CN101827946A - 快速蛋白质标记和分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于标记、分离和分析蛋白质(特别是细胞裂解物内或蛋白质混合物中的特定目的蛋白质)的方法和组合物。用氨基反应性或巯基反应性荧光染料，或氨基反应性荧光试剂(其在与位于蛋白质上的胺基反应后发出荧光)标记蛋白质。标记步骤之后，可以分离和分析混合物内的蛋白质。在进一步的实施方案中，添加可以与带标签的蛋白质上的标签结合的标签结合荧光试剂，以特异性标记目的蛋白质。

Description

快速蛋白质标记和分析
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年5月18日提交的美国临时申请60/938,973的优先权，所述申请以其全文通过引用并入本文(达到与本公开内容没有不一致的程度)。
发明背景
本发明涉及蛋白质的标记和使用分离技术(包括电泳和色谱法)分析此类经标记的蛋白质。
发明概述
本发明提供用于标记、分离和分析蛋白质(特别是细胞裂解物内或蛋白质混合物中的特定目的蛋白质)的方法和组合物。在一个实施方案中，用氨基反应性(amine reactive)或巯基反应性(thiolreactive)荧光染料标记一种或多种蛋白质。在另一个实施方案中，用当与位于蛋白质上的胺基(amine group)反应时发出荧光的氨基反应性荧光试剂标记一种或多种蛋白质。标记步骤之后，可以分离和分析混合物内的蛋白质。在进一步的实施方案中，第一标记化合物(其可以是荧光染料或荧光试剂)用于标记混合物内的所有蛋白质，且第二标记化合物(能与带标签的蛋白质结合的荧光试剂)用于特异性标记目的蛋白质。
标记后，此类经标记的蛋白质和/或蛋白质片段通过使用技术(包括但不限于电泳技术，色谱技术，免疫印迹法，质谱法，和其组合)进行分离，检测和分析。此类方法可用于标记和分析蛋白质样品，例如酸性蛋白质，碱性蛋白质，经纯化的蛋白质或裂解物的样品。本方法具有高灵敏度且检测的线性范围宽。此类方法可重复并且快速，并减少了背景染色和其他非特异性伪迹(artifact)，并且对样品蛋白质的电泳迁移，色谱洗脱或分辨没有任何视觉上可检测的影响。
一个实施方案提供了用于蛋白质标记和分析的方法，其包括通过将蛋白质混合物与组合物(其包含pH在pH 8与pH 10之间的第一缓冲剂，氨基反应性荧光试剂，以及丙酮氰醇、腈或碱性氰化物之一)混合形成第一反应混合物。该反应混合物在第一温度温育第一温育时间，然后与第二缓冲剂混合以形成第二反应混合物。第二缓冲剂pH在pH 6和pH 9之间并且任选地具有大于第一缓冲剂的缓冲容量，以使第二反应混合物的pH在pH 6和pH 9之间。然后第二反应混合物在第二温度(第二温度可以与第一温度相同或不同)温育第二温育时间(第二温育时间也可以与第一温育时间相同或不同)。然后将荧光标记的蛋白质分离和显现。任选地，第一反应混合物还包含阴离子表面活性剂，糖或糖醇，或烷化剂。任选地，第二反应混合物还包含一种或多种还原剂。
在进一步的实施方案中，蛋白质混合物还包含带标签的目的蛋白质并且第二缓冲剂进一步包含标签结合荧光试剂，所述试剂与带标签的蛋白质上的标签结合。氨基反应性荧光试剂具有第一发射波长而标签结合荧光试剂具有第二发射波长。发射波长是不同的，从而允许比较和分析波长。
另一实施方案提供了用于蛋白质标记和分析的方法，其包括通过将蛋白质混合物与第一组合物(其包含pH在pH 8与pH 10之间的第一缓冲剂，以及氨基反应性荧光染料或标签结合荧光试剂)混合形成第一反应混合物。该反应混合物在第一温度温育第一温育时间，然后与第二组合物混合以形成第二反应混合物。第二组合物包含pH在pH 6和pH 10之间的第二缓冲剂，至少一种还原剂，以及氨基反应性荧光染料或者标签结合荧光试剂。如果第一组合物包含氨基反应性荧光染料，则第二组合物包含标签结合荧光试剂，并且如果第一组合物包含标签结合荧光试剂，则第二组合物包含氨基反应性荧光染料。然后第二反应混合物在第二温度(所述第二温度可以与第一温度相同或不同)温育第二温育时间(所述第二温育时间也可以与第一温育时间相同或不同)。然后将荧光标记的蛋白质分离和显现。氨基反应性荧光染料具有第一发射波长而标签结合荧光试剂具有第二发射波长。发射波长是不同的，从而允许比较和分析波长。
其他实施方案包括沉淀包含蛋白质混合物的样品，然后在本文描述的标记溶液中重构样品。该沉淀步骤可以除去存在于起始样品中的潜在干扰的或多余的(unwanted)化学组分。可选地，或除该沉淀步骤之外，所述蛋白质或蛋白质混合物在标记前进行烷基化，以消除任何还原剂对标记的负面影响。
另一实施方案提供了用于荧光标记蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括a)具有缓冲剂(pH为pH 8至pH 10)，氨基反应性荧光试剂或氨基反应性荧光染料，糖或糖醇，以及阴离子表面活性剂的第一组合物；和b)包含pH为pH 6至pH 10的第二缓冲剂的第二组合物。在其中第一组合物包含氨基反应性荧光试剂的进一步的实施方案中，第一组合物还包含丙酮氰醇，腈或碱性氰化物，优选腈例如苯乙醇腈。在进一步的实施方案中，第一组合物包含氨基反应性荧光染料。在进一步的实施方案中，第二组合物还包含标签结合荧光试剂(其与至少四半胱氨酸部分结合)和至少一种还原剂，其中氨基反应性荧光试剂或荧光染料具有第一发射波长，而标签结合荧光染料具有第二发射波长，并且第一发射波长和第二发射波长不同。
在示例性实施方案中，本文描述的用于蛋白质分析的方法和组合物使用平板凝胶电泳，不需要凝胶处理，或打开电泳夹盒(cassette)以进行凝胶染色和成像，从而允许快速、实时分析。
附图简介
图1为本文描述的使用氨基反应性荧光试剂的用于总蛋白质标记和分析的方法的一些实施方案的示意图。
图2为本文描述的使用氨基反应性荧光试剂的用于总蛋白质标记和分析的方法的一个实施方案的示意图。
图3为使用本文描述的标记和分析方法的用于蛋白质表达分析的方法的一些实施方案的示意图。
图4为使用本文描述的标记和分析方法的用于蛋白质表达分析的方法的一个实施方案的示意图。
图5A为使用本文描述的方法标记的蛋白质或蛋白质标准的凝胶图像，而图5B为用SimplyBlueTMSafeStain染色后图5A中所示的凝胶的图像。
图6阐明利用本文描述的蛋白质标记方法获得的检测灵敏度。图6A为利用本文描述的方法标记的蛋白质的凝胶图像，而图6B为用SimplyBlueTM SafeStain染色后图6A中所示的凝胶的图像。
图7用两种不同的检测仪器比较利用本文描述的蛋白质标记方法获得的检测灵敏度。图7A为利用本文描述的方法标记的BSA的凝胶图像，使用Fujifilm′s LAS-1000(477nm EPI光源，520-640nm带通滤光片(band pass filter)，60秒曝光时间)。图7B为使用SafeImagerTM透照仪(～470nm光源)和Kodak DC290数码相机(2.1MP，8秒曝光时间)获得的图像。图7C为使用SimplyBlueTM SafeStain进行总蛋白质染色后图7A和图7B中所示的凝胶的图像。
图8表示使用本文描述的方法在三个不同的标记时间标记大肠杆菌(E.coli)裂解物。图8A为使用Fujifilm′s LAS-1000(477nm EPI光源，520-640nm带通滤光片，30秒曝光时间)获得的大肠杆菌裂解物(还原的)的荧光凝胶图像。图8B为用SimplyBlueTM SafeStain染色后图8A中所示的凝胶的图像。
图9比较使用本文描述的方法进行的不同蛋白质的标记。图9A为凝胶图像(荧光和在SimplyBlueTM染色后)，第1道中为经标记的溶菌酶(还原的)，第2道中为SeeBlue
Figure G200880024991XD00041
Plus2Prestained Standard(Invitrogen，Carlsbad)，而图9B为凝胶图像(荧光和在SimplyBlueTM染色后)，第1道中为SeeBlue
Figure G200880024991XD00042
Plus2Prestained Standard(Invitrogen，Carlsbad)，第3道中为大鼠肝裂解物，第2道为空白。用Fujifilm′s LAS-1000(477nm EPI光源，520-640nm带通滤光片，30秒曝光时间)获得荧光图像。
图10表示h-IgG，肌红蛋白和BSA的天然标记。图10A为用SimplyBlueTM Safe Stain染色后的凝胶图像，而图10B为用本文描述的方法标记的h-IgG，肌红蛋白和BSA的凝胶图像。用Fujifilm′sLAS-1000(477nm EPI光源，520-640nm带通滤光片，1分钟曝光时间)获得荧光图像。
图11表示h-IgG，肌红蛋白，BSA和大肠杆菌裂解物在变性条件下标记(标记反应中存在LDS和蔗糖)后的荧光。上方的凝胶图像为用SimplyBlueTM Safe Stain染色后获得的，而下方的为用本文描述的方法标记的h-IgG，肌红蛋白，BSA和大肠杆菌裂解物的荧光凝胶图像。用Fujifilm′s LAS-1000(477nm EPI光源，520-640nm带通滤光片，1分钟曝光时间)获得荧光图像。
图12举例说明作为标记BSA(使用本文描述的方法)的反应物浓度和标记时间的函数的条带锐度和信号强度。上方的凝胶图像为如本文所述进行标记的BSA的荧光图像，而下方图像为用SimplyBlueTMSafe Stain染色后的凝胶。用Fujifilm′s LAS-1000(477nm EPI光源，520-640nm带通滤光片，1分钟曝光时间)获得荧光图像。
图13表示荧光过饱和，在高温下进行标记，和将标记的蛋白质暴露于低pH对在升高的温度下标记蛋白质的影响。
图14为在本文描述的方法中使用的电泳凝胶夹盒的一个实施方案的图示。
图15为在本文描述的方法中使用的电泳凝胶夹盒的一个实施方案的横截面。
图16表示在本文描述的方法中使用的一些电泳凝胶夹盒的口(aperture)和孔(well)的排列的实施方案。
图17为用473nm激发光(产生520nm发射光)获得的凝胶夹盒图像，并且显示用双砷试剂标记大肠杆菌裂解物中的目的蛋白质的特异性。
图18为用532nm激发光(产生580nm发射光)获得的凝胶夹盒图像，并且显示大肠杆菌裂解物的总蛋白质标记(使用BODIPY TR-X SE)。
图19为用633nm激发光(产生675nm发射光)获得的凝胶夹盒图像，并且显示大肠杆菌裂解物的总蛋白质标记(使用BODIPY 650/665SE)。
图20为用473nm激发光(产生520nm发射光)获得的图像，并且显示用双砷试剂标记大肠杆菌裂解物中的目的蛋白质的特异性。
图21为用532nm激发光(产生580nm发射光)获得的图像，并且显示大肠杆菌裂解物，哺乳动物细胞裂解物，蛋白质标准组和蛋白质梯(protein ladder)的总蛋白质标记(使用BODIPY TR-X SE)。
图22为用633nm激发光(产生675nm发射光)获得的图像，并且显示大肠杆菌裂解物，哺乳动物细胞裂解物，蛋白质标准组和蛋白质梯的总蛋白质标记(使用BODIPY 650/665SE)。
通过参考以下详细描述，可以更好地理解本方法和组合物的特征和优点，所述详细描述阐明了示例性实施方案(其中利用了本方法的原理，组合物，装置和仪器)和附图。
发明详述
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文使用的术语是公知的并且为本领域常用的。方位术语，例如″上″和″下″，″顶部″和″底部″，″上面″和″下面″或″上方″或″下方″等等，是指装置使用期间部分的方位。当以单数形式提供术语时，发明人还预期该术语的复数形式。当通过引用并入本文的参考文献中使用的定义和术语中存在矛盾时，本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。如贯穿本公开内容使用的，下列术语应理解为具有下列含义(除非另有说明)。
本文使用的术语″环境温度″指约20℃至约25℃范围内的温度。本文使用的术语″室温″，指约20℃至约25℃范围内的温度。
本文使用的术语″蛋白质″或″蛋白″包括全长蛋白质，蛋白质片段，天然状态的蛋白质或变性的蛋白质。蛋白质混合物可以为全长蛋白质的混合物，蛋白质片段的混合物，或全长蛋白质和蛋白质片段的混合物。蛋白质可以是酸性的或碱性的，并且可以纯化为来自细胞裂解物的混合物。
本文使用的术语″肽″指包括两个或更多个氨基酸的化合物。氨基酸连接在一起以形成肽链。存在20种参与肽的生物学产生的不同的天然存在的氨基酸，并且任意数目的这些氨基酸可以以任意顺序连接，从而形成肽链。肽的生物学产生中使用的天然存在的氨基酸都具有L-构型。可以使用常规的合成方法，用L-氨基酸，D-氨基酸或两中不同构型的氨基酸的不同组合制备合成的肽。一些肽链仅包含很少的氨基酸单位。短肽链(例如具有小于10个氨基酸单位的肽链)有时被称为″寡肽″，其中前缀″寡″表示″少″。其他的肽链包含许多氨基酸单位(例如多达100个或更多)并且被称为″多肽″，其中前缀″多″表示″很多″。包含固定数目的氨基酸单位的其他的肽链使用表示链中单位的固定数目的前缀，例如，八肽，其中前缀″八″表示八个。一般地，″多肽″可认为是包含三个或更多个氨基酸的任意肽链，而″寡肽″通常认为是特定种类的″短的″多肽链。因此，如本文使用的，应当理解，任何提及的″多肽″还包括寡肽。此外，任何提及的″肽″包括多肽，寡肽。氨基酸的各种不同的排列形成不同的多肽链。在一些非限制性实例中，多肽包括40-4000个，50-3000个，或75-2000个氨基酸。
本文使用的术语″荧光部分″的″荧光团″指固有地发出荧光的化合物，化学基团或组合物。荧光团可以包含改变荧光团的可溶性，光谱性质或物理性质的取代基。很多荧光团是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于香豆素，菁蓝，苯并呋喃，喹啉，喹唑酮，吲哚，呋喃，氮茚，borapolyazaindacene和夹氧杂蒽(包括荧光素，罗丹明和罗多尔)以及在RICHARD P.HAUGLAND，MOLECULAR PROBES HANDBOOKOF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(第9版，CD-ROM，2002年9月)中描述的其他荧光团。
本文使用的术语″荧光的(fluorogenic)″指这样的化合物，化学基团，或组合物，其在质子化，或与生物化合物或金属离子结合，或通过酶代谢后，发出荧光或在荧光方面发生变化。荧光化合物，基团或组合物还在与反应性基团共价连接时发出荧光。
本文使用的术语″标记的均一性″指标记蛋白质或蛋白质片段上存在的反应性位点的程度。
本文使用的术语″反应性基团″指能够与另一个化学基团反应以形成共价键的基团，即所述基团在适合的反应条件下是共价反应性的并且通常代表另一种物质连接的点。反应性基团通常包括亲核基团，亲电子基团和光敏基团(photoactivatable group)。示例性反应性基团包括但不限于，烯烃，乙炔，醇，酚，醚，氧化物，卤化物，醛，酮，羧酸，酯，酰胺，氰酸盐(酯)，异氰酸盐(酯)，硫氰酸盐(酯)，异硫氰酸盐(酯)，胺，肼，腙，酰肼，重氮基(diazo)，重氮基(diazonium)，硝基，腈，硫醇，硫化物，二硫化物，亚砜，砜，磺酸，亚磺酸，缩醛，缩酮，酐，硫酸盐(酯)，次磺酸，异腈，脒，酰亚胺，亚氨酸酯，硝酮，羟胺，肟，氧肟酸，thiohydroxamic acids，二烯烃，原酸酯，亚硫酸盐(酯)，烯胺，炔胺，脲，假脲，氨基脲，碳二亚胺，氨基甲酸盐(酯)，亚胺，叠氮化物，偶氮化合物，氧化偶氮化合物，和氧化偶氮化合物。反应性官能基团还包括用于制备生物缀合物(bioconjugate)，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯，马来酰亚胺等等的那些基团。用于制备这些官能团的方法在本领域中是公知的并且它们的应用或为了特定目的而进行的改进在本领域技术人员能力范围内(参见，例如，Sandler和Karo编，Organic Functional Group Preparations，Academic Press，San Diego，1989)。
本文使用的术语″可检测的应答″指信号的出现或变化，所述信号通过观察或通过仪器直接或间接可检测。一般地，可检测的应答为导致波长分布模式，或吸光或荧光强度的改变或光散射，荧光寿命，荧光偏振的改变，或上述参数的组合的光学应答。
本文使用的术语″染料″指发光以产生可观察到的可检测的信号的化合物。
本文使用的术语″试剂盒″指经包装的一套相关的组分(一般为一种或多种化合物或组合物)。
本文使用的术语″标记″指当其连接至靶或化合物并且用于本方法中时，直接或间接可检测(例如，由于其光谱性质，构象或活性)的化学部分或蛋白质，包括报告分子，固体支持物和载体分子。如本文使用的，总地来说，标记是指报告分子，固体支持物或载体分子。标记可以为直接可检测的(荧光团)或间接可检测的(半抗原或酶)。这样的标记包括但不限于，可以用放射计数装置测量的放射性标记；视觉上可观察的或用分光光度计可测量的色素，染料或其他的发色团；用自旋标记分析器可测量的自旋标记；和荧光标记(荧光团)，其中通过适合的分子加合物的激发产生输出信号，且输出信号可以通过用被染料吸收的光激发显现或可以用例如标准荧光计或成像系统测量。标记可以为化学发光物质，其中通过信号化合物的化学修饰产生输出信号；含有金属的物质；或酶，其中产生依赖于酶的二次发生的信号，例如由无色底物形成有颜色的产物。术语标记还可以指能够选择性地与缀合分子结合，从而缀合分子(当随后和底物一起添加时)用于产生可检测的信号的″标签″或半抗原。例如，可以使用生物素作为标签，然后使用辣根过氧化物酶(HRP)的亲合素或链霉亲合素缀合物以与标签结合，然后使用比色底物(例如四甲基联苯胺(TMB))或荧光底物例如Amplex Red试剂(Molecular Probes，Inc.)以检测HRP的存在。很多的标记为本领域技术人员所已知，包括但不限于，颗粒，荧光团，半抗原，酶和它们的比色底物，荧光底物和化学发光底物及在RICHARDP.HAUGLAND，MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBESAND RESEARCH PRODUCTS(第10版，CD-ROM 2005年9月，同上)中描述的其他标记。
如本文使用的，术语″快速标记″指使用可以在小于2小时内，更优选在小于1小时内完成的方法荧光标记蛋白质。在一些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法在小于30分钟内，优选在小于20分钟内，更优选在小于10分钟内完成。在一些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法在小于1至5分钟内完成。
为了易于理解本发明，将首先详细描述总蛋白质标记和表达标签标记，之后是其中可使用这些标记的许多经改变的方法，之后是使用的示例性方法。
标记蛋白质的方法
本文公开了用于蛋白质分析的方法和组合物，其中将包含目的蛋白质的蛋白质混合物与氨基反应性荧光染料或巯基反应性荧光染料接触或混合，从而荧光标记蛋白质并且使得能够测量存在的总蛋白质。此外，将该混合物与第二荧光部分接触或混合，所述第二荧光部分与连接至目的蛋白的标签结合，从而可测量目的蛋白质。第二荧光部分为荧光染料(其与连接至目的蛋白的标签结合)，或荧光试剂(其在与连接至目的蛋白的标签结合后发出荧光)。然后利用技术，例如电泳法，色谱法，或其组合分离此类经标记的蛋白质。两个荧光部分具有不同的发射光性质，从而允许双重荧光测量。本方法进一步包括比较两种荧光的测量值以获得目的蛋白质相对于存在于混合物中的其他蛋白质的量度。在一些实施方案中，所述方法用于蛋白质表达分析，且两种荧光的测量值的比较产生目的蛋白质的表达水平的量度。
本文还公开了用于蛋白质分析的方法，其中将包含目的蛋白质的蛋白质混合物与氨基反应性荧光试剂(其在与蛋白质上的胺基或硫基反应后发出荧光)接触或混合，从而荧光标记蛋白质并且允许测量存在的总蛋白质。此外，将该混合物与第二荧光部分接触或混合，所述第二荧光部分与连接至目的蛋白的标签结合，从而可测量目的蛋白质。第二荧光部分为荧光染料(其与连接至目的蛋白的标签结合)，或荧光试剂(其在与连接至目的蛋白的标签结合后发出荧光)。然后利用技术，例如电泳法，色谱法，或其组合分离此类经标记的蛋白质。两个荧光部分具有不同的发射光性质，从而允许双重荧光测量。本方法进一步包括比较两种荧光的测量值以获得目的蛋白质相对于存在于混合物中的其他蛋白质的量度。在一些实施方案中，所述方法用于蛋白质表达分析，且两种荧光的测量值的比较产生目的蛋白质的表达水平的量度。
在所述方法中，两个荧光部分可以用来源于相同激发源的相同激发波长激发，或两个荧光部分可以用来源于不同激发源的不同激发波长激发。此外，两个荧光部分可以用来源于不同激发源的相同激发波长激发，或两个荧光部分可以用来源于一个激发源的不同激发波长激发。
本文进一步公开了用于蛋白质分析的方法，其中将蛋白质，蛋白质片段或蛋白质混合物与氨基反应性荧光试剂(其与蛋白质，蛋白质片段或蛋白质混合物上的胺基反应后发出荧光)接触或混合。然后利用电泳法，色谱法，或其组合分离此类经标记的蛋白质。在此类蛋白质分析方法中使用的荧光标记蛋白质的方法允许使用荧光试剂有效标记蛋白质，同时还还原在变性条件下进行分析的蛋白质。用于在变性条件下进行分析的技术包括但不限于SDS-PAGE分析。
其他实施方案包括沉淀包含蛋白质混合物(其可能含有目的蛋白)的样品，然后在本文描述的标记溶液中重构样品。额外的沉淀步骤可以除去存在于起始样品中的潜在干扰的或多余的(unwanted)化学组分。可选地，或除该沉淀步骤外，所述蛋白质或蛋白质混合物在被标记前，可利用本领域已知的烷化剂例如二甲基丙烯酰胺(DMA)烷基化，以消除任何还原剂对标记的负面影响。
利用本文描述的方法标记的蛋白质，蛋白质片段或蛋白质混合物具有提高的标记效率，其中标记的均一性可以为70％到100％。在一些实施方案中，标记的均一性为75％到100％。在其他的实施方案中，标记的均一性为80％到100％。在其他的实施方案中，标记的均一性为85％到100％。在其他的实施方案中，标记的均一性为90％到100％。在一些实施方案中，标记的均一性为95％到100％。在其他的实施方案中，标记的均一性大于98％。标记的均一性由以下来表征：利用平板凝胶电泳分离经标记的蛋白质时存在的最小的条带扩展(相对于相同蛋白质未标记时获得的条带宽度)。此外，标记的均一性由以下来表征：利用毛细管电泳分离经标记的蛋白质时的最小的条带加宽(相对于相同蛋白质未标记时获得的条带加宽)。此外，改善的标记的均一性由以下来表征：蛋白质标记后对蛋白质迁移的最小影响(相对于相同蛋白质未经标记时获得的迁移)。
在本文描述的标记方法的一些实施方案中，当将标记的蛋白质与未标记的蛋白质进行比较时，在条带宽度或条带迁移上没有视觉上可观察到的差异。在一些实施方案中，当将凝胶图像上的条带数字化并且数字化地进行测量并且与从未标记的蛋白质获得的条带相比较时，在标记的蛋白质的条带宽度或条带迁移上的差异为+/-20％。在一些实施方案中，当将凝胶图像上的条带数字化并且数字化地进行测量并且与从未标记的蛋白质获得的条带相比较时，在标记的蛋白质的条带宽度或条带迁移上的差异为+/-10％。在一些实施方案中，当将凝胶图像上的条带数字化并且数字化地进行测量并且与从未标记的蛋白质获得的条带相比较时，在标记的蛋白质的条带宽度或条带迁移上的差异为+/-5％。在此类实施方案中，分离的蛋白质的条带浓度和表观分子量不受荧光染料的存在的影响。
在本文描述的标记和分析方法中，在分离之前标记蛋白质或蛋白质混合物，从而排除对任何后标记或染色处理的需要。因此，所述方法允许蛋白质表达和存在于样品中的总蛋白质的快速分析。例如，本文描述的标记方法适合用于免疫印迹法(即蛋白质印迹法/转移)并且还可以引起灵敏度的显著(十倍)增加。标记之后的其他应用也可以包括质谱法。此外，本文描述的方法允许蛋白质，蛋白质片段或蛋白质混合物的凝胶内检测，而不需要干燥凝胶，不需要印迹，并且不需要昂贵而复杂的设备。
利用用于总蛋白质标记的氨基反应性荧光试剂进行的蛋白质分析
在利用氨基反应性荧光试剂的用于总蛋白质分析的方法的一个方面中，首先将蛋白质，蛋白质片段或蛋白质混合物与包括第一缓冲剂(具有约pH 8和约pH 10之间的pH)，氨基反应性荧光试剂，碱性氰化物和任选地阴离子表面活性剂的组合物混合。任选地，碱性氰化物可以用毒性较低的替代物例如丙酮氰醇或腈(例如苯乙醇腈)替代。在该起始步骤中使用的第一缓冲剂不包括具有伯胺或仲胺部分的缓冲化合物或添加剂。然而，本文描述的方法可以耐受可能已经存在于蛋白质样品中的低水平的胺。然后第一反应混合物在与第二缓冲剂混合之前，在第一温育温度温育第一温育时间，所述第二缓冲剂的缓冲容量大于第一缓冲剂，从而使pH维持在约pH 6和约pH 9之间。任选地，可以在添加第二缓冲剂之后添加还原剂，并且所得的混合物在第二温育温度温育第二温育时间。蛋白质，蛋白质片段或蛋白质混合物被荧光标记并且可以利用电泳法，色谱法或其组合分离。
第二缓冲剂的缓冲容量可以为第一缓冲剂的缓冲容量的1X至20X。在某些实施方案中，第二缓冲剂的缓冲容量为第一缓冲剂的缓冲容量的至少2X，至少3X，至少4X，至少5X，至少6X，至少7X，至少8X，至少9X，至少10X，至少11X，至少12X，至少13X，至少14X，至少15X，至少16X，至少17X，至少1X，至少19X，或至少20X。在某些实施方案中，第二缓冲剂的缓冲容量在第一缓冲剂的缓冲容量的2X和20X之间，3X和20X之间，4X和20X之间，5X和20X之间，6X和20X之间，7X和20X之间，8X和20X之间，9X和20X之间，10X和20X之间，15X和20X之间，10X和25X之间。
图1为本文描述的利用氨基反应性荧光试剂的用于总蛋白质标记和分析的方法的示意图。此类方法包括在没有变性剂存在的情况下，标记处于其″天然″状态的蛋白质，或者用本文描述的此类方法标记变性的蛋白质。此外，任选地，可以在分别用Native PAGE或SDS PAGE电泳法分离前，还原标记的天然蛋白质或标记的变性蛋白质。
