CN102209725B - 缺乏功能性ii组荚膜基因簇的大肠埃希氏菌bl21菌株 - Google Patents

缺乏功能性ii组荚膜基因簇的大肠埃希氏菌bl21菌株 Download PDF

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Abstract

本发明涉及含有II组荚膜基因簇缺失的新的非致病性大肠埃希氏菌（<i>E.coli</i>）B？BL21菌株，及其用于生产肽的用途。

Description

缺乏功能性II组荚膜基因簇的大肠埃希氏菌BL21菌株
技术领域
本发明涉及大肠埃希氏菌（Escherichia coli，E. coli）基因组的操作，改进的非致病性E. coli B菌株及其用于生产肽和蛋白质的用途。
背景技术
细菌已经被用于生产很多商业产品。遗传工程化的细菌，如E. coli，作为宿主细胞，在实验室和产业中用于生产生物试剂如肽和核酸的用途在现有技术中是公知的。自然环境中的细菌暴露于很多在标准工业化或实验室生长正常情况下不会经历的条件，因此它们的基因组携带了大量条件依赖性、压力诱导的基因，或换言之，非必须的基因，这些基因在这些有机体的工业化或实验室用途中可能不需要，或者可能甚至是不想要的。
细菌病原含有致病因子，例如细胞表面的荚膜多糖，介导细菌及其邻近环境的相互作用，并且具有一些与其致病性直接相关的功能。E. coli 中已经发现了超过80个血清学和化学性质上不同类型的多糖荚膜，并且称为K抗原。这些多糖荚膜分为4组，其中II组荚膜多糖与流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）和脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitides）的荚膜多糖类似。II组荚膜基因簇含有大部分与侵入性疾病相关的荚膜类型，并具有含有三个功能区域的保守的遗传组织。在II组基因簇中，区域1和3为保守区域，编码将多糖从其合成的位点转运到细胞表面必需的肽，而区域2为血清型特异性，编码负责生物合成和单个单糖聚合的酶类，包含特定的多糖。区域1含有6个基因 kpsFEDUCS，组织在单个转录单元中。区域2为血清型特异性，在II组抗原不同。区域3含有2个基因kpsM和kpsT，组织在单个转录单元中[Andreishcheva 等人Gene (2006) 384: 113-119]。
E. coli 菌株K-12和B为非包膜的细菌，为肽生产通常使用的菌株。E. coli K-12基因组已经完全测序，不含任何荚膜基因。已经发现，高产量表达重组肽优选的菌株E. coli B BL21(DE3)，含有一簇编码II组荚膜多糖的基因，并且认为E. coli B 的祖先一定已经通过横向转移获得了这些荚膜基因。在含有基因功能形式的菌株中，位于E. coli荚膜的K抗原经常与致病性表型相关。已经证明在E. coli B BL21中，II组荚膜基因簇的区域2通过插入元件（IS1）失活，阻止抗原产生，而支持野生型荚膜抗原转运和呈递的区域1和3仍然完整[Andreishcheva 等人 Gene (2006) 384: 113-119]。但是，仍然存在重建功能性II组荚膜基因簇的理论可能性，例如，如果区域2的IS1丢失则II组基因簇就可以重建。或者，如果IS1突变的区域与外源野生型区域2交换，则II组基因簇也可以重建。
本发明提供了永久性敲除（KO）II组荚膜基因簇的E. coli B BL21 (DE3)菌株，使该菌株达到其他商品化的重要菌株如E. coli K-12同样的安全等级。
发明内容
本发明涉及具有不可逆失活的II组荚膜基因簇的E. coli B BL21菌株。
在一个实施方式中，E. coli B BL21菌株特征为具有II组荚膜基因簇的全部或部分缺失。
在一个实施方式中，E. coli B BL21菌株特征为具有II组荚膜基因簇的全部缺失。
在一个实施方式中，E. coli B BL21菌株特征为具有II组荚膜基因簇的部分缺失。
在另一个实施方式中，E. coli B BL21菌株特征为在II组荚膜基因簇中具有一个或多个点突变。
在另一个实施方式中，E. coli 菌株特征为具有至少5%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。
在另一个实施方式中，E. coli菌株特征为具有至少25%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。
在另一个实施方式中，E. coli菌株特征为具有至少40%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。
在另一个实施方式中，E. coli菌株特征为具有至少55%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。
在另一个实施方式中，E. coli菌株特征为具有75%到100%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。
在另一个实施方式中，E. coli菌株特征为具有至少85%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。
在另一个实施方式中，E. coli菌株特征为具有至少95%的II组荚膜基因簇通过缺失永久性失活。
在一个实施方式中，30%的II组荚膜基因簇被缺失。
在另一个实施方式中，50%的II组荚膜基因簇被缺失。
在另一个实施方式中，70%的II组荚膜基因簇被缺失。
在另一个实施方式中，80%的II组荚膜基因簇被缺失。
在另一个实施方式中，90%的II组荚膜基因簇被缺失。
在一个实施方式中，E. coli 菌株为E. coli B BL21(DE3)，并且在另一个实施方式中E. coli 菌株为E. coli B BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr。
本发明还涉及生产E. coli B菌株的方法，其中II组荚膜基因簇采用包含下列步骤的方法被缺失：
a. 使用选择标记替换II组荚膜基因簇，
b. 消除选择标记，并
c. 通过PCR分析确认缺失。
在一个实施方式中，选择标记为抗生素抗性基因。
在另一个实施方式中，抗生素抗性基因选自氯霉素、四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、万古霉素和红霉素。
在还另一个实施方式中，抗生素抗性基因是氯霉素。
本发明还涉及通过在本发明的E. coli菌株中引入包含编码肽的DNA序列的表达载体生产肽的方法。
在一个实施方式中，本发明还涉及生产肽的方法，包括在适当的培养基中，在用于编码所述肽的DNA表达的条件下，培养根据本发明的E. coli B菌株。表达载体所要表达的肽可以是任何能够在E. coli中表达的肽。这些肽代表性的实例为hGH，胰高血糖素样肽，白细胞介素、胰岛素类似物，野生型脂联素、FGF-21、胰蛋白酶、抑肽酶、胰淀素和瘦蛋白及其类似物，以及酶类如唾液酸酶、转谷氨酰胺酶（tGase）、HRV（人类鼻病毒）3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶及其变体。
在一个实施方式中，本发明的E. coli菌株含有包含编码肽的DNA序列的表达载体。
在一个实施方式中，所要生产的肽为hGH。
在另一个实施方式中，所要生产的肽为FGF-21。
在另一个实施方式中，所要生产的肽为胰淀素。
在另一个实施方式中，所要生产的肽为瘦蛋白。
在另一个实施方式中，所要生产的肽为唾液酸酶。
附图说明
图1显示具有非编码侧翼区的E. coli B BL21(DE3)荚膜基因簇的遗传组织结构（orgnisation）。B BL21(DE3) 荚膜基因簇的开放阅读框（ORFs）（大箭头），转录方向（箭头指向）：区域1基因（灰色箭头）；区域2 ORFs（黑色箭头）；区域3基因（白色箭头）；IS1元件（白色盒子）[Andreishcheva 等人 Gene (2006) 384: 113-119]。小箭头表示非编码左臂（LA）和右臂（RA）的位置。
