BR112019015425A2 - Uma vacina de segurança alimentar para controlar salmonella enterica e reduzir campylobacter em aves domésticas - Google Patents

Abstract

são descritas nesse relatório descritivo composições e métodos para a produção e utilização de bactérias recombinantes que são capazes de atenuação regulada, expressão regulada de um ou mais antígenos de interesse, e/ou modificação de n-glicano de antígenos secretados/de superfície.

Description

UMA VACINA DE SEGURANÇA ALIMENTAR PARA CONTROLAR SALMONELLA ENTERICA E REDUZIR CAMPYLOBACTER EM AVES DOMÉSTICAS

DIREITOS GOVERNAMENTAIS

[001] Es sa invenção foi feita com suporte governamental sob a Concessão N° 12229724 concedida pelo National Institute of Food and Agriculture of the United States Department of Agriculture. 0 governo possui certos direitos na invenção.

PEDIDO RELACIONADO

[002] Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido U.S. Provisório N° 62/451.146, depositado em 27 de janeiro de 2017. Todo o conteúdo do pedido citado anteriormente é expressamente incorporado nesse relatório descritivo por referência.

FUNDAMENTOS

[003] Patógenos humanos de origem alimentar são um problema de saúde pública. Em particular, Campylobacter e Salmonella são as causas principais de doença alimentar de origem bacteriana em todo o mundo. A gastrenterite por Campylobacter está associada à manipulação inadequada de galinha crua ou consumo de galinha malcozida. (1) (2) O suprimento de aves domésticas, incluindo galinhas, perus, patos e gansos, está frequentemente infectado com C. jejuni e C. coli. (3) Infecções humanas por Salmonella estão associadas, em parte, à ingestão de alimentos contaminados por fezes de animais ou contaminados de forma cruzada por outras fontes, incluindo aves domésticas. (4) (5) O consumo crescente de aves domésticas e produtos de aves domésticas tornou as doenças de origem alimentar associadas com aves domésticas uma preocupação de saúde pública significante.

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[004] Estratégias para o controle de Campylobacter e Salmonella em aves domésticas incluem a administração de antibióticos. No entanto, o uso abusivo de antibióticos e o risco de desenvolvimento de cepas bacterianas resistentes a antibióticos diminuíram o interesse no uso de antibióticos para essas finalidades. Dessa forma, a vacinação de aves domésticas surgiu como uma estratégia importante para atenuar a prevalência pelo menos desses dois patógenos de origem alimentar em suprimentos de aves domésticas.

[005] Vacinas contra Salmonella atenuadas recombinantes (RASVs) foram desenvolvidas como vacinas e sistemas de liberação de antígeno para estimular respostas imunes protetoras contra uma variedade de antígenos. RASVs aprimoradas que são modificadas geneticamente para incluir atributos patogênicos regulados por promotor induzível foram desenvolvidas recentemente. Aprimoramentos nessa tecnologia incluíram o desenvolvimento de RASVs Atenuadas Retardadas Reguladas (RDA RASVs) que são desenvolvidas in vitro na presença de um indutor (por exemplo, um açúcar) para induzir a expressão de genes associados à patogênese. Mediante administração a um indivíduo, as RDA RASVs se replicam com virulência total e colonizam tecidos linfóides para induzir respostas imunes potentes. No entanto, à medida que os níveis de indutor diminuem dentro do indivíduo e após várias rodadas de replicação, as RDA RASVs se tornam atenuadas evitando, dessa forma, proliferação adicional das bactérias in vivo.

[006] O uso de RASVs para a profilaxia e tratamento de patógenos de origem alimentar em aves domésticas é particularmente promissor. No entanto, são necessários novos meios para aumentar a imunogenicidade e segurança das vacinas

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3/242 in vivo. RASVs e composições farmacêuticas capazes de indução de respostas imunes potentes a múltiplos patógenos de origem alimentar em aves domésticas são particularmente desejáveis.

SUMÁRIO

[007] A presente revelação fornece cepas de bactérias recombinantes, incluindo Salmonella, com propriedades imunogênicas aumentadas e características de segurança desejáveis. As bactérias recombinantes podem ser usadas com segurança para liberar eficazmente compostos antigênicos a um indivíduo (por exemplo, aves domésticas) a fim de montar respostas imunogênicas potentes contra patógenos como, por exemplo, Campylobacter e Salmonella. Essas cepas liberam múltiplos antígenos de superfície/secretados de Salmonella e/ou antígenos de superfície/secretados modificados de Nglicano de Campylobacter conservados protetores para induzir imunidade protetora.

[008] Em algumas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um derivado recombinante de uma bactéria patogênica, que compreende atenuação regulada-retardada, a síntese regulada-retardada de um antígeno de interesse, um fenótipo in vivo de lise regulada-retardada, e síntese e liberação de um ou mais antígenos protéicos de C. jejuni.

[009] Em algumas modalidades, as bactérias recombinantes descritas nesse relatório descritivo são capazes de sintetizar e anexar um N-glicano de Campylobacter a um antígeno de interesse a fim de aumentar a imunogenicidade do antígeno in vivo. As bactérias recombinantes podem depender de dois ou três açúcares para regular o fenótipo de virulência das bactérias por controle da expressão de múltiplos genes de virulência e, opcionalmente, o antígeno

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4/242 de interesse, bem como um fenótipo de lise retardada regulada, permitindo contenção biológica e o aumento de propriedades imunogênicas. A dependência de múltiplos açúcares aumenta a segurança das bactérias recombinantes, considerando a improbabilidade de que os organismos encontrarão todos os açúcares em um ambiente de ocorrência natural. Veja PCT/US18/14860, depositado em 23 de janeiro de 2018, cujo conteúdo completo é expressamente incorporado nesse relatório descritivo por referência.

[010] Especificamente, as bactérias reveladas nesse relatório descritivo são baseadas em uma vacina recombinante contra Salmonella atenuada (RASV) derivada da cepa de S. Typhimurium aviária altamente virulenta UK-1 e pode ser usada para sintetizar e liberar múltiplos antigenos protéicos protetores conservados de Campylobacter jejuni. Verificouse que a vacinação com essas RASVs induz imunidade contra múltiplos sorotipos de Salmonella e C. jejuni que infectam aves domésticas. A presente revelação ainda fornece uma nova estratégia de design inovadora de RASV para gerar essas vacinas de segurança alimentar que induzem níveis superiores de imunidade protetora a vários patógenos de aves domésticas. Esses vetores de RASV foram programados para passar por lise retardada regulada em vários compartimentos da célula dentro do animal imunizado para induzir imunidades mucosas e sistêmicas de anticorpo e celular superiores. Além disso, essas RASVs vivas exibem contenção biológica completa sem persistência in vivo e nenhuma sobrevida se excretadas. Prevê-se que o uso disseminado dessas RASVs reduza substancialmente infecções por Salmonella e C. jejuni e, por fim, elimine a colonização de galinhas por C. jejuni para

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5/242 reduzir a transmissão desses patógenos através da cadeia alimentar aos humanos. Além disso, o uso desses sistemas de vetor muito aprimorados também diminuirá o uso de antibióticos durante a criação de aves domésticas e, dessa forma, reduzirá a pressão seletiva para espécies bacterianas com resistência farmacológica que também pode ser transmitida através da cadeia alimentar aos humanos.

[Oil] A presente revelação ainda fornece uma RASV de S. Typhimurium UK-1 validada e altamente imunogênica que exibe atenuação retardada regulada, síntese retardada regulada de antígenos recombinantes e fenótipos de lise retardada regulada. Foram construídos derivados que são capacitados para sintetizar e liberar múltiplos antígenos protéicos de

C. jejuni. Dessa forma, por causa da incapacidade da RASV para sintetizar o antígeno-0 de LPS sorotipo-específico in vivo para expor o núcleo de LPS que é o mesmo em todos, sorotipos de Salmonella induzem imunidade protetora cruzada para a maioria dos sorotipos de Salmonella liberando, ao mesmo tempo, múltiplos antígenos protéicos de C. jejuni para induzir imunidade protetora superior contra C. jejuni.

[012] As RASVs construídas foram projetadas para exibir, no momento da pulverização grosseira ou liberação oral às aves domésticas, os mesmos atributos que a cepa parental virulenta UK-1 do tipo selvagem para competir com estratégias de defesa do hospedeiro, e invadir com sucesso através das superfícies mucosas para colonizar eficientemente tecidos linfóides efetores internos antes da exibição do fenótipo de atenuação e, dessa forma, são incapazes de induzir quaisquer sintomas de doença ou prejudicar ou reduzir o crescimento. Foi verificado que as RASVs que alcançam esses tecidos

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6/242 internos gradualmente começam a servir como fábricas para sintetizar antígenos de C. jejuni protetores a serem liberados por secreção e, por fim, por lise da RASV. Como a lise é habilitada para ocorrer em compartimentos extracelulares e intracelulares diversos, foram induzidas respostas imunes mucosas e sistêmicas de anticorpo e celulares desejadas. Essas estratégias inovadoras fornecem um meio clássico de atenuação usado previamente que reduzia a imunogenicidade por causa das habilidades de colonização prejudicadas das cepas atenuadas. Além disso, essas RASVs com o fenótipo de lise retardada regulada exibem contenção biológica completa sem persistência de células da vacina in vivo e nenhuma sobrevivente se excretada.

[013] Em um aspecto, é revelado nesse relatório descritivo um derivado recombinante de uma bactéria patogênica que compreende um fenótipo de atenuação reguladaretardada; uma expressão regulada-retardada de um antígeno de interesse; um fenótipo in vivo de lise regulada-retardada; e que é capaz de síntese e liberação de um ou mais antígenos protéicos de C. jejuni. Em uma modalidade, a bactéria ainda compreende mutações que causam exibição do polissacarídeo do núcleo de LPS universal in vivo.

[014] Em um aspecto, é revelado nesse relatório descritivo um derivado recombinante de uma bactéria patogênica que compreende um fenótipo de atenuação reguladaretardada; uma expressão regulada-retardada de um antígeno de interesse; um fenótipo in vivo de lise regulada-retardada; e que é capaz de síntese e liberação de um ou mais antígenos protéicos que exibem o N-glicano de Campylobacter jejuni.

[015] Em um aspecto, é revelado nesse relatório

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7/242 descritivo um derivado recombinante de uma bactéria patogênica que compreende um fenótipo de atenuação reguladaretardada; uma expressão regulada-retardada de um antígeno de interesse; um fenótipo in vivo de lise regulada-retardada; e que é capaz de síntese e liberação de um ou mais antígenos protéicos de C. jejuni e também exibe o N-glicano de Campylobacter jejuni.

[016] Em uma modalidade, a bactéria compreende um ou mais genes de óperon de Campylobacter pgl. Em uma modalidade, os (um ou mais) genes de óperon de Campylobacter pgl são códonotimizados para expressão na bactéria.

[017] Em uma modalidade, a bactéria é uma bactéria Gramnegativa. Em uma modalidade, a bactéria pertence à família Enterobacteriaceae.

[018] Em uma modalidade, o antígeno de interesse é um antígeno de Campylobacter. Em uma modalidade, o antígeno de Campylobacter é um antígeno selecionado da Tabela 4, ou um antígeno que possui homologia ou identidade para ele, como descrito nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, o antígeno de interesse é selecionado do grupo que consiste em Pebl, CjaA, Dps, TlyA, 0mpl8, Cj0998c, Cj0034c, Cj0168c, Cj0248, Peb3, CmeC, Cj0404, Cj0420, Cj0427, Cj0428, PorA, FlaA, CadF e Cjl656c.

[019] Em uma modalidade, o N-glicano de C. jejuni está anexado ao antígeno de interesse.

[020] Em uma modalidade, a bactéria compreende a inserção de todo ou parte do gene cj1433c em uma deleção do gene ompA para gerar uma fusão da proteína Cjl433c.

[021] Em uma modalidade, a atenuação regulada-retardada é conferida pelo gene fur ou mntR.

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[022] Em uma modalidade, o fenótipo in vivo de lise regulada-retardada é conferido por deleções ou mutações por deleção/inserção AP_murA::TT araC Pbad murA, SasdA: : TT araC Pbad c2 ou H (wza-wcaM) .

[023] Em uma modalidade, a bactéria ainda compreende uma mutação no gene sifA.

[024] Em uma modalidade, a bactéria ainda compreende uma mutação no gene relA.

[025] Em um aspecto, é revelada nesse relatório descritivo uma composição farmacêutica que compreende a bactéria recombinante, e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição farmacêutica ainda compreende um segundo derivado recombinante de uma bactéria patogênica, em que a referida bactéria compreende um ácido nucleico que codifica um segundo antigeno de interesse. Em uma modalidade, o segundo antigeno de interesse é um antigeno de Salmonella.

[026] Em um aspecto, é revelado nesse relatório descritivo um método para indução de imunidade protetora em uma ave, o método compreendendo a administração à ave de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica revelada nesse relatório descritivo.

[027] Outros aspectos e iterações da invenção são descritos com mais detalhe abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[028] AS Figs. 1A e 1B retratam ensaios de proliferação de linfócitos antigeno-especificos. Na Fig. 1A, amostras representativas de linfócitos esplênicos isolados de galinhas imunizadas com a RASV não-lise de controle de vetor X11840(pYA3342) (G2), RASV não-lise χ11442(pYA5301) (G3),

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9/242 não-lise AsifA RASV χ11840(pYA5301) (G4), RASV de lise de controle de vetor χ11791(pYA3681) (G5), RASV de lise X11730(pYA5293) (G6) e RASV de lise AsifA χ11791(pYA5293) (G7), foram marcados com CSFE e estimulados com o antígeno de Eimeria S07. A população de linfócitos proliferativa foi definida por diluição de CFSE. A Fig. 1B apresenta uma análise gráfica da proliferação celular em cada grupo descrito na Fig. 1A. Barra, média e DP são a soma de 3 experimentos independentes, cada um utilizando três galinhas por grupo. Asterisco representam diferenças significantes entre os grupos como indicado (p <0,05) . Também correlacionadas com produção aumentada de INF-γ e IL-2 e respostas de CD4 e CD8 aumentadas.

[029] As Figs. IC e 1D retratam a indução de imunoglobulina A (IgA) intestinal contra SO7 de E. tenella em galinhas imunizadas, no dia 35 pós-imunização (Fig. IC) ou no dia 42 pós-imunização (Fig. 1D).

[030] A Fig. 2A retrata análise da proliferação de CD4 e CD8 SO7-específica em RASVs não-lise versus de lise com e sem escape de SCV em decorrência da mutação AsifA.

[031] A Fig. 2B retrata ativação de linfócitos e secreção de citocina após memória de linfócitos esplênicos homólogos in vitro de pintos vacinados com cepas da vacina RASV.

[032] As Fig. 3A e 3B retratam mapas do vetor de lise. Fig. 3A - Vetor de lise pYA4763, pBR ori. Fig. 3B - Vetor de lise pG8R17 com bla SS aprimorado, pBR ori.

[033] As Figs. 4A e 4B retratam produções de antígeno na cepa de RASV χ12341.

[034] A Fig. 5 retrata análises de western blot de antígenos de C. jejuni em χ12452. Cepa de S. Typhimurium

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10/242 desenvolvida em caldo L com 0,1% cada de arabinose, ramnose e manose com/sem indução por 1 mM de IPTG. Anticorpo monoclonal anti-poli-histidina produzido em camundongos foi usado para detecção de antigenos sintetizados.

[035] A Fig. 6 retrata o mapa genético do óperon de C. jejuni pgl.

[036] A Fig. 7 retrata a expressão do óperon pgl com/sem deleção do gene pglB, com a adição de N-glicano de C. jejuni sintetizado ao núcleo de LPS em uma S. Typhimurium com uma deleção do gene wbaP.

[037] As Figs. 8A e 8B retratam os aspectos estruturais da proteína OmpA de S. Typhimurium modificada com a inserção das sequências codificadas pelo gene Cjl433c, que especifica as nove repetições às quais o N-glicano conservado de C. jejuni está anexado como uma consequência do óperon pgl de C. jejuni e a atividade da enzima WaaL de Salmonella.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[038] A fim de que a revelação possa ser mais facilmente compreendida, primeiro serão definidos certos termos. Essas definições devem ser lidas à luz do restante da revelação e como compreendidas por aqueles habilitados na técnica. Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem o mesmo significado como comumente compreendidos por aqueles habilitados na técnica. Definições adicionais são apresentadas ao longo da descrição detalhada.

[039] Como usado nesse relatório descritivo, o termo bactéria recombinante se refere a uma célula bacteriana que foi modificada geneticamente de seu estado nativo. Por exemplo, uma bactéria recombinante pode compreender uma ou

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11/242 mais inserções de nucleotídeos, deleções de nucleotídeos, rearranjos nucleotídeos e modificações de nucleotídeos. Essas modificações genéticas podem ser introduzidas no cromossomo da bactéria ou, alternativamente, estar presentes em um ácido nucleico extracromossômico (por exemplo, um plasmídeo). As bactérias recombinantes da revelação podem compreender um ácido nucleico localizado em um plasmídeo. Alternativamente, as bactérias recombinantes podem compreender um ácido nucleico localizado no cromossomo bacteriano (por exemplo, nele incorporado estavelmente). Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é avirulenta. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante exibe virulência reduzida. Em algumas modalidades, é bactéria recombinante é não-virulenta. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é atenuada. Em outra modalidade, a bactéria recombinante é um derivado recombinante de uma bactéria patogênica.

[040] Como usado nesse relatório descritivo, o termo gene se refere a um fragmento de ácido nucleico que codifica uma proteína ou um fragmento desta, ou uma molécula de RNA funcional ou estrutural, e pode opcionalmente incluir uma sequência reguladora que precede (sequências não codificadoras 5') e sucede (sequências não codificadoras 3') a sequência codificadora do ácido nucleico. Em algumas modalidades, um gene não inclui sequências reguladoras que precedem e sucedem a sequência codificadora.

[041] Em uma modalidade, o gene é um gene heterólogo. Em outra modalidade, o ácido nucleico é um ácido nucleico heterólogo. Como usados nesse relatório descritivo, os termos gene heterólogo ou ácido nucleico heterólogo se

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12/242 referem a um gene ou uma sequência de ácidos nucleicos presente em uma célula recombinante, por exemplo, bactéria, que não é encontrada normalmente na célula do tipo selvagem, por exemplo, bactéria, na natureza. Em algumas modalidades, o gene heterólogo ou ácido nucleico heterólogo é introduzido exogenamente em certa célula. Em algumas modalidades, um gene heterólogo pode incluir um gene, ou fragmento deste, introduzido em uma célula hospedeira não nativa. Em algumas modalidades, o termo gene heterólogo inclui uma segunda cópia de um gene nativo, ou fragmento deste, que foi introduzida na célula hospedeira em adição ao gene nativo correspondente. Um ácido nucleico heterólogo também pode incluir, em algumas modalidades, uma sequência gênica que é encontrada naturalmente em certa célula, mas que foi modificada, por exemplo, por regulação por uma sequência promotora diferente, para expressar uma quantidade não natural do ácido nucleico e/ou do polipeptídeo que codifica; e/ou duas ou mais sequências de ácidos nucleicos que não são encontradas no mesmo relacionamento entre elas na natureza.

[042] Como usado nesse relatório descritivo, o termo gene endógeno se refere a um gene nativo que está presente em sua localização natural no genoma de um organismo (por exemplo, um cromossomo bacteriano).

[043] Um promotor, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que é capaz de controlar a expressão de uma sequência codificadora ou gene. Um promotor pode compreender uma ou mais sequências reguladoras da transcrição específicas para aumentar ainda mais a expressão e/ou para alterar a expressão espacial e/ou a expressão temporal de um ácido nucleico. Por

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13/242 exemplo, um promotor pode incluir um ou mais ácidos nucleicos que são reconhecidos especificamente por uma proteína ativadora da transcrição (por exemplo, um elemento intensificador), uma proteína repressora da transcrição, uma polimerase e semelhantes. 0 termo ligado operacionalmente, como usado nesse relatório descritivo, significa que a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos está sob o controle de um promotor com o qual está espacialmente conectada. Um promotor pode estar posicionado 5' (a montante) da sequência de ácidos nucleicos sob seu controle. A distância entre o promotor e uma sequência de ácidos nucleicos a ser expressa pode ser aproximadamente a mesma que a distância entre aquele promotor e a sequência de ácidos nucleicos nativa que ele controla. Como é conhecido na técnica, a variação nessa distância pode ser acomodada com perda de função do promotor. As sequências de ácidos nucleicos dos promotores descritos nesse relatório descritivo são conhecidas na técnica, e métodos de se ligar operacionalmente esses promotores a um gene (por exemplo, um gene que codifica um repressor) são conhecidos na técnica.

[044] Em algumas modalidades, o promotor para uso como descrito nesse relatório descritivo pode ser regulado diretamente ou indiretamente por um açúcar. Por exemplo, em algumas modalidades, o promotor é responsive ao nível de arabinose, de outro modo referido nesse relatório descritivo como um promotor regulável por arabinose. De um modo geral, arabinose pode estar presente durante o crescimento in vitro de uma bactéria, enquanto tipicamente ausente do tecido hospedeiro. Em uma modalidade, o promotor é derivado de um sistema araC-ParaBAD de Escherichia coli. O araC ParaBAD sistema

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14/242 é um sistema de expressão firmemente regulado, que demonstrou que funciona como um promotor forte induzido pela adição de níveis baixos de arabinose. 0 promotor araC-araBAD é um promotor bidirecional que controla a expressão das sequências de ácidos nucleicos de araBAD em uma direção, e a sequência de ácidos nucleicos de araC na outra direção.

[045] Por conveniência, a porção do promotor araC-araBAD que medeia a expressão das sequências de ácidos nucleicos de araBAD, e que é controlada pelo produto da sequência de ácidos nucleicos de araC, é referida nesse relatório descritivo como ParaBAD. Para uso como descrito nesse relatório descritivo, um cassete com a sequência de ácidos nucleicos de araC e o promotor araC-araBAD pode ser usado. Esse cassete é referido nesse relatório descritivo como araC ParaBAD. A proteína AraC é um regulador tanto positivo como negativo de ParaBAD. Na presença de arabinose, a proteína AraC é um elemento regulador positivo que permite a expressão de ParaBAD. Na ausência de arabinose, a proteína AraC reprime a expressão de Pbad · Outras bactérias entéricas contêm sistemas reguladores de arabinose homólogos ao sistema araC-araBAD de E. coli incluindo, por exemplo, S. Typhimurium. Por exemplo, a proteína AraC de E. coli só ativa ParaBAD de E. coli (na presença de arabinose) , e não S. ParaBAD de Typhimurium. Dessa forma, um promotor regulado por arabinose pode ser usado em uma bactéria recombinante que possui um óperon de arabinose similar, com interferência substancial entre os dois, se o promotor e o óperon são derivados de duas espécies diferentes de bactérias. De um modo geral, a concentração de arabinose necessária para induzir expressão é tipicamente menos do que cerca de 2% (p/p) em um meio de cultura. Em algumas

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15/242 modalidades, a concentração é menos do que cerca de 1,5%, 1%, 0,5%, 0,2% 0,1% ou 0,05% (p/p) em um meio de cultura. Em outras modalidades, a concentração é de 0,05% ou abaixo, por exemplo, cerca de 0,04%, 0,03%, 0,02% ou 0,01% (p/p). Em uma modalidade exemplar, a concentração é cerca de 0,05% (p/p) em um meio de cultura.

[046] Em outras modalidades, o promotor pode ser responsive ao nivel de maltose no ambiente, de outro modo referido nesse relatório descritivo como um promotor regulável por maltose. Em algumas modalidades, as bactérias recombinantes descritas nesse relatório descritivo são cultivadas em um meio que compreende maltose. O gene malT codifica MalT, um regulador positivo de quatro promotores responsivos à maltose (Ppq, Pefg, Pkbm e Ps) . A combinação de promotor de malT e mal cria um sistema de expressão firmemente regulado que demonstrou que funciona como um promotor forte induzido na presença de maltose. Diferentemente do sistema araC-P_araBAD, a expressão de malT é regulada por um promotor (ou seja, Pt) que não está funcionalmente relacionado com os outros promotores de mal. Pt não é regulado por MalT. O promotor malEFG-malKBM é um promotor bidirecional que controla a expressão das sequências de ácidos nucleicos de malKBM em uma direção, e as sequências de ácidos nucleicos de malEFG na outra direção. Por conveniência, a porção do promotor malEFG-malKBM que medeia a expressão da sequência de ácidos nucleicos de malKBM, e que é controlada por MalT, é referida nesse relatório descritivo como PmaiKBM, e a porção do promotor malEFG-malKBM que medeia a expressão da sequência de ácidos nucleicos de malEFG, e que é controlada por MalT, é referida

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16/242 nesse relatório descritivo como Pefg· A indução completa de Pkbm exige a presença dos sítios de ligação a MalT de PmaiEFG· Para uso nos vetores e sistemas descritos nesse relatório descritivo, um cassete gênico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica MalT e um promotor mal pode ser usado. Esse cassete gênico é referido nesse relatório descritivo como malT-Pmai· Na presença de maltose, o MalT é um elemento regulador positivo que permite a expressão mediada por Pmai · De um modo geral, a concentração de maltose necessária para induzir expressão é tipicamente menos do que cerca de 1% (p/p) em um meio de cultura. Em algumas modalidades, a concentração é de menos do que cerca de 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3% 0,2%, 0,1% ou 0,05% (p/p) em um meio de cultura. Em outras modalidades, a concentração é de 0,05% ou abaixo, por exemplo, cerca de 0,04%, 0,03%, 0,02% ou 0,01% (p/p). Em uma modalidade exemplar, a concentração é cerca de 0,2% até cerca de 0,4% (p/p) em um meio de cultura.

[047] Ainda em outras modalidades, o promotor usado nesse relatório descritivo é responsive ao nível de ramnose no ambiente, de outro modo referido nesse relatório descritivo como um promotor regulável por ramnose. Análogo ao sistema araC-ParaBAD descrito acima, o sistema ativador-promotor rhaRS-P zhaB é regulado firmemente por ramnose. A expressão pelo promotor de ramnose (Prha) é induzida até níveis elevados na presença de ramnose. Em algumas modalidades, as bactérias são cultivadas na presença de ramnose. Ramnose é encontrada comumente em bactérias, mas raramente encontrada em indivíduos humanos. O óperon de rhaBAD é controlado pelo promotor PrhaBAD. Esse promotor é regulado por dois ativadores,

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RhaS e RhaR, e as sequências de ácidos nucleicos correspondentes pertencem a uma unidade de transcrição que está localizada na direção oposta das sequências de ácidos nucleicos de rhaBAD. Na presença de L-ramnose, RhaR se liga ao promotor PrhaRs e ativa a produção de RhaR e RhaS. RhaS, junto com L-ramnose, por sua vez, se ligam aos promotores PrhaBAD e PrhaT e ativam a transcrição das sequências de ácidos nucleicos estruturais. A indução plena dos promotores regulados por arabinose, maltose e ramnose descritos nesse relatório descritivo exige a ligação do complexo Crp-cAMP, que é um regulador-chave da repressão de catabólito.

[048] Embora tanto L-arabinose quanto L-ramnose atuem diretamente como indutores da expressão de regulons que medeiam seu catabolismo, existem diferenças importantes em relação aos mecanismos reguladores. L-Arabinose atua como um indutor com o ativador AraC no controle positivo do regulon de arabinose. No entanto, o regulon de L-ramnose está sujeito a uma cascata reguladora, e está, portanto, sujeito a um controle ainda mais rígido do que o sistema araC-ParaBAD. LRamnose atua como um indutor com o ativador RhaR para a síntese de RhaS, que, por sua vez, atua como um ativador no controle positivo do regulon de ramnose. Na presente revelação, ramnose pode ser usada para interagir com a proteína RhaR e depois a proteína RhaS pode ativar a transcrição de uma sequência de ácidos nucleicos ligada operacionalmente ao promotor P rhaBAD.

[049] Ainda em outras modalidades, o promotor pode ser responsive ao nível de xilose no ambiente, referido nesse relatório descritivo como um promotor regulável por xilose. Geralmente, concentrações de xilose entre 0,0002%

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18/242 a 0,63% (p/p) no ambiente ativam a expressão de um promotor induzível por xilose descrito nesse relatório descritivo.

(6) O sistema xylR-P_xyiA é outro sistema ativador-promotor induzível bem estabelecido. Xilose induz óperons xiloseespecíficos (por exemplo, xylE, xylFGHR e xylAB), que são regulados por XylR e pelo sistema AMP cíclico-Crp. A proteína XylR serve como um regulador positivo por ligação a duas regiões distintas dos promotores da sequência de ácidos nucleicos de xyl. Como com o sistema araC-P_araBAD descrito acima, os sistemas reguladores xylR-P_xyiAB e/ou xylR-P_xyiFGH podem ser usados. Nessas modalidades, xilose xylR-P_xyiAB que interage com a proteína XylR ativa a transcrição de sequências de ácidos nucleicos ligadas operacionalmente a um de dois promotores P_xyi.

[050] Como usado nesse relatório descritivo, o termo exógeno se refere a uma substância (por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo) presente em uma célula diferente de sua fonte nativa. O termo exógeno pode se referir a um ácido nucleico ou a uma proteína que foi introduzida por um processo que envolve a mão do homem em um sistema biológico como, por exemplo, uma célula ou organismo no qual não é normalmente encontrada ou no qual é encontrada em quantidades indetectáveis. Uma substância pode ser considerada exógena se ela é introduzida em uma célula ou um ancestral da célula que herda a substância. Em contraste, o termo endógeno se refere a uma substância que é nativa ao sistema biológico ou célula.

[051] Como usado nesse relatório descritivo, o termo invasiva, quando usado em referência a uma bactéria, se refere a uma bactéria que é capaz de ser absorvida por uma

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19/242 célula eucariótica, ou uma bactéria que penetra ativamente em uma célula eucariótica. Em algumas modalidades, uma bactéria invasiva penetra uma célula eucariótica e alcança o citoplasma da célula eucariótica por lise de uma membrana vacuolar.

[052] Como usado nesse relatório descritivo, o termo patogênica, quando usado em referência a uma bactéria, se refere a uma bactéria capaz de infectar e causar doença em um hospedeiro, bem como de produzir sintomas relacionados à infecção no hospedeiro infectado. Uma espécie bacteriana que é um patógeno e é patogênica pode ficar atenuada ou avirulenta, de modo que não produza mais sintomas relacionados à infecção no hospedeiro infectado. Essas bactérias são referidas como derivados atenuados de bactérias patogênicas.

[053] O termo composição farmacêutica, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma composição que compreende um ingrediente ativo (por exemplo, uma bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo) com outros componentes como, por exemplo, um carreador e/ou excipiente fisiologicamente adequado.

[054] Como usado nesse relatório descritivo, o termo carreador farmaceuticamente aceitável ou um excipiente farmaceuticamente aceitável se refere a um material, composição ou veiculo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um enchimento liquido ou sólido, diluente, excipiente, auxiliar de fabricação (por exemplo, lubrificante, talco, estearato de magnésio, cálcio ou zinco, ou ácido esteárico), ou material de encapsulação de solvente, envolvido na realização ou transporte do composto em questão

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20/242 de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo. Cada carreador deve ser aceitável no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial ao paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, por exemplo, lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, por exemplo, amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, por exemplo, carboximetil celulose sódica, metilcelulose, etil celulose, celulose microcristalina e acetato de celulose;

(4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco; (8) excipientes, por exemplo, manteiga de cacau e ceras de supositório; (9) óleos, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafroa, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, por exemplo, propileno glicol; (11) polióis, por exemplo, glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol (PEG); (12) ésteres, por exemplo, oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, por exemplo, hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água sem pirogênio; (17) solução salina isotônica (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS)); (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções com pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, por exemplo, polipeptídeos e aminoácidos (23) componentes do soro, por exemplo, albumina sérica, HDL e LDL; (22) C2-C12 álcoois, por exemplo, etanol; e (23) outras substâncias compatíveis atóxicas empregadas em formulações

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21/242 farmacêuticas. Agentes umidificantes, agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes desintegrantes, ligantes, agentes adoçantes, agentes flavorizantes, agentes perfumantes, inibidores de protease, plastificantes, emulsificantes, agentes estabilizantes, agentes de aumento da viscosidade, agentes formadores de filme, agentes solubilizantes, tensoativos, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na formulação. Os termos como, por exemplo, excipiente, carreador, excipiente farmaceuticamente aceitável ou semelhantes são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo.

[055] Um plasmídeo ou vetor inclui uma construção de ácido nucleico projetada para liberação a uma célula hospedeira ou transferência entre células hospedeiras diferentes. O ácido nucleico incorporado no plasmídeo pode estar ligado operativamente a uma sequência de controle de expressão quando a sequência de controle de expressão controla e regula a transcrição e tradução daquela sequência de polinucleotídeos.

[056] Como usados nesse relatório descritivo, os termos proteína e polipeptídeo são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para designar uma série de resíduos de aminoácidos, conectados uns aos outros por ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carbóxi de resíduos adjacentes. Os termos proteína e polipeptídeo se referem a um polímero de aminoácidos, incluindo aminoácidos modificados (por exemplo, fosforilados, glicados, glicosilados etc.) e análogos de aminoácidos, independentemente de seu tamanho ou função. Os termos proteína e polipeptídeo, como usados nesse

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22/242 relatório descritivo, se referem tanto aos polipeptídeos grandes quanto aos peptídeos pequenos. Os termos proteína e polipeptideo são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo quando se referem a um produto gênico e fragmentos deste. Dessa forma, polipeptídeos ou proteínas exemplares incluem produtos gênicos, proteínas de ocorrência natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos e outros equivalentes, variantes, fragmentos e análogos dos citados anteriormente.

[057] Um ácido nucleico ou sequência de ácidos nucleicos pode ser qualquer molécula, preferivelmente uma molécula polimérica, que incorpora unidades de ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico ou um análogo deste. O ácido nucleico pode ser de fita simples ou de fita dupla. Um ácido nucleico de fita simples pode ser uma fita de ácido nucleico de um DNA de fita dupla desnaturado. Alternativamente, ele pode ser um ácido nucleico de fita simples não derivado de nenhum DNA de fita dupla. Em um aspecto, o ácido nucleico pode ser DNA. Em outro aspecto, o ácido nucleico pode ser RNA. Moléculas de ácido nucleico adequadas são DNA, incluindo DNA ou cDNA genômico. Outras moléculas de ácido nucleico adequadas são RNA, incluindo mRNA, rRNA e tRNA.

[058] Alterações da sequência de aminoácidos nativa podem ser obtidas por qualquer uma de diversas técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Mutações podem ser introduzidas, por exemplo, em loci particulares por síntese de oligonucleotídeos que contêm uma sequência mutante, flanqueada por sítios de restrição que habilitam a ligação de fragmentos da sequência nativa. Após a ligação, a

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23/242 sequência reconstruída resultante codifica um análogo que possui a inserção, substituição ou deleção de aminoácido desejada. Alternativamente, procedimentos de mutagênese oligonucleotídeo-dirigida sítio-específica podem ser empregados para fornecer uma sequência de nucleotídeo alterada que possui códons particulares alterados de acordo com a substituição, deleção ou inserção necessária. Técnicas para a realização dessas alterações são bem estabelecidas e incluem, por exemplo, aquelas reveladas por Walder e cols.

(7); Bauer e cols. (8); Craik (9); Smith e cols. (10) ; e Patentes U.S. N^os 4.518.584 (11) e 4.737.462 (12), que são incorporados nesse relatório descritivo por referência em suas totalidades. Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do polipeptídeo também pode ser substituído, geralmente com serina, para aumentar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar reticulação aberrante. Inversamente, ligação(ões) de cisteína pode ser adicionada ao polipeptídeo para aumentar sua estabilidade ou facilitar a oligomerização.

[059] O termo estatisticamente significante ou significantemente se refere à significância estatística e geralmente significa uma diferença de dois desvios-padrão (2DP) ou maior.

[060] Como usado nesse relatório descritivo, o termo célula hospedeira se refere a uma célula em um organismo ao qual a bactéria recombinante está sendo administrada a fim de, por exemplo, induzir uma resposta imune. Em uma modalidade, um hospedeiro é um pássaro, equino ou humano e a uma célula hospedeira se refere, respectivamente, a uma célula de pássaro, uma célula de um equino ou a uma célula

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24/242 humana .

[061] Exceto nos exemplos de operação, ou salvo quando indicado em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação usados nesse relatório descritivo devem ser subentendidos como modificados em todos os casos pelo termo cerca de. O termo cerca de, quando usado em conexão com percentagens, pode significar ± 1%.

[062] Os artigos um e uma, como usados nesse relatório descritivo, devem ser subentendidos como significando pelo menos um, salvo indicação clara em contrário.

[063] A frase e/ou, quando usada entre elementos em uma lista, visa significar (1) que somente um único elemento listado está presente, ou (2) que mais de um elemento da lista está presente. Por exemplo, A, B e/ou C indica que a seleção pode ser somente A; somente B; somente C; A e B; A e C; Be C; ou A, B, e C. A frase e/ou pode ser usada de forma intercambiável com pelo menos um ou um ou mais dos elementos em uma lista.

[064] As faixas fornecidas nesse relatório descritivo são subentendidas como sendo uma forma abreviada para todos os valores dentro da faixa. Por exemplo, subentende-se que uma faixa de 1 a 50 inclui qualquer número, combinação de números, ou subfaixa do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5,

6, 7, 8,	9,	10,	11,	12,	13,	14,	15,	16,	17,	18,	19, 20,	21
22, 23,	24,	25,	26,	27,	28,	29,	30,	31,	32,	33,	34, 35,	36
37, 38,	39,	40,	41,	42,	43,	44,	45,	46,	47,	48,	49 ou 50

I. Bactérias recombinantes

[065] A presente revelação fornece, em algumas

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25/242 modalidades, uma bactéria recombinante capaz de expressão regulada de pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno de interesse (por exemplo, um antígeno de Campylobacter). A bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo é particularmente eficaz para provocar uma resposta imune (por exemplo, imunidade protetora) contra o antígeno de interesse, pois a bactéria compreende múltiplos sistemas reguladores recombinantes que permitem que a bactéria replique mediante administração e colonize tecidos linfóides em um indivíduo a fim de provocar respostas imunes potentes. No entanto, após múltiplos ciclos de replicação in vivo, a bactéria por fim exibe um fenótipo atenuado que permite a administração segura a um indivíduo, por exemplo como uma composição de vacina. Os sistemas reguladores recombinantes das bactérias descritos nesse relatório descritivo dependem, em parte, de múltiplos elementos reguladores genéticos que são responsivos a um ou mais açúcares (por exemplo, arabinose, ramnose, manose, maltose, xilose e galactose) que não estão disponíveis à bactéria in vivo. Dessa forma, o uso do fenótipo das bactérias recombinantes descritas nesse relatório descritivo pode ser alterado mediante administração a um indivíduo. Em algumas modalidades, o fenótipo das bactérias recombinantes descritas nesse relatório descritivo é a expressão reguladaretardada de um antígeno de interesse, e o gene que confere o fenótipo codifica um antígeno de interesse. Em algumas modalidades, o indivíduo recebe a administração de um ou mais açúcares antes, depois ou concomitantemente com a administração de uma bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo a fim de ativar e/ou reprimir um sistema

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26/242 regulador responsive a açúcares das bactérias. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo compreende pelo menos três sistemas reguladores, cada um dependente de um açúcar diferente, o que facilita a invasão inicial de uma célula hospedeira no indivíduo, atenuação retardada e imunogenicidade aumentada.

[066] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo pode ser regulada para atenuação retardada in vivo. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo é capaz de expressão regulada retardada de um ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo exibe produção regulada de Módulos Generalizados para Antígenos da Membrana (GMMA) in vivo, o que pode levar à produção aumentada de proteínas da membrana externa conservadas presentes na bactéria, e, por fim, imunogenicidade aumentada. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo é capaz tanto de expressão regulada de pelo menos um ácido nucleico que codifica pelo menos um antígeno de interesse quanto de atenuação regulada. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo é capaz tanto de expressão regulada de pelo menos um ácido nucleico que codifica pelo menos um antígeno de interesse quanto de produção regulada de GMMA in vivo. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo é capaz tanto de produção regulada de GMMA in vivo, quanto de atenuação regulada. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse

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27/242 relatório descritivo é capaz de expressão regulada de pelo menos um ácido nucleico que codifica pelo menos um antigeno de interesse, atenuação regulada e produção regulada de GMMA in vivo. Em algumas modalidades, cada uma dessas propriedades é regulada diretamente ou indiretamente pela abundância de pelo menos um açúcar (por exemplo, arabinose, ramnose, manose, xilose, maltose e galactose).

[067] Em algumas modalidades, a bactéria descrita nesse relatório descritivo é uma bactéria Gram-negativa. Em algumas modalidades, a bactéria é uma bactéria patogênica. Em algumas modalidades, a bactéria é uma bactéria avirulenta. Em algumas modalidades, a bactéria pertence às Enterobaceteriaceae. Em algumas modalidades, a bactéria pertence a um gênero selecionado de: Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Brenneria, Budvicia, Buttiauxella, Candidatus Phlomobacter, Cedeceae, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhbdus, Yersinia, Yokenella. Em algumas modalidades, a bactéria é uma espécie patogênica de Enterobaceteriaceae. Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada do grupo que consiste em Escherichia coll, Shigella, Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Morganella, Providencia e Yersinia. Em algumas modalidades, a bactéria é do gênero Salmonella. Em algumas

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28/242 modalidades, a bactéria é do gênero Yersinia. Em algumas modalidades, a bactéria é do gênero Edwardsiella. Em algumas modalidades, a bactéria é de um gênero, espécie ou cepa comumente usada como uma vacina viva ou atenuada.

[068] Algumas modalidades da presente revelação compreendem uma espécie ou subespécie dos gêneros Salmonella (por exemplo, S. enterica ou S. bongori) . Por exemplo, a bactéria recombinante pode ser um sorovar de Salmonella enterica incluindo, por exemplo, Paratyphi A, Enteritidis, Typhi e Typhimurium. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é do sorovar S. Typhimurium, S. Typhi, S. Paratyphi, S. Gallinarum, S. Enteritidis, S. Choleraesius,

S. Arizonae, S. Newport, S. Heidelberg, S. Infantis, S. Choleraesius ou S. Dublin.

[069] Uma bactéria recombinante derivada de Salmonella pode ser particularmente adequada para uso como uma vacina. Por exemplo, a infecção oral de um hospedeiro com uma cepa de Salmonella tipicamente leva à colonização do tecido linfóide associado ao intestino (GALT), o que leva à indução de uma resposta imune mucosa generalizada à bactéria recombinante. A penetração adicional da bactéria para dentro dos linfonodos mesentéricos, fígado e baço pode aumentar a indução de respostas imunes sistêmicas e celulares dirigidas contra a bactéria. Dessa forma, o uso de Salmonella recombinante para imunização oral estimula todas as três ramificações do sistema imune, o que é particularmente importante para imunização contra agentes infecciosos de doenças que colonizam e/ou invadem através de superfícies mucosas. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo é usada para induzir uma

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29/242 resposta imune em aves domésticas (por exemplo, como uma vacina). Quando usada em aves domésticas, a bactéria recombinante pode ser administrada por pulverização grosseira e, dessa forma, inocular o tecido linfóide associado à conjuntiva (CALT) por meio de exposição ocular, o tecido linfóide associado ao nariz (NALT) e tecido linfóide associado aos brônquios (BALT) por meio de exposição respiratória e o GALT por meio de exposição oral. Em algumas

modalidades, a bactéria	recombinante	descrita	nesse
relatório descritivo é	administrada	a pintos	recém
eclodidos.
A. Antígenos
[070] Como usado nesse	relatório descritivo, o	termo

antígeno se refere a uma biomolécula capaz de provocar uma resposta imune em um hospedeiro. Em algumas modalidades, um antígeno pode ser uma proteína, ou fragmento de uma proteína. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico (por exemplo, um plasmídeo) que codifica um antígeno de interesse, em que o ácido nucleico é expresso pela célula hospedeira (por exemplo, uma vacina de DNA). Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito ou mais ácidos nucleicos que codificam um antígeno de interesse (por exemplo, uma ou mais cópias de um ácido nucleico que codifica um antígeno específico, um ou mais ácidos nucleicos que codificam antígenos de interesse diferente, ou combinações destes). Em uma modalidade

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30/242 exemplar, o antígeno provoca uma resposta imune protetora em um indivíduo.

