CN109844538A - 用于增强荧光的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及荧光染料领域,并且特别涉及用于增加荧光信号和减少荧光猝灭的组合物和方法。
Description
技术领域
本公开涉及荧光染料领域,并且特别涉及用于增加荧光信号和减少荧光猝灭的组合物和方法。
背景技术
荧光标记的生物分子广泛用于各种方法,包括与定量测定和细胞成像有关的方法。生物分子如抗体、抗原、DNA和RNA被荧光标记并用于如免疫荧光(IFC)、流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹、药物结合研究、酶动力学、成像(免疫细胞化学ICC)包括HCA、体内成像以及核酸杂交等应用中。荧光染料继续被选择用于这些应用,因为它们易于使用并且不仅特异且敏感,而且还提供多路复用选项。然而,并非所有应用都适合荧光标记。例如,在许多应用中,随着增加量的荧光标记物(高染料与蛋白质的比率)被添加到生物分子中(猝灭),荧光的强度可以降低。此外,通过生物分子的荧光标记引起的空间位阻也可以降低荧光。需要展现增强的信号强度的荧光标记物和缀合方法。
发明内容
本文公开了通过例如经修饰的接头、化学物质和特定方案增加与生物分子缀合的荧光染料的强度的组合物和方法。因此,本发明的一个方面是改善染料的性能。已经发现,与用单独的染料制备的相应缀合物相比,当用染料和间隔分子标记生物分子时,荧光强度可以增加。用这些间隔分子制成的缀合物在蛋白质印迹、斑点印迹分析、平板分析、流式细胞术和免疫分析应用(例如,免疫荧光成像应用)中显示荧光增强。
此外,即使较少的染料分子与每个生物分子(共价或非共价)缔合,也可以看到增强的荧光。据信这种效应与间隔基团与表现出增强荧光的生物分子的连接有关。虽然不希望受理论束缚,但据信增强的荧光是由染料发射的猝灭减少引起的。在一些方面,本发明部分涉及包含第一生物分子(例如,第一抗体)的组合物,其中两个或更多个荧光标记物和两个或更多个间隔分子共价连接至第一生物分子,并且其中荧光和间隔分子彼此不共价连接。在一些情况下,第一生物分子(例如,第一抗体)表现出比用等量荧光标记物但没有间隔物制备的第二生物分子(例如,第二抗体)更高的荧光发射水平。在另外的实例中,第一生物分子表现出比第二生物分子更高的荧光发射水平,其中第一生物分子和第二生物分子各自具有相同数量的共价结合荧光标记物,并且其中第二生物分子不具有共价结合的间隔物。在具体的实施例中,与不存在间隔物时的猝灭相比,间隔分子减少了荧光标记物的猝灭。
在本发明的一些方面,间隔分子通过反应性基团与生物分子缀合。此类反应性基团可以是胺反应性基团(例如,NHS酯,一个或多个胺基可以在多肽和/或赖氨酸侧链的胺末端)、巯基、羧酸基等。可以与间隔分子缀合的其他基团包括多肽的半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基和/或羧基末端。此外,荧光标记物可以通过缀合臂与生物分子缀合。这些荧光标记物可以带正电、中性和/或带负电。
在一些实施例中,在本发明的实践(包括组合物和方法)中所用的荧光标记物可以是花青、苯并罗丹明、bodipy、荧光素、苯并吡喃鎓衍生物并且进一步包括染料和/或DyLightTM染料。这样的染料可以选自由以下组成的组:350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610-X、633、647、660、680、 700、750、790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、 488、514、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE)、DyLightTM 350、DyLightTM 405、DyLightTM 488、DyLightTM 550、DyLightTM 594、DyLightTM 633、DyLightTM650、DyLightTM 680、DyLightTM 755和DyLightTM 800。当然,其他染料以及上述染料的修饰形式可用于本发明的实践中。
间隔物可以是负电荷或中性电荷的,可以用于本发明的实践中。此外,间隔物可以选自例如乙酸酯和聚乙二醇(PEG)。间隔物可以包含乙酰基并且可以是乙酸酯分子(例如,磺基-NHS-乙酸酯)。此外,间隔物可包含(PEG)n或由(PEG)n组成,其中n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15,和/或MS-(PEG)n,其中n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
此外,在本发明的实践中使用的间隔物可包含一种或多种选自烷酰基、烯酰基和炔酰基(-C(O)CnHm)的基团或由其组成,其中n为1至20个原子,其中m>n,其中碳原子可通过单键、双键和/或三键彼此连接。烷基、烯基和/或炔基可进一步被-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR取代,其中x为1至20,y为1至6,R为H或C1-6烷基。另外,烷基、烯基和/或炔基可进一步被铵(-NH3 +)、季铵(-NR3 +)基团取代,其中R为C1-6烷基。
另外,在本发明的具体实施例中,荧光染料可包含一种或多种350、405、430、488、500、514、532、546、555、 568、594、610-X、633、 647、660、680、700、750、790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、、488、 514、PacificBlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、或7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE);间隔物可包含一种或多种磺基-NHS-乙酸酯;(PEG)n,其中n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15;MS-(PEG)n,其中n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15;烷酰基、烯酰基和炔酰基(-C(O)CnHm),其中n为1至20个原子,其中m>n,其中碳原子可通过单键、双键和/或三键彼此连接;或烷基、烯基和/或炔基,其进一步被-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR取代,其中x为1至20,y为1至6,R为H或C1-6烷基,或其中烷基、烯基和/或炔基进一步被铵(-NH3 +)、季铵(-NR3 +)基团取代,其中R为C1-6烷基。此外,烷基、烯基和/或炔基可进一步被鏻基团(-PQ3 +)取代,其中Q为芳基、取代的芳基或C1-6烷基。
本发明的组合物和方法可含有或使用荧光标记的生物分子(例如,抗体),其中荧光标记物与生物分子的比例为1至50、5至30或1至20。本发明的组合物和方法可含有或使用荧光标记的生物分子(例如,抗体),其中间隔剂与生物分子的比例为1至50、5至30、5至30或1至20。
另外,本发明的组合物和方法可含有或使用荧光标记的生物分子(例如,抗体),其中间隔剂是以相对于多个荧光标记物0.1至25、1至15或2.5至10倍的量摩尔过量的;其中间隔剂是以相对于多个荧光标记物2.5倍的量摩尔过量的;其中间隔剂是以相对于多个荧光标记物5倍的量摩尔过量的;其中间隔剂是以相对于多个荧光标记物7.5倍的量摩尔过量的;或者其中间隔剂是以相对于多个荧光标记物10倍的量摩尔过量的。
此外,本发明的组合物和方法可含有或使用荧光标记的生物分子(例如,抗体),其中生物分子上由多个荧光标记物占据的结合位点(例如,可接近的胺基)的百分比为1%至99%。
在一些实施例中,间隔物的存在使荧光标记物的可检测荧光增加至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。
本发明还部分涉及用于增加荧光标记的生物分子的荧光的方法。这样的方法包括那些包含以下的方法:(a)将间隔分子与生物分子缀合;(b)将荧光标记物与生物分子缀合;其中步骤(a)和(b)可以同时或以任何顺序进行,并且其中间隔物和荧光标记物不相互缀合。此外,与不存在间隔物时发生的猝灭量相比,间隔分子可以减少荧光标记物的猝灭。
本发明还部分涉及鉴定能够增强荧光标记的生物分子的荧光发射的间隔分子的方法。这样的方法可以包括:(a)独立于与生物分子缀合的多个荧光标记物,将间隔分子与生物分子缀合;(b)测试除了与生物分子缀合的多个荧光标记物之外是否存在间隔剂增加了多个荧光标记物的可检测荧光;(c)除了与生物分子缀合的多个荧光标记物之外,当间隔物的存在增加了多个荧光标记物的可检测荧光时,将间隔剂鉴定为将减少与蛋白质缀合的荧光标记物的猝灭的间隔剂。在一些情况下,间隔剂在生物分子上存在的初级赖氨酸侧链上与生物分子缀合。此外,生物分子是抗体或抗体片段。而且,多个荧光标记物可以带负电和/或带正电。另外,间隔剂可以带负电和/或带正电。
本发明还部分涉及用于确定生物样品中所需目标的存在的方法。这样的方法可以包括:(a)使生物样品与抗体组合物接触,其中两个或更多个荧光标记物和两个或更多个间隔分子共价连接至抗体,其中荧光分子和间隔分子彼此不共价连接,(b)检测由多个荧光标记物发射的荧光;(c)当检测到由多个荧光标记物发射的荧光时,确定生物样品中所需目标的存在。在本发明的实践中使用的生物样品可包括细胞裂解物、完整细胞(例如,流体如体液中的完整细胞)、分离的蛋白质和/或重组蛋白质。此外,可以将生物样品固定在固体支持物上。此外,生物样品包括活动物,例如哺乳动物。
本发明还部分涉及包含第一核酸分子的组合物,其中两个或更多个荧光标记物和两个或更多个间隔分子共价连接至第一核酸分子,并且其中荧光分子和间隔分子彼此不共价连接。.在一些实施例中,第一核酸分子可以表现出比用等量荧光标记物但没有间隔物制备的第二核酸分子更高的荧光发射水平。此外,在一些实施例中,第一核酸分子可以表现出比第二核酸分子更高的荧光发射水平,其中第一核酸分子和第二核酸分子各自具有相同数量的共价结合荧光标记物,并且其中第二核酸分子不具有共价结合的间隔物。
本发明还包括缀合的抗体,其包含各自与多个荧光标记物(例如,平均约2至约30个、约2至约20个、约3至约30个、约2至约15个、约3至约15个、约4至约30个、约6至约20个、约7至约30个等)缀合的抗体,其中缀合的抗体包含一种或多种下列特征:
(a)基于每个荧光标记物的荧光比率等于或大于0.5,
(b)至少四个荧光标记物与抗体缀合,
(c)抗体的总荧光比未缀合的荧光分子的荧光高至少20%,和/或
(d)平均每个抗体分子连接有约3至约80个荧光标记物。
此外,荧光标记物可以通过一个或多个(例如,约1至约15个、约2至约10个、约2至约15个、约2至约8个、约3至约10个、约3至约6个等)多臂聚合物与生物分子(例如抗体)缀合。另外,多臂聚合物的臂可以由选自由以下组成的组的类型的化学物质构成:(a)聚乙二醇,(b)多糖,和(c)多肽,以及其他材料。此外,荧光标记物之间的平均刷子距离可以在200至800埃之间(例如,约200至约700、约300至约800、约400至约800、约500至约800、约200至约600、约500至约800、约300至约700、约350至约800等)。此外,与抗体(或其他生物分子)缀合的荧光标记物可以与抗体(或其他生物分子)分隔开至少16个(例如,约16至约800个、约25至约800个、约40至约800个、约60至约800个、约100至约800个、约200至约800个、约250至约800个、约150至约600个等)共价键。另外,缀合的抗体(或其他生物分子)可以与荧光标记物缀合,所述荧光标记物可以是一种或多种选自由以下组成的组的染料:350、405、430、488、500、514、532、 546、555、568、594、610-X、633、647、660、680、700、750、790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、、488、514、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、或7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE);和选自由以下组成的组的荧光标记物:DyLightTM 350、DyLightTM 405、DyLightTM 488、DyLightTM 550、DyLightTM 594、DyLightTM 633、DyLightTM 650、DyLightTM 680、DyLightTM755和DyLightTM 800以及聚乙二醇化DyLightTM染料。
本发明还包括制备荧光标记的生物分子的方法,这些方法可包括:(a)将反应性基团和两个或更多个荧光标记物缀合至间隔分子,从而形成荧光标记的间隔分子,和(b)将荧光标记的间隔分子与生物分子缀合,从而形成荧光标记的生物分子,其中所述荧光标记的生物分子的各个荧光标记物具有基于每个荧光标记物等于或大于0.5的荧光比率。此外,平均为1至10个(例如,约1至约9个、约2至约10个、约3至约10个、约4至约10个、约5至约10个、约2至约6个、约3至约6个、约3至约7个等)荧光标记的间隔分子可以缀合于各个生物分子。另外,荧光标记的间隔分子可以是多臂聚合物(例如,分支聚乙二醇分子)。此外,间隔分子(例如,多臂聚合物)可各自与平均4至20个(例如,约4至约10个、约3至约8个、约4至约8个、约3至约9个等)荧光标记物缀合。此外,间隔分子(例如,多臂聚合物)的分子量可为4,000至80,000道尔顿(例如,约4,000至约70,000、约4,000至约60,000、约4,000至约50,000、约4,000至约40,000、约10,000至约70,000、约15,000至约60,000等)。
本发明还包括用于检测荧光标记的生物分子的方法。这样的方法可以包括:(a)用激发与生物分子缀合的荧光标记物的光暴露荧光标记的生物分子(例如抗体)和(2)检测由与生物分子缀合的荧光标记物产生的发射光。在一些情况下,荧光标记的生物分子可以与四种或更多种荧光标记物缀合。此外,荧光标记的生物分子的各个荧光标记物可以具有基于每个荧光标记物等于或大于0.7(例如,约0.7至约1.0、约0.7至约0.95、约0.7至约0.9、约0.7至约0.85、约0.75至约0.95等)的荧光比率。
附图说明
图1示出了本发明一个实施例的示意图。在该实施例中,抗体与两种不同染料摩尔过量的NHS荧光染料和磺基NHS-乙酸酯间隔物在50mM硼酸盐缓冲液pH 8.5中缀合。染料和间隔物的缀合导致增强的灵敏度和减少的猝灭。
图2示出了本发明的一些实施例的示意图。在该实施例中,抗体与NHS-荧光染料和甲基-PEG-NHS-酯间隔物在50mM硼酸盐缓冲液pH 8.5中缀合。在该实施例中使用的间隔物是MS(PEG)4、MS(PEG)8和MS(PEG)12。
图3示出了使用成像仪器捕获的斑点印迹的软件分析结果。用NHS乙酸值或MS(PEG)4间隔物和DyLightTM 488荧光染料(在表1中缩写为“DyLightTM 488”)共标记的GAM抗体测试斑点印迹。用NHS乙酸酯或MS(PEG)4制备的DyLightTM 488-GAM缀合物导致荧光强度提高1.2至1.8倍,在相比于基础缀合物(在没有间隔物的情况下制备)的1.2至1.8倍范围内。该图的分道如下:
图4:斑点印迹-在染料各种摩尔过量下相比于基础缀合物来自NHS乙酸酯(2.5X,5X)或MS(PEG)4(3.75X)的小鼠IgG倍数改善的DyLightTM 488-GAM检测。该图示出了使用成像仪器捕获的斑点印迹的软件分析的结果。使用NHS乙酸值或MS(PEG)4间隔物和DyLightTM488荧光染料共标记的GAM抗体,使用分析法测试斑点印迹。这些数据使用抗体的另一个来源证实了图3的结果。与单独的抗体-染料缀合物相比,NHS乙酸酯和MS(PEG)4间隔物均提供荧光信号强度的显著改善(增加多达约2.6)。
图5:斑点印迹-用DyLightTM 550-2XPEG-GAR检测小鼠IgG。在不同摩尔过量下,NHS乙酸酯(2.5X,5X)或MS(PEG)4(3.75X)相对于基础缀合物的信号/背景倍数改善。这显示了使用成像仪器捕获的斑点印迹的软件分析的结果。用NHS乙酸酯或MS(PEG)4间隔物和DyLightTM 550荧光染料共标记的DyLightTM 550-GAM抗体测试斑点印迹。将小鼠IgG从1000ng/斑点1∶1连续稀释。所有DyLightTM 550-2xPEG-GAR二抗是1mg/ml原液稀释1/5000。添加到缀合混合物中的NHS乙酸酯或MS(PEG)4提供了与每种相应染料摩尔过量的基础缀合物相比的信号强度的改善(增加多达约1.6)。改善范围介于1.2至1.6倍;特别是对于以下GAM-DyLightTM 550-2xPEG:10X染料+5X乙酸酯、15X染料+3.75X MS(PEG)4、20X染料+5X乙酸酯和20X+3.75X MS(PEG)4,显示出改善比相应的基础缀合物大1.3倍。
图6:斑点印迹-在每种染料摩尔过量下相比于基础缀合物来自NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X)或MS(PEG)4(3.75X,5X,10X)的小鼠IgG倍数改善的DyLight 650-4XPEG-GAM检测。该图示出了使用成像仪器捕获的斑点印迹的软件分析的结果。用NHS乙酸值(2.5X,5X和10X)或MS(PEG)4(3.75X)和DyLightTM 650-4xPEG(在表2中缩写为“DyLightTM 650”)(10X-20X)共标记的GAM抗体测试斑点印迹。将小鼠IgG从1000ng/斑点1∶1连续稀释。所有DyLightTM 650-4xPEG-GAR是1mg/ml原液稀释1/10,000。具有高染料取代的缀合物倾向于在如斑点印迹和蛋白质印迹的应用中表现更好。与初始基础缀合物相比,NHS乙酸酯和(MS)PEG4在灵敏度和信号/背景(增加多达约2.2)方面带来显著改善。以2.5X摩尔过量添加到GAM-DyLightTM 650-4xPEG-15X的NHS乙酸酯使强度提高1.7倍。NHS乙酸酯提供的改善显示出比用最高摩尔过量(20X)制备的缀合物高1.3倍的性能。添加到GAM-DyLightTM 650-4xPEG-15X缀合物中的所有MS(PEG)4将荧光强度提高1.8至2.2倍并且比相应的最高基础缀合物GAM-DyLightTM 650-4xPEG-20X表现更好。该图的分道如下:
图7:斑点印迹-在每种摩尔过量下相比于基础缀合物来自NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X)或MS(PEG)4(3.75X,5X,10X)的DyLightTM 880-4XPEG缀合物的倍数改善。该图显示了在荧光斑点印迹分析中,添加NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X)或MS(PEG)4(3.75X,5X,10X)对GAM-DyLightTM 800-4xPEG(在表3中缩写为“DyLightTM 800”)的可检测荧光水平的影响。将小鼠IgG从1000ng/斑点1∶2连续稀释。所有DyLightTM 800-4xPEG-GAR二抗稀释至1mg/ml原液的1/20,000。该斑点印迹应用显示,添加MS(PEG)4(3.75X和5X)和NHS乙酸酯(5X)显著增强基础DyLightTM 800-4xPEG缀合物的荧光强度和灵敏度1.5至6倍。该图的分道如下:
图8蛋白质印迹分析证明,在范围介于5X至20X染料的摩尔过量下,添加NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X摩尔过量)或MS(PEG)4(3.75X摩尔过量)对与抗体缀合的GAR-DyLightTM 488的荧光检测水平的影响。将A431细胞裂解物从1μg/孔稀释3倍。使用的兔一抗是从1mg/ml稀释1/5000的抗Hsp90和从1mg/ml稀释1/5000的抗亲环蛋白B。所有DyLightTM二抗是从1mg/ml原液稀释1/5000。这些结果表明,在蛋白质印迹应用中,对于通过添加NHS乙酸酯或MS(PEG)4缀合的DyLightTM 488-GAR,在7.5X至20X的每种染料摩尔过量下,荧光强度相对于基础缀合物(在无间隔物的情况下制备)具有明显增加。
图9显示在蛋白质印迹中NHS乙酸酯(5X)或MS(PEG)4(5x))对GAM-DyLightTM 650-4xPEG-GAR(7.5X染料摩尔过量)的影响。将HeLa细胞裂解物从0.5μg/孔稀释4倍。将一抗小鼠抗PDI稀释至1mg/ml的1/5000。所有DyLightTM二抗稀释至1mg/ml原液的1/5000。以5X摩尔过量添加到GAM-DyLightTM 650-4xPEG-7.5X缀合物中的NHS乙酸酯将强度提高1.5倍。以3.75X摩尔过量添加到GAM-DyLightTM 650-4xPEG-7.5X缀合物中的NHS乙酸酯将强度提高1.4倍。
图10显示来自蛋白质印迹分析的结果,其测试NHS乙酸酯(2.5X,5X)或MS(PEG)4对GAR-DyLightTM 800-4xPEG(在表4中缩写为“DyLightTM800”)的可检测荧光水平的影响。将A431细胞裂解物以1∶1连续稀释。将一抗兔抗Hsp90和抗亲环蛋白B均稀释1/5000。所有DyLightTM二抗稀释至1mg/ml原液的1/20,000。在该蛋白质印迹应用中,在不同的染料摩尔过量下,MS(PEG)4(3.75X和5X)和NHS乙酸酯(2.5-5X)的添加使基础DyLightTM 800-4xPEG缀合物的荧光强度和灵敏度显著增强了20-100%。该图的分道如下:
图11显示了在荧光蛋白质印迹和斑点印迹分析中添加NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X)或MS(PEG)4(5x)和MS(PEG)8(5x)对GAM-DyLightTM 550-2xPEG(在12.5X染料摩尔过量下)的影响。将HeLa细胞裂解物从0.5μg/孔稀释4倍,并用稀释至1mg/ml的1/5000的抗PDI一抗染色。所有DyLightTM二抗稀释至1mg/ml原液的1/5000。蛋白质印迹和斑点印迹分析表明,添加MS(PEG)4(5X)和NHS乙酸酯(2.5X和5X)显著增强基础DyLightTM 550-2xPEG结合物的荧光强度和灵敏度至少2倍。用较长链MS(PEG)8制备的缀合物未显示出比基础缀合物显著的改善。
图12示出在蛋白质印迹和斑点印迹分析中NHS乙酸酯(2.5X,5X)或MS(PEG)4(5X)对GAM-DyLightTM 680-4xPEG-GAR(在10X染料摩尔过量下)的影响。对于蛋白质印迹,将HeLa细胞裂解物从0.5μg/孔稀释4倍,并将抗PDI一抗稀释至1mg/ml的1/5000。对于斑点印迹,将小鼠IgG从1000ng/点1∶2连续稀释。所有DyLightTM 680-4xPEG-GAR二抗稀释至1mg/ml原液的1/20000。蛋白质印迹和斑点印迹均显示,添加MS(PEG)4(5X)和NHS乙酸酯(2.5X和5X)显著增强基础DyLightTM 680-4xPEG缀合物的荧光强度和灵敏度3至4倍。
