SK284610B6 - Vakcína obsahujúca nevirulentný, neopuzdrený geneticky modifikovaný Actinobacillus pleuropneumoniae a spôsob jej výroby - Google Patents

Vakcína obsahujúca nevirulentný, neopuzdrený geneticky modifikovaný Actinobacillus pleuropneumoniae a spôsob jej výroby Download PDF

Info

Publication number
SK284610B6
SK284610B6 SK1771-98A SK177198A SK284610B6 SK 284610 B6 SK284610 B6 SK 284610B6 SK 177198 A SK177198 A SK 177198A SK 284610 B6 SK284610 B6 SK 284610B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
pleuropneumoniae
dna
fragment
vaccine
serotype
Prior art date
Application number
SK1771-98A
Other languages
English (en)
Other versions
SK177198A3 (en
Inventor
Thomas J. Inzana
Christine Ward
Original Assignee
Virginia Tech Intellectual Properties, Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Virginia Tech Intellectual Properties, Inc filed Critical Virginia Tech Intellectual Properties, Inc
Publication of SK177198A3 publication Critical patent/SK177198A3/sk
Publication of SK284610B6 publication Critical patent/SK284610B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0002—Fungal antigens, e.g. Trichophyton, Aspergillus, Candida
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/825—Bacterial vaccine for porcine species, e.g. swine

Abstract

Sú opísané vakcíny používané vo veterinárstve, a to najmä vakcíny na očkovanie ošípaných proti pleuropneumónii, ktorá obsahuje nevirulentný , neopuzdrený geneticky modifikovaný Actinobacillus pleuropneumoniae, s chýbajúcimi DNA sekvenciami, kódujúcimi syntézu puzdra, ktoré sú lokalizované pred hybridizačným miestom BamHI-Xbal fragmentu v pCW-1C, ako je znázornený na obrázku 1. Je uvedený aj spôsob výroby takýchto vakcín.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa vo všeobecnosti týka vakcín používaných vo veterinárstve a to najmä vakcíny obsahujúcej nevirulentný, neopuzdrený geneticky modifikovaný Actinohacillus pleuropneumoniae. Predmetná geneticky modifikovaná baktéria neobsahuje gény pre syntézu puzdra. Vynález zahŕňa aj spôsob výroby takýchto vakcín a ich použitie na očkovanie ošípaných proti pleuropneumónii.
Doterajší stav techniky
Vakcíny sú preparáty používané na prevenciu proti špecifickým ochoreniam zvierat a ľudí vyvolaním imunity (odolnosti). Toto sa dosiahne vystavením pacienta pôsobeniu antigénu príslušnej choroby, ktorý zasa pôsobí na imunitný systém pacienta tak, že produkuje vysoké množstvá protilátok. Prítomnosť protilátky v krvi pacienta chráni pacienta pred neskorším útokom agensu spôsobujúceho ochorenie. Vakcíny môžu byť buď zložené z podjednotiek agensu, alebo môžu byť tvorené samotným agensom, živým alebo usmrteným. Napríklad poliomyelitíde, bežne označovanej ako polio”, sa typicky predchádza buď podaním živej, oslabenej orálnej poliovirusovej vakcíny, ktorá sa bežne používa na ošetrenie detí, alebo podaním usmrtenej alebo inaktivovanej poliovirusovej vakcíny, ktorá sa zvyčajne používa na ošetrenie dospelých, pretože u nich je všeobecne vyššie riziko náchylnosti na polio zo živej vakcíny. Ak má byť použitá živá vakcína, jej virulencia musí byť nejakým spôsobom oslabená; inakšie vírus vo vakcíne spôsobí ochorenie, proti ktorému sa očakáva ochrana.
Veľa ochorení je spôsobených opuzdrenými (enkapsulovanými) baktériami, pričom prítomnosť kapsuly, ktorá tvorí gume podobnú vrstvu polysacharidu alebo polypeptidu zvonka bukových stien týchto baktérií, je nutná na spôsobenie patogénneho účinku. Pleuropneumónia ošípaných je jedným príkladom a virulentné faktory Actinobacillus pleuropneumoniae, baktérie ktorá zapríčiňuje ochorenie, zahŕňajú puzdrový polysacharid, endotoxín a proteínové exotoxiny. Pleuropneumónia ošípaných je jedna z mnohých respiračných chorôb vplývajúcich na produkciu ošípaných na celom svete, a len priemyslu USA ročne spôsobuje straty miliónov dolárov.
US patent číslo 5 429 818 (Inzana), ktorý je tu začlenený týmto odkazom, uvádza, že neopuzdrené mutanty Actinobacillus pleuropneumoniae sú nevirulentné a schopné poskytnúť znamenitú ochranu proti následnému účinku virulentných baktérií. Neopuzdrené mutanty, opísané Inzanom, boli pripravené etylmetánsulfonátovou mutagenézou. Ale takýto spôsob prípravy má nevýhody, lebo niektoré spontánne alebo chemicky vyvolané mutanty nie sú stabilné a neznámy je aj pôvod mutácie(-í).
Podstata vynálezu
Podstatou predloženého vynálezu je vakcína na očkovanie ošípaných proti pleuropneumónii, ktorá obsahuje nevirulentný, neopuzdrený geneticky modifikovaný Actinobacillus pleuropneumoniae, s chýbajúcimi DNA sekvenciami, kódujúcimi syntézu puzdra, ktoré sú lokalizované pred hybridizačným miestom BamHI-Xbal fragmentu v pCW-1C ako je znázornený na obrázku 1.
Podľa vynálezu bol pripravený rekombinantný živý, oslabený kmeň Actinobacillus pleuropneumoniae, ktorý bol geneticky skonštruovaný tak, aby nemal puzdro. Keďže puz dro je nevyhnutné pre virulencii, ale nie je nevyhnutné na imunologickú ochranu, kmeň bude užitočný ako vakcína proti pleuropneumónii ošípaných. Vakcína bola pripravená prostredníctvom klonovaného plazmidového vektora, ktorý sa nemôže replikovať v A. pleuropneumoniae. Sekvenovali sa gény na export syntézu puzdra A. pleuropneumoniae sérotyp 5. V génoch na export a syntézu puzdra sa vykonala rozsiahla delécia a do miesta delécie sa klonoval gén kanamycínovej rezistencie a gén citlivosti na sacharózu, aby slúžili ako markerové gény. Samovražedný vektor sa vložil do virulentného kmeňa A. pleuropneumoniae sérotyp 5 využitím elektroporácie, aby prebehla homologická rekombinácia dvojitým crossing overom medzi homologickými oblasťami chromozómu a plazmidu. Získali sa štyri izoláty a každému chýbalo dúhové sfarbenie, potvrdzujúce chýbanie puzdra. Chýbajúce puzdro a deletovaná oblasť puzdra génov sa potvrdili v jednom kmeni buď dot blottingom, alebo Southem blottingom. Prítomnosť markerových génov v rekombinantnom kmeni bola tiež potvrdená. Nebola identifikovaná žiadna iná zmena v ďalších fenotypových vlastnostiach a markerové gény neboli nájdené v iných oblastiach chromozómu. Rekombinantný kmeň, označený ako J45-100, bol veľmi citlivý proti séru, desaťkrát znížil virulenciu 50 % letálnej dávky rodičovského kmeňa pri prasiatkach a mal by poskytovať ochranu ošípaným proti pleuropneumónii.
Bol vytvorený neopuzdrený kmeň Actinobacillus pleuropneumoniae a má byť použiteľný ako vakcína proti pleuropneumónii ošípaných. Hlavným znakom vynálezu je genetická modifikácia mikroorganizmu, ktorá zahrnuje deléciu v jeho deoxyribonukleovej kyseline (DNA) v oblasti kódujúcej syntézu puzdra. Len ako ilustračný príklad je opisaná syntéza transformovaného sérotypu 5 mutantu Actinobacillus pleuropneumoniae', malo by byť jasné, že spôsobom, podobným uvedenému, by mohli byť pripravené aj iné sérotypy a byť užitočné v samotných vakcínach alebo v zmesi s jedným alebo viacerými rekombinantnými mutantmi rôznych sérotypov.
