (Dailej, D.C. i wsp. Infect.Immunol. 59:2083-2088 (1991); Anderson, B.E. i wsp. Infect.Immunol. 58: 2760-2769 (1990); von Eic^łΊe^l^ί^tt^t^ii^t^r^, C. i wsp. Gene 96:107-113 (1990)). Powtórzenia znalezione w przypadku antygenu alfa są unikatowe z trzech powodów: (i) są większe niż powtórzone znajdowane w innych białkach powierzchniowych bakterii Gram-dodatnich; (ii) są identyczne na poziomie nukleotydowym i nie wykazują zmienności w obrębie genu; (iii) wielkość białka kodowanego przez jednostki powtarzalne odpowiada prążkom, widocznym po elektroforezie zarówno natywnego, jak sklonowanego antygenu alfa.

Znalezienie długich, tandemowo powtarzalnych jednostek przywołuje wiele pytań, dotyczących zmienności genotypowej i fenotypowej antygenu alfa. Poddany elektroforezie i sondowany na immunoblotach za pomocą monoklonalnego przeciwciała 4G8, zarówno natywny, jak sklonowany antygen alfa, wykazuje regularną drabinkę prążków elektroforetycznych, różniących się wielkością ok. 8 kD; antygen alfa ponadto wykazuje zmienność pomiędzy szczepami bakterii, z których jest izolowany (Madoff, L.C. i wsp. Infect.Immunol. 59:2638-2644 (1991)). Mapowanie restrykcyjne oryginalnego klonu pJMS23 antygenu alfa wykazuje wielokrotne fragmenty Styl, o wielkości około 270 pz (Michel, J.L. i wsp. Infect.Immunol 59:2023-2028 (1991)). Ponieważ szczep A909 zawiera jedynie jedną kopię bca, przepuszczać można, że fragmenty te są odpowiedzialne za heterogenność białka. Sekwencjonowanie DNA potwierdziło repetytywną naturę genu, lecz nie pozwoliło ustalić mechanizmu powstawania drabinki białkowej.

Ponieważ białka różniące się masą charakterystyczne są zarówno dla genu natywnego, jak sklonowanego, i ponieważ nie ma danych wskazujących na istnienie rodziny genowej, postulujemy że istnienie drabinki wynika z mechanizmu istniejącego zarówno w komórkach GBS, jak E. coli illuh że eet t wynikiem specyficznych waasnośc i antygenu alfa . Wettem bioty produttu genu zmienionego mutagenezą transpoconową (izsercje Tn5) w obrębie regionu powtarzalnego, wykazują nadal obecność drabinki wielkości, co wskazuje że C koniec nie jest wymagany do powstania tej Ceterogezzości, sugerując, że albo N koniec albo region powtórzeń warunkuje powstawanie drabinki wielkości.

177 302

Badania zmienności antygenu alfa pomiędzy różnymi izolatami GBS, z wykorzystaniem przeciwciała mcnoklcdalnego, wykazały że największa masa cząsteczkowa antygenu alfa jest stała dla danego izolatu, lecz zmienia się w szerokich granicach pomiędzy różnymi izlolatami (Madoff, L.C. i wsp. Infect.Immunol. 59:2638-2644 (1991). Jednostki tandemowo powtórzone mogą dostarczać odpowiednie, stałe miejsca do zachodzenia rekombinacji, prowadzących do dnleóti lub duplikacji tego regionu. Delecje zmniejszałyby wielkość genu i mogłyby zachodzić w czasie replikacji DNA, na zasadzie niewzajemnegc cros-sing over lub ślizgania się polimerazy na nie w pełni sparowanej matrycy (co mogłoby następować z zachowaniem fazy odczytu) (Harayama, S. i wsp. J.Bacteriol. 773:7540-7548 (1991)). Duplikacja DNA mogłaby powodować powielanie mutacji w obrębie powtórzeń, i tak tworzyć zmienność antygenową. Jednakże, nie mamy dowodów, że zmienności wielkości białka antygenu alfa towarzyszy zmienność antygenowa i ekspresja różnych ochronnych lub opsceiecwyóh epitopów.

Dziewięć pełnych tandemowych powtórzeń w antygenie alfa ze szczepu A909 jest identycznych na poziomie eukleotydcwym, co wskazuje na istnienie wysoce konserwowanej ewolucji struktury. Sugeruje to, że duplikacja która doprowadziła do powstania powtórzeń, zaszła niedawno, i że istnieją pewne wewnętrzne cechy powtórzeń, utrzymujące ich spójność, lub też że struktura ta jest istotna dla całości genu. Hybrydyzacja gnecmowa z sondą specyficzną wobec antygenu alfa, przeprowadzona dla szczepów gBs niosących antygen alfa, wykazała zmienność wielkości genu pomiędzy różnymi szczepami. Dla poznania mechanizmów różnorodności genotypowej szczepów, konieczne będzie sklonowanie i określenie sekwencji bca, pochodzących z innych wariantów fndOhypowycC oraz określenie zależności filogenetycznych pomiędzy szczepami GBS, syetezyjącymi białka C (Michel, J.L. i wsp. w: Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci wyd. Dunny i wsp. Am.Soó.Microbicl., Washington (1991) str. 214-218; Michel, J.L. i wsp. Infect.Immunol. 59:2023-2028 (1991); Cleat, P.H. i wsp. Infect. Immunol. 55:1151-1155 (1987); Heden, L.-O. i wsp. Eur. J.Immunol. 27:1481-1490 (1991); LίedCal, G. i wsp. Eur. J.Immunol. 20:2241-2247 (1990)).

Podsumowując: metodą elektroforezy i Western blotting zarówno natywnego, jak sklonowanego produktu genu bca, wykazano istnienie regularnej drabinki prążków nlektroforetyóznych, świadczącej o obecności Cetnrogennych polineptydów. Sekwencja nuk^^dowa locus bca wykazała obecność otwartej ramki odczytu o długości 3060 nukleotydów, kodującej białko prekursorowe o masie 108.705 D. Odcięcie przypuszczalnego peptydu sygnalnego o długości 41 aminokwasów daje dojrzałe białko o masie 104.106 D. N końcowy region antygenu alfa o masie 20.417 D nie wykazuje podobieństwa do uprzednio opisanych sekwencji białkowych; po nim następuje region składający eię z dziewięciu jednostek, powtórzonych tandemowo, tworzących do 74% dojrzałego białka. Każda jednostka powtarzalna jest identyczna, składa się z 82 aminokwasów, posiada masę cząsteczkową 8665 D oraz jest kodowana przez 246 nukleotydów. Wielkość jednostki powtarzalnej odpowiada obserwowanej różnicy wielkości w drabince prążków elaktrofcrntyczdych białka alfa C, eksprymcwaeegc w GBS. Region C końcowy antygenu alfa zawiera motyw błonowej domeny kotwiczącej, wspólny dla wielu białek nowierzcCeiowycC bakterii Gram-dodatnich. Duży region identycznych jednostek powtórzonych w bca określa ochronne epitopy i jego struktura może być zmieniana w celu tworzenia szczepionek ochronnych, skierowanych przeciw fenotypowo i genotypowo zmiennemu antygenowi alfa.

Przykład 15. Szczepionka zawierająca funkcjonalne pochodne antygenu alfa białka C, posiadająca co najmniej jedną z naturalnych jednostek powtarzalnych

Jak przedstawiono powyżej, funkcjonalne pochodne ochronnego antygenu alfa białka C (takie, jak części białkowe N, C, N-C, Ri R2, R3, R4 R5, Ró, R7, Rs, R9, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R6, N-R7, N-Rs, N-R9, Ri-C, R2-C, R3-C, R4-C, R 5-C, Ró-C, R7-C, R₈-C, R9-C, N-Ri-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-Ró-C, N-R7-C, N-Rs-C lub N-R9-C) mogą być przygotowane technikami rekombinacji, podobnymi do metod opisanych powyżej, stosowanych do klonowania i nksnrymcwadia nat^nego antygenu alfa i beta Streptococcus grupy A, w komórkach gospodarza, takiego jak E. coli. Wykorzystywane mogą być dowolne techniki służące do syntezowania pożądanych funkcjonalnych pochodnych sekwencji antygenu alfa, włączając w to przedstawione powyżej zrnkcmbinowane produkty, jak również te, przedsta38

177 302 wionę w: Williams, J.L. i wsp. US 5.089.406 (Method of Producing a Gen Cassette Coding for Polypeptides with Repeating Amino Acids Sequences, włączony tu na zasadzie odnośnika literaturowego) i w: McPherson, M.J. red. Directed Mutagenesis. A Practical Approach. IRL Press, NY, 1991.