图13A(在DyLightTM 488-GAM 4μg/ml下的IFC。在各种摩尔过量下,NHS乙酸酯(2.5X,5X)或MS(PEG)4(3.75X)相对于基础缀合物的信号/背景倍数改善)和图13B(在DyLightTM 488-GAR 4μg/ml下的IFC-PDI侦测。在各种摩尔过量下,NHS乙酸酯(2.5X,5X)或MS(PEG)4(3.75X)相对于基础缀合物的信号/背景倍数改善)证明在细胞成像分析中,在7.5X至20X染料摩尔过量下,NHS乙酸酯(2.5X和5X)或MS(PEG)4(3.75X)添加对GAM-DyLightTM 488(13A)和GAR-DyLightTM 488(13B)的萤光。图13A:A549细胞用稀释至1mg/ml原液的1/1000的pH2Ax一抗染色。所有DyLightTM 488二抗稀释至1mg/ml原液的1/250。与15X染料摩尔过量的基础缀合物相比,NHS乙酸酯修饰的缀合物提供了信号/背景的改善;范围介于1.4至1.5倍(GAM)和1.1至1.6倍(GAR)。对于GAM缀合物,用5X的NHS乙酸酯和3.75X的MS(PEG)4观察到最显著的改善,对于GAR缀合物,用2.5X的NHS乙酸酯和3.75X的MS(PEG)4观察到更明显的改善。图13B显示了类似的实验,其中A549细胞用pH2Ax一抗染色。
图14:通过DyLightTM 550-2XPEG(7.5X至20X)4μg/ml进行PDI的IFC侦测。在每个染料摩尔过量下,相对于基础缀合物添加NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X)或MS(PEG)4(3.75x,5X,10X)的倍数改善。该图显示了在荧光细胞成像分析中,NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X)或MS(PEG)4(3.75X,5x和10X)添加对GAM-DyLightTM 550-2XPEG-GAM(在7.5X至20X染料摩尔过量下)的影响。用稀释至1mg/ml原液的1/100的抗PDI一抗对U2OS细胞进行染色。所有DyLightTM550-2xPEG-GAM二抗(在表5中缩写为“DyLightTM 550”)稀释至1mg/ml原液的1/250。在这种细胞成像应用中,对于12.5X染料摩尔过量的DyLightTM 550-2xPEG GAM缀合物,添加5X NHS乙酸酯产生与基础结合物(在无添加剂的情况下制备)相比约50%的改善,且添加3.75X MS(PEG)4在20X染料摩尔过量下产生相比基础缀合物约50%的改善。该图的分道如下:
图15:通过DyLightTM 650-4XPEG(7.5X至20X)4μg/ml进行PDI的IFC侦测。在每个染料摩尔过量下,相对于基础缀合物添加NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X)或MS(PEG)4(3.75X,5X,10X)的倍数改善。该图显示了在荧光细胞成像分析GAM-DyLightTM 650-4xPEG)中,添加NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X)或MS(PEG)4(3.75X,5X和10X)对GAM-DyLightTM 650-4xPEG的影响。用稀释至1mg/ml原液的1/100的抗PDI一抗对U2OS细胞进行染色。所有DyLightTM 650-4xPEG-GAM二抗(在表6中缩写为“DyLightTM 650”)稀释至1mg/ml原液的1/250。在该应用中,对于20X摩尔过量的DyLightTM 650-4xPEG-GAM缀合物,添加NHS乙酸酯-5X产生与基础缀合物(在无添加剂的情况下制备)相比约70%的改善,并且MS(PEG)4-3.75X在20X摩尔过量下显示出相比基础缀合物约90%的改善。该图的分道如下:
图16:IFC-DyLightTM 680-4XPEG在每种摩尔过量下相对于基础缀合物来自NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X)或MS(PEG)4(3.75X,5X,10X)的倍数改善。该图显示了在细胞成像分析中添加NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X)或MS(PEG)4(3.3.75X,5X,10X)对GAM-DyLightTM 680-4xPEG)的影响。用稀释至1mg/ml原液的1/100的小鼠抗PDI一抗对U2OS细胞进行染色。所有DyLightTM 680-4xPEG-GAM二抗(在表7中缩写为“DyLightTM 680”)稀释至1mg/ml原液的1/250:在该细胞成像应用中,与DyLightTM 680-4xPEG的基础缀合物(在无添加剂的情况下制备)相比,添加NHS乙酸酯-5X使得在7.5X和10X下的染料缀合物产生约70%改善。在15X摩尔过量和MS(PEG)4-3.75X的摩尔过量下的GAM缀合物显示出在15X摩尔过量下相比基础缀合物约80%的改善。该图的分道如下:
图17:具有或不具有甜菜碱的TAMRA-GAM共缀合物。该图举例说明了在各种染料/蛋白质摩尔比下观察到的具有或不具有甜菜碱的TAMRA-山羊抗小鼠抗体(GAM)缀合物的荧光水平。与抗体的摩尔数相比,在2.5、5和10X摩尔过量下测试甜菜碱的水平。当抗体与作为间隔剂的甜菜碱缀合时,用NHS-罗丹明(TAMRA)标记并且与各种NHS-甜菜碱浓度(甜菜碱2.5X、甜菜碱5X、甜菜碱10X染料摩尔过量)缀合的这些抗体呈现总萤光增加。
图18显示了含有荧光标记物的分支PEG分子产生和连接于抗体分子的示意图。在步骤1中,将反应性基团和荧光标记物连接到分支PEG分子上的NH2基团。在步骤2中,将连接位点添加至抗体分子。在步骤3中,荧光标记的分支PEG分子与抗体分子共价连接。
图19是示出单臂连接物(例如,直链淀粉)和多臂连接物(葡聚糖)中每一个的一个实例的图示。BM代表生物分子,AP代表连接点,意味着荧光标记物连接在那一点。
图20是不同类型的星形聚合物的图示和一些星形聚合物的组分的实例,以及如何制备星形聚合物的实例。图20A是具有核(黑色圆圈)和多个臂(黑色线)的星形聚合物的图示。星星代表与臂共价连接的荧光标记物。一些臂未被荧光标记,表明标记没有完成。图20B是类似的星形聚合物的图示,其中臂具有两种不同类型(例如,聚乙二醇和聚乙烯醇),不同的臂类型由实线和虚线表示。图20C的左侧显示了具有反应性基团(灰色条)的核(黑色半圆)的部分表示,其可用于连接其他化学实体或用作聚合的引发剂。核在中心表示,其具有连接到反应性基团的衔接物(实心黑线)。聚合物臂显示在右侧(黑色虚线),其连接到衔接物,并用荧光分子(星星)标记
图21显示了可用于本发明实践的类型的示例性聚赖氨酸分子。R1和R2基团显示为未标记的。这些基团可用作荧光标记物的连接点和用于与生物分子(例如抗体)的缀合。
图22:与AF647分支PEG构建体缀合的SK3小鼠抗人CD4抗体。SK3小鼠抗人CD4抗体(5.5.mg/mL)用647琥珀酰亚胺酯以相对于抗体10倍摩尔过量的酯(虚线)修饰。用相对于抗体10倍过量的叠氮基-SE标记的SK3在1mg/mL叠氮基-SK3抗体下在25℃下与100μM AF647-HG20K8 PEG-sDIBO点击缀合20小时,用5mM NaN3淬灭,用MilliporeAmiconTMUltra-2 100kDa离心过滤器(点线)纯化缀合物。用相对于抗体20倍过量的叠氮基-SE标记的SK3在3mg/mL叠氮基-SK3抗体下在37℃下与600μM AF647-HG20K8 PEG-sDIBO点击缀合3小时,用5mM NaN3淬灭,用Millipore AmiconTM Ultra-2 100kDa离心过滤器(实线)纯化缀合物。使用7点滴定1μg至0.015μg抗体,用SK3缀合物对96孔板中每孔100万Ficoll分离的PBMC进行染色。使用AttuneTM NxT流式细胞仪进行染色细胞的分析。
图23:与AF647分支PEG构建体缀合的SK3小鼠抗人CD4抗体。SK3小鼠抗人CD4抗体(5.5.mg/mL)用647琥珀酰亚胺酯以相对于抗体10倍摩尔过量的酯修饰(AF)。用相对于抗体20倍过量的叠氮基-SE标记的SK3在3mg/mL叠氮基-SK3抗体下在37℃下与600μM AF647-HG20K8 PEG-sDIBO点击缀合3小时,用5mM NaN3淬灭,用MilliporeAmiconTM Ultra-2 100kDa离心过滤器纯化缀合物(B1)。用相对于抗体10倍过量的叠氮基-SE标记的SK3在1mg/mL叠氮基-SK3抗体下在25℃下与100μM AF647-HG20K8 PEG-sDIBO点击缀合20小时,用5mM NaN3淬灭,用Millipore AmiconTM Ultra-2 100kDa离心过滤器纯化缀合物(B2)。使用7点滴定1μg至0.015μg抗体,用SK3缀合物对96孔板中每孔100万Ficoll分离的PBMC进行染色。使用AttuneTM NxT流式细胞仪进行染色细胞的分析,并与别藻蓝蛋白(APC)(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific),目录号MHCD0405)相比较。
具体实施方式
荧光标记物广泛用于成像,因为它们提供对生物分子(包括蛋白质和核酸)的直接、定量、特异性和灵敏的检测。与基础未修饰染料相比,经磺化和/或PEG修饰的经修饰的荧光标记物提供增加的灵敏度。然而,即使这些经修饰的荧光标记物在某些染料与蛋白质(D/P)比率下也显示出荧光猝灭。
随着标记染料的摩尔过量增加,观察到荧光增加,然而,导致超过最佳染料与蛋白质(D/P)比率的摩尔过量通常导致生物分子的猝灭和/或沉淀,尤其是在荧光成像应用中,抗原/抗体或DNA/RNA相互作用的空间构象可引起静态猝灭。
在一些实施例中,本发明包括在导致荧光减少的标准缀合中用高度标记的缀合物(例如,具有高染料与蛋白质比率(D/P)的生物分子)减少猝灭和/或增加荧光信号的方法。可以对蛋白质、核酸和其他生物分子(例如,寡糖)进行修饰。在一些实施例中,本发明包括含有荧光标记的生物分子的组合物,所述生物分子表现出增加的荧光信号和/或减少的猝灭,其中所述组合物包含生物分子、间隔物和荧光标记物,其中所述间隔物和荧光标记物不直接彼此缀合。
本发明还涉及在每个荧光标记物基础上显示出增强的荧光的组合物,以及制备和使用这种组合物的方法。作为说明,假设将连接到生物分子的单个荧光标记物设定100%荧光发射的基线。进一步假设,当两个荧光标记物连接到同一生物分子时,两个荧光标记物中的每一个显示出平均80%的基线荧光发射。本发明部分涉及用于将平均荧光发射增加到基线的80%以上的组合物和方法。
在某些情况下,本发明的组合物以及本发明方法中使用的组合物可以由一种或多种功能特性定义。这些特性的实例是与标记分子(例如,生物分子)相关的荧光标记物的数量、标记分子上的荧光标记物之间的平均距离(以多种不同方式中的任何一种测量)和/或标记分子上荧光标记物的量子产率。
测量荧光强度的一种方法是通过测量量子产率。荧光系统的量子产率(Φ)实际上是给定荧光团的发射效率,可以通过以下等式确定:
量子产率也可用于测量猝灭效应,如下文实例8中所述。此外,可以用于测量量子产率的仪器,例如Hamamatsu绝对PL量子产率光谱仪(Hamamatsu Corp.,Bridgewater NJ08807,C11347-11 Quantaurus-QY绝对PL量子产率光谱仪)是可商购的。
如实例8和表25中所述,可以将荧光标记分子的量子产率与游离荧光标记物的量子产率进行比较。如果将单个单位的游离荧光标记物在有效无猝灭发生的条件下的量子产率设定为1,那么这可以用作比较连接到标记分子的每个荧光标记物产生的荧光的基准。在许多情况下,本发明的组合物包括用多种荧光标记物标记的荧光标记分子,其中基于每个荧光标记物的荧光发射的平均量为游离荧光标记的荧光发射的至少70%(0.7荧光比率)(例如,约70%至约99%、约70%至约90%、约80%至约99%、约85%至约99%、约87%至约99%、约90%至约99%、约80%至约95%、约85%至约96%等)。
如实例8和表25中所述,荧光强度可通过测量荧光标记分子的总荧光与游离标记物的荧光相比来确定。如果将单个单位的游离荧光标记物在有效无猝灭发生的条件下的荧光设定为1,那么这可以用作比较连接到标记分子的每个荧光标记物产生的荧光的基准。在许多情况下,本发明的组合物包括用多种荧光标记物标记的荧光标记分子,其中基于每个荧光标记物的荧光发射的平均量为游离荧光标记的荧光发射的至少70%(0.7荧光比率)(例如,约70%至约99%、约70%至约90%、约80%至约99%、约85%至约99%、约87%至约99%、约90%至约99%、约80%至约95%、约85%至约96%等)。
如表25所示,可以确定荧光标记分子与游离荧光标记物相比的亮度。亮度正比于量子产率(Φ)、消光系数(ε)和每分子染料数(N)的乘积,如以下等式所给出:
B=Φ×ε×N
因此,游离荧光标记物的亮度与标记分子的亮度之比可用于描述总荧光增强。
例如,表25中的数据设定为去离子水中的基准647。此外,这设定了100%的游离染料量子产率和亮度比为1.0的基准。在样品中,分子AF647-20K8具有游离染料的73%的量子产率,但显示出比游离染料高5.8倍的荧光增强。还显示样品AF647-10K4具有最高的游离染料的百分比量子产率(89%),但相对于游离染料仅具有3.6倍的荧光增强。这些数据表明,这些分子的荧光增强程度可与臂的长度直接相关。数据还表明,当臂长保持恒定并且更多荧光标记的臂被添加到聚合物中时,荧光增强趋于增加。
因此,本发明包括用于将多个荧光标记物连接到单个分子(例如,生物分子)的组合物和方法,使得荧光标记物以增强荧光信号的方式间隔开。这可以通过减少猝灭来完成。增强荧光信号的一种方法是在空间上分离样品中存在的荧光标记物。当多个荧光标记物连接到待检测的相同分子(例如,生物分子)时,这尤其有用。
在一些方面,本发明包括产生与间隔物和荧光标记物缀合的抗体的方法,其中间隔剂用于将间隔物与抗体缀合,并且其中间隔物不与荧光标记物缀合。还涵盖包含间隔物、抗体和荧光标记物的组合物,其中间隔物不与荧光标记物缀合。
在一些实施例中,间隔物可能能够减少与抗体缀合的多个荧光标记物的猝灭。
在一些实施例中,涵盖产生与间隔剂缀合的核酸的方法,其中间隔剂不直接与荧光标记物缀合。这种间隔剂可能能够减少与核酸缀合的荧光标记物的猝灭。
在一些实施例中,本发明包括与荧光标记物和与它们缀合的分子(例如,生物分子)上的点的空间分离相关的组合物和方法。在许多情况下,这将通过将一个或多个荧光标记物连接到间隔物并将间隔物连接到分子(例如,生物分子)来完成。这种组合物和方法的实例显示在图18中。
定义
本说明书和示例性实施例不应视为是限制性的。为了本说明书和所附权利要求的目的,除非另外指出,否则表示数量、百分数或比例的所有的数值,和本说明书和权利要求中使用的其他数值,在所有情况下应理解为被术语“约”修饰,至它们还未如此修饰的程度。因此,除非相反指出,否则在下面说明书和所附权利要求中阐释的数值参数是近似值,因为其可取决于期望寻求获得的特性而改变。至少,并且不尝试将等同原则的应用限于权利要求的范围,每个数值参数应至少从报告的有效数字的值的角度考虑并且应用常规的四舍五入技术。
注意,如在本说明书和所附的权利要求中所使用,单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”和任何词语的任何单数使用,包括复数形式,除非明确和确切地限于一个指示物。如本文所使用,术语“包括”和其语法变型旨在是非限制性的,使得列表中项目的叙述不排除可替换或添加至所列项目的其他类似的项目。
如本文所用,“生物分子”是指可包括在生物系统中的任何分子,包括但不限于合成或天然存在的蛋白质或其片段、糖蛋白、脂蛋白、氨基酸、核苷、核苷酸、核酸、寡核苷酸、DNA、RNA、碳水化合物、糖、脂质、脂肪酸、半抗原、抗体等。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中以一般含义使用,包括任何长度的氨基酸残基的聚合物。本文所用的术语“肽”是指其中单体为氨基酸并通过酰胺键连接在一起的聚合物,或者称为多肽。当氨基酸是α-氨基酸时,可以使用L-光学异构体或D-光学异构体。另外,还包括非天然氨基酸,例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。通常遇到的非基因编码的氨基酸也可用于本发明。用于本发明的所有氨基酸可以是D-或L-异构体。通常使用L-异构体。此外,其他肽模拟物也可用于本发明。对于一般综述,参见Spatola,A.F.,《氨基酸,肽和蛋白质的化学和生物化学(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides andProteins)》,B.Weinstein编,Marcel Dekker,New York,第267页(1983)。
如本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)超家族的蛋白质,其非共价结合某些物质(例如,抗原和免疫原)以形成抗体-抗原复合物,包括但不限于由杂交瘤细胞系、通过免疫接种引发多克隆抗体反应、通过化学合成和用编码抗体的表达载体转化的重组宿主细胞产生的抗体。在人类中,免疫球蛋白抗体被分类为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且据说每类成员具有相同的同种型。人IgA和IgG同种型进一步细分为亚型IgA1和IgA2以及IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。小鼠通常具有与人类相同的同种型,但IgG同种型又细分为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3亚型。因此,应当理解,本文所用的术语“抗体”在其范围内包括(a)免疫球蛋白的各种类别或亚类中的任何一种(例如,来自产生抗体的任何动物的IgA、IgD、IgG、IgM和IgE)和(b)多克隆和单克隆抗体,例如鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。抗体分子具有可以充当抗原决定簇的氨基酸序列区(例如Fc区、κ轻链、λ轻链、铰链区等)。针对选定区域产生的抗体被指定为抗[区域](例如,抗Fc、抗κ轻链、抗λ轻链等)。通常通过用大分子免疫生物体来产生针对抗原的抗体,以启动淋巴细胞活化以表达免疫球蛋白蛋白质。如本文所用,术语抗体还涵盖具有与抗体结合结构域相同或同源的结合结构域的任何多肽或蛋白质,包括但不限于单链Fv分子(scFv),其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接,所述肽接头允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点(Bird等人,《科学(Science)》242:423(1988)和Huston等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879(1988))。这些可以源自天然来源,或者它们可以部分或完全合成产生。
此外,VHH抗体可以使用从抗原刺激的细胞获得的或作为工程化的抗原结合蛋白使用。
如本文所用的术语“抗体片段”是指保留整个抗体的主要选择性结合特征的抗体片段。特定片段是本领域公知的,例如,Fab、Fab′和F(ab′)2,其通过用各种蛋白酶消化来获得并且缺少完整抗体的Fc片段或通过连接完整抗体中重链组分的二硫键的还原性切割获得的所谓“半分子”片段。此类片段还包括由轻链可变区组成的分离片段、由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段以及其中轻和重可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子。结合片段的其他实例包括(i)Fd片段,其由VH和CH1结构域组成;(ii)dAb片段(Ward等人,《自然(Nature)》341:544(1989)),其由VH结构域组成;(iii)分离的CDR区;和(iv)上述单链Fv分子(scFv)。另外,可以使用保留抗原识别特征的重组技术制备任意片段。
可以使用的示例性VHH抗体是单结构域抗体,其是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。此类抗体片段通常具有仅12-25kDa的分子量,因此比许多其他抗体(150-160kDa)小,其由两条重蛋白链和两条轻链组成。
如本文所用,“抗原”是指诱导或能够诱导抗体形成或抗体选择性结合的分子,其包括但不限于生物材料。抗原也指“免疫原”。当相对缺乏与其他存在物质的交叉反应性或干扰时,抗体选择性地结合抗原。
如本文所用的术语“反应性基团”是指能够与另一个化学基团反应以形成共价键,即在合适的反应条件下共价反应的基团,并且通常代表另一种物质的连接点。反应性基团通常包括亲核试剂、亲电子试剂和可光活化基团。示例性反应性基团包括但不限于烯烃、乙炔、醇、酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮(diazo)、重氮(diazonium)、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酸酐、硫酸酯、亚磺酸异腈、脒、酰亚胺、亚氨酸酯、硝酮、羟胺、肟、异羟肟酸、炔烃和叠氮化物。
如本文所用,“间隔物”、“间隔分子”或“间隔剂”是指当与生物分子直接或间接缀合时能够增强从生物分子发射的荧光的化合物(例如,有机化合物)。这被认为是由荧光标记物的荧光猝灭的减少引起的。任何数量的化合物可用作间隔物,示例性化合物包括NHS-乙酸酯和各种形式的聚乙二醇(PEG)。如本文所用,术语“聚乙二醇”或“PEG”是指环氧乙烷的低聚物或聚合物。PEG聚合物链长度可以变化很大,但倾向于具有高达10,000,000g/mol的分子量。PEG也可具有不同的几何形状。例如,分支PEG通常具有从中心核基团发出的三至十个PEG链。星形PEG具有从中心核基团发出的3至100个PEG链。梳状PEG具有通常接枝到聚合物主链上的多个PEG链。大多数PEG包括具有分子量分布的分子(即,它们是多分散的)。尺寸分布可以通过其重均分子量及其数均分子量在统计学上表征,其比率称为多分散指数。可用于实施本发明的示例性PEG化合物包括MS(PEG)4、MS(PEG)8和MS(PEG)12(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技,目录号分别为22341、22509B和22686),以及分支PEG化合物,例如(甲基-PEG12)3-PEG4-NHS酯(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技,目录号22421)。
如本文所用,术语“直接间隔物”是指具有至少一种与其连接的荧光标记物并直接与生物分子结合的分子。直接间隔物可以是(1)单一聚合物或(2)连接到核的多种聚合物。直接间隔物的实例包括单臂聚合物和多臂聚合物。
如本文所用,“聚合物”是由重复亚基(通常至少4个重复亚基)构成的分子。聚合物可以是合成的或天然存在的。聚合物的重复单元不必相同。例如,蛋白质是由不同氨基酸亚基构成的聚合物。此外,聚合物不必是完全线性分子,因此可以类似于葡聚糖分支。
如本文所用,术语“单臂聚合物”是指未分支的分子,其上连接有至少一个荧光标记物并具有未分支结构(参见图19)。可用于本发明实践的单臂聚合物的实例是“线性”多糖(例如直链淀粉)、聚乙二醇、长链碳分子(例如Ahx)和多肽。在一些情况下,未分支/线性多糖由通过α1,4键彼此连接的单体构成。
如本文所用,术语“多臂聚合物”是指分支分子,其上连接有至少一个荧光标记物并具有未分支结构(参见图19)。可用于本发明实践的多臂聚合物的实例是分支多糖(例如,葡聚糖、糖原)、聚乙二醇、分支长链碳分子(例如Ahx)和分支多肽。
如本文所用,术语“缀合分子”或“缀合臂”是指染料通过其与分子(例如,生物分子)连接(例如,共价连接)的接头。缀合分子可以与单个染料分子或多个染料分子(相同的染料或不同的染料)结合。
如本文所用,术语“荧光”是指光学现象,其中分子吸收高能光子并将其作为较低能量(较长波长)光子重新发射,吸收和发射的光子之间的能量差异最终成为分子振动或热量。