[071] Como usado nesse relatório descritivo, o termo protetora significa que a resposta imune contribui para a redução de quaisquer sintomas associados à infecção de um hospedeiro com o patógeno do qual o antígeno foi derivado ou contra o qual foi projetado para provocar uma resposta. Por exemplo, um antígeno protetor de um patógeno, por exemplo, Salmonella, pode induzir uma resposta imune que ajuda a melhorar os sintomas associados à infecção por Salmonella ou reduzir a morbidade e mortalidade associadas à infecção com o patógeno ou pode reduzir a habilidade de Salmonella para infectar e colonizar o hospedeiro. O uso do termo protetora nessa revelação não exige necessariamente que o hospedeiro seja completamente protegido dos efeitos do patógeno.

[072] C. jejuni é um comensal para aves domésticas e não causa sintomas de doença. Dessa forma, quando a imunidade protetora ao C. jejuni é induzida em aves domésticas, isso se refere à habilidade da vacina para reduzir os níveis de colonização por Cj no intestino e ceco. Isso também é verdadeiro para Salmonella. Dessa forma, embora várias cepas de Salmonella possam causar doença e mortalidade em pintos recém eclodidos, os pintos se tornam totalmente tolerantes à Salmonella por volta de uma semana de idade, e depois a maioria das cepas de Salmonella persiste no trato gastrintestinal (GI) como um comensal.

[073] Em algumas modalidades, o antígeno de interesse é um antígeno derivado de um agente infeccioso. Em algumas modalidades, o antígeno de interesse é derivado de um agente infeccioso selecionado do grupo que consiste em um vírus,

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31/242 uma bactéria, um protozoário, um príon, um fungo e um helminto. Em algumas modalidades, o antígeno de interesse é derivado de uma bactéria.

[074] Alternativamente, os antígenos podem ser derivados de organismos recém identificados ou recém associados com uma doença ou condição patogênica, ou patógenos novos ou emergentes de animais ou humanos, incluindo aqueles agora conhecidos ou identificados no futuro, que podem ser expressos por uma bactéria detalhada nesse relatório descritivo. Além disso, os antígenos não estão limitados àqueles de organismos patogênicos.

[075] A imunogenicidade da bactéria pode ser aumentada e/ou modulada por construção de cepas que também expressam sequências para citocinas, adjuvantes e outros imunomoduladores .

[076] Alguns exemplos de microorganismos úteis como uma fonte para antígeno estão listados abaixo. Esses podem incluir microorganismos para o controle de praga causada por Yersinia pestis e outras espécies de Yersinia como, por exemplo, Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica, para o controle de gonorréia causada por Neisseria gonorrhoeae, para o controle de sífilis causada por Treponema pallidum, e para o controle de doenças venéreas, bem como infecções oculares causadas por Chlamydia trachomatis. Espécies de Streptococcus tanto do grupo A quanto do grupo B, tais como aquelas espécies que causam dor de garganta ou doenças cardíacas, Streptococcus equi, que causa estrangulamentos em equinos, Streptococcus mutans, que causa cavidades, e Streptococcus pneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Neisseria meningitidis, Mycoplasma pneumoniae e outras

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32/242 espécies de Mycoplasma, Haemophilus influenza, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, other espécies de Bordetella, Escherichia coli, Streptococcus equi, Streptococcus pneumoniae, Brucella abortus, Pasteurella hemolytica e P. multocida, Vibrio cholera, espécies de Shigella, espécies de Borrellia, espécies de Bartonella, Heliobacter pylori, espécies de Campylobacter, espécies de Pseudomonas, espécies de Moraxella, espécies de Brucella, espécies de Francisella, espécies de Aeromonas, espécies de Actinobacillus, espécies de Clostridium, espécies de Rickettsia, espécies de Bacillus, espécies de Coxiella, espécies de Ehrlichia, espécies de Listeria e Legionella pneumophila são exemplos adicionais de bactérias dentro do escopo dessa revelação das quais sequências de ácidos nucleicos de antígenos poderíam ser obtidas.

[077] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno de Campylobacter (por exemplo, um antígeno de C. jejuni ou um antígeno de C. coli) . Em algumas modalidades, o antígeno de Campylobacter é selecionado do grupo que consiste em Pebl (codificado pelo gene cj0921c) , CjaA (codificado pelo gene cj0982c), Dps (codificado pelo gene cj1534c), TlyA (codificado pelo gene cj0588) , 0mpl8 (codificado pelo gene cj0113), Cj0998c (codificado pelo gene cj0998c), Cj0034c (codificado pelo gene cj0034c), Cj0168c (codificado pelo gene cj0168c), Cj0248 (codificado pelo gene cj0248), Peb3 (codificado pelo gene cj0289), CmeC (codificado pelo gene cj0365) , Cj0404 (codificado pelo gene cj0404), Cj0420 (codificado pelo gene cj0420), Cj0427 (codificado pelo gene cj0427), Cj0428 (codificado pelo gene cj0428), PorA

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33/242 (codificado pelo gene cjl259) , Fia (codificado pelo gene cjl339c), CadF (codificado pelo gene cjl478c) e Cjl656c (codificado pelo gene cjl656c).

[078] Em algumas modalidades, o antígeno de Campylobacter compreende a sequência de aminoácidos canônica de Nglicosilação de Campylobacter. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos canônica de N-glicosilação de Campylobacter compreende a sequência de aminoácidos Asp/GluXaa-Asn-Tyr-Ser/Thr (ID. DE SEQ. N°: 1) . A presença da sequência de aminoácidos canônica de N-glicosilação de Campylobacter permite a glicosilação do antígeno quando produzido por uma bactéria recombinante que compreende um óperon pgl (por exemplo, um óperon pgl de Campylobacter) ou um ou mais genes de óperon pgl (por exemplo, wlaA, gne, pglK, pglH, pgll, pglJ, pglB, pglA, pglC, pglD, wlaJ, pglE, pglF e pglG). Em uma modalidade, a enzima PglB pode adicionar o N-glicano em uma sequência de aa ligeiramente diferente, DGGK (ID. DE SEQ. N° : 2), diferente da sequência de Nglicosilação usada em eucariotas (Barre e cols., 2017. Glycobiology 27:978-989).

[079] Em algumas modalidades, o antígeno de interesse compreende uma sequência de aminoácidos canônica de Nglicosilação nativa de Campylobacter. Em algumas modalidades, o antígeno de interesse é modificado geneticamente para compreender pelo menos uma sequência de aminoácidos canônica de N-glicosilação não nativa de Campylobacter Asp/Glu-Xaa-Asn-Tyr-Ser/Thr (ID. DE SEQ. N°:

1), de modo que o antígeno seja N-glicosilado quando produzido por uma bactéria recombinante que compreende um óperon pgl (por exemplo, um óperon pgl de Campylobacter) ou

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34/242 um ou mais genes de óperon pgl.

[080] Em certas modalidades, um antígeno pode compreender um epítopo de célula B ou um epítopo de célula T. Alternativamente, um antígeno ao qual uma resposta imune é desejada por ser expresso como uma fusão a uma proteína carreadora que contém um forte epítopo de célula T promíscuo e/ou serve como um adjuvante e/ou facilita a apresentação do antígeno para aumentar, em todos os casos, a resposta imune ao antígeno ou sua parte componente. Isso pode ser obtido por métodos conhecidos na técnica. A fusão a um fragmento C, CT-B, LT-B de toxina tetânica e ao núcleo do vírus da hepatite B são particularmente úteis para essas finalidades, embora outros sistemas de apresentação de epítopo sejam bem conhecidos na técnica.

[081] Em modalidades adicionais, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno pode compreender um sinal de secreção.

[082] Como estabelecido acima, o nível de síntese de um antígeno de interesse pode ser otimizado por modificação da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor e/ou promotor. Como usado nesse relatório descritivo, o termo modificar se refere a uma alteração da sequência de ácidos nucleicos do repressor e/ou promotor que resulta em uma alteração no nível de transcrição da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor, ou que resulta em uma alteração no nível de síntese do repressor. Por exemplo, em uma modalidade, modificar pode se referir à alteração do códon de início da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor. De um modo geral, um códon de início GTG ou TTG, ao contrário de um códon de início ATG, pode diminuir

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35/242 a eficiência de tradução dez vezes. Em outra modalidade, modificar pode se referir à alteração da sequência de Shine-Dalgarno (SD) da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor. A sequência de SD é um sítio de ligação ao ribossomo geralmente localizado 6-7 nucleotídeos a montante do códon de início. A sequência de consenso de SD é AGGAGG (ID. DE SEQ. N°: 80), e variações da sequência de consenso podem alterar a eficiência de tradução. Ainda em outra modalidade, modificar pode se referir à alteração da distância entre a sequência de SD e o códon de início. Ainda em outra modalidade, modificar pode se referir à alteração da sequência -35 para reconhecimento RNA polimerase. Em uma modalidade similar, modificar pode se referir à alteração da sequência -10 para ligação à RNA polimerase. Em uma modalidade adicional, modificar pode se referir à alteração do número de nucleotídeos entre as sequências -35 e -10. Em uma modalidade alternativa, modificar pode se referir à otimização dos códons da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor para alterar o nível de tradução do mRNA que codifica o repressor. Por exemplo, códons não ricos em A inicialmente após o códon de início da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor podem não maximizar a tradução do mRNA que codifica o repressor. Similarmente, os códons da sequência de ácidos nucleicos que codifica qualquer uma das proteínas descritas nesse relatório descritivo podem ser códon-otimizados, ou seja, alterados de modo a mimetizar os códons de proteínas altamente sintetizadas de um organismo particular. Em uma modalidade adicional, modificar pode se referir à alteração do teor de GC da sequência de ácidos nucleicos que

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36/242 codifica o repressor para alterar o nível de tradução do mRNA que codifica o repressor. Métodos de modificação de uma sequência de ácidos nucleicos são conhecidos na técnica.

[083] Em algumas modalidades, mais do que uma modificação ou tipo de modificação pode ser realizada para otimizar o nível de expressão de um ácido nucleico descrito nesse relatório descritivo (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um repressor ou antígeno de interesse) . Por exemplo, pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove modificações, ou tipos de modificações, podem ser realizadas para otimizar o nível de expressão de um ácido nucleico descrito nesse relatório descritivo. Como exemplo não limitante, quando o repressor é LacI, então a sequência de ácidos nucleicos de LacI e o promotor podem ser alterados de modo a aumentar o nível de síntese de LacI. Em uma modalidade, o códon de início do repressor de LacI pode ser alterado de GTG para ATG. Em outra modalidade, a sequência de SD pode ser alterada de AGGG para AGGA. Ainda em outra modalidade, os códons de lacl podem ser otimizados de acordo com o uso de códons para proteínas altamente sintetizadas de Salmonella. Em uma modalidade adicional, o códon de início de lacl pode ser alterado, a sequência de SD pode ser alterada e os códons de lacl podem ser otimizados.

[084] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que está localizado em um plasmídeo ou vetor. Como usado nesse relatório descritivo, o termo vetor se refere a uma unidade de ácido nucleico que se replica autonomamente. A presente revelação pode ser praticada com qualquer tipo conhecido de vetor, incluindo vetores virais, de cosmídeos, de fagomídeos e de plasmideos.

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37/242 tipo de vetor mais preferido é um vetor de plasmídeo. Em algumas modalidades, o plasmídeo ou vetor é um plasmídeo de alta cópia. Em algumas modalidades, o plasmídeo ou vetor é um plasmídeo ou vetor de baixa cópia.

[085] Como é bem conhecido na técnica, plasmídeos e outros vetores podem possuir uma ampla variedade de promotores, múltiplas sequências de clonagem, terminadores da transcrição etc., e vetores podem ser selecionados de modo a controlar o nível de expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno por controle do número de cópia relativo do vetor. Em alguns casos nos quais o vetor pode codificar uma adesina localizada na superfície como o antígeno, ou um antígeno capaz de estimular imunidade de célula T, pode ser preferível usar um vetor com um número de cópia baixo como, por exemplo, pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez cópias por célula bacteriana. Um exemplo não limitante de um vetor de número de cópia baixo pode ser um vetor que compreende a ori de pSClOl.

[086] Em algumas modalidades, o plasmídeo compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um gene de aspartato-semialdeído desidrogenase (por exemplo, asdA). Esses plasmídeos podem ser usados vantajosamente para complementar uma bactéria que compreende um gene de aspartato-semialdeído desidrogenase (por exemplo, asdA). Em algumas modalidades, o plasmídeo é selecionado do grupo que consiste em pYA3342, pYA3337 e pYA3332.

[087] Em outros casos, um vetor com número de cópia intermediário pode ser ótimo para indução de respostas imunes desejadas. Por exemplo, um vetor com número de cópia

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38/242 intermediário pode ter pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 cópias por célula bacteriana. Um exemplo não limitante de um vetor com número de cópia intermediário pode ser um vetor que compreende a ori de pl5A.

Ainda em outros casos, um vetor com número de cópia alto pode ser ótimo para a indução de respostas de anticorpos máximas. Um vetor com número de cópia alto pode ter pelo menos 31, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 cópias por célula bacteriana. Em algumas modalidades, um vetor com número de cópia alto pode ter pelo menos 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 ou 400 cópias por célula bacteriana. Exemplos não limitantes de vetores com número de cópia alto podem incluir um vetor que compreende a ori de pBR ou a ori de pUC.

[088] Adicionalmente, o número de cópia do vetor pode ser aumentado por seleção de mutações que aumentam o número de cópia do plasmídeo. Essas mutações podem ocorrer no cromossomo bacteriano, mas têm maior probabilidade de ocorrer no vetor de plasmídeo.

[089] De preferência, os vetores usados nesse relatório descritivo não compreendem marcadores de resistência antibiótica para selecionar quanto à manutenção do vetor.

[090] Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos descritas nesse relatório descritivo estão ligadas operacionalmente a um promotor. Promotores para uso nas modalidades descritas nesse relatório descritivo são conhecidos na técnica. Aqueles habilitados na técnica reconheceríam que a seleção de um repressor dita, em parte, a seleção do promotor a ser usado para regular a expressão

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39/242 de um ácido nucleico descrito nesse relatório descritivo. Por exemplo, se o repressor é LacI, então o promotor pode ser selecionado do grupo que consiste em promotores responsivos a LacI, por exemplo, Ptrc, Piac, PT?iac e Ptac Se o repressor é C2, então o promotor pode ser selecionado do grupo que consiste em promotores responsivos a C2, por exemplo, promotores Pl e Pr P22. Se o repressor é Cl, então o promotor pode ser selecionado do grupo que consiste em promotores responsivos a Cl, por exemplo, promotores Pl e Pr λ.

[091] Em cada modalidade desse relatório descritivo, o promotor regula a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, o promotor compreende uma sequência reguladora controlada por um repressor, de modo que a expressão da sequência de ácidos nucleicos seja reprimida quando o repressor é sintetizado (por exemplo, durante crescimento in vitro da bactéria), mas a expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno é elevada quando o repressor não é sintetizado (por exemplo, in vivo) . De um modo geral, a concentração do repressor diminuirá com cada divisão celular após cessar a expressão do gene que codifica o repressor. Em algumas modalidades, a concentração do repressor diminui, de modo que níveis elevados de expressão da sequência de ácidos nucleicos que está sendo regulada são obtidos após cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 divisões da bactéria. Em uma modalidade exemplar, a concentração do repressor diminui o suficiente para permitir a expressão em nível elevado da sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno após cerca de 5 divisões da bactéria in vivo.

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[092] Em certas modalidades, o promotor pode compreender outros elementos reguladores. Por exemplo, o promotor pode compreender lacO se o repressor é LacI. Isso é o caso com o promotor de lipoproteina Pippiaco que é regulado por LacI, na medida em que possui o domínio de ligação a LacI lacO. Em uma modalidade, o repressor é um repressor de LacI e o promotor é Ptrc·

[093] Em algumas modalidades, a expressão da sequência de ácidos nucleicos regulada por um repressor é reprimida in vivo. Ά expressão pode ser reprimida ou parcialmente reprimida quando ela é cerca de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, ou ainda menos do que 1% da expressão sob condições não reprimidas. Dessa forma, embora o nível de expressão sob condições de repressão completa possa ser excessivamente baixo, é provável que ele seja detectável usando métodos muito sensíveis, na medida em que a repressão nunca pode ser absoluta.

[094] Inversamente, a expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica o antígeno deve ser alta quando a expressão do repressor é reprimida. Por exemplo, se o repressor não é expresso durante o crescimento da bactéria recombinante em um hospedeiro, a expressão do ácido nucleico sob o controle do repressor será alta. Como usado nesse relatório descritivo, o termo expressão em nível alto se refere à expressão que é suficientemente forte para provocar uma resposta imune ao antígeno. Consequentemente, o número de cópia que se correlaciona com a expressão em nível alto pode e irá variar, dependendo do antígeno e do tipo de resposta imune desejada. Métodos para determinar se um antígeno provoca uma resposta imune como, por exemplo, por

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41/242 medição dos níveis de anticorpo ou populações de células T antígeno-dependentes ou níveis de citocina antígenodependentes, são conhecidos na técnica, e métodos de medição dos níveis de expressão de sequências que codificam antígenos por medição dos níveis de mRNA transcritos ou por quantificação do nível de expressão de uma proteína, também são conhecidos na técnica.

[095] Em cada uma das modalidades acima, uma bactéria recombinante capaz de expressão regulada também pode ser atenuada. O termo atenuada se refere ao estado da bactéria no qual a bactéria foi enfraquecida em relação à sua aptidão do tipo selvagem por alguma forma de manipulação recombinante ou física. Isso inclui a alteração do genótipo da bactéria para reduzir sua habilidade para causar doença. No entanto, a habilidade da bactéria para colonizar o intestino (no caso de Salmonella) e induzir respostas imunes não é, preferivelmente, substancialmente comprometido.

[096] Em uma modalidade exemplar, uma bactéria recombinante pode ser atenuada como descrito acima. Nesse caso, tanto a atenuação regulada quanto a expressão regulada de uma sequência codificadora de antígeno podem ser dependentes de um sistema regulável por açúcar. Consequentemente, a concentração de açúcar (por exemplo, arabinose) necessária para expressão ótima da sequência codificadora de antígeno regulada pode não ser a mesma que a concentração para expressão ótima de atenuação. Em uma modalidade exemplar, a concentração de arabinose para a otimização tanto de atenuação regulada quanto de expressão regulada de sequências que codificam antígeno será substancialmente a mesma.

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[097] Consequentemente, o promotor e/ou a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de atenuação pode ser modificada para otimizar o sistema. Métodos de modificação são detalhados acima. Resumidamente, por exemplo, a sequência de ligação ao ribossomo de SD pode ser alterada, e/ou o códon de início pode ser alterado de ATG para GTG para as sequências de ácidos nucleicos fur e phoPQ, de modo que os níveis de produção de Fur e PhoPQ sejam ótimos tanto para o fenótipo de atenuação regulada quanto para expressão regulada, quando são desenvolvidas cepas com certa concentração de arabinose. Aqueles habilitados na técnica observarão que outras sequências de ácidos nucleicos, além de fur e phoPQ, também podem ser alteradas como descrito nesse relatório descritivo em combinação com outros protocolos bem conhecidos. Além disso, essas sequências de ácidos nucleicos atenuantes podem ser reguladas por outros sistemas com o uso de protocolos bem estabelecidos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, elas podem ser reguladas usando promotores dependentes da adição de maltose, ramnose ou xilose, ao invés de arabinose.

[098] cj0034c - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0034c (por exemplo, um gene cj0034c de C. jejuni).

[099] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0034c está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0034c está localizado em um cromossomo da bactéria.

[100] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0034c de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

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ATGAAAACAAATAATATCTTTATGGCTTTAGCCATAGTTTTGGCAAGTTTGATTCTAGC TTTTGGATTTAACAAGGCTTTAAGTGATTTTAAAACACTTGAAAGAAGTGTAAGTGTAA AGGGTTTAAGTCAAAAAGAAGTCGAAGCGGATACTTTGATACTTCCTATAAAATTCACA AGAT CAAACAACAAT C T TACAAAT T TATAC GAAGAAC TAGAACAAGATAAAGAAAATAT CATCAAATTTTTAGAAAAACAAGGCATAAAAGAAGATGAGATCAGCTACAACTCGCCAA ATATCATAGATCGTTTAAGCGATCCTTATAGCAACGACACTCAAGCTGCATACCGATAC ATAGGCACTGCGAATTTACTCATCTATACTCAAAATGTAAAGCTTGGAAAAAGCATACT AGAAAACATTTCAAGTCTTGCAAAATTTGGTATAGTAACAAAAATCGATGATTATGATA TAGAATAC CTTTACACCAAGC TAAAT GATATAAAAC CACAAAT GATAGAAGAAG CAAC G CTCAATGCTAGAAATGCAGCGATAAAATTCGCACAAGACTCAAACAGCCATCTAGGCAA GATAAAAAAGGCTTCTCAAGGACAATTTAGCATTAGCAACAGAGATAAAAACACCCCTT ATATCAAAACCATAAGAGTGGTTTCTACTATAGAATACTACTTAAAAGACTGA (ID . DE SEQ. N°: 3)

[101] A sequência de aminoácidos da proteína Cj0034c codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N°: 3 é fornecida abaixo:

MKTNNIFMALAIVLASLILAFGFNKALSDFKTLERSVSVKGLSQKEVEADTLILPIKFT RSNNNLTNLYEELEQDKENIIKFLEKQGIKEDEISYNSPNIIDRLSDPYSNDTQAAYRY IGTANLLIYTQNVKLGKSILENISSLAKFGIVTKIDDYDIEYLYTKLNDIKPQMIEEAT LNARNAAIKFAQDSNSHLGKIKKASQGQFSISNRDKNTPYIKTIRWSTIEYYLKD (ID. DE SEQ. N°: 4)

[102] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0034c de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°:

3) . Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0034c, em que o gene cj0034c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos

84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos

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95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 3. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0034c, em que o gene cj0034c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 3.

[103] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0034c, em que a referida proteína Cj0034c compreende uma

sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%, pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos 84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%, pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos 95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 4. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0034c, em que a referida proteína

Cj0034c compreende uma sequência	de aminoácidos	que é	pelo
menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,
pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos
86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo
menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,

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pelo menos	94%, pelo menos	95%,	pelo menos 96%,	pelo menos
97%, pelo	menos 98%, pelo	menos	99%	ou 100%	homóloga à
sequência	de aminoácidos do	ID.	DE	SEQ.	N° : 4 .

[104] cj0113 -Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0113 (por exemplo, um gene cj0113 de C. jejuni).

[105] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0113 está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0113 está localizado em um cromossomo da bactéria.

[106] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0113 de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGAAAAAAGTTTTATTGAGTTCATTGGTTGCGGTGTCTTTGTTAAGCACAGGTTTGTT TGCTAAAGAATATACTTTAGATAAAGCACATACAGATGTAGGTTTTAAAATCAAACATT TACAAATTAGCAATGTAAAAGGAAATTTCAAAGATTATTCTGCGGTGATTGATTTTGAT CCTGCGAGTGCTGAATTTAAAAAGCTTGATGTAACTATAAAAATCGCATCTGTAAATAC AGAAAAT CAAACAAGAGATAAT CACTTACAACAAGATGATTTTTT CAAAG CAAAAAAAT ATCCTGATATGACTTTTACAAT GAAAAAATAT GAAAAAAT C GATAAT GAAAAAG G CAAA ATGACAGGAACTTTAACTATAGCTGGAGTTTCTAAAGATATCGTTTTAGATGCTGAAAT CGGCGGTGTAGCTAAAGGCAAAGATGGAAAAGAAAAAATAGGATTTTCTTTAAATGGAA AAAT CAAAC GCTCTGATTT TAAAT TTGCAACAAGTACTTCAACTATTACTTTAAGTGAT GATATTAATTTAAATATCGAAGTTGAAGCGAACGAAAAATAA (ID. DE SEQ. N°: 5)

[107] A sequência de aminoácidos da proteína 0mpl8 codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N°: 5 é fornecida abaixo:

MKKVLLSSLVAVSLLSTGLFAKEYTLDKAHTDVGFKIKHLQISNVKGNFKDYSAVIDFD PASAEFKKLDVTIKIASVNTENQTRDNHLQQDDFFKAKKYPDMTFTMKKYEKIDNEKGK MTGTLTIAGVSKDIVLDAEIGGVAKGKDGKEKIGFSLNGKIKRSDFKFATSTSTITLSD

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DINLNIEVEANEK (ID. DE SEQ. N°: 6)

[108] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0113 de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 5) . Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0113, em que o gene cj0113 compreende uma sequência

de ácidos	nucleicos	que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,
pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos
84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo
menos	88%,	pelo	menos 89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,
pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos
95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo

menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 5. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0113, em que o gene cj0113 compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 5.

[109] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

Ompl 8	, em	que	a referida	prot	eína	Ompl 8	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo	menos	75%,	pelo menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos 86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo

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47/242 menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 6. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína 0mpl8, em que a referida proteína 0mpl8

compreende	uma	sequência de aminoácidos que é	pelo	menos
75%, pelo	menos	80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%,	pelo
menos 83%,	pelo	menos 84%, pelo menos 85%, pelo	menos	86%,
pelo menos	87%,	pelo menos 88%, pelo menos 89%,	pelo	menos
90%, pelo	menos	91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%,	pelo
menos 94%,	pelo	menos 95%, pelo menos 96%, pelo	menos	97%,
pelo menos	98%,	pelo menos 99% ou 100% homóloga	à sequência
de aminoácidos c	io ID. DE SEQ. N°: 6.
[110] cj0168c - Em algumas modalidades,	a bactéria

recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0168c (por exemplo, um gene cj0168c de C. jejuni).

[111] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0168c está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0168c está localizado em um cromossomo da bactéria.

[112] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0168c de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGAAAAAAGTTGTACTAATCTCAGCATTACTAGGTGCTTTCGCAGCTAATGTTTTTGC AGCTAATACTCCAAGCGATGTAAATCAAACACATACAAAAGCTAAAGCTGATAAAAAAC ATGAAGCTAAAACTCACAAAAAAACAAAAGAGCAAACACCAGCTCAATAA (ID. DE SEQ. N°: 7)

[113] A sequência de aminoácidos da proteína Cj0168c codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N°: 7 é fornecida abaixo:

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MKKWLISALLGAFAANVFAANTPSDVNQTHTKAKADKKHEAKTHKKTKEQTPAQ (ID. DE SEQ. N°: 8)

[114] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0168c de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 7) . Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0168c, em que o gene cj0168c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos

84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos

95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 7. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0168c, em que o gene cj0168c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 7.

[115] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0168c, em que a referida proteína Cj0168c compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 55/261

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91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 8. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0168c, em que a referida proteína

Cj0168c compreende uma sequência	de aminoácidos	que é	pelo
menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,
pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos
86%,	pelo	menos	87%,	pelo :	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo
menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,
pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos
97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos 99% ou	100%	homóloga à

sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 8.

[116] cj0248 - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0248 (por exemplo, um gene cj0248 de C. jejuni).

[117] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0248 está localizado em um plasmideo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0248 está localizado em um cromossomo da bactéria.

[118] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0248 de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGATTGGAGATATGAATGAGCTTTTATTAAAAAGCGTTGAAGTATTGCCACCTTTACC TGATACTGTAAGTAAGTTAAGAAAATATGTGAGCGAGGCTAATTCAAATATAGAAACTA TGAAAGTTGCTGAAATCATTTCAAGCGATCCGTTGATGACGGCTAAGCTTTTGCAATTA G CAAAT TCTCCTTATTATGGTTT TACAAGAGAAAT TACAAC CATAAAT CAAGTGATTAC TTTATTAGGCGTTGGTAATATCATCAATATAGTTATGGCTGACTCCATTAGAGATAATT TTAAAATAGACGTTTCACCTTATGGTTTAAATACTCAAAATTTTTTAAAAACGTGCAAT

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 56/261

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GAAGAGGCAACTTTTATCGCAAATTGGCTTAATGATGAAGATAAAAAACTTTCTCATCT TTTAGTTCCTTGTGCAATGCTTTTAAGGCTTGGTATTGTTATTTTTTCAAATTTTCTTA TACAAAAT CATAAGGATAAGGATTTTTTAGCTTTTT TAAATAAAAAT GAAAAT C T T G C T TTAGCGGAGAATGAATTTTTAGGCGTAGATCATATTTCTTTCTTGGGATTTTTGTTACA TCGTTGGAATTTTGATGATGTTTTGATTGAAAGTATATGTTTTGTTCGCACTCCTCATG CTGCTCGCGAAAAAGTGAAAAAATCCGCTTATGCTTTAGCAATAACAGATCATCTTTTT GCTCCGCATGATGGTTCTTCTCCATTTAACGCAAAAGCTGCAGTTGCTTTACTTAAAGA GG CAAAAAC T CAAG GAAT TAATTTTGATT TAAACAAT CTTTTATCTAAGCTTCCTAACA AAGCTAAGGAAAATTTAAACAAAGAAGATTAA (ID. DE SEQ. N°: 9)

[119] A sequência de aminoácidos da proteína Cj0248 codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N°: 9 é fornecida abaixo:

MIGDMNELLLKSVEVLPPLPDTVSKLRKYVSEANSNIETMKVAEIISSDPLMTAKLLQL ANSPYYGFTREITTINQVITLLGVGNIINIVMADSIRDNFKIDVSPYGLNTQNFLKTCN EEATFIANWLNDEDKKLSHLLVPCAMLLRLGIVIFSNFLIQNHKDKDFLAFLNKNENLA LAENEFLGVDHISFLGFLLHRWNFDDVLIESICFVRTPHAAREKVKKSAYALAITDHLF APHDGSSPFNAKAAVALLKEAKTQGINFDLNNLLSKLPNKAKENLNKED (ID. DE SEQ. N°: 10)

[120] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0248 de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 9) . Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0248, em que o gene cj0248 compreende uma sequência

de ácidos	nucleicos	que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,
pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos
84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo
menos	88%,	pelo	menos 89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,
pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos
95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo

menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 9. Em algumas modalidades, o ácido

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 57/261

51/242 nucleico compreende um gene cj0248_r em que o gene cj0248 compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 9.

[121] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0248, em que a referida proteína Cj0248 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos

80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0248, em que a referida proteína

Cj0248 compreende uma	sequência	de aminoácidos	que é	pelo
menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos 81%,	pelo	menos	82%,
pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo menos	85%,	pelo	menos
86%,	pelo	menos	87%,	pelo :	menos	88%, pelo	menos	; 89%,	pelo
menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos 92%,	pelo	menos	93%,
pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo menos	96%,	pelo	menos
97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos 99% ou	100%	homóloga à
sequência	de aminoácidos do	ID .	DE SEQ. N°:	10 .

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 58/261

52/242

[122] cjO289c - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0289c (por exemplo, um gene cj0289c de C. jejuni) .

[123] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0289c está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0289c está localizado em um cromossomo da bactéria.

[124] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0289c de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGAAAAAAATTATTACTTTATTTGGTGCATGTGCCTTAGCTTTTAGTATGGCAAATGC AGACGTGAACCTGTACGGCCCGGGCGGCCCGCACACGGCCCTGAAAGACATCGCAAACA AATATAGCGAAAAAACCGGCGTGAAAGTGAACGTGAACTTTGGCCCGCAGGCGACCTGG TTTGAAAAAGCGAAAAAAGACGCGGACATCCTGTTTGGCGCGTCAGACCAGTCCGCTCT GGCTATCGCGAGCGACTTTGGCAAAGACTTTAACGTGAGCAAAATCAAACCGCTGTATT TTCGTGAAGCCATCATCCTGACCCAGAAAGGCAACCCGCTGAAAATCAAAGGCCTGAAA GACCTGGCGAACAAAAAAGTGCGTATCGTGGTGCCGGAAGGCGCGGGCAAAAGCAACAC CTCTGGCACCGGCGTGTGGGAAGACATGATCGGCCGTACCCAGGACATCAAAACCATCC AGAACTTTCGTAACAACATCGTGGCCTTTGTGCCGAACAGCGGTAGCGCGCGTAAACTG TTCGCGCAGGACCAGGCCGACGCTTGGATCACTTGGATCGACTGGTCAAAAAGCAACCC GGACATCGGCACTGCCGTGGCTATCGAAAAAGACCTGGTGGTGTATCGTACTTTTAACG TGATCGCGAAAGAAGGCGCGAGCAAAGAAACACAGGACTTTATCGCTTATCTGAGTTCT AAAGAAGCGAAAGAAATCTTTAAAAAATACGGCTGGCGTGAATAA (ID. DE SEQ. N°: 11)

[125] A sequência de aminoácidos da proteína Peb3 codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 11 é fornecida abaixo:

MKKIITLFGACALAFSMANADVNLYGPGGPHTALKDIANKYSEKTGVKVNVNFGPQATW FEKAKKDADILFGASDQSALAIASDFGKDFNVSKIKPLYFREAIILTQKGNPLKIKGLK DLANKKVRIWPEGAGKSNTSGTGVWEDMIGRTQDIKTIQNFRNNIVAFVPNSGSARKL

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 59/261

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FAQDQADAWITWIDWSKSNPDIGTAVAIEKDLWYRTFNVIAKEGASKETQDFIAYLSS KEAKEIFKKYGWRE (ID. DE SEQ. N°: 12)

[126] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0289c de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 11). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0289c, em que o gene cj0289c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 11. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0289c, em que o gene cj0289c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 11.

[127] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Peb3, em que a referida proteína Peb3 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 60/261

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91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Peb3, em que a referida proteína Peb3 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,

pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12.

[128] cj0365c - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0365c (por exemplo, um gene cj0365c de C. jejuni).

[129] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0365c está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0365c está localizado em um cromossomo da bactéria.

[130] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0365c de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGAATAAAATAATTTCAATTAGTGCTATAGCAAGTTTTACTCTTTTGATTTCAGCTTG CTCTTTAAGTC CAAAT T TAAATAT T C C C GAAG CAAAC TATAGCATTGATAATAAGCTTG GAGCCTTATCTTGGGAAAAAGAAAACAATAGCTCTATCACAAAAAATTGGTGGAAAGAC T T T GAT GAT GAAAAT T TAAATAAAG TGGTTGATTTAGCACT TAAAAATAATAAT GAT T T AAAACTTGCTTTCATACACATGGAACAAGCTGCTGCTCAATTAGGTATAGATTTTAGCA GTTTGTTGCCAAAATTTGATGGTAGCGCAAGCGGAAGTCGTGCAAAAACAGCTATAAAT

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 61/261

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GCTCCAAGCAATCGAACTGGGGAAGTAAGTTACGGTAATGATTTTAAAATGGGACTTAA TTTAAGCTATGAAATCGATCTTTGGGGAAAATATCGCGATACATATCGCGCCTCAAAAT CAGGCTTTAAAGCAAGTGAGTATGATTATGAAGCTGCAAGACTTTCTGTTATTTCAAAT ACAGTTCAAACTTATTTTAATCTTGTAAATGCTTATGAAAATGAAAATGCTCTTAAAGA AGCCTATAAATCTGCAAAAGAAATTTATAGGATTAATGATGAAAAATTTCAAGTTGGTG CTGTAGGTGAATATGAACTTGCTCAAGCAAGAGCCAACTTAGAAAGTATGGCTTTGCAA TATAAT GAAG CAAAG T TAAATAAAGAAAAT TAC C T TAAAG C T T TAAAAAT TTTAACTTC AAAT GATT TAAAT GACATACTT TACAAAAAT CAAAG CTATCAAGTTTTTAATCT TAAAG AATTTGACATTCCAACTGGAATTTCAAGTACCATCTTGCTTCAACGTCCAGATATTGGC TCTTCTTTAGAAAAATTAACTCAGCAAAATTATCTTGTTGGAGTAGCTCGCACGGCTTT CTTACCTAGCCTTTCTTTAACAGGATTATTGGGATTTGAAAGCGGGGATTTAGATACCT TGGTTAAAGGAGGTTCTAAGACTTGGAATATAGGTGGAAACTTTACTCTGCCTATTTTT CATTGGGGTGAAATTTACCAAAATGTAAATTTAGCCAAGCTTAATAAAGATGAAGCTTT TGTAAATTATCAAAATACTTTGATTACTGCTTTTGGAGAAATTCGCTATGCTTTAGTAG CTAGAAAAACTATACGCTTACAATACGATAATGCACAAGCAAGCGAACAATCTTACAAA AGAAT C TAT GAAAT TGC TAAAGAAC GCTATGATATAG GAGAAAT G T C T T T G CAAGAT TA TTTAGAGGCACGTCAAAATTGGCTTAATGCTGCGGTTGCTTTTAATAATATTAAATATT CTTATGCCAATTCCATAGTAGATGTAATCAAAGCATTTGGTGGAGGATTTGAGCAAAGT GAAGATAC GAG TAAAAATATAAAAGAAGAAT CAAAAAAT TTAGATATGTCTTTTAGAGA ATAG (ID. DE SEQ. N°: 13)

[131] A sequência de aminoácidos da proteína CmeC codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 13 é fornecida abaixo:

MNKIISISAIASFTLLISACSLSPNLNIPEANYSIDNKLGALSWEKENNSSITKNWWKD FDDENLNKWDLALKNNNDLKLAFIHMEQAAAQLGIDFSSLLPKFDGSASGSRAKTAIN APSNRTGEVSYGNDFKMGLNLSYEIDLWGKYRDTYRASKSGFKASEYDYEAARLSVISN TVQTYFNLVNAYENENALKEAYKSAKEIYRINDEKFQVGAVGEYELAQARANLESMALQ YNEAKLNKENYLKALKILTSNDLNDILYKNQSYQVFNLKEFDIPTGISSTILLQRPDIG SSLEKLTQQNYLVGVARTAFLPSLSLTGLLGFESGDLDTLVKGGSKTWNIGGNFTLPIF HWGEIYQNVNLAKLNKDEAFVNYQNTLITAFGEIRYALVARKTIRLQYDNAQASEQSYK

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 62/261

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RIYEIAKERYDIGEMSLQDYLEARQNWLNAAVAFNNIKYSYANSIVDVIKAFGGGFEQS EDTSKNIKEESKNLDMSFRE (ID. DE SEQ. N°: 14)

[132] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0365c de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 13). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj 03 65c, em que o gene cj0365c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 13. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0365c, em que o gene cj0365c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 13.

[133] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína CmeC, em que a referida proteína CmeC compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 63/261

57/242

91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 14. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína CmeC, em que a referida proteína CmeC compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,

pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 14.

[134] cj0404 - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0404 (por exemplo, um gene cj0404 de C. jejuni).

[135] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0404 está localizado em um plasmideo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0404 está localizado em um cromossomo da bactéria.

[136] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0404 de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

AT G GAAAAT CAAAAAAAT GAAT TTGATGATATTATTT TAGAAAAAAG TAATAAAAG T GA AAAAGTAAAAAAAATTCTTTTACGAGTTATTGCTTTAGTTATTTTGTTTTTAGCTATCA TGATAGTTATGAAGCTTATTAATGGTAGTGGTGATGAAAATACGCAAAATCAAAGTGTA TTGCCAAGT GAAC CTATAGCAACTCAAGACAATAACAATGATACTTCTTTT GAAAG TAT GCCAATTACAGATAATACTTCAG CAGAAGAT CAATTTGAGGCAT TAAGAAAACAAT T T C AAGAT GAACAAAATACAAC T CAAAATACAACAAC CTCTAGTT CAAATAACAAT GATAC T

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 64/261

58/242

ACAAATTTTGCTATGCCTGATCAAGAAGTTCCAGCAGAACCAACAGCAACTACTTCAGC AAATAC CACTCCACAAGCAAGTACTCC TAAACAAGAAG TAACACAAAC T G CAAAAT C TA AAGAAGAAGCAAAAAAACAAACAGCTGTAAAAAAAGAAAAAGAAAGTGCAAAACAAACC CCTAAAAAAGAACAAAATGCAAATGATTTATTTAAAAATGTTGATGCTAAACCTGTACA TCCAAGTGGTTTAGCATCGGGTATTTATGTGCAAATTTTCTCAGTAAGTAATTTGGATC AAAAATCAAAAGAACTTGCTTCTGTAAAGCAAAAAGGTTATGATTATAAACTTTATAAA ACTACAGTTGGAAGTAAAGAAATTACCAAGGTTTTAATAGGACCATTTGAAAAGGCAGA TATTGCAGCAGAACTTGCTAAAATCCGTAAGGATATTGCAAAAGATGCTTTTTCTTTTA CTTTAAAATGA (ID. DE SEQ. N°: 15)

[137] A sequência de aminoácidos da proteína Cj0404 codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 15 é fornecida abaixo:

MENQKNEFDDIILEKSNKSEKVKKILLRVIALVILFLAIMIVMKLINGSGDENTQNQSV LPSEPIATQDNNNDTSFESMPITDNTSAEDQFEALRKQFQDEQNTTQNTTTSSSNNNDT TNFAMPDQEVPAEPTATTSANTTPQASTPKQEVTQTAKSKEEAKKQTAVKKEKESAKQT PKKEQNANDLFKNVDAKPVHPSGLASGIYVQIFSVSNLDQKSKELASVKQKGYDYKLYK TTVGSKEITKVLIGPFEKADIAAELAKIRKDIAKDAFSFTLK (ID. DE SEQ. N°:

16)

[138] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0404 de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 15). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0404, em que o gene cj0404 compreende uma sequência

de ácidos	nucleicos	que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,
pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos
84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo
menos	88%,	pelo	menos 89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,
pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos
95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo

menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 15. Em algumas modalidades, o ácido

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 65/261

59/242 nucleico compreende um gene cj0404_r em que o gene cj0404 compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 15.

[139] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0404, em que a referida proteína Cj0404 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos

80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 16. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0404, em que a referida proteína

Cj0404 compreende uma	sequência	de aminoácidos	que é	pelo
menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos 81%,	pelo	menos	82%,
pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo menos	85%,	pelo	menos
86%,	pelo	menos	87%,	pelo :	menos	88%, pelo	menos	; 89%,	pelo
menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos 92%,	pelo	menos	93%,
pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo menos	96%,	pelo	menos
97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos 99% ou	100%	homóloga à
sequência	de aminoácidos do	ID .	DE SEQ. N°:	16.

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 66/261

60/242

[140] cjO42O- Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0420 (por exemplo, um gene cj0420 de C. jejuni).

[141] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0420 está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0420 está localizado em um cromossomo da bactéria.