图2表示利用氨基反应性荧光试剂的蛋白质标记和分析方法的一个实施方案的示意图。在该实施方案中，向蛋白样品(浓度为0.1-10mg/mL)中加入ATTO-TAG FQTM(Invitrogen Corp.，Carlsbad)，苯乙醇腈(于碳酸盐缓冲剂(pH～9)中)的混合物。任选地，向该混合物添加LDS和蔗糖。该反应混合物在室温下(RT)温育0-30分钟，然后加入Bis-Tris缓冲剂以降低该反应混合物的pH至约pH6.5。在该实施方案中Bis-Tris缓冲剂的缓冲容量为碳酸盐缓冲剂的3X。任选地添加蛋白质还原剂，并且该反应混合物在70℃加热0-20分钟。然后将该混合物加载到电泳夹盒中的电泳凝胶中的样品孔中，然后分离标记的蛋白质，并且用荧光成像检测显现。
此类标记方法可用于标记蛋白质，蛋白质梯和/或蛋白质标准。例如，在一个实施方案中，用氨基反应性荧光试剂标记牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶以及BenchMarkTM蛋白质梯(Invitrogen，Carlsbad)和Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，Carlsbad)标准/梯。然而，可以用所述方法标记任何蛋白质，蛋白质梯或标准。
所述标记方法可用于标记细胞裂解物。图8展示利用本文描述的方法，用氨基反应性荧光试剂在不同时间标记大肠杆菌裂解物后获得的凝胶图像。其他裂解物，包括但不限于大鼠肝，HeLa细胞，及其他哺乳动物细胞的裂解物，可以用所述方法标记。图9展示标记大鼠肝裂解物后获得的凝胶图像。
所述标记方法可用于标记处于其″天然″状态的细胞蛋白质。图10展示在没有变性剂，例如SDS或LDS的情况下标记牛血清白蛋白(BSA)，肌红蛋白，h-IgG和大肠杆菌裂解物后获得的凝胶图像。可选地，所述标记方法可用于标记处于其″变性″状态的细胞蛋白质。图11展示在存在变性剂，例如SDS或LDS的情况下，标记牛血清白蛋白(BSA)，肌红蛋白，h-IgG和大肠杆菌裂解物后获得的凝胶图像。
观察到，本文描述的利用氨基反应性荧光试剂的蛋白质标记方法产生清晰的条带，如凝胶电泳中所观察到的。通过使用本文描述的方法，使用不同的反应物浓度和标记时间，用氨基反应性荧光试剂标记牛血清白蛋白(BSA)来表明对条带锐度的影响(图12)。其与用标准标记方法观察到的不同，所述的标准标记方法只使用pH 8-10的单一标记缓冲剂。
使用本文描述的方法，用氨基反应性荧光试剂进行的蛋白质标记可以用于蛋白质消化分析，如图13中所示的，其中降解标记的BSA并且分析所得的消化混合物。
使用荧光标签结合试剂和氨基反应性荧光染料进行的蛋白质表达分析
在利用标签结合荧光试剂/染料(与氨基反应性荧光染料组合)的用于蛋白质分析(包括蛋白质表达分析)的方法的一个方面中，通过将包含带标签的目的蛋白质的蛋白质混合物与包括第一缓冲剂(pH在约pH 8和约pH 10之间)和氨基反应性荧光染料的组合物混合形成第一反应混合物。在起始步骤中使用的第一缓冲剂不包括具有伯胺或仲胺部分的缓冲化合物或添加剂。然而，本文描述的方法可以耐受可能已经存在于蛋白质样品中的低水平的胺。然后该第一反应混合物和氨基反应性荧光染料一起在第一温育温度温育第一温育时间，导致蛋白质混合物(包括带标签的目的蛋白质)的标记，从而得以测量存在于蛋白质混合物中的总蛋白质。将第一反应混合物进一步与第二缓冲剂(pH在约pH 7和约pH 10之间)，与连接至目的蛋白质的标签结合的荧光试剂/染料，至少一种还原剂，和任选的阴离子表面活性剂混合，从而形成第二反应混合物。然后第二反应混合物在第二温育温度温育第二温育时间，由此当荧光试剂/染料与目的蛋白质上的标签结合时，荧光试剂/染料发出荧光。该标记方法导致蛋白质混合物(包括带标签的目的蛋白质)被一种荧光部分(来自胺荧光染料)标记，并且目的蛋白质还被第二荧光部分(来自荧光试剂)标记。
因此，蛋白质混合物中的一部分蛋白质被两种荧光部分荧光标记，而混合物中的其余的蛋白质只被氨基反应性荧光染料标记。除了标记蛋白质混合物以外，所述蛋白质分析方法进一步包括用电泳法，色谱法，或其组合分离荧光标记的蛋白质混合物，并用荧光成像技术显现/测量经分离的蛋白质的荧光。氨基反应性荧光染料具有不同于与目的蛋白质上的标签结合的荧光部分的光谱发射性质，因此比较所得的荧光测量结果，以获得目的蛋白质相对于存在于蛋白质混合物中的总蛋白质的量度。氨基反应性荧光染料和与标签结合的荧光试剂可以通过相同激发源激发或者它们可以通过不同的激发源激发。在所述蛋白质分析方法的某些实施方案中，第一缓冲剂包括至少一种还原剂而第二缓冲剂不包含还原剂，而在其他的实施方案中，第一缓冲剂和第二缓冲剂都包括至少一种还原剂。在某些实施方案中，所述蛋白质分析方法用于蛋白质表达分析，并且两个荧光部分的荧光测量结果的比较产生了目的蛋白的蛋白表达水平的量度。
图3表示所述蛋白质标记和分析方法的一个实施方案的示意图，其中向还包含用具有四半胱氨酸部分的肽标签标记的目的蛋白质的细胞裂解物添加在碳酸氢盐缓冲剂(pH 9.5)中的DDAO-SETM(InvitrogenCorp.，Carlsbad)的混合物。使该反应混合物在室温(RT)下反应10分钟，然后添加包含FlAsH-EDT2(LumioTM Green，Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.)的Tris缓冲剂(pH 8.6)，甘油，SDS，和至少一种还原剂。任选地，添加示踪染料和/或标记的蛋白质标准，然后将该混合物加载到电泳夹盒内的电泳凝胶上的样品孔中，其中分离标记的蛋白质，并且用荧光成像检测显现。
在利用标签结合荧光试剂/染料(与氨基反应性荧光染料组合)的用于蛋白质分析(包括蛋白质表达分析)的方法中，通过将包含带标签的目的蛋白质的蛋白质混合物与包括pH在约pH 8和约pH 10之间的第一缓冲剂，结合连接至目的蛋白质的标签的标签结合荧光试剂/染料，至少一种还原剂，和任选的阴离子表面活性剂的组合物混合形成第一反应混合物。在起始步骤中使用的第一缓冲剂不包括具有伯胺或仲胺部分的缓冲化合物或添加剂。然而，本文描述的方法可以耐受可能已经存在于蛋白质样品中的低水平的胺。然后该第一反应混合物在第一温育温度温育第一温育时间，导致带标签的目的蛋白质的标记，从而得以测量存在于蛋白质混合物中的蛋白质。第一反应混合物进一步与pH在约pH 8和约pH 10之间的第二缓冲剂，和氨基反应性荧光染料混合，从而形成第二反应混合物。然后该第二反应混合物在第二温育温度温育第二温育时间，导致蛋白质混合物(包括带标签的目的蛋白质)的标记，从而得以测量存在的总蛋白质。该标记方法导致蛋白质混合物(包括带标签的目的蛋白质)被一种荧光部分(来自胺荧光染料)标记，并且目的蛋白质还被第二荧光部分(来自荧光试剂)标记。
因此，蛋白质混合物中的一部分蛋白质被两种荧光染料荧光标记，而混合物中的其余的蛋白质只被氨基反应性荧光染料标记。除了标记蛋白质混合物以外，所述蛋白质分析方法进一步包括用电泳法，色谱法，或其组合分离荧光标记的蛋白质混合物，并用荧光成像技术显现/测量经分离的蛋白质的荧光。氨基反应性荧光染料具有不同于与目的蛋白质上的标签结合的荧光部分的光谱发射性质，因此比较所得的荧光测量结果，以获得目的蛋白质相对于存在于蛋白质混合物中的总蛋白质的量度。氨基反应性荧光染料和与标签结合的荧光试剂可以通过相同激发源激发或者它们可以通过不同的激发源激发。在所述蛋白质分析方法的某些实施方案中，第一缓冲剂包括至少一种还原剂而第二缓冲剂不包含还原剂，而在其他的实施方案中，第一缓冲剂和第二缓冲剂都包括至少一种还原剂。在某些实施方案中，所述蛋白质分析方法用于蛋白质表达分析，并且两个荧光部分的荧光测量结果的比较产生了目的蛋白的蛋白表达水平的量度。
在利用标签结合荧光试剂/染料(与氨基反应性荧光染料组合)的用于蛋白质分析(包括蛋白质表达分析)的方法的另一个方面中，首先通过将包含带标签的目的蛋白质的蛋白质混合物与包含pH在约pH7和约pH 10之间的第一缓冲剂，与连接至存在的目的蛋白质的标签结合的荧光试剂/染料，至少一种还原剂，和任选的阴离子表面活性剂的组合物混合形成第一反应混合物。然后第一反应混合物在第一温育温度温育第一温育时间。结合后，标签结合荧光试剂发出荧光，从而荧光标记目的蛋白质。然后将第一混合物与氨基反应性荧光染料混合并且在第二温育温度温育第二温育时间，从而标记混合物中的所有蛋白质，包括目的蛋白质。氨基反应性染料可以在水溶液或缓冲剂，包含非水性溶剂的水溶液，或非水性溶剂中。该标记方法导致蛋白质混合物(包括带标签的目的蛋白质)被一种荧光部分(来自胺荧光染料)标记，并且目的蛋白质还被第二荧光部分(来自荧光试剂)标记。
因此，蛋白质混合物中的一部分蛋白质被两种荧光染料荧光标记，而混合物中的其余的蛋白质只被氨基反应性荧光染料标记。然后利用电泳法，色谱法，或其组合分离包含经标记的蛋白质的第二反应混合物。该蛋白质分析方法进一步包括利用荧光成像技术显现经分离的蛋白质的荧光并且比较来自两种荧光部分的荧光。氨基反应性荧光染料具有不同于与目的蛋白质上的标签结合的荧光部分的光谱发射性质，因此可以比较所得的荧光测量结果，以获得目的蛋白质相对于存在于蛋白质混合物中的总蛋白质的量度。氨基反应性荧光染料和与标签结合的荧光试剂可以通过相同激发源激发或者它们可以通过不同的激发源激发。在某些实施方案中，所述蛋白质分析方法用于蛋白质表达分析，并且两个荧光部分的荧光测量结果的比较产生了目的蛋白的蛋白表达水平的量度。在所述蛋白质分析方法的某些实施方案中，第二缓冲剂包括至少一种还原剂而第一缓冲剂不包含还原剂，而在其他的实施方案中，第一缓冲剂和第二缓冲剂都包括至少一种还原剂。在某些实施方案中，所述蛋白质分析方法在分离步骤前可以包括，将第二反应混合物与第二缓冲剂混合，其中第二缓冲剂的pH在约pH 7和约pH10之间。
图4表示所述蛋白质标记和分析方法的示意图，其中将上样缓冲剂加入包含带标签的目的蛋白质的裂解物，并且在70℃温育混合物3分钟。温育之后，添加氨基反应性荧光染料，并且在平板凝胶电泳前，在室温下进一步温育混合物10分钟。可选地，用上样缓冲剂重悬浮的细胞沉淀在70℃温育3分钟，随后添加氨基反应性荧光染料并且在平板凝胶电泳前，进一步在室温下温育10分钟。在某些实施方案中，上样缓冲剂为磷酸盐缓冲剂(pH 8.5)中的FlAsH-EDT2(LumioTM Green，Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.)，甘油，SDS，示踪染料和至少一种还原剂的混合物，并且氨基反应性荧光染料为BODIPY TR-X SE或BODIPY 650/665SE。
图17-19展示从大肠杆菌裂解物获得的凝胶图像，所述的大肠杆菌裂解物包含用所述方法标记的具有GFP四半胱氨酸标签的蛋白质。图17展示用473nm激发光(产生520nm发射光)获得的图像并且展示用双砷试剂，FlAsH-EDT2(LumioTM Green，Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.)标记目的蛋白质的特异性。图18展示用532nm激发光(产生580nm发射光)获得的图像并且展示用BODIPY TR-X SE标记的总蛋白质。图19展示用633nm激发光(产生675nm发射光)获得的图像并且展示用BODIPY 650/665SE标记的总蛋白质。
图20-22展示从包含具有GFP四半胱氨酸标签的蛋白质的大肠杆菌裂解物和包含具有CFP四半胱氨酸标签的蛋白质的哺乳动物细胞裂解物获得的凝胶图像，各个裂解物用如上所述的方法标记。图20展示用473nm激发光(产生520nm发射光)获得的图像并且展示用双砷试剂，FlAsH-EDT2(LumioTM Green，Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.)标记目的蛋白质的特异性。图21展示用532nm激发光(产生580nm发射光)获得的图像并且展示用BODIPY TR-X SE标记的总蛋白质。图22展示用633nm激发光(产生675nm发射光)获得的图像并且展示用BODIPY 650/665SE标记的总蛋白质。
用标签结合荧光试剂/染料和氨基反应性荧光试剂分析蛋白质表达
在本文描述的利用标签结合荧光试剂/染料(与氨基反应性荧光试剂组合)的用于蛋白质分析(包括蛋白质表达分析)的方法的一个方面中，通过将包含带标签的目的蛋白质的蛋白质混合物与包括pH在约pH 8和约pH 10之间的第一缓冲剂，氨基反应性荧光试剂，碱性氰化物(或毒性较低的替代物例如丙酮氰醇，或腈例如苯乙醇腈)，和任选的阴离子表面活性剂的组合物混合形成第一反应混合物。相对于碱性氰化物，丙酮氰醇和腈可能是优选的，因为它们具有显著降低的毒性。在起始步骤中使用的第一缓冲剂不包括具有伯胺或仲胺部分的缓冲化合物或添加剂。然而，本文描述的方法可以耐受可能已经存在于蛋白质样品中的低水平的胺。然后，在通过混合pH为约pH 6至约pH9的第二缓冲剂而形成第二反应混合物之前，该第一反应混合物在第一温育温度温育第一温育时间。第二缓冲剂具有大于第一缓冲剂的缓冲容量，从而使第二反应混合物的pH维持在约pH 6至约pH 9。第二缓冲剂还包含与连接至存在于蛋白质混合物中的目的蛋白质的标签结合的荧光试剂/染料，任选的阴离子表面活性剂(其可以与第一缓冲剂中使用的阴离子表面活性剂相同或不同)，和至少一种还原剂。所得的混合物在第二温育温度温育第二温育时间，由此当荧光试剂与目的蛋白质上的标签结合时，荧光试剂发出荧光。该标记方法导致蛋白质混合物(包括带标签的目的蛋白质)被一种荧光部分(来自胺荧光试剂)标记，并且目的蛋白质还被第二荧光部分(来自标签结合荧光试剂)标记。
因此，蛋白质混合物中的一部分蛋白质被两种荧光部分荧光标记，而混合物中的其余的蛋白质只被一种荧光部分(来自氨基反应性荧光试剂)标记。除了标记蛋白质混合物以外，所述蛋白质分析方法进一步包括用电泳法，色谱法，或其组合分离荧光标记的蛋白质混合物，并用荧光成像技术显现/测量经分离的蛋白质的荧光。由氨基反应性荧光试剂形成的荧光部分具有不同于与目的蛋白质上的标签结合的荧光部分的光谱发射性质，因此比较所得的荧光测量结果，以获得目的蛋白质相对于存在于蛋白质混合物中的总蛋白质的量度。由氨基反应性荧光试剂和标签结合荧光试剂形成的荧光部分可以通过相同激发源激发或者它们可以通过不同的激发源激发。在所述蛋白质分析方法的某些实施方案中，第一缓冲剂包括至少一种还原剂而第二缓冲剂不包含还原剂，而在其他的实施方案中，第一缓冲剂和第二缓冲剂都包括至少一种还原剂。在某些实施方案中，所述蛋白质分析方法用于蛋白质表达分析，并且两个荧光部分的荧光测量结果的比较产生了目的蛋白的蛋白表达水平的量度。
可选地，在本文描述的利用标签结合荧光染料(与氨基反应性荧光试剂组合)的用于蛋白质分析(包括蛋白质表达分析)的方法中，通过将包含带标签的目的蛋白质的蛋白质混合物与包含pH为约pH 8至约pH 10的第一缓冲剂，标签结合荧光染料，氨基反应性荧光试剂，碱性氰化物或丙酮氰醇或腈，和任选的阴离子表面活性剂的组合物混合形成第一反应混合物。在起始步骤中使用的第一缓冲剂不包括具有伯胺或仲胺部分的缓冲化合物或添加剂。然而，本文描述的方法可以耐受可能已经存在于蛋白质样品中的低水平的胺。然后，在通过混合pH为约pH 6至约pH 9的第二缓冲剂而形成第二反应混合物之前，第一反应混合物在第一温育温度温育第一温育时间。第二缓冲剂具有大于第一缓冲剂的缓冲容量，从而使第二反应混合物的pH保持在约pH 6至约pH 9。任选地，第二缓冲剂包含至少一种还原剂，或者在形成第二反应混合物后可以添加一种或多种还原剂。然后，第二混合物在第二温育温度温育第二温育时间。利用该标记方法，当与目的蛋白质上的标签结合时，标签结合荧光试剂发出荧光。该标记方法导致蛋白质混合物(包括带标签的目的蛋白质)被一种荧光部分(来自氨基反应性荧光试剂)标记，并且目的蛋白质还被第二荧光部分(来自标签结合荧光试剂)标记。
因此，蛋白质混合物中的一部分蛋白质被两种荧光部分荧光标记，而混合物中的其余的蛋白质只被一种荧光部分(来自氨基反应性荧光试剂)标记。除了标记蛋白质混合物以外，所述蛋白质分析方法进一步包括用电泳法，色谱法，或其组合分离荧光标记的蛋白质混合物，并用荧光成像技术显现/测量经分离的蛋白质的荧光。由氨基反应性荧光试剂形成的荧光部分具有不同于与目的蛋白质上的标签结合的荧光部分的光谱发射性质，因此比较所得的荧光测量结果，以获得目的蛋白质相对于存在于蛋白质混合物中的总蛋白质的量度。由氨基反应性荧光试剂和标签结合荧光试剂形成的荧光部分可以通过相同激发源激发或者它们可以通过不同的激发源激发。在所述蛋白质分析方法的某些实施方案中，第一缓冲剂包括至少一种还原剂而第二缓冲剂不包含还原剂，而在其他的实施方案中，第一缓冲剂和第二缓冲剂都包括至少一种还原剂。在某些实施方案中，所述蛋白质分析方法用于蛋白质表达分析，并且两个荧光部分的荧光测量结果的比较产生了目的蛋白的蛋白表达水平的量度。
材料和方法
在本文描述的标记和分析方法中使用的荧光试剂，在与蛋白质、蛋白质片段或蛋白质混合物反应前是非荧光的，并且只在与蛋白质、蛋白质片段或蛋白质混合物反应后形成荧光标记。所述反应包括但不限于，与连接至蛋白质的标签结合或与蛋白质上的胺基反应。因此，使用所述试剂的蛋白质标记方法可具有较低的背景荧光并且可以在蛋白质检测中允许更大的灵敏度。此外，所述方法可以不需要用于除去任何未反应的染料的大量清洗，如用于标记蛋白质的非荧光染料的情况。对于很多用于标记蛋白质的荧光染料，进行清洗以减少凝胶中的背景荧光，特别是在较低分子量区域中的背景荧光。
在某些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法的灵敏度为至少0.2ng蛋白质。在其他的实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法的灵敏度为至少0.1ng蛋白质。在其他的实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法的灵敏度为至少0.05ng蛋白质。在其他的实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法的灵敏度为约0.01ng蛋白质至约0.2ng蛋白质。在其他的实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法的灵敏度为约0.05ng蛋白质至约0.2ng蛋白质。在其他的实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法的灵敏度为约0.1ng蛋白质至约0.2ng蛋白质。
使用本文描述的蛋白质标记方法获得的检测灵敏度在图6和图7中显示，其中电泳分离并检测不同浓度的经标记的牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶。两个附图都显示，与使用SimplyBlueTM SafeStain染色获得的图像相比较的使用本文描述的方法获得的荧光图像。
本文描述的蛋白质标记方法中使用的荧光试剂(氨基反应性荧光试剂和标签结合荧光试剂)的浓度为50nM至100mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至50mM。在其他的实施方案中，浓度为50nM至25mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至10mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至5mM。在某些实施方案中，浓度为100nM至10mM。在某些实施方案中，浓度为100nM至5mM。在某些实施方案中，浓度为200nM至5mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至100μM。在某些实施方案中，浓度为1μM至100μM。在某些实施方案中，所述浓度通过稀释浓度为100nM至200mM的荧光试剂原液而获得。在某些实施方案中，原液的浓度为100mM。在某些实施方案中，原液的浓度为50mM。在某些实施方案中，原液的浓度20mM。在某些实施方案中，原液的浓度为10mM。在某些实施方案中，原液的浓度为1mM。在某些实施方案中，原液的浓度为500μM。在某些实施方案中，原液的浓度为10μM至500μM。在某些实施方案中，原液的浓度为1μM至100μM。在某些实施方案中，原液的浓度为10μM。在某些实施方案中，原液的浓度为100μM至200μM。
本文描述的蛋白质标记方法中使用的氨基反应性荧光试剂包括但不限于芳酰基-2-喹啉-甲醛型试剂。此类试剂已描述于美国专利5,459,272和美国专利5,631,374中，其各自通过引用以其全文并入本文。例如，在本文描述的总蛋白质分析方法中使用的芳酰基-2-喹啉-甲醛试剂为3-(4-羧基苯甲酰基)喹啉-2-甲醛或3-(2-糠酰)喹啉-2-甲醛。在某些实施方案中，氨基反应性荧光试剂为3-(2-糠酰)喹啉-2-甲醛)，而其他的实施方案中，氨基反应性荧光试剂为3-(4羧基苯甲酰基)-喹啉-2-甲醛。
本文描述的荧光染料作为报告分子起作用，从而由于缀合至蛋白质上的官能团(包括但不限于胺基或巯基)而赋予样品直接或间接可检测的信号。这导致能够检测样品中的总蛋白质，通常与检测样品的总蛋白质的子集组合。在所述情况下，总蛋白质标记是可检测的，且不同于标记样品中的总蛋白质的子集的染料。
当可检测的应答为荧光应答时，其一般为荧光的变化，例如荧光的强度，激发或发射波长，分布，荧光寿命，荧光偏振上的变化，或其组合。
荧光染料可以是本领域技术人员已知的任何荧光团。适用于本文所述的总蛋白质标记的多种荧光团是本领域已知的(RICHARD P.HAUGLAND，MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES ANDRESEARCH PRODUCTS(2002))。本文描述的方法和组合物中使用的荧光染料是在超过280nm处展示最大吸收的任何化学部分。所述化学部分包括但不限于，芘，磺化芘，磺化香豆素，磺化羰菁，磺化夹氧杂蒽，蒽，萘，吖啶，均二苯代乙烯，吲哚，异吲哚，中氮茚，苯氮茚，噁唑或苯并噁唑，噻唑或苯并噻唑，4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(NBD)，羰菁，喹诺酮(carbostyryl)，卟啉，水杨酸盐(酯)，邻氨基苯甲酸盐(酯)，甘菊环，二萘嵌苯，吡啶，喹啉，异喹啉，色烯，borapolyazaindacene，夹氧杂蒽，荧光素，rosamine，罗丹明，罗丹明，苯并-或二苯并荧光素，半萘并荧光素(seminaphthofluorescein)，萘并荧光素，bimane，噁嗪或苯并噁嗪，卡巴嗪(carbazine)，芴酮(phenalenone)，香豆素，苯并呋喃，苯并芴酮(benzphenalenone))和其衍生物。如本文所使用的，噁嗪包括试卤灵，氨基噁嗪酮，二氨噁嗪，和它们的苯并取代类似物。
在一个方面，荧光染料包含一个或多个芳香环或芳香杂环，所述环任选地由多种取代基取代一次或多次，所述的取代基包括不限于卤素，硝基，磺基，氰基，烷基，全氟烷基，烷氧基，烯基，炔基，环烷基，芳基烷基，酰基，芳基或杂芳基环系，苯并，或本领域已知的通常存在于发色团或荧光团上的其他取代基。在一个方面，荧光团是包含一个或多个久洛里定环的夹氧杂蒽。
在示例性实施方案中，染料独立地由选自氢，卤素，氨基，经取代的氨基，烷基，经取代的烷基，芳香基，经取代的芳香基，杂芳基，经取代的杂芳基，烷氧基，磺基，反应性基团，固体支持物和载体分子的取代基取代。在另一个实施方案中，本发明的夹氧杂蒽染料包含在夹氧杂蒽的中心环的碳原子上被取代基取代的和未经取代的化合物，所述取代基通常发现于基于夹氧杂蒽的染料中，例如苯基和经取代的苯基。最优选的染料为罗丹明，荧光素，borapolyazaindacene，吲哚和其衍生物。
在某些实施方案中，总蛋白质标记和表达标签标记(标签结合荧光试剂)为化学反应性的，并且由至少一种反应性基团取代。反应性基团用作另一个部分(例如蛋白质上的胺基或蛋白质上的表达标签)的连接位点，其中所述反应性基团与蛋白质上的适当的反应性基团或官能团发生化学反应。
在示例性实施方案中，总蛋白质标记和表达标签标记进一步包含选自丙烯酰胺，羧酸的活化酯，羧酸酯，酰基叠氮，酰基腈，醛，烷基卤，酐，苯胺，胺，芳基卤，叠氮化物，氮丙啶，硼酸盐，重氮烷，卤代乙酰胺，卤代烷基，卤代三嗪，肼，亚氨酸酯，异氰酸酯，异硫氰酸酯，马来酰亚胺，亚磷酰胺，光敏基团，活性铂络合物，甲硅烷基卤，磺酰卤，和硫醇的反应性基团。在特定的实施方案中，反应性基团选自羧酸，羧酸的琥珀酰亚胺酯，酰肼，胺和马来酰亚胺。反应性基团可以连接至标记上的任何适当的位点。一般地，反应性基团与总蛋白质标记或表达标签标记之间的缀合反应引起反应性基团的一个或多个原子并入新键中，从而将总蛋白质标记和表达标签标记连接至蛋白质。官能团和键的经选择的实例在表1中展示，其中亲电子基团和亲核基团的反应产生共价键。
表1：产生有用的共价键的一些途径(routes)的实例
  亲电子基团   亲核基团   所得的共价键
  活化酯*   胺/苯胺   酰胺
  丙烯酰胺   硫醇   硫醚
  酰基叠氮**   胺/苯胺   酰胺
  酰基卤   胺/苯胺   酰胺
  酰基卤   醇/酚   酯
  酰基腈   醇/酚   酯
  酰基腈   胺/苯胺   酰胺
  醛   胺/苯胺   亚胺
  醛或酮   肼   腙
  醛或酮   羟胺   肟
  烷基卤   胺/苯胺   烷基胺
  烷基卤   羧酸   酯
  烷基卤   硫醇   硫醚
  亲电子基团   亲核基团   所得的共价键
  烷基卤   醇/酚   醚
  烷基磺酸盐(酯)   硫醇   硫醚
  烷基磺酸盐(酯)   羧酸   酯
  烷基磺酸盐(酯)   醇/酚   醚
  酐   醇/酚   酯
  酐   胺/苯胺   酰胺
  芳基卤   硫醇   苯硫酚
  芳基卤   胺   芳基胺
  氮丙啶   硫醇   硫醚
  硼酸盐   乙二醇   硼酸酯
  碳二亚胺   羧酸   N-酰基脲或酐
  重氮烷   羧酸   酯
  环氧化物   硫醇   硫醚
  卤代乙酰胺   硫醇   硫醚
  haloplatinate   氨基   铂络合物
  haloplatinate   杂环   铂络合物
  haloplatinate   硫醇   铂络合物
  卤代三嗪   胺/苯胺   氨基三嗪
  卤代三嗪   醇/酚   三嗪醚
  卤代三嗪   硫醇   三嗪硫醚
  亲电子基团   亲核基团   所得的共价键
  亚氨酸酯   胺/苯胺   脒
  异氰酸酯   胺/苯胺   脲
