HU219327B - Process for the production of conjugated vaccine for group b streptococcus - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás Streptococcus B csoport mikroorganizmusaiáltal okozott fertőzés ellen a gazdaszervezetnek immunitást biztosító,rekombináns S1 vagy S23 fehérjét kivéve, egyéb Streptococcusfehérjétől lényegében mentes konjugált vakcina előállítására. Avakcinát úgy állítják elő, hogy a Streptococcus B csoport egykapszuláris poliszacharidját a Streptococcus B csoport legalább egyrekombináns C fehérjéjéhez konjugálják, ahol az említett fehérje arekombináns S1 fehérje vagy a rekombináns S23 fehérje lehet, és akapott konjugátumot a kívánt esetben a vakcinakészítésben szokásoshordozóanyagokkal összekeverik. A találmány tárgya továbbá eljárásStreptococcus B csoportba tartozó mikroorganizmusok által okozottfertőzés elleni antiszérum, valamint az ilyen mikroorganizmusokrekombináns S1 és S23 fehérjéje és az ezt kódoló génszekvenciáttartalmazó rekombináns molekula előállítására. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás olyan vakcina előállítására, amely képes Streptococcus B csoportba tartozó mikroorganizmus által okozott fertőzéssel szemben immunitást biztosítani, továbbá eljárás ilyen fertőzés elleni antiszérum előállítására, valamint az ilyen mikroorganizmusok rekombináns Sl és S23 fehérjéjének és az ezt kódoló génszekvenciát tartalmazó rekombináns molekula előállítására.

A Streptococcus fajba tartozó baktériumokról ismert, hogy betegségek kórokozói emberekben és állatokban. A Streptococcusokat immunológiai csoportokba osztották azon az alapon, hogy specifikus szénhidrát antigének megtalálhatók-e a felszínükön. Jelenleg az A-0 csoportok ismertek [Davis, B. D. et al., In: Microbiology, 3. edition, 609. old. (Harper & Row, 1980)]. A Streptococcusok a legelterjedtebb és legfontosabb olyan baktériumok, amelyek emberi megbetegedéseket okoznak.

Jóllehet a B csoportba tartozó Streptococcusok az állati megbetegedésekhez kapcsolódnak (például masztitisz szarvasmarháknál), az utóbbi időben Streptococcus agalactiae (egy Streptococcus B csoportba tartozó) tűnt fel, amelyik az Amerikai Egyesült Államokban a humán neonatális szepszis legáltalánosabb kórokozója, és úgy vélik, hogy évente legalább 6000 halálesetért felelős [Hill, H. R. et al., Sexually Transmitted Diseases, McGraw-Hill, 397-407). A Streptococcus B csoport fontos patogén a gyerekek kései támadású agyhártyagyulladásában, a szülés utáni méhnyálkahártyagyulladásban és immunológiai problémákkal rendelkező felnőttek fertőzéseiben is [Patterson, M. J. et al., Bact. Rév., 40, 774-792 (1976)]. Jóllehet a mikroorganizmus érzékeny az antibiotikumokra, a nagy támadási sebesség és a szepszis gyors fellépése az újszülöttekben és a gyerekek agyhártyagyulladásában mind nagy megbetegedési arányt (50%), mind nagy halálozási arányt (20%) eredményez [Baker, C. J. et al., New Engl. J. Med. (editorial) 314 (26) 1702-1704 (1986); Baker, C. J. et al., J. Infect. Dis. 136, 137-152 (1977)].

A Streptococcus B csoport általános résztvevője a vagina és a vastagbél flórájának. Jóllehet az újszülöttfertőzésnek a legáltalánosabb útja szülés közben a vaginális kolóniákból történik, leírták az újszülött gyerekszobákban a nozokomiális elterjedését is [Patterson, M. J. et al., Bact. Rév., 40, 774-792 (1976)]. A Streptococcus B-vel kolonizált gyerekeknek csak kis százalékában fejlődik ki súlyos fertőzés. A gazdaszervezet faktorainak és a bakteriális virulencia determinánsoknak a szerepe a kolonializációból a fertőzésbe való átmenetben még nem ismert teljesen.

Számos, a Streptococcus B csoportba tartozó fehérjéről az a vélemény, hogy szerepet játszik a virulenciában és az immunitásban [Ferrieri, P. Rév. Infect. Dis., 10, S363 (1988)]. Lancefíeld azon az alapon definiálja a Streptococcus B csoportba tartozó C fehérjéket, hogy képesek-e protektív immunitást kifejteni [Lancefreld, R. C. et al., J. Exp. Med., 142, 165-179 (1975)]. Erről a fehérjecsoportról az a vélemény, hogy számos különböző polipeptidet és antigén-determinánst tartalmaz. Ezeknek a felfedezéseknek a fényében a Streptococcus

B csoport által okozott fertőzések megelőzésére irányuló erőfeszítések a profilaktikus antibiotikumok alkalmazására és a Streptococcus B csoport elleni vakcina kifejlesztésére irányulnak [Baker, C. J. et al., Rév. of Infec. Dis., 7, 458-467 (1985); Baker, C. J. et al., New Engl. J. Med. (editorial), 314 (26), 1702-1704 (1986)].

A Streptococcus 8 csoport elleni poliszacharid vakcinákat Kasper, D. L. írja le (4 207 414 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, valamint a RE1672 számú újra kibocsátott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, a 4 324 887, 4 356 263, 4 367 221, 4 367 222, és 4 367 223), valamint Carlo, D. J. (4 413 057 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és Yavordios D. et al. (71 515 számon publikált európai szabadalmi leírás).

Azoknak a gyerekeknél előforduló szubpopulációknak a kivételével, amelyeknél a Streptococcus B csoporttal való anyai kolonializációt és más perinatális rizikófaktort lehet azonosítani, az antibiotikumok profilaktikus alkalmazása nem alkalmas gyakorlati szempontból, illetve nem hatásos az esetek legnagyobb többségében [Boyer, K. M. et al., New Engl. J. Med, 314 (26), 1665-1669 (1986)]. A szülés közben való kemoprofilaxis nem terjedt el széles körben az alábbi okok miatt:

1) nem lehetséges a Streptococcus B csoporttal való anyai kolonializációt gyors, megbízható és gazdaságos módszerrel kimutatni;

2) a neonatális esetek 40%-a kis rizikójú esetekben fordul elő;

3) nem tartják gyakorlatilag megvalósíthatónak, hogy az összes olyan anyát és gyermeket, akiknél a fertőzés veszélye előfordul, szűrővizsgálatnak és/vagy kezelésnek vessék alá;

4) az antibiotikum profilaxis nem bizonyult megbízhatónak a kései agyhártyagyulladás (7200 eset évente az Amerikai Egyesült Államokban) vagy a szülés utáni méhnyálkahártya-gyulladás (évi 45 000 eset) megelőzésében [Baker, C. J. et al., New Engl. J. Med. (editorial), 314 (26), 1702-1704(1986)].

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott és letétbe helyezett plazmidok a pJMSl és pJMS23 plazmidok a pUX12 plazmid származékai, amely Streptococcus antigén fehérjéket kódoló DNS-t tartalmaz, és ezek a fehérjék használhatók a jelen találmány alkalmazása során. A pUX12 plazmid a pUC12 plazmid egy származéka. A pJMSl és pJM223 plazmidokat 1989. szeptember 15-én helyeztük letétbe az American Type Culture Collection-nál (Rockville, MD), letéti jelük ATCC 40659 és ATCC 40660.

A Streptococcus agalactiae a neonatális szepszis legáltalánosabb okozója az Amerikai Egyesült Államokban, és évente 6000-10 000 halálesetért felelős. Jóllehet a Streptococcus B csoport típusspecifikus poliszacharid kapszulája immunogén és fontos védőantigéneket hordoz, a poliszacharid vakcinával végzett klinikai kísérletek nagyon gyenge választ mutattak [Baker, C. J. et al., New Engl. J. Med. 319, 1180 (1980); Insel R. A. et al., New Engl. J. Med. (editorial), 319 (18), 1219-1220 (1988)].

HU 219 327 Β

A jelen találmány célja egy konjugátumvakcina kifejlesztése a Streptococcus B csoport (azaz Streptococcus agalactiae) ellen, amely egy, a Streptococcus B csoportból származó, onnan klónozott génről expreszszálódó védőantigén fehéijét alkalmaz. Ez az új konjugátumvakcina azzal az előnnyel rendelkezik, hogy kiváltja mind a T-sejt dependens védelmet a hordozó fehéijeadjuváns akcióján át, mind pedig további védő epitopokat szolgáltat, amelyek jelen vannak a Streptococcus B fehéije klónozott csoportján [Insel R. A. et al., New Engl. J. Med. (editorial), 319 (18), 1219-1220 (1988); Baker, C. J., et al., Rév., of Infec. Dis., 7, 458-467 (1985)].

A találmány tárgya tehát eljárás konjugátumvakcina előállítására, amely képes arra, hogy a gazdaszervezet számára immunitást biztosítson egy Streptacoccus B csoport által okozott fertőzés ellen oly módon, hogy egy kapszuláris poliszacharidot legalább egy C fehéréhez konjugálunk, ahol mind a poliszacharid, mind a fehérje a Streptococcus B csoportra jellemző molekula.

A találmány szerinti vakcina Streptococcus B csoport által okozott fertőzés megelőzésére vagy legyengítésére alkalmazható oly módon, hogy egy egyednek, akiről feltételezhető, hogy egy ilyen fertőzés kockázatának van kitéve, a fenti eljárással előállított konjugátumvakcinából egy hatásos mennyiséget adunk be, amely képes a gazdaszervezet immunitását biztosítani a fertőzéssel szemben.

A találmány szerinti eljárással előállított vakcina alkalmazható Streptococcus B csoport által okozott fertőzés megelőzésére vagy legyengítésére terhes nők esetén is, így alkalmas arra, hogy a nő még meg nem született gyermeke számára immunitást biztosítson a fertőzéssel szemben.

A találmány tárgya továbbá eljárás egy Streptococcus B csoport által okozott fertőzés elleni antiszérum előállítására oly módon, hogy egy emlősnek a találmány szerinti eljárással előállított vakcina hatásos mennyiségét adjuk be, és az antiszérumot a vérből kinyerjük.

Az 1. ábrán láthatjuk a pUC12 plazmid módosítását a pUX12 plazmid előállítása során.

A 2. ábrán láthatjuk a pUX12 plazmid restrikciós és transzkripciós térképét.

A 3. ábrán láthatjuk azokat a módosításokat, amelyeket a pUX12 plazmidon végeztünk azzal a céllal, hogy előállítsuk a +1 leolvasási kerettel rendelkező pUX12 + l plazmidot (A) és a -1 leolvasási kerettel rendelkező pUX12-l plazmidot (C). A (B) mutatja azt a konstrukciót, amely emellett még egy -1-es leolvasási kerettel rendelkező plazmidot eredményez.

A 4. ábrán láthatjuk az egéren végzett megvédési vizsgálatok eredményét, amely során SÍ és S23 elleni antiszérumot alkalmaztunk. A védelmet olyan egerekben figyeltük meg, amelyeket anti-Sl antiszérummal (p<0,002) vagy anti-S23 antiszérummal (p< 0,002) oltottunk be. Az alkalmazott minta méretének következtében az SÍ és S23 kísérletek között megfigyelt statisztikai szignifikanciakülönbség nem szignifikáns. Az ábrán az öszszes vizsgálthoz viszonyított túlélő egerek száma van feltüntetve.

A Streptococcus B csoport vakcinával végzett anyai immunprofilaxis egy olyan lehetőség, amellyel az antitestek szülés előtti átadása révén megvédhetjük a fertőzéstől mind az anyát, mind az újszülöttet [Baker, C. J. et al., New Engl. J. Med. (editorial), 314 (26), 1702-1704 (1986); Baker, C. J. et al., New Engl. J. Med. 319, 1180 (1980); Baker, C. J. et al., J. Infect. Dis. 7, 458 (1985)]. Amint az más, kapszulával rendelkező baktériumoknál előfordul, a fertőzésre való érzékenység korrelál a típusspecifikus antitestek hiányával [Kasper D. L. et al., J. Clin. Invest., 72, 260-269 (1983); Kasper, D. L, et al., Antibiot. Chemother., 35, 90-100 (1985)]. Az opszonikusan aktív típusspecifikus antikapszulás antitestek hiánya a Streptococcus B csoport ellen egy kockázati faktor a betegség kifejlődésében, a Streptococcus B csoporttal való kolonializációt követően [Kasper, D. L. et al., J. Infec. Dis., 153, 407-415 (1986)].

Az egyik megközelítés az, hogy tisztított típusspecifikus kapszuláris poliszacharidokkal vakcinálunk. Az ilyen vakcinák előállítási eljárásai, valamint az ilyen vakcinák alkalmazása a Streptococcus B csoporttal szembeni vakcinálásra már ismert, lásd a Kasper, D. Liter-féle következő szabadalmi leírások: 4 207 414 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, valamint a RE1672 számú újra kibocsátott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, a 4 324 887, 4 356 263, 4 367 221, 4 367 222 és 4 367 223 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások, valamint Carlo, D. J. féle következő szabadalmi leírások: 4 413 057 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és a 38 265 számon publikált európai szabadalmi leírás, és Yavordios D. és társai féle 71 515 számon publikált európai szabadalmi leírás.

Jóllehet a Streptococcus B csoport poliszacharid kapszulája jól jellemzett, és mindegyiknek megvan a szerepe mind a virulenciában, mind az immunitásban [Kasper, D. L. et al., J. Infec. Dis., 153, 407-415 (1986)], ezekről a kapszuláris komponensekről azt derítették ki, hogy immunogenitásuk változó, függően a specifikus kapszulafajtától és a gazdaszervezet immunrendszerének faktoraitól [Baker, C. J. et al., J. Infect. Dis. 7, 458 (1985)]. Egy nemrégiben befejezett klinikai vizsgálat, amelynek célja a Streptococcus B csoport kapszuláris poliszacharidjainak a kiértékelése volt, egy általános 63%-os választ mutatott, és ezzel azt jelezte, hogy az ilyen vakcina nem optimálisan immunogén [Baker, C. J. et al., New Engl. J. Med., 319 (18), 1180-1185 (1988)].

Az immunogenitásbeli különbséget más baktériumok poliszacharidjaival is megfigyelték. Például a C típusú meningococcus kapszula elleni vakcina erősen aktív, míg a B típusú meningococcus poliszacharid vakcina nem immunogén [Kasper, D. L. et al., J. Infec. Dis.,

HU 219 327 Β

153, 407-415 (1986)]. A gazdaszervezet immunrendszerének T-sejttől független funkcióira is gyakran szükség van ahhoz, hogy antitestválasz jöjjön létre a poliszacharid antigénekkel szemben. A poliszacharid antigének elleni T-sejtektől független válasz hiánya lehet a felelős az alacsony Streptococcus H elleni antitestszintért olyan anyákban, akiknek a gyermeke a későbbiekben a Streptococcus B csoporttal lesz megfertőződve. Emellett a 18-24 hónapnál fiatalabb gyermekek gyengén fejlett immunválasszal rendelkeznek a T-sejttől független antigének ellen.

