PL167882B1 - Sposób wytwarzania nowej koniugowanej szczepionki© Pierwszenstwo:15.09.1989,US,07/408036© PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowej koniugowanej szczepionki zdolnej do nadawania gospo­ darzowi odpornosci na infekcje wywolane przez Streptococcus grupy B przez koniugowanie wlasciwego dla Streptococcus grupy B polisacharydu z otoczki z bialkiem, znamienny tym, ze jako bialko stosuje sie bialko C nalezace do bialek Streptococcus grupy B. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowej szczepionki przeciw Streptococcus grupy B.

Bakterie rodzaju Streptococcus są czynnikiem wywołującym choroby ludzi i zwierząt. Streptococci podzielono na grupy immunologiczne w oparciu o obecność na powierzchni ich komórek specyficznych antygenów węglowodanowych. Obecnie znane są grupy od A do O /Davis, B. D. i in., w: Microbology, wydanie 3, str. 609, (Harper Row, 1980). Streptococci należą do najbardziej rozpowszechnionych i ważnych bakterii powodujących ludzkie choroby.

Chociaż Streptococci grupy B powodują choroby zwierząt (takie jak zapalenie gruczołu mlecznego u bydła), Streptococcus agalaciae (Streptococci grupy B) okazał się najpowszechniejszą przyczyną ludzkiej posocznicy noworodków w Stanach Zjednoczonych i uważa się, że odpowiedzialny jest za ponad 6000 zgonów rocznie (Hill, H. R. i in., Sexually Transmitted Diseases, McGraw Hill, str. 397-407). Streptococcus grupy B jest także ważnym patogenem w późnych atakach zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u niemowląt, w poporodowym zapaleniu śluzówki macicy i w infekcjach dorosłych z osłabionym układem immunologicznym (Patterson, M. J. i in., Bact. Rev. 40: 774-792 (1976)). Chociaż organizm wrażliwy jest na antybiotyki, duża szybkość ataku i gwałtowny początek posocznicy u noworodków oraz zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u niemowląt powodują w obydwu przypadkach wysoką zachorowalność (50%) i śmiertelność (20%) (Baker, C. J. i in., New Eng. J. Med. 314 (26). 1702-1704 (1986); Baker, C. J. i in., J. Infect. Dis. 136: 137-152 (1977)).

Streptococcus grupy B jest powszechnie występującym składnikiem normalnej ludzkiej flory pochwowej i okrężnicy. O ile najpowszechniejszą drogą infekcji noworodków jest zarażenie z pochwy podczas porodu, zdarzały się także szpitalne zakażenia na oddziałach noworodków (Patterson, M. J. i in., Bact. Revm 40: 774-792 (1976)). Jednakże, wśród niemowląt zarażonych Streptococcus grupy B tylko w małym procencie rozwijają się poważne infekcje. Rola zarówno czynników gospodarza, jak i czynników determinujących zjadliwość bakteryjną w przejściu od zarażenia do infekcji nie jest dobrze zrozumiała.

Sądzi się, że kilka białek Streptococcus grupy B odgrywa rolę w zjadliwości i odporności (Ferrieri, P., Rev. Infect. Dis. 10: S363 (1988)). W 1975 r. Lancefield zdefiniowała białka C Streptococcus grupy B przez ich zdolność do wywoływania odporności ochronnej (Lancefield, R. C„ i in., J. Exp. Med. 142: 165-179 (1975)). Sądzi się, że ta grupa białek obejmuje kilka różnych polipeptydów i determinant antygenowych. W świetle tych odkryć, wysiłki w kierunku zapobiegania infekcjom Streptococcus skierowano ku stosowaniu profilaktycznych antybioty167 882 ków i opracowaniu szczepionki przeciw Streptococcus grupy B (Baker, C. J. i in., Rev. of Infect. Dis. 7: 458-467 (1985), Baker, C. J. i in., New Eng. J. Med. 314 (26): 1702-1704 (1986)). Szczepionkę polisacharydową przeciw Streptococcus grupy B opisali D. L. Kasper (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 207 414 i ponownie wydany opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr RE31672 oraz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 324 887,4 356,263,4 367 2214 367 222 i 4 3)7 223, (D. J. Carlo) opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 413 057, publikacja europejskiego opisu patentowego nr 38 265 (i D. Yavordios i in.) publikacja europejskiego opisu patentowego nr 71 515, wszystkie te pozycje włączono do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe.

Z wyjątkiem małej subpopulacji niemowląt, w przypadkach, w których można stwierdzić zarówno występowanie u matki Streptococcus grupy B, jak i inne okołoporodowe czynniki ryzyka, stosowanie profilaktycznych antybiotyków nie było możliwe do przeprowadzenia w praktyce lub nie było skuteczne w zapobieganiu większości przypadków (Boyer, K. M., i in., New. Eng. Jm Med. 314 (26): 1665-1669 (19866). Chemiprofilaktyka podczas porodu nie uzyskała szerokiej akceptacji z następujących powodów: (1) nie było możliwe rozpoznanie występowania u matki Streptococcus grupy B w sposób szybki, pewny i ekonomiczny; (2) około 40% przypadków u noworodków występuje w grupach niskiego ryzyka; (3) nie uważano za praktyczne testowanie i/lub leczenie wszystkich matek lub niemowląt, u których istnieje potencjalne ryzyko zachorowania i (4) nie wydaje się aby profilaktyka antybiotykowa mogłaby zapobiegać późnym atakom zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (7200 przypadków rocznie w Stanach Zjednoczonych) lub poporodowemu zapaleniu śluzówki macicy (45 000 przypadków rocznie) (Baker, C. J. i in., New Eng. J. Med. 314 (26): 1702-1704 (1986}).

Plazmidy pJ!MS1 i pJMS23 są pochodnymi plazmidu pUX12, zawierającego DNA kodujący białka antygenowe Streptococci, które można stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Plazmid pUX12 jest pochodną plazmidu pUC12. Plazmidy pJMS1 i pJMS23 zdeponowano w American Type Culture Collection, (ATCC) Rockville, Md 15 września 1989 r., i nadano im oznaczenia, odpowiednio, ATCC 40659 i ATCC 40660.

Streptococcus agalactiae jest najpowszechniejszą przyczyną posocznicy noworodków w Stanach Zjednoczonych, i odpowiedzialny jest za 6 000 do 20 000 zgonów rocznie. O ile specyficzna dla typu otoczka polisacharydowa Streptococcus grupy B jest immunogenna i niesie ważne antygeny ochronne, próby kliniczne szczepionki polisacharydowej wykazywały niski współczynnik odpowiedzi (Baker, C. J. i in., New Engl. J. Med. 319: 1180 (1980); Insel, R. A., i in., New Engl. J. Med. 319 (18): 1219-1220 (1988)).

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowej koniugowanej szczepionki przeciw Streptococcus grupy B (tj. Streptococcus agalactiae) wykorzystującej ochronny antygen białkowy eksprymowany z genu sklonowanego z Streptococcus grupy B. Zaletą tej nowej koniugowanej szczepionki jest zarówno wywoływanie ochrony zależnej od komórek T przez działanie adiuwantowe białka nośnikowego, jak i także dostarczenie dodatkowych epitopów ochronnych, obecnych na sklonowanym białku Streptococcus grupy B (Insel, R. A. i in. New. Engl. J. Med. 319 (18): 1219-1220 (1988); Baker, C. J. i in., Rev. of infect. Dis. 7: 458-467 (1985)).

Sposób wytwarzania koniugowanej szczepionki przeciw Streptococcus grupy B zdolnej do nadawania gospodarzowi odporności na infekcje wywołane przez Streptococcus grupy B przez koniuwanie właściwego dla Streptococcus grupy B polisacharydu z otoczki z białkiem polega na tym, że jako białko stosuje się białko C należące do białek Streptococcus grupy B.

Szczepionka ta znajduje zastosowanie w zapobieganiu lub osłabianiu infekcji powodowanej przez Streptococcus grupy B. Osobnikowi, u którego podejrzewa się możliwość takiej infekcji, podaje się skuteczną ilość koniugowanej szczepionki, zdolnej do nadania odporności gospodarzowi na infekcję, a więc szczepionki obejmującej (a) polisacharyd skoniugowany z (b) białkiem, w której zarówno polisacharyd jak i białko są cząsteczkami charakterystycznymi dla Streptococcus grupy B.

Zapobieganie lub osłabienie infekcji powodowanej przez Streptococcus grupy B obejmuje podawanie ciężarnej kobiecie skutecznej ilości koniugowanej szczepionki zdolnej do nadaw arna odporności na infekcję nieurodzonym potomkom tych kobiet, szczepionki e·

167 882 polisacharyd skoniugowany z (b) białkiem, w której zarówno polisacharyd jak i białko są cząsteczkami charakterystycznymi dla Streptococcus grupy B.

W celu zapobieżenia lub osłabienia infekcji spowodowanej przez Streptococcus grupy B, osobnikowi, u którego podejrzewa się możliwość takiej infekcji podaje się skuteczną ilość antysurowicy pobranej od drugiego osobnika, któremu uprzednio podano koniugowaną szczepionkę zdolną do nadawania odporności gospodarzowi na infekcję, szczepionkę obejmującą (1) polisacharyd skoniugowany z (b) białkiem, w której zarówno polisacharyd jak i białko są cząsteczkami charakterystycznymi dla Streptococcus grupy B.

Figura 1 przedstawia modyfikacje plazmidu pUC12 wykonane w celu przygotowania plazmidu pUX12.

Figura 2 przedstawia mapę restrykcyjną i transkrypcyjną plazmidu pUX 12.

Figura 3 przedstawia modyfikacje plazmidu pUX 12 wykonane w celu wytworzenia ramki odczytu +1 na plazmidzie puX12+1 (A), i ramki odczytu - 1 plazmidu pUX12-1 (C). (B) przedstawia konstrukcję, której wynikiem może być dodatkowo plazmid o ramce odczytu -1.

Figura 4 przedstawia wynik badań reakcji obronnych u myszy, w których zastosowano antysurowicę królika skierowaną przeciwko S1 i S23. Reakcje obronne obserwowano u myszy które zaszczepiono antysurowicą anty-S1 (p<0,002) lub antysurowicą anty-S23 (p. 0,022). Z powodu wielkości użytych próbek ta różnica obserwowanej istotności statystycznej pomiędzy doświadczeniami z surowicami anty-S 1 i £ntty-S23 nie jest istotna. Na rysunku fig. . 4 przedstawiono stosunek myszy przeżywających do wszystkich jako ułamek powyżej każdego słupka.

Immunoprofilaktykę matek szczepionką przeciw Streptococcus grupy B proponowano jako potencjalną drogę ochrony przed infekcjami zarówno matek, jak i noworodków przez okołoporodowe przejście przeciwciał (Baker, C. J. i in., New Eng. J. Med. 314 (26): 1702-1704 (1986); Baker, C. J. i in., New Engl. J. Med. 319: 1180 (1988); Baker, C. J. i in., Rev. of Infect. Dis. 7:458-467 (1985)). Tak jak w przypadku innych bakterii posiadających otoczkę, podatność na infekcję skorelowanajest z nieobecnością przeciwciał specyficznych wobec typu (Kasper, D. L., i in., J. Clin. Invest. 72:260-269 (1983), Kasper, D. L. i in., Antibiot, Chemother, 35:90-100 (1985)). Brak opsonizujących, specyficznych dla typu przeciwciał skierowanych przeciwko otoczce Streptococcus grupy B jest czynnikiem ryzyka dla rozwoju choroby w następstwie zarażenia Streptococcus grupy B (Kasper, D. L. i in., J. Infec. Dis. 153: 407-415 (1986)).

Jednym z podejść było zaszczepienie oczyszczonymi specyficznymi dla typu polisacharydami otoczki. Sposoby wytwarzania takich szczepionek, i ich stosowanie do immunizacji przeciwko Streptococcus grupy B ujawnili D. L. Kasper (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 207 414 i ponownie wydany opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr RE31 672 oraz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 324 887,4 356 263, 4 367 221,4 367 222 i 4 367 223), D. J. Carlo (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 413 057, publikacja europejskiego opisu patentowego nr 36 265) i D. Yavordios i in. (publikacja europejskiego opisu patentowego nr 71 515), wszystkie te pozycje włączono do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe.

Chociaż otoczka polisacharydowa Streptococcus grupy B jest dobrze scharakteryzowana i, jak wykazano, odgrywa rolę zarówno w zjadliwości jak i odporności (Kasper, D. L. i in., J. Infec. Dis. 153:407 (1986)), stwierdzono, że składniki otoczki różnią się swoją immunogennością w zależności od zarówno określonego typu otoczki, jak i czynników w układzie immunologicznym gospodarza (Baker, C. J. i in., Rev. of Infect. Dis. 7: 458-467 (1985)). Zakończono ostatnio próby kliniczne oceny szczepionki opartej o polisacharydy otoczki Streptococcus grupy B wykazały występowanie odpowiedzi w 63% i wskazywały, że szczepionka taka nie była immunogenna w stopniu optymalnym (Baker, C. J. i in., New Engl. J. Med. 319: 118(0-118(1988)).

Obserwowano także różnice immunogenności dla polisacharydów otoczki innych bakterii. Na przykład, szczepionka przeciw otoczce meningokoków typu C jest w znacznym stopniu aktywna, podczas gdy polisacharydowa szczepionka przeciw meningokokom grupy B nie jest immunogenna (Kasper, D. L. i in., J. Infec. Dis. 153:407-415 (1986)). Do wywołania odpowiedzi humoralnej na antygeny polisacharydowe często wymagane są niezależne od komórek T funkcje układu immunologicznego gospodarza. Brak zależnej od komórek T odpowiedzi na antygeny

167 882 polisacharydowe może być odpowiedzialny za niski poziom przeciwciał skierowanych przeciwko Streptococcus grupy B obecnych u matek dzieci, u których nastąpił rozwój infekcji spowodowanych przez Streptococcus grupy B. Ponadto, dzieci w wieku poniżej 18 lub 24 miesięcy mają słabo rozwiniętą odpowiedź immunologiczną na antygeny niezależne od komórek T.