如本文所用,术语“荧光标记物”、“荧光染料”、“荧光团”或“荧光部分”是指固有荧光的化合物、化学基团或组合物。荧光团可含有改变荧光团的溶解度、光谱特性或物理特性的取代基。许多荧光团是本领域技术人员已知的,包括但不限于包括荧光素、罗丹明和对甲氨基酚的香豆素、花青、苯并呋喃、喹啉、喹唑啉酮、吲哚、呋喃、苯并唑、硼聚吖吲得辛(borapolyazaindacene)和呫吨,以及在RICHARD P.HAUGLAND,分子探针荧光探针和研究化学品手册(MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES ANDRESEARCHCHEMICALS)(第9版,CD-ROM,2002年9月)中描述的其他荧光团。目前,反应性化学物质如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、马来酰亚胺和酰肼以及点击化学(例如SiteClickTM)用于将荧光标记物缀合到生物分子上。
如本文所用,术语“缀合的”是指分子通过共价或非共价连接直接或间接连接至另一分子。
术语“染料缀合物”是指与另一种载体分子(例如抗体)共价或非共价结合的染料分子,并且在许多情况下,染料是共价结合的。染料缀合物可以通过单个共价键直接结合、交联或通过接头结合,例如一系列稳定的共价键,其中包含1-20个选自由C、N、O、S和P组成的组的非氢原子,将荧光染料共价连接到抗体或另一部分,例如化学反应性基团或生物和非生物组分。缀合物或接头可以涉及受体结合基序,例如生物素/抗生物素蛋白。
如本文所用的术语“近IR染料”或“近IR报告分子”或“NIR染料”或“NIR报告分子”表示激发波长为约580nm至约800nm的染料或报告分子。在许多情况下,NIR染料在约590nm至约860nm的范围内发射。在许多情况下,NIR染料在约680nm至约790nm被激发。在许多情况下,染料包括 660染料、680染料、700染料、750染料和790染料。NIR染料对于体内成像特别有利,因为它们可以选择性地可视化而不会激发活体中存在的内源性物质。一些NIR染料具有大的斯托克斯位移,使得激发和发射波长分开至少20、30、40、50、60、70或80nm。
“固体支撑物”是指具有刚性或半刚性表面的衬底材料。通常,衬底的至少一个表面将基本上是平坦的,尽管可能希望用例如阱、凸起区域、蚀刻沟槽或其他这样的拓扑结构物理地分离某些区域。固体支撑材料还包括球体(包括微球体)、棒(例如光纤)和制造的不规则形状的物品。
固体支撑材料包括用作化学和生物分子合成和分析的亲和基质或支撑物的任何材料,例如但不限于:聚(偏二氟乙烯)(PVDF)、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、尼龙、玻璃、葡聚糖、甲壳素、沙子、浮石、聚四氟乙烯、琼脂糖、多糖、树枝状大分子、巴克球、聚丙烯酰胺、硅藻土-聚丙烯酰胺非共价复合物、聚苯乙烯-聚丙烯酰胺共价复合物、聚苯乙烯-PEG[聚(乙二醇)]复合物、硅、橡胶和用作固相合成、亲和分离和纯化、杂交反应、免疫分析和其他此类应用的支撑物的其他材料。固体支持物可以是颗粒状的,或者可以是连续表面的形式,例如微量滴定盘或孔、载玻片、硅芯片、硝化纤维素片、尼龙网或其他这样的材料。
“试剂盒”是指一组包装好的相关组分,通常是一种或多种化合物或组合物。
可检测的生物分子
在一些实施例中,本文公开了用多种荧光标记物可检测地标记的生物分子,所述荧光标记物还包含间隔剂。
a.间隔物
间隔物可以是当与生物分子缀合时能够增强荧光发射的任何分子,所述荧光发射是由独立缀合到生物分子的多个荧光标记物的激发产生的。据信这是由于荧光标记的荧光猝灭的减少。
在一些实施例中,间隔物包含乙酰基(-C(O)CH3)。在一些实施例中,间隔物是乙酸酯分子。在一些实施例中,乙酸酯分子是磺基-NHS-乙酸酯。
在一些实施例中,间隔剂包含聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中,间隔剂包含(PEG)n,其中n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施例中,间隔剂包含MS-(PEG)n。
在一些实施例中,间隔物选自烷酰基、烯酰基和炔酰基(-C(O)CnHm,其中n为1至20个原子,m>n,碳原子可通过单键、双键和/或三键彼此连接,并且烷基、烯基和/或炔基可以进一步被取代。在一些实施例中,特定取代包括聚(乙烯)二醇部分,例如-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR,其中x为1至20,y为1至6,并且R为H或C1-6烷基。在一些实施例中,特定取代包括铵(-NH3 +);季铵((-NR3 +)基团,其中R是C1-6烷基;或鏻基团(-PQ3 +),其中Q是芳基、取代的芳基或C1-6烷基。
在一些实施例中,间隔物选自烷基、烯基和炔基(-CnHm,其中n为1至20个原子,m>n,碳原子可通过单键、双键和/或三键彼此连接,并且烷基、烯基和/或炔基可以进一步被取代。在一些实施例中,特定取代包括带负电荷的磺酸酯基(-OSO3-)、羧酸酯基(-CO2-)、磷酸酯基(-OPO3-)和/或膦酸酯基(-PO3-)。在一些实施例中,其他取代包括聚(乙烯)二醇部分,例如-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR,其中x是1至20,y是1-6,并且R是H或C1-6烷基。在一些实施例中,其他特定取代包括铵基(-NH3 +);季铵基((-NR3 +),其中R是C1-6烷基;或鏻基(-PQ3 +)’其中Q为芳基、取代的芳基或C1-6烷基。
在一些实施例中,间隔物是带正电的。在一些实施例中,间隔剂包含甜菜碱(即三甲基甘氨酸)。
在一些实施例中,间隔剂是带负电的。
b.荧光标记物
本文所述的荧光染料起到报告分子的作用,通过与蛋白质上的官能团(包括但不限于胺基或硫醇基)缀合而直接或间接地向样品赋予可检测信号。这使得检测样品中总蛋白质的能力通常与检测样品总蛋白质的子集相结合。在这种情况下,总蛋白质标记物可检测的区别于标记样品中总蛋白质子集的染料。
在可检测反应是荧光反应的情况下,其通常是荧光的变化,例如强度、激发或发射波长、荧光分布、荧光寿命、荧光偏振或其组合的变化。
荧光染料可以是本领域技术人员已知的任何萤光团。通常,染料含有一个或多个芳族或杂芳族环,其任选被各种取代基取代一次或多次,所述取代基包括但不限于卤素、硝基、磺基、氰基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、芳基烷基、酰基、芳基或杂芳基环系、苯并或通常存在于本领域已知的发色团或荧光团上的其他取代基。
如本文所述的可适用于总蛋白质标记的多种荧光团是本领域已知的(RICHARDP.HAUGLAND,分子探针荧光探针和研究产品手册(2002))。在本文所述的方法和组合物中使用的荧光染料是表现出最大吸收超过280nm的任何化学部分。这些化学部分包括但不限于芘、磺化芘、磺化香豆素、磺化羰花青、磺化呫吨、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚、异吲哚、吲嗪、苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑(NBD)、羰花青、羰基苯乙烯、卟啉、水杨酸盐、邻氨基苯甲酸盐、薁、苝、吡啶、喹啉、异喹啉、色烯、硼聚吖吲得辛、呫吨、荧光素、玫瑰精、罗丹明、罗丹明、苯并-或二苯并荧光素、半萘并荧光素、萘并荧光素、白曼(bimane)、噁嗪或苯并噁嗪、卡巴嗪、苯嵌萘酮、香豆素、苯并呋喃、苯并苯嵌萘酮)及其衍生物。如本文所用,噁嗪包括试卤灵(resorufin)、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪和它们的苯并取代的类似物。
在一个方面,荧光染料含有一个或多个芳族或杂芳族环,其任选被各种取代基取代一次或多次,所述取代基包括但不限于卤素、硝基、磺基、氰基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、芳基烷基、酰基、芳基或杂芳基环系、苯并或通常存在于本领域已知的发色团或荧光团上的其他取代基。在一个方面,荧光团是呫吨,其包含一个或多个久洛尼定(julolidine)环。
在一个示例性实施例中,染料独立地被选自由以下组成的组的取代基取代:氢、卤素、氨基、取代的氨基、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、磺基、反应性基团、固体支撑物和载体分子。在另一个实施例中,本发明的呫吨染料包含在呫吨中心环的碳原子上被通常在基于呫吨的染料中发现的取代基如苯基和取代的苯基部分取代和未取代的化合物。在许多情况下,染料是罗丹明、荧光素、硼聚吖吲得辛、吲哚及其衍生物。
用于将总蛋白质标记物或表达标签标记物连接到待缀合蛋白质上的反应性基团的选择通常取决于待缀合物质上的反应性基团或官能团以及所需的共价键的类型或长度。通常存在于有机或无机物质(生物分子或非生物分子)上的官能团类型包括但不限于胺、酰胺、硫醇、醇、酚、醛、酮、磷酸酯、咪唑、肼、羟胺、二取代的胺、卤化物、环氧化物、甲硅烷基卤化物,羧酸酯、磺酸酯、嘌呤、嘧啶、羧酸、烯烃键或这些基团的组合。在蛋白质中可以存在多种位点,包括但不限于胺、硫醇、醇和酚。
可用于本文所述的蛋白质标记方法的胺反应性荧光染料包括但不限于350、405、430、488、 500、514、532、546、555、568、594、610-X、633、647、660、680、700、750、790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、、二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、 488、514、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、和7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE)。
在一些实施例中,与连接到本文所述蛋白质标记方法中使用的蛋白质的标签结合的荧光试剂/染料是双砷荧光团,包括荧光素的双砷衍生物,例如FlAsH-EDT2(4′-5′-双(1,3,2-砷戍环-2-基)荧光素-(2,2-乙二硫醇)2)(LumioTM Green,加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司(Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA))或试卤灵的双砷衍生物,例如ReAsh-EDT2(LumioTM Red,加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司),或可实际上是氧化的衍生物,诸如ChoXAsH-EDT2或HoXAsH-EDT2。此外,双砷荧光团可以是其他已知荧光团的双砷衍生物,包括但不限于本文所述的系列,例如350、430、488、532、546、568、594、663和660,可从分子探针公司(Molecular Probes)(Eugene,Oregon)商购获得。
在一些实施例中,双砷荧光团可以至少约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、50μM、100μM或更高的浓度存在,并且浓度不超过约500μM、400μM、300μM、200μM、100μM、90μM、80μM、70μM、60μM、50μM、40μM、30μM、20μM、15μM、10μM、5μM、4μM、3μM、2μM或1μM。
在一些实施例中,与这种荧光染料结合的蛋白质连接的标签是四半胱氨酸肽基序cys-cys-Xn-cys-cys(SEQ ID NO:1),其中每个X是任何天然氨基酸、非天然氨基酸或其组合,并且n是2-100的整数。在某些实施例中,n是2-90的整数,而在其他实施例中,n是2-80的整数。在某些实施例中,n是2-70的整数,而在其他实施例中,n是2-60的整数。在某些实施例中,n是2-50的整数,而在其他实施例中,n是2-40的整数。在某些实施例中,n是2-30的整数,而在其他实施例中,n是2-20的整数。在某些实施例中,n是2-10的整数,而在其他实施例中,n是2-5的整数。天然氨基酸(如果这些基序包括)不限于丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫胺酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在某些实施例中,四半胱氨酸标签具有序列CCPGCC(SEQ ID NO:2)。在其他实施例中,使用含有四半胱氨酸基序的12个氨基酸的肽,包括但不限于氨基酸序列AGGCCPGCCGGG(SEQ ID NO:3)。此外,蛋白质可以用单个四半胱氨酸标签标记,或者蛋白质可以用多个四半胱氨酸标签标记,包括但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个四半胱氨酸标签。这些标签可以在蛋白质的一级氨基酸序列内彼此分开,或者作为多联体直接串联多聚化。
在某些实施例中,四半胱氨酸肽具有序列cys-cys-Xn-cys-X-cys-X(SEQ ID NO:1),其中每个X是任何天然氨基酸、非天然氨基酸或其组合,并且n是2-100的整数。在某些实施例中,n是2-90的整数,而在其他实施例中,n是2-80的整数。在某些实施例中,n是2-70的整数,而在其他实施例中,n是2-60的整数。在某些实施例中,n是2-50的整数,而在其他实施例中,n是2-40的整数。在某些实施例中,n是2-30的整数,而在其他实施例中,n是2-20的整数。在某些实施例中,n是2-10的整数,而在其他实施例中,n是2-5的整数。天然氨基酸(如果这些基序包括)不限于丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫胺酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在某些实施例中,四半胱氨酸标签具有序列CCGGKGNGGCGC(SEQID NO:4)。
可以在蛋白质序列的N末端、C末端或框内将四半胱氨酸肽标签重组融合至所需标记的蛋白质;用于产生四半胱氨酸融合的重组蛋白的表达载体可以使用本领域技术人员已知的技术容易地构建。在某些实施例中,四半胱氨酸标记的蛋白质在宿主细胞中重组表达,包括但不限于细菌宿主细胞、真菌宿主细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。此类细菌宿主细胞包括但不限于任何属的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌,仅举例来说,包括埃希氏菌属(Escherichia sp.)(例如,大肠杆菌)、克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、志贺杆菌属(Shigella sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、伊文氏杆菌属(Erwinia sp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(例如,蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium))、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)(例如,铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和丁香假单胞菌(P.syringae))和沙门氏菌属(Salmonella sp.)(例如,伤寒沙门氏菌(S.typhi)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))。适用于本发明的合适的细菌菌株和血清型可包括大肠杆菌血清型K、B、C和W。典型的细菌宿主是大肠杆菌菌株K-12。仅举例来说,真菌宿主细胞包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞,而仅举例来说,哺乳动物细胞包括人细胞。在此类实施例中,含有感兴趣的蛋白质的蛋白质样品是宿主细胞的裂解物,其可以在使用本文所述的方法标记和分析之前未纯化、部分纯化或基本上纯化。
在其他实施例中,四半胱氨酸标记的蛋白质在体外表达,其中含有感兴趣的蛋白质的蛋白质样品是其中进行翻译(和任选地,转录)的无细胞提取物,或其部分纯化或纯化的部分。在提取物允许在单一无细胞提取物中偶联转录和翻译的实施例中,例如基于大肠杆菌的ExpresswayTM或ExpresswayTM Plus系统(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司),样品是通常发生转录和翻译的无细胞提取物,或其一部分。
或者,技术(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司)是一种通用克隆技术,可用于在大肠杆菌中表达感兴趣的基因。
使用本文所述的双砷染料标记的蛋白质可以是具有四半胱氨酸基序的任何蛋白质。四半胱氨酸标签融合或缀合的蛋白质可以是任何需要标记的蛋白质,其为天然存在的或非天然存在的。天然存在的蛋白质可以具有已知的生物学功能或没有,并且可以已知从基因组序列表达或仅预测。如果天然存在,蛋白质可以是完整蛋白质或仅是其片段。因此,四半胱氨酸标记的蛋白质可以是动物蛋白质,例如人蛋白质或非人哺乳动物蛋白质;真菌蛋白质;细菌蛋白质,包括真细菌和古细菌蛋白质;植物蛋白质;昆虫蛋白质或病毒蛋白质。
除了四半胱氨酸标签之外,其他蛋白质序列可以有用地重组附加到需要标记的蛋白质上。在这些另外的蛋白质序列中有接头和/或短标签;有用的表位标签,例如FLAG标签,或myc标签;或用于纯化的其他序列,例如多组氨酸(例如,6xhis)标签。或者,可以使用领域常规缀合化学法将四半胱氨酸标签化学缀合至待标记的蛋白质。
在一些实施例中,荧光标记带正电荷。在一些实施例中,荧光标记带负电荷。
在一些实施例中,荧光标记的激发波长在350和850nm之间。在一些实施例中,荧光标记的激发波长是远红外的。在一些实施例中,荧光标记的激发波长是近红外的。在一些实施例中,荧光标记的激发波长是紫外(UV)的。
在一些实施例中,荧光标记物包含fluor。在一些实施例中,fluor选自DyLightTM 350、DyLightTM 405、DyLightTM 488、DyLightTM 550、DyLightTM 594、DyLightTM 633、DyLightTM 650、DyLightTM 680、DyLightTM 755和DyLightTM800。在一些实施例中,DyLightTM fluor与PEG分子(例如,2X PEG、4XPEG、8XPEG或12X PEG)缀合。
在一些实施例中,荧光标记物包含在一些实施例中, 选自350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、 647、660、680、700、750和790。
在一些实施例中,荧光标记物包含选自呫吨;香豆素;花青;芘;噁嗪;硼聚吖吲得辛;苯并吡喃鎓;和碳派若宁(carbopyronine)的部分。
在一些实施例中,荧光标记物包含荧光素(例如,Cy2或FITC)。在一些实施例中,荧光标记物包含罗丹明(例如,TRITC或Cy3)。在一些实施例中,荧光标记物包含MCA、香豆素、Rhodamine Red、Texas Red、Cascade Blue、Cy5、Cy5.5、IR680、IR800和Cy7。
在一些实施例中,荧光标记物是修饰的荧光标记物(例如,荧光标记物已经磺化或与PEG缀合)。
在一些实施例中,荧光标记物是荧光蛋白。在一些实施例中,荧光蛋白是藻胆蛋白。可用于本发明的藻胆蛋白的实例是别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白B、B-藻红蛋白、藻红蓝蛋白和b-藻红蛋白。已经研究了藻胆蛋白的结构,并且已知它们的荧光光谱特性。参见A.N.Glazer,“具有胆汁三烯修复基团的光合辅助蛋白(PhotosyntheticAccessory Proteins with Bilin Prosthetic Groups),”《植物生物化学(Biochemistryof Plants)》,第8卷,M.D.Hatch和N.K.Boardman编,学术出版社(Academic Press),第51-96页(1981)和A.N.Glazer,“光合辅助色素系统的结构与进化,特别参考藻胆蛋白(Structure and Evolution of Photosynthetic Accessory Pigment Systems withSpecial Reference to Phycobiliproteins),”《蛋白质结构和功能的演变(TheEvolution of Protein Structure and Function)》,B.S.Sigman和M.A.Brazier编,学术出版社,第221-244页(1980)。在一些实施例中,荧光蛋白具有至少约450nm,通常至少约500nm的吸收最大值,具有至少15nm,通常至少约25nm的斯托克斯位移,并且具有至少约500nm,通常至少约550nm的荧光发射最大值。
在一些实施例中,荧光标记物是二吡咯亚甲基二氟化硼染料,如US 2014/0349,893中所公开,其通过引用整体并入本文。
本文所述的蛋白质标记方法中使用的胺反应性荧光试剂包括但不限于芳酰基-2-喹啉-甲醛类试剂。此类试剂已在美国专利号5,459,272和美国专利号5,631,374中描述,所述专利各自通过引用整体并入本文。在一些实施例中,使用的芳酰基-2-喹啉-甲醛试剂是3-(4-羧基苯甲酰基)喹啉-2-甲醛或3-(2-呋喃甲酰基)喹啉-2-甲醛)。在某些实施例中,胺反应性荧光试剂是3-(2-呋喃甲酰基)喹啉-2-甲醛),而在其他实施例中,胺反应性荧光试剂是3-(4-羧基苯甲酰基)-喹啉-2-甲醛。
c.生物分子
可用于本文公开的组合物和方法的生物分子包括可用于分子生物学应用的任何生物分子。
在一些实施例中,生物分子是抗体(例如,一抗或二抗)。在一些实施例中,生物分子是抗体片段。用于本发明实践的抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体或工程化抗体,并且可以来自任何来源(例如,鲨鱼、鸡或哺乳动物,例如美洲驼、人类小鼠、兔、山羊、大鼠等)。此外,可以使用人源化抗体。
在一些实施例中,抗体是嵌合的。
在一些实施例中,生物分子是蛋白质或多肽。在一些实施例中,生物分子是重组多肽。
在一些实施例中,生物分子是核酸分子。在一些实施例中,核酸分子是寡核苷酸(例如,长度为15至50个核苷酸)。在一些实施例中,核酸分子长度大于50个核苷酸,长度大于100个核苷酸,长度大于500个核苷酸,长度大于1kb,长度大于2kb,或长度大于5kb。
d.荧光染料与生物分子的缀合
在选择具有所需光谱特征的合适染料后,通常在激发波长为至少580nm的情况下,可以使用本领域熟知的方法将染料与靶向载体分子缀合(Haugland,《分子探针手册(MOLECULAR PROBES HANDBOOK)》,见上文,(2002))。在许多情况下,缀合形成共价键包括简单地将本发明的反应性化合物混合在合适的溶剂中,其中待缀合的反应性化合物和间隔分子都是可溶的。在许多情况下,反应在室温或低于室温下没有添加试剂的情况下自发进行。对于那些被光活化的反应性化合物,通过照射反应混合物以活化反应性化合物来促进缀合。在许多情况下,可以在非质子溶剂如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮、乙酸乙酯、甲苯或氯仿中进行水不溶性物质的化学改性,从而可以制备所需的化合物-缀合物。通过使用本发明的反应性化合物使其更易溶于有机溶剂,可以容易地实现水溶性材料的类似改性。
