CN102985530A - 涉及减毒支原体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鉴定或产生减毒支原体细菌的方法，所述细菌具有至少一种所列出的基因中的突变，以及所述细菌在用于诱导对支原体的防护性免疫的疫苗中的应用或检测被所述细菌感染中的应用。

Description

涉及减毒支原体的方法
技术领域
本发明涉及减毒猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）的应用，例如，诊断样品中减毒支原体的存在的方法以及筛选减毒支原体的方法。
背景技术
猪肺炎支原体为猪支原体肺炎的病源因素（也称为地方性肺炎（EP））。它是影响全世界猪生产的最常见的和具有经济显著性的呼吸道疾病之一。这种疾病通常会伴随着继发性感染，高发病率，低死亡率以及低饲料转化率，这种疾病所造成的全球经济损失估计为约每年十亿美元。
在EP中，猪肺炎支原体细菌粘附到猪肺部上皮细胞的纤毛上，损害健康的正常纤毛，同时造成机会性生物进入呼吸道组织中从而引起疾病。一旦定植，猪肺炎支原体将引起猪的肺部病变。
这种疾病是高度传染性的，并且通常通过直接接触感染的呼吸道分泌物传播，例如打喷嚏或咳嗽时从鼻孔或嘴中喷出的液滴。
目前存在几种抵抗猪肺炎支原体的疫苗。其中大多数疫苗由约十个公司的22个被注册为单价或二价/多价的疫苗商标所提供。所有的疫苗都是灭活或者失活的猪肺炎支原体制剂。
全细胞灭活的猪肺炎支原体疫苗的例子包括RESPISURETM和STELLAMUNETM（辉瑞）、SUVAXYN M.HYOTM（富道）、HYORESPTM（梅里亚）、M+PACTM（先灵葆雅）和PORCILISTM（英特威）。
尽管一些疫苗可减轻EP的严重程度，但没有任何一种可用的全细胞灭活或失活的疫苗能够完全免除猪肺炎支原体的感染。
作为WO2010/132932公开的相关申请（co-pending application），描述了一种温度敏感的活的减毒猪肺炎支原体菌株。在2004年5月13日将该菌株表示为ts-19，并作为NM 04/41259保藏在布达佩斯条约国家计量研究院。当将该菌株作为疫苗时，能够赋予接种疫苗的猪对猪肺炎支原体的防护性免疫。
发明内容
第一方面，提供了一种鉴定减毒支原体细菌的方法，该方法包括：分析支原体细菌，以确定在至少一种编码表1列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中突变的存在；其中，突变的存在表明所述支原体是减毒的。
减毒疫苗通常具有很多优越性，因为他们携带天然形式的与致病因子（infectious agent）有关的所有免疫原决定簇（immunogenic determinants），并将其带入宿主的免疫系统中，并且由于所述因子能够在接种疫苗的宿主中增殖，因此，需要的免疫因子的量相对少。减毒的方法包括：将毒性菌株多次传代或暴露于放射线或化学药品。据推测，这些方法在基因组中引入了突变，致使微生物毒性降低但仍能复制。
这些方法的缺点在于，引入了在分子水平上无法表征的随机突变。同样，筛选减毒的方法，如有关温度敏感性的筛选，常常是耗时的，会产生错误的结果，因为温度敏感的菌株可能不是减毒的，并且减毒菌株不需要是温度敏感的，以及需要大量的试验和错误。另外，减毒菌株也可能进行进一步的突变并恢复为毒性菌株（virulence）。一种替代策略为产生不可逆的基因限定的减毒支原体。然而到目前为止，尚未确定支原体减毒影响的基因。与减毒支原体的亲本菌株（Parent strain）相比，本发明确定了在减毒支原体中的突变，并利用这方面的知识确定了应该突变哪些基因以提供减毒支原体。
第一方面的方法能够促进减毒支原体菌株的筛选，以及鉴定减毒菌株是否已经恢复为毒性菌株。
第二方面，提供了一种产生减毒支原体的方法，该方法包括：将支原体细菌的初始群体（initial population）置于减毒条件下，从而产生假定的减毒细菌群，并分析假定的减毒细菌群的单克隆，以确定在至少一种编码表1列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中突变的存在，其中，突变的存在表明所述支原体是减毒的。
第三方面，提供了一种由第一方面的方法筛选的或由第二方面的方法产生的减毒支原体细菌。
第四方面，提供了一种含有第三方面的减毒支原体细菌的免疫原性组合物。
第五方面，提供了一种含有第四方面的免疫原性组合物的支原体疫苗。
第六方面，提供了一种诱导对个体（subject）中的支原体引起的疾病的防护性免疫的方法，该方法包括：用安全剂量（protective amount）的第三方面的减毒支原体、第四方面的免疫原性组合物或第五方面的疫苗对个体进行给药。
可选择的方面，提供了用于诱导对支原体引起的疾病的防护性免疫的第三方面的减毒支原体、第四方面的免疫原性组合物或第五方面的疫苗。
进一步可选择的方面，提供了第三方面的减毒支原体、第四方面的免疫原性组合物或第五方面的疫苗在制备用于预防由支原体引起的疾病的药物中的应用。
本发明的发明人确定了减毒猪肺炎支原体菌株（ts-19）（保藏在国家计量研究院，保藏号（accession number）为NM04/41259）的核酸序列，以及毒性菌株（通过NTG突变（Mycoplasma hyopneumoniae isolate LKR,Lloyd&Etheridge(1981)J.Comp.Path.91:77-83）从该毒性菌株中产生减毒菌株）的序列。利用序列比对和他们在本领域中的知识分析，本发明的发明人能够确定某些他们认为和减毒有关的突变。本发明的发明人将这些突变作为猪肺炎支原体中和其它支原体中减毒的标记，并且这些突变可以用来筛选减毒支原体菌株。当利用引起随机突变的减毒条件产生减毒支原体时，这特别适用。突变的筛选提供了一种简单的确定支原体菌株是否为减毒的菌株的方法，因此适于配制成疫苗。
第七方面，提供了一种确定动物是否被减毒或毒性支原体菌株感染的方法，该方法包括：分析来自动物的含有支原体的样品，以确定在至少一种编码表1列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中突变的存在，其中，不存在突变表明所述动物被毒性支原体感染了。