Istnieje pięć serotypów Streptococcus grupy B, które posiadają wspólną grupę specyficznych antygenów polisacharydowych. Jednakże, przeciwciała przeciw tej grupie antygenów nie wykazują właściwości ochronnych w modelach zwierzęcych. Lancefield, stosując techniki wykorzystujące precypityny, sklasyfikowała pierwotną grupę B Streptococcus w cztery serotypy (Ia, Ib, II i III). Następnie dla każdego z serotypów określono skład i strukturę unikalnych specyficznych dla danego typu polisacharydów otoczki (Jennings, H. J. i in., Biochem. 22: 1258-1264 (1983), Kasper, D. L. i in., J. Infec. Dis. 153: 407-415 (1986). Wessels, M. R. i in., Trans, Assoc, Amer. Phys. 98: 384-391 (1985)). Wilinson zdefiniował piąty serotyp, Ic, przez identyfikację antygenu białkowego (pierwotnie nazwanego białkiem Ic) obecnego na wszystkich szczepach serotypu Ib i pewnych szczepach z otoczką typu Ia (Wilkinson, H. W. i in., J. Bacteriol. 97: 629-634 (1969), Wilkinson, H. W. i in., Infec. and Immun. 4: 596-604 (1971)). Później stwierdzono, że białko to różni się rozpowszechnieniem w różnych serotypach Streptococcus grupy B, lecz nieobecne było w serotypie Ia (Johnson, D. R. i in. J. Clin, Microbiol. 19: 506-510 (1984)).

Ostatnio zmieniono nomenklaturę klasyfikującą serotypy Streptococcus grupy B jedynie na podstawie specyficznych dla typu polisacharydów otoczek i opisano także piąty typ otoczki (typ IV) (Pritchard, D. G. i in., Rev. Infec. Dis. 10 (8): 5367-5371 (1988)). Dlatego też, oznaczanie szczepów Streptococcus grupy B nie opiera się już na antygenowym białku Ibc, które obecnie nazywa się białkiem C. Typ szczepu Ic przeklasyfikowano na podstawie jego składu polisacharydów otoczki jako serotyp Ia, z dodatkową informacją, że niesie on także białko C.

Dane immunologiczne, epidemiologiczne i genetyczne sugerują, że specyficzna dla typu otoczka odgrywa ważną rolę w odporności na infekcje wywołane przez Streptococcus grupy B. Skład i strukturę specyficznych dla typu polisacharydów otoczek oraz ich rolę w zjadliwości i odporności poddano intensywnym badaniom (Ferrieri, P. i in., Infec. Immun. 27: 1023-1032 (1980), Krause, R. M. i in., J. Exp. Med. 142: 165-179 (1975), Levy, N. J. i in., J. Infec. Dis. 149: 851-860 (1984), Wagner, B. i in., J. Gen. Microbiol. 118: 95-105 (1980), Wessels, M. R. i in., Trans. Assoc. Amer. Phys. 98: 384-391 (1985)).

Istnieją kontrowersje dotyczące strukturalnego rozmieszczenia specyficznych dla typu i grupy B Streptococcus polisacharydów na powierzchni komórkowej, ważnych immunologicznie determinant polisacharydów specyficznych dla typu, i mechanizmu zjadliwości determinowanej przez otoczkę Streptococcus grupy B (Kasper, D. L. i in., J. Infec. Dis. 153: 407-415 (1986)). Rubens i in. do badań roli otoczki w zjadliwości stosowali mutagenezę transpozonami w celu przygotowania izogenicznego szczepu typu III Streptococcus grupy B pozbawionego otoczki (Rubens, C. E. i in., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 7208-7212. Wykazali oni, że utrata otoczki powoduje znaczące zmniejszenie zjadliwości w modelu noworodków szczura. Jednakże, zjadliwość izolatów klicznych o podobnym składzie otoczki jest znacznie zróżnicowana. Sugeruje to, że w dodatku do otoczki, inne czynniki bakteryjne odgrywają rolę w patogenezie Streptococcus grupy B.

U Streptococcus grupy B opisano liczne białka i inne produkty bakteryjne, których roli w zjadliwości i odporności nie ustalono: czynnik CAMP (Christine Atkins-Much Peterson), barwnik (prawdopodobnie karotenoid), antygen R, antygen X, czynniki hamujące fagocytozę i słabo zdefiniowane toksyny płucne (Ferrieri, P. i in., J. Exp. Med. 151: 56-68 (1980), Ferrieri, F. i in., Rev. Inf. Dis. 10 (2): 1004-1071 (1988), Hill, H. R. i in., Sexually Transmitted Diseases, McGraw-Hill, str. 397-407). Białka C dyskutowane są poniżej:

Izogeniczne szczepy Streptococcus grupy B pozbawione hemolizyny nie wykazują obniżenia zjadliwości w modelu noworodków szczura (Weiser, J. N. i in., Infec. and Immun. 55: 2314-2316(1987). Zarówno hemolizyna, jak i neuraminidaza nie zawsze są obecne w izolatach klinicznych związanych z infekcją. Czynnik CAMPjestzewnątrzkomórkowym białkiem Streptococcus grupy B o masie cząsteczkowej 23 500 daltonów, prowadzącym w obecności stafylo6

167 882 kokowej toksyny beta (sfingomielinazy) do lizy błon erytrocytów. Ostatnio skłonowano i doprowadzono do ekspresji w E. coli gen czynnika CAMP (Schneewind, O. i in., Infec. and Immun. 56: 2174-2179 (1988)). Roli, jeśli taka jest, czynnika CAMP, antygenów X i R i innych wymienionych powyżej, w patogenezie Streptococcus grupy B nie ujawniono we wcześniejszych pracach (Fehrenbach, F. J. i in., w: Bacterial Protein Toxins, Gustaw Fischer Verlag, Stuttgart (1988); Hill, H. R. i in., Sexually Transmitted Diseases, McGraw-Hill, NY, str. 397-407 (1984)).

Białko (a) C są grupą antygenów białkowych związanych z powierzchnią komórkową Streptococcus grupy B, które pierwotnie wyekstrahowali z Streptococcus grupy B Wilkinson i in. (Wilkinson, H. W. i in., J. Bacteriol. 97: 629-634 (1969), Wilkinson, H. W. i in., Infec. and Immun. 4: 596-604 (1971)). Do ekstrakcji ścian komórkowych zastosowali oni gorący kwas chlorowodorowy (HCl), a do wytrącania antygenów białkowych kwas trójchlorooctowy (TGA). Opisano dwie odrębne antygenowo populacje białek C: (1) grupę białek wrażliwych na degradację przez pepsynę, ale nie przez trypsynę, nazwanych TR (odporne na trypsynę, lub α, (2) Inną grupę białek Streptococcus grupy B, wrażliwych na degradację przez zarówno pepsynę, jak i trypsynę, i nazwanych TS (wrażliwe na trypsynę), lub β. (Bevanger, L. i in., Acta Path. Microbio, Scand. Sect. B. 87: 51-54 (1979), Bevanger, L. i in., Acta Path, Microbio. Scand. Sect.

B. 89: 205-209 (1981), Bevanger, L. i in., Acta Path. Microbio. Scand. Sect, B. 91: 231-234 (1983), Bevanger, L. i in., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B. 93: 113-119 (1985), Bevanger, L. i in., Acta Path, Microbio, Scand. Sect. B. 93: 121-124 (1985), Johnson, D. R. i in., J. Clin. Microbiol. 19: 506-510 (1984), Russell-Jones, G. J. i in., J. Exp. Med. 160: 1476-1484 (1984)).

W 1975 r. Lancefield i in., zastosowali badania reakcji obronnych myszy z antysurowicami przygotowanymi w królikach w celu funkcjonalnego określenia zdolności białek C do nadawania odporności ochronnej przeciw szczepom Streptococcus grupy B niosącym podobne białka antygenowe (Lacefield, R. C. i in., J. Exp. Med. 142: 165-179 (1975). Liczni badacze otrzymali nieoczyszczone preparaty białek antygenowych z Streptococcus grupy B, które nazwano białkami C, przez ekstrakcję chemiczną ze ściany komórkowej przy użyciu albo HCl, albo detergentów (Bevanger, L. i in., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B. 89: 205-209 (1981), Bevanger, L. i in., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B. 93: 113-119 (1985), Russell-Jones, G. J. i in., J Exp. Med. 160: 1476-1484 (1984), Valtonen, M. V. i in., Microb. Path, i: 191-204 (1986), Wilkinson, H. W. i in., Infec. and. Immun. 4: 596-604 (1971)). Donoszona wielkość tych antygenów wahała się pomiędzy 10 a 190 kilodaltonów, i nie wyizolowano lub scharakteryzowano pojedynczego rodzaju białka (Ferrieri, P. i in., Rev. Inf. Dis. 10 (2): 1004-1071 (1988)).

Testując ochronnymi antysurowicami, białka C można wykryć w około 60% klinicznych izolatów Streptococcus grupy B, i wykrywa się je we wszystkich serotypach, lecz z różną częstością (Johnson, D. R. i in., J. Clin, Microbiol. 19: 506-510 (1984)). Pojedyncze izolaty Streptococcus grupy B mogą posiadać zarówno antygen TR jak i TS, tylko jeden z nich lub nie posiadać żadnego z tych antygenów. Z wyjątkiem zdolności częściowo oczyszczonych antygenów do wywoływania odporności ochronnej, nie badano in vitro roli tych antygenów w patogenezie. Badania in vivo szczepów Streptococcus grupy B niosących białka C dostarczyły pewnych dowodów na to, że białka C mogą być odpowiedzialne za oporność na opsonizację (Payne, N. R. i in., J. Infec. Dis. 151: 672-681 (1985)), i mogą hamować wewnątrzkomórkowe zabijanie Streptococcus grupy B następujące w wyniku fagocytozy (Payne, N. R. i in., Infect, and Immun. 55: 1243-1251 (1987)). Wykazano, że szczepy typu Ii Streptococcus grupy B niosące białka C są bardziej zjadliwe w modelu posocznicy u noworodków szczura (Ferrieri, P i in., Infect. Immun. 27: 1023-1032 (1980), Ferrieri, P i in., Rev. Inf. Dis. U (2): 1004-1071 (1988)). Ponieważ brak jest danych genetycznych na temat białek C, nie badano uprzednio izogenicznych szczepów pozbawionych ich. Istnieje dowód, że jeden z TS, lub β, białek C wiąże sięzIgA(Russell-Jones,G. J. i in., J. Exp. Med. 160: 1476-1484(1984)). Wpływu nazjadliwość, jeśli taki jest, wiązania IgA przez białka C jednakże nie ujawniono.

W 1986 r. Valtonen i in., wyizolowali z supernatantów hodowli białka Streptococcus grupy B wywołujące ochronę w modelu mysim (Valtonen, M. V. i in., Microb Path, i: 191 -204 (1986)) Zidentyfikowali oni i częściowo oczyścili oporne na trypsynę białko Streptococcus grupy B o

167 882 masie cząsteczkowej 14 000 daltonów. Otrzymane w królikach antysurowice skierowane przeciwko temu białku chroniły myszy przed podawanym następnie Streptococcus grupy B typu Ib (89% ochrona). Białko to jest, według definicji Lancefield, białkiem C. Kiedy jednakże antysurowice skierowane przeciwko temu białku zastosowano do immunoprecypitacji z ekstraktów antygenów Streptococcus grupy B, stwierdzono reaktywność licznych białek o wyższej masie cząsteczkowej. Sugeruje to, że białko o masie cząsteczkowej 14 000 może posiadać wspólny epitop kilku białek Streptococcus grupy B, lub że jest ono produktem degradacji stwierdzonym w supernatantach hodowli Streptococcus grupy B. Różnorodność wielkości białek C wyizolowanych zarówno z komórek bakteryjnych, jak i supernatantów sugeruje, że białka te mogą być kodowane przez rodzinę genów, i utrzymywać różnorodność antygenową jako mechanizm obrony przed układem immunologicznym.

Zakres donoszonych mas cząsteczkowych i trudności napotykane przy oczyszczaniu pojedynczych białek C podobne są do problemów, które wielu badaczy napotyka podczas izolowania białka M Streptococcus grupy A (Dale, J. B. i in., Infec. and Immun. 46 (1): 267-269 (1984), Fischetti, V. A. i in., J. Exp. Med. 144: 32-53 (1976), Fischetti, V. A. i in., J. Exp. Med. 146: 1108-1123 (1977)). Gen białka M sklonowano i zsekwencjonowano i stwierdzono, że zawiera on liczne powtarzalne sekwencje DNA (Hollingshead, S. K. i in., J. Biol. Chem. 261: 1677-1686 (1986), Scott, J. R. i in., Proc Natl. Acad. Sei USA 82: 1822-1826, Scott, J. R. i in., Infec. and Immun. 52: 609-612 (1986)). Te powtarzalne sekwencje mogą być odpowiedzialne za potranskrypcyjne procesy, których wynikiem jest różnorodność wielkości wytwarzanych białek M. Mechanizm, dzięki któremu to następuje nie jest zrozumiały. Zakres mas cząsteczkowych opisywanych dla białek C Streptococcus grupy B mógłby być wynikiem podobnego procesu.

Cleat i in. usiłowali sklonować białka C stosując dwa preparaty antysurowic skierowanych przeciw Streptococcus grupy B otrzymanych od Bevangera (a i β) do przeszukiwania biblioteki DNA Streptococcus grupy B w E. coli (Bevanger, L. i in., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B. 93: 113-119 (1985), Cleat, P. H. i in., Infec and Immun. 55 (5): (1151-1155 (1987), pozycje te włączono do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe). Badacze ci opisali dwa klony wytwarzające białka, które wiążą się z przeciwciałami skierowanymi przeciw Streptococcus. Jednakże, nie ustalili oni czy sklonowane białka posiadały zdolność wywoływania przeciwciał ochronnych oraz czy występowanie tych genów skorelowane jest ze szczepami Streptococcus grupy B o których wiadomo, że niosą białka C. Nie badano roli sklonowanych sekwencji genowych w zjadliwości Streptococcus grupy B. Ponieważ białka C zdefiniowano na podstawie ich zdolności do wywoływania przeciwciał ochronnych, praca ta nie dostarczyła dowodu, że którykolwiek z klonów koduje białko C.

Niniejszy wynalazek pokonuje dyskutowane powyżej trudności w wytwarzaniu szczepionek przeciw Streptococcus grupy B. Istota wynalazku polega na wytworzeniu nowej koniugowanej szczepionki, w której polisacharydy otoczki są związane kowalencyjnie ze szkieletem białkowym. Podejście to ułatwia otrzymanie zależnej od komórek T odpowiedzi humoralnej na polisacharydowe antygeny otoczki i umożliwia uniknięcie niezależnych od komórek T warunków wytwarzania przeciwciał (Baker, C. J. i in., Rev. of Infec. Dis. 7: 458-467 (1985); Kasper, D. L. i in., J. Infec. Dis. 153: 407-415 (1986), pozycje te włączono do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe).