Opísaný kmeň spolu s inými kmeňmi neopuzdrenej, toxickej baktérie alebo inými mikroorganizmami vyrobenými na základe uvedených postupov, vytvorí výborné vakcíny, pretože sú nevirulentné, ale produkujú všetky antigény, nevyhnutné pre hostiteľa na produkciu ochrannej imunitnej odpovede. Vakcíny môžu byť podané rozličnými spôsobmi, uprednostňuje sa však intramuskuláme alebo podkožné injekčné podanie. Výhodou týchto živých vakcín je, že toxíny, ktoré sú primáme zodpovedné za ochorenie, a ďalšie zložky, ktoré môžu byť vytvorené len živými organizmami alebo in vivo, budú vytvorené na mieste imunizácie a hostiteľ vytvorí imunitnú odpoveď, ktorá ho sama ochráni pred léziami (poškodeniami), spôsobenými toxínmi. Teda k ochoreniu (akútnemu alebo chronickému) nedôjde. Organizmy sa nemôžu rozširovať, ale, keďže sú bez puzdra, sú extrémne citlivé proti séru a sú veľmi rýchlo odstraňované z krvného riečiska alebo respiračného traktu. Navyše, pretože ide o živú vakcínu, bunkami sprostredkovaná imunitná odpoveď bude vyššia a ochrana bude trvať dlhšie ako pri usmrtených vakcínach.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Uvedené ako aj ďalšie aspekty a výhody vynálezu budú lepšie zrozumiteľné z nasledujúceho detailného opisu výhodných príkladov uskutočnenia vynálezu s odkazmi na výkresy, na ktorých obrázok 1 predstavuje fyzikálnu mapu pCW-llE klonovanej DNA z oblasti syntézy puzdra A. pleuropneumoniae J45. Je tiež zobrazené umiestnenie a smer transkripcie dvoch kompletných ORFs (cpsA a cpsB, hrubá výplň). Označený je aj čiastočný tretí potenciálny ORF (cpsC). Zobrazené je tiež umiestnenie a smer transkripcie neúplného génu exportu puzdra cpxD umiestneného na tomto DNA fragmente. Je naznačený fragment 2,1 kb Bglll-Stul, použitý ako DNA sonda na obrázku 2. Bodkovaná výplň označuje nekompletné ORFs.
Na obrázku 2 je Southem blot analýza A. pleuropneumoniae genomickej DNA hybridizujúccj s 2,1 kb Bglll-Stul fragmentom pCWHE značeným s digoxigenínom. Genomická DNA kmeňa 4074 sérotypu 1 poštiepená s BamHI (dráha 1), sérotypu 2 kmeňa 1536 (dráha 2), sérotypu 5a kmeňa J45 (dráha 3), sérotypu 5a kmeňa K17 (dráha 4), sérotypu 5 kmeňa 178 (dráha 5), sérotypu 7 kmeňa 29628 (dráha 6) a sérotypu 9 kmeňa 13261 (dráha 7) hybridizovali so sondou, ako je uvedené. Je uvedená molekulová hmotnosť hybridizovaných pásov (v kb).
Obrázky 3a a 3b predstavujú nukleotidovú sekvenciu 3,2kb Hindlll-EcoRV fragmentu pCW-llE, obsahujúceho sérotypovo špecifickú DNA A. pleuropneumoniae J45 (sekv. č. 1). Odvodené aminokyselinové sekvencie dvoch kompletných ORFs, detegovaných v tejto sekvencií, cpsA (sekv. č. 2) a cpsB (sekv. č. 3) a odvodenej N-koncovej sekvencie tretieho nekompletného ORF, cpsC (sekv. č. 4), sú zobrazené pod nukleotidovou sekvenciou. Pravdepodobné ribozómy viažuce miesta, predchádzajúce každý ORF, sú označené tučným a znázornené sú aj pravdepodobné -10 a -35 promótorové sekvencie proti smeru expresie cpsA.
Obrázok 4 znázorňuje konštrukciu samovražedného vektora obsahujúceho deletovanú DNA na syntézu puzdra, pCWl 1 ΕΔ1 KSI a produkciu ncopuzdrcných mutantov A. pleuropneumoniae J45 alelickou výmenou. Plazmidický vektor pCWll ΕΔ1 KSI bol skonštruovaný štiepením pCW-11E s Bglll a Stul vytvárajúcim tupo zakončené konce a ligáciou vcľkcho 6,4kb fragmentu s 3,8kb BamHI fragmentom pKS (tiež zatupeným) obsahujúcim nptl-sacRB (Kanr Suc3) kazetu. Reštrikčné miesta v zátvorkách označujú pôvodné konce fragmentov ligovaných v pCWl 1 ΕΔ1 KSI. Vektor pCWll ΕΔ1 KSI bol elektrotransformovaný do A. pleuropneumoniae a neopuzdrené Kanr transformanty boli skrínované na chýbajúce dúhové sfarbenie na médiu obsahujúcom 85 pg/ml kanamycínu.
Obrázok 5 predstavuje Southem blot analýzu genomickej DNA, izolovanej z A. pleuropneumoniae J45 (dráha 1) alebo J45-100 (dráha 2) so sondami značenými digoxigenínom, špecifickými pre ntpl alebo pre časti opuzdrovacieho lokusu A. pleuropneumoniae. A. pleuropneumoniae J45 (dráha 1) alebo J45-100 (dráha 2) genomické DNA boli štiepené s Xbal (panely A a C) alebo BamHI (panel B) a hybridizované buď s l,24kb Pst! fragmentom pKS (nptlšpecifický), panel A; alebo s 2,lkb Bglll-Stul fragmentom pCW-11E (cpsABC špecifický, pozri obr. 1), panel B, alebo s 2,lkb C/al fragmentom pCW-1 C (cpxCBA-špecifický, pozri obr. 3.2), panel C.
Na obrázku 6 je imunoblot kolónií A. pleuropneumoniae J45 a J45-100 zreagovaných s antisérom ošípaných špecifickým pre puzdrový polysacharid. Na jamku nitrocelulózovej membrány sa aplikovalo približne 5x 105 (dráha 1) alebo 5x 104 (dráha 2) CFU. Membrána bola lyzovaná v chloroforme a inkubovaná s antisérom ošípaných, ktoré obsahovalo protilátky proti sérotypu 5a puzdrového polysacharidu, ale nie proti iným povrchovým antigénom A. pleuropneumoniae.
Obrázok 7 znázorňuje imunobloty A. pleuropneumoniae J45 (dráha 1) a J45-100 (dráha 2) koncentrovaných kultivačných supematantov obsahujúcich prevládajúco exotoxíny Apxl a Apxll. Panel A reagoval s Apxll špecifickou mono klonálnou protilátkou. Na paneli A bol použitý koncentrovaný kultivačný supematant A. pleuropneumoniae sérotyp 2 kmeň 1536 (pruh 3) ako negatívna kontrola, pretože tento sérotyp nesyntetizuje Apxl. Škvrna na paneli A reagovala s
Obrázok 8 predstavuje elektroforetické profily LPS izolovaného z A. pleuropneumoniae J45 (dráha 1) a rekombinantného neopuzdreného mutanta J45-100 (dráha 2). LPS sa podrobil elektroforéze v 15 % separačnom géli a zafarbil sa s amoniakálnym striebrom.
Na obrázku 9 je bakteriocídna aktivita prekolostrálneho teľacieho séra proti A. pleuropneumoniae J45 a J45-100. Percento životaschopnosti bakteriálnych kmeňov sa vyhodnotilo po 60-minútovej inkubácii pri 37 °C. Každý bod reprezentuje priemer troch jednotlivých experimentov vykonaných dvojmo. Chybové pásma predstavujú štandardnú odchýlku každého priemeru. Maximálne percento životaschopnosti zaznamenané pre J45 bolo 100 %, hoci tieto hodnoty boli typicky vyššie, pretože baktérie zvyčajne počas experimentu rástli. Hodnoty vyššie ako 100 % neboli zaznamenané, pretože sa nedali správne stanoviť.
Obrázky 10a a 10b znázorňujú nukleotidovú sekvenciu 3,2kb Xbal-Cla\ fragmentu pCW-lC kódujúceho gény pre export puzdra A. pleuropneumoniae J45 (sekv. č. 5). Sú uvedené odvodené aminokyselinové sekvencie (sekv. č. 6-8) proteínov podieľajúcich sa na exporte puzdrového polysacharidu A. pleuropneumoniae sérotypu 5a.
Na obrázku 11 je fyzikálna mapa pCW-lC DNA z A. pleuropneumoniae J45.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Bola identifikovaná a charakterizovaná DNA oblasť podieľajúca sa na biosyntéze puzdrového polysacharidu Actinobacillus pleuropneumoniae. Na identifikáciu a klonovanie priľahlého 5,8kb BamHI fragmentu J45 genómovej DNA sa použila sonda špecifická pre gén cpxD podieľajúci sa na exporte A. pleuropneumoniae sérotyp 5a J45 puzdrového polysacharidu. Southem blot analýza ukázala, že časť tejto oblasti obsahuje DNA, ktorá bola sérotypovo špecifická. Analýza DNA sekvencie ukázala, že táto oblasť obsahuje dva kompletné otvorené čítacie rámce, cpsA a cpsB a nekompletný potenciálny tretí čítací rámec, cpsC. cpsA a cpsB sú mierne homologické s glykozyltransferázami podieľajúcimi sa na biosyntéze lipopolysacharidu Escherichia coli respektíve puzdrového polysacharidu Haemophilus influenzae typ b. Skonštruovala sa 2,lkb delécia, ktorá zahŕňala klonované cpsABC čítacie rámce a rckombinovala sa do J45 chromozómu alelickou výmenou za vzniku mutantu J45-100. Tento mutant neprodukoval intracelulámy ani extracelulámy puzdrový polysacharid, z čoho vyplýva, že cpsA, cpsB a/alebo cpsC sa podieľajú na biosyntéze puzdrového polysacharidu A. pleuropneumoniae. Apx toxín a lipopolysacharidové profily J45-100 boli identické s opuzdreným rodičovským kmeňom J45. Ale J45-100 rástol in vitro rýchlejšie ako J45. J45-100 bol citlivý na usmrtenie v prekolostrálnom teľacom sére, zatiaľ čo J45 nebol. J45-100 bol avirulentný, keď sa použil na intratracheálne podanie prasatám v dávke, trojnásobnej ako 50 % letálnej dávky kmeňa J45. Pri 6-násobne vyššej dávke ako je 50 % letálna dávka J45, J45-100 spôsobil mierne až stredné lezie pľúc, ale nie smrť. Tieto výsledky demonštrujú, že puzdrový polysacharid je hlavným determinantom sérovej rezistencie a virulencie A. pleuropneumoniae.
