CN103424400B - 用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂及使用方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂及使用方法和应用，该试剂包括：第一组分，是将带异硫氰酸基团的化合物溶解于保护异硫氰酸基团的溶剂中所形成的溶液；第二组分，是不含伯氨基的碱性上样缓冲液；使用方法包括：将第一组分与第二组分混合形成处理液,处理液与待测蛋白质样品混合，或将第二组分与待测蛋白质样品混合后再加入第一组分，加热，形成有色蛋白质样品液。本发明的试剂可用于凝胶电泳中。本发明的试剂具有简单易用、效果可靠、试剂使用量少且易于生产加工、可实时观察、适用范围广阔、没有污染、省时省力，可用于凝胶电泳蛋白质的预先显色等优势，而且蛋白质电泳图谱没有发生可以观察到得变化。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质显色试剂及方法，特别是涉及一种用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂及使用方法和应用。
背景技术
蛋白质的凝胶电泳是生命科学研究中最常用的实验方法之一。在蛋白质的凝胶电泳实验中，必须使用染色剂使蛋白质染上醒目的颜色，便于观察结果。现在常用的染色方法如考马斯亮蓝染色法、银染法等，需要在蛋白质的凝胶电泳结束之后对凝胶进行固定、染色、脱色等繁琐处理才能观察，耗时长，不可能快速知晓实验结果，也不便于在实验过程中观察结果。且固定、染色、脱色需要大量试剂（尤其是有机溶剂）浸泡凝胶，使用量很大，增加了对环境的污染。对于以上情况，现有的改进方法有：1)使用微波炉加热以加快反应速度；2)调整染色液配方以提高染色效率等。但是以上的方法都没有从本质上改变凝胶电泳实验中蛋白质染色步骤繁琐、污染严重等问题，而且染色仍然必须在电泳结束后才能进行。
故而，需要一种同时具备可靠性、可推广性、快速简便、无污染性的凝胶电泳蛋白质显色方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂及使用方法和应用。本发明中的采用该试剂的显色方法有别于传统凝胶电泳中蛋白质染色方式的蛋白质显色方法，而且本发明的显色方法弥补了几种传统染色方式的不足，而且在电泳环境下很稳定。
为解决上述技术问题，本发明的用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂（快速显色剂），其组分包括：第一组分和第二组分；
其中，第一组分是将带异硫氰酸基团（—NCS）的化合物溶解于保护异硫氰酸基团（—NCS）的溶剂中所形成的溶液，即带异硫氰酸基团（—NCS）的化合物溶液；
第二组分是不含伯氨基（—NH2基团）的碱性上样缓冲液。
所述带异硫氰酸基团（—NCS）的化合物，是带异硫氰酸基团（—NCS）的色素或者荧光素，包括：异硫氰酸荧光素（FITC）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TetramethylRhodaminIsothiocyanate，TRITC）等。
所述保护异硫氰酸基团（—NCS）的溶剂，包括：N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亚砜（DMSO）等。
所述第一组分的浓度推荐为0.08～0.12g/100mL（如0.1g/100mL）或者饱和浓度以下的其他浓度，视色素或荧光素的种类不同而不同。
所述第二组分，可采用常规的不含伯氨基（—NH2基团）的碱性缓冲液即可，如可采用pH8～10的不含伯氨基（—NH2基团）的碱性上样缓冲液（缓冲体系浓度优选为100mM以上），如包括：pH8～10的硼酸-氢氧化钠缓冲液（缓冲体系浓度优选为100mM以上）或pH7.5～8.5的磷酸盐缓冲液（缓冲体系浓度优选为100mM以上）及其他缓冲液。
其中，pH8～10的硼酸-氢氧化钠缓冲液的配方（100ml）如下：
将20ml1MpH8～10硼酸-氢氧化钠缓冲液（即Na2B4O7-NaOH）、2mlβ-巯基乙醇、4gSDS（十二烷基磺酸钠）、0.1gEDTA（乙二胺四乙酸）、20ml甘油混匀，并定容至100ml或将20ml1MpH8～10硼酸-氢氧化钠缓冲液、2g二硫苏糖醇、4gSDS、0.1gEDTA、20ml甘油混匀，并定容至100ml。