图2是II组荚膜基因簇敲除方法的工作流程示意图：a）用抗生素抗性基因替换II组荚膜基因簇和b）消除抗生素抗性基因。
图3显示敲除候选的PCR筛选。在敲除候选（但不是其母体菌株（BL或D））中扩增出正确大小的1696bp（LA+部分cat，上图A1-A3，下图B1-B3）和1578bp（LA+部分cat，上图A1-A3，下图B1-B3）片段表示成功敲除II组基因簇。对于阴性对照，仅母体菌株具有约3kb的条带，而II组敲除菌株没有。BL为BL21（DE）菌株标准对照，D为BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr菌株的标准对照。A1-A3为BL21(DE3)敲除候选的不同的菌落编号，B1-B3为BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr的敲除候选。
图4为摇瓶中宿主E. coli B菌株生长比较。所用的符号指下列菌株：●, BL21(DE3); □, BL21(DE3)∆ (kpsM-kpsF); ▬, BL21(DE3) ∆ dadX ∆ alr; Δ, BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr ∆ (kpsM-kpsF)。
图5显示不同E. coli B菌株的发酵生长曲线。所用的符号指下列菌株：♦, BL21(DE3); □, BL21(DE3)∆ (kpsM-kpsF); ▬, BL21(DE3) pNNC1-g; ○, BL21(DE3)∆ (kpsM-kpsF)/pNNC1-g。
图6显示不同诱导时间hGH表达的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：a）E. coli B BL21(DE3)/pNNC-1g中的表达和b）E. coli B BL21(DE3)∆ (kpsM-kpsF)/pNNC1-g中的表达。在a）和b）中，泳道1-3表示不同浓度的hGH：分别为5μg、2.5μg和1.25μg。泳道4表示诱导前的hGH表达，泳道5-14表示1-10小时不同诱导时间每小时的hGH的表达。所有的样品都相对同样的上样OD进行标准化。
图7显示了诱导hGH表达前后不同E. coli B菌株的生长。所用的符号指下列菌株：♦: BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr/pNNC1-1h; □:BL21∆ dadX ∆ alr ∆ (kpsM-kpsF)/pNNC1-1h; Δ, BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr/pNNC1-1h 诱导的; ▬, BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr ∆ (kpsM-kpsF)/ pNNC1-1h 诱导的。
图8显示SDS-PAGE分析的不同诱导时间的hGH表达：a) E. coli B BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr /pNNC1-1h; b) E. coli B BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr ∆ (kpsM-kpsF) /pNNC1-1h。在a)和b)中，泳道1-3显示不同浓度的hGH的表达，分别为5μg, 2.5μg和1.25μg。泳道4表示诱导前的hGH表达，泳道5-13表示1-9小时的不同诱导时间每小时的hGH的表达。所有的样品都相对同样的上样OD进行标准化。
图9显示在FDM1-2培养基中高细胞密度发酵中E. coli B BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr ∆ (kpsM-kpsF) /pNNC1a.23的生长曲线。当细胞密度达到70 OD600时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，诱导hGH突变体MEAE-hGH(L101C)的表达，并在25℃继续培养。8小时诱导后最终细胞密度达到大约100 OD600。
图10显示高细胞密度发酵期间MEAE-hGH(L101C)的表达。泳道1：标记；泳道2-4：作为标准品的纯化的hGH，浓度分别为5、2.5、1.25μg；泳道5-13：分别诱导 0、1、2、3、4、5、6、7和8小时后，不同时间间隔取样的样品。箭头表示目标蛋白MEAE-hGH(L101C)。
图11显示E. coli B BL21(DE3)∆ (kpsM-kpsF)中表达产脲节杆菌（Arthrobacter ureafaciens）唾液酸酶的发酵样品的SDS-PAGE分析。泳道1：标记；泳道2：诱导前，匀浆；泳道3：诱导后，匀浆；泳道4：最终样品，匀浆；泳道5：诱导前，不溶组分；泳道6：诱导后，不溶组分；泳道7：最终样品，不溶组分；泳道8：诱导前，可溶组分；泳道9：诱导后，可溶组分；泳道10：最终样品，可溶组分；泳道11-12：唾液酸酶标准品（150和300mg/l）。所有样品10×稀释。
图12显示来源于智人（H.sapiens）的FGF21、胰淀素和瘦蛋白在E. coli B BL21 DE3和E. coli B BL21 DE3∆ (kpsM-kpsF)中的表达。泳道1：标记；泳道3-8：BL21 DE3中的表达；泳道9-14：BL21 DE3∆ (kpsM-kpsF)中的表达；泳道3和9：未诱导；泳道4和10：诱导的FGF21；泳道5和11：未诱导；泳道6和12：诱导的胰淀素；泳道7和13：未诱导；泳道8和14：诱导的瘦蛋白。
具体实施方式
本发明涉及具有不可逆失活的II组荚膜基因簇的E. coli B BL21菌株，其提供了生产肽的永久性安全的菌株。
野生型或任何其他E. coli B BL21(DE3)菌株的II组荚膜基因簇的损伤或失活，可以通过任何适当的技术包括缺失整个基因簇或其部分缺失或通过基因簇中一个或多个点突变来实现。
相比在工业上通常使用的菌株例如E. coli K-12，本发明的E. coli 菌株优点在于提供更耐久的（robust）和高产量的生产肽的方法。
本发明使用的E. coli B BL21(DE3)可以是如WO2008/025744中所述的双敲除（2×KO）菌株。此E. coli B BL21(DE3)菌株缺失了alr和dadX 两个基因，这两个基因均编码D,L-丙氨酸消旋酶。不向生长培养基中加入D-丙氨酸或质粒上不存在消旋酶之一（可以提供必需的D-丙氨酸），此双敲除菌株就不能生长。此2×KO的D-丙氨酸营养缺陷型E. coli 菌株，本说明书中称为E. coli B BL21(DE3)ΔalrΔdadX，能够进行非抗生素的选择操作来保持细胞中的质粒。
在本发明的一个实施方式中，野生型E. coli B BL21(DE3)或E. coli B BL21(DE3)ΔalrΔdadX 菌株的II组荚膜基因簇内一个或多个基因被缺失。Studier和Moffat[J.Mol.Biol. (1986) 189:113-130]，以及Studier等[Methods in Enzymology (1990) 185:60-89]描述了E. coli菌株B BL21 (DE3)，可以从Stratagene和Novagen得到。
在本发明的一个实施方式中，野生型E. coli B BL21(DE3)菌株的II组荚膜基因簇内一个或多个基因被缺失。在本发明的另一个实施方式中，E. coli B BL21(DE3)ΔalrΔdadX菌株的II组荚膜基因簇内一个或多个基因被缺失。
在另一个实施方式中，II组荚膜基因簇中缺失基因所选择的基因或多个基因是那些负责潜在病原性的基因。整个16kb的II组荚膜基因的缺失提供了防止致病性荚膜表型潜在的重建。图1显示荚膜菌株的II组荚膜基因簇中涉及的基因，包括区域1基因kpsFEDUCS，区域2 ORF1-4和区域3kpsM和kpsT。这些基因的任何一个或其组合都可以被缺失。