[142] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0420 de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGAAAAAAGTTTTATTGAGTTCATTGGTTGCGGTGTCTTTGTTAAGCACAGGTTTGTT TGCTAAAGAATATACTTTAGATAAAGCACATACAGATGTAGGTTTTAAAATCAAACATT TACAAATTAGCAATGTAAAAGGAAATTTCAAAGATTATTCTGCGGTGATTGATTTTGAT CCTGCGAGTGCTGAATTTAAAAAGCTTGATGTAACTATAAAAATCGCATCTGTAAATAC AGAAAAT CAAACAAGAGATAAT CACTTACAACAAGATGATTTTTT CAAAG CAAAAAAAT ATCCTGATATGACTTTTACAAT GAAAAAATAT GAAAAAAT C GATAAT GAAAAAG G CAAA ATGACAGGAACTTTAACTATAGCTGGAGTTTCTAAAGATATCGTTTTAGATGCTGAAAT CGGCGGTGTAGCTAAAGGCAAAGATGGAAAAGAAAAAATAGGATTTTCTTTAAATGGAA AAAT CAAAC GCTCTGATTT TAAAT TTGCAACAAGTACTTCAACTATTACTTTAAGTGAT GATATTAATTTAAATATCGAAGTTGAAGCGAACGAAAAATAA (ID. DE SEQ. N°:

17)

[143] A sequência de aminoácidos da proteína Cj0420 codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 17 é fornecida abaixo:

MKKVLLSSLVAVSLLSTGLFAKEYTLDKAHTDVGFKIKHLQISNVKGNFKDYSAVIDFD PASAEFKKLDVTIKIASVNTENQTRDNHLQQDDFFKAKKYPDMTFTMKKYEKIDNEKGK MTGTLTIAGVSKDIVLDAEIGGVAKGKDGKEKIGFSLNGKIKRSDFKFATSTSTITLSD DINLNIEVEANEK (ID. DE SEQ. N°: 18)

[144] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0420 de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°:

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 67/261

61/242

17). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0420, em que o gene cj0420 compreende uma sequência

de ácidos	nucleicos	que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,
pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos
84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo
menos	88%,	pelo	menos 89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,
pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos
95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo

menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 17. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0420, em que o gene cj0420 compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 17.

[145] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0420, em que a referida proteína Cj0420 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos

80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 18. Em algumas modalidades, o ácido

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 68/261

62/242 nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0420, em que a referida proteína

Cj0420 compreende uma	sequência	de aminoácidos	que é	pelo
menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos 81%,	pelo	menos	82%,
pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo menos	85%,	pelo	menos
86%,	pelo	menos	87%,	pelo :	menos	88%, pelo	menos	; 89%,	pelo
menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos 92%,	pelo	menos	93%,
pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo menos	96%,	pelo	menos
97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos 99% ou	100%	homóloga à
sequência	de aminoácidos do	ID .	DE SEQ. N°:	18 .

[146] cj0427- Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0427 (por exemplo, um gene cj0427 de C. jejuni).

[147] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0427 está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0427 está localizado em um cromossomo da bactéria.

[148] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0427 de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGATGGCTAAATTTAGAATTCAATACAGCGCAGGTTTTGGGCACTATACGCAAAATCA CAAGGGTTTTGGACCTACGATTTATATAGAAGAGGTCGTAGAGTTTGATAATGGCAAGG ATTATTTTGACTATATAGATTTT TATAAAAC T TAT T CAAAGAG CGATGATACTTATTTT CATATCAGTTTTT TAGAAGATAGAC C T C TAAG C GATAAAGAAAT CACCATTCGCAATGA ATACCGCAAAATGCGTGATGAAAACTGTAAAAAAGCCAAGGAGGAATTTATAGCCAACA ATGAGCTTGATGTGGAGCATTTGCCTACTCACCATGATTAA (ID. DE SEQ. N°: 19)

[149] A sequência de aminoácidos da proteína Cj0427 codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 19 é fornecida abaixo:

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 69/261

63/242

MMAKFRIQYSAGFGHYTQNHKGFGPTIYIEEWEFDNGKDYFDYIDFYKTYSKSDDTYF HISFLEDRPLSDKEITIRNEYRKMRDENCKKAKEEFIANNELDVEHLPTHHD (ID. DE SEQ. N°: 20)

[150] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0427 de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 19). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0427, em que o gene cj0427 compreende uma sequência

de ácidos	nucleicos	que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,
pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos
84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo
menos	88%,	pelo	menos 89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,
pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos
95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo

menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 19. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0427, em que o gene cj0427 compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 19.

[151] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0427, em que a referida proteína Cj0427 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%,

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 70/261

64/242 pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 20. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0427, em que a referida proteína

Cj0427 compreende uma	sequência	de aminoácidos	que é	pelo
menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos 81%,	pelo	menos	82%,
pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo menos	85%,	pelo	menos
86%,	pelo	menos	87%,	pelo :	menos	88%, pelo	menos	; 89%,	pelo
menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos 92%,	pelo	menos	93%,
pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo menos	96%,	pelo	menos
97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos 99% ou	100%	homóloga à
sequência	de aminoácidos do	ID .	DE SEQ. N°:	20 .

[152] cj0428- Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0428 (por exemplo, um gene cj0428 de C. jejuni).

[153] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0428 está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0428 está localizado em um cromossomo da bactéria.

[154] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0428 de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGCAGGTAAATTATAGAACGATTAGCTCGTATGAATACGATGCTATTAGTGGTCAGTA TAAACAGGTGGATAAACAGATTGAAGATTATTCTTCATCTGGAGATTCTGATTTTATGG ATATGTTAAATAAGGCGGATGAGAAGTCAAGCGGAGATGCTTTAAATTCTAGCAGTAGT TTTCAAAGCAATGCGCAAAACTCAAATTCAAATTTAAGTAATTATGCTCAAATGTCAAA TGTTTACGCTTATCGTTTTAGACAAAATGAAGGCGAGCTGTCTATGAGAGCTCAAAGTG

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 71/261

65/242

CTAGCGTTCATAATGATCTTACACAACAAGGTGCAAATGAACAAAGTAAGAATAATACT

TTGTTAAATGATTTATTGAACGCAATTTAA (ID. DE SEQ. N°: 21)

[155] A sequência de aminoácidos da proteína Cj0428 codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 21 é fornecida abaixo:

MQVNYRTISSYEYDAISGQYKQVDKQIEDYSSSGDSDFMDMLNKADEKSSGDALNSSSS FQSNAQNSNSNLSNYAQMSNVYAYRFRQNEGELSMRAQSASVHNDLTQQGANEQSKNNT LLNDLLNAI (ID. DE SEQ. N°: 22)

[156] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0428 de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 21). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0428, em que o gene cj0428 compreende uma sequência

de ácidos	nucleicos	que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,
pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos
84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo
menos	88%,	pelo	menos 89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,
pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos
95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo

menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 21. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0428, em que o gene cj0428 compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 21.

[157] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 72/261

66/242 uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

Cj0428, em que a referida proteína Cj0428 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos

80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 22. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0428, em que a referida proteína

Cj0428 compreende uma	sequência	de aminoácidos	que é	pelo
menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos 81%,	pelo	menos	82%,
pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo menos	85%,	pelo	menos
86%,	pelo	menos	87%,	pelo :	menos	88%, pelo	menos	; 89%,	pelo
menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos 92%,	pelo	menos	93%,
pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo menos	96%,	pelo	menos
97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos 99% ou	100%	homóloga à
sequência	de aminoácidos do	ID .	DE SEQ. N°:	22 .

[158] cj0588- Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0588 (por exemplo, um gene cj0588 de C. jejuni).

[159] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0588 está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0588 está localizado em um cromossomo da bactéria.

[160] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0588 de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 73/261

67/242

ATGCGTTTCGACTTCTTCGTGTCCAAACGTCTGAACATCAGCCGTAACAAAGCGCTGGA GCTGATCGAAAACGAAGAGATCCTGCTGAACGGCAAAAGCTTCAAAGCGTCCTTCGACG TGAAAAACTTCCTGGAAAACCTGAAAAAAACCCAGGACCTGAACCCGGAAGACATCCTG CTGGCGAACGAGCTGAAACTGGACCTGCTGAGCGAAATCTACGTGTCCCGTGCGGCGCT GAAAC T GAAAAAAT T C C T G GAAGAAAAC GACAT C GAAAT CAAACACAAAAAC T G T C T G G ACATCGGCTCCAGCACCGGCGGCTTCGTGCAGATCCTGCTGGAAAACCAGGCGCTGAAA ATCACCGCGCTGGACGTGGGCAGCAACCAGCTGCACCCGAGCCTGCGTGTGAACGAAAA AATCATCCTGCACGAAAACACCGACCTGCGTGCGTTCAAAAGCGAAGAAAAATTCGAAC TGGTGACCTGCGACGTGAGCTTCATCTCCCTGATCAACCTGCTGTACTACATCGACAAC CTGGCGCTGAAAGAAATCATCCTGCTGTTCAAACCGCAGTTCGAAGTGGGCAAAAACAT CAAACGTGACAAAAAAGGCGTGCTGAAAGACGACAAAGCGATCCTGAAAGCGCGTATGG ACTTCGAAAAAGCGTGCGCGAAACT (ID. DE SEQ. N°: 23)

[161] A sequência de aminoácidos da proteína TlyA codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 23 é fornecida abaixo:

MRFDFFVSKRLNISRNKALELIENEEILLNGKSFKASFDVKNFLENLKKTQDLNPEDIL LANELKLDLLSEIYVSRAALKLKKFLEENDIEIKHKNCLDIGSSTGGFVQILLENQALK ITALDVGSNQLHPSLRVNEKIILHENTDLRAFKSEEKFELVTCDVSFISLINLLYYIDN LALKEIILLFKPQFEVGKNIKRDKKGVLKDDKAILKARMDFEKACAKLGWLLKNTQKSS IKGKEGNVEYFYYYIKN (ID. DE SEQ. N°: 24)

[162] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0588 de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 23). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0588, em que o gene cj0588 compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 74/261

68/242 menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 23. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0588, em que o gene cj0588 compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 23.

[163] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

TlyA,	em	que	a referida	proteína	TlyA	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 24. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína TlyA, em que a referida proteína TlyA compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 75/261

69/242 pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 24.

[164] cj0921c - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0921c (por exemplo, um gene cj0921c de C. jejuni).

[165] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0921c está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0921c está localizado em um cromossomo da bactéria.

[166] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0921c de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGGTTTTTAGAAAATCTTTGTTAAAGTTGGCAGTTTTTGCTCTAGGTGCTTGTGTTGC ATTTAGCAATGCTAATGCAGCAGAAGGCAAACTGGAGTCCATCAAATCCAAAGGCCAGC TGATCGTGGGCGTGAAAAACGACGTGCCGCACTACGCTCTGCTGGACCAGGCAACCGGC GAAATCAAAGGCTTCGAAGTGGACGTGGCCAAACTGCTGGCTAAAAGCATCCTGGGGGA CGACAAAAAAATCAAACTGGTGGCAGTGAACGCCAAAACCCGTGGCCCGCTGCTGGACA ACGGCAGCGTGGACGCGGTGATCGCAACCTTCACCATCACCCCGGAGCGCAAACGTATC TATAACTTCTCCGAGCCGTATTATCAGGACGCTATCGGCCTGCTGGTTCTGAAAGAAAA AAAATATAAATCTCTGGCTGACATGAAAGGTGCAAACATCGGCGTGGCTCAAGCTGCAA CTACAAAAAAAGCTATCGGCGAAGCTGCTAAAAAAATCGGCATCGACGTGAAATTCAGC GAATTCCCGGACTATCCGAGCATCAAAGCTGCTCTGGACGCTAAACGTGTGGACGCGTT CTCTGTGGACAAATCCATCCTGCTGGGCTATGTGGACGACAAAAGCGAAATCCTGCCGG ACAGCTTCGAACCGCAGAGCTATGGCATCGTGACCAAAAAAGACGACCCGGCTTTCGCA AAATATGTGGACGACTTCGTGAAAGAACACAAAAACGAAATCGACGCTCTGGCGAAAAA ATGGGGCCTGTAA (ID. DE SEQ. N°: 25)

[167] A sequência de aminoácidos da proteína Pebl codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 25 é fornecida abaixo:

MVFRKSLLKLAVFALGACVAFSNANAAEGKLESIKSKGQLIVGVKNDVPHYALLDQATG

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 76/261

70/242

EIKGFEVDVAKLLAKSILGDDKKIKLVAVNAKTRGPLLDNGSVDAVIATFTITPERKRI YNFSEPYYQDAIGLLVLKEKKYKSLADMKGANIGVAQAATTKKAIGEAAKKIGIDVKFS EFPDYPSIKAALDAKRVDAFSVDKSILLGYVDDKSEILPDSFEPQSYGIVTKKDDPAFA KYVDDFVKEHKNEIDALAKKWGL (ID. DE SEQ. N°: 26)

[168] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0921c de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 25). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0921c, em que o gene cj0921c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 25. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0921c, em que o gene cj0921c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 25.

[169] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Pebl, em que a referida proteína Pebl compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 77/261

71/242

menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 26. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Pebl, em que a referida proteína Pebl compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,

pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 26.

[170] cj0982c - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0982c (por exemplo, um gene cj0982c de C. jejuni).

[171] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0982c está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0982c está localizado em um cromossomo da bactéria.

[172] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0982c de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGAAAAAAATACTTCTAAGTGTTTTAACGGCCTTTGTTGCAGTAGTATTGGCTGCGGC GGCAACTCCGACTCCAAAACCCTGAACTCCCTGGACAAAATCAAACAGAACGGCGTGGT GCGTATCGGCGTGTTTGGCGACAAACCGCCGTTTGGCTATGTGGACGAAAAAGGCAACA ACCAGGGCTATGACATCGCTCTGGCTAAACGTATCGCGAAAGAACTGTTTGGCGACGAA

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 78/261

72/242

AACAAAGTGCAGTTTGTGCTGGTGGAAGCTGCGAACCGTGTGGAGTTTCTGAAATCCAA CAAAGTGGACATCATCCTGGCTAACTTTACCCAGACCCCGCAGCGTGCGGAGCAGGTGG ACTTTTGCTCCCCGTATATGAAAGTGGCTCTGGGCGTGGCTGTGCCGAAAGACAGCAAC ATCACCAGCGTGGAAGACCTGAAAGACAAAACCCTGCTGCTGAACAAAGGCACCACCGC GGACGCTTATTTTACC CAGAAC TAT C C GAACAT CAAAAC C C T GAAATAT GAC CAGAACA CCGAAACCTTTGCGGCTCTGATGGACAAACGTGGCGACGCTCTGAGCCACGACAACACC CTGCTGTTTGCTTGGGTGAAAGACCACCCGGACTTTAAAATGGGCATCAAAGAGCTGGG CAACAAAGACGTGATCGCGCCGGCGGTGAAAAAAGGCGACAAAGAACTGAAAGAATTTA TCGACAACCTGATCATCAAACTGGGCCAGGAGCAGTTTTTTCACAAAGCTTATGACGAA ACCCTGAAAGCTCACTTTGGCGACGACGTGAAAGCGGACGACGTGGTGATCGAAGGCGG

CAAAATCTAA	(ID. DE SEQ.	N° :	27)
[173] A	sequência	de	aminoácidos	da	proteína	C jaA
codificada	pelo ácido	nucleico do ID.	DE	SEQ. N°:	27 é

fornecida abaixo:

MKKIL L S VL T AF VAWL AAC GGN SDSKTLNSLDKIKQNGWRIGVF GD KP P F G YVD E KG NNQGYDIALAKRIAKELFGDENKVQFVLVEAANRVEFLKSNKVDIILANFTQTPQRAEQ VDFCSPYMKVALGVAVPKDSNITSVEDLKDKTLLLNKGTTADAYFTQNYPNIKTLKYDQ NTETFAALMDKRGDALSHDNTLLFAWVKDHPDFKMGIKELGNKDVIAPAVKKGDKELKE FIDNLIIKLGQEQFFHKAYDETLKAHFGDDVKADDWIEGGKI (ID. DE SEQ. N°: 28)

[174] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0982c de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 27). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0982c, em que o gene cj0982c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 79/261

73/242 menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 27. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0982c, em que o gene cj0982c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 27.

[175] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

CjaA,	em	que	a referida	proteína	CjaA	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 28. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína CjaA, em que a referida proteína CjaA compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 80/261

74/242 pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 28.

[176] cj0998c - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj0998c (por exemplo, um gene cj0998c de C. jejuni).

[177] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0998c está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj0998c está localizado em um cromossomo da bactéria.

[178] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj0998c de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGAAAAAAATTCTTGTAAGTGTTTTAAGTTCTTGCTTGTTAGCTTCGGCTTTAAGTGC GGTGTCCTTCAAAGAAGACAGCCTGAAAATCTCCTTCGAAGGCTACAAAACCAAAGACA TGATCGGCACCAAAGGCGAATTCAAAAACGTGGAATACAAATTCTCCAAAAACATCAAA GACCTGGCGAGCTACCTGAAAGGCGCGAAAGCGACCATCAAACCGAGCAACGCGTTCAT GGGCGAAGGCAACGACATCATCACCAACAACATCACCAAAGTGTTCTTCCCGGCGCTGC TGGGCGACACGGACATCAAAGTGGTGTTTCAGGACGTGATCGCGGGCGAAAACAAAGGC GTGATCTCCGCGAAAATCACCATGGACAAAAAAAGCACCATCGTGCCGCTGACCTATAC CATCAAAGACAACAAATTTGAAGCGAAAGGCCAGCTGGACCTGCACACCTTTAAAAACG GCTCCAAAGCGCTGAAAGCGCTGAGCGACGTGGCTGCAGGCCACGGCGGCATCTCCTGG CCGCTGGTGGACATCAGCTTTAACGCGGACCTGGCGGAATAA (ID. DE SEQ. N°: 29)

[179] A sequência de aminoácidos da proteína Cj0998c codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 29 é fornecida abaixo:

MKKILVSVLSSCLLASALSAVSFKEDSLKISFEGYKTKDMIGTKGEFKNVEYKFSKNIK DLASYLKGAKATIKP SNAFMGEGND11TNNITKVFFPALLGDTDIKWFQDVIAGENKG VISAKITMDKKSTIVPLTYTIKDNKFEAKGQLDLHTFKNGSKALKALSDVAAGHGGISW PLVDISFNADLAE (ID. DE SEQ. N°: 30)

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 81/261

75/242

[180] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0998c de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 29). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0998c, em que o gene cj0998c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 29. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj0998c, em que o gene cj0998c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 29.

[181] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0998c, em que a referida proteína Cj0998c compreende uma

sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%, pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos 84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%, pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos 95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 82/261

76/242 pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 30. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cj0998c, em que a referida proteína

Cj0998c compreende uma sequência	de aminoácidos	que é	pelo
menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,
pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos
86%,	pelo	menos	87%,	pelo :	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo
menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,
pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos
97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos 99% ou	100%	homóloga à

sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 30.

[182] cjl259 - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cjl259 (por exemplo, um gene cjl259 de C. jejuni).

[183] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cjl259 está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cjl259 está localizado em um cromossomo da bactéria.

[184] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cjl259 de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGAAACTAGTTAAACTTAGTTTAGTTGCAGCTCTTGCTGCAGGTGCTTTTTCAGCAGC TAACGCTACCCCGCTGGAAGAAGCGATCAAAGACGTGGACGTGTCCGGCGTGCTGCGTT ACCGTTACGACACCGGCAACTTTGACAAAAACTTCGTGAACAACTCCAACCTGAACAAC AGCAAACAGGACCACAAATATCGTGCACAGGTGAACTTCAGTGCTGCTATCGCTGACAA CTTCAAAGCTTTTGTGCAGTTTGACTATAACGCTGCTGACGGTGGCTATGGCGCTAACG GCATCAAAAACGACCAGAAAGGCCTGTTTGTGCGTCAGCTGTACCTGACTTATACCAAC GAAGACGTGGCTACCAGTGTGATCGCTGGTAAACAGCAGCTGAACCTGATCTGGACGGA CAACGCTATCGACGGTCTGGTGGGCACCGGTGTGAAAGTGGTGAACAACAGCATCGACG

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 83/261

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GTCTGACTCTGGCTGCTTTTGCTGTGGACAGCTTCATGGCTGCGGAGCAGGGTGCGGAC

CTGCTGGAACACAGTAACATCTCCACCACCTCCAACCAGGCTCCGTTTAAAGTGGACTC

CGTGGGCAACCTGTACGGTGCTGCTGCTGTGGGTTCTTATGACCTGGCTGGTGGCCAGT

TCAACCCGCAGCTGTGGCTGGCTTATTGGGACCAGGTGGCATTCTTCTATGCTGTGGAC GCAGCTTATAGCACAACTATCTTTGACGGCATCAACTGGACACTGGAAGGCGCTTACCT GGGAAACAGCCTGGACAGCGAACTGGACGACAAAACACACGCTAACGGCAACCTGTTTG CTCTGAAAGGCAGCATCGAAGTGAACGGCTGGGACGCTAGCCTGGGTGGTCTGTACTAC GGCGACAAAGAAAAAGCTTCTACAGTGGTGATCGAAGACCAGGGTAACCTGGGTTCTCT GCTGGCAGGTGAGGAAATCTTCTATACTACTGGCTCACGCCTGAACGGTGACACTGGTC GTAACATCTTCGGTTATGTGACTGGTGGATATACTTTCAACGAAACAGTGCGCGTGGGT GCTGACTTCGTGTATGGTGGAACAAAAACAGAAGCTGCTAACCACCTGGGTGGTGGTAA

AAAACTGGAAGCTGTGGCACGCGTGGACTACAAATACTCTCCGAAACTGAACTTCTCAG CATTCTATTCTTATGTGAACCTGGACCAGGGTGTGAACACTAACGAAAGTGCTGACCAC AGCACTGTGCGTCTGCAGGCTCTGTACAAATTCTAA (ID. DE SEQ. N°: 31)

[185] A sequência de aminoácidos da proteína PorA codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 31 é fornecida abaixo:

MKLVKLSLVAALAAGAFSAANATPLEEAIKDVDVSGVLRYRYDTGNFDKNFVNNSNLNN SKQDHKYRAQVNFSAAIADNFKAFVQFDYNAADGGYGANGIKNDQKGLFVRQLYLTYTN EDVATSVIAGKQQLNLIWTDNAIDGLVGTGVKWNNSIDGLTLAAFAVDSFMAAEQGAD LLEHSNISTTSNQAPFKVDSVGNLYGAAAVGSYDLAGGQFNPQLWLAYWDQVAFFYAVD AAYSTTIFDGINWTLEGAYLGNSLDSELDDKTHANGNLFALKGSIEVNGWDASLGGLYY GDKEKASTWIEDQGNLGSLLAGEEIFYTTGSRLNGDTGRNIFGYVTGGYTFNETVRVG ADFVYGGTKTEAANHLGGGKKLEAVARVDYKYSPKLNFSAFYSYVNLDQGVNTNESADH STVRLQALYKF (ID. DE SEQ. N°: 32)

[186] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cjl259 de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 31). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cjl259, em que o gene cjl259 compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%,

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 84/261

78/242

pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos
84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo
menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,
pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos
95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo
menos	99%	ou 100	% idêntica	à sequência de	ácidos	nucleicos

do ID. DE SEQ. N°: 31. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cjl259, em que o gene cjl259 compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 31.

[187] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

PorA,	em	que	a referida	proteína	PorA	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 32. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PorA, em que a referida proteína PorA compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 85/261

79/242

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,

pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 32.

[188] cj!339c - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj!339c (por exemplo, um gene cj!339c de C. jejuni).

[189] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj!339c está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj!339c está localizado em um cromossomo da bactéria.

[190] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj!339c de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo: ATGGGTTTTCGTATCAACACCAACGTGGCGGCTCTGAACGCAAAAGCAAACGCGGATCT GAACAGCAAAAGCCTGGATGCTTCTCTGAGCCGTCTGAGCTCCGGCCTGCGTATCAACT CCGCAGCAGATGATGCTTCCGGGATGGCGATCGCAGATAGCCTGCGTTCTCAGGCTAAC ACTCTGGGCCAGGCTATCTCTAACGGCAACGATGCTCTGGGCATCCTGCAGACTGCTGA TAAAGCTATGGACGAGCAGCTGAAAATCCTGGATACCATCAAAACTAAAGCAACCCAGG CGGCTCAGGATGGCCAGAGCCTGAAAACCCGTACCATGCTGCAGGCAGATATCAACCGT CTGATGGAAGAACTGGACAACATCGCAAACACTACTTCCTTTAACGGTAAACAGCTGCT GAGCGGCAACTTTATCAACCAGGAATTTCAGATCGGCGCAAGCTCCAACCAGACTGTGA AAGCTACTATCGGCGCAACTCAGTCTTCTAAAATCGGTCTGACCCGCTTTGAAACCGGC GGCCGTATCTCCACTAGCGGCGAAGTGCAGTTTACTCTGAAAAACTACAACGGTATCGA TGATTTTCAGTTTCAGAAAGTGGTGATCTCCACTTCCGTGGGCACCGGCCTGGGCGCTC TGGCAGATGAGATCAACAAAAACGCTGATAAAACCGGTGTGCGTGCTACTTTTACAGTG GAAACTCGTGGTATCGCTGCAGTGCGTGCAGGCGCTACTTCAGATACTTTTGCTATCAA

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 86/261

80/242

CGGGGTGAAAATCGGCAAAGTGGATTACAAAGATGGCGATGCTAACGGCGCCCTGGTGG

CTGCAATCAACTCGGTGAAAGATACCACCGGCGTGGAAGCTTCGATCGATGCTAACGGC CAGCTGCTGCTGACTTCCCGTGAAGGCCGTGGCATCAAAATCGATGGTAACATCGGTGG CGGTGCCTTTATCAACGCTGATATGAAAGAAAACTATGGCCGCCTGTCTCTGGTGAAAA ACGATGGTAAAGATATCCTGATCAGCGGTAGCAACCTGTCTTCTGCAGGTTTTGGTGCA ACCCAGTTTATCTCTCAGGCTTCTGTGTCTCTGCGTGAGTCCAAAGGCCAGATCGATGC TAACATCGCTGATGCTATGGGCTTTGGCTCTGCAAACAAAGGCGTGGTGCTGGGTGGTT ATTCTTCTGTGAGCGCCTATATGAGCAGCGCAGGCAGCGGCTTTTCTTCCGGTTCCGGT TATTCTGTGGGTAGCGGCAAAAACTATTCCACCGGTTTTGCAAACGCTATCGCTATCTC CGCTGCTTCGCAGCTGTCTACGGTGTATAACGTGTCTGCAGGCTCAGGTTTTTCAAGCG GTTCCACCCTGTCTCAGTTTGCCACTATGAAAACCACTGCTTTTGGCGTGAAAGATGAA ACCGCAGGTGTGACCACCCTGAAAGGCGCTATGGCTGTGATGGATATCGCTGAAACCGC TATCACCAACCTGGATCAGATCCGTGCCGACATCGGCTCGGTGCAGAACCAGGTGACAT CCACTATCAACAACATCACCGTGACTCAGGTGAACGTGAAAGCAGCAGAATCGCAGATC CGTGATGTGGACTTTGCAGCCGAGAGCGCAAACTACTCTAAAGCAAACATCCTGGCTCA GAGCGGCTCTTATGCCATGGCACAGGCTAACTCTGTGCAGCAGAACGTGCTGCGTCTGC TGCAGTA (ID. DE SEQ. N°: 33)

[191] A sequência de aminoácidos da proteína FlaA codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 33 é fornecida abaixo:

MGFRINTNVAALNAKANADLNSKSLDASLSRLSSGLRINSAADDASGMAIADSLRSQAN TLGQAISNGNDALGILQTADKAMDEQLKILDTIKTKATQAAQDGQSLKTRTMLQADINR LMEELDNIANTTSFNGKQLLSGNFINQEFQIGASSNQTVKATIGATQSSKIGLTRFETG GRISTSGEVQFTLKNYNGIDDFQFQKWISTSVGTGLGALADEINKNADKTGVRATFTV

ETRGIAAVRAGATSDTFAINGVKIGKVDYKDGDANGALVAAINSVKDTTGVEASIDANG QLLLTSREGRGIKIDGNIGGGAFINADMKENYGRLSLVKNDGKDILISGSNLSSAGFGA TQFISQASVSLRESKGQIDANIADAMGFGSANKGWLGGYSSVSAYMSSAGSGFSSGSG YSVGSGKNYSTGFANAIAISAASQLSTVYNVSAGSGFSSGSTLSQFATMKTTAFGVKDE TAGVTTLKGAMAVMDIAETAITNLDQIRADIGSVQNQVTSTINNITVTQVNVKAAESQI RDVDFAAESANYSKANILAQSGSYAMAQASVQQNVLRLLQ (ID. DE SEQ. N°:

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81/242

34)

[192] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cjl339c de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 33). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj1339c, em que o gene cjl339c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 33. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cjl339c, em que o gene cjl339c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 33.

[193] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

FlaA,	em	que	a referida	proteína	FlaA	compreende	: uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos 86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 88/261

82/242 menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 34. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína FlaA, em que a referida proteína FlaA compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,

pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 34.

[194] cj!478c - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cj!478c (por exemplo, um gene cj!478c de C. jejuni).

[195] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj!478c está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj!478c está localizado em um cromossomo da bactéria.

[196] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj!478c de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGAAAAAAATCTTCCTGTGTCTGGGCCTGGCGAGCGTGCTGTTTGGCGCTGACAACAA CGTGAAATTTGAAATCACCCCGACCCTGAACTATAACTACTTTGAAGGCAACCTGGACA TGGACAACCGTTATGCGCCGGGGATCCGTCTGGGCTATCACTTTGACGACTTTTGGCTG GACCAGCTGGAATTTGGGCTGGAGCACTATTCTGACGTGAAATATACCAACACCAACAA AACCACCGACATCACCCGTACCTATCTGAGCGCTATCAAAGGCATCGACGTGGGTGAGA AATTTTATTTCTATGGCCTGGCAGGCGGCGGCTATGAGGACTTTTCCAACGCTGCGTAT GACAACAAAAGCGGCGGCTTTGGCCACTATGGCGCGGGCGTGAAATTCCGTCTGAGCGA

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 89/261

83/242

CTCTCTGGCTCTGCGTCTGGAAACCCGTGACCAGATCAACTTCAACCACGCAAACCACA

ACTGGGTGTCCACTCTGGGCATCAGCTTTGGCTTTGGCGGCAAAAAAGAAAAAGCTGTG GAAGAAGTGGCTGACACCCGTGCAACTCCGCAGGCCAAATGTCCGGTGGAACCGCGTGA AGGCGCTCTGCTGGACGAAAACGGCTGCGAAAAAACCATCTCTCTGGAAGGCCACTTTG GC T T T GACAAAAC CACCATCAACCCGACTTTTCAG GAAAAAAT CAAAGAAAT C G CAAAA GTGCTGGACGAAAACGAACGTTATGACACTATCCTGGAAGGCCACACCGACAACATCGG CTCCCGTGCTTATAACCAGAAACTGTCCGAACGTCGTGCTAAAAGCGTGGCTAACGAAC TGGAAAAATATGGCGTGGAAAAAAGCCGCATCAAAACAGTGGGCTATGGCCAGGACAAC CCGCGCTCCAGCAACGACACCAAAGAAGGCCGCGCGGACAACCGTCGCGTGGACGCTAA ATTTATCCTGCGCTAA (ID. DE SEQ. N°: 35)

[197] A sequência de aminoácidos da proteína CadF codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 35 é fornecida abaixo:

MKKIFLCLGLASVLFGADNNVKFEITPTLNYNYFEGNLDMDNRYAPGIRLGYHFDDFWL DQLEFGLEHYSDVKYTNTNKTTDITRTYLSAIKGIDVGEKFYFYGLAGGGYEDFSNAAY DNKSGGFGHYGAGVKFRLSDSLALRLETRDQINFNHANHNWVSTLGISFGFGGKKEKAV EEVADTRATPQAKCPVEPREGALLDENGCEKTISLEGHFGFDKTTINPTFQEKIKEIAK VLDENERYDTILEGHTDNIGSRAYNQKLSERRAKSVANELEKYGVEKSRIKTVGYGQDN PRSSNDTKEGRADNRRVDAKFILR (ID. DE SEQ. N°: 36)

[198] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cjl478c de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 35). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj!478c, em que o gene cj!478c compreende uma sequência

de ácidos	nucleicos	que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,
pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos
84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo
menos	88%,	pelo	menos 89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,
pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos
95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo

menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 90/261

84/242 do ID. DE SEQ. N°: 35. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cjl478c, em que o gene cjl478c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 35.

[199] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

CadF,	em	que	a referida	proteína	CadF	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 36. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína CadF, em que a referida proteína CadF

compreende	uma	sequência de aminoácidos que é	pelo	menos
75%, pelo	menos	80%, pelo menos 81%, pelo menos	82%,	pelo
menos 83%,	pelo	menos 84%, pelo menos 85%, pelo	menos	86%,
pelo menos	87%,	pelo menos 88%, pelo menos 89%,	pelo	menos
90%, pelo	menos	91%, pelo menos 92%, pelo menos	93%,	pelo
menos 94%,	pelo	menos 95%, pelo menos 96%, pelo	menos	97%,
pelo menos	98%,	pelo menos 99% ou 100% homóloga â	i sequência

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 91/261

85/242 de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 36.

[200] cj!534c - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cjl534c (por exemplo, um gene cjl534c de C. jejuni).

[201] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj!534c está localizado em um plasmideo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cj!534c está localizado em um cromossomo da bactéria.

[202] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cj!534c de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo: ATGTCCGTGACCAAACAGCTGCTGCAGATGCAGGCGGACGCGCACCACCTGTGGGTGAA ATTCCACAACTACCACTGGAACGTGAAAGGCCTGCAGTTCTTCTCCATCCACGAGTACA CCGAAAAAGCGTACGAAGAAATGGCAGAACTGTTCGACAGCTGTGCGGAACGTGTGCTG CAGCTGGGCGAAAAAGCGATCACCTGCCAGAAAGTGCTGATGGAAAACGCGAAAAGCCC GAAAGTGGCGAAAGACTGCTTCACCCCGCTGGAAGTGATCGAACTGATCAAACAGGACT ACGAATACCTGCTGGCGGAATTCAAAAAACTGAACGAAGCGGCAGAAAAAGAAAGCGAC ACCACCACCGCTGCTTTCGCGCAGGAAAACATCGCGAAATATGAAAAAAGTCTGTGGAT GATCGGCGCTACCCTGCAGGGCGCTTGCAAAATGTAA (ID. DE SEQ. N°: 37)

[203] A sequência de aminoácidos da proteína Dps codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 37 é fornecida abaixo:

MSVTKQLLQMQADAHHLWVKFHNYHWNVKGLQFFSIHEYTEKAYEEMAELFDSCAERVL QLGEKAITCQKVLMENAKSPKVAKDCFTPLEVIELIKQDYEYLLAEFKKLNEAAEKESD TTTAAFAQENIAKYEKSLWMIGATLQGACKM (ID. DE SEQ. N°: 38)

[204] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cjl534c de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 37). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj!534c, em que o gene cj!534c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%,

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 92/261

86/242

pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos
84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo
menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,
pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos
95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo
menos	99%	ou 100	% idêntica	à sequência de	ácidos	nucleicos

do ID. DE SEQ. N°: 37. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cj 1534c, em que o gene cj!534c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 37.

[205] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Dps, em que a referida proteína Dps compreende uma sequência

de aminoácidos	que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo
menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 38. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Dps, em que a referida proteína Dps compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 93/261

87/242

80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 38.

[206] cjl656c - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene cjl656c (por exemplo, um gene cjl656c de C. jejuni).

[207] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cjl534c está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene cjl534c está localizado em um cromossomo da bactéria.

[208] A sequência de ácidos nucleicos de um gene cjl656c de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGGTTTCAGATGTTTCTATGGGTAATGTTAATTTAATGACTGCTGTTAATACTTCAGT TTTGAAAAAATCTATGGACACAAACGAGGCATTGATGAATGAACTCATCGAAGGTATGG AAGGTGTCTCTCAAGCCTCCGCTCCACAAGCTTCTAGCTCTAGTGGTTTGGATATTTAC GCTTAA (ID. DE SEQ. N°: 39)

[209] A sequência de aminoácidos da proteína Cjl656c codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 39 é fornecida abaixo:

MVSDVSMGNVNLMTAVNT SVLKKSMD TNEALMNE LIE GME GVSQASAP QAS SSSGLDIY A (ID. DE SEQ. N°: 40)

[210] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cjl656c de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 39). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cjl656c, em que o gene cjl656c compreende uma sequência

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88/242

de ácidos	nucleicos	que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,
pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos
84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo
menos	88%,	pelo	menos 89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,
pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos
95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo

menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 39. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene cjl656c, em que o gene cjl656c compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 39.

[211] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cjl656c, em que a referida proteína Cjl656c compreende uma

sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%, pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos 84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%, pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos 95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 40. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Cjl656c, em que a referida proteína

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Cjl656c compreende uma sequência	de aminoácidos	que é	pelo
menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,
pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos
86%,	pelo	menos	87%,	pelo :	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo
menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,
pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos
97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos 99% ou	100%	homóloga à

sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 40.

B. Proteínas de glicosilação de Campylobacter

[212] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante foi modificada geneticamente para produzir o N-glicano de Campylobacter jejuni em sua superfície. O N-glicano de C. jejuni é um heptassacarídeo ((GalNAc-αΙ,4-GalNAc-al,4-[Glcβ-1,3]GalNAc-αΙ,4-GalNAc-al,4-GalNAc-al,3-diNAcBac; diNAcBac é 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesóxi-D-glicopiranose, GalNAc é N-acetilgalactosamina e Glc é glicose), e é comumente encontrado em todos os isolados de C. jejuni e Campylobacter coli. Em Campylobacter, o N-glicano é adicionado a várias proteínas periplasmáticas e da membrana, e é imunogênico em coelhos e humanos (veja, por exemplo, Nothaft e cols. (2012) Mol. Cell. Proteomics 11: 1.203-19 (13); e Szymanski e cols. (2003) J. Biol. Chem. 278: 24.50920 (14)).

[213] 0 N-glicano de C. jejuni é conjugado sobre a asparagina dentro do motivo de consenso de glicosilação Glu/Asp Xaal Asn-Xaa2-Ser/Thr (ID. DE SEQ. N° : 41). Em C. jejuni, os genes que codificam proteínas que medeiam glicosilação ligada ao N estão presentes em um lócus de 17 kb denominado o óperon pgl, que contém 14 quadros de leitura aberta (ORFs) (veja Wacker e cols. (2002) Science 298: 1.790-

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90/242 (15)). As 14 ORFs codificam várias glicotransferases e enzimas biossintéticas de açúcar que, consequentemente, geram um precursor do heptassacarídeo ligado a lipídeo. O heptassacarídeo é transferido para a asparagina-alvo por PglB no periplasma bacteriano. O óperon pgl de C. jejuni compreende os seguintes genes: wlaA, gne, pglK, pglH, pgll, pglJ, pglB, pglA, pglC, pglD, wlaJ, pglE, pglF e pglG (Fig.

6) .

Tabela A: Tamanho e teores de GC do gene do óperon pgl.

gene	aa	bp	% de GC
wlaA	264	795	29, 6
gne	330	993	34,0
pglK	526	1581	29, 0
pglH	354	1062	30,7
pgll	304	912	29, 3
pglJ	362	1089	29, 6
pglB	713	2142	29,2
pglA	376	1128	30,8
pglC	198	597	31,7
pglD	195	588	31,1
wlaJ	217	654	24,3
pglE	386	1161	31,0
pglF	590	1770	30,7
pglG	297	894	30,1

[214] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um óperon pgl (por exemplo, um óperon pgl de C. jejuni ou um óperon pgl de C. coli) . Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende pelo menos um gene de óperon pgl selecionado do grupo que consiste em walA, gne, pglK, pglH, pgll, pglJ, pglB, pglA, pglC, pglD, wlaJ, pglE, pglF e pglG. A expressão

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 97/261

91/242 do ácido nucleico que compreende o óperon pgl ou de um ou mais dos genes de óperon pgl pode conferir à bactéria (por exemplo, uma bactéria não-Campylobacter) a habilidade para sintetizar N-glicano e conjugar o N-glicano às proteínas que compreendem o motivo de consenso de glicosilação Glu/Asp Xaal Asn-Xaa2-Ser/Thr (ID. DE SEQ. N° : 41).