pH7.5～8.5的磷酸盐缓冲液的配方（100ml）如下：
将20ml1MpH7.5～8.5磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、2mlβ-巯基乙醇、4gSDS、0.1gEDTA（乙二胺四乙酸）、20ml甘油混匀，用3M氢氧化钠溶液将pH调回7.5～8.5，并定容至100ml或将20ml1MpH8～10磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、2g二硫苏糖醇、4gSDS、0.1gEDTA、20ml甘油混匀，用3M氢氧化钠溶液将pH调回7.5～8.5，并定容至100ml。
另外，本发明还公开了用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂（快速显色剂）在凝胶电泳蛋白质显色中的使用方法，包括：
I、方法A，其步骤包括：
（1）将第一组分与第二组分按比例进行混合，形成处理液；
其中，不同的带异硫氰酸基团的化合物（即带异硫氰酸基团的色素或荧光素）所需要的混合比例不同，如可根据待测蛋白样品浓度进行调整，以蛋白摩尔数略低于所加含有异硫氰酸基团（—NCS）的色素或荧光素为最宜，也可以自行摸索；
（2）将步骤（1）形成的处理液与待测蛋白质样品按比例进行混合后，70～100℃加热，形成有色蛋白质样品液，从而实现对蛋白质的显色。本步骤中，由于在上样缓冲液中反应，所以显色与蛋白质电泳前样品处理同步完成；
或II、方法B，其步骤包括：
将第二组分与待测蛋白质样品按比例进行混合后，再加入第一组分，70～100℃加热，形成有色蛋白质样品液，从而实现对蛋白质的显色。
所述方法A或方法B中，第一组分中含异硫氰酸荧光素（FITC）时，第一组分与第二组分以体积比为0.5～1:1的比例进行混合；第一组分中含四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）时，第一组分与第二组分以体积比为3～5:50的比例进行混合；
优选地，第一组分中含四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）时，在1mlpH8～10硼酸-氢氧化钠缓冲液中加入60μlTRITC的DMSO（二甲亚砜）溶液（TRITC的浓度优选为0.1g/100mL）；第一组分中含异硫氰酸荧光素（FITC）时，在1mlpH7.5～8.5磷酸盐缓冲液中加入1mlFITC的DMF溶液（FITC的浓度优选为0.1g/100mL）。
所述方法A的步骤（2）中，优选地，处理液与待测蛋白质样品以体积比为530～1000：500的比例进行混合。
所述方法B中，优选地，第二组分与待测蛋白质样品以体积比为1：1的比例进行混合。其中，本发明中，待测蛋白质样品的浓度可根据需要进行适当调整，如可处理的最大蛋白浓度理论上的物质量浓度大约是0.06mM，实测的质量浓度大约是15mg/ml。当蛋白样品浓度大于最高检测浓度后，荧光亮度差异仍然能体现出不同条带间的浓度差异，但是荧光在不同泳道间显示的浓度差异会减弱。
所述方法A或方法B中，加热的时间可为3～10分钟，但如果最终混合液体积较大或者混合液中蛋白浓度较高，可以适量增加70～100℃加热时间。
再者，本发明还公开了用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂（快速显色剂）的应用，即用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂在凝胶电泳中的应用，其步骤包括：
①将上述步骤（2）形成的有色蛋白质样品液直接加入至凝胶加样孔中，连通电源，进行电泳；
本步骤中，与蛋白结合的色素或荧光素不会在电泳过程中脱落；
②电泳完成后，取出凝胶，直接用肉眼观察蛋白质电泳条带的电泳结果（如凝胶上具有荧光色的蛋白质电泳条带），或将凝胶放入凝胶成像仪中进行观察。
所述步骤②中，取出的凝胶还可进行传统的蛋白质凝胶染色法，其中，传统的蛋白质凝胶染色法包括：考马斯亮蓝染色法；如考马斯亮蓝染色法等进行进一步染色，即直接将上述凝胶在电泳结束后进行传统考马斯亮蓝染色，而且染色效果与未使用本显色方法的样品完全相同。
另外，所述步骤②中，取出的凝胶还可用于后续的免疫印迹杂交等实验。