Według wynalazku, sposób wytwarzania koniugowanej szczepionki polega na tym, że cząsteczkę antygenową, taką jak polisacharydy otoczki Streptococcus grupy B (o których była mowa powyżej) wiąże się kowalencyjnie z białkiem lub polipeptydem nośnikowym. Wiązanie służy do zwiększenia antygenowości skoniugowanej cząsteczki. Sposoby wytwarzania koniugowanych szczepionek z cząsteczki antygenowej i białka lub polipeptydu nośnikowego są ogólnie znane (Jacob, C. O. i in., Eur. J. Immunol. 16: 1057-1062 (1985); Parker, J. M. R. i in., w: Modern Approaches to Vaccines, Chanock, R. M. i in. (red., str. 133-138, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983); Żurawski, V. R. i in., J. Immunol. 121: 122-129 (1978); Klipstein, F. A. i in., Infect. Immun. 37: 550-557 (1982); Bessler, W. G., Immunobiol. 170: 239-244 (1985); Posnett, D. N. i in., J. Biol. Chem. 263: 1719-1725 (1988);

167 882

Ghose, A. C. i in., Molec. Immunol. 25: 223-230 (1988); wszystkie te pozycje włączono do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe).

Prototypowy model koniugowanej szczepionki opracowano przeciwko Hemophilus influenzae (Anderson, P., Infec. and Immun. 39: 223-238 (1983); Chu, C. i in., Infect Immun. 40: 245-256 (1983); Lepów, M. Pediat. Infect. Dis. J. 6: 804-807 (1987), pozycje te włączono do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe); model ten można wykorzystać do konstruowania nowych szczepionek sposobem według niniejszego wynalazku. Dodatkowe sposoby wytwarzania takich koniugowanych szczepionek ujawnili Anderson, P. W. i in., publikacja europejskiego opisu patentowego nr 245 045; Anderson, P. W. i in., opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 673 574 i 4 761 283; Frank, R. i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 789 735; publikacja europejskiego opisu patentowego nr 206 852; Gordon, L. K., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 619 828; i Beachey, E. H., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 284 537, wszystkie te pozycje włączono do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe.

Jako szkielet białkowy dla koniugowanych szczepionek, takich jak szczepionka przeciw Hemophilus influenzae wykorzystuje się białka nie wykazujące właściwości antygenowych w organizmie docelowym, z którego otrzymano bakteryjne polisacharydy otoczki (Ward, J. i in., w: Waccines, Plotkin, SA, i in., (red.), Saunders, Filadelfia, str. 300 (1988).

W przeciwieństwie do tego, koniugowana szczepionka wytwarzana sposobem według niniejszego wynalazku wykorzystuje białka immunogenne Streptococcus grupy B jako szkielet do koniugowanej szczepionki. Sądzi się, że takie podejście prowadzi do otrzymania szczepionek skuteczniejszych (Insel, R. A. i in., New Eng. J. Med 319(18): 1219-1220 (1988)). Koniugowana szczepionka białkowo-polisacharydowa wytworzona sposobem według wynalazkujest pierwszą w której scharakteryzowane są białka Streptococcus grupy B, które można zastosować w koniugowanej szczepionce. W koniugowanych szczepionkach otrzymanych sposobem według niniejszego wynalazku wykorzystuje się białko charakterystyczne dla Streptococcus grupy B. Korzystne jest wykorzystanie do tego celu białka C Streptococcus grupy B. Jak dyskutuje się dokładnie poniżej, plazmidy pJMS 1 i pJMS23 zawierają DNA kodujący białko C Streptococcus. Klonowania i ekspresja genów kodujących ochronne antygeny białkowe Streptococcus grupy B prowadzi do syntezy białka, które stosuje się korzystnie jako białkowy szkielet i z którym można skoniugować polisacharydy otoczki Streptococcus grupy B w celu przygotowania koniugowanej szczepionki przeciw tym bakteriom. Ponadto, można wykorzystać rolę tych białek w zjadliwości i odporności Streptococcus grupy B do opracowania dodatkowej terapii przeciw infekcji Streptococcus grupy B. Wyizolowanie i charakteryzacja tych genów pochodzenia bakteryjnego umożliwia manipulowanie produktami genu w celu optymalizacji zarówno adiuwantu, jak i antygenowych właściwości polipeptydowego szkieletu (nośnika koniugowanej szczepionki).

Pomimo dostępnej obszernej literatury na temat klonowania w wielu grupach Streptococci, przeprowadzono jedynie ograniczone manipulacje w obrębie Streptococcus grupy B (Macrina,

F. L., Ann. Rev. Microbiol. 38: 193-219 (1984), Wagner, A. R. i in., Infec, and Immun, 55. 1170-1175 (1987). Najszerzej stosowaną techniką w badaniach Streptococcus grupy B było opracowanie Tn916 i jego stosowania w mutagenezie transpozonami (Rubens, C. E. i in., Proc. Natl. Acad. Sei, USA 84: 7208-7212 (1987), Wagner, A. R. i in., Res. Vet. Sei, 38: 202-208 (1985)). Jednakże, ponieważ mogłoby się okazać, że istnieje więcej niż jeden gen białek C, i antysurowice ochronne wiążą się z kilkoma białkami, poszukiwanie genów białka C metodą mutagenezy transpozonami jest niepraktyczne.

Udoskonalono metody klonowania białek C (i wszystkich innych białek, które są zaangażowane w zjadliwości Streptococcus grupy B, lub wpływających na odporność gospodarza w stosunku do Streptococcus grupy B) dzięki zastosowaniu nowego wektora plazmidowego. Dla spełnienia tego celu pożądane jest wykorzystanie wektora klonującego, który można by było szybko testować pod kątem ekspresji białek wiążących się z naturalnie otrzymywanymi przeciwciałami przeciw Streptococcus grupy B, ponieważ takie przeciwciała są heterogennymi przeciwciałami poliklonalnymi, a nie przeciwciałami monoklonalnymi, konieczne było by także

167 882 aby wykorzystany wektor można było łatwo testować przy wielu dodatnich klonach w celu identyfikacji genów będących przedmiotem zainteresowania.

Dostępne były liczne techniki przeszukiwania klonów pod kątem ekspresji antygenów wiążących się ze specyficznymi antysurowicami (Aruffo, A. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987)). Najczęściej stosowany układ, Agtl 1 opracowali Young i Davis (Huynh, T. V. i in., w: Dna Cloning, Waszyngton, str. 49-78 (1985); Wong, W. W. i in., J. Immunol. Methods. 82: 303-313 (1985), pozycje te włączono do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe). Technika ta pozwala na szybkie przeszukiwanie klonów eksprymowanych w lizogenicznym fagu, którego produkty uwalniane są przez liżę pod wpływem faga. Powszechnie napotykane problemy przy tym układzie obejmują wymagania odnośnie subklonowania fragmentów w wektorach plazmidowych w celu szczegółowego mapowania restrykcyjnego endonukleazami, przygotowywania sond i sekwencjonowania DNA. Ponadto, przygotowywanie DNA fagowego jest niewygodne i ogranicza liczbę potencjalnie dodatnich klonów, które można skutecznie badać. Wreszcie, przygotowywanie nieoczyszczonych ekstraktów białkowych z klonowanych genów jest problematyczne dla gospodarza wektora fagowego.

Wytwarzanie wektora plazmidowego opracowano dla przeszukiwania, sklonowanego bakteryjnego DNA chromosomalnego pod kątem ekspresji białek zaangażowanych w zjadliwości i/lub odporności. Efektywny wektor klonujący można szybko przeszukiwać pod kątem ekspresji białek wiążących się z naturalnie otrzymywanymi przeciwciałami przeciw Streptococcus.

Wektor przygotowano przez modyfikację powszechnie stosowanego plazmidowego wektora klonującego, pUC12 (Messing, J. i in., Gene 19: 269-276 (1982); Norrander, J. i in., Gene 26:101 -106 (1983); Wieira, J. i in., Gene 19:259-268 (1982); pozycje te włączono do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe). Klonami plazmidowymi można łatwo manipulować, mapować je endonukleazami restrykcyjnymi i ich włączonymi sekwencjami DNA, przygotowywać sondy i badać produkty genów bez konieczności subklonowania. pUC12 jest plazmidem o długości 2,73 tysięcy par zasad (kb) i wysokiej liczbie kopii, który niesie miejsce początku replikacji ColE1, oporność na ampicylinę i poliłącznik w genie lacZ (Ausubel, F. M. i in., Current Topics in Molecular Biology: Greene Publ. Assn.) Wiley Interscience, NY (1987), pozycje te włączono do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe).

W poliłączniku plazmidu pUC 12 wykonano kilka modyfikacji (Aruffo. A. i in., Proc. Netl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987), pozycję tę włączono do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy). Całkowity plan zmian plazmidu pUC 12 obejmował: zmodyfikowanie poliłącznika dla wprowadzenia identycznego, ale nie spoistego miejsca restrykcyjnego BstXI do klonowania, dodanie fragmentu wypełniającego aby umożliwić łatwe oddzielenie liniowego plazmidu gospodarza, i aby zapewnić ekspresję z promotora lac we wszystkich trzech translacyjnych ramkach odczytu.

W celu dostarczenia miejsca wbudowania obcego DNA z wysoką wydajnością i w celu minimalizacji możliwości ligowania się plazmidu samego ze sobą, do poliłącznika dołączono odwrócone, nie spoiste końce BstXl. Jak przedstawiono na rysunku fig. 1 plazmid pUC12 trawiono najpierw restryktazę BamHI (Etap 1), a następnie plazmid mieszano z dwoma częściowo komplementarnymi syntetycznymi adaptorami oligonukleotydowymi: 15-nu kleotydowym (GATCCATTGTGCTGG) i 11 -nukleotydowym (GTAACACGACC) (Etap 2). Podczas ligowania adaptorów z plazmidem pUC12 powstają dwa nowe miejsca restrykcyjne BstXI, ale przywracane są także pierwotne miejsca restrykcyjne BamHI (Etap 3). Plazmid traktowano następnie kinazą polinukleotydową i ligowano tworząc zamknięty plazmid kołowy (Etap 4). Kiedy plazmid ten traktuje się restryktazą BstXI, powstające końce są identyczne i nie spoiste (oba posiadają wystające odcinki GTGT) (Etap 5).

Drugą modyfikację wykonano dla umożliwienia oczyszczania liniowego plazmidu do klonowania od zanieczyszczeń częściowo strawionym plazmidem, który może ligować się sam ze sobą. Z plazmidu pCDM otrzymano fragment FnuD2 z tępymi końcami o długości 365 par zasad (bp). Kasetka ta lub fragment wypełniający, nie zawierający miejsca restrykcyjnego

167 882

BstX 1 ligowano tępymi końcami z dwoma częściowo komplementarnymi syntetycznymi oligonukleotydami: 12-nukleotydowym (ACACGAGATTTC) i 8-nukleotydowym (CTCTAAAG) (Etap 6). Otrzymane fragmenty z adaptorami posiadają wystające odcinki o długości 4 bp (ACAC) komplementarne do końców zmodyfikowanego plazmidu pUC12 przedstawionego w Etapie 5. Zmodyfikowany plazmid pUC12 ligowano przez adaptory z wstawką z plazmidu pCDM; otrzymaną konstrukcję, nazwaną pUX12, przedstawiono na rysunku, fig. 2. Plazmid pUX12 można odtworzyć z plazmidów pJMS1 lub pJMS23 przez wycięcie wprowadzonych sekwencji DNA Streptococcus. Alternatywnie, można go utworzyć metodami rekombinacyjnymi (lub przez rekombinację homologiczną) stosując plazmid pUC12.

Ponieważ plazmid pUX12 przeznaczony jest do stosowania jako wektor ekspresyjny, korzystne jest dalsze zmodyfikowanie poliłącznika tak, aby zawierał wszystkie trzy możliwe ramki odczytu z promotora lac. Zmiany te pozwalają na uzyskanie poprawnej translacyjnej ramki odczytu sklonowanych fragmentów genu z częstością jeden na sześć: Na przykład, sklonowany fragment można wstawić w wektor w jednej z dwóch orientacji i jednej z trzech ramek odczytu. W celu otrzymania ramki odczytu +1 pl^mid pUX12 trawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI, który trawi w pojedynczym miejscu w poliłączniku. Jednoniciowe lepkie końce 5' uzupełniono wykorzystując aktywność polimerazową 5' -3' polimerazy DNA T4 i ligowano dwa tępe końce. Wynikiem tego jest utrata miejsca restrykcyjnego EcoRI i utworzenie nowego miejsca XMnI (fig. 3). Konstrukcję tę potwierdzono przez wykazanie utraty miejsca EcoRI i potwierdzenie obecności nowego miejsca Xmnl w poliłączniku. Ponadto przeprowadzono sekwencjonowanie dwuniciowego DNA zmodyfikowanego plazmidu pUX12 posiadającego ramkę odczytu +1 stosując standardowe startery sekwencyjne (Ausubel, F. M. i in., Current Topics in Molecular Biology; Greene Publ. Assn. (Wiley Interscience, NY (1987)). Sekwencja DNA wykazała obecność dodatkowych 4 par zasad w poliłączniku i potwierdziła modyfikację plazmidu pUX12 polegającą na uzyskaniu ramki odczytu +1. Plazmid ten nazwano pUX12+1.

W celu otrzymania ramki odczytu -1 wektor pUX12 trawiono enzymem restrykcyjnym SacI, trawiącym w pojedynczym miejscu w poliłączniku tego plazmidu. Jednoniciowe lepkie końce 3 trawiono ponownie do uzyskania tępych końców stosując aktywność egzonukleazy 3' - 5' polimerazy T4, i otrzymane tępe końce ligowano. W otrzymanej sekwencji wyeliminowane powinno być miejsce restrykcyjne SacI, a powstać nowe miejsce FnuD2 (fig. 3). Mapa restrykcyjna plazmidów PuX 12-1 wykazała jednakże, że o ile miejsce restrykcyjne SacI było nieobecne, nie stwierdzono obecności miejsca FnuD2. Ponadto nie byłyjuż obecne miejsca restrykcyjne SmaL/Xmal w poliłączniku. Kilka potencjalnych konstrukcji pUX12-1 zsekwencjonowano po minipreparatyce dwuniciowego DNA. Stwierdzono, że w sześciu zsekwencjonowanych zmodyfikowanych plazmidów w jednym brak było dziesięciu nukleotydów, co tworzyło ramkę odczytu -1 (fig. 3). Sugeruje to, że polimeraza DNA T4 posiada dodatkową aktywność endonukleazy i ponownie wycina dodatkowe dwuniciowe odcinki poliłącznika. Niemniej jednak, otrzymany plazmid posiadał ramkę odczytu -1. Plazmid nazwano pUX12-1.

Stosowanie wektorów pUX-12 do klonowania białek antygenowych Streptococcus grupy B dyskutuje się szczegółowo w poniższych przykładach. W skrócie, DNA pochodzący z Streptococcus grupy B, lub komplementarny do takiego DNA, wprowadza się do wektorów pUX12, pUX12+1 lub pUX12-1, i transformuje nim Escherichia coli. Sklonowane DNA eksprymuje się w E.coli, a lizaty komórkowe testuje w celu określenia, czy zawierają one jakieś białko zdolne do wiązania z antysurowcami przeciw Streptococcus grupy B.