  异氰酸酯   醇/酚   氨基甲酸酯
  异硫氰酸酯   胺/苯胺   硫脲
  马来酰亚胺   硫醇   硫醚
  亚磷酰胺   醇   亚磷酸酯
  甲硅烷基卤   醇   硅醚
  磺酸酯   胺/苯胺   烷基胺
  磺酸酯   硫醇   硫醚
  磺酸酯   羧酸   酯
  磺酸酯   醇   醚
  磺酰卤   胺/苯胺   磺胺
  磺酰卤   酚/醇   磺酸酯
用于将总蛋白质标记或表达标签标记连接到待缀合的蛋白质的反应性基团的选择取决于待缀合的物质上的反应性基团或官能团以及期望的共价键的类型或长度。一般地，存在于有机物或无机物(生物分子或非生物分子)上的官能团的种类包括但不限于胺，酰胺，硫醇，醇，酚，醛，酮，磷酸盐(酯)，咪唑，肼，羟胺，双取代胺，卤化物，环氧化物，甲硅烷基卤，羧酸酯，磺酸酯，嘌呤，嘧啶，羧酸，烯键，或这些基团的组合。可存在于蛋白质中的多种位点包括但不限于胺，硫醇，醇和酚。
包含反应性基团的总蛋白质标记还可称为不依赖于序列的荧光性染料(sequence independent fluorescent dye)或不依赖于序列的荧光染料(sequence independent fluorogenic dye)。
一般地，反应性基团将与胺，硫醇，醇，醛或酮反应。在一个实施方案中，所述反应性基团为丙烯酰胺，羧酸的活化酯，酰基叠氮，酰基腈，醛，烷基卤，甲硅烷基卤，酐，苯胺，芳基卤，叠氮化物，氮丙啶，硼酸盐，重氮烷，卤代乙酰胺，卤代三嗪，肼(包括酰肼)，亚氨酸酯，异氰酸酯，异硫氰酸酯，马来酰亚胺，亚磷酰胺，磺酰卤，或巯基。
在一个方面，所述化合物包含至少一个选择性地与胺基反应的反应性基团。这些氨基反应性基团选自琥珀酰亚胺酯，磺酰卤，四氟苯基酯和异硫氰酸酯。因此，在一个方面，总蛋白质标记和表达标签标记与蛋白质中包含胺的分子形成共价键。在另一个方面，所述化合物包含至少一个选择性地与巯基反应的反应性基团。该巯基反应性基团选自马来酰亚胺，卤代烷基和卤代乙酰胺。
当所述反应性基团为羧酸的活化酯，例如羧酸的琥珀酰亚胺酯，磺酰卤化物，四氟苯基酯或异硫氰酸酯时，所得的化合物可特别用于制备蛋白质，核苷酸，寡聚核苷酸或半抗原的缀合物。当所述反应性基团为马来酰亚胺，卤代烷基或卤代乙酰胺时，所得的化合物可特别用于与包含巯基的物质的缀合。当所述反应性基团为酰肼时，所得的化合物可特别用于与高碘酸盐氧化的碳水化合物和糖蛋白的缀合。
例如，用于本文描述的蛋白质标记方法的氨基反应性荧光染料包括这样的染料，其包含芘，磺化芘，磺化香豆素，磺化羰菁，磺化夹氧杂蒽，蒽，萘，吖啶，均二苯代乙烯，吲哚，异吲哚，中氮茚，苯氮茚，噁唑或苯并噁唑，噻唑或苯并噻唑，4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(NBD)，羰菁，喹诺酮，卟啉，水杨酸盐(酯)，邻氨基苯甲酸盐(酯)，甘菊环，二萘嵌苯，吡啶，喹啉，异喹啉，色烯，borapolyazaindacene，夹氧杂蒽，荧光素，rosamine，罗丹明，罗丹明，苯并-或二苯并荧光素，半萘并荧光素，萘并荧光素，bimane，噁嗪或苯并噁嗪，卡巴嗪，芴酮，香豆素，苯并呋喃，苯并芴酮)和其衍生物。如本文所使用的，噁嗪包括试卤灵，氨基噁嗪酮，二氨噁嗪，和它们的苯并取代类似物。所述氨基反应性染料还包括选自酰基叠氮，羰基叠氮化物，异硫氰酸酯，异氰酸酯，琥珀酰亚胺酯，羧酸酯，羧酸，琥珀酰亚胺酯，磺基琥珀酰亚胺酯，STP酯，四氟苯基酯，磺酰氯，酸性卤化物，醛，甲醛，二氯三嗪，NBD氯化物，或NBD氟化物的反应性部分。
在本文描述的蛋白质标记方法中使用的氨基反应性荧光染料包括但不限于，Alexa
Figure G200880024991XD00281
350，Alexa
Figure G200880024991XD00282
405，Alexa430，Alexa
Figure G200880024991XD00284
488，Alexa
Figure G200880024991XD00285
500，Alexa
Figure G200880024991XD00286
514，Alexa532，Alexa
Figure G200880024991XD00288
546，Alexa
Figure G200880024991XD00289
555，Alexa
Figure G200880024991XD002810
568，Alexa
Figure G200880024991XD002811
594，Alexa610-X，Alexa
Figure G200880024991XD002813
633，Alexa647，Alexa
Figure G200880024991XD002815
660，Alexa
Figure G200880024991XD002816
680，Alexa700，Alexa
Figure G200880024991XD002818
750，Alexa
Figure G200880024991XD002819
790，AMCA-X，
Figure G200880024991XD002820
630/650，
Figure G200880024991XD002821
650/665，FL，TMR，TR，
Figure G200880024991XD002825
TR-X，Cascade
Figure G200880024991XD002826
二硝基苯基，荧光素，HEX，JOE，Marina
Figure G200880024991XD002827
Oregon
Figure G200880024991XD002828
488，Oregon
Figure G200880024991XD002829
514，PacificBlueTM，Pacific OrangeTM，Rhodamine GreenTM，
Figure G200880024991XD00291
7，
Figure G200880024991XD00292
9，
Figure G200880024991XD00293
21，
Figure G200880024991XD00294
35，ROX，Rhodamine RedTM，TET，TAMRA，四甲基罗丹明，FAM，Texas和7-羟基-9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE)。
用于本文描述的蛋白质标记方法的氨基反应性荧光染料的浓度为50nM至100mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至50mM。在其他实施方案中，浓度为50nM至25mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至10mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至5mM。在某些实施方案中，浓度为100nM至10mM。在某些实施方案中，浓度为100nM至5mM。在某些实施方案中，浓度为200nM至5mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至100μM。在某些实施方案中，浓度为1μM至100μM。在某些实施方案中，通过稀释浓度为100nM至200mM的荧光试剂原液获得所述浓度。在某些实施方案中，原液浓度为100mM。在某些实施方案中，原液浓度为50mM。在某些实施方案中，原液浓度为20mM。在某些实施方案中，原液浓度为10mM。在某些实施方案中，原液浓度为1mM。在某些实施方案中，原液浓度为500μM。在某些实施方案中，原液浓度为10μM至500μM。在某些实施方案中，原液浓度为1μM至100μM。在某些实施方案中，原液浓度为10μM。在某些实施方案中，原液浓度为100μM至200μM。
在本文描述的蛋白质标记方法中使用的与连接至蛋白质的标签结合的荧光试剂/染料为双砷荧光团，包括荧光素的双砷衍生物，例如，FlAsH-EDT2(4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)荧光素-(2，2-乙二硫醇)2)(LumioTM Green，Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.)，或试卤灵的双砷衍生物，例如，ReAsh-EDT2(LumioTM Red，InvitrogenCorp.，Carlsbad，Calif.)，或可替代地为氧化衍生物，例如ChoXAsH-EDT2或HoXAsH-EDT2。此外，双砷荧光团可以是其他已知的荧光团的双砷衍生物，包括但不限于本文描述的Alexa Fluor系列，例如，Alexa
Figure G200880024991XD00296
350，Alexa
Figure G200880024991XD00297
430，Alexa
Figure G200880024991XD00298
488，Alexa
Figure G200880024991XD00299
532，Alexa
Figure G200880024991XD002910
546，Alexa
Figure G200880024991XD002911
568，Alexa
Figure G200880024991XD00301
594，Alexa
Figure G200880024991XD00302
663和Alexa
Figure G200880024991XD00303
660，其可商购自Molecular Probes(Eugene，Oregon)。
双砷荧光团可以以至少约1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，10μM，15μM，20μM，30μM，40μM，50μM，100μM或更大的浓度存在，和以不大于约500μM，400μM，300μM，200μM，100μM，90μM，80μM，70μM，60μM，50μM，40μM，30μM，20μM，15μM，10μM，5μM，4μM，3μM，2μM或1μM的浓度存在。
与此类荧光染料结合的连接至蛋白质的标签为四半胱氨酸肽基序，cys-cys-Xn-cys-cys(SEQ ID NO：1)，其中各个X为任何天然氨基酸，非天然氨基酸或其组合，并且n为2-100的整数。在某些实施方案中，n为2-90的整数，而在其他的实施方案中，n为2-80的整数。在某些实施方案中，n为2-70的整数，而在其他的实施方案中，n为2-60的整数。在某些实施方案中，n为2-50的整数，而在其他的实施方案中，n为2-40的整数。在某些实施方案中，n为2-30的整数，而在其他的实施方案中，n为2-20的整数。在某些实施方案中，n为2-10的整数，而在其他的实施方案中，n为2-5的整数。所述基序中的天然氨基酸包括但不限于，丙氨酸，精氨酸，天门冬酰胺，天门冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸。在某些实施方案中，所述四半胱氨酸标签具有序列CCPGCC(SEQ ID NO：2)。在其他的实施方案中，使用包含12个氨基酸的肽的四半胱氨酸基序，其包括但不限于氨基酸序列AGGCCPGCCGGG(SEQ ID NO：3)。此外，蛋白质可以用单个四半胱氨酸标签标记或蛋白质可以用多个四半胱氨酸标签(包括但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个四半胱氨酸标签)标记。所述标签可以在蛋白质的初级氨基酸序列内相互分离或作为串联体直接多聚串联。
在某些实施方案中，四半胱氨酸肽具有序列cys-cys-Xn-cys-X-cys-X(SEQ ID NO：4)，其中各个X为任何天然氨基酸，非天然氨基酸或其组合，并且n为2-100的整数。在某些实施方案中，n为2-90的整数，而在其他的实施方案中，n为2-80的整数。在某些实施方案中，n为2-70的整数，而在其他的实施方案中，n为2-60的整数。在某些实施方案中，n为2-50的整数，而在其他的实施方案中，n为2-40的整数。在某些实施方案中，n为2-30的整数，而在其他的实施方案中，n为2-20的整数。在某些实施方案中，n为2-10的整数，而在其他的实施方案中，n为2-5的整数。所述基序中的天然氨基酸包括但不限于丙氨酸，精氨酸，天门冬酰胺，天门冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸。在某些实施方案中，所述四半胱氨酸标签具有序列CCGGKGNGGCGC(SEQ ID NO：5)。
可将一个或多个四半胱氨酸肽标签重组融合至希望被标记的蛋白质的N-端或C-端或框内融合至蛋白质序列内；用于产生四半胱氨酸融合重组蛋白质的表达载体可以使用本领域技术人员已知的技术容易地构建。在某些实施方案中，带四半胱氨酸标签的蛋白质在宿主细胞中重组表达，所述宿主细胞包括但不限于细菌宿主细胞，真菌宿主细胞，昆虫细胞，植物细胞或哺乳动物细胞。所述细菌宿主细胞包括但不限于任何属的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，包括，例如，埃希氏菌属的种(Escherichia sp.)(例如，大肠杆菌)，克雷伯氏杆菌属的种(Klebsiella sp.)，链霉菌属的种(Streptomyces sp.)，链球菌属的种(Streptococcus sp.)，志贺氏菌属的种(Shigella sp.)，葡萄球菌属的种(Staphylococcus sp.)，欧文氏菌属的种(Erwiniasp.)，克雷伯氏杆菌属的种，芽孢杆菌属的种(Bacillus sp.)(例如蜡状芽孢杆菌(B.cereus)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium))，沙雷氏菌属的种(Serratia sp.)，假单胞菌属的种(Pseudomonas sp.)(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和丁香假单胞菌(P.syringae))和沙门氏菌属的种(Salmonella sp.)(例如伤寒沙门氏菌(S.typhi)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))。适合的细菌菌株和适用于本发明的血清型可以包括大肠杆菌血清型K，B，C和W。通常，细菌宿主为大肠杆菌菌株K-12。真菌宿主细胞包括，例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞，而哺乳动物细胞包括，例如，人细胞。在此类实施方案中，包含目的蛋白质的蛋白质样品为宿主细胞的裂解物，在用本文描述的方法标记和分析前，其可以是未纯化的，部分纯化的，或基本上纯化的。
在其他的实施方案中，体外表达带四半胱氨酸标签的蛋白质，其中包含目的蛋白质的蛋白质样品为无细胞提取物(在其中进行翻译(和，任选地，转录))，或其部分纯化的或纯化的级分。在其中提取物允许在单个无细胞提取物中进行偶联的转录和翻译(例如基于大肠杆菌的ExpressWay或Expressway Plus systems(InvitrogenCorp.，Carlsbad，Calif.))的实施方案中，样品为无细胞提取物(其中共同发生转录和翻译)或其级分。可选地，
Figure G200880024991XD00321
Technology(Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.)为可用于在大肠杆菌中表达目的基因的通用克隆技术。
用本文描述的双砷染料标记的蛋白质可以为具有四半胱氨酸基序的任何蛋白质。融合或缀合一个或多个四半胱氨酸标签的蛋白质可以为希望被标记的天然存在或非天然存在的任何蛋白质。天然存在的蛋白质可以具有或不具有已知的生物学功能，并且已知被表达或仅从基因组序列预测。如果是天然存在的，则蛋白质可以为完整蛋白质或仅为其片段。因此，带四半胱氨酸标签的蛋白可以为动物蛋白质例如人蛋白质或非人哺乳动物蛋白质，真菌蛋白质，细菌蛋白质(包括真细菌和古生菌蛋白质)，植物蛋白质，昆虫蛋白质或病毒蛋白质。
除四半胱氨酸标签以外，其他蛋白质序列可以有效地重组附加至期望被标记的蛋白质。此类其他的蛋白质序列包括连接子和/或短标签，有效地表位标签，例如FLAG标签，或myc标签，或其他的用于纯化的序列(例如聚组氨酸(例如，6xhis)标签)。
可选地，一个或多个四半胱氨酸标签可以使用如上所述的本领域常规的缀合化学作用与待标记的蛋白质化学缀合。
本文描述的方法中使用的温育温度可以是室温，环境温度，或高于室温的温度，例如，至少约26℃，27℃，28℃，29℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，甚至高至90℃，95℃，96℃，97℃，98℃，99℃或100℃。本文描述的方法中使用的第一温育温度和第二温育温度可以相同或不同。在一个实施方案中，第一温育温度在20℃和80℃之间，更优选地在25℃和30℃之间，更优选地为环境温度或室温。在一个实施方案中，第二温育温度在20℃和80℃之间，更优选在65℃和75℃之间，更优选为大约70℃。在另一个实施方案中，第二温育温度为环境温度或室温。
本文描述的方法中使用的温育时间包括但不限于，至少30秒，至少1分钟，至少2分钟，3分钟，4分钟，5分钟，6分钟，7分钟，8分钟，9分钟，10分钟，15分钟，20分钟，30分钟，40分钟，50分钟，至少1小时或其中的任何范围。本文描述的方法中使用的第一温育时间和第二温育时间可以相同或不同。在一个实施方案中，第一温育时间为0至60分钟，优选5至10分钟，更优选在室温下5至10分钟。在一个实施方案中，第二温育时间为0至20分钟，更优选大约10分钟，更优选地在大约70℃下大约10分钟。
本文描述的方法的任选的样品还原步骤可以在室温下，环境温度下，或高于室温的温度下，例如在至少约26℃，27℃，28℃，29℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，甚至高至90℃，95℃，96℃，97℃，98℃，99℃或100℃的温度下进行。所述还原步骤可以进行至少30秒，至少1分钟，至少2分钟，3分钟，4分钟，5分钟，6分钟，7分钟，8分钟，9分钟，10分钟，15分钟，20分钟，30分钟，40分钟，50分钟，或至少1小时。
在本文描述的方法的某些实施方案中，可标记一种或多种对照蛋白质以在平行反应中监测标记的效率，或者如果能够与期望被标记的蛋白质容易地区分，所述对照蛋白也可包含于相同的反应中。
在本文描述的方法的某些实施方案中，经标记的样品蛋白质可以用一系列荧光分子量标准平行有效地进行分辨。有效地，所述标准与用于标记蛋白质的至少一种荧光团光谱匹配。可以例如通过使用带四半胱氨酸标签的蛋白质标准(其平行地用用于标记蛋白质样品的相同双砷荧光团进行标记)，或通过使用具有荧光部分(其与用于标记样品蛋白质的双砷荧光团或其他荧光团光谱匹配)的标准，来实现所述光谱匹配。在某些实施方案中，用于本发明的实施的蛋白质标准(其在某些方面为蛋白质梯)包括这样的标准，所述标准包括一组重组蛋白质，重组蛋白质片段，以及由其衍生的融合蛋白质和多聚体。用于本发明的实施的标准的实例包括BenchmarkTM蛋白质标准家族(Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.)和Mark12TM UnstainedStandard(Invitrogen，Carlsbad)。
本文描述的方法和组合物还可以用于定量存在于样品中的荧光标记的蛋白质的量。在某些实施方案中，本文描述的方法进一步包括定量来自双砷荧光团的荧光的量。在某些实施方案中，本文描述的方法进一步包括定量来自氨基反应性荧光染料的荧光的量。在某些实施方案中，本文描述的方法进一步包括定量来自氨基反应性荧光试剂的荧光部分的荧光的量。可以进行定量而不分辨存在于蛋白质样品中的蛋白质，或定量可以在已经部分或完全地分辨蛋白质(如通过电泳，例如PAGE，2D-PAGE，或IEF或色谱法或其组合)后进行。
用于本文描述的蛋白质标记方法的阴离子表面活性剂包括但不限于，烷基苯磺酸盐，烷基磺酸盐，烷基磺基琥珀酸盐，烷基磷酸盐，烷基硫酸盐，烷基羧酸盐，烷基醚苯磺酸盐，烷基醚磺酸盐，烷基醚磺基琥珀酸盐，烷基醚磷酸盐，烷基醚硫酸盐，烷基醚羧酸盐或其混合物。在本文描述的方法的某些实施方案中，阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸锂，月桂基乙醚硫酸钠，油酸钠，棕榈酸钠，肉豆蔻酸钠，硬脂酸钠或其混合物。在某些实施方案中，阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠，而在其他实施方案中，阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸锂。
在本文描述的蛋白质标记方法中使用的阴离子表面活性剂的浓度为0.1％(w/v)至10％(w/v)。在某些实施方案中，浓度为0.1％(w/v)至5％(w/v)。在其他实施方案中，浓度为0.5％(w/v)至10％(w/v)。在某些实施方案中，浓度为0.5％(w/v)至5％(w/v)。在某些实施方案中，浓度为1％(w/v)至10％(w/v)。在某些实施方案中，浓度为1％(w/v)至5％(w/v)。在某些实施方案中，通过稀释浓度为1％(w/v)至20％(w/v)的阴离子表面活性剂的原液而获得所述浓度。在某些实施方案中，原液的浓度为10％(w/v)。在某些实施方案中，原液的浓度为5％(w/v)。在某些实施方案中，原液的浓度为2％(w/v)。
本文描述的蛋白质标记方法中使用的碱性氰化物包括但不限于氰化锂，氰化钾，氰化钠，氰化铷，氰化铯，或其混合物。在某些实施方案中，碱性氰化物为氰化钾，而在其他的实施方案中碱性氰化物为氰化钠。在某些实施方案中，碱性氰化物为氰化锂，而在其他的实施方案中碱性氰化物为氰化铯。由于碱性氰化物的毒性作用，优选毒性较低的替代物，例如丙酮氰醇或腈。例如，氰化钠的LD50值为6.44，而丙酮氰醇的LD50值为18.65，并且苯乙醇腈的LD50值为116(即苯乙醇腈的毒性比氰化钠少大约18倍)。
本文描述的蛋白质标记方法中使用的碱性氰化物，丙酮氰醇，或腈的浓度为50nM至200mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至100mM。在其他实施方案中，浓度为50nM至50mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至25mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至10mM。在某些实施方案中，浓度为50nM至5mM。在某些实施方案中，浓度为100nM至10mM。在某些实施方案中，浓度为100nM至5mM。在某些实施方案中，浓度为200nM至5mM。在某些实施方案中，通过稀释浓度为100nM至200mM的荧光试剂的原液获得所述浓度。在某些实施方案中，原液的浓度为100mM。在某些实施方案中，原液的浓度为50mM。在某些实施方案中，原液的浓度为20mM。在某些实施方案中，原液的浓度为10mM。
用本文描述的方法标记的蛋白质或蛋白质片段的浓度为0.01mg/mL至200mg/mL。在某些实施方案中，浓度为0.1mg/mL至100mg/mL。在其他实施方案中，浓度为0.1mg/mL至50mg/mL。在某些实施方案中，浓度为0.1mg/mL至10mg/mL。在某些实施方案中，浓度为0.2mg/mL至100mg/mL。在某些实施方案中，浓度为0.2mg/mL至50mg/mL。在某些实施方案中，浓度为0.2mg/mL至10mg/mL。在某些实施方案中，浓度为0.3mg/mL至10mg/mL。在某些实施方案中，浓度为0.4mg/mL至10mg/mL。在某些实施方案中，浓度为0.5mg/mL至10mg/mL。
本文公开的蛋白质或蛋白质混合物的标记方法为快速蛋白质标记方法，其能够在小于2小时内完成。在某些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法在小于1小时内完成。在某些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法在小于30分钟内完成。在某些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法在小于20分钟内完成。在某些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法在小于10分钟内完成。在某些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法在小于5分钟内完成。在某些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法在小于4分钟内完成。在某些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法在小于3分钟内完成。在某些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法在小于2分钟内完成。在某些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法在小于1分钟内完成。
第一缓冲剂
在本文描述的蛋白质标记方法的第一步中使用的缓冲剂(本文也称为第一缓冲剂)在环境温度下具有约pH8至约pH10的pH。在某些实施方案中，第一缓冲剂在25℃具有约pH8至约pH10的pH。此外，第一缓冲剂不包括具有伯胺或仲胺部分的缓冲化合物或添加剂。然而，本文描述的方法可以耐受可能已经存在于蛋白质样品中的低水平的胺。例如，第一缓冲剂可以包括碳酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐，硼酸盐，Bis-Tris丙烷，N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)，N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)或其组合。