本发明中，采用化学方法，使异硫氰酸基团（—NCS）在碱性条件下和蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，使含有异硫氰酸基团（—NCS）的色素或者荧光素与蛋白质共价结合，形成稳定的结合物质，从而使色素或者荧光素连接到蛋白上，实现对蛋白质的染色（参照图1、图2）。另外，本发明染色的亮度与蛋白质物质的量成正比。
使用本发明染色的蛋白质，染色过程简单，染色时间短且与样品制备同步进行，在凝胶电泳过程中色素或荧光素不会脱落，可以直接在自然光下观察，也可以在凝胶成像仪的暗箱中使用紫外光源观察。其中，在蛋白质的凝胶电泳过程中，可以透过电泳槽和玻璃板直接观察电泳状况，如可以观察到结合至蛋白质上的带异硫氰酸基团（—NCS）的色素或者荧光素的颜色或者荧光呈蛋白质电泳条带状（如绿色荧光色的蛋白质电泳条带的泳动过程），将电泳槽放置于单光源暗室中条带更明显。电泳结束后也可以立即观察并且不影响凝胶电泳结束后，还可进一步使用传统染色（如考马斯亮蓝染色）对蛋白质染色。
本发明中，由于采用用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂进行蛋白质显色，完全免去传统染色方法中的固定、染色-脱色的繁琐过程。本发明的试剂具有简单易用、效果可靠、试剂使用量少且易于生产加工、可实时观察、适用范围广阔、没有污染、省时省力，可用于凝胶电泳蛋白质的预先显色等优势，而且蛋白质电泳图谱没有发生可以观察到得变化。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是为使用本发明快速染色反应过程的化学式：FITC在碱性条件下，其异硫氰酸基团（—NCS）和蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键。
图2是为使用本发明快速染色反应过程的化学式：TRITC在碱性条件下，其异硫氰酸基团（—NCS）和蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键。
图3是使用本发明快速染色并进行电泳的蛋白质凝胶电泳完成后的该凝胶上的蛋白质电泳条带图。其中，泳道2、3、4为对于同一蛋白质样品使用本发明中TRITC显色的泳道；泳道1作为对照，是未使用本发明中TRITC显色的泳道。该图为电泳后使用凝胶成像仪在紫外光源下实拍的照片，荧光亮度与蛋白质物质的量成正比。
图4是使用本发明快速染色后进一步用传统染色法染色的蛋白质凝胶的蛋白质电泳条带图（即对凝胶进一步用传统染色法染后使用凝胶成像仪在透射白光光源下实拍的照片）。其中，泳道2、3、4为对于同一蛋白质样品使用本发明中TRITC显色的泳道；泳道1作为对照，是未使用本发明中FITC显色的泳道。统一浓度使用传统凝胶考马斯亮蓝染色法再次染色、脱色，染色深度与蛋白质质量成正比。
图5是使用本发明快速染色并进行电泳的蛋白质凝胶电泳完成后的该凝胶上的蛋白质电泳条带图。其中，泳道2、3、4、5为对于同一蛋白质样品使用本发明中FITC显色的泳道；泳道1作为对照，是未使用本发明中FITC显色的泳道。荧光亮度与蛋白质物质的量成正比。该图为电泳后使用凝胶成像仪在透射紫外光源下实拍的照片。
图6是使用本发明快速染色后进一步用传统染色法染色的蛋白质凝胶的蛋白质电泳条带图（即对凝胶进一步用传统染色法染后使用凝胶成像仪在透射白光光源下实拍的照片）。其中，泳道2、3、4、5为对于同一蛋白质样品使用本发明中FITC显色的泳道；泳道1作为对照，是未使用本发明中FITC显色的泳道。统一浓度使用传统凝胶考马斯亮蓝染色法再次染色、脱色，染色深度与蛋白质质量成正比。
具体实施方式
以下采用的试剂如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1
(一)溶液配方
1、溶液A（不含伯氨基的碱性上样缓冲液，即pH9.0的硼酸-氢氧化钠缓冲液）：
20ml1M硼酸-氢氧化钠缓冲液（即Na2B4O7-NaOH）pH9.5
4gSDS
2gDTT（二硫苏糖醇）
0.1gEDTA（乙二胺四乙酸）
20ml甘油
加单蒸水定容至100ml，最终pH9.0。
2、溶液B（TRITC溶液）：
将TRITC溶解于DMSO（二甲亚砜）中，配制成浓度为1mg/ml的溶液。
3、考马斯亮蓝染色液（对照用）：
670ml单蒸水
250ml乙醇
1.25g考马斯亮蓝G-250