生物分子(例如,蛋白质)缀合物的制备通常包括首先在室温或低于室温下将生物分子溶解在约1-10mg/mL的水性缓冲液中。例如,碳酸氢盐缓冲液(pH约8.3)、碳酸盐和硼酸盐缓冲液(pH约9)特别适合与琥珀酰亚胺酯反应,磷酸盐缓冲液(pH约7.2-8)适合与巯基反应性官能团反应,碳酸盐或硼酸盐缓冲液(pH约9)适合与异硫氰酸酯和二氯三嗪反应。然后将合适的反应性化合物溶解在非羟基溶剂(通常为DMSO或DMF)中,其量足以在加入到待缀合的生物分子的溶液中时产生合适的缀合度。用于任何生物分子(例如蛋白质)或其他组分的适当量的化合物可方便地通过实验预先确定,其中将可变量的化合物加入到生物分子中,将缀合物进行色谱纯化以分离未缀合的化合物,并且化合物-生物分子缀合物是在其所需的应用中进行测试。
任何数量的缓冲液可用于缀合反应,也可用于本文所述的其他反应。出于说明的目的使用实例1和5,磷酸盐缓冲盐水和硼酸盐缓冲液可以用于缀合反应中。还认为可以使用pH 9.5的碳酸盐缓冲液。按照这些方法,据信较高的pH缀合需要较低摩尔过量的染料和间隔分子。因此,本发明包括用于进行缀合反应的组合物和方法,其中pH为约4.0至约10.0(例如,约4.0至约10.0、约5.0至约10.0、约6.0至约10.0、约7.0至约10.0、约7.5至约10.0、约8.0至约10.0等)。缀合反应可以在硼酸盐缓冲液50mM,pH 8.5中用荧光染料,或每种荧光染料和选自NHS-乙酸酯、NHS-MS(PEG)4、NHS-MS(PEG)8或NHS-MS(PEG)12的间隔物的混合物在各种摩尔过量下进行。标记反应可以在室温(RT)下培育约1小时。NHS活化的染料和NHS活化的间隔剂可以在添加到抗体之前组合,使得两个反应同时进行,允许染料取代和间隔物的随机间隔。
可用于本发明实践的缓冲剂包括2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、磷酸盐、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、硼酸盐、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和碳酸盐缓冲剂作为实例。
本文所述的生物分子(例如蛋白质)标记方法中使用的荧光试剂的浓度范围为50nM至100mM(例如,约50nM至约25mM、约50nM至约10mM、约50nM至约5mM、约100nM至约10mM、约100nM至约5mM、约200nM至约5mM、约50nM至约100μM、约1μM至约100μM等)。在某些实施例中,通过稀释浓度范围为100nM至200mM(例如,约10μM至约500μM、约1μM至约100μM、约100μM至约200μM等)的荧光试剂的储备溶液获得此类浓度。在某些实施例中,储备溶液的浓度为100mM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为50mM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为20mM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为10mM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为1mM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为500μM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为10μM。
在一些实施方案中,本文所述的生物分子(例如蛋白质)标记方法中使用的胺反应性荧光染料的浓度范围为50nM至约100mM(例如,约50nM至约50mM、约50mM至约25mM、约50nM至约10mM、约50nM至约5mM、约50nM至约5μM、约50nM至100μM、约100nM至约5mM等)。在某些实施例中,通过稀释浓度范围为100nM至200mM的荧光试剂的储备溶液获得此类浓度。在某些实施例中,储备溶液的浓度为100mM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为50mM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为20mM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为10mM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为1mM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为500μM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为10μM至500μM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为1μM至100μM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为10μM。在某些实施例中,储备溶液的浓度为100μM至200μM。
在一些实施例中,使用本文所述方法标记的蛋白质或蛋白质片段(例如,抗体片段)的浓度范围为0.01mg/mL至200mg/mL(例如,约0.1mg/mL至100mg/mL、约0.1mg/mL至约50mg/mL、约0.1mg/mL至约10mg/mL、约0.2mg/mL至约100mg/mL、约0.2mg/mL至约50mg/mL、约0.2mg/mL至约10mg/mL、约0.3mg/mL至10mg/L、约0.4mg/mL至约10mg/mL、约0.5mg/mL至约10mg/mL等)。
在一些情况下,可以在生物分子上的每个位置处连接一个以上的染料分子。将一种以上染料分子连接在生物分子上的单个位置的一种方式是通过使用与一种以上染料分子结合的缀合分子。然后将这些缀合分子与生物分子连接并使其携带多个染料分子。例如,聚合物树枝状大分子,例如美国专利公开2012/0256102中所述的那些,可以使用与单个聚合物主链或核(在其中称为“树枝状大分子”)缀合的多个荧光染料分子用于这些染料分子与生物分子的附接。这些树枝状大分子可具有规则或不规则的分支聚合物网络结构,其允许以组合方式化学连接多种染料分子、多种颜色染料和/或多种官能团。
可以使用的缀合分子的其他实例包括许多用作间隔物的相同分子。因此,在一些情况下,间隔分子和缀合分子将具有相同的结构,不同之处在于缀合分子具有与其结合的染料分子。按照这些方法,可以使用各种形式的PEG分子作为缀合分子。因此,间隔分子可含有染料分子(例如,荧光标记)(参见图18)。
因此,本发明考虑使用缀合分子,每个缀合分子平均具有约2至约50个(例如,约2至约45个、约2至约40个、约2至约35个、约2至约30个、约2至约20个、约5至约45个、约10至约45个等)相关的染料分子。在许多情况下,与缀合分子结合的染料分子的平均数量的标准偏差将小于10%、15%和/或20%。
标记程度可以是标记的生物分子的量度。标记程度可以如下计算。首先,使用例如下式计算标记的生物分子的摩尔浓度:
ε=蛋白质摩尔消光系数(例如,IgG的摩尔消光系数为~210,000M-1cm-1)
Amax=在染料分子的波长最大值(λmax)下测量的染料溶液的吸光度(A)
CF=校正因子;调整染料引起的280nm吸光度(见表8)
稀释因子=蛋白质:染料样品稀释用于吸光度测量的程度(如果有的话)
然后使用以下公式计算标记程度:
ε′=荧光染料的摩尔消光系数
在本发明的一些实施例中,对于标记程度(DOL)低于没有间隔物的生物分子的包含间隔物的生物分子观察到增强的荧光。例如,假设存在已用分别具有和不具有间隔物的荧光染料标记的抗体。在相同的DOL基础上,用染料标记的抗体也具有与其结合的间隔物,其荧光增强可以在1.5和3.5倍之间,其中1对两种抗体呈现相同水平的荧光。关键是基于每个染料分子的荧光信号量对于与染料和间隔物结合的生物分子而言增加。
在向组分溶液中加入反应性化合物后,将混合物培育合适的时间(通常在室温下约1小时至冰上数小时),通过凝胶过滤、透析、HPLC、吸附在离子交换或疏水聚合物上或其他合适的方式去除过量的化合物。化合物-缀合物以溶液形式使用或冻干。以这种方式,可以由抗体、抗体片段和其他靶向载体分子制备合适的缀合物。
本文所述方法中使用的培育温度可以是室温、环境温度或高于室温的温度,例如,仅举例来说,至少约26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃,甚至高达90℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。在本文描述的方法中使用的第一培育温度和第二培育温度可以相同或不同。在一些实施例中,第一培育温度为20℃至80℃、25℃至30℃和/或在环境温度或室温下。在一些实施例中,第二培育温度为20℃至80℃、65℃至75℃和/或约70℃。在其他实施例中,第二培育温度为环境温度或室温。
本文所述方法中使用的培育时间包括但不限于至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、至少1小时或本文的任何范围。在本文描述的方法中使用的第一培育时间和第二培育时间可以相同或不同。在一个实施例中,第一培育时间为0至60分钟、5至10分钟和/或在室温下5至10分钟。在一些实施例中,第二培育时间为0至20分钟和/或约10分钟。在特定情况下,第二培育时间为在约70℃下约10分钟。在其他实施例中,第一培育时间为在25℃下1至3小时,第二培育时间为在25℃下过夜,第三培育时间为在37℃下2至3小时。
包括生物聚合物和其他较高分子量聚合物的聚合物的缀合物通常通过本领域公认的方式制备(例如,Brinkley等人,《生物缀合化学(Bioconjugate Chem.)》,3:2(1992))。在这些实施例中,可以获得单一类型的反应性位点,如多糖的典型情况,或者可以获得多种类型的反应性位点(例如,胺、硫醇、醇、酚),这是蛋白质的典型情况。通过选择合适的反应性染料可以最好地获得标记的选择性。例如,用硫醇选择性试剂如卤代乙酰胺或马来酰亚胺修饰硫醇,或用胺反应性试剂如活化酯、酰基叠氮化物、异硫氰酸酯或3,5-二氯-2,4,6-三嗪修饰胺。通过仔细控制反应条件也可以获得部分选择性。
当用化合物修饰聚合物时,相对于预期的化合物取代程度,通常使用过量的化合物。通常通过透析、色谱或沉淀去除任何残留的未反应的化合物或化合物水解产物。残留的未缀合染料的存在可以通过薄层色谱法使用溶剂检测,所述溶剂将染料从其缀合物洗脱。在所有情况下,通常情况是试剂保持尽可能浓缩以获得足够的缀合速率。
在本文所述方法的某些实施例中,可以标记对照蛋白质,以监测标记的有效性,或者在平行反应中,或者如果易于从希望标记的蛋白质中拆分,则通过包含在相同的反应中。
在本文所述方法的某些实施例中,标记样品的蛋白质可以有效地与一系列荧光分子量标准物平行拆分。有用的是,标准物与至少一个用于标记蛋白质的荧光团在光谱上匹配。这种光谱匹配可以例如通过使用与用于标记蛋白质样品的相同的双砷荧光团平行标记的四半胱氨酸标记的蛋白质标准物,或通过使用具有与双砷荧光团或用于标记样品蛋白质的其他荧光团光谱匹配的荧光部分的标准物来实现。在本发明的实践中有用的标准物的实例包括BenchmarkTM家族的蛋白质标准品(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司)和Markl2TM未染色标准物(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司)。
本文所述的方法和组合物还可用于定量样品中存在的荧光标记的蛋白质的量。在某些实施例中,本文所述的方法还包括定量来自双砷荧光团的荧光量。在某些实施例中,本文所述的方法还包括定量来自胺反应性荧光染料的荧光量。在某些实施例中,本文所述的方法还包括定量来自胺反应性荧光试剂的荧光部分的荧光量。可以在不拆分蛋白质样品中存在的蛋白质的情况下或在蛋白质已经部分或完全拆分后进行定量,例如通过电泳,例如PAGE、2D-PAGE,或IEF或色谱法或其组合。
e.间隔分子与生物分子的缀合
在一些实施例中,使用本文实例中描述的NHS-酯化学物质将间隔分子与生物分子缀合,也可以将其他化学物质如马来酰亚胺、吡啶二硫化物和酰肼,以及涉及叠氮化物/炔烃的SiteClickTM技术用于这种缀合策略。
在一些实施例中,间隔分子与蛋白质(例如抗体)上存在的初级赖氨酸侧链上的生物分子(例如抗体)缀合。
在一些实施例中,使用本文描述的方法标记的蛋白质、蛋白质片段或其他生物分子的浓度为约0.01mg/mL至约200mg/mL(例如,约0.1mg/mL至约100mg/mL、约0.1mg/mL至约50mg/mL、约0.1mg/mL至约10mg/mL、约0.2mg/mL至约100mg/mL、约0.2mg/mL至约50mg/mL、约0.2mg/mL至约10mg/mL、约0.3mg/mL至约10mg/mL、约0.4mg/mL至约10mg/mL、约0.5mg/mL至约10mg/mL等)。
在一些实施例中,荧光标记与抗体的染料与蛋白质的比率为1至50。在一些实施例中,荧光标记与抗体的染料与蛋白质的比率为5至30。在一些实施例中,荧光标记与抗体的染料与蛋白质的比率为1至20。
在一些实施例中,间隔物与蛋白质的比率为1至50。在一些实施例中,间隔剂与蛋白质的比率为5至30。在一些实施例中,间隔剂与蛋白质的比率为1至20。
在一些实施例中,间隔剂以相对于多个荧光标记物0.1至25倍、1至15倍或2.5至10倍摩尔过量的量加入。在一些实施例中,间隔剂以相对于多个荧光标记物2.5倍的量摩尔过量的。在一些实施例中,间隔剂以相对于多个荧光标记物5倍的量摩尔过量的。在一些实施例中,间隔剂以相对于多个荧光标记物7.5倍的量摩尔过量的。在一些实施例中,间隔剂以相对于多个荧光标记物10倍的量摩尔过量的。
在一些实施例中,间隔剂与核酸分子缀合。本领域描述了用于将部分(例如,荧光标记)缀合至核酸的方案(参见例如,Rombouts等人,《生物缀合化学》,27:280-207(2016))。用于标记核酸分子的一种方法是通过使用ARESTM 488DNA标记试剂盒(赛默飞世尔,目录号A21665)。胺修饰的核苷酸也可用于实现核酸分子标记。例如,5-氨基己基丙烯酰胺基-dUTP(aha-dUTP)和5-氨基己基丙烯酰胺基-dCTP(aha-dCTP)可用于通过常规酶促掺入方法如逆转录、切口平移、随机引物标记或PCR产生胺修饰的DNA。然后可以用任何胺反应性染料或半抗原标记胺修饰的DNA。这种两步技术始终如一地产生均匀且高度的DNA标记,这是其他方法难以获得的。
用于实现具有空间分离的荧光标记的高DOL的一种方法在图18中示出。图18显示荧光标记的分支PEG分子的制备和所得PEG分子(直接间隔物)与抗体的连接,其中PEG分子通过Click-iTTM反应与抗体共价连接(参见实例7)。
图18中所示的PEG分子各自与七个荧光标记物共价连接。此外,荧光标记物可以这样的方式连接到各个PEG分子,使得标记物相对于标记分子具有特定的“刷子”长度。“刷子长度”是指将荧光标记物连接到标记分子的化学基团的伸展长度。作为一个实例,假设PEG分子中的平均单体长度为约3.5埃,当在图18中n=1时,则荧光标记物的刷子长度范围为约5埃至约10埃。在许多情况下,图18中的n不会是1。此外,PEG分子的大小通常不同,并且基于平均分子量进行描述。因此,使用图18中所示的PEG分子,为了说明的目的,平均重量为10,000的PEG分子群具有约30的n。此外,平均重量为40,000的PEG分子群将具有约120的n。鉴于将该分子与标记分子连接的分支PEG分子的臂和另一个臂都具有重复区域的事实,刷子长度可以在约15埃至约800埃的范围内(例如,约25至约800、约150至约800、约450至约800、约600至约800、约65至约800、约25至约700、约40至约700、约28至约600、约28至约500、约70至约700等)。因此,本发明包括用于产生和使用与至少一种荧光标记物共价连接的分子的组合物和方法,其中荧光标记物具有约22埃至约800埃的刷子长度。
作为替代方案,本发明的组合物可以通过分子与它们所连接的荧光标记物之间的共价键的数量来描述。再次使用图18中所示的分支PEG分子,为了说明的目的,介入的共价键的数量将在约24和约32个之间,这取决于荧光标记物与分支PEG分子连接的位置。本发明包括用于产生和使用与至少一种荧光标记物共价连接的分子的组合物和方法,其中荧光标记物通过约16至约800个(例如,约16至约700个、约32至约800个、约60至约800个、约100至约800个、约150至约800个、约200至约800个、约250至约800个、约250至约700个、约250至约650个、约250至约600个、约350至约800个等)介入的共价键与分子连接。
本发明还部分涉及间隔多个荧光标记物,所述多个荧光标记物连接于各个标记分子上的相同位置。类似于上面关于从标记分子中分离荧光标记所述的内容,连接在各个标记分子上相同位置的多个荧光标记物可以彼此分开约15埃至约800埃的距离(包括上述范围)和/或约16至约800个(包括上述范围)介入的共价键。
如本文所述,本发明的方面涉及荧光标记的间隔。表9显示了一系列分支PEG分子的估计特征。应当理解,这些PEG分子以及其他分子在不同时间以多种形式存在。例如,分支PEG分子的臂可以完全伸展(刷子)或完全盘绕(蘑菇),以及有效地在它们之间的所有构象。此外,在任何一个时间,每个臂可以独立于其他臂而处于不同的伸展状态或盘绕状态。因此,在表9中,术语“刷子”是指完全伸展的PEG臂,术语“蘑菇”是指完全盘绕的PEG臂。蘑菇状态以80埃的非常大的Flory半径(相邻PEG臂之间的距离)为模型以获得最小数量。
假设所有荧光团彼此等距,表9中的F-F距离是不同臂末端上的两个荧光团之间的距离。最大距离是臂长的两倍。此外,最近邻值假设4个臂的四面体排列和8个臂的球形/立方体排列。当然,在任何一个时间点的F-F距离的实际值通常在刷子距离和蘑菇距离之间的某处。
葡聚糖是另一种用于将荧光标记物与分子连接的合适材料。葡聚糖是亲水性多糖,其特征在于其中等至高分子量、良好的水溶性和低毒性。由于其不常见的聚(α-D-1,6-葡萄糖)键,葡聚糖倾向于具有生物惰性。这些键使它们对大多数内源性细胞糖苷酶的切割具有抗性。它们通常也具有低免疫原性并且通常是分支分子。
葡聚糖可商购获得,其标称分子量(MW)在3000道尔顿和2,000,000道尔顿之间变化。适用于本发明实践的葡聚糖可具有任何数量的不同分子量,包括3000、10,000、40,000、70,000、500,000和2,000,000道尔顿(例如,约4,000至约150,000、约6,000至约150,000、约8,000至约150,000、约15,000至约150,000、约10,000至约80,000、约12,000至约70,000等)。
对于10,000MW范围内的葡聚糖,葡聚糖通常具有每个葡聚糖分子0.2至2个染料分子的取代度(例如DOL)。此外,葡聚糖通常在3000MW范围内每个葡聚糖含有0.2-0.7个染料,在10,000MW范围内每个葡聚糖含有0.4-2个染料,在40,000MW范围内含有1-4个染料,在70,000MW范围内含有2-6个染料。因此,在本发明的实践中使用的葡聚糖以及其他标记的聚合物可具有每1,000MW约0.03至0.3个荧光标记物(例如每1,000MW约0.03至约0.25、约0.08至约0.3、约0.09至约0.3、约0.1至约0.3、约0.05至约0.2、约0.07至约0.25等)的DOL。
葡聚糖以及其他聚合物可以多种方式标记。例如,荧光标记的葡聚糖可以通过水溶性氨基葡聚糖与具有琥珀酰亚胺酯基的荧光标记物的反应来制备。荧光标记的葡聚糖也可以通过天然葡聚糖与荧光标记物如FITC的异硫氰酸酯衍生物的反应来制备。在适当的情况下,一旦添加荧光标记物,可以将葡聚糖上的未反应的胺封端以产生中性或带电荷的葡聚糖(即带负电荷或带正电荷)。此外,即使在不进行封端的情况下,也可以使用带电荧光标记物,其可以使葡聚糖呈阴离子或阳离子。
可用于实施本发明的另一类多糖是直链淀粉。直链淀粉是由α-1,4-糖苷键连接的a-D-葡萄糖单元组成的线性多糖。由于氢键,直链淀粉倾向于形成每圈含有六个葡萄糖单元的螺旋结构。这种类型的分子提供结构规则性,可以用于以有意识设计的方式隔开荧光标记物。因此,本发明包括组合物,以及制备和使用这种组合物的方法,其具有可用于保持荧光标记物之间的均匀距离的相当静态的结构特征。在许多情况下,以一定方式和在一定条件下与这种分子缔合的两个荧光标记物之间的距离将使得两个荧光标记物距离彼此的距离变化不大于30%(例如,约5%至约30%、约10%至约30%、约15%至约30%、约20%至约30%、约10%至约20%等)。
多肽也可用于本发明的实践中。一种示例性的此类分子是图21中所示的分支聚赖氨酸分子。该分子可以根据美国专利公开号2010/0278750中列出的方法制备。图21中示出了许多“R基团”,代表可连接荧光标记物的位置。在这样的分子中,R基团可以相同或不同(例如,R1和R2)。此外,当许多R基团相同时,这些基团可以充当荧光标记物连接点,其中R基团未被全部标记。
作为示例,图21显示具有33个R基团、32个R1基团和1个R2基团的聚合物。假设所有R基团都是相同类型的。这些R基团可以半随机方式部分荧光标记。这意味着可以提供条件使得仅一部分R基团接收荧光标记物。此外,标记是半随机的,因为由于它们在聚合物中的位置,一些R基团更容易接受荧光标记物。因此,本发明包括荧光标记聚合物的设计,其中定位和DOL被调节以获得所需的荧光效果。在一些情况下,基于每个聚合物接收标记物的可用连接位点的平均数量在10%至90%的范围内(例如,约10%至约85%、约15%至约85%、约20%至约85%、约20%至约75%、约30%至约75%、约30%至约80%、约40%至约80%等)。
如上所述,图21显示具有R1和R2基团的聚合物。如果需要聚合物与生物分子(例如抗体)的“定向”键联,则R2基团可以与R1基团不同。如果R基团相同,那么在聚合物上合适位置的任何R基团可以作为生物分子的缀合点的意义上,连接将是“非定向的”。当然,将调节条件以实现高水平的荧光,同时保持生物分子的高水平生物活性(例如,抗原结合)。
生物分子荧光的最大化可以部分地与感兴趣的生物分子上的荧光标记物的数量无关。例如,假设当在第一组条件下标记时,特定抗体上有7个荧光标记物,当在第二组条件下标记时,在同一抗体上有10个荧光标记物。进一步假设在第一组条件下标记的抗体的总荧光量大于在第二组条件下标记的抗体的总荧光量。在这种情况下,较少的荧光标记物导致更多的荧光。因此,其他因素相同(例如,生物分子的功能活性),第一组条件优于第二组条件。
可以使用任何数量的连接基团将荧光标记物连接到生物分子上。这些连接可以是非共价的或共价的。此外,非共价或共价可以指(1)荧光标记物与聚合物的连接,(2)聚合物与核(当存在时)的连接,和/或(3)聚合物或核(当存在时)与生物分子的连接中的一种或全部。
在许多情况下,聚合物(具有或不具有核)以及本文所述的其他类型的间隔物可以起到增加连接于生物分子的荧光标记物的荧光强度的作用。
可用于本发明实践的一类分子称为星形聚合物(参见Ren等人,《星形聚合物(StarPolymers)》,《化学评论(Chemical Reviews)》,116:6743-6836(2016))。星形聚合物是多臂分子,其含有核和一系列线性聚合物(称为“臂”)。这些臂通常含有末端功能以促进其他分子的连接。星形聚合物可以分类为同臂(包含仅一种组合物的臂)或杂臂(包含多于一种组合物、分子量或末端官能团的臂)。星形聚合物的合成通常使用核首次、臂首次或接枝接近来进行。