第八方面，提供了一种区分接种减毒支原体菌株的动物和感染支原体的动物的方法，该方法包括：分析含有支原体的样品，以确定在至少一种编码表1列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中突变的存在；其中，样品中突变的存在表明所述样品来源的动物接种了减毒的支原体疫苗。
猪肺炎支原体是在猪中引起地方性肺炎的高度传染性和慢性的疾病。这种疾病是在世界范围内流行的。第七方面和第八方面的方法使得能够将已接种减毒菌株的猪和感染的猪或疫苗菌株已转化为毒性菌株的猪区分开。
第九方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括对一种或多种编码表1列出的蛋白的基因中的突变或者表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中的突变具有特异性的引物或探针。
第十方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括对图1中显示的至少一种突变具有特异性的引物或探针。
第九方面和第十方面的试剂盒可以用于第一、第七或第八方面的方法中。
附图说明
图1A-C显示了与作为NC 007295.1保藏的M.hto J和M.hyo LKR菌株相比，M.hyo ts-19疫苗菌株（第一代（master）和P12）中突变的确切性质和位置。
图2A-D显示了在标准图形模式中基因组靶MHP2的高分辨率溶解曲线（HRM）图。（A）
Figure BDA00002427787000051
MHP菌株、MHP的亲本菌株和M.hyo的野外分离株（field isolated strain）的HRM；（B）
Figure BDA00002427787000053
MHP菌株和
Figure BDA00002427787000054
MHP亲本菌株的HRM；（C）MHP菌株和野外分离株的HRM；（D）野生型菌株已经被标准化的差异图，以便能够观察到野生型的任何偏差。
图3A和B显示了
Figure BDA00002427787000056
MHP菌株和亲本菌株在标准图形模式中基因组靶MHP9/10的高分辨率溶解曲线（HRM）图。（B）疫苗菌株已经被标准化的差异图，以便能够观察到疫苗的任何偏差。
图4A和B显示了
Figure BDA00002427787000057
MHP菌株、亲本菌株和这两种菌株的混合在标准图形模式中基因组靶MHP9/10的高分辨率溶解曲线（HRM）图。（B）疫苗菌株已经被标准化的差异图，以便能够观察到疫苗菌株的任何偏差。
具体实施方式
猪肺炎支原体菌株“LKP”最初分离于屠宰样本（Lloyd and Etheridge1981,J of Comp Path 91:77-83）。该生物从实验性感染的猪中再分离，然后在非细胞培养基中传代约10次，得到克隆化分离物（CSIRO，Victoria）。然后将该克隆提交至南澳大利亚阿德莱德大学支原体收藏中心（University ofAdelaide Mycoplasma collection）。然后，所述LKP分离株被墨尔本大学兽医学系（支原体组）获得，在此，将该LKP分离株在改良的Friss培养液中进行3次体外传代并保存。将保藏的小瓶表示为“LKR P3 29/5/97”。该克隆代表亲本菌株。
将LKR P3 29/5/97进行体外传代，并使用之前描述的方法（Nonamuraand Imada (1982)Avian Diseases 26:763-775）进行NTG突变（200mg/ml）。从琼脂平板中筛选到了温度敏感的克隆（“ts-19”），然后在3mL改良的Friss培养液中进行培养。将该克隆的传代数记为“P0”，随后使用改良的Friss培养液进一步体外传代四次，每次传代按照1:4体积比进行稀释。将最后的传代级别记为“LKR ts-19 P4 MS”。
将LKR ts-19 P4 MS在改良的Friss培养液中进行一系列体外稀释传代，以达到3.2×10–21的稀释度。将最后的突变克隆记为“LKR ts-19 3.2×10-21”
将LKR ts-19 3.2×10-21冻干，并提交至澳大利亚政府分析实验室（布达佩斯条约中在国际上认可的用于专利程序目的的生物的保藏），保藏号为NM04/41259。
支原体具有高度减化的基因组，这反映了它们有限的生物合成能力及其依赖于宿主寄生的喜好。鉴于在它们基因组中有限的冗余，通路特定组分的NTG诱变可能对支原体细胞的生存有重大的影响。NTG诱变导致基因组内的随机突变（核苷酸转换、颠倒、缺失或插入）。这样能够得到一系列的变异基因组，其中每个变异基因组含有一个或多个突变。假定因为突变造成一个或多个至关重要的基因丧失功能从而使突变基因组中的大多数不能够存活。如果突变体不引发对生物体生长能力的有害影响，那么这些存活的变异生物体便能进行进一步的筛选（例如，温度筛选）。在ts-19的发展过程中，筛选基于变异菌株在33℃的温度下生长为高滴度株（titre）的能力和在39.5℃下生长减弱的能力。基于猪肺炎支原体疫苗菌株ts-19和亲本菌株（LKP）之间的全基因组序列的比对，确定了ts-19基因组内的一些突变（核苷酸变化）。这些突变包括核苷酸替换（转换和颠倒）、以及缺失和插入。
这些突变遍布整个基因组，并且包括一系列的表达基因以及假想蛋白和非编码序列。表1列出了通过碱基替换、缺失或插入造成突变的已知基因。已根据其主要功能对这些基因进行了分类。
表2显示了在ts-19的基因和非编码区中确定的沉默突变。表3显示了在ts-19的非编码区中确定的缺失。表4显示了在ts-19的假想基因中确定的突变。表5显示了在ts-19的假想基因中确定的缺失。
图1显示了M.hyo J菌株、M.hyo LKR菌株以及ts-19减毒菌株（第一代和12次体外传代后获得的菌株）间的具体差异的确切性质。
据假设，单独作用或共同作用而产生表型特征的单一或多重突变导致了生物体的温度敏感性和减毒。
本领域技术人员将很容易理解如何通过确定提供的参考序列（例如，YP 278901.1）和作为NM04/41259保藏的减毒菌株ts-19的序列之间是否存在差别，来确定M.hyo菌株是否含有一种表1中列出的基因的突变。
在一种实施方式中，所述减毒菌株具有表1中列出的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34种或全部突变，单独或与表2、3、4或5中列出的至少一种突变结合。