搅拌溶解后，加冰醋酸80ml。
4、脱色液（对照用）
670ml单蒸水
250ml乙醇
80ml冰醋酸
（二）反应方法
将溶液A与待电泳检测的蛋白质样品以体积比为1：1进行混合，每毫升混合液加入30μl溶液B，70～100℃金属浴加热10min后，在SDS-PAGE凝胶中上样进行电泳。其中，TRITC预染的蛋白质样品的平均每条带大约0.2微克，上样时总蛋白浓度大约0.12mg/ml。另外，电泳的电压、电流、温度、时间、pH可根据待电泳检测的蛋白质本身的需求进行确定。
电泳结束后，直接将凝胶放置在凝胶成像仪的暗箱中，使用透射紫外光源观察电泳结果，可以观察到红色荧光的蛋白条带（如图3所示），并且荧光亮度与蛋白质物质的量成正比。
另外，取出上述电泳结束后的SDS-PAGE凝胶，用传统的蛋白质凝胶染色法（即考马斯亮蓝染色法），进行进一步染色，再进行电泳。具体步骤为：将电泳后的SDS-PAGE凝胶放入盛有100ml考马斯亮蓝染色液的容器中，用微波炉中火加热5分钟后，在摇床上反应10分钟；倒去考马斯亮蓝染色液，用蒸馏水漂洗凝胶和容器后，加入脱色液，用微波炉中火加热5分钟后，在摇床上反应15分钟；倒去脱色液，用蒸馏水漂洗凝胶和容器后，再次加入脱色液，用微波炉中火加热5分钟后，在摇床上反应15分钟；倒去脱色液，用蒸馏水漂洗凝胶和容器后，将凝胶放置在凝胶成像仪的暗箱中，使用透射白光光源观察电泳结果，可以观察到蓝紫色的蛋白条带（图4所示），染色深度与蛋白质质量成正比。
比较图3与图4可以发现：使用本发明的用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂对蛋白本身的电泳结果没有任何影响，其显示的结果与不使用用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂而使用考马斯亮蓝染色所显示的电泳结果没有差别，且使用用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂显色后，还能够正常地继续使用考马斯亮蓝染色。
实施例2
(一)溶液配方
1、溶液A（不含伯氨基的碱性上样缓冲液，即pH8的磷酸盐缓冲液）：
20ml1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（NaH2PO4-Na2HPO4）pH8.0
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2mlβ巯基乙醇
0.1gEDTA
20ml甘油
用3M氢氧化钠溶液将pH调回8。
加单蒸水定容至100ml。
2、溶液B（FITC溶液）：
将FITC溶解于DMF（N,N-二甲基甲酰胺）中，配制成浓度为1mg/ml的溶液。
3、考马斯亮蓝染色液（对照用）：
670ml单蒸水
250ml乙醇
1.25g考马斯亮蓝G-250
搅拌溶解后加冰醋酸80ml。
4、脱色液（对照用）
670ml单蒸水
250ml乙醇
80ml冰醋酸
（二）反应方法：
将溶液A与待电泳检测的蛋白质样品以体积比为1：1进行混合，每毫升混合液加入500μl溶液B，70～100℃金属浴加热10min后，在SDS-PAGE凝胶中上样进行电泳。其中，FITC预染样品的蛋白质样品的平均每条带大约0.5微克，上样时总蛋白浓度大约0.6mg/ml。另外，电泳的电压、电流、温度、时间、pH可根据待电泳检测的蛋白质本身的需求进行确定。
电泳结束后直接将凝胶放置在凝胶成像仪中的暗箱中，使用透射紫外光源观察结果，可看到有绿色荧光的蛋白条带（图5所示），并且荧光亮度与蛋白质物质的量成正比。
另外，取出上述电泳结束后的SDS-PAGE凝胶，用传统的蛋白质凝胶染色法（即考马斯亮蓝染色法），进行进一步染色，再进行电泳。具体步骤为：将电泳后的SDS-PAGE凝胶放入盛有100ml考马斯亮蓝染色液的容器中，用微波炉中火加热5分钟后，在摇床上反应10分钟；倒去考马斯亮蓝染色液，用蒸馏水漂洗凝胶和容器后，加入脱色液，用微波炉中火加热5分钟后，在摇床上反应15分钟；倒去脱色液，用蒸馏水漂洗凝胶和容器后，再次加入脱色液，用微波炉中火加热5分钟后，在摇床上反应15分钟；倒去脱色液，用蒸馏水漂洗凝胶和容器后，将凝胶放置在凝胶成像仪的暗箱中，使用透射白光光源观察电泳结果，可以观察到蓝紫色的蛋白条带（图6所示），染色深度与蛋白质质量成正比。