Istnieją liczne potencjalnie interesujące modyfikacje pUX12, które mogłyby zwiększyć jego użyteczność. Na przykład, promotor lac można zastąpić innym promotorem, miejsce początku replikacji można zmodyfikować otrzymując wektor o niższej liczbie kopii, i zmienić można marker oporności na lek.

Szczepionka wytwarzana sposobem według niniejszego wynalazku może nadawać oporność na Streptococcus grupy B przez albo immunizację bierną, albo immunizację czynną. W jednym rozwiązaniu immunizacji biernej szczepionkę podaje się ochotnikowi (człowiekowi lub ssakowi), a otrzymane antysurowice odzyskuje się i bezpośrednio podaje się biorcy, u którego podejrzewa się infekcję spowodowaną przez Streptococcus grupy B.

167 882

Możliwość znakowania przeciwciał lub ich fragmentów znacznikami toksycznymi zapewnia dodatkową metodę leczenia infekcji Streptococcus grupy B kiedy przeprowadza się ten rodzaj immunizacji biernej. W rozwiązaniu tym przeciwciała, lub ich fragmenty, zdolne do rozpoznawania antygenów Streptococcus grupy B, znakuje się przed podaniem ich pacjentowi cząsteczkami toksyn. Kiedy taka przeprowadzona w toksyczną pochodną cząsteczka zwiąże się z komórką Streptococcus grupy B, grupa toksyczna powodować będzie śmierć komórki.

Szczepionkę podaje się kobietom (w lub przed ciążą lub porodem) w czasie i ilości wystarczających do powodowania wytwarzania antysurowic służących do ochrony zarówno kobiety, jak i płodu lub noworodka (przez bierne włączenie przeciwciał przez łożysko). Szczepionka ta zapobiega lub osłabia infekcje Streptococcus grupy B lub innymi organizmami posiadającymi antygeny, które mogą być rozpoznawane i wiązane przez antysurowice przeciw polisacharydom i/lub białkom koniugowanej szczepionki. W znaczeniu tu używanym, szczepionka zapobiega lub osłabia chorobę, jeśli podawanie osobnikowi powoduje całkowite lub częściowe osłabienie (tj. supresję) objawów lub stanów chorobowych, lub całkowitą lub częściową odporność osobnika na chorobę.

Podawanie szczepionki (lub antysurowic które ona wywoła) można stosować w celu albo profilaktycznym, albo terapeutycznym”. Kiedy podaje się ją profilaktycznie, związek (1) dostarcza się przed wystąpieniem jakichkolwiek objawów infekcji Streptococcus grupy B. Profilaktyczne podawanie związku(ów) służy zapobieganiu lub osłabianiu każdej następnej infekcji. Jeśli podaje się ją terapeutycznie, związek (1) dostarcza się po wykryciu objawów aktualnie występującej infekcji. Podawanie terapeutyczne związku(ów) służy osłabianiu każdej aktualnej infekcji.

Czynniki przeciwzapalne można zatem podawać albo przed początkiem infekcji (tak żeby zapobiegać lub osłabić spodziewaną infekcję) lub po rozpoczęciu aktualnej infekcji.

Kompozycja jest określana jako farmaceutycznie dopuszczalna, jeśli biorca może tolerować jej podawanie. Określa się, że taki czynnik podawany jest w terapeutycznie skutecznej ilości, jeśli podawana ilość jest znacząca fizjologicznie. Czynnik jest fizjologicznie znaczący jeżeli wynikiem jego obecności jest wykrywalna zmiana fizjologii biorcy.

Powinno być zrozumiałe dla każdego fachowca w tej dziedzinie, że kiedy szczepionkę wytworzoną sposobem według niniejszego wynalazku podaje się osobnikowi, może ona występować w kompozycji zawierającej sole, bufory, adiuwanty lub inne substancje pożądane do poprawienia skuteczności kompozycji. Adiuwanty są substancjami, które można stosować w celu specyficznego zwiększania specyficznej odpowiedzi immunologicznej. Zazwyczaj, adiuwant i kompozycję miesza się przed wprowadzeniem do układu immunologicznego, lub wprowadza oddzielnie, ale w to samo miejsce immunizowanego zwierzęcia. Adiuwanty można luźno podzielić na kilka grup w oparciu o ich skład. Grupy te obejmują adiuwanty olejowe (na przykład kompletny i niekompletny adiuwant Freunda), sole mineralne (na przykład A1K(S04)2, AlNa(S04)2, AlNH4(S04)2, krzemionkę, glinkę kaolinową i węgiel), polinukleotydy (na przykład kwasy polilC i poliAU) i pewne substancje naturalne (na przykład wosk D z Mycotia^cterium tuberculosis, jak również substancje stwierdzone w Corynebacterium parvum lub Bordetella pertusis i przedstawicielach rodzaju Brucella). Spośród tych substancji szczególnie użyteczne jako adiuwanty są saponiny, takie jak, na przykład, Quil A (Superfos A/S, Dania). Przykłady substancji szczególnie odpowiednich do stosowania w kompozycjach szczepionek podano w Remington’s Pharmaceutical Sciences (Osol, A., red., Mack Publishing Co., Easton, PA, str. 1324-1341 (1980), pozycję tę włączono do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy).

Kompozycje terapeutyczne oparte na tej szczepionce można podawać pozajelitowo przez iniekcję, szybką infuzję, absorpcję nosowo-gardłową, absorpcję przez skórę, lub doustnie. Kompozycje można alternatywnie podawać domięśniowo lub dożylnie. Kompozycje do pozajelitowego podawania obejmują jałowe roztwory wodne lub niewodne, zawiesiny i emulsje. Przykładami rozpuszczalników niewodnych są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje ros'linne, takie jak olej z oliwek, i iniekcyjne estry organiczne, takie jak oleinian etylu. Do zwiększenia przepuszczalności przez skórę i wzmocnienia absorpcji antygenu można stosować

167 882 nośniki lub opatrunki zamknięte. Płynne formy do podawania doustnego mogą generalnie obejmować roztwór liposomów zawierających płynne formy dawkowania. Odpowiednie formy do zawieszania liposomów obejmują emulsje, zawiesiny, roztwory, syropy i roztwory wodno-alkoholowe zawierające powszechnie stosowane rozcieńczalniki obojętne, takie jak oczyszczona woda. Oprócz rozcieńczalników obojętnych, takie kompozycje mogą także zawierać adiuwanty, czynniki zwilżające, emulgujące i zawieszające lub czynniki słodzące, smakowe oraz zapachowe.

Istnieje wiele różnych technik czasowej regulacji immunizacji kiedy stosuje się wielokrotne podawanie. W celu zwiększenia poziomów i różnorodności immunoglobulin wytwarzanych przez immunizowane zwierzę możliwe jest stosowanie kompozycji według wynalazku kilkakrotnie. Zazwyczaj, jeśli stosuje się wielokrotne immunizacje, podaje się je w odstępie jednego do dwóch miesięcy.

Pod definicją skuteczna ilość kompozycji terapeutycznej rozumie się taką ilość, która dostateczna jest do osiągnięcia pożądanego efektu biologicznego. Na ogół dawka potrzebna do dostarczenia skutecznej ilości kompozycji będzie się różnić w zależności od takich czynników, jak wiek zwierzęcia lub człowieka, stan, płeć i zaawansowanie choroby, o ile taka występuje oraz innych zmiennych według oceny fachowców w tej dziedzinie.

Preparaty antygenowe można podawać zarówno w wielokrotnych, jak i jednokrotnych dawkach skutecznej ilości. Skuteczne ilości kompozycji mogą wahać się od 0,01-1000 pg/ml na dawkę, korzystniej 0,1-500 μg/ml na dawkę, a najkorzystniej 10-300 μg/ml na dawkę. Wynalazek zostanie bliżej objaśniony w przykładach wykonania, które nie ograniczają jednak zakresu ochrony.

Przykład I. Wydajność klonowania wektorów pUX12.

Zaprojektowano kilka doświadczeń dla określenia wydajności klonowania wektora pUX12 i dla sprawdzenia, czy transkrypcja według zmodyfikowanej ramki odczytu zachodzi prawidłowo. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono poniżej.

1. W celu w prowadzenia fzegmfntu DNA do wektora pUX i p sko 1struowaro trzy w ariynty wektora pUX 12 (wyjściowy, z gezDalną ramką odczytu), pUx 12+1 i pUX 12-1, które zmieszano w równemelargyph stężeniach. Plazmidy przecięto BstXI, aby wyciąć nieistotny fragment z poliligUrza. Fragment ten oddzielono od plazmidu przy użyciu agarozy o niskim punkcie topnienia lub w gradiencie octanu potasowego (Aruffo, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987), Ausubel, F. M., et al., Current Topics in Mo^^lar Bio^y; Greene Publ. Assn. (Wiley Intrrsρirnρe, NY (1987). DNA przeznaczone do wprowadzenia pocięto enzymami dającymi tępe końce (można użyć dowolnego enzymu). Jeśli zachodzi konieczność, dwuniniowy DNA z końcowymi sekwencjami sygnałowymi, można zmodyfikować w celu otrzymania tępych końców. Tępe końce fragmentów DNA miesza się z dwoma syntetycznymi adapterami eliuenokleotydowyDi. Są to te same adaptery o 12 nokleetydach i 8 nukleonach używane do otrzymania nirirtotnruo fragmentu. Zmodyfikowane fragmenty DNA oddzielono od nirwłąpzonyph syntetycznych oligonoklretydów w gradiencie octanu dotarewego. Fragmenty te włączono do liniowego wektora z rodziny pUX 12, który użyto do transformacji Pałeczki okrężnicy (E. coli).

Dla potwierdzenia małej częstości spontanicznego łączenia się wektorów pUX12, w warunkach dobranych dla łączenia fragmentów DNA z syntetycznymi adapterami, do wektora pUX 12 wprowadzono drugi marker lrkoodorgeśpi. Jak przedstawiono na fig. 1, pUX12 ma gen kodujący d-l!a<^,ttaDazę i niesie oporność na ampicylinę (ampR). Uzasadnieniem włączenia drugiego markera było rIwozzrnir możliwości porównania stosunku liczby wektorów zawierających oba markery oporności na leki do liczby wektorów powstałych przez spontaniczne łączenie wektora pUX 12 i zawierających tylko marker oporności na ampicylinę. Do doliłącznika wektora pUX12, zmodyfikowanego opisanymi powyżej adapterami, wprowadzono gen oporności na tetracyklinę (tet^R) z plazmidu pBR322. Przeprowadzono kilka próbnych ligacji dla ustalenia optymalnego stężenia eligenuklotydewych adapterów i tępych końców oraz stosunku zmodyfikowanych fragmentów DNA i linowych cząsteczek wektora dUX1S używanych do syntezy i transformacji. Używając genu te^ako markera, można było dobrać warunki klonowania tak,

167 882 żeby ponad 99% wyselekcjonowanych transformatorów opornych na ampicylinę posiadało także marker tetR Tak więc częstość spontanicznego łączenia pUX 12 w tak dobranych warunkach jest bardzo niska i nie ma konieczności sprawdzania włączenia fragmentów dNa do poliłącznika przed sprawdzeniem biblioteki DNA w wektorach pUX12.

2. W celu okres lenie odczy hi poltłącznikapUX12, do wektora wprawapzonagen strukturalny, którego sekwencja i produkt jest znany, a który nie posiada własnego promotora. W tym celu wybrano zmutowany gen strukturalny tox niesiony przez plazmid, który opisano w literaturze (Costa, J. J., et al., J. Bakteriel. 148 (1): 124-130 (1981), Michel, J. L., et al., J. ViroI. 42: 510-518 (1982). Plazmid pABC402 przecięto jednocześnie rndenunlraoaml Apal i Hindin (Bishai, W. R., et al.,J. Becteriol. 169: 1554-1563 (1987), Bishai, W. R., et al.,J. Bacteriol. 169: 5140-5151 (1987)), których opis zamieszczono w literaturze. Miejsce cięcia rnkonukleapy Apal leży blisko N-końca, a endonukleazy tuż za C-końcem genu tox. Ten fragment restrykcyjny o wielkości 1,2 kb oddzielono od pozostałego fragmentu o wielkości 4,1 kb wektora pABC402 przy użyciu agarozy o niskim punkcie topnienia.

Do otrzymania tępych końców, przydatnych do klonowania, na fragment tox działano polimerazą DNA faga T4. Aktywność egoenąnlrazowa tego enzymu powoduje odcinanie końca 3’ plazmidu pozostałego po działaniu rnkonunlraoy Apal, a aktywność polimerazowa dopełnia koniec 5’ pozostały po działaniu endenunleaoy Hindin (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Oczyszczony fragment z tępymi końcami włączono w wektory pUX12 zawierające trzy różne ramki odczytu. Pojedyncze trnasformanty wybrano losowo i przy użyciu mapowania restrykcyjnego określono kierunek transkrypcji i ramkę odczytu wprowadzonych fragmentów. Ponadto, określono sekwencję nuklretykową regionów peliłąkonik (akapter) fragment wprowadzony. Zidentyfikowano sześć możliwych kombinacji kierunków transkrypcji i ramki odczytu. Następnie ekstrakty klonów oddzielono przy użyciu techniki Western blotting z próbkami surowicy odpornościowej przeciw toksynie błonicy (Blake, M. S., et al., Analyt. Biochem. 136: 175-179 (1984), Murphy, J. R., et al., Curr. Topics Mikrobiol. and Immun. 118: 235-251 (1985)).

Aktywne białka, podobne do toksyn, wykryto tylko w klonach zawierających gen tox z właściwym kierunkiem transkrypcji i ramką odczytu. Plazmid ten nazwano pUDTAH-1. Sekwencję DNA 2eliłąkznina i początku genu strukturalnego tox pokazano w tabeli 1. Wydzielona sekwencja DNA jest sekwencją początku genu strukturalnego tox’ w wektorze pUDTAH-1. ATG jest sygnałem startowym transkryptu (lacZ’), GAT jest początkiem zmodyfikowanego 2eliłąkonlna wektora pUX12, a GCC jest kodonem startowym właściwej ramki odczytu genu tox’.

Tabela 1

Sekwencje plazmidu pUDTAH

ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGCCCGGG Peliłąkonln (ATG^odon inicjacji translacji genu LacZ)

GATCCATTGTGCTGGAAAG Adaptory eligenąnlretjkewr

CCACC Gen tox’ toksyny błonicy

Przykład II. Oczyszczanie chromosomowego DNA paciorkowca grupy B (Streptokekkus grupy B).