A Streptococcus B csoportnak öt szerotípusa létezik, amelyek egy közös csoportspecifikus poliszacharid antigénnel rendelkeznek. A csoport antigén elleni antitest azonban az állati modellekben nem mutat védőhatást. Lancefield eredetileg a Streptococcus B csoportot négy szerotípusba sorolta (la, Ib, II és III), precipitintechnikák alkalmazásával. Ezt követően meghatározták az egyedi típusspecifikus kapszuláris poliszacharidok összetételét és szerkezetét [Jennings, H. J. et al., Biochem., 22, 1258-1264 (1983); Kasper, D. L. et al., J. Infec. Dis., 153, 407-415 (1986); Wessels, M. R. et al., Trans. Assoc. Amer. Phys., 98, 384-391 (1985)]. Wilkinson meghatározott egy ötödik szerotípust, az Ic-t, egy olyan fehérjeantigén azonosításával (eredetileg Ibe fehérjének nevezték), amelyik az Ib szerotípusba tartozó összes törzsön megtalálható, valamint néhány, az la típusú kapszulával rendelkező törzsön is [Wilkinson, H. W. et al., Journal of Bacteriology, 97, 629-634 (1969); Wilkinson H. W. et al., Infec. and Immun., 4, 596-604 (1971)]. Erről a fehérjéről később kiderült, hogy a Streptococcus B csoport különböző szerotípusai között változó az elterjedtsége, de nem található meg az la szerotípusban [Johnson, D. R. et al., J. Clin. Microbiol., 19, 506-510 (1984)].

A nevezéktan újabban úgy változott meg, hogy a Streptococcus B csoport szerotípusait alapvetően a kapszuláris típusspecifikus poliszacharidok alapján osztályozzák, és egy ötödik kapszulatípust is leírtak (IV típus) [Pritchard, D. G. et al., Rév. Infec. Dis., 10 (8), 5367-5371 (1988)]. Ennek következtében a Streptococcus B csoport tipizálása többé nem az Ibe antigénfehérjén alapul, amelyet most már C fehérjének hívnak. Az Ic típusú törzset újra osztályba sorolták (az la osztályba) a kapszuláris poliszacharidjának az összetétele alapján, azzal a további információval, hogy még a C fehérjét is hordozza.

Az immunológiai, járványtani és genetikai adatok azt sugallják, hogy a típusspecifikus kapszula jelentős szerepet játszik a Streptococcus B csoporttal való fertőződés elleni immunitásban. A típusspecifikus kapszuláris poliszacharidok összetétele és szerkezete, valamint ezek szerepe a virulenciában és az immunitásban kimerítő vizsgálatok tárgya volt [Ferrieri, P. et al., Infec. Immun., 27, 1023-1032 (1980); Krause, R. M. et al., J. Exp. Med., 142, 165-179 (1975); Levy, N. J. et al., Journal of Infectious Diseases, 149, 851-860 (1984); Wagner, B. et al., Journal of General Microbiology, 118, 95-105 (1980); Wessels, M. R. et al., Trans. Assoc. Amer. Phys., 98, 384-391 (1985)].

Vita van a típusspecifikus és a Streptococcus B csoportra jellemző poliszacharidok felületen való szerkezeti elrendezését illetően, a típusspecifikus poliszacharidokon belül az immunológiaiíag fontos determinánsokat illetően, valamint a Streptococcus B csoport kapszula által meghatározott virulenciájának mechanizmusát illetően (Kasper, D. L. et al., J. Infec. Dis., 153, 407-415 (1986)]. A kapszula virulenciában való szerepének a tanulmányozására Rubens és munkatársai transzpozon mutagenezissel egy izogén törzset állítottak elő a Streptococcus B csoport III-as típusából, amelyiknek nincs kapszulája [Rubens, C. E. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 7208-7212 (1987)]. Ezzel igazolták, hogy a kapszula expressziójának elvesztésének az az eredménye, hogy az újszülött egérmodellben a virulencia jelentős mértékben elvész. De a hasonló kapszula összetételű klinikai izolátumok virulenciája széles körben változik. Ez azt sugallja, hogy más bakteriális virulenciafaktorok a kapszula mellett szerepet játszanak a Streptococcus B csoport patogenezisében.

Számos fehéijét és más baktériumterméket is leírtak a Streptococcus B csoportban, amelyeknek a szerepét a virulenciában és az immunitásban még nem határozták meg, például a CAMP (Christine Atkins-Much Peterson) faktor, pigment (valószínűleg karotinoid), R antigén, X antigén, antifagocita faktorok és a nagyon gyengén definiált „pulmonáris toxinok” [Ferrieri, P. et al., J. Exp. Med., 151, 56-68 (1980); Ferrieri, P. et al., Rév. Inf. Dis., 10 (2), 1004-1071 (1988); Hill, H. R. et al., Sexually Transmitted Diseases, McGraw-Hill, 397-407]. A C fehérjéket az alábbiakban tárgyaljuk.

A hemolizinnel nem rendelkező Streptococcus B csoport izogén törzsei nem mutatnak megnövekedett virulenciát az újszülött patkánymodellben [Weiser, J. N. et al., Infec. and Immun., 55, 2314-2316 (1987)]. Sem a hemolizin, sem a neuraminidáz nincs mindig jelen a fertőzéshez kapcsolható klinikai izolátumokban. A CAMP faktor egy extracelluláris fehérje a Streptococcus B csoportban, molekulatömege 23 500 D, amely a stafilokokkusz béta-toxin (egy szfmgomielináz) jelenlétében az eritrocita membránok hidrolíziséhez vezet. A Streptococcus B csoport CAMP faktort kódoló génjét nemrég izolálták és klónozták Escherichia coliban [Schneewind, O. et al., igénypont szerinti Infec. and Immun., 56, 2174-2179 (1988)]. A CAMP faktor, az X és R antigének és más, az előzőkben felsorolt faktorok szerepét (ha van ilyen) a Streptococcus B csoport patogenezisében nem írták le a korábbi szakirodalomban [Fehrenbach, F. J. et al., in: Bacterial Protein Toxins, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1988); Hill, H. R. et al., Sexually Transmitted Diseases, McGraw-Hill, 397-407],

A C fehérjék egy olyan, a sejt felszínéhez kapcsolódó Streptococcus B csoport antigéncsoportba tartoznak, amelyeket eredetileg Wilkinson és munkatársai izoláltak a Streptococcus B csoportból [Wilkinson, H. W. et al., Journal of Bacteriology, 97, 629-634 (1969); Wilkinson H. W. et al., Infec. and Immun., 4, 596-604 (1971)]. Ők forró sósavat (HCl) használtak a sejtfal ext4

HU 219 327 Β rahálására, valamint triklór-ecetsavat (TCA) a fehéqeantigének kicsapására. A C fehérjéknek két, antigenikusan különböző populációját írták le:

1) egy olyan fehérjecsoportot, amely érzékeny a pepszinnel való emésztésre, de nem érzékeny a tripszinnel való emésztésre, és vagy TR-nek (tripszinrezisztens), vagy α-nak nevezik,

2) a Streptococcus B csoport egy másik fehéijecsoportja, amelynek tagjai érzékenyek mind a pepszinnel, mind a tripszinnel való emésztésre, és vagy TS-nek (tripszinérzékeny), vagy B-nek nevezik [Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, 87, 51-54 (1979); Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, 89, 205-209 (1981); Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, 91, 231-234 (1983); Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, 93, 121-124 (1985); Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Immunoi. Scand. Sect. B, 93, 121-124 (1985); [Johnson, D. R. et al., J. Clin. Microbiol., 19, 506-510 (1984); Russell-Jones, G. J. et al., J. Exp. Med., 160, 1476-1484 (1984)].

1975-ben Lancefield és munkatársai egérvédelmi vizsgálatokat alkalmaztak nyulakban készített antiszérum felhasználásával, hogy funkcionálisan meghatározzák a C fehérjéket, illetve azt a képességüket, hogy képesek-e védőimmunitást biztosítani hasonló fehérjeantigéneket hordozó Streptococcus B csoport törzsekkel szemben [Lancefield, R. C. et al., J. Exp. Med., 142, 165-179 (1975)]. Számos kutató állított elő nyerskészítményt a Streptococcus 8 csoport antigénfehérjéiből, amelyeket C fehéijéknek neveztek, a sejtfal kémiai extrakciójával, sósavat vagy detergenst alkalmazva [Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, 89, 205-209 (1981); Bevanger, L, et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, 93, 121-124 (1985); Russell-Jones, G. J. et al., J. Exp. Med., 160, 1476-1484 (1984); Valtonen, Μ. V. et al., Microb. Path., 1, 191-204 (1986); Wilkinson H. W. et al., Infec. and Immun., 4, 596-604 (1971)]. Ezeknek az antigéneknek a közölt mérete 10 és 190 kD között változott, és egyetlen fehérjét nem izoláltak, illetve jellemeztek [Femeri, P. et al., Rév. Inf. Dis., 10 (2), 1004-1071 (1988)].

Protektív antiszérumokkal végzett vizsgálatok alapján a C fehéijék a Streptococcus B csoport klinikai izolátumainak körülbelül 60%-ában kimutathatók, és az összes szerotípusban megtalálhatók, de különböző gyakorisággal [Johnson, D. R. et al., J. Clin. Microbiol., 19, 506-510 (1984)]. Az egyes Streptococcus B csoport izolátumok rendelkezhetnek mind a TS, mind a TR antigénekkel, vagy csak az egyikkel, vagy egyikkel sem. Azzal a kivétellel, hogy a részlegesen tisztított antigének képesek protektív immunitást biztosítani, ezeknek az antigéneknek a patogenezisben játszott szerepét nem tanulmányozták in vitro. A C fehérjéket hordozó Streptococcus B csoport törzsekkel végzett in vivő vizsgálatok szolgálhatnak némi bizonyítékkal, hogy a C fehérjék lehetnek a felelősek az opszonizációval szembeni rezisztenciáért [Payne, N. R. et al., Journal of Infectious Diseases, 151, 672-681 (1985)], és a C fehéijék gátolhatják a Streptococcus B csoport intracelluláris elpusztítását a fagocitózist követően [Payne, N. R. et al., Infection and Immunity, 55, 1243-1251 (1987)]. Igazolták, hogy a Streptococcus B csoport ΙΙ-es típusú törzsei, amelyek a C fehéijéket hordozzák, sokkal virulensebbek az újszülött patkány szepszismodellben [Ferrieri et al., Rév. Inf. Dis., 10 (2), 1004-1071 (1988); Ferrieri, P. et al., Infect. Immun., 27, 1023-1032 (1980)]. Mivel a C fehéijékre nincs genetikai adat, a C fehérjékkel nem rendelkező izogenikus törzseket még nem tanulmányozták. Van bizonyíték arra, hogy a TS vagy 8- vagy C fehéijék közül az egyik kötődik az IgG-hez [Russell-Jones, G. J. et al., J. Exp. Med., 160, 1476-1484 (1984)]. Az IgG és a C fehérjék kötődésének szerepe a virulenciában, ha van ilyen egyáltalán, nincs leírva.

1986-ban Valtonen és munkatársai tenyészet felülúszóból izoláltak Streptococcus B csoport fehérjéket, amelyek védőhatást fejtettek ki az egérmodellben [Valtonen, Μ. V. et al., Microb. Path., 1, 191-204 (1986)]. Azonosítottak és részlegesen tisztítottak egy tripszinrezisztens Streptococcus B csoport fehéijét, amelynek molekulatömege 14 000 D. Az ez ellen a fehérje ellen nyúlban előállított antiszérumok megvédték az egereket az Ib típusú Streptococcus B csoporttal való fertőzéstől (89%-os védelem). Ez a fehéije Lancefield meghatározása szerint egy C fehérje. Ha azonban az ez ellen a fehéije ellen készült antiszérumot használták a Streptococcus B csoport antigének kivonatának immunprecipitációjára, akkor számos magasabb molekulatömegű fehéijét találtak reakcióképesnek. Ez azt sugallta, hogy a 14 000 D molekulatömegű fehéije a Streptococcus B csoport fehérjéknek egy közös epitopját képviselheti, vagy ez egy, a Streptococcus B csoport tenyészetek felülúszóiban található lebomlási termék. A mind a baktériumsejtekből, mind a felülúszókból izolált C fehérjék méretbeli különbözősége azt sugallja, hogy a C fehéijék egy géncsaládot képviselhetnek, és antigén diverzitást tartanak fent az immunrendszer elleni védelem egyik mechanizmusaként.

A közölt molekulatömegek tartománya és az egyes C fehéijék tisztítása során tapasztalt nehézségek hasonlóak ahhoz, amit számos kutató tapasztalt a Streptococcus A csoport M fehérjéjének tisztítása során [Dalé, J. B. et al., Infec. and Immun., 46 (1), 267-269 (1984); Fischetti, V. A. et al., J. Exp. Med., 144, 32-53 (1976); Fischetti, V. A. et al., J. Exp. Med., 146, 1108-1123 (1977)]. Az M fehéije génjét klónozták és szekvenciáját meghatározták, és azt találták, hogy számos ismétlődő DNS-szekvenciát tartalmaz [Hollingshead, S. K. et al., Journal of Biological Chemistry, 261, 1677-1686 (1986); Scott, J. R. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 1822-1826 (1985); Scott, J. R. et al., Infec. and Immun., 52, 609-612 (1986)]. Ezek az ismétlődő szekvenciák lehetnek a felelősek a poszttranszkripciós processzálásért, aminek az eredménye az M fehérjék méretében tapasztalt változékonyság. Annak a mechanizmu5

HU 219 327 Β sa, hogy ez miképpen játszódik le, nem ismert. A Streptococcus B csoport C fehéijéinek molekulatömegében megfigyelt változékonyság is hasonló folyamat eredménye lehet.

Cleat és munkatársai megpróbálták a C fehéijéket klónozni, két Streptococcus B csoport antiszérumpreparátumot használva, amelyeket Bevangertől kaptak (a és β), és ezzel megvizsgáltak egy Streptococcus B csoport Escherichia coliban előállított DNS-könyvtárat [Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Immunoi. Scand. Sect. B, 93, 121-124 (1985); Cleat, P. H. et al., Infec. and Immun., 55 (5), 1151-1155 (1987)]. Ezek a kutatók két olyan kiónt írtak le, amelyek az anti-Streptococcus antitesthez kötődő fehérjéket termelnek. Azt azonban nem tudták meghatározni, hogy bármelyik klónozott fehéije rendelkezik-e azzal a képességgel, hogy protektív antitest termelődését okozza, vagy hogy ezeknek a géneknek az elterjedtsége korrelál-e azokkal a Streptococcus B csoport törzsekkel, amelyekről ismert, hogy a C fehérjéket hordozzák. A klónozott génszekvenciák szerepét a Streptococcus B csoport virulenciájában nem vizsgálták. Mivel a C fehéijéket azon tulajdonságuk alapján definiáljuk, hogy képesek protektív antitestek képződését kiváltani, ez a munka nem tudta igazolni, hogy bármelyik klón is egy C fehérjét kódolna.

A jelen találmány szerinti megoldás kiküszöböli a Streptococcus B csoport elleni korábbi vakcinák előzőkben tárgyalt hiányosságait azáltal, hogy egy olyan konjugált vakcinát biztosít, amelyben a kapszuláris poliszacharidokat kovalens kötéssel egy fehérjelánchoz kötjük. Ez a megközelítés támogatja a T-sejtektől függő antitestválaszt a kapszuláris poliszacharid antigénekre, és megkerüli a T-sejtektől független igényeket az antitesttermelésben [Baker, C. J. et al., J. Infect. Dis. 7, 458 (1985); Kasper, D. L. et al., J. Infec. Dis., 153, 407-415 (1986)].