II组荚膜基因簇的完全缺失意味着3个区域的缺失，即Δ(kpsM-kpsF)。所获得的E. coli B菌株为E. coli B BL21(DE3)Δ(kpsM-kpsF)和E. coli B BL21(DE3)ΔalrΔdadX Δ(kpsM-kpsF)。
在一个实施方式中，本发明涉及除了插入元件（IS1）之外，任何足以使II组基因簇失活的修饰。
细菌是单倍体有机体，即它们仅有一个染色体，因此仅从环境中获得新的DNA例如通过转化时才发生重组。并且，细菌不容易被线性DNA转化，例如因为细胞内的外切核酸酶会降解线性DNA。但是，易重组的突变体缺少重组复合体的外切核酸酶，能够被线性DNA转化。重组酶为催化天然重组反应的酶类，已经证明λ Red相比其他重组系统显示出增强的重组率。缺失本发明菌株的II组荚膜基因簇的方法可以基于Datsenko和Wanner开发的Red-介导的重组技术[(2000) PNAS 97(12): 6640-6645]或其他传统方法。
图2显示了如何缺失本发明菌株的16kb的II组荚膜基因簇的示意图。在一个实施方式中，方法的第一步是通过PCR，通过使用具有核酸同源性延伸或同源性区域的引物RA和LA（参见图1），产生用选择标记替换16kb的II组荚膜基因簇。这通过在这些侧翼同源延伸中进行Red介导的重组来实现。选择后，本方法的第二步是通过使用表达FLP重组酶的辅助质粒消除选择标记，所述重组酶作用于选择标记侧翼的直接重复的FRT（FLP识别目标）位点。Red和FLP辅助质粒通过在37℃生长后消除（cured），因为它们是温度敏感的复制子。第三步包括用PCR分析验证缺失。
细菌转化可以称为通过吸收DNA带来的稳定的遗传变化，感受态指能够吸收外源DNA的状态。一些细菌在实验室条件下天然地能够吸收DNA，这些菌种携带负责使DNA通过细胞膜或多层膜的机制的基因集合，而其他细菌必须通过实验室操作被诱导，在所述实验室操作中使用自然界通常不发生的条件使细胞被动地变得可通透DNA。在存在二价阳离子，例如Ca2+ (在CaCl2中)的条件下制备冷却的（chilling）细胞，使细胞壁变得可以通透质粒DNA。细胞在冰上与DNA共同孵育，然后短暂热激（例如42℃，30-120秒），使DNA进入细胞，这是现有技术中公知的方法[Sambrook等人, A Laboratory Manual (1989) CSH]。电转化是在细菌（及其他）细胞上打孔的另一个方法，其通过用kV范围电场短暂电击这些细胞来进行。质粒DNA可以通过这些孔进入细胞。该方法可以用于大的质粒DNA。天然的膜修复机制将在电击后快速关闭这些孔。为了维持并在细胞内稳定保持，质粒DNA分子必须含有复制起始点，使其在细胞内独立于染色体进行复制。
当使用任何本说明书描述的基因失活方法时，II组基因簇的部分或全部的任何靶向失活都通过选择标记检测，从而可以鉴定并分离被修饰的E. coli B BL21菌株克隆。
选择标记可以是任何适当的标记基因，例如抗生素抗性基因或营养缺陷型标记。
适当的抗生素抗性基因为氯霉素、四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、万古霉素和红霉素、或者β-内酰胺类、氨基糖苷类、糖肽类或大环内酯类抗生素的任何其他代表。
本说明书使用的术语“克隆”需要制造DNA序列的多个同样的拷贝。然后将目标DNA序列插入克隆载体。因为此载体来源于自我复制的病毒、质粒或高等有机体细胞，当适当大小的DNA插入后，“目标和载体DNA片段随即连接”并产生重组的DNA分子。重组的DNA分子随后导入细菌菌株（通常为E. coli），在转化后产生多个同样的拷贝。转化是细菌进行的DNA吸收机制。但是，在单个细菌细胞内仅一个具有特定复制起始点的重组DNA分子能够确立，因此每个克隆仅含有一个DNA插入。
本说明书所使用的术语“基因组”或“遗传组成”指整个遗传物质，包括结构性和功能性，其是可遗传的和/或可转移的，并且包含在鉴定的细胞或微生物中。微生物的基因组（遗传组成）从而理解为包括染色体DNA和染色体外DNA（例如，质粒、R因子等）。
本说明书所使用的术语“约”意味着在所述的数值的合理范围内，例如加或减10%。
本说明书所使用的术语“敲除”指遗传工程化的细菌菌株，其中一个或多个基因被缺失或失活（被从机体中“敲除”）。敲除有机体通常用作研究已经被测序但功能未知的基因功能的模型。敲除技术可以用于从感兴趣的有机体中移除不希望和/或潜在致病性的基因。
本说明书所使用的术语“基因簇”意思是一组遗传上或功能上偶联的两个或多个基因。因为来自于共同祖先的群体倾向于具有相同基因簇的变体，因此它们可以用于回溯最近的进化历史。
术语“母本菌株”可以是任何基因组减少的菌株来源的细菌菌株。根据本发明的母本菌株的代表性例子包括但不限于E. coli菌株例如B或C，或与其基因组序列基本相同的菌株。
本说明书所使用的术语在给定的细菌宿主细胞中产生的肽的“水平”或“量”可以指根据所选择的生产方法对细胞培养基中存在或可检测的肽的定量测量。例如，如果所选择的肽的生产方法造成肽在细胞自身内的累积，则所产生的肽的水平或量将为在细胞自身内存在的肽的定量测量。如果肽生产方法包括肽的分泌，则所产生的肽的水平将为生长培养基中存在的肽的定量测量。
本说明书所使用的术语肽的“产量”指基本上纯的肽的定量的量，其中肽被回收和/或纯化，基本上不含有宿主菌株相关的天然肽。为了确定细菌宿主细胞例如E. coli B BL21菌株产生的定量的“产量”或“量”，可以使用常规的肽特异性的方法，例如免疫测定、高效液相色谱（HPLC）、酶活、分光光度计技术、SDS-PAGE等。
本说明书所使用的术语“表达对照序列”指引导与其可操作连接的核酸的转录的启动子或转录因子结合位点的阵列。
双链核酸所使用的术语“游离末端”可以指带有平游离末端或粘性游离末端的线性的核酸或其组合。
本说明书所使用的术语“基因”指包含编码多肽或其前体的核酸序列的核酸（例如，DNA或RNA）。多肽可以由全长编码序列编码或通过编码序列的任何部分编码，只要保留全长或片段的所期望的活性或功能性质（例如酶活、配体结合、信号转导、抗原性等）。术语还包括位于临近5'和3'末端上的编码区的序列，其有助于基因转录成全长mRNA。术语“基因”包含基因的cDNA和染色体形式。基因的染色体形式或克隆可以包含被所定义的非编码序列（例如内含子）打断的编码区域。
当用于指将核酸加入菌株时，术语“导入”或“被导入”意思是在菌株内核酸可以整合到菌株的染色体或包含在载体上，例如质粒。
本说明书所使用的术语“开放阅读框”或“ORF”指不含终止子的遗传序列。
术语“肽”、“多肽”或“蛋白”在本说明书中可以互换使用，意思是无论天然还是重组的肽、多肽和蛋白，及其片段、衍生物、同源物、变体和融合蛋白等。
II组敲除菌株的生长在摇瓶中和高密度发酵罐中评价，并与其母本菌株比较。实验显示在每种菌株背景下，II组基因敲除不影响细胞生长。将含有多个肽的表达载体转化到II组缺失的菌株中用于在高密度发酵罐中进行表达测试。
在一个实施方式中，在本发明E. coli B菌株中生产的肽可以选自但不限于：hGH、胰高血糖素样肽、白细胞介素、胰岛素类似物、野生型脂联素、FGF-21、胰蛋白酶、抑肽酶、胰淀素和瘦蛋白及其类似物。酶类例如唾液酸酶、转谷氨酰胺酶（tGase）、HRV（人类鼻病毒）3C蛋白酶、烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶及其变体，以及任何其他肽或其表达系统可以在E. coli中操作的肽。
本发明还涉及制备如上所述人类的肽的方法。通常，将克隆的野生型肽的核酸序列修饰成编码所期望的蛋白。然后将该修饰的序列插入表达载体，之后转化或转染到宿主细胞中。可操作的表达系统一般包括Studier和Moffat [J.Mol.Biol. (1986) 189:113-130]以及 Studier等人[Methods in Enzymology (1990) 185:60-89]描述的常规的基因表达成分。
宿主细胞中要生产的肽可以作为融合肽合成，分泌到培养基中或进入周质空间，以游离形式产生在细胞质内，或累积在细胞内小体内，例如包涵体。肽的纯化类似地包括使用上述常规的、公开可获得的方法，其再次通过常规技术改造后用于感兴趣的肽。