Materiál a metódy
Bakteriálne kmene, plazmidy a rastové podmienky
Bakteriálne kmene a plazmidy, použité v tejto práci, sú opísané v tabuľke 1. Na extrakciu genómovej DNA a na baktericídne testy kmene A. pleuropneumoniae rástli za pretrepávania pri 37 °C v mozgovo srdcovom infúznom rastovom médiu (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), obsahujúcom 5 pg/ml nikotínamidadenín dinukleotidu (NAD) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Na elektroporáciu kmene A. pleuropneumoniae rástli za pretrepávania pri 37 °C tryptickom sójovom bujóne (Difco Laboratories), obsahujúcom 0,6 % kvasničného extraktu (Difco Laboratories) a 5 pg/ml NAD (TSY-N). Kvôli podávaniu prasatám rástli kmene A. pleuropneumoniae za pretrepávania pri 37 °C v Columbia bujóne (Difco Laboratories), obsahujúcom 5pg/ml NAD. Kmene Escherichia coli sa pestovali v Luria-Bertani rastovom médiu (Sambrook et al., 1989) na rutinné kultivácie alebo v Terrific médiu (Tartof and Hobbes, 1987) na extrakciu plazmidov. Antibiotiká na udržiavanie plazmidov v E. coli boli použité v rastovom médiu v nasledujúcich koncentráciách: ampicilín (Amp) 100 pg/ml a kanamycín (Kan) 50 pg/ml. Kanamycín v koncentrácii 85 pg/ml bol použitý na selekciu A. pleuropneumoniae rekombinantných mutantov.
Tabuľka 1
Použité bakteriálne kmene a plazmidy
A. pleuropneumoniae kmene 4074 sérotyp 1; (ATCC 27088)
ATCCa1536 sérotyp 2; (ATCC 27089)
ATCCaJ45 sérotyp 5a
Fenwick et al., 1986a K17 sérotyp 5a
Nielsen, 1986a 178 sérotyp 5
M. Mulks 29628 sérotyp 7
L. Hoffmann 13261 sérotyp 9
J. Nicolet J45-C neopuzdrený mutant izolovaný po etylmetánsulfonátovej mutagenéze kmeňa
J-45 Inzana et al., 1993a J-45-100 derivovaný rekombinantný neopuzdrený mutant z kmeňa J45
E. coli kmene XL1 Blue recA éWAl gyrA96 thi-\ hsdRil supE44 re/Al lac(F~ proAB lacIqZAM15 TalO); hostiteľ pre rekombinantné plazmidy
Stratagene, La Jolla, Calif. Plazmidy PGEM-3Z klonovací vektor, 2,74 kb; Amp1
Promega pCW-lC 5,3 kb Xba\ fragment J45 klonovaný do pGEM-3Z
pCW-llE 5,8 kb BamHI fragment J45 klonovaný do pGEM-3Z
pKS 3,8 kbBamHl fragment obsahujúci upíf-sacRB kazetuc klonovanú do BamHI miesta pGEM-3Z; Ampr, Kanr
S.M.Boyle pCWllAIKSl pCW-Ι 1E s 2,1 kb Sg/ll-5twl deletovaným fragmentom a 3,8 kb BamHI nptl-sacRB kazetou z pKS ligovanou v tomto segmente
a americký typ zbierky kultúr, Rockville, MD
b tento marker bol pôvodne izolovaný od Tn903 nptl génu pUC4K (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)
c táto kazeta bola toho času už opísaná (Ried and Collmer, 1987)
Výpočet generačného času
Čas tvorenia logaritmickej fázy rastu kmeňov A. pleuropneumoniae v TSY-N bol počítaný s využitím rovnice: R = 1/g, kde R je priemerná rýchlosť rastu baktérií a g je čas vytvorenia bakteriálnej populácie (Pelczar a ďalší, 1993). Priemerná rýchlosť rastu, R, bola vypočítaná použitím nasledujúcej rovnice: R = 3,32(log10N - log10No)/t, kde t je uplynutý čas, N je počet baktérií v čase t a No je východiskový počet baktérií v čase 0 (Pelczar ďalší, 1993).
DNA hybridizačná analýza
DNA poštiepená reštrikčnou endonukleázou DNA (približne 5 pg na pás) sa podrobila elektroforéze na 0,7 % agarózových géloch a kapilárne sa preniesla na MagnaGraph nylonové membrány (Micron Separations Inc., Webstoro, Mass.) s použitím 20x fyziologického roztoku citrátu sodného (20x SSC je 3 M NaCl, 300 mM citrátu sodného, pH = 7), ako už bolo opísané (Sambrook a ďalší, 1989; Southem, 1975). DNA bola kovalentne naviazaná na nylonové membrány ultrafialovým ožiarením s použitím UV Stratalinker (Stratagene, La Jolla, Calif.). Digoxínom značené DNA hybridizačné sondy boli syntetizované náhodnou primerovou metódou použitím Génius Systém nerádioaktívneho značenia a detekčnej súpravy (BoehringerMannheim Corp., Indianapolis, Ind.) podľa pokynov výrobcu. Hybridizácie DNA sa uskutočnili pri 68 °C v roztokoch, obsahujúcich 5x SSC. Membrány sa premyli a vyvolali podľa pokynov Génius Systém na kolorimetrickú detekciu.
Rekombinantné DNA spôsoby a reakčné činidlá
Genómová DNA bola izolovaná z vyrastených buniek A. pleuropneumoniae použitím postupu opísaného S. Spinolom. V krátkosti, baktérie boli resuspendované v 10 mM Tris-1 mM EDTA (pH 8) a inkubované s dodecylsulfátom sodným (0,66 %) a RNA-ázou (100 pg/ml) počas 1 hodiny pri 37 °C. Bola pridaná proteináza K na výslednú koncentráciu 100 pg/ml a zmes bola inkubovaná 1 hodinu pri 56 °C. Zmes sa jedenkrát extrahovala fenolovým tlmivým roztokom a štyrikrát fenol-chloroformovým tlmivým roztokom (Amresco, Inc., Solon, Ohio), genómová DNA sa vyzrážala etanolom a resuspendovala v 10 mM Tris-1 mM EDTA (pH 8). Plazmidová DNA bola izolovaná rýchlou alkalickou lyzačnou metódou (Ish-Horowicz a Búrke, 1981). Reštrikčné fragmenty, požadované na klonovanie a syntézu sondy, boli eluované z agarózových gélov ako je opísané v Zhen a Swank, 1993. Štiepenie restriktázami, elektroforéza na agarózovom géli a DNA ligácie boli uskutočnené podľa predchádzajúcich opisov (Sambrook a ďalší, 1989). Konce reštrikčných fragmentov sa zatupili vyplnením prečnievaní na 5' koncoch nukleotidmi (dNTPs) s použitím Klenowho fragmentu DNA polymerázy 1, ako už bolo opísané (Sambrook a ďalší, 1989). Plazmidová DNA sa zaviedla do kmeňov E. coli elektroporáciou (Dower a ďalší, 1988) s použitím BTX ECM 600 elektroporátora (BTX, Inc., San Diego, Calif.).
Reštrikčné endonukleázy a Klenow fragment DNA polymerázy 1 boli získané od Promega Corporation (Madison, Wis.). T4 DNA ligáza bola získaná od Gibco BRL (Gaithersburg, Md.). Nukleotidy (dNTPs) na vyplňovacie reakcie boli získané od Boehringer-Mannheim Corporation (Indianapolis, Ind.).
Sekvenovanie a analýza DNA
Nukleotidová sekvencia oboch vlákien 2,7kb XbalEcoRN DNA fragmentu pCW-11E bola stanovená dideoxy reťazovou terminačnou metódou (Sanger a ďalší, 1977) s použitím DNA sekvenčnej súpravy Sequenase verzia 2,0 (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) s a
SK 284610 Β6 35[S]dATP (Du Pont/NEN Research Products, Boston, Mass.). Templáty dvojvláknovej DNA boli sekvenované použitím bežných oligonukleotidových primárov (DNAgency, Inc., Malveme, Pa) na pokračovanie čítania pozdĺž každého vlákna.
Získaná nukleotidová sekvencia bola kombinovaná s nukleotidovou sekvenciou 4,6 kb Xbal-Clal DNA fragmentu pCW-lC, kódujúceho upstream puzdrové štruktúrne gény (obr. 10) a analyzovaná bola použitím DNASTAR analyzačného softvéru (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.). Vyhľadávanie podobných sekvencii v databáze EMBUGenBank/DDBJ sa uskutočňovalo použitím BLAST softvéru (Altschul et al., 1990) v National Center for Biotechnology Information (Bethesda, Md.).