Egy konjugált vakcinában egy molekula, úgymint a Streptococcus B csoport kapszuláris poliszacharidjai (lásd fent) kovalensen hozzá vannak kötve egy „hordozó”-fehéijéhez vagy polipeptidhez. A kötés azt célozza, hogy megnöveljük a konjugált molekula antigén hatását. Azok a módszerek, amelyek azt szolgálják, hogy konjugált vakcinákat hozzunk létre egy antigén molekulából és egy ,Jiordozó”-fehérjéből, jól ismertek a szakterületen [Jacob, C. O. et al., Eur. J. Immunoi., 16, 1057-1062 (1986); Parker, J. M. R. et al., in: Modem Approaches to Vaccines, Chanock, R. M. et al., Eds., 133-138, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1983); Zurawski, V. R. et al., Journal of Immunology, 121, 122-129 (1978); Klipstein, F. A. et al., Infect. Immun., 37, 550-557 (1982); Bessler, W. G., Immunobioi., 170, 239-244 (1985); Posnett, D. N. et al., Journal of Biological Chemistry, 263, 1719-1725 (1988); Ghose, A. C. et al., Molec. Immunoi., 25, 223-230 (1988)].

A konjugált vakcináknak egy prototípus modelljét Hemophilus influenzáé ellen fejlesztették ki [Anderson, P., Infec. and Immun., 39, 223-238 (1983); Chu, C. et al., Infect. Immun., 40, 245-256 (1983); Lepow, M.,

Pediat. Infect. Dis. J., 6, 804-807 (1987)], amely publikációkra a továbbiakban is hivatkozunk, és ezt a modellt alkalmazhatjuk a jelen találmány szerinti új vakcinák konstrukciójában. Az ilyen konjugált vakcinák előállításának további módszereit az alábbi publikációkban közlik: 245 045 számon publikált európai szabadalmi bejelentés (Anderson, P. W. és társai); 4 673 574 és 4 761 283 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Anderson, P. W. és társai), 4 789 735 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Frank R. és társai) és a 206 852 számon publikált európai szabadalmi bejelentés; 4 619 828 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, (Gordon, L. K.); valamint 4 284 537 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Beachey, Ε. H.).

A konjugált vakcinák (például a Hemophilus influenzáé vakcina) fehétjevázaként olyan fehérjéket alkalmaznak, amelyeknek nincsenek közös antigén tulajdonságaik azzal a megcélzott szervezettel, amelyből a bakteriális kapszuláris poliszacharidok származnak [Ward, J. et al., in: Vaccines, Plotkin, S. A. et al., Eds, Saunders, Philadelphia, 300. oldal (1988)].

Ezzel szemben a jelen találmány szerinti konjugált vakcinák a Streptococcus B csoport immunogén fehérjéit alkalmazzák a konjugált vakcinák gerinceként. Az a véleményünk, hogy ez a megközelítés sokkal hatékonyabb vakcinákat eredményez [Insel R. A. et al., New Engl. J. Med. (editorial), 319 (18), 1219-1220 (1988)]. A jelen találmány szerinti konjugált, fehéije-poliszacharid vakcina az első abból a szempontból, hogy olyan Streptococcus B csoport fehéijéket tartalmaz, amelyek konjugált vakcinában alkalmazhatók. Bármely, a Streptococcus B csoportra jellemző fehéije használható a jelen találmány szerinti konjugált vakcinában fehéreként. Előnyös azonban, ha a Streptococcus B csoport C fehérjéjét használjuk erre a célra. Amint azt az alábbiakban részletesebben elemezzük, a pJMSl és pJMS23 plazmidok tartalmaznak olyan DNS-t, amely a Streptococcus C fehéqét kódolja. Azok a legelőnyösebb C fehérjék, amelyeket ezeknek a DNS-eknek baktériumokban való expressziójával állítunk elő.

Amint azt az előzőkben jeleztük, a jelen találmány tárgya olyan gének klónozása és expressziója, amelyek a Streptococcus B csoport fehéijeantigének védőcsoportjait kódolják. Előnyösen ezeket a fehéijéket használjuk fehéijegerincként, amelyhez a Streptococcus B csoport kapszuláris poliszacharidjai konjugálhatók azzal a céllal, hogy ezen baktériumokkal szemben konjugált vakcinát állítsunk elő. Emellett ezeknek a fehérjéknek a Streptococcus B csoport virulenciájának és immunitásának meghatározásában játszott szerepe kihasználható arra is, hogy további terápiát dolgozzunk ki a Streptococcus B fertőzés ellen. Ezeknek a bakteriális eredetű géneknek az izolálása és jellemzése lehetővé teszi a géntermék manipulálását azzal a céllal, hogy optimalizáljuk a konjugált vakcina polipeptidgerincének/hordozójának mind az adjuváns, mind az antigén tulajdonságait.

A jelen találmány tárgya tehát a Streptococcus B csoport C fehérjéinek klónozása, a virulenciában és im6

HU 219 327 Β munitásban játszott szerepük vizsgálata, valamint az a tulajdonságuk, hogy immunogénként szolgáljanak egy Streptococcus B csoport elleni konjugált vakcinában.

A Streptococcus különböző csoportjaiban végzett klónozási tevékenységről szóló nagy mennyiségű irodalmi hivatkozás ellenére csak korlátozott számú genetikai manipulációt hajtottak végre a Streptococcus B csoportban [Macrina, F. L., Ann. Rév. Microbiol., 38, 193-219 (1984); Wanger, A. R. et al., Infec. and Immun., 55, 1170-1175 (1987)]. A Streptococcus B csoportban legszélesebb körben alkalmazott technika a Tn916 kifejlesztése, és felhasználása a transzpozon mutagén kezelésben [Rubens, C. E. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 7208-7212 (1987); Wanger, A. R. et al., Rés. Vet. Sci., 38, 202-208 (1985)]. Mivel azonban úgy tűnik, hogy a C fehérjének egynél több génje létezik, és a protektív antiszérumok különböző fehérjékhez kötődnek, ezért a C fehérje génjeinek transzpozon mutagenezissel való szűrővizsgálatának nincs gyakorlati jelentősége.

A jelen találmány tárgya a C fehérjék klónozása (valamint bármely más olyan fehérjének a klónozása, amelyik szerepet játszik a Streptococcus B csoport virulenciájában, illetve érinti a Streptococcus B csoport gazdaszervezet immunitását) egy új típusú plazmidvektor használatán keresztül. Ebből a célból az az előnyös, ha egy olyan klónozóvektort használunk, amelyet gyorsan meg lehet vizsgálni, hogy expresszál-e olyan fehérjéket, amelyek a Streptococcus B csoport ellen természetes úton kifejlesztett antitestekkel reagálnak. Mivel az ilyen antitestek heterológ poliklonális antitestek és nem monoklonális antitestek, ezért szükséges, hogy egy olyan vektort használjunk, amelyet könnyen meg lehet vizsgálni számos pozitív kiónon keresztül, hogy a számunkra érdekes géneket azonosítsuk.

Számos technika volt hozzáférhető a specifikus antiszérumokhoz kötődő antigéneket expresszáló kiónok vizsgálatára [Aruffo, A. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 8573-8577 (1987)]. A legáltalánosabban használt rendszert, a lambda GTll-et Young and Davis fejlesztette ki [Huynh, T. V, et al., in: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol. 1. (Glover, D. M. editorral) IRL Press, Washington, 49-78. oldal (1985); Wong, W. W. et al., J. Immunoi. Methods, 82, 303-313 (1985)]. Ez a technika lehetővé teszi azoknak a kiónoknak a gyors átvizsgálását a lizogén fágban, amelyeknek a termékei a fágok lízise során szabadulnak fel. Az ebben a rendszerben általánosan előforduló problémák közé tartozik a DNS-fragmensek szubklónozása plazmidvektorokba a részletes restrikciós enzimes térképezés, próbák készítése és DNS-szekvenálás céljából. Emellett a DNS előállítása fágokból munkaigényes, és korlátozza a potenciálisan pozitív kiónok számát, amelyeket hatékonyan lehet vizsgálni. Végezetül a nyersfehérje-kivonatok készítése a klónozott génekből problematikus a fágvektor-gazdaszervezetek esetében.

Ezeknek a problémáknak a megkerülése céljából a jelen találmány tárgya egy olyan plazmidvektor, amelyet azon az alapon fejlesztettünk ki, hogy átvizsgáltuk a klónozott bakteriális kromoszomális DNS-eket, hogy melyik termel a virulenciában és/vagy az immunitásban szerepet játszó fehérjéket. A jelen találmány tárgya tehát továbbá egy hatékony klónozóvektor kifejlesztése és alkalmazása, amely gyorsan vizsgálható, hogy termel-e olyan fehérjéket, amelyek kötődnek a természetes úton kifejlesztett Streptococcus B csoport-ellenes antitestekhez. A vektort az általánosan ismert pUC12 plazmid klónozóvektor módosításával állítjuk elő [Messing, J. et al., Gene, 19, 269-276 (1982); Norrander, J. et al., Gene, 26, 101-106 (1983); Vieira, J. et al., Gene, 19, 259-268 (1982)].

Ennek a rendszernek az alkalmazása során a plazmidklónok könnyen módosíthatók, restrikciós enzimekkel térképezhetők, valamint DNS-inszert-szekvenciáik, a próbák és a géntermékek tanulmányozhatók anélkül, hogy a szubklónozásra szükség lenne. A pUC12 egy 2,73 kb méretű, nagy kópiaszámú plazmid, amely a ColEl replikációs origót, ampicillinrezisztenciát kódoló gént, valamint egy, a lacZ génben elhelyezett polilinkert tartalmaz [Ausubel, F. M. et al., Current Topics in Molecular Biology; Greene Publ. Assn./Wiley Interscience, N. Y. (1987)].

Számos módosítást hajtottak végre a pUC12 polilinkerében [Aruffo, A. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 8573-8577 (1987)]. A pUC12 módosításának végső célja az volt, hogy a polilinkert módosítsuk oly módon, hogy azonos, de tapadós véget nem szolgáltató BstXl hasítási helyeket kapjunk a klónozás céljára, valamint „kitöltő” fragmenst adjunk hozzá, amely lehetővé teszi a lineáris gazdaplazmid könnyű elválasztását, és biztosítsuk az expressziét a lac promoterről mind a három transzlációs leolvasási fázisban.

Abból a célból, hogy helyet biztosítsunk az idegen DNS beépítésére nagy hatékonysággal, és minimalizáljuk a plazmid önmagával való záródásának valószínűségét, invertált, nem tapadós BstXl végeket adunk a polilinkerhez. Amint az az 1. ábrán látható, a pUC12 plazmidot először BamHI restrikciós enzimmel emésztjük (1. lépés), majd a plazmidot két szintetikus oligonukleotid adapterrel keveijük, amelyek részlegesen komplementerek: egy 15 tagú (GATCCATTGTGCTGG) és egy 11 tagú (GTAACACGACC) oligonukleotidot használunk erre a célra (2. lépés). Amikor a két adaptermolekulát ligáljuk a pUC12 plazmidba, akkor két BstXl hasítási helyet hozunk létre, de az eredeti BamHI restrikciós hasítási helyet is visszaállítjuk (3. lépés). A plazmidot ezután polinukleotid kinázzal kezeljük és ligáljuk, így hozunk létre egy zárt cirkuláris plazmidot. Ha ezt a plazmidot BstXl restrikciós enzimmel kezeljük, akkor a kapott végek azonosak, és nem kohezívek (mindegyik GTGT túllógó véget tartalmaz) (5. lépés).

Egy második módosítást is végrehajtunk a polilinkerben, hogy lehetővé tegyük a lineáris plazmid tisztítását a klónozáshoz anélkül, hogy a részlegesen hasított, önmagával ligálódni képes plazmiddal lenne szennyezve. A pCDM plazmidból egy tompa végű, 365 bp méretű FnuD2 fragmenst állítunk elő. Ezt a kazettát vagy

HU 219 327 Β „kitöltő” fragmenst, amely nem tartalmaz BstXl hasítási helyet, tompa véggel ligáljuk két szintetikus oligonukleotidhoz, amelyek részlegesen komplementerek: egy 12 tagú (ACACGAGATTTC) és egy 8 tagú (CTCTAAAG) oligonukleotidot használunk erre a célra (6. lépés). A kapott, adaptereket tartalmazó fragmense 4 bp hosszúságú túlnyúló végeket tartalmaz (ACAC), amelyek komplementerek az 5. lépésben bemutatott módosított pUC12 plazmid végeivel. A módosított pUC12 plazmidot ligáljuk a pCDM inszerttel adapterekkel; a kapott konstrukció, neve pUX12 látható a 2. ábrán. A módosított pUX12 plazmid visszahozható a pJMSl és pJMS23 plazmidokból oly módon, hogy a bejuttatott Streptococcus szekvenciákat kihasítjuk belőlük. Egy másik módszer szerint rekombináns módszerekkel vagy homológ rekombinációval is előállíthatok a pUC12 plazmid felhasználásával.

Mivel a pUX12 plazmidot expressziós vektorként kívánjuk alkalmazni, előnyös, ha a polilinkert tovább módosítjuk oly módon, hogy mindhárom lehetséges leolvasási fázist tartalmazza a lac promoterről kiindulva. Ezek a változtatások lehetővé teszik, hogy a klónozott génffagmensek a helyes transzlációs leolvasási fázisban legyenek, ennek gyakorisága egy a hathoz. Például egy klónozott génfragmens két különböző orientációban és a három lehetséges leolvasási fázis közül az egyikben építhető be a vektorba. Egy + 1-es leolvasási fázis előállításához a pUX12 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk, amely a polilinkerben egyetlen helyen hasít. Az egyszálú túlnyúló 5’-végeket T4 DNS-polimeráz 5’-3’-polimeráz aktivitással feltöltjük, majd a két tompa véget ligáljuk. Ennek eredménye az EcoRI hasítási hely elvesztése, és egy új XmnI hasítási hely létrejötte (3A. ábra). Ezt a konstrukciót úgy igazoljuk, hogy kimutatjuk az EcoRI restrikciós hasítási hely elvesztését, és kimutatjuk, hogy a polilinkerben egy új XmnI hasítási hely jött létre. Emellett kétszálú DNS-szekvencia-meghatározást végzünk a +1 módosított pUX12 plazmidon a standard szekvenáló indítómolekulák alkalmazásával [Ausubel, F. M. et al., Current Topics in Molecular Biology; Greene Publ. Assn./Wiley Interscience, N. Y. (1987)]. A DNS-szekvenciáról látható a 4 bázispár hozzáadása a polilinkerhez, és igazolódik a pUX12 módosítása a +1 leolvasási fázisra. Ennek a plazmidnak a jele apUX12+l.

Abból a célból, hogy a-l leolvasási fázist előállítsuk, a pUX12 vektort SacI restrikciós enzimmel hasítjuk, amely a pUX12 polilinkerében egyetlen helyen hasít. Az egyszálú 3’-tapadó végeket tompa végre visszaemésztjük a T4 DNS-polimeráz 3’5’-exonukleáz felhasználásával, és a kapott tompa végeket ligáljuk. A kapott szekvenciából a SacI hasítási helynek hiányoznia kell, és létre kellett jönnie egy új FnuD2 hasítási helynek (3B. ábra). A pUX12-l plazmid restrikciós enzimes emésztése azonban azt mutatta, hogy míg SacI hasítási hely nincs benne, addig FnuD2 hasítási hely sem jött létre. Továbbá a polilinker a Smal/Xmal hasítási helyeket sem tartalmazta. Számos lehetséges pUX12-l konstrukciót szekvenáltunk miniprepből kinyert, kétszálú DNS formájában. A szekvenált hat módosított plazmid közül egy olyat találtunk, amelyből tíz nukleotid hiányzott, és így létrejött benne a -1-es leolvasási keret (3C. ábra). Ez azt sugallja, hogy a T4 DNS-polimeráz további exonukleáz aktivitással rendelkezik, és a polilinkerben a kétszálú részbe is belevág. Mindenesetre a kapott plazmid egy -1-es leolvasási kerettel rendelkezik. A plazmid neve pUX12-1 lett.