Eksprymowane, zrekombinowane ochronne funkcjonalne pochodne antygenu alfa białka C, przedstawione powyżej (takie, jak części białkowe N, C, N-C, Ri, R2, R3, R4, R5, Ró, R7, R8, R9, N-Ri, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-Ró, N-R7, N-R8, N-R9, Ri-C, R2-C, R3-C, R4C, R5-C, Ró-C, R7-C, R8-C, R9-C, N-Ri-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4C, N-R5-C, N-Ró-C, N-R7-C, N-R8-C lub N-R 9-C) mogą być oczyszczone, jeżeli jest to konieczne, od komórek gospodarza lub podłoża z wykorzystaniem dobrze znanych technik, a następnie mogą być testowane pod względem użyteczności w szczepionce sprzężonej. Każdy rodzaj polipeptydu może być testowany osobno lub w połączeniu z innymi polipeptydami. W celu oceny użyteczności polipeptydów, przygotowano ekstrakty komórkowe E. coli, szczepów niosących zrekombinowane plazmidy, przygotowane jak podano powyżej, i stosowano je następnie do szczepienia królików. Powstałe surowice odpornościowe testowano stosuj ąc mysi test śmiertelności, pod względem oceny stopnia ochrony myszy przed infekcją Streptococcus grupy B, szczep H36B. Szczep H36B syntezuje białko C, charakterystyczne dla Streptococcus grupy B. Jako kontrolę stosowano te same surowice, do ochrony myszy przed infekcją szczepem nie syntezującym białka C (Streptococcus grupy B, szczep 515).

Podobny test można stosować w celu oceny użyteczności formy sprzężonej, gdzie peptyd jest sprzężony z polisacharydem Streptococcus grupy B, technikami dobrze znanymi i przedstwionymi powyżej. Korzystnie, polisacharydem jest polisacharyd otoczkowy Streptococcus grupy B. Konjugaty te używano również do szczepienia królików. Powstające surowice odpornościowe testowano w mysim teście śmiertelności, pod względem oceny stopnia ochrony myszy przed infekcją Streptococcus grupy B, szczep H36B. Szczep H36B syntezuje białko C, charakterystyczne dla Streptococcus grupy B. Jako kontrolę stosowano te same surowice, do ochrony myszy przed infekcją szczepem nie syntezującym białka C (Streptococcus grupy B, szczep 515).

1ΊΊ 302

Lista Sekwencji (1) Główne informacje:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Michel , .James L.

Kasper, Dennie Ausubel, Frederck M.

Madeff, Lawrence C.

(u) TYTUŁ WYNALAZKU: Sprzęzons szceepionks przeciw Streptococcus grups B (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 29 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI::

(A)	ADERESAT:	Sterne, Kessler, Goldstein & Fox
(B)	ULICA: 1100 New York Avenue, N.Y.; Suite 600
(C)	MIASTKO:	WasCington
(D)	STAN:	D.C.
(E)	PAŃSIWAO:	USA
(F)	KOD:	2005-3934

(v) MOŻLIWY DO ODCZYTANIA FORMAT KOMPUTERA:

(A) NOŚNIK : Dysk elastyczny (dyskiekaa) (B) KOMPUTER : IBM PC kompatybilny (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Re^ase #1 .0. Wersja #1.25 (vi) AKTUALNE DANE O ZGŁOSZENIU:

(A)	NUMER ZGŁOSZENIA:	PCT (sos^^^ie oznaczony)
(B)	DATA ZGŁOSZENIA :	02-LISTOPADA-1993
(C)	KLASYFIKACJA:

(vii) DANE O PIERWSZEŃSTWIE ΖΈ ZGŁOSZENIA:

(A)	NUMER ZGŁOSZENIA:	US 07/968,866
(B)	DATA ZGŁOSZENIA:	O2-Ł1STOPADA-1992
(C)

(viii) DANE O PEŁNOMOCNIKU/AGENCIE:

(A) NAWYISKO : Cimbala, MicCele A.

(B) NUMER RJJESTRACYJNY; 33,851 (C) NUMRR SPRAWY/RJEESTRU: O6O9.33PCCO1 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A)	TLEEFON :	(202) 371-2600
(B)	TLEEFAX :	(202) 371-254-0
(C)	TEEEX: 248636 SSK

(2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR: 1:

(i)

CECHY CHARAKTERYSYCCZNE SEKWENCJI:

(A)	DUUGOĆĆ :	8 aminokwasów
(B)	TYP:	aminokwas
(C)	TOPOLOGIA:	obie

białko (ii) TYP CZĄSTESCZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI:

SEK. ID NR: 1:

Pro Pro PCe PCe Xaa Xaa Ala Ala 1 5

177 302 (2) INFORMACJA DLA SEK: ID NR: 2:

(i) CCECYCCAAAA.TEEYSSYCCNE SSEWENCCI:

(A)	DŁ.UGOŚĆ:	6 aminokwasów
(B)	TSP:
(C)	TOPOLOGIA:	obie

(ii) TSP CZĄSTESCZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK. ID CA: 2:

Leu Pro Xaa Thr Gly Glu

5 (2) INFORMACJA DLA SEK . ID NR : 3:

(i) CECHY CHARAKKTERYSTTrCZNE SEKWENCJI:

(A)		15 oodstawowych aar
(B)	ΤΎΡ:	kwas nukieotydowy
(C)	NICIOWOŚĆ :	pojedyncza
(D)	TOPOLOGIA :	obie

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEK. ID CR: 3:

GATCCATTGT GCTGG (2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR: 4:

(i) CEECY CEYRAKTENASTΎCEZC SENWENNJI:

(A)		1: podstawowych par
(B)	TSP:	kwas nukieotydowy
(C)	NICIOWOŚĆ:	poiedyńcza
(D)	dPOLU^C^^^:	obe

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEK. ID NR: 4:

GTAACACGAC C (2) INFORMACJA DA SEK: ID NR: 5:

(2) (i) CEE^HY' CCARAKTENASTYCZNE SEEKVENCJI:

	(A) (B) (C) (D)	DŁUGOŚĆ : TYP: NICIOWOŚĆ: OOCOCOGIA:	12 podsaawowych par kwa: t^i^lt^^ot^c^c^o^y poeedy ńcaa obes
(xi)	OPIS SEKWENCJA :	SEK:	ID NR: 5:
ACACGAGATT TC
INFORMACJA DLA SEK. ID NR: 6:
(i)	CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJ (A) DUUGOŚĆ: 57 oodsaowowyc haar (B) TY:: Owas uul^^^ot^i^t^oty (C) NIOIOWOŚĆ: o°jednCcaa (D) OOCOCGGIA: obie
(xi)	OPIS :	: SEK.	ID NR: 6:

ATGACCATGA TTACGAATTC GAGCTHGCHC GGGGATCCAT TGTGCTGGAA AGCCACC

177 302 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR: 7:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ :	16 podstawowych par
(B)	TPP:	kwas nukleotydowy
(C)	NICIOWOŚĆ:	podwójna
(D)	TOPOLOGIA:	obie

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEK. ID NR: 7:

GGATCCATTG TGCTGG (2) INFORMACJA DL A SEK . D NR : 8:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚ: :	:32 podstawowych par
(B)	TYP:	kwa: r^ulr^^o^(^(^vły
(C)	NICIOWOŚĆ:	podwójta
(D)	TOPOLOGIA:	obie

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEK. ID NR: 8:

GGATCCATTG TGCTGGCCAG CACAATGGAT CC (2) ΙΜΟΡιΜΑ^Α DLA SEK . ID NR 9:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJL

(A)	DŁUG OŚĆ :	12 podstawowych par
(B)	ΊΎΡ:	kwasuukiootydowy
(C)	NICIOWOŚĆ :	pojedyncza
(D)	TOPOLOGIA :	obie

(xi) OPIS SEKWENCJL SEK. IDDR:9 :

GGATCCATTG TG (2) INGORMACLADLA EKKi ID RROO:

(i) CECHY SEKWENCJL

(A)	DŁUGOŚĆ :	20 podstawowych par
(B)	TYP:	kwasuukiootyOwwy
(C)	NICIOWOŚĆ :	podwójta
(D)	OOPOLOGAA:	obie

(2) (xi) OPIS SEKWENCJL : SEE. AD NR:1O:

GGATCCATTG TGCTCTAAAG

INFORMACJA DLA SEK. ID NR:11:

(i) CECHY CHALAKSNRYSTYCRNA βΗΚ^/ΕΝΟΙ:

(A)	DŁUGOŚĆ:	1 2 oddstkwkwych tar
(B)	YPP:	kwasnuilootyOkwy
(C)	NICIOWOŚĆ:	pod wójta
(D)	OOGOGOGIĆ:	obie

SEK. ID NR:H:

(xi) OPIS SEKVERNCJ::

CGAATTAATT CG

177 302 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:12:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ :	13 podstawowychpar
(B)	TYP:	kwss nukleotydlowy
(C)	NICIOWOŚĆ :	pojedyiczaa
(D)	TOPOLOGIA:	obie

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEK. IDNR:12:

TCGAGCGGGC CCC (2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:13:

(i) CECHH CCHRAATERRYTYYCNE SEKK^ENNJJ

(A)	ου^ι^οέ:·.	1 5 odSstawowyhh par
(B)	YPP:	kwssnuldootyoowy
(C)	NICIOWOŚĆ:	pod wO jaa
(D)	OOPOLGGIA:	obie

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEK. ID NR:13:

AATTCGCGCC CGGGG (2) INFORMCCRADRAREK.ID AR:14:

(i) CCCHY CHARAKTERYSTYCZNE S^KK^E^NC^^I:

	(A) (B) (C) (D)	DŁUGOŚĆ: TYYP: NICIOWOOĆ : TOPOLOGIA:	1380 podstawowych par kwas nukieotydowy iiniowa
(ix)	CECHY ZNAMIENNE:
	(A)	NAŻW/A/KLUCZ:	CDS
	(B)	POŁOŻENIE:	79.1173
(iX)	CECHY
	(A)	NAWRA/OLUCZ:	mice echae
	(B)	POŁOŻENIU:	1044

(C) INNE INFORMACJE: /uwaga: cecha ta oznacza, ze sekwencja nukleotydowa od pozycji 757 do 1003 jest wstawiona jako pozycja 1004 i może być powtarzana do ośmiu razy (dla całkowitej liczby kopii tej sekwencji wynoszącej dziewięć wewnątrz polinukleotydu) (xi) OPIS SEKWENOJI: SEK. ID NN:^:

AGCATAGATA TTCTAATATT TGTTGTTTAA GCCTATAATT TACTCTGTAT AGAGTTATAC 60

AGAGTAAAGG AGAATATT ATG TTT AGA	AGG TCT AAA AAT AAC	AGT ΤΑΤ σΐΠ Ser Tyr Asp 10	111
	Met 1	hhe	Arg	Arg	Ser 5	Lys	Asn Asn
ACT TCA	CAG ACG AAA CAA	CGG	TTT	TT	ATT	ALG	AAA TTG	LAA LTT GGT	159
Thr Ser	Gin Thh Lys yln	Arg	Phe	Ser	Ile	Lys	Lyy Lhe	Lls hhe Gly
	15			20				25
GCA GCT	TCT GGT LTA TAL	GGT	·AAC	AGT	ATT'	TTG	GGG CGG	LAT AGA CAA	207
Ala Ala	Ser Val Leu eln	Gly	Gly	Ser	ehe	ene	LGs LGy	Val Thr Gln
	30		35				40
GGT AAT	CTrAAA ATT TTL	GAT	(GAG	T£GL	ATA	(CTT	GCCT GCCA	TCT ACA ATT	255
Gly Asn	Leu Ad Lle lhn	Glu	Glu	Sen	eie	eal	Ala AAa	Ser Thr Ile
45		50					55