[215] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um óperon pgl está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um óperon pgl está localizado em um cromossomo da bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um óperon pgl está localizado no lócus cromossômico que corresponde ao lócus de um gene cysG endógeno que foi deletado ou alterado no cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um óperon pgl está ligado operacionalmente a um promotor regulável (por exemplo, um promotor regulável por Lacl como, por exemplo, Ptrc) ·

[216] A sequência de ácidos nucleicos de um óperon pgl de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

GGATTACAAATGGCAAAAAATGAAGGTTATATTTGTGTTTTTGATTGTGAGAGTGTGCC AGATGTTGAGCTTATCCGCAAAACTTTGGGTTTTGAAGGAAGTGATTTAGAGGTAAGTT TAAAAGCACTTCAGTGGCAAAAAGAACAAAGTGGGAGTGAGTTTTTGCCTTTGCCTTAT CATAAAATTATCAGTATTTGTGCGGTTTTAAGTGATAATTTTGGAAAATTTATCAAAGT GAATAAAAT T GAT G GACAAAAT GAAAAAGAAAT GAT T GAGAAT TTTTTCAATTTTATAG AAAATTATGAGCCAAAATTAGTCAGTTTTAATGGTAAAAATTTCGATATGCCTGTTCTT GTTTTAAGGGCTTTAAAATACAATTTAAAAGCAGCAACTTATTTGGATACTCAAAGTGA TAAAT G GAATAAT TATAAAACAAGAT T T T CAGAAT TAAAACAT T G T GAT T TAT TAGAAT CCTTAGGATCTAACGGGCGTGGAATAAAGCTTGATACACTTTGTTCTATGGTGGGTTTG CCAGGAAAATATGATGTGCATGGCGATGAGGTAATGAAACTTTTTTATGAAAATAAACT

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TGAAAAAATCCACGAATATTGTGAAAGTGATGTTTTAAACACCTATATGCTTTTTTTAA AATATGAACTTATTAAAGCTAATGTTGATGAAGAAGATTATGTTGGTTTTCTTTCTTAT ATGAGAGATTTCTTGTGTGCAAAAAAATCAGATCGTTCTTATACAGAAGTTTTTGCAAA AGCTTGTGAGAGTGAAATTTCAAAAGTTCGATCTTAAGTATTTAAGAAAATATATTAAA ATTTATTTTTGACATTTTTAAAAAAAGGAATGATGATGAAAATTCTTATTAGCGGTGGT GCAGGTTATATAGGTTCTCATACTTTAAGACAATTTT TAAAAACAGAT CAT GAAAT T T G TGTTTTAGATAATCTTTCTAAGGGTTCTAAAATCGCAATAGAAGATTTGCAAAAAACAA GAGCTTTTAAATTTTTCGAACAAGATTTAAGTGATTTTCAAGGCGTAAAAGCATTGTTT GAGAGAGAAAAATTTGACGCTATTGTGCATTTTGCAGCAAGCATTGAAGTTTTTGAAAG TAT G CAAAAT C C T T TAAAATAT TATAT GAACAACAC TGTTAATAC GACAAAT C T CAT C G AAACTTGTTTGCAAACTGGAGTGAATAAATTTATATTTTCTTCAACGGCGGCCACTTAT GGCGAACCACAAACTCCCGTTGTGAGCGAAACAAGTCCTTTAGCACCTATTAATCCTTA TGGGCGTAGTAAGCTTATGAGTGAAGAAGTTTTGCGTGATGCAAGTATGGCAAATCCTG AATTTAAGCATTGTATTTTAAGATATTTTAATGTTGCAGGTGCTTGTATGGATTATACT TTAGGACAACGCTATCCAAAAGCGACTTTGCTTATAAAAGTTGCAGCTGAATGTGCCGC AGGAAAACGTGATAAACTTTTCATATTTGGCGATGATTATGATACAAAAGATGGTACTT GCATAAGAGATTTTATCCATGTAGATGATATTTCAAGTGCACATTTAGCGGCTTTGGAT TATTTAAAAGAGAATGAAAGCAATGTTTTTAATGTAGGTTATGGACATGGTTTTAGCGT AAAAGAAGTGATTGAAGCGATGAAAAAAGTTAGCGGAGTGGATTTTAAAGTAGAACTTG CCCCACGCCGTGCGGGTGATCCTAGTGTATTGATTTCTGATGCAAGTAAAATCAGAAAT CTTACTTCTTGGCAGCCTAAATATGATGATTTAGAGCTTATTTGTAAATCTGCTTTTGA TTGGGAAAAACAGTGTTAAAAAAACTTTTTTTTATTTTAAGTAAGGAAGATAAAAATTT TTTATTTTTCTTGCTTGTTTTTTCAGTATTTATTTCTTTTATAGAAACTTTTGCAATTT CTTTGGTAATGCCTTTTATCACTTTGGCTAGTGATTTTTCTTATTTTGATCGTAATAAA TATTTAATCAGCCTAAAAGAATATCTTAATATCCCTGTTTTTGAAATCATTGTTTATTT TGGAGTGGGGCTTATTGTTTTTTATGTGTTTAGAGCTTTGTTAAATGCGTATTATTTTC ATCTTTTGGCAAGATTTTCTAAAGGGCGTTATCATGCGATCGCTTATAAGGTTTTTTCT AAATTTTTAAATATTAATTATGAAAAATTTACTCAAAAAAATCAATCTGAAATTTTAAA GTCCATTACAGGGGAAGTTTATAATCTAAGCACTATGATTTCATCATTTTTACTTTTGA TGAGTGAAATTTTTGTAGTACTTTTGCTTTATGCTTTAATGCTTTTGATTAATTATAAA

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ATCACTTTGTTTTTAAGTATTTTTATGGTGTTAAATGCCTTTATTTTAGTGAAAATTTT AAGCCCTATCATTAAAAAAGCAGGAGTAAGACGCGAAGAAGCGATGAAAAATTTCTTTG AAAT T T TAAATACAAAT T TAAATAAT T T CAAAT TTATTAAGCT TAAAAC CAAAGAAGAT GGAGTATTAAGTCTTTTTAAAGCGCAAAGTGAAGCTTTTTCTAAAGCAAATATTACCAA CGAAAGCGTAGCTGCGGTGCCTAGAATTTATCTTGAAGGAATAGGCTTTTGCGTACTTG TTTTTATCGTGGTATTTTTGGTTTTGAAAAATGAAAGTGATATTTCAGGTATTTTATCC ACGATTTCTATTTTTGTTTTAGCGCTTTATCGCTTAATGCCAAGTGCAAATCGTATTAT TACAAGTTATCATGATTTGCTTTATTATCATTCTTCTTTGGATATTATTTATCAAAATT TAAGACAAGAAGAAGAAAATTTGGGCGAGGAAAAATTAAGCTTTAATCAAGAGCTTAAA ATTTGCAATCTTAGCTTTGGTTATGAGGGAAAAAAATATTTATTTAAAAATCTTAACTT AAATATTAAAAAAGGCGAAAAAATCGCTTTTATAGGGGAGAGTGGTTGTGGAAAAAGTA CCTTAGTAGATCTTATCATAGGACTTTTAAAACCAAAAGAAGGGCAAATTTTAATTGAT GAGCAAGAATTAAATGCAAATAATACAAAAAATTATCGCCAAAAAATAGGCTATATCCC GCAAAATATCTATCTTTTTAATGACAGTATAGCTAAAAATATCACTTTTGGAGATGCGG TTGATGAAGAAAAACTTAATAGGGTTATCAAACAAGCAAATTTAGAGCATTTTATAAAA AATTTACCTCAAGGAGTGCAAACAAAAGTGGGCGATGGGGGGAGTAATTTAAGCGGGGG ACAAAAACAACGCATAGCTATAGCAAGAGCTTTATATTTAGAGCCTGAAATGTTAGTGC TTGATGAAGCAACTTCTGCGCTTGATACTCAAAGTGAAGCAAAAATTATGGATGAAATT TATAAAAT T T C TAAAGATAAAAC CATGATTATTATCGCACATCGCCTTTCTACGATAAC ACAATGTGATAAGGTTTATCGTTTAGAACACGGTAAGCTTAAAGAGGAGAAATGATGAA AATAAGCTTTATTATCGCAACTTTAAATTCAGGAGGTGCTGAGCGTGCTTTAGTAACCT TAGCTAATGCACTTTGCAAAGAGCATGAAGTAAGTATTATTAAATTTCATGCAGGAGAA TCTTTTTATAAGCTTGAAAATGAAGTTAAAGTTACAAGTTTGGAACAATTTAGATTTGA CACGCTTTATCATAAAATCGCAAGTCGTTTTAAGAAATTTTTTGCTTTAAGAAAGGCTT TGAAAGAAAGTAAGTCTGATGTTTTTATTTCTTTTTTGGATACGACTAATATTGCTTGT ATTGCTGCGAAAATAGGGCTTAAAACTCCACTCATTATAAGTGAGCATAGCAATGAAGC GTATTTAAAACCTAAAATTTGGCGTTTTTTAAGAAGGGTAAGCTATCCTTTTTGTGATG CTTTAAGTGTGCTTGGAAGCAGTGATAAGGTGTATTATGAAAGATTTGTAAAAAGGGTT AAGCTTTTATTAAACCCTTGTCATTTTAGCGATGAAATTTCTTTTGATTCTAGTTTTGA AAAGGAAAATTTGGTTCTTTTTATAGGGCGTTTAGATCACAACAAAAACCCTGTAATGT

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TTTTAAAAGCTATAGCGCATTTGGATAAAAATTTACAAGAAAATTATAAATTTGTTATA GCAGGAGATGGACAGTTAAGACAAGAACTTGAATATAAGGTAAAATCTTTAGGAATAAA AGTTGATTTTTTAGGACGCGTTGAAAATGTCAAGGCTCTTTATGAAAAAGCAAAAGTGC TTTGCCTTTGTTCTTTTGTAGAGGGTTTGCCAACGGTTTTAATTGAAAGTTTGTATTTT GAGGTTTGTAGAATTTCAAGTTCTTATTATAATGGTGCTAAGGATTTAATCAAAGATAA TCATGATGGGCTTTTGGTAGGTTGTGATGATGAAATAGCACTTGCTAAAAAACTTGAAC TTGTTTTAAATGATGAAAATTTTAGAAAAGAACTTGTAAATAATGCCAAACAAAGGTGT AAAGACTTTGAAATTTCTCATATCAAAGAAGAATGGCTTAAGCTTATAGCCGAGGTTAA AAATGCCTAAACTTTCTGTTATAGTACCAACTTTTAATCGTCAAGTTTTGTTAGAAAAG GC TAT TAAAAG CATACAAAAT CAAGAT T T TAAAGAT T TAGAAAT TAT T G TAAG C GAT GA TAATTCTAGCGATGATACTAAAAGTGTGGTGCAAAATTTACAAAAAGATGATGATCGCA TTAAGTATTTTTTAAATCAAAATTACAAACAAGGTCCAAATGGCAATAAAAACAATGGC TTAGATCAAGCAAGTGGCGAGTTTGTAACTTTTTTAGATGATGATGATGAGCTTTTATC CGGGGCTTTAAGTACCTTGATGCAAAAAGCAAATGAGGGTTATGCTCATGTTTTTGGAA ATTGTTTGATAGAAAAAGAAGGAAATTTAAGCAAGGAATTTAGCGGCAAGGGCTTGGAA AAAGATAGTGAAATTTCTAAAAAAGATTTTTTAATGGCTAAATTTAGCGGAGAGTTTTT TTCTGTTTTTAAAAAATCCCTACTTGAAAATAAGCGTTTTAATGAAGAATTTTATGGCA ATGAAGCCACGCTTTGGGTAAATTTATACAAAGAAAAAAGTTTTTATATCCATAAGGCT TTTAGGATTTATAGAATTTTTAGGCAAGATAGCGTGACTTTAGGGGCGAGTAAAAATGC TTATAGGGTGTATTTGGGATATTTAGAGCTTGCTAAAATTTTAGAAAATGAACTTAGAA TGAGTAAGGATAAAGATTATAAAAAAACTTGTGCGAGTTATTATAAAATGGCAGCTTAT TATGCAAAACTTGCAAAAAATTATAAAGCCCTTTATAAATGTTTGTTTAAAAGCCTAAG TATAAAAAT CAACGCTCCTGCTTTGATATTACTCATTTTAAGTATAATT C CAAATAATA TGATTGAAAAATTATCAAAAATTCGGGTGGCTTTATGCAAAAATTAGGCATTTTTATTT ATTCTTTAGGAAGTGGTGGTGCTGAAAGAGTTGTGGCGACTTTATTGCCTATTTTAAGT TTGAAATTTGAAGTGCATTTGATCTTGATGAATGATAAAATTTCTTATGAAATTCCAGA GTGTCAAATTCATTTTTTAGAATGTTCAAAACCTAGTGAAAATCCTATTTTGAAATTTT TAAAAC TACCTTTTTTGGCTT TAAAATACAAAAAAC T T T G CAGAAAT TTAGGTATTGAT ACAGAATTTGTTTTTTTAAATCGACCTAATTATATAGCTTTAATGGCAAGAATGTTTGG AAACAAAACTCGCCTTGTGATCAATGAATGCACTACGCCAAGTGTGATGTATATGAAAA

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ATAATTTTAATTCTTTGGTAAATAAATTTTTAATTTCTTTGCTTTACCCAAAAGCTGAT TTAATCTTGCCTAATTCTAAGGGAAATTTAGAAGATTTAGTGCAAAATTTTAGTATAAG T C CAAAAAAAT G T GAAAT TTTATACAATGCCATCGATT TAGAAAACATAG G GCAAAAAG CCCTTGAAGACATAGCTTTAAAAGATAAATTTATTTTAAGTGTAGGCAGGCTTGATAAA GGTAAAAATCATGCTTTATTAATTCGTGCTTATGCGAGATTGAAAACAGATTTAAAGCT TGTGATTTTAGGTGAAGGTGTGCTTAAGGATGAGCTTTTAGCTTTGATTAAAGAATTAA ATTTGGAAGAAAAGGTTTTGCTTTTAGGATTTGATAATAATCCTTATAAATACATGGCT AAATGCGAATTTTTTGCTTTTGCTTCTGTGTTTGAAGGTTTTTCAAATGTTTTAATCGA AAGTTTGGCTTGTTCTTGTGCGGTGGTTTGCACTGATCATAAAAGTGGTGCAAGAGAGC TTTTTGGCGATGATGAATTTGGACTTTTAGTAGAAGTAGATAATGAAAACTCTATGTTT CAGGGTTTAAAAACTATGCTTGAAGACGATAAATTAAGAAAAGCGTATAAAAACAAAGC TAAAACTAGGGCTAAAGCCTTTGATAAAGTAAAAATTGCACGCGATGCTTTGAAATATT TATTAGGATAAAAGATGTTGAAAAAAGAGTATTTAAAAAACCCTTATTTAGTTTTGTTT GCGATGATTGTATTAGCTTATGTTTTTAGTGTATTTTGCAGGTTTTATTGGGTTTGGTG GGCAAGTGAGTTTAACGAGTATTTTTTCAATAATCAATTAATGATCATT T CAAAC GAT G GCTATGCTTTTGCTGAGGGCGCAAGAGATATGATAGCAGGTTTTCATCAGCCTAATGAT TTGAGTTATTATGGATCTTCTTTATCTACGCTTACTTATTGGCTTTATAAAATCACACC TTTTTCTTTTGAAAGTATCATTTTATATATGAGTACTTTTTTATCTTCTTTGGTGGTGA TTCCTATTATTTTACTAGCTAATGAATACAAACGCCCTTTAATGGGCTTTGTAGCTGCT CTTTTAGCAAGTGTAGCAAACAGTTATTATAATCGCACTATGAGTGGGTATTATGATAC GGATATGCTGGTAATTGTTTTACCTATGTTTATTTTATTTTTTATGGTAAGAATGATTT TAAAAAAAGACTTTTTTTCATTGATTGCCTTGCCATTATTTATAGGAATTTATCTTTGG TGGTATCCTTCAAGTTATACTTTAAATGTAGCTTTAATTGGACTTTTTTTAATTTATAC ACTTATTTTTCATAGAAAAGAAAAGATTTTTTATATAGCTGTGATTTTGTCTTCTCTTA CTCTTTCAAATATAGCATGGTTTTATCAAAGTGCCATTATAGTAATACTTTTTGCTTTA TTTGCTTTAGAGCAAAAACGCTTAAATTTTATGATTATAGGAATTTTAGGTAGTGCAAC TTTGATATTTTTGATTTTAAGTGGTGGGGTTGATCCCATACTTTATCAGCTTAAATTTT ATATTTTTAGAAGCGATGAAAGTGCGAATTTAACACAGGGCTTTATGTATTTTAATGTT AAT CAAAC CATACAAGAAG T T GAAAAT GTAGATTTTAGC GAAT T TAT G C GAAGAAT TAG TGGTAGTGAAATTGTTTTCTTGTTTTCTTTGTTTGGTTTTGTATGGCTTTTGAGAAAAC

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ATAAAAGTATGATTATGGCTTTACCTATATTGGTGCTTGGGTTTTTAGCCTTAAAAGGA GGACTTAGATTTACCATTTATTCTGTACCTGTAATGGCTTTAGGATTTGGTTTTTTATT GAGCGAGTTTAAGGCTATATTGGTTAAAAAATATAGCCAATTAACTTCAATGTTTGTAT TGTTTTTGCAACTATTTTGACTTTGGCTCCAGTATTTATCCATATTTACAACTATAAAG CGCCAACAGTTTTTTCTCAAAATGAAGCATCATTATTAAATCAATTAAAAAATATAGCC AATAGAGAAGATTATGTGGTAACTTGGTGGGATTATGGTTATCCTGTGCGTTATTATAG CGATGTGAAAACTTTAGTAGATGGTGGAAAGCATTTAGGTAAGGATAATTTTTTCCCTT _CTTTTTCTTTAA_GTAAA_GA_TGAA_CA_AGCTGCA_GCTA_ATA_TGGCA_AGA_CTTA_GTGTA_GAA TATACAGAAAAAAG CTTTTATGCTCCG CAAAAT GATAT T T TAAAAT CAGACATTTTACA AGCCATGATGAAAGATTATAATCAAAGCAATGTGGATTTATTTCTAGCTTCATTATCAA AACCTGATTTTAAAATCGATACACCAAAAACTCGTGATATTTATCTTTATATGCCCGCT AGAATGTCTTTGATTTTTTCTACGGTGGCTAGTTTTTCTTTTATTAATTTAGATACAGG AGTTTTGGATAAACCTTTTACCTTTAGCACAGCTTATCCACTTGATGTTAAAAATGGAG AAATTTATCTTAGCAACGGAGTGGTTTTAAGCGATGATTTTAGAAGTTTTAAAATAGGT GATAATGTGGTTTCTGTAAATAGTATCGTAGAGATTAATTCTATTAAACAAGGTGAATA CAAAAT CACTCCAATCGATGATAAGGCTCAGTTTTATATTTTTTATT TAAAGGATAG T G CTATTCCTTACGCACAATTTATTTTAATGGATAAAACCATGTTTAATAGTGCTTATGTG CAAATGTTTTTTTTGGGAAATTATGATAAGAATTTATTTGACTTGGTGATTAATTCTAG AGATGCTAAAGTTTTTAAACTTAAAATTTAAGGGTTGAAAATGAGAATAGGATTTTTAT CACATGCAGGAGCGAGTATTTATCATTTTAGAATGCCTATTATAAAAGCGTTAAAAGAT AGAAAAGACGAAGTTTTTGTTATAGTGCCGCAAGATGAATACACGCAAAAACTTAGAGA TCTTGGCTTAAAAGTAATTGTTTATGAGTTTTCAAGAGCTAGTTTAAATCCTTTTGTGG TTTTAAAGAATTTTTTTTATCTTGCTAAGGTTTTGAAAAATTTAAATCTTGATTTTATT CAAAGTGCGGCACACAAAAGCAATACTTTTGGAATTTTAGCAGCAAAATGGGCAAAAAT TCCTTATCGTTTTGCCTTAGTAGAAGGCTTGGGATCTTTTTATATAGATCAAGGTTTTA AGGCAAATTTAGTGCGTTTTGTTATTAATAGTCTTTATAAATTAAGTTTTAAATTTGCA CACCAATTTATTTTTGTCAATGAAAGTAATGCTGAGTTTATGCGGAATTTAGGACTTAA AGAAAATAAAATTTGCGTGATAAAATCTGTAGGGATCAATTTAAAAAAATTTTTTCCTA TTTATGTAGAATCGGAAAAAAAAGAGCTTTTTTGGAAAAATTTAAACATAGATAAAAAA CCCATTGTGCTTATGATAGCAAGAGCTTTATGGCATAAGGGTGTAAAAGAATTTTATGA

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AAGTGCTACTATGCTAAAAGACAAAGCAAATTTTGTTTTAGTTGGTGGAAGAGATGAAA ATCCTTCTTGTGCAAGTTTGGAGTTTTTAAACTCTGGCGCGGTGCATTATTTGGGTGCT AGAAGTGATATAGTCGAGCTTTTGCAAAATTGTGATATTTTTGTTTTGCCAAGCTATAA AGAAGGCTTTCCTGTAAGTGTTTTGGAGGCAAAAGCTTGCGGTAAGGCTATAGTGGTGA GTGATTGTGAAGGTTGTGTGGAGGCTATTTCTAATGCTTATGATGGACTTTGGGCAAAA ACAAAAAAT G C TAAAGAT T TAAG C GAAAAAAT TTCACTTTTAT TAGAAGAT GAAAAAT T AAGAT TAAAT T TAG C TAAAAAT GCCGCCCAAGATGCTTTACAATACGAT GAAAATATAA TCGCACAGCGTTATTTAAAACTTTATGATAGGGTAATTAAGAATGTATGAAAAAGTTTT TAAAAGAATTTTTGATTTTATTTTAGCTTTAGTGCTTTTAGTGCTTTTTTCTCCGGTGA TTTTAATCACTGCTTTACTTTTAAAAATCACTCAAGGAAGTGTGATTTTTACCCAAAAT CGTCCCGGGTTAGATGAAAAAATTTTTAAAATTTATAAATTTAAAACCATGAGCGATGA AAGAGATGAAAAGGGTGAGTTATTAAGCGATGAATTGCGTTTGAAAGCTTTTGGAAAAA TCGTTAGAAGCTTAAGTTTGGATGAGCTTTTGCAACTTTTTAATGTTTTAAAAGGGGAT ATGAGTTTTGTTGGACCTAGACCTCTTTTGGTTGAGTATTTGCCTCTTTACAATAAAGA GCAAAAATTGCGTCATAAAGTGCGTCCAGGTATAACAGGATGGGCGCAGGTAAATGGTA GAAATGCTATTTCTTGGCAGAAAAAATTCGAACTTGATGTGTATTATGTGAAAAATATT TCTTTTTTGCTTGATTTAAAAATCATGTTTTTAACAGCTTTAAAGGTTTTAAAACGAAG TGGGGTAAGCAAAGAAGGCCATGTTACAACAGAGAAATTTAATGGCAAGAACTGAAAAA ATTTATATTTATGGTGCTAGTGGTCATGGGCTTGTTTGTGAAGATGTGGCTAAAAATAT GGGTTATAAAGAATGTATTTTTTTAGATGATTTTAAAGGAATGAAATTTGAAAGTACCT TAC C TAAATAT GATTTTTTTATAGCCATAG GAAACAAT GAAAT T C GAAAAAAGAT T TAT CAAAAAATTTCAGAAAATGGCTTTAAAATTGTCAATCTTATCCATAAAAGCGCGCTTAT AAGTCCTAGCGCAATCGTGGAAGAAAATGCAGGAATTTTAATCATGCCTTATGTAGTGA TTAACGCTAAAGCTAAAATAGAAAAAGGTGTGATTTTAAATACTTCAAGCGTAATTGAG CATGAATGTGTGATAGGGGAATTTTCTCATGTGAGTGTGGGAGCTAAATGTGCGGGTAA TGTAAAAATTGGTAAAAATTGTTTTTTAGGGATTAATTCTTGTGTTTTGCCTAATTTAA GTTTGGCAGATGATAGTATTTTAGGTGGTGGAGCAACTTTAGTTAAAAATCAAGATGAA AAAGGTGTTTTTGTGGGAGTACCTGCAAAAAGGATGTAAATTGCATTTTAATAACAATC TTGTTGTTCACTATATAGTAAATCCTTCGCCTTTGGGGTGGATTGTCATTAATTTACTA ACCATATGTCTAATATGCTACATATTTCCTTT GAAAAAT T C T T TAAAACACAAAAAAC T

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TTTTAGTCTTAAAGCAAATGTAAATTCTAAAAATAGTAGGATTATAAAATATACAGGTA TTGCTGCTTTTTTGGGTGGATTAATAGGAATTTGGTATAATTTTGAAGGTTTTTATCAA CTTCTTTTTTTCTTTGAATTAGAAAATGAAAATTTAAAAACACTTTGGAGTTTGCAAGT ATCAGTTTCTTCTGTGATAACAGGTATGTTATTATTGTTGATATATGTTATAAATTTAG CAATGGTTTGTGAAAATGGAATTTATATAGTTAGTAAATTTAATCTTTTTTATATGTAT T T TATAAAAC GAGAAGAT T T G GAAAT T G T TAAAATAGAAAAAAT GAAAT T T T TAAAT CA AGTTGAAGTTTGTTTTGTTATCAAAACAAAAAATAAAATACTCCTTAAATGCTTTGAAA GTAT T TATAAAAAAGAAGAC T TAGAAAAG C T TAAAAAT T G G TAT GAAAACAAG C T T T GA CTATAAAAAGAATTTAAATATTTGAATCTTTGTAAATTTTTTTAGGTAAAATAGAGTCA ATTTATAAAAATTTTGTTTTACACAAAGGATAAATCATGAGATTTTTTCTTTCTCCTCC GCATATGGGTGGTAATGAATTAAAATACATAGAAGAAGTTTTCAAAAGCAATTATATAG CACCTTTGGGTGAATTTGTAAATCGCTTTGAACAAAGTGTCAAGGCTTACAGTAAAAGT GAAAATGCCTTAGCTTTAAATTCAGCCACAGCGGCTTTGCATTTAGCTTTAAGGGTGGC AGGGGTAAAACAAGATGATATTGTTTTGGCTTCTTCTTTTACTTTTATCGCTTCAGTAG CACCTATTTGTTATCTTAAAGCAAAACCTGTATTTATAGATTGTGATGAAACTTATAAT ATCGATGTAGATTTATTAAAGCTTGCTATTAAAGAATGTGAAAAAAAACCAAAAGCATT GATTTTAACTCATCTTTATGGCAATGCGGCTAAAATGGATGAAATTGTTGAAATTTGCA AAGAAAATGAAATTGTTTTAATCGAAGATGCTGCTGAAGCTTTAGGAAGTTTTTATAAG AATAAAGCTTTAGGAACTTTTGGAGAATTTGGAGCTTATTCTTATAATGGCAATAAAAT TATCACCACTTCAGGTGGAGGTATGCTTATAGGAAAAAATAAAGAAAAGATTGAAAAAG CAAGATTTTATAGCACTCAAGCTAGGGAAAATTGTTTGCATTATGAACATTTAGATTAT GGTTATAATTACCGCTTAAGCAATGTTTTAGGAGCTATTGGCGTAGCGCAAATGGAGGT TTTAGAACAAAGAGTGCTTAAAAAAAGAGAAATTTATGAGTGGTATAAAGAATTTTTAG GAGAGTGTTTTAGCTTTTTAGATGAATTAGAAAATTCAAGAAGCAATCGCTGGTTAAGT ACAGCTTTGATTGATTTT GATAAAAAT GAAC TTAATTCTTGT CAAAAAGATATAAATAT CAG T CAAAAAAATAT TACTTTGCATC CAAAAAT T T CAAAAC T CATAGAAGAT T T GAAAA AT GAACAAATAGAAACAAGAC CAT TAT G GAAAG CTATGCACGCT CAAGAAG TAT T TAAA GGAGCTAAGGCTTATCTTAATGGCAATAGTGAGTTATTTTTCCAAAAAGGAATTTGTTT GCCAAGTGGCACGGCGATGAGTAAAGATGATGTTTATGAAATTTCAAAACTGATCTTAA AGAGCATAAAGGCTTAAAATGATTTTTTATAAAAGCAAAAGATTAGCATTTTTTTTAAC

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TTCAGATATTGTTTTAATTTTACTTAGCGTTTATCTGGCTTTTTCTTTGAGATTTAGTG GAGATATTCCGAGTATTTTTTATCATGGTATGATGGTTTCTGCTATTATTTTGCTTGTT TTAAAACTTTCATTTTTGTTTGTTTTTAGAATTTATAAAGTAGCTTGGAGATTTTTTTC TCTCAATGAAGCAAGAAAGATTTTTATCGCTTTGCTTTTAGCTGAGTTTTGTTTTTTTC TTATTTTTTATTTTTTTAGTGATTTTTTTAATCCTTTTCCAAGAAGTGCTATTGTGATA GATTTTGTTCTTTCTTATATGTTTATAGGTACTTTAAGAATTAGCAAAAGAATGCTTGT GGATTTTAAACCTTCTAGAATGAAAGAAGAAGAAACTCCTTGTATTGTAGTAGGGGCAA CTTCTAAGGCTTTGCATTTGTTAAAAGGTGCAAAAGAAGGTTCTTTAGGGCTTTTTCCT GTAGGCGTAGTTGATGCGAGAAAAGAGCTTATAGGGACTTATTGTGATAAATTTATTGT AGAAGAAAAAGAAAAAATAAAATCTTATGTAGAACAAGGGGTAAAAACTGCCATTATTG CTTTAAGACTTGAACAAGAAGAGCTTAAAAAACTTTTTGAAGAACTTGTAGCTTATGGT AT T T G C GAT G TAAAAATAT T T T C T T T TACAAGAAAC GAAG CAAGAGATAT CAG TATAGA AGACTTGCTTGCTAGAAAACCAAAAGATTTAGATGATAGTGCTGTGGCGGCTTTTTTAA AAGATAAGGTAGTTTTGGTAAGTGGAGCAGGTGGAACTATAGGCAGTGAACTTTGTAAG CAATGTATTAAATTTGGTGCTAAGCATCTTATCATGGTTGATCATAGTGAGTATAATCT TTATAAGATCAATGATGATTTAAATTTATATAAAGAAAAAATTACTCCTATTTTACTGA GTATTTTAGATAAGCAAAGTTTAGATGAGGTATTAAAAACTTATAAACCCGAGCTTATT TTACATGCAGCCGCTTATAAACATGTGCCTCTTTGCGAACAAAATCCACATTCAGCAGT AATCAATAATATTTTAGGAACTAAAATTTTATGCGACAGTGCTAAAGAAAACAAAGTAG CTAAATTTGTGATGATAAGTACAGATAAAGCAGTACGACCAACAAATATTATGGGTTGC ACTAAGAGAGTTTGCGAGCTTTATACTTTAAGTATGAGTGATGAAAATTTTGAAGTTGC TTGTGTGCGTTTTGGTAATGTTTTAGGTTCTAGTGGTAGTGTGATACCGAAATTTAAAG CACAAATTGCCAATAATGAGCCTTTAACTTTAACGCACCCTGATATAGTGCGTTATTTT ATGCTTGTGGCTGAGGCAGTGCAACTTGTTTTACAAGCTGGAGCTATCGCAAAAGGGGG AGA (ID. DE SEQ. N°: 42).

[217] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um óperon pgl de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 42). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um óperon pgl de C. jejuni, em que o óperon pgl de C. jejuni compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos

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75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%, pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos 85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%, pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos 96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100% idêntica à	l sequência
de ácidos	nucleicos	do ID. DE	SEQ. N°:	42. Em algumas
modalidades, o	ácido	nucleico compreende óperon	pgl	de C.
jejun	i, em que	óperon pgl de	C. jejuni	compreende	s uma
sequência	de ácidos nucleicos que é pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos 82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%, pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos 93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99% ou 100	% homóloga à sequência	de ácidos
nucleicos	do ID.	. DE SEQ. Nc	> : 42 .
[218] n	71 a A	- Em	algumas	modalidade	s, a	bactéria

recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene wlaA (por exemplo, um gene wlaA de C. jejuni).

[219] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

compreende	um	gene	wlaA	está	localizado	em um	plasmídeo	na
bactéria.	Em	algumas modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene	wlaA	está	localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.

[220] A sequência de ácidos nucleicos de um gene wlaA de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo: ATGGCAAAAAATGAAGGTTATATTTGTGTTTTTGATTGTGAGAGTGTGCCAGATGTTGA GCTTATCCGCAAAACTTTGGGTTTTGAAGGAAGTGATTTAGAGGTAAGTTTAAAAGCAC TTCAGTGGCAAAAAGAACAAAGTGGGAGTGAGTTTTTGCCTTTGCCTTATCATAAAATT

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ATCAGTATTTGTGCGGTTTTAAGTGATAATTTTGGAAAATTTATCAAAGTGAATAAAAT T GAT G GACAAAAT GAAAAAGAAAT GATT GAGAAT TTTTTCAATTT TATAGAAAAT TAT G AGCCAAAATTAGTCAGTTTTAATGGTAAAAATTTCGATATGCCTGTTCTTGTTTTAAGG GCTTTAAAATACAATTTAAAAGCAGCAACTTATTTGGATACTCAAAGTGATAAATGGAA TAAT TATAAAACAAGAT T T T CAGAAT TAAAACAT TGTGATTTAT TAGAAT CCTTAGGAT CTAACGGGCGTGGAATAAAGCTTGATACACTTTGTTCTATGGTGGGTTTGCCAGGAAAA TATGATGTGCATGGCGATGAGGTAATGAAACTTTTTTATGAAAATAAACTTGAAAAAAT CCACGAATATTGTGAAAGTGATGTTTTAAACACCTATATGCTTTTTTTAAAATATGAAC TTATTAAAGCTAATGTTGATGAAGAAGATTATGTTGGTTTTCTTTCTTATATGAGAGAT TTCTTGTGTGCAAAAAAATCAGATCGTTCTTATACAGAAGTTTTTGCAAAAGCTTGTGA GAGTGAAATTTCAAAAGTTCGATCTTAA (ID. DE SEQ. N°: 43)

[221] A sequência de aminoácidos da proteína WlaA codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 43 é fornecida abaixo:

MAKNEGYICVFDCESVPDVELIRKTLGFEGSDLEVSLKALQWQKEQSGSEFLPLPYHKI ISICAVLSDNFGKFIKVNKIDGQNEKEMIENFFNFIENYEPKLVSFNGKNFDMPVLVLR ALKYNLKAATYLDTQSDKWNNYKTRFSELKHCDLLESLGSNGRGIKLDTLCSMVGLPGK YDVHGDEVMKLFYENKLEKIHEYCESDVLNTYMLFLKYELIKANVDEEDYVGFLSYMRD FLCAKKSDRSYTEVFAKACESEISKVRS (ID. DE SEQ. N°: 44)

[222] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene wlaA de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 43). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene wlaA, em que o gene wlaA compreende uma sequência de

ácidos nucleicos	que i	é pelo	menos 75%,	pelo	menos 80%,	pelo
menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo :	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID.

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 108/261

102/242

DE SEQ. N°: 43. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene wlaA, em que o gene wlaA compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 43.

[223] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

WlaA,	em	que	a referida	proteína	WlaA	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 44. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína WlaA, em que a referida proteína WlaA

compreende	uma	sequência de aminoácidos que é	pelo	menos
75%, pelo	menos	80%, pelo menos 81%, pelo menos	82%,	pelo
menos 83%,	pelo	menos 84%, pelo menos 85%, pelo	menos	86%,
pelo menos	87%,	pelo menos 88%, pelo menos 89%,	pelo	menos
90%, pelo	menos	91%, pelo menos 92%, pelo menos	93%,	pelo
menos 94%,	pelo	menos 95%, pelo menos 96%, pelo	menos	97%,
pelo menos	98%,	pelo menos 99% ou 100% homóloga â	i sequência

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 109/261

103/242 de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 44.

[224] wlaJ - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene wlaJ (por exemplo, um gene wlaA de C. jejuni).

[225] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

compreende	um	gene	wlaJ está	localizado	em um	plasmídeo	na
bactéria.	Em	algumas modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene	wlaJ está	localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.

[226] A sequência de ácidos nucleicos de um gene wlaJ de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo: ATGAAAAAGGTGTTTTTGTGGGAGTACCTGCAAAAAGGATGTAAATTGCATTTTAATAA CAATCTTGTTGTTCACTATATAGTAAATCCTTCGCCTTTGGGGTGGATTGTCATTAATT TACTAACCATATGTCTAATATGCTACATATTTCCTTT GAAAAAT T C T T TAAAACACAAA AAACTTTTTAGTCTTAAAGCAAATGTAAATTCTAAAAATAGTAGGATTATAAAATATAC AGGTATTGCTGCTTTTTTGGGTGGATTAATAGGAATTTGGTATAATTTTGAAGGTTTTT ATCAACTTCTTTTTTTCTTTGAATTAGAAAATGAAAATTTAAAAACACTTTGGAGTTTG CAAGTATCAGTTTCTTCTGTGATAACAGGTATGTTATTATTGTTGATATATGTTATAAA TTTAGCAATGGTTTGTGAAAATGGAATTTATATAGTTAGTAAATTTAATCTTTTTTATA T G TAT T T TATAAAAC GAGAAGAT T T G GAAAT T G T TAAAATAGAAAAAAT GAAAT T T T TA AATCAAGTTGAAGTTTGTTTTGTTATCAAAACAAAAAATAAAATACTCCTTAAATGCTT TGAAAGTATTTATAAAAAAGAAGACTTAGAAAAGCTTAAAAATTGGTATGAAAACAAGC

TTTGA (ID.	DE SEQ. N°:	45) .
[227] A	sequência	de aminoácidos	da	proteína	WlaJ
codificada	pelo ácido	nucleico do ID.	DE	SEQ. N°:	45 é

fornecida abaixo:

MKKVFLWEYLQKGCKLHFNNNLWHYIVNPSPLGWIVINLLTICLICYIFPLKNSLKHK KLFSLKANVNSKNSRIIKYTGIAAFLGGLIGIWYNFEGFYQLLFFFELENENLKTLWSL QVSVSSVITGMLLLLIYVINLAMVCENGIYIVSKFNLFYMYFIKREDLEIVKIEKMKFL NQVEVCFVIKTKNKILLKCFESIYKKEDLEKLKNWYENKL (ID. DE SEQ. N° :

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 110/261

104/242

46) .

[228] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene wlaJ de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 45). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene wlaJ, em que o gene wlaJ compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo

menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 45. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene wlaJ, em que o gene wlaJ compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 45.

[229] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

WlaJ,	em	que	a referida	proteína	WlaJ	compreende	: uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos 86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 111/261

105/242

menos 95%,	pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%,
pelo menos	99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos
do ID. DE	SEQ. N°: 46. Em algumas modalidades, o ácido

nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína WlaJ, em que a referida proteína WlaJ

compreende

uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo

menos 94%,	pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%,
pelo menos	98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência

de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 46.

[230] gne - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene gne (por exemplo, um gene gne de C. jejuni).

[231] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

compreende	um gene gne está localizado em um plasmideo na
bactéria.	Em algumas modalidades, o ácido nucleico que
compreende	um gene gne está localizado em um cromossomo da

bactéria.

[232] A sequência de ácidos nucleicos de um gene gne de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo: ATGATGATGAAAATTCTTATTAGCGGTGGTGCAGGTTATATAGGTTCTCATACTTTAAG ACAATTTTTAAAAACAGATCATGAAATTTGTGTTTTAGATAATCTTTCTAAGGGTTCTA AAAT C G CAATAGAAGAT T T G CAAAAAACAAGAG C T T T TAAAT T T T T C GAACAAGAT T TA AGTGATTTTCAAGGCGTAAAAGCATTGTTTGAGAGAGAAAAATTTGACGCTATTGTGCA TTTTGCAGCAAGCATTGAAGTTTTTGAAAGTATGCAAAATCCTTTAAAATATTATATGA ACAACACTGTTAATACGACAAATCTCATCGAAACTTGTTTGCAAACTGGAGTGAATAAA TTTATATTTTCTTCAACGGCGGCCACTTATGGCGAACCACAAACTCCCGTTGTGAGCGA

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 112/261

106/242

AACAAGTCCTTTAGCACCTATTAATCCTTATGGGCGTAGTAAGCTTATGAGTGAAGAAG TTTTGCGTGATGCAAGTATGGCAAATCCTGAATTTAAGCATTGTATTTTAAGATATTTT AATGTTGCAGGTGCTTGTATGGATTATACTTTAGGACAACGCTATCCAAAAGCGACTTT GCTTATAAAAGTTGCAGCTGAATGTGCCGCAGGAAAACGTGATAAACTTTTCATATTTG GCGATGATTAT GATACAAAAGAT GGTACTTGCATAAGAGATTTTATCCATGTAGATGAT ATTTCAAGTGCACATTTAGCGGCTTTGGATTATTTAAAAGAGAATGAAAGCAATGTTTT TAATGTAGGTTATGGACATGGTTTTAGCGTAAAAGAAGTGATTGAAGCGATGAAAAAAG TTAGCGGAGTGGATTTTAAAGTAGAACTTGCCCCACGCCGTGCGGGTGATCCTAGTGTA TTGATTTCTGATGCAAGTAAAATCAGAAATCTTACTTCTTGGCAGCCTAAATATGATGA TTTAGAGCTTATTTGTAAATCTGCTTTTGATTGGGAAAAACAGTGTTAA (ID. DE SEQ. N°: 47)

[233] A sequência de aminoácidos da proteína Gne codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 47 é fornecida abaixo:

MMMKILISGGAGYIGSHTLRQFLKTDHEICVLDNLSKGSKIAIEDLQKTRAFKFFEQDL

SDFQGVKALFEREKFDAIVHFAASIEVFESMQNPLKYYMNNTVNTTNLIETCLQTGVNK

FIFSSTAATYGEPQTPWSETSPLAPINPYGRSKLMSEEVLRDASMANPEFKHCILRYF NVAGACMD YT L GQRYP KAT L LIKVAAE CAAGKRDKLFIFGDDYDTKDGTCIRDFIHVDD IS SAHLAALDYLKENE SNVFNVGYGHGF SVKEVIEAMKKVS GVDFKVE LAP RRAGDP SV LISDASKIRNLTSWQPKYDDLELICKSAFDWEKQC (ID. DE SEQ. N°: 48).

[234] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene gne de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 47). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene gne, em que o gene gne compreende uma sequência de

ácidos nucleicos	que i	é pelo	menos 75%,	pelo	menos 80%,	pelo
menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo :	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 113/261

107/242

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 47. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene gne, em que o gene gne compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 47.

[235] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Gne, em que a referida proteína Gne compreende uma sequência

de aminoácidos	que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo
menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 48. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Gne, em que a referida proteína Gne compreende

uma sequência de	aminoácidos que	é pelo	menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 114/261

108/242 pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 48.

[236] pglK - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene pglK (por exemplo, um gene pglK de C. jejuni).

[237] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

compreende	um	gene	pglK	está	localizado	em um	plasmídeo	na
bactéria.	Em	algumas modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene	pglK	está	localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.

[238] A sequência de ácidos nucleicos de um gene pglK de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo: ATGCCTTTTATCACTTTGGCTAGTGATTTTTCTTATTTTGATCGTAATAAATATTTAAT CMAGCCTAAAAGAATATCTTAATATCCCTGTTTTTGAAATCATTGTTTATTTTGGAGTG GGGCTTATTGTTTTTTATGTGTTTAGAGCTTTGTTAAATGCGTATTATTTTCATCTTTT GGCALAGATTTTCTAAAGGGCGTTATCATGCGATCGCTTATAAGGTTTTTTCTAAATTT T TAAATAT TAAT TAT GAAAAAT T TAC T CAAAAAAAT CAAT C T GAAAT T T TAAAG T C CAT TACAGGGIGAAGTTTATAATCTAAGCACTATGATTTCATCATTTTTACTTTTGATGAGT GAAATTTTTGTAGTACTTTTGCTTTATGCTTTAATGCTTTTGATTAATTATAAAATCAC TTTGTTTTTAVAGTATTTTTATGGTGTTAAATGCCTTTATTTTAGTGAAAATTTTAAGC CCTATCATTAAAAAAGCAGGAGTAAGACGCGAAGAAGCGATGAAAAATTTCTTTGAAAT T T TAAATACAAAT KT TAAATAAT T T CAAAT TTATTAAGCT TAAAAC CAAAGAAGAT G GA GTATTAAGTCTTTTTAAAGCGCAAAGTGAAGCTTTTTCTAAAGCAAATATTACCAACGA AAGCGTAGCTGCGGTGKCCTAGAATTTATCTTGAAGGAATAGGCTTTTGCGTACTTGTT TTTATCGTGGTATTTTTGGTTTTGAAAAATGAAAGTGATATTTCAGGTATTTTATCCAC GATTTCTATTTTTGTTTTAVGCGCTTTATCGCTTAATGCCAAGTGCAAATCGTATTATT ACAAGTTATCATGATTTGCTTTATTATCATTCTTCTTTGGATATTATTTATCAAAATTT AAGACAAGAAGAAGAAAATTTGYGGCGAGGAAAAATTAAGCTTTAATCAAGAGCTTAAA ATTTGCAATCTTAGCTTTGGTTATGAGGGAAAAAAATATTTATTTAAAAATCTTAACTT AAATATTAAAAAAGGCGAAAAAATCEGCTTTTATAGGGGAGAGTGGTTGTGGAAAAAGT

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 115/261

109/242

ACCTTAGTAGATCTTATCATAGGACTTTTAAAACCAAAAGAAGGGCAAATTTTAATTGA T GAG CAAGAAT TAAAT G CAAATAATACALAAAAAT TAT C G C CAAAAAATAG GC TATAT C CCGCAAAATATCTATCTTTTTAATGACAGTATAGCTAAAAATATCACTTTTGGAGATGC GGTTGATGAAGAAAAACTTAATAGGGTTATCIAAACAAGCAAATTTAGAGCATTTTATA AAAAATTTACCTCAAGGAGTGCAAACAAAAGTGGGCGATGGGGGGAGTAATTTAAGCGG GGGACAAAAACAACGCATAGCTATAGCAAGAGCTGTTATATTTAGAGCCTGAAATGTTA GTGCTTGATGAAGCAACTTCTGCGCTTGATACTCAAAGTGAAGCAAAAATTATGGATGA AAT T TATAAAAT T T C TAAAGATAAAAC CATGATTATTSATCGCACATCGCCTTTCTACG ATAACACAATGTGATAAGGTTTATCGTTTAGAACACGGTAAGCTTAAAGAGGAGAAATG A (ID. DE SEQ. N°: 49)

[239] A sequência de aminoácidos da proteína PglK codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 49 é fornecida abaixo:

MPFITLASDFSYFDRNKYLISLKEYLNIPVFEIIVYFGVGLIVFYVFRALLNAYYFHLL ARFSKGRYHAIAYKVFSKFLNINYEKFTQKNQSEILKSITGEVYNLSTMISSFLLLMSE IFWLLLYALMLLINYKITLFLSIFMVLNAFILVKIL SP11KKAGVRRE EAMKNF FEIL NTNLNNFKFIKLKTKEDGVLSLFKAQSEAFSKANITNESVAAVPRIYLEGIGFCVLVFI WFLVLKNESDISGILSTISIFVLALYRLMPSANRIITSYHDLLYYHSSLDIIYQNLRQ EEENLGEEKLSFNQELKICNLSFGYEGKKYLFKNLNLNIKKGEKIAFIGESGCGKSTLV DLIIGLLKPKEGQILIDEQELNANNTKNYRQKIGYIPQNIYLFNDSIAKNITFGDAVDE EKLNRVIKQANLEHFIKNLPQGVQTKVGDGGSNLSGGQKQRIAIARALYLEPEMLVLDE ATSALDTQSEAKIMDEIYKISKDKTMIIIAHRLSTITQCDKVYRLEHGKLKEEK (ID. DE SEQ. N° : 50).