核有效地充当了臂的分支点。任何数量的分子都可以用作本发明组合物的核。合适的核的实例包括低聚甘油(例如六甘油)、低聚赤藓糖醇(例如,季戊四醇、二季戊四醇、三季戊四醇)、山梨糖醇、三羟甲基丙烷、硅烷(例如1,2-双(甲基甲硅烷基)乙烷)、金刚烷、PAMAM(1代、2代和3代(G-1-3)聚(酰胺胺))树枝状大分子、聚乙烯亚胺(PEI)分支聚合物、肽(例如聚赖氨酸、聚天冬氨酸等)。
核可能已经具有用于引发聚合或连接到臂上的官能团,或者如图20所示,可能需要化学修饰以便于臂的连接。
使用六甘油作为实例,该化合物可商购获得,并且可以用于星形PEG聚合物的核首次合成。具有六甘油核的StarPEG可用于药物的控制释放和伤口密封。具有六甘油核的StarPEG可以通过来自六甘油核的环氧乙烷的受控聚合来制备。在这种情况下,核是六甘油,臂是聚乙二醇。
臂可以由任何数量的线性聚合物构成,并且通常用作荧光标记物的连接点并且用于将这些标记物彼此隔开,以及将标记物与连接于相同标记分子(例如,生物分子)的其他荧光标记物隔开。合适的臂的实例包括聚乙二醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚甘油和聚乙烯醇、两性离子聚合物(例如聚磺基甜菜碱)以及水溶性聚合物。在许多情况下,适用于本发明的聚合物是不带电的。
当存在时,对于荧光标记物的连接特别有用的抗体的一个区域是Fc(可结晶片段)区。Fc区相对于抗原结合位点位于抗体的远端。该抗体区域与称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的蛋白质相互作用。通常,化学实体在Fc区或其附近的连接对抗体的抗原结合几乎没有影响。然而,抗原结合事件的干扰倾向于随着连接于抗体的化学实体的大小而增加。此外,由于空间位阻,大的连接化学实体在连接于生物分子的能力方面倾向于彼此干扰。因此,可能需要平衡一系列因子以产生具有高水平荧光和高水平功能活性(例如,抗原结合能力)的生物分子(例如,抗体)。这些因素中的一些如下:(1)生物分子的大小,(2)用于荧光标记的生物分子上的连接点的位置,和(3)连接于生物分子的荧光标记分子的大小和三维结构。
关于抗体,本发明包括含有一种或多种以下特征的抗体:
-荧光标记的聚合物在抗体分子上平均2至10个不同位置结合(例如,共价结合)。
-每个抗体分子平均连接3至80个荧光标记物。
-荧光标记的抗体分子的抗原结合亲和力(KD)与未标记形式的抗体相比降低不超过2个(例如,约0.5至约2.0个、约1.0至约2.0个、约0.5至约1.5个、约0.75至约1.5个等)数量级。
-基于每个荧光标记物与抗体分子结合的荧光发射的平均量为游离荧光标记物的至少60%(例如,约60%至约98%、约70%至约98%、约80%至约98%、约85%至约98%、约80%至约93%等)。
f.生物分子/荧光标记物/间隔物组合
本发明部分基于三种组分的组合:生物分子、荧光标记物和间隔物。关于蛋白质(例如,抗体),可以用作荧光标记物和间隔物的连接位点的基团可能不总是易于连接,尤其是当蛋白质未变性时。此外,在许多情况下,需要保持未变性形式的蛋白质。
已发现荧光发射的增强涉及用于标记生物分子(例如,抗体)的荧光标记物和间隔物的各种比率。此外,每种生物分子都有可能在缀合过程中需要不同比率的组分以产生特定的增强的荧光水平。这可能是由于生物分子(例如抗体)的不同结构(例如,一级、二级、三级和四级结构)以及特定荧光标记物和特定间隔物的特征。
在一些情况下,比率可以基于组分的相应重量。在其他情况下,比率可以基于摩尔比。本申请的许多附图和实例涉及摩尔比。在一些情况下(例如,在生物分子很大并且具有大量缀合位点的情况下),组分重量的使用可能更合适。
对于抗体以及其他生物分子,在缀合过程中使用的以下生物分子与荧光标记物与间隔物的比例可以变化很大,但在大多数情况下,生物分子的量将低于荧光标记物和间隔物的量。
此外,生物分子上的缀合位点的密度和/或间隔是通常将确定荧光标记物与间隔物的最佳比率的一个因素。这是因为,假设增强的荧光是由于猝灭减少,则缀合位点的总密度或区域密度越低,预期猝灭量就越低。在任何情况下,可以使用的生物分子与荧光标记物与间隔物的比率可以描述如下:B1∶FL2-30∶S2-20,其中B是生物分子,FL是荧光标记物,S是间隔物。可用于本发明实践的具体比率范围包括在1∶2-25∶2-20内的比率(例如,约1∶2∶2至约1∶25∶20、约1∶5∶2至约1∶25∶5、约1∶10∶2至约1∶25∶5、约1∶5∶2至约1∶15∶10、约1∶10∶5至约1∶25∶20、约1∶10∶5至约1∶15∶20、约1∶10∶5至约1∶20∶20等),其中第一个数字是生物分子的量(例如摩尔),第二个数字是荧光标记物的量,第三个数字是间隔物的量。
在一些情况下,用于缀合的荧光标记物和间隔物浓度将使得生物分子上的可用连接位点将被有效饱和(例如,至少95%的可用连接位点将与荧光标记物或间隔物结合)。在这种情况下,荧光标记物和间隔物比率可以是荧光增强水平的决定因素。在许多情况下,荧光标记物与间隔物的比率将在10∶1至10∶50之间(例如,约10∶1至约10∶25、约10∶1至约10∶10、约10∶1至约10∶5、约10∶5至约10∶50、约10∶5至约10∶20、约10∶3至约10∶30、约10∶5至约10∶30、约10∶10至约10∶25等)。
间隔物和染料可以同时或依次与生物分子缀合,其中间隔物或染料首先与生物分子缀合。在许多情况下,当间隔物和染料在相同位点连接到生物分子时,它们将同时与生物分子缀合。然而,当第一次缀合反应(例如,间隔物)在结合位点是不饱和生物分子的条件下进行时,可以使用顺序缀合,从而留下可用于第二次缀合反应(例如,染料)的结合位点。
g.缓冲液
在一些实施例中,本发明的组合物在缓冲液中包含一种或多种间隔物、一种或多种荧光标记物。本文公开的任何荧光和间隔分子可以与本领域已知的任何缓冲液一起使用。
在一些实施例中,本文公开的组合物包含任何用于分子生物学应用的合适缓冲液。
在一些实施例中,缓冲液是合适的储存缓冲液(例如,硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液)。
在一些实施例中,在用于检测测定期间,缓冲液适合于缓冲如本文所公开的可检测生物分子。
方法
本发明在基础研究、高通量筛选、免疫组织化学、荧光原位杂交(FISH)、微阵列技术、诊断和医学治疗中具有有用的应用。本发明可用于各种测定形式,用于微生物学、免疫学、血液学和输血学、组织病理学、法医病理学和兽医病理学的诊断应用。
在一些实施例中,本文所述的组合物可用于任何分子生物学应用,其中检测荧光标记的分子。例如,如本文所公开的可检测的生物分子可用于蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术、流式细胞术和涉及FRET的应用。如本文所公开的可检测的生物分子也可用于荧光免疫组织化学(IHC)、荧光免疫细胞化学(ICC)和体内成像应用。
在一些实施例中,涵盖用于确定生物样品中所需靶标的存在的方法,所述方法包括:a)使所述生物样品与包含一种或多种荧光标记和一种或多种间隔分子的组合物接触,其中间隔物和荧光标记与生物分子偶联但不相互结合,b)检测由多个荧光标记发射的荧光;c)当检测到由多个荧光标记发射的荧光时,确定生物样品中所需目标的存在。在一些实施例中,生物样品包含细胞裂解物。在一些实施例中,生物样品包含完整细胞。在一些实施例中,生物样品包含组织样品。可以固定其它这样的组织样本。此外,本发明的组合物可用于诸如免疫组织化学的应用。在一些实施例中,生物样品包含分离的蛋白质。在一些实施例中,生物样品包含重组蛋白。在一些实施例中,将生物样品固定在固体支持物上。在一些实施例中,生物样品包含流体中的完整细胞。在一些实施例中,生物样品为活动物。在一些实施例中,活动物是哺乳动物。在一些情况下,样品包括组织,例如肝、肺、肌肉和皮肤。
在一些实施例中,本文公开了一种用于在活体中成像靶抗原的方法,其中所述方法包括:a)提供与多种荧光标记缀合的抗体和如本文所公开的与靶抗原结合的间隔剂;b)将抗体导入体内以形成接触体;c)用适当的波长照射接触体,形成发光体;d)观察其中靶抗原成像的发光体。在一些实施例中,这些抗体或对活体中靶或抗原特异的其他靶向蛋白或肽已经与具有与体内成像相容的激发波长的荧光染料缀合,通常为约580nm至约800nm。靶特异性染料缀合物在循环血液中相对自由地行进,直到它们的优先隔离发生在靶病理或非病理组织部位,例如患病或损伤组织部位。
h.试剂盒
可将本发明的组合物掺入试剂盒中,以促进各种试验的实施。试剂盒可以与组合物一起包装成干燥形式或与组合物一起包装在溶液中。所述试剂盒可任选地进一步包括一种或多种缓冲剂,通常作为水溶液、样品制备试剂、附加的检测试剂、有机溶剂、其他荧光检测探针、标准品、微球、特定的细胞系、抗体和/或用于进行检测的说明书。另外的任选试剂包括用于与化合物一起测试其他细胞功能的组分。
在一些实施例中,试剂盒包含如本文所公开的生物分子、间隔剂和荧光标记。在一些实施例中,试剂盒还包含缓冲液。在一些实施例中,生物分子已经与间隔剂和荧光标记物缀合。在一些实施例中,试剂盒可包含与荧光标记缀合的聚合物和作为生物缀合试剂盒的反应性基团。
本发明的试剂盒可以进一步含有用于制备荧光标记的生物分子(例如抗体)的试剂。示例性试剂包括以下中的一种或多种:荧光染料、根据试剂盒中提供的说明书预先标记的间隔物、以及可用于将(1)间隔物与生物分子和/或(2)荧光标记物与生物分子缀合的化合物。
本说明书和示例性实施例不应视为是限制性的。为了本说明书和所附权利要求的目的,除非另外指出,表示数量、百分数或比例的所有的数值,和本说明书和权利要求中使用的其他数值,在所有情况下应理解为被术语“约”修饰,至它们还未如此修饰的程度。因此,除非相反指出,在下面说明书和所附权利要求中阐释的数值参数是近似值,因为其可取决于期望寻求获得的特性而改变。至少但并不试图将等同原则的应用限制到权利要求书的范围,每一个数值参数都应当至少根据所报告的有效数字的数目并且通过应用一般四舍五入技术来解释。
实例
提供下述实例,以阐释某些公开的实施例并且决不视为限制本公开的范围。
实例1:荧光蛋白质印迹方法
a.)使用NHS活化荧光染料和磺基NHS-乙酸酯/NHS-乙酸酯和NHS-MS(PEG)4、NHS-MS(PEG)8和NHS-MS(PEG)12进行抗体标记
NHS活化荧光染料,如DyLightTM650-4xPEG,在二甲基甲酰胺(DMF)中以10mg/ml重构。在二甲基甲酰胺(DMF)中以1mg/ml新鲜制备NHS-乙酸酯。将NHS-MS(PEG)4(目录号22341(赛默飞世尔科技)、NHS-MS(PEG)8(目录号22509(赛默飞世尔科技)、NHS-MS(PEG)12(目录号22686(赛默飞世尔科技)在DMF中以100mg/ml重构。在使用前将PEG试剂在DMF中进一步稀释至1mg/ml。用每种荧光染料,或用各种摩尔过量的每种荧光染料和选自NHS-乙酸酯、NHS-MS(PEG)4、NHS-MS(PEG)8或NHS-MS(PEG)12的间隔物的混合物在7-10mg/ml的50mM硼酸盐缓冲液(目录号28384(赛默飞世尔科技)pH 8.5中标记1mg山羊抗小鼠(GAM)和山羊抗兔(GAR)抗体。将标记反应在室温(RT)下培育约1小时。在加入抗体之前,将NHS活化的染料和NHS活化的间隔剂组合,使得两个反应同时进行,允许染料取代和间隔物的随机间隔。向每个样品中加入pH 4.7的100mM MES缓冲液以将pH从8.5降低至约7.2。此时,将缀合物的浓度调节至约6mg/ml,以适应储存缓冲液中的最终稀释。使用染料去除树脂(赛默飞世尔科技,目录号22858)和5μm Harvard柱(Harvard Apparatus,目录号74-3820)去除游离染料。每mg蛋白质使用0.2ml的50%纯化树脂浆液。用0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.2(PBS)将缀合物1∶50稀释,并使用UV Cary分光光度计扫描。OD扫描(252nm至900nm)用于测定缀合物的浓度并计算摩尔染料/摩尔蛋白比(D/P)。最后,缀合物在NOBLE储存缓冲液(SurModics,目录号SZ04)中稀释至1mg/ml用于长期存储。
将连续稀释的细胞裂解物(500ng至2ng)与SDS-PAGE样品缓冲液合并。将样品在95℃下加热五分钟,并加载到赛默飞世尔科技Tris甘氨酸SDS-PAGE凝胶(Novex Gels,4-20%,10孔,目录号WT4202BX10)。根据制造商的说明对凝胶进行电泳,然后使用半干转移方法将其转移到硝酸纤维素膜上。用SEA BLOCK阻断缓冲液(赛默飞世尔科技,目录号0037527)将膜阻断30分钟。在Sea Block阻断缓冲液中将一抗制备成终浓度为0.1至2.5μg/ml。将印迹与在Sea Block阻断缓冲液中制备的抗体一起培育1小时,同时在室温(RT)下振荡。滗析抗体溶液,并将膜在10mM Tris,150mM NaCl,0.05%Tween-20,pH 7.2(TBST)中洗涤两次,每次10分钟。在SEA BLOCK阻断缓冲液中将荧光标记的二抗缀合物稀释至终浓度20至1000ng/mL。将洗过的膜与相关的二抗缀合物一起培育并搅拌30至60分钟。滗析缓冲液,用TBST洗涤膜6次,每次5分钟。使用兼容的荧光成像仪对膜进行成像。
结果显示在图8中,用于测试在蛋白质印迹测定中以5X-20X摩尔过量添加NHS乙酸酯(2.5X、5X和10X)和MS(PEG)4(3.75X)间隔物对缀合至DyLightTM 488的GAM二抗的效果的实验。将A431细胞裂解物从1μg/孔稀释3倍。使用的一抗兔是从1mg/ml稀释1/5000的抗Hsp90。所有DyLightTM二抗从1mg/ml原液稀释1/5000。在蛋白质印迹应用中,在添加NHS乙酸酯或MS(PEG)4的情况下缀合的DyLightTM 488-GAR,在每种染料摩尔过量7.5X至20X时,荧光强度相比于基础缀合物(不含间隔物)明显增加。
在蛋白质印迹测定中,表明添加NHS乙酸酯(5X)或MS(PEG)4(5x)间隔物对缀合至DyLightTM650-4xPEG(7.5X染料)的GAM二抗中的效果的结果显示于图9。将HeLa细胞裂解物从0.5μg/孔稀释4倍。将一抗小鼠抗PDI稀释至1mg/ml的1/5000。将所有DyLightTM二抗稀释至1mg/ml原液的1/5000。以5倍摩尔过量添加至GAM-DyLightTM650-4xPEG-7.5X缀合物中的NHS乙酸酯使强度提高1.5倍。以3.75倍摩尔过量添加至GAM-DyLightTM650-4xPEG-7.5X缀合物中的NHS乙酸酯使强度提高1.4倍
在蛋白质印迹分析中,表明添加NHS乙酸酯(2.5X、5X)和MS(PEG)4间隔物对GAR-DyLightTM 800-4xPEG二抗的效果的结果显示于图10和表10中。将A431细胞裂解物以1∶1连续稀释。将一抗兔抗Hsp90和抗亲环蛋白B稀释1/5000。将所有DyLightTM二抗稀释至1mg/ml原液的1/20,000。在该蛋白质印迹应用中,在不同摩尔过量的染料中,添加MS(PEG)4(3.75X和5X)和NHS乙酸酯(2.5-5X)使基础DyLightTM800-4xPEG缀合物的荧光强度和灵敏度显著增强了20-100%。
在蛋白质印迹试验中,表明添加NHS乙酸酯(2.5X、5X和10X)和MS(PEG)4(5x)和MS(PEG)8(5x)间隔物对GAM-DyLightTM550-2xPEG缀合物(在12.5倍摩尔过量的染料下)的效果的结果如图11所示。将HeLa细胞裂解物从0.5μg/孔稀释4倍,并用稀释至1mg/ml的1/5000的抗PDI一抗染色。将所有DyLightTM二抗稀释至1mg/ml原液的1/5000。该实验表明,在蛋白质印迹分析中添加MS(PEG)4(5X)和NHS乙酸酯(2.5X和5X)使基础DyLightTM550-2xPEG缀合物的荧光强度和灵敏度显著增强了至少2倍。用较长链MS(PEG)8制备的缀合物在该实验中没有显示出比基础缀合物显著的改善。
表明添加NHS乙酸酯(2.5X、5X)和MS(PEG)4(5X)间隔物对GAM-DyEightTM680-4xPEG-GAR(在10X摩尔过量的染料)的效果的结果如图12所示。将HeLa细胞裂解物从0.5μg/孔稀释4倍,并将抗PDI第一抗体稀释至1mg/ml的1/5000。将所有DyLightTM680-4xPEG-GAR二抗稀释至1mg/ml原液的1/20000。该实验表明在蛋白质印迹分析中添加MS(PEG)4(5X)和NHS乙酸酯(2.5X和5X)使基础DyLightTM680-4xPEG缀合物的荧光强度和灵敏度显著增强了3至4倍。
实例2:斑点印迹分析
系列稀释液(1∶1)从选择的原液浓度制备小鼠或兔IgG。使用20μL 12通道多移液管将稀释液从最高至最低置于96孔板中。将1或2μL 11系列稀释液小心地点在硝酸纤维素膜上。将膜干燥过夜,然后用TBST中的2%BSA阻断缓冲液封闭。将膜在室温下搅拌培育1小时。从容器中倾析出封闭溶液。将第二抗体缀合物在TBS或阻断缓冲液中稀释。二抗缀合物稀释根据缀合的标记而变化:1∶5000(DyLightTM488和550-2xPEG缀合物);1∶10,000(DyLightTM650-4xPEG缀合物);和1∶20,000(DyLightTM680-4xPEG和DyLightTM800-4xPEG缀合物)。将膜与相关的二抗缀合物一起培育并搅拌30至60分钟。用TBST缓冲液将膜洗涤五次,每次5分钟。用合适的成像器对膜进行成像,例如ChemiDoc MP(488、550、650、680nm)和LiCOR Odyssey CLx(650、680、800nm)。
图3和表11所示的结果显示了在斑点印迹分析中NHS乙酸酯(2.5X、5X和10X)和MS(PEG)4(3.75x)间隔物对GAM-DyLightTM 488(染料的5X-20X摩尔过量)的效果印迹分析。在斑点印迹应用中,相比于在各种染料摩尔过量7.5X至20X基础缀合物(无间隔物制成),添加NHS乙酸酯和MS(PEG)4制成的DyLightTM 488-GAM缀合物导致荧光强度明显提高1.2至1.8倍。
图4和表12中显示的结果证明了在斑点印迹分析中添加NHS乙酸酯(2.5X和5X)和MS(PEG)4(3.75X)对GAM-DyLightTM 488(在7.5X-20X摩尔过量的染料中)的效果。在该实验中,使用不同的二抗源。与5X、15X和20X染料摩尔过量的基础缀合物相比,加入到缀合混合物中的NHS乙酸酯和MS(PEG)4提供了信号强度的显著改善,从1.2到2.6倍不等。
图5和表13中显示的结果证明了在斑点印迹测定中添加NHS乙酸酯(2.5X、5X和10X)和MS(PEG)4(3.75X)对GAM-DyLightTM 550-2xPEG-GAR(在10X-20X摩尔过量的染料中)的效果。将小鼠IgG从1000ng/斑点1∶1连续稀释。将所有DyLightTM 550-2xPEG-GAR二抗稀释至1mg/ml原液的1/5000。与每种相应染料摩尔过量的基础缀合物相比,添加到缀合混合物中的NHS乙酸酯和MS(PEG)4提供了信号强度的改善。改善范围从1.2到1.6倍。
结果如图6和表14所示[Surbhi和Marie:图6和表14中的数据不完全匹配。我不确定哪个是正确的。请解决这个问题。这不是一个主要问题,但我们应该做对。]图6和表14中显示的结果证明了在斑点印迹分析中向GAM-DyLightTM 650-4xPEG-GAM(在10X-20X摩尔过量的染料中)添加NHS乙酸酯(2.5X,5X和10X)和MS(PEG)4(3.75X)的效果。将小鼠IgG从1000ng/斑点1∶1连续稀释。将所有DyLightTM 650-4xPEG-GAR二抗稀释至1mg/ml原液的1/10000。与初始基础缀合物相比,NHS乙酸酯和(MS)PEG4均在灵敏度和信号/背景方面带来显著改善。以2.5X摩尔过量添加至GAM-DyLightTM 650-4xPEG-15X中的NHS乙酸酯将强度提高1.7倍。NHS乙酸酯提供的改善性能比用最高摩尔过量的染料(20X)制备的缀合物表现出高1.3倍的性能。所有MS(PEG)4加入到GAM-DyLightTM 650-4xPEG-15X缀合物使荧光强度改善了1.8至2.2倍,并且比相应的最高基础缀合物GAM-DyLightTM 650-4xPEG-20X表现更好。
图7和表15中显示的结果证明了在斑点印迹分析中添加NHS乙酸酯(2.5X、5X和10X)和MS(PEG)4(3.75X、5X、10X)间隔物对GAM-DyLightTM 800-4xPEG的效果。将小鼠IgG从1000ng/斑点1∶2连续稀释。所有DyLightTM 800-4xPEG-GAR二抗稀释至1mg/ml原液的1/20000。这个实验表明,在斑点印迹分析中添加MS(PEG)4(3.75X和5X)和NHS乙酸酯(5X)使基础DyLightTM 800-4xPEG缀合物的荧光强度和灵敏度显著增强了1.5至6倍。
图11中显示的结果证明了在斑点印迹分析中添加NHS乙酸酯(2.5X、5X和10X)和MS(PEG)(5X)和MS(PEG)8(5X)间隔物对GAM-DyLightTM 550-2xPEG-GAR(12.5X摩尔过量的染料)的效果。将小鼠IgG从0.5μg/孔稀释3倍。将所有DyLightTM二抗稀释至1mg/ml原液的1/5000。这些斑点印迹分析表明,添加MS(PEG)4(5X)和NHS乙酸酯(2.5X和5X)的使基础DyLightTM 550-2xPEG缀合物的荧光强度和灵敏度显著增强了至少2倍。用较长链MS(PEG)8制备的缀合物未显示出比基础缀合物显著的改善。
图12中显示的结果证明了在斑点印迹分析中添加NHS乙酸酯(2.5X、5X)和MS(PEG)4(5X)间隔物对GAM-DyLightTM 680-4xPEG-GAR(10X摩尔过量的染料)的效果。将小鼠IgG从1000ng/斑点1∶2连续稀释。所有DyLightTM680-4xPEG-GAR二抗稀释至1mg/ml原液的1/20000。这些斑点印迹分析表明,加入MS(PEG)4(5X)和NHS乙酸酯(2.5X和5X)显著增强了基础DyLightTM 680-4xPEG缀合物的荧光强度和灵敏度。
实例3:平板分析方法
为制备平板,制备从10μg/ml开始的11个(1∶1)连续稀释的小鼠或兔IgG。使用300μL 12通道多重移液管将100μL每种稀释液置于相应孔中的96孔板中,从最高到最低1-11;将PBS加入最后一栏(#12;阴性对照)。这重复从行A至H。将板培育过夜,然后阻断,并用与SuperBlockTM阻断缓冲液(赛默飞世尔,目录号37515)一起培育如下:两次200μL持续5分钟,然后一次200μL持续10分钟。使板干燥,然后在4℃下干燥保存。
将小鼠IgG或兔IgG包被的板用PBST 20洗涤两次200μL,然后用PBS洗涤一次。将二抗缀合物在TBS或PBS中稀释。将二抗缀合物稀释1∶100(DyLightTM 488和550-2xPEG,DyLightTM 650-4xPEG DyLightTM 680-4xPEG和DyLightTM 800-4xPEG缀合物)。将100μL小鼠IgG包被的板中的相关缀合物GAM、兔IgG包被的板中的GAR加入板孔中。对于每种待测试的缀合物,将每种稀释液加入不同的行中。所有比较均在同一平板上进行。将板培育60分钟。用TBST或PBST缓冲液将板洗涤三次200μL。在每个孔的每一行中加入100μL PBS。使用VariosKan仪器或使用合适的成像仪(例如ChemiDoc MP(488、550、650、680nm)和LiCOROdyssey CLx(650、680、800nm)对荧光信号进行荧光强度测量。
实例4:免疫荧光(IFC)方法(即,细胞成像方法)