A pUX12 vektorok alkalmazását a Streptococcus B csoport antigén tulajdonságú fehéréinek klónozásában az alábbi példákban részletesen tárgyaljuk. Röviden, a Streptococcus B csoportból származó DNS-t, illetve az ilyen DNS-sel komplementer DNS-t bejuttatjuk a pUX12, pUX12 + l vagy pUX12-l vektorokba, és Escherichia coliba transzformáljuk. A klónozott DNS-t Escherichia coliban expresszáljuk, és a sejtlizátumot megvizsgáljuk, hogy tartalmaz-e olyan fehérjét, amely képes a Streptococcus B csoport elleni antiszérumhoz kapcsolódni.

A pUX12 plazmidnak számos, potenciálisan érdekes módosítása létezik, amely megnövelheti a használhatóságát. Például a lac promotert egy másik promoterrel helyettesíthetjük, a replikációs origót módosíthatjuk, hogy egy alacsonyabb kópiaszámú vektort kapjunk, és a rezisztenciamarkereket is lecserélhetjük.

A jelen találmány tárgya olyan, a Streptococcus B csoportra jellemző poliszacharidot (például kapszuláris poliszacharidot) tartalmazó vakcina, amely fehéijével van konjugálva, és amely fehérje szintén jellemző a Streptococcus B csoportra. Az ilyen konjugált vakcinában levő „poliszacharid” és „fehétje” azonos lehet azzal a molekulával, amely a Streptococcus B csoportra jellemző, illetve lehet az ilyen molekulák funkcionális származéka. A funkcionális származékok közé tartoznak például a természetes fehérjék fragmensei és/vagy a természetes fehérjék variánsai (például azok a fehérjék, amelyeknek eltérő az aminosavszekvenciája, de lényegében megtartják ugyanazokat az immunogén, virulencia- vagy antigén tulajdonságokat, amelyekkel a természetes molekulák rendelkeznek). A jelen találmány szempontjából bármely poliszacharid használható, amely egy emlősbe (legyen az állat vagy ember) juttatva antitesteket termel, amely antitestek képesek a Streptococcus B csoporttal reagálni. A jelen találmány szerinti előnyös poliszacharidok közé tartozik a Streptococcus B csoport kapszuláris poliszacharidja, vagy ennek ekvivalensei. A jelen találmány szempontjából bármely olyan fehérje használható, amelyet ha emlősbe (legyen az állat vagy ember) juttatunk, akkor antitestek termelődését indukálja, amely antitestek képesek a Streptococcus B csoport által expresszált fehérjével reagálni, vagy amely megnöveli egy poliszacharid immunogenitását, amely poliszacharidot arra lehet használni, hogy a Streptococcus B csoport egy poliszacharidja elleni antitestek képződését indukálja. A jelen találmány szempontjából előnyös fehérjék közé tartoznak például a Streptococcus B csoport C fehérjéi vagy azok ekvivalensei.

Amint azt az alábbiakban alkalmazzuk, egy poliszacharid vagy fehérje Jellemző” egy baktériumra, ha szerkezete vagy struktúrája lényegében megegyezik egy

HU 219 327 Β baktériumhoz kapcsolódó molekuláéval. A szakkifejezés szándékaink szerint vonatkozik mindazokra a molekulákra, amelyek specifikusak a szervezetre, mind pedig azokra a molekulákra, amelyek jóllehet más szervezetekben találhatók meg, szerepet játszanak a baktérium virulenciájában vagy antigén hatásában egy emberi vagy állati gazdaszervezetben.

A jelen találmány szerinti vakcina rezisztenciát biztosíthat a Streptococcus B csoporttal szemben mind passzív immunizációval, mind aktív immunizációval. A passzív immunizáció egy előnyös megvalósítási módja szerint a vakcinát egy önkéntes gazdaszervezetnek adjuk be (azaz embernek vagy más emlősnek), majd a kialakuló antiszérumot kinyerjük, és közvetlenül egy olyan befogadónak adjuk be, akiről (amelyről) feltételezhető, hogy a Streptococcus B csoport által okozott fertőzése van.

Az a lehetőség, hogy az antitesteket vagy antitestffagmenseket toxinjelzésekkel lássuk el, további lehetőségeket kínál a Streptococcus B csoport által okozott fertőzések kezelésére, ha a passzív immunizálásnak ezt a típusát használjuk. Ebben a megvalósítási módban az antitesteket vagy az antitestek fragmenseit, amelyek képesek a Streptococcus B csoport antigének felismerésére, toxinokkal jelezzük, mielőtt a betegnek beadnánk. Ha egy ilyen toxinszármazék-molekula egy Streptococcus B csoportból származó sejthez kapcsolódik, akkor a toxinrész a sejt pusztulását okozza.

Egy második megvalósítási mód szerint a vakcinát egy nősténynek adjuk be (a terhesség vagy szülés előtt vagy közben) olyan időben és mennyiségben, hogy elegendő legyen olyan antiszérum termelésére, amelynek az a célja hogy mind a nőstényt, mind a magzatot vagy az újszülöttet megvédje (az antitesteknek a méhlepényen keresztül történő passzív beépülésével).

A találmány szerinti eljárással előállított vakcina alkalmazható Streptococcus B csoport vagy egyéb olyan mikroorganizmus által okozott fertőzés megelőzésére vagy legyengítésére, amelyeket a poliszacharid és/vagy a konjugált vakcina fehérjéje elleni antiszérum felismer és megköt. A továbbiakban a vakcináról azt mondjuk, hogy megelőz vagy legyengít egy fertőzést, ha egy adott egyedbe történő adagolásának eredménye a tüneteknek, illetve a kóros állapotnak vagy a teljes, vagy részleges legyengítése (azaz elnyomása), vagy az adott egyednek a betegséggel szembeni teljes vagy részleges immunitása.

A vakcina (vagy az általa geqesztett antiszérum) adagolása lehet „profilaktikus” vagy „terápiás” célú. Ha proíilaktikusan adjuk be, akkor a vegyület(ek)et előre adjuk be, mielőtt a Streptococcus fertőzésnek bármely nyoma lenne. A vegyület(ek) profilaktikus adagolása azt a célt szolgálja, hogy megelőzzük vagy legyengítsük a fertőzést. Ha terápiás céllal adagoljuk, akkor a vegyület(ek)et az aktuális fertőzés felismerése után adjuk be. A vegyület(ek) terápiás adagolásának célja az adott fertőzés legyengítése.

A jelen találmány szerinti gyulladáscsökkentő szereket vagy a fertőzés előtt adjuk be (azaz azért, hogy megelőzzünk vagy legyengítsünk egy feltételezett fertőzést), vagy egy adott fertőzés iniciációja után.

Egy készítményről akkor mondjuk hogy „gyógyászatilag elfogadható”, ha a beadását egy befogadó beteg eltűri. Egy ilyen ágensről az a vélemény, hogy „terápiásán hatékony mennyiségben” lehet adagolni, ha a beadott mennyiség fiziológiásán hatásos. Egy ágens fiziológiásán hatékony, ha jelenléte azt eredményezi, hogy kimutatható változás következik be a befogadó beteg fiziológiájában.

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló lesz, hogy ha a jelen találmány szerinti vakcinát egy egyednek beadjuk, akkor az olyan készítmény formájában történik, amely sókat, puffereket, adjuvánsokat vagy más olyan anyagokat tartalmaz, amelyek kívánatosak a készítmény hatékonyságának a javítása szempontjából. Az adjuvánsok olyan anyagok, amelyeket arra lehet használni, hogy specifikusan megnöveljenek egy specifikus immunválaszt. Az adjuvánst és a készítményt általában az immunrendszernek való bemutatás előtt összekeverik, vagy külön adják be, de az immunizálandó állatnak ugyanarra a pontjára. Az adjuvánsokat az összetételük alapján néhány csoportra lehet osztani. Ezek a csoportok lehetnek olajadjuvánsok (például a Freund-féle komplett vagy inkomplett adjuváns), ásványi sók [például A1K(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂, A1NH₄(SO₄)₂, szilikát, kaolin és szén], polinukleotidok (például a poli IC és poli AU savak), valamint bizonyos természetes anyagok (például a Mycobacterium tuberculosis-ból származó D viasz, valamint a Corynebacterium parvumban vagy a Bordetella pertussis-ban és a Brucella nemzetség tagjaiban talált anyagok). Az említett anyagok közül adjuvánsként különösen jól használhatók a szaponinok, például a Quil A (Superfos A/S, Dánia). A vakcinakészítményekben jól használható anyagokat például felsorolják a Remington’s Pharmaceutical Sciences (Osol, A., ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1324-1341 (1980) kiadványban.

A jelen találmány szerinti terápiás készítményeket beadhatjuk parenterálisan injekció, gyors infúzió, orrnyálkahártyán át való felszívódás, bőrön át való felszívódás vagy orális úton. A készítményeket emellett intramuszkulárisan vagy intravénásán is be lehet adni. A parenterális adagolás esetén a készítmények összetételében szerepelnek vizes vagy nem vizes oldatok, szuszpenziók és emulziók. A nem vizes oldatokra példa a propilénglikol, polietilénglikol, növényi olajak, például az olívaolaj, és az injekciózható szerves észterek, például az etil-oleát. Hordozókat vagy abszorbeáló zsiradékokat használhatunk, hogy ezzel megjavítsuk a bőr permeabilitását, és megnöveljük az antigén adszorpcióját. A szájon át való adagoláskor használt folyékony dózisformák általában folyékony dózisformát tartalmazó liposzómaoldatot tartalmaznak. A liposzómák szuszpendálására alkalmas formák lehetnek emulziók, szuszpenziók, oldatok, szirupok, valamint a szakterületen általánosan alkalmazott semleges hígítóanyagokat, például tisztított vizet tartalmazó elixírek. A semleges hígítóanyagok mellett ezek a készítmények tartalmazhatnak adjuvánsokat, nedvesítőanyagokat, emulgeáló és szuszpendálóanyagokat, illetve édesítő-, ízesítő- vagy illatosítóanyagokat.

HU 219 327 Β

Számos különböző technika létezik az immunizálás időzítésére, ha többszörös adagolási módot alkalmazunk. Lehetséges a találmány szerinti készítmények egynél többször való alkalmazása, hogy megnöveljük az immunizált állat által expresszált immunoglobulin repertoárszintjét és sokszerűségét. Tipikusan, ha többszörös immunizálást végzünk, akkor egy-két hónap elteltével végezzük az ismétlést.

A jelen találmány szerint egy gyógyászati készítmény „hatásos mennyisége” az a mennyiség, amely elegendő a kívánt biológiai hatás elérésére. A készítmény hatásos mennyiségének biztosításához szükséges dózis számos dologtól függ, például az állat vagy az ember életkorától, állapotától, nemétől, a betegség kiterjedtségétől (ha van ilyen egyáltalán), valamint egyéb változóktól, amelyeket a szakterületen jártas szakember képes beállítani.

A találmány szerinti antigénkészítményeket egy hatásos mennyiség egyszeri vagy többszöri dózisában adhatjuk be. A találmány szerinti készítmények hatásos mennyisége 0,01-1000 pg/ml per dózis között változik, előnyösebben 0,1-500 pg/ml per dózisérték között, és legelőnyösebben 10-300 pg/ml per dózisérték között.

Miután a találmányt az előzőkben általánosan ismertettük, még jobban érthetővé tesszük az alábbi példák segítségével, amelyeket csak az illusztráció kedvéért adunk meg, és nem az a célunk vele, hogy a jelen találmányt korlátozzuk rajtuk keresztül, hacsak külön nem jelezzük.

1. példa

A pUX12 vektorok klönozási hatásfoka

Számos kísérletet terveztünk a pUX12 vektorok klönozási hatásfokának vizsgálatára és annak meghatározására, hogy a módosított leolvasási keretek helyesen íródnak-e át. Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit az alábbiakban röviden összefoglaljuk:

1. A DNS-fragmens pUX12-be való klónozásához a három konstrukciót, a pUX12-t (az eredeti „nullás” leolvasásifázis-konstrukció), a pUX12+l-et és a pUX12-l-et azonos mólkoncentrációban összekeverjük. A plazmidokat ezután BstXI restrikciós enzimmel emésztjük, hogy a kitöltő fragmest elhasítsuk a polilinkeren belül. A kitöltő fragmenst elválasztjuk a plazmidtól, vagy alacsony olvadásponttá agarózt vagy kálium-acetát-gradienst alkalmazva [Aruffo, A. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 8573-8577 (1987); Ausubel, F. M. et al., Current Topics in Molecular Biology; Greene Publ. Assn./Wiley Interscience, Ν. Y. (1987)]. A klónozandó DNS-t egy olyan restrikciós enzimmel emésztjük, amelyik tompa végeket ad (bármelyik ilyen restrikciós enzim alkalmazható). Ha szükséges, akkor az egyszálú végekkel rendelkező kétszálú DNS-ek módosíthatók, hogy tompa végeket hozzunk létre. A DNS-fragmensek tompa végeit összekeverjük a két szintetikus oligonukleotid adapterrel. Ezek ugyanazok a 12 tagú, illetve 8 tagú oligonukleotidok, mint amelyeket a kitöltő fragmens készítése során használtunk. A módosított DNSfragmenseket kálium-acetát-gradiensen elválasztjuk a beépületlen szintetikus oligonukleotidoktól. Ezeket a íragmenseket azután a lineáris pUX12 plazmidcsaládba

Egáljuk, majd Escherichia coli transzformálására használjuk.

Annak igazolására, hogy a pUX12 vektorok önmagukkal kis frekvenciával kapcsolódnak olyan optimalizált körülmények között, amelyeket az inszertek adapterek segítségével való klónozására optimalizáltak, egy második rezisztenciamarkert klónoztunk a pUX12 vektorba. Amint az az 1. ábrán látható, a pUX12 vektor egy β-laktamáz génnel rendelkezik, és ampicillin elleni rezisztenciát (amp^R) hordoz. Egy második marker klónozásának értelme az, hogy összehasonlíthassuk azoknak a kiónoknak az arányát, amelyek mindkét rezisztenciamarkert tartalmazzák, azoknak a kiónoknak az arányával, amelyek a tipikus klönozási körülmények között önmagukkal záródtak, és ezért csak ampicillinrezisztenciát expresszálnak. A pBR322 plazmidból származó tetraciklinrezisztencia gént (tet^R) a pUX12 polilinkerbe klónozzuk az előzőkben ismertetett adapterek felhasználásával. Egy sor tesztligálást végzünk annak megállapítására, hogy mi az oligonukleotid adapter és a fragmens végek egymáshoz viszonyított optimális koncentrációja, valamint annak megállapítására, hogy a módosított inszertnek és a lineáris pUX12 plazmidnak az optimális aránya a ligáláshoz és transzformáláshoz. A tet^R rezisztenciagént markerként alkalmazva meg tudtuk állapítani a klönozási paramétereket, ezzel az ampicillint tartalmazó lemezen szelektált transzformánsoknak több mint 99%-a hordozza a tet^R-markert is. Tehát az önmagával való záródás frekvenciája nagyon kicsi ebben a rendszerben, és nem szükséges, hogy egy inszertnek a polilinkerben való jelenlétére vizsgáljuk a rendszert, mielőtt egy, a pUX12-ben készült könyvtárat vizsgálnánk át.