[240] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglK de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 49). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglK, em que o gene pglK compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 116/261

110/242

88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 49. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglK, em que o gene pglK compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 49.

[241] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

PglK,	em	que	a referida	proteína	PglK	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 50. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PglK, em que a referida proteína PglK compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%,

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 117/261

111/242 pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 50.

[242] pglH - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene pglH (por exemplo, um gene pglH de C. jejuni).

[243] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

compreende	um	gene	pglH	está	localizado	em um	plasmídeo	na
bactéria.	Em	algumas modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene	pglH	está	localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.

[244] A sequência de ácidos nucleicos de um gene pglH de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo: AAAATAAGCTTTATTATCGCAACTTTAAATTCAGGAGGTGCTGAGCGTGCTTTAGTAAC CTTAGCTAATGCACTTTGCAAAGAGCATGAAGTAAGTATTATTAAATTTCATGCAGGAG AATCTTTTTATAAGCTTGAAAATGAAGTTAAAGTTACAAGTTTGGAACAATTTAGATTT GACACGCTTTATCATAAAATCGCAAGTCGTTTTAAGAAATTTTTTGCTTTAAGAAAGGC TTTGAAAGAAAGTAAGTCTGATGTTTTTATTTCTTTTTTGGATACGACTAATATTGCTT GTATTGCTGCGAAAATAGGGCTTAAAACTCCACTCATTATAAGTGAGCATAGCAATGAA GCGTATTTAAAACCTAAAATTTGGCGTTTTTTAAGAAGGGTAAGCTATCCTTTTTGTGA TGCTTTAAGTGTGCTTGGAAGCAGTGATAAGGTGTATTATGAAAGATTTGTAAAAAGGG TTAAGCTTTTATTAAACCCTTGTCATTTTAGCGATGAAATTTCTTTTGATTCTAGTTTT GAAAAGGAAAATTTGGTTCTTTTTATAGGGCGTTTAGATCACAACAAAAACCCTGTAAT GTTTTTAAAAGCTATAGCGCATTTGGATAAAAATTTACAAGAAAATTATAAATTTGTTA TAGCAGGAGATGGACAGTTAAGACAAGAACTTGAATATAAGGTAAAATCTTTAGGAATA AAAGTTGATTTTTTAGGACGCGTTGAAAATGTCAAGGCTCTTTATGAAAAAGCAAAAGT GCTTTGCCTTTGTTCTTTTGTAGAGGGTTTGCCAACGGTTTTAATTGAAAGTTTGTATT TTGAGGTTTGTAGAATTTCAAGTTCTTATTATAATGGTGCTAAGGATTTAATCAAAGAT

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 118/261

112/242

AATCATGATGGGCTTTTGGTAGGTTGTGATGATGAAATAGCACTTGCTAAAAAACTTGA ACTTGTTTTAAATGATGAAAATTTTAGAAAAGAACTTGTAAATAATGCCAAACAAAGGT GTAAAGACTTTGAAATTTCTCATATCAAAGAAGAATGGCTTAAGCTTATAGCCGAGGTT (ID. DE SEQ. N°: 51)

[245] A sequência de aminoácidos da proteína PglH codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 51 é fornecida abaixo: KISFIIATLNSGGAERALVTLANALCKEHEVSIIKFHAGESFYKLENEVKVTSLEQFRF DTLYHKIASRFKKFFALRKALKESKSDVFISFLDTTNIACIAAKIGLKTPLIISEHSNE AYLKPKIWRFLRRVSYPFCDALSVLGSSDKVYYERFVKRVKLLLNPCHFSDEISFDSSF EKENLVLFIGRLDHNKNPVMFLKAIAHLDKNLQENYKFVIAGDGQLRQELEYKVKSLGI KVDFLGRVENVKALYEKAKVLCLCSFVEGLPTVLIESLYFEVCRISSSYYNGAKDLIKD NHDGLLVGCDDEIALAKKLELVLNDENFRKELVNNAKQRCKDFEISHIKEEWLKLIAEV (ID. DE SEQ. N°: 52)

[246] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglH de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 51). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglH, em que o gene pglH compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo

menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 51. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglH, em que o gene pglH compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos

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87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 51.

[247] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

PglH,	em	que	a referida	proteína	PglH	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 52. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PglH, em que a referida proteína PglH

compreende	uma	sequência de aminoácidos que é	pelo	menos
75%, pelo	menos	80%, pelo menos 81%, pelo menos	82%,	pelo
menos 83%,	pelo	menos 84%, pelo menos 85%, pelo	menos	86%,
pelo menos	87%,	pelo menos 88%, pelo menos 89%,	pelo	menos
90%, pelo	menos	91%, pelo menos 92%, pelo menos	93%,	pelo
menos 94%,	pelo	menos 95%, pelo menos 96%, pelo	menos	97%,
pelo menos	98%,	pelo menos 99% ou 100% homóloga â	i sequência

de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 52.

[248] pgll - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene pgll (por exemplo, um gene pgll de C. jejuni).

[249] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

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compreende	um	gene	pgll	está	localizado	em um	plasmídeo	na
bactéria .	Em	algumas modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene	pgll	está	localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.

[250] A sequência de ácidos nucleicos de um gene pgll de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo: ATGCCTAAACTTTCTGTTATAGTACCAACTTTTAATCGTCAAGTTTTGTTAGAAAAGGC TAT TAAAAG CATACAAAAT CAAGAT T T TAAAGAT T TAGAAAT TATTGTAAGCGATGATA ATTCTAGCGATGATACTAAAAGTGTGGTGCAAAATTTACAAAAAGATGATGATCGCATT AAGTATTTTTTAAATCAAAATTACAAACAAGGTCCAAATGGCAATAAAAACAATGGCTT AGATCAAGCAAGTGGCGAGTTTGTAACTTTTTTAGATGATGATGATGAGCTTTTATCCG GGGCTTTAAGTACCTTGATGCAAAAAGCAAATGAGGGTTATGCTCATGTTTTTGGAAAT TGTTTGATAGAAAAAGAAGGAAATTTAAGCAAGGAATTTAGCGGCAAGGGCTTGGAAAA AGATAGTGAAATTTCTAAAAAAGATTTTTTAATGGCTAAATTTAGCGGAGAGTTTTTTT CTGTTTTTAAAAAATCCCTACTTGAAAATAAGCGTTTTAATGAAGAATTTTATGGCAAT GAAGCCACGCTTTGGGTAAATTTATACAAAGAAAAAAGTTTTTATATCCATAAGGCTTT TAGGATTTATAGAATTTTTAGGCAAGATAGCGTGACTTTAGGGGCGAGTAAAAATGCTT ATAGGGTGTATTTGGATATTTAGAGCTTGCTAAAATTTTAGAAAATGAACTTAGAATGA GTAAGGATAAAGATTATAAAAAAACTTGTGCGAGTTATTATAAAATGGCAGCTTATTAT GCAAAACTTGCAAAAAATTATAAAGCCCTTTATAAATGTTTGTTTAAAAGCCTAAGTAT AAAAAT CAACGCTCCTGCTTTGATATTACTCATTTTAAGTATAATTC CAAATAATAT GA

TTGAAAAATTATCAAAAATTCGGGTG	(ID. DE SEQ. N°: aminoácidos da	53)
[251] A	sequência	de	proteína	Pgll
codificada	pelo ácido	nucleico do ID. DE	SEQ. N°:	53 é

fornecida abaixo:

MPKLSVIVPTFNRQVLLEKAIKSIQNQDFKDLEIIVSDDNSSDDTKSWQNLQKDDDRI

KYFLNQNYKQGPNGNKNNGLDQASGEFVTFLDDDDELLSGALSTLMQKANEGYAHVFGN CLIEKEGNLSKEFSGKGLEKDSEISKKDFLMAKFSGEFFSVFKKSLLENKRFNEEFYGN EATLWVNLYKEKSFYIHKAFRIYRIFRQDSVTLGASKNAYRVYLGYLELAKILENELRM SKDKDYKKTCASYYKMAAYYAKLAKNYKALYKCLFKSLSIKINAPALILLILSIIPNNM

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115/242

IEKLSKIRV (ID. DE SEQ. N°: 54)

[252] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pgll de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 53). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pgll, em que o gene pgll compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo

menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 53. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pgll, em que o gene pgll compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 53.

[253] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

Pgll,	em	que	a referida	proteína	Pgll	compreende	: uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos 86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo

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116/242 menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 54. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Pgll, em que a referida proteína Pgll compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,

pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 54.

[254] pglJ - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene pglJ (por exemplo, um gene pglJ de C. jejuni).

[255] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene pglJ está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene pglJ está localizado em um cromossomo da bactéria.

[256] A sequência de ácidos nucleicos de um gene pglJ de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo: TTAGGCATTTTTATTTATTCTTTAGGAAGTGGTGGTGCTGAAAGAGTTGTGGCGACTTT ATTGCCTATTTTAAGTTTGAAATTTGAAGTGCATTTGATCTTGATGAATGATAAAATTT CTTATGAAATTCCAGAGTGTCAAATTCATTTTTTAGAATGTTCAAAACCTAGTGAAAAT CCTATTTTGAAATTTTTAAAACTACCTTTTTTGGCTTTAAAATACAAAAAACTTTGCAG AAAT TTAGGTATT GATACAGAAT TTGTTTTTT TAAAT CGACCTAATTATATAGCTTTAA TGGCAAGAATGTTTGGAAACAAAACTCGCCTTGTGATCAATGAATGCACTACGCCAAGT GTGATGTATATGAAAAATAATTTTAATTCTTTGGTAAATAAATTTTTAATTTCTTTGCT

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117/242

TTACCCAAAAGCTGATTTAATCTTGCCTAATTCTAAGGGAAATTTAGAAGATTTAGTGC AAAAT TTTAGTATAAGTC CAAAAAAAT G T GAAAT TTTATACAATGCCATCGATT TAGAA AACATAGGGCAAAAAGCCCTTGAAGACATAGCTTTAAAAGATAAATTTATTTTAAGTGT AGGCAGGCTTGATAAAGGTAAAAATCATGCTTTATTAATTCGTGCTTATGCGAGATTGA AAACAGATTTAAAGCTTGTGATTTTAGGTGAAGGTGTGCTTAAGGATGAGCTTTTAGCT TTGATTAAAGAATTAAATTTGGAAGAAAAGGTTTTGCTTTTAGGATTTGATAATAATCC TTATAAATACATGGCTAAATGCGAATTTTTTGCTTTTGCTTCTGTGTTTGAAGGTTTTT CAAATGTTTTAATCGAAAGTTTGGCTTGTTCTTGTGCGGTGGTTTGCACTGATCATAAA AGTGGTGCAAGAGAGCTTTTTGGCGATGATGAATTTGGACTTTTAGTAGAAGTAGATAA TGAAAACTCTATGTTTCAGGGTTTAAAAACTATGCTTGAAGACGATAAATTAAGAAAAG CGTATAAAAACAAAGCTAAAACTAGGGCTAAAGCCTTTGATAAAGTAAAAATTGCACGC GATGCTTTGAAATATTTATTAGGATAA (ID. DE SEQ. N°: 55)

[257] A sequência de aminoácidos da proteína PglJ codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 55 é fornecida abaixo:

LGIFIYSLGSGGAERWATLLPILSLKFEVHLILMNDKISYEIPECQIHFLECSKPSEN PILKFLKLPFLALKYKKLCRNLGIDTEFVFLNRPNYIALMARMFGNKTRLVINECTTPS VMYMKNNFNSLVNKFLISLLYPKADLILPNSKGNLEDLVQNFSISPKKCEILYNAIDLE NIGQKALEDIALKDKFILSVGRLDKGKNHALLIRAYARLKTDLKLVILGEGVLKDELLA LIKELNLEEKVLLLGFDNNPYKYMAKCEFFAFASVFEGFSNVLIESLACSCAWCTDHK SGARELFGDDEFGLLVEVDNENSMFQGLKTMLEDDKLRKAYKNKAKTRAKAFDKVKIAR DALKYLLG (ID. DE SEQ. N°: 56)

[258] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglJ de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 55). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglJ, em que o gene pglJ compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo

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118/242 menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 55. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglJ, em que o gene pglJ compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 55.

[259] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

PglJ,	em	que	a referida	proteína	PglJ	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 56. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PglJ, em que a referida proteína PglJ compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos

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119/242

90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 56.

[260] pglB - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene pglB (por exemplo, um gene pglB de C. jejuni).

[261] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

compreende	um	gene	pglB	está	localizado	em um	plasmídeo	na
bactéria.	Em	algumas modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene	pglB	está	localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.

[262] A sequência de ácidos nucleicos de um gene pglB de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGTTGAAAAAAGAGTATTTAAAAAACCCTTATTTAGTTTTGTTTGCGATGATTGTATT AGCTTATGTTTTTAGTGTATTTTGCAGGTTTTATTGGGTTTGGTGGGCAAGTGAGTTTA ACGAGTATTTTTTCAATAATCAATTAATGATCATTTCAAACGATGGCTATGCTTTTGCT GAGGGCGCAAGAGATATGATAGCAGGTTTTCATCAGCCTAATGATTTGAGTTATTATGG ATCTTCTTTATCTACGCTTACTTATTGGCTTTATAAAATCACACCTTTTTCTTTTGAAA GTATCATTTTATATATGAGTACTTTTTTATCTTCTTTGGTGGTGATTCCTATTATTTTA CTAGCTAATGAATACAAACGCCCTTTAATGGGCTTTGTAGCTGCTCTTTTAGCAAGTGT AGCAAACAGTTATTATAATCGCACTATGAGTGGGTATTATGATACGGATATGCTGGTAA TTGTTTTACCTATGTTTATTTTATTTTTTATGGTAAGAATGATTTTAAAAAAAGACTTT TTTTCATTGATTGCCTTGCCATTATTTATAGGAATTTATCTTTGGTGGTATCCTTCAAG TTATACTTTAAATGTAGCTTTAATTGGACTTTTTTTAATTTATACACTTATTTTTCATA GAAAAGAAAAGATTTTTTATATAGCTGTGATTTTGTCTTCTCTTACTCTTTCAAATATA GCATGGTTTTATCAAAGTGCCATTATAGTAATACTTTTTGCTTTATTTGCTTTAGAGCA AAAACGCTTAAATTTTATGATTATAGGAATTTTAGGTAGTGCAACTTTGATATTTTTGA TTTTAAGTGGTGGGGTTGATCCCATACTTTATCAGCTTAAATTTTATATTTTTAGAAGC GATGAAAGTGCGAATTTAACACAGGGCTTTATGTATTTTAATGTTAATCAAACCATACA

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 126/261

120/242

AGAAGTTGAAAATGTAGATTTTAGCGAATTTATGCGAAGAATTAGTGGTAGTGAAATTG TTTTCTTGTTTTCTTTGTTTGGTTTTGTATGGCTTTTGAGAAAACATAAAAGTATGATT ATGGCTTTACCTATATTGGTGCTTGGGTTTTTAGCCTTAAAAGGAGGACTTAGATTTAC CATTTATTCTGTACCTGTAATGGCTTTAGGATTTGGTTTTTTATTGAGCGAGTTTAAGG CTATATTGGTTAAAAAATATAGCCAATTAACTTCAAATGTTTGTATTGTTTTTGCAACT ATTTTGACTTTGGCTCCAGTATTTATCCATATTTACAACTATAAAGCGCCAACAGTTTT T T C T CAAAAT GAAG CATCATTAT TAAAT CAAT TAAAAAATATAG C CAATAGAGAAGAT T ATGTGGTAACTTGGTGGGATTATGGTTATCCTGTGCGTTATTATAGCGATGTGAAAACT TTAGTAGATGGTGGAAAGCATTTAGGTAAGGATAATTTTTTCCCTTCTTTTTCTTTAAG TAAAGATGAACAAGCTGCAGCTAATATGGCAAGACTTAGTGTAGAATATACAGAAAAAA GCTTTTATGCTCCG CAAAAT GATAT T T TAAAAT CAGACATTTTACAAGCCATGAT GAAA GAT TATAAT CAAAG CAATGTGGATTTATTTCTAGCTTCATTAT CAAAAC CTGATTTTAA AATCGATACACCAAAAACTCGTGATATTTATCTTTATATGCCCGCTAGAATGTCTTTGA TTTTTTCTACGGTGGCTAGTTTTTCTTTTATTAATTTAGATACAGGAGTTTTGGATAAA CCTTTTACCTTTAGCACAGCTTATCCACTTGATGTTAAAAATGGAGAAATTTATCTTAG CAACGGAGTGGTTTTAAGCGATGATTTTAGAAGTTTTAAAATAGGTGATAATGTGGTTT CTGTAAATAGTATCGTAGAGATTAATTCTATTAAACAAGGTGAATACAAAATCACTCCA ATCGATGATAAGGCTCAGTTTTATATTTTTTATTTAAAGGATAGTGCTATTCCTTACGC ACAATTTATTTTAATGGATAAAACCATGTTTAATAGTGCTTATGTGCAAATGTTTTTTT TGGGAAATTATGATAAGAATTTATTTGACTTGGTGATTAATTCTAGAGATGCTAAAGTT TTTAAACTTAAAATTTAA (ID. DE SEQ. N°: 57)

[263] A sequência de aminoácidos da proteína PglB codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 57 é fornecida abaixo:

MLKKEYLKNPYLVLFAMIVLAYVFSVFCRFYWVWWASEFNEYFFNNQLMIISNDGYAFA EGARDMIAGFHQPNDLSYYGSSLSTLTYWLYKITPFSFESIILYMSTFLSSLWIPIIL LANEYKRPLMGFVAALLASVANSYYNRTMSGYYDTDMLVIVLPMFILFFMVRMILKKDF FSLIALPLFIGIYLWWYPSSYTLNVALIGLFLIYTLIFHRKEKIFYIAVILSSLTLSNI AWFYQSAIIVILFALFALEQKRLNFMIIGILGSATLIFLILSGGVDPILYQLKFYIFRS DESANLTQGFMYFNVNQTIQEVENVDFSEFMRRISGSEIVFLFSLFGFVWLLRKHKSMI

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121/242

MALPILVLGFLALKGGLRFTIYSVPVMALGFGFLLSEFKAILVKKYSQLTSNVCIVFAT ILTLAPVFIHIYNYKAPTVFSQNEASLLNQLKNIANREDYWTWWDYGYPVRYYSDVKT LVDGGKHLGKDNFFPSFSLSKDEQAANMARLSVEYTEKSFYAPQNDILKSDILQAMMKD YNQSNVDLFLASLSKPDFKIDTPKTRDIYLYMPARMSLIFSTVASFSFINLDTGVLDKP FTFSTAYPLDVKNGEIYLSNGWLSDDFRSFKIGDNWSVNSIVEINSIKQGEYKITPI DDKAQFYIFYLKDSAIPYAQFILMDKTMFNSAYVQMFFLGNYDKNLFDLVINSRDAKVF KLKI (ID. DE SEQ. N°: 58)

[264] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglB de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 57). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglB, em que o gene pglB compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo

menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 57. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglB, em que o gene pglB compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 57.

[265] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 128/261

122/242

PglB,	em	que	a referida	proteína	PglB	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 58. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PglB, em que a referida proteína PglB

compreende	uma	sequência de aminoácidos que é	pelo	menos
75%, pelo	menos	80%, pelo menos 81%, pelo menos	82%,	pelo
menos 83%,	pelo	menos 84%, pelo menos 85%, pelo	menos	86%,
pelo menos	87%,	pelo menos 88%, pelo menos 89%,	pelo	menos
90%, pelo	menos	91%, pelo menos 92%, pelo menos	93%,	pelo
menos 94%,	pelo	menos 95%, pelo menos 96%, pelo	menos	97%,
pelo menos	98%,	pelo menos 99% ou 100% homóloga â	i sequência

de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 58.

[266] pglA - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene pglA (por exemplo, um gene pglA de C. jejuni).

[267] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

compreende	um	gene	pglA	está	localizado	em um	plasmídeo	na
bactéria.	Em	algumas modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene	pglA	está	localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.

[268] A sequência de ácidos nucleicos de um gene pglA de

C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGAGAATAGGATTTTTATCACATGCAGGAGCGAGTATTTATCATTTTAGAATGCCTAT

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123/242

TATAAAAGCGTTAAAAGATAGAAAAGACGAAGTTTTTGTTATAGTGCCGCAAGATGAAT ACACGCAAAAACTTAGAGATCTTGGCTTAAAAGTAATTGTTTATGAGTTTTCAAGAGCT AGTTTAAATCCTTTTGTGGTTTTAAAGAATTTTTTTTATCTTGCTAAGGTTTTGAAAAA TTTAAATCTTGATTTTATTCAAAGTGCGGCACACAAAAGCAATACTTTTGGAATTTTAG CAGCAAAATGGGCAAAAATTCCTTATCGTTTTGCCTTAGTAGAAGGCTTGGGATCTTTT TATATAGATCAAGGTTTTAAGGCAAATTTAGTGCGTTTTGTTATTAATAGTCTTTATAA ATTAAGTTTTAAATTTGCACACCAATTTATTTTTGTCAATGAAAGTAATGCTGAGTTTA TGCGGAATTTAGGACTTAAAGAAAATAAAATTTGCGTGATAAAATCTGTAGGGATCAAT TTAAAAAAATTTTTTCCTATTTATGTAGAATCGGAAAAAAAAGAGCTTTTTTGGAAAAA TTTAAACATAGATAAAAAACCCATTGTGCTTATGATAGCAAGAGCTTTATGGCATAAGG GTGTAAAAGAATTTTATGAAAGTGCTACTATGCTAAAAGACAAAGCAAATTTTGTTTTA GTTGGTGGAAGAGATGAAAATCCTTCTTGTGCAAGTTTGGAGTTTTTAAACTCTGGCGC GGTGCATTATTTGGGTGCTAGAAGTGATATAGTCGAGCTTTTGCAAAATTGTGATATTT TTGTTTTGCCAAGCTATAAAGAAGGCTTTCCTGTAAGTGTTTTGGAGGCAAAAGCTTGC GGTAAGGCTATAGTGGTGAGTGATTGTGAAGGTTGTGTGGAGGCTATTTCTAATGCTTA TGATGGACTTTGGGCAAAAACAAAAAATGCTAAAGATTTAAGCGAAAAAATTTCACTTT TAT TAGAAGAT GAAAAAT TAAGAT TAAAT T TAG C TAAAAAT GCCGCCCAAGATGCTTTA CAATAC GAT GAAAATATAAT CGCACAGCGTTATT TAAAAC TTTATGATAGGGTAATTAA GAATGTA (ID. DE SEQ. N°: 59)

[269] A sequência de aminoácidos da proteína PglA codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 59 é fornecida abaixo:

MRIGFLSHAGASIYHFRMPIIKALKDRKDEVFVIVPQDEYTQKLRDLGLKVIVYEFSRA SLNPFWLKNFFYLAKVLKNLNLDFIQSAAHKSNTFGILAAKWAKIPYRFALVEGLGSF YIDQGFKANLVRFVINSLYKLSFKFAHQFIFVNESNAEFMRNLGLKENKICVIKSVGIN LKKFFPIYVESEKKELFWKNLNIDKKPIVLMIARALWHKGVKEFYESATMLKDKANFVL VGGRDENPSCASLEFLNSGAVHYLGARSDIVELLQNCDIFVLPSYKEGFPVSVLEAKAC GKAIWSDCEGCVEAISNAYDGLWAKTKNAKDLSEKISLLLEDEKLRLNLAKNAAQDAL QYDENIIAQRYLKLYDRVIKNV (ID. DE SEQ. N°: 60)

[270] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 130/261

124/242 um gene pglA de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°:

59). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglA, em que o gene pglA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo

menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 59. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglA, em que o gene pglA compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 59.

[271] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

PglA,	em	que	a referida	proteína	PglA	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 131/261

125/242 do ID. DE SEQ. N°: 60. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PglA, em que a referida proteína PglA compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,

pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 60.

[272] pglC - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene pglC (por exemplo, um gene pglC de C. jejuni).

[273] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

compreende	um	gene	pglC	está	localizado	em um	plasmídeo	na
bactéria.	Em	algumas modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene	pglC	está	localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.

[274] A sequência de ácidos nucleicos de um gene pglC de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo: GAAAAAGTTTTTAAAAGAATTTTTGATTTTATTTTATCTTTAGTGCTTTTAGTGCTTTT TTCTCCGGTGATTTTAATCACTGCTTTACTTTTAAAAATCACTCAAGGAAGTGTGATTT T TAC C CAAAAT CGTCCCGGGTTAGAT GAAAAAAT T T T TAAAAT T TATAAAT T TAAAAC C ATGAGCGATGAAAGAGATGAAAAGGGTGAGTTATTAAGCGATGAATTGCGTTTGAAAGC TTTTGGAAAAATCGTTAGAAGCTTAAGTTTGGATGAGCTTTTGCAACTTTTTAATGTTT TAAAAGGGGATATGAGTTTTGTTGGACCTAGACCTCTTTTGGTTGAGTATTTGCCTCTT TACAATAAAGAGCAAAAATTGCGTCATAAAGTGCGTCCAGGTATAACAGGATGGGCGCA GGTAAATGGTAGAAATGCTATTTCTTGGCAGAAAAAATTCGAACTTGATGTGTATTATG TGAAAAATATTTCTTTTTTGCTTGATTTAAAAATCATGTTTTTAACAGCTTTAAAGGTT

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 132/261

126/242

TTAAAACGAAGTGGGGTAAGCAAAGAAGGCCATGTTACAACAGAGAAATTTAATGGCAA GAACTGA (ID. DE SEQ. N°: 61)

[275] A sequência de aminoácidos da proteína PglC codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 61 é fornecida abaixo:

EKVFKRIFDFILSLVLLVLFSPVILITALLLKITQGSVIFTQNRPGLDEKIFKIYKFKT MSDERDEKGELLSDELRLKAFGKIVRSLSLDELLQLFNVLKGDMSFVGPRPLLVEYLPL YNKEQKLRHKVRPGITGWAQVNGRNAISWQKKFELDVYYVKNISFLLDLKIMFLTALKV LKRSGVSKEGHVTTEKFNGKN (ID. DE SEQ. N°: 62)

[276] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglC de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 61). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglC, em que o gene pglC compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo

menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 61. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglC, em que o gene pglC compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 61.

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 133/261

127/242

[277] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

PglC,	em	que	a referida	proteína	PglC	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 62. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PglC, em que a referida proteína PglC

compreende	uma	sequência de aminoácidos que é	pelo	menos
75%, pelo	menos	80%, pelo menos 81%, pelo menos	82%,	pelo
menos 83%,	pelo	menos 84%, pelo menos 85%, pelo	menos	86%,
pelo menos	87%,	pelo menos 88%, pelo menos 89%,	pelo	menos
90%, pelo	menos	91%, pelo menos 92%, pelo menos	93%,	pelo
menos 94%,	pelo	menos 95%, pelo menos 96%, pelo	menos	97%,
pelo menos	98%,	pelo menos 99% ou 100% homóloga â	i sequência

de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 62.

[278] pglD - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene pglD (por exemplo, um gene pglD de C. jejuni).

[279] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

compreende	um	gene	pglD	está	localizado	em um	plasmideo	na
bactéria.	Em	algumas modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene	pglD	está	localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.

[280] A sequência de ácidos nucleicos de um gene pglD de

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 134/261

128/242

C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGGCAAGAACTGAAAAAATTTATATTTATGGTGCTAGTGGTCATGGGCTTGTTTGTGA AGATGTGGCTAAAAATATGGGTTATAAAGAATGTATTTTTTTAGATGATTTTAAAGGAA T GAAAT T T GAAAG TACCTTACC TAAATAT GATTTTTTTATAGCCATAG GAAACAAT GAA AT T C GAAAAAAGAT T TAT CAAAAAAT T T CAGAAAAT G G C T T TAAAAT TGTCAATCTTAT CCATAAAAGCGCGCTTATAAGTCCTAGCGCAATCGTGGAAGAAAATGCAGGAATTTTAA TCATGCCTTATGTAGTGATTAACGCTAAAGCTAAAATAGAAAAAGGTGTGATTTTAAAT ACTTCAAGCGTAATTGAGCATGAATGTGTGATAGGGGAATTTTCTCATGTGAGTGTGGG AGCTAAATGTGCGGGTAATGTAAAAATTGGTAAAAATTGTTTTTTAGGGATTAATTCTT GTGTTTTGCCTAATTTAAGTTTGGCAGATGATAGTATTTTAGGTGGTGGAGCAACTTTA GTTAAAAATCAAGATGAAAAAGGTGTTTTTGTGGGAGTACCTGCAAAAAGGATGTAA (ID. DE SEQ. N°: 63)

[281] A sequência de aminoácidos da proteína PglD codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 63 é fornecida abaixo:

MARTEKIYIYGASGHGLVCEDVAKNMGYKECIFLDDFKGMKFESTLPKYDFFIAIGNNE IRKKIYQKISENGFKIVNLIHKSALISPSAIVEENAGILIMPYWINAKAKIEKGVILN TSSVIEHECVIGEFSHVSVGAKCAGNVKIGKNCFLGINSCVLPNLSLADDSILGGGATL VKNQDEKGVFVGVPAKRM (ID. DE SEQ. N°: 64)

[282] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglD de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 63). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglD, em que o gene pglD compreende uma sequência de

ácidos nucleicos	que i	é pelo	menos 75%,	pelo	menos 80%,	pelo
menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo :	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID.

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 135/261

129/242

DE SEQ. N°: 63. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglD, em que o gene pglD compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 63.

[283] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

PglD,	em	que	a referida	proteína	PglD	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 64. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PglD, em que a referida proteína PglD

compreende	uma	sequência de aminoácidos que é	pelo	menos
75%, pelo	menos	80%, pelo menos 81%, pelo menos	82%,	pelo
menos 83%,	pelo	menos 84%, pelo menos 85%, pelo	menos	86%,
pelo menos	87%,	pelo menos 88%, pelo menos 89%,	pelo	menos
90%, pelo	menos	91%, pelo menos 92%, pelo menos	93%,	pelo
menos 94%,	pelo	menos 95%, pelo menos 96%, pelo	menos	97%,
pelo menos	98%,	pelo menos 99% ou 100% homóloga â	i sequência

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 136/261

130/242 de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 64.

[284] pglE - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene pglE (por exemplo, um gene pglE de C. jejuni).

[285] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

compreende	um	gene	pglE	está	localizado	em um	plasmídeo	na
bactéria.	Em	algumas modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene	pglE	está	localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.

[286] A sequência de ácidos nucleicos de um gene pglE de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo: ATGAGATTTTTTCTTTCTCCTCCGCATATGGGTGGTAATGAATTAAAATACATAGAAGA AGTTTTCAAAAGCAATTATATAGCACCTTTGGGTGAATTTGTAAATCGCTTTGAACAAA GTGTCAAGGCTTACAGTAAAAGTGAAAATGCCTTAGCTTTAAATTCAGCCACAGCGGCT TTGCATTTAGCTTTAAGGGTGGCAGGGGTAAAACAAGATGATATTGTTTTGGCTTCTTC TTTTACTTTTATCGCTTCAGTAGCACCTATTTGTTATCTTAAAGCAAAACCTGTATTTA TAGATTGTGAT GAAAC TTATAATATCGATGTAGATTTAT TAAAG CTTGCTAT TAAAGAA TGTGAAAAAAAACCAAAAGCATTGATTTTAACTCATCTTTATGGCAATGCGGCTAAAAT GGATGAAATTGTTGAAATTTGCAAAGAAAATGAAATTGTTTTAATCGAAGATGCTGCTG AAGCTTTAGGAAGTTTTTATAAGAATAAAGCTTTAGGAACTTTTGGAGAATTTGGAGCT TATTCTTATAATGGCAATAAAATTATCACCACTTCAGGTGGAGGTATGCTTATAGGAAA AAATAAAGAAAAGATTGAAAAAGCAAGATTTTATAGCACTCAAGCTAGGGAAAATTGTT TGCATTATGAACATTTAGATTATGGTTATAATTACCGCTTAAGCAATGTTTTAGGAGCT ATTGGCGTAGCGCAAATGGAGGTTTTAGAACAAAGAGTGCTTAAAAAAAGAGAAATTTA TGAGTGGTATAAAGAATTTTTAGGAGAGTGTTTTAGCTTTTTAGATGAATTAGAAAATT CAAGAAGCAATCGCTGGTTAAGTACAGCTTTGATTGATTTTGATAAAAATGAACTTAAT T C T T G T CAAAAAGATATAAATAT CAG T CAAAAAAATAT TACTTTGCATC CAAAAAT T T C AAAAC T CATAGAAGAT T T GAAAAAT GAACAAATAGAAACAAGAC CAT TAT G GAAAG C TA TGCACGCTCAAGAAGTATTTAAAGGAGCTAAGGCTTATCTTAATGGCAATAGTGAGTTA TTTTTCCAAAAAGGAATTTGTTTGCCAAGTGGCACGGCGATGAGTAAAGATGATGTTTA

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 137/261

131/242

T GAAAT T T CAAAAC T GAT C T TAAAGAG CATAAAG G C T TAA	(ID	. DE	SEQ.	N° :
65)
[287] A	sequência	de aminoácidos	da	proteína	PglE
codificada	pelo ácido	nucleico do ID.	DE	SEQ.	N° :	65 é

fornecida abaixo:

MRFFLSPPHMGGNELKYIEEVFKSNYIAPLGEFVNRFEQSVKAYSKSENALALNSATAA LHLALRVAGVKQDDIVLASSFTFIASVAPICYLKAKPVFIDCDETYNIDVDLLKLAIKE CEKKPKALILTHLYGNAAKMDEIVEICKENEIVLIEDAAEALGSFYKNKALGTFGEFGA YSYNGNKIITTSGGGMLIGKNKEKIEKARFYSTQARENCLHYEHLDYGYNYRLSNVLGA IGVAQMEVLEQRVLKKREIYEWYKEFLGECFSFLDELENSRSNRWLSTALIDFDKNELN SCQKDINISQKNITLHPKISKLIEDLKNEQIETRPLWKAMHAQEVFKGAKAYLNGNSEL FFQKGICLPSGTAMSKDDVYEISKLILKSIKA (ID. DE SEQ. N°: 66)

[288] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglE de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 65). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglE, em que o gene pglE compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo

menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 65. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglE, em que o gene pglE compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo

menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 138/261

132/242 pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 65.

[289] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

PglE,	em	que	a referida	proteína	PglE	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 66. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PglE, em que a referida proteína PglE

compreende	uma	sequência de aminoácidos que é	pelo	menos
75%, pelo	menos	80%, pelo menos 81%, pelo menos	82%,	pelo
menos 83%,	pelo	menos 84%, pelo menos 85%, pelo	menos	86%,
pelo menos	87%,	pelo menos 88%, pelo menos 89%,	pelo	menos
90%, pelo	menos	91%, pelo menos 92%, pelo menos	93%,	pelo
menos 94%,	pelo	menos 95%, pelo menos 96%, pelo	menos	97%,
pelo menos	98%,	pelo menos 99% ou 100% homóloga â	i sequência

de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 66.

[290] pglF - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene pglF (por exemplo, um gene pglF de C. jejuni).

[291] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene pglF está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 139/261

133/242 compreende um gene pglF está localizado em um cromossomo da bactéria.

[292] A sequência de ácidos nucleicos de um gene pglF de C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

AT GAT T T T T TATAAAAG CAAAAGAT TAGCATTTTTTTTAACTTCAGATATTGTTTTAAT TTTACTTAGCGTTTATCTGGCTTTTTCTTTGAGATTTAGTGGAGATATTCCGAGTATTT TTTATCATGGTATGATGGTTTCTGCTATTATTTTGCTTGTTTTAAAACTTTCATTTTTG TTTGTTTTTAGAATTTATAAAGTAGCTTGGAGATTTTTTTCTCTCAATGAAGCAAGAAA GATTTTTATCGCTTTGCTTTTAGCTGAGTTTTGTTTTTTTCTTATTTTTTATTTTTTTA GTGATTTTTTTAATCCTTTTCCAAGAAGTGCTATTGTGATAGATTTTGTTCTTTCTTAT ATGTTTATAGGTACTTTAAGAATTAGCAAAAGAATGCTTGTGGATTTTAAACCTTCTAG AATGAAAGAAGAAGAAACTCCTTGTATTGTAGTAGGGGCAACTTCTAAGGCTTTGCATT TGTTAAAAGGTGCAAAAGAAGGTTCTTTAGGGCTTTTTCCTGTAGGCGTAGTTGATGCG AGAAAAGAGCTTATAGGGACTTATTGTGATAAATTTATTGTAGAAGAAAAAGAAAAAAT AAAATCTTATGTAGAACAAGGGGTAAAAACTGCCATTATTGCTTTAAGACTTGAACAAG AAGAGCTTAAAAAACTTTTTGAAGAACTTGTAGCTTATGGTATTTGCGATGTAAAAATA TTTTCTTT TACAAGAAAC GAAG CAAGAGATATCAG TATAGAAGAC T T G C T T GC TAGAAA ACCAAAAGATTTAGATGATAGTGCTGTGGCGGCTTTTTTAAAAGATAAGGTAGTTTTGG TAAGTGGAGCAGGTGGAACTATAGGCAGTGAACTTTGTAAGCAATGTATTAAATTTGGT GCTAAGCATCTTATCATGGTTGATCATAGTGAGTATAATCTTTATAAGATCAATGATGA T T TAAAT T TATATAAAGAAAAAAT TACTCCTATTTTACTGAGTATTT TAGATAAG CAAA GTTTAGATGAGGTATTAAAAACTTATAAACCCGAGCTTATTTTACATGCAGCCGCTTAT AAACATGTGCCTCTTTGCGAACAAAATCCACATTCAGCAGTAATCAATAATATTTTAGG AACTAAAATTTTATGCGACAGTGCTAAAGAAAACAAAGTAGCTAAATTTGTGATGATAA GTACAGATAAAGCAGTACGACCAACAAATATTATGGGTTGCACTAAGAGAGTTTGCGAG CTTTATACTTTAAGTATGAGTGATGAAAATTTTGAAGTTGCTTGTGTGCGTTTTGGTAA TGTTTTAGGTTCTAGTGGTAGTGTGATACCGAAATTTAAAGCACAAATTGCCAATAATG AGCCTTTAACTTTAACGCACCCTGATATAGTGCGTTATTTTATGCTTGTGGCTGAGGCA GTGCAACTTGTTTTACAAGCTGGAGCTATCGCAAAAGGGGGAGAACTTTTTGTTTTGGA TATGGGTAAGCCTGTGAAAATCATAGATTTAGCTAAAAAAATGCTTTTACTTTCTAATC

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 140/261

134/242

GCAATGATTTAGAAATTAAAATCACAGGCTTAAGAAAAGGTGAGAAGCTTTATGAAGAG CTTTTGATTGATGAAAATGATGCTAAAACACAATATGAGAGTATTTTTGTAGCAAAGAA TGAGAAGGTTGATCTTGATTGGCTTAATAAAGAGATAGAAAATTTACAAATATGTGAAG ATATTTCAGAGGCTTTATTAAAGATTGTACCTGAATTTAAACACAATAAAGAAGGTGTA (ID. DE SEQ. N°: 67)

[293] A sequência de aminoácidos da proteína PglF codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 67 é fornecida abaixo:

MIFYKSKRLAFFLTSDIVLILLSVYLAFSLRFSGDIPSIFYHGMMVSAIILLVLKLSFL FVFRIYKVAWRFFSLNEARKIFIALLLAEFCFFLIFYFFSDFFNPFPRSAIVIDFVLSY MFIGTLRISKRMLVDFKPSRMKEEETPCIWGATSKALHLLKGAKEGSLGLFPVGWDA RKELIGTYCDKFIVEEKEKIKSYVEQGVKTAIIALRLEQEELKKLFEELVAYGICDVKI FSFTRNEARDISIEDLLARKPKDLDDSAVAAFLKDKWLVSGAGGTIGSELCKQCIKFG AKHLIMVDHSEYNLYKINDDLNLYKEKITPILLSILDKQSLDEVLKTYKPELILHAAAY KHVPLCEQNPHSAVINNILGTKILCDSAKENKVAKFVMISTDKAVRPTNIMGCTKRVCE LYTLSMSDENFEVACVRFGNVLGSSGSVIPKFKAQIANNEPLTLTHPDIVRYFMLVAEA VQLVLQAGAIAKGGELFVLDMGKPVKIIDLAKKMLLLSNRNDLEIKITGLRKGEKLYEE LLIDENDAKTQYESIFVAKNEKVDLDWLNKEIENLQICEDISEALLKIVPEFKHNKEGV (ID. DE SEQ. N°: 68) .

[294] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglF de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 67). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglF, em que o gene pglF compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo

menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID.

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 141/261

135/242

DE SEQ. N°: 67. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglF, em que o gene pglF compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 67.

[295] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

PglF,	em	que	a referida	proteína	PglF	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 68. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PglF, em que a referida proteína PglF

compreende	uma	sequência de aminoácidos que é	pelo	menos
75%, pelo	menos	80%, pelo menos 81%, pelo menos	82%,	pelo
menos 83%,	pelo	menos 84%, pelo menos 85%, pelo	menos	86%,
pelo menos	87%,	pelo menos 88%, pelo menos 89%,	pelo	menos
90%, pelo	menos	91%, pelo menos 92%, pelo menos	93%,	pelo
menos 94%,	pelo	menos 95%, pelo menos 96%, pelo	menos	97%,
pelo menos	98%,	pelo menos 99% ou 100% homóloga â	i sequência

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 142/261

136/242 de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 68.