Konzervatívne oblasti H. influenzae typ b cap (capb) lokusu podieľajúce sa na exporte puzdrového polysacharidu boli použité na identifikovanie, klonovanie a charakterizovanie časti zapuzdrovacieho lokusu A. pleuropneumoniae sérotyp 5a podieľajúcej sa na exporte puzdrového polysacharidu. Uskutočnil sa Southem blot genomickej DNA A. pleuropneumoniae sérotyp 5a kmeňa J45 so sondami špecifickými pre susediace oblasti H. influenzae typ b kapsulačného (capb} lokusu. Tieto sondy nehybridizovali s genomickou DNA A. pleuropneumoniae za vysoko stringentných podmienok (68 °C, 5x SSC), ale hybridizovali za stredne až nízko stringentných podmienok (55 °C, 5x SSC). 4,4kb FcoRl fragment H. influenzae capb lokusu z plazmidu pSKHl, obsahujúci oblasť 1 bexD génu, podieľajúceho sa na exporte puzdrového polysacharidu, a dve oblasti 2 otvorených čítacích rámcov (ORFs), podieľajúcich sa na biosyntéze puzdrového polysacharidu, hybridizoval s l,2kb fíindlU a 5,3kb Xbal fragmentárni J45 genomickej DNA. 9,0kb EcoRI fragment H. influenzae capb lokusu z plazmidu pSKH2, obsahujúci oblasť 1 bexCBA génov, podieľajúcich sa na exporte puzdrového polysacharidu, nejakú necharakterizovanú DNA oblasti 3, ktorá je spoločná pre niekoľko sérotypov H. influenzae, a nejakú DNA oblasti 2, ktorá sa podieľa na biosyntéze puzdrového polysacharidu, sa hybridizoval s 1,5kb Hindlll, 5,3kb Xbal a 2,4kb Xhol fragmentárni J45 genomickej DNA. Z týchto údajov vyplynulo, že lokusy puzdrových génov H. influenzae typ b a A. pleuropneumoniae sérotyp 5a majú spoločné homologické oblasti. Z toho, že obe H. influenzae capb špecifické sondy obsahujú DNA oblasti 1 podieľajúcu sa na exporte puzdrového polysacharidu, naznačujúcu, že 5,3kb genomický DNA fragment Xbal z J45, ktorý hybridizoval s oboma H. influenzae capb sondami, môže obsahovať gény, ktoré kódujú proteíny podieľajúce sa na exporte puzdrového polysacharidu A. pleuropneumoniae sérotyp 5a. 5,3kb Xbal genomický DNA fragment z J45, ktorý hybridizoval s dvoma H. influenzae capb sondami, bol klonovaný do Xbal miesta plazmidu pGEM-3Y (v oboch orientáciách) z Xbalpoštiepených fragmentov J45 genomickej DNA v rozsahu 4,8 až 6,0 kb, ktoré boli elektroeluované (po elektroforetickej separácii) z agarózového gélu. Jeden z výsledných plazmidov bol označený pCW-lC. Na určenie, či H. influenzae typ b bexD, bexC, bexB a bexA hybridizovali so susednými fragmentárni pCW-lC v tom istom poradí (bexDCBA), v ktorom sa tieto gény vyskytovali v H. influenzae, sa použili Southem bloty. Výsledky naznačili, že DNA oblasť A. pleuropneumoniae sérotyp 5a, požadovaná na export puzdrového polysacharidu, bola úspešne klonovaná a že táto oblasť bola usporiadaná spôsobom podobným H. influenzae typ b bex lokusu.
Bola určená nukleotidová sekvencia 4,6kb Xbal-Clal reštrikčného fragmentu pCW-lC a 3,2kb Xbal-Clal reštrikčný fragment sa nachádza na obr. lOa-b (sekv. č. 5).
Štyri čítacie rámce (ORFs) (znázornené na obr. lOa-b a na obr. 11), označené cpxDCBA (cpx sa použil na označenie exportu puzdrového polysacharidu), boli detegované v tesnej blízkosti na rovnakom DNA reťazci. AUG iniciačný kodón pre cpxC (sekv. č. 7) bol 26 nukleotidov downstream od UAA terminačného kodónu pre cpx D (sekv. č. 6), zatiaľ čo AUG iniciačný kodón pre cpxB (sekv. č. 8) sa prekrýval s UAA terminačným kodónom pre cpxC (sekv. č. 7) a AUG iniciačný kodón pre cpxA sa prekrýval s UGA terminačným kodónom pre čiastočne prítomného cpxB (sekv. č. 8). Shine-Dalgamové ribozóm viažuce konsenzus sekvencie sa identifikovali v 17 bázach upstream od každého AUG iniciačného kodónu a pravdepodobný promótor obsahujúci sekvencie podobné s E. coli o70 -10 (TATAAT) a -35 (TTGACA) konsenzus sekvenciami, bol identifikovaný upstream od cpxD (sekv. č. 6). Palindromatická sekvencia, ktorá môže fungovať ako rho-nezávislý transkripčný terminačný signál, bola identifikovaná downstream od cpxA (nezobrazené). Genetické usporiadanie naznačuje, že cpxDCBA sú transkribované do jedinej polycistronickej mRNA.
Elektrotransformácia A. pleuropneumoniae
A. pleuropneumoniae sa nechal rásť do strednej logaritmickej fázy v TSY-N, peletizovaný centrifugáciou pri 7000 x g pri 4 °C a štyrikrát premytý v chladenom (4 °C), filtráciou vysterilizovanom tlmivom roztoku, obsahujúcom 272 mM manitolu, 2,43 mM K2HPO4, 0,57 mM KH2PO4, 15 % glycerol, pH 7,5. Tento tlmivý roztok bol upravený (obsahuje manitol namiesto sacharózy) z predtým opísaného tlmivého roztoku, použitého na premývanie buniek A. pleuropneumoniae pred elektroporáciou (Lalonde a ďalší, 1989b). Bunky sa potom premyli jedenkrát v chladenom, filtráciou vysterilizovanom 15 % glycerole a resuspendovali na približne 1010 CFU/ml v 15 % glycerole. Alikvotné časti (90 μΐ) tejto suspenzie sa zmiešali s 1,5 až 2,0 pg plazmidovej DNA (v 1,5 pl destilovanej vody), ktorá bola čistená ultracentrifugáciou v gradiente chloridu cézneho (Sambrook a ďalší, 1989), umiestnili sa v studených elektroporačných kyvetách (BTX, Inc.) s 2mm medzerami a podrobili sa elektroporácii s využitím BTX ECM 600 elektroporátora (BTX, Inc.) pri napätí 2,5kV a nastavení odporu R7 (247 ohmov). Skutočný generovaný impulz bol 2,39 kV dodaný za 10,7 milisekúnd. Po elektroporácii boli bunky opätovne regenerované v 1 ml TSY-N, obsahujúcom 5 mM MgClj s miernym pretrepávaním počas 3 hodín pri 37 °C. Po regenerácii sa bunky kultivovali na TSY-N agare, obsahujúcom 85 pg kanamycínu na ml a inkubovali sa pri 37 °C.
Imunoblotting
Aby sa urobili imunobloty kolónií, celé bunky A. pleuropneumoniae, vyrastené cez noc na TSY-N agarových platniach, sa zoškrabali do fosfátom tlmeného fyziologického roztoku (PBS) a upravili na 109 CFU/ml, ako sa určilo spektrofotometricky. Aplikovalo sa približne 5x104 alebo 5x105 CFU na jamku na nitrocelulózovú membránu (NitroBind; Micron Separations Inc.) použitím Bio-Dot prístroja (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.). Membrána sa dala do chloroformu na 15 minút pri laboratórnej teplote, aby došlo k lýze bakteriálnych buniek na membráne. Membrána sa na vzduchu úplne vysušila a inkubovala 1 hodinu pri laboratórnej teplote v Tris-tlmivom fyziologickom roztoku, pH 7,5 (TBS), obsahujúcom 2 % odstredené mlieko kvôli blokovaniu nešpecifických väzbových miest na membráne. Membrána bola 1 hodinu inkubovaná pri laboratórnej teplote v riedení 1:200 (v 2 % mliečnom-TBS) adsorbovaného prasačieho antiséra, ktoré obsahovalo protilátky proti puzdrovému polysacharidu sérotypu 5, ale nie proti iným povrchovým antigénom A. pleuropneumoniae. Toto antisérum obohatené puzdrovým polysacharidom bolo pripravené adsorpciou hyperimúnneho prasačieho antiséra A. pleuropneumoniae KÍ7 so spontánnym neopuzdreným mutantom K17-C (Inzana and Mathison, 1987), ako už bolo opísané (Inzana, 1995). Membrána bola premytá v TBS obsahujúcom 0,05 % Tween 20, potom 1 hodinu inkubovaná pri laboratórnej teplote v 1:1000 riedený králičieho antiprasačieho IgG konjugovaného s chrenovou peroxidázou (ťažké a ľahké reťazce; Cappel, Durham, N.C.). Membrána bola premytá v TBS, potom vyvolaná s 4-chlór-l-naftolom (Bio-Rad Laboratories) v TBS, obsahujúcom 0,02 % H2O2.