177 302

CCA GGG AGT G<C GCG ACC ΤΓΑ AAA ACA AGC ATC ACT AAA AAAT ATA CCAA

303

Pro Gly Ser Ala Ala Thr

Leu Asn

TTr

Ser

Ile 70

Tho

Lys Asn Ile

Gln 7S

60

5 5

AAC

GGA

AAT

GCT

TAC

ATA

GAT

TTA

TTA

AGAT

GTA

AAA

TTA

GGT

AAA

ATA

351

Asn

Gly

Asn

Ala

Tyr

Ile

Asp

Leu

Tyy

Asp

lal

Lys

Leu

Gly

Lys

11 e

80

85

90

GAT

CCA

TTA

CAA

TTA

ATT

GTT

TTA

GAA

CAA

GGT

TTT

ACA

GCA

AAG

TAT

309

Asp

Pro

Leu

Gln

Leu

Ile

lal

Leu

Glu

Gln

Gly

Phe

Tho

Ala

Lys

Tyo

95

100

110

GTT

TTT

AGA

CAA

GGT

ACT

AAA

TAC

TAT

HG

GAT

GTT

TCT

CAG

TTG

CAG

447

lal

Phe

Arg

Gln

Gly

Thr

Lys

Tyr

Tyr

Gly

Asp

lal

Ser

Gln

Leu

Gln

110

115

120

AGT

ACA

GGA

AGG

GCT

AGT

CTT

ACC

TAT

AAT

ATA

TTT

GGT

GAA

GAT

GGA

495

Ser

Thr

Gly

Arg

Ala

Ser

Leu

Tho

Tyr

Asn

Ile

Phe

Gly

Glu

Asp

Gly

125

130

135

CTA

CCA

CAT

GTA

AAG

ACT

GAT

GGA

CAA

ATT

GAT

ATA

GTT

AGT

GTT

GCT

5543

Leu

Pro

His

lal

Lys

Thr

Asp

Gly

Gln

Ile

Asp

Ile

lal

Ser

lal

Ala

140

145

150

155

TTA

ACT

ATT

TAT

GAT

TCA

ACA

ACC

TTG

AGG

GAT

AAG

ATT

GAA

GAA

GTT

591

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asp

Ser

Thr

Tho

Leu

Arg

Asp

Lys

Ile

Glu

Glu

lal

160

115

177

AGA

ACG

AAT

GCA

AAC

GAT

CCT

AAG

TGG

ACG

GAA

GAA

AGT

CGT

ACT

GAG

(339

Arg

Thr

Asn

Ala

Asn

Asp

Pro

Lys

Top

Tho

Glu

Glu

Ser

Arg

Thr

Glu

175

118

185

GTT

TTA

ACA

GGA

TTA

GAT

ACA

ATT

AAG

ACA

GAT

ATT

GAT

AAT

AAT

CCT

687

lal

Leu

Thr

Gly

Leu

Asp

Thr

Ile

Lys

Tho

Asp

Ile

Asp

Asn

Asn

Pro

190

110

220

AAG

ACG

CAA

ACA

GAT

ATT

GAT

AGT

AAA

ATT

GTT

GAG

GTT

AAT

GAA

TTA

755

Lys

Thr

Gln

Thr

Asp

Ile

Asp

Ser

Lys

Ile

lal

Glu

lal

Asn

Glu

Leu

205

221

221

GAG

AAA

TTG

TTA

GTA

TTG

TCA

GTA

CCG

GAT

AAA

GAT

AAA

TAT

GAT

CCA

083

Glu

Lys

Leu

Leu

lal

Leu

Ser

lal

Pro

Asp

Lys

Asp

Lys

Tyo

Asp

Pro

220

225

23 0

23 3

ACA

GGA

GGG

GAA

ACA

ACA

GTA

CCC

CAA

HG

ACA

CCA

GTT

TCA

GAT

AAA

811

Tnr

Gly

Gly

Glu

Thr

Thr

lal

Pro

Gln

Gly

Thr

Pro

lal

Ser

Asp

Lys

240

244

225

GAA

ATC

ACA

GAC

TTA

GTT

AAG

ATT

CCA

GAT

GGC

TCA

AAA

GGG

GTT

CCG

799

Glu

Ile

Thr

Asp

Leu

lal

Lys

Ile

Pro

Asp

Gly

Ser

Lys

Gly

lal

Pro

255

220

265

ACA

GTT

GTT

GGT

GAT

CGT

CCA

GAT

ACT

AAC

GTT

CCT

GGA

GAT

CAT

AAA

277

Thr

lal

lal

Gly

Asp

Arg

Pro

Asp

Tho

Asn

lal

Pro

Gly

Asp

His

Lys

270

27S

220

GTA

ACG

GTA

GAA

GTA

ACG

TAT

CCA

GAT

GGA

ACA

AAG

GAT

ACA

GTA

GAA

755

lal

Thr

lal

Glu

lal

Thr

Tyr

Pro

Asp

Gly

Thr

Lys

Asp

Thr

lal

Glu

285

290

225

GTA

ACG

GUT

gtg

ACA

CCC

AAA

CCCA

GTA

CCG

<avr

AAAA

dAT

AAA

TAT

l·509

lal

Thr

Val

His

Vv1

Thr

Pro

Lls

Pro

Val

Pro

Asp

Lys

Asp

Lys

Tyr

300

35 5

310

3 3 5

GAT

CCA

ACA

GGT

AAA

GCT

CAG

CCA

GTC

AAC

GGT

AAA

GGA

AAT

AAA

CTA

1071

Asp

Pro

Thr

Gly

Lys

Ala

Gln

Gil

Val

Asn

Gly

Lys

Gly

Asn

Lys

Leu

320 325 330

177 302

CCA GCA AOl Pro Ala Thr

GGT GZLy 335

GAG AAT GCA

AAT CCA TTC

TIT AAT

GTT Val

GCA Ala 345

GCT Ala

TTG Leu

Glu

Asn

Ala

Thr

Pro 340

Phe

Phe

Asn

ACA

ATT

ATA

TA

TCA

GTT

GGT

ΤΓΑ

TTA

TCT

GTT

TCT

AAG

JAAl

AAA

GAG

1167

Thr

Ile

Ile

Ser

Ser

Val

Gly

Leu

Leu

Ser

Val

Ser

Lys

Lys

Lys

Glu

350

355

360

GAT TAATCTTTTG ACCTAAAATG TCACTAAATT TTTCACCATT TATTGGTGTG 1220

Asp

365 AACACATTAA	TAAAGTTATG	cATCTcrcrc	CAACAAAATT TTTCAATTTT	12 00
TCGAGATTAA	TTCTTGAAAA	TAUGCCTATCG	AGATTAmA	TTTCGATAGG	CTTTTGATIT	1340
TGTGTAAGCG	TCCAATATAC	CTTGTTATTG	GATGCTTΆCT·			1300

(2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:15:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DŁUGOŚĆ: TYP: TOPOLOGIA :	364 aminokwasów aminokwas iiniowa
(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	białko
(ix)	CECHY ZNAMIENNE:
	(A)	t^/^iW^./^/iLU^CZ:	mieccecha
	(B)	POŁOŻENIE:	310_

(C) INNE INFORMACJE: /uwaga: cecha ta wskazuje, że sekwencja eminokwasowa od pozycji 227 do 303 jest wstawiona jako pozycja 310 i może się powtarzać do ośmiu razy (dla całkowitej liczby kopii tej sekwencji wynoszącej dziewięć wewnątrz polipeptydu)

(xi)

OPIS ŻEKWENCJ: .

SEK . ID NR!::

Met

Phe

Arg

Arg

Ser

Lys

Asn

Asn

Ser

TTy

Asp

Thr

Ser

Gln

Thr

Lyy

1

5

10

15

Gln

Arg

Phe

Ssr

Ile

Lys

Lyy

Phe

LyT

Pt^e

Gly

Ala

Ala

Ser

Val

Lie

20

125

30

Ile

Gly

Leu

Ser

Phe

Leu

Gly

Gly

Val

Thr

Gln

Gly

Asn

Liu

Asn

Ile

35

40

45

Phe

Glu

Glu

Ser

Ile

Val

Ala

Ala

Ser

Thr

Ile

Pro

Gly

Ser

Ala

Aya

50

55

60

Thr

Leu

Asn

Thr

Ser

Ile

Thr

Lys

Asn

Ile

Gln

Asn

Gly

Asn

Ala

IYr

6 5

70

75

80

Ile

Asp

Leu

Tyr

Asp

LpI

Uys

L eu

Gly Lyi

yi e

Asp

Pro

Leu

oln

Leu

85

90

90

Ile

Val

Leu

du

Gln

Gly

Phe

Thr

Ala

Ly^y

Tyr

Vyl

hei

Arg

Gln

dy

100

105

110

Thr

Lls

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Val

Ser

Gln

Leu

Gln

Ser

Thr

dy

Arg

Aya

115

120

125

Ser

Leu

Thr

Tyr

Asn

Ile

Phe

Gly

ilu

Asp

Gly

Leu

Pro

His

Val

Lyn

130

135

110

Thr

Asp

Gly

Gln

Ile

Asp

Ile

Val

Ser

Val

Ala

Leu

Thr

IIu

Tyr

Aa;?

145

150

115

116

Ser

Thr

Thr

Leu

Arg

Asp

Lys

Ile

Glu

Glu

Val

Arg

Thr

Asn

Ala

Asn

165

117

117

177 302

Asp Pro Lys Tir? Thr Glu Glu Ser Arg Thr Glu Val Leu Thh Gly Lee

180

185

119

Asp

hhr

Ile

Lys

Thr

Asp

11 e

Asp

Asn .

Asn

Pro

Lys

Thr

dn

Ahv .

Ais

195

200

205

Ile

Asp

Ssu

Lys

Ile

Val

Glu

Val

Asn

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Liu

VvS

210

215

220

Leu

Ser

Val

Pro

Asp

Lys

Asp

eys

hyo

Asp

Poo

hhr

Gly

Gly

Glu

Thr

225

23l

235

240

hhr

Val

Pro

Gin

Gly

Thr

Pro

Val

Ser

Asp

eys

Glu

Ile

Thr

Asp

Leu

245

250

255

Val

eys

111

Pro

Asp

Gly

Ser

eys

Gly

Val

Pro

hhr

Val

vai

Gly

Ais

2 S 0

225

220

Arg

Prr

Asp

hhr

Asn

Val

Pito

Gly

Asp

His

Lys

Vll

Thr

Val

GGu

Val

275

288

228

hhr

Thr

Pro

Asp

Gly

TPA

Lys

Asp

Thr

Val

siu

Val

Thr

Vo l

His

Tal

290

295

300

Thr

Pro

Lys

Pro

Val

0oi

Asp

Lys

Aoo

Lyi

pyr

Asp

Pro

spi

Gly

Lys

305

310

315

330

Ala

dn

Gin

Val

Asn

d.