[296] pglG - Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene pglG (por exemplo, um gene pglG de C. jejuni).

[297] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que

compreende	um	gene	pglG	está	localizado	em um	plasmídeo	na
bactéria.	Em	algumas modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene	pglG	está	localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.

[298] A sequência de ácidos nucleicos de um gene pglG de

C. jejuni exemplar é fornecida abaixo:

ATGTATATAAAAGATATACAAAGATTTGAAGATAATCGCTATCGTGCTAGAGCTTATAT GAGTTATATTT TAACAAGAAAT C T G C C CAATAAAC TTCCTGATATTCACCTT GAAAC GA TTAAAACAGCTTTGGATAAAATAGCTCATGAAGTTGTTGTTTTTGATGCTTTGTATATT TTAGATATTTCAGGCATGCAAATAGAAAATGCGATTTCCTTAAATAAAGCTCATGAAAT AGGGCAGGGTGAGGATAGAAGTACTCGTTCTTATTTTTATAGAGCTGTAAAATTAAGAC GATGTGTTTTGAGCGATCCTTATCCTTCGGTTTTAAATAATGAGCTTTGCGTGACAGCT TCTATGCCAATTTACGATGATAAAAATAACTTGCTTTTTGTTGTTTGTATTGATATCAA GCTTGAAGATATTTTAAAGATTATTCAAGCAGGAAAATTTGAATTTGTTTTTACTCAGT TTAGTCGTTTGGTATATTTTTGCTTCGCACTGGTTTTATTTGTGATTACTTGTTTTTTA TTTCAAAAAGGTTTTTTTAGTCTTTTTGATAATCAAGCTATAGGTATAGAACATATGTT TGAAAGTACCATCGCTATAACTTTGGCTTTAGCTATTTTTGATTTGGCAAAAACTTTGA TCGAACAAGAAGTATTAGGAAGGACGAAAAAAGAAGAAGGTGGAATTCAAAAAACTATG GTGAGATTTTTGGGTTCTATTATCATTGCTTTAGCTATAGAAGCTTTGATGTTGGTATT TAAACTTGCTATTGGTGATCTTTCTCAGATGATTTATGCGATTTATCTTATCGGTGGAG TGAGCTTGCTTCTTTTAGGTTTAAGTGTATATTTATTTACGGTTAAGTATAAAAATAAT AATATTTGA (ID. DE SEQ. N°: 69)

[299] A sequência de aminoácidos da proteína PglG codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N° : 69 é fornecida abaixo:

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 143/261

137/242

MYIKDIQRFEDNRYRARAYMSYILTRNLPNKLPDIHLETIKTALDKIAHEVWFDALYI LDISGMQIENAISLNKAHEIGQGEDRSTRSYFYRAVKLRRCVLSDPYPSVLNNELCVTA SMPIYDDKNNLLFWCIDIKLEDILKIIQAGKFEFVFTQFSRLVYFCFALVLFVITCFL FQKGFFSLFDNQAIGIEHMFESTIAITLALAIFDLAKTLIEQEVLGRTKKEEGGIQKTM VRFLGSIIIALAIEALMLVFKLAIGDLSQMIYAIYLIGGVSLLLLGLSVYLFTVKYKNN NI (ID. DE SEQ. N°: 70)

[300] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglG de C. jejuni (fornecido como ID. DE SEQ. N°: 69). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglG, em que o gene pglG compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo

menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,
pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos
88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo
menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,
pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos

99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 69. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene pglG, em que o gene pglG compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 69.

[301] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PglG, em que a referida proteína PglG compreende uma

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 144/261

138/242

sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%, pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos 84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%, pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos 95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 70. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína PglG, em que a referida proteína PglG compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo
menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,
pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo menos	89%,	pelo	menos
90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo
menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,
pelo	menos	98%,	pelo menos	99% ou 100%	homóloga à	l sequência

de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 70.

C. Atenuação

[302] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo é modificada de modo que a expressão de um ou mais genes possa ser regulada de uma forma açúcar-responsiva. Em algumas modalidades, um ou mais genes endógenos, por exemplo, genes de virulência, são deletados do cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a deleção é uma deleção parcial do gene endógeno. Em algumas modalidades, a deleção é uma deleção de comprimento total do gene endógeno. Em algumas modalidades, o gene é alterado geneticamente para evitar a transcrição e/ou tradução do gene que codifica a proteína. Em algumas modalidades, o gene

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 145/261

139/242 endógeno é alterado geneticamente para inserir um terminador da transcrição no quadro de leitura aberta do gene. Em algumas modalidades, uma região reguladora do gene, por exemplo, gene de virulência, é modificada geneticamente para alterar (por exemplo, diminuir) a expressão do gene. Em algumas modalidades, o promotor de um gene, por exemplo, gene de virulência, é alterado para incluir um ou mais elementos reguladores (por exemplo, um promotor responsive a açúcares).

[303] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene, em que uma cópia endógena do gene no cromossomo bacteriano foi alterada e/ou deletada. Em algumas modalidades, o ácido

nucleico compreende um	i gene	que é	pelo	menos	75%,	pelo	menos
80%, pelo menos 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos 84%, pelo menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo menos 88%, pelo menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%, pelo menos 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos 95%, pelo menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,
pelo menos 99% ou 100% idêntico a	um gene endógeno no
cromossomo bacteriano	que	foi deletado e/ou alterado. Em
algumas modalidades, o	ácido nucleico	compreende um gene que
é pelo menos 75%, pelo	menos 80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos
82%, pelo menos 83%,	pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo
menos 86%, pelo menos	87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,
pelo menos 90%, pelo menos	91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos
93%, pelo menos 94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 146/261

140/242 menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homólogo a um gene endógeno no cromossomo bacteriano que foi deletado e/ou alterado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene de uma espécie, subespécies, sorovar ou cepa bacteriana que é diferente da espécie bacteriana da bactéria recombinante.

[304] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene de uma espécie, subespécies, sorovar ou cepa bacteriana que é a mesma que a espécie bacteriana da bactéria recombinante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene que está ligado operacionalmente a um promotor regulável (por exemplo, um promotor regulável por açúcares). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene que está ligado operacionalmente a um promotor regulável por ramnose, um promotor regulável por xilose, um promotor regulável por galactose, um promotor regulável por arabinose, um promotor regulável por ramnose, um promotor regulável por manose ou um promotor regulável por maltose. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende o gene está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende o gene está localizado no cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende o gene está localizado no lócus cromossômico que corresponde ao lócus de um gene endógeno que foi deletado ou alterado no cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é códon-otimizado (por exemplo, para aumentar a expressão do ácido nucleico na bactéria recombinante) .

Genes de GTP pirofosfoquinase

[305] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante

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141/242 compreende uma deleção em um gene relA endógeno, que codifica o RelA de GTP pirofosfoquinase. A inclusão de uma deleção de relA na bactéria recombinante desacopla a ocorrência da lise crescimento-dependente devido à necessidade de síntese de proteína continuada. Em algumas modalidades, a deleção do gene relA endógeno é uma deleção parcial. Em algumas modalidades, a deleção do gene relA endógeno é uma deleção de comprimento total.

Outros métodos de atenuação

[306] Outros métodos de atenuação são conhecidos na técnica. Por exemplo, a atenuação pode ser obtida por alteração (por exemplo, deleção) de sequências de ácidos nucleicos nativas encontradas na bactéria do tipo selvagem. Por exemplo, se a bactéria é Salmonella, exemplos não limitantes de sequências de ácidos nucleicos que podem ser usadas para atenuação incluem: uma sequência de ácidos nucleicos de pab, uma sequência de ácidos nucleicos de pur, uma sequência de ácidos nucleicos de aro, asd, uma sequência de ácidos nucleicos de dap, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL,

ompR,	htrA, hemA,	cdt, cya,	crp, dam,	phoP, phoQ,	rfc,	poxA,
galU,	mviA, sodC,	recA, ssrA, sirA,	inv, hilA,	rpoE,	flgM,
tonB,	slyA, e	qualquer	combinação destas	Mutações
atenuantes exemplares podem	ser aroA,	aroC, aroD	', cdt,	cya,

crp, phoP, phoQ, ompR, galE e htrA.

[307] Em certas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos acima podem ser colocadas sob o controle de um promotor regulado por açúcar, em que o açúcar está presente durante crescimento in vitro da bactéria recombinante, mas substancialmente ausente dentro de um hospedeiro animal ou humano. A cessação na transcrição das sequências de ácidos

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142/242 nucleicos listadas acima resultaria, então, na atenuação e na incapacidade da bactéria recombinante para induzir sintomas de doença.

D. Mutações adicionais

[308] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma deleção em um gene recF endógeno, que codifica a proteína RecF de replicação e reparo de DNA. Em algumas modalidades, a deleção do gene recF endógeno é uma deleção parcial. Em algumas modalidades, a deleção do gene recF endógeno é uma deleção de comprimento total. Em algumas modalidades, o gene recF endógeno é alterado geneticamente para inserir um terminador da transcrição no quadro de leitura aberta do gene.

[309] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma deleção em um gene recJ endógeno, que codifica a RecJ exonuclease. Em algumas modalidades, a deleção do gene recJ endógeno é uma deleção parcial. Em algumas modalidades, a deleção do gene recJ endógeno é uma deleção de comprimento total. Em algumas modalidades, o gene recJ endógeno é alterado geneticamente para inserir um terminador da transcrição no quadro de leitura aberta do gene.

[310] A bactéria também pode ser modificada para criar a sistema hospedeiro-vetor balanceado-letal, embora outros tipos de sistemas também possam ser usados (por exemplo, criação de heterozigotos de complementação). Para o sistema hospedeiro-vetor balanceado-letal, a bactéria pode ser modificada por manipulação de sua habilidade para sintetizar vários constituintes essenciais necessários para a síntese da camada rígida de peptidoglicano de sua parede celular. Em um exemplo, o constituinte é ácido diaminopimélico (DAP)

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 149/261

143/242 (veja, por exemplo, Patente U.S. N^os 5.672.345; 5.840.482; e 6.872.547, cujo conteúdo de cada uma é expressamente incorporado nesse relatório descritivo por referência). Várias enzimas estão envolvidas na síntese eventual de DAP.

[311] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma deleção em um gene asd endógeno. Em algumas modalidades, a deleção do gene asd endógeno é uma deleção parcial. Em algumas modalidades, a deleção do gene asd endógeno é uma deleção de comprimento total. Em algumas modalidades, o gene asd endógeno é alterado geneticamente para inserir um terminador da transcrição no quadro de leitura aberta do gene. Em algumas modalidades, o promotor de um gene asd endógeno é alterado para incluir um ou mais elementos reguladores (por exemplo, um promotor responsive a açúcares) . Em um exemplo, a bactéria é modificada por utilização de uma mutação hasdA para eliminar a habilidade da bactéria para produzir β-aspartato semialdeído desidrogenase, uma enzima essencial para a síntese de DAP. Outras mutações que resultam na abolição da síntese de DAP incluem, sem limitação, dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF e asd (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.872.547, incorporada nesse relatório descritivo por referência). Outras modificações que podem ser empregadas incluem modificações a uma habilidade da bactéria para sintetizar Dalanina ou para sintetizar ácido D-glutâmico (por exemplo, mutações CmurI), que são, ambos, constituintes exclusivos da camada de peptidoglicano da parede da célula bacteriana.

[312] Similarmente, várias modalidades podem compreender o cassete gênico araC ParaBAD c2 inserido na sequência de ácidos nucleicos de asd que codifica aspartato semialdeído

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144/242 desidrogenase. Como a sequência de ácidos nucleicos de araC é transcrita em uma direção que levaria à interferência na expressão de sequências de ácidos nucleicos adjacentes e afetaria de forma adversa o desempenho da cepa da vacina, uma sequência de terminação da transcrição (TT) é geralmente inserida 3' em relação à sequência de ácidos nucleicos de araC. Ά sequência de ácidos nucleicos cromossômica de asd é tipicamente inativada para permitir o uso de vetores de plasmídeo que codificam a sequência de ácidos nucleicos de asd do tipo selvagem no sistema hospedeiro-vetor balanceadoletal. Isso permite a manutenção estável de plasmideos in vivo na ausência de quaisquer atributos de resistência farmacológica que não são permissiveis em vacinas bacterianas vivas. Em algumas dessas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos de asd do tipo selvagem pode ser codificada pelo vetor descrito nesse relatório descritivo. 0 vetor habilita a expressão regulada de uma sequência codificadora de antígeno por meio do promotor reprimível.

Lise retardada regulada in vivo

[313] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante pode compreender deleções e/ou mutações de deleção-inserção para facilitar a lise retardada regulada in vivo que evita persistência bacteriana in vivo e a sobrevida se excretada (Tabela 3) . Essas mutações cromossômicas podem incluir: Δ (wza-wcaM) , AP_murA::TT araC Pbad murA e hasdA: : TT araC Pbad c2. Δ(wza-wcaM) elimina vinte enzimas necessárias à síntese de vários exopolissacarídeos que promovem formação de biofilme e à síntese de GDP-fucose, que é necessária para a síntese de ácido colônico (194), o que pode proteger as

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145/242 células de passarem por morte por menos parede celular decorrente da lise (195) . ÚP_murA::TT araC Pbad murA torna a síntese de MurA, a primeira enzima na síntese de ácido murâmico, dependente da presença de arabinose no meio de crescimento e deixa de ser sintetizado in vivo em função da ausência de arabinose (142) (118) . MurA diminui em consequência de divisão celular in vivo até, por fim, levar à lise e morte da célula (166) (191). 0 defeito de murA é complementado por vetores de plasmídeo MurA⁺ (142)(118). Com relação às mutações HasdA·. : TT araC Pbad c2, a enzima Asd é essencial para a síntese de ácido diaminopimélico necessário à síntese de peptidoglicano (167) (192) . A síntese arabinosedependente do repressor C2 é para tornar a expressão regulada retardada de sequências de DNA sob o controle de um promotor reprimida por C2 (142) (118) . A mutação HasdA é complementada por vetores de plasmídeo Asd⁺ (157) (193) .

[314] As duas últimas mutações são tipicamente complementadas por um vetor de plasmídeo de lise retardada regulada que possui uma expressão arabinose-dependente de genes asdA e murA. Uma bactéria recombinante que compreende essas mutações cresce normalmente na presença de arabinose. In vivo, no entanto, a bactéria para de expressar qualquer ácido nucleico que codifique as enzimas Asd e MurA, de modo que a síntese da camada de peptidoglicano da parede celular cessa, resultando, por fim, na lise da bactéria. Essa lise pode resultar na liberação de um bolo de antígeno específico para um patógeno entérico servindo, dessa forma, como um meio para aumentar a indução de imunidade contra aquele patógeno entérico conferindo, ao mesmo tempo, contenção biológica.

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 152/261

146/242

[315] Métodos de lise retardada adicionais são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° 9.481.888, cujo conteúdo completo é expressamente incorporado nesse relatório descritivo por referência.

Mutação sopB

[316] Para ser seguro para uso como uma vacina, o patógeno bacteriano entérico deve ser atenuado para virulência por deleção ou expressão regulada de um gene de virulência. No caso de Salmonella, por exemplo, uma molécula efetora secretada pelo sistema de secreção tipo 3, por exemplo, sopB, pode ser alterada para obter atenuação. Os genes podem ser deletados ou um promotor regulável pode ser inserido em frente do gene para obter atenuação retardada regulada. Como usado nesse relatório descritivo, o termo atenuação retardada regulada se refere à habilidade do micróbio para colonizar um hospedeiro e depois exibir um fenótipo de atenuação para evitar realmente causar uma infecção sintomática.

E. Sistemas reguladores repressores

[317] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico (por exemplo, um gene) que está ligado operacionalmente a um repressor-promotor regulável para facilitar a expressão regulável do gene. Dessa forma, em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene que codifica um repressor. Em algumas modalidades, o gene que codifica o repressor está ligado operacionalmente a um promotor regulável. Métodos de integrar cromossomicamente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor ligado operacionalmente a um promotor regulável são

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147/242 conhecidos na técnica e detalhados nos exemplos. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor não está integrada em um lócus cromossômico, de modo que a habilidade da bactéria para colonizar uma célula hospedeira é rompida. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que codifica um repressor que está integrado no lócus relA do cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que codifica um repressor que está integrado no lócus endA do cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou mais ácidos nucleicos que codificam um repressor. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o repressor está presente em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o repressor está localizado no cromossomo bacteriano. Caso haja mais de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor, cada sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor pode estar ligada operacionalmente a um promotor regulável, de modo que cada promotor seja regulado pelo mesmo composto ou condição. Alternativamente, cada sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor pode estar ligada operacionalmente a um promotor regulável, cada um deles regulado por um composto ou condição diferente.

[318] Como usado nesse relatório descritivo, um repressor se refere a uma biomolécula que reprime a

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148/242 atividade transcricional de um promotor. Em algumas modalidades, o repressor é sintetizado pela bactéria recombinante em quantidades suficientemente altas durante cultura in vitro, de modo que a transcrição de um ácido nucleico que está ligado operacionalmente a um repressorpromotor regulável seja reprimida. Isso pode ser particularmente vantajoso se, por exemplo, a expressão do produto codificado pelo referido ácido nucleico impede o crescimento in vitro da bactéria, e/ou a habilidade da bactéria para infectar e/ou colonizar um indivíduo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que está ligado operacionalmente ao repressor-promotor regulável expressa um antígeno de interesse. Em algumas modalidades, a concentração do repressor dentro da célula diminui gradualmente com cada ciclo de divisão celular depois que a transcrição do gene que codifica o repressor diminui ou cessa (por exemplo, in vivo) . 0 uso de um repressor particular, como descrito nesse relatório descritivo, pode depender, em parte, da espécie, subespécies, cepa ou sorovar da bactéria recombinante que está sendo usada. Em algumas modalidades, o repressor é derivado da mesma espécie (por exemplo, a mesma espécie bacteriana ou o mesmo fago) da qual o repressorpromotor regulável é derivado. Em algumas modalidades, o repressor não é derivado da mesma espécie bacteriana que a espécie bacteriana na qual o repressor é expresso. Por exemplo, em algumas modalidades, o repressor é derivado de E. coli se a bactéria recombinante é do gênero Salmonella. Outros repressores adequados incluem repressores derivados de um bacteriófago.

[319] Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um

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149/242 repressor e promotor regulável detalhada acima pode ser modificada de modo a otimizar o nível de expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor. 0 nível de expressão ótimo da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor pode ser estimado, ou pode ser determinado, por experimentação. Essa determinação deve levar em consideração se o repressor atua como um monômero, dímero, trímero, tetrâmero ou múltiplo superior, e também deve levar em consideração o número de cópia do vetor que codifica o antígeno de interesse. Em uma modalidade exemplar, o nível de expressão é otimizado de modo que o repressor seja sintetizado enquanto em um ambiente permissivo (ou seja, crescimento in vitro) em um nível que inibe substancialmente a expressão do ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse, e não é substancialmente sintetizado em um ambiente não permissivo permitindo, dessa forma, a expressão do ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse.

[320] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene lacl, que codifica a proteína repressora Lacl. A expressão do repressor codificado por lacl na bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo pode ser usada para regular a expressão de um antígeno de interesse expresso pela bactéria. Por exemplo, em algumas modalidades, a expressão do gene lacl é regulada por um promotor regulável por açúcares (por exemplo, um promotor regulável por arabinose). Quando cultivada na presença de arabinose, a bactéria recombinante expressará a proteína repressora Lacl, que, por sua vez, reprime a expressão de um gene que codifica

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150/242 um antígeno de interesse que está ligado operacionalmente a um promotor responsive a LacI (por exemplo, Ptrc, Piac, PT?iac e Ptac) · Mediante administração ao indivíduo e na ausência de uma fonte de arabinose, a síntese do repressor LacI cessa, levando à desrepressão do promotor responsive a LacI e à subsequente expressão do antígeno de interesse. A concentração de LacI na célula diminui à cerca da metade em cada divisão celular in vivo, levando a uma diminuição gradual do nível de repressão e a um aumento gradual da síntese do antígeno de interesse.

[321] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene lacl está localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene lacl está localizado em um cromossomo da bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene lacl está localizado no lócus cromossômico que corresponde ao lócus de um endógeno um gene relA que foi deletado ou alterado no cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene lacl e, dessa forma, uma cópia endógena do gene lacl no cromossomo bacteriano foi alterada e/ou deletada.

[322] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl de Escherichia coli. A sequência de ácidos nucleicos do gene lacl de E. coli é fornecida abaixo: gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgt ttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaag cggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaa cagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaat tgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatgg

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151/242 tagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgc gtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagc tgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaaca gtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattg ggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcg tctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacggg aaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggc atcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgc cattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgata ccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctg ctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaaggg caatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgc aaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcc cgactggaaagcgggcagtga (ID. DE SEQ. N°: 78)

[323] A sequência de aminoácidos da proteína LacI de E. coli codificada pelo ácido nucleico do ID. DE SEQ. N°: 78 é fornecida abaixo:

MKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRWNQASHVSAKTREKVEAAMAELNYIPNRVAQQLAGK QSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVWSMVERSGVEACKAAVHNLLAQR VSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSHEDGTRLGVEHLVAL GHQQIALLAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSAMSGFQQTMQMLNEG IVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISWGYDDTEDSSCYIPPLTTIKQDFRL LGQTSVDRLLQLSQGQAVKGNQLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPRALADSLMQLARQVS RLESGQ (ID. DE SEQ. N°: 79)

[324] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl, em que o gene lacl compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo

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152/242 menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 78. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl, em que o gene lacl compreende uma

sequência	de ácidos	nucleicos que é	pelo	menos	75%,	pelo
menos	80%,	pelo	meno	s 81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,
pelo	menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos
87%,	pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo
menos	91%,	pelo	meno	s 92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,
pelo	menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos
98%,	pelo	menos	99%	ou 100	% homóloga	à sequência	de ácidos

nucleicos do ID. DE SEQ. N°: 78.

[325] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína

Lacl,	em	que	a referida	proteína	Lacl	compreende	uma
sequência	de aminoácidos que é	pelo menos	75%,	pelo	menos
80%,	pelo	menos	81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo
menos	84%,	pelo	menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,
pelo	menos	88%,	pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos
91%,	pelo	menos	92%,	pelo	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo
menos	95%,	pelo	menos	96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,

pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 79. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Lacl, em que a referida proteína Lacl compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos

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90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% homóloga à sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 79.

[326] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl que está ligado operacionalmente a um promotor regulável (por exemplo, um promotor regulável por açúcares). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl que está ligado operacionalmente a um promotor regulável por açúcares. Em algumas modalidades, o promotor regulável por açúcar exibe atividade aumentada (por exemplo, transcrição aumentada) na presença de um açúcar específico e atividade diminuída na ausência de um açúcar. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl que está ligado operacionalmente a um promotor regulável por ramnose (por exemplo, um promotor regulável por açúcares). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl que está ligado operacionalmente a um promotor regulável por arabinose. Em algumas modalidades, o promotor regulável por arabinose é ParaBAD. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende a mutação UrelA·. ·. araC ParaBAD lacl TT.

II. Composições farmacêuticas

[327] Uma bactéria recombinante pode ser administrada a um hospedeiro como uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode ser usada como uma vacina para provocar uma resposta imune à bactéria recombinante, incluindo quaisquer antígenos que possam ser sintetizados e liberados pela bactéria. Em uma modalidade exemplar, a resposta imune é protetora. Respostas imunes aos antígenos são bem estudadas e amplamente relatadas.

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[328] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma bactéria recombinante que sintetiza um antígeno de Salmonella de interesse. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma bactéria recombinante que sintetiza um antígeno de Campylobacter de interesse. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma bactéria recombinante que sintetiza um antígeno de Salmonella de interesse e uma bactéria recombinante que sintetiza um antígeno de Campylobacter de interesse. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma bactéria recombinante que sintetiza um antígeno de interesse que compreende um Nglicano de Campylobacter. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou mais cepas bacterianas recombinantes, como descrito nesse relatório descritivo.

[329] As composições farmacêuticas podem ser administradas a qualquer hospedeiro capaz de montar uma resposta imune. Esses hospedeiros podem incluir todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos, incluindo animais domésticos, animais agrícolas, animais de laboratório e humanos, e várias espécies de pássaros, incluindo pássaros domésticos e pássaros de importância agrícola. De preferência, o hospedeiro é um animal de sangue quente. Em uma modalidade, o hospedeiro é uma vaca. Em algumas modalidades, o hospedeiro é um equino. Em outra modalidade,

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155/242 o hospedeiro é uma ave. Em outra modalidade, o hospedeiro é um humano.

[330] A composição farmacêutica pode ser administrada ao indivíduo como um profilático ou para fins de tratamento. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode ser administrada para a profilaxia ou tratamento de salmonelose. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode ser administrada para a profilaxia ou tratamento de uma infecção por Campylobacter. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode ser administrada para a profilaxia ou tratamento de salmonelose e/ou uma infecção por Campy1obacter.

[331] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante está viva quando administrada a um hospedeiro em uma composição farmacêutica descrita nesse relatório descritivo. Formulações de composição de vacina e métodos de administração adequados são detalhados abaixo.

[332] Uma composição farmacêutica que compreende uma bactéria recombinante pode opcionalmente compreender um ou mais aditivos possíveis, tais como carreadores, conservantes, estabilizantes, adjuvantes, e outras substâncias.

[333] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende um adjuvante. Adjuvantes são adicionados opcionalmente para aumentar a habilidade da vacina para desencadear, aumentar ou prolongar uma resposta imune. Em modalidades exemplares, o uso de uma bactéria recombinante viva atenuada pode atuar como um adjuvante natural. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante sintetiza e secreta um modulador imune. Materiais adicionais, tais como

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156/242 citocinas, quimiocinas e sequências de ácidos nucleicos bacterianas encontradas naturalmente em bactérias, como CpG, também são adjuvantes de vacinas potenciais.

[334] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende solução salina tamponada (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS)).

[335] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um produto alimentício.

[336] Em outra modalidade, o produto farmacêutico pode compreender um carreador farmacêutico (ou excipiente). Esse carreador pode ser qualquer solvente ou material sólido para encapsulação que seja atóxico para o hospedeiro inoculado e compatível com a bactéria recombinante. Um carreador pode dar forma ou consistência, ou atuar como um diluente. Carreadores farmacêuticos adequados podem incluir carreadores líquidos, por exemplo, soro fisiológico e outros sais atóxicos em concentrações fisiológicas ou quase fisiológicas, e carreadores sólidos não usados para humanos, por exemplo, talco ou sacarose, ou ração animal. Carreadores também podem incluir agentes estabilizantes, agentes umidificantes e emulsificantes, sais para variação da osmolaridade, agentes de encapsulação, tampões, e intensificadores da penetração cutânea. Carreadores e excipientes, bem como formulações para liberação parenteral e não parenteral de fármacos, são apresentados em Remington's Pharmaceutical Sciences 19^a Edição, Mack Publishing (1995). Quando usada para administração através dos brônquios, a composição farmacêutica é apresentada preferivelmente na forma de um aerossol.

[337] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica

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157/242 é liberada a um animal de criação (por exemplo, aves domésticas). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é liberada como uma pulverização grosseira (por exemplo, para uso em incubatórios para liberação às aves domésticas). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é liberada na água potável.

[338] Deve-se ter cuidado quando se utilizam aditivos, de modo que a bactéria recombinante não seja morta, ou tenha sua habilidade para colonizar eficazmente tecidos linfóides como, por exemplo, o GALT, NALT e BALT, comprometida pelo uso de aditivos. Estabilizantes, por exemplo, lactose ou glutamato monossódico (MSG), podem ser adicionados para estabilizar a composição farmacêutica contra diversas condições como, por exemplo, variações de temperatura ou um processo de liofilização. A bactéria recombinante também pode ser co-administrada com glutamato e/ou arginina, como descrito nesse relatório descritivo.

[339] As dosagens de uma composição farmacêutica podem e irão variar dependendo da bactéria recombinante, do antígeno regulado e do hospedeiro visado, como será observado por aqueles habilitados na técnica. De um modo geral, a dosagem só precisa ser suficiente para provocar uma resposta imune protetora na maioria dos hospedeiros. Experimentação de rotina pode estabelecer facilmente a dosagem necessária. Dosagens iniciais típicas de vacinas para administração oral poderiam ser cerca de 1 χ 10⁷ a 1 χ 10¹⁰ CFU, dependendo da idade do hospedeiro a ser imunizado. A administração de múltiplas dosagens também pode ser usada, como necessário para fornecer o nível desejado de imunidade protetora.

[340] A fim de estimular uma resposta preferida das

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158/242 células do GALT, NALT ou BALT, a administração da composição farmacêutica diretamente no intestino, nasofaringe ou brônquios é preferida, por exemplo, por administração oral, administração intranasal, intubação gástrica ou na forma de aerossóis, embora outros métodos de administração da bactéria recombinante, por exemplo, administração intravenosa, intramuscular, injeção subcutânea ou administração intramamária, intrapeniana, intra-retal, vaginal, ou outras vias parenterais, sejam possíveis, por exemplo, para aplicações anticâncer.

[341] Em algumas modalidades, essas composições são formuladas para administração por injeção (por exemplo, por via intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscular etc.).

[342] Em outra modalidade, a revelação fornece um método para provocar uma resposta imune contra um antígeno em um hospedeiro. 0 método compreende a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende uma bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo.

[343] Ainda em outra modalidade, uma bactéria recombinante pode ser usada em um método para provocar uma resposta imune contra um patógeno em um indivíduo necessitado. 0 método compreende a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende uma bactéria recombinante como descrita nesse relatório descritivo. Em uma modalidade adicional, uma bactéria recombinante descrita nesse relatório descritivo pode ser usada em um método para a melhora de um ou mais sintomas de uma doença infecciosa em

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159/242 um hospedeiro necessitado. 0 método compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende uma bactéria recombinante como descrita nesse relatório descritivo.

EXEMPLOS

[344] A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos seguintes, que não devem ser considerados de forma alguma como limitantes. Os conteúdos de todas as referências citadas, incluindo referências da literatura, patentes concedidas e pedidos de patentes publicados, como citados ao longo desse pedido, são aqui expressamente incorporados nesse relatório descritivo por referência. Deve ser ainda subentendido que os conteúdos de todas as figuras e tabelas aqui anexadas também são expressamente incorporados nesse relatório descritivo por referência.

Exemplo 1: Fundamentos e visão geral

[345] Campylobacter é uma das principais causas de gastrenterite alimentar de origem bacteriana em todo o mundo e é um problema importante de saúde pública (21-23). Uma estimativa recente pelo CDC (Center for Disease Control Centro de Controle de Doenças) indica que C. jejuni não apenas está entre as causas mais comuns de enfermidades de origem alimentar em humanos (mais de 800.000 casos por ano), mas também é uma das principais causas de hospitalização (mais de 8.000 anualmente) (24). Pacientes infectados com C. jejuni frequentemente apresentam diarréia aquosa/sanguínea, cólicas abdominais, náuseas e febre. Sequelas neurológicas severas, bacteremia e outras complicações extra-intestinais podem se desenvolver raramente (25) . C. jejuni está espalhado em animais produtores de alimentos, especialmente em aves

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160/242 domésticas. A maioria das infecções humanas por C. jejuni está predominantemente associada à manipulação inadequada de galinha crua ou ao consumo de galinha malcozida (1, 2, 2632) . O papel predominante de aves domésticas na campilobacteriose humana é suportado pela alta prevalência de C. jejuni tanto em pássaros vivos quanto em suas carcaças, achados de estudos epidemiológicos e detecção de genótipos idênticos tanto em aves domésticas quanto em infecções humanas (28-30, 33, 34).

[346] Aves domésticas, incluindo galinhas, perus, patos e gansos, são frequentemente infectados com C. jejuni e C. coli (3, 35-37). Apesar da colonização extensa no trato intestinal, a infecção por Campylobacter produz pouca ou nenhuma doença clínica em aves domésticas (3, 35, 38, 39) . Estudos de prevalência realizados na Europa e nos Estados Unidos relataram rebanhos C. Jejuni-positivos variando de 2% a 100% (38, 40-42). Tipicamente, a prevalência de C. jejuni aumenta à medida que os pássaros crescem, e alcança os maiores pontos na idade de abate para frangos. Após um rebanho de frangos ser infectado com C. jejuni, a maioria dos pássaros dentro do rebanho se torna colonizada (40, 4346) . Os altos números de C. jejuni no trato intestinal resultam em contaminação de carcaças de aves domésticas durante o abate, de tal modo que C. jejuni em carcaças de aves domésticas ao final de linha de processamento (pósresfriamento) está normalmente acima de 50%, variando de 0 a 100% (33, 47-53). Nos Estados Unidos, vários estudos relataram que uma grande percentagem de carcaças de frango processadas estava contaminada com números elevados de C. jejuni (47, 53-55). A contaminação de carcaças por C. jejuni

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161/242 é atribuível à fazenda de origem, na medida em que a alta prevalência em uma fazenda está normalmente associada a um nível elevado contaminação da carcaça em instalações de processamento (56-60).

[347] A salmonelose desenvolve diferentes síndromes, incluindo gastrenterite, febre entérica (febre tifóide) e bacteremia, e como transporte assintomático em animais e humanos (61). É a causa principal de enfermidade de origem alimentar nos Estados Unidos, com 35% das hospitalizações e 28% das mortes (24). Há aproximadamente 1,03 milhão de casos de Salmonella não tifóide a cada ano nos Estados Unidos, o que custa uma perda econômica de aproximadamente 3, 31 bilhões de dólares em consequência da mortalidade prematura, deficiência, e custos médicos e de produtividade, com uma perda anual de 16.782 anos de vida ajustados à qualidade (62) . A Salmonella tem uma ampla gama de hospedeiros e se adapta para sobreviver em uma grande variedade de ambientes diferentes, até mesmo após 16 meses em ração seca armazenada a 25°C (63, 64). Embora um grande número de infecções humanas esteja associado com fontes de animais de produção, as infecções também vêm de animais de estimação, répteis, frutas, vegetais e de outros humanos (65-67). A transmissão de Salmonella aos humanos tipicamente ocorre quando são ingeridos alimentos que estão contaminados por fezes de animais ou contaminados de forma cruzada por outras fontes (4) . Entre essas fontes, aves domésticas e produtos associados às aves domésticas são amplamente reconhecidos como estando entre os veículos mais importantes para infecções humanas por Salmonella de acordo com relatórios do CDC (5, 67-74) . Com o consumo crescente de aves domésticas

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162/242 e produtos de aves domésticas, o número de salmonelose associado às aves domésticas continua a ser uma questão significante de saúde pública nos Estados Unidos.

[348] Há mais de 2.000 sorotipos de Salmonella. S. Enteritidis, S. Heidelberg, S. Kentucky e S. Typhimurium estão comumente associadas com galinhas e, em vários graus, com outras espécies de animais de produção e infecções humanas. De acordo com o CDC e o USDA (United States Department of Agriculture - Departamento de Agricultura dos Estados Unidos), S. Enteritidis foi o sorovar mais comum implicado em enfermidade humana nos Estados Unidos (74) e o mais comumente associado com galinhas e ovos e, em um grau menor, com outras espécies de animais de produção (74-80) . S. Heidelberg também é encontrada na maioria das principais espécies de animais de produção, ovos e amostras de carnes comercializadas e está entre os cinco principais sorotipos mais comuns associados com doença humana (79, 81, 82) . Embora

S. Kentucky raramente cause infecções humanas nos Estados Unidos, é um sorovar emergente na Europa e África do Norte (83) e é prevalente em aves domésticas (75, 84, 85) .

[349] Tradicionalmente, antibióticos têm sido usados para tratar infecções bacterianas e para a promoção de crescimento em animais de produção. No entanto, esses usos de antibióticos contribuíram para as taxas crescentes de resistência antibiótica (86), resultando em contaminação de rebanhos e produtos alimentícios por Campylobacter, Salmonella, Enterococcus e Escherichia coii resistentes a antibióticos e, dessa forma, para os riscos crescentes de infecções humanas (87). Preocupações públicas sobre a disseminação de resistência antibiótica em patógenos

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163/242 bacterianos zoonóticos, o que impõe uma ameaça à eficácia da terapia antibiótica existente tanto na prática médica quanto na veterinária (88-97), levaram a União Européia, em 1999, a banir o uso da maioria dos antibióticos para promoção de crescimento para preservar a eficácia de fármacos humanos importantes (98) . Em 2004, o FDA (Food and Drug Administration agência governamental americana que regula e fiscaliza a fabricação de comestíveis, drogas e cosméticos) dos Estados Unidos baniu a enrofloxacina em animais de produção baseado no fato de que seu uso contribui para a resistência à fluorquinolona em patógenos humanos. Mais recentemente, o FDA e a indústria concordaram em parar o uso de antimicrobianos de promoção de crescimento. No entanto, há preocupações de que reduções no uso de antibióticos na produção de animais possa levar a um aumento nos patógenos de origem alimentar na carne e em outros alimentos de origem animal. Além de práticas de manejo, é necessário desenvolver outras formas eficazes de atenuar a emergência de bactérias resistentes a antibióticos e controlar patógenos de origem alimentar. Uma das melhores estratégias de prevenção é o desenvolvimento e uso de vacinas.

[350] Controle de Campylobacter: Galpões avícolas podem ser contaminados por Campylobacter por várias formas diferentes de várias fontes ambientais, tornando a prevenção da colonização do rebanho por Campylobacter uma tarefa muito desafiadora. Em geral, as estratégias de controle na fazenda examinadas para Campylobacter em aves domésticas podem ser amplamente divididas em duas abordagens: 1) prevenção da colonização do rebanho por uso de intervenções baseadas em biossegurança, e 2) prevenção e/ou redução da colonização

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164/242 por Campylobacter por medidas não baseadas em biossegurança como, por exemplo, vacinação, adição de bacteriocinas, bacteriófagos e aditivos alimentares, e exclusão competitiva (42, 99-101). O aumento da biossegurança em fazendas aparentemente possui um efeito notável sobre a redução da prevalência global do rebanho. No entanto, até mesmo as medidas mais rigorosas de biossegurança nem sempre possuem um efeito consistente e previsível sobre o controle de Campylobacter e sua eficácia na prevalência do rebanho é difícil de avaliar sob configurações comerciais (42, 102105) . Além disso, medidas de biossegurança rigorosas têm custos proibitivos, são difíceis de manter e sua eficácia parece variar com sistemas de produção (36, 42). Várias medidas que não são de biossegurança foram avaliadas para o controle de Campylobacter em pássaros vivos. Atualmente, não há produtos de exclusão competitiva, vacinas, bacteriocinas, bacteriófagos ou aditivos à ração/água disponíveis comercialmente para a exclusão de Campylobacter de galinhas sob condições de produção, embora alguns resultados promissores obtidos sob condições de laboratório tenham sido relatados recentemente (99, 106-108).

[351] A vacinação contra C. jejuni é uma estratégia promissora, mas exige otimização do regime de vacinação (por exemplo, indução de imunidade mucosa e possivelmente celular e sistemas de liberação práticos) com o uso de antígenos protetores. C. jejuni é geralmente considerado um comensal de galinhas, embora respostas sistêmicas e mucosas humorais tenham sido observadas (109-111) e anticorpos antiCampylobacter são detectáveis em proles como anticorpos derivados maternalmente (112). No entanto, a ausência de

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165/242 forte ativação de respostas imunes inatas/adaptivas em galinhas, ao contrário do que ocorre em humanos, exige o desenvolvimento de estratégias de vacina que aumentem a resposta imune aos antígenos de C. jejuni. Para que os antígenos de vacina C. jejuni sejam imunogênicos, é crucial liberar antígenos aos tecidos linfóides regionais e baço para estimular imunidade mucosa eficaz e respostas imunes sistêmicas de anticorpo e celulares. Portanto, foram construídas RASVs derivadas de S. Typhimurium que liberam antígenos protetores de C. jejuni para controlar/reduzir a prevalência de C. jejuni em aves domésticas.

[352] Controle de Salmonella. Como produtos de aves domésticas contaminados são a principal fonte de infecção humana por Salmonella, a vacinação de galinhas é uma estratégia importante para reduzir os níveis de Salmonella em rebanhos de aves domésticas, o que levará, por fim, a taxas menores de infecção humana por Salmonella. Considerando a expectativa de vida inteira de frangos como somente 5-6 semanas, é um desafio desenvolver uma vacina segura e eficaz contra Salmonella que pudesse fornecer proteção cruzada contra diferentes sorovares. Atualmente, há 3 tipos de vacina, viva atenuada, inativada e de subunidade; somente as duas primeiras são licenciadas para galinhas. Vacinas vivas atenuadas podem ser administradas oralmente, liberando um bolo de antígenos ao hospedeiro e induzem respostas imunes tanto de anticorpo quanto mediadas por células. Essas vacinas vivas usaram estratégias de atenuação diversas para cepas de S. Typhimurium (113-115) e S. Enteritidis (115-121). No entanto, eficácia e persistência variáveis, reversão para virulência, ausência de proteção

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166/242 cruzada e/ou possível interferência com procedimentos de testagem de Salmonella são preocupações (122-125). Vacinas mortas são seguras, mas devem ser liberadas por injeção cara e exige adjuvantes para aumentar a eficácia (123-125) . Dessa forma, ainda existe a necessidade de uma vacina viva atenuada segura e aprimorada, mas altamente imunogênica, contra Salmonella (125) . Os sorotipos de Salmonella são definidos pelas cadeias laterais de antígeno-0 de LPS imunologicamente heterogêneas e antígenos flagelares. Portanto, a indução de respostas imunes a esses antígenos heterogêneos não servirá bem à finalidade de indução de imunidade protetora cruzada à diversidade de sorotipos. Por outro lado, Salmonella e outros patógenos bacterianos entéricos possuem diversos antígenos com reatividade cruzada imunologicamente relacionados. Esses incluem o polissacarídeo do núcleo de LPS, que é o mesmo na maioria, se não em todos, os sorotipos de S. enterica, exceto para o sorotipo Arizonae de S. enterica (126) . Além disso, numerosas proteínas da membrana externa (OMPs), embora possuam micro-heterogeneidade, no entanto compartilham determinantes antigênicos (127), como possuem as proteínas da membrana externa reguladas por ferro (IROMPs) que são necessárias para a aquisição de ferro (128), uma função essencial importante para o sucesso do patógeno dentro de um animal infectado. Foram desenvolvidas estratégias para vacinas contra Salmonella para exibir determinantes antigênicos de superfície do tipo selvagem in vitro e durante a fase inicial da infecção através das superfícies no hospedeiro imunizado oralmente e depois parar de sintetizar cadeias laterais de antígeno-0 de LPS e sintetizar constitutivamente proteínas da membrana externa

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167/242 reguladas por ferro (IROMPs) em órgãos internos (19, 129). A eliminação gradual de cadeias laterais de antígeno-0 de LPS in vivo também expõe melhor as OMPs e IROMPs imunologicamente relacionadas que reagem de forma cruzada para vigilância e estimulação do sistema imune. Respostas imunes às IROMPs são conhecidas por serem eficazes na prevenção de infecção septicêmica com enteropatógenos, especialmente E. coli, que causa colissepticemia em galinhas e perus (130) . Além disso, anticorpos induzidos para IROMPs de um sorotipo bacteriano podem reconhecer IROMPs sintetizadas por outros sorotipos (131). O gene fur codifica um repressor que, na presença de ferro livre, reprime todos os genes que codificam IROMPs (128) . Quando as concentrações de ferro ficam baixas, como ocorre com tecidos do hospedeiro animal além da barreira da parede intestinal, o Fur deixa de ser sintetizado em um nível alto e se observa expressão constitutiva de IROMPs e outros genes regulados por Fur necessários para sequestrar ferro para longe do hospedeiro animal infectado (128) . Mutantes de fur são atenuados quando alimentados oralmente, gerando uma LD50 dois a três logs maior quando administrados a camundongos (132) ou pintos no dia da eclosão (133). Para obter um nível constitutivo elevado de síntese de todos os componentes para aquisição de ferro, incluindo IROMPs, o promotor do gene fur (Pf_Ur) foi deletado e substituído com um ativador-promotor araC Pbad firmemente regulado, de modo que a expressão do gene fur seja dependente exclusivamente da presença de arabinose (129) e seja independente da concentração de ferro. O crescimento de vacinas de S. Typhimurium com uma mutação de deleção-inserção APf_Ur::TT araC ParaBAD fur em meios com um

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168/242 nível baixo de arabinose resulta em colonização muito boa de tecidos linfóides, atenuação total em doses de 10⁹ CFU e níveis muito elevados de imunidade protetora induzida (129).