Imunoblotting A. pleuropneumoniae koncentrovaných kultivačných supematantov sa uskutočňoval spôsobom už opísaným (Ma a Izana, 1990). Stručne, približne 15 pg celkového kultivačného supematantového proteínu sa rozdelilo diskontinuálnou SDS-PAGE (Laemli, 1970) prostredníctvom 8 % separačného gélu. Proteíny boli prenesené na nitrocelulózovú membránu (NitroBind; Micron Separation Inc.) spôsobom podľa Towbin a ďalší (1979). Membrána bola inkubovaná v TBS obsahujúcom 2 % bovinný sérový albumín na blokovanie nešpecifického viazania a bola nastrihaná na prúžky. Prúžky sa inkubovali cez noc pri 4 °C buď s monoklonálnou protilátkou špecifickou pre ApxII toxín (Ma a Inzana, 1990), alebo s monoklonálnou protilátkou špecifickou pre Apxl toxín (Devendish a ďalší, 1989; Frey a ďalší, 1992) a premyli sa v TBS. Blotting reakcia s ApxII špecifickou monoklonálnou protilátkou bola inkubovaná s 1:2000 zriedeným kozím anti-myšacim IgG, konjugovaným s chrenovou peroxidázou (Cappel), premytá v TBS a vyvolaná spôsobom už opísaným. Bíot reagujúci s Apxl špecifickou monoklonálnou protilátkou bol inkubovaný s 1:2000 riedením kozieho anti-myšacieho IgG, konjugovaného s alkalickou fosfatázou, a vyvolal sa spôsobom už opísaným (Frey a ďalší, 1992).
LPS extrakcia a elektroforéza
LPS bol izolovaný z A. pleuropneumoniae použitím mikroextrakčnej horúcej fenol-vodnej metódy, ako už bolo opísané (Inzana, 1983). Purifikovaný LPS bol podrobený elektroforéze na 15 % polyakrylamidovom separačnom géli, obsahujúcom močovinu, ako je opísané (Inzana a ďalší, 1988). LPS elektroforetické profily boli vizualizované farbením gélu s amoniakálnym striebrom (Tsai a Frasch, 1982).
Baktericídny sérový test
Bola stanovená citlivosť A. pleuropneumoniae proti baktericídnej aktivite prekolostrálneho teľacieho séra. Percento prežitia bakteriálnych kmeňov v 5, 10, 15, 20, 30, 40 a 50 % prekolostrálnom teľacom sére bolo vyhodnotené po 60 minútovej inkubácii pri 37 °C.
Štúdium virulencie
Sedem- až deväťtýždňové prasatá boli získané z dvoch stád, nenapadnutých infekciou A. pleuropneumoniae a boli rozdelené náhodne do skupín. Skupiny prasiat sa umiestnili do oddelených ohrád, ktoré nedovoľovali priamy fyzický kontakt medzi skupinami. Vybavenie pre zvieratá z Virginia Polytechnic Inštitúte a State University bolo obsluhované a udržiavané v súlade s požiadavkami Američan Association for Acreditation of Laboratory Animal Čare. Na uskutočnenie experimentu boli kmene A. pleuropneumoniae pestované za pretrepávania v Columbia bujóne (Difco Laboratories), doplnenom 5 pg/NAD, otáčanom pri 7000 x g a resuspendovanom na približne 109 CFU/ml v PBS. Prasatám sa intratracheálne vpravilo 10 ml roztoku tejto suspenzie, po ktorej nasledovalo mierne sedatívum so Strensilom (Pittman-Moore, Inc., Washington, Crossing, N.J.). Na prasatách sa vykonala pitva hneď, ako bolo možné po uhynutí alebo ihneď po eutanázii pentobarbitalom sodným. Lézie (poškodenia) pľúc sa vyhodnotili veterinárnym patológom podľa nasledujúcich kritérií: 0: obyčajné pľúca (nezistené žiadne veľké lézie); 1+: 1-10 % pľúcneho tkaniva postihnutého niektorou kombináciou hyperémie, opuchu, krvácania, konsolidácie a/alebo zápalu pohrudnice; 2+: 11-49 % pľúcneho tkaniva postihnutého; 3+: 50-74 % pľúcneho tkaniva postihnutého; 4+: 75 % alebo viac pľúcneho tkaniva postihnutého. Vzorky pľúc boli nekroskopicky odobraté z pravej kraniálno-dorzálnej polohy kaudálneho laloku a kultivované na mozgovo srdcovom infúznom médiu obsahujúcom NAD kvôli detegovaniu prítomnosti A. pleuropneumoniae.
Výsledky
Identifikácia a klonovanie sérotypovo špecifickej DNA oblasti A. pleuropneumoniae
Na identifikáciu a klonovanie A. pleuropneumoniae J45 DNA podieľajúcej sa na biosyntéze puzdrového polysacharidu boli vykonané Southem blot analýzy na identifikovanie priľahlej DNA oblasti upstream (v smere 5) od cpxDCBA génovej skupiny podieľajúcej sa na exporte puzdrového polysacharidu, opísané skôr (obr. lOa-b a 11). Očakávalo sa, že upstream DNA oblasť by mohla kódovať sérotypovo špecifické gény podieľajúce sa na biosyntéze puzdrového polysacharidu, pretože opuzdrovací lokus (cap) A. pleuropneumoniae sa zdá byť organizovaný podobným spôsobom ako opuzdrovacie lokusy Haemopfilus influenzae typ b a Neisseria meningitidis skupina B. Genómická DNA A. pleuropneumoniae J45, poštiepená s BamHI, sa sondovala s 1,2kb BamHl-Xbal fragmentom pCW-lC, značeným digoxigenínom, ktorý obsahoval časť cpxD génu. cpxD špecifická sonda hybridizovala s jedným, približne 5,8kb BamHI fragmentom J45 genomickej DNA (údaje nie sú znázornené). Tento 5,8kb BamHI fragment bol klonovaný do BamHI miesta pGEM-3Z z BamHI poštiepených fragmentov J45 genomickej DNA v rozsahu 5,0 až 6,5 kb, ktoré boli elektroeluované (po elektroforetickej separácii) z agarózového gélu. Výsledný plazmid sa označil pCW-11 E a bola zostrojená jeho reštrikčná mapa (obr. 1). Časť inzertu DNA pCW-11 E (1,2 kb BamHI-Xbal fragment) sa prekrývala s DNA nachádzajúcu sa v inzerte pCW-1 C.
Genómická DNA, poštiepená s BamHI, z niekoľkých rozličných A. pleuropneumoniae sérotypov, bola hybridizovaná s 2, lkb Bglll-Stul fragmentom pCW-11 E (obr. 1) kvôli určeniu sérotypovej špecificity tejto DNA oblasti (obr. 2). 2,1 kb Bglll-Stul DNA fragment hybridizoval s 5,8kb BamHI fragment genomickej DNA z troch testovaných kmeňov J. pleuropneumoniae sérotyp 5, ale nie s genomickou DNA zo sérotypov 1, 2, 7 a 9 (obr. 2). Teda DNA A. pleuropneumoniae v pCW-11 E obsahovala DNA, ktorá bola špecifická pre kmene sérotypu 5. Pretože táto DNA bola sérotypovo špecifická, je pravdepodobné, že sa bude podieľať na biosyntéze puzdrového polysacharidu.
Nukleotidová sekvencia a analýza sérovo špecifickej DNA oblasti A. pleuropneumoniae
Určila sa nukleotidová sekvencia 2,7kb Xbal-EcoRV DNA fragmentu pCW-11 E. Táto nukleotidová sekvencia bola kombinovaná s nukleotidovou sekvenciou 4,6kb ClalXbal fragmentu pCW-1 C a skúmala sa na prítomnosť otvorených čítacích rámcov (ORFa), neidentifikovaných pred
SK 284610 Β6 tým. Nukleotidová sekvencia 3,2kb W/Wlll-ŕľcoRV fragmentu pCW-HE, obsahujúca novo identifikované ORFs, je uvedená na obr. 3. Dva kompletné čítacie rámce, označené cpsA a cpsB (cps ako syntéza puzdrového polysacharidu), boli identifikované upstream a na protiľahlom reťazci ako cpxD gén, podieľajúci sa na exporte puzdrového polysacharidu A. pleuropneumoniae (obr. 1 a obr. 3). AUG iniciačný kodón pre cpsB bol 3 nukleotidy downstream od UAA terminačného kodónu cpsA. AUG iniciačný kodón tretieho potenciálneho ORF, cpsC, bol identifikovaný 15 báz downstream od UAA terminačného kodónu pre cpsB. ShineDalgamové ribozóm viažuce konsenzus sekvencie (Shine a Dalgamo, 1974) boli identifikované v rámci 13 báz upstream od AUG iniciačných kodónov cpsA, cpsB a cpsC (obr. 3). Pravdepodobný promótor, obsahujúci sekvencie podobné konsenzus sekvenciám E. coli70 -10 (TATAAT) a -35 (TTGACA) (Hawley a Mc Clure, 1983), bol identifikovaný upstream od cpsA (obr. 3). Tesná blízkosť cpsABC a identifikácia pravdepodobného promótora upstream naznačovala, že tieto ORFs môžu byť transkribované spoločne. G+C obsah pre DNA oblasť kódujúcu cpsXBCbol 28 %.