W celu oczyszczenia chromosomowego DNA paciorkowca grupy B, ze szczepu A909 paciorkowca grupy B (Lancefield, R. C., et al., J. Exp. Med. 142: 165-179 (1975)) wyizolowano chromosomowy DNA metodą opisaną przez Hulla i wsp. (Kuli, R. A., et al., Infect. and Immun. 33: 933-938 (1981)) i zmodyfikowaną przez Rubensa i wsp. (Rubens, C. E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7208-7212 (1987)). Przy użyciu mutanelioyny otrzymano protoplasty komórek szczepu A909 paciorkowca grupy B (Ia/c). Otrzymany ekstrakt powierzchni komórkowej zawierał różne białka, które dają reakcję immunologiczną z przeciwciałami powstającymi po kontakcie z bakteriami. Nierozpuszczalną frakcję białek oczyszczono częściowo przy użyciu

167 882 tradycyjnej chromatografii kolumnowej. Dwie frakcje, wśród nich frakcję zawierającą wysokozagęszczone białka o masie cząsteczkowej wynoszącej 14 kilodaltonów (kd) użyto do immunizacji królików. Przeciwciała powstające przeciw tym częściowo oczyszczonym białkom paciorkowca grupy B były zdolne do wytworzenia biernej obrony immunologicznej w mysich testach zjadliwości przeciw różnym typom otoczkowym paciorkowca grupy B, zawierającym białka C.

DNA paciorkowca grupy B oczyszczono przez wirowanie w gradiencie chlorku cezu (CsCl) i DNA chromosomowy dializowano przeciw buforowi TAE, pH 8.0 (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Szczep A909 paciorkowca grupy B ma typ 1 otoczki, powoduje ekspresję białka C i był poprzednio używany do badań białek C (VaItonem, M. V., et al., Microb. Path. 1: 191-204 (1986)). Jest to także szczep paciorkowca grupy B, który stosowano do otrzymywania przeciwciał do testów.

Wydajność chromosomowego DNA paciorkowca grupy B wynosi około 3 do 5 mg z każdych 500 ml całonocnej hodowli paciorkowca grupy B. Oczyszczony DNA trawiono oddzielnie 24 powszechnie stosowanymi enzymami restr/kcyjnymi, a otrzymane fragmenty restrykcyjne rozdzielono na 1.0% żelu agarozowym. Wybierano różne enzymy restrykcyjne, także te, które dają unikalne miejsca cięcia poliłączników powszechnie stosowanych do klonowania DNA. Barwienie bromkiem etydyny (EtBr) wykazało, że wszystkie enzymy dają dyskretny rozkład fragmentów DNA paciorkowca grupy B. Sugeruje to, że żaden z enzymów restrykcyjnych nie modyfikował DNA paciorkowca grupy B.

Aby sprawdzić, czy nie występują żadne inhibitory łączenia DNA, fragmenty restrykcyjne opisane powyżej wytrącono etanolem, umieszczono w buforze do ligacji i inkubowano całą noc w temperaturze I4°C w obecności ligazy DNA. Następnie próbki rozdzielono na 1.0% żelu agarozowym i barwiono EtBr. Otrzymane fragmenty DNA posiadały wyższą masę cząsteczkową, co wskazuje na brak inhibitorów łączenia DNA paciorkowca grupy B.

Przykład III. Przygotowanie biblioteki DNA paciorkowca grupy B.

Przegotowanie biblioteki chromosomowego DNA paciorkowca grupy B w wektorach pUX 12 i ich transformację do pałeczki okrężnicy przeprowadzono według poniższego opisu. Do cięcia DNA paciorkowca grupy B używanego do klonowania wybrano cztery enzymy restrykcyjne dające szeroki rozkład masy cząsteczkowej fragmentów. Wektor pUX 12 i adaptory były najbardziej wydajne, gdy klonowane fragmenty miały tępe końce. Wybrane enzymy restrykcyjne rozpoznają czteronukleotydowe sekwencje i dają po cięciu tępe końce. DNA paciorkowca grupy B trawiono oddzielnie AIuI, FunD2, Haelll i Rsal.

Otrzymane fragmenty restr/kcyjne zmieszano, oczyszczono metodą fenolowo-chloroformową, wytrącono etanolem i ponownie zawieszono w buforze do ligacji (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). 1 pr fragmentów DN /a paciorkowca g^rupy B zmieszano z 3 pg 12-merowy c h i 3 pg 8-merowych sdspterów eligenuOΪeetudowupy. Następnie dodano 3 pi ligyzD DA AfegaT4 (600 jednostek, New England Biolabs) i prowadzono reakcję przez noc w temperaturze 14°C. Wolne iinkery oddzielono od fragmentów DNA paciorkowca grupy B w gradiencie gęstości octanu potasowego (Aruffo, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987)).

Plazmidy pUX 12 o trzech różnych ramkach odczytu trawiono BstXI i nieistotny fragment usunięto na żelu ararozawym o niskim punkcie topnienia. Bibliotekę DNA paciorkowca grupy B przygotowano przez zmieszanie 10 ng 2edyyfiawwaupyh fsa2mnenkw DNA wciOor0kwaa grupy Bi 100 ng liniowego wektora pUX 12 w 100 μ l buforu do ligacji, do którego dodano 0,1 % ligazy DNA faga T4. Reakcję ligacji prowadzono przez noc w temperaturze 14°C, a otrzymane fragmenty DNA następnie zastosowano do transformacji szczepu MC 1061 Pałeczki okrężnicy na płytkach zawierających ampicylinę (Ausubel, F. M., et al., Current Topics in Molecular Bialegu (1987)).

Szesnaście otrzymanych transformantów wyizolowano, hodowano przez noc na pożywce LB i wyizolowano plazmidowy DNA metodą mini-preps. Plazmidowy DNA trswiane BamHI i rozwinięto na 1,0% żelu agarozewum. Wszystkie sprawdzane plazmidy zawierały wstawki o

167 882 wielkości 1,4 kb włączone do wektora pUX12. Na ponad 200 plazmidów testowanych tylko 1 klon nie miał fragmentu DNA paciorkowca grupy B włączonego w poliłącznik.

Przykład IV. Charakterystyka surowicy odpornościowej używanej do sprawdzania biblioteki DNA.

Jak wspomniano wcześniej, surowica odpornościowa i białka C zostały otrzymane przez wielu badaczy (Bevanger, L. et al., Acta Path. Microbio. Soand. Sect. B. 93: 113-119 (1985), Russell-Jones, G. J., et al., J. Exp. Med. 160: 1476-1484 (1984) Wilkinson, H. W., et al., Infec. and Iramunm. 4: 596-604 (1971)).

Przeprowadzono serię doświadczeń powtarzając pracę Valtonena, Kaspera i Levy'ego, którzy wyizolowali białka o masie molowej 14 000 z nadsączów paciorkowca grupy B, który indukuje powstawanie przeciwciał (Valtonem. M. V., et atl., Microb. Path. 1: 191-204 (1982). Doświadczenie to dowiodło, że kiedy inhibitory proteolizy dodano do nadsączów kultury paciorkowca grupy B na początku zagęszczania i oczyszczania białek C, białka o masie molowej 14 000 nie stanowiły głównych białek w nadsączu. Sugeruje to, że te białka powstają w wyniku proteolizy białek C o większej masie cząsteczkowej w nadsączach kultury paciorkowca grupy B.

Przykład V. Optymalizacja warunków badania ekspresji wektora opartego na plazmidzie.

Jak wspomniano wyżej, do wykrywania ekspresji najczęściej stosuje się wektory oparte nafagu λ gT11 (Young, R. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 1194-1198 (1983)). Udało się zwiększyć czułość wykrywania ekspresji wektora plazmidowego pUX12 przez połączenie dwóch wcześniej opisanych technik sprawdzania kolonii bakteryjnych za pomocą przeciwciał. Transformanty z biblioteki DNA hodowano przez noc, a wyrastające kolonie przeniesiono na filtry nitrocelulozowe (Bio-Rad). Kolonie lizowano przez umieszczenie filtrów w atmosferze nasyconej chloroformem (CHC1) w zamkniętym pojemniku w ciągu 30 minut. Następnie filtry umieszczono w buforze lizującym i inkubowano przez noc, jak opisali Helfman i wsp. (Helfman, D. M., et al., Proc. Natl. Acad. USA 80: 31-35 (1983)). Do testowania przeciwciałami użyto dostępnego w handlu lizatu Pałeczki okrężnicy (w stosunku 1:200) i połączonych z peroksydazą chrzanu, oczyszczonych przez powinowactwo kozich immunoglobin IgG przeciw królikowi (w stosunku 1:3000) z zestawu Express-Blot Assay produkowanych przez Bio-Rad Laboratories. Opisane wyżej wstępne traktowanie kolonii chloroformem i całonocna inkubacja z DNazą i lizozymem umożliwiła obniżenie stosunku użytych przeciwciał z 1:500 do 1:5000.

Przykład VI. Wstępna analiza pozytywnych klonów i ich produktów białkowych.

Chromosomowy DNA z biblioteki paciorkowca grupy B umieszczony w wektorach pUX12 bada się wspomnianymi wyżej surowicami odpornościowymi przeciw białkom C. W bibliotece DNA Streptococcus grupy B znajdują się fragmenty średniej wielkości 1,4 kb. Transformanty bada się, jak opisano powyżej, a subklony powtórnie, trzy razy surowicą odpornościową. Z 20 000 przebadanych klonów, 35 niezależnie wyizolowanych klonów reagowało z surowicą odpornościową. Klony nazwano S1 + S35, a wektory zawierające klony pJMS 1 - pJMS35. Klony miały zakres wielkości od 0,9 kb do 13,7 kb, a średnią wielkość 4,5 kb.

Plazmidowy DNA izolowano metodą minipreps, a wbudowane fragmenty cięto czterema endonukleazami. 14 klonów podzielono na trzy grupy na podstawie podobieństwa wielkości wbudowanych fragmentów i rozkładu fragmentów resttykcyjnych w obrębie każdej z grup. Klony S1 i S23, omówione niżej, należą do innych grup.

Porównanie fragmentów restrykcyjnych poszczególnych klonów umożliwiło zidentyfikowanie 24 klonów zawierających popularne fragmenty restrykcyjne. Klony S1 i S23 nie zawierają takich fragmentów.

Ekstrakty klonów przygotowano techniką Western blotting i badano surowicą odpornościową, używaną do badania biblioteki DNA. Zidentyfikowano 6 klas wielkości białkowych antygenów (A-F). Porównanie danych z mapowania restrykcyjnego i Western blotting umożliwiło podzielenie 24 z 35 wyizolowanych klonów na 6 grup kodujących różne antygeny (tabela 2). Ta wstępna klasyfikacja została wykonana w celu uzyskania wstępnego szacunku liczby genów. S1 ma wielkość 3,5 kd i należy do grupy A. S23 ma 13,7 kd i należy do grupy D.

167 882

Tabela 2

Wstępna klasyfikacja klonów białek C Paciorkowca grupy B

Grupa białka	Liczba klonów	Masa cząsteczkowa wstawki (kb)	Zdolność kodowania wstawki DNA	Wielkość antygenu (dakony)
A	6	3,5	136.000	115.000
B	3	1,9	76.000	50.000
C	7	4,4	174.000	130.000
D	6	13,7	>500.000	110.000
E	1	1,7	67.000	50.000
F	1	0,9	36.000	15.000

Ekstrakty Western blots klonów badano także surowicą odpornościową przeciw szczepowi Stredtepepρus grupy B, który nie produkuje białek C i otrzymano tylko jeden pozytywny klon (z grupy B). Wynika z tego, że większość wyizolowanych klonów wytwarzających białka jest unikalna dla szczepów wytwarzających białka C. Białka te nie występują powszechnie we wszystkich szczepach Strrdtepocpor grupy B.

Przykład VII. Charakterystyka klonowanych sekwencji genowych

Nie określono jeszcze dokładnej liczby białek C produkowanych przez Strrdtopoccur grupy B. Wcześniejsze badania immunologiczne rozewic odpornościowych z C. D. C. przeciw białkom C wskazują na istnienie czterech odrębnych antygenów (Brady, L. J., et al., J. Infect. Dis. 158 (5): 965-972 (1988). Wstępna genetyczna immunologiczna charakterystyka otrzymanych klonów białek C Strrdtopepρur grupy B sugeruje występowanie czterech lub pięciu genów kodujących białka C w genomie Strrdtepopcur grupy B. Przeprowadzono dwa rodzaje eksperymentów, aby stwierdzić, czy produkty klonowanych genów są białkami C.

Jak wspomniano wyżej, w trakcie badań białka C podzielono na dwa fenotypy: pierwsza grupa to białka wrażliwe na degradację pepsyną, a niewrażliwe na tzydrynę (nazwane TR lub a), dryga grupa to białka wrażliwe na pepsynę i trydrygę (nazwane TS lub p) (Johnson, D. R., et al., J. Clin, Microbiol. 19: 506-510 (1984), Russell-Jones, G. J., et al., J. Exp. Med. 160: 1476-H88(1984).

Do badania produktów klonowanych genów używa się wzorcowych surowic odpornościowych przeciw białkom α i β (B^an^r, L., et al., Acta Path. Miczebie. Scand. Sect. B. 87:51-54 (1979); Brvaggrz, L., et al., Acta Path. Microbio. Scant Sect. B. 89:205-209 (1981); B^^ger, L., et al., Acta Path. Microbio. Scant, Sect. B. 91: 231-234 (1983); B^an^r, L., et al., Acta Path. Miρzebie. Scant. Sect. B. 93: 113-119 (1985); B^nger, L., et al., Acta Path. Miρrebie. Immunol. Scand. Sect. B. 93: 121-124 (1985), których opis zamieszczono w literaturze.

Surowica eddezgeśpiewa a rozpoznaje białka z grupy D, a surowica odpornościowa [ białka z grupy A. Białka te poddano trawieniu pepsyną i tiypsyną. Białka grupy D są wrażliwe na pepsynę, ale nie na trydrygę, natomiast białka grupy A są wrażliwe na oba enzymy. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi badaniami i dowodzą, że udało się klonować przynajmniej dwa geny kodujące białka C.

Charakterystyczną cechą białek Cjest ich zdolność do stymulacji wytwarzania przeciwciał przeciw szczepom Stredteρepρor grupy B produkującym białka C. Do wytwarzania przeciwciał przeciw produktom klonowanych genów można stosować kilka technik. Na przykład, lizaty klonów E. coli można bezpośrednio wstrzykiwać królikom w celu stwierdzenia, czy te lizaty zawierają białka zdolne do stymulacji wytwarzania przeciwciał przeciw białkom E. coli lub Strrdteceppor grupy B. Otrzymana surowica może być przed testem wytrącana lizatem E. coli, żeby zmniejszyć liczbę przeciwciał reagujących krzyżowo. Taki lizat może być używany do zmniejszania liczby przeciwciał reagujących krzyżowo, zarówno przy badaniu wyrosłych kolonii jak i w technice Western blotting, używanej do badania ekstraktów komórkowych Stredtececpur grupy B i częściowo oczyszczonych białek Stzrptopeppus grupy B.