在一种实施方式中，所述减毒菌株包括一个或各个毒性因子；和/或一个或各个参与碳水化合物代谢的基因，和/或参与磷脂代谢的基因；和/或参与辅助因子代谢的基因；和/或一个或各个参与转录或翻译的基因；和/或一个或各个参与膜转运的基因；和/或一个或各个参与DNA复制、修复或代谢的基因；和/或表1中列出的转座酶基因。
在一种实施方式中，所述减毒菌株具有各个毒性因子的突变。
在P95、P69、P216、P146基因以及脂蛋白基因内发现的突变最可能对减毒具有影响，因为已经记载了这些基因与毒性有关（Ferreira and de Castroet al.,(2007).Genetic and Molecular Biology 30:p245-255）。
在另一种实施方式中，所述减毒菌株具有表2中列出的至少1、2、4、5、6、7、8、9、10种或全部突变，单独或与表1、3、4或5中列出的至少一种突变结合。
在另一种实施方式中，所述减毒菌株具有表3中列出的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44种或全部突变，单独或与表1、2、4或5中列出的至少一种突变结合。
在另一种实施方式中，所述减毒菌株具有表4中列出的至少1、2、4、5、6、7、8、9、10种或全部突变，单独或与表1、2、4或5中列出的至少一种突变结合。
在另一种实施方式中，所述减毒菌株具有表5中列出的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31种或全部突变，单独或与表1、2、3或4中列出的至少一种突变结合。
表1：猪肺炎支原体疫苗菌株ts-19基因中的减毒突变。
Figure BDA00002427787000091
Figure BDA00002427787000101
YP_数字表示NCBI参考序列
表2：猪肺炎支原体疫苗菌株ts-19中的沉默的或非编码区的减毒突变。
Figure BDA00002427787000102
表3：猪肺炎支原体疫苗菌株ts-19的非编码区的缺失突变。
Figure BDA00002427787000111
Figure BDA00002427787000121
表4：猪肺炎支原体疫苗菌株ts-19的假想基因中的突变。
突变# 基因[NCBI参考序列]
1 假想蛋白[YP_278814.1]
2 假想蛋白[YP_278896.1]
3 假想蛋白[YP_279014.1]
4 假想蛋白[YP_279117.1]
5 假想蛋白[YP_279159.1]
6** 假想蛋白[YP_279238.1]
7 假想蛋白[YP_279240.1]
8** 假想蛋白[YP_279241.1]
9 假想蛋白[YP_279257.1]
10 假想蛋白[YP_279271.1]
11 假想蛋白[YP_279283.1]
**已记载这些假想蛋白为可变抗原（Ferreira and de Castro,(2007)supra）
表5：猪肺炎支原体疫苗菌株ts-19的假想基因内的缺失。
Figure BDA00002427787000131
本发明基于温度敏感的减毒M.hyo菌株（ts-19）及其亲本菌株的核酸序列的确定。这些菌株和其它菌株的比对有利于确定减毒菌株中突变的位置和性质。
温度敏感型突变分为普通级：产生热不稳定性蛋白的支原体；以及在蛋白合成、折叠或组装中产生缺陷的支原体。对于热不稳定性蛋白，ts基因的突变可能在许可温度（对于ts-19为33℃）下较高水平地表达，在不许可温度（对于ts-19为39.5℃）下较低水平地表达。
本文中使用的术语“突变”指任何基因材料（例如，DNA、RNA、cDNA或任何过程）中可检测到的改变、机理或这种改变产生的结果。这种突变可以为点突变（即，核酸序列中的一个或多个碱基被不同的碱基所替代的突变）、插入突变（即，通过一个或多个碱基的插入，核酸分子或基因的总长度增加的突变）、缺失突变（通过一个或多个碱基的去除，核酸分子或基因的总长度减少的突变）以及倒位突变（inversion mutations）（两个或多个碱基的区域旋转180度的突变），或这些突变的组合。
基因间区域中的突变是指突变位于核酸分子的非编码区。
含有少于总密码子的缺失的基因将产生移码突变。这将导致将由氨基酸组成的基因产物与原始（原生）蛋白没有或几乎没有相似性。因此，蛋白质是功能异常的。这将影响蛋白的作用以及该蛋白可能的稳定性，因为该蛋白将不再能够正确地折叠或组装。因此，与野生型相比，该蛋白的表达水平将降低或消除。
缺失可能导致基因产物表达的过早终止。再次地，也会影响该蛋白质的功能和稳定性。此外，截断的mRNA转录可能不稳定并且容易降解。因此，与野生型相比，突变蛋白的表达水平将降低或消除。
减毒ts-19菌株包括大量的影响表面蛋白（如，外膜蛋白P95、P216、P146、P69和脂蛋白）的缺失。缺失突变也会影响膜转运蛋白，这将导致这些基因产物的功能异常。因此，如果将这些基因与亲本菌株LKP的表达进行比较，预期可以发现这些蛋白质的表达水平存在显著差异。
由产生框内的氨基酸改变的单个碱基替换引起的突变可能改变蛋白的折叠或组装，因此，尽管它可以被合成，它可能无法以正确的方式发挥作用。这种蛋白可能也会影响许多其他可能受该突变蛋白控制和影响的基因的表达。
在一种实施方式中，通过分析至少一种蛋白的表达的改变检测到了至少一种编码表1列出的蛋白的基因中的突变的存在。在一种实施方式中，在表达中的改变为表达的降低或消失。本领域技术人员能够很容易的理解确定蛋白表达是否改变或降低的方法，例如，通过基于定量抗体的方法，如，Western免疫印迹、放射免疫分析法（RIAs）、使用检测和结合目的蛋白的抗体的酶联免疫吸附测定法（ELISAs）。此外，由于mRNA水平通常能够反应由他们编码的蛋白质的量，也可以使用定量核酸的方法确定支原体是否存在一种或多种蛋白表达的降低或消失。例如，可以使用定量反转录酶/聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定相应特定目的蛋白的mRNA的量。众多基于定量核酸的方法为本领域技术人员所公知。同样基于定量核酸的方法（例如，Northern印迹杂交分析）为本领域技术人员所公知。
在一种实施方式中，因为ts-19包括均参与蛋白质合成的亮氨酰-tRNA合成酶的突变形式和异亮氨酰tRNA合成酶的缺失形式，与野生型支原体相比，减毒支原体中的总蛋白的合成可能被改变。因此，在一种实施方式中，所述方法包括分析支原体细菌的总蛋白合成。