Lys

Gly

Asy

Lye

siu

Pro

Ala

sei

dy

Alu

325

330

335

Asn

All

Thr

Pro

Phi

Phe

Asn

Val

Ala

Ala

Leu

Thr

11i

11 e

Ssr

isr

340

345

350

Val

Gly

Aeu

Leu

Ser

Val

Ser

eys

eys

Lys

Glu

Asp

355

360

(2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:16:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DŁUGOŚĆ: POP: TOPOLOGIA:	56 aminokwasów aminokwas obie
(ii)	TYP CZĄTTECZKI :	: białko
(xi)	OPI SEEKWECCJ I:	SEK.	10 NR:16:

Met

Phe

Arg

Arg

Ser

Uol

Am Asn

Ser

Tyr

Oip

Tino

Ser

d a

Thh

Lys

1

5

10

15

Gln

Arg

Phe

Ser

IUl

eys

Ley Phe

Lys

Phe

Gly

Ala

Ala

Ser

Vai

Leu

20

25

33 0

Ile

Gly

Leu

Ser

Phe

hei

Gly Gly

Gly

ThV

lin

Gly

Asn

lei

Asn

I le

35

40

45

Phe Glu Glu Ser Ile Val Ala Ala 50 55

1ΊΊ 302 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:13:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DŁUGOŚĆ: TYP: TOPOLOGIA:	33 aminokwasów aminokwe8 ob'ie
(ii)	TPP CZĄSTECZKI: :	; białkb
(xi)	opis :	EEK. ID NR:13:

Met Phe Lys Ser Asn Tyr Glu Arg Lys Met Arg Tyr 15 10

Phe Ser Val Gly Val Ala Ser Vil Ala Val Arg Ser 20 25

Ser Val Ala His Ala 35

Ser Ile Arg lys
	15
Leu	Pilił Met da 30

(2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:18:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DŁUGOŚĆ: TY^^: TOPOLOGIA:	41 aminokwasów aminokwss obte
(li)	TPP CZĄSTCCKKI :	: białko
(xi)	OPISSEKVEESCJl :	SE^K. ID 1^R:18:

Met	Ala	Arg	Gln	Gln	Thr	Lys	Lys	ss r	yrs ril	uru
1				5					1 0
Thr	Gly	TTA	A Aa	Ser	Vrl	Ala	Val	Ala	Leu Thr	Va1
			20					125
Phe	Ala	Aas	Gin	Thr	Gru	Va3.	Arg	VVi
		35					40

Arg Lys Leu Lys 15 ^rye ^rl^h Ha lly 30 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:19:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DŁUGOŚĆ: TYP: TOPOLOGIA:	42 aminokwasów aminokwas οόϊβ
(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	; biaikk
(Xi)	OPIS SZKWENCJl :	SED. Ώ N/):19:

Met

Thr

Lys

Ias

rsn

snr

Asn

Arg

Asn

TyA

Sr r

Lhu

rrg

Lr

Leu

Lys

1

5

10

15

Thr

Gly

TTr

IAi

rer

Srr

Ala

Val

Ala

Leu

arr

Va1

Leu

SAr

Ala

Gly

20

25

30

Leu Val VvV lsn lhr hrr Glu Vrl Glu Ala 35 40

177 302 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:20:

(i) CECYS CYARAKTERSSISCZNE SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DLUGOOŚ: TSP: TOPOLOGIA:	41 aminokwasów ^minoko^^s obie
(u)	TYP CZĄSTCCZK::	białko
(xi)	OPIS NKKWNNCJI;	SEK: ID NR:20:

Met

Ala

Lys

Asn

Asn

snA

Ash

Arg

Hśs

Tyr

S ir

Leu

Arg

yai

Lee

Leu

1

5

10

15

Thr

Gly

Thr

Ala

ler

Val

Ala

lal

Ala

Lei

lir

Val

Leu

VUa

Ash

ii1

20

25

30

Phe

Ala

Asn

Gln

Thr

Glu

Val

Lys

Ala

35

40

(2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:21:

(i) CECYS CYAAAKTNASSTYHZNN SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DLUGOOŚ: TSP: TOPOLOGIA:	50 aminokwasów aminokwas obie
(ii)	TSP CZĄSTECZKI :	baalko
(xi)	OPIS SEKWENCJE	SEK:	I NFE21:

Met 1

Ala

Lys

Asn Asn Tha Am AAa His Tya Sea Leu Arg Lys Leu

Lys

5

10

15

Tha

Gly

Thr

Ha

Aer

Vi1

Ala

lal

Ala

Lei

lir Val

Leu

Gily

Aha

Ha

20

25

350

Phe

Ala

Asn

Ala

Ahr

hll

Val

Lys

Vla

Asn

sly ίΤρ

Gly

As a

Pro

Arg

35

40

45

Glu Val (2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:22:

(i) CECYS CYAAAKTNASSTSCZNN SEKWENCJE

	(A) (B) (D)	DLUGOOŚ: 1ΎΡ: topologia:	45 aminokwasów aminokwas ootim
(ii)	TSP CZĄSTECZKĘ	: białko
(xi)	OPIS sekwencj: :	SEK : I NR:Z2:

Lys Ala Gln Gln 1

Val Asn Gly Lys Gly Asn Lys

Leu

Pio

Ala

Thr dy 15

5

00

Glu

Asn

Ala

Tha

Pio

Phe

Phe

Asn

Val

Ala

Ala

Leu

Tha

Ile

Ile

Sa^r

20

25

30

Sea

Val

Gly

Leu

Leu

Sea

Val

Sea

Lys

Lys

Lys

Glu

Asg

35

40

45

177 302 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:23:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DŁUGOŚĆ τοκηο^: :	4-6 tminokwtaów aminokkas obie
(ii)	TYP cząsteczk::	białko
(xi)	opis sekwencji: :	SEK . ID NR:23:

Asn Lys Ala 1

Pro

Met 5

Lys Glu TTh Ala Arg Gln Leu Pro Ty!· Thr G!y

10

15

lal

Thr

Ala

Asn

Pro

Phe

Phe

Tłur

Ala

Ala

Ala

Leu

Thr

V®1

Met

Ala

20

25

330

Thr

Ala

Gly

iai

Ui a

Ala

Val

lal

Lys

Arg

Lys

GG.u

Glu

Asn

35

410

45

(2) INFORMACJA DLA SEK. ID (i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ 45 tmlnokwtaów (B) TYTP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: obie (ii) TY: CZĄSSCCEKI : Oiatko (xi) OPSS SEKWRCCJ I: SEK: ID NR:24:

aiu 1

Pro Ser

Gln Asn Lys 5

Gly

Mec

Arg

Ser Gln 10

Leu

Pro Sep

Thr Gly 15

Glu

Ala

Ala

Asn

Pro

Phe

Phe

Thr

Ala

Ali

Ala

Ala

Thr

Vu1

Mut

Val

20

25

00

Ser

ASu

Gly

MU

Leu

AUs

Alu

Lys

Ass

rgA

slu

Glu

Asn

35

4:

45

(2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:25:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DŁUGOŚĆ TYP: TOPOLOGIA:	46 tmlnokwtaów aminokwas obie
(ii)	TYP CZĄSTECZKA	biatko
(xi)	OPIS SEKWENCJU :	SRRι 2D NR:25:

Ala Lys Lys Glu Asp Ala Lys Lys Ala Glu Thr Leu Pro Thr Thr Gly

10 15

Glu Gly Ser Asn Pro rOp ehe Thr Tir Ala Ala Leu Ala ea1 Mec Ala 20 2: 300

Gly Ala Gly ASu leu AUa ailAla Aua Lys Arg Lys Alu Asp

40 45

1ΊΊ 302 (2) INFORMACJA DLA EEK. ID NR:26:

(i) CECHY SHARAKTEDYESYSCNE SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DŁUGOŚĆ: TYP: TOPOLOGIA:	46 aminokwasów abiro>kwes bUe
(ii)	TYP CZĄSTCCZ^ :	bidko
(xi)	OPISTZKWEC<CJl:	SeR: ID NR:26:

Ala Lys Lys Anp Asp Ala Lys Lys Ala Glu Tler Leu Pro Thr Thr Gly 15 10 15

Glu Gly Ser Asn Pro Phe Phe Thr Ala Ala Ala Leu Ala Val Met Ala

25 30

Gly Ala Gly Ala Ltu Ala Val Ala Str Lys Arg Lys Glu Asp

40 45 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:23:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DŁUGOŚĆ: TYP: TOPOLOGIA:	45 aminokwasów aminokwas obie
(ii)	TYP CZĄSTECZKt :	biłkoo
(Xi)	OPIS sekwencje: :	HK.	N) NR:37:

Str Arg Ser Ala Mer Thr Gln Gln Lys Arg Thr Leu Pro Ser Tir Gly 15 10 15

Glu Thr Ala Asn —or Phe Phe Thr Ala Ala Ala Ala Thr Vv1 M^t. Val

25 30

See A1v Gly Met Lsa Ala Leu Lys Arg Lys Glu Glu Asn

40 45 (2) INFORMACJA DLA EEK. ID ND:28:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