方法#1:储存在-80℃下的冷冻U20S细胞板在50℃解冻三十分钟。去除储存缓冲液(PBS),用1X PBS缓冲液中的0.1%Triton-X100将细胞透化15分钟(100μl/孔)。将板在2%BSA/PBS-0.1%Triton-X100阻断剂中阻断30分钟。将在2%BSA/PBS-0.1%Triton-X100中稀释的一抗小鼠抗PDI或兔抗HDAC2(10μg/ml)(目录号PA1-861,加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司)加入板中并在室温下培育1小时。阴性对照仅含有2%BSA/PBS-0.1%Triton-X100阻断剂。培育后,从板上去除一抗溶液,将板洗涤三次100μl/孔PBST和一次100μl/孔PBS。接下来,将用各种摩尔过量染料标记的GAM或GAR二抗在PBS中稀释至4μg/ml,并在室温下培育1小时。将板洗涤三次,加入100μl/孔的PBST和1x 100μL/孔PBS和Hoechst33342(目录号62249,Thermo Scientific,Waltham,MA),(在PBS中稀释至0.1μg/ml)加入到每个孔(100μl/孔)。该板在ArrayScanTM平板阅读器VTI3,20X物镜上进行扫描。
方法#2:在384孔板中的A549细胞中进行某些实验。一抗以相同浓度(1μg/ml)使用,而二抗的稀释度不同。在依托泊苷(50μM,3小时,Tocris Bioscience,目录号12-261-00)处理的细胞中的pH2AX测量用于测量B信号/噪声(S/N,也称为信号比背景),并将亮度用于比较不同的抗体。在4种不同稀释度(0.5、1、2和4mg/ml)下测试二抗缀合物。标准程序用于抗体染色:4%甲醛固定15分钟。渗透在0.5%Tritonx-100中进行10分钟。用3%BSA进行阻断30分钟。一抗培育在室温下进行1小时。然后用PBS洗涤三次。将二抗缀合物在室温下培育1小时,然后用PBS洗涤三次。细胞在ArrayScanTM VTI(赛默飞世尔)上进行了分析。
图13和表16和17中显示的结果证明了在细胞成像应用中NHS乙酸酯(2.5X和5X)和MS(PEG)4(3.75X)间隔物添加到GAM-DyLightTM 488(13A)和GAR-DyLight TM 488((13B)在7.5X至20X摩尔过量的染料)的效果。DyLightTM 488-GAM和DyLightTM 488-GAR。用稀释至1mg/ml原液的1/1000的pH2Ax一抗染色A549细胞。将所有DyLight TM 488二抗稀释至1mg/ml原液的1/250。与15X染料摩尔过量的基础缀合物相比,添加到缀合混合物中的NHS乙酸酯提供了信号/背景的改善;范围从1.4到1.5倍(GAM)和1.1到1.6倍(GAR)。对于GAM缀合物,用NHS乙酸酯在5X和MS(PEG)4在3.75X观察到最显著的改善,对于GAR缀合物,用NHS乙酸酯在2.5X和MS(PEG)4在3.75X观察到更显著的改善。
图14和表18显示的结果证明了在细胞荧光成像应用中NHS乙酸酯(2.5X、5X和10X)和MS(PEG)4(3.75X、5x和10X)对GAM-DyLightTM 550-2XPEG-GAM(在7.5X到20X摩尔过量的染料)的效果。用稀释至1mg/ml原液的1/100的抗PDI一抗对U2OS细胞染色。所有DyLightTM550-2xPEG-GAM二抗稀释到1mg/ml原液的1/250。在这种细胞成像应用中,与12.5X染料摩尔过量的DyLightTM 550-2xPEG GAM缀合物的基础缀合物(不含添加剂)相比,添加5X NHS乙酸酯产生约50%的改善,并添加3.75X MS(PEG)4在20X染料摩尔过量时,比基础缀合物产生约50%的改善。
结果显示在图15和表19中,在细胞成像应用中用于测试NHS乙酸酯(2.5X、5X和10X)和MS(PEG)4(3.75X、5X、10X)间隔物对GAM-DyLightTM 650-4xPEG的效果。用稀释至1mg/ml原液的1/100的抗PDI一抗对U2OS细胞染色。将所有DyLightTM 650-4xPEG-GAM二抗稀释至1mg/ml原液的1/250。在该细胞成像应用中,与20X摩尔过量的DyLightTM 650-4xPEG-GAM缀合物的基础缀合物(不含添加剂)相比,添加NHS乙酸酯-5X生成约70%的改善,以及MS(PEG)4-3.75X在20X染料摩尔过量时显示比基础缀合物约90%的改善。
结果显示在图16和表20中,在细胞成像应用中用于测试NHS乙酸酯(2.5X、5X和10X)和MS(PEG)4(3.75X、5X、10X)间隔物对GAM-DyLightTM 680-4xPEG的可检测荧光水平的效果。用稀释至1mg/ml原液的1/100的小鼠抗PDI一抗染色U2OS细胞。将所有DyLightTM 680-4xPEG-GAM二抗稀释至1mg/ml原液的1/250:在该细胞成像应用中,与DyLightTM 680-4xPEG的基础缀合物(不含添加剂)相比,添加NHS乙酸酯-5X可使染料缀合物在7.5X和10X时产生约70%的改善。在摩尔过量15X摩尔过量和MS(PEG)4-3.75X的GAM缀合物在15X摩尔过量时显示出比基础缀合物高约80%的改善。
结果
使用间隔剂如NHS-乙酸酯、NHS-MS(PEG)和NHS-甜菜碱增加荧光信号灵敏度和强度,使其高于通常导致猝灭的最佳D/P水平。这通过用NHS-DyLightTM 488、NHS-DyLightTM550 2XPEG、NHS-DyLightTM 650 4XPEG、NHS-DyLightTM 680 4XPEG、NHS-DyLightTM 8004XPEG与间隔剂组合标记山羊抗小鼠(GAM)和山羊抗兔(GAR)二抗来证明,所述间隔剂包括但不限于NHS-乙酸酯和NHS-NHS-MS(PEG)4、NHS-MS(PEG)8和NHS-MS(PEG)12。我们在染料缀合和纯化后对D/P值的计算表明,间隔剂的添加没有对D/P比率造成显著差异,表明这些试剂和荧光团在抗体上标记了不同的伯胺(即,它们不竞争同样的伯胺)。
用不同的染料和间隔剂制备的缀合物在多种应用中进行测试,包括IFC、蛋白质印迹、斑点印迹或基于IgG结合板的分析。在每种情况下,对于某些摩尔过量值的间隔剂对染料的某些间隔剂,当使用间隔剂时,与缺少间隔剂的对照相比,观察到荧光强度的增加。
除了上述实验外,当抗体与作为间隔物修饰试剂的甜菜碱缀合时,用抗NHS-罗丹明标记并与多种NHS-甜菜碱浓度(甜菜碱2.5、甜菜碱5、甜菜碱10摩尔比)缀合的抗体显示出总荧光增加。参见下面的图17和表21和22。甜菜碱10在染料的所有摩尔过量中对TAMRA和对在D/P比率为12的555具有阳性作用(数据未显示)。
实例5:山羊抗小鼠IgG(GAM)和5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(5(6)TAMRA-SE)在有和没有N,N,N-三甲基甘氨酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溴化物(甜菜碱-SE)的情况下的反应
将TAMRA-SE称重并在无水DMSO中以10mg/mL的储备溶液配制并将甜菜碱-SE称重并在无水DMSO中以4mg/mL的储备溶液配制。然后将DMSO溶液转移到反应小瓶中,基于染料与IgG的5、10或20倍摩尔比,将TAMRA-SE+/-甜菜碱-测量到小瓶中并且摩尔当量比为0或10的甜菜碱--SE与IgG也加入到小瓶中。
另外,将0.417mL(3.5mg)的8.4mg/mL GAM在10mM磷酸钾,150mM氯化钠缓冲液(PBS)中的溶液测量到塑料管中,并且用42μL的1M碳酸氢钠pH 9.0将pH升至>8.0。0.5mg的GAM溶液加入到含SE的反应小瓶中,在室温下反应1小时。使用填充有PBS中的BioRadTM P-30的5-0.75×20cm柱,通过尺寸排阻色谱法将染料-蛋白质缀合物与游离染料和甜菜碱分离,并用其洗脱。收集来自每个柱的初始含蛋白质的条带。
在Perkin-Elmer Lambda 35UV/Vis光谱仪上获得吸光度光谱,并测定每个样品的取代度(DOS)或摩尔染料/摩尔GAM。使用Perkin Elmer LS 55荧光光谱仪上获得荧光发射光谱,采用具有在545nm处相匹配的光密度和在545nm处激发样品。从550-750纳米采集发射数据。测量相对量子产率(RQY)作为染料标准光谱的样品光谱/面积的面积。然后计算总荧光作为RQY*DOS的乘积。
实例6:山羊抗小鼠IgG(GAM)和Alexa488羧酸琥珀酰亚胺酯二锂盐(AF488-SE)在有和没有1,3-丙磺酸内酯(3-羟基-1-丙磺酸γ-磺内酯)的反应
称重AF488-SE并在无水DMSO中以10mg/mL的储备溶液配制,并称出丙烷磺内酯,并在E-纯化H2O中以1mg/mL的储备液补足。
将0.357mL(4.0mg)11.2mg/mL GAM在10mM磷酸钾,150mM氯化钠缓冲液(PBS)中的溶液测量到塑料管中,用36μL 1M碳酸氢钠pH 9.0将pH升至>8.0。将0.5mg GAM溶液转移至反应小瓶中并与0、2、5或10倍摩尔过量的丙磺酸内酯反应2分钟,然后将AF488原液以相对于GAM的8或15倍摩尔过量添加到混合物中,并在室温下反应1小时。使用填充有PBS中的BioRadTM P-30细胞的5-0.75×20cm柱,通过尺寸排阻色谱法将染料-蛋白质缀合物与游离染料和丙烷磺内酯分离,并用其洗脱。收集来自每个柱的初始含蛋白质的条带。
在Perkin-Elmer Lambda 35UV/Vis光谱仪上获得吸光度光谱,并测定每个样品的取代度(DOS)或摩尔染料/摩尔GAM。使用Perkin Elmer LS 55荧光光谱仪上获得荧光发射光谱,采用具有在475nm处相匹配的光密度和在475nm处激发样品。从480-800纳米采集发射数据。测量相对量子产率(RQY)作为染料标准光谱的样品光谱/面积的面积。然后计算总荧光作为RQY*DOS的乘积。
实例7:用Alexa647 NHS酯、三(三乙铵盐)(AF647-SE)修饰的20kDa 8臂PEG胺(20K8 PEG)标记SK3小鼠抗人CD4叠氮化物
将647NHS/琥珀酰亚胺酯(赛默飞世尔科技,目录号A37573),缩写为“AF647-SE”,称重并在无水DMSO(赛默飞世科学,D12345)中制成32mM的储备溶液。Click-iTTM SDP酯sDIBO炔烃(sDIBO)(赛默飞世尔科技,目录号C20025)在无水DMSO中以9mg/mL的储备溶液配制。8臂PEG胺(六甘油)HCl盐(JenKem,Plano,TX 75024,目录号8ARM-NH2HCl),缩写为“20K8 PEG”,具有以下结构:
将其称重并制备成40mg/mL的无水DMSO储备溶液。
向塑料管中加入300μL 20K8 PEG储备溶液、176μL sDIBO储备溶液(2.4倍摩尔过量/20K8 PEG)和6μL纯三乙胺(TEA),并使其在25℃下反应3小时。反应后,将300μL AF647-SE储备溶液(2倍摩尔过量/PEG-胺)加入管中,反应在25℃下进行过夜。AF647-20K8 PEG-sDIBO构建体通过尺寸排阻色谱法从游离染料和sDIBO中纯化,使用填充有PBS中的P-10F的1×30em柱并在其中洗脱。收集含有初始染料的级分并使用EMDMillipore AmiconTM Ultra-4 10kDa离心过滤器浓缩。
将叠氮基(PEO)4丙酸,琥珀酰亚胺酯(赛默飞世尔科技,目录号A10280),缩写为“叠氮基-SE”称重,并在无水DMSO(赛默飞世尔科技,D12345)中以10mM的储备溶液配制。将266μL SK3小鼠抗人CD4抗体(2.5mg)和134μL PBS加入塑料管中,用pH 9.0的50μL 1M碳酸氢钠将pH升至>8.0。将8.3μL叠氮基-SE储备溶液(5倍摩尔过量/抗体)和42μLDMSO加入到抗体溶液中。使反应在25℃下进行2小时。使用2mL BioRadP-30M离心柱纯化叠氮基-SK3抗体。用5倍至20倍过量的叠氮基-SE抗体制备叠氮基-SK3抗体。
将24.2μL的2mM AF647-20K8 PEG-sDIBO溶液(DIBO浓度)和116μL的4.3mg/mL叠氮基-SK3在塑料管中合并。加入360μL PBS以使溶液的最终浓度达到100μM AF647-20K8 PEG-sDIBO(DIBO浓度)和1mg/mL叠氮基-SK3抗体。使点击反应在37℃下进行2小时,然后在室温下用5mM NaN3猝灭1小时。将AF647-20K8 PEG-SK3缀合物在PBS中稀释至0.5mg/mL。缀合反应在100至600μM的最终DIBO浓度下进行,其中叠氮基-SK3抗体为1-3mg/mL,反应温度为25℃至37℃,进行2小时至20小时。每个实验运行的具体条件列于表24中。
将24.2μL的2mM AF647-20K8 PEG-sDIBO溶液(DIBO浓度)和116μL的4.3mg/mL叠氮基-SK3在塑料管中合并。加入360μL PBS以使溶液的最终浓度达到100μM AF647-20K8 PEG-sDIBO(DIBO浓度)和1mg/mL叠氮基-SK3抗体。使点击反应在37℃下进行2小时,然后在室温下用5mM NaN3猝灭1小时。使用EMD Millipore AmiconTM Ultra-4 100kDa离心过滤器纯化和浓缩缀合物。将AF647-20K8 PEG-SK3缀合物在PBS中稀释至0.5mg/mL。缀合反应在100至600μM的最终DIBO浓度下进行,其中叠氮基-SK3抗体为1-3mg/mL,反应温度为25℃至37℃,进行2小时至20小时。每个实验运行的具体条件列于表24中。
实例8:分支PEG AF647构建体的量子产率表征
为了制备用于量子产率测量的样品,将AF647分支PEG构建体(AF647-2K4、AF647-10K4、AF647-10K8和AF647-20K8)的溶液在去离子水中稀释至0.16μM的最终染料浓度。使用Hamamatsu绝对PL量子产率光谱仪测量量子产率(Φ)。将分支PEG构建体的量子产率与游离染料的量子产率进行比较,以确定最终构建体中的猝灭程度。另外,确定亮度以确定使用分支PEG间隔物实现的荧光增强。最小的构建体AF647-2K4(具有四个臂的2,000分子量的分支PEG)显示出最大的猝灭(游离染料的20%QY,0.2荧光比)并且总荧光的总体改善最低。对于具有4或8个臂(AF647-10K4和AF647-20K8)的较高分子量的构建体,观察到最大的荧光增强,其中保留了游离染料的高达89%的荧光量子产率(荧光比率为0.9),并且注意到亮度提高了5.8倍。
实例9:AF647-20K8 PEG-SK3构建体的流式细胞术评估
使用ACK裂解缓冲液在室温下裂解新鲜收集的抗凝血的全血(人)20分钟。通过离心(400×g,5分钟)分离白细胞,并在1%牛血清白蛋白/PBS(1%BSA/PBS)中洗涤两次。分离后,使用自动细胞计数器测定白细胞总数,然后稀释至每毫升1000万个细胞。使用7点滴定1μg至0.015μg抗体,用AF647-20K8 PEG-SK3缀合物对96孔板中每孔100万个细胞进行染色。用1%BSA/PBS洗涤染色的细胞两次。使用AttuneTM NxT流式细胞仪进行染色细胞的分析,并与APC(赛默飞世尔科技,目录号MHCD0405)、488(Invitrogen,目录号MHCD0420)、FITC(赛默飞世尔科技,目录号MA1-81103)和Brilliant VioletTM 605(BioLegend,San Diego,CA,目录号300555)CD4缀合物进行比较。
图22示出了作为AttuneTM NxT流式细胞仪的RL1通道中荧光强度的函数的CD4阳性淋巴细胞的直方图。与CD4缀合的647显示为虚线,AF647-20K8 PEG-SK3缀合物显示为点线或实线。与单独的AF647缀合物相比,StarPEG缀合物显示出更大的0.5log亮度增加。图23显示了作为流式细胞术实验中缀合物浓度的函数的绘制的信噪比(S/N)和阳性百分比(%阳性)。结果表明,与APC CD4基准缀合物相比,StarPEG构建体(此处为B1和B2)的S/N增加了多达2.5倍,与AF647 CD4基准缀合物相比,S/N增加了多达2倍,同时保留了准确评估样品中CD4阳性细胞的数量的能力。
实例10:Alexa488与氨基葡聚糖支架的缀合
70kD氨基葡聚糖AF488支架的制备:将10mg氨基葡聚糖(70,000MW,20个氨基;赛默飞世尔科技,目录号D1862)溶于1.2ml含有1.0μl DIEA的无水DMSO中。将0.9mg488琥珀酰亚胺酯锂盐(643MF;赛默飞世尔科技,目录号A20000)加入到溶液中,并将混合物在环境温度下搅拌3.5小时。将溶液用12mL乙酸乙酯稀释,并将所得悬浮液离心。弃去上清液,将固体物质与10mL新鲜乙酸乙酯一起振荡并离心。用10mL新鲜乙酸乙酯重复该洗涤3次,并将所得沉淀物真空干燥。将固体重新溶解在0.5ml水中,并将溶液置于从两侧夹住的10cm Spectra/Por透析膜(Spectrum Labs,MWCO 12-14,000平宽度10mm)中。将透析膜在1L水中缓慢搅拌1周。水每天更换两次。透析膜是从一端开口,溶液冷冻干燥,得到氨基葡聚糖支架。所测量的DOL是9.7,相对QY是0.6(参考488的QY)。
将硫醇接头连接至70kD氨基葡聚糖AF488支架:将氨基葡聚糖AF488支架(4.5mg)溶解于0.5mL含有0.055μL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的DMSO中。将3-(2-吡啶基二硫代)丙酸琥珀酰亚胺酯(SPDP)(20μg)加入到溶液中,并将混合物在环境温度下保持过夜,然后用乙酸琥珀酰亚胺酯(1.0mg,3小时)封端。将溶液用10mL乙酸乙酯稀释。离心所得悬浮液并弃去上清液。将固体与10mL新鲜乙酸乙酯一起振荡并离心。洗涤重复5次。将得到的固体真空干燥。测得的DOL为0.74。将该物质重新溶解在2mL水中,并将16mg DTT加入到溶液中。将混合物搅拌5分钟,并加载在G15柱,将产物用DE水洗脱为绿色荧光溶液,其用于缀合SMCC修饰的链亲和素。测定的浓度为48μM(通过染料吸附)。
用硫醇接头修饰的氨基葡聚糖AF488支架与SMCC修饰的链亲和素的缀合:用1、2、3和4当量的硫醇修饰的氨基葡聚糖AF488支架(48μM水溶液)处理SMCC修饰的链亲和素(35μL水溶液)。反应在环境温度下进行3小时,然后将反应混合物在4℃下保持过夜。缀合物在P100尺寸排阻柱上用10nM PBS缓冲液纯化。
结果:如表26和27所示,与由单一AF488染料制成的缀合物相比,由支架制成的缀合物更亮。此外,对于单染料缀合,AF488荧光团的QY从0.70降至0.34,与用氨基葡聚糖支架标记的几乎恒定的QY相反。
本发明进一步由以下条款表示:
1.一种包含第一抗体的组合物,其中两个或更多个荧光标记物和两个或更多个间隔分子共价连接到所述第一抗体,并且其中所述荧光标记物和间隔分子彼此不共价连接。
2.根据条款1所述的组合物,其中所述第一抗体表现出高于用等量荧光标记物但没有间隔分子制备的第二抗体的荧光发射水平。
3.根据条款1和2所述的组合物,其中所述第一抗体表现出高于第二抗体的荧光发射水平,其中所述第一抗体和所述第二抗体各自具有相同数量的共价结合的荧光标记物,并且其中所述第二抗体不具有共价结合的间隔分子。
4.根据条款1-3所述的组合物,其中与不存在所述间隔分子时的猝灭相比,所述间隔分子减少所述荧光标记物的猝灭。
5.根据条款1-4所述的组合物,其中所述间隔分子通过反应性基团与所述抗体缀合。
6.根据条款5所述的组合物,其中所述反应性基团是胺基。
7.根据条款6所述的组合物,其中所述胺基在赖氨酸残基上。
8.根据条款1所述的组合物,其中所述荧光标记物通过缀合分子与所述抗体缀合。
9.根据条款1-5所述的组合物,其中所述荧光标记物带正电荷。
10.根据条款1-5所述的组合物,其中所述荧光标记物是染料或DyLightTM染料。
11.根据条款1-9所述的组合物,其中所述荧光标记物是选自由以下组成的组的染料:350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610-X、633、647、660、680、 700、750、790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、、二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、、 488、514、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、或7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE)。
12.根据条款10所述的组合物,其中所述荧光标记物是选自由以下组成的组的染料:DyLightTM 350、DyLightTM 405、DyLightTM 488、DyLightTM 550、DyLightTM 594、DyLightTM 633、DyLightTM 650、DyLightTM 680、DyLightTM 755和DyLightTM 800。
13.根据条款1-12所述的组合物,其中所述间隔分子是带负电荷或中性的。
14.根据条款1-13所述的组合物,其中所述间隔分子选自乙酸酯和聚乙二醇(PEG)。
15.根据条款1-12所述的组合物,其中所述间隔分子包含乙酰基。
16.根据条款1-14所述的组合物,其中所述间隔分子包含乙酸酯分子。
17.根据条款16所述的组合物,其中所述乙酸酯分子是磺基-NHS-乙酸酯。
18.根据条款1-17所述的组合物,其中所述间隔分子包含(PEG)n或由(PEG)n组成,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
19.根据条款1-17所述的组合物,其中所述间隔分子包含MS-(PEG)n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
20.根据条款1-19所述的组合物,其中所述间隔分子包含选自烷酰基、烯酰基和炔酰基(-C(O)CnHm的基团或由所述基团组成,其中n是1至20个原子,其中m>n,其中所述碳原子可以通过单键、双键和/或三键相互连接。
21.根据条款20所述的组合物,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR取代,其中x是1至20,y是1至6,R是H或C1-6烷基。
22.根据条款21所述的组合物,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被铵(-NH3 +)、季铵((-NR3 +)基团取代,其中R是C1-6烷基。
23.根据条款1-22所述的组合物,其中所述荧光染料包含一个或多个 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610-X、633、647、660、680、700、 750、790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、 488、 514、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、或7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE),并且来自由DyLightTM350、DyLightTM 405、DyLightTM 488、DyLightTM 550、DyLightTM 594、DyLightTM 633、DyLightTM 650、DyLightTM 680、DyLightTM 755和DyLightTM 80组成的组;并且所述间隔分子包含以下中的一个或多个:磺基-NHS-乙酸酯;(PEG)n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15;MS-(PEG)n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15;烷酰基、烯酰基或炔酰基(-C(O)CnHm),其中n是1至20个原子,其中m>n,其中所述碳原子可以通过单键、双键和/或三键相互连接;或烷基、烯基或炔基进一步被-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR取代,其中x是1至20,y是1至6,R是H或C1-6烷基,或其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被铵(-NH3 +)、季铵((-NR3 +)基团取代,其中R是C1-6烷基。