与野生型相比，关于“表达的降低”，所述降低，与野生型相比可以至少约为5%。在另一种实施方式中，表达的降低至少约为10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、95%或99%。在另一种实施方式中，细菌没有表达在野生型细菌中表达的蛋白，因此，表达降低的百分比为100%。
在一种实施方式中，通过基因水平上的分析即分析核酸，能够检测在至少一种编码表1列出的蛋白的基因中突变的存在或在表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中突变的存在。这种分析可以为PCR分析。
合适的PCR分析的类型包括常规的PCR、多重PCR、定量PCR（qPCR）、实时PCR（RT-PCR）、荧光毛细管电泳（CE）、高分辨率熔解曲线（HRM）分析、解链温度（Tm）分析、可变数目串联重复（VNTR）和多位点序列分型（MLST）以及单核苷酸引物延伸分析。
常规PCR产物的分析对本领域技术人员来说是显而易见的，并且可以包括例如核甘酸序列分析、限制性片段长度多态性（RFLP）分析、变性梯度凝胶电泳（DGGE）以及单链构象多态性（SSCP）分析的技术。
通过选择突变区域侧翼的引物可以进行PCR扩增。每一PCR引物对优选仅产生单一条带（扩增子）。扩增子的大小可以为基于PCR分析方法的适当大小。
尽管本发明部分涉及M.hyo野生型菌株和它的温度敏感型减毒菌株的DNA序列之间的改变，由于这些蛋白在支原体物种中的保守性，与减毒有关的这些突变的发现适用于所有含有相同基因的支原体物种。
第一方面和第二方面的方法，以及第三方面的减毒支原体细菌可以涉及任何支原体物种。
在一种实施方式中，所述减毒细菌源自动物-致病性支原体细菌，本文中使用的术语“动物-致病性支原体细菌”指野生型、未减毒状态的能够感染并引起疾病和/或使动物患病的细菌。“疾病和/或使动物患病”包括动物不良的生理表现（adverse physical manifestations），以及仅通过组织学、微观的和/或分子的诊断表明的疾病或感染的临床症状。动物-致病性支原体细菌包括人-和非人-致病性支原体细菌。人-致病性支原体细菌包括，但并不限于，例如，生殖支原体（M.genitalium）、发酵支原体（M.fermentans）、唾液支原体（M.salivarium）、人型支原体（M.hominis）、肺炎支原体（M.pneumonia）、未识支原体（M.incognitus）、穿透支原体（M.penetrans）、梨支原体（M.pirum）、咽支原体（M.faucium）、嗜脂支原体（M.lipophilum）以及上颌支原体（M.buccale）的支原体物种的细菌。非人-致病性支原体细菌包括，例如，鸟-、猪-、绵羊-、牛-、山羊-、犬-致病性支原体细菌。鸟-致病性支原体细菌包括，但并不限于，例如，泄殖腔支原体（M.cloacale）、鸡支原体（M.gallinarum,）、鸡毒支原体（M.gallisepticum）、吐绶鸡支原体（M.gallopavonis）、嗜肝糖支原体（M.glycophilum）、惰性霉形体（M.iners）、华支原体（M.iowae）、霉浆支原体（M.liofaciens）、火鸡支原体（M.meleagridis）以及滑液囊支原体（M.synoviae）的支原体物种的细菌。猪-致病性支原体细菌包括，但并不限于，例如絮状支原体（M.flocculare）、猪肺炎支原体（M.hyopneumoniae）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）以及猪滑液支原体（M.hyosynoviae）的支原体物种的细菌。绵羊-、牛-、山羊-、犬-致病性支原体细菌包括，但并不限于，例如，山羊支原体山羊亚种（M.capricolum subspcapricolum）、山羊支原体山羊肺炎亚种（M.capricolum subsp.capripneumoniae）、丝状支原体丝状LC亚种（M.mycoides subsp.mycoidesLC）、丝状支原体山羊亚种（M.mycoides subsp.capri）、牛支原体（M.bovis）、牛眼霉形体（M.bovoculi）、犬支原体（M.canis）、加利福尼亚霉形体（M.californicum）以及差异霉形体（M.dispar）的支原体物种的细菌。
在第二方面的方法中，将支原体细菌的初始群体置于减毒条件下。
根据本发明的这一方面，所述“支原体细菌的初始群体”可以为任意量的支原体细菌。在某种实施方式中所述细菌为野生型细菌。可选择地，所述细菌可以包括一种或多种突变。在一种实施方式中，初始群体中的细菌为完全同源或大体完全同源的细菌；即，所述细菌优选均源自单一的亲本支原体细菌细胞、和/或具有相同或大体相同的基因型和/或表型性状。
本文中使用的术语“减毒条件”指任何条件或条件的结合，具有在支原体细菌的基因组中引入一种或多种基因改变（例如，核苷酸突变）的潜能。通常地，非限制性地，减毒条件包括，例如，在培养物中传代细菌、利用可插入基因组的基因元件例如转座子（随机插入支原体基因组中的转座子）转化细菌、将细菌暴露于一种或多种诱变剂（例如，化学诱变剂或紫外线）中、定向诱变或缺失等。当细菌的细胞通过在体外传代为减毒的时，可以将所述细胞在体外传代任何次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40次或更多次。
本文中提及的置于减毒条件后的支原体细胞的初始群体为假定减毒细菌群体。通过标准微生物技术能够获得假定减毒细菌群体的单个克隆，所述标准微生物技术包括，例如连续稀释细胞并在合适的培养基上挑取（platingout）单个细胞。一旦获得单个细胞，便分析假定减毒细菌群体的单个克隆，以确定在至少一种编码表1列出的蛋白的基因或在表2-5中的任何一个或多个列出的核酸分子中突变的存在。本文其他地方描述了确定减毒支原体细菌是否含有突变的方法。通常的方法包括，例如，基于RT-PCR的方法、Western免疫印迹等。