167 882

Wybrane klony z grup A, B i D sonifikuje się i wstrzykuje królikom, aby wywołać powstanie surowicy odpornościowej przeciw klonowanym białkom antygenowym Streptococcus grupy B (Lancefield, R. C., et al., J. Exp. Med. 142: 165-179 (1975), Valtonen, M. V., et al., Microb Path. 1: 191-204 (1986). Kontrolnym królikom wstrzykuje się bakterie E. coli zawierające wektor pUX12 bez wstawionych w poliłącznik fragmentów dNa. Otrzymane surowice odpornościowe są wytrącane lizatem z E. coli i testowane techniką Western blotting wobec ekstratów klonów z biblioteki DNA. Sposób ten umożliwia stwierdzenie, czy wśród klonów znajdują się epitopy dające reakcje krzyżowe i czy otrzymane surowice reagują dokładnie z klonowanymi białkami, zidentyfikowanymi we wstępnych badaniach.

Wytrąconą surowicę odpornościową można także testować na mysim modelu obrony. W tym klasycznym modelu, nastrzykuje się myszy dootrzewnowo surowicą królika (Lancefield, R. C., et al., J. Exp. Med. 142: 165-179 (1975). Następnego dnia nastrzykuje się ponownie dawką LD 90 żywych bakterii Streptococcus grupy B produkujących białka C. Określa się liczbę myszy martwych po 48 h.

Dla określenia immunogenności białek kodowanych przez klonowane sekwencje genowe, bakterie E. coli zawierające wektory pJMS1 i pJMS23 namnaża się i używa do przygotowania ekstraktów komórkowych. Ekstrakty te są następnie używane do immunizowania królików. Powstające w odpowiedzi na immunizację surowice odpornościowe testuje się stosując mysi model ochrony.

Po przeprowadzeniu eksperymentów z mysim modelem ochrony stwierdzono, że surowice odpornościowe indukowane przez klony należące do grupy A, D (odpowiednio S1, S23) działają ochronnie. Surowica odpornościowa indukowana przez klon z grupy C nie działa ochronnie, ponadto surowica kontrolna także nie działała ochronnie. Surowice odpornościowe indukowane przez klony z grupy C oddziaływały ponadto z białkami ekstrahowanymi ze szczepów Streptococcus grupy B nie produkującymi białek C. Ta grupa białek nie koduje białek C. Podsumowując, wyizolowano 5 lub 6 grup klonów, które nie kodują białek unikalnych dla szczepów Streptococcus grupy B produkujących białka C.

Wstępna analiza biochemiczna, immunologiczna i funkcjonalna wykazała, że wyizolowano przynajmniej dwa geny (S1, S23) kodujące białka C. Jest to pierwsza izolacja pojedynczego, polipeptydowego produktu genu Streptococcus grupy B, który może indukować odpowiedź immunologiczną. Przeciwciała do S1 są zdolne do łączenia się z dwoma prążkami ekstraktu z A909 o masie 50, 60 kd. Przeciwciała do S23 są zdolne do łączenia się z regularnie powtarzającym się układem prążków z ekstraktu ściany komórkowej Streptococcus grupy B o masie cząsteczkowej od 40 do > 180 kd. Monoklonalne przeciwciało do ekstraktu z A909 przejawia tę samą zdolność do łączenia się z wymienionym układem prążków. Sugeruje to, że przeciwciała rozpoznają pojedynczy epitop w różnych białkach i sugeruje regularnie powtarzającą się sekwencję aminokwasów. Białka rozpoznawalne przez surowicę odpornościową S1 są wrażliwe na pepsynę i trypsynę, natomiast rozpoznawalne przez surowicę odpornościową S23 są wrażliwe na pepsynę, ale nie na trypsynę. Eksperymenty wykazały, że częściowo oczyszczone białka z Streptococcus grupy B i otrzymane z klonowanych genów Streptococcus grupy B należą do a i β antygenów białek C Streptococcus grupy B.

Otrzymane 35 możliwych klonów białek C, jakie opisano powyżej, może być scharakteryzowane genetycznie i immunologicznie w celu określenia liczby wyizolowanych genów. Ponadto izolacja tych klonów może umożliwić identyfikację genów biorących udział w ochronie immunologicznej przed infekcjami Streptococcus grupy B. Prawdopodobnie, surowice odpornościowe używane do otrzymania wyjściowych klonów, wykrywają także inne białka poza białkami C. Stosowanie tych białek w leczeniu infekcji Paciorkowcem grupy B jest także rozważane w tym wynalazku, ponieważ głównym celem tego wynalazku jest izolacja i identyfikacja białek zaangażowanych w wywołanie odpowiedzi immunologicznej, a surowice odpornościowe wytwarzane przeciw produktom tych klonów mogą być badane na mysim modelu ochrony. Geny wytwarzające białka, które działają ochronnie są preferowanymi białkami do przygotowania szczepionek sprzężonych.

167 882

Jak wspomniano powyżej, wstępne przebadanie chromosomowego DNA paciorkowca grupy B w bibliotece genów w wektorze pUX 12/Pałeczki okrężnicy, przy użyciu surowic odpornościowych, umożliwiło niezależne wyizolowanie 35 klonów. Porównanie danych z mapowania resttykcyjnego i Western blottingu umożliwiło podzielenie 24 z 35 wyizolowanych klonów na 6 grup kodujących różne antygeny (tabela 2). Takie postępowanie umożliwia szacunkowe określenie liczby wyizolowanych genów.

Do późniejszej charakterystyki klonów korzystnie używa się kolonii, aby sprawdzić, który klon zawiera popularne sekwencje DNA. Pojedynczą kolonię każdego klonu umieszcza się w studzience zawierającej podłoże LB i inkubuje przez całą noc. Jako kontrolnych kolonii używa się E. coli i E. coli zawierającej plazmid pUX12. Całonocne hodowle przenosi się na filtry nitrocelulozowe leżące na szalkach zawierających zestalone agarem podłoże hodowlane. Szalki inkubuje się ponad 8 godzin w temperaturze 37°C, a filtry nitroceju]ozowe ze świeżo wyrosłymi koloniami poddaje się hybrydyzacji DNA-DNA. Próbki przygotowuje się z biblioteki fragmentów DNA Streptococcus grupy B w wektorach pUX12. Do otrzymywania z klonów plazmidowego DNA używa się techniki mini-preps. Poliłącznik wektora pUX12 ma sekwencje rozpoznawalne przez BamHI i BatXI po każdej stronie wstawionego fragmentu, dlatego fragment DNA Streptococcus grupy B jest wycinany z plazmidu przy użyciu BamHI lub BatXI. Szczęśliwie, chromosomowy DNA Streptococcus grupy B ma tylko kilka sekwencji rozpoznawalnych przez BamHI i jego fragmenty są wycinane z wektora przez BamHI jako pojedyncze fragmenty DNA. Do oddzielenia DNA wektora od wstawionego fragmentu używa się agarozy o niskim punkcie topnienia. Wstawione fragmenty wycina się z żelu agarozowego i bezpośrednio znaczy przez losowe znaczenie końców. Znaczonych fragmentów używa się następnie do badania DNA kolonii. W rezultacie można zidentyfikować klony zawierające DNA o podobnych sekwencjach.

Bazując na informacjach uzyskanych opisaną wyżej metodą, 35 wyizolowanych klonów podzielono na grupy o podobnych sekwencjach DNA. Każdą grupę mapowano restir/kcyjnie, aby określić związki pomiędzy poszczególnymi klonami i podobieństwa DNA. Ponieważ wyjściowy plazmid zawiera wiele unikalnych sekwencji restrykcyjnych, obecnych tylko w obrębie poliłącznika wiele mapowań restrykcyjnych może być wykonywanych przy użyciu techniki mini-preps bez konieczności osobnego oczyszczania fragmentów. Porównanie danych ze zbadania kolonii ze szczegółową mapą restrykcyjną umożliwia określenie liczby wyizolowanych loci genetycznych. Jeśli jakieś grupy klonów nie zawierają interesujących genów, może być konieczne użycie ich do izolacji innych bardziej kompletnych kopii genów z biblioteki DNA. Jednakże, na podstawie otrzymanego szerokiego rozkładu wielkości wyizolowanych 35 klonów, można przypuszczać, że niektóre klony mogą reprezentować otwartą ramkę odczytu.

Przed przystąpieniem do analizy genetycznej, korzystnie przygotowuje się surowice odpornościowe przeciw produktom wyizolowanych genów i przy użyciu mysiego modelu ochrony określa się zdolność surowicy do ochrony myszy przed infekcjami wywołanymi Streptococcus grupy B (Lancefield, R. C., et al., J. Exp. Med. 142: 165-179 (1975), Valtonen, M. V., et al., Microb. Path 1: 191-2(^(1986).

Klon kodujący białko, które może indukować powstawanie przeciwciał jest preferowany przy przygotowywaniu sprzężonych szczepionek. Klony kodujące białka, które nie indukują powstania przeciwciał, mogą być później zbadane w celu określenia ich przydatności w przygotowywaniu szczepionek. Ponieważ białka C są związane z błonami, brak indukcji przeciwciał przez produkty niektórych klonów może wynikać z niestabilności tych białek w E. coli i w wektorach o wielu kopiach. Problem ten powstał także przy klonowaniu innych białek związanych z błonami z Streptococcus grupy A i B (Kehoe, M., et al., Infect, and Immun. 43: 804-810 (1984). Schneewind, O., et al., Infect, and Immun, 56: 2174-2179 (1988). Kilka z 35 klonów wyizolowanych we wstępnych badaniach wykazuje cechy morfologiczne małych kolonii. W dodatku niektóre z tych klonów są niestabilne i tracą część fragmentów DNA Streptococcus grupy B włączonego do poliłącznika. Istnieje kilka metod stabilizacji takich klonów. Są to: klonowanie do wektora o małej liczbie kopii lub klonowanie za promotor, który można

167 882 regulować przez inkubację w temperaturze 30°C zamiast w temperaturze 37°C, klonowanie do wektora, który został przystosowany do gromadzenia białek związanych z błonami. W dodatku, możliwa jest transformacja plazmidu, do szczepu E. coli pcnB, który rozcina kopie plazmidów pochodzących od pBR322, takie jak pUX12 (Lopilato J. et al., Mol. Gen Genet. 205: 285-290 (1986), których opis zamieszczono w literaturze).

Niezdolność wyizolowanych klonów do wytwarzania białka, które indukuje powstawanie przeciwciał, może wskazywać także na utratę przez to białko epitopu, ważnego w reakcji ochronnej. Taki przypadek zachodzi, gdy kompletny gen został klonowany lub nie może ulec ekspresji w E. coli. Problem powstaje także jeżeli zachodzi potranskiypcyjna obróbka białek C w Streptococcus grupy B, natomiast produkty genów białek C w E. coli nie ulegają takiej obróbce. Może być konieczne wyizolowanie kompletnego genu lub przeniesienie go do szczepu, w którym może ulegać ekspresji.

Niezdolność wyizolowanych klonów do wytwarzania białka, które indukuje powstawanie przeciwciał, może wynikać także z faktu, że przeciwciała indukowane przez antygeny E. coli mogą różnić się od przeciwciał indukowanych przez natywne białka C Streptococcus grupy B. Zlizowane ekstrakty bakteryjne używane do immunizacji królików zawierają wiele antygenów białkowych E. coli. Dlatego może być konieczne otrzymanie surowicy odpornościowej do testowania modeli zwierzęcych, przeciw częściowo oczyszczonym produktom wyizolowanych genów, a nie całych komórek.

Każdą klonowaną grupę białek Streptococcus grupy B zdolną do indukcji przeciwciał można nazwać białkami C. Wytworzone surowice odpornościowe mogą być użyte do lokalizacji tych białek.

Przykład VIII. Mapowanie, charakteryzacja i sekwencjonowanie genów kodujących białka C.

W celu scharakteryzowania genów kodujących białka C przygotowuje się dokładną mapę genetyczną i określa sekwencję ich DNA. Takie mapowanie korzystnie wykonuje się przy użyciu techniki Southern blotting. Przez określenie sekwencji DNA genów kodujących białka C, można określić strukturę genów, a także ich miejsca wiązania z rybosomami, prawdopodobny promotor, sekwencje sygnałowe i sekwencje powtarzające się. Sekwencje DNA korzystnie porównuje się z biblioteką znanych sekwencji DNA, aby wykryć ewentualne homologie z innymi znanymi genami. Często możliwe jest przewidzenie struktury, funkcji i umiejscowienia białka na podstawie jego sekwencji aminokwasowej.

Techniki Southern blotting korzystnie używa się do określenia, czy geny są sprzężone. Chromosomowy DNA Streptococcus grupy B trawi się oddzielnie kilkoma enzymami restrykcyjnymi i określa się sekwencję zawierające sześć lub więcej par zasad, w celu otrzymania większych fragmentów chromosowego DNA zawierających więcej niż jeden gen. Oligonukleotydy otizymane z każdego trawienia rozwija się na żelu agarozowym i przenosi na nitrocelulozę. Następnie hybrydyzuje się ze znaczonymi fragmentami opisane wyżej biblioteki DNA. Jeżeli dwa klony, które różnią się mapami resttykcyynymi, wiążą się z podobnymi fragmentami chromosomowego DNA, świadczy to, że są one częściami jednego genu lub dwoma genami sprzężonymi. Istnieje kilka sposobów klonowania dużych genów do późniejszych badań. Można przygotować bibliotekę kosmidów DNA Streptococcus grupy B i testować metodą hybrydyzacji, używając jako próbki interesującego DNA. Gdy otrzyma się klon zawierający dwa lub więcej sprzężonych genów, można je mapować restrykcyjnie i badać ekspresję antygenów, tak jak opisano dla wcześniej opisanych klonów.

Identyfikacja opisanych powyżej klonów umożliwiła określenie ich sekwencji nukleotydowej. Jeżeli klony uzyskano przy pomocy wektora pUX12 można zastosować sekwencjonowanie dwuniciowego DNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy, do badania oligonukleotydów modyfikujących poliłącznik. Ta technika była wcześniej stosowana do charakteryzowania plazmidu pUX12 i umożliwia szybkie sekwencjonowanie modyfikujących oligonukleotydów, używanych do sekwencjonowania genów większych niż 600 par zasad. Dlatego sekwencjonowanie DNA genów kodujących białka C korzystnie prowadzi się przez klonowanie w M13.

167 882 jedgegiplowym syst^^ie sekwencjonowαgiα DNA (Ausubel, F. M., et al., Current Topics in Moleρulaz Biolog (1987).