本发明适合生产任何类型的肽。
在一个实施方式中，选择在II组敲除的E. coli B BL21宿主细胞中生产的肽为人生长激素（hGH），以及在一个实施方式中，人生长激素（hGH）如EP217814中描述从前体肽生产，EP217814描述了如何从hGH前体制备hGH。
在进一步的实施方式中，生长激素为MEAE(SEQ ID 16)-hGH(L101C)，其为hGH类似物的前体，其中hGH分子中第101位亮氨酸被半胱氨酸替换。
在另一个实施方式中，胰高血糖素样肽为 GLP-1、GLP-1和/或其衍生物。
本说明书所使用的术语“胰高血糖素样肽”意思是胰高血糖素家族的肽、各种胰高血糖素样肽的抑制剂（exendin）及其类似物。胰高血糖素家族的肽由前胰高血糖素基因编码并包含三个高度同源的小肽，即胰高血糖素（1-29）、GLP-1（1-37）和GLP-2（1-33）。Exendin是在蜥蜴中表达的肽，类似于GLP-1是促胰岛素的。Exendin的实例为exendin-3和exendin-4。
本说明书所使用的术语“胰高血糖素样肽类似物”指修饰的胰高血糖素样肽，其中胰高血糖素样肽的一个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基替换，和/或其中一个或多个氨基酸残基从胰高血糖素样肽中缺失，和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加到胰高血糖素样肽。这种氨基酸残基的增加或缺失可以在肽的任何位置发生。
实验部分
对于菌株的甘油原种（stock）的制备，将单克隆转移到含有2ml具有适当抗生素的LB培养基的12ml测试管中，在37℃下生长，并以220rpm振荡2小时。
对于发酵接种物的制备，来自于甘油原种的细胞在加入和不加入氨苄青霉素的LB平板上划线。过夜的细胞用LB培养基洗涤并接种到含100ml每种发酵复合培养基具有适当的抗生素浓度的500ml摇瓶中，并在37℃下生长，并以220rpm振荡3-4小时。然后将细胞接种到反应器中，至浓度大约0.5 OD600。
在5l生物反应器内在有氧条件下进行发酵，发酵复合培养基初始体积为2.5l，并含有适当的抗生素。在零时间点，向反应器内接种至OD600大约0.5。用5N NH3和H2SO4保持pH在7.0，并在发酵期间，以6ml/min的恒定空气流速使空气通过培养物。温度保持37℃。通过保持溶氧水平直至饱和 O2的20%对搅拌进行级联控制。
进行分批补料试验来比较II组缺失菌株与其母本菌株在高密度发酵罐内的生长和肽表达情况。发酵罐加入添加27g/l甘油的复合培养基。在零时间点，向发酵罐内接种至0.5的OD600。当基础甘油被消耗时，在补料步骤（increasing steps）中连续加入甘油和酵母提取物，通过溶氧增加指示甘油的消耗。从发酵罐中收集用于测定OD600和蛋白表达的样品并用分光光度计和SDS-PAGE进行分析。
在细菌中诱导蛋白表达是公知的现有技术。在本发明中，蛋白表达的诱导通过加入异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG）来进行。
在本发明的某些实施方式中使用的质粒和菌株分别列举在表1和2中。使用Sambrook等人[A Laboratory Manual (1989) CSH]描述的标准分子生物学技术进行质粒的构建。
表1 实施例中使用的质粒
表2 实施例中使用的菌株
表3 用于实现本发明的引物列表
实施例
实施例1：替换盒的构建。
使用E. coli B BL21(DE3)菌株作为PCR扩增的DNA来源。针对含有SacII/EcoRI克隆位点的KpsM5'末端上游1001bp区域，合成寡核苷酸引物（LA_BL_GII_F/LA_BL_GII_R）。从基因组DNA中扩增此区域作为左臂（LA）。对于右臂（RA），针对含有BamHI/SacI克隆位点的KpsF基因5'末端上游1108bp区域，合成寡核苷酸引物（RA1_BL_GII_F/RA1_BL_GII_R）（表3）。产生左臂和右臂的PCR产物。在热循环仪中进行DNA扩增反应，使用的程序包括如下参数：94℃ 50s 变性，57℃ 60s 退火，72℃ 60s 引物延伸，总共进行30个循环。通过在1%的琼脂凝胶上进行凝胶电泳观察具有正确条带大小的PCR扩增产物，从胶中提取50μl扩增产物并用于构建替换片段。表3显示了寡核苷酸序列的列表。
凝胶纯化扩增的左臂并连接到质粒pEZ-T中，得到质粒pEZ-T-LA。用限制性酶EcoRI/BamHI消化FRT-cat-FRT片段，后者被连接到pEZ-T-LA的EcoRI/BamHI位点中，得到质粒pEZ-T-LA-FRT-cat-FRT。扩增的右臂连接到质粒pGEM-T中，并用BamHI/SacI消化。将携带氨苄青霉素抗性基因的BamHI/SacI消化的DNA片段连接到质粒pEZ-T-LA-FRT-cat-FRT中。氯霉素抗性基因提供了鉴定替换片段的选择性标记。得到的质粒pEZ-T-LA-FRT-cat-FRT-RA用于产生敲除的BL21(DE3)菌株。
实施例2：敲除的BL21(DE3)菌株的生产。
E. coli BL21(DE3)在LB培养基中在37℃下生长过夜，通过标准方法制备热激的BL21(DE3)感受态细胞。将pKD46质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，使转化的细胞在添加100μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤中在30℃下生长到0.4 OD600nm。使用L-阿拉伯糖（终浓度1mmol/l）诱导Red重组酶的表达进行一个小时。
对于II组基因簇的敲除，通过电转化将扩增于pEZ-T-LA-FRT-cat-FRT-RA的500ng替换片段转移至BL21(DE3)感受态细胞。使用标准方法制备电转化感受态细胞。在30℃下进行细胞复苏1.5小时。细胞涂布到添加8μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上。在30℃孵育过夜后形成BL21(DE3)ΔkpsM-kpsF)::cat的氯霉素抗性克隆。
为了保证在染色体的正确位置完全敲除II组基因簇，设计与II组基因簇左臂和右臂外侧同源的寡核苷酸。由于缺少18kb以外的E.coli B BL21(DE3)侧翼序列，使用公开的E.coli 536序列（登录号CP000247.1）设计PCR筛选引物，基于附近侧翼区域的高度同源性假定两基因组中II组基因簇的类似位置。检验了三个氯霉素抗性菌落的基因替换。
通过在LB+Cm(25μg/ml)中生长至少两代来对氯霉素抗性克隆进行表型检验。所有的氯霉素抗性克隆在LB+Cm（25μg/ml）培养基中均可以生长良好。在同样的过程中补入D-丙氨酸，对氯霉素抗性D-丙氨酸营养缺陷型菌株也进行了检验。
1686bp和1578bp的条带验证了替换成功。
寡核苷酸引物（LA_SEQ_F1/Cat_ID_R）用于扩增含有左臂和部分cat基因的条带（大小1686bp），寡核苷酸引物（RA_SEQ_R1/Cat_SEQ_F）用于扩增含有右臂和部分cat基因的条带（大小1578bp）。对于三个氯霉素抗性克隆，条带的正确大小表示16kb的II组基因簇已被cat基因替换（图3）。产生了3000bp条带的阴性对照，其含有右臂，包括kpsF和kpsE的一部分，仅应当在对照菌株（替换前）而不是在氯霉素抗性菌株中出现。寡核苷酸引物（RA6_BL_GII_F/RA6_BL_GII_R）（表3）用于扩增kpsF和kpsE。PCR结果显示仅对照菌株而不是氯霉素抗性菌株具有此条带。
对D-丙氨酸营养缺陷型菌株BL21(DE3)ΔdadxΔalr也应用同样的消除过程，该菌株在LB培养基中生长过程中需要添加D-丙氨酸。
通过表型和PCR筛选验证了氯霉素抗性菌株E. coli B BL21(DE3)Δ(kpsM-kpsF)::cat和BL21(DE3)ΔdadXΔalrΔ(kpsM-kpsF)::cat，证实II组基因簇已被cat基因替换。