本文公开的方法中使用的第一缓冲剂的浓度为约10mM至约1M。在某些实施方案中，浓度在约20mM和约500mM之间，在其他实施方案中，浓度在约50mM和约300mM之间。在某些实施方案中，浓度在约10mM和约500mM之间。在某些实施方案中，浓度在约10mM和约400mM之间。在某些实施方案中，浓度在约10mM和约300mM之间。在某些实施方案中，浓度在约10mM和约200mM。在某些实施方案中，浓度在约10mM和约100mM。在某些实施方案中，浓度在约10mM和约50mM。
第二缓冲剂
在本文描述的蛋白质标记方法的第二步中使用的缓冲剂(本文也称为第二缓冲剂)在环境温度下具有约pH2至约pH8的pH并且具有大于第一缓冲剂的缓冲容量。在某些实施方案中，第二缓冲剂在25℃具有约pH2至约pH8的pH并且具有大于第一缓冲剂的缓冲容量。
本文描述的方法中使用的第二缓冲剂可以是任何电泳缓冲剂，包括但不限于两性离子缓冲剂。所述方法中使用的第二缓冲剂包含至少一种在环境温度具有约2至约9的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在环境温度具有约3至约8的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在环境温度具有约4至约8的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在环境温度具有约5至约8的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在环境温度具有约6至约8的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在环境温度具有约7至约8的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在环境温度具有约6至约7的pKa的化合物。在某些实施方案中，在所述方法中使用的第二缓冲剂包含至少一种在25℃具有约2至约8的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在25℃具有约3至约8的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在25℃具有约4至约8的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在25℃具有约5至约8的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在25℃具有约6至约8的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在25℃具有约7至约8的pKa的化合物。在某些实施方案中，第二缓冲剂包含在25℃具有约6至约7的pKa的化合物。
本文公开的方法中使用的第二缓冲剂包括但不限于，磷酸盐，琥珀酸盐，柠檬酸盐，马来酸盐，甲次砷酸盐，N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)，2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)，N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)，哌嗪-N，N′-2-乙磺酸(PIPES)，2-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)，N，N-双-(羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)，3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)，N-三-(羟甲基)-2-乙磺酸(TES)，N-2-羟乙基-哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)，3-(N-三-(羟甲基)甲氨基)-2-羟基丙磺酸(TAPSO)，3-(N，N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸(DIPSO)，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)，N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)，双[2-羟乙基]亚氨基三[羟甲基]甲烷(BisTris)或其组合。
在某些实施方案中，第二缓冲剂可选自磷酸盐，甘氨酸，柠檬酸，乙酸，2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)，二甲胂酸，碳酸，双[2-羟乙基]亚氨基三[羟甲基]甲烷(BisTris)，哌嗪-N，N′-2-乙磺酸)(PIPES)，N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)，咪唑，N，N-双(羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)，3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)，N-三-(羟甲基)-2-乙磺酸(TES)，N-2-羟乙基-哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)和三乙醇胺。在某些实施方案中，第二缓冲剂为双[2-羟乙基]亚氨基三[羟甲基]甲烷(BisTris)。
在某些实施方案中，将第二缓冲剂加入包含第一缓冲剂，荧光试剂，碱性氰化物(或可选地丙酮氰醇或腈例如苯乙醇腈)和阴离子表面活性剂的起始反应混合物，从而将最终的混合物的pH(在环境温度)维持在约pH5和约pH9之间。在某些实施方案中，最终的混合物在环境温度具有6和8之间的pH。在某些实施方案中，最终的混合物在环境温度具有6和7之间的pH。在某些实施方案中，最终的混合物在25℃具有5和8之间的pH。在某些实施方案中，最终的混合物在25℃具有6和8之间的pH。在某些实施方案中，最终的混合物在25℃具有6和7之间的pH。
本文描述的方法中使用的第二缓冲剂的浓度为约10mM至约1M。在某些实施方案中，浓度为约20mM至约500mM，在其他实施方案中，浓度为约50mM至约300mM。在某些实施方案中，浓度为约10mM至约500mM。在某些实施方案中，浓度为约10mM至约400mM。在某些实施方案中，浓度为约10mM至约300mM。在某些实施方案中，浓度为约10mM至约200mM。在某些实施方案中，浓度为约10mM至约100mM。在某些实施方案中，浓度为约10mM至约50mM。
分离方法
本文描述的方法中使用的用于分析蛋白质的色谱技术包括但不限于液相色谱法，高效液相色谱法，环状色谱法，尺寸排阻色谱法，离子交换色谱法，亲和色谱法，和免疫亲和色谱法。
在某些实施方案中，在用电泳技术，色谱技术，或其组合分离之前，标记的蛋白质或标记的蛋白质混合物没有从未反应的荧光试剂中纯化出来。在其他的实施方案中，在用电泳技术，色谱技术，或其组合分离之前，将标记的蛋白质或标记的蛋白质混合物从未反应的荧光试剂中纯化出来。其他实施方案包括沉淀包含蛋白质或蛋白质混合物的样品，然后在本文描述的标记溶液中重构样品。可选地，或除该沉淀步骤之外，所述蛋白质或蛋白质混合物可在标记前进行烷基化，以消除任何还原剂对标记的负面影响。
本文描述的方法中使用的用于分析标记的蛋白质的电泳技术包括但不限于毛细管电泳(CE)，毛细管区带电泳(CZE)，毛细管凝胶电泳(CGE)，平板凝胶电泳，等电聚焦凝胶电泳，等电聚焦电泳和2D电泳技术。分离蛋白质的方法包括但不限于通过大小分离，通过电荷分离，或通过大小和电荷的组合分离。在某些实施方案中，如本文所述，使用包含在一次性夹盒内的平板凝胶来电泳分离荧光标记的蛋白质。
对于通过凝胶电泳进行的大小分级，标记的蛋白质可以通过在平板凝胶中进行电泳而进行分辨，所述凝胶包括但不限于10％Bis-Tris凝胶，4-12％Bis-Tris凝胶，或12％Bis-Tris凝胶，例如，用2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)或3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)缓冲剂进行电泳的
Figure G200880024991XD00401
Bis-Tris凝胶(Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.)。在某些实施方案中，标记的蛋白质可以在Tris-acetate(TA)凝胶中进行分辨，所述凝胶包括但不限于7％或3-8％梯度Tris-acetate凝胶，例如，
Figure G200880024991XD00402
Tris acetate凝胶(Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.)。在某些其他的实施方案中，标记的蛋白质可以在Tris-glycine(TG)凝胶中进行分辨，所述凝胶包括但不限于4％TG凝胶，6％TG凝胶，8％TG凝胶，10％TG凝胶，12％TG凝胶，14％TG凝胶，16％TG凝胶和18％TG凝胶。在某些其他的实施方案中，标记的蛋白质可以在梯度Tris-glycine(TG)凝胶中进行分辨，所述凝胶包括但不限于梯度为例如4-12％，4-20％，8-16％，10-20％的TG凝胶，例如，可从Invitrogen Corp.(Carlsbad，Calif.)获得的TG凝胶。在进一步的实施方案中，标记的蛋白质可以在Tricine凝胶中进行分辨，所述凝胶例如10％Tricine凝胶，16％Tricine凝胶，和10-20％梯度Tricine凝胶。在进一步的实施方案中，标记的蛋白质可以在标准Laemmli凝胶中进行分辨。
本发明的方法的基于凝胶的电泳实施方案可以在任何适合的物理形式的凝胶中进行，例如在标准尺寸的平板凝胶，微型凝胶平板凝胶，胶条，毛细管中的凝胶中进行，在经设计用于与微量滴定板一起使用和用于其他高通量应用的凝胶中进行。
在某些实施方案中，用本文描述的方法标记的多达96种蛋白质样品可以在E-PAGETM 96凝胶系统(Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.)中同时进行分辨。E-PAGETM 96凝胶为独立完整的预制凝胶，其包括包装在一次性UV-透明夹盒内的凝胶基质和电极。每个E-PAGETM 96凝胶以交错排列的孔形式包含96个样品泳道和8个标记物泳道。
对于基于等电点的分离，可以使用等电聚焦(I EF)分辨标记的蛋白质，其作为单一的分离步骤或作为使用如上所述的方法，系统和凝胶进行的大小分级之前的步骤，包括但不限于作为2D-PAGE的第一步。在某些实施方案中，标记的蛋白质可以使用液相等电聚焦进行分辨。在某些实施方案中，可以使用
Figure G200880024991XD00411
IEF Fractionator(其为来自Invitrogen Corp.(Carlsbad，Calif.)的一种液相等电聚焦仪器)分辨标记的蛋白质。在所述实施方案中，蛋白质可以在用液相I EF分级前或分级后，用本文描述的荧光试剂和方法标记。在其他实施方案中，可以使用基于凝胶的等电聚焦，在平板凝胶中、在管状凝胶中、或在固相pH梯度(IPG)胶条中分辨标记的蛋白质。
可以使用恒定电压，脉冲电压，恒定电流，脉冲电流，恒定功率或脉冲功率实现标记的蛋白质的电泳分离。随后，本文公开的方法中使用的电场(V/cm)可以是恒定的或脉冲的。应理解，用于产生下文提供的电场范围的外加电压，外加电流或外加功率的大小将随电泳仪(毛细管或平板凝胶)的尺寸和缓冲剂的导电率而变化。例如，外加电压可以为5V至10,000V。在某些实施方案中，外加电压可以为5V至2,000V，并且在某些实施方案中，外加电压可以为5V至1,000V，5V至500V，5V至250V，或5V至100V。例如，外加电流可以为5mA至400mA，且在某些实施方案中，外加电流可以为5mA至200mA，5mA至100mA，5mA至50mA，或5mA至25mA。在一个实施方案中，外加电流可以为60mA。例如，外加功率可以为5mA至400mA，并且在某些实施方案中，外加电流为25mW至400W，25mW至100W，25mW至50W或25mW至25W。在一个实施方案中，外加电流可以为4.5W。此外，外加电压(恒定或脉冲)的极性可以是阳性的或阴性的，并且外加电流(恒定或脉冲)的极性可以是阳性的或阴性的。
在某些实施方案中，使用的恒定电场的大小在1V/cm和100V/cm之间。在某些实施方案中，使用的恒定电场的大小在1V/cm和50V/cm之间。在某些实施方案中，使用的恒定电场的大小在1V/cm和25V/cm之间。在某些实施方案中，使用的恒定电场的大小在1V/cm和15V/cm之间。在某些实施方案中，使用的恒定电场的大小在1V/cm和10V/cm之间。
脉冲电场分布可以是方波，三角波或正弦波，并且此类分布可以是对称或不对称的。将脉冲电场应用于恒定基线电场并且该基线电场的大小为0V/cm至100V/cm。在某些实施方案中，该基线电场的大小为0V/cm至50V/cm。该基线电场的大小为0V/cm至25V/cm。该基线电场的大小为0V/cm至10V/cm。在某些实施方案中，除基线电场外使用的脉冲电场的大小在1V/cm和100V/cm之间。在某些实施方案中，除基线电场外使用的脉冲电场的大小在1V/cm和50V/cm之间。在某些实施方案中，除基线电场外使用的脉冲电场的大小在1V/cm和25V/cm之间。在某些实施方案中，除基线电场外使用的脉冲电场的大小在1V/cm和10V/cm之间。
对于对称方波脉冲电场，除基线电场外使用脉冲电场(开)的时间与不使用脉冲电场(关)的时间相同。在某些实施方案中，开和关的时间为1ms至60秒。对于不对称方波脉冲电场，除基线电场外使用脉冲电场的时间(开)与不使用脉冲电场(关)的时间不同。在某些实施方案中，开的时间独立地为1ms至60秒，且关的时间独立地为1ms至60秒。
对于对称三角波脉冲电场，升至使用的最大电场的电压斜率(V/s)与降至使用的基线电场的电压斜率(V/s)相同。在某些实施方案中，电压上升和电压下降的斜率在10mV/s和100V/s之间。对于不对称三角波脉冲电场，升至使用的最大电场的电压斜率(V/s)与降至使用的基线电场的电压斜率(V/s)不同。在某些实施方案中，电压上升斜率独立地在10mV/s和100V/s之间并且电压下降斜率独立地在10mV/s和100V/s之间。
对于对称正弦波脉冲电场，周期和频率是恒定的，并且正弦波的最小电场与使用的基线电场相同。对于不对称正弦波脉冲电场，周期和频率是调制的，并且正弦波的最小电场与使用的基线电场相同。
在某些实施方案中，用
Figure G200880024991XD00421
PowerbaseTM(InvitrogenCarlsbad)，
Figure G200880024991XD00422
i-BaseTM(Invitrogen Carlsbad)和(Invitrogen Carlsbad)施加电场。
在某些实施方案中，使用平板凝胶电泳技术分离标记的蛋白质或标记的蛋白质混合物。在所述实施方案中，本文描述的标记方法中使用的第一缓冲剂还包括糖，糖醇，或其组合。在其他的实施方案中，本文描述的标记方法中使用的第二缓冲剂还包括糖，糖醇，或其组合。可选地，在其他的实施方案中，向最终的反应混合物添加糖，糖醇，或其组合。在某些实施方案中，加入第一缓冲剂的糖是蔗糖。在其他的实施方案中，加入第一缓冲剂的糖醇是甘油。在某些实施方案中，加入第二缓冲剂的糖是蔗糖。在其他的实施方案中，加入第二缓冲剂的糖醇是甘油。在某些实施方案中，加入最终的反应混合物的糖是蔗糖。在其他实施方案中，加入最终的反应混合物的糖醇是甘油。
本文描述的蛋白质标记方法中使用的糖或糖醇的浓度为约1％(w/v)至约30％(w/v)。在某些实施方案中，本文描述的蛋白质标记方法中使用的糖或糖醇的浓度为约1％(w/v)至约25％(w/v)。在某些实施方案中，浓度为约1％(w/v)至约20％(w/v)，并且在其他的实施方案中，浓度为约1％(w/v)至约15％(w/v)。在某些实施方案中，浓度为约1％(w/v)至约10％(w/v)，并且在其他的实施方案中，浓度为约5％(w/v)至约25％(w/v)。在其他的实施方案中，浓度为约5％(w/v)至约20％(w/v)。
标记的蛋白质或蛋白质混合物可以在分离步骤之前用还原剂处理。所述还原剂包括但不限于，二硫苏糖醇(DTT)，2-巯基乙醇(又称为β-巯基乙醇)，亚硫酸氢钠，巯基乙酸，巯基乙磺酸，谷胱甘肽和三烷基膦化合物或其组合。所述三烷基膦化合物包括但不限于三正丁基膦(TBP)或三[2-羧乙基]膦(TCEP)。可以在添加第二缓冲剂前，向第一缓冲剂添加还原剂或还原剂的组合，或可选地，可以在将第二缓冲剂添加到第一缓冲剂之前，向第二缓冲剂添加还原剂或还原剂的组合。
本文描述的方法中使用的还原剂的浓度包括但不限于，至少约10μM，至少约100μM，至少约1mM，至少约2mM，至少约2.5mM，至少约3mM，至少约3.75mM，至少约4mM，至少约5mM，至少约10mM，至少约15mM，至少约20mM，至少约25mM，至少约30mM，至少约35mM，至少约40mM，至少约45mM，至少约50mM，至少约55mM，至少约60mM，至少约65mM，至少约70mM，至少约75mM，至少约80mM，至少约85mM，至少约90mM，至少约95mM，至少约100mM，至少约200mM，至少约350mM，或至少约500mM。本文描述的方法中使用的还原剂的浓度包括但不限于10μM，100μM，1mM，2mM，2.5mM，3mM，3.75mM，4mM，5mM，10mM，15mM，20mM，25mM，30mM，35mM，40mM，45mM，50mM，55mM，60mM，65mM，70mM，75mM，80mM，85mM，90mM，95mM，100mM，200mM，350mM或500mM。
在某些实施方案中，本文描述的方法中使用的电泳凝胶包括丙烯酰胺，包括例如，浓度为约2.5％至约30％，或约5％至约20％的丙烯酰胺。在某些实施方案中，所述的聚丙烯酰胺电泳凝胶包含1％至10％的交联剂，包括但不限于双丙烯酰胺。在某些实施方案中，本文描述的方法中使用的电泳凝胶包括琼脂糖，包括例如，浓度为约0.1％至约5％，或约0.5％至约4％，或约1％至约3％的琼脂糖。在某些实施方案中，本文描述的方法中使用的电泳凝胶包括丙烯酰胺和琼脂糖，例如，电泳凝胶包括约2.5％至约30％的丙烯酰胺和约0.1％至约5％的琼脂糖，或约5％至约20％的丙烯酰胺和约0.2％至约2.5％的琼脂糖。在某些实施方案中，所述的聚丙烯酰胺/琼脂糖电泳凝胶包含1％至10％的交联剂，包括但不限于双丙烯酰胺。
在本文公开的方法的某些实施方案中，电泳夹盒中的电泳凝胶为梯度凝胶。在本文公开的方法的其他实施方案中，电泳夹盒中的电泳凝胶为高度交联的凝胶。
在某些实施方案中，本文公开的方法中使用的电泳夹盒和电泳凝胶为E-PAGETM夹盒/凝胶(Invitrogen，Carlsbad)和
Figure G200880024991XD00441
夹盒/凝胶(Invitrogen Carlsbad)。在某些实施方案中，E-PAGETM(Invitrogen，Carlsbad)夹盒/凝胶具有两行孔，其中一行孔为上样孔而另一行孔为收集孔。在其他实施方案中，
Figure G200880024991XD00442
夹盒/凝胶(Invitrogen Carlsbad)具有两行孔，其中一行孔为上样孔而另一行孔为收集孔。在某些实施方案中，使用具有两行孔的0.8％(Invitrogen Carlsbad)夹盒/凝胶，其中一行孔为上样孔而另一行孔为收集孔。在其他实施方案中，使用具有两行孔的2％夹盒/凝胶(Invitrogen Carlsbad)，其中一行孔为上样孔而另一行孔为收集孔。
本文公开的方法的电泳凝胶可以包含任何形成凝胶的物质，包括但不限于合成聚合物，天然聚合物和其组合。所述合成聚合物的实例包括但不限于线性聚丙烯酰胺，交联聚丙烯酰胺，聚乙烯吡咯烷酮和其组合。所述天然聚合物的实例包括但不限于多糖例如琼脂糖，角叉菜胶和壳聚糖。在某些实施方案中，凝胶可以包括琼脂糖，聚丙烯酰胺，或琼脂糖和聚丙烯酰胺的组合。在某些实施方案中，凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，而在其他实施方案中，凝胶为琼脂糖凝胶。在其他实施方案中，凝胶包括丙烯酰胺和琼脂糖两者。在某些实施方案中，凝胶包括交联的聚丙烯酰胺，而在其他实施方案中，凝胶包括非交联的聚丙烯酰胺(本文也称为线性聚丙烯酰胺)。
本文描述的方法中使用的凝胶可以是变性凝胶，其中凝胶包括去污剂，离液剂或其组合。离液剂包括但不限于三氟乙酸钠，高氯酸钠，碘化钠，尿素，盐酸胍和异硫氰酸胍。变性去污剂包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基硫酸锂(LDS)。本文描述的方法中使用的变性凝胶包括但不限于SDS聚丙烯酰胺凝胶和SDS线性聚丙烯酰胺。
此外，本文描述的方法中使用的凝胶可以是天然凝胶，本文也称为非变性凝胶。本文公开的方法中使用的天然或非变性凝胶进行电泳时，凝胶或电泳缓冲剂中没有变性剂，例如蛋白质变性去污剂或离液剂。在一些实施方案中，本文描述的方法中使用的电泳凝胶是梯度凝胶。
本文描述的方法中使用的电泳凝胶可以水平或垂直进行电泳。
本文公开的方法中使用的电泳凝胶包括一块分离胶和任选地包括浓缩胶(stacking gel)。分离胶和浓缩胶可以由形成凝胶的相同物质组成，或分离胶和浓缩胶可以由形成凝胶的不同物质组成。在某些实施方案中，分离胶和浓缩胶为聚丙烯酰胺凝胶，其中浓缩胶还包括线性聚丙烯酰胺。在其他的实施方案中，分离胶和浓缩胶为聚丙烯酰胺凝胶，其中分离胶还包括线性聚丙烯酰胺。在某些实施方案中，分离胶和浓缩胶为聚丙烯酰胺凝胶，其中分离胶和浓缩胶都包括线性聚丙烯酰胺。本文公开的方法中使用的电泳凝胶可以包括浓缩胶和分离胶，其中线性丙烯酰胺仅存在于浓缩胶中而不存在于分离胶中。在某些实施方案中，所述浓缩胶和分离胶都包括聚丙烯酰胺，但仅浓缩胶包含线性丙烯酰胺。
本文公开的方法中使用的聚丙烯酰胺凝胶用″丙烯酰胺″溶液(其为单体丙烯酰胺和双丙烯酰胺的混合物)制备。丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合使用聚合引发剂，和催化剂(如果需要的话)，以制备交联的聚丙烯酰胺凝胶。在用于制备本文公开的组合物、凝胶夹盒和方法的聚丙烯酰胺凝胶的混合物中使用的单体丙烯酰胺比双丙烯酰胺的比率为约15∶1至约50∶1。例如，所述聚丙烯酰胺凝胶中的(单体)丙烯酰胺∶双丙烯酰胺的比率可以是15∶1、19∶1、24∶1、29∶1、37.5∶1、40∶1、45∶1和50∶1。在本文公开的某些实施方案中，用于分析蛋白质和蛋白质复合物的(单体)丙烯酰胺比双丙烯酰胺的比率为约19∶1至约45∶1。
在本文公开的方法中使用的电泳凝胶的某些实施方案中，浓缩胶包含使用如上所述的丙烯酰胺和双丙烯酰胺的混合物制备的聚丙烯酰胺。在某些实施方案中，用比用于制备分离胶的丙烯酰胺浓度低的丙烯酰胺浓度制备浓缩胶。例如，浓缩胶的丙烯酰胺浓度(w/v)可以为约2％至约8％，约2.5％至约7.5％的丙烯酰胺，约3％至约7％的丙烯酰胺，约3.5％至约6.5％的丙烯酰胺，约4％至约6％的丙烯酰胺，约4.5％至约5.5％的丙烯酰胺，或约2.5％至约6％的丙烯酰胺。例如，浓缩胶的丙烯酰胺浓度(w/v)可以为约2％至约8％，约2.5％至约7.5％的丙烯酰胺，约3％至约7％的丙烯酰胺，3.5％至约6.5％的丙烯酰胺，约4％至约6％的丙烯酰胺，约4.5％至约5.5％的丙烯酰胺，或约2.5％至约6％的丙烯酰胺。
在某些实施方案中，本文公开的方法中使用的电泳凝胶的分离胶和浓缩胶(单独地或共同地)包括线性聚丙烯酰胺。在其他的实施方案中，本文公开的方法中使用的电泳凝胶的聚丙烯酰胺分离胶和聚丙烯酰胺浓缩胶(单独地或共同地)包括线性聚丙烯酰胺。包含于所述凝胶中的线性丙烯酰胺的浓度(重量/体积)可以为约0.005％至约1％，0.005％至约0.75％，0.005％至约0.5％，0.005％至约0.1％，0.01％至约1％，0.01％至约0.75％，0.01％至约0.5％，0.01％至约0.1％，0.02％至约1％，0.02％至约0.75％，0.02％至约0.5％，0.02％至约0.2％，或0.02％至约0.1％。在示例性实施方案中，包含于所述凝胶中的线性丙烯酰胺的浓度(重量/体积)可以为0.005％至1％，0.005％至0.75％，0.005％至0.5％，0.005％至0.1％，0.01％至1％，0.01％至0.75％，0.01％至0.5％，0.01％至0.1％，0.02％至1％，0.02％至0.75％，0.02％至0.5％，0.02％至0.2％，或0.02％至0.1％。
此外，包含于所述凝胶中的线性丙烯酰胺的分子量可以为约1,000道尔顿至约6,000,000道尔顿，约1,000道尔顿至约5,000,000道尔顿，约1,000至约2,000,000道尔顿，约1,000道尔顿至约1,000,000道尔顿，约1,000道尔顿至约750,000道尔顿，约1,000道尔顿至约500,000道尔顿，约1,000道尔顿至约300,000道尔顿，约1,000道尔顿至约200,000道尔顿，约1,000道尔顿至约100,000道尔顿，约1,000道尔顿至约50,000道尔顿，约1,000道尔顿至约25,000道尔顿，或约1,000道尔顿至约10,000道尔顿。此外，包含于所述凝胶中的线性丙烯酰胺的分子量可以为1,000道尔顿至6,000,000道尔顿，1,000道尔顿至5,000,000道尔顿，1,000至2,000,000道尔顿，1,000道尔顿至1,000,000道尔顿，1,000道尔顿至750,000道尔顿，1,000道尔顿至500,000道尔顿，1,000道尔顿至300,000道尔顿，1,000道尔顿至200,000道尔顿，1,000道尔顿至100,000道尔顿，1,000道尔顿至50,000道尔顿，1,000道尔顿至25,000道尔顿，或1,000道尔顿至10,000道尔顿。