确定为包括至少一种所需突变的单个克隆可以通过用该克隆对易感染野生型（未减毒的）细菌的动物进行给药而进行检测。本文中所用的“易感染野生型（未减毒的）支原体细菌的动物”为与野生型支原体细菌接触后表现出至少一种临床症状的动物。这种症状为本领域普通技术人员所公知。例如，对于在表1中列出的各种蛋白以及表2-5中列出的各种突变中呈现突变的假定减毒M.hyo菌株，可以用该菌株对猪（通常是易感染野生型M.hyo的猪）进行给药。M.hyo感染的猪的临床症状包括：例如，急性呼吸道症状和体重增加的减少。因此，与感染了野生型M.hyo菌株的猪相比，如果用所述假定减毒M.hyo菌株对猪进行给药时，症状减少和/或严重的症状减少，然后所述假定减毒M.hyo菌株便被认为具有“降低的毒性”。症状任何程度的减轻均视为所述假定减毒菌株具有降低的毒性。在某些实施方式中，所述假定减毒菌株为无毒的。
第三方面的减毒支原体细菌可以在活疫苗中使用。
术语“体外连续传代”指在培养基中细菌的反复传代的行为。它涉及在培养液中接种活的细菌培养物，然后在适当的温度下孵育一段时间。然后使用部分孵育的培养物接种新鲜的无菌的培养物，依次将其孵育一段时间。继续该循环以获得理想的传代数。每一轮生长和再接种称为一个单独的传代。
第四方面的免疫原性组合物包括第三个方面的减毒支原体细菌。该免疫原性组合物可以与合适的载体在第五方面的疫苗中使用。
疫苗为建立或提高对特定疾病免疫力的生物制剂。疫苗可以为预防性的（例如，防止或减轻被病原体进一步感染的作用），或治疗性的（例如，治疗感染）。第五方面的疫苗是预防支原体细菌引起的疾病的。
适当的载体对本领域技术人员是显而易见的，而且在很大程度上取决于给药途径。所述疫苗还可以包括一种或多种额外的成分，该成分包括，但不限于，悬浮剂、稳定剂或分散剂。存在于疫苗中的额外的成分还可以为佐剂、防腐剂、化学稳定剂或其他抗原蛋白。通常，稳定剂、佐剂和防腐剂均经过优化来确定在靶动物中有效的最佳配方。合适的示例性的防腐剂包括氯代丁醇山梨酸钾（chlorobutanol potassium sorbate）、山梨酸、二氧化硫，没食子酸丙酯，对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、酚和对氯苯酚。可以使用的合适的稳定成分包括，例如，酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、磷酸二氢钾（monopotassium diphosphate）、乳糖、乳清蛋白水解物和奶粉。使用常规的佐剂来吸引白细胞或增强免疫应答。这种佐剂包括，除其他外，MPL.TM.（3-O-脱酰基单磷酰基脂A，3-O-deacylated monophosphoryl lipid A；RIBI ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,Mont.）、矿物油和水、氢氧化铝、爱菲金（Amphigen）、阿夫立定（Avridine）、L121/角鲨烯、D-丙交酯-聚交酯/苷（D-lactide-polylactide/glycoside）、泊洛尼克普来奥斯（pluronic plyois）、胞壁酰二肽、灭活的博代氏杆菌、皂苷，例如Quil A或者Stimulon.TM.QS-21（Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Framingham,Mass.）和霍乱毒素（野生型或突变型，例如，其中氨基酸29位上的谷氨酸被其他氨基酸所取代（优选为组氨酸）代替，根据国际专利申请No.PCT/US99/22520）。
在一种实施方式中，所述疫苗如果是注射的，在注射位置有很少或没有不良或不希望有的反应，例如，皮肤刺激、肿胀、皮疹、坏死、皮肤敏感。
第六方面涉及预防支原体引起的疾病，第五方面的疫苗是预防支原体引起的疾病的。
本文中提及的“预防”或“预防性的”或“防护性的”治疗或“保护…免患”包括使感染不发生或阻止或抵御或预防由猪肺炎支原体引起的疾病的发生或严重性，包括阻止、预防或减轻有倾向感染疾病的个体（但尚未被诊断为感染了支原体）中疾病的症状或特征的严重性。它还包括减少感染期或症状的发生率，以及减少任何病变的规模。
本文中所用的“预防”包括疾病的完全预防或在一定程度上减轻疾病的症状。它也指减轻或抑制支原体的传播、或防止细菌定值在宿主中、或防止其他支原体菌株或其他感染因子的继发感染。
可以制备第五方面的疫苗对动物进行给药，给药的形式例如，液体、粉末、气溶胶、片剂、胶囊、肠溶片剂（enteric coated tablets）或胶囊、或栓剂。给药的途径包括，并不限于，非肠道给药、腹腔给药、静脉给药、肌肉给药、皮下给药、皮内给药、口服给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药（intra-pulmonary administration）、直肠给药、阴道给药等。
在一种实施方式中，涉及感染呼吸道的支原体细菌，所述疫苗被制成用于给药至呼吸道，例如通过鼻内给药、气溶胶给药或通过口或鼻的吸入给药。这种给药途径是优选的，因为对猪肺炎支原体防护性免疫的特征可能是预防疾病的局部（肺部）免疫以及细胞介导的免疫，而不是来自循环抗体。所述疫苗在呼吸道的存在可以刺激局部免疫应答。因此，疫苗的局部给药可能更有效。此外，通过在封闭的容器（barn）或空间进行疫苗给药（粗雾大量给药（coarse spray mass administration）），并使猪吸入疫苗，减少了接种大量动物的劳动力。目前使用的具有商业基础的有效针对特定疾病给家禽接种疫苗的方法是气溶胶接种（或喷雾接种），并也适用于接种猪。
鼻内给药包括通过鼻道或口鼻（snout）的任何给药。所述疫苗可以作为溶液、悬浮液或干粉施用到鼻内。例如，移液器、滴管或喷雾器，可选的气雾喷雾器都可以用于溶液和悬浮液的鼻内给药。干粉可以通过吸入的方式进行鼻内给药。
气溶胶给药指在空气中将疫苗分散为细微固体颗粒或者液滴形式的给药。
吸入（也称为吸气（inspiration））为空气从外部环境，通过气道，并进入肺部的肺泡的动作。
在治疗上使用的疫苗的有效剂量将取决于，例如，治疗目标、给药途径和动物的状况。
疫苗的剂量水平通常按照大约为每毫升每剂量103至108颜色变化单位（CCU）的量，并且优选每毫升每剂量104至107CCU。
然而，能够理解的是，任何特定猪类动物的具体剂量水平将取决于多种因素，包括：使用的具体化合物的活性、年龄、体重、健康状况（general health）、性别、饮食、给药时间和给药途径。
有效剂量的选择以及上调或下调是本领域技术人员已知的。
赋予菌株减毒的支原体细菌中的突变信息有利于确定动物是否感染了减毒的或毒性的支原体菌株。