Abból a célból hogy igazoljuk a pUX12 polilinkerben levő transzlációs leolvasási keret pozícióját, egy olyan struktúrgént klónozunk, amelynek szekvenciája és terméke ismert, viszont hiányzik a saját promotere. Éne a célra egy mutáns toxgént hordozó plazmidot alkalmazunk [Costa, J. J. et al., Journal of Bacteriology, 148 (1), 124-130 (1981); Michel, J. L. et al., J. Virol., 42, 510-518 (1982)]. A kiválasztott pABC402 plazmidot egyszerre kezeltük Apai és HindlII restrikciós enzimmel [Bishai, W. R. et al., Journal of Bacteriology, 169, 1554-1563 (1987); Bishai, W. R. et al., Journal of Bacteriology, 169, 5140-5151 (1987)]. Az Apai hasítási hely a tox struktúrgénen belül található, az N-terminálishoz közel, a HindlII hasítási hely pedig éppen a Cterminálison kívül található. Ezt az 1,2 kb méretű fragmenst a pABC402 vektor megmaradó 4,1 kb méretű részétől alacsony olvadáspontú agarózon választjuk el.

Abból a célból, hogy a klónozáshoz tompa végeket hozzunk létre, a toxfragmenst T4 DNS-polimerázzal kezeljük. A polimeráz exonukleázaktivitása leemészti az Apai 3’-végeket, a polimeráz aktivitása pedig feltölti a HindlII hasítási hely 5’-túlnyúló végeket [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν. Y.

HU 219 327 Β (1982)]. Ezt a tisztított, tompa végekkel rendelkező fragmenst ligáljuk a pUX12 keverékbe, amely mindhárom leolvasási keretet tartalmazza. Az egyes transzformánsokat izoláljuk, majd restrikciós enzimes elemzéssel átvizsgáljuk, hogy meghatározzuk az inszertek orientációját és leolvasási keretét. Emellett a polilinker/adapter/inszert régiók nukleotidszekvenciáját is meghatározzuk. Mind a hat potenciális orientáció- és leolvasásikeret-kombinációt azonosítjuk. Végezetül az ezekből a kiónokból származó kivonatokat Westemblot segítségével vizsgáljuk át diftériatoxin-ellenes antiszérumok alkalmazásával [Blake, M. S., et al., Analyt. Biochem., 136, 175-179 (1984); Murphy, J. R. et al.,

Curr. Topics Microbiol. and Immunoi., 118, 235-251 (1985)].

A reaktív toxinhoz kapcsolódó fehérjéket csak azokban a kiónokban lehetett kimutatni, amelyek a struktúr5 géneket a helyes orientációban és leolvasási keretben tartalmazzák. Ennek a plazmidnak a jele pUDTAH-1; a polilinker és a tox struktúrgén kezdetének DNS-szekvenciáját az 1. táblázatban mutatjuk be. Az ismertetett szekvencia a pUDTAH plazmidban levő tox’ struktúr10 gén kezdetének szekvenciáját mutatja. A transzkriptumnak a startjele az ATG (lacZ’), GAT-vel kezdődik a pUX12 módosított polilinkere, és GCC-vel kezdődik a tox’-gén helyes transzlációs leolvasási kerete.

1. táblázat

A pUDTAH plazmid szekvenciái

ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGCCCGGG GATCCATTGTGCTGGAAAG CCACC POLILINKER OLIGONUKLEOTID DIFTÉRIA

ATG=LacZ transzlációs ADAPTEREK TOX’ GÉN iniciációs kodon)

2. példa

Kromoszomális DNS tisztítása a Streptococcus B csoportból

Abból a célból, hogy kromoszomális DNS-t tisztítsunk a Streptococcus B csoportból, a Streptococcus B csoport A909 törzséből kromoszomális DNS-t izolálunk [Lancefield, R. C. et al., J. Exp. Med., 142, 165-179 (1975)] Hull és munkatársai módszerével [Hull, R. A. et al., Infect. and Immun. 33, 933-938 (1981)], Rubens és munkatársai módosítását alkalmazva [Rubens, C. E. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 7208-7212 (1987)]. Röviden mutanolizint használunk a Streptococcus B csoport A909 (Ia/c) törzsének protoplasztokká alakítására. A keletkező felületi kivonatról kiderült, hogy számos olyan fehérjét tartalmaz, amely a fertőző baktériumok ellen készített antiszérumokkal reagál immunológiailag. Egy oldhatatlan fehéijefrakciót részlegesen tisztítunk szokványos oszlopkromatográfia alkalmazásával. Két frakciót használunk nyulak immunizálására, ezek közül az egyikben egyetlen 14 kD méretű fehéije van feldúsulva. Azokról az antiszérumokról, amelyeket ezek ellen a részlegesen tisztított Streptococcus B csoport fehéijék ellen állítottunk elő, kiderült, hogy képesek passzív védelmet biztosítani egy egér virulencia vizsgálatban, egy heterológ, a C fehérjét hordozó Streptococcus B csoport kapszulatípus ellen.

A Streptococcus B csoport DNS-ét centrifugálással tisztítjuk cézium-klorid (CsCl) sűrűséggradiensen, majd a kromoszomális DNS-t kimerítően dializáljuk TAE pufferrel szemben (pH=8,0) [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)]. A Streptococcus B csoport A909-es törzsének 1-es típusú kapszulája van, expresszálja a C fehéijéket, és korábban a C fehéijék tanulmányozása során használták [Valtonen, M. V. et al., Microb. Path., 1, 191-204 (1986)]. Szintén ezt a Streptococcus B csoport törzsét használtuk a szűrővizsgálatban alkalmazott védő antiszérum előállítására.

A Streptococcus B csoportból előállított kromoszomális DNS mennyisége 3-5 mg között változik, a Streptococcus B csoport éjszakán át növesztett 500 ml-es tenyészetéből kiindulva. A tisztított DNS-t külön-külön emésztjük 24 általánosan használt restrikciós endonukleázzal, majd a kapott fragmenseket l,0%os agarózgélen futtatjuk. Nagyon különböző enzimeket választunk, beleértve olyanokat is, amelyeknek csak egyetlen hasítási helye található az általánosan használt klónozóvektorok polilinkerében. A gélt etídium-bromiddal (EtBr) festve láthatjuk, hogy mindegyik restrikciós enzim diszkrét fragmensméret-eloszlást eredményez a Streptococcus B csoport DNS-ének emésztésével. Ez azt sugallja, hogy a Streptococcus B csoport DNS-e egyik vizsgált restrikciós enzimnek megfelelően sincs módosítva.

Abból a célból, hogy meghatározzuk, hogy van-e jelen olyan inhibitor, amely gátolja a DNS ligálását, az előzőkben ismertetett restrikciós endonukleázos emésztéseket etanollal kicsapjuk, ligálópufferbe tesszük, majd éjszakán át 14 °C-on DNS-ligázzal inkubáljuk. Ezeket a mintákat ismét 1,0%-os agarózgélen futtatjuk, és etídium-bromiddal festjük. A kapott restrikciós enzimes mintázat magasabb molekulatömeg-eloszlást mutat. Ez azt jelenti, hogy a Streptococcus B csoport DNS-ének ligálását semmi nem gátolja.

3. példa

Könyvtárkészítés a Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-éből

A Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-éből a pUX12 plazmidban könyvtárt készítünk, majd Escherichia coliba transzformáljuk az alábbi leírás szerint. A Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-ének klónozás céljából való hasításához négy olyan restrikciós enzimet választunk, amelyek széles méreteloszlású restrikciós fragmenseket eredményeznek. A pUX12 vektor és az adapterek akkor a leghatékonyabbak, ha tompa végű fragmenseket klónozunk. A választott enzi11

HU 219 327 Β mek négy bázispáros-felismerési hellyel rendelkeznek, és tompa végeket eredményeznek. A Streptococcus B csoport DNS-t részlegesen emésztjük egyenként Alul, FunD2, HaelII és Rsal restrikciós enzimekkel.

A keletkező fragmenseket elegyítjük, fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével tisztítjuk, etanollal kicsapjuk, majd ligálópufferben szuszpendáljuk [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)]. A Streptococcus B csoport DNS-ffagmenseiből egy pg-ot összekeverünk 3 pg 12 tagú, és 2 pg 8 tagú oligonukleotid adapterrel. Három mikroliter T4 DNS-ligázt (New England Biolabs) adunk hozzá, majd a reakcióelegyet éjszakán át 14 °C-on tartjuk. A szabad linkereket elválasztjuk a Streptococcus B csoport DNS-ffagmenseitől egy kálium-acetát sebességi gradiensen [Aruffo, A. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 8573-8577 (1987)].

A mindhárom transzlációs leolvasási keretet tartalmazó pUX12 plazmidot BstXl restrikciós enzimmel emésztjük, majd a kitöltő ffagmenst eltávolítjuk alacsony olvadáspontú agarózgélen. A Streptococcus B csoport könyvtárat úgy állítjuk elő, hogy az adaptált Streptococcus B csoport ffagmensekből 10 ng-ot keverünk össze a lineáris pUX12 vektorral és 100 liter ligálópufferben, amelyhez 0,1% T4 DNS-ligázt adtunk. A ligáló reakcióelegyet éjszakán át 14 °C-on tartjuk, majd Escherichia coli MCI061 törzs transzformálására használjuk ampicillint tartalmazó lemezeken [Ausubel, F. M. et al., Current Topics in Molecular Biology; Greene Publ. Assn./Wiley Interscience, N. Y. (1987)].

A keletkező transzformánsokból tizenhatot izolálunk, éjszakán át növesztünk LB táptalajban, majd kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk. A plazmid DNS-t BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, majd 1,0%-os agarózgélen futtatjuk. Az összes átvizsgált plazmid tartalmaz inszertet a pUX12 vektorban, és az átlagos inszertméret 1,4 kb. Mostanáig több mint 200 klónból állítottunk elő plazmid-DNS-t és vizsgáltunk át, és csak egy olyan kiónt találtunk, amely nem tartalmaz inszertet a polilinkerben.

4. példa

A könyvtár átvizsgálására használt protektiv antiszérum jellemzése

Amint azt az előzőkben tárgyaltuk, a C fehérjéket különböző technikákkal részlegesen tisztítjuk, majd a protektiv antiszérumot különböző módszerekkel részlegesen tisztítjuk, a protektiv antiszérumokat számos kutató előállította [Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Immunoi. Scand. Sect. B, 93, 121-124 (1985); Russell-Jones, G. J. et al., J. Exp. Med., 160, 1476-1484 (1984); Wilkinson H. W. et al., Infec. and Immun., 4, 596-604 (1971)].

Sok kísérletet végeztünk, hogy megismételjük Valtonen, Kasper és Levy munkáját, akik egy 14 000 D molekulatömegű fehérjét izoláltak az olyan Streptococcus B csoport felülúszóiból, amelyek protektiv antitestek képződését okozzák [Valtonen, Μ. V. et al.,

Microb. Path., 1, 191 -204 (1986)], amely publikációt a későbbiekben referenciaként említünk. Ez a kísérlet felfedte, hogy ha a Streptococcus B csoport tenyészeteinek felülúszóihoz a C fehéijék töményítése és tisztítása előtt proteolitikus inhibitorokat adunk [Wong, W. W. et al., J. Immunoi. Methods, 82, 303-313 (1985)], akkor a 14 000 D molekulatömegű fehéije nem domináns fehéije a felülúszóban. Ez azt mutatja, hogy ez a fehérje nagyobb molekulatömegű C fehéijék proteolíziséből származik, amelyek a Streptococcus B csoport tenyészetek felülúszóiban fordulnak elő.

5. példa

A körülmények optimalizálása egy plazmidalapú vektorban való expresszióhoz

Amint azt az előzőkben tárgyaltuk, az expresszió kimutatására legszélesebb körben alkalmazott vektorok a lambda GTll-en alapulnak [Young, R. A. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 80, 1194-1198 (1983)]. Képesek vagyunk megnövelni az expresszió kimutatását a pUX12 plazmidvektorról oly módon, hogy kombinálunk két korábban ismertetett eljárást a baktériumtelepek antitestekkel való screenelésére. A könyvtárban levő transzformánsokat szélesztjük, majd éjszakán át inkubáljuk, és a kapott telepeket nitrocellulóz szűrőlapokra átvisszük (Bio-Rad). A telepeket lizáljuk oly módon, hogy a szűrőket egy zárt edényben kloroformmal (CHC1₃) telített atmoszférába tesszük 30 percre. A szűrőlapokat ezután egy feltáró pufferbe tesszük, majd éjszakán át inkubáljuk Helfman és munkatársai leírása szerint [Helfman, D. M. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 80, 31-35 (1983)]. Az antitest-szűrővizsgálatot oly módon végezzük, hogy kereskedelmi forgalomban levő Escherichia coli lizátumot (1:200 arányban), majd tormaperoxidázzal konjugált, affinitás-tisztított kecskeanti-nyúl IgG-t (1:3000 arányban) használunk az Express-Blot Kit-ben, amelyet a Bio-Rad Laboratories-tól vásárolunk. A telepeket kloroformmal előkezelve, majd éjszakán át DN-ázzal és lizozimmel kezelve lehetséges volt a szükséges primer antitestek arányát 1:500ról 1:5000-re csökkenteni.

6. példa

A pozitív klánok és fehérjetermékeik kezdeti elemzése

A Streptococcus B csoport DNS-ének a pUX12 vektorban előállított könyvtárát az előzőkben említett protektiv anti-C fehérje antiszérumokkal vizsgáljuk. A Streptococcus B csoport könyvtár átlagos fragmens mérete 1,4 kb. A transzformánsokat az előzőkben leírt módon vizsgáljuk, majd szubklónozzuk, és az antiszérummal háromszor újra vizsgáljuk. A levizsgált 20 000 kiónból 35 függetlenül izolált olyan klón volt, amely a protektiv antiszérummal reagált. A kiónok az S1-S35 jelzést kapják, majd a kiónokat tartalmazó plazmidokat pJMSl és pJMS35 jelzéssel látjuk el. A kiónok mérete 0,9 és 13,7 kb között változik, átlagos méretük 4,5 kb.

A klónokból plazmid-DNS-t izolálunk a miniprepmódszerrel, majd az inszerteket négy restrikciós endo12

HU 219 327 Β nukleázzal vizsgáljuk. A kiónok közül tizennégy három csoportba osztható azon az alapon, hogy azonos az inszertméretük, és közös a restrikciós endonukleázzal kapott mintázatuk az egyes csoportokon belül. Az SÍ és S23 kiónokról kiderült (az alábbiakban tárgyaljuk), hogy különböző csoportokba tartoznak.

Az egyes kiónok restrikciós mintázatának további összehasonlításával lehetséges volt 24 olyan klón azonosítása, amelyek restrikciós mintázata azonos volt. Az SÍ és S23 kiónok egyik-másik kiónnal sem tartalmaznak közös restrikciós fragmenst.

A kiónokból kivonatokat készítünk, Westem-blotokat végzünk velük, és a könyvtár screenelésében használt antiszérumokkal vizsgáljuk. A fehérjeantigének hat méretosztályát tudtuk azonosítani (A-F). A restrikciós endonukleázos térképezésből származó adatokat és a Westem-blotból származó adatokat kombinálva lehetséges a 35 kiónból 24-et hat különböző fehérjeantigén-mintázatba sorolni (2. táblázat). Ezt a kezdeti besorolást csak azért végeztük el, hogy az érintett gének lehetséges számára egy durva becslést kapjunk. Az Síről kiderült, hogy mérete 3,5 kD, és az A mintázatú antigénfehéijék közé tartozik. A S23-ról kiderült, hogy mérete 13,7 kD, és a D mintázatú antigénfehérjék közé tartozik.