在一些实施方案中，本文描述的方法中使用的电泳凝胶为梯度凝胶，其中聚合物的浓度沿着凝胶变化，通常从凝胶体顶部的低浓度到凝胶体底部的高浓度。所述梯度分离胶中聚合物的浓度范围取决于应用，和特别地待分离的蛋白质的大小。在某些实施方案中，本文公开的方法的电泳凝胶可以为梯度聚丙烯酰胺凝胶，其丙烯酰胺浓度的浓度梯度(w/v)为约2％至约30％，约2.5％至25％，约3％至约20％，约3％至约8％，约4％至约16％，约3％至约12％，约4％至约20％，或约5％至约20％。
本文公开的方法中使用的电泳凝胶可以包括梯度分离胶和浓缩胶，其中浓缩胶聚合物的浓度等于或小于梯度分离胶中使用的聚合物的最低浓度。在某些实施方案中，电泳凝胶包括聚丙烯酰胺梯度分离胶和聚丙烯酰胺浓缩胶，其中浓缩胶中丙烯酰胺的浓度等于或小于梯度分离胶中使用的丙烯酰胺的最低浓度。在其他实施方案中，电泳凝胶包括聚丙烯酰胺梯度分离胶和聚丙烯酰胺浓缩胶，其中浓缩胶中的丙烯酰胺浓度等于或小于梯度分离胶中使用的丙烯酰胺的最低浓度，并且浓缩胶包括线性聚丙烯酰胺，其浓度(w/v)为约0.005％至约1％，0.005％至约0.75％，0.005％至约0.5％，0.005％至约0.1％，0.01％至约1％，0.01％至约0.75％，0.01％至约0.5％，0.01％至约0.1％，0.02％至约1％，0.02％至约0.75％，0.02％至约0.5％，0.02％至约0.2％或0.02％至约0.1％。在其他实施方案中，电泳凝胶包括聚丙烯酰胺梯度分离胶和聚丙烯酰胺浓缩胶，其中浓缩胶中丙烯酰胺的浓度等于或小于梯度分离胶中使用的丙烯酰胺的最低浓度，并且浓缩胶包括线性聚丙烯酰胺，其浓度(w/v)为0.005％至1％，0.005％至0.75％，0.005％至0.5％，0.005％至0.1％，0.01％至1％，0.01％至0.75％，0.01％至0.5％，0.01％至0.1％，0.02％至1％，0.02％至0.75％，0.02％至0.5％，0.02％至0.2％，或0.02％至0.1％。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的电泳凝胶可以包括平板梯度聚丙烯酰胺分离胶(其包含浓度为4％-16％的聚丙烯酰胺)和聚丙烯酰胺浓缩胶(其具有3％聚丙烯酰胺和0.05％(重量/体积)线性聚丙烯酰胺)。
本文公开的组合物，凝胶夹盒和方法中使用的电泳凝胶的梯度分离胶还可以包括线性丙烯酰胺，其浓度(w/v)为约0.005％至约1％，0.005％至约0.75％，0.005％至约0.5％，0.005％至约0.1％，0.01％至约1％，0.01％至约0.75％，0.01％至约0.5％，0.01％至约0.1％，0.02％至约1％，0.02％至约0.75％，0.02％至约0.5％，0.02％至约0.1％，或0.02％至约0.1％。在某些实施方案中，所述梯度分离胶包括线性丙烯酰胺，其浓度(w/v)为0.005％至1％，0.005％至0.75％，0.005％至0.5％，0.005％至0.1％，0.01％至1％，0.01％至0.75％，0.01％至0.5％，0.01％至0.1％，0.02％至1％，0.02％至0.75％，0.02％至0.5％，0.02％至0.1％，或0.02％至0.1％。在某些实施方案中，所述梯度分离胶为聚丙烯酰胺梯度分离胶，其丙烯酰胺浓度的浓度梯度(w/v)为约2％至约30％，约2.5％至约25％，约3％至约20％，约3％至约8％，约4％至约16％，约3％至约12％，约4％至约20％，或约5％至约20％。在某些实施方案中，所述梯度分离胶为聚丙烯酰胺梯度分离胶，其丙烯酰胺浓度的浓度梯度(w/v)为2％至30％，2.5％至25％，3％至20％，3％至8％，4％至16％，3％至12％，4％至20％，或5％至20％。
本文公开的方法中使用的电泳凝胶可以包括为变性凝胶的分离胶和浓缩胶。在某些实施方案中，所述变性分离胶和浓缩胶包括线性聚丙烯酰胺，而在其他实施方案中，所述变性分离胶和浓缩胶为聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，其中浓缩胶包括线性聚丙烯酰胺。在其他实施方案中，所述变性分离胶和浓缩胶为包括线性聚丙烯酰胺的聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶。在其他实施方案中，本文公开的方法中使用的电泳凝胶为不包括浓缩胶的变性聚丙烯酰胺凝胶。
本文描述的方法的分离步骤中使用的凝胶包括一种或多种凝胶缓冲剂，其可以为任何电泳缓冲剂，包括但不限于两性离子缓冲剂。在某些实施方案中，凝胶缓冲剂在环境温度下的pH在5和9之间。在某些实施方案中，凝胶缓冲剂在环境温度下的pH在6和8.5之间。在某些实施方案中，凝胶缓冲剂在环境温度下的pH在6和8之间。在某些实施方案中，凝胶缓冲剂在环境温度下的pH在6和7之间。在某些实施方案中，凝胶缓冲剂在环境温度下的pH在7和8之间。在某些实施方案中，凝胶缓冲剂在25℃下的pH在5和9之间。在某些实施方案中，凝胶缓冲剂在25℃下的pH在6和8.5之间。在某些实施方案中，凝胶缓冲剂在25℃下的pH在6和8之间。在某些实施方案中，凝胶缓冲剂在25℃下的pH在7和8之间。在某些实施方案中，凝胶缓冲剂在25℃下的pH在6和7之间。
在某些实施方案中，本文描述的方法的分离步骤中使用的一种或多种缓冲剂(包括一种或多种凝胶缓冲剂)包含环境温度下pKa在约5和约8.5之间的化合物。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含环境温度下pKa在约6和约8.5之间的化合物。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含环境温度下pKa在约6和约8之间的化合物。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含环境温度下pKa在约6和约7之间的化合物。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含环境温度下pKa在约7和约8之间的化合物。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含在25℃下pKa在约5和约8.5之间的化合物。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含在25℃下pKa在约6和8.5之间的化合物。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含在25℃下pKa在约6和约8之间的化合物。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含在25℃下pKa在约6和约7之间的化合物。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含在25℃下pKa在约7和约8之间的化合物。
本文描述的方法的分离步骤中使用的一种或多种缓冲剂(包括一种或多种凝胶缓冲剂)包括但不限于，琥珀酸盐，柠檬酸盐，硼酸盐，马来酸盐，甲次砷酸盐，N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)，2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)，N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)，哌嗪-N，N′-2-乙磺酸(PIPES)，2-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)，N，N-双-(羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)，3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)，N-三-(羟甲基)-2-乙磺酸(TES)，N-2-羟乙基-哌嗪-N-2-磺酸(HEPES)，3-(N-三-(羟甲基)甲氨基)-2-羟基丙磺酸(TAPSO)，3-(N，N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸(DIPSO)，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)，N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)，N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)，(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸(TAPS)，N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)，三(羟甲基)氨基-甲烷(Tris)，TRIS-乙酸-EDTA(TAE)，甘氨酸，双[2-羟乙基]亚氨基三[羟甲基]甲烷(BisTris)或其组合。此外，所述凝胶缓冲剂可以包括乙二胺四乙酸(EDTA)。
本文描述的方法中使用的一种或多种缓冲剂的浓度可以为约10mM至约1.5M。在某些实施方案中，浓度可以为约10mM至约1M。在某些实施方案中，浓度可以为约20mM至约500mM，并且在其他实施方案中，浓度为约50mM至约300mM。在某些实施方案中，浓度可以为约10mM至约200mM，并且在其他实施方案中，浓度为约10mM至约500mM。在某些实施方案中，浓度可以为约50mM至约200mM，并且在其他实施方案中，浓度为约50mM至约500mM。在某些实施方案中，浓度可以为约5mM至约200mM，并且在其他实施方案中，浓度为约5mM至约500mM。在某些实施方案中，浓度可以为约5mM至约1M。在某些实施方案中，本文描述的方法中使用的一种或多种缓冲剂的浓度可以为10mM至1.5M。在某些实施方案中，浓度可以为10mM至1M。在某些实施方案中，浓度可以为20mM至500mM，并且在其他实施方案中，浓度为50mM至300mM。在某些实施方案中，浓度可以为10mM至200mM，并且在其它的实施方案中，浓度为10mM至500mM。在某些实施方案中，浓度可以为50mM至200mM，并且在其它的实施方案中，浓度为50mM至500mM。在某些实施方案中，浓度可以为5mM至200mM，并且在其它的实施方案中，浓度为5mM至500mM。在某些实施方案中，浓度可以为5mM至1M。
显现
可以在分离过程期间或之后，监测或显现标记的蛋白质的分离。本领域技术人员已知的用于电泳或色谱技术的任何检测系统可用于本文描述的方法。例如，激光诱导的荧光检测系统，成像系统，基于CCD的系统，基于吸光度的系统，利用PMT的系统，和基于质谱的检测。
可以通过用适当波长的光照射电泳凝胶以允许观察与样品条带结合的染料、着色剂或其他指示剂来显现电泳凝胶中的样品条带。电泳凝胶可以单独地显现或凝胶可以在电泳夹盒或毛细管内显现。
用于显现的光可以是单色的或多色的。例如，多色光可以是白光、UV光或红外线，而单色光可以用激光器或发光二极管(LED′s)或通过光源(例如白光、UV光或红外线)的特异性光谱过滤实现。应当理解，所述单色光的期望的波长取决于使用的染料或着色剂的特异性光谱特征，并且本领域技术人员知道获得所述单色光的方法。
在单独放置的″光箱(light box)″中进行显现，其中在电泳分离荧光标记的蛋白质期间或之后，将电泳凝胶或包含凝胶的电泳夹盒置于所述光箱中。当在电泳分离期间将电泳凝胶或包含凝胶的电泳夹盒放置在所述″光箱″中时，连续地或者间歇地进行显现。可选地，在分离后对凝胶进行显现。在所述光箱中，可以从上方或从下方照射电泳夹盒。可以使用CCD照相机或摄像机或通过用户的直接观测实现监测。在所述显现方法的其他实施方案中，使用电泳/监测装置，其中将监测手段(CCD照相机或摄像机，或通过直接观察)和施加一个或多个电场的手段组合入一个装置。此外，在其他实施方案中，并入用于在电泳期间冷却电泳夹盒的手段。可以通过冷却的气体(例如，液氮)的流动，风扇或Peltier冷却器实现所述冷却。在某些实施方案中，使用Dark
Figure G200880024991XD00521
(Clare Chemicals，Dolores)或Safe ImagerTM(Invitrogen，Carlsbad)进行显现。在某些实施方案中，使用置于Da rk
Figure G200880024991XD00522
(Clare Chemicals，Dolores)上的PowerbaseTM(Invitrogen Carlsbad)(将包含电泳凝胶的电泳夹盒连接到其中)进行显现。在某些实施方案中，使用置于Dark
Figure G200880024991XD00524
(Clare Chemicals，Dolores)上的PowerbaseTM(Invitrogen Carlsbad)(将E-PAGETM或
Figure G200880024991XD00526
夹盒(InvitrogenCarlsbad)连接到其中)进行显现。在某些实施方案中，使用置于SafeImagerTM(Invitrogen，Carlsbad)上的
Figure G200880024991XD00527
PowerbaseTM(Invitrogen Carlsbad)(将包含电泳凝胶的电泳夹盒连接到其中)进行显现。在某些实施方案中，使用置于Safe ImagerTM(Invitrogen，Carlsbad)上的PowerbaseTM(Invitrogen Carlsbad)(将E-PAGETM或
Figure G200880024991XD00532
夹盒(Invitrogen Carlsbad)连接到其中)进行显现。
在某些实施方案中，使用置于Dark
Figure G200880024991XD00533
(Clare Chemicals，Dolores)上的iBaseTM(Invitrogen Carlsbad)(将包含电泳凝胶的电泳夹盒连接到其中)进行显现。在某些实施方案中，使用置于Dark
Figure G200880024991XD00535
(Clare Chemicals，Dolores)上的
Figure G200880024991XD00536
iBaseTM(Invitrogen Carlsbad)(将E-PAGETM或
Figure G200880024991XD00537
夹盒(InvitrogenCarlsbad)连接到其中)进行显现。在某些实施方案中，使用置于SafeImagerTM(Invitrogen，Carlsbad)上的
Figure G200880024991XD00538
iBaseTM(InvitrogenCarlsbad)(将包含电泳凝胶的电泳夹盒连接到其中)进行显现。在某些实施方案中，使用置于Safe ImagerTM(Invitrogen，Carlsbad)上的
Figure G200880024991XD00539
iBaseTM(Invitrogen Carlsbad)(将E-PAGETM或
Figure G200880024991XD005310
夹盒(Invitrogen Carlsbad)连接到其中)进行显现。
在某些实施方案中，使用
Figure G200880024991XD005311
(Invitrogen Carlsbad)(将包含电泳凝胶的电泳夹盒连接到其中)进行显现，并且落射照明用于监测荧光标记的蛋白。在某些实施方案中，用
Figure G200880024991XD005312
(InvitrogenCarlsbad)(将E-PAGETM或
Figure G200880024991XD005313
夹盒(Invitrogen Carlsbad)连接到其中)进行显现，并且落射照明用于监测荧光标记的蛋白质。在上述实施方案中，落射照明可以用本文提供的光源实现，包括但不限于白光灯，具有适当的滤光片以获得期望的波长的白光灯，蓝光灯，激光器，发光二极管(LED′s)和蓝色发光二极管(LED′s)。
在其它的实施方案中，用将电源(用于驱动电泳)和显现系统组合入单个一体化单元中的系统进行显现。例如，在某些实施方案中，使用已并入本文描述的显现系统中的
Figure G200880024991XD005314
iBaseTM进行显现。
本文公开的方法中使用的电泳凝胶夹盒的非限制性实例，和所述夹盒可以用于其中的装置的非限制性实例已经公开于美国专利5,582,702，美国专利5,865,974，和美国专利6,562,213中，上述各个专利通过引用以其全文并入本文。
在某些示例性实施方案中，本文公开的方法中使用的电泳夹盒是封闭的电泳夹盒。封闭的电泳凝胶夹盒有至少四个壁，其被密封以形成由壁包围的分离室，并且分离室包含具有至少2个形成于其中的孔的电泳凝胶基质。此外，所述夹盒的至少一个壁具有一行开口(本文还称为口)，用于从夹盒外进入形成于电泳凝胶(包含在分离室中)中的孔，或用于从夹盒外进入夹盒内的空分离室。所述封闭的夹盒还包括进行电泳分离所需要的全部化学化合物，并且在某些实施方案中还包括使得能够显现分离的样品条带的化合物。此外，所述封闭的夹盒可以是一次性的。在某些实施方案中，由供应者将电泳凝胶放入分离室，而在其他实施方案中，分离室不包含电泳凝胶，直至最终用户在使用电泳夹盒前将电泳凝胶放入分离室。
图14和15表示本文公开的方法中使用的封闭的夹盒的一个实施方案。图14为外视图，其中在沿着图14的IV--IV的横截面中观察到图15。夹盒10包含三维的分离室，其具有底壁19，侧壁12和14，和顶壁18(各具有特定的厚度)。夹盒10为基本上封闭的，其由壁12、14、16和19包围，但如本文公开的，其还包括口36，并且还可以包括任选的排气孔(34和/或32)。壁的厚度可以为0.1-10mm，并且在某些实施方案中，厚度为1.5mm。在其他实施方案中，厚度为9mm，8mm，7mm，6mm，5mm，4mm，3mm，2mm或1mm。
夹盒10的长度可以为50至200mm，夹盒10的宽度可以为50-150mm并且夹盒10的高度可以为1-10mm。在一个实施方案中，夹盒10的长度，宽度和高度分别为160毫米(mm)，100mm和6mm。在另一个实施方案中，夹盒10的长度，宽度和高度分别为130mm，130mm和6mm。在另一个实施方案中，夹盒10的长度，宽度和高度分别为100mm，80mm和6mm。在另一个实施方案中，夹盒10的长度，宽度和高度分别为108mm，135mm和6.7mm。
如上所述，夹盒10可以任选地包括排气孔32和34以允许在电泳期间由于电极23和21上的电化学反应而可能产生的气体分子(例如氧气和/或氢气)的排出。在某些实施方案中，排气孔直径为0.5-2mm，而在其他实施方案中，排气孔直径为0.5-1mm。在其他实施方案中，排气孔直径为1-2mm，且在一个实施方案中，排气孔直径为1mm。
如图15A和15B的横截面图所示，分离室包含电泳凝胶基质16，其可以是本文描述的任何适合的电泳凝胶基质。分离室还包含21和23所指的两个传导电极，当连接到外部直流(DC)电源时，其提供进行电泳分离所需要的电场。在图14和15中图示的实施方案中，电极21为阴极而电极23为阳极，然而在其他实施方案中，电极21为阳极而电极23为阴极。
分离室可以任选地包含20和22所指的离子交换基质。在图15A和15B中图示的实施方案中，电极21为阴极，电极23为阳极，基质20为阳离子交换基质，而基质22为阴离子交换基质，然而在其他实施方案中，电极21为阳极，电极23为阴极，基质20为阴离子交换基质，而基质22为阳离子交换基质。
分离室还可以任选地包含内部容积29和30，其彼此独立地可以是空的，由电泳凝胶基质占据，或由缓冲剂占据。如果是空的，内部容积29或30用作电泳期间产生的气体可以积累于其中的容积。可选地，如上所述，夹盒10可以任选地包括至少两个排气孔32和34，用于排出容积29和/或30中积累的气体。应理解，如果夹盒10包括排气孔32和34，它们紧在电泳开始前打开并且在试验完成后关闭，以充分减少污染的可能性。
此外，夹盒10可以包含斜面27，其可以支持电极21。斜面便于电极21和覆盖电极21的离子交换基质22的表面之间持续地接触，借此在电极21附近产生的气泡向空容积30释放。在某些实施方案中，斜面27形成为夹盒10的必须部分，并且以约45度角朝向底壁19。
图15A和15B的横截面图中还显示，在电泳凝胶基质16中形成孔38。所述孔位于口36的下方。图14中所示的口36，和对应的孔38用于导入待电泳分离的蛋白质或蛋白质片段的样品。然而，本文公开的方法中使用的口和孔的排列方式不限于单行并且可以包括其他排列方式，例如本文讨论的各种阵列。在一个实施方案中，夹盒10包含多个口和多个孔，其中多个口和多个孔为1-200个口和1-200个孔。在另一个实施方案中，多个口和多个孔为1-100个口和1-100个孔。在另一个实施方案中，多个口和多个孔为1-50个口和1-50个孔。在某些实施方案中，夹盒10包含96个口和96个孔，而在某些实施方案中，夹盒10包含48个口和48个孔。本文讨论了口36和37及孔38和39的尺寸，然而在一个实施方案中，孔38和39的尺寸为0.5-5mm宽，1-5mm长，3-5mm深。
孔可以通过任何合适的方法形成，例如在电泳凝胶基质装配期间，当电泳凝胶基质仍为液态时，通过将″梳子″插入分离室内的电泳凝胶基质中而形成。所述的″梳子″具有经排列的突出的齿状物，从而齿状物经由顶壁18中的口插入电泳凝胶基质中。当基质固化成凝胶状态时，围绕梳子部件在电泳凝胶基质中形成孔。当将梳子拔出电泳凝胶基质时，口和孔可用于加载液体，例如样品，缓冲剂或水。可以紧在加载前移除梳子，或可以在加载前一段时间移除梳子，例如加载前5秒至1天，或加载前10秒至12小时，或加载前10秒至30分钟。可选地，从电泳凝胶基质中拔出梳子并且用胶带覆盖口和夹盒的顶部(包括口和对应的孔)，从而封闭所得的孔以避免潜在的污染。然后，紧在加载前除去胶带，或可以在加载前一段时间除去它，例如加载前5秒至1天，或加载前10秒至12小时。
在某些实施方案中，电泳夹盒可以在夹盒中的包含液体缓冲剂的区域中具有电极。在某些实施方案中，包含液体缓冲剂的区域在与电泳凝胶相同的平面中，而在其他实施方案中，包含液体缓冲剂的区域位于电泳凝胶平面之下或之上。在其他实施方案中，电极与凝胶(例如电泳凝胶)直接接触，所述凝胶包含离子以便于施加电场而不需要液体缓冲剂。在其他实施方案中，将电极嵌入凝胶，例如电泳凝胶，所述凝胶包含离子以便于施加电场而不需要液体缓冲剂。在其他实施方案中，电极与凝胶(例如电泳凝胶)间接接触，所述凝胶包含离子以便于施加电场而不需要液体缓冲剂，所述间接接触可以是经由另一种凝胶物质或通过简单的电接触。
可选地，本文描述的方法中使用的分离技术是使用电泳平板凝胶的开放系统，其中所述平板凝胶没有浸在电泳缓冲剂中并且不包含在夹盒内。在所述方法中，平板凝胶包含上表面和下表面，其中上表面不与液体接触，或平板凝胶不浸在用于进行电泳分离的电泳缓冲剂中。在所述方法中，例如，将平板凝胶直接或间接地与电极接触并且施加电场以进行样品的电泳迁移。可以使用毛细渗透技术(wickingtechnique)实现间接接触，其中将电极置于缓冲槽中，所述缓冲槽在平板凝胶和槽之间具有毛细渗透工具，或者可以使用位于电极和平板凝胶之间的凝胶基质实现间接接触。此外，此类方法中使用的平板凝胶包含上样孔和收集孔的阵列(如本文对于电泳夹盒公开的)，从而虽然不使用口，但分离的方法与对于电泳夹盒公开的那些相同。
可选地，本文描述的方法中使用的分离技术是使用电泳平板凝胶的开放系统，其中所述平板凝胶浸在电泳缓冲剂中但不包含在夹盒内。
本文公开的方法中使用的平板凝胶和电泳夹盒可以具有单行孔和口或所述凝胶和夹盒可以具有孔和口的阵列。所述孔和口的阵列可以公开为″r ×c″阵列，其中r为行的数目，而c为列的数目。所述阵列的行的数目(r)和列的数目(c)彼此独立并且因此本文公开的方法中使用的孔和口的阵列可以是对称阵列(其中r＝c)或不对称阵列(其中r≠c)。所述孔和口的阵列可以包括至少1行，至少2行，至少3行，至少4行，至少5行，至少6行，至少7行，至少8行，至少9行，至少10行，只是11行，至少12行，至少15行，至少20行，至少50行，或至少100行，相互独立地，与至少1列，至少2列，至少3列，至少4列，至少5列，至少6列，至少7列，至少8列，至少9列，至少10列，至少11列，至少12列，至少15列，至少20列，至少50列，或至少100列组合。
本文公开的方法中使用的孔和口的阵列的非限制性实例包括但不限于r×1阵列，r×2阵列，r×3阵列，r×4阵列，r×5阵列，r×6阵列，r×7阵列，r×8阵列，r×9阵列，r×10阵列，r×11阵列，r×12，r×13阵列，r×14阵列，r×15阵列，r×16阵列，r×17阵列，r×18阵列，r×19阵列，r×20阵列，r×21阵列，r×22阵列，r×23阵列，r×24阵列，r×25和r×26阵列，其中r为2至26的整数。
本文公开的方法中使用的孔和口的阵列的其他非限制性实例包括但不限于1×c阵列，2×c阵列，3×c阵列，4×c阵列，5×c阵列，6×c阵列，7×c阵列，8×c阵列，9×c阵列，10×c阵列，11×c阵列，12×c，13×c阵列，14×c阵列，15×c阵列，16×c阵列，17×c阵列，18×c阵列，19×c阵列，20×c阵列，21×c阵列，22×c阵列，23×c阵列，24×c阵列，25×c，和26×c阵列，其中c为2至26的整数。
本文公开的方法中使用的孔的阵列中孔和口的排列可以是单行孔和口。可选地，本文公开的方法中使用的孔的阵列中孔和口的排列包括但不限于图16中所示的那些。所述排列可以为如图16E-16F所示的棋盘模式。其中行以交错形式排列。可选地，孔和口的排列可以为图14A-14D所示的模式。在此类阵列模式中，孔和口的数目可以为2至200，2至150，2至96，2至48，2至24或2至12。
在某些实施方案中，在孔和口的阵列的行中，孔之间的间距和口之间的间距为等距离的，并且可以为5mm至10cm(从一个孔的中心测量至下一个孔)。在某些实施方案中，在孔和口的阵列的列中，孔之间的间距和口之间的间距为等距离的，并且可以为5mm至10cm(从一个孔的中心测量至下一个孔)。
在某些实施方案中，在孔和口的阵列的行中，孔之间的间距和口之间的间距可以从左至右以线性增量增加，其中第一间距为5mm至10cm(从第一孔的中心测量至下一孔)并且增量为5mm至10cm。可选地，在某些实施方案中，在孔和口的阵列的行中，孔之间的间距和口之间的间距可以从左到右以线性增量减少，其中第一间距为5mm至10cm(从第一孔的中心测量至下一孔)并且增量为5mm至10cm。