Pravdepodobné polypeptidy cpsA a cpsB pozostávali z 321 (CpsA) a 526 (CpsB) aminokyselín (obr. 3). Predpokladané molekulové hmotnosti CpsA a CpsB boli 36,9 resp. 61,7 kDa. Hydropatické diagramy ukázali, že CpsA a CpsB sú relatívne hydrofilné proteíny, naznačujúc, že tieto proteíny môžu byť spojené s cytoplazmatickým úsekom A. pleuropneumoniae (údaje nie sú ukázané). BLAST vyhľadávania (Altschul a ďalší, 1990) v kombinovaných, neredundantných nukleotidových a proteínových databázach v National Center for Biotechnology Information neodhalili žiadnu podstatnú homológiu ani na nukleotidovej, ani na aminokyselinovej úrovni medzi cpsABC a inými sekvenciami v databázach (údaje nezobrazené). Ale nízka úroveň homológie (15 % podobnosť) bola pozorovaná medzi CpsA a Ríb proteínom E. coli, O-antigén glykozyltransferázou podieľajúcou sa na biosyntéze LPS (Cheah a Manning, 1993). Nízka úroveň homológie (približne 14 % podobnosť) sa zistila medzi CpsB a oblasťou 2 ORF 3 predpokladaného proteínového produktu zapuzdrovacieho lokusu H. influenzae typ b. Predpokladaný proteín ORF 3 sa podieľa na biosyntéze polyribozylribitolfosfátového puzdrového polysacharidu H. influenzae typ b (Van Eldere a ďalší, 1995). Žiadna signifikantná homológia nebola zistená medzi N-koncovými 83 aminokyselinami CpsC a akýmkoľvek iným proteínom v databáze.
Produkcia proti kanamycínu odolných, neopuzdrených transformantov A. pleuropneumoniae sérotyp 5a
Obr. 4 schematicky znázorňuje postupy, použité na prípravu rekombinantných neopuzdrených mutantov A. pleuropneumoniae J45 homologickou rekombináciou a alelickou výmenou. Najskôr bol skonštruovaný vektor pCWl 1ΕΔ1 KS1 na použitie ako nereplikujúci sa samovražedný vektor na podporu výmeny štandardnej DNA pre opuzdrovanie A. pleuropneumoniae za geneticky zmenená DNA pre opuzdrenie A. pleuropneumoniae dvojitou crossing over homologickou rekombináciou. Vektor pCWl ΙΕΔΙ KS1 bol skonštruovaný tak, že sa najskôr poštiepil pCW-11 E s BgAl a Stul, aby sa vytvorila veľká delécia v sérotypovo špecifickej A. pleuropneumoniae opuzdrovacej DNA. Konce tejto poštiepenej DNA boli tupo zakončené a fragment veľkosti 6,4 kb bol ligovaný s 3,8kb BamHI fragmentom pKS (tiež tupo zakončeným), obsahujúcim nptl-sacR-sacB kazetu. Táto kazeta obsahuje Tn903, a pred ním nptl gén, o ktorom je známe, že poskytuje kanamycínovú rezistenciu (Kan1) A. pleuropneumoniae (Tas con a ďalší, 1994), a sacRB sekvencie, ktoré poskytujú citlivosť na sacharózu (Sucs) mnohým gram-negatívnym baktériám (Gay a ďalší, 1983; Ried a Collmer, 1987). Delécia vytvorená v pCWllEAlKSl zahrnula cpsABC (obr. 1, obr. 4) a bola preto pravdepodobne postihla proteínové produkty týchto ORFs.
Vektor pCWllEAlKSl sa nereplikoval v A. pleuropneumoniae a preto fungoval ako samovražedný vektor. Potom, ako bol pCWllEAlKSl elektroporovaný do A. pleuropneumoniae J45, sa získalo sedem transformantov odolných proti kanamycínu po dvojdňovej inkubácii získaných zmesí pri 37 °C. Štyri z týchto J45 transformantov, odolných proti kanamycínu, neboli sfarbené, keď sa vizualizovali na platniach s nepriamo preneseným zdrojom svetla, preukazujúc, že tieto transformanty sú neopuzdrené (údaje nezobrazené). Činiteľom bolo médium použité na pestovanie A. pleuropneumoniae pred elektroporáciou s pCWllEAlKSl, pretože neopuzdrené transformanty, odolné proti kanamycínu, sa nikdy nezískali, keď sa A. pleuropneumoniae pestoval v mozgovo srdcovom médiu doplnenom s NAD.
Genotypová charakterizácia transformantov A. pleuropneumoniae, odolných proti kanamycínu
Predbežné analýzy kolónovej hybridizácie siedmich transformantov, odolných proti kanamycínu, odhalili, že štyri transformanty, ktoré sa javili ako neopuzdrené (vizuálnou kontrolou) hybridizovali s nptl špecifickou DNA sondou (1,24 kb Pstl fragment pKS), ale nie so sondami špecifickými pre pGEM-3Z (1,1 kb Bgll fragment pGEM3Z) alebo sérotypovo špecifickým 2,1 kb ŕ?g/ll-Stal fragmentom pCW-HE (dáta nezobrazené). Z týchto výsledkov vyplýva, že dvojitá rekombinácia sa vyskytla v každom z týchto štyroch transformantov, odolných proti kanamycínu. Na rozdiel od toho, kolónie ďalších troch kanamycín-rezistentných transformantov hybridizovali so sondami, špecifickými pre nptl gén, pGEM-3Z a 2,lkb Bg/H-Atal fragment pCW-Ι 1E, dokazujúc, že došlo k jednoduchému crossing o veru a celý samovražedný vektor pCWllEAlKSl bol integrovaný do chromozómu týchto transformantov (údaje neznázomené). Southem blot analýzy genomickej DNA purifikovanej zo štyroch kanamycin-rezistentných, potenciálne neopuzdrených transformantov (použitím opísaných sond) boli identické, z čoho vyplýva, že rovnaká dvojitá rekombinácia prebehla v každom z týchto transformantov. Jeden z týchto transformantov bol náhodne vybraný na ďalšie testovanie a bol označený ako J45-100.
Vykonali sa Southem blot analýzy genomickej DNA, izolovanej z J45 a J45-100 DNA, sondami špecifickými pre nptl gén, 2,lkb Bglll-Stul fragment pCW-UE a 2,lkb Clal fragment pCW-lC (obr. 5). nptl špecifická DNA sonda hybridizovala s 5,0kb fragmentom Xbal poštiepenej J45-100 DNA, ale nie s J45 DNA, potvrdzujúc, že nptl marker bol v chromozóme J45-100 (obr. 5A). Hybridizácia nptl sondy s 5,0kb Xbal J45-100 fragmentom genomickej DNA bola v súlade s veľkosťou tohto Xbal fragmentu v pCWl 1E 1KS1 samovražednom vektore použitom na prípravu J45-100. 2,lkb fragment Bglll-Stul pCW-HE hybridizoval s 5,8kb BamHI fragment J45, ale nie s J45-100, potvrdzujúc, že tento fragment bol v J45-100 deletovaný (obr. 5B). Sonda špecifická pre gény cpxCBA (2,1 kb Clal fragment pCW-1C) podieľajúca sa na exporte puzdrového polysacharidu hybridizovala s 5,3kb Xbal fragment J45 aj J45-100 (obr. 5C). Tento výsledok potvrdil, že časť opuzdrovacieho lokusu A. pleuropneumoniae ostala dvojitou rekombináciou, ktorá nastala v susednej DNA oblasti, nedotknutá. Sonda špecifická pre pGEM-3Z nehybridizovala s genomickou
SK 284610 Β6
DNA ani z J45, ani z J45-100, potvrdzujúc, že v genóm J45-100 neobsahuje žiadny vektor. Zo všetkých týchto výsledkov DNA hybridizácie vyplynulo, že v J45-100 nastala dvojitá rekombinácia a alelická výmena.
Fenotypová charakterizácia kanamycín-rezistentného transformantu A. pleuropneumoniae, J45-100
J45-100 bol hodnotený z hľadiska produkcie puzdrového polysacharidu kolónovým imunoblottingom a latexovou aglutináciou. Antisérum, obsahujúce protilátky špecifické pre puzdrový polysacharid A. pleuropneumoniae sérotyp 5 a, ale nie pre iné komponentny povrchu baktérie, reagovalo s J45, ale nereagovalo s J45-100 (obr. 6). Pretože bakteriálne kolónie na membráne boli lyzované chloroformom, tieto výsledky naznačujú, že J45-100 neprodukoval intracelulámy alebo extracelulámy puzdrový polysacharid. Úplný alebo sonifikovaný J45-100 neaglutinoval latexové guľôčky, ktoré boli kovalentne konjugované kvôli purifikovaniu protilátky proti puzdrovému polysacharidu sérotyp 5a A. pleuropneumoniae (Inzana, 1995), zatiaľ čo J45 celé bunky a sonifikované J45-C bunky silne aglutinovali latexové guľôčkové reakčné činidlá (údaje nezobrazené). Tieto výsledky potvrdili, že delécia v cap lokuse A. pleuropneumoniae J45-100 vyústila do straty biosyntézy puzdrového polysacharidu. Tieto výsledky ďalej naznačili, že neopuzdrený mutant J45, izolovaný po etylmetánsulfonátovej mutagenéze (Inzana et al., 1993a) J45-C, produkoval intracelulámy, ale nie extracelulámy polysacharid puzdra.