野生型野外菌株感染动物，而且如果它们是毒性菌株，则它们可以凭凭借它们自身的性质引起疾病，也可以为继发性细菌和/或病毒感染创造条件。
感染之后，从动物中能够重新获得疫苗菌株和任意野生型支原体菌株（通过自然暴露感染）。可以使用PCR进行检测。可以从感染的组织（例如，从肺或气管）中直接提取生物体并通过PCR进行检测。从动物中重新获得的生物体可以先在体外培养以使所述生物体生长，而产生更多的生物体拷贝以增强检测方法的有效性（例如，通过PCR或通过生物化学或血清学方法鉴定）。
关于分析感染的爆发，第九方面的方法能够确定爆发是否是由于疫苗菌株。就是说，如果动物已经接种了支原体疫苗，并很快发展了疾病，可以对个体进行检测以确定感染的原因是否是疫苗或是否是野生型毒性野外菌株（wild type virulent field strain）。这在农场环境中是特别重要的。
第九和第十方面提供了包括用于检测与减毒有关的突变的引物或探针的试剂盒。
在一种实施方式中，所述引物为MHP-2F（SEQ ID NO:1）和MHP-2R（SEQ ID NO:2）。
在另一种实施方式中，所述引物为MHP-9/10-2F（SEQ ID NO:3）和MHP-9/10-2R（SEQ ID NO:4）。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括与突变基因或核酸分子杂交的寡核苷酸探针。该探针可以标记有放射性或非放射性标记试剂，非放射性标试剂包括传统的生物素，Dig（洋地黄毒苷）、FRET（荧光共振能量转移）或荧光染料（Cy5或Cy3）。另外，寡核苷酸可以作为PCR扩增的引物。在这种情况下，所述试剂盒可以包括用于PCR反应的DNA聚合酶、4种dNTPs以及PCR缓冲液。此外，寡核苷酸可以作为探针附着于基因芯片（microarray）上。在这种情况下，所述试剂盒可以包括杂交反应缓冲液、含有用于扩增靶基因的引物的PCR试剂盒、未杂交DNA的洗涤液、染料、未结合的染料的洗涤液以及基因芯片的说明手册。
在一种实施方式中，所述探针可以为多个探针的结合，能够从单一样品中同时检测多个突变。实际上，在相同的杂交和洗涤条件下，探针最好能够同时与支原体的多种目标突变DNAs杂交。
在一种实施方式中，所述试剂盒提供了包括用于检测一种或多种突变的一组探针的基因芯片，该试剂盒能够在单一实验中同时检测来自单一样品的多种突变。
除非上下文另有要求，在整个说明书中，词语“包括”或例如“含有”或“包含”的变体应理解为表示包括已阐明的元素或整体或者元素或整体的组，但不排除任何其他的元素或整体或者元素或整体的组。
还必须指明的是，正如说明书主体所用的，除上下文另有明确规定，否则单数形式：“一个”、“一种”以及“这个”包括该方面的复数形式。
尽管为了清楚和理解的目的，本发明进行了某些细节的描述，在不背离本说明书公开的发明构思的范围内，可以对本文所描述的实施方式和方法做出各种修饰以及改变，这对本领域技术人员是显而易见的。
本说明书中引用的全部参考文献，包括任何专利或专利申请，一并通过引用纳入本文。在此明确表示：尽管本文引用了一些现有技术的公开文件，但这些参考文件并不构成对这些文件是组成本领域的部分公知常识的认可。
下面参考以下实施例对本发明进行更详细的描述。除非文中明确的提到，否则这里提供的实施例仅为示例目的，并不意味着局限于此。因此，本发明包括由于本发明提供的教导而变得明显的任何和全部的变化方式。
实施例1：疫苗菌株的制备
澳大利亚猪肺炎支原体分离株LKP为呈现典型地方性肺炎疾病的猪肺的屠宰样本（Lloyd and Etheridge(1981),J.Comp.Path.91:77-83）。该分离株培养并保藏在南澳大利亚阿德莱德大学支原体参考培养中心。所述分离株的培养物随后由维多利亚墨尔本大学支原体组获得。
将所述培养物在体外传代3次后，使用200mg/mL的N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（N-Methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine（NTG）），利用之前描述的方法（Nonamura and Imada (1982)Avian Diseases 26:763-775）进行突变。简单地说，猪肺炎支原体菌株LKR的培养物生长到对数期末期并进行离心得到沉淀。在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤细胞并将其暴露于NTG。沉淀所述细胞并在改良的Friis培养基（Friis,N.F.1975）中进行重悬，接下来在33℃下孵育4小时。然后将所述培养物过0.45μm滤膜。进行适当的稀释，并分装置于琼脂平板上，在33℃下进行孵育。将长大的克隆体克隆（cloned）到3mL的培养液中，并在33℃下进行孵育。将克隆的安瓿瓶保存在-70℃下，并确定每个克隆的温度敏感性。
通过进行二次滴定以及在33℃和39.5℃下进行孵育确定了ts-19的温度敏感性。在33℃，滴定量（titre）通常＞1×108CCU/mL，在39.5℃，滴定量<1×102CCU/mL。
所述ts-19菌株基于布达佩斯条约保藏为NM 04/41259。它以
Figure BDA00002427787000241
MHP（活的减毒的温度敏感疫苗，用于预防猪的猪肺炎支原体感染）使用。
实施例2：测序和分析
对3株猪肺炎支原体菌株（疫苗菌株ts-19第一代，ts-19 P12与亲本菌株LKR）进行全基因组测序。利用454测序技术（Roche）进行测序。对各个进行测序的三个基因组的每次读码进行了至少15×覆盖。对各个分离的基因组，从每组读码推断出共有序列。将各个基因组的重叠读码排列成若干个大重叠群（large contigs）。通过序列比对确定了源自疫苗菌株的重叠群与猪肺炎支原体J菌株序列（NC 007295.1）具有高度的同源性。
将来自各个菌株的大重叠群与J菌株的序列进行比对，随后确定了ts-19或LRK序列内的缺口（gaps）。设计并合成了横跨该缺口的几种PCR引物。引物序列以生成于疫苗或LKP菌株或在核苷酸数据库上获得的J菌株的序列（GENBANK,NC 007295.1）的序列的组合为基础。使用所述引物并通过PCR扩增目的区域。然后对PCR扩增子进行测序。然后将从横跨该缺口区域的重叠读码生成的序列排列成重叠群，直到所述缺口交联，随后完成了全基因组的测序。