2. táblázat

A Streptococcus B csoport C fehérjeklónok előzetes osztályozása

Fehérje profil	A kiónok száma	Az inszert molekulatömege (kb)	A DNS-in- szert kódoló kapacitása	Az antigén mérete (D)
A	6	3,5	136 000	115 000
B	3	1,9	76 000	50 000
C	7	4,4	174 000	130 000
D	6	13,7	>500 000	110 000
E	1	1,7	67 000	50 000
F	1	0,9	36 000	15 000

Ha a kiónokból készült kivonatok Westem-blotjait egy olyan Streptococcus B csoport törzse ellen készült antiszérummal mint próbával vizsgáljuk, amelyik nem expresszálja a C fehérjéket, akkor csak az egyik klóncsoport pozitív (a B fehérje profilú). Ez azt jelzi, hogy a pozitív kiónok olyan fehérjéket expresszálnak, amelyek csak a C fehérjéket hordozó törzsekre jellemzőek; ezek a fehérjék nem közösek az összes Streptococcus B csoport törzsben.

7. példa

A klónozott DNS-szekvenciák jellemzése

A Streptococcus B csoport által expresszált C fehérjék aktuális száma nincs meghatározva. A C fehérje jellemzésére Brady és munkatársai által folytatott legfrissebb immunológiai vizsgálatok szerint a C. D. C.-ből származó tipizáló antiszérumok négy különböző antigént azonosítottak [Brady, L. J. et al., Journal of Infectious Diseases, 158 (5), 965-972 (1988)]. A Streptococcus B csoport feltételezett C fehérje kiónjainak előzetes genetikai és immunológiai vizsgálata azt sugallja, hogy azokon a Streptococcus B csoportba tartozó törzseken, amelyekről ismert, hogy a C fehérjét hordozzák, négy vagy öt gén kódolja a fehérjéket. Két kísérletsorozatot végeztünk annak meghatározására, hogy a klónozott géntermékek C fehérjéket képviselnek-e.

Amint azt az előzőkben tárgyaltuk, a C fehérjék vizsgálata két fenotípust határozott meg: az egyik csoportba tartozó fehérjék érzékenyek a pepszines lebontásra, de nem érzékenyek tripszinre (ezeket TR vagy α jelöléssel láttuk el), míg a másik csoportba tartozó fehérjék érzékenyek mind a tripszines, mind a pepszines lebontásra (ezeket TS vagy β jelöléssel láttuk el) [Johnson, D. R. et al., J. Clin. Microbiol., 19, 506-510 (1984); Russell-Jones, G. J. et al., J. Exp. Med., 160, 1476-1484 (1984)].

A tipizáló antiszérumokat, α-t és β-t használjuk a klónozott géntermékek Westem-blottal való átvizsgálása során [Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Immunoi. Scand. Sect. B, 87, 51-54 (1979); Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Immunoi. Scand. Sec. B., 89, 205-209 (1981); Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Immunoi. Scand. Sec. B., 91, 231-234 (1983); Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Immunoi. Scand. Sec. B., 93, 113-119 (1985); Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbiol. Immunoi. Scand. Sec. B., 93, 121-124 (1985)], amely publikációkat a későbbiekben referenciaként használjuk.

Az α tipizáló szérum azonosítja a D profilú fehérjét, míg a 8 tipizáló szérum azonosítja az A profilú fehérjét. Ezeket a fehérjéket pepszines és tripszines emésztésnek vetjük alá. A D profilú fehérje érzékeny pepszinre, de nem érzékeny tripszinre, míg az A profilú fehérje érzékeny mind pepszinre, mind pedig tripszinre. Ezek az eredmények összecsengenek az előző vizsgálatokkal, és megerősítik, hogy a C fehérjegének közül legalább kettőt klónoztunk.

A C fehérjék legfontosabb és jellemző tulajdonsága az a képesség, hogy protektív antitestek képződését tudják indukálni a C fehérjéket expresszáló Streptococcus B csoportba tartozó törzsek ellen. Számos megközelítés használható a klónozott géntermékek elleni antiszérumok előállítására. Például az Escherichia coli kiónok lizátumait közvetlenül nyulakba injekciózhatjuk annak meghatározására, hogy a lizátumok tartalmaznak-e olyan fehérjéket, amelyek képesek antitestek képződését indukálni bármely Escherichia coli vagy bejuttatott Streptococcus B csoport fehérje ellen. A keletkező antiszérumat előabszorbeálhatjuk egy Escherichia coli lizátummal, mielőtt levizsgáljuk, hogy csökkentsük a keresztreakciókat adó antitestek számát. Egy ilyen lizátumot arra lehet használni, hogy csökkentsük a keresztreakciót adó antitestek számát mind az expressziós kiónok vizsgálatára végzett telephibridizációk során, mind azokban a Westem-blotokban, amelyeket arra használunk, hogy mind a Streptococcus B csoport sejkivonatokat, mid a részlegesen tisztított Streptococcus B csoport fehérjéket tanulmányozzuk.

HU 219 327 Β

Az A profilú fehérje, a B profilú fehérje és a D profilú fehérje jellemző kiónjait ultrahanggal feltárjuk, majd nyulakba injekciózzuk, hogy a klónozott Streptococcus B csoport fehérjeantigének ellen antiszérumot termeljünk [Lancefield, R. C. et al., J. Exp. Med., 142, 165-179 (1975); Valtonen, Μ. V. et al., Microb. Path., 1, 191-204 (1986)]. A kontrollnyulakat olyan Escherichia colival injekciózzuk, amely az inszert nélküli pUX12-t tartalmazza. Az antiszérumot előabszorbeáljuk egy Escherichia coli lizátummal, majd először Westem-blotokkal vizsgáljuk a könyvtárban levő kiónok kivonataival szemben. Ezért lehetséges meghatározni, hogy van-e keresztreakciót adó epitóp a kiónokban, és megerősíteni azt, hogy ezek az antiszérumok közvetlenül azok ellen a klónozott fehérjék ellen irányulnak, amelyeket a vizsgálatoknak egy korábbi fázisában azonosítottunk.

Másképpen az előadszorbeált antiszérumokat levizsgálhatjuk az egér-védőmodellben. Ebben a klasszikus modellben az egereket intraperitonálisan injektáljuk nyúl antiszérummal [Lancefield, R. C. et al., J. Exp. Med., 142, 165-179 (1975)]. A következő napon ismét injekciózzuk őket intraperitonálisan olyan élő Streptococcus B csoportba tartozó mikroorganizmussal, amelyről tudjuk, hogy C fehérjéket hordoznak, a mikroorganizmusok mennyisége LD^,. A végpont az egerek pusztulása egy 48 órás periódus során.

Abból a célból, hogy megvizsgáljuk a klónozott génszekvenciák által expresszált fehérjék immunogenitását, a pJMSl és pJMS23 plazmidokat tartalmazó Escherichia coli sejteket elszaporítjuk, majd sejtkivonatot készítünk belőlük. Majd ezeket a sejtkivonatokat használjuk nyulak immunizálására. Az SÍ és S23 kivonatokkal való immunizálásra keletkező antiszérumokat vizsgáljuk meg az egér-védőmodellben.

Miután az egér-védőmodell-kísérletet elvégeztük az A profilú fehéijét és a D profilú fehérjét képviselő kiónok (SÍ és S23) elleni antiszérumokról kiderült, hogy mindegyiknek van védőhatása. A C profilú fehérjét képviselő klón elleni antiszérumnak nem volt védőhatása, és a kontroll-antiszérumoknak sem. A C profilú fehérjét expresszáló kiónok ellen előállított antiszérum kötődik az azokból a Streptococcus B csoportbeli törzsekből készített sejtkivonatokhoz is, amelyek nem hordozzák a C fehérjét, azaz a kiónoknak ez a csoportja nem kódol C fehérjét. Összefoglalva a kiónok hat csoportjából öt nem kódol olyan fehérjéket, amelyek csak azokra a Streptococcus B csoportbeli törzsekre jellemzők, amelyek C fehérjét expresszálnak.

A két klóncsoport kezdeti biokémiai, immunológiai és funkcionális elemzése azt mutatja, hogy legalább két C fehérjegént (SÍ és S23) sikerült klónozni. Ez az első igazolása annak, hogy a Streptococcus B csoportból klónozott egyetlen polipeptid géntermék képes protektív immunitást kelteni. Az SÍ elleni antitestekről kiderült, hogy képesek az A909 sejtkivonat két csíkjához kapcsolódni az 50 és 60 kD értéknél. Az S23 antitestekről kiderült, hogy képesek egy szabályszerűen ismétlődő csíkmintázathoz kapcsolódni a Streptococcus B csoport felület sejtkivonatában, aminek a mérete > 180 kD és 40 kD között van. Az A909 sejtkivonatból származó egy monoklonális antitest ugyanezt az ismétlődő mintázatot mutatja az immunreaktivitás alapján. Ez azt jelzi, hogy egyetlen epitopot ismernek fel a különböző molekulatömegű fehérjékben, és ez egy szabályosan ismétlődő szerkezetet sugall. Az SÍ antiszérum által felismert fehérjék érzékenyek pepszinre és tripszinre, míg az S23 antiszérum által felismert fehérjék csak pepszinre érzékenyek, tripszinre nem. Ez a kísérlet azt mutatja, hogy ezek, a Streptococcus B csoportból részlegesen tisztított és a Streptococcus B csoport klónozott génjeiről expresszált fehérjék jelentik a Streptococcus B csoport C fehérjéinek alfa és béta antigénjeit.

Az előzőkben ismertetett 35 potenciális C fehérjeklón mind genetikailag, mind immunológiailag értékelhető, hogy meghatározzuk a jelen levő gének számát. Emellett ezeknek a kiónoknak az izolálása lehetővé teszi, hogy azonosítsuk azokat a géneket, amelyek protektív immunitást biztosítanak a Streptococcus B csoport ellen. Valószínű, hogy a kezdeti kiónok azonosítására használt antiszérumok is kimutattak a C fehérjéktől eltérő fehérjéket. Az ezeknek a fehérjéknek a Streptococcus B fertőzés elleni terápiában való felhasználását is megcélozza a jelen találmány. Mivel a jelen találmány fő célja azoknak a fehérjéknek az izolálása és azonosítása, amelyek az immunitásban szerepet játszanak, az ezek által a kiónok által expresszált fehérjék ellen készített antiszérumok vizsgálhatók az egér-védőmodellben. Azok a gének, amelyek protektív fehérjét expresszálnak, a konjugált vakcinában előnyösen használt fehérjét expresszálnak.

Amint azt az előzőkben tárgyaltuk, a Streptococcus B csoport kromoszomális DNS Escherichia coli/pUX12 vektor könyvtárban való kezdeti szűrővizsgálata protektív antiszérumokkal 35 függetlenül izolált kiónt eredményezett. A klónozott ffagmensek restrikciós endonukleázos térképezéséből származó adatokat és a kiónokból származó sejtkivonatok Westem-blotjából származó adatokat kombinálva lehetséges volt a 35 klónból 24-et előzetesen 6 különböző antigénmintázattal rendelkező csoportba sorolni (2. táblázat). Ez a vizsgálat tette lehetővé, hogy az izolált gének lehetséges számát meghatározzuk.

Az ilyen telepek jellemzésére előnyösen telephibridizációt alkalmazunk, hogy meghatározzuk, mely kiónokban találhatók közös DNS-szekvenciák. Az ilyen blothoz az egyes klónokból egyetlen telepet teszünk LB táptalajt tartalmazó mikrotiterlukba, majd éjszakán át 37 °C-on növesztjük. A kontrolltelep lehet az Escherichia coli gazdaszervezet, valamint a pUX12-t tartalmazó Escherichia coli törzs. Az éjszakán át növesztett tenyészeteket egy nitrocellulóz szűrőlapra visszük át, amely szűrőlap szintén LB táptalajt tartalmazó agarlemezen van. Ezeket a lemezeket 8 óra hosszat 37 °C-on növesztjük, majd a frissen kinőtt telepeket tartalmazó nitrocellulóz lapokat feldolgozzuk, hogy átvizsgálhatok legyenek DNS-DNS hibridizálással. A próbákat a pUX12 könyvtárban található Streptococcus B csoport DNS-inszertekből készítjük. A klónokból kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk. A pUX12 plaz14

HU 219 327 Β midban a polilinkerben az inszert mindegyik oldalán található BamHI és BstXl hasítási hely, ezért a Streptococcus B csoport inszertet a plazmidból mind BamHI, mind BstXl restrikciós enzimmel ki lehet hasítani. Szerencsére a Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-e kevés BamHI csoportot tartalmaz, és a vektorból a legtöbb inszert eltávolítható egyetlen ffagmens formájában a BamHI-es emésztés következtében. A plazmidvektor és az inszert elválasztásához alacsony olvadáspontú agarózt használunk. Az inszerteket kivágjuk az agarózgélből, és közvetlenül jelezzük a random primer jelzési módszerrel. Ennek eredménye azoknak a kiónoknak az azonosítása, amelyek közös DNS-szekvenciákat tartalmaznak.

így a fentiekben ismertetett telephibridizálásból kapott információk alapján a 35 kiónt azonos DNS-szekvenciákat tartalmazó csoportokra lehet osztani. Ezeket a csoportokat többszörös restrikciós endonukleázos emésztéssel térképezzük, hogy meghatározzuk az egyes kiónok közötti kapcsolatot az adott DNS-régión belül. Mivel a gazda plazmid, a pUX12 számos restrikciós hasítási helyet tartalmaz a polilinkerben, ezért a restrikciós térképezés legnagyobb része a miniprep-eljárással előállított plazmidpreparátumokkal elvégezhető anélkül, hogy szükség lenne az inszertek izolálására és tisztítására. A telephibridizálási adatokat az alapos restrikciós térképezéssel kombinálva lehetséges az érintett genetikai lokuszok számának hozzávetőleges felmérése. Ha a kiónok egyik-másik csoportja nem képvisel egy számunkra érdekes gént teljes egészben, akkor ezeket a kiónokat lehet arra használni, hogy a génekből még teljesebb kópiákat izoláljunk a kromoszómakönyvtárból. Azonban az eredetileg izolált 35 klón nagy átlagos inszerteloszlását figyelembe véve valószínű, hogy néhány teljes nyílt leolvasási keretet tartalmaz.

Mielőtt a genetikai elemzéssel továbbhaladunk, előnyösen antiszérumot készítünk a klónozott géntermékek ellen, és az egér-védőmodellben használjuk annak meghatározására, hogy ezek az antiszérumok képesek-e a Streptococcus B csoport által okozott fertőzések kivédésére [Lancefield, R. C. et al., J. Exp. Med., 142, 165-179 (1975); Vallonén, Μ. V. et al., Microb. Path., 1, 191-204 (1986)].