Expresia Apx toxínu a LPS elektroforetické profily J45 a J45-100 sa porovnávali kvôli určeniu, či genetická mutácia v cap lokuse J45-100 ovplyvnila tieto dôležité virulentné determinanty. Nebol zistený žiadny rozdiel vo vylučovaní 105kDa Apxl a Apxll proteínového toxínu do kultivačného supematantu medzi J45 a J45-100 (obr. 7). Okrem toho nebol zistený žiadny rozdiel v LPS elektroforetických profiloch J45 a J45-100 (obr. 8).
Skúmali sa rast J45 a J45-100 v TSY-N a citlivosť J45 a J45-100 proti bakteriálnej aktivite prekolostrálneho teľacieho séra kvôli stanoveniu vplyvu straty zapuzdrenia na tieto fenotypové vlastnosti. Krivky rastu J45 a J45-100 v TSY-N boli podobné, ale nie identické (údaje nezobrazené). Ale platňové impulzy určujúce životaschopnosť demonštrovali, že počas logaritmickej fázy rastu J45-100 rástol rýchlejšie (generačný čas = cca 23 minút) ako rodičovský opuzdrený kmeň J45 (generačný čas = cca 28 minút) (údaje nezobrazené). Rekombinantný neopuzdrený mutant J45-100 bol účinne usmrtený do 60 minút v 10 až 50 % prekolostrálnom teľacom sére ako doplnkovom zdroji, pričom opuzdrený rodičovský kmeň J45 nebol usmrtený (obr. 9).
Skúmala sa citlivosť J45-100 proti sacharóze kvôli stanoveniu, či by sacRB sekvencie mohli fungovať ako kontraselektovateľný marker v A. pleuropneumoniae a následne indukovať excíziu npíl-sacRB kazety z chromozómu J45-100. V rastovom médiu J45-100 rástli veľmi ťažko, keď sa umiestnili priamo, alebo keď sa zriedili a potom umiestnili do TSY-N alebo Luria-Bertani (ku ktorému sa pridalo 5 μg/ml NAD) kultivačného média, obsahujúceho 5 % alebo 8 % sacharózy. Prítomnosť sacRB sekvencií v chromozóme J45-100 bola overená Southcm blotom. Výsledky ukázali, že buď sacRB marker nebol inkorporovaný do A. pleuropneumoniae, alebo snáď levan produkt, vytvorený sacRB levansacharózou (invertázou) v prítomnosti sacharózy, nebol toxický proti J45-100.
Intratracheálne očkovanie prasiat s rekombinatným neopuzdreným J45-100 mutantomď. pleuropneumoniae
Rekombinantný neopuzdrený mutant J45-100 nespôsoboval žiadnu mortalitu prasiat, keď bol podávaný v dávkach 3 a 6-násobku (1,45 x 107 CFU respektíve 2,95 x 107 CUF) 50 % letálnej dávky (LD50) opuzdreného rodičovského kmeňa J45 (5 x 106 CFU) (Inzana a ďalší, 1993a) (tabuľka 2). Na druhej strane pri všetkých troch prasatách, testovaných s 6,5-násobkom LD50 J45, sa vyvinuli vážne pľúcne lézie a uhynuli (tabuľka 2).
Tabuľka 2
Virulencia A pleuropneumoniae J45 a J45-100 pri prasatách
počet pozitívnych/celkový počet testovaných
testovaný imunológ, kmeň testovaná imunologická dávka vyhodnotenie priemernej pľúcnej lézie úmrtnosť uzdravenier
J45 1,6-3,3x10’ CFUb 4+ 3/4c 4/4
J45-100 1,5x10’ CFU 0 0/5 0/5
J45-100 3,0x10’ CFU 1 + 0/5 2/5d
J45-100 8,4x10’ CFU 1+ 1/4C 4/4d
J45-100 1,8x108 CFU 2+ 0/4 4/4d
J45-C( 1,7x10“ CFU 1+ 0/2 2/2d
a uzdravenie testovaného kmeňa zo vzorky pľúc odobratej nekropsiou. Prasatá ošetrené s J45-100 boli pitvané 4 dni po podaní
b táto dávka je 6,6-násobkom 50 % letálnej dávky (5x106 CFU), uvedenej v predchádzajúcej štúdii (Inzana et al., 1993 a)
c všetky prasatá v tejto skupine uhynuli do 36 hodín po podaní dávky
11 A. pleuropneumoniae bol opätovne získaný z pľúc a potvrdilo sa, že je neopuzdrený chýbajúcim sfarbením a zlyhaním pri aglutinácii 5-špecifickým sérotypom senzitivizovaných latexových čiastočiek
' po nekropsii jedného uhynutého prasaťa bola smrť označená ako zapríčinená nesprávnym podaním
f J45-C je chemicky indukovaný neopuzdrený mutant, ktorý už bol charakterizovaný
Päť prasiat, ktorým bola podaná nižšia dávka J45-100 (1,45 x 107 CFU), nemalo žiadne klinické príznaky, charakteristické pre pleuropneumóniu ošípaných, a nevyvinuli sa v nich žiadne pľúcne lézie. Ďalej, A. pleuropneumoniae nebol kultivovaný z pľúcnych vzoriek, nekroskopicky odobratých štyri dni po podaní dávky. Dve z piatich prasiat, ktorým bola podaná vyššia dávka J45-100 (2,95 x 107 CFU), boli klinicky normálne a pri nekropsii sa nezistili žiadne pľúcne lézie. Jedno prasa v tejto skupine, ktorému bola podaná vyššia dávka J45-100, malo rozvinutú dusnosť a pri nekropsii boli zistené nejaké pľúcne prekrvenia a drobné krvácania (vyhodnotenie pľúcnej lézie = 1+). Zostávajúce dve prasatá tejto skupiny mali miernu dušnosť a pri nekropsii sa zistila pleuritída a zhojenie (vyhodnotenie pľúcnej lézie = 2+). Kultivovaný bol len A. pleuropneumoniae J45-100 z týchto dvoch prasiat s najvážnejšími pľúcnymi léziami. Baktérie získané opätovne z týchto prasiat neviazali latexovým aglutinačným činidlom sérotyp 5a. Teda opätovne získané baktérie už boli neopuzdrené, z čo ho vyplýva, že J45-100 sa in vivo nepremenil na opuzdrený fenotyp.
Hoci nptl (poskytuje odolnosť proti kanamycínu) a SacB/SacR (poskytuje citlivosť proti sacharóze) gény boli klonované do miesta delécie, tieto gény boli uvažované len na použitie ako markerové gény. Použité môžu byť aj alternatívne markerové gény. Toto môže byť výhodné na predídeme použitia markerov odolných proti antibiotikám, ako napríklad nptl z dôvodov zdravia a príslušnej bezpečnosti alebo na poskytnutie mechanizmu na vyliečenie alebo inaktiváciu antibiotického markeru. Vhodné neantibiotické markery môžu zahŕňať odolnosť proti ortuti.
Neopuzdrený kmeň A. pleuropneumoniae sérotyp 5 pripravený uvedenými postupmi produkuje len dva z troch toxínov vytváraných Actinobacillus pleuropneumoniae. Hoci modifikovaný Actinobacillus pleuropneumoniae je ochranný a imunogénny, môže byť užitočné klonovanie tretieho RTX toxínového génu do miesta delécie. Toto sa dá urobiť klonovaním RTX toxínového génu do kazety génu kanamycínu kmeňa J45-100, teda inaktiváciou kanamycínového génu.
Vakcíny by mali byť výhodne poskytnuté vo forme podobnej iným vakcínam, známym zo stavu techniky. Je výhodné, ak vakcína bude balená ako lyofílizovaná zmes a môže obsahovať jeden alebo viac sérotypov mutantných kmeňov. Na zachovanie životaschopnosti by mohli obsahovať také substancie, ako Columbia médium, trehalózu alebo albumín, glycerol alebo nejaké iné činidlo. Obsah lyofilizovanej zmesi by mal byť len rehydratovaný sterilnou vodou alebo izotonickým roztokom a injektovaný (intramuskuláme, intravenózne, intraperitoneálne, subkutánne a pod.). Vakcína môže byť tiež upravená aj na ďalšie spôsoby aplikácie (napríklad orálny, transdermálny, sublingválny atď.), s využitím vhodných nosičových matríc (napríklad škrob, polysacharidy, oleje, lipozómy, gumy atď.).