在某些实施方案中，在孔和口的阵列的行中，孔之间的间距和口之间的间距可以从左至右以非线性增量增加，其中第一间距为5mm至10cm(从第一孔的中心测量至下一孔)并且增量为5mm至10cm。可选地，在某些实施方案中，在孔和口的阵列的行中，孔之间的间距和口之间的间距可以从左到右以非线性增量减少，其中第一间距为5mm至10cm(从第一孔的中心测量至下一孔)并且增量为5mm至10cm。
在某些实施方案中，在孔和口的阵列的列中，孔之间的间距和口之间的间距可以自上而下以线性增量增加，其中第一间距为5mm至10cm(从第一孔的中心测量至下一孔)并且增量为5mm至10cm。可选地，在某些实施方案中，在孔和口的阵列的列中，孔之间的间距和口之间的间距可以自上而下以线性增量减少，其中第一间距为5mm至10cm(从第一孔的中心测量至下一孔)并且增量为5mm至10cm。
在某些实施方案中，在孔和口的阵列的列中，孔之间的间距和口之间的间距可以自上而下以非线性增量增加，其中第一间距为5mm至10cm(从第一孔的中心测量至下一孔)并且增量为5mm至10cm。可选地，在某些实施方案中，在孔和口的阵列的列中，孔之间的间距和口之间的间距可以自上而下以非线性增量减少，其中第一间距为5mm至10cm(从第一孔的中心测量至下一孔)并且增量为5mm至10cm。
孔和口的阵列中的各个孔和口的形状可以相互独立地为圆形，半圆形，正方形，长方形，三角形，或椭圆形。不同形状的孔的尺寸可以如下：
圆形的孔：直径为2mm至15mm；并且深度为1mm至6mm，
半圆形的孔：半径为1mm至7.5mm；并且深度为1mm至6mm，
正方形的孔：长度和宽度为2mm至15mm；且深度为1mm至6mm，
长方形的孔：长度为2mm至15mm；宽度为2mm至15mm；并且深度为1mm至6mm，
三角形的孔：长度为2mm至15mm；高度为2mm至15mm；并且深度为1mm至6mm，
椭圆形的孔：长度为2mm至15mm；高度为2mm至15mm；并且深度为1mm至6mm。
尽管所述孔可以为圆形或椭圆形，但优选本发明的孔为正方形，长方形，半圆形或三角形，其在电泳的方向上具有基本上平的壁，因为在电泳的方向上的不平的壁可以在电泳期间对样品条带产生不利影响并且因此影响分离的样品组分的分辨。此外，所述孔的深度应该小于电泳凝胶的厚度，其中所述孔的底部由电泳凝胶而非电泳夹盒的壁形成。
孔的阵列中的各个孔相互独立地可以具有150nL至14mL的体积。在某些实施方案中，各个孔的体积相互独立地可以为5μL至10mL。在某些实施方案中，各个孔的体积相互独立地可以为5μL至1mL。在某些实施方案中，各个孔的体积相互独立地可以为5μL至500μL。在某些实施方案中，各个孔的体积相互独立地可以为5μL至200μl。在某些实施方案中，各个孔的体积相互独立地可以为5μL至100μL。较大体积的孔，包括但不限于体积为500μL至14mL的孔，可以用于从大体积样品分离，分开和收集目的组分。
本文描述的方法中使用的凝胶夹盒的聚合物组分可以由聚合物制备，所述聚合物为可见光透明的，紫外线透明的，红外线透明的，或可见光和紫外线透明的。用于制备本文公开的凝胶夹盒的聚合物的非限制性实例为苯乙烯丙烯腈，聚碳酸酯，聚苯乙烯，基于丙烯酸的聚合物，聚甲基丙烯酸甲酯，聚对苯二甲酸乙二酯，乙二醇修饰的聚对苯二甲酸乙二酯，聚丙烯，Acetel和其共聚物。凝胶夹盒的聚合物组分可以用成型技术，热压方法，铸造方法，热成形方法，立体光刻方法，加工方法和铣削方法制造。在进一步或可选的实施方案中，所述成型技术包括注射成型和模压成型。
如本文公开的，凝胶夹盒还包括两个电极，阳极和阴极，其中孔和口的阵列位于所述电极之间。所述电极用于产生用于驱动电泳迁移和样品组分的分离的电场。电泳夹盒的电极可以是导电金属材料或导电非金属物质，包括但不限于铂，钯，金，铜，铅，铝，银，镍，铁，不锈钢，石墨，或碳。可选地，电泳夹盒的电极可以包含用导电金属或非金属覆盖的非导体材料，所述导电金属或非金属包括但不限于铂，钯，金，铜，铅，铝，银，镍，铁，不锈钢，石墨，碳或其组合。
电泳凝胶夹盒中的口的阵列具有至少一行或一列上样口，其中样品可以通过口加载到位于所述上样口下方的对应的上样孔中。
本文公开的方法中使用的电泳凝胶夹盒可以任选地具有位于阳极和电泳凝胶之间的阳离子离子交换基质，并且可以具有位于阴极和电泳凝胶之间的阴离子离子交换基质。并入凝胶夹盒的阳离子交换材料的非限制性实例为CM-25-120Sephadex，并入凝胶夹盒的阴离子交换材料的非限制性实例为WA-30，二者均可商购自Sigma Inc.of St.Louis，U.S.A。
本文公开的方法中使用的电泳凝胶夹盒可以具有电泳凝胶，所述的电泳凝胶已经浇注到分离室中，且具有任选地由至少一个凝胶梳子占据的孔。移除一个或多个梳子以提供用作上样孔和收集孔的孔。可选地，本文公开的方法中使用的电泳凝胶夹盒可以是空的并且电泳凝胶由用户浇注(使用适当的梳子)以产生用作上样孔和收集孔的孔的阵列。
组合物
另一方面，本文提供了用于实施本文描述的方法的组合物。一个实施方案是包含双砷荧光团，氨基反应性荧光染料和还原剂的组合物。另一个实施方案是pH为pH 6至pH 9的包含氨基反应性荧光试剂，碱性氰化物(或可选地丙酮氰醇或腈例如苯乙醇腈)和还原剂的组合物。另一个实施方案是pH为pH 6至pH 9的包含氨基反应性荧光试剂，碱性氰化物(或可选地丙酮氰醇或苯乙醇腈)，双砷荧光团和还原剂的组合物。
另一方面，提供了组合物，其包括pH为pH 8至pH 10的缓冲剂，标签结合荧光染料，阴离子表面活性剂，糖或糖醇，示踪染料，一种或多种还原剂和碳酸氢盐。
在某些实施方案中，所述组合物中的一种或多种还原剂选自三烷基膦化合物，二硫苏糖醇(DTT)，2-巯基乙醇，亚硫酸氢钠，巯基乙酸，巯基乙磺酸或谷胱甘肽，其中三烷基膦化合物是三-N-丁基膦(TBP)或三[2-羧乙基]膦(TCEP)。
在某些实施方案中，所述组合物中的标签结合荧光染料是双砷荧光团。在某些实施方案中，所述组合物中的标签结合荧光染料是荧光素的双砷衍生物。在某些实施方案中，所述组合物中的标签结合荧光染料是4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)荧光素-(2，2-乙二硫醇)2。在某些实施方案中，所述组合物中的标签结合荧光染料是试卤灵的双砷衍生物。在某些实施方案中，所述组合物中的标签结合荧光染料是4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)试卤灵-(2，2-乙二硫醇)2。
在某些实施方案中，所述组合物中的阴离子表面活性剂是烷基苯磺酸盐，烷基磺酸盐，烷基磺基琥珀酸盐，烷基磷酸盐，烷基硫酸盐，烷基羧酸盐，烷基醚苯磺酸盐，烷基醚磺酸盐，烷基醚磺基琥珀酸盐，烷基醚磷酸盐，烷基醚硫酸盐或烷基醚羧酸盐。在某些实施方案中，所述组合物中的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸锂，月桂基乙醚硫酸钠，油酸钠，棕榈酸钠，肉豆蔻酸钠，或硬脂酸钠。在某些实施方案中，所述组合物中的阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸锂。
在某些实施方案中，所述组合物中的阴离子表面活性剂是蔗糖，并且在其他实施方案中，所述糖醇是甘油。在某些实施方案中，示踪染料是溴酚蓝。在某些实施方案中，所述组合物中的缓冲剂选自碳酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐，硼酸盐，Bis-Tris丙烷，和N-二(羟乙基)甘氨酸。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含带标签的蛋白质。在某些实施方案中，所述带标签的蛋白质的标签为包含四半胱氨酸的肽。
在某些实施方案中，所述组合物进一步包括氨基反应性荧光染料。在某些实施方案中，所述组合物中的氨基反应性荧光染料具有选自荧光素部分，罗丹明部分，吖啶部分，香豆素部分，吲哚部分，异吲哚部分，中氮茚部分，喹啉部分，异喹啉部分，色烯部分，夹氧杂蒽部分，萘部分，芘部分，bimane部分和BODIPY部分的荧光部分。在某些实施方案中，所述组合物中的氨基反应性荧光染料进一步包括选自酰基叠氮，羰基叠氮化物，异硫氰酸酯，异氰酸酯，琥珀酰亚胺酯，羧酸酯，羧酸，琥珀酰亚胺酯，磺基琥珀酰亚胺酯，STP酯，四氟苯基酯，磺酰氯，酸性卤化物，醛，甲醛，二氯三嗪，NBD氯化物，或NBD氟化物的反应性部分。
在一个实施方案中，所述组合物包括pH为pH 8至pH 10的磷酸盐缓冲剂，4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)荧光素-(2，2-乙二硫醇)2，十二烷基硫酸钠，甘油，溴酚蓝，三[2-羧乙基]膦(TCEP)，巯基乙磺酸和碳酸氢盐。
试剂盒
本文公开的另一方面是用于蛋白质标记和分析的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包括如本文描述的氨基反应性荧光试剂，如本文描述的碱性氰化物(或可选地，丙酮氰醇或腈例如苯乙醇腈)，如本文描述的第一缓冲剂和如本文描述的第二缓冲剂。所述试剂盒可以任选地包括如本文描述的还原剂，如本文描述的凝胶夹盒，如本文描述的阴离子表面活性剂，烷化剂例如二甲基丙烯酰胺(DMA)和本领域已知的其他烷化剂，或其组合。此外，所述试剂盒可以任选地包括可选的非荧光凝胶上样缓冲剂，其可以包含一种或多种示踪染料，例如溴酚蓝，溴甲酚绿，Serva blue G250或Ponceau S，但不包含酚红。
在本文公开的其他实施方案中，试剂盒包括如本文描述的双砷荧光团，如本文描述的氨基反应性荧光染料，如本文描述的第一缓冲剂和如本文描述的第二缓冲剂。所述试剂盒可以任选地包括如本文描述的还原剂，如本文描述的凝胶夹盒，如本文描述的阴离子表面活性剂，烷化剂例如(DMA)和本领域已知的其他烷化剂，或其组合。
在某些实施方案中，试剂盒包括：
a)第一组合物，其包含pH为pH 8至pH 10的缓冲剂，与至少四半胱氨酸部分结合的荧光染料，至少一种还原剂，阴离子表面活性剂，糖或糖醇，示踪染料，一种或多种还原剂和碳酸氢盐；和
b)第二组合物，其包含氨基反应性荧光染料。
在所述试剂盒的某些实施方案中，氨基反应性荧光染料包含选自荧光素部分，罗丹明部分，吖啶部分，香豆素部分，吲哚部分，异吲哚部分，中氮茚部分，喹啉部分，异喹啉部分，色烯部分，夹氧杂蒽部分，萘部分，芘部分，bimane部分和BODIPY部分的荧光部分。在所述试剂盒的其他实施方案中，氨基反应性荧光染料进一步包括选自酰基叠氮，羰基叠氮化物，异硫氰酸酯，异氰酸酯，琥珀酰亚胺酯，羧酸酯，羧酸，琥珀酰亚胺酯，磺基琥珀酰亚胺酯，STP酯，四氟苯基酯，磺酰氯，酸性卤化物，醛，甲醛，二氯三嗪，NBD氯化物，或NBD氟化物的反应性部分。在所述试剂盒的其他实施方案中，阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸锂，月桂基乙醚硫酸钠，油酸钠，棕榈酸钠，肉豆蔻酸钠，或硬脂酸钠。在所述试剂盒的其他实施方案中，阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸锂。在所述试剂盒的其他实施方案中，还原剂选自三烷基膦化合物，二硫苏糖醇(DTT)，2-巯基乙醇，亚硫酸氢钠，巯基乙酸，巯基乙磺酸，谷胱甘肽或其组合。在所述试剂盒的其他实施方案中，三烷基膦化合物是三-N-丁基膦(TBP)或三[2-羧乙基]膦(TCEP)。在所述试剂盒的其他实施方案中，与至少四半胱氨酸部分结合的荧光染料是双砷荧光团。在所述试剂盒的其他实施方案中，双砷荧光团是荧光素的双砷衍生物。在所述试剂盒的其他实施方案中，双砷荧光团是4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)荧光素-(2，2-乙二硫醇)2。在所述试剂盒的其他实施方案中，双砷荧光团是试卤灵的双砷衍生物。在所述试剂盒的其他实施方案中，双砷荧光团是4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)试卤灵-(2，2-乙二硫醇)2。在所述试剂盒的其他实施方案中，糖是蔗糖。在所述试剂盒的其他实施方案中，糖醇是甘油。在所述试剂盒的其他实施方案中，示踪染料是溴酚蓝。在所述试剂盒的其他实施方案中，缓冲剂选自碳酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐，硼酸盐，Bis-Tris丙烷，和N-二(羟乙基)甘氨酸。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含第一组合物和第二组合物，其中所述第一组合物包含6％w/v LDS，30％w/v蔗糖，1M碳酸盐缓冲剂(pH大约9.2)，5X苯乙醇腈，和ATTO-TAG FQ(于DMSO中)，所述第二组合物包含无荧光缓冲剂(4X)。
本领域技术人员将理解，本发明不限于上文特别展示和公开的内容。通过参考以下实施例，进一步阐明本发明，所述实施例仅意欲为示例性的，而不意欲以任何方式限制本发明的范围。以下实施例意欲为示例性的，而不意欲限制本文公开的发明。
实施例
除非另有说明，在实施例1-9中使用下列材料和原试剂：
1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂，pH＝9.2：
2.3mL的溶于水的1M碳酸氢钠(J.T.Baker)
0.2mL的溶于水的1M碳酸钠(Fisher)
5X LDS/蔗糖：
溶于水的10％w/v LDS(Sigma)和50％w/v蔗糖(ResearchOrganics)
3X bis-Tris：
溶于水的0.90bis-Tris(Research Organics)，用6N HCl(VWR)调节pH至6.5
1X bis-Tris/LDS/蔗糖(300mM bis-Tris，2％LDS，和10％蔗糖)：
通过用适当体积的超纯水稀释3X bis-Tris和5X LDS/蔗糖制备1X
Figure G200880024991XD00651
样品缓冲剂：
通过用超纯水稀释
Figure G200880024991XD00652
LDS样品缓冲剂(4X)(Invitrogen)制备
20mMATTO-TAGTMFQ(Molecular Probes，Eugene，Oregon)：
将995μL甲醇(J.T.Baker)装入包含5mg固体材料的小瓶溶于水的100mM氰化钠(Fluka)，丙酮氰醇或苯乙醇腈
实施例1-9中使用的″10X″标记溶液根据表1进行制备。
表1
  原液   组分体积(μl)
  5X LDS/蔗糖*   120*
  1M碳酸盐/碳酸氢盐，pH＝9.2   30
  100mM NaCN或苯乙醇腈   30
  20mM ATTO-TAG-FQ   60
  超纯水   60
  总体积   300μl
*对于即用标准，预制混合物中不加入5X LDS/蔗糖：改为添加相同体积的超纯水。
″10X″标记溶液的组分的浓度在下面的表2中列出。
表2
  反应混合物组分   标记期间的浓度
  LDS&蔗糖*   1X*
  碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂   50mM
  经纯化的蛋白质   0.5或5mg/ml
  反应混合物组分   标记期间的浓度
  NaCN或苯乙醇腈   5mM
  ATTO-TAG-FQ   2mM
 甲醇(来自FQ原液)(任选地，可以用DMSO取代甲醇) 10％
*对于即用标准，预制混合物中不加入5X LDS/蔗糖：改为添加相同体积的超纯水。
通过1比10稀释10X溶液制备实施例1-9中使用的“1X”标记溶液，并且“1X”标记溶液的组分的浓度在下面的表3中列出。
表3
  反应混合物组分   标记期间的浓度
  LDS&蔗糖*   0.1X*
  碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂   5mM
  经纯化的蛋白质   0.5或5mg/ml
  NaCN   0.5mM
  ATTO-TAG-FQ   0.2mM
  甲醇(来自FQ原液)   1％
*对于即用标准，预制混合物中不加入5X LDS/蔗糖：改为添加相同体积的超纯水。
通过称量固体材料(冻干的)(h-IgG除外，其以11mg/ml的原液形式提供)然后用适当体积的超纯水溶解，制备1mg/mL或10mg/mL的实施例1-9中使用的蛋白质原液。实施例1-9中使用的蛋白质是牛血清白蛋白(BSA)，片段V(Sigma)；人IgG(h-IgG)(Pierce)；来自鸡卵白的溶菌酶(Sigma)和来自马的心脏的肌红蛋白(Sigma)。
实施例1：蛋白质标准和经纯化的蛋白质的标记
图5中展示用氨基反应性荧光试剂标记蛋白质标准和其他蛋白质(例如牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶)的一个实施方案。通过将5μ1的10X标记溶液加到5μl的1mg/mL蛋白质原液或10mg/ml蛋白质原液中并且在室温下温育10分钟来在微量离心管中标记BSA和溶菌酶。然后添加2μl的5X LDS/蔗糖，6μl的0.91M bis-Tris(pH 6.5)和2μl的
Figure G200880024991XD00671
样品还原剂(10X)(或对于未还原的样品，超纯水)，从而得到0.125mg/ml或1.25mg/ml的各蛋白质，然后该混合物在70℃温育10分钟。温育后，进一步用1X
Figure G200880024991XD00672
样品缓冲剂或1X bis-Tris/LDS/蔗糖稀释混合物以得到0.1mg/ml或1mg/ml的蛋白质浓度。对于使用凝胶电泳进行的电泳分离，所用的蛋白质浓度为0.1mg/ml，因此，在加载经标记的样品之前，用1X
Figure G200880024991XD00673
样品缓冲剂将1mg/ml的样品稀释十倍。
通过向5μl的BenchMarkTM蛋白质梯(Invitrogen，Carlsbad)和Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，Carlsbad)添加5μl的10X标记溶液(用相同体积的超纯水代替5X LDS/蔗糖)并且在室温下温育10分钟来进行BenchMarkTM蛋白质梯(Invitrogen，Carlsbad)和Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，Carlsbad)的标记。
通过将最终的样品(2μl的0.1mg/ml制备物，以在凝胶中包含200ng蛋白质)加载到4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中，在200伏特下在XCell SureLockTM Mini-Cell(Invitrogen)或XCell4SureLockTM Midi-Cell(Invitrogen)中使用1X
Figure G200880024991XD00682
2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)/SDS电泳缓冲剂(Invitrogen)进行电泳来实现电泳分离，并且根据提供的说明书用SimplyBlueTM SafeStain(Invitrogen)染色。直接加载经标记的BenchMarkTM蛋白质梯(Invitrogen，Carlsbad)和Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，Carlsbad)而不进一步稀释或添加还原剂。
图5A中给出的凝胶图像显示荧光标记的蛋白质标准，经标记的BSA和经标记的溶菌酶的电泳分离。图5B为使用SimplyBlueTMSafeStain的后染色，用于证明本文描述的使用氨基反应性荧光染料的标记方法的效率。经标记的样品对应于图5的凝胶图像中给出的下列凝胶泳道：
凝胶泳道                    样品
1.            5μl经标记的BenchMarkTM蛋白质梯(Invitrogen，
              Carlsbad)
2.            5μl经标记的和再还原的BenchMarkTM蛋白质梯
              (Invitrogen，Carlsbad)
3.            5μl经标记的Mark12TM Unstained Standard
              (Invitrogen，Carlsbad)
4.            5μl经标记的和再还原的Mark12TM Unstained
              Standard(Invitrogen，Carlsbad)
5.            5μl经标记的
Figure G200880024991XD00683
Sharp Pre-stained Protein
              Standards(Invitrogen，Carlsbad)
6.            5μl经标记的和再还原的Sharp Pre-stained
              Protein Standards(Invitrogen，Carlsbad)
7.            以0.5mg/ml标记的200ng溶菌酶，200ng BSA，未
          还原的
8.        以0.5mg/ml标记的200ng溶菌酶，200ng BSA，经
          还原的
9.        以5mg/ml标记的200ng溶菌酶，200ng BSA，未还
          原的
10.       以5mg/ml标记的200ng溶菌酶，200ng BSA，经还
          原的
11.       200ng BSA，200ng溶菌酶，未经标记的对照，未
          还原的
12.       200ng BSA，200ng溶菌酶，未经标记的对照，经
还原的
实施例2：检测的灵敏度
通过检测不同浓度的经标记的牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶，评估检测的灵敏度，所述检测使用用本文描述的氨基反应性荧光试剂标记的蛋白质。
通过向5μl的1mg/mL蛋白质原液添加5μl的10X标记溶液并且在室温下温育10分钟来在微量离心管中标记BSA和溶菌酶。然后添加2μl的5X LDS/蔗糖，6μl的0.91M bis-Tris(pH 6.5)和2μl的
Figure G200880024991XD00691
样品还原剂(10X)(或对于未还原的样品，超纯水)，从而得到0.125mg/ml的各蛋白质，然后该混合物在70℃温育10分钟。温育后，用1X
Figure G200880024991XD00692
样品缓冲剂或1X bis-Tris/LDS/蔗糖进一步稀释该混合物以达到0.1mg/ml(凝胶中200ng蛋白质)。然后进一步用1X bis-Tris/LDS/蔗糖稀释该溶液以获得20ng蛋白质，5ng蛋白质，2ng蛋白质，0.5ng蛋白质和0.2ng蛋白质的溶液。
通过将2μl稀释系列物加载到
Figure G200880024991XD00693
4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中，在200伏特下在XCell SureLockTM Mini-Cell(Invitrogen)或XCell4SureLockTM Midi-Cell(Invitrogen)中使用1X
Figure G200880024991XD00694
2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)/SDS电泳缓冲剂(Invitrogen)进行电泳来实现电泳分离，并且根据提供的说明书用SimplyBlueTMSafeStain(Invitrogen)染色。
图6A中给出的凝胶图像显示荧光标记的蛋白质标准，经标记的BSA和经标记的溶菌酶的电泳分离。图6B为使用SimplyBlueTMSafeStain的后染色，用于证明本文描述的使用氨基反应性荧光染料的标记方法的效率。SimplyBlueTMSafeStain对于BSA的检测灵敏度为大约20ng，即在这个量或更少的蛋白量的情况下，将几乎没有或没有图像产生(如图6B所示)。相比之下，本发明的标记方法对这些蛋白质水平能够提供显著的图像(图6A)。经标记的样品对应于图6的凝胶图像中给出的下列凝胶泳道：
凝胶泳道            样品
1和3          20ng BSA，20ng溶菌酶，经标记的，未还原的
2和4          20ng BSA，20ng溶菌酶，经标记的，经还原的
5             5ng BSA，5ng溶菌酶，经标记的，未还原的
6             5ng BSA，5ng溶菌酶，经标记的，经还原的
7             2ng BSA，2ng溶菌酶，经标记的，未还原的
8             2ng BSA，2ng溶菌酶，经标记的，经还原的
9             0.5ng BSA，0.5ng溶菌酶，经标记的，未还原的
10            0.5ng BSA，0.5ng溶菌酶，经标记的，经还原的
11            0.2ng BSA，0.2ng溶菌酶，经标记的，未还原的
12            0.2ng BSA，0.2ng溶菌酶，经标记的，经还原的
实施例3：检测的灵敏度
用不同浓度的经标记的牛血清白蛋白(BSA)评估使用不同的成像仪器获得的检测的灵敏度，所述的仪器用于测量根据本文描述的方法用氨基反应性荧光试剂标记的蛋白质。
通过向5μl的10mg/mL BSA原液添加5μl的10X标记溶液并且在室温下温育10分钟来在微量离心管中标记BSA。然后添加2μl的5X LDS/蔗糖，6μl的0.91M bis-Tris(pH 6.5)和2μl的
Figure G200880024991XD00701
样品还原剂(10X)，从而得到1.25mg/ml的BSA。然后该混合物在70℃温育10分钟。温育后，用1X
Figure G200880024991XD00711