[353] Sorovares de Salmonella modificados por engenharia genética Typhimurium (134), Paratyphi A e Typhi (135, 136) foram criados como vacinas para atenuação retardada regulada in vivo (129, 134), síntese retardada regulada in vivo de antígenos protetores especificada por sequências de DNA códon-otimizadas (137-140) e lise retardada regulada in vivo (140-142), de modo que possam ser desenvolvidas vacinas sob condições que as permitam exibir, após pulverização grosseira ou imunização oral, as capacidades de uma cepa do tipo selvagem para sobreviver aos estresses da defesa do hospedeiro e colonizar eficientemente tecidos linfóides efetores antes de manifestar atenuação para impedir sintomas de doença e para sintetizar antígenos protéicos para induzir respostas imunes protetoras. Cepas foram modificadas por engenharia genética para eliminar ou diminuir a síntese de antígeno-0 de LPS sorotipo-específico (18, 143) e antígenos flagelares, para expor núcleo de LPS conservado (18, 19, 143) e superexpressar antígenos protéicos de superfície da membrana externa que reagem imunologicamente de forma cruzada (19, 144) necessários para a aquisição de íons essenciais de ferro e manganês, para diminuir a indução de sintomas de gastrenterite (145) retendo, ao mesmo tempo, as habilidades para recrutar imunidade inata, e para exibir contenção biológica por lise de células para impedir a persistência in vivo ou sobrevida, se excretadas (140-142). As cepas são totalmente seguras em doses altas aos recémnascidos (136, 146, 147) mulheres grávidas, camundongos

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169/242 malnutridos em termos de proteínas e imunocomprometidos. Também filhotes neonatais (7 dias de idade) nascidos de mães imunizadas com a mesma cepa de RASV desenvolvem respostas imunes melhores e exibem níveis maiores de imunidade protetora ao ataque do que filhotes nascidos de mães não imunizadas. Um resultado um pouco análogo foi observado há muito anos, quando pintos eclodidos de ovos postos por galinhas imunizadas exibiram níveis maiores de imunidade protetora à mesma vacina atenuada de S. Typhimurium usada para imunizar as galinhas do que pintos de ovos postos por galinhas não imunizadas (148). Essas tecnologias foram usadas para desenvolver vacinas para evitar infecções de recém-nascidos com Streptococcus pneumoniae (147), Mycobacterium tuberculosis (140, 149), uma diversidade de patógenos bacterianos entérico que causam doenças diarréicas em humanos e vírus influenza (141). Em um experimento humano recente de uma RASV derivada de S. Typhi, foram observados a segurança completa e o derramamento de zero células viáveis da vacina em fezes coletadas por 12 dias e com doses de vacina de até 10¹⁰ CFU administradas oralmente (150) . Também foram desenvolvidas vacinas usando RASVs de S. Typhimurium contra patógenos de animais agricolamente importantes, especialmente para patógenos de galinhas como, por exemplo, espécies de Eimeria que causam coccidiose (151, 152) e Clostridium perfringens que causa enterite necrótica (153, 154). A esse respeito, seis estudos (140-142, 154-156) demonstram que RASVs com o fenótipo de lise retardada regulada in vivo geraram níveis superiores de respostas imunes e imunidade protetora, comparadas com RASVs que não possuíam esse fenótipo de lise.

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[354] Para eliminar o uso de vetores de plasmídeo com genes de resistência farmacológica não permitidos e para estabilizar vetores de plasmídeo em RASVs in vivo, (157) um sistema de vetor-hospedeiro balanceado-letal foi desenvolvido por deleção do gene asd para impor uma exigência obrigatória para ácido diaminopimélico (DAP), um constituinte essencial da camada rígida da parede celular e um vetor de plasmídeo com o gene asd do tipo selvagem. Também foi demonstrado que respostas imunes melhores aos antígenos protetores sintetizados poderiam ser obtidas ao tê-los secretados usando T2SSs como, por exemplo, fusão às sequências de β-lactamase do terminal-N e -C (158, 159), que agora foi adicionalmente otimizado (154) . A imunogenicidade aumentada é parcialmente consequência da formação aumentada de vesículas imunogênicas da membrana externa que contêm antígenos protetores (19, 160).

[355] Também foram construídos (118) e usados plasmídeos que são necessários para a exibição do fenótipo de lise retardada regulada in vivo em conjunto com os derivados de χ11730, χ11791 e χ12341. Essas cepas possuem uma expressão regulada por araC ParaBAD do gene murA que codifica a primeira enzima na síntese de ácido murâmico e a mutação Lasd que bloqueia a síntese de DAP em seu cromossomo. Esses plasmídeos de lise causam a síntese de antígenos protetores para liberação por lise de células e possuem os genes murA e asd regulados por araC ParaBAD com códons de início GTG para diminuir a eficiência da tradução. Ο P22 Pr, localizado com orientação oposta à transcrição dos genes do plasmídeo araC ParaBAD GTG-murA GTG-asd, é reprimido pelo repressor de C2 feito durante o crescimento da cepa em meio com arabinose

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171/242 (em consequência da mutação AasdA::TT araC ParaBAD c2) . No entanto, a concentração de C2 diminui em consequência da divisão celular in vivo para causar síntese dirigida por Pr de mRNA anti-senso para bloquear a tradução de mRNA de asdA e murA residual. Os terminadores da transcrição (TT) flanqueiam todos os domínios de plasmídeo para lise controlada, replicação e expressão de gene, de modo que a expressão em um domínio não afete atividades de outro domínio.

A. Imunidade protetora contra infecção por Eimeria em galinhas.

[356] Foram demonstradas respostas protetoras em galinhas contra E. acervulina que causa coccidiose. As Figs. 1A e 1B mostram dados comparativos para imunização de galinhas com cepas não-lise e de lise com e sem a mutação AsifA para liberação do antígeno de Eimeria S07. A mutação AsifA permite que a RASV escape da vesícula que contém Salmonella (SCV), de modo que a lise ocorra no citosol para aumentar a indução de imunidades celulares CD8-, CD17 e NKTdependentes. Nitidamente, a proliferação de linfócitos Eimeria S07-específicos mais extensa foi induzida por cepas de RASV com o fenótipo de lise e a mutação AsifA (Grupo 7). Esse mesmo grupo gerou os maiores níveis de respostas de anticorpos IgA antígeno-específicas (Fig. IC e 1D), células CD8 (Fig. 2A) , resposta de citocina (Fig. 2B) e ganho de peso após ataque por oocisto de Eimeria (Tabela 1). Com base nesses resultados, a mutação AsifA é incluída nas cepas de vetor de RASV para especificar a síntese e liberação de antígenos protetores de C. jejuni. Esses resultados coletivos demonstram a eficácia na utilização dessas RASVs

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172/242 aprimoradas para o desenvolvimento de vacinas que irão conferir imunidade protetora às cepas de Salmonella e C. jejuni em galinhas. 0 uso de RASVs que também exibem contenção biológica completa sem persistência in vivo ou sobrevida se derramadas nas fezes, fornece outro benefício importante.

Tabela 1. Imunização de frangos de corte com cepas de RASV e atacados com oocistos de E. tenella.

Grupo	a Imunizaçã o primária	Imunização secundária	b Ataque por oocisto	c Ganho de peso (média ± SEM)	d Proporção de conversão alimentar (FCR)
1	BSG	BSG	Não	576 ± 32	((((((1(/(((7(5(((((((1(((((((0(/(1(7((((((
2	BSG	BSG	Sim	510 ± 17	1,95 ± 0,06
3	(pYA3681)	Sim	Sim	491 ± 36	2,22 ± 0,47
4	χ11442 (PYA5301)	Sim	Sim	502 ± 58	2,04 ± 0,17
5	χ11840 (PYA5301)	Sim	Sim	433 ± 28	2,03 ± 0,19
6	χ11730 (pYA5293)	Sim	Sim	558 ± 7	1,91 ± 0,08
7	((((((((((((((((((1(11111(((((((((((((((((( (pYA5293)	Sim	Sim	598 ± 20	1,77 ± 0,00

^a As galinhas foram vacinadas oralmente quando com 1 semana de idade e novamente 1 semana mais tarde.

^b Três semanas mais tarde, os grupos G2 a G7 foram inoculados com 10⁵ oocistos de E. tenella.

Grupo 3 = Controle de vetor vazio. Grupos 3 & 4 = RASVs não lise que liberam antígeno de Eimeria S07. Grupos 6 & 7 = RASVs de lise que liberam antígeno S07. Grupo 7 - RASV também

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173/242 escapa da vesícula que contém Salmonella para lise no citosol para induzir imunidades sistêmica e celular máximas.

^c Ganho de peso em gramas calculado ao longo do período de infecção (6 dias) entre ataque por E. tenella e terminação. ^d FCR, proporção de conversão alimentar calculada como quantidade média de ração (g) consumida/ganho de peso médio ao longo do período de infecção (6 dias) entre ataque por E. tenella e terminação.

B. cepas de vetor de vacina de S. Typhimurium

[357] Cepas hospedeiras de E. coii para a construção de vetores de plasmideo recombinantes e para transferência por conjugação de vetores suicidas para construção de S. Typhimurium com propriedades aprimoradas com alterações mutacionais adicionadas estão listadas na Tabela 2. As cepas usadas para a construção e avaliação da síntese de cepas de RASV e liberação do antígeno de Eimeria S07 e antígenos de C. jejuni também estão listadas na Tabela 2. Os atributos fenotípicos associados às mutações nessas cepas são descritos na Tabela 3.

Tabela 2: Cepas bacterianas.

Cepas de E. coii χ6212(pYA232): <p80d lacZ DM15 deoR Δ (lacZYA-argF) UI69 supE44

1~ gyrA96 recAl relAl endAl SasdA4 Szhf-2::TnlO hsdR17 (r“ m⁺), laclq in pSClOl ori, Tc plasmid 10.2 kb χ7213: thi-1 thr-1 leuB6 glnV44 fhuA21 lacYl recAl RP4-2-Tc::Mu [1 pir] OasdA4 Ozhf-2::Tnl0

Cepas de S. Typhimurium χ11442: OasdA33 OrelAl 98: :araC P_Bad lad TT OaraBAD23 Opmi-2426 χ11730: DP_murA25::TT araC P_araBAD murA

OasdA27: :TT araC P_araBAD c2 D (wza-wcaM) -8 Opmi-2426

OrelA198: :araC P_araBAD lad TT χ11791: DP_murA25::TT araC P_araBAD murA

OasdA27: :TT araC Pbad c2 D(wza-wcaM) -8 Opmi-2426

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OrelA198: :araC P_araBAD lacl TT DsifA26 χ11840: OasdA33 OrelAl 98: : araC P_araBAD lacl TT OaraBAD23 Opmi2426 OsifA26 χ12341: DP_murA25::TT araC P_araBAD murA

OasdA27: :TT araC P_araBAD c2 D (wza-wcaM) -8 Opmi-2426

OrelAl 97: : araC P_araBAD lacl TT ArecF126 AsifA26 OwaaL46 ApagL64 : : TT rhaRS P_rh_aBAD waaL χ12396:

DPmurA25::TT araC P_araBAD murA OasdA27: : TT araC P_araBAD c2 D (wzawcaM)-8 Opmi-2426

OrelAl 97: : araC P_araBAD lacl TT OrecF126 OsifA26 OwaaL46

OpagL64::TT rhaRS P_rh_aBAD waaL DP_fur3₃::TT araC P_araBAD fur χ12445:

DP_mUrA25::TT araC P_araBAD murA OasdA27::77 araC P_araBAD c2 D (wzawcaM)-8 Opmi-2426 OrelA197: :

araC P_araBAD lacl TT OrecF126 OsifA26 AwbaP45

OpagL14::TT araC P_araBAD wbaP χ12452:

DP_mUrA25::TT araC P_araBAD murA OasdA27::77 araC P_araBAD c2 D (wzawcaM)-8 Opmi-2426 OrelAl 97: : araC P_araBAD lacl TT OrecF126 OsifA26 OwaaL46 OpagL64: :TT rhaRS P_rh_aBAD waaL OompAll T)sopB1925

Tabela 3. Mutações e fenótipos associados usados em cepas de vacina de S. Typhimurium ^a

Genótipo Fenótipo

A. Deleção e mutações de deleção-inserção para conferir uma atenuação retardada regulada

Δριαί - codifica fosfomanose isomerase necessária à síntese de GDP-manose para antígeno-0 de LPS e, dessa forma, necessária à virulência (18).

AwaaL HpagL: :TT rhaRS PrhaBAD waaL - regula a síntese da enzima responsável pela adesão da primeira subunidade de antígeno0 de LPS ao núcleo de LPS (a deleção do gene waaL é necessária para evitar deficiência na expressão de outros genes de óperon rfb (161); o cassete de expressão regulada é, portanto, inserido no gene pagL.

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APf_ur::TT araC Pbad fur - torna a síntese de Fur dependente da presença de arabinose no meio de crescimento e deixa de ser sintetizada in vivo em função da ausência de arabinose (162) (104) . Fur diminui em consequência da divisão celular in vivo para levar à síntese elevada de IROMPs e atenuação presumivelmente em função de uma sobrecarga de ferro.

APmntR::TT araC Pbãd mntR - torna a síntese de MntR dependente da presença de arabinose no meio de crescimento e deixa de ser sintetizada in vivo em função da ausência de arabinose (162) (104). MntR diminui em consequência da divisão celular in vivo para causar a síntese elevada de MnROMPs para aumentar a indução de imunidade protetora cruzada.

B. Promotores e mutações de deleção-inserção para a síntese regulada in vivo de antígenos

Ptrc - um promotor expresso em nível alto sob condições tanto anaeróbicas quanto aeróbicas e reprimido por LacI (163).

ArelA: : araC Pbad lad TT - a mutação relA desacopla a regulação do crescimento de uma dependência da síntese de proteína, um atributo importante em cepas com lise retardada regulada (164) (189) . A síntese arabinose-dependente do repressor LacI é para permitir a expressão regulada retardada de sequências de DNA sob o controle de Ptrc (137) (113) .

Fago P22 Pl e Pr - esses promotores são reprimíveis pela síntese arabinose-dependente do repressor de C2 (Vander Byl e Kropinski (190) (165).

C. Deleção e mutações de deleção-inserção para facilitar a lise retardada regulada in vivo

ΔΡπμγα: :TT araC Pbad murA - torna a síntese de MurA, a primeira enzima na síntese de ácido murâmico, dependente da presença

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176/242 de arabinose no meio de crescimento e deixa de ser sintetizada in vivo em função da ausência de arabinose (142) (118) . MurA diminui em consequência da divisão celular in vivo até, por fim, levar à lise e morte da célula (166) (191) . 0 defeito de murA é complementado por vetores de plasmídeo MurA+ (142) (118).

AasdA::TT araC Pbãd c2 - a enzima Asd é essencial para a síntese de ácido diaminopimélico necessário à síntese de peptidoglicano (167) (192). A síntese arabinose-dependente do repressor de C2 é permitir a expressão regulada retardada de sequências de DNA sob o controle de um promotor reprimido por C2 (142) (118) . A mutação HasdA é complementada por vetores de plasmídeo Asd⁺ (157) (193).

Δ(wza—wcaM) - elimina vinte enzimas necessárias para sintetizar vários exopolissacarídeos que promovem a formação de biofilme e para a síntese de GDP-fucose, que é necessária para a síntese de ácido colânico (168) (194), que pode proteger células que passam por morte por perda da parede celular da lise (169) (195) .

D. Mutações necessárias para aumentar a liberação eficaz de antígenos protetores de epítopo de célula T

AsifA - permite que Salmonella escape de endossomo = vesícula que contém Salmonella (SCV) para lise no citosol (170) (196) .

E. Outras mutações contribuintes

ArecF - elimina recombinase que facilita a recombinação inter- e intraplasmídica (171-173) (197-199).

AsopB - elimina inflamação intestinal excessiva e aumenta a indução de imunidade mucosa (145, 174-176) (122, 123)

AompA - elimina uma proteína da membrana externa importante

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177/242 que é altamente imunogênica (177), mas does não contribui para a imunidade protetora (178), com eliminação em função da mutação levando à indução aumentada de imunidade protetora a outras proteínas da membrana externa ^a Δ = deleção; TT = terminador da transcrição; P = promotor

C. Antígenos protetores de Campylobacter jejuni supostos e demonstrados.

[358] Dezenove antígenos de C. jejuni foram selecionados como antígenos protetores conhecidos ou prováveis com base na revisão da literatura e análises por bioinformática. Eles estão listados na Tabela 4 como provavelmente indutores de respostas imunes protetoras.

Tabela 4. Antígenos de Campylobacter jejuni exemplares.

Gene	Antíge- no	Função	Teor de GC	Peptídeo sinaliza -dor	bp/a a	Identidade entre sequências de C. jejuni
cj0034 c	Cj0034c	Suposta proteína periplasmática	32,3 o_ o	22/23 para euk	702/ 233	96-100%
cj0113	0mpl8	L i p o p r o t e i n a â. S S O C 1 â.dâ. âO peptidoglicano	33, 9	21/22 para euk	498/ 165	100%
cj0168 c	C j 0168c	Suposta proteína periplasmática	33, 3	Sim 20/21	168/ 55	78-100%
cj0248	Cj0248	Fator de virulência e participa da motilidade	30,8	Não	858/ 285	90-100%
cj0289 c	Peb3 AcfC	Peptídeo antigênico importante PEB3 fator de	34, 9	Sim 20/21	753/ 250	100%

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		co lonizaç:ão acessório
cj0365 c	CmeC	Proteína do canal da membrana externa CmeC (sistema de efluxo multifármacos CmeAB)	31, 6	19/20 euk 23/24 grnN	1479 /492	98-100%
cj0404	Cj0404	Suposta proteína transmembrana	29, 5	Não	838/ 278	100%
cj0420	Cj0420	Precursor da proteína ycel, Proteína de ligação a poliisoprenoid	28,8	21/22 grnN e euk	573/ 191	88-100%
cj0427	Cj0427	Proteína hipotética conservada	34,5	Não	336/ 111	99-100%
cj0428	Cj0428	Proteína h i p o t é t r c a	33, 1	Não	384/ 127	82-100%
cj0588	TlyA	Suposta hemolisina	25, 7	Não	762/ 253	82-100%
cj0921 c	Pebl	Transportador bifuncional de adesina/ABC Proteína de ligação ao aspartato/ glutamato	31,7	Sim 26/27	780/ 259	100%
cj0982 c	C jaA	Antigeno de superfície/ transportador de glutamina ABC Proteína de ligação ao substrato	33, 9	18/19 grnN/euk	840/ 279	100%

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cj0998 c	Cj0998c	Proteína hipotética	29, 7	19/20 euk 20/21 gmN	573/ 190	100%
cj!259	Momp (PorA)	Proteína da membrana externa importante	36, 1	Sim 22/23	12 7 5 /42 4	100%
cjl339 c	FlaA	Flagelina A	37,0	Não	1719 /572	100%
cjl478 c	CadF	Proteína da membrana externa de ligação à fibronectina	31,8	16/17 euk very weak	960/ 319	100%
cjl534 c	Dps	Proteína de proteção da privação de DNA/fase estacionária, suposta bacterioferrit ina	32,0	Não	450/ 149	93-100%
cjl656 c	Cjl656c	Suposta proteína de mot.il idade	38,3	Não	183/ 60	80-100%

cj sequências são de Campylobacter jejuni NCTC 11168 (ATCC700819) , *Analisadas usando Blast contra C. jejuni NCTC 11168 (ATCC700819), 327, LMG23211, 84-25, H693-13, CG8486,

LMG9872, S3, LMG23269, 414, ATCC33560, 2008-831, 1997-4, 260.94. CF93-6, Ml, RM221 e 20 genomas de C. jejuni adicionais sequenciados euk: em eucariótios; gmN: em gram-negativos

[359] Essas sequências estão presentes em todos os 39 genomas de C. jejuni analisados e possuem 82% ou mais identidade de sequência de aminoácidos em todas essas cepas.

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Esses incluem cj0034c,	cj0113	(Omp18),	c j0168c,	cj0248,
cj0289	(Peb3),	cj0365	(CmeC),	cj0404,	cj0420,	cj0427,
cj0428,	cj0588	(TlyA),	cj0921c	(Pebl),	cj0982c	(CjaA),
cj0998c,	cjl259	(PorA),	cjl339c (Fia),	cjl478c	(CadF),
cjl534c	(Dps) e	cj165 6c	Cada	um dos	19 antígenos foi

analisado usando diversas análises bioinformáticas para determinar quais antígenos estão presentes em todas as cepas de C. jejuni sequenciadas, que são altamente conservadas em termos de sequência de aminoácidos, possuem sequências sinalizadoras para exportação e estão localizadas na superfície da célula. Dez dessas foram selecionadas, incluindo: Cj0113 = 0mpl8 (Refs necessário), Cj0289c = Peb3 (120-123), Cj0982c = CjaA (124-128), Cjl259 = PorA (120, 121, 123, 126, 129-134), Cjl339c=FlaA (120, 121, 123, 135144), Cjl478 = CadF (120, 121, 129, 132, 144-147), Cj0588 TlyA (148-150), Cj0921c = Pebl (121-123, 145, 151-157), Cj0998c (US 9,328,148 (150) e Cjl534c = Dps (158, 159) para gerar plasmídeos recombinantes usando os plasmídeos de lise regulada pYA4763 e/ou pG8R17, dependendo se os antígenos tinham ou não sequências sinalizadoras para sua secreção por cepas de C. jejuni.

[360] As sequências codificadoras foram códon-otimizadas para ajustar os teores de GC e otimizar a expressão em Salmonella e também eliminar sítios potenciais no mRNA sujeitos à divagem por RNase E, de modo a prolongar a meiavida do mRNA para também aumentar o nível de síntese de antígeno. As sequências códon-otimizadas foram modificadas para deletar as sequência nativas que codificam o peptídeo sinalizador (se presente), adicionar uma sequência que codifica um His-tag na extremidade do terminal-C para

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181/242 facilitar a purificação de proteína e outras sequências nas extremidades do terminal-N e -C para especificar as sequências de nucleotídeos a serem reconhecidas por enzimas de restrição para permitir a clonagem em pYA4763 (se o antígeno não tiver que ser secretado pela RASV) (Fig. 3A) ou em pG8R17 (Fig. 3B) com a sequência sinalizadora β-lactamase bem mais aprimorada (154) (131), se o antígeno tiver que ser secretado. As sequências também foram projetadas para permitir a excisão da sequência do His-tag posteriormente, se desejado. Essas sequências foram sintetizadas comercialmente e retornaram em vetores pUC ori sem promotor. As sequências a serem clonadas foram excisadas desses plasmídeos e inseridas em um dos plasmídeos de lise que foram então eletroporados na cepa de E. coli χ6212(pYA232) (Tabela

2). pYA232 codifica o gene lacl^q que superproduz LacI para reprimir a síntese de antígeno pelas cepas recombinantes nas quais as sequências codificadoras de antígeno estão sob o controle de Ptrc que é reprimida por LacI. Após seleção dos clones recombinantes por seleção para Asd⁺ e purificação, a viabilidade é verificada pela habilidade da E. coli recombinante para crescer na presença de IPTG para causar desrepressão e síntese dos antígenos de C. jejuni recombinantes. Desejavelmente, o crescimento não é alterado pela síntese de antígeno, embora, em alguns casos, o crescimento seja ligeiramente retardado em função dos níveis elevados de síntese de antígeno de C. jejuni. Os plasmídeos de lise recombinantes foram então isolados da cepa hospedeira χ6212 e eletroporados na cepa da vacina de S. Typhimurium χ12341 (Z\PmurA25 : : TT araC Pbad murA AasdA27::TT araC Pbad c2 Apmi-2426 AwaaL46 ApagL64: : TT rhaRS

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PrhaBAD waaL Δ (wza-wcaM) - 8 ArelAl 97: : araC Pbad lacl TT ArecF126 AsifA26)) (Tabela 2), novamente selecionando para Asd⁺. Após purificação, as RASVs foram testadas quanto à taxa de crescimento e síntese de antígenos de C. jejuni com e sem IPTG, quanto à síntese de antígeno-0 de LPS dependente do crescimento na presença tanto de manose quanto de ramnose e quanto à estabilidade da manutenção do plasmídeo e síntese de antígeno após 50 gerações de crescimento sob crescimento permissivo em meios suplementados com DAP.

[361] As Figs. 4A—4B mostram análises de western blot da síntese de antígeno recombinante em χ12341. O plasmídeo recombinante pG8R selecionado está indicado no topo da Figura e também se o plasmídeo foi derivado de pYA4763 ou de pG8R17. Proteína foi detectada usando anticorpos monoclonais anti His-tag marcados com peroxidase de raiz-forte. Em alguns casos, por exemplo, com pG8R130 que codifica o antígeno CadF, o nível de proteína CadF é baixo, indicando síntese pobre ou degradação do antígeno. Esses problemas são algumas vezes encontrados e podem ser avaliados. A síntese de antígeno é, dessa forma, induzida por exposição de cepas de RASV ao IPTG por duas horas e depois adição de 50 pg de cloranfenicol/ml para bloquear a síntese de proteína adicional. São então retiradas amostras a cada hora por quatro horas para medir

os níveis	de	antígeno	por	análises de western blot.	A
manutenção	de	níveis	de	antígeno	constantes exclui
instabilidade.	Caso	seja	observada	instabilidade,	a
sequência	de	aminoácidos é	examinada	com programas	de

computador para indicar sítios de divagem por proteases potenciais e depois novas construções são feitas com alterações de nucleotídeos para eliminar esses sítios de

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183/242 clivagem por protease potenciais. Caso pareça que a síntese de antígeno é baixa, a sequência é examinada e novas construções são feitas para estabelecer totalmente a base para o problema e, por fim, gerar clones recombinantes com nível de síntese elevado estável dos antígenos recombinantes. Em alguns casos, isso necessita de modificação da sequência de SD para aumentar a ligação ao ribossomo ou outras alterações na sequência codificadora do terminal-N para aumentar a eficiência de tradução. Como a liberação de múltiplos antígenos de C. jejuni recombinantes às aves domésticas é examinada para selecionar aqueles que reduzem as titulações cecais de cepas de ataque por 100 vezes ou mais, não é improvável que mais do que três ou quatro antígenos serão necessários na vacina final. Dessa forma, problemas na obtenção de um nível de síntese elevado estável de todos os antígenos potenciais podem não ser necessários.

[362] Na avaliação de construções de RASV para induzir imunidade protetora contra sorotipos de Salmonella prevalentes em aves domésticas (Tabela 5), alguns dos plasmídeos recombinantes que codificam antígenos de C. jejuni foram introduzidos em χ12452, que é um derivado de χ12341 com mutações UsopB e SompA. Dessa forma, pG8R86 que codifica CjaA, pG8R88 que codifica 0mpl8, pG8R89 que codifica Pebl, pG8R90 que codifica Cj0998c, pG8R102 que codifica Peb3, pG8R128 que codifica Dps e pG8R129 que codifica TlyA foram introduzidos. Todas essas construções geram níveis bons de síntese de antígeno, como mostrado na Fig. 4. As habilidades relativas das construções de χ12341 são comparadas versus as construções de χ12452 para proteger contra infecção com as cepas do sorotipo de Salmonella selecionadas (Tabela 5) .

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Essas construções também estão sendo avaliadas quanto à proteção ao ataque com as cepas de C. jejuni também listadas na Tabela 5. A fim de determinar a melhor combinação de antígenos de C. jejuni para resultar nas maiores reduções em C. jejuni após infecção de ataque de galinhas não imunizadas versus galinhas imunizadas, diferentes combinações de cepas, cada uma liberando um antígeno de C. jejuni separado, são avaliadas quanto aos benefícios aditivos na redução de titulações cecais de cepas de ataque. Em vários estudos com outras RASVs, níveis muitos similares, se não idênticos, de imunidade protetora foram encontrados quando se imuniza com uma mistura de duas RASVs que liberam dois antígenos protetores diferentes, como foi observado quando uma única RASV liberava ambos os antígenos.

Tabela 5. Cepas usadas para estudos de ataque.

Cepa	Genótipo ou Fenótipo	Referência
Salmonella
S. Typhimurium UK-1 Z3761	Tipo selvagem B, jL, 4, [5], 12: i:l,2	(179)
S. Enteritidis χ3550	Tipo selvagem Dl jL, 9,12: g, m	(144)
S. Heidelberg χ3749	Tipo selvagem B 1,4, [5],12:r:l,2:-	(180)
S. Montevideo NR35 Z3217	Tipo selvagem Cl 6, 7,14, [54] :g,m, [p],s: [1 ,2,7]	(113)
S. Hadar NR14 χ3210	Tipo selvagem C2 6,8:Zio: e,n,x	(113)
S. Infantis NR2 9 Z3213	Tipo selvagem Cl 6, 7,14:r:l,5	(113)
S. Newport NR90	Tipo selvagem C2	M.

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Z3240	6, 8,20:e,h:1,2	Rosenfeld, Borstel Institute
S. Kentucky χ11609	Tipo selvagem C3 8,20:i:Z6	John Maurer, U. of Georgia
C. jejuni 81-176	Isolado humano, 0:23/36	(181)
C. jejuni NCTC11168	Isolado humano, sorotipo 0:2	(182)
C. jejuni 81116 (NCTC11828)	Humana e de galinha, cepa Lab 0:6	(183)
C. jejuni RM1221	Isolado de galinha HS:53	(184, 185)
Mistura de isolado de galinha de C. jejuni	Galinha	(186)

[363] Essa pesquisa aumenta a segurança alimentar por imunização de aves domésticas com múltiplas RASVs derivadas de S. Typhimurium que liberam múltiplos antígenos de C. jejuni protetores para reduzir a colonização e persistência em galinhas de sorotipos de Salmonella e cepas de C. jejuni para reduzir sua transmissão através da cadeia alimentar aos humanos. Espera-se que a vacina selecionada também aumentará a produtividade da criação de aves domésticas e diminuirá o uso de antibióticos, contribuindo para o aprimoramento econômico da produção de aves domésticas. A imunização de matrizes, bem como de pintos de frangos com essas RASVs, deve reduzir, se não eventualmente eliminar, a transmissão de Salmonella e C. jejuni através da cadeia alimentar aos humanos.

D. Materiais e métodos

a. Cepas bacterianas, meios e crescimento bacteriano.

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[364] A cepa atenuada de S. Typhimurium UK-1 induz imunidade protetora ao ataque com todas as cepas de S. Typhimurium, enquanto outras cepas de S. Typhimurium atenuadas com as mesmas mutações frequentemente não podem induzir imunidade protetora para outras cepas de S. Typhimurium e, definitivamente, não para a cepa altamente virulenta UK-1 (187). Portanto, uma cepa que exibe habilidade máxima para causar doença é usada como as cepas parentais para todas as cepas de vacinas derivadas atenuadas. Caldo LB e ágar são usados como meio complexo para propagação e plaqueamento de Salmonella (veja 163 (188, 189)) . Caldo Purple (Difco), que não possui arabinose, manose e ramnose, e meio de sais mínimos e ágar, também são usados (190) (164) . Placas de Cromo Azurol S (CAS) são usadas para avaliar a síntese de sideróforos de aquisição de Fe. Ágar de MacConkey com lactose 0,5% (Lac) e arabinose 0,1% (Ara), quando necessário, é usado para enumerar bactérias de galinhas. Caldo de tetrationato ou selenita, com ou com suplementos, é usado para enriquecer para Salmonella o conteúdo cecal e intestinal, a bolsa de Fabricius, fígado e baço. O crescimento bacteriano é monitorado espectrofotometricamente e por plaqueamento para contagens de colônias. Cepas sequenciadas e bem caracterizadas de C. jejuni NCTC11168, 81-176, 81116 e RM221 e isolados de C. jejuni de galinhas (Tabela 5) são usados em estudos de ataque. Essas cepas são cultivadas de forma microaerofílica (N2 85%, CO2 10%, O2 5%) em meio de Mueller-Hinton (MH) a 42°C por 24 h. Para isolamento de C. jejuni de fezes e órgãos de galinha, placas de ágar MH são suplementadas com suplemento seletivo para Campylobacter (SR117E; Oxoid, Lenexa, KS). Cepas bacterianas

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187/242 para os estudos de ataque estão listadas na Tabela 5.

b. Procedimentos moleculares e genéticos.

[365] Métodos para isolamento de DNA, digestão por enzima de restrição, clonagem de DNA e uso de PCR para construção e verificação de vetores são padronizados (veja 172 (191)) . Análises de sequência de DNA foram realizadas no University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research (ICBR). Todas as sínteses de segmento oligonucleotideo e/ou gene foram realizadas usando otimização de códons para aumentar a eficiência de tradução em Salmonella e estabilizar o mRNA por eliminação de sítios de divagem de RNase E para prolongar a meia-vida do mRNA (192-194) (173-175). Como vacinas vivas não podem exibir resistência antibiótica, são geradas mutações de deleção não marcadas definidas com e sem inserções usando tecnologias de vetor suicida (veja 176-181 Edwards e cols. (1998) Gene 207: 149-57 (195); Kaniga e cols. (1998) Infect. Immun. 66: 5.599606 (196); Maloy e Nunn (1981) J. Bacteriol. 145: 1.110-2 (197); Miller e Mekalanos (1988) J. Bacteriol. 170: 2.57583 (198); Ried e Collmer (1987) Gene 57: 239-46 (199); e Roland e cols. (1999) Avian Dis. 43: 429-41) (200)). Foram usados vetores suicidas que possuem sequências de flanqueamento derivadas da S. Typhimurium parente χ3761 para a geração de todas as mutações definidas listadas na Tabela

3. Essas mutações podem ser introduzidas usando transdução de fago P22HTint (201, 202) (182, 183) de vetores suicidas integrados na mutação de deleção na cepa de S. Typhimurium parental, seguida por seleção para resistência à sacarose ou por transferência por conjugação de vetores suicidas com o uso de métodos padronizados (201, 202) (195, 203) (176, 185)

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188/242 com as cepas doadoras de vetor suicida χ7213 (181)) . Todas as cepas construídas recebem números Chi e são armazenadas a -80°C. A construções de plasmídeo serão avaliadas por sequenciamento de DNA e a habilidade para especificar a síntese de proteínas de C. jejuni usando eletroforese em gel e análises de western blot.

c. Caracterização da cepa de RASV.

[366] Cepas de vacina foram totalmente caracterizadas em cada etapa em sua construção e após introdução de plasmídeos que codificam antígenos de C. jejuni. Inicialmente, os antígenos de C. jejuni Pebl e 0mpl8 serão avaliados para permitir análises comparativas das diferentes cepas de vetor de RASV χ12341 e χ12452. A seguir, avaliaremos diferentes combinações de duas cepas para estabelecer uma classificação na geração da maior diminuição nas titulações cecais das cepas de ataque de C. jejuni. Antes do início dos estudos de imunização, RASVs foram comparadas com cepas de controle de vetor quanto à estabilidade de manutenção do plasmídeo, integridade e habilidade de síntese de antígeno quando desenvolvidas na presença de arabinose e DAP por 50 gerações. Para a síntese constitutiva dos antígenos de C. jejuni, as cepas são desenvolvidas na presença de IPTG para determinar se ele resulta em crescimento pobre e/ou instabilidade genética. Atributos de genética molecular foram confirmados por PCR e/ou análises Southern blot. A medição do núcleo de LPS e antígeno-0 foi realizada após eletroforese usando géis corados com prata (204) (186). Essa análise é realizada após cada etapa em qualquer construção de cepa para eliminar variantes grosseiras que possam ter surgido. Testes de mobilidade e uso de específicos para antígenos flagelares

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189/242 são usados para determinar a presença de flagelos. As RASVs finais foram avaliadas quanto à sensibilidade à bile, tolerância a ácidos, e à habilidade para sobreviver em soros com e sem inativação de complemento (104, ill) . A sensibilidade completa das RASVs a antibióticos também será avaliada. Atributos metabólicos de cepas de vacina são avaliados usando testes API-20E.

d. Experimentação animal.

[367] Testagem de cepas de RASV: Serão feitos estudos em RASVs em pintos Leghorn brancos SPAFAS e em pintos de frangos Cobb e/ou Ross obtidos de um incubatório comercial. Pintos Leghorn brancos recém eclodidos serão imunizados oralmente, e depois alimento e água serão fornecidos ad libitum. Pintos de frangos serão imunizados oralmente similarmente um dia após recebidos do incubatório para permitir que eles se aclimatizem, mas antes da alimentação. Alimento será fornecido após imunização. As cepas de vacina a serem avaliadas (bem como cepas de ataque de Salmonella) serão desenvolvidas em caldo LB até uma ODgoo de aproximadamente 0,9, sedimentadas por centrifugação em temperaturas ambientes e suspensas em PBS em densidades de 5 X 10¹⁰ CFU/ml para permitir doses orais de até 1 X 10⁹ CFU a serem administradas em 20 μΐ em pintos. As RASVs finais serão avaliadas quanto à indução de respostas imunes que diminuem titulações teciduais (bolsa, fígado e baço) e cecais de cepas de ataque do sorotipo de Salmonella e titulações cecais de cepas de ataque de C. jejuni. RASVs serão enumeradas quantitativamente em vários tecidos em função do tempo após inoculação oral.

[368] O NIH RAC e o UF IBC reclassificaram as cepas

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190/242 de RASV com o fenótipo de lise regulada e contenção biológica completa em contenção de nível 1, em configurações comerciais e em pacientes ambulatoriais, com imunizações iniciais em pintos abrigados em baterias ou em ninhada. No entanto, para ataque com sorotipos de Salmonella, os pássaros são abrigados em Federal Design Molded Isolators. Todo o trabalho experimental é realizado em conformidade os regulamentos e políticas do Animal Welfare Act e a Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals e aprovado pelo UF IACUC.

e. Análise estatística.

[369] Todos os resultados são analisados usando o teste estatístico mais apropriado do programa SAS para avaliar a significância relativa, ou ausência desta, de resultados obtidos. Em casos específicos, a equipe no Clinicai Translational Science Institute em UF é consultada para fornecer ajuda com o design experimental e serviços de análises estatísticas para estudos e experimentos animais e humanos. O uso de dez galinhas/grupo de tratamento irá gerar um poder estatístico > 0,80. Em estudos prévios, foi verificado que n = 10 é um número de pássaros adequado para obter diferenças estatisticamente significantes entre grupos de tratamento. No entanto, as melhores RASVs serão avaliadas várias vezes em duas instituições para substanciar as conclusões.

Exemplo 2. Construção de cepas de RASV

[370] A cepa de partida para o desenvolvimento de cepas derivadas foi S. Typhimurium χ12341 (AP_murA25: : TT araC Pbad murA AasdA27::TT araC Pbad c2 Apmi-2426 AwaaL46 ApagL64::TT rhaRS PrhaBAD waaL Δ (wza-wcaM)-8

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191/242

ArelAl97::araC Pbad lacl TT ArecF126 AsifA2) . Essa cepa foi derivada em muitas etapas a partir da cepa parental de S. Typhimurium UK-1 χ3761. Como vacinas vivas não podem exibir resistência antibiótica, foram geradas mutações de deleção não marcadas definidas usando tecnologias de vetor suicida (veja Edwards e cols. (1998) Gene 207: 149-57 (195); Kaniga e cols. (1998) Infect. Immun. 66: 5.599-606 (196); Maloy e Nunn (1981) J. Bacteriol. 145: 1.110-2 (197); Miller e Mekalanos (1988) J. Bacteriol. 170: 2.575-83 (198); Ried e Collmer (1987) Gene 57: 239-46 (199); e Roland e cols. (1999) Avian Dis. 43: 429-41 (200) . Mutações de deleção e de deleção-inserção precisas com interferência em funções gênicas adjacentes e sem deixar cicatrizes repetitivas que possam contribuir para instabilidade genética podem ser geradas usando uma combinação de genética molecular, vetores suicidas e transdução mediada por fago P22 (Kang e cols. (2002) J. Bacteriol. 184: 307-12) (205). Esses procedimentos foram usados para introduzir as mutações de deleção e de deleção-inserção listadas na Tabela 3 para a construção das cepas listadas na Tabela 2, bem como dos derivados descritos nesse relatório descritivo em S. Typhimurium χ12341. Vetores suicidas derivados de pRE112 ou pMEG-375 foram e são construídos, como necessário. Para evitar um efeito adverso por uma sequência inserida na expressão de quaisquer genes adjacentes, um forte terminador da transcrição (TT) isolado do genoma de um bacteriófago pode ser inserido em localizações apropriadas para bloquear esses efeitos indesejáveis. Essas sequências podem ser inseridas nos vetores suicidas como adequado para as construções individuais. Mediante a construção de vetores suicidas e a

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192/242 criação de mutações de deleção e de deleção-inserção, números de alelos e números Chi são atribuídos para permitir a distinção. As cepas são armazenadas a -80°C.

Construção de RASV que exibe o N-glicano conservado de C. jejuni.

[371] Nesse caso, o óperon pgl do gene-14 de C. jejuni que codifica a síntese do N-glicano protetor cruzado, altamente conservado (15, 206), que também possui propriedades adjuvantes, que está ligado e é transportado pelo carreador universal UndPP com adesão ao núcleo de LPS, será inserido em uma deleção do gene cysG que é dispensável e um sítio muito útil para inserção de genes estranhos. A expressão do óperon pgl será dirigida por fusão a um Ptrc Lacl-regulável modificado por inclusão de uma sequência de 35 bp encontrada em promotores de óperons que codificam muitos genes envolvidos na síntese de polissacarídeo (207, 208), o que permite a síntese de transcritos de mRNA longos. Essa inserção em CcysG será introduzida no derivado de χ12341 χ12445 (Tabela 2), no qual as mutações AwaaL46 ApagL64::TT rhaRS PrhaBAD waaL foram eliminadas, já que a atividade de WaaL é necessária para causar a ligação e transporte do Nglicano de C. jejuni (209, 210). Como a cessação regulada do antígeno-0 de LPS in vivo é desejada para melhor exibir antígenos protetores de superfície, uma deleção do gene wbaP que codifica a enzima que acopla o primeiro açúcar galactose da repetição de antígeno-0 no núcleo de LPS e um araC ParaBAD wbaP no gene pagL estão presentes em χ12445. Dessa forma, o gene waaL é expresso continuamente e a enzima WaaL será capaz de ligar o N-glicano de C. jejuni no núcleo de LPS, na proteína Cjl433c sintetizada e quaisquer proteínas de

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193/242 superfície de C. jejuni ou RASV como, por exemplo, OmpC e OmpD, com as sequências D/E-X1-N-X2-T/S que servem como a sequência receptora para N-glicosilação.