24.根据条款23所述的组合物,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被鏻基团(-PQ3 +)取代,其中Q是芳基、取代的芳基或C1-6烷基。
25.根据条款1-24所述的组合物,其中荧光标记物与抗体的比率为1至50。
26.根据条款25所述的组合物,其中荧光标记物与抗体的比率为5至30。
27.根据条款25所述的组合物,其中荧光标记物与抗体的比率为1至20。
28.根据条款1-27所述的组合物,其中所述间隔分子与抗体的比率为1至50。
29.根据条款28所述的组合物,其中所述间隔分子与抗体的比率为5至30。
30.根据条款28所述的组合物,其中所述间隔分子与抗体的比率为5至30。
31.根据条款28所述的组合物,其中所述间隔分子与抗体的比率为1至20。
32.根据条款1-31所述的组合物,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物0.1至25、1至15或2.5至10倍的量摩尔过量的。
33.根据条款32所述的组合物,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物2.5倍的量摩尔过量的。
34.根据条款33所述的组合物,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物5倍的量摩尔过量的。
35.根据条款33所述的组合物,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物7.5倍的量摩尔过量的。
36.根据条款33所述的组合物,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物10倍的量摩尔过量的。
37.根据条款33所述的组合物,其中所述抗体上由所述多个荧光标记物占据的结合位点的百分比为1%至99%。
38.根据条款1-37所述的组合物,其中所述间隔分子的存在使所述荧光标记物的可检测的萤光增加至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。
39.一种用于增加荧光标记的生物分子的萤光的方法,所述方法包含:
(a)将间隔分子与生物分子缀合;和
(b)将荧光标记物与生物分子缀合;和
其中步骤(a)和(b)可以同时或以任何顺序进行,和
其中所述间隔物和荧光标记物彼此不缀合。
40.根据条款39所述的方法,其中与不存在所述间隔分子时的猝灭相比,所述间隔分子减少所述荧光标记物的猝灭。
41.根据条款39所述的方法,其中所述间隔分子通过反应性基团与所述抗体缀合。
42.根据条款41所述的方法,其中所述反应性基团是胺基。
43.根据条款42所述的方法,其中所述胺基在赖氨酸残基上。
44.根据条款39-43所述的方法,其中所述荧光标记物带正电荷。
45.根据条款39-43所述的方法,其中所述荧光染料物是选自和DyLightTM。
46.根据条款39-43所述的方法,其中所述荧光标记物选自由以下组成的组:350、405、430、488、500、514、532、546、 555、568、594、610-X、 633、647、660、680、700、750、790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、、二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、、 488、514、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、和7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE)。
47.根据条款39-43和45所述的方法,其中所述荧光标记物选自由以下组成的组:DyLightTM 350、DyLightTM 405、DyLightTM 488、DyLightTM 550、DyLightTM 594、DyLightTM633、DyLightTM 650、DyLightTM 680、DyLightTM 755和DyLightTM 800。
48.根据条款39-43所述的方法,其中所述间隔分子是带负电荷或中性的。
49.根据条款39-43所述的方法,其中所述间隔分子选自乙酸酯和聚乙二醇(PEG)。
50.根据条款39-48所述的方法,其中所述间隔分子包含乙酰基。
51.根据条款39-49所述的方法,其中所述间隔分子包含乙酸酯分子。
52.根据条款51所述的方法,其中所述乙酸酯分子是磺基-NHS-乙酸酯。
53.根据条款39-52所述的方法,其中所述间隔分子包含(PEG)n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
54.根据条款39-52所述的方法,其中所述间隔分子包含MS-(PEG)n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
55.根据条款39-48所述的方法,其中所述间隔分子包含选自烷酰基、烯酰基和炔酰基(-C(O)CnHm)的基团,其中n是1至20个原子,其中m>n,其中所述碳原子可以通过单键、双键和/或三键相互连接。
56.根据条款39-48所述的方法,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR取代,其中x是1至20,y是1至6,R是H或C1-6烷基。
57.根据条款55所述的方法,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被铵(-NH3 +)、季铵((-NR3 +)基团取代,其中R是C1-6烷基。
58.根据条款55所述的方法,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被鏻基团(-PQ3 +)取代,其中Q是芳基、取代的芳基或C1-6烷基。
59.根据条款39-58所述的方法,其中荧光标记物与抗体的比率为1至50。
60.根据条款59所述的方法,其中荧光标记物与抗体的比率为5至30。
61.根据条款59所述的方法,其中荧光标记物与抗体的比率为1至20。
62.根据条款39-61所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为1至50。
63.根据条款62所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为5至30。
64.根据条款62所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为5至30。
65.根据条款62所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为1至20。
66.根据条款39-65所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物0.1至25、1至15或2.5至10倍的量摩尔过量的。
67.根据条款66所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物2.5倍的量摩尔过量的。
68.根据条款66所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物5倍的量摩尔过量的。
69.根据条款66所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物7.5倍的量摩尔过量的。
70.根据条款66所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物10倍的量摩尔过量的。
71.根据条款39-70所述的方法,其中所述抗体上由所述多个荧光标记物占据的结合位点的百分比为1%至99%。
72.根据条款39-71所述的方法,其中所述间隔分子的存在使所述荧光标记物的可检测的萤光增加至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。
73.一种鉴定能够增强荧光标记的生物分子荧光发射的间隔分子的方法,所述方法包含:
(a)独立于与所述生物分子缀合的多个荧光标记物,将间隔分子与生物分子缀合;
(b)测试除了与所述生物分子缀合的所述多个荧光标记物之外是否存在所述间隔分子增加了所述多个荧光标记物的可检测荧光;和
(c)除了与所述生物分子缀合的所述多个荧光标记物之外,当所述间隔分子的存在增加了所述多个荧光标记物的可检测荧光时,将所述间隔分子鉴定为将减少与所述蛋白质缀合的所述荧光标记物的猝灭的间隔分子。
74.根据条款73所述的方法,其中所述间隔分子在所述生物分子上存在的初级赖氨酸侧链与所述生物分子缀合。
75.根据条款73-74所述的方法,其中所述生物分子是抗体或抗体片段。
76.根据条款73-75所述的方法,其中所述多个荧光标记物带正电荷。
77.根据条款73-76所述的方法,其中所述间隔分子带正电荷。
78.根据条款73-74所述的方法,其中所述多个荧光标记物带负电荷。
79.根据条款73-76所述的方法,其中所述间隔分子带负电荷。
80.根据条款73-79所述的方法,其中所述多个荧光标记物是选自 和DyLightTM分子的染料。
81.根据条款73-79所述的方法,其中所述多个荧光标记物是选自 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610-X、633、647、660、680、700、 750、790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、 488、 514、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、和7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE)。
82.根据条款73-80所述的方法,其中所述多个荧光标记物是选自DyLightTM 350、DyLightTM 405、DyLightTM 488、DyLightTM 550、DyLightTM 594、DyLightTM 633、DyLightTM650、DyLightTM 680、DyLightTM 755和DyLightTM 800。
83.根据条款73-82所述的方法,其中所述间隔分子是选自乙酸酯和PEG。
84.根据条款73-83所述的方法,其中所述多个荧光标记物通过缀合分子与所述抗体缀合。
85.根据条款73-84所述的方法,其中所述多个荧光标记物在初级赖氨酸侧链与所述抗体缀合。
86.根据条款85所述的方法,其中所述间隔分子在初级赖氨酸侧链与所述抗体缀合。
87.根据条款73-86所述的方法,其中所述多个荧光标记物与所述抗体的所述染料与蛋白质的比率为1至50。
88.根据条款87所述的方法,其中所述多个荧光标记物与所述抗体的所述染料与蛋白质的比率为5至30。
89.根据条款87所述的方法,其中所述多个荧光标记物与所述抗体的所述染料与蛋白质的比率为1至20。
90.根据条款73-88所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为1至50。
91.根据条款90所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为5至30。
92.根据条款90所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为5至30。
93.根据条款90所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为1至20。
94.根据条款73-89所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物0.1至25、1至15或2.5至10倍的量摩尔过量的。
95.根据条款94所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物2.5倍的量摩尔过量的。
96.根据条款94所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物5倍的量摩尔过量的。
97.根据条款94所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物7.5倍的量摩尔过量的。
98.根据条款94所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物10倍的量摩尔过量的。
99.根据条款73-98所述的方法,其中所述抗体上由所述多个荧光标记物占据的结合位点的百分比为1%至99%。
100.根据条款99所述的方法,其中所述间隔分子的存在使所述荧光标记物的可检测的萤光增加至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。
101.一种用于确定在生物样品中存在所需目标的方法,所述方法包含:
(a)使所述生物样品与抗体组合物接触,其中两个或更多个荧光标记物和两个或更多个间隔分子共价连接至所述抗体,其中所述荧光分子和间隔分子彼此不共价连接,
(b)检测由所述多个荧光标记物发射的荧光;和
(c)当检测到由所述多个荧光标记物发射的荧光时,确定所述生物样品中存在所述所需目标。
102.根据条款101所述的方法,其中所述生物样品包含细胞裂解物。
103.根据条款101所述的方法,其中所述生物样品包含完整的细胞。
104.根据条款101所述的方法,其中所述生物样品包含分离的蛋白质。
105.根据条款101所述的方法,其中所述生物样品包含重组蛋白质。
106.根据条款101-105所述的方法,其中所述生物样品固定在固体支撑物上。
107.根据条款101所述的方法,其中所述生物样品包含流体中的完整细胞。
108.根据条款101所述的方法,其中所述生物样品是活动物。
109.根据条款108所述的方法,其中所述活动物是哺乳动物。
110.一种包含第一核酸分子的组合物,其中两个或更多个荧光标记物和两个或更多个间隔分子共价连接至所述第一核酸分子,并且其中所述萤光分子和间隔分子彼此不共价连接。
111.根据条款110所述的组合物,其中所述第一核酸分子表现出高于用等量荧光标记物但没有间隔分子制备的第二核酸分子的荧光发射水平。
112.根据条款110所述的组合物,其中所述第一核酸分子表现出比第二核酸分子更高的荧光发射水平,其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子各自具有相同数量的共价结合的荧光标记物,并且其中所述第二核酸分子不具有共价结合的间隔分子。
113.一种包含与多个荧光标记物缀合的抗体的缀合抗体,其中所述缀合抗体包含以下特征中的一个或多个:
(a)基于每个荧光标记物的荧光比率等于或大于0.5,
(b)至少四个荧光标记物与所述抗体缀合,和/或
(c)所述抗体的总荧光比未缀合的荧光分子的荧光高至少20%。
114.根据条款113所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物通过一个或多个多臂聚合物与所述抗体缀合。
115.根据条款113-114所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物通过一个多臂聚合物与所述抗体缀合。
116.根据条款113和114所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物通过两个至十个多臂聚合物与所述抗体缀合。
117.根据条款116所述的缀合抗体,其中两个或更多个荧光标记物与所述抗体缀合。
118.根据条款113-117所述的缀合抗体,其中所述多臂聚合物的臂由选自由以下组成的组的类型的化学物质构成:
(a)聚乙二醇,
(b)多糖,和
(c)多肽。
119.根据条款113-118所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物之间的平均刷子距离是200至800埃。
120.根据条款113-119所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物与所述抗体分隔开至少16个共价键。
121.根据条款120所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物与所述抗体分隔开16至800个共价键。
122.根据条款120所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物是选自由以下组成的组的染料:350、405、430、 488、500、514、532、546、555、568、594、610-X、633、647、660、680、700、750、790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、、二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、 488、514、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、或7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE);和来自由以下组成的组的荧光标记物:DyLightTM 350、DyLightTM 405、DyLightTM 488、DyLightTM 550、DyLightTM 594、DyLightTM 633、DyLightTM 650、DyLightTM 680、DyLightTM755和DyLightTM 800以及聚乙二醇化DyLightTM染料。
123.一种制备荧光标记的生物分子的方法,所述方法包含:
(a)将反应性基团和两个或更多个荧光标记物缀合到间隔分子上,从而形成荧光标记的间隔分子,和
(b)将所述荧光标记的间隔分子与所述生物分子缀合,从而形成所述荧光标记的生物分子,和
其中所述荧光标记的生物分子的各个荧光标记物具有基于每个荧光标记物等于或大于0.5的荧光比率。
124.根据条款123所述的方法,其中平均1至10个荧光标记的间隔分子与每个生物分子缀合。
125.根据条款123所述的方法,其中平均3至10个荧光标记的间隔分子与每个生物分子缀合。
126.根据条款123-125所述的方法,其中所述荧光标记的间隔分子是多臂聚合物。
127.根据条款126所述的方法,其中多臂聚合物是分支聚乙二醇分子。
128.根据条款126所述的方法,其中所述多臂聚合物与4至10个荧光标记物缀合。
129.根据条款126所述的方法,其中所述多臂聚合物的分子量为4,000至80,000道尔顿。
130.一种检测荧光标记的生物分子的方法,所述方法包含:
(a)用激发与所述生物分子缀合的荧光标记物的光暴露所述荧光标记的生物分子和
(b)检测由与所述生物分子缀合的所述荧光标记物产生的发射光,
其中所述荧光标记的生物分子与四个或更多个荧光标记物缀合和
其中所述荧光标记的生物分子的各个荧光标记物具有基于每个荧光标记物等于或大于0.7的荧光比率。
131.根据条款130所述的方法,其中所述荧光标记的生物分子是抗体。
Claims (131)
1.一种包含第一抗体的组合物,
其中两个或更多个荧光标记物和两个或更多个间隔分子共价连接到所述第一抗体,和
其中所述荧光标记物和间隔分子彼此不共价连接。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第一抗体表现出高于用等量荧光标记物但没有所述间隔分子制备的第二抗体的荧光发射水平。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第一抗体表现出高于第二抗体的荧光发射水平,其中所述第一抗体和所述第二抗体各自具有相同数量的共价结合的荧光标记物,并且其中所述第二抗体不具有共价结合的间隔分子。
4.根据权利要求1所述的组合物,其中与不存在所述间隔分子时的猝灭相比,所述间隔分子减少所述荧光标记物的猝灭。
5.根据权利要求1所述的组合物,其中所述间隔分子通过反应性基团与所述抗体缀合。
6.根据权利要求5所述的组合物,其中所述反应性基团是胺基。
7.根据权利要求6所述的组合物,其中所述胺基在赖氨酸残基上。
8.根据权利要求1所述的组合物,其中所述荧光标记物通过缀合分子与所述抗体缀合。
9.根据权利要求1所述的组合物,其中所述荧光标记物带正电荷。
10.根据权利要求1所述的组合物,其中所述荧光标记物是Alexa染料或DyLightTM染料。
11.根据权利要求1所述的组合物,其中所述荧光标记物是选自由以下组成的组的染料:Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa 488、Alexa500、Alexa514、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa610- X、Alexa633、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、Alexa790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、Cascade二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、Marina Oregon488、Oregon514、PacificBlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、RhodamineRedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、Texas或7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE)。
12.根据权利要求1所述的组合物,其中所述荧光标记物是选自由以下组成的组的染料:DyLightTM350、DyLightTM405、DyLightTM488、DyLightTM550、DyLightTM594、DyLightTM633、DyLightTM650、DyLightTM680、DyLightTM755和DyLightTM800。
13.根据权利要求1所述的组合物,其中所述间隔分子是带负电荷或中性的。
14.根据权利要求1所述的组合物,其中所述间隔分子选自乙酸酯和聚乙二醇(PEG)。
15.根据权利要求1所述的组合物,其中所述间隔分子包含乙酰基。
16.根据权利要求1所述的组合物,其中所述间隔分子包含乙酸酯分子。
17.根据权利要求1所述的组合物,其中所述乙酸酯分子是磺基-NHS-乙酸酯。
18.根据权利要求1所述的组合物,其中所述间隔分子包含(PEG)n或由(PEG)n组成,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
19.根据权利要求1所述的组合物,其中所述间隔分子包含MS-(PEG)n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