实施例3：药物抗性标记的消除和II组敲除菌株的表征。
E.coli BL21(DE3)Δ(kpsM-kpsF)::cat和BL21(DE3)ΔdadXΔalr(kpsM-kpsF)::cat细胞的冷冻原种在加入25μg/ml氯霉素或25μg/ml 氯霉素的LB培养基中在37℃下生长过夜，对于二代菌株还加入100mM D-丙氨酸。通过标准方法制备两种敲除菌株的电转化感受态细胞。将质粒pCP20 (CmR, AmpR)转化至两种敲除感受态菌株。通过使转化的细胞在SOC肉汤中在30℃下温和振荡生长1小时来消除药物抗性标记。在30℃下培养过夜后选择平板上的氨苄青霉素抗性候选克隆的单克隆。候选克隆在仅为LB培养基或在添加D-丙氨酸的LB培养基中在37℃下生长3个小时，以消除质粒pCP20。进一步用PCR筛选鉴定在仅为LB培养基或在添加D-丙氨酸的LB培养基上出现的5个单克隆。
通过使单克隆在LB、LB+Cm（8μg/ml）和LB+Amp中生长对cat消除菌株进行表型检验。所有的cat消除克隆都能在仅为LB培养基上生长。对于cat消除的D-丙氨酸营养缺陷型菌株，所有5个克隆仅能在添加D-丙氨酸的LB培养基内生长。因此，cat基因已被消除。
成功消除cat基因应通过2381bp的条带来确认。寡核苷酸引物（LA_SEQ_F2/RA_SEQ_R1）用于扩增含有左臂和右臂的条带。对于所有的单克隆，出现2381bp条带表明cat基因已被消除。
通过其表型和PCR筛选来验证敲除菌株E. coli B BL21(DE3)Δ(kpsM-kpsF)和B BL21(DE3)ΔdadXΔalrΔ(kpsM-kpsF)。制备两菌株的甘油原种用于保存。
实施例4：敲除宿主菌株在摇瓶中的生长。
来自于冷冻原种的E. coli B BL21(DE3)和B BL21(DE3)Δ(kpsM-kpsF)细胞在LB平板上在37℃下生长过夜。将从过夜平板上洗下的适当量的细胞接种到含25ml LB培养基的250ml带有挡板的摇瓶中，至浓度大约0.05OD600。细胞在37℃下以220rpm振荡生长8小时。每半小时取每种菌株的样本来比较细胞在OD600的生长。
对添加D-丙氨酸的E. coli B BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr和B BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr Δ(kpsM-kpsF)应用同样的工作流程来比较摇瓶中的生长。
图4中的结果显示，使用LB培养基，在摇瓶中BL21∆ (kpsM-kpsF)随时间的生长与其母本菌株BL21(DE3)的生长相同。比较BL21(DE3) ∆ dadX ∆ alr ∆(kpsM-kpsF)和BL21(DE3) ∆ dadX ∆ alr也可以得到同样的结论。
实施例5：宿主菌株BL21(DE3)和BL21(DE3) Δ(kpsM-kpsF)在高密度发酵时生长和MEAE-hGH表达的比较。
来自冷冻原种的E. coli B BL21(DE3)Δ(kpsM-kpsF)细胞在LB平板上生长。使用标准方法制备敲除菌株的热激感受态细胞。将含有hGH表达盒的质粒pNNC1-g (pET11d-MEAE-hGH(AmpR))转化到B BL21(DE3)Δ(kpsM-kpsF)感受态细胞中，制备转化的细胞的甘油原种。
如上文所述在在有氧条件下进行高密度发酵。
图5显示在复合培养基中，在高密度发酵罐中BL21∆ (kpsM-kpsF)随时间的生长与其母本菌株BL21(DE3)的生长相同。比较BL21(DE3)∆ (kpsM-kpsF)/pNNC1-g和BL21(DE3)/pNNC1-g可以得到同样的结论。在未诱导的状态下，细胞密度达到大约140 OD600。当细胞生长达到80 OD600时，加入IPTG到浓度为1mM，进行hGH表达。在30℃下IPTG诱导10小时后，细胞密度达到大约100 OD600。
如SDS-PAGE所见，E. coli B BL21(DE3)/pNNC1-g和B BL21(DE3)Δ(kpsM-kpsF)/pNNC1-g有效生产hGH。SDS-PAGE凝胶上显示了增加诱导时间从1到10小时，hGH表达随之增加（图6）。两种菌株生产hGH的能力相同，即，宿主菌B BL21(DE3)∆(kpsM-kpsF)与含有II组基因簇的B BL21(DE3)相比，没有观察到显著的差别。
实施例6：宿主菌株BL21(DE3)∆ alr ∆ dadX和BL21(DE3)∆ alr ∆ dadX ∆ (kpsM-kpsF)在高密度发酵时生长和MEAE-hGH表达的比较。
来自冷冻原种的E. coli B BL21(DE3) ΔdadXΔalr∆(kpsM-kpsF)细胞在添加D-丙氨酸的LB培养基中生长。通过标准方法制备敲除菌株的电转化感受态细胞。使用AatII/PsiI消化含有D-丙氨酸互补基因的质粒 pNNC1-1h (pET11d-MEAE-hGH和alrP-alrCD (AmpR)) ，然后对质粒进行平端化和自连接，得到bla-质粒，用于在质粒上选择alr基因。将质粒pNNC1-1h (pET11d-MEAE-hGH, alrP-alrCD, bla-)转化到BL21(DE3)ΔdadXΔalr∆(kpsM-kpsF)感受态细胞中。分离在未添加D-丙氨酸的LB平板上出现的克隆用于制备甘油原种。
按照实施例5中的描述进行高密度发酵。
图7显示在FCM1培养基中，在高密度发酵罐中E. coli B BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr ∆ (kpsM-kpsF) /pNNC1-1h随时间的生长与其母本菌株BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr /pNNC1-1h相同。比较B BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr/pNNC1-1h和BL21(DE3)∆ dadX ∆ alr ∆ (kpsM-kpsF)/pNNC1-1h在诱导hGH下可以得到同样的结论。在不诱导的状态下，细胞密度达到大约120 OD600。当细胞生长达到80 OD600时，加入IPTG到浓度为1mM，进行hGH表达。在30℃下IPTG诱导9小时后，细胞密度达到大约100 OD600。
如通过SDS-PAGE结果可见，E.coli B BL21(DE3)ΔdadXΔalr /pNNC1-1h和B BL21(DE3)ΔdadXΔalrΔ(kpsM-kpsF) /pNNC1-1h有效生产hGH（图8）。hGH的表达水平随诱导时间的增加而增加。两菌株生产hGH的能力相同。
实施例7：使用宿主菌株E. coli B BL21(DE3)∆alr∆dadX∆(kpsM-kpsF)在高密度发酵中的细胞生长和MEAE-hGH表达的评价。
来自冷冻原种的E. coli B BL21(DE3) ΔdadXΔalr∆(kpsM-kpsF)细胞在添加D-丙氨酸的LB培养基中生长。通过标准方法制备此三敲除菌株用于使用热激方法转化的感受态细胞。
为了缺失编码氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，使用AatII/PsiI消化编码MEAE-hGH(L101C)并且含有alrP-alrCD用于补充宿主细胞D-丙氨酸缺陷的质粒pNNC1a.23 (pET11d-MEAE-hGH(L101C)，然后进行平端化和自连接以除去β-内酰胺酶基因。将得到的质粒pNNC1a.23 (pET11d-MEAE-hGH, alr, bla- )用热激法转化到宿主细胞BL21(DE3)ΔdadXΔalr∆(kpsM-kpsF)中。选择从未添加D-丙氨酸的LB平板生长的单克隆以制备甘油原种用于在-80℃保存。
按照实施例5中所述进行两批高细胞密度发酵。在发酵过程中监测细胞生长，结果显示在图9中。
在高细胞密度发酵中评价含有质粒pNNC1a.23的菌株E.coli B BL21(DE3)ΔdadXΔalrΔ(kpsM-kpsF)中的MEAE-hGH(L101C)表达。结果显示收获时的细胞密度可以达到在OD600nm测量为约100，并且8小时的诱导后，目标蛋白MEAE-hGH(L101C)的表达水平达到约7g/l，如图10所示。