一旦完成了ts-19（第一代和P12）以及亲本菌株LKP的全基因组测序，将三个序列与J菌株的全基因组在多序列比对中进行比对。
当与LKP的和J菌株的序列比较时，从多序列比对可以确定ts-19第一代和P12基因组中核苷酸碱基的替换、缺失或插入为突变。这些突变分为已知基因内的改变、假想基因的改变、基因间的改变或非编码区的改变。表1列出了由突变基因编码的蛋白。表2-5列出了进一步的突变。图1显示了突变的确切性质和位置。
实施例3：新型减毒支原体的筛选
可以通过筛选在ts-19中已经突变的一种或多种基因的克隆进行新型猪肺炎支原体或其他支原体变种的待选疫苗的筛选。
诱变形成及ts筛选后，在培养物中培养ts支原体克隆，并使用标准方法进行该生物体mRNA的提取，使用反转录酶将mRNA转换为cDNA。同时在培养物中培养亲本菌株，并进行该生物体mRNA的提取。将该mRNA转换为cDNA。
在针对ts-19中确定的一个或多个突变基因的不同的PCR反应中使用各个ts克隆和亲本菌株的cDNA。将产生的PCR扩增子印记到基因芯片上。制备两种包括ts克隆的PCR产物的阵列的芯片，并制备其他两种包括亲本PCR产物的阵列的芯片。
然后将ts克隆的全基因组cDNA与Cy Dye Ester（例如Cy3）进行耦连，将亲本的全基因组cDNA与另一种Cy Dye Ester（例如Cy4）进行耦连。
将Cy3标记的cDNA与各个基因芯片（一种为ts克隆，一种为亲本）进行杂交。同样地，将Cy4标记的cDNA与各个基因芯片（一种为ts克隆，一种为亲本）进行杂交。
基于能够反映基因表达水平的杂交信号强度以及颜色分析差异表达。
实施例4：ts-19和其它野生M.hyo之间的区分
使用特异性引物对对野外样品（例如，源自感染的猪的鼻拭子（nasalswab）或肺组织）进行PCR扩增。根据突变的不同位点的侧翼设计每个引物对，所述突变确定是ts-19疫苗菌株独有的。可以通过突变检测技术分析PCR扩增子，例如：
荧光毛细管电泳（CE）：
对于缺失和插入突变，荧光CE将是可用的合适的突变检测技术。在这种情况下，引物将各自标记不同的荧光团并用于PCR反应。将野外样品（测试）以及ts-19样品（阳性对照）进行PCR扩增。将野外测试样品和阳性对照（ts-19）产生的PCR产物进行毛细管电泳，从而根据大小分离PCR产物。CE能够鉴定出单个（或多个）核苷酸碱基的缺失或插入产生的扩增子大小的改变。因此，疫苗菌株的PCR扩增子将具有已定的峰位置，这与野外样品产生的PCR扩增子是不同的。如果样品中存在ts-19疫苗和野外菌株，将会观察到两个不同的峰。
单链构象多态性（SSCP）：
单链构象多态性（SSCP）分析是灵敏的突变检测技术。SSCP分析的原理是基于单链DNA具有确定的构象的事实。由序列中单个碱基变化产生的改变的构象能够在非变性电泳条件下引起单链DNA不同地迁移。因此，来自ts-19疫苗菌株（阳性对照）的PCR和野外测试样品的PCR将呈现不同的条带图谱。
SSCP能够应用于碱基改变、缺失和插入。利用放射性标记的引物（例如，标记P33）能够PCR扩增一个或多个突变区。使用与野外测试样品相同的方法分析ts-19阳性对照扩增子样品。将双链DNA扩增子进行变性（例如，暴露于高温和碱性条件下）将导致单链DNA分子的构象，并立即将其在非变性电泳条件下进行电泳分离。电泳后的凝胶在滤纸（例如Whatmann）上进行干燥，然后暴露于放射自显影胶片（autoradiographic film）。将来自野外样品的条带图谱放射自显影形成后与ts-19阳性对照样品的放射自显影条带图谱进行比较。与ts-19图谱相同的条带图谱将表明该样品为ts-19疫苗菌株。不同的条带图谱将表明该样品不是ts-19。
SSCP方法也可应用在非放射性的模式中。
高分辨率熔解（HRM）曲线分析：
HRM曲线分析适用于涉及碱基替换、缺失和插入的突变。在这种情况下，野外测试样品以及ts-19阳性对照样品利用循环测序仪进行特定（包括突变）区域的实时（RT）PCR扩增。使用的PCR仪器是能够进行HRM曲线分析的仪器。PCR扩增循环完成时，对PCR扩增子进行由PCR仪器执行的HRM曲线分析。与野外菌株扩增子相比，ts-19扩增子将呈现不同的熔解曲线。
实施例5：
Figure BDA00002427787000281
MHP的HRM分析
基于实施例2的突变数据，进行了2种能够区分包括疫苗亲本菌株的MHP疫苗菌株和其它M.hyo菌株的高分辨率熔解（HRM）曲线分析的实施例。然而，任何疫苗菌株内存在的突变改变均能够作为HRM分析的目标。
选择了疫苗基因组内的2个区域作为分析HRM的例子。指定这些区域为MHP2和MHP9/10。MHP2为将单一突变作为目标的HRM的例子（图1B和C突变2号）。MHP9/10为两种突变作为目标的HRM的例子（图1B和C突变9和10号）。具有2或5种Plex和HRM能力的凯杰试剂盒（Qiagen）“Rotor Gene Q”单元与
Figure BDA00002427787000283
HRMTM试剂盒相结合用于该分析工作。总之，HRM为能够用于突变扫描和基因分型的后-PCR技术。该方法不需要后-PCR处理，因此，减少了交叉污染的风险。此外，该方法不涉及分离步骤，减少了分析时间。
对DNA样品（例如，在抑制污染生物体生长的猪肺炎支原体选择性培养液中培养的临床样品（例如，拭子或组织制剂））进行HRM分析。然后从培养的M.hyo样品中提取DNA。为所有的测试样品对纯化的DNA进行标准化。
实施例5a：靶MHP2：
选择引物对（MHP-2F和MHP-2R）扩增猪肺炎支原体基因组的151bp的区域。
PCR反应
进行HRM反应（一式三份）。各个反应包括以下试剂：
Figure BDA00002427787000292
将所需的试剂（如上）分装到0.1mL的PCR管中并进行热循环。
热循环条件：
Figure BDA00002427787000293
结果
对从疫苗或其他M.hyo菌株的纯培养物中提取的DNA进行HRM分析。对来自各个菌株的DNA或来自不同菌株的DNA的混合物进行了单独的反应。
图2（A、B和C）显示了
Figure BDA00002427787000301
HMP疫苗菌株和两种野生型M.hyo（疫苗亲本菌株以及野外分离菌株）的靶MHP2的HRM图谱。HRM表现了熔解模式，溶解模式在大约75.2℃时开始其分离并在大约77.4℃时结束。所述疫苗菌株显示了较低的温度熔解图谱，使得能够将它从野生型菌株