20.根据权利要求1所述的组合物,其中所述间隔分子包含选自烷酰基、烯酰基和炔酰基(-C(O)CnHm)的基团或由所述基团组成,其中n是1至20个原子,其中m>n,其中所述碳原子可以通过单键、双键和/或三键相互连接。
21.根据权利要求1所述的组合物,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR取代,其中x是1至20,y是1至6,R是H或C1-6烷基。
22.根据权利要求21所述的组合物,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被铵(-NH3 +)、季铵((-NR3 +)基团取代,其中R是C1-6烷基。
23.根据权利要求1所述的组合物,其中所述荧光染料包含一个或多个Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa 500、Alexa514、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa610-X、Alexa633、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、Alexa790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、Cascade二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、MarinaOregon488、Oregon514、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、Texas或7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE),和来自由以下组成的组:DyLightTM350、DyLightTM405、DyLightTM488、DyLightTM550、DyLightTM594、DyLightTM633、DyLightTM650、DyLightTM680、DyLightTM755和DyLightTM80;和
所述间隔分子包含以下中的一个或多个:磺基-NHS-乙酸酯;(PEG)n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15;MS-(PEG)n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15;烷酰基、烯酰基或炔酰基(-C(O)CnHm),其中n是1至20个原子,其中m>n,其中所述碳原子可以通过单键、双键和/或三键相互连接;或烷基、烯基或炔基进一步被-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR取代,其中x是1至20,y是1至6,R是H或C1-6烷基,或其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被铵(-NH3 +)、季铵((-NR3 +)基团取代,其中R是C1-6烷基。
24.根据权利要求23所述的组合物,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被鏻基团(-PQ3 +)取代,其中Q是芳基、取代的芳基或C1-6烷基。
25.根据权利要求1所述的组合物,其中荧光标记物与抗体的比率为1至50。
26.根据权利要求25所述的组合物,其中荧光标记物与抗体的比率为5至30。
27.根据权利要求25所述的组合物,其中荧光标记物与抗体的比率为1至20。
28.根据权利要求1所述的组合物,其中所述间隔分子与抗体的比率为1至50。
29.根据权利要求28所述的组合物,其中所述间隔分子与抗体的比率为5至30。
30.根据权利要求28所述的组合物,其中所述间隔分子与抗体的比率为5至30。
31.根据权利要求28所述的组合物,其中所述间隔分子与抗体的比率为1至20。
32.根据权利要求1所述的组合物,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物0.1至25、1至15或2.5至10倍的量摩尔过量的。
33.根据权利要求32所述的组合物,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物2.5倍的量摩尔过量的。
34.根据权利要求33所述的组合物,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物5倍的量摩尔过量的。
35.根据权利要求33所述的组合物,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物7.5倍的量摩尔过量的。
36.根据权利要求33所述的组合物,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物10倍的量摩尔过量的。
37.根据权利要求33所述的组合物,其中所述抗体上由所述多个荧光标记物占据的结合位点的百分比为1%至99%。
38.根据权利要求1所述的组合物,其中所述间隔分子的存在使所述荧光标记物的可检测的萤光增加至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。
39.一种用于增加荧光标记的生物分子的萤光的方法,所述方法包含:
(a)将间隔分子与生物分子缀合;和
(b)将荧光标记物与所述生物分子缀合;
其中步骤(a)和(b)可以同时或以任何顺序进行,和
其中所述间隔物和荧光标记物彼此不缀合。
40.根据权利要求39所述的方法,其中与不存在所述间隔分子时的猝灭相比,所述间隔分子减少所述荧光标记物的猝灭。
41.根据权利要求39所述的方法,其中所述间隔分子通过反应性基团与所述抗体缀合。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述反应性基团是胺基。
43.根据权利要求42所述的方法,其中所述胺基在赖氨酸残基上。
44.根据权利要求39所述的方法,其中所述荧光标记物带正电荷。
45.根据权利要求39所述的方法,其中所述荧光染料选自Alexa和DyLightTM。
46.根据权利要求39所述的方法,其中所述荧光标记物选自由以下组成的组:Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa500、Alexa514、Alexa532、Alexa546、Alexa 555、Alexa568、Alexa594、Alexa610-X、Alexa 633、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、Alexa790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、Cascade二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、MarinaOregon 488、Oregon514、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、Texas和7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE)。
47.根据权利要求39所述的方法,其中所述荧光标记物选自由以下组成的组:DyLightTM350、DyLightTM405、DyLightTM488、DyLightTM550、DyLightTM594、DyLightTM633、DyLightTM650、DyLightTM680、DyLightTM755和DyLightTM800。
48.根据权利要求39所述的方法,其中所述间隔分子是带负电荷或中性的。
49.根据权利要求39所述的方法,其中所述间隔分子选自乙酸酯和聚乙二醇(PEG)。
50.根据权利要求39所述的方法,其中所述间隔分子包含乙酰基。
51.根据权利要求39所述的方法,其中所述间隔分子包含乙酸酯分子。
52.根据权利要求39所述的方法,其中所述乙酸酯分子是磺基-NHS-乙酸酯。
53.根据权利要求39所述的方法,其中所述间隔分子包含(PEG)n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
54.根据权利要求39所述的方法,其中所述间隔分子包含MS-(PEG)n,其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
55.根据权利要求39所述的方法,其中所述间隔分子包含选自烷酰基、烯酰基和炔酰基(-C(O)CnHm的基团,其中n是1至20个原子,其中m>n,其中所述碳原子可以通过单键、双键和/或三键相互连接。
56.根据权利要求55所述的方法,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR取代,其中x是1至20,y是1至6,R是H或C1-6烷基。
57.根据权利要求55所述的方法,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被铵(-NH3 +)、季铵((-NR3 +)基团取代,其中R是C1-6烷基。
58.根据权利要求55所述的方法,其中所述烷基、烯基和/或炔基进一步被鏻基团(-PQ3 +)取代,其中Q是芳基、取代的芳基或C1-6烷基。
59.根据权利要求39所述的方法,其中荧光标记物与抗体的比率为1至50。
60.根据权利要求59所述的方法,其中荧光标记物与抗体的比率为5至30。
61.根据权利要求59所述的方法,其中荧光标记物与抗体的比率为1至20。
62.根据权利要求39所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为1至50。
63.根据权利要求62所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为5至30。
64.根据权利要求62所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为5至30。
65.根据权利要求62所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为1至20。
66.根据权利要求39所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物0.1至25、1至15或2.5至10倍的量摩尔过量的。
67.根据权利要求66所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物2.5倍的量摩尔过量的。
68.根据权利要求66所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物5倍的量摩尔过量的。
69.根据权利要求66所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物7.5倍的量摩尔过量的。
70.根据权利要求66所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物10倍的量摩尔过量的。
71.根据权利要求39所述的方法,其中所述抗体上由所述多个荧光标记物占据的结合位点的百分比为1%至99%。
72.根据权利要求39所述的方法,其中所述间隔分子的存在使所述荧光标记物的可检测的萤光增加至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。
73.一种鉴定能够增强荧光标记的生物分子荧光发射的间隔分子的方法,所述方法包含:
(a)独立于与所述生物分子缀合的多个荧光标记物,将间隔分子与生物分子缀合;
(b)测试除了与所述生物分子缀合的所述多个荧光标记物之外是否存在所述间隔分子增加了所述多个荧光标记物的可检测荧光;和
(c)除了与所述生物分子缀合的所述多个荧光标记物之外,当所述间隔分子的存在增加了所述多个荧光标记物的可检测荧光时,将所述间隔分子鉴定为将减少与所述蛋白质缀合的所述荧光标记物的猝灭的间隔分子。
74.根据权利要求73所述的方法,其中所述间隔分子在所述生物分子上存在的初级赖氨酸侧链与所述生物分子缀合。
75.根据权利要求73所述的方法,其中所述生物分子是抗体或抗体片段。
76.根据权利要求73所述的方法,其中所述多个荧光标记物带正电荷。
77.根据权利要求73所述的方法,其中所述间隔分子带正电荷。
78.根据权利要求73所述的方法,其中所述多个荧光标记物带负电荷。
79.根据权利要求73所述的方法,其中所述间隔分子带负电荷。
80.根据权利要求73所述的方法,其中所述多个荧光标记物是选自Alexa 和DyLightTM分子的染料。
81.根据权利要求73所述的方法,其中所述多个荧光标记物选自Alexa 350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa500、Alexa514、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa610-X、Alexa633、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa 750、Alexa790、AMCA-X、630/650、 650/665、FL、TMR、TR、TR-X、Cascade二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、MarinaOregon488、Oregon514、Pacific BlueTM、Pacific OrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、Rhodamine RedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、Texas和7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE)。
82.根据权利要求73所述的方法,其中所述多个荧光标记物选自DyLightTM350、DyLightTM405、DyLightTM488、DyLightTM550、DyLightTM594、DyLightTM633、DyLightTM650、DyLightTM680、DyLightTM755和DyLightTM800。
83.根据权利要求73所述的方法,其中所述间隔分子是选自乙酸酯和PEG。
84.根据权利要求73所述的方法,其中所述多个荧光标记物通过缀合分子与所述抗体缀合。
85.根据权利要求73所述的方法,其中所述多个荧光标记物在初级赖氨酸侧链与所述抗体缀合。
86.根据权利要求73所述的方法,其中所述间隔分子在初级赖氨酸侧链与所述抗体缀合。
87.根据权利要求73所述的方法,其中所述多个荧光标记物与所述抗体的所述染料与蛋白质的比率为1至50。
88.根据权利要求87所述的方法,其中所述多个荧光标记物与所述抗体的所述染料与蛋白质的比率为5至30。
89.根据权利要求87所述的方法,其中所述多个荧光标记物与所述抗体的所述染料与蛋白质的比率为1至20。
90.根据权利要求73所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为1至50。
91.根据权利要求90所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为5至30。
92.根据权利要求90所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为5至30。
93.根据权利要求90所述的方法,其中所述间隔分子与蛋白质的比率为1至20。
94.根据权利要求73所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物0.1至25、1至15或2.5至10倍的量摩尔过量的。
95.根据权利要求94所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物2.5倍的量摩尔过量的。
96.根据权利要求94所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物5倍的量摩尔过量的。
97.根据权利要求94所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物7.5倍的量摩尔过量的。
98.根据权利要求94所述的方法,其中所述间隔分子是以相对于所述多个荧光标记物10倍的量摩尔过量的。
99.根据权利要求73所述的方法,其中所述抗体上由所述多个荧光标记物占据的结合位点的百分比为1%至99%。
100.根据权利要求99所述的方法,其中所述间隔分子的存在使所述荧光标记物的可检测的萤光增加至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。
101.一种用于确定在生物样品中存在所需目标的方法,所述方法包含:
(a)使所述生物样品与抗体组合物接触,其中两个或更多个荧光标记物和两个或更多个间隔分子共价连接至所述抗体,其中所述荧光分子和间隔分子彼此不共价连接,
(b)检测由所述多个荧光标记物发射的荧光;和
(c)当检测到由所述多个荧光标记物发射的荧光时,确定所述生物样品中存在所述所需目标。
102.根据权利要求101所述的方法,其中所述生物样品包含细胞裂解物。
103.根据权利要求101所述的方法,其中所述生物样品包含完整的细胞。
104.根据权利要求101所述的方法,其中所述生物样品包含分离的蛋白质。
105.根据权利要求101所述的方法,其中所述生物样品包含重组蛋白质。
106.根据权利要求101所述的方法,其中所述生物样品固定在固体支撑物上。
107.根据权利要求101所述的方法,其中所述生物样品包含流体中的完整细胞。
108.根据权利要求101所述的方法,其中所述生物样品是活动物。
109.根据权利要求108所述的方法,其中所述活动物是哺乳动物。
110.一种包含第一核酸分子的组合物,
其中两个或更多个荧光标记物和两个或更多个间隔分子共价连接到所述第一核酸分子,和
其中所述荧光分子和间隔分子彼此不共价连接。
111.根据权利要求110所述的组合物,其中所述第一核酸分子表现出高于用等量荧光标记物但没有所述间隔分子制备的第二核酸分子的荧光发射水平。
112.根据权利要求110所述的组合物,其中所述第一核酸分子表现出比第二核酸分子更高的荧光发射水平,其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子各自具有相同数量的共价结合的荧光标记物,并且其中所述第二核酸分子不具有共价结合的间隔分子。
113.一种包含与多个荧光标记物缀合的抗体的缀合抗体,其中所述缀合抗体包含以下特征中的一个或多个:
(a)基于每个荧光标记物的荧光比率等于或大于0.5,
(b)至少四个荧光标记物与所述抗体缀合,和/或
(c)所述抗体的总荧光比未缀合的荧光分子的荧光高至少20%。
114.根据权利要求113所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物通过一个或多个多臂聚合物与所述抗体缀合。
115.根据权利要求114所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物通过一个多臂聚合物与所述抗体缀合。
116.根据权利要求114所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物通过两个至十个多臂聚合物与所述抗体缀合。
117.根据权利要求116所述的缀合抗体,其中两个或更多个荧光标记物与所述抗体缀合。
118.根据权利要求113所述的缀合抗体,其中所述多臂聚合物的臂由选自由以下组成的组的类型的化学物质构成:
(a)聚乙二醇,
(b)多糖,和
(c)多肽。
119.根据权利要求113所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物之间的平均刷子距离是200至800埃。
120.根据权利要求113所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物与所述抗体分隔开至少16个共价键。
121.根据权利要求120所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物与所述抗体分隔开16至800个共价键。
122.根据权利要求120所述的缀合抗体,其中所述荧光标记物是选自由以下组成的组的染料:Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa500、Alexa514、Alexa532、Alexa 546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa610-X、Alexa633、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、Alexa790、AMCA-X、630/650、650/665、FL、TMR、TR、TR-X、Cascade二硝基苯基、荧光素、HEX、JOE、MarinaOregon488、Oregon514、Pacmc BlueTM、PacificOrangeTM、Rhodamine GreenTM、7、9、21、35、ROX、RhodamineRedTM、TET、TAMRA、四甲基罗丹明、FAM、Texas或7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE);和来自由以下组成的组的荧光标记物:DyLightTM350、DyLightTM405、DyLightTM488、DyLightTM550、DyLightTM594、DyLightTM633、DyLightTM650、DyLightTM680、DyLightTM755和DyLightTM800以及聚乙二醇化DyLightTM染料。
123.一种制备荧光标记的生物分子的方法,所述方法包含:
(a)将反应性基团和两个或更多个荧光标记物缀合到间隔分子上,从而形成荧光标记的间隔分子,和
(b)将所述荧光标记的间隔分子与所述生物分子缀合,从而形成所述荧光标记的生物分子,
以及
其中所述荧光标记的生物分子的各个荧光标记物具有基于每个荧光标记物等于或大于0.5的荧光比率。
124.根据权利要求123所述的方法,其中平均1至10个荧光标记的间隔分子与每个生物分子缀合。
125.根据权利要求123所述的方法,其中平均3至10个荧光标记的间隔分子与每个生物分子缀合。
126.根据权利要求123所述的方法,其中所述荧光标记的间隔分子是多臂聚合物。
127.根据权利要求126所述的方法,其中多臂聚合物是分支聚乙二醇分子。
128.根据权利要求126所述的方法,其中所述多臂聚合物与4至10个荧光标记物缀合。
129.根据权利要求126所述的方法,其中所述多臂聚合物的分子量为4,000至80,000道尔顿。
130.一种检测荧光标记的生物分子的方法,所述方法包含:
(a)用激发与所述生物分子缀合的荧光标记物的光暴露所述荧光标记的生物分子,和
(b)检测由与所述生物分子缀合的所述荧光标记物产生的发射光,
其中所述荧光标记的生物分子与四个或更多个荧光标记物缀合和
其中所述荧光标记的生物分子的各个荧光标记物具有基于每个荧光标记物等于或大于0.7的荧光比率。
131.根据权利要求130所述的方法,其中所述荧光标记的生物分子是抗体。
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