[372] Essa cepa χ12445 é ainda modificada por inserção de todo ou parte do gene cjl433c (209) em uma deleção do gene ompA para gerar uma fusão da proteína Cjl433c, que possui nove repetições de uma sequência DLNNT para ligação ao N-glicano, com a sequência sinalizadora codificada por ompA. Deve ser observado que a proteína OmpA é um dos antígenos de superfície de Salmonella mais abundantes, é totalmente desnecessária para colonização e virulência e, no entanto, é uma das proteínas de Salmonella mais imunogênicas, mas incapaz de gerar qualquer imunidade protetora.

Exemplo 3: RASV que exibe N-glicano de C. jejuni

[373] Uma RASV que está sendo atualmente construída exibirá o antígeno de N-glicano conservado C. jejuniespecífico e sintetizará uma proteína da membrana externa de C. jejuni com múltiplos alvos para N-glicosilação. Isso será obtido por expressão do óperon pgl do gene-14 de C. jejuni que codifica as enzimas para sintetizar o glicano ligado ao N imunoprotetor anexado a muitas proteínas de superfície de C. jejuni em um plasmídeo balanceado-letal ou após inserção no cromossomo e inserção de sequências que codificam a sequência canônica bacteriana de N-glicosilação D/E-X-N-YT/S em genes que codificam antígenos de superfície de RASV. Essa RASV pode ser adicionalmente modificada para causar exibição in vivo de antígenos conservados com reatividade cruzada para captação de ferro e manganês para gerar uma RASV que induzirá imunidade protetora cruzada para a maioria dos sorotipos de Salmonella liberando, ao mesmo tempo,

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194/242 múltiplos antígenos protéicos de C. jejuni para induzir imunidade protetora superior contra C. jejuni.

Construção de RASV que codifica o óperon pgl de C. jejuni.

[374] C. jejuni possui um óperon pgl do gene-14 que codifica enzimas para a síntese e colocação de um N-glicano protetor cruzado altamente conservado (15, 206) . A Fig. 7 retrata o óperon pgl. O N-glicano possui propriedades adjuvantes quando ligado e transportado pelo carreador universal UndPP para adesão ao núcleo de LPS. Em função do comprimento da sequência de nucleotídeos do óperon pgl, até agora não foi feita nenhuma tentativa para otimizar códons para expressão em Salmonella, na medida em que isso exigiría códon-otimização e síntese de segmentos que, então, precisariam ser remontados em um óperon de comprimento total. Embora isso seja possível, a sequência nativa de C. jejuni foi inicialmente clonada e inserida em um derivado modificado (pG8R160) do plasmideo Asd⁺ de número de cópia baixo pYA3337 (pSClOl ori) que possui o promotor Ptrc reprimível por LacI modificado por inserção de uma inserção de 35 bp que aumenta a transcrição completa de óperons longos (206, 207) . Como o gene pglB codifica uma óligo polissacarídeo transferase, ele possui uma atividade de competição em duplicata com a enzima WaaL de Salmonella e a deleção do gene pglB permitiu uma adição melhor do N-glicano ao núcleo de LPS (veja a Fig. 5) para permitir sua transferência às sequências D/E-X-N-Y-T/S em proteínas. O gene pglB na construção derivada de pG8R160 pG8R161 foi, portanto, deletado. A sequência do óperon pgl inserida, que segue, possui um teor de GC de aproximadamente 30% e ainda contém códons usados raramente em genes de

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195/242

Salmonella altamente expressos. No entanto, isso pode ser benéfico para o bem-estar do derivado de RASV de χ12445 (Z\PmurA25 : : TT araC ParaBAD murA AasdA27: : TT araC ParaBAD c2 Apmi2426 Δ (wza-wcaM) - 8 ArelAl 97: : araC ParaBAD lad TT ArecF126 AsifA26 AwbaP45 ApagL14: : TT araC ParaBAD wbaP) , na medida em que a superexpressão de genes, até mesmo em um plasmídeo de número de cópia baixo, pode resultar em crescimento diminuído. Dessa forma, níveis baixos de expressão gênica provavelmente são benéficos.

Construção de RASV que exibe o N-glicano conservado de C. jejuni.

[375] 0 óperon pgl foi inserido no plasmídeo Asd⁺ de número de cópia baixo pYA3337 (pSClOl ori) pG8R161 (veja acima) e será inserido em uma deleção do gene cysG, que é dispensável, e um sítio muito útil para inserção de genes estranhos. A expressão do óperon pgl é dirigida por fusão a um promotor Ptrc Lacl-regulável modificado por inclusão de uma sequência de 35 bp encontrada em promotores de óperons

que codificam	muitos	genes	envolvidos	na	síntese	de
polissacarideo	(207,	208) .	Isso permite	a	síntese	de
transcritos de	mRNA	longos.	A inserção	em	AcysG	será

introduzida em χ12445 (Tabela 2), no qual as mutações AwaaL46 ApagL64::TT rhaRS P rhaBAD waaL foram eliminadas, ja que a atividade de WaaL é necessária para causar a ligação e transporte do N-glicano de C. jejuni (209, 210) . Como a cessação regulada da síntese de antígeno-0 de LPS in vivo para exibir melhor antígenos protetores de superfície é desejada, uma deleção do gene wbaP que codifica a enzima que acopla o primeiro açúcar galactose da repetição de antígeno0 no núcleo de LPS foi inserida, e um araC ParaBAD wbaP foi

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196/242 inserido no gene pagL. Ά cepa resultante derivada em múltiplas etapas a partir de χ12341 é χ12445 (Z\PmurA25 : : TT araC ParaBAD murA AasdA27: : TT araC ParaBAD c2 Apmi2426 Δ (wza-wcaM) - 8 ArelAl 97: : araC ParaBAD lacl TT ArecF126 AsifA26 AwbaP45 ApagL14: : TT araC ParaBAD wbaP) . Nessa cepa, com um plasmídeo ou a inserção cysG do óperon pgl, o gene waaL é expresso continuamente e a enzima WaaL ligará o Nglicano de C. jejuni no núcleo de LPS, na fusão da proteína Cjl433c sintetizada (veja abaixo) e quaisquer proteínas de superfície de C. jejuni ou RASV como, por exemplo, OmpC e OmpD, com a sequência D/E-X1-N-X2-T/S que serve como a sequência receptora para N-glicosilação. χ12445 é ainda modificado por inserção do gene Cjl433c (209) em uma deleção parcial do gene ompA para gerar uma fusão da proteína Cjl433c, que possui nove repetições de uma sequência DLNNT para ligação ao N-glicano, com a sequência sinalizadora codificada por ompA. Deve ser observado que a proteína OmpA é um dos antígenos de superfície de Salmonella mais abundantes, é totalmente desnecessária para colonização e virulência e, no entanto, é uma das proteínas de Salmonella mais imunogênicas, mas incapaz de gerar qualquer imunidade protetora. Se desejado, as mutações de deleção-inserção APf_Ur::TT araC Pbad fur e ÚP_mntR::TT araC Pbad mntR podem ser adicionadas a χ12445 para levar à supra-regulação in vivo de todos os genes necessários para a captação de ferro e manganês. Como as respostas imunes aos IROMPs reagem de forma cruzada nas Enterobacteriaceae, essa cepa, na medida em que a síntese de antígeno-0 de LPS cessa in vivo (em função da mutação pmi e da ausência de manose e do fechamento regulado por araC ParaBAD do gene wbaP) para expor melhor antígenos de

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197/242 superfície de proteína, induzirá imunidade protetora cruzada aumentada aos sorotipos de Salmonella e outras bactérias entéricas.

Construção de fusão Cjl433c-0mpA e inserção na mutação AompAll em χ12445.

[37 6] 0 genoma de C. jejuni é rico em AT, o que causa problemas na fidelidade de transcrição em S. Typhimurium. 0 gene Cjl433c é particularmente 'ruim', já que ele possui um teor de GC de somente 26,4%. Foram realizadas duas otimizações de códons sucessivas para aumentar a expressão fiel desse gene ou partes dele em cepas de RASV. As sequências de nucleotídeos originais e aprimoradas para o gene Cj14433c são apresentadas abaixo, com indicação das sequências que especificam sítios de N-glicosilação na proteína.

[377] Cjl433c - 1.107 bp (368 aa) Sem peptídeo sinalizador, GC de 26,4%

[378] Identidade entre várias C. jejuni; baixa (31%— 100%), muitas sequências alinhadas apenas com sequência parcial

I^a linha; original (26,4%)

2^a linha; melhor otimizada (45,9%)

3^a linha; modificada para GC maior (49,1%) serina, valina, glicina (S, V e G) modificada

Os sítios de adição de N-glicano estão sublinhados

TATAATATTTTTGGCAGTTTGTTTTAA AGGATGTTTTA

1/1

31/11

ATG

CAG

CGA

TTT

AAA

AAA

TGG

TTT

TTG

TCT

ATC

ATA

AAA

AAT

TTC

AAG

CAA

CAT

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CAG

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AAA

M

Q

R

F

K

K

W

F

L

S

I

I

K

N

F

K

Q

Η E K

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 204/261

198/242

61/21

91/31

ATT

AAG

ATA

GAT

CTT

AAT

AAT

ACA

AAG

ATA

GAT

CTT

AAT

AAT

ACA

AAG

ATA

GAT

CTT

AAT

ATC

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC

ATC

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC

I

K

I

D

L

N

N

T

K

I

D

L

N

N

T

K

I

D

L

N

121/41

151/51

AAT

ACA

AAG

ATA

GAT

CTT

AAT

AAT

ACA

AAG

ATA

GAT

CTT

AAT

AAT

ACA

AAG

ATA

GAT

CTT

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ATC

GAC

CTG

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AAC

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ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

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GAC

CTG

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GAC

CTG

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AAC

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AAC

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L

N

N

T

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I

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L

181/61

211/71

AAT

AAT

ACA

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ATA

GAT

CTT

AAT

AAT

ACA

AAG

ATA

GAT

CTT

AAT

AAT

ACA

AAG

ATA

GAT

AAC

AAC

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ATC

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CTG

AAC

AAC

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ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

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ATC

GAC

AAC

AAC

ACC

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ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

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ATC

GAC

N

N

T

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I

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L

N

N

T

K

I

D

L

N

N

T

K

I

D

241/81

271/91

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AAT

AAT

ACA

AAG

ATA

GAA

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TCG

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TTA

AAA

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AAC

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TCG

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GAA

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CTG

AAC

AAC

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CTG

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CTG

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L

D

301/101

331/111

TTT

CAT

TTA

AGA

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ATT

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TTT

TTA

GAG

ATT

GTT

GAA

ATT

CAT

TTA

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CAG

GCG

TTC

CTG

GAA.

ATC

GTT

GAA

ATC

CAC

CTG

GCG

TTC

CAC

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CGT

AAA

ATC

ACC

CCG

CAG

GCG

TTC

CTG

GAA

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GAA

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L

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V

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H

L

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361/121

391/131

GAA

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TGT

AAT

TTA

AAT

TGT

TTT

GGT

TGT

AAT

CAT

TTT

TCA

CAA

ATA

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GAA

GAA

TCC

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GGT

TGC

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GAA

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CTG

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GGC

TGC

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TCC

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GCG

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Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 205/261

199/242

EKE

421/141

TTT CCA GAT ATA GAA GAA ATA TCT AAA GGT TTC CCG GAO ATC GAA GAA ATG TCT AAA GGT TTC CCG GAC ATC GAA GAA ATC TCT AAA GGC F P D I E

I S K G 481/161

ATT GTC GGA ACT TTT CCC AAT TGT ATA CAG ATC GTT GGT ACC TTC CCC AAC TGC ATC CAG ATC GTC GGC ACC TTC CCG AAC TGC ATC CAG I V G T F N C I Q 541/181

TTT TTT GAC ATT ACA TTG GTA ACT AAT GGT TTC TTC GAC ATC ACC GTG GTC ACC AAC GGT TTC TTC GAC ATC ACC CTG GTG ACC AAC GGC F F D I T V T N G 601/201

ATT TTA CTT GAT AAG AGG AAT AAA ATG CAA TGG AAC TCT TGC CAG CAG AAC GAA GAC TTC L L D K Q K M Q

661/221

ATT CGT CCA ACA AAG AAA GAT AAG TGT GAT ATC CGT CCG ACC AAA AAA GAC AAA TGC GAC ATC CGT CCG ACC AAA AAA GAC AAA TGC GAC I R P T K

D K C D 721/241

CAA TAT GAT ATC CCC AAA ACT TCT TGG AAA

ATT TTT AAA AAA GAT

ATC TTC AAA AAA GAC ATC TTC AAA AAA GAC

I F K K D

AGA TTG ATG GGT GGC CGT CTG ATG GGT GGT CGT CTG ATG GGC GGC

R L M G G

AGA TAT TTT TTT CCA

CGT TAC TTC TTC CCG

CGT TAC TTC TTC CCG

R Y F F P

CAA AAT GAG GAT TTT

ATC CTG CTG GAC AAA

CGT AAC AAA ATG CAG

TGG AAC TCC TGC CAG

N E D F W

TAT CCT ATA AAA ATT

TAC CCG ATC AAA ATC TAC CCG ATC AAA ATC

Y P I K I

TTG ATA TTT TTT AAC

CAG TAC GAC ATC CCG

451/151

ATG CAA AGA CTT TCA

ATG CAG CGT CTG TCT

ATG CAG CGT CTG TCC

M Q R L S E

511/171

GAA CCT CTT TTA AAT

GAA CCG CTG CTG AAC

GAA CCG CTG CTG AAC

E P L L N P

571/191

AAA AGT GCC ATT TGG

AAA TCT GCG ATC TGG

AAA TCC GCG ATC TGG

K S A I W L

631/211

TGG AAT TCA TGC CAA

CAG AAG GAA GAG TTG

ATC CTG CTG GAC AAA

CGT AAC AAA ATG CAG I

N S C Q R N

691/231

AAT TGG GAT TTG ATT

AAC TGG GAC CTG ATC

AAC TGG GAC GTG ATC

N W D L I K

751/251

AAT GGA GAG TTG GAA

CTG ATC TTC TTC AAC

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 206/261

200/242

AAC

GGT

GAA

CTG

GAA

AAA

ACC

TCT

TGG

AAA

CAG

TAC

GAC

ATC

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CTG

ATC

TTC

TTC

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AAC

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K

781/261

811/271

TTT

TCT

CTA

GAT

CCT

TCT

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GAT

AAT

TAC

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TTT

ACA

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GGT

AAC

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GAC

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ACC

AAC

TGC

TCT

ATG

TTC

TCC

CTG

GAC

CCG

TCC

GGC

AAG

TGG

GAG

AAG

TAC

CAG

TCC

TTC

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AAC

TGC

TCC

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N

C

S

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841/281

871/291

GCA

AAT

CAC

TGT

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CAG

TTT

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GAT

GGA

AAG

CTA

TTT

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TGT

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TTT

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CAT

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GTT

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TTC

AAA

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GGT

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ACC

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GCG

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GGC

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901/301

931/311

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CAT

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GAA

TTT

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AAA

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K

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H

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V

C

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D

F

I

961/321

991/331

GAT

ATT

TAT

AAA

GCC

AAG

GAT

TAT

CAA

GAA

ATT

TTA

TTT

TTT

CTT

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AAG

CCT

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GAC

ATC

TAG

AAA

GCG

AAA

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TAG

CAG

GAA

ATC

CTG

TTC

TTC

CTG

TCT

AAA

CCG

ATC

CCG

GAC

ATC

TAC

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GCG

AAA

GAC

TAC

CAG

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ATC

CTG

TTC

TTC

CTG

TCC

AAA

CCG

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F

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1051/351

TTT

TGT

AGA

TAT

TGC

AAG

GTA

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CAA

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GAA

ATT

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AAA

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CAG

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GCG

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TGG

CGT

TCT

AAC

TTC

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CGA

TAC

TGC

AAA

GTG

TCC

CAG

TGG

GCG

GAA

ATC

GGC

AAA

TGG

CGT

TCC

TCC

AAC

F

C

R

Y

C

K

V

s

Q

W

A

E

I

G

K

W

R

S

S

N

1081/361

AAA

ACA

AAA

CAT

GAA

TAT

TTA

ATT

TGA

(SEQ ID

NO:71 )

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 207/261

201/242

AAA ACC AAA CAC GAA TAC CTG ATC TGA (SEQ ID NO:72 )

AAA ACC AAA CAC GAA TAC CTG ATC TGA (SEQ ID NO:73 )

KTKHEYLI* (SEQ ID NO:74 )

[379] A topologia da proteína OmpA que indica todas as sequências transmembrana foi diagramada por Reusch e cols., Int. J. Mol. Sci. 2013, 14 (6): 10.727-10.748 (213) (214, 215), cujo conteúdo completo é expressamente incorporado nesse relatório descritivo por referência. Com base em análises bioinformáticas, uma porção do gene Cjl433c de C. jejuni que codifica as repetições dos sítios de Nglicosilação (aminoácidos 21 a 86) foi inserida como um substituto para a alça que transpõe e que inclui as sequências transmembrana 3 e 4 (aminoácidos 70 a 107) de OmpA.

Sequência codificadora para OmpA modificada com inserção de porção da sequência de Cj 1433c

[380] Alças-beta 3 e 4 de OmpA (aa 70-107) são deletadas e 66 aa (aa 21 a 86) de Cjl433c são inseridos, que especificam as nove repetições para N-glicosilação.

31/11

ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC

GCT ACC GTA GCG CAG MKKTAIAIAV

ALAGFATVAQ

61/21

91/31

GCC GCT CCG AAA GAT AAC ACC TGG TAC GCT GGT GCT AAA CTG GGC

TGG TCT CAG TAC CAT

AAPKDNTWYAGAKLG

W S Q Y H

121/41

151/51

GAC ACC GGC TTC ATT CAC AAT GAT GGC CCG ACT CAT GAA AAC CAA

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 208/261

202/242

CTG T

GGC H

GCA E

GGT N

GCT Q

D L

T G

G A

F G

I A

Η N

D

G

P

181/61

211/71

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GGT

GGT

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GTT

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TAT

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ATC

GAC

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K

I

D

L

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N

T

K

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aa69

Cjl433 í

aa 21-86

241/81

271/91

ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC AAC

ACC

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

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D

L

N

N

T K

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D

L

N

N

T

K

I

D

L

N

N

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301/101

331/111

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

AAA

ATC

GAC

CTG AAC

AAC

ACC

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

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I

D

L

N

N

T

K

I

D

L N

N

T

K

I

D

L

N

N

361/121

391/131

ACC

AAA

ATC

GAC

CTG

AAC

AAC

ACC

AAA

ATC

GAC CTG

AAC

AAC

ACC

AAA

ATC

ctg

cag

ATC

T

K

I

D

L

N N

T

K

I

D

L

N

N

T

K

I

L

Q

I

OmpA aa

108

421/141

451/151

ACT

GAC

GAT

CTG

GAC

GTT

TAT

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CTG

GGT GGT

ATG

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CGT

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GAC

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D

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L

G G

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V

W

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A

D

T

K

481/161

511/171

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 209/261

203/242

TCT

AAC

GTC

CCT

GGC

GGC

CCG

TCT

ACT

AAA

GAC

CAC

GAC

ACC

GGC

GTT

TCC

CCG

GTA

TTC

541/181

571/191

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N

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P

G

G

P

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K

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D

T

G

V

S

P

V

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GCG

GGC

GGT

ATC

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TAT

GCT

ATC

ACC

CCT

GAA

ATC

GCA

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CGT

CTG

GAA

TAC

CAG

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G

I

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A

I

T

P

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I

A

T

R

L

E

Y

Q

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601/201

631/211

ACT

AAC

AAC

ATC

GGT

GAT

GCC

AAC

ACC

ATC

GGC

ACC

CGT

CCG

GAC

AAC

GGC

CTG

CTG

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N

N

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G

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A

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G

T

]

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P

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G

L

L

S

661/221

691/231

GTA

GGT

GTT

TCC

TAC

CGT

TTC

GGC

CAG

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GAA

GCT

GCT

CCG

GTA

GTA

GCT

CCG

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V

G

V

S

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R

F

G

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Q

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A

A

P

V

V

A

P

A

P

721/241

751/251

GCT

CCG

GCT

CCG

GAA

GTA

CAG

ACC

AAG

CAC

TTC

ACT

CTG

AAG

TCT

GAC

GTA

CTG

TTC

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P

A

P

E

V

Q

T

K

H

F

T

I

J

K

S

D

V

L

F

N

781/261

811/271

TTC

AAC

AAA TCT

ACC

CTG

AAG

CCG

GAA

GGC

CAG

CAG

GCT

CTG

GAT

CAG

CTG

TAC AGC

CAG

F

N

K S

T

L

K

P

E

G

Q

Q

A

L

D

Q

L

Y S

Q

841/281

871/291

CTG

AGC

AAC CTG

GAT

CCG

AAA

GAC

GGT

TCC

GTT

GTC

GTT

CTG

GGC

TTC

ACT

GAC CGT

ATC

L

S

N

L

D

P

K

D

G

S

V

V

V

L

G

F

T

D

R

I

901/301

931/311

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 210/261

204/242

GGT

TCT

GAC

GCT

TAC

AAC

CAG

GGT

CTG

TCC

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AAA

CGT

GCT

CAG

TCT

GTT

GTT

GAT

TAC

G

S

D

A

Y

N

Q

G

L

S

E

K

R

A

Q

S

V

V

D

Y

961/321

991/331

CTG

ATC

TCC

AAA

GGT

ATT

CCG

TCT

GAC

AAA

ATC

TCC

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CGT

GGT

ATG

GGC

GAA

TCT

AAC

L

I

S

K

G

I

P

S

D

K

I

S

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R

G

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N

1021/341

1051/351

CCG

GTT

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GGC

AAC

ACC

TGT

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AAC

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AAA CCT

CGC

GCT

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ATC

GAT

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P

V

T

G

N

T

C

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N

V

K P

R

A

A

L

I

D

C

L

1081/361

1111/371

GCT

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CGT

CGC

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GAG

ATC

GAA

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AAA GGC

GTT

AAA

GAC

GTG

GTA

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CAG

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A

P

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R

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G

V

K

D

V

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Q

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(ID.

. DE

SEQ.

. N°

: 75

)

Q

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*

(ID.

DE SEQ.

N° :

76 )

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ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCA GGCCGCTCCGAAAGATAACACCTGGTACGCTGGTGCTAAACTGGGCTGGTCTCAGTACC ATGACACCGGCTTCATTCACAATGATGGCCCGACTCATGAAAACCAACTGGGCGCAGGT GCTTTTGGTGGTTACCAGGTTAACCCGTATGTCGACATCAAAATCGACCTGAACAACAC CAAAAT C GAC C T GAACAACAC CAAAAT C GAC C T GAACAACAC CAAAAT C GAC C T GAACA ACAC CAAAAT C GAC C T GAACAACAC CAAAAT C GAC C T GAACAACAC CAAAAT C GAC C T G AACAACAC CAAAAT C GAC C T GAACAACAC CAAAAT C GAC C T GAACAACAC CAAAAT C C T GCAGATCACTGACGATCTGGACGTTTATACCCGTCTGGGTGGTATGGTATGGCGTGCAG ACACCAAGTCTAACGTCCCTGGCGGCCCGTCTACTAAAGACCACGACACCGGCGTTTCC CCGGTATTCGCGGGCGGTATCGAGTATGCTATCACCCCTGAAATCGCAACCCGTCTGGA

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205/242

ATACCAGTGGACTAACAACATCGGTGATGCCAACACCATCGGCACCCGTCCGGACAACG GCCTGCTGAGCGTAGGTGTTTCCTACCGTTTCGGCCAGCAAGAAGCTGCTCCGGTAGTA GCTCCGGCACCAGCTCCGGCTCCGGAAGTACAGACCAAGCACTTCACTCTGAAGTCTGA CGTACTGTTCAACTTCAACAAATCTACCCTGAAGCCGGAAGGCCAGCAGGCTCTGGATC AGCTGTACAGCCAGCTGAGCAACCTGGATCCGAAAGACGGTTCCGTTGTCGTTCTGGGC TTCACTGACCGTATCGGTTCTGACGCTTACAACCAGGGTCTGTCCGAGAAACGTGCTCA GTCTGTTGTTGATTACCTGATCTCCAAAGGTATTCCGTCTGACAAAATCTCCGCACGTG GTATGGGCGAATCTAACCCGGTTACCGGCAACACCTGTGACAACGTGAAACCTCGCGCT GCCCTGATCGATTGCCTGGCTCCGGATCGTCGCGTAGAGATCGAAGTTAAAGGCGTTAA AGACGTGGTAACTCAGCCGCAGGCTTAA (ID. DE SEQ. N° : 77)

[381] As Figs. 8A-8B retratam os aspectos estruturais da proteína OmpA modificada de S. Typhimurium com a inserção das sequências codificadas pelo gene Cjl433c que especifica as nove repetições às quais o N-glicano conservado de C. jejuni está anexado como uma consequência do óperon pgl de C. jejuni e a atividade da enzima WaaL de Salmonella. A construção resultante está atualmente sendo introduzida em um vetor suicida que será usado para introduzir a sequência que codifica essa fusão Cjl4433c-OmpA no cromossomo de χ12445 no lugar do gene ompA do tipo selvagem. Essa cepa será, então, adicionalmente modificada para liberar um plasmideo de lise que codifica os antígenos de C. jejuni considerados em estudos prévios como maximamente eficazes na redução das titulações cecais de cepas de ataque de C. jejuni. Experimentos como descritos acima por imunização de galinhas Leghorn brancas e pintos de frangos serão repetidos.

Produção de IROMPS e MnOMPs para aumentar a imunidade protetora contra sorotipos de Salmonella e outras bactérias entéricas.

[382] A mutação APf_Ur::TT araC Pbad fur foi inserida em

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206/242 χ12341 para gerar χ12396 (Tabela 2) e a mutação de deleçãoinserção AP_mntR::TT araC Pbad mntR (Tabela 3) também será inserida, para levar à supra-regulação in vivo de todos os genes necessários à captação de ferro e manganês. Como as respostas imunes aos IROMPs reagem de forma cruzada nas Enterobacteriaceae, essa cepa, na medida em que a síntese de antígeno-0 de LPS cessa in vivo (em função da mutação pmi e da ausência de manose e do fechamento do gene waaL regulado por araC ParaBAD) para expor melhor antígenos de superfície de proteína, induzirá imunidade protetora cruzada aumentada aos sorotipos de Salmonella e outras bactérias entéricas.

Exemplo 4: Avaliação de cepas de RASV-Cj em galinhas Leghorn brancas

Avaliação de habilidade para induzir imunidade protetora cruzada aos sorotipos de Salmonella, para evitar a colonização de órgãos e para reduzir as titulações cecais.

[383] RASV-Cj será avaliada liberando CjaA especificado pelo vetor de pG8R17 T2SS pG8R86 (Fig. 8), comparando χ12341 com o derivado de χ12396 descrito no Exemplo 2. O protocolo descrito por Hassan e Curtiss (113) será seguido. O antígeno CjaA é selecionado para esses estudos comparativos, já que, em um estudo não publicado com uma das novas cepas de RASV, houve uma redução de 3- a 4-log nas titulações cecais da cepa de ataque de C. jejuni. Além disso, CjaA, que foi avaliado em uns 23 estudos prévios, contém uma sequência que deve permitir a glicosilação com o N-glicano de C. jejuni na cepa de RASV-Cj. Pintos Leghorn brancos no dia da eclosão serão imunizados oralmente e receberão uma segunda imunização em 10 dias. Em seis semanas de idade, dez pintos imunizados e dez pintos não imunizados serão, cada um,

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207/242 atacados com 1 X 10⁶ CFU de cada um dos oito sorotipos de Salmonella listados na Tabela 5 (Typhimurium, Enteritidis, Heidelberg, Montevideo, Hadar, Infantis, Newport e Kentucky). Quatro e onze dias após o ataque, cinco pássaros em cada grupo serão sacrificados por asfixia com CO2 e as titulações das cepas de ataque e de vacina no fígado, baço, ovário (se presente), bolsa de Fabricius e ceco quantificadas por plaqueamento direto em ágar SS e por enriquecimento do caldo com selenita-cisteína (113). O caldo de enriquecimento detectará titulações bacterianas de apenas 5 por grama de tecido ou conteúdo. As características de contenção biológica das RASVs impedirão sua detecção.

Estudos de segundo estágio.

[384] Esses estudos são repetidos com uma mistura das duas RASVs, cada uma liberando dois ou três antígenos

protetores	de C. jejuni	validados. 0 mesmo protocolo	de
imunização	descrito acima	será	usado. Isso	servirá como	uma
repetição	independente	do	primeiro	experimento	e

estabelecerá o nível de repetitividade dos resultados iniciais. As titulações de cepas de ataque de S. Typhimurium e S. Enteritidis também serão avaliadas 10, 20 e 30 dias após o ataque por imunização com uma combinação das duas RASVs, cada uma liberando múltiplos antígenos protéicos de C. jejuni. Outro pequeno estudo será dirigido a determinar se uma única imunização é suficiente e determinar quanto tempo depois da imunização primária a imunidade protetora aos sorotipos de Salmonella é detectável em estudos de ataque.

Exemplo 5: Avaliação de cepas de RASV-Cj em frangos de corte

[385] Cepas de RASV-Cj que compreendem plasmideos de lise

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208/242 que codificam cada um dos antígenos de C. jejuni listados na Tabela 4 serão avaliadas para determinar o nível de proteção contra colonização e persistência de C. jejuni. Testes iniciais avaliarão se a liberação por χ12341 (Figs. 4A e 4B) ou χ12452 (Fig. 5) do antígeno CjaA dá os melhores resultados. A melhor cepa de liberação será então usada em avaliações subsequentes. A proteção será avaliada por medição da CFU no conteúdo cecal e os resultados correlacionados com respostas de anticorpos tanto no soro quanto nas fezes. Plasmídeos que codificam antígenos de C. jejuni que resultam nos maiores níveis de proteção serão usados para avaliar a proteção contra ataque heterólogo usando cepas bem caracterizadas de C. jejuni, bem como a um coquetel de isolados de galinha que são frequentemente isolados de aves domésticas nos Estados Unidos (listados na Tabela 5).

[38 6] Pintos de frangos recém eclodidos com um dia de idade serão obtidos de incubatórios e, antes do uso, os pintos serão confirmados negativos para Campylobacter por cultivo de esfregaços cloacais em placas de ágar MH e por PCR.

[387] Seis grupos de frangos de corte de 3 dias de idade (n = 10/grupo) serão imunizados com 1 X 10⁹ CFU/pinto oralmente com diferentes cepas de RASV-Cj que liberam antígenos de C. jejuni (Tabela 4). Grupos de controle de 10 pássaros serão inoculados com RASV-Cj com um plasmídeo vazio ou não serão vacinados. Os pintos serão inoculados novamente com RASVs 10 dias após a primeira inoculação. Duas semanas após o reforço, os pintos serão atacados com a cepa de C. jejuni 81-176 oralmente (1 X 10⁵ CFU/pinto em 200 μΐ de PBS) .

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209/242

Nosso trabalho prévio usando 81-176 e um coquetel de C. jejuni de galinha indicou que essa dose resulta em 100% de colonização (186, 211). Uma semana após o ataque, as galinhas serão mortas, o conteúdo cecal coletado, homogeneizado em PBS, e plaqueado um placas MH ágar + CSS. As placas serão incubadas a 42°C de forma microaeróbica por 3 dias e a CFU/g do conteúdo cecal determinada para avaliar a proteção contra o ataque por C. jejuni, comparando titulações dos grupos vacinados com os grupos de controle não vacinados. Esperase que várias construções de RASV-Cj levarão a uma redução de mais de 100 vezes nas titulações de colonização cecal por C. jejuni.

[388] Amostras de sangue, bile e fecais serão coletadas, respostas de IgY no soro e respostas de IgA nas fezes serão medidas por ELISA indireto, como descrito previamente (212) . Resumidamente, placas de microtitulação serão revestidas com proteínas de C. jejuni recombinantes purificadas, lavadas, bloqueadas com tampão de bloqueio Sea Block (Pierce, Rockford, IL). Amostras de teste (soro, bile ou fezes) serão adicionadas, as placas lavadas e anticorpos anti-C. jejuni detectados com anticorpo de cabra biotinilado anti-IgG ou IgA de galinha (Betyl Laboratories, Montgomery, TX) . As placas serão lavadas e solução de estreptavidina-peroxidase de raiz-forte (Southern Biotech, Birmingham, AL) será adicionada. O desenvolvimento de cor será detectado usando ABTS (Sigma, St. Louis, MO) contendo H2O2 0,03% em tampão citrato, pH 4,35. Após o desenvolvimento de cor, a reação será interrompida com solução de SDS 1% e a OD405 medida usando uma leitora de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

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210/242

[389] É testado se a liberação de múltiplos antígenos de C. jejuni confere titulações de ataque reduzidas após imunização. Plasmideos que codificam os múltiplos antígenos serão construídos e introduzidos nas cepas de RASV-Cj. Os estudos envolverão a comparação de uma RASV versus uma mistura das duas que liberam o mesmo antigeno de C. jejuni ou até mesmo antígenos de C. jejuni diferentes. Será comparada a imunização com uma versus duas doses. Se os resultados com uma dose única forem satisfatórios, doses orais menores serão investigadas. A habilidade dessas RASVs para conferir proteção contra colonização cecal por C. jejuni será avaliada como descrito acima. A resposta protetora também será correlacionada com a resposta de anticorpo em soros e fezes como acima. Grupos de controle de galinhas inoculadas com uma RASV que carrega um plasmídeo vazio e galinhas atacadas e não atacadas e não vacinadas serão usados.

[390] RASVs selecionadas dos estudos acima são testadas para ver se elas conferem proteção contra o ataque com cepas heterólogas de C. jejuni. Galinhas imunizadas com RASV serão atacadas com cepas de C. jejuni bem caracterizadas comumente usadas (NC11168, 81116, RM221 e 81-176) . Além disso, as galinhas serão atacadas com um coquetel de isolados de C. jejuni originários de aves domésticas (5 isolados que são frequentemente isolados de aves domésticas). As galinhas (n = 10/grupo) serão vacinadas com as RASVs selecionadas (1 X 10⁹ CFU/galinha oralmente) pelo melhor meio como estabelecido pelos estudos descritos acima, e atacadas com 1 X 10⁵ CFU/pinto em 200 μΐ de PBS de cepas de C. jejuni. Para o coquetel, concentrações iguais de cada cepa (1 X 10⁵) serão

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211/242 misturadas em PBS para o ataque. Após o ataque, a proteção contra colonização cecal e as respostas de anticorpos no soro e nas fezes serão avaliadas como acima. Grupos de galinhas inoculadas com RASVs que carregam um plasmídeo vazio e atacadas com C. jejuni, bem como um grupo de galinhas não vacinadas não atacadas, serão usados como controles.

[391] Em relação à segurança e utilidade, são incluídas múltiplas mutações em todas as cepas de S. Typhimurium que impedem a formação de biofilme e incapacidade para colonizar cálculos biliares na presença de bile. Essas mesmas mutações diminuem a habilidade para persistência nos tratos intestinais de camundongos e galinhas. Cepas de S. Typhi com algumas das mesmas mutações na RASVs de S. Typhimurium propostas foram incapazes de causar bacteremia em humanos e não foram derramadas de uma forma cultivável viável nas fezes após administração oral de até 10¹⁰ CFU (150) . Cepas de S. Typhimurium do mesmo genótipo foram seguras em camundongos recém-nascidos (146, 147), prenhes, malnutridos e imunocomprometidos. Além disso, a maioria das cepas passa por lise retardada regulada, o que impede a persistência in vivo e a viabilidade se derramadas nas fezes (142) . Além disso, a infectividade e a virulência total dessas RASVs exigem a presença dos açúcares arabinose, manose e ramnose e, dessa forma, se derramadas, são incapazes de infectar ou imunizar animais ou humanos. Novos meios para avaliar e demonstrar a segurança e eficácia de RASVs são continuamente desenvolvidos, frequentemente com informação produtiva de APHIS e FDA. Estudos sobre a sobrevida de RASVs na água (com e sem cloração), como uma consequência da dessecação, no esgoto, nas fezes, em sangue total, em soros com e sem

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212/242 inativação de complemento, e em macrófagos derivados de monócitos foram realizados. Essa testagem de RASVs de S. Typhimurium e em fezes de galinhas, líquidos corpóreos e células por fim serão feitos.

[392] Embora Salmonella seja um patógeno de categoria 2 com pesquisas realizadas usando instalações laboratoriais BSL2 e procedimentos e estudos animais em instalação ABSL2, o NIH RAC revisou as propriedades de segurança de nossas RASVs e permitiu que a realização de todos os estudos com imunização fossem feitos sob contenção de nível 1, em ambientes agrícolas comerciais e em voluntários humanos ambulatoriais. Essa aprovação foi possível mediante concordância pelo Institutional Biosafety Committee e o UF IBC concedeu essa aprovação. No entanto, o ataque de animais imunizados ainda deve ser realizado sob o nível de contenção necessário para aquele patógeno particular.

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206. Young NM, Brisson JR, Kelly J, Watson DC, Tessier L, Lanthier PH, Jarrell HC, Cadotte N, St Michael F, Aberg E, Szymanski CM. 2002. Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium, Campylobacter jejuni. J. Biol. Chem. 277: 42.530-42.539.

207. Hobbs M, Reeves PR. 1994. The JUMPstart sequence:

a 3 9 bp	element common	to	several	polysaccharide gene
clusters	'. Mol.	Microbiol.	12 :	855-856.
208 .	Nieto	JM, Bailey	MJ,	Hughes C,	Koronakis V. 1996.
Suppression of	transcription	polarity	in the Escherichia

coll haemolysin operon by a short upstream element shared by polysaccharide and DNA transfer determinants. Mol. Microbiol. 19: 705-713.

209. Nothaft H, Davis B, Lock YY, Perez-Munoz ME, Vinogradov E, Walter J, Coros C, Szymanski CM. 2016. Engineering the Campylobacter jejuni N-glycan to create an

Petição 870190122989, de 25/11/2019, pág. 248/261

242/242 effective chicken vaccine. Sci. Rep. 6: 26.511.

210. Price NL, Goyette-Desjardins G, Nothaft H, Valguarnera E, Szymanski CM, Segura M, Feldman MF. 2016. Glycoengineered Outer Membrane Vesicles: A Novel Platform for Bacterial Vaccines. Sci. Rep. 6: 24.931.

211. Gangaiah D, Liu Z, Arcos J, Kassem, II, Sanad Y, Torrelles JB, Rajashekara G. 2010. Polyphosphate kinase 2: a novel determinant of stress responses and pathogenesis in Campylobacter jejuni. PLoS One 5: el2142.

212. Annamalai T, Pina-Mimbela R, Kumar A, Binjawadagi B, Liu Z, Renukaradhya GJ, Rajashekara G. 2013. Evaluation of nanoparticle-encapsulated outer membrane proteins for the control of Campylobacter jejuni colonization in chickens. Poult. Sci. 92: 2.201-2.211.

213. Reusch RN. 2013. The role of short-chain conjugated poly-(R)-3-hydroxybutyrate (cPHB) in protein folding. Int. J. Mol. Sci. 14: 10.727-10.748.

214. Pautsch A, Schulz GE. 1998. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nat. Struct. Biol. 5: 1.013-1.017.

215. Vogel H, Jahnig F. 1986. Models for the structure of outer-membrane proteins of Escherichia coli derived from raman spectroscopy and prediction methods. J. Mol. Biol. 190: 191-199.

Claims (4)

REIVINDICAÇÕES

1. Derivado recombinante de uma bactéria patogênica, caracterizado por compreender:

a. uma atenuação regulada-retardada;

b. uma expressão regulada-retardada de um antígeno de interesse;

c. um fenótipo in vivo de lise regulada-retardada; e

d. síntese e liberação de um ou mais antígenos de proteína de Campylobacter jejuni.

2/4

5. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a bactéria compreende um ou mais genes de óperon de Campylobacter pgl. 6. Bactéria, de acordo com a reivindicação 5,

caracterizada pelo fato de que os (um ou mais) genes de óperon de Campylobacter pgl são códon-otimizados para expressão na bactéria.

7. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a bactéria é uma bactéria Gram-negativa.

8. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a bactéria pertence à família Enterobacteriaceae.

9. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o antígeno de interesse é um antígeno de Campylobacter.

10. Bactéria, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o antígeno de interesse é selecionado do grupo que consiste em Pebl, CjaA, Dps, TlyA, 0mpl8, Cj0998c, Cj0034c, Cj0168c, Cj0248, Peb3, CmeC, Cj0404, Cj0420, Cj0427, Cj0428, PorA, FlaA, CadF e Cjl656c.

11. Bactéria, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o N-glicano de C. jejuni está anexado ao antígeno de interesse.

12. Bactéria, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a bactéria compreende a inserção de todo ou parte do gene cjl433c em uma deleção do gene ompA para gerar uma fusão da proteína Cjl433c.

13. Bactéria, de acordo com qualquer uma das

Petição 870190071624, de 26/07/2019, pág. 19/23

2. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a bactéria compreende ainda mutações que causam exibição do polissacarídeo do núcleo de LPS universal in vivo.

3/4 reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a atenuação regulada-retardada é conferida pelo gene fur ou mntR.

14. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o fenótipo in vivo de lise regulada-retardada é conferido por deleções ou mutações por deleção/inserção AP_murA::TT araC Pbad murA, ÁasdA: : TT araC Pbad c2 ou Δ (wza-wcaM) .

15. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a bactéria compreende ainda uma mutação no gene sifA.

16. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a bactéria compreende ainda uma mutação no gene relA.

17. Composição farmacêutica caracterizada por compreender a bactéria recombinante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por compreender ainda um segundo derivado recombinante de uma bactéria patogênica, em que a referida bactéria compreende um ácido nucleico que codifica um segundo antígeno de interesse.

19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o segundo antígeno de interesse é um antígeno de Salmonella.

20. Método para indução de imunidade protetora em uma ave, o método caracterizado por compreender a administração à ave de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das

Petição 870190071624, de 26/07/2019, pág. 20/23

3. Derivado recombinante de uma bactéria patogênica, caracterizado por compreender:

a. uma atenuação regulada-retardada;

b. uma expressão regulada-retardada de um antígeno de interesse;

c. um fenótipo in vivo de lise regulada-retardada; e

d. síntese e liberação de um ou mais antígenos de proteína que exibem o N-glicano de Campylobacter jejuni.

4. Derivado recombinante de uma bactéria patogênica, caracterizado por compreender:

a. uma atenuação regulada-retardada;

b. uma expressão regulada-retardada de um antígeno de interesse;

c. um fenótipo in vivo de lise regulada-retardada; e

d. síntese e liberação de um ou mais antígenos de proteína de Campylobacter jejuni e também exibe o N-glicano de Campylobacter jejuni.

Petição 870190071624, de 26/07/2019, pág. 18/23

4/4 reivindicações 17 a 19.