Określenie sekwencji DNA genów kodujących białka C zapewnia uzyskanie podstawowych informacji dotyczących struktury, funkcji i regulacji genów i ich produktów. Jak omówiono wcześniej hetezogengeść wielkości wyizolowanych białek C i ich zróżnicowanie antygenowe sugeruje występowanie całej rodziny genów lub mechanizm dotzagrkzyppyjgej obróbki modyfikującej produkty transkrypcji genów kodujących białka C (Fn-rieri, P. et al., Infect. Immun. 27: 1023-1032 (1985). Białka M Streptepeppur grupy A omówiono wcześniej jako przykład takiego przypadku (Scott. J. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1822-1826 (1985). Chociaż hybrydyzacja DNA kodującego białka M nie wykazała homolo^ z chromosomowym DNA Saredtopepcur grupy B mogą istnieć strukturalne homologie pomiędzy tymi sekwencjami (Hollinghead, S. K. et al., J. Biok. Chem. 261: 1677-1686 (1986), Scott, J. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 82: 1822-1826 (1985), Scott, J. R. et al., Infec and Immun. 52: 609-612 (1986). Sekwencję DNA genów kodujących białka C korzystnie porównuje się z biblioteką znanych sekwencji DNA. Ponadto porównuje się sekwencje αminokwarewe produktów genów kodujących białka C ze znanymi sekwencjami aDigokwarowyDi.

Przykład IX. Występowanie genów kodujących białka C.

W celu określenia występowania genów kodujących białka C, wyizolowano chromosomowy DNA z różnych klinicznych i laboratoryjnych serotypów Stzepteceppus grupy B i porównano metodą Southern blotting z genami kodującymi białka C. Ponadto porównano ekspresję frnetydewą metodą precyditαpji i strukturę genetyczną metodą hybrydyzacji DNA-DNA, w celu uzyskania informacji dotyczących ekspresji genów kodujących białka C. Próbek genów kodujących białka C użyto do porównania chromosomowego DNA innych typów Saredtopopcur grupy B i innych bakteryjnych patogenów.

Przygotowane i znakowane próbki genów kodujących białka C pochodziły głównie z ezyulgalgych szczepów Streptopopcos grupy B, używanych przez Lagcefirlda (Ltgpefield, R.

C. et al., J. Exp. Med. 142: 165-179 (1975). Badanie kolonii 24 klinicznych i labezatoryjgyph serotypów przrpzowadzoge metodą ^tedzienkową opisaną powyżej. Zdolność różnych szczepów do hybrydyzacji z DNA genów kodujących białka C, porównano z fenotydewą charakterystyką łączenia tych szczepów z surowicami odpornościowymi najczęściej używanymi przeciw białkom C. W ten sposób można określić które serotypy posiadają kopie genów kodujących białka C i czy geny te ulegają ekspresji.

Szczepy, których DNA hybrydyzował z DNA genów kodujących białka C badano używając tw:hniki Southern blettlgg, w celu określenia wielkości, struktury i lokalizacji ich genów kodujących białka C. Chromosomowy DNA wyizolowany z serotypów Stzeptepeppur grupy B, które hybrydyzowały z DNA genów kodujących białka C trawiono enzymami restiykcyinymi, rozwijano na żelu auαrezewyD i drzenerzege na nitrocelulozę. To DNA sprawdzano z DNA genów kodujących białka C. W ten sposób można określić czy występują różnice w lokalizacji i wielkości tych genów, w różnych rerotydaρh Strrptoceppus grupy B i porównać ze szczepami klinicznymi (potencjalnie zjadliwymi) i laboratoryjnymi (a także z tymi które występują klinicznie, ale nie wywołują infekcji).

Próbki DNa genów kodujących białka C, korzystnie używa się także do badania innych szczepów Streptopopcur grupy B i różnych bakterii patogennych. Szczepy dapiorkewρów wytwarzają także inne białka związane ze zjadliwością, między innymi białka M i G (Fahnestock, S. R. et al., J. Bact. 167 (3): 870-880 (1986), Heath, D. G. et al., Infect and Immun. 55: 1233-1238 (1987), Scott, J. R. et al., Infec and Immun. 52: 609-612 (1986), Walker, J. A. et al., Infect and Immun. 55: 1184-1189 (1987), których opis zamieszczono w literaturze).

Szczepy przeznaczone do sprawdzenia bada się najpierw na występowanie jakichkolwiek homologi z genami kodującymi białka C metodą porównywania kolonii. Następnie kolonie pozytywne porównuje się techniką Southern blottigu z DNA genów kodujących białka C, w celu zlokalizowania i określenia wielkości homologi, takich jak części białka C, rozpoznawane przez fragment Fc przeciwciała, a służące do zakotwiczania się w błonie, lub regiony heDeleuipzgr z innymi genami o podobnej funkcji w innych bakteriach.

167 882

Przykład X. Modyfikacja genów kodujących C Streptococcus grupy B.

Białkom C przypisuje się wiele zjadliwych cech, takich jak oporność na opsonizację lub hamowanie degradacji wewnątrz komórkowej występującej po fagocytozie (Payne, N. R. et al., J. Infect. Dis. 151: 672-681 (1985), Payne.N. R. et al., Infect and Immun. 55:1243-1251 (1987). Dla lepszego zrozumienia zjadliwości białek C, otrzymano izogeniczne szczepy Streptococcus grupy B, w których geny kodujące białka C są zmutowane. Szczepy te testowano na szczurzym modelu noworodkowym (Zeligs, B. J. et al., Infect and Immun. 37: 255-263 (1982). Do otrzymania izogenicznych szczepów Streptococcus grupy B, używanych do badań zjadliwości białek C, można użyć dwóch metod. Korzystnie używa się metody mutagenezy transpozonowej, w której można użyć samoistnie-włączającego się transpozonu Tn916. Można też zastosować mutagenezę miejscową. Brak efektywnej metody manipulacji genetycznej w genomie Streptococcus grupy B ogranicza zastosowanie nowych technik genetycznej modyfikacji genów Streptococcus grupy B i otrzymanie izogenicznych szczepów, służących do badań zjadliwości (Lopilato, J. et al.. Mol, Gen. Genet. 205: 285-290 (1986), których opis zamieszczono w literaturze).

Mutagenoza transpozonowa jest najczęściej stosowaną techniką w otrzymywaniu izogenicznych szczepów, różniących się ekspresją antygenów związanych ze zjadliwością i jej zastosowanie do mutagenizowania Streptococcus grupy B jest dobrze udokumentowane (Caparon. M. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8677-8681 (1987), Rubens, C. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7208-7212 (1987), Wanger, A. R., Res. Vet. Sci. 38: 202-208 (1985), Weiser, J. N. et al.. Trans Assoc. Amer. Phys. 98: 384-391 (1985), których opis zamieszczono w literaturze). Rubens i wsp. wykazali przydatność Tn916 do badań otoczki Streptococcus grupy B (Rubens, C. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7208-7212 (1987). Transpozon Tn916 można przenieść do Streptococcus grupy B z Streptococcus faecalis, jak to wcześniej opisano (Wanger, A. R. Res. Vet. Sci. 38: 202-208 (1985), którego opis zamieszczono w literaturze). Szczepy selekcjonowano na obecność markerów oporności na antybiotyki, a kolonie badano na brak ekspresji białek C przy pomocy specyficznych surowic odpornościowych, jak opisano powyżej. Szczepy które nie wytwarzały białek C, mapowano, używając techniki Southern blotting w celu zlokalizowania wstawek w genach kodujących białka C. Oryginalny transpozon Tn916 niesie oporność na tetracykliny, jednakże ostatnio wstawiono do niego także gen oporności na erytromycynę (Rubens, C. E. et al., Plasmid 20: 137-142 (1988). Konieczne jest zbadanie, czy po mutagenezie transpozonem Tn916, zmutowany szczep posiada tylko jedną kopię Tn916 i czy transpozon włączył się w obrębie genów kodujących białko C.

Przystosowanie tej techniki do usuwania genów kodujących białka C z genomu Streptococcus grupy B jest łatwe, chyba że, geny kodujące białka C będą niezbędne do przeżycia Streptococcus grupy B. Jednakże opisano szczepy Streptococcus grupy B nie wytwarzające białek C w wykrywalnych ilościach, poza tym jest rzadkością, żeby determinanty zjadliwości bakteryjnej były niezbędne do wzrostu in vitro. Użycie Tn916 do identyfikacji sekwencji regulatorowych genów kodujących białka C będzie dodatkowo badane.

W przypadku, gdy wymagane są specyficzne mutacje lub geny kodujące białka C są niezbędne do życia Streptococcus grupy B, można stosować technikę mutagenezy miejscowej (na przykład do otrzymywania mutantów warunkowych). Mutagenezy miejscowej można używać do analizy genetycznej białek Streptococcus grupy B. Jednym z problemów ograniczających zastosowanie tej techniki do Streptococcus grupy B są trudności występujące podczas transformacji. Elektroporacja poprawiła nieco szanse wprowadzenia DNA do komórek Streptococcus grupy B i innych bakterii trudnych do transformacji (Shigekawa, K. Biotech. 6: 742-751 (1988), której opis zamieszczono w literaturze). Transformacja Streptococcus grupy B z zastosowaniem elektroporacji może pomóc przezwyciężyć te trudności. Jest możliwe zastosowanie mutagenezy miejscowej do polepszenia komplementacji i wprowadzenia genów kodujących białka C do szczepów paciorkowca grupy B, które nie wytwarzają białek C. Każdej z wymienionych niżej technik można użyć do wprowadzenia natywnego lub zmutowanego genu kodującego białka C do szczepu Streptococcus grupy B. Na przykład, można w klon genu kodującego

167 882 białka C w plazmidzie pUX 12 włączyć marker leneopernośki’ Korzystny jest marker lekooproneśki, który może ulec ekspresji w paciorkowcu grupy B, ale normalnie nie jest obecny. Tak zmodyfikowany gen kodujący białka C w wektorze pUX12 transformuje się do Streptokokcus grupy B przy użyciu elentre2oracji (ShigekawaK. et al., BioTech 6: 742-751 (1988), której opis zamieszczono w literaturze). Jeśli plazmid pUX12 nie może być replikowany w Strapto^^^ grupy B, te szczepy które wymagają fenotypu oporności na leki, prawdopodobnie uzyskają go przez rekombinację homologiczną pomiędzy genem kodującym białka C na chromosomie GB gospodarza a zmutowanym genem kodującym białka C z pUX12. Mutanty można badać jak opisano powyżej’ Jeśli nie ma sekwencji homologicznych w szczepie biorcy, można otrzymać wektor z genem kodującym białka C wstawionym w znany gen Stre2tekeckus. Korzystnie w natywny marker lekooporności paciorkowca grupy B. Po elentro2erakji taka konstrukcja plazmidowa powinna włączyć się do chromosomu poprzez rekombinację homologiczną.

ZmOdyfikowane geny kodujące białka C można także włączać do chromosomu Streptocokkus grupy B przez wstawienie genów do samoistnie-włączającego się transpozonu Tn916 i włączenie zmodyfikowanych transpozonów przez łączenie S^p^occ^ faecalis. Technikę tę zastosowano z powodzeniem modyfikując Tn916 genem oporności na erytromycynę i wstawiając ten gen w chromosom Stre2tokocρus grupy B (Rubens, C. E. et al., Plasmid 20: 137-1-42 (1988). Konieczne jest zbadanie czy po mutagenezie transpozonem Tn916, zmutowany szczep posiada tylko jedną kopię Tn916 i czy transpozon włączył się w obrębie genów kodujących białka C.

Przykład XI. Ocena roli białek C w zjakliwości S^p^occ^ grupy B.

Z wcześniejszych badań wynika, że szczepy Stre2tokokcus grupy B nie są izegenicznr co do zawartości białek C (Ferrieri, P. et al., Revl Inf. Dis. 10 (2): 1004-1071 (1988). Dlatego nie można stwierdzić, czy zaobserwowane różnice w zjadliwości są związane z białkami C, czy z innymi czynnikami. Uzyskanie szczepu izegenlkznego, posiadającego nieuszkodzone geny kodujące białka C lub ich delecję, pozwoliłoby określić rolę białek C w zjadliwości. Do określenia zjakliweśki szczepy korzystnie testuje się na szczurzym modelu noworodkowym, a do określenia własności immunologicznych na modelu ochrony myszy. Drugim, ważnym testem określającym stopień ojadliwości jest zdolność zmutowanego genu do przywrócenia zjakliweścl przez rewersję alleliczną. Wpływ białka C na zjadliwość można określić włączając geny kodujące białka C do szczepów Strap^oc^ grupy B, które nie mają tych genów lub mają je nieaktywne i badając zjadliwość otrzymanych szczepów na wyżej opisanych modelach zwierzęcych.

Izogeniczne szczepy Streptokeckus grupy B, w których geny kodujące białka C są indywidualnie zmutowane można uzyskać używając transpozonu albo stosując mutagenezę miejscową. Aby określić czy nastąpiło tylko pojedyncze wstawienie w chromosom, szczepy takie korzystnie charakteryzuje się techniką Southern blotting. Położenie wstawień sprawdza się za pomocą omówionych wyżej odpowiednich technik mapowania struktury genetycznej. Izogeniczne szczepy testuje się określając zjadliwość w szczurzym modelu noworodkowym (Zeligs, B. J. et al., Infec. and Immun. 37: 255-263 (1982).

Mutageneza transpozonowa pozwala na identyfikację genów regulatorów ekspresji białek C. Na przykład, szczepy zawierające dziki typ genów kodujących białka C, nie wytwarzają białka C po mutagenezie transpozonowej, w której transpozon nie włączył się w gen kodujący białko C, a wywoła muzaccę genów regulatorowych. Ten sposób był z powodzeniem do charakterystyki locus mry, który odgrywa rolę w regulacji ekspresji białka M Streptocokkus grupy A (Caparon, M. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 8677-8681 (1987), Robbins, J. C., et al., J. Bacteriol 169: 5633-5640 (1987), którego opis zamieszczono w literaturze). Takimi metodami można się także posługiwać w tworzeniu szczepów, które wytwarzają nadmierne ilości białek C lub które wytwarzaj białka C o zmienionej zjadliwoH lub immunogenności.

Przykład XII. Lokalizacja białek C Streptocokcus grupy B i ocena ich zdolności do wiązania immunoglobulin.

Lancefield i inni wykazali, że przeciwciało do białek C wiąże się z błoną zewnętrzną Strr2tokekkus grupy B (Lancefield, R. C. et al., J. Exp. Med. 142: 165-179 (1975), Wagner, B.