样品缓冲剂或1Xbis-Tris/LDS/蔗糖进一步稀释该混合物以达到1mg/ml(凝胶中2000ng蛋白质)。然后进一步用1X bis-Tris/LDS/蔗糖稀释该溶液以获得500ng BSA，200ng BSA，50ng BSA，20ng BSA，5ng BSA，2ng BSA，0.5ng BSA，0.2ng BSA和0.05ng BSA的溶液。
通过将2μl稀释系列物加载到
Figure G200880024991XD00712
4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中，在200伏特下在XCell SureLockTM Mini-Cell(Invitrogen)或XCell4 SureLockTM Midi-Cell(Invitrogen)中使用1X2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)/SDS电泳缓冲剂(Invitrogen)进行电泳来实现电泳分离，并且根据提供的说明书用SimplyBlueTMSafeStain(Invitrogen)染色。
图7A和7B中给出的凝胶图像显示荧光标记的BSA和预标记的标准(
Figure G200880024991XD00714
Plus2 Protein Standard(Invitrogen，Carlsbad))的电泳分离。图7A为用Fujifilm LAS-1000(477nm EPI光源，520-640nm带通滤光片和60秒曝光时间)获得的经标记的BSA(还原的)的凝胶图像。图7B为使用Safe Imager(～470nm光源)获得的图像，用Kodak DC290数码相机(2.1MP，8秒曝光时间)获得的图像。图7C为使用SimplyBlueTM SafeStain的后染色，用于证明本文描述的使用氨基反应性荧光染料的标记方法的效率。经标记的样品对应于图7的凝胶图像中给出的下列凝胶泳道：
凝胶泳道                样品
1.            3μl
Figure G200880024991XD00715
Plus2 Protein Standard
              (Invitrogen，Carlsbad)
2.            500ng BSA
3.            200ng BSA
4.            50ng BSA
5.            20ng BSA
6.            5ng BSA
7.        2ng BSA
8.        0.5ng BSA
9.        0.2ng BSA
10.       0.05ng BSA
实施例4：细胞裂解物的标记
使用本文描述的方法用氨基反应性荧光试剂在不同时间进行的细胞裂解物的标记通过标记大肠杆菌裂解物来证实。
通过向5μl的大肠杆菌裂解物添加5μl的10X标记溶液并且在室温下温育10分钟，30分钟和1小时，在微量离心管中标记大肠杆菌裂解物。然后向各个样品添加2μl的5X LDS/蔗糖，6μl的0.91Mbis-Tris(pH 6.5)和2μl的
Figure G200880024991XD00721
样品还原剂(10X)，并且该混合物在70℃温育10分钟。温育后，用1X
Figure G200880024991XD00722
样品缓冲剂或1Xbis-Tris/LDS/蔗糖稀释该混合物以实现。
通过将2μl经标记的大肠杆菌裂解物(10μg/泳道)加载到4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中，在200伏特下在XCellSureLockTM Mini-Cell(Invitrogen)或XCell4SureLockTM Midi-Cell(Invitrogen)中使用1X
Figure G200880024991XD00724
2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)/SDS电泳缓冲剂(Invitrogen)进行电泳来实现电泳分离，并且根据提供的说明书用SimplyBlueTM SafeStain(Invitrogen)染色。
图8A中给出的凝胶图像显示经荧光标记的大肠杆菌裂解物和预标记的标准(
Figure G200880024991XD00725
Plus2Protein Standard(Invitrogen，Carlsbad))的电泳分离，使用Fujifilm LAS-1000(477nm EPI光源，520-640nm带通滤光片和30秒曝光时间)获得图像。图8B为使用SimplyBlueTM SafeStain的后染色，用于证明标记方法的效率。经标记的样品对应于图8的凝胶图像中给出的下列凝胶泳道：
凝胶泳道                样品和时间
1.            大肠杆菌裂解物(经还原的)，10分钟
2.            大肠杆菌裂解物(经还原的)，30分钟
3.            大肠杆菌裂解物(经还原的)，1小时
4.            10μlPlus2Prestained Standard
              (Invitrogen，Carlsbad)
实施例5：细胞裂解物的标记
使用本文描述的方法用氨基反应性荧光试剂进行的细胞裂解物的标记通过标记大鼠肝裂解物来证实。还标记蛋白质溶菌酶作为对照。
通过向5μl的大鼠肝裂解物添加5μl的10X标记溶液并且在室温下温育10分钟，在微量离心管中标记大鼠肝裂解物。然后向各个样品添加2μl的5X LDS/蔗糖，6μl的0.91M bis-Tris(pH 6.5)和2μl的
Figure G200880024991XD00732
样品还原剂(10X)，并且该混合物在70℃温育10分钟。温育后，用1X
Figure G200880024991XD00733
样品缓冲剂或1X bis-Tris/LDS/蔗糖稀释该混合物以实现。
通过向5μl的1mg/mL溶菌酶原液添加5μl的10X标记溶液并且在室温下温育10分钟，在微量离心管中标记溶菌酶。然后添加2μl的5X LDS/蔗糖，6μl的0.91M bis-Tris(pH 6.5)和2μl的
Figure G200880024991XD00734
样品还原剂(10X)，从而得到0.125mg/ml的蛋白质，然后该混合物在70℃温育10分钟。温育后，用1X
Figure G200880024991XD00735
样品缓冲剂或1Xbis-Tris/LDS/蔗糖进一步稀释该混合物以达到0.1mg/ml的蛋白质浓度。
通过将2μl经标记的大鼠肝裂解物(20μg/泳道)和2μl溶菌酶(1μg/泳道)加载到
Figure G200880024991XD00736
4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中，在200伏特下在XCell SureLockTM Mini-Cell(Invitrogen)或XCell4 SureLockTM Midi-Cell(Invitrogen)中使用1X
Figure G200880024991XD00737
2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)/SDS电泳缓冲剂(Invitrogen)进行电泳来实现标记的裂解物、溶菌酶和预标记的蛋白质标准的电泳分离，并且根据提供的说明书用SimplyBlueTM SafeStain(Invitrogen)染色。
图9表示使用本文描述的方法进行的不同蛋白质的标记。图9A为经标记的溶菌酶(经还原的，泳道1)和SeeBlue Plus2(泳道2，用SimplyBlue Safe Stain染色)的凝胶图像，而图9B为SeeBlue Plus2(泳道1，用SimplyBlue Safe Stain染色)和经标记的大鼠肝裂解物(泳道3)的凝胶图像，其中泳道2为空白。使用Fujifilm LAS-1000(477nm EPI光源，520-640nm带通滤光片和30秒曝光时间)获得图像。
实施例6：在天然条件下进行的标记
图10表明，本文描述的方法可以用于在天然条件下用氨基反应性荧光试剂标记蛋白质，其中蛋白质具有不同的分子量和不同数目的反应性基团(例如赖氨酸残基)。图10还阐明荧光信号对存在的经标记的蛋白质的量的比例以及本文描述的标记方法用于在还原过程中维持荧光信号强度的用途。经标记的蛋白质为牛血清白蛋白(BSA)，肌红蛋白，h-IgG和大肠杆菌裂解物。
如上述实施例中所述进行牛血清白蛋白(BSA)，肌红蛋白，h-IgG和大肠杆菌裂解物的标记和电泳分离。
图10A为用SimplyBlueTM SafeStain染色后的凝胶图像，而图10B为用本文描述的方法标记的h-IgG，肌红蛋白和BSA的凝胶图像。在下列凝胶泳道中分离经标记的样品：
凝胶泳道                样品和时间
1.            6μl Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，
              Carlsbad)
2.            0.5μg经标记的h-IgG，未还原的
3.            1μg经标记的h-IgG，未还原的
4.            0.5μg经标记的h-IgG，经还原的
5.            1μg经标记的h-IgG，经还原的
6.            0.5μg经标记的肌红蛋白，未还原的
7.            1μg经标记的肌红蛋白，未还原的
8.            0.5mg经标记的肌红蛋白，经还原的
9.            1μg经标记的肌红蛋白，经还原的
10.        0.5μg经标记的BSA，未还原的
11.        1μg经标记的BSA，未还原的
12.        0.5μg经标记的BSA，经还原的
13.        1μg经标记的BSA，经还原的
14.        2μg经标记的大肠杆菌裂解物，未还原的
15.        4μg经标记的大肠杆菌裂解物，未还原的
16.        2μg经标记的大肠杆菌裂解物，经还原的
17.        4μg经标记的大肠杆菌裂解物，经还原的
18.        0.5μg经标记的BSA，未还原的对照，在标记期间变性
19.        0.5μg经标记的BSA，经还原的对照，在标记期间变性
20.        6μl Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，
           Carlsbad)
实施例7：用不同浓度的反应物在变性条件下进行的标记
如上述实施例所述，通过用氨基反应性荧光试剂标记h-IgG，肌红蛋白，牛血清白蛋白(BSA)和大肠杆菌裂解物获得变性条件下的蛋白质标记以及反应物浓度对标记的蛋白质的荧光强度的影响。为了证明反应物浓度的影响，使用10X标记溶液或1X标记溶液标记蛋白质。
不同标记条件的结果在图11的凝胶图像中展示，其中用标记反应中存在的LDS和蔗糖标记h-IgG，肌红蛋白，BSA和大肠杆菌裂解物。上方的凝胶图像为用SimplyBlueTM SafeStain染色的凝胶，而下方的凝胶图像为荧光标记的h-IgG，肌红蛋白，BSA和大肠杆菌裂解物的图像。此外，未标记的蛋白质标准(Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，Carlsbad))和经标记的蛋白质一起电泳。经标记的样品对应于图11的凝胶图像中给出的下列凝胶泳道：
凝胶A泳道                样品
1.            0.5μgh-IgG，10X标记的，未还原的
2.            6μl Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，
              Carlsbad)
3.        1μg h-IgG，10X标记的，未还原的
4.        0.5μg h-IgG，10X标记的，经还原的
5.        1μg h-IgG，10X标记的，经还原的
6.        0.5μg h-IgG，1X标记的，未还原的
7.        1μg h-IgG，1X标记的，未还原的
8.        0.5μg h-IgG，1X标记的，经还原的
9.        1μg h-IgG，1X标记的，经还原的
10.       0.5μg肌红蛋白，10X标记的，未还原的
11.       1μg肌红蛋白，10X标记的，未还原的
12.       0.5μg肌红蛋白，10X标记的，经还原的
13.       1μg肌红蛋白，10X标记的，经还原的
14.       0.5μg肌红蛋白，1X标记的，未还原的
15.       1μg肌红蛋白，1X标记的，未还原的
16.       0.5μg肌红蛋白，1X标记的，经还原的
17.       1μg肌红蛋白，1X标记的，经还原的
18.       1μg标记的BSA，未还原的对照
19.       6μl Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，
          Carlsbad)
20.       1μg标记的BSA，经还原的对照
凝胶B泳道                样品
1.        0.5μg BSA，10X标记的，未还原的
2.        1μg BSA，10X标记的，未还原的
3.        6μl Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，
          Carlsbad)
4.        0.5μg BSA，10X标记的，经还原的
5.        1μg BSA，10X标记的，经还原的
6.        0.5μg BSA，1X标记的，未还原的
7.        1μg BSA，1X标记的，未还原的
8.         0.5μg BSA，1X标记的，经还原的
9.         1μg BSA，1X标记的，经还原的
10.        2μg大肠杆菌裂解物，10X标记的，经还原的
11.        4μg大肠杆菌裂解物，10X标记的，经还原的
12.        2μg大肠杆菌裂解物，10K标记的，再还原的
13.        4μg大肠杆菌裂解物，10X标记的，再还原的
14.        2μg大肠杆菌裂解物，1X标记的，经还原的
15.        4μg大肠杆菌裂解物，1X标记的，经还原的
16.        2μg大肠杆菌裂解物，1X标记的，再还原的
17.        4μg大肠杆菌裂解物，1X标记的，再还原的
18.        6μl Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，
           Carlsbad)
19.        1μg标记的BSA，未还原的对照
20.        1μg标记的BSA，经还原的对照
实施例8：标记的蛋白质的条带锐度和荧光强度取决于反应物浓 度和标记时间
使用本文描述的氨基反应性荧光试剂的蛋白质标记方法导致如在凝胶电泳中观察到的清晰的条带。通过用不同反应物浓度和标记时间用本文描述的方法用氨基反应性荧光试剂标记牛血清白蛋白(BSA)来展示对条带锐度的影响。此外，BSA的标记证明，所述标记方法在标记的蛋白质还原后不引起荧光信号的损失。用上述方法标记BSA，而反应物浓度通过使用10X标记溶液或1X标记溶液而改变，并且标记时间为15分钟或1小时。然后，如上述实施例中所述分离不同浓度的标记的BSA。图12表明，条带锐度不受不同反应条件的影响。上方的凝胶图像为标记的BSA的荧光图像，而下方的图像为用SimplyBlueTMSafeStain染色后的凝胶。未标记的蛋白质标准(Mark12TM UnstainedStandard(Invitrogen，Carlsbad))用作对照。使用Fujifilm′sLAS-1000(477nm EPI光源，520-640nm带通滤光片和1分钟曝光时间)获得荧光图像。在下列凝胶泳道中分离标记的样品：
凝胶泳道            样品和时间
1.        6μl Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，
          Carlsbad)
2.        0.5μg BSA，10X浓度，标记15分钟，未还原的
3.        1μg BSA，10X浓度，标记15分钟，未还原的
4.        0.5μg BSA，10X浓度，标记15分钟，经还原的
5.        1μg BSA，10X浓度，标记15分钟，经还原的
6.        0.5μg BSA，10X浓度，标记1小时，未还原的
7.        1μg BSA，10X浓度，标记1小时，未还原的
8.        0.5μg BSA，10X浓度，标记1小时，经还原的
9.        1μg BSA，10X浓度，标记1小时，经还原的
10.       0.5μg BSA，1X浓度，标记15分钟，未还原的
11.       1μg BSA，1X浓度，标记15分钟，未还原的
12.       0.5μg BSA，1X浓度，标记15分钟，经还原的
13.       1μg BSA，1X浓度，标记15分钟，经还原的
14.       0.5μg BSA，1X浓度，标记1小时，未还原的
15.       1μg BSA，1X浓度，标记1小时，未还原的
16.       0.5μg BSA，1X浓度，标记1小时，经还原的
17.       1μg BSA，1X浓度，标记1小时，经还原的
实施例9：蛋白质标记和消化
通过在升高的温度下标记牛血清白蛋白，任选地还原标记的混合物，然后电泳分离所述混合物来证明使用本文描述的方法用氨基反应性荧光试剂进行的蛋白质标记，接着消化标记的蛋白质。如上述实施例中所述，在室温下和70℃标记BSA。图13(小图1)表明，在升高的温度下进行标记导致凝胶底部的小的标记的蛋白质片段，其因此″过饱和″检测器，且该荧光阻止荧光强度较弱的标记的蛋白质的显现。去除(切掉)所述凝胶底部允许显现所述凝胶中的其他标记的蛋白质或蛋白质片段(图13(小图2))。小图2表明蛋白质片段的存在，所述片段由于蛋白质在标记期间在升高的温度下的消化而产生。图13(小图3和4)还表明，可以在低pH下可逆地淬灭荧光且在高pH下完全恢复荧光。因此，对于氨基反应性荧光试剂，使用本文描述的标记方法获得的荧光信号是pH依赖的。使用Fujifilm′s LAS-1000(477nm EPI光源，520-640nm带通滤光片和1分钟曝光时间)获得荧光图像。凝胶的泳道1是SeeBlue Plus 2(Invitrogen)预染色的标准，其包含荧光标记的蛋白质。剩余的凝胶泳道是如下所述的样品组：
凝胶泳道            样品和时间
1.        10μlPlus2Prestained Standard
          (Invitrogen，Carlsbad)
2.        1μg BSA，在室温下标记，经还原的
3.        0.5μg BSA，在室温下标记，经还原的
4.        0.5μg BSA，在室温下标记，未还原的
5.        1μg BSA，在室温下标记，未还原的
6.        1μg BSA，在70℃标记，经还原的的
7.        0.5μg BSA，在70℃标记，经还原的
8.        1μg BSA，在70℃标记，未还原的
9.        0.5μg BSA，在70℃标记，未还原的
10.       10μl MagicMarkTM XP Standard(Invitrogen，
          Carlsbad)
实施例10：蛋白质表达分析：大肠杆菌裂解物
用带四半胱氨酸标签(TC)的GFP(绿色荧光蛋白)质粒构建体(在C末端带标签)转化大肠杆菌。细胞在振荡下，在37℃，在Luria-Bertani(LB)/抗生素中生长过夜至OD600为0.8-1.0。取出各个的样品并且用1mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导剩下的并且在振荡下温育30分钟。等分细胞，在4,000xg离心10分钟，吸出培养基并且沉淀贮存于-20℃。
对于各个实验，将细胞沉淀的等分试样置于室温下，在1％SDS中重悬浮以裂解细胞，涡旋，加热到70℃，再次涡旋，并且在14,000xg下离心5分钟以沉淀细胞碎片。上清液用作实验的裂解物。当目的蛋白质溶于PBS时，1X PBS还用于重悬浮细胞沉淀并且细胞用超声法裂解。
将一管细胞沉淀置于室温下并且在100μl 1％SDS中重悬浮，涡旋，在70℃加热10分钟，再次涡旋，并且在14,000xg下离心10分钟。将第二管细胞沉淀在100μl 1X PBS中重悬浮，超声处理并且在14,000xg下离心10分钟。
上样缓冲剂(也称为FlAsH缓冲剂)包含(作为2X缓冲剂)：4％SDS，20％甘油，120mM磷酸钾缓冲剂pH 8.5，0.4mg/mL溴酚蓝，50mM巯基乙磺酸，2mM三[2-羧乙基]膦(TCEP)，20μM 4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)荧光素-(2，2-乙二硫醇)2(FlAsH)和333μM NaHCO3，其用于标记带TC标签的蛋白质。对于各个管，将6μl上样缓冲剂(FlAsH缓冲剂)添加到4μl裂解物中。类似地制备对照样品，然而不具有FlAsH试剂(用水替换)的上样缓冲剂用于表明，全蛋白质染色不依赖于FlAsH并且在FlAsH试剂的存在下仅检测到带TC标签的蛋白质。将各个样品涡旋并且立刻离心，然后在70℃温育3分钟。三分钟后，将样品置于室温下并且添加2μl于DMSO中的氨基反应性染料，用于测量总蛋白。在某些样品中，所用的氨基反应性染料是BODIPY TR-X SE，而其他样品中，氨基反应性染料为BODIPY650/665SE。BODIPY TR-X SE的终浓度为12.5μM，其获自125μM的原液，并且BODIPY 650/665SE的终浓度为10μM，其获自10μM的原液。向不具有总蛋白染料的对照样品中添加2μl DMSO。涡旋所有样品并且在室温下温育10分钟，然后将10μl各样品加载到NuPage4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶和Novex 4-20％Tris-甘氨酸凝胶上并且根据相应的凝胶的实验方案进行电泳。NuPage凝胶在3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)电泳缓冲剂中电泳并且Novex凝胶在Novex电泳缓冲剂中电泳。两者都在200V下电泳一个小时。
电泳完成后，将夹盒中的凝胶置于荧光成像仪(Fuji FLA3000)上并且用473nm激发激光器和520nm发射滤光片成像以检测用FlAsH标记的带TC标签的GFP蛋白质。然后用532nm激发激光器和580nm发射滤光片(用于检测BODIPY TR-X)或633nm激发激光器和675nm发射滤光片(用于检测BODIPY 650/665)对夹盒成像(取决于添加到样品中的氨基反应性蛋白质染料)，以检测总蛋白质裂解物特征。图17-19展示获得的凝胶图像。如下所述，从第一管的上清液获得的样品用于泳道1-12中并且从第二管的上清液获得的样品用于泳道13-15中(对于Novex凝胶)或泳道13-17中(对于NuPage凝胶)。用如下处理的样品加载凝胶：
凝胶泳道            样品
1.         Benchmark预染的梯(10μl，未经处理的)
2.         裂解物+上样缓冲剂
3.         裂解物+上样缓冲剂
4.         裂解物+上样缓冲剂
5.         裂解物+FlAsH缓冲剂
6.         裂解物+FlAsH缓冲剂
7.         裂解物+FlAsH缓冲剂
8.         裂解物+FlAsH缓冲剂+BODIPY TR-X
9.         裂解物+FlAsH缓冲剂+BODIPY TR-X
10.        裂解物+FlAsH缓冲剂+BODIPY TR-X
11.        裂解物+上样缓冲剂+BODIPY TR-X
12.        裂解物+上样缓冲剂+BODIPY TR-X
13.        裂解物+FlAsH缓冲剂+BODIPY 650/665
14.        裂解物+FlAsH缓冲剂+BODIPY 650/665
15.        裂解物+FlAsH缓冲剂+BODIPY 650/665
16.        裂解物+上样缓冲剂+BODIPY 650/665
17.        裂解物+上样缓冲剂+BODIPY 650/665
注意：在Novex凝胶(其具有15个泳道而不是17个)中，泳道1-14为如所指出的，并且泳道15包含泳道16的样品。
在用473nm激发光和520nm发射光获得的图像(图17)中，在泳道5至10中可观察到带TC标签的蛋白质GFP。在不具有FlAsH上样缓冲剂的泳道(2-4，11-12和16-17)中，观察不到带TC标签的蛋白质。在用532nm激发光和580nm发射光获得的图像(图18)中，可观察到来自用BODIPY TR-X SE标记的裂解物的总蛋白质特征(泳道8-12)。在用633nm激发光和675nm发射光获得的图像(图19)中，可观察到来自用BODIPY 650/665SE标记的裂解物的总蛋白质特征(泳道13-17)。在上样缓冲剂中不具有FlAsH试剂的泳道中，也可观察到总蛋白质特征(泳道11-12和16-17)，表明带TC标签的蛋白质的FlAsH标记和用BODIPY SE染料进行的总蛋白质标记之间是独立的。
实施例11：蛋白质表达分析：哺乳动物细胞裂解物和蛋白质梯
在实施例10中描述的实验方案和上样缓冲剂也可用于蛋白质梯和哺乳动物细胞裂解物。
用带四半胱氨酸标签(TC)的GFP(绿色荧光蛋白)质粒构建体(在C末端带标签)转化大肠杆菌。细胞在振荡下，在37℃，在Luria-Bertani(LB)/抗生素中生长过夜至OD600为0.8-1.0。取出各个的样品并且用1mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导剩下的并且在振荡下温育30分钟。等分细胞，在4,000xg离心10分钟，吸出培养基并且沉淀贮存于-20℃。