	(A) (B) (D)	DŁUGOŚĆ: T^P: TOPOLOGIA:	34 aminokwasów imbinokwes obie
(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: bidko
(Xi)	OPIS SEKWENCJH:	SZR: O NR:28:

Asn

Lys

Ala

Pro

Met

—or

GMe

rhr Lys

Arg

dy

Aeu

Pro

Is r

TLe

Gly

1

5

10

15

gia

Thr

Ala

AAn

Pro

PSi

PPe

rhr Aha

Al i

—Aa

reu

Thr

la i

MLt

Ala

20

25

30

Ala Ala

177 302 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID NR:29:

(i) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ:	4-4 aminokwasów
(B)	TYPP:	aminokwas
(D)	TOPOLOdA:	obie

(ii) TYP CZĄSTECZKI : białko (xi) OPIS SEKWEN<JJI : S£ż^. :D NN:22:

Lys

GGy

Asn

hro

Thr

Ser

Thr

Thr

Glu

Lys

Lys

Leu

hro

ryr

Thr Gly

1

S

10

15

aal

Ala

Ser

Asn

Leu

Val

Leu

Glu

Ile

Met

Gly

Leu

Leu

GTy

Leu Ile

20

25

30

Gly

Thr

Ser

hhe

Ile

Ala

Met

Lys

Arg

Arg

Lys

Ser

35

40

177 302

G GATCC <CCTAG G^ pUC12

PLAZMID pUC

PRZECIĘTY ENZYMEM BamHl

MIEJSCE BamHl MIEJSCE BstXl

GATCCATTGTGCTGG 15 mer Π, GTAACACGACC 11 mer

ADAPTORY OLIGONUKLEOTYDOWE

UGACJA

BamHl BstXI

GGATCCATTGTGCTGG <CCTAGGTAACACGACC

BamHI BstXI

CCAGCACAATGGATCC GGTCGTGTTACCTAGGΛ

Ili

I KINAZOWANIE I LIBACJA

BstXI I BstXI

GGATCCATTGTGCTGGCCAGCACAATGGATCC_ ' CCTAGGTAACACGACCGGTCGTGTTACCTAGG

IV.

V.

VII.

GGATCCATTGTG CCTAGGTA

TĘPE KOŃCE ZAPOBIEGAJĄCE PONOWNEMU ZAMKNIĘCIU SIĘ PLAZMIDU

VI.

BamHI

BstXI

PRZECIĘCIE ENZYMEM BstXI

ATGGATCC GTGTTACCTAGG'