实施例8：E. coli BL21(DE3)∆(kpsM-kpsF)中产脲节杆菌唾液酸酶的表达。
在大肠埃希氏菌BL21(DE3)Δ(kpsM-kpsF)菌株中生产带有C-末端His-标签的产脲节杆菌唾液酸酶（AUS, 理论分子量53.4 kDa）。将C-末端带有His6-标签的产脲节杆菌唾液酸酶基因克隆到表达载体pET-24a (Novagen)中，在T7启动子的控制下。为了生产来自于产脲节杆菌的唾液酸酶，生成了编码下列蛋白序列的合成的密码子优化的基因（SEQ ID 12）：
MAPTPPNSPTLPPGSFSETNLAADRTAANFFYRIPALTYLGNDVVLAAWDGRPGSAADAPNPNSIVQRRSTDGGKTWGPVQVIAAGHVADASGPRYGYSDPSYIYDAEANKVFAFFVYSKDQGFGGSQFGNDDADRNVISSAVIESSDAGVTWSQPRLITSVTKPGTSKTNPAAGDVRSNFASSGEGIQLKYGPHKGRLIQQYAGDVRQADGSNKIQAYSVYSDDHGVTWHKGANVGDRMDENKTVELSDGRVLLNSRDNANRGYRKVAVSTDGGATYGPVSQDTELPDPANNGAIARMFPNAAQGSADAKKLIFTNANSKTGRENVSARVSCDDGETWPGVRTIRSGFSAYSTVTRLADGKFGVLYEGNYTDNMPFATFDDAWLNYVCAPLAVPAVNIAPSATQEVPVTVTNQEATTLSGATATVYTPSGWSATTVPVPDVAPGASVTVTVALTAPADASGPRSLNAAFTTADGRVSQFTFTATTPVAPQVGLTITGSALEHHHHHH。
将合成的基因作为XbaI-XhoI片段导入pET-24a表达载体，产生AUS表达载体pLLC028。将得到的载体转化到BL21(DE3)Δ(kpsM-kpsF)感受态中，并将转化子在-80℃下保存在甘油中。
使用一个冻存管的冷冻的初始细胞克隆（ICC）来接种两个酵母提取物培养基（酵母提取物5g/l、葡萄糖10g/l、琼脂20g/l）琼脂瓶。琼脂培养基含有卡那霉素用于选择。在30℃下孵育25小时。孵育后，用无菌的0.9%的氯化钠溶液将细胞从琼脂表面洗下。用来自于两个琼脂摇瓶的预培养物接种10 l发酵。所获得的接种物体积为75 m，OD600为4.3，在发酵罐中得到的起始OD600值为约0.03。在20 l不锈钢容器中进行发酵，起始工作体积为10 l。发酵从在复合培养基上的8小时长的分批培养阶段开始，所述复合培养基含有40g/l酵母提取物、15g/l甘油（87%）、盐和微量金属，然后在预定的情况提供甘油。在最初17小时中，发酵温度为37℃。此后，温度降为30℃。在已经过的发酵时间的18小时处，加入0.1mM的诱导剂IPTG来诱导蛋白表达。诱导时间可以直至22小时。回收过程包括离心、高压匀浆和使用0.2 μm孔径的Sartocon Slice Cassettes进行横流微滤。
AUS发酵分析使用SDS-PAGE和酶活测定进行。SDS-PAGE分析表明表达的唾液酸酶在小珠研磨后的可溶性和沉淀组分中均存在。图11显示了在30℃诱导温度和0.1mM IPTG下运行的10L批次的典型的发酵结果。
实施例9：人成纤维细胞生长因子21（FGF21）在BL21 DE3和BL21 DE3∆ (kpsM-kpsF)中的表达
人FGF21的DNA和氨基酸序列由例如Nishimura等人在Biochim. Biophys. Acta 1492(1):203-206 (2000)公开。序列还可以从公共数据库中获得（登录号分别为EMBL:AB021975和UNIPROT:Q9NSA1）。
合成具有用于分泌的28个氨基酸的信号肽（下文斜体）的天然多肽，而成熟的FGF21多肽含有剩下的181个氨基酸（SEQ ID 13）：
MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACQAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPA-LPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPS QGRSPSYAS。
成熟的FGF21多肽被克隆并在E. coli中表达为细胞内蛋白，不带有信号肽，但是带有增加的N-末端甲硫氨酸。特别是，将550bp的编码区插入表达载体pET11c（Novagen公司）在T7噬菌体启动子的控制下的Nde1-BamH1位点处，然后转化到E.coli B BL21(DE3)和E.coli B BL21 DE3∆ (kpsM-kpsF)中，该编码区包含在3’-末端的Met密码子ATG，以及在3’-和5’-末端分别具有Ned1和BamH1限制性位点。细胞在LB amp 100 ug/ml 的条件下生长到OD450 0.5，在37℃用0.3mM IPTG诱导4小时。通过超声制备细胞粗提液用于FGF21表达分析。
图12中考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶显示FGF21在E.coli B BL21 DE3和E.coli B BL21 DE3∆ (kpsM-kpsF)中相等的成功表达。虽然由此表达的FGF21（Met-FGF21）经计算的分子量(MW)为19.5kD，但是其在凝胶上的迁移为25kD蛋白，这可能是由于脯氨酸含量较高，阻碍了蛋白的运动。
目前的实施例显示FGF21的产量未被宿主菌株的遗传操作所影响。
实施例10：人胰淀素在BL21 DE3和BL21 DE3∆ (kpsM-kpsF)中的表达。
Cooper等人Proc. Natl. Acad. Sci. (84) : 8628-8632, (1987)公开了37个氨基酸的淀粉样肽胰淀素的序列。克隆了基因并将其N-末端地融合到海栖热袍菌（Thermotoga maritima）的核糖体蛋白RL23上。146个氨基酸的融合蛋白的具有下列序列（SEQ ID 14）：
KQEKLSLHDVLIRPIITEKALILREQRKYVFEVNPLANKNLVKEAVEKLFNVKVEKVNILNMKPKPKRRGIFEGKTRSWKKAVVTLKEGYTIKELEGEHSSSSDDDDKKCNTATCATQRLA-NFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY。
如实施例9中所述，将融合基因作为被Nde1- BamH1消化的450bp的片段克隆到pET11c载体中，其在T7启动子的控制下，并将质粒转化到BL21 DE3和BL21 DE3∆ (kpsM-kpsF)中。
如实施例9中所述进行表达，结果显示在图12中，再次证明在两种E. coli B宿主菌株BL21 DE3和BL21 DE3∆ (kpsM-kpsF)中具有相等的高产量表达。
实施例11：人瘦蛋白在BL21 DE3和BL21 DE3∆ (kpsM-kpsF)中的表达。
Masuzaki 等人在Diabetes (44): 855-858 (1995)发表了146个氨基酸长的人瘦蛋白序列。该蛋白在人体中分泌，带有21个氨基酸的信号肽。在E. coli中胞内表达的成熟的瘦蛋白具有下列序列（SEQ ID 15）：
mvpiqkvqddtktliktivtrindishtqsvsskqkvtgldfipglhpiltlskmdqtlavyqqiltsmpsrnviqisndlenlrdllhvlafskschlpwasgletldslggvleasgystevvalsrlqgslqdmlwqldlspgc。
如实施例9中所述，将瘦蛋白基因作为被Nde1- BamH1消化的450bp的片段克隆到pET11c载体中，其在T7启动子的控制下，并将质粒转化BL21 DE3和BL21 DE3∆ (kpsM-kpsF)中。