Az a klón, amely által expresszált fehéije képes protektív antitesteket indukálni, az egy előnyös jelölt egy konjugált vakcinában való alkalmazásra. Azokat a kiónokat, amelyek által expresszált fehérjék nem indukálnak védő antitesteket, tovább elemezhetjük, hogy alkalmazhatók-e egy vakcinában. Mivel a C fehérjék a membránhoz kötődnek, az, hogy egy klón által expresszált fehéije nem képes védő antitesteket indukálni, esetleg azt a tényt tükrözi, hogy a fehéije nem stabil Escherichia coliban vagy egy magas kópiaszámú vektorban. Ez a probléma fordult elő más, mind az A, mind a B csoportba tartozó Streptococcus membránfehéijék klónozása esetében [Kehoe, M. et al., Infect. and Immun., 43, 804-810 (1984); Schneewind, O. et al., Infec. and Immun., 56, 2174-2179 (1988)]. Az előzetes vizsgálatok során izolált 35 klón közül néhány csekély telepmorfológiát mutat. Emellett ezek közül a kiónok közül néhány instabil, és kiderült, hogy a pUX12 polilinkerból kihasítja a Streptococcus B csoport DNS-inszert egy részét. Létezik néhány technika, amelyet ezeknek a kiónoknak a stabilizálására lehet használni; ilyen például egy alacsony kópiaszámú vektorba való klónozás vagy egy lefojtható promoter mögé való klónozás (a kiónokat 30 °C helyett 37 °C-on növesztjük), egy olyan vektorban való klónozás, amelyet arra a célra készítettek, hogy membránfehéijéket akkumuláljon. Emellett lehetséges, hogy a plazmidokat egy olyan Escherichia coli gazdaszervezetbe transzformáljuk (pcnB-be), amely korlátozza a pBR322 eredetű plazmidok (például a pUX12) kópiaszámát [Lopilato J. et al., Molecular and General Genetics, 255, 285-290 (1986)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként említjük.

Ha kiderül, hogy egy klón nem képes protektív antitesteket indukáló fehérjét expresszálni, ez jelezheti azt is, hogy az expresszált fehéréből hiányzik egy olyan epitop, amely fontos a védelem szempontjából. Ez az az eset lehet, amikor nem klónoztuk a teljes gént, illetve nem tudjuk Escherichia coliban expresszálni. Az is problémát jelenthet, ha a Streptococcus B csoportban a C fehérjék poszttranszkripciós processzáláson esnek át, míg a klónozott C génekkel ez nem történik meg Escherichia coliban. Szükséges lehet, hogy vagy szubklónozzuk a teljes gént és/vagy átvigyük egy gazdaszervezetbe, ahol expresszálható.

Ha kiderül, hogy egy klón nem képes protektív antitesteket indukáló fehérjét expresszálni, ez jelezheti azt is, hogy az Escherichia coliban termelt antigének elleni antitestek eltérnek azoktól az antitestektől, amelyeket a Streptococcus B csoportba tartozó mikroorganizmusok C fehérjék ellen termel egy állat. Emellett a nyulak immunizálására használt baktérium sejtkivonatok számos Escherichia coli antigént tartalmaznak. Ezért lehet szükséges hogy az állatmodellben való vizsgálathoz az antiszérumokat részlegesen tisztított géntermékről állítsuk elő, és ne a teljes mikroorganizmusról.

A Streptococcus B csoport fehéqék bármely klónozott csoportját, amely képes protektív antitestek képződését kiváltani, nevezhetjük C fehéijéknek. Az ebben a kísérletsorozatban alkalmazott antiszérumok használhatók ezeknek a fehéijéknek a lokalizálására.

8. példa

A C fehérje génjeinek térképezése, jellemzése és szekvenciájának meghatározása

Abból a célból, hogy a C fehéije génjeit tovább jellemezzük, az előzőkben leírt C fehérjegén-klónoknak egy finom szerkezetű genetikai térképét állíthatjuk elő, és DNS-szekvenciáját(it) meghatározhatjuk. Az ilyen térképezést előnyösen genomiális Southem-blottal végezhetjük. A C fehérje génjei DNS-szekvenciájának meghatározásával meghatározhatjuk a gének szerkezetét, beleértve a riboszomális kötőhelyeiket, a potenciális promotereiket, szignálszekvenciákat és bármely szokatlan ismétlődő szekvenciát. A DNS-szekvenciákat előnyösen egy ismert DNS-szekvenciákat tartalmazó könyvtárral hasonlítjuk össze, hogy lássuk, van-e ho15

HU 219 327 Β mológia más, már jellemzett génekkel. Emellett a C fehérjék aminosavszekvenciáját is meghatározhatjuk a génjeik DNS-szekvenciájából. Gyakran lehet becsléseket tenni a fehéije szerkezetére, funkciójára és sejtbeli lokalizációjára a fehérje szekvenciája alapján.

A genomiális Southem-blotokat előnyösen használhatjuk arra is, hogy meghatározzuk, bármely gének között létezik-e kapcsolat. Ennél a technikánál a Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-t egyenként emésztjük különböző olyan restrikciós endonukleázokkal, amelyek hat vagy több bázispárt tartalmazó szekvenciát ismernek fel. Ennek az a célja, hogy nagyobb kromoszomális DNS-szekvenciákat kapjunk, amelyek egynél több gént hordozhatnak. Az egyes endonukleázos emésztéseket ezután agarózgélen futtatjuk, és nitrocellulóz membránra visszük át. A Southemblotokat azután az előzőkben ismertetett könyvtárból származó jelzett inszertekkel mint próbákkal vizsgáljuk át. Ha két klónról a telephibridizálások vagy a kromoszomális csíkokhoz kötődő endonukleázos térképezés alapján nem derül ki, hogy közük van egymáshoz, ez azt jelzi, hogy vagy ugyanannak a génnek a részei, vagy két olyan gént, amelyek a kromoszómán szoros közelségben találhatók. Mindegyik esetben számos lehetőség van arra, hogy ezeket a nagyobb fragmenseket szubklónozzuk a további vizsgálatok céljára. Az egyik ilyen technika egy kozmid könyvtár készítése a Streptococcus B csoport DNS-éből, és ennek átvizsgálása az egyik érdekes próbával történő hibridizálással. Ha egy olyan kiónt kapunk, amely két vagy több, számunkra érdekes gént tartalmaz, akkor erről endonukleázos térképet készíthetünk, és vizsgálhatjuk a protektív antigének expresszióját, amint azt az előzőkben ismertetett klónoknál leírtuk.

Az előzőkben ismertetett kiónok azonosítása lehetővé teszi DNS-szekvenciájuk azonosítását. Ha a kiónok a pUX12 plazmidon találhatók, akkor lehetséges kétszálú DNS-szekvenálást alkalmazni reverz transzkriptáz enzimmel, a polilinkerhez készített oligonukleotid indítómolekulák felhasználásával. Ezt a technikát korábban alkalmazták a pUX12 plazmid jellemzésénél. Ez egy gyors módszer 600 bázispámál nagyobb gén szekvenciájának meghatározására újabb oligonukleotid indítómolekulák felhasználásával. Ezért a C fehérje génjeinek szekvenálását előnyösen úgy végezzük, hogy egy Ml 3as, egyszálú DNS-szekvenáló rendszerbe szubklónozzuk [Ausubel, F. M. et al., Current Topics in Molecular Biology; Greene Publ. Assn./Wiley Interscience, N. Y. (1987)].

A C fehérjék DNS-szekvenciáinak felderítése számos információval szolgál a gének szerkezetét, funkcióját és szabályozását illetően, valamint a fehéijetermékeikről. Amint azt a korábbiakban tárgyaltuk, a különböző kutatók által izolált C fehérjék méretének heterogenitása, valamint antigén diverzitásuk látszólagos diverzitása egy géncsalád létét sugallja, vagy pedig egy olyan poszttranszlációs mechanizmus létét, amely a C fehérjék génjeinek termékét módosítja [Ferrieri, P. et al., Infect. Immun., 27, 1023-1032 (1980)]. A Streptococcus A csoport M fehérjéjét tárgyaltuk korábban mint ennek a jelenségnek egy példáját [Scott, J. R. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 1822-1826 (1985)]. Jóllehet az M fehéije DNS-szekvenciája nem mutat homológiát a Streptococcus B csoport kromoszomális DNS-sel hibridizáció alapján, létezhet strukturális homológia DNS-szekvenciáik között [Hollingshead, S. K. et al., Journal of Biological Chemistry, 261, 1677-1686 (1986); Scott,

J. R. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 1822-1826 (1985); Scott, J. R. et al., Infec. and Immun., 52, 609-612 (1986)]. A C fehérjék DNS-szekvenciáit előnyösen ismert DNS-szekvenciák könyvtárával hasonlítjuk össze. Emellett a DNSszekvenciákból származó aminosavszekvenciákat ismert aminosavszekvenciákat tartalmazó könyvtárral hasonlítjuk össze.

9. példa

A C fehérje génjeinek elterjedtsége

A C fehéije génjei elterjedtségének meghatározásához a Streptococcus B csoport klinikai és laboratóriumi izolátumainak különböző szerotípusait vizsgálják genomiális Southem-blottal a C fehéijék génjeit használva próbaként. Emellett a precipitintechnikákkal meghatározott fenotípusos expresszió összehasonlítása a DNSDNS hibridizációval meghatározott genetikai összetétellel információt ad a C fehéijegének expressziójának szabályozásáról. A C fehéijegéneket használjuk a más típusú Streptococcusból vagy más baktériumpatogénekből származó kromoszomális DNS átvizsgálására.

A próbákat a Streptococcus B csoport olyan izolátumainak C fehérjegénjeiből készítjük és (jelezzük), amelyek a Lancefield által használt eredeti tipizáló törzsek legnagyobb részét tartalmazzák. [Lancefield, R. C. et al., J. Exp. Med., 142, 165-179 (1975).] A Streptococcus B csoport 24 klinikai és laboratóriumi izolátumának telepblotjait az előzőkben leírt mikrotitertechnika alkalmazásával vizsgáljuk át. A különböző géneknek azt a tulajdonságát, hogy miképpen hibridizálnak a C fehéijegénjeihez azután ezeknek a mikroorganizmusoknak azzal a fenotípusos tulajdonságával hasonlítjuk össze, hogy miképpen kötődnek a C fehérjék elleni tipizáló antiszérumokhoz. Ily módon meg lehet határozni, hogy mely törzsek hordozzák a C fehéije génjeit vagy egy részüket, és azt, hogy néhány törzs tartalmazza-e ezeknek a géneknek a csendes vagy kriptikus kópiáit.

Azokat a törzseket, amelyek telephibridizálás során a C fehérje génjeihez hibridizálódnak, ezután genomiális Southem-blottal vizsgáljuk át, hogy meghatározzuk a C fehéije génjeinek méretét, szerkezetét és lokalizációját. A telephibridizálás során kötődést mutató Streptococcus B csoport törzsekből származó kromoszomális DNS-t restrikciós endonukleázokkal emésztjük, majd agarózgélen futtatjuk, és nitrocellulóz membránra blottoljuk. Ezeket a Southem-blotokat vizsgáljuk a C fehéije génjeivel mint próbákkal. Ily módon lehetséges annak meghatározása, hogy van-e különbség ezeknek a géneknek a lokalizációjában és méretében a Streptococcus B csoport különböző fenotípusai között, és összehasonlíthatjuk a klinikai (azaz potenciálisan vi16

HU 219 327 Β rulens) izolátumokat a laboratóriumi törzsekkel (azaz azokkal, amelyek klinikailag kolonializálnak, de nem kapcsolódnak fertőzéshez).

A C fehéqegén-próbákat előnyösen használhatjuk még más Streptococcus törzsek és más patogén baktériumok átvizsgálására. A Streptococcus törzsekről közismert, hogy más, a virulenciához kapcsolódó fehérjéket, beleértve az M és G fehérjéket is megosztanak egymással [Fahnenstock, S. R. et al., Journal of Bacteriology, 167 (3), 870-880 (1986); Heath, D. G. et al., Infec. and Immun., 56, 1223-1238 (1987); Scott, J. R. et al., Infec. and Immun., 52, 609-612 (1986); Walker, J. A. et al., Infec and Immun., 55, 1184-1189 (1987)], amely publikációkra a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. A vizsgálandó törzseket először telephibritizációval vizsgáljuk át annak meghatározására, hogy tartalmaznak-e a C fehérjegének próbáival homológ szekvenciákat. Ezután genomiális Southem-blotokat készítünk azoknak a baktériumtörzseknek a kromoszomális DNS-eivel, amelyek a telephibridizálásnál pozitívnak bizonyultak. Ezeket a biotokat azután a C fehérje génjeivel mint próbákkal vizsgáljuk át, hogy meghatározzuk a homológra területeit, például a C fehérje azon régióit, amelyek membránhorgonyzó szereppel rendelkeznek, az immunoglobulinok Fc-régióihoz kötődnek, vagy egyéb, a baktériumokban hasonló szerepet játszó génekkel homológ részeket tartalmaznak.

10. példa

A C fehérjegének módosítása a Streptococcus B csoportban

Számos potenciális, a virulenciához kötődő tulajdonságot tulajdonítanak a C fehérjéknek, beleértve az opszonizáció (falósejtek működése) és a fagocitózist követően az intracelluláris pusztulás gátlását [Payne, N. R. et al., Journal of Infectious Diseases, 151, 672-681 (1985); Payne, N. R. et al., Infection and Immunity, 55, 1243-1251 (1987)]. Ahhoz hogy jobban megismerjük a C fehérjéknek a virulenciában játszott szerepét, izogenikus törzseket készítünk, amelyekben a C fehérjegéneket egyenként mutagén kezelésnek vetjük alá. Ezeket a törzseket vizsgáljuk a virulencia szempontjából újszülött patkánymodellen [Zeligs, B. J. et al., Infec. and Immun., 37, 255-263 (1982)]. Két módszer használható izogéntörzsek készítésére annak érdekében, hogy a C fehérjék szerepét tisztázzuk a Streptococcus B csoport virulenciájában. Előnyösen a Tn916 önkonjugatrv transzpozont használhatjuk a transzpozon mutagenezisre. Egy másik módszer szerint helyspecifikus mutagenezist is használhatunk. Mivel a Streptococcus B csoportban hiányoznak a hatékony módszerek a genetikai manipulációhoz, ezért szükséges új genetikai technikák kifejlesztése a Streptococcus B csoportban levő gének módosítására, és a virulencia tanulmányozásához izogén törzsek készítésére [Lopillato, J. et al., Molecular and General Genetics, 205, 285-290 (1986)], amely publikációra a továbbiakban referenciaként hivatkozunk.

A transzpozon inszerciós mutagenezis egy általánosan használt technika olyan izogén törzsek készítésére, amelyek a virulenciához kapcsolódó antigének expreszsziójában különböznek, és ennek alkalmazását a Streptococcus B csoportnál alaposan ismertették [Caparon, M. G. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 8677-8681 (1987); Rubens, C. E. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84. 7208-7212 (1987); Wanger, A. R. et al., Rés. Vet. Sci., 38, 202-208 (1985); Weiser, J. N., Trans. Assoc. Amer. Phys., 98, 384-391 (1985)], amely publikációra a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. Ruben és munkatársai igazolták a Tn916 használhatóságát a Streptococcus B csoport kapszulájának vizsgálatában [Rubens, C. E. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 7208-7212 (1987)]. A Tn916, önkonjugációra képes transzpozon a Streptococcus faecalis törzsből vihető be a Streptococcus B csoportba, amint azt már közölték [Wanger, A. R. et al., Rés. Vet. Sci., 38, 202-208 (1985)], amely publikációra a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. A törzseket a megszerzett antibiotikumrezisztencia alapján szelektáljuk, majd telephibridizációval vizsgáljuk abból a szempontból, hogy hiányzik-e belőlük a C fehérje expressziója, amint azt az előzőkben leírt módon készített specifikus antiszérumokkal kimutattuk. Azokat az izolátumokat, amelyek láthatólag nem expresszálják a C fehéqéket, tovább térképezhetjük genomiális Southem-blotok felhasználásával, hogy lokalizáljuk az inszerciót a C fehérjegénekben. Az eredeti Tn916 törzs tetraciklinrezisztenciát hordoz, újabban azonban eritromicinrezisztenciát klónoztak a Tn916-ba [Rubens, C. E. et al., Plasmid, 20, 137-142 (1988)]. Szükséges annak igazolása, hogy a Tn916 transzpozonnal végzett mutagenezis után a mutáns törzs csak egyetlen transzpozont tartalmaz, és a transzpozon a C fehérjegénben található.