WSTAWKA dCM Z LINKERAMI

CTCTAAAG

ACACGAGATTTC

CTTTAGAGCACA

GAAATCTC

BstXI BamHl

GGATCCATTGTGCTCTAAAG CTTTAGAGCACAATGGATCC rCCTAGGTAACACGAGATrTC^lGAAATCTCGTGnACCTAGG^ pUX12

FIG. 1

177 302

ACG AATTCG TGCTTAA GC

TRAWIENIE EcoRI

UZUPEŁNIENIE KOŃCÓW I LIGACJA

CGAATTAATTCG

GCTTAATTAAGC

UTWORZENIE MIEJSCA Xmnl USUNIĘCIE MIEJSCA EcoRI

AATTCGAGCT CGCCCGGGG TTAAGC TCGAGCGGGCCCC

AATTCGCGCCCGGGG

TTAAGCGCGGGCCCC

TRAWIENIE Sacl

USUNIĘCIE LEPKICH KOŃCÓW I LIGACJA

UTWORZENIE MIEJSCA FnuO2 USUNIĘCIE MIEJSCA Sacl

AATTCGAGCT CGCCCGGGG __ AATTC

TTAAGC TCGAGCGGGCCCC TTAAG

USUNIĘCIE

TRAWIENIE Sacll LEPKICH KOŃCÓW

GGGG__ AATTCGGGG CCCC TTAAGCCCC

LIGACJA USUNIĘCIE 10 NUKLEOTYDÓW

USUNIĘCIE MIEJSC SacL, Xmal i Smal

FIG. 3

177 302

OCHRONA 48 GODZIN

FIG. 4

O KONTROLAdkl EJ ANTYS23 U ANTY SI

-o <i- <1<- -1> , , <-<=<i- I-1 <- -r>

<ZZZL 500bp <j—-: ©>

FIG. 5

1ΊΊ 302

AGCATAGATA TTCTAATATT TGTTGTTTAA GCCTATAATT TACTCTGTAT AGAGTTATAC 60 RBF PEPTYD SYGNAŁOWY

AGAGTAAAGG

AGAATATT

ATG

TTT

AGA

AGG

TCT

AAA

AAT

AAC

AGT

TAT

GAT

111

Met

Phe

Arg

Arg

Se r

Lys

Asn

Asn

Ser

Tyr

As p

1

5

10

ACT

TCA

CAG

ACG

AAA

CAA

CGG

TTT

TCA

ATT

AAG

AAG

TTC

AAG

TTT

GGT

159

Thr

Se r

Gln

Thr

Lys

Gln

Arg

Phe

Ser

Ile

Lys

Lys

Phe

Lys

Phe

G1 y

20 25

BIAŁKO

GCA GCT TCT GTA CTA ATT GGT

CTT AGT TTT TTG GGT GGG GTT

ACA CAA Thr Gln

207

Ala Ala Ser VaI

Leu

Ile

Gly

Leu

Se r

Phe

Leu

Gly

Gly

Val

30

35

40

DOJRZAŁE

GGT

AAT

CTT

AAT

ATT

TTT

GAA

GAG

TCA

ATA

GTT

GCT

GCA

TCT

ACA

ATT

255

Gly

Asn

Leu

Asn

Ile

Phe

Glu

Glu

Sar

Ile

Va I

Ala

Ala

Se r

Thr

Ile

45

50

55

CCA

GGG

AGT

GCA

GCG

ACC

TTA

AAT

ACA

AGC

ATC

ACT

AAA

AAT

ATA

CAA

303

Pro

Gly

Ser

Ala

Ala

Thr

Leu

Asn

Thr

Se r

Ile

Thr

Lys

Asn

Ile

Gln

60

65

70

75

AAC

GGA

AAT

GCT

TAC

ATA

GAT

TTA

TAT

GAT

GTA

AAA

TTA

GGT

AAA

ATA

351

Asn

G1 y

Asn

Ala

Tyr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Asp

Va I

Lys

Leu

Gly

Lys

Ile

80

85

90

GAT

CCA

TTA

CAA

TTA

ATT

GTT

TTA

GAA

CAA

GGT

TTT

ACA

GCA

AAG

TAT

399

Asp

Pro

Leu

Gln

Leu

Ile

Val

Leu

Glu

Gln

Gly

Phe

Thr

Ala

Lys

Tyr

95

100

105

GTT

TTT

AGA

CAA

GGT

ACT

AAA

TAC

TAT

GGG

GAT

GTT

TCT

CAG

TTG

CAG

447

Va I

Phe

Arg

Gln

Gly

Thr

Lys

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Val

Ser

Gln

Leu

Gl n

110

115

120

AGT

ACA

GGA

AGG

GCT

AGT

CTT

ACC

TAT

AAT

ATA

TTT

GGT

GAA

GAT

GGA

495

Se r

Thr

Gly

Arg

Al a

Ser

Le u

Thr

Tyr

Asn

Ile

Phe

Gly

Glu

Asp

Gly

125

130

135

CTA

CCA

CAT

GTA

AAG

ACT

GAT

GGA

CAA

ATT

GAT

ATA

GTT

AGT

GTT

GCT

543

Leu

Pro

His

Va I

Lys

Thr

Asp

Gly

Gln

Ile

Asp

Ile

Va I

Ser

Va I

Al a

140

145

150

155

FIG. 6A

177 302

TTA ACT ATT

TAT GAT TCA ACA

ACC TTG AGG GAT AAG ATT GAA GAA GTT

591

Leu Thr

Ile

Tyr Asp Ser 160

Thr

Thr

Leu

Arg 165

Asp Lys

Ile

Glu

Glu Val 170

AGA

ACG

AAT

GCA

AAC

GAT

CCT

AAG

TGG

ACG

GAA

GAA

AGT

CGT

ACT

GAG

639

Arg

Thr

Asn

Ala

Asn

Asp

Pro

Lys

Trp

Thr

Glu

Glu

Ser

Arg

Thr

G1 u

175

180

185

GTT

TTA

ACA

GGA

TTA

GAT

ACA

ATT

AAG

ACA

GAT

ATT

GAT

AAT

AAT

CCT

687

Va I

Leu

Thr

Gly

Leu

Asp

Thr

Ile

Lys

Thr

Asp

Ile

Asp

Asn

Asn

Pro

190

195

200

AAG

ACG

CAA

ACA

GAT

ATT

GAT

AGT

AAA

ATT

GTT

GAG

GTT

AAT

GAA

TTA

735

Lys

Thr

Gln

Thr

Asp

Ile

Asp

Ser

Lys

Ile

Val

Glu

Val

Asn

Glu

Leu

205 210 215

POWTÓRZENIE 1

GAG

AAA

TTG

TTA

GTA

TTG

TCA

GTA

CCG

GAT AAA GAT

AAA

TAT

GAT

CCA

783

Glu

Lys

Leu

Leu

Val

Leu

Ser

Val

Pro

Asp Lys Asp

Lys

Tyr Asp Pro

220

225

230

235

ACA

GGA

GGG

GAA

ACA

ACA

GTA

CCC

CAA

GGG ACA CCA

GTT

TCA

GAT

AAA

831

Thr

G 1 y

Gly

Glu

Thr

Thr

Val

Pro

Gln

Gly Thr Pro

Val

Ser

Asp

Lys

240

245

250

GAA

ATC

ACA

GAC

TTA

GTT

AAG

ATT

CCA

GAT GGC TCA

AAA

GGG

GTT

CCG

879

Glu

Ile

Thr

Asp

Leu

Val

Lys

ile

Pro

Asp Gly Ser

Lys

Gly

Val

Pro

255

260

265

ACA

GTT

GTT

GGT

GAT

CGT

CCA

GAT

ACT

AAC GTT CCT

GGA

GAT

CAT

AAA

927

Thr

Val

Va I

Gly

Asp Arg

Pro Asp

Thr

Asn Val Pro

Gly

Asp

H i s

Lys

270

275

280

GTA

ACG

GTA

GAA

GTA

ACG

TAT

CCA

GAT

GGA ACA AAG

GAT

ACA

GTA

GAA

975

Va 1

Thr

Val

Glu

Va 1

Thr

Tyr

Pro Asp Gly Thr Lys

Asp Thr

Val

Glu

285

290

295

CZĘŚCIOWE

I

r POWTÓRZ0C2-9} -

POWTÓRZĘ®

GTA

ACG

GTT

CAT

GTG

ACA

CCA

AAA

CCA

(1003- 2970)

J

GTA

CCG

GAT

2979

Val

Thr

Val

Hi s

Val

Thr

Pro

Lys

Pro1

L (309 -964)

J

Val

Pro

Asp

300 305 965

FIG.6B

177 302

KONIEC C

AAA Lys

GAT Asp

AAA TAI GAT Lys Tyr Asp 970

CCA ACA GGT AAA GCT CAG CAA GTC AAC GGT AAA

3027

Pro

Thr

Gly 975

Lys Ala

Gln Gln

Val 980

Asn Gly

Lys

GGA

AAT

AAA

CTA

CCA

GCA

ACA

GGT

GAG

AAT

GCA

ACT

CCA

TTC

TTT

AAT

3075

GI y

Asn

Lys

Leu

Pro

Ala

Thr

Gly

Glu

Asn

Ala

Thr

Pro

Phe

Phe

Asn

985

990

995

GTT

GCA

GCT

TTG

ACA

ATT ATA

TCA TCA

GTT

GGT

TTA

TTA TCT

GTT

TCT

3123

Val

Ala

Ala

Leu

Thr

Ile

Ile

Ser

Ser

Val

Gly

Leu

Leu

Se r

Va 1

Ser

1000 1005 1010 1015

AAG AAA AAA GAG GAT TAATCTTTTG ACCTAAAATG TCACTAAATT TTTCACCATT 3178 Lys Lys Lys Glu Asp KONEC

1020

TATTGGTGTGAACACAT TAATAAAGTT ATGCATCTCT CTCCAACAAA ATTAATTAAA GIG 3238

TTTCAATTTTTCGAGAT TAATTCTTGA AAAAAGCCTA TCGAGATTAT TAATTTCGAT AGG 3298

CTTTTGA TTTTGTGTAA GCGTCCAATA TACCTTGTTA TTGGACGCTT ACT 3348

FIG. 6C

177 302

MFRRSKNNSYDTSOTKORFSIKKFK FGAASVLIGL SFLGGV TQGNLNIFEESIVAA

MFKSNYERKMRYSIRK FSVGVASVAVRSLFMG SVAHA

MAROOTKKNYSLRKLK TGTASVAVALTVLGAGFA NQTEVRA

MTKNNTNRHYSLRKLK TGTASVAVALTVLGAGLW NTNEVSA

MAKNNTNRHYSLRKLK TGTASVAVALTVLGAGFA NQTEVKA

MAKNNTWHYSLRKLK TGTASVAVALTVLGAGFA NQTEVKANGDGNPREV

FIG.7A

1 KAQQVNGKGNK	LPATGE
2 NKAPMKETKRO	LPYTGV
3 RPSONKGNRSO	LPSTGE
4 AKKEDAKKAET	LPTTGE
5 AKKDDAKKAET	LPTTGE
6 SRSAMTOOKRT	LPSTGE
7 NKAPNKETKRO	LPSTGE
8 KGNPTSTTEKK	LPYTGV

NAT

TAN

AAN

GSN

GSN

TAN

PFFNVAAL

PFFTAAAL

PFFTAAAA

PFFTAAAL

PFFTAAAL

PFFTAAAA

PFFTAAAL

TIISSVGLLSV SKKKE D

TVMATAGVAAW KRKEE N

TVMVSAGMLAL KRKEE N

AVMAGAGALAVA SKRKE D

AVMAGAGALAVA SKRKE O

TVMVSAGMLAL KRKEE N

TVM AAA

LVLEIMGLIGLIGTSFIAM KRRKS kDa

A909

PJMS23-1

FIG7B

FIG.8

177 302

NUKLEOTYDY

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz Cena 6,00 zł.