比较图5与图6可以发现：使用本发明的用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂对蛋白本身的电泳结果没有任何影响，其显示的结果与不使用用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂而使用考马斯亮蓝染色所显示的电泳结果没有差别，且使用用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂显色后，还能够正常地继续使用考马斯亮蓝染色。
本发明中，带异硫氰酸基团的荧光素（FITC或TRITC等）或色素是在荧光素或色素的基础上通过化学反应增加异硫氰酸基团（—NCS）得到的，在碱性环境下，异硫氰酸基团（—NCS）可以和蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对蛋白质的染色。由于这种荧光标记在电泳环境下很稳定，所以可以在凝胶电泳前对蛋白质样品进行预染色，而未反应的荧光分子在电泳过程中能与溴酚蓝同速度甚至更快跑到凝胶底部或者胶外，因此，凝胶背景透明无色，凝胶中的蛋白条带可以直接在紫外灯下观察，免去了染色-脱色的繁琐步骤，同时，也能在电泳过程中实时观察到蛋白质条带。
Claims (3)
1.一种用于凝胶电泳蛋白质显色的试剂，其特征在于，其组分包括：第一组分和第二组分；
其中，第一组分是将异硫氰酸荧光素或四甲基异硫氰酸罗丹明溶解于N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中所形成的溶液；所述第一组分的浓度为0.1g/100mL；
所述第二组分为pH8～10的硼酸-氢氧化钠缓冲液或pH7.5～8.5的磷酸盐缓冲液；所述第二组分的浓度为100mM以上；
其中，pH8～10的硼酸-氢氧化钠缓冲液的配方如下：
将20ml1MpH8～10硼酸-氢氧化钠缓冲液、2mlβ-巯基乙醇、4gSDS、0.1gEDTA、20ml甘油混匀，并定容至100ml；或将20ml1MpH8～10硼酸-氢氧化钠缓冲液、2g二硫苏糖醇、4gSDS、0.1gEDTA、20ml甘油混匀，并定容至100ml；
pH7.5～8.5的磷酸盐缓冲液的配方如下：
将20ml1MpH7.5～8.5磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、2mlβ-巯基乙醇、4gSDS、0.1gEDTA、20ml甘油混匀，用3M氢氧化钠溶液将pH调回7.5～8.5，并定容至100ml；或将20ml1MpH7.5～8.5磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、2g二硫苏糖醇、4gSDS、0.1gEDTA、20ml甘油混匀，用3M氢氧化钠溶液将pH调回7.5～8.5，并定容至100ml。
2.一种如权利要求1所述的试剂在凝胶电泳蛋白质显色中的使用方法，其特征在于，包括：
I、方法A，其步骤包括：
(1)将第一组分与第二组分按比例进行混合，形成处理液；
(2)将步骤(1)形成的处理液与待测蛋白质样品按比例进行混合后，70～100℃加热，形成有色蛋白质样品液，实现对蛋白质的显色；
或II、方法B，其步骤包括：
将第二组分与待测蛋白质样品按比例进行混合后，再加入第一组分，70～100℃加热，形成有色蛋白质样品液，从而实现对蛋白质的显色；
所述方法A或方法B中，第一组分中含异硫氰酸荧光素时，第一组分与第二组分以体积比为0.5～1:1的比例进行混合；第一组分中含四甲基异硫氰酸罗丹明时，第一组分与第二组分以体积比为3～5:50的比例进行混合；
方法A的步骤(2)中，处理液与待测蛋白质样品以体积比为530～1000：500的比例进行混合；
方法B中，第二组分与待测蛋白质样品以体积比为1：1的比例进行混合；
方法A或方法B中，加热的时间为3～10分钟。
3.如权利要求2所述的使用方法，其特征在于：所述第一组分中含四甲基异硫氰酸罗丹明时，在1mlpH8～10硼酸-氢氧化钠缓冲液中加入60μl0.1g/100mL四甲基异硫氰酸罗丹明的二甲亚砜溶液；第一组分中含异硫氰酸荧光素时，在1mlpH7.5～8.5磷酸盐缓冲液中加入1ml0.1g/100mL异硫氰酸荧光素的N,N-二甲基甲酰胺溶液。
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