用带四半胱氨酸标签(TC)的CFP(青色荧光蛋白)质粒构建体(在C末端带标签)转化哺乳动物细胞。细胞在振荡下，在37℃，在Luria-Bertani(LB)/抗生素中生长过夜至OD600为0.8-1.0。取出各个的样品并且用1mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导剩下的并且在振荡下温育30分钟。等分细胞，在4,000xg离心10分钟，吸出培养基并且沉淀贮存于-20℃。
对于各个实验，将细胞沉淀的等分试样置于室温下，在1％SDS中重悬浮以裂解细胞，涡旋，加热到70℃，再次涡旋，并且在14,000xg下离心5分钟以沉淀细胞碎片。上清液用作实验的裂解物。当目的蛋白质溶于PBS时，1X PBS还用于重悬浮细胞沉淀并且细胞用超声法裂解。
将一管大肠杆菌细胞沉淀置于室温下并且在100μl 1％SDS中重悬浮，涡旋，在70℃加热10分钟，再次涡旋，并且在14,000xg下离心10分钟。将第二管哺乳动物细胞沉淀在100μl 1X PBS中重悬浮，超声处理并且在14,000xg下离心10分钟。随后发现，哺乳动物细胞中表达的带TC标签的CFP不是完整的而是被降解的。即使用1％SDS裂解哺乳动物细胞，也检测不到带TC标签的CFP。
上样缓冲剂(也称为FlAsH缓冲剂)包含(作为2X缓冲剂)：4％SDS，20％甘油，120mM磷酸钾缓冲剂pH 8.5，0.4mg/mL溴酚蓝，50mM巯基乙磺酸，2mM三[2-羧乙基]膦(TCEP)，20μM 4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)荧光素-(2，2-乙二硫醇)2(FlAsH)和333μM NaHCO3，其用于标记带TC标签的蛋白质。对于各个管，将6μl上样缓冲剂(FlAsH缓冲剂)添加到4μl裂解物(大肠杆菌和哺乳动物)中。将各个样品涡旋并且立刻离心，然后在70℃温育3分钟。三分钟后，将样品置于室温下并且添加2μl于DMSO中的氨基反应性染料，用于测量总蛋白。在某些样品中，所用的氨基反应性染料是BODIPYTR-X SE，而其他样品中，氨基反应性染料为BODIPY 650/665SE。BODIPY TR-X SE的终浓度为125μM，其获自1.25mM的原液，并且BODIPY 650/665SE的终浓度为10μM，其获自10μM的原液。还发现，当混合到一起时，总蛋白染料也起作用。
通过向蛋白质梯溶液添加2μl于DMSO中的氨基反应性染料(BODIPY TR-X SE，BODIPY 650/665SE或两者)，用氨基反应性荧光染料标记蛋白质梯BenchMarkTM蛋白质梯(Invitrogen，Carlsbad)和Mark12TM Unstained Standard(Invitrogen，Carlsbad)。
涡旋所有样品并且在室温下温育10分钟，然后将10μl各样品加载到NuPage 4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶和Novex 4-20％Tris-甘氨酸凝胶上并且根据相应的凝胶的实验方案进行电泳。NuPage凝胶在3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)电泳缓冲剂中电泳并且Novex凝胶在Novex电泳缓冲剂中电泳。两者都在200V下电泳一个小时。
电泳完成后，将夹盒中的凝胶置于荧光成像仪(Fuji FLA3000)上并且用473nm激发激光器和520nm发射滤光片成像以检测用FlAsH标记的带TC标签的GFP蛋白质和带TC标签的CFP蛋白质。然后用532nm激发激光器和580nm发射滤光片(用于检测BODIPY TR-X)或633nm激发激光器和675nm发射滤光片(用于检测BODIPY 650/665)对夹盒成像(取决于添加到样品中的氨基反应性蛋白质染料)，以检测总蛋白质裂解物特征。图20-22展示获得的凝胶图像。经标记的BenchMarkTM蛋白质梯(Invitrogen，Carlsbad)的样品加载到泳道3-5中，从大肠杆菌上清液获得的样品用于泳道6-9，从哺乳动物细胞上清液获得的样品用于泳道10-12，并且经标记的Mark12TM UnstainedStanda rd(Invitrogen，Carlsbad)的样品用于泳道13-15。
凝胶泳道                样品
1.        Benchmark预染的梯(10μl，未经处理的)
2.        Benchmark荧光梯(5μl，未经处理的)
3.        Benchmark梯(2μl)+BODIPY TR-X
4.        Benchmark梯(2μl)+BODIPY 650/665
5.        Benchmark梯(2μl)+BODIPY TR-X+BODIPY
          650/665
6.        GFP-TC裂解物+DMSO(无所有的蛋白质染料)
7.        GFP-TC裂解物+BODIPY TR-X
8.        GFP-TC裂解物+BODIPY 650/665
9.        GFP-TC裂解物+BODIPY TR-X+BODIPY 650/665
10.       哺乳动物裂解物+BODIPY TR-X
11.       哺乳动物裂解物+BODIPY 650/665
12.       哺乳动物裂解物+BODIPY TR-X+BODIPY 650/665
13.       Mark 12梯+BODIPY TR-X
14.       Mark 12梯+BODIPY 650/665
15.       Mark 12梯+BODIPY TR-X+BODIPY 650/665
图20-22中所示的图像还证明，存在于哺乳动物细胞裂解物中的具有TC样区域的蛋白质可以用FlAsH上样缓冲剂检测，并且它们的相对丰度可以通过总蛋白质标记指示。
应理解，之前的描述仅是本发明的示例。标题仅是为了方便，而不意欲于将标题下的公开内容限制至仅该标题。各种替代物和修饰可以由本领域技术人员想到而不背离本发明。因此，本发明意欲包括落在附加的权利要求的范围内的所有此类替代物，修饰和改变。
虽然已结合优选实施方案描述了本发明，但应理解，不意欲将本发明限制于这些实施方案。相反，本发明意欲包括替代物，修饰和等价物，其可以包括在如附加的权利要求定义的本发明的范围内。
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Claims (128)

1.用于蛋白质分析的方法，其包括荧光标记蛋白质混合物，其中所述标记包括步骤：
a)通过将所述蛋白质混合物与组合物混合形成第一反应混合物，所述组合物包含：
i)pH在pH 8和pH 10之间的第一缓冲剂；
ii)氨基反应性荧光试剂；和
iii)丙酮氰醇，腈，或碱性氰化物，
b)在第一温度温育第一反应混合物第一温育时间；
c)通过将第二缓冲剂与第一反应混合物混合形成第二反应混合物，其中第二缓冲剂的pH在pH 6和pH 9之间；
d)在第二温度温育第二温育时间；和
e)分离和显现荧光标记的蛋白质。
2.权利要求1的方法，其中所述组合物包含丙酮氰醇或苯乙醇腈。
3.权利要求1的方法，其中所述组合物包含碱性氰化物。
4.权利要求3的方法，其中所述碱性氰化物是氰化钠或氰化钾。
5.权利要求1的方法，其中所述氨基反应性荧光试剂是芳酰基-2-喹啉-甲醛试剂。
6.权利要求5的方法，其中所述芳酰基-2-喹啉-甲醛试剂为3-(4-羧基苯甲酰基)喹啉-2-甲醛或3-(2-糠酰)喹啉-2-甲醛)。
7.权利要求6的方法，其中所述芳酰基-2-喹啉-甲醛试剂是3-(2-糠酰)喹啉-2-甲醛)。
8.权利要求1的方法，其中所述组合物还包含阴离子表面活性剂。
9.权利要求8的方法，其中所述阴离子表面活性剂是烷基苯磺酸盐，烷基磺酸盐，烷基磺基琥珀酸盐，烷基磷酸盐，烷基硫酸盐，烷基羧酸盐，烷基醚苯磺酸盐，烷基醚磺酸盐，烷基醚磺基琥珀酸盐，烷基醚磷酸盐，烷基醚硫酸盐或烷基醚羧酸盐。
10.权利要求8的方法，其中所述阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸锂，月桂基乙醚硫酸钠，油酸钠，棕榈酸钠，肉豆蔻酸钠，或硬脂酸钠。
11.权利要求8的方法，其中所述阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸锂。
12.权利要求1的方法，其中第一缓冲剂选自碳酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐，硼酸盐，Bis-Tris丙烷和N-二(羟乙基)甘氨酸。
13.权利要求1的方法，其中第二缓冲剂选自磷酸盐，甘氨酸，柠檬酸，乙酸，MES，二甲胂酸，碳酸，Bis-Tris，PIPES，ACES，咪唑，BES，MOPS，AMPSO，TES，HEPES，HEPPSO和三乙醇胺。
14.权利要求1的方法，其中第二缓冲剂具有大于第一缓冲剂的缓冲容量，从而将第二反应混合物的pH维持在pH 6和pH 9之间。
15.权利要求1的方法，其中所述组合物还包含糖或糖醇。
16.权利要求15的方法，其中所述糖是蔗糖。
17.权利要求15的方法，其中所述糖醇是甘油。
18.权利要求1的方法，其中第一温育时间在1分钟和15分钟之间。
19.权利要求1的方法，其中第一温育时间在5分钟和15分钟之间。
20.权利要求1的方法，其中第一温育时间在10分钟和15分钟之间。
21.权利要求1的方法，其中第一温育温度是室温或环境温度。
22.权利要求1的方法，其中第一温育温度在25℃和70℃之间。
23.权利要求1的方法，其中第二温育时间在1分钟和15分钟之间。
24.权利要求1的方法，其中第二温育时间在5分钟和15分钟之间。
25.权利要求1的方法，其中第二温育时间在10分钟和15分钟之间。
26.权利要求1的方法，其中第二温育温度在25℃和80℃之间。
27.权利要求1的方法，其中第二温育温度在35℃和80℃之间。
28.权利要求1的方法，其中第二温育温度在50℃和80℃之间。
29.权利要求1的方法，其中第二温育温度为70℃。
30.权利要求1的方法，其中第一温育时间在5分钟和10分钟之间，并且第二温育时间是大约10分钟。
31.权利要求1的方法，其还包括向第二反应混合物添加还原剂。
32.权利要求31的方法，其还包括向第二反应混合物添加选自三烷基膦化合物，二硫苏糖醇(DTT)，2-巯基乙醇，亚硫酸氢钠，巯基乙酸，巯基乙磺酸，谷胱甘肽或其组合的还原剂。
33.权利要求31的方法，其中三烷基膦化合物是三-n-丁基膦(TBP)或三[2-羧乙基]膦(TCEP)。
34.权利要求1的方法，其中所述组合物还包含烷化剂。
35.权利要求1的方法，其中电泳分离所述荧光标记的蛋白质。
36.权利要求35的方法，其中使用平板凝胶电泳分离所述荧光标记的蛋白质。
37.权利要求35的方法，其中使用毛细管凝胶电泳分离所述荧光标记的蛋白质。
38.权利要求1的方法，其中通过色谱分离所述荧光标记的蛋白质。
39.权利要求1的方法，其中所述荧光标记的蛋白质的显现包括成像。
40.权利要求1的方法，其中在荧光标记的蛋白质的分离期间进行显现。
41.权利要求1的方法，其中在荧光标记的蛋白质分离后进行显现。
42.权利要求1的方法，其中在包含于一次性夹盒内的平板凝胶上分离所述荧光标记的蛋白质。
43.权利要求42的方法，其中用一次性夹盒内的平板凝胶进行显现。
44.权利要求1的方法，其中在荧光标记的蛋白质的分离期间进行显现。
45.权利要求44的方法，其中在荧光标记的蛋白质分离后进行显现。
46.权利要求1的方法，其中所述方法在小于1小时内完成。
47.权利要求1的方法，其中所述方法在小于30分钟内完成。
48.权利要求1的方法，其中所述方法在小于20分钟内完成。
49.权利要求1的方法，其中所述方法在小于10分钟内完成。
50.权利要求1的方法，其中所述蛋白质混合物包含带标签的蛋白质，且第二缓冲剂进一步包含与带标签的蛋白质上的标签结合的标签结合荧光试剂，其中所述氨基反应性荧光试剂具有第一发射波长并且所述标签结合荧光染料具有第二发射波长，并且第一发射波长和第二发射波长不同。
51.权利要求50的方法，其中所述标签结合荧光是双砷荧光团。
52.权利要求51的方法，其中所述双砷荧光团是荧光素或试卤灵的双砷衍生物。
53.权利要求52的方法，其中所述双砷荧光团是4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)荧光素-(2，2-乙二硫醇)2或4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)试卤灵-(2，2-乙二硫醇)2。
54.权利要求50的方法，其还包括比较第一发射波长和第二发射波长。
55.权利要求50的方法，其中所述带标签的蛋白质上的标签包含肽，所述肽包含至少四半胱氨酸部分。
56.权利要求50的方法，其中所述肽包含Cys-Cys-Xn-Cys-Cys部分，其中各个X独立地是选自丙氨酸，精氨酸，天门冬酰胺，天门冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸或缬氨酸的氨基酸，并且n是2至20的整数。
57.权利要求50的方法，其中所述肽是Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys。
58.权利要求50的方法，其中所述肽包含Cys-Cys-Xn-Cys-Gly-Cys部分，其中各个X独立地是选自丙氨酸，精氨酸，天门冬酰胺，天门冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸或缬氨酸的氨基酸，并且n是2至20的整数。
59.权利要求50的方法，其中所述肽是Cys-Cys-Gly-Gly-Lys-Gly-Asn-gly-Gly-Cys-Gly-Cys。
60.用于蛋白质分析的方法，其包括荧光标记包含带标签的蛋白质的蛋白质混合物，其中所述标记包括步骤：
a)通过将所述蛋白质混合物与第一组合物混合形成第一反应混合物，所述第一组合物包含：
i)pH在pH 8和pH 10之间的第一缓冲剂；和
ii)氨基反应性荧光染料，或与所述带标签的蛋白质上的标签结合的标签结合荧光试剂；
b)在第一温度温育第一反应混合物第一温育时间；
c)通过将第二组合物与第一反应混合物混合形成第二反应混合物，其中第二组合物包含：
i)pH在pH 6和pH 10之间的第二缓冲剂；
ii)氨基反应性荧光染料，或标签结合荧光试剂，前提条件是，如果第一组合物包含氨基反应性荧光染料，则第二组合物包含标签结合荧光试剂，并且如果第一组合物包含标签结合荧光试剂，则第二组合物包含氨基反应性荧光染料；和
iii)至少一种还原剂，
d)在第二温度温育第二反应混合物第二温育时间；和
e)分离并显现荧光标记的蛋白质，
其中第一缓冲剂不包含伯胺或仲胺，所述氨基反应性荧光染料具有第一发射波长并且所述标签结合荧光染料具有第二发射波长，并且第一发射波长和第二发射波长不同。
61.权利要求60的方法，其还包括比较第一发射波长和第二发射波长。
62.权利要求60的方法，其中所述氨基反应性荧光染料包含选自荧光素部分，罗丹明部分，吖啶部分，香豆素部分，吲哚部分，异吲哚部分，中氮茚部分，喹啉部分，异喹啉部分，色烯部分，夹氧杂蒽部分，萘部分，芘部分，bimane部分和BODIPY部分的荧光部分。
63.权利要求60的方法，其中所述氨基反应性荧光染料进一步包括选自酰基叠氮，羰基叠氮化物，异硫氰酸酯，异氰酸酯，琥珀酰亚胺酯，羧酸酯，羧酸，琥珀酰亚胺酯，磺基琥珀酰亚胺酯，STP酯，四氟苯基酯，磺酰氯，酸性卤化物，醛，甲醛，二氯三嗪，NBD氯化物，或NBD氟化物的反应性部分。
64.权利要求60的方法，其中所述氨基反应性荧光染料选自7-羟基-9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)琥珀酰亚胺酯(DDAO-SE)，Bodipy TR-X-琥珀酰亚胺酯，和Bodipy 650/665-琥珀酰亚胺酯。
65.权利要求60的方法，其中第一缓冲剂选自碳酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐，硼酸盐，Bis-Tris丙烷和N-二(羟乙基)甘氨酸。
66.权利要求60的方法，其中第二缓冲剂选自磷酸盐，甘氨酸，柠檬酸，乙酸，MES，二甲胂酸，碳酸，Bis-Tris，PIPES，ACES，咪唑，BES，AMPSO，MOPS，TES，HEPES，HEPPSO和三乙醇胺。
67.权利要求60的方法，其中第一组合物还包含阴离子表面活性剂。
68.权利要求67的方法，其中所述阴离子表面活性剂是烷基苯磺酸盐，烷基磺酸盐，烷基磺基琥珀酸盐，烷基磷酸盐，烷基硫酸盐，烷基羧酸盐，烷基醚苯磺酸盐，烷基醚磺酸盐，烷基醚磺基琥珀酸盐，烷基醚磷酸盐，烷基醚硫酸盐或烷基醚羧酸盐。
69.权利要求67的方法，其中所述阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸锂，月桂基乙醚硫酸钠，油酸钠，棕榈酸钠，肉豆蔻酸钠，或硬脂酸钠。
70.权利要求67的方法，其中所述阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸锂。
71.权利要求60的方法，其中第一组合物还包含糖或糖醇。
72.权利要求71的方法，其中所述糖是蔗糖。
73.权利要求71的方法，其中所述糖醇是甘油。
74.权利要求60的方法，其中第一温育时间在1分钟和15分钟之间。
75.权利要求60的方法，其中第一温育时间在5分钟和15分钟之间。
76.权利要求60的方法，其中第一温育时间在10分钟和15分钟之间。
77.权利要求60的方法，其中第一温育温度是室温。
78.权利要求60的方法，其中第一温育温度是环境温度。
79.权利要求60的方法，其中第一温育温度在25℃和70℃之间。
80.权利要求60的方法，其中第二温育时间在1分钟和15分钟之间。
81.权利要求60的方法，其中第二温育时间在5分钟和15分钟之间。
82.权利要求60的方法，其中第二温育时间在10分钟和15分钟之间。
83.权利要求60的方法，其中第二温育温度在25℃和80℃之间。
84.权利要求60的方法，其中第二温育温度在35℃和80℃之间。
85.权利要求60的方法，其中第二温育温度在50℃和80℃之间。
86.权利要求60的方法，其中第二温育温度是70℃。
87.权利要求60的方法，其中第一温育时间在5分钟和10分钟之间，并且第二温育时间是大约10分钟。
88.权利要求60的方法，其中所述还原剂选自三烷基膦化合物，二硫苏糖醇(DTT)，2-巯基乙醇，亚硫酸氢钠，巯基乙酸，巯基乙磺酸，谷胱甘肽或其组合。
89.权利要求60的方法，其中与带标签的蛋白质上的标签结合的荧光染料是双砷荧光团。
90.权利要求89的方法，其中所述双砷荧光团是荧光素或试卤灵的双砷衍生物。
91.权利要求89的方法，其中所述双砷荧光团是4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)荧光素-(2，2-乙二硫醇)2或4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)试卤灵-(2，2-乙二硫醇)2。
92.权利要求60的方法，其中所述带标签的蛋白质上的标签包含肽，所述肽包含至少四半胱氨酸部分。
93.权利要求92的方法，其中所述肽包含Cys-Cys-Xn-Cys-Cys部分，其中各个X独立地是选自丙氨酸，精氨酸，天门冬酰胺，天门冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸或缬氨酸的氨基酸，并且n是2至20的整数。
94.权利要求92的方法，其中所述肽是Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cy s。
95.权利要求92的方法，其中所述肽包含Cys-Cys-Xn-Cys-Gly-Cys部分，其中各个X独立地是选自丙氨酸，精氨酸，天门冬酰胺，天门冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸或缬氨酸的氨基酸，并且n是2至20的整数。
96.权利要求92的方法，其中所述肽是Cys-Cys-Gly-Gly-Lys-Gly-Asn-gly-Gly-Cys-Gly-Cys。
97.用于荧光标记包含带标签的蛋白质的蛋白质混合物的试剂盒，所述试剂盒包含：
a)包含pH为pH 8至pH 10的缓冲剂，氨基反应性荧光试剂或氨基反应性荧光染料，糖或糖醇，和阴离子表面活性剂的第一组合物；和
b)包含pH为pH 6至pH 10的第二缓冲剂，和任选地标签结合荧光试剂的第二组合物。
98.权利要求97的试剂盒，其中第一组合物包含氨基反应性荧光试剂并且还包含丙酮氰醇、腈或碱性氰化物。
99.权利要求98的试剂盒，其中第一组合物包含丙酮氰醇或苯乙醇腈。
100.权利要求97的方法，其中所述组合物包含碱性氰化物。
101.权利要求100的方法，其中所述碱性氰化物是氰化钠或氰化钾。
102.权利要求97的试剂盒，其中所述氨基反应性荧光试剂是芳酰基-2-喹啉-甲醛试剂。
103.权利要求102的方法，其中所述芳酰基-2-喹啉-甲醛试剂为3-(4-羧基苯甲酰基)喹啉-2-甲醛或3-(2-糠酰)喹啉-2-甲醛)。
104.权利要求103的方法，其中所述芳酰基-2-喹啉-甲醛试剂是3-(2-糠酰)喹啉-2-甲醛)。
105.权利要求97的试剂盒，其中第一组合物包含氨基反应性荧光染料，所述氨基反应性荧光染料包含选自荧光素部分，罗丹明部分，吖啶部分，香豆素部分，吲哚部分，异吲哚部分，中氮茚部分，喹啉部分，异喹啉部分，色烯部分，夹氧杂蒽部分，萘部分，芘部分，bimane部分和BODIPY部分的荧光部分。
106.权利要求105的试剂盒，其中所述氨基反应性荧光染料进一步包括选自酰基叠氮，羰基叠氮化物，异硫氰酸酯，异氰酸酯，琥珀酰亚胺酯，羧酸酯，羧酸，琥珀酰亚胺酯，磺基琥珀酰亚胺酯，STP酯，四氟苯基酯，磺酰氯，酸性卤化物，醛，甲醛，二氯三嗪，NBD氯化物，或NBD氟化物的反应性部分。
107.权利要求97的试剂盒，其中第二组合物还包含与至少四半胱氨酸部分结合的标签结合荧光试剂，和至少一种还原剂，其中氨基反应性荧光试剂或荧光染料具有第一发射波长而标签结合荧光染料具有第二发射波长，并且第一发射波长和第二发射波长不同。
108.权利要求107的试剂盒，其中所述标签结合荧光试剂是荧光素或试卤灵的双砷衍生物。
109.权利要求108的试剂盒，其中双砷荧光团是4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)荧光素-(2，2-乙二硫醇)2或4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)试卤灵-(2，2-乙二硫醇)2。
110.一种组合物，其包含pH为pH 8至pH 10的缓冲剂，标签结合荧光染料，阴离子表面活性剂，糖或糖醇，示踪染料，一种或多种还原剂和碳酸氢盐。
111.权利要求110的组合物，其中所述一种或多种还原剂选自三烷基膦化合物，二硫苏糖醇(DTT)，2-巯基乙醇，亚硫酸氢钠，巯基乙酸，巯基乙磺酸，或谷胱甘肽。
112.权利要求111的组合物，其中三烷基膦化合物是三-N-丁基膦(TBP)或三[2-羧乙基]膦(TCEP)。
113.权利要求110的组合物，其中所述标签结合荧光染料是双砷荧光团。
114.权利要求113的组合物，其中所述双砷荧光团是荧光素的双砷衍生物。
115.权利要求114的组合物，其中所述双砷荧光团是4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)荧光素-(2，2-乙二硫醇)2。
116.权利要求114的组合物，其中所述双砷荧光团是试卤灵的双砷衍生物。
117.权利要求116的组合物，其中所述双砷荧光团是4′-5′-双(1，3，2-dithioarsolan-2-基)试卤灵-(2，2-乙二硫醇)2。
118.权利要求110的组合物，其中所述阴离子表面活性剂是烷基苯磺酸盐，烷基磺酸盐，烷基磺基琥珀酸盐，烷基磷酸盐，烷基硫酸盐，烷基羧酸盐，烷基醚苯磺酸盐，烷基醚磺酸盐，烷基醚磺基琥珀酸盐，烷基醚磷酸盐，烷基醚硫酸盐或烷基醚羧酸盐。
119.权利要求118的组合物，其中所述阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸锂，月桂基乙醚硫酸钠，油酸钠，棕榈酸钠，肉豆蔻酸钠，或硬脂酸钠。
120.权利要求118的组合物，其中所述阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸锂。
121.权利要求110的组合物，其中所述糖是蔗糖。
122.权利要求110的组合物，其中所述糖醇是甘油。
123.权利要求110的组合物，其中所述示踪染料是溴酚蓝。
124.权利要求110的组合物，其中所述缓冲剂选自碳酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐，硼酸盐，Bis-Tris丙烷和N-二(羟乙基)甘氨酸。
125.权利要求110的组合物，其中所述组合物还包含带标签的蛋白质。
126.权利要求125的组合物，其中所述组合物还包含氨基反应性荧光染料。
127.权利要求126的组合物，其中所述氨基反应性荧光染料包含选自荧光素部分，罗丹明部分，吖啶部分，香豆素部分，吲哚部分，异吲哚部分，中氮茚部分，喹啉部分，异喹啉部分，色烯部分，夹氧杂蒽部分，萘部分，芘部分，bimane部分和BODIPY部分的荧光部分。
128.权利要求127的组合物，其中所述氨基反应性荧光染料进一步包括选自酰基叠氮，羰基叠氮化物，异硫氰酸酯，异氰酸酯，琥珀酰亚胺酯，羧酸酯，羧酸，琥珀酰亚胺酯，磺基琥珀酰亚胺酯，STP酯，四氟苯基酯，磺酰氯，酸性卤化物，醛，甲醛，二氯三嗪，NBD氯化物，或NBD氟化物的反应性部分。
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