Figure BDA00002427787000302
HMP的亲本菌株和野外分离株）中分离出来。野生型菌株比导致熔解图谱右移的疫苗菌株能够维持更长一段时间更高水平的荧光。这种移动可以用于区分疫苗菌株和其他M.hyo野生型菌株。
两种M.hyo野生型菌株的HRM图谱是相同的，如它们的重叠图谱所示（图2A）。图2B和C分别显示了重叠图谱。图2D利用显示疫苗菌株和野生型菌株之间清晰分离的“差异图”显示了相同的数据。通过规定疫苗菌株作为参考创建所述差异图。然后将野生型菌株的荧光水平标准化归零，差异图还显示了与野生型标准的各种差异。
实施例5b：靶MHP9/10
选择引物对（MHP-9/10-2F和MHP-9/10-2R）扩增猪肺炎支原体基因组的160bp的区域。
Figure BDA00002427787000303
PCR反应
进行HRM反应（一式三份）。各个反应包括以下试剂：
Figure BDA00002427787000311
将所需的试剂（如上）分装到0.1mL的PCR管中并进行热循环。
热循环条件：
图3A显示了HMP疫苗菌株和亲本菌株的靶MHP9/10的HRM图谱。HRM表现了熔解模式，熔解模式在大约73.7℃时开始其分离并在大约77.0℃时结束。所述疫苗菌株显示了较高的温度熔解图谱，产生了与亲本菌株的区别。疫苗菌株比导致熔解图谱右移的亲本菌株能够维持更长一段时间更高水平的荧光。这种移动可以用于区分疫苗菌株和亲本菌株。图3B利用显示疫苗菌株和亲本菌株之间清晰分离的“差异图”显示了相同的数据。
将来自
Figure BDA00002427787000321
HMP疫苗菌株和亲本M.hyo菌株LKR的DNA以1:1的比例混合，并进行靶MHP9/10的HRM分析。同样的分析，将来自各个菌株的单独的DNA进行HRM分析。图谱（图4A）显示了与如上面描述的促使区分疫苗菌株和亲本菌株的靶MHP9/10相同的熔解模式。图4（A）显示的混合M.hyo DNA（疫苗菌株和亲本菌株）的HRM图谱展示了区别单独疫苗和亲本菌株的DNA的熔解模式。在差异图中（图4B），疫苗菌株已经被标准化，以便能够观察到与疫苗的任何差异。在差异图中，所述疫苗能够区别于野生型菌株，但混合样品展示出完全不同于野生型和疫苗菌株的熔解图谱（图4B）。
结论
选择两个实施例以证明HRM曲线分析能够作为工具使用，以区分包括疫苗亲本菌株的
Figure BDA00002427787000322
HMP疫苗菌株和其它
Figure BDA00002427787000323
HMP疫苗菌株。实施例5a证明了基于单个核苷酸碱基的差异。实施例5b证明了基于两个核苷酸碱基变化的差异。随后HRM分析作为工具使用，HRM分析可以将疫苗菌株中存在的多个突变变化中的任意突变作为目标，以区分感染的动物和接种疫苗的动物（DIVA）。单个HRM分析可以将单个或多个突变作为目标。对于每种突变，正向引物可以设计在突变位点上游500bp区域内的任何位置。反向引物可以设计在突变位点下游500bp区域内的任何位置。优选产生的扩增子的大小在50-200bp之间。

Claims (13)

1.一种鉴定减毒支原体细菌的方法，该方法包括：分析支原体细菌，以确定在至少一种编码表1列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个列出的核酸分子中突变的存在；其中，突变的存在表明所述支原体是减毒的。
2.一种产生减毒支原体的方法，该方法包括：将支原体细菌的初始群体置于减毒条件下，从而产生假定的减毒细菌群，并分析假定的减毒细菌群的单克隆，以确定在至少一种编码表1列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个列出的核酸分子中突变的存在；其中，突变的存在表明所述支原体是减毒的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，该方法包括分析在编码表1列出的蛋白的基因中和/或在表2-5中的任何一个列出的核酸分子中突变的组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述突变的组合包括表1中的P85、P69、P216、P146和脂蛋白基因中的至少两种突变。
5.一种减毒支原体细菌，该减毒支原体细菌为由权利要求1所述的方法所筛选的减毒支原体细菌或由权利要求2所述的方法所产生的减毒支原体细菌。
6.一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包括权利要求5所述的减毒支原体细菌。
7.一种支原体疫苗，该支原体疫苗包括权利要求6所述的免疫原性组合物。
8.一种诱导对个体中的支原体引起的疾病的防护性免疫的方法，该方法包括：用安全剂量的权利要求5所述的减毒支原体、权利要求6所述的免疫原性组合物或权利要求7所述的疫苗对个体进行给药。
9.一种确定动物是否被减毒或毒性支原体菌株感染的方法，该方法包括：分析来自动物的含有支原体的样品，以确定在至少一种编码表1列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个列出的核酸分子中突变的存在，其中，不存在突变表明所述动物被毒性支原体感染了。
10.一种区分接种减毒支原体菌株的动物和感染支原体的动物的方法，该方法包括：分析含有支原体的样品，以确定在至少一种编码表1列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一个列出的核酸分子中突变的存在；其中，样品中突变的存在表明所述样品来源的动物接种了减毒的支原体疫苗。
11.一种试剂盒，该试剂盒包括对至少一种编码表1列出的蛋白的基因中的突变或表2-5中的任何一个列出的核酸分子中的突变具有特异性的引物或探针。
12.一种试剂盒，该试剂盒包括对图1中显示的至少一种突变具有特异性的引物或探针。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述引物包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
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