167 882

2.3 et al., J. Gen. Microbiol. 118: 95-105 (1980). Sugeruje to, że białko C jest białkiem błony zewnętrznej. Białka C można także izolować z nadsączu kultur Serepeoceppus grupy B, co wskazuje, że białka te mogą być wydzielane przez Sereptopopcus grupy B lub w szybkim tempie tracone z powierzchni komórki. Sekwencje DNA i produktów genów kodujących białka C są użyteczne do określenia struktury i funkcji białek C. Jedna potencjalnie zjadliwa determinanta, powszechnie opisywana dla białek C, posiada zdolność wiązania immuneg1obu1iny IgA (Ferrieri, P. etal., Rev. Inf. Dis. 10(2): 1004-1071 (1988), Russell-Jones, G. J. et al., J. Exp. Med. 160: 1^1^-^-417^1(1984).

Do zlokalizowania determinant powierzchniowych komórki, rozpoznawalnych przez swoiste przeciwciała, można użyć mikroskopu immuno-elektronowene. Otrzymaną surowicę edperneściową przeciw białkom C Streptopepcus grupy B inkubuje się ze szczepami Serepteρopρus grupy B wytwarzającymi białka C. Do wykrywania antygenu na powierzchni komórki używa się połączonych z ferrytyną kozich immunen1ebu1in IgG przeciw królikowi, jak opisano poprzednio (Rubens, C. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 7208-7212 (1987), Wagner B. et al., J. Gen Miprebie1. 118: 95-105 (1980).

Proste określenie zdolności białek C do wiązania immunen1obu1in można oszacować za pomocą techniki Western blotting. Ekstrakty komórkowe klonów E. coli zawierających geny kodujące białka C oraz ekstrakty komórkowe szczepów Serepeepecpus grupy B zawierające białka C można rozwijać na SDS-PAGE i przenieść na nitrocelulozę. Kontrole zawierają ekstrakty komórek E. coli niosącej dziki typ plazmidu pUX12, szczepy Streptopoρcus grupy B nie wytwarzające białek C oraz izoneniρzne szczepy Strepeopecρus grupy B, w których geny kodujące białka C są nieaktywne. Dzięki technice Western blotting można porównywać geny kodujące białka C ze znaczonymi immunen1obu1inami IgG, IgA, IgM lub ich składowymi, na przykład, fragmentami Fc lub F(ab)2 (Heath, D. G. et al., Infec and Immun. 55:1233-1238 (1987), Russell-Jones, G. J. et al., J. Exp. Med. 160: 1467-1475 (1984). KerΒUStnie używa się immuneglobulin jodowanych jedenenem lub chloraminą T.

Bardziej szczegółowymi sposobem oceny zdolności białek C do wiązania immunen1obu1in i ich składowych jest oczyszczanie białek C i używanie ich bezpośrednio do testu precypitacji (Fahnestock, S. R. et al., J. Bact. 167 (3): 870-880 (1986), Heath. D. G. et al., Infect, and Immun 55: 1233-1238 (1987). Białka C można oczyścić używając sekwencji białkowej. Ponadto, możliwa jest ekspresja genów kodujących białka C w E. coli i można uzyskać szczepy E. coli wytwarzające nadmierne ilości białek C, a przez to można uzyskać większą ilość białek C do oczyszczania.

Chociaż przykłady dotyczą poszczególnych, korzystnych przypadków, zrozumiałe jest, że nie ograniczają one zakresu wynalazku. Jest zrozumiałe dla że można robić różne modyfikacje ujawnionych warunków i modyfikacje te są także objęte zakresem wynalazku.

Przykład XIII. Stosowanie klonowanych antynenewupy białek C Streptopecpus grupy B w szczepionce koniunowanej.

Opisane powyżej antygenowe białka C Streptoceppus grupy B zostały przetestowane co do możliwości ich użycia w szczepionce keniugewanej. Aby określić ich przydatność przunaeawuje się ekstrakt komórkowy E. coli zawierającej pJMS 1 lub pJMS23, tak jak opisano powyżej, i immunizuje nim królika. Zdolność otrzymanej surowicy edporneściewej do ochrony myszy przed infekcją szczepem H36B Sereρtepoρpus grupy B testuje się na modelu śmiertelności myszy. Szczep h36B wytwarza białko C Streptopopρus grupy B. Kontrolą jest zdolność ochronna otrzymanej surowicy odpornościowej przeciw infekcji szczepem 515 Streptecoppus grupy B (który nie wytwarza białka C). Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na rysunku, fig. 4.

Przykład XIV. Wytwarzanie koniunewanej szczepionki przeciw Strepeopaρcus grupy B.

W przykładzie tym stosowane są następujące skróty: GBS, paciorkowce z grupy B; III-β, keniunαt polisacharyd typu III-białko C beta; GC-MS, chromatografia gazowa-spektrometria masowa.

167 882

1. SzczeSy bakteryjne. S^^epy pochodzHy z kol ekcji ehan ning Laboratoiy Iuo y yły izolatami klinicynymi ze szpitali zwiąyjbocy z Baylor College of Mediche (grzecznościowo dostarczonymi przez dr Carol J. Baker) i zostały uprzednio opisane (Madoffa i in., Infect. Immun. 59: 2638-2644 (1991)). SerotydS tych szczepów przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 3

Parotsc, szczep, fenotyp białka C paciorkowców grupo B stosowanych w tych badaniach

Serotyp polisacharydu otoczki	Sycsac	Białko C	Literatura
alfa	beta
Ia	515	+	-	(Michel i in., Infoct Immun. 59: 2033-8 (1991))
	A909	+	+	(LancafialZ i in., J. Exp. MoZ. 142: 165-79 (1975))
Ib	H36B	+	+	(LabcafialZ i in., J. Exp. Mad. 142: 165-79 (1975))
	S40	+	+	(Madoff i in., Infect. Immun. 59: 2638-2644 (1991))
	S42	-	+	(Madoff i in., Infoct, Immun. 59: 2638-2644 (1991))
II	18RS21	-	-	(LanconoM i in., J. Exp. Mad. 142: 165-79 (1975))
III	M781	-	-	(RoZowald i in., J. Infoct. Dis. 166:635-9 (1992))
	S23	-	-	(Madoff i in., Infoct. Immun. 59: 2638-2644 (1991))

2. Białko C beta. Białko C beta grzecznościowo dostarczył dr Milan Blake (Rockefeller University, Nowy Jork), a otrysmjno je przez ekstrakcję w SDS ze szczepu H36B5 GBS o serotypie Ib/C i oczyszczone przez chromatografię sączenia molekularnego, jak opisano uprzednio (Russell-Jones i in., J. Exd. Med. 160:1467-75 (1984)). Czystość oceniono przez obserwację pojedynczego prążka o masie odpowiadającej 130 kDa na barwionym srebrem żelu poliαnryloαmidowsm z SDS.

3. Utlenianie polisacharydu typu HI GBS. Polisacharyd otoczkowy topu III GBS (Mr < 200 000) oczyszczono ze syczadu M781 GBS jak opisano uprzednio (Wessels i in., J. Clin. Invest. 86: 1428-33 (1990)). Grupy aldehydowe na dolisjcyjΓodyie topu III GBS wytworzono przez konwersję części reszt kwasu stalowego łańcuchów bocznych przez ograniczone utlenianie z zastosowaniem bjdjodjbu sodowego, jak opisano uprzednio (Wessels i in., J. Clin. Invest. 86: 1428-33 (1990); Jenn^g i Ługowski, J. Immunol. 127: 1011-1018 (1981)). W skrócie, 8,1 mg oczyszczonego polisacharydu typu III GBS, zawierającego około 8 μmoli kwasu sialowego, połączono z 2 gmolami świeżo przygotowanego m-nadjodanu sodowego (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) w całkowitej objętości 0,5 ml wody. Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej, w ciemności, w ciągu 90 minut. Po inkubacji nadmiar naZjoZabu usunięto przez dodanie glikolu etylenowego. Potwierdzenie zakresu utlenienia uzyskano przez chromatografię gazową-spektrometrię masową^C-MS) pochodnych trimetylosililowych (Wessels i in., J. Clin. Invest. 86: 1428-33 (1990)). Mieszaninę umieszczono w woreczku dializacyjnym (Pdectrocor = 1, Ppoctrum Modical Industries, Inc., Los Angeles, CA) i dializowano w temperaturze 4°C wobec w sumie 8 litrów wody. Przedijliynwabą próbkę przesączono (0,45 μπι ) i wyuusznno przez liofilizację.

4. Koniugacja dolisαcyaroZu typu III GBS z białkiem C beta GBS. Polisacharyd typu III (5,5 mg) połączono z 5 mg białka C beta w całkowitej objętości 0,5 ml zbufnrnwabej fosforanami soli fizjologicznej o pH 9,0-9,5. Koniugacja nia zachodziła, jeśli pH nie utrzymywano powyżej 8,0. Dodano cojjnobnrnwodornu sodowego (33 mg) i mieszaninę inkubnwabo w temperaturze pokojowej w ciemności. Dla zαdawniebiα całkowitego sprzęgnięcia, po 6 dniach inkubacji dodano dodatkowe 12 mg cyjannbnrowoZorhu. pH mieszaniny reakcyjnej monitorowano przez nahraciabie próbki o objętości 2 μΐ na papiareh wskaźnikowy do określania pH i utrzymywano w zakresie 9,0-9,5 przez dodawanie 0,1 N NaOH. Postęp koniugacji monitorowano przez chromatografię sączenia molekularnego próbek, jak ndisjnn uprzednio (Panletti i in., Trends in Glscosciance and Glscntechbnlnos, 4: 269-278 (1992)). Koniugację określano jako yannń167882 czoną, gdy wielkość piku białka występującego przy objętości pustek (wskazującej na kompleks o wysokiej Mr) kolumny Superose 6 (Pharmacia Fine Chemicals) pozostawała stała. Po 7 dniach inkubacji, skoniugowaną szczepionkę oddzielono od niesprzęgniętych składników z zastosowaniem kolumny do sączenia molekularnego S-300 HR (Pharmacia) (2,6 cm x 91,5 cm). Frakcje, które ulegały elucji w objętości pustek zebrano, a niesprzęgnięte grupy aldehydowe polisacharydu zredukowano przez dodanie około 2 mg borowodorku sodowego. Umożliwiono zachodzenie reakcji redukcji w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Koniugat polisacharyd typu III GBS-białko beta C (III-β) dializowano w temperaturze 4°C wobec w sumie 16 litrów wody i wysuszono przez liofilizację.

5. Analiza biochemiczna szczepionki ΙΠ-β.

Zawartość węglowodanów w szczepionce ΠΙ-β określono przez oznaczenie fenolowo-siarkowe (Jennings i Ługowski, J. Immunol. 127: 1011-1018 (1981)) z galaktozą jako standardem. Zawartość białka w szczepionce określono metodą Lowry’ego i in. (Baltimore i in., J. Immunol. 118: 673-678 (1997)) w sposób zmodyfikowany przez Larsona i in. (Rodewald i in., J. Infect. Dis. 166: 635-9 (1992) z zastosowaniem albuminy surowicy bydlęcej jako standardu.

Jak stwierdzono na podstawie przeprowadzonych prób biologicznych immunizacja królików koniugatem polisacharyd-bialko (ΠΙ-β) wywołuje wysokie miana przeciwciał skierowanych przeciw obu składnikom, a surowica indukuje opsoninofagocytarne zabijanie szczepów typu III, Ia/C i Ib/C paciorkowców grupy B. Immunizacja samic myszy koniugatem ΠΙ-β, a następnie ich rozmnożenie, ujawniło, że 93% noworodków urodzonych przez matki szczepione ΠΙ-β przeżywało infekcję typem ΠΙ, a 76% przeżywało infekcję typem Ia/C, w porównaniu z odpowiednio 3% i 8% przeżyć w przypadku noworodków kontrolnych (P < 0,001). Białko C beta działa jako skuteczny nośnik polisacharydu typu ΠΙ, jednocześnie indukując odporność ochronną wobec szczepów paciorkowców z grupy C zawierających białko C beta.

Jest zrozumiałe dla specjaIistów, że można robić różne modyfikacje ujawnionych warunków i modyfikacje te są także objęte zakresem wynalazku.

167 882

Fig. 2

167 882

ACG AATTCG TGCTTAA GC rozcięcie EcoRl _CGAATTAATTCG dopełnienie GCTTAATTAAGC i połączenie utworzenie miejsca Xmn I a zniszczenie Eco R I

AATTCGAGCT CGCCCGGGG__ AATICGCGCCCGGGG

TTAAGC TCGAGOGGGCCCC odcięcie TTAAGOGOGGGCCCC rozcięcie Sac I końców utworzenie miejsca i połączenie FnuD2,a zniszczenie Sac I

AATTCGAGCT GGGXGGGG_ AATTC GGGG_ AATTCGGGG TTAAGC TCGAGOGGGCCCC KAAG CCCC HAAGOCCC rozcięcie Sac I odcięcie końców połączenie de lec jo 10 par zasad, przywrócenie miejsc Sac I, Xmo I, Sma I

Fig.3

Sumaryczne dane ochrony myszy

Fig.4

167 882

I.

pUC 12 przecięty BamHI

BamHI B$tXI

GGATCCATTGTGCTGG

CGAGGTAACACGATC

G GATCC

GC1AG G

PUC12

miejsce BamHI miejsce BstXI GATCCATTGTGCTGG15 nukleotydów . GTAACACGACC 11 nukleotydów

Adaptory oligonukleotydowe

Ugacja

BstXT BamHI CCAGCACAATGGATCC GGTCGTGTTACCTAGG “

III.

Przeniesienie i ligocia BstXI ' BstXI

GGATCCATTCIGCIGGCCAGCACAAIGGARI._

CCTAGGTAACAffjACffiGTGjTCiriACCTAGG

IV.

Przecięcie Bst XI

ATGGATCC, gtgttacctagg

V.

GGATCCATTGTG 'CCTAGGTA nie spoiste końce zapobiegają ponownemu zamknięciu

VI.

wstawka pCOM z Tącznikiem

CTCTAAAGrrrirrrn CTTTAGAGCACA · .·!

VII.

BamHI BstXI BstXI BamHI .GGATGCATTGTGCTCTAAAG rTTTrnCTTlAGAGCACAATGGATCC^ ' CCTAGGTA ACACGAGATTTC ^—^GAAATCTCGTGTTACCTAGG dUX12

Fig .1

DrdtztaDrgt Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena 1,50 zł

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowej koniugowanej szczepionki zdolnej do nadawania gospodarzowi odporności na infekcje wywołane przez Streptococcus grupy B przez koniugowanie właściwego dla Streptococcus grupy B polisacharydu z otoczki z białkiem, znamienny tym, że jako białko stosuje się białko C należące do białek Streptococcus grupy B.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako białko C stosuje się rekombinowane białko S1.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako białko C stosuje się rekombinowane białko S23.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, żejako białko S1 stosuje się białko kodowane przez rekombinowany plazmid pJMS 1.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako rekombinowane białko S23 stosuje się białko kodowane przez rekombinowany plazmid pJMS23.