如实施例9中所述进行表达，结果显示在图12中，再次表明在两种E. coli B宿主菌株BL21 DE3和BL21 DE3∆ (kpsM-kpsF)中具有相等的高表达产量。
结论是在任何生长条件下，II组荚膜基因簇的消除都不会影响细胞生长。还可以得出结论：II组荚膜基因簇的消除不会影响蛋白表达。因此，使用E. coli B BL21(DE3)作为商业化的宿主菌，产生了一种完全去除II组荚膜基因簇的更加安全的菌株，用于治疗性蛋白的生产。在E. coli B BL21(DE3)中缺失II组荚膜基因的操作使其达到与E. coli K12相同的安全类别，因为II组基因簇是两菌株间仅有的显著性差异。
序列表
<110> Novo Nordisk A/S
<120> 缺乏功能性II组荚膜基因簇的大肠埃希氏菌BL21菌株
<130> 7849
<160> 16
<170> PatentIn 版本 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 1
tccttaccgc gggtcaaacc cgcttaccgg gc 32
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 2
ctaccggaat tcttgatgat gtgatcctaa tctc 34
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 3
ttcggatcca tcagctcctt tgcacggaa 29
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 4
gaacgagctc acactcccga atcatcaata 30
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 5
gcaccactaa ttcttaagaa cccgcccaca ag 32
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 6
actggaattt ggacgggggt aggtattgcc 30
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 7
aattcttaag aacccgccca caaggcgg 28
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 8
cgacgatttc cggcagtttc tac 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 9
gccaggtttt caccgtaaca cgcc 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 10
cctgtggatc cagaacgttg ttg 23
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 11
gaacgagctc atgttgataa aagtgaagtc 30
<210> 12
<211> 508
<212> PRT
<213> 产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)
<400> 12
Met Ala Pro Thr Pro Pro Asn Ser Pro Thr Leu Pro Pro Gly Ser Phe
1 5 10 15
Ser Glu Thr Asn Leu Ala Ala Asp Arg Thr Ala Ala Asn Phe Phe Tyr
20 25 30
Arg Ile Pro Ala Leu Thr Tyr Leu Gly Asn Asp Val Val Leu Ala Ala
35 40 45
Trp Asp Gly Arg Pro Gly Ser Ala Ala Asp Ala Pro Asn Pro Asn Ser
50 55 60
Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Gly Pro Val
65 70 75 80
Gln Val Ile Ala Ala Gly His Val Ala Asp Ala Ser Gly Pro Arg Tyr
85 90 95
Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Ile Tyr Asp Ala Glu Ala Asn Lys Val
100 105 110
Phe Ala Phe Phe Val Tyr Ser Lys Asp Gln Gly Phe Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Phe Gly Asn Asp Asp Ala Asp Arg Asn Val Ile Ser Ser Ala Val Ile
130 135 140
Glu Ser Ser Asp Ala Gly Val Thr Trp Ser Gln Pro Arg Leu Ile Thr
145 150 155 160
Ser Val Thr Lys Pro Gly Thr Ser Lys Thr Asn Pro Ala Ala Gly Asp
165 170 175
Val Arg Ser Asn Phe Ala Ser Ser Gly Glu Gly Ile Gln Leu Lys Tyr
180 185 190
Gly Pro His Lys Gly Arg Leu Ile Gln Gln Tyr Ala Gly Asp Val Arg
195 200 205
Gln Ala Asp Gly Ser Asn Lys Ile Gln Ala Tyr Ser Val Tyr Ser Asp
210 215 220
Asp His Gly Val Thr Trp His Lys Gly Ala Asn Val Gly Asp Arg Met
225 230 235 240
Asp Glu Asn Lys Thr Val Glu Leu Ser Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn
245 250 255
Ser Arg Asp Asn Ala Asn Arg Gly Tyr Arg Lys Val Ala Val Ser Thr
260 265 270
Asp Gly Gly Ala Thr Tyr Gly Pro Val Ser Gln Asp Thr Glu Leu Pro
275 280 285
Asp Pro Ala Asn Asn Gly Ala Ile Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Ala
290 295 300
Gln Gly Ser Ala Asp Ala Lys Lys Leu Ile Phe Thr Asn Ala Asn Ser
305 310 315 320
Lys Thr Gly Arg Glu Asn Val Ser Ala Arg Val Ser Cys Asp Asp Gly
325 330 335
Glu Thr Trp Pro Gly Val Arg Thr Ile Arg Ser Gly Phe Ser Ala Tyr
340 345 350
Ser Thr Val Thr Arg Leu Ala Asp Gly Lys Phe Gly Val Leu Tyr Glu
355 360 365
Gly Asn Tyr Thr Asp Asn Met Pro Phe Ala Thr Phe Asp Asp Ala Trp
370 375 380
Leu Asn Tyr Val Cys Ala Pro Leu Ala Val Pro Ala Val Asn Ile Ala
385 390 395 400
Pro Ser Ala Thr Gln Glu Val Pro Val Thr Val Thr Asn Gln Glu Ala