Ezeknek a technikáknak az alkalmazása a C fehérje génjeinek a Streptococcus B csoportból célra törő, hacsak a C fehérjegének nem szükségesek a Streptococcus csoport túléléséhez. Leírtak azonban olyan Streptococcus B csoportba tartozó törzseket, amelyekből hiányzik a kimutatható C fehérje, és az is szokatlan, hogy egy baktérium virulencia determináns in vitro körülmények között a túlélés egy lényeges génje legyen. A Tn916 transzpozon egy további, vizsgálandó felhasználása a C fehéijegének potenciális szabályozóelemeinek azonosítása.

Abban az esetben, amikor specifikusan meghatározott mutánsokra van szükség, vagy ha a C fehérje génje fontos a Streptococcus B csoport életképessége szempontjából, akkor a helyspecifikus mutagenezis technikáját alkalmazhatjuk (például kondicionális mutánsok előállítására). Tehát a helyspecifikus mutagenezis használható a Streptococcus B csoport genetikai analízisére. A probléma, amely késleltette ezeknek a technikáknak a kifejlődését a Streptococcus B csoportban, az a Streptococcus B csoport transzformációjának nehézsége. Az egyébként nehezen transzformálható baktériumoknál az elektroporáció bizonyult használhatónak a DNS-nek a baktériumokba való juttatására [Shigekawa, K. et al., Biotech., 6, 742-751 (1988)], amely publikációra a to17

HU 219 327 Β vábbiakban referenciaként hivatkozunk. Ennek az akadálynak a leküzdéséhez az elektroporáció alkalmazása a Streptococcus B csoport transzformációjának körülményei között bizonyulhat alkalmasnak. Lehetséges tehát helyspecifikus mutagenezist csinálni, kiértékelni a komplementációt, és C fehéijegéneket bejuttatni a Streptococcus B csoport azon törzseibe, amelyek nem expresszálják a C fehérjéket. A számos megközelítés közül bármelyik használható természetes vagy mutált C fehérjegéneknek a Streptococcus B csoport törzseibe való bejuttatására. Például egy antibiotikumrezisztencia gén építhető be a C fehérje kiónjaiba a pUXl 2-ben. Előnyös az az antibiotikumrezisztencia-bélyeg, amely expresszálható a Streptococcus B csoportban, de általában nincs jelen a sejtekben. Ez a módosított pUX12 fehéijeklón transzformálható a Streptococcus B csoportba elektroporációval. [Shigekawa, K. et al., Biotech., 6, 742-751 (1988)], amely publikációra a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. Mivel a pUX12 plazmid nem képes replikálódni a Streptococcus B csoportban, azok a törzsek, amelyek antibiotikumrezisztens fenotípusúnak bizonyulnak, ezt a tulajdonságot valószínűleg úgy szerzik meg, hogy a gazdaszervezet GB kromoszómáján levő C fehérjegén és a pUX12 plazmidon található mutált C fehérje génje között homológ rekombináció játszódik le. A mutánsokat az előzőkben leírt módon vizsgáljuk át. Ha nincsenek homológ szekvenciák a befogadó törzsben, akkor lehetséges olyan vektor konstrukciója, amelyben a C fehéije génje egy ismert Streptococcus génbe, például egy, a Streptococcus B csoportból származó természetes antibiotikumrezisztencia génbe ágyazva található meg. Az elektroporációt követően ezek a plazmidkonstrukciók integrálódnak a kromoszómába homológ rekombináció útján.

Egy másik módszer szerint a módosított C fehéijegéneket úgy juttatjuk be a Streptococcus B csoport kromoszómájába, hogy a géneket az önkonjugációra képes Tn916 transzpozonba juttatjuk be, és a módosított transzpozonokat Streptococcus faecalis-sal végzett szexuális keresztezés útján juttatjuk be a Streptococcus B csoport törzsébe. Ezt a technikát sikeresen alkalmazták a Tn916 transzpozon eritromicingénnel való módosítására, és ennek a génnek a Streptococcus B csoport kromoszómájába való bejutására [Rubens, C. E. et al., Plasmid, 20, 137-142 (1988)]. Azt azonban igazolni kell, hogy a Tn916 transzpozonnal végzett mutagenezis után a mutáns törzs a transzpozonnak csak egyetlen kópiáját tartalmazza, és hogy a transzpozon a C fehérje génjében található.

11. példa

A C fehérjéknek a Streptococcus B csoport virulenciájában játszott szerepének értékelése Az előzetes vizsgálatok, amelyek során a Streptococcus B csoport C fehéijét hordozó, illetve nem hordozó törzseit hasonlították össze, olyan izolátumokat alkalmaztak, amelyek nem voltak izogének [Ferrieri et al., Rév. Inf. Dis., 10 (2), 1004-1071 (1988)]. Ezért annak meghatározása nem volt lehetséges, hogy a virulenciában megfigyelt különbségek a C fehérjéhez kapcsolódnak vagy más virulenciadeterminánshoz. Olyan izogén törzsek konstrukciója, amelyek vagy érintetlen C fehérjegéneket vagy deléciós C fehérjegéneket tartalmaznak, lehetővé teszi a C fehérje szerepének jellemzését a virulenciában. A törzseket a virulencia szempontjából előnyösen az újszülött patkánymodellben, illetve az immunológiai tulajdonságok szempontjából előnyösen az egér-védőmodellben vizsgáljuk. A virulenciának egy másik fontos vizsgálati módja a génnek azon a tulajdonságán alapul, hogy képes-e helyreállítani a virulenciát allelikus helyettesítés reverziója útján mutáns törzsekben. Ha a C fehéije génjeit olyan Streptococcus B csoport törzsekbe juttatjuk be, amelyek vagy nem tartalmazzák a gént, vagy inaktivált C fehéijegéneket hordoznak, akkor lehetséges a C fehérje hatását meghatározni oly módon, hogy vizsgáljuk a kapott konstrukciók virulenciáját az említett állati modellekben.

A Streptococcus B csoportnak olyan izogén törzseit állíthatjuk elő transzpozon mutagenezissel vagy helyspecifikus mutagenezissel, amelyekben a C fehéije génjei egyenként el vannak mutálva. Ezeket a törzseket előnyösen genomiális Southem-blottal jellemezzük annak meghatározására, hogy a kromoszómán csak egy inszerció található. Ezeknek az inszercióknak a helyét az előzőkben leírt finom szerkezetű genetikai térképezéssel határozhatjuk meg. Az izogén törzsek virulenciáját azután az újszülött patkánymodellben vizsgálhatjuk [Zeligs, B. J. et al., Infec. and Immun., 37, 255-263 (1982)].

A transzpozon mutagenezis lehetővé teszi, hogy azonosítsuk a C fehéijék expresszióját szabályozó géneket. Például olyan törzseket, amelyek a vad típusú C fehéijegéneket hordozzák, de amelyek már nem expresszálják a C fehérjéket a transzpozon mutagenezis után, és amelyekben a transzpozon nem a C fehérje struktúrgénjében található, mutációkat azokban a szekvenciákban hordoznak, amelyek a C fehérjegének expressziójának szabályozásában játszanak szerepet. Ezt a megközelítést sikeresen alkalmazták a Streptococcus A csoport mry lokuszának jellemzésében, amely az M fehérje szabályozásában játszik szerepet [Caparon, M. G. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 8677-8681 (1987); Robbins, J. C. et al., Journal of Bacteriology, 169, 5633-5640 (1987)], amely publikációkra a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. Ezeket a módszereket használhatjuk olyan törzsek előállítására is, amelyek túlexpresszálják a C fehérjéket, vagy amelyek megváltozott virulenciával vagy immunitással rendelkező C fehérjéket termelnek.

12. példa

A C fehérjék lokalizálása a Streptococcus B csoportban, és annak kiértékelése, hogy miképpen kötik az immunoglobulinokat

Lancefield és mások kimutatták, hogy a C fehérjék elleni antitestek a Streptococcus B csoport külső membránjához kötődnek [Lancefield, R. C. et al., J. Exp. Med., 142, 165-179 (1975); Wagner, B. et al., Journal of General Microbiology, 118, 95-105 (1980)]. Ez azt

HU 219 327 Β sugallja, hogy a C fehérje egy külső membrán fehérje. A C fehéijéket a Streptococcus B csoport tenyészetek felülúszóiból is izolálhatjuk, jelezve, hogy ezeket a fehérjéket vagy a Streptococcus B csoport szekretálja, vagy nagy sebességgel válnak le a sejt felszínéről. A C fehérjegénekről származó DNS- és fehéijeszekvenciák értékesek a C fehérjék szerkezetének és működésének meghatározásában. A C fehétjéknek egy általánosan ismert potenciális virulenciadeterminánsa az a képesség, hogy képesek az IgA immunoglobulinhoz kötődni [Ferrieri et al., Rév. Inf. Dis., 10 (2), 1004-1071 (1988); Russell-Jones, G. J. et al., J. Exp. Med., 160, 1476-1484(1984)].

Immun-elektronmikroszkópiát használunk egy specifikus antitest által kimutatott sejtfelszíni determinánsok lokalizálására. A Streptococcus B csoportból származó C fehéijeklónok ellen készített antiszérumokat inkubálunk olyan Streptococcus B csoportba tartozó törzsekkel, amelyek a C fehérjéket hordozzák. Ferritinnel konjugált kecske-antinyúl IgG-t használunk arra, hogy az előzőkben leírt módon az antigént kimutassuk a sejt felszínén (Rubens, C. E. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 7208-7212 (1987); Wagner, B. et al., Journal of General Microbiology, 118, 95-105 (1980)].

A C fehérjéknek azt a képességét, hogy az immunoglobulinokhoz kötődik, Westem-blottal lehet meghatározni. Mind a C fehéijegéneket tartalmazó Escherichia coli kiónokból származó sejtkivonatokat, mind a C fehéijéket hordozó Streptococcus B csoport törzseiből származó sejtkivonatokat SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel futtathatjuk, és nitrocellulózra blottolhatjuk. Kontroll lehet a vad típusú pUX12 plazmidot hordozó Escherichia coliból származó sejtkivonat, a C fehéije génjeit nem hordozó Streptococcus B csoportba tartozó törzsekből származó sejtkivonat és az izogén Streptococcus B csoportba tartozó törzsek, amelyekben a C fehéije génjeit inaktiváltuk. A Westem-blotokat egyenként vizsgálhatjuk le próbaként jelzett immunoglobulinokat használva, például IgG-t, IgM-et, IgA-t és komponenseit, például az Fc és F(ab)2 fragmenseket [Heath, D. G. et al., Infec. and Immun., 56, 1223-1238 (1987); Russell-Jones, G. J. et al., J. Exp. Med., 160, 1476-1484 (1984)]. Az immunoglobulinokat előnyösen jódozzuk jodogén vagy kloramin T alkalmazásával.

Egy sokkal specifikusabb módja a C fehérje immunoglobulinokhoz és komponenseikhez való kötődésének mérésére, ha a C fehéijéket megtisztítjuk, és közvetlenül használjuk egy kötődési vizsgálatban [Fahnestock, S. R. et al., Journal of Bacteriology, 167 (3), 870-880 (1986); Heath, D. G. et al., Infec. and Immun., 56, 1223-1238 (1987)]. A fehérjeszekvenciák felhasználásával megtisztíthatjuk a C fehéijét. Emellett, mivel lehetséges, hogy a C fehéije génjeit Escherichia coliban expresszáljuk, olyan Escherichia coli törzseket konstruálhatunk, amelyek a C fehérjéket túltermelik, és így nagy mennyiségben lehet előállítani a C fehérjét tisztítás céljából.

Jóllehet az előzőkben említettek egyes előnyös megvalósítási módokra vonatkoznak, a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a jelen találmány nem ezekre korlátozódik. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a leírt megvalósítási módokban különböző módosítások tehetők, és ezek a módosítások is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

13. példa

A klónozott C fehérjeantigének alkalmazása egy konjugált vakcinában

A Streptococcus B csoport előzőekben említett protektív antigénjeit megvizsgáltuk, hogy mennyire alkalmazhatók egy konjugált vakcinában. Ennek a potenciálnak a becsléséhez pJMSl vagy pJMS23 plazmidot tartalmazó Escherichia coli törzsekből sejtkivonatokat készítünk az előzőekben leírt módon, majd nyulak immunizálására használjuk. A kapott antiszérumot vizsgáljuk az egér letalitási modellben, hogy mennyire képes megvédeni az egereket a Streptococcus B csoportba tartozó H36B törzzsel való fertőzéstől. A H36B törzs a Streptococcus B csoport C fehérjéjét tartalmazza. Kontrollként meghatározzuk, hogy az antiszérum képes-e megvédeni az egereket a Streptococcus 515-ös törzzsel való fertőzéstől (ez nem tartalmazza a C fehéijét). Ennek a kísérletnek az eredményei láthatók a 4. ábrán.

Védelmi képesség:

15% túlélés preimmunizációval antiszérumtiter <1:200

69% túlélés postimmunizációval

Antiszérumtiter magas 1/102 400 hígítás esetében is.

Claims (12)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás Streptococcus B csoport által okozott fertőzés elleni konjugált vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptococcus B csoport egy kapszuláris poliszacharidját a Streptococcus B csoport legalább egy rekombináns C fehéqéjéhez konjugáljuk, ahol az említett fehéije a rekombináns Sl fehéije vagy a rekombináns S23 fehéije lehet, és a kapott konjugátumot kívánt esetben a vakcinakészítésben szokásos hordozóanyagokkal összekeverjük.
2. 2. Eljárás egy rekombináns molekula előállítására, amelyben a Streptococcus B csoport egy fehérjéjét kódoló génszekvencia van jelen, azzal jellemezve, hogy Sl fehérjét vagy S23 fehérjét kódoló szekvenciát illesztünk egy plazmidba.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmádként pCV12 plazmidot alkalmazunk.
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptococcus B csoport egy C fehérjéjét kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns molekulát állítunk elő.
5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pMSJl plazmidot állítunk elő.
6. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pMSJ23 plazmidot állítunk elő.
7. 7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan molekulát állítunk elő, amely képes expresszálni az említett fehéijét egy baktériumban.

   HU 219 327 Β
8. 8. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan molekulát állítunk elő, amely képes expresszálni az említett C fehérjét egy baktériumban.
9. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy olyan molekulát állítunk elő, amely az említett fehérjét Escherichia coliban képes expresszálni.
10. 10. Eljárás Streptococcus B csoportba tartozó rekombináns SÍ és S23 fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 2. igénypont szerinti rekombináns molekulát expresszáltatunk.
11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expresszálást E. coliban hajtjuk végre.
12. 12. Eljárás Streptococcus B csoport által okozott fertőzés elleni antiszérum előállítására, azzal jellemezve, hogy egy emlőst egy 1. igénypont szerinti eljárással előállított konjugált vakcinával immunizálunk, és az antiszérumot a vérből kinyeijük.