Claims (27)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Szczepionka sprzężona zdolna do nadania gospodarzowi odporności na infekcje Streptococcus grupy B, znamienna tym, że zawiera (a) polisacharyd specyficzny wobec grupy lub specyficzny wobec typu Streptococcus grupy B sprzężony z (b) funkcyjną pochodną antygenu alfa białka C Streptococcus grupy B, przy czym wymieniona pochodna jest zdolna do wytwarzania przeciwciał ochronnych przeciw Streptococcus grupy B i wyselekcjonowana jest z grupy obejmującej sekwencje N, C, N-C, R1, R2, R3, R4, Rs, Re, R7, Rs, R9, R9', Rx, N-Ri, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-R₆, N-R7, N-Rs, N-R9, N-Ry, N-R_x, Ri-C, R₂-C, R3-C, R4-C, R5-C, Ró-C, R7-C, R₈-C, R9-C, Ry'-C, Rx-C, N-Ri-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-Re-C, N-R7-C, N-R8-C, N-R9-C, N-R9'-C, N-Rx-C, w których N oznacza flankującą od strony 5' sekwencję aminokwasową, określoną sekwencją przedstawioną na fig. 6, z lub bez sekwencji sygnalnej, C oznacza 45 aminokwasową sekwencję kotwiczącą przedstawioną na fig. 6, R oznacza pojedynczą kopię 82 aminokwasowego powtórzenia, rozpoczynającego się na 679 aminokwasie sekwencji DNA przedstawionej na fig. 6, R9 oznacza sekwencję aminokwasów 227-975 przedstawioną na fig. 6, a w R_x x oznacza liczbę tandemowych kopii tego powtórzenia, połączonych tandemowo końcem karboksylowym jednej jednostki R z aminowym końcem następnej jednostki R.
2. 2. Szczepiona według zastrz. 1, znamienna tym, że jako polisacharyd zawiera polisacharyd otoczkowy.
3. 3. Szczepiona według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera pochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej sekwencje N, C, Ri, R2, R3, R4, R 5, Re, R7, Rs, R9, R9' i Rx, w którym x jest równe co najmniej 10, oraz z nich kombinacji.
4. 4. Szczepiona według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera więcej niż jedną pochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej sekwencje N, C, Ri, R2, R3, R4, Rs, R6, R7, Rs, R9, R9' i Rx, w którym x jest równe co najmniej 10, oraz z ich kombinacji.
5. 5. Szczepiona według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera pochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej sekwencje N-C, N-Ri, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-Ró, N-R7, N-Rs, N-R9, N-Ry i N-Rx, w którym x jest równe co najmniej 10, oraz ich kombinacji.
6. 6. Szczepiona według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera więcej niż jedną pochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej sekwencje N-C, N-R1, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-Ró, N-R.7, N-Rs, N-R9, R9' i N-Rx, w którym x jest równe co najmniej 10, oraz z ich kombinacji.
7. 7. Szczepiona według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera pochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej sekwencje Ri-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5C, Ró-C, R7-C, Rs-C, R9-C, Ry-C i Rx-C, w którym x jest równe co najmniej 10, oraz ich kombinacji.
8. 8. Szczepiona według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera więcej niż jedną pochodną wyselekcjonowaną z grupy obejmującej sekwencje Ri-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, Ró-C, R7-C, Rs-C, R9-C, Ry-C i Rx-C, w którym x jest równe co najmniej 10, oraz ich kombinacji.
9. 9. Szczepiona sprzężona według zastrz. 1, znamienna tym, że wymieniona pochodna białka zawiera więcej niż 10 powtórzonych jednostek R.
10. 10. Cząsteezka rckombinanta DNA zaNierająca sekwencję DNA kodując-ćj antyg en alfa białka C Streptococcus grupy B lub przeciwciało stanowiące eaga fragment, znamienna tym, że wymieniony antygen lub fragment zawiera sekwencję co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej Rx, N-Rx, Rx-C i N-Rx-C, w której x jest większe lub równe 1, w której N oznacza sekwencję flankującą, która poprzedza początek sekwencji powtarzających się jednostek antygenu alfa zawartych w sekwencji przedstawionej na fig. 6A-6C (Sek.ID Nr 15) z lub bez sekwencji sygnalnej; C oznacza 45 aminokwasawą C-terminalną sekwencję kotwiczącą m 302 przedstawioną na fig. 6A-6C (Sek.ID Nr 15); R oznacza jedną kopię sekwencji 82 aminokwasów 227-308 z fig. 6A-6 C (Sek.ID Nr 15); a w Rx x oznacza liczbę tandemowych kopii tego powtórzenia, połączonych tandemowo z końcem karboksylowymjednej jednostki R aminowego końca następnej jednostki R, w której rekombinant DNA zawiera sekwencję nukleotydów pokazaną na fig. 6A-6C (Sek.ID Nr 14), która koduje antygen alfa Streptococcus grupy B lub przeciwciało zawierające jego fragment i cząsteczka ta jest zdolna do ekspresji pochodnej białka C antygenu alfa w bakterii.
11. 11. Cząsteczka według zastrz. 10, znamienna tym, że jako wymieniony antygen lub fragment zawiera sekwencję co najmniej jednego członka wybranego z grupy obejmującej sekwencje N-C, R1, R2, R3, R4, R5, Ró, R7, Rs, R9, R9, Rx, N-R1N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-Ró, N-R7, N-R₈, N-R9, N-R9', N-R_x, Ri-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, Ró-C, R7-C, Rs-C, R9-C, R9-C, R_x-C, N-Ri-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-Ró-C, N-R7-C, N-R8-C, N-R9-C, N-Ry'-C i N-Rx-C, w którym x jest równe co najmniej 10, w którym N oznacza N-terminalną sekwencję, która poprzedza rozpoczęcie sekwencji powtarzających się jednostek antygenu alfa znajdujących się w sekwencji przedstawionej na fig. 6 A- 6 C (Sek.ID Nr 15) z lub bez sekwencji sygnalnej, C oznacza 45 'aminokwasową C-terminalną sekwencję kotwiczącą przedstawioną na fig. 6A-6C (Sek.ID Nr 15), R oznacza jedną kopię sekwencji 82 aminokwasów 227-308 z sekwencji fig. 6A-6C (Sek.ID Nr 15), R9' przedstawia sekwencję aminokwasów 227-975 przedstawioną na fig. 6 (Sek.ID Nr 15), a w R_x x oznacza liczbę tandemowych kopii tego powtórzenia, połączonych tandemowo przy końcu karboksylowym jednej jednostki R z aminowym końcem sąsiedniej jednostki R.
12. 12. Cząsteczka według zastrz. 11, znamienna tym, że fragment zawiera co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej sekwencje Ri, R2, R3, R4, R5, Ró, R7, Rs, R9, R9' i Rx.
13. 13. Cząsteczka według zastrz. 11, znamienna tym, że fragment zawiera sekwencję co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej sekwencje N-C, N-Ri, N-R2, N-R3, N-R4, N-R5, N-Ró, N-R7, N-Rs, N-R9, N-R9' i N-Rx.
14. 14. Cząsteczka według zastrz. 11, znamienna tym, że fragment zawiera sekwencję co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej sekwencje Ri-C, R2-C, R3-C, R4-C, R5-C, Ró-C, R7-C, R8-C, R9-C, R9-C i Rx-C.
15. 15. Cząsteczka według zastrz. 11, znamienna tym, że fragment zawiera sekwencję co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej sekwencje N-Ri-C, N-R2-C, N-R3-C, N-R4-C, N-R5-C, N-Ró-C, N-R7-C, N-Rs-C, N-R9-C, N-R9-C i N-Rx-C.
16. 16. Cząsteczka według zastrz. 10 albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, znamienna tym, że sekwencja DNA jest sekwencją dającą się przyłączyć do promotora.
17. 17. Cząsteczka według zastrz. 10, znamienna tym, że wymieniony fragment zawiera sekwencję co najmniej jednego członu dobranego z grupy obejmującej N, C i N-C.
18. 18. Cząsteczka według zastrz. 17, znamienna tym, że wymieniony fragment zawiera sekwencję N.
19. 19. Cząsteczka według zastrz. 17, znamienna tym, że wymieniony fragment zawiera sekwencję C.
20. 20. Cząsteczka według zastrz. 17, znamienna tym, że wymieniony fragment zawiera sekwencję N-C.
21. 21. Cząsteczka według zastrz. 10 albo 17, albo 18, albo 19, albo 20, znamienna tym, że sekwencja DNA jest sekwencją dającą się przyłączyć do promotora.
22. 22. Wektor rekombinanta zawierający cząsteczkę rekombinanta DNA, znamienny tym, że stanowi cząsteczkę rekombinanta DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 6A-6C (Sek. ID nr 14), która koduje antygen alfa Streptococcus grupy B lub przeciwciało zawierające jego fragment, operacyjnie połączoną z promotorem.
23. 23. Wektor rekombinanta według zastrz. 22, znamienny tym, że stanowi wektor dobrany z grupy obejmującej plazmid, kosmid, transpozon i fag.
24. 24. Komórka gospodarza przekształconego cząsteczką rekombinanta DNA, znamienna tym, że zawiera przekształconą cząsteczkę rekombinanta DNA o sekwencji nukleotydowej

    177 302 przedstawionej na fig. 6A-6C (Sek. ID nr 14), która koduje antygen alfa Streptococcus grupy B lub przeciwciało zawierające jego fragment, operacyjnie połączoną z promotorem.
25. 25. Komórka gospodarza według zastrz. 24, znamienna tym, że wymieniona komórka gospodarza dobrana jest z grupy obejmującej komórkę bakteryjną lub komórkę drożdży.
26. 26. Komórka gospodarza według zastrz. 24, znamienna tym, że wymieniona komórka bakterii należy do Streptococcus grupy B.
27. 27. Komórka gospodarza według zastrz. 24, znamienna tym, że wymieniona komórka bakterii należy do Escherichia coli.