405 410 415
Thr Thr Leu Ser Gly Ala Thr Ala Thr Val Tyr Thr Pro Ser Gly Trp
420 425 430
Ser Ala Thr Thr Val Pro Val Pro Asp Val Ala Pro Gly Ala Ser Val
435 440 445
Thr Val Thr Val Ala Leu Thr Ala Pro Ala Asp Ala Ser Gly Pro Arg
450 455 460
Ser Leu Asn Ala Ala Phe Thr Thr Ala Asp Gly Arg Val Ser Gln Phe
465 470 475 480
Thr Phe Thr Ala Thr Thr Pro Val Ala Pro Gln Val Gly Leu Thr Ile
485 490 495
Thr Gly Ser Ala Leu Glu His His His His His His
500 505
<210> 13
<211> 209
<212> PRT
<213> 人类
<400> 13
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro
20 25 30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr
35 40 45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg
50 55 60
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
65 70 75 80
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val
85 90 95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
100 105 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
130 135 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
145 150 155 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
165 170 175
Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
180 185 190
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
195 200 205
Ser
<210> 14
<211> 146
<212> PRT
<213> 海栖热袍菌(Thermotoga maritima)
<220>
<221> 多肽
<222> (110)..(146)
<213> 人类
<400> 14
Met Lys Gln Glu Lys Leu Ser Leu His Asp Val Leu Ile Arg Pro Ile
1 5 10 15
Ile Thr Glu Lys Ala Leu Ile Leu Arg Glu Gln Arg Lys Tyr Val Phe
20 25 30
Glu Val Asn Pro Leu Ala Asn Lys Asn Leu Val Lys Glu Ala Val Glu
35 40 45
Lys Leu Phe Asn Val Lys Val Glu Lys Val Asn Ile Leu Asn Met Lys
50 55 60
Pro Lys Pro Lys Arg Arg Gly Ile Phe Glu Gly Lys Thr Arg Ser Trp
65 70 75 80
Lys Lys Ala Val Val Thr Leu Lys Glu Gly Tyr Thr Ile Lys Glu Leu
85 90 95
Glu Gly Glu His Ser Ser Ser Ser Asp Asp Asp Asp Lys Lys Cys Asn
100 105 110
Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val His Ser
115 120 125
Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val Gly Ser Asn
130 135 140
Thr Tyr
145
<210> 15
<211> 147
<212> PRT
<213> 人类
<400> 15
Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys
1 5 10 15
Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser
20 25 30
Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro
35 40 45
Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln
50 55 60
Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp
65 70 75 80
Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser
85 90 95
Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly
100 105 110
Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser
115 120 125
Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser
130 135 140
Pro Gly Cys
145
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端延伸
<400> 16
Met Glu Ala Glu
1

Claims (12)

1.一种大肠埃希氏菌（E. coli ）B BL21菌株，其特征在于具有II组荚膜基因簇的全部缺失，并且包含具有插入的编码肽的DNA序列的表达载体。
2.根据权利要求1的大肠埃希氏菌B BL21菌株，其中所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌B BL21（DE3）。
3.根据权利要求2的大肠埃希氏菌B BL21菌株，其中所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌B BL21（DE3）∆ dadX ∆ alr。
4.根据任一前述权利要求的大肠埃希氏菌B BL21菌株，其中所述肽选自hGH、胰高血糖素样肽、白细胞介素、胰岛素、野生型脂联素、FGF-21、胰淀素、瘦蛋白以及酶类。
5.根据权利要求4的大肠埃希氏菌B BL21菌株，其中所述酶类选自胰蛋白酶、抑肽酶、唾液酸酶、转谷氨酰胺酶、人类鼻病毒3C蛋白酶和烟草蚀纹病毒蛋白酶。
6.一种生产肽的方法，其包括在适当的培养基中培养根据权利要求1-5任一项的大肠埃希氏菌B BL21菌株，然后通过公知技术分离并纯化表达的肽。
7.根据权利要求6的方法，其中所述肽为hGH肽。
8.根据权利要求6的方法，其中所述肽为FGF-21肽。
9.根据权利要求6的方法，其中所述肽为胰淀素肽。
10.根据权利要求6的方法，其中所述肽为胰高血糖素样肽。
11.根据权利要求6的方法，其中所述肽为白细胞介素肽。
12.根据权利要求6的方法，其中所述肽为胰岛素。
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