Dávka vakcíny, podaná živočíchovi, bude závisieť od takých faktorov, ako sú vek alebo pohlavie živočícha a spôsob podávania. Vo všetkých prípadoch by malo byť podané dostatočné množstvo živého, nevirulentného, neopuzdreného Actinobacillus pleuropneumoniae, aby sa dosiahol nárast imunogenetickej odozvy vakcinovaného živočícha. Úspešné výsledky sa dosiahli s 2 oddelenými dvoj- až trojtýždňovými imunizáciami 109 jednotiek tvoriacich kolóniu.
Zatiaľ čo vynález bol opísaný formou výhodných uskutočnení, odborníci v odbore budú vedieť, že vynález môže byť realizovaný v modifikáciách, ktoré spadajú do rozsahu priložených nárokov.

Claims (5)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Vakcína na očkovanie ošípaných proti pleuropneumónii, vyznačujúca sa tým, že obsahuje nevirulentný, neopuzdrený geneticky modifikovaný Actinobacillus pleuropneumoniae, s chýbajúcimi DNA sekvenciami, kódujúcimi syntézu puzdra, ktoré sú lokalizované pred hybridizačným miestom BamHI-Xbal fragmentu v pCW-1C ako je znázornený na obrázku 1.
  2. 2. Vakcína podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že DNA sekvencie kódujúce syntézu puzdra sú lokalizované pred génom na export puzdra uvedenej baktérie.
  3. 3. Vakcína podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že génom na export puzdra je cpxD.
  4. 4. Vakcína podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že je v injekčnej forme na subkutánne alebo intramuskuláme podanie.
  5. 5. Spôsob výroby vakcíny na prevenciu ochorení spôsobených baktériou Actinobacillus pleuropneumoniae sérotyp 5 podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky: identifikáciu DNA sekvencií kódujúcich syntézu puzdra v baktériách, ktoré sú lokalizované pred hybridizačným miestom BamHI-Xbal fragmentu v pCW-lC a deletovanie uvedených DNA sekvencií kódujúcich syntézu puzdra na prípravu neopuzdrených mutantov uvedených baktérií.
SK1771-98A 1996-06-27 1997-06-17 Vakcína obsahujúca nevirulentný, neopuzdrený geneticky modifikovaný Actinobacillus pleuropneumoniae a spôsob jej výroby SK284610B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/673,814 US6086894A (en) 1996-06-27 1996-06-27 Recombinant vaccine for diseases caused by encapsulated organisms
PCT/US1997/010236 WO1997049416A1 (en) 1996-06-27 1997-06-17 Recombinant vaccine for diseases caused by encapsulated organisms

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK177198A3 SK177198A3 (en) 2000-03-13
SK284610B6 true SK284610B6 (sk) 2005-07-01

Family

ID=24704213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1771-98A SK284610B6 (sk) 1996-06-27 1997-06-17 Vakcína obsahujúca nevirulentný, neopuzdrený geneticky modifikovaný Actinobacillus pleuropneumoniae a spôsob jej výroby

Country Status (19)

Country Link
US (2) US6086894A (sk)
EP (1) EP0964689A4 (sk)
JP (1) JP2001522347A (sk)
CN (1) CN1092069C (sk)
AR (1) AR008615A1 (sk)
AU (1) AU734254B2 (sk)
BR (1) BR9710986A (sk)
CA (1) CA2258168A1 (sk)
CZ (1) CZ295438B6 (sk)
HK (1) HK1020004A1 (sk)
NO (1) NO986099L (sk)
NZ (1) NZ333387A (sk)
PL (1) PL186728B1 (sk)
RU (1) RU2234941C2 (sk)
SK (1) SK284610B6 (sk)
TR (1) TR199802716T2 (sk)
UA (1) UA70287C2 (sk)
WO (1) WO1997049416A1 (sk)
ZA (1) ZA975586B (sk)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL138803A0 (en) * 1998-04-02 2001-10-31 Univ Oklahoma Nucleic acid encoding hyaluronan synthase
US7708642B2 (en) 2001-10-15 2010-05-04 Igt Gaming device having pitch-shifted sound and music
PT1350796E (pt) * 2002-04-05 2009-01-23 Merial Sas Bactérias gram-negativas atenuadas
US7449178B2 (en) 2002-04-05 2008-11-11 Merial Limited Attenuated gram negative bacteria
GB0228691D0 (en) * 2002-12-09 2003-01-15 Imp College Innovations Ltd Bacterial virulence genes
BRPI0410911B1 (pt) * 2003-07-02 2014-07-08 Biotechnology Res & Dev Mutantes acapsulares de p. multocida por deleção de hyae
CN102209725B (zh) * 2008-11-10 2016-02-24 诺沃—诺迪斯克有限公司 缺乏功能性ii组荚膜基因簇的大肠埃希氏菌bl21菌株
TWI548746B (zh) * 2009-08-06 2016-09-11 英特威特國際股份有限公司 防備豬胸膜肺炎之疫苗及製備該疫苗之方法
CN106866800B (zh) * 2016-09-14 2020-08-18 四川农业大学 胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US549818A (en) * 1895-11-12 Rolling-mill
AR241545A1 (es) * 1985-07-12 1992-08-31 Cornell Res Foundation Inc Un metodo para preparar una cepa de s. equi avirulenta a.t.c.c. 53186 para equinos.
WO1993010815A1 (en) * 1991-12-06 1993-06-10 Center For Innovated Technology Non-capsulated mutants of bacteria useful as vaccines
JP2717481B2 (ja) * 1992-08-25 1998-02-18 富士写真フイルム株式会社 ハロゲン化銀カラー写真感光材料

Also Published As

Publication number Publication date
PL330863A1 (en) 1999-06-07
AU734254B2 (en) 2001-06-07
EP0964689A1 (en) 1999-12-22
JP2001522347A (ja) 2001-11-13
EP0964689A4 (en) 2004-09-08
US6326001B1 (en) 2001-12-04
RU2234941C2 (ru) 2004-08-27
CZ418998A3 (cs) 1999-07-14
WO1997049416A1 (en) 1997-12-31
AR008615A1 (es) 2000-02-09
NO986099L (no) 1999-01-13
US6086894A (en) 2000-07-11
CA2258168A1 (en) 1997-12-31
NO986099D0 (no) 1998-12-23
ZA975586B (en) 1998-03-23
UA70287C2 (en) 2004-10-15
BR9710986A (pt) 2001-12-11
TR199802716T2 (xx) 2001-06-21
HK1020004A1 (en) 2000-03-10
CN1223586A (zh) 1999-07-21
AU3390497A (en) 1998-01-14
NZ333387A (en) 2000-06-23
PL186728B1 (pl) 2004-02-27
CN1092069C (zh) 2002-10-09
SK177198A3 (en) 2000-03-13
CZ295438B6 (cs) 2005-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Barry et al. Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin and hemolytic activities require a second gene, cyaC, for activation
HU228700B1 (en) Streptococcus suis vaccines and diagnostic tests
US5843444A (en) Conjugate vaccine for group B streptococcus
Ward et al. Cloning and mutagenesis of a serotype-specific DNA region involved in encapsulation and virulence of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5a: concomitant expression of serotype 5a and 1 capsular polysaccharides in recombinant A. pleuropneumoniae serotype 1
EP0656014B1 (en) Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group b streptococcus; process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition
JPH11504662A (ja) アクチノバチラス・プレウロニューモニエに対するワクチンとしてのリボフラビン変異体
KR100349331B1 (ko) 비(b)군연쇄상구균에대한접합백신
US20080241181A1 (en) Environmentally regulated genes of Streptococcus suis
Bandara et al. Association of Actinobacillus pleuropneumoniae capsular polysaccharide with virulence in pigs
Shimoji et al. Construction and vaccine potential of acapsular mutants of Erysipelothrix rhusiopathiae: use of excision of Tn 916 to inactivate a target gene
JP3388171B2 (ja) 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造
SK284610B6 (sk) Vakcína obsahujúca nevirulentný, neopuzdrený geneticky modifikovaný Actinobacillus pleuropneumoniae a spôsob jej výroby
WO2006130925A1 (en) Genetic manipulation of clostridium difficile
JP2001510342A (ja) 新規微生物
AU743654B2 (en) LKTA deletion mutant of P. haemolytica
KR20000049090A (ko) 헬리코박터 필로리 생백신
NZ208282A (en) Immunogen compositions containing salmonella typhi and dna vector containing a base sequence encoding lt-b toxin
US7541447B2 (en) Process for the preparation of an improved Brucella strain plasmid to develop the strain and the vaccine comprising the said strain
CN108671227A (zh) 一种预防猪链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗
JPH0284183A (ja) ボルデテラ・ペルタシスワクチン
JPH09501308A (ja) 接触仲介性溶血素のレギュレーター
KR100567351B1 (ko) 피낭형세균에의해유발되는질병에대한재조합백신
US5895756A (en) Non-antibiotic system for selection of recombinant mycobacteria
WO2004089408A2 (en) Vaccine preparations comprising live or killed attenuated mutant neisseria bacteria
Guidolin Molecular biology of" Vibrio cholerae" bacteriophage CP-